CN117440804A - 鉴定保护免受脂褐素细胞毒性的化合物的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开文本提供了用于治疗眼病(例如，视网膜病变)、更特别地与视网膜细胞中细胞毒性脂褐素相关细胞毒性相关的眼病的组合物和方法。

Description

鉴定保护免受脂褐素细胞毒性的化合物的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月22日提交的美国临时专利申请号63/140,533的权益和优先权，将所述临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
政府支持声明
本发明是在由美国国立卫生研究院/美国国立眼科研究所授予的EY027422-04下在美国政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本发明技术总体上涉及用于治疗眼病(例如，视网膜病变)、更特别地与视网膜细胞中细胞毒性脂褐素相关细胞毒性相关的眼病的组合物和方法。
背景技术
对本发明技术背景的以下描述仅仅是为了帮助理解本发明技术而提供的，并不承认描述或构成本发明技术的现有技术。
视网膜色素上皮(RPE)细胞死亡是患有斯塔加特病(Stargardt)和干性AMD的视网膜中地图样萎缩(GA)的主要原因，斯塔加特病和干性AMD分别是年轻人和老年人中最普遍且无法治愈的遗传性、年龄相关性致盲性障碍。脂褐素(LF)是一种由不可消化的材料构成的精细黄褐色色素，其被认为是溶酶体消化后的残留物。LF主要由称为脂质双类视黄醇的视黄醛二聚体以及少量碳水化合物、氧化蛋白质和金属构成。视网膜细胞中LF的积累引起视网膜毒性，其与诸如黄斑变性、眼睛的退行性疾病和斯塔加特病的病症相关。然而，LF导致变性的机制和程度尚不清楚，部分原因是所有针对其细胞毒性作用的尝试都未能维持RPE的活力并阻止视网膜衰退。因此，迫切需要新型分子靶标来治疗继发于斯塔加特病和干性AMD的GA。
发明内容
在一方面，本公开文本提供了一种用于预防或治疗有需要的受试者的与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的眼病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的选自以下的至少一种治疗剂：达拉非尼、坏死磺酰胺(necrosulfonamide，NSA)、阿瑞洛莫(arimoclomol)、激酶抑制性RNA酶衰减剂(Kinase Inhibiting RNase Attenuator，KIRA)化合物、salubrinal、SAL003及其任何药学上可接受的盐，其中所述与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的眼病是常染色体隐性视网膜色素变性(RP)、斯塔加特病(STGD)、贝斯特病(Best disease，BD)、视锥视杆细胞营养不良或ABCA4突变型年龄相关性黄斑变性(AMD)。KIRA化合物的例子包括但不限于KIRA3、KIRA6、KIRA7或KIRA8。在一些实施方案中，所述受试者包含ABCA4和/或RDH12的突变。所述ABCA4和/或RDH12的突变可以是纯合的或杂合的。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述有效量的所述至少一种治疗剂的施用防止所述受试者的视网膜细胞中脂褐素相关细胞毒性的恶化。
在另一方面，本公开文本提供了一种用于预防或治疗有需要的受试者的与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的ABCA4突变型眼病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的坏死抑素7(Necrostatin 7，Nec7)或其药学上可接受的盐，其中所述与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的ABCA4突变型眼病是常染色体隐性视网膜色素变性(RP)、视锥视杆细胞营养不良或年龄相关性黄斑变性(AMD)。在一些实施方案中，所述有效量的Nec7或其药学上可接受的盐的施用防止所述受试者的视网膜细胞中脂褐素相关细胞毒性的恶化。
在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，所述眼病是遗传性的、非遗传性的或与衰老相关的。在本文公开的方法的一些实施方案中，所述AMD是干性AMD。在本文公开的方法的其他实施方案中，所述视锥视杆细胞营养不良是常染色体隐性视锥视杆细胞营养不良。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述受试者携带选自以下的至少一个ABCA4突变：ABCA4 D2177N、ABCA4 G1961E、ABCA4 G863A、ABCA41847delA、ABCA4 L541P、ABCA4 T2028I、ABCA4 N247I、ABCA4 E1122K、ABCA4 W499*、ABCA4 A1773V、ABCA4 H55R、ABCA4 A1038V、ABCA4 IVS30+1G→T、ABCA4IVS40+5G→A、ABCA4 IVS14+1G→C和ABCA4 F1440del1cT。在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，所述受试者携带选自以下的至少一个RDH12突变：RDH12 G127*、RDH12 Q189*、RDH12 Y226C、RDH12 A269Gfs*、RDH12 L274P、RDH12 R65*、RDH12H151D、RDH12 T155I、RDH12 V41L、RDH12 R314W和RDH12V146D。视锥视杆细胞营养不良。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，本发明技术的所述至少一种治疗剂(例如，达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、所述KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐)减少或消除脂褐素双类视黄醇(LB)脂质诱导的MLKL的磷酸化和/或聚合。在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，本发明技术的所述至少一种治疗剂(例如，达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、所述KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐)逆转LB脂质诱导的磷酸化MLKL(pMLKL)向视网膜色素上皮细胞中的质膜的易位。在某些实施方案中，所述LB脂质选自N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)、A2E异构体、A2E的氧化衍生物和全反式视黄醛二聚体(ATRD)。
在本文公开的方法的任何前述实施方案中，本发明技术的所述至少一种治疗剂(例如，达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、所述KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐)降低与视网膜变性、炎症/血管生成、ER应激和/或坏死性凋亡相关的一种或多种基因的mRNA或蛋白质水平。与视网膜变性、炎症/血管生成、ER应激和/或坏死性凋亡相关的基因的例子包括但不限于EDN2、FGF2、GFAP、SERP、VEGF、CXCL15、XBP1s、SCAND1、CEBPA和HMGA。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，本发明技术的所述至少一种治疗剂(例如，达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、所述KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐)抑制或减轻脂褐素诱导的坏死性凋亡和/或减少视网膜色素上皮细胞中激活的小胶质细胞/巨噬细胞的浸润。
在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，将本发明技术的所述至少一种治疗剂(例如，达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、所述KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐)经由局部、玻璃体内、眼内、视网膜下或巩膜下施用来施用。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，本发明技术的所述至少一种治疗剂(例如，达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、所述KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐)与靶向视网膜色素上皮细胞的药剂缀合。靶向视网膜色素上皮细胞的药剂的例子包括但不限于他莫昔芬、氯喹(CQ)/羟氯喹(HCQ)、乙胺丁醇(EMB)或碘酸钠(NaIO3)。RPE靶向剂的其他例子描述于Crisóstomo S,Vieira L,Cardigos J(2019)Retina:23-28；Michaelides M(2011)Arch Ophthalmol 129(1):30；Tsai RK,He MS,Chen ZY,Wu WC,Wu WS(2011)MolVis 17(6月):1564-1576；MacHalińska A等人(2010)Neurochem Res 35(11):1819-1827；Tsang SH,Sharma T(2018)Drug-Induced Retinal Toxicity.Atlas of InheritedRetinal Diseases,编辑Tsang SH,Sharma T(Springer International Publishing,Cham),第227-232页中。
附图说明
图1A-图1E展示了每个RPE的LF颗粒含量随着年龄的增长不间断地增加。图1A：来自年轻和年老WT和DKO小鼠的平面封片的RPE视杯的自发荧光图像。将10X单个视场拼接在一起并按以下方向显示：背侧-顶部；腹侧-底部；鼻侧-右方；颞侧-左方，条＝1mm。插图显示了来自赤道中部区域(central-equatorial area)的RPE的高放大倍率视图，其中黄色对应于LF颗粒，红色对应于ZO1边界，并且蓝色对应于用Hoechst染色的细胞核，条＝10μm。图1B：通过63X显微镜定量的每个RPE的LF荧光。用鬼笔环肽可视化边界，并且用ImageJ手动选择单个细胞。每个点是8个月和33个月WT(n＝5)；3个月DKO(n＝4)；8个月DKO(n＝6)；13个月DKO(n＝4)；26个月DKO(n＝5)RPE在中央视网膜中的整合自发荧光/细胞。3月龄DKO中的LF含量高于33个月WT中的LF含量(p<0.01)。此外，所有DKO年龄组之间的LF/细胞显著不同(WT8MS相比于WT 33MS，p<0.05；DKO 3MS相比于WT 33MS，p<0.01；p<0.001；DKO 8MS/DKO 13MS/DKO 26MS相比于WT 33MS，p<0.0001)。图1C：RPE层中脂褐素的63X图像，并且脂褐素在600d和700d时没有下降。图1D：鬼笔环肽细胞骨架(红色)和LF颗粒(黄色)的63X图像，以观察与LF积聚相关的结构异常，条＝10μm。图1E：不同年龄的DKO小鼠的RPE中A2E含量的HPLC定量。每个点是一只眼睛中的含量。条表示每个年龄组的中位数。
图2A-图2H展示了视网膜随着LF积聚的退行性变化。图2A：中央视网膜RPE的大小(μm2)。每个点是8(n＝5)和27(n＝5)个月WT以及8(n＝6)和23(n＝5)个月DKO动物中的面积/细胞。与所有其他组相比，最年老的DKO组展现出显著增大的RPE(*p<0.01，用Prism7通过非配对t检验得知)。图2B：在23月龄DKO(n＝10)和27月龄WT(n＝8)视网膜中每0.1mm间隔计数并随距ONH的距离变化绘制的RPE细胞核数。每个点的平均值(±SEM)显著不同(DKO相比于WT，p<0.05，用Prism7通过多重t检验得知)。图2C：在27月龄的DKO眼(n＝5)和WT对照眼(n＝7)中从ONH沿纵轴每0.1mm间隔测量的ONL厚度。每个位置的平均值(±SEM)显著不同(DKO相比于WT，p<0.05，用Prism7通过多重t检验得知)。图2D：来自30月龄WT(n＝3)和DKO(n＝3)小鼠的冷冻切片的代表性荧光显微图。DKO神经视网膜描绘了约1-3μm LF颗粒的大量浸润，20μm尺度。图2E：左方图像是20月龄DKO的黑色素漂白的石蜡包埋的横切片，其显示约1-3μm LF浸润物对Iba1呈强阳性。右方图像是10月龄DKO的明场/荧光叠加，其显示约1-3μm颗粒对视紫红质(红色)呈阳性，而对黑色素呈阴性(比例尺＝20μm)。图2F：800d DKO的横切片，其显示脱落的RPE(箭头)迁移到神经视网膜中。图2G：通过共聚焦显微术获得的神经视网膜平面封片和Z堆叠切片的最大投影，其显示迁移性RPE以不同深度插入光感受器层中。比例尺＝20μm。图2H：石蜡包埋的横切片上的H&E，其显示了DKO的RPE中的迁移和多层化。迁移性RPE含有黑色素，并且测量约5-10μm。DKO显示出覆盖具有迁移/增殖行为的RPE的ONL的损伤。
图2I-图2J显示了视网膜随着LF积聚的退行性变化。图2I：代表性显微镜图片显示，出现在DKO小鼠眼睛外段的小胶质细胞呈CD11b(红色)和IBA1(绿色)阳性，它也负载了LB(白色)。图2J：如通过HPLC所测定的，来自不同年龄DKO小鼠的RPE细胞显示出累积的A2E增加，直到200天，随后是较少的A2E积累。
图3A-图3B证明，光非依赖性LF细胞毒性是视网膜色素变性的主要促成因素。图3A：在完全黑暗中相比于在12h的光照/黑暗循环中饲养的动物在2与12月龄之间光感受器和RPE的损失(每种照明、年龄和基因型条件n＝6)。红色和蓝色分别对应于2和12月龄小鼠中的ONL厚度，而橙色和灰色圆圈分别是其RPE细胞核数。在该时期期间，通过双因素方差分析得知，只有DKO显示出ONL变薄和RPE损失(p<0.01)，并且在光照循环与黑暗饲养的小鼠之间是相似的。图3B：来自在黑暗或循环照明下饲养的12月龄DKO和WT的视杯的自发荧光。将来自单个视场的图像拼接在一起，用5X物镜(λexc＝430nm，λemm＝610nm)拍摄，方向为：背侧-顶部；腹侧-底部；鼻侧-右方；颞侧-左方。比例尺＝1mm。
图4A-图4I证明，光非依赖性LF细胞毒性引起非典型坏死性凋亡。图4A：研究LF黑暗毒性的细胞死亡测定。将90％汇合的ARPE-19或hfRPE在补充有所指示脂质双类视黄醇(LB)浓度的无血清培养基中孵育过夜。合并的自发荧光位于lamp2溶酶体内。通过或采用DRAQ7/NUC405的显微术在24h时评估活力。图4B：自动荧光显微术对坏死性(红色为DRAQ7＝质膜渗漏)和凋亡性(蓝色为NUC405＝半胱天冬酶3激活)细胞死亡的实时监测。图4C：洗涤剂活性的中和没有保护免受A2E的影响。与未经处理的细胞相比，10μM甲基-βCD在A2E、TRITON、含MBCD的A2E中抵消了500μMTRITON-X100(*p<0.001)。p值用Prism7.0通过t检验测定，但是不影响20μM A2E的细胞毒性。图4D：程序性坏死的效应级联的抑制。在NSA的情况下有剂量依赖性保护(p<0.01)，但是在泛半胱天冬酶、gasdermin-D和RIPK3抑制剂的情况下没有剂量依赖性保护(n＝4)。图4E：采用抗MLKL的IP仅在来自具有累积A2E的细胞的拉下物(pulldown)中显示出显著增加的激酶活性(p<0.01)，表明坏死小体(necrosome)的形成。图4F：采用抗Ser358磷酸化MLKL的蛋白质印迹，其显示了人MLKL的剂量依赖性磷酸化和聚合。图4G：坏死抑素的保护作用。坏死抑素7(Nec7)(p<0.01)而非抗RIPK1坏死抑素1、1s和5屏蔽A2E细胞毒性(n＝3)。图4H：蛋白质印迹，其显示Nec7阻止A2E对MLKL的磷酸化和聚合。图4I：ARPE-19单层的荧光图像，其显示A2E和ATRD诱导pMLKL向质膜的易位，这被Nec7阻断。
图4J-图4T显示了光非依赖性LF细胞毒性。图4J：用于测试A2E 20μM和ATRD 80μM在具有不同细胞数的ARPE199培养物中的毒性的活力测定。完全汇合的ARPE19细胞对LB细胞死亡更具抗性。图4K：增加的细胞汇合度影响被吸收到细胞中的A2E的量。图4L：使20μMA2E负载到具有不同汇合度的ARPE19细胞中持续24小时。培养细胞中的A2E/细胞量与DKO800日龄小鼠的RPE细胞中的脂褐素量相当。图4M：经受A2E处理的ARPE19和hfRPE细胞存活的比较。hfRPE细胞比ARPE19细胞对20μM、30μM和45μM的A2E更具抗性(p<0.05，t检验)。图4N：与ARPE19相比，hfRPE中的光非依赖性LF细胞毒性。图4O：病毒、toll样激动剂和TNF诱导的坏死性凋亡级联显示，该途径显著依赖于坏死性凋亡刺激物的性质。图4P：ATRD对MLKL磷酸化和聚合的剂量依赖性诱导。图4Q：MLKL的磷酸化和聚合没有被Nec1和GSL’872阻止，但是被Nec7而非Nec1消除(图4R)。图4S：RNAseq对ARPE19细胞中RIPK1、2、3和4的不同亚型的表达的分析。图4T：WB，其分析了通过用A2E、ATRD或STZ处理经历细胞死亡的HT29中pMLKL、RIPK1、RIPK3的激活。
图4U：蛋白质印迹，其显示Nec7而非Nec1阻止脂褐素材料诱导的MLKL磷酸化/聚合。图4V：黑色素不影响荧光定量。向裂解缓冲液或如M&M中所述获得的来自WT C57BL6的RPE裂解物中掺入300pmol A2E/ml，并且使用430nm/600mn荧光进行定量。图4W：暴露于A2E、ATRD和ATR的ARPE19细胞中的剂量依赖性细胞死亡。图4X：用33μM Nec1、Nec1s或Nec7预处理没有阻断因ATR的细胞死亡。图4Y：采用抗磷酸化MLKL和GAPDH的蛋白质印迹显示ATR没有改变MLKL的磷酸化状态。
图5A-图5E证明，LF坏死性凋亡不涉及氧化应激，而是涉及ER应激。图5A：抗氧化剂(如Trolox、NAC、L-Cys、Vit-C、BHA和TMB)没有从不同量的A2E中拯救ARPE-19。图5B：RNAseq/IPA分析揭示到，Nec7的保护作用主要涉及未折叠蛋白反应(UPR)途径的减少。图5C：典型UPR级联的视图，其显示Nec7下调IRE1α和PERK途径内的多个mRNA。图5D：IPA预测了用Nec7下调UPR的存活效应。
图5E证明，Nec7中和A2E的作用，如从Ctr-Nec7和A2E-Nec7在热图和PCA分析两者中的紧密聚类中明显看出的。
图6A-图6N证明，LF触发ER应激，并且IRE1α抑制剂阻断坏死性凋亡。图6A：蛋白质印迹，其显示p-eIF2a、ATF4和BiP/GRP78在没有照明的情况下被LF上调。图6B：通过qPCR检测的黑暗A2E 25μM和80μM ATRD的ATF4 mRNA诱导(n＝2)。通过qPCR检测的用A2E和ATRD诱导XBP1s的剂量(图6C)和动力学(图6D)(n＝3)。图6E：琼脂糖凝胶，其证实ARPE-19和原代hfRPE细胞两者中有XBP1剪接(n＝2)。图6F：蛋白质印迹，其显示了具有累积A2E的细胞中ATF6的切割。图6G：qPCR，其显示Nec7阻断XBP1s(IRE1α分支)。图6H：蛋白质印迹，其显示Nec7也阻断CHOP(在PERK的下游)，并且Nec1和GSK’872都不影响UPR，这与它们缺乏针对坏死性凋亡的保护是一致的。图6I：用shRNA单独敲低ER应激传感器/效应物后经受LF的ARPE-19细胞的活力。只有IRE1α敲低才赋予针对A2E和ATRD的保护(p<0.05，n＝3)。图6J：选择性抑制IRE1α激酶和/或RNA酶激活没有针对LF的保护作用，但是阻断IRE1α二聚化的药物(KIRA)增加了存活率。图6K：蛋白质印迹，其显示IRE1α抑制剂KIRA6阻止LF诱导的MLKL磷酸化和聚合。图6L：积累LF并用KIRA6处理的ARPE19细胞的免疫染色显示出pMLKL质膜易位的抑制。图6M：KIRA6和Nec7在hfRPE中促进经受LF但存活的有效性。图6N：qPCR，其证实LF诱导XBP1剪接，并且其在hfRPE中被Nec7阻止。
图6O证明，抗氧化剂不能阻止LF诱导的UPR。WB显示，LF诱导的IRE1α的光非依赖性磷酸化在NAC的存在下不受影响地进行。
图7A-图7F显示了DKO视网膜中的ER应激和坏死性凋亡。图7A：来自如图中所指示年龄的DKO的赤道中部RPE中的用抗XBP1s(红色)和核DAPI(蓝色)免疫染色的平面封片的RPE视杯。XBP1s在年老WT中可忽略不计，但是在2月龄DKO中可检测到并且随着年龄的增长而变得更强。条＝20μm(每组n＝3)。图7B：用抗磷酸化Ser345-MLKL(红色)和核DAPI(蓝色)监测的ER应激在最年老组中显示出与年龄相关的定位至质膜的标记的增加(n＝3)，比例尺＝20μm。图7C：脱黑石蜡横切片，其显示了RPE层和小的约1-3μm Iba1+细胞中的XBP1s(绿色)和pMLKL(红色)的共表达。图7D：视网膜下间隙中的共表达Iba1(红色)/XBP1s(绿色)或Iba1(红色)/MLKL(绿色)的Iba1+细胞，比例尺＝20μm。图7E：具有大“斑点(fleck)”的大面积的神经视网膜的全景视图。将神经视网膜平面封片用抗pMLKL(红色)进行免疫染色。一个值得注意的特征是RPE浸润物周围的ONL层中的pMLKL晕(halo)。图7F：是图7E中所指示的正方形区域的放大视图，在z轴上投影的最大值显示坏死性凋亡信号围绕侵入的RPE片段在所有方向上传播。
图7G-图7I显示了RPE细胞中的ER应激和坏死性凋亡。图7G：示例性免疫荧光共聚焦图像，其显示了来自700天小鼠的RPE平面封片样品上的p-MLKL(红色)、XBP1s(绿色)和LB(白色)的共定位(n＝3)。条＝20μm。图7H：单次眼内注射1μl Nec7降低视网膜中的pMLKL水平，如来自经处理DKO的RPE平面封片中所示。图7I：700日龄DKO的经媒介物和Nec7处理的眼睛的上半视网膜中每0.1mm间隔测量并随距ONH的距离变化绘制的pMLKL的平均荧光强度(MFI)图；(通过Image J定量，**p<0.01，模拟相比于KIRA6，n＝3；在GraphPad Prism中通过双因素方差分析测定)。
图7J：附着在来自20月龄DKO视网膜的RPE平面封片的视杯上的小胶质细胞/巨噬细胞对磷酸化MLKL染色呈阳性。图7K：富含脂褐素(黄色)并具有强烈迁移活性的RPE区域中的磷酸化MLKL染色(红色)。
图7L：单次玻璃体内注射Nec7而非Nec1消除了20月龄DKO视网膜中的磷酸化MLKL染色(n＝4)。图7M：代表性神经视网膜平面封片，其显示了1周前接受眼内Nec7后光感受器层中磷酸化MLKL的减少。图7N：1周前接受玻璃体内注射2μl媒介物(对照)或Nec7的18至20月龄DKO中的RPE平面封片上的CD11b细胞的视网膜下浸润，条＝20μm。
图8A-图8E证明，IRE1α抑制剂减少具有LF的视网膜中的炎症和坏死性凋亡。图8A：玻璃体内注射KIRA6减少DKO视网膜中的ER应激。来自分别用1μl媒介物(模拟)或KIRA6处理的17月龄DKO的右眼(OD)和左眼(OS)的RPE平面封片沿纵轴的中心到外周图像。针对XBP1s的免疫染色以绿色描绘。条＝20μm。插图是这些眼睛的中央视网膜RPE的放大视图。条＝20μm。600日龄DKO的经媒介物和KIRA6处理的眼睛的上半视网膜中每0.1mm间隔测量并随距ONH的距离变化绘制的XBP1s(绿色)免疫染色的平均荧光强度(MFI)图；(通过Image J定量，**p<0.01，模拟相比于KIRA6，n＝3；在GraphPad Prism中通过双因素方差分析测定)。图8B：来自512日龄DKO的右眼(对照)和左眼(经处理的)的RPE平面封片沿纵轴的中心到外周图像。小鼠每只眼睛接受单次玻璃体内注射1μl媒介物或KIRA6。坏死性凋亡的pMLKL标记物(红色)显著减少(n＝3)。条＝20μm。插图是这些眼睛的中央视网膜RPE的放大视图，尺度20μm。512日龄DKO的经媒介物和KIRA6处理的眼睛的上半视网膜中每0.1mm间隔测量并随距ONH的距离变化绘制的pMLKL(红色)免疫染色的平均荧光强度(MFI)图；(通过Image J定量，**p<0.01，模拟相比于KIRA6，n＝3；在GraphPad Prism中通过双因素方差分析测定)。图8C：点图，其表示600天DKO的冷冻切片中XBP1s/pMLKL双阳性细胞的百分比。顶图为OD-经媒介物处理，并且底图为OS-经KIRA6处理。图8D：KIRA6减少800d DKO中浸润视网膜外层的Iba-1+小胶质细胞/巨噬细胞数(n＝3)。图8E：qPCR，其显示了KIRA6对在光感受器变性期间上调的转录物的正常化。图8F显示了如通过qPCR所检测的，WT和DKO小鼠中正在进行的视网膜变性的多种标记物的比较。
图9A显示了解释Salubrinal(和SAL003)保护免受视网膜脂褐素影响的示例性模型。图9B显示了本发明技术的组合物保护免受光非依赖性脂褐素细胞毒性影响的示例性作用机制。脂褐素形成固体晶体，当量大时其穿透溶酶体膜并引起LMP。溶酶体酶的释放触发使MLKL磷酸化的非典型坏死小体的形成，促进其低聚化和膜易位。磷酸化MLKL使溶酶体膜不稳定，促进更多的LMP。当质膜中的磷酸化MLKL水平变得无法耐受时，细胞经历坏死性凋亡。
图10显示了本文所述的实施例中使用的抗体。
图11显示了本文所述的实施例中使用的引物序列。
图12显示了本文所述的实施例中使用的化学抑制剂。
图13显示了本文所述的实施例中使用的抗体和荧光探针。
图14A：在没有照明的情况下，在ARPE19的线粒体中检测到细胞ROS(红色)，但是在脂褐素颗粒中没有检测到(绿色)。只有在蓝光暴露后，ROS才与脂褐素共定位。图14B：A2E(MW＝592)不能通过0.45μm过滤器，表明它形成聚集体。图14C：不形成聚集体的分子的MW与膜截止值之间的相关性。图14D：DIC和自发荧光(绿色)揭示了细胞中与溶酶体示踪剂(红色)共染色的有明显边界的A2E颗粒。黄色由绿色-红色重叠产生。图14E：将溶剂在盖玻片上蒸发后的A2E晶体。图14F：用以评价溶酶体膜损伤的半乳糖凝集素3斑点(puncta)测定。阳性对照LLO和A2E两者都诱导了溶酶体膜透化(LMP)。图14G：暴露于不同剂量LLO的细胞中组织蛋白酶D的失活。图14H：具有不同量A2E的细胞中的组织蛋白酶D。图14I：组织蛋白酶D活性的损失可以用阿瑞洛莫或坏死抑素7来阻止。图14J：阿瑞洛莫或Nec7促进经受A2E积累的存活。图14K：LMP诱导剂LLO促进可用Nec7和阿瑞洛莫而非Nec1阻止的非典型坏死性凋亡。
图15A：热图，其描绘了含有脂褐素(15μM-24h A2E，负载过夜)的细胞相比于健康对照中通过质谱法检测的蛋白质水平。上调和下调水平分别用橙色到蓝色标度表示。图15B：使用Ingenuity Pathway(IPA)的因果网络关联和分级聚类分析，其鉴定了脂褐素诱导的细胞过程。基于皮尔逊相关度量和平均聚类方法构建的树状图表明，亚致死量的脂褐素主要诱导抗坏死性凋亡反应。统计显著性(表示为用IPA的右尾费希尔精确检验获得的p值的负底数-10对数)是通过IPA鉴定的细胞过程或信号传导途径不是偶然的概率。-log(p值)由圆圈的直径显示。IPA还分配了z得分，其预测细胞/信号传导途径的整体激活/抑制状态，此处指示为圆圈的颜色(蓝色-橙色标度)。图15C：Ingenuity软件对负责被脂褐素占据的细胞中的坏死性凋亡细胞死亡抑制和存活的主要信号传导级联(eIF2a、eIF4、mTOR、泛素-蛋白酶体系统(UPS)、整合素信号传导(IS)和上皮粘附连接重塑(REAJ))的鉴定。圆圈大小和颜色分别表示调节的统计显著性(-log(p值))和方向。图15D：由eIF2a、eIF4、mTOR、泛素-蛋白酶体系统(UPS)、整合素信号传导(IS)和上皮粘附连接重塑(REAJ)单独控制的细胞过程的IPA分析。图15E：IPA对eIF2a、eIF4、mTOR和UPS抵消脂褐素坏死毒性的分子过程的鉴定。
图16A：脂褐素调节的蛋白质的身份及其与前几种抗坏死性凋亡信号传导途径eIF2a、eIF4、mTOR和UPS的关联。数据表明，通过蛋白质翻译和泛素化起始的变化，细胞的蛋白质组学发生了明显的重塑。图16B：导致亚致死量的脂褐素诱导的ER中合成的蛋白质的降解的分解代谢机器增加的标志。
图17：脂褐素在体内诱导的信号传导途径的IPA分析。使用通过批量RNAseq(bulkRNAseq)检测的mRNA水平差异的Ingenuity Pathway Analysis的来自100天与800天ABCA4-/-RDH8-/-双敲除(DKO)小鼠的RPE/脉络膜之间的比较。
图18A：将ARPE19细胞用以下的激动剂预处理1h：eIF2a(Salubrinal(SAL)、SAL003或胍那苄)；eIF4(布瑞西利(Briciclib)或eFT508)；mTOR(雷帕霉素、Torin-1)；或非特异性蛋白质翻译抑制剂(环己酰胺，CHX)，然后在这些药物的存在下与致死剂量的A2E(25μM)再一起孵育24h。用评估活力。只有靶向由与GADD34或CreP(催化亚基)结合的PP1组成的两种细胞eIF2α磷酸酶的SAL和SAL003才保护免受脂褐素的影响。相比之下，仅破坏PP1-GADD34结合的胍那苄或eIF4和mTOR激活剂没有赋予显著的保护。图18B：SAL保护免受增加剂量的A2E或全反式视黄醛二聚体(ATRD)的影响，A2E和全反式视黄醛二聚体(ATRD)是视网膜脂褐素中最丰富的双类视黄醇中的两种。用评估活力。图18C：SAL没有保护免受脂质双类视黄醇的光毒性分解的影响。将ARPE-19细胞与无毒量的A2E(5μM)一起孵育过夜以允许其掺入溶酶体中，并且在将培养基换为PBS并用蓝光辐照10min后，将细胞在Optimem中再维持24h，之后使用评价活力。图18D：在Optimem中与致死量的A2E(25μM)一起孵育24h的细胞的荧光显微图。绿色荧光对应于A2E沉积物。将细胞核在活细胞中用DNA染料Hoechst进行染色(蓝色)，并且在死细胞中用Hoechst和DRAQ7(一种只进入膜破裂细胞的DNA染料)进行染色(紫色)。
图19A：由于SAL是eIF2a的已知激活剂(通过保留其磷酸化状态)，并且PERK是eIF2a激酶，在存在(或不存在)强效且具特异性的PERK抑制剂(GSK2606414)的情况下，将ARPE19细胞用SAL预处理1h，随后在这些药物的存在下与致死剂量的A2E(25μM)再一起孵育24h。用评估活力。图19B：敲低ATF4没有阻止SAL保护免受脂褐素的影响。由于ATF4是PERK的主要下游效应物，将ARPE-19细胞用表达乱序(scramble)-shRNA或ATF4-shRNA的慢病毒转导48h，然后在存在或不存在SAL的情况下与25μM A2E再一起孵育24h。用评估活力。
图20A：剪接XBP1(XBP1s)的水平(通过定量实时PCR测量为IRE1a活性的读数)随着细胞中累积的脂褐素的量以剂量依赖性方式增加。IRE1a活性可以通过用SAL处理来消除。IRE3是IRE1a的强效抑制剂，此处用作对照。图20B：磷酸化MLKL(绿色)的免疫荧光染色，其显示经历因A2E或ATRD的坏死性凋亡的细胞显示出磷酸化MLKL膜定位，这可以通过用SAL处理来消除。将IRE3用作IRE1a抑制的阳性对照。
具体实施方式
应理解，下文以不同详细程度描述了本发明方法的某些方面、模式、实施方案、变化形式和特征，以提供对本发明技术的实质性理解。
在实践本发明方法时，使用了分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。参见例如，Sambrook和Russell编辑(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版；丛书Ausubel等人编辑(2007)CurrentProtocols in Molecular Biology；丛书Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；MacPherson等人(1991)PCR 1:A Practical Approach(IRL Press at OxfordUniversity Press)；MacPherson等人(1995)PCR 2:A Practical Approach；Harlow和Lane编辑(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique,第5版；Gait编辑(1984)OligonucleotideSynthesis；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编辑(1984)Nucleic AcidHybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins编辑(1984)Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press(1986))；Perbal(1984)A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller和Calos编辑(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring HarborLaboratory)；Makrides编辑(2003)Gene Transfer and Expression in MammalianCells；Mayer和Walker编辑(1987)Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology(Academic Press,London)；以及Herzenberg等人编辑(1996)Weir’s Handbook ofExperimental Immunology。检测和测量多肽基因表达产物水平(即，基因翻译水平)的方法是本领域熟知的，并且包括使用多肽检测方法，如抗体检测和定量技术。(还参见，Strachan和Read,Human Molecular Genetics,第二版(John Wiley and Sons,Inc.,NY,1999))。
提供了用于维持患有斯塔加特病(STGR1和STGR3)、卵黄状黄斑变性(贝斯特黄斑营养不良或贝斯特病)、常染色体隐性视锥视杆细胞营养不良(ar-CRD)和常染色体隐性视网膜色素变性(ar-RP)(继发于ABCA4或RDH12基因的突变)的受试者，最后是患有干性年龄相关性黄斑变性(干性AMD)、脉络膜黑色素瘤或与眼底自发荧光(FAF)增加相关的严重眼外伤的个体的RPE层的活力的方法和组合物(C.J.Kennedy等人,Eye(Lond).9(第6部分)(1995)763-71；S.K.Verbakel等人,Prog.Retin.Eye Res.66(2018)157-186；M.a vanDriel等人,Ophthalmic Genet.19(1998)117-122；A.Maugeri等人,Am.J.Hum.Genet.67(2000)960-966；A.V.Cideciyan等人,Hum.Mol.Genet.13(2004)525-534)。
光感受器中过度的ER应激仅与常染色体显性形式的视网膜色素变性(adRP)相关，但是从未与常染色体隐性视网膜色素变性(arRP)相关。Comitato等人,Human MolecularGenetics,第25卷,第13期2801-2812(2016)。化学伴侣(即，增加细胞中的折叠能力并降低所有(IRE1α、PERK和ATF)UPR传感器的活性的药物)对于adRP而言是有益的(S.X.Zhang等人,Exp.Eye Res.125(2014)30-40；M.S.Gorbatyuk等人,Prog.Retin.Eye Res.(2020)100860)，但是对脂褐素引起的ER应激没有影响。另外，用Salubrinal治疗实际上增加了adRP视网膜中的IRE1α活性(Comitato等人,Human Molecular Genetics,第25卷,第13期2801-2812(2016))，而本文的实施例证明，Salubrinal降低了由于脂褐素引起ER应激的细胞中的相同活性。
在另一种由于施用氧化应激引起剂诱导的ER应激引起的视网膜变性模型中，抑制IRE1α结果是有害的(S.X.Zhang等人,Exp.Eye Res.125(2014)30-40；T.McLaughlin等人,Mol.Neurodegener.13(2018)1-15)。虽然IRE1α的KIRA抑制剂已被证明可用于保护具有大量错误折叠蛋白质的光感受器免受细胞凋亡的影响(大多数adRP病例)(R.Ghosh等人,Cell.(2014)1-15；H.C.Feldman等人,ACS Chem.Biol.11(2016)2195-2205)，但是从未用于保护RPE免受脂质细胞毒性的影响。
本公开文本的方法基于以下意想不到的发现，这些发现挑战了脂褐素发病机制领域的当前教条：1)脂质双类视黄醇使它们被捕获的溶酶体渗漏(溶酶体膜透化(LMP)增加)；2)胞质脂褐素触发未折叠蛋白反应(UPR)；3)脂褐素引发的UPR经由ER应激传感器IRE1α诱导使MLKL磷酸化的非典型坏死小体的形成。磷酸化MLKL随后自组装成破坏ER、溶酶体和质膜的孔，产生放大环路“ER应激磷酸化MLKL”，这最终导致被脂褐素占据的细胞的坏死。脂褐素引发的细胞死亡途径与先前报道的细胞死亡机制根本不同，因为它不涉及氧化应激、细胞凋亡或含有RIPK1和RIPK3激酶的经典坏死小体。
本公开文本的方法保留了患有脂褐素病状的受试者的视觉功能，所述脂褐素病状如斯塔加特病(STGD)、常染色体隐性视网膜色素变性(RP)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、贝斯特病(BD)或常染色体隐性视锥视杆细胞营养不良：i)通过施用有效量的KIRA化合物(例如，KIRA3、KIRA6、KIRA7、KIRA8)；ii)通过施用有效量的Salubrinal衍生物；iii)通过施用有效量的坏死抑素7、坏死磺酰胺(NSA)、达拉非尼或阿瑞洛莫，它们抑制磷酸化MLKL的形成，因此中断“磷酸化MLKL→ER应激→IRE1α→磷酸化MLKL”环路。这些策略可以单独应用或组合应用，以阻止退行性过程。
上述方法与迄今为止用于保护视网膜免受脂褐素细胞毒性影响的所有先前尝试完全不同，所述先前尝试包括阻断脂质双类视黄醇形成、使用抗凋亡剂、抗氧化剂或遮光镜片。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科技术语通常都具有与本技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确规定。例如，对“一个/一种细胞”的提及包括两个/两种或更多个/更多种细胞的组合，等等。通常，本文所用的命名和下文所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学以及核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域熟知且常用的那些。
如本文所用，关于数字的术语“约”通常视为包括落在所述数字任一方向(大于或小于)的1％、5％或10％范围内的数字，除非上下文另外说明或另外明显看出(这样的数字低于可能值的0％或超过可能值的100％的情况除外)。
如本文所用，向受试者“施用”药剂或药物包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行，所述合适的途径包括但不限于口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠、鞘内或局部。施用包括自我施用和由另一人施用。
如本文所用，术语“生物样品”意指源自活细胞的样品材料。生物样品可以包括从受试者分离的组织、细胞、细胞的蛋白质或膜提取物和生物流体(例如，腹水或脑脊液(CSF))，以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。本发明技术的生物样品包括但不限于取自以下的样品：眼睛、乳腺组织、肾组织、子宫颈、子宫内膜、头或颈、胆囊、腮腺组织、前列腺、脑、脑下垂体、肾脏组织、肌肉、食管、胃、小肠、结肠、肝脏、脾脏、胰腺、甲状腺组织、心脏组织、肺组织、膀胱、脂肪组织、淋巴结组织、子宫、卵巢组织、肾上腺组织、睾丸组织、扁桃体、胸腺、血液、毛发、颊、皮肤、血清、血浆、CSF、精子、前列腺液、精液、尿液、粪便、汗液、唾液、痰、粘液、骨髓、淋巴和泪液。生物样品也可以从内脏的活检获得。生物样品可以从受试者获得以进行诊断或研究；或者可以从未患病的个体获得，作为对照或用于基础研究。样品可以通过标准方法来获得，所述标准方法包括例如静脉穿刺和手术活检。在某些实施方案中，生物样品是通过针吸活检获得的组织样品。
如本文所用，“对照”是在实验中用于比较目的的替代性样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。例如，在实验目的是确定治疗剂对特定类型疾病的治疗的功效的相关性的情况下，通常采用阳性对照(已知展现出所需治疗效果的化合物或组合物)和阴性对照(不接受治疗或接受安慰剂的受试者或样品)。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现所需的治疗和/或预防效果的量，例如导致预防或减少本文所述的疾病或病症或者与本文所述的疾病或病症相关的一种或多种体征或症状的量。在治疗性或预防性应用的背景下，施用至受试者的组合物的量将根据组合物、疾病的程度、类型和严重程度以及根据个体的特征(如一般健康状况、年龄、性别、体重和药物耐受性)而变化。熟练技术人员将能够根据这些和其他因素确定适当的剂量。也可以将组合物与一种或多种另外的治疗性化合物组合施用。在本文所述的方法中，可以将治疗性组合物施用至具有本文所述的疾病或病症的一种或多种体征或症状的受试者。如本文所用，组合物的“治疗有效量”是指疾病或病症的生理影响得到改善或消除的组合物水平。可以在一次或多次施用中给予治疗有效量。
如本文所用，“表达”包括以下中的一项或多项：基因转录成前体mRNA；前体mRNA的剪接和其他加工以产生成熟mRNA；mRNA稳定性；成熟mRNA翻译成蛋白质(包括密码子使用和tRNA可用性)；以及翻译产物的糖基化和/或其他修饰(如果正确表达和功能需要的话)。
如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”可以是单独的生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在一些实施方案中，个体、患者或受试者是人。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌化合物和抗真菌化合物、等渗化合物和吸收延迟化合物等。药学上可接受的载体及其配制品是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Remington'sPharmaceutical Sciences(第20版,编辑A.Gennaro,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.)中。药学上可接受的载体的例子包括可用于将活性剂引入体内的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或者硬脂酸)或溶剂包封材料。
如本文所用，对障碍或病症的“预防(prevention)”、“预防(prevent)”或“预防(preventing)”是指这样的一种或多种化合物，其在统计样本中，相对于未经处理的对照样品，降低经处理的样品中障碍或病症的发生率，或者相对于未经处理的对照样品，延迟障碍或病症的一种或多种症状的发作。
如本文所用，术语“分开”治疗使用是指通过不同途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所用，术语“依序”治疗使用是指在不同时间施用至少两种活性成分，施用途径相同或不同。更具体地，依序使用是指完整地施用一种活性成分之后才开始施用其他一种或多种活性成分。因此，可以在施用一种或多种其他活性成分前几分钟、几小时或几天内施用一种活性成分。在这种情况下，不存在同时治疗。
如本文所用，术语“同时”治疗使用是指通过相同途径并且同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所用的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”涵盖对受试者(如人)的本文所述的疾病或障碍的治疗，并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或障碍，即使障碍消退；(iii)减缓障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或障碍的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中，治疗意指与疾病相关的症状例如得到缓和、减轻、治愈或处于缓解状态。
还应理解，如本文所述的障碍的各种治疗方式旨在意指“基本上的”，其包括完全治疗以及不到完全治疗，并且其中实现了一些生物学或医学上相关的结果。治疗可以是针对慢性疾病的连续长期治疗，或者是治疗急性病症的单次或几次施用。
与视网膜细胞脂褐素细胞毒性相关的眼病
脂褐素随着年龄而积累，并且可能由于遗传素质和某些潜在的病症而增加。参见Molday RS,Zhong M,Quazi F,Biochim Biophys Acta 1791(7):573-83(2009)；ZaneveldJ等人Genet Med 17(4):262-270(2015)；Allikmets R等人,Science 277(5333):1805-7(1997)；van Driel M a,Maugeri a,Klevering BJ,Hoyng CB,Cremers FP,OphthalmicGenet 19(3):117-122(1998)；Fishman GA,Ophthalmic Genet 31(4):183-9(2010)；LimLS,Mitchell P,Seddon JM,Holz FG,Wong TY,Lancet 379(9827):1728-1738(2012)；Swaroop A,Chew EY,Rickman CB,Abecasis GR,Annu Rev Genomics Hum Genet 10:19-43(2009)；Charbel Issa P,Barnard AR,Herrmann P,Washington I,MacLaren RE(2015)Proc Natl Acad Sci 112(27):8415-20(2017)。ABCR突变可能发生在患有年龄相关性黄斑变性(AMD)、斯塔加特病、眼底黄色斑点症、视锥细胞营养不良(COD，其中只有视锥细胞经历变性)和视锥视杆细胞营养不良(CRD，其中视杆细胞和视锥细胞两者都经历变性)和视网膜色素变性的患者中。此类ABCR突变的例子包括但不限于ABCA4 D2177N、ABCA4 G1961E、ABCA4 G863A、ABCA4 1847delA、ABCA4 L541P、ABCA4 T2028I、ABCA4 N247I、ABCA4 E1122K、ABCA4 W499*、ABCA4 A1773V、ABCA4 H55R、ABCA4 A1038V、ABCA4 IVS30+1G→T、ABCA4IVS40+5G→A、ABCA4 IVS14+1G→C、ABCA4 F1440del1cT以及Allikmets R等人,Science277(5333):1805-7(1997)中披露的突变。
视网膜色素变性(RP)是一组光感受器细胞死亡的疾病。RP是最常见的遗传性视网膜营养不良(IRD)，全球患病率为大约1:4000(S.K.Verbakel等人,Prog.Retin.EyeRes.66,157-186(2018))。RP可以以常染色体显性、常染色体隐性或X连锁方式遗传。到目前为止，已有40多个基因与RP相关，其中大多数在光感受器或视网膜色素上皮中表达。该疾病的巨大异质性使RP的遗传学变得复杂。Ferrari等人,Current Genomics,12,238-249(2011)。
典型的眼底异常包括主要位于视网膜外周和/或赤道部的骨针状色素沉着，这就是该疾病名字的由来。典型的骨针状深色色素沉着可用检眼镜观察到，并且代表在光感受器变性后从布鲁赫膜分离并迁移到视网膜内血管周部位(在那里它们在血管周围形成黑色素沉积物)的RPE细胞。这些骨针状体通常出现在赤道部，那里的视杆细胞浓度最高。究竟是什么触发了RPE迁移还不得而知，但是由于光感受器的变性，怀疑视网膜内部血管与RPE之间的距离减小促进了迁移。几乎所有形式的RP都经历视网膜中不存在色素变化的阶段。在典型的RP体征出现前，这个阶段可能存在数十年。
由于ABCA4或RDH12基因的突变，存在两种常染色体隐性RP亚型，它们是非常严重的RP形式，在生命早期即发病(R.F.Mullins等人,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.53,1883-94(2012)；A.Schuster等人,Investig.Ophthalmol.Vis.Sci.48,1824-1831(2007))。一项在亚洲群体中进行的研究揭示到，它们分别占所有RP病例的至少3％和2％(L.Huang等人,Sci.Rep.7,1-10(2017))。此类RDH12突变的例子包括但不限于RDH12 p.G127X、RDH12p.Q189X、RDH12 p.Y226C、RDH12 p.A269GfsX1、RDH12 p.L274P、RDH12 p.R65X、RDH12p.H151D、RDH12 p.T155I、RDH12 p.V41L、RDH12 p.R314W和RDH12 p.V146D。与常染色体显性RP不同，常染色体隐性RP的特征在于RPE中的视网膜脂褐素含量高。
本发明技术的治疗方法
本公开文本提供了在视网膜细胞中保护免受脂褐素细胞毒性影响的组合物，例如阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003或其药学上可接受的盐。
在一方面，本公开文本提供了用于预防或治疗有需要的受试者的与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的眼病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的选自以下的至少一种治疗剂：达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、阿瑞洛莫、激酶抑制性RNA酶衰减剂(KIRA)化合物、salubrinal、SAL003及其任何药学上可接受的盐，其中与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的眼病是常染色体隐性视网膜色素变性(RP)、斯塔加特病(STGD)、贝斯特病(BD)、视锥视杆细胞营养不良或ABCA4突变型年龄相关性黄斑变性(AMD)。KIRA化合物的例子包括但不限于KIRA3、KIRA6、KIRA7或KIRA8。在一些实施方案中，受试者包含ABCA4和/或RDH12的突变。ABCA4和/或RDH12的突变可以是纯合的或杂合的。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，有效量的所述至少一种治疗剂的施用防止受试者的视网膜细胞中脂褐素相关细胞毒性的恶化。
在另一方面，本公开文本提供了用于预防或治疗有需要的受试者的与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的ABCA4突变型眼病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的坏死抑素7(Nec7)或其药学上可接受的盐，其中与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的ABCA4突变型眼病是常染色体隐性视网膜色素变性(RP)、视锥视杆细胞营养不良或年龄相关性黄斑变性(AMD)。在一些实施方案中，有效量的Nec7或其药学上可接受的盐的施用防止受试者的视网膜细胞中脂褐素相关细胞毒性的恶化。
在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，眼病是遗传性的、非遗传性的或与衰老相关的。在本文公开的方法的一些实施方案中，AMD是干性AMD。在本文公开的方法的其他实施方案中，视锥视杆细胞营养不良是常染色体隐性视锥视杆细胞营养不良。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，受试者携带选自以下的至少一个ABCA4突变：ABCA4 D2177N、ABCA4 G1961E、ABCA4 G863A、ABCA41847delA、ABCA4L541P、ABCA4 T2028I、ABCA4 N247I、ABCA4 E1122K、ABCA4 W499*、ABCA4 A1773V、ABCA4H55R、ABCA4 A1038V、ABCA4 IVS30+1G→T、ABCA4IVS40+5G→A、ABCA4 IVS14+1G→C和ABCA4F1440del1cT。在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，受试者携带选自以下的至少一个RDH12突变：RDH12 G127*、RDH12Q189*、RDH12 Y226C、RDH12 A269Gfs*、RDH12 L274P、RDH12 R65*、RDH12 H151D、RDH12 T155I、RDH12 V41L、RDH12 R314W和RDH12 V146D。视锥视杆细胞营养不良。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，本发明技术的所述至少一种治疗剂(例如，达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐)减少或消除脂褐素双类视黄醇(LB)脂质诱导的MLKL的磷酸化和/或聚合。在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，本发明技术的所述至少一种治疗剂(例如，达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐)逆转LB脂质诱导的磷酸化MLKL(pMLKL)向视网膜色素上皮细胞中的质膜的易位。在某些实施方案中，LB脂质选自N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)、A2E异构体、A2E的氧化衍生物和全反式视黄醛二聚体(ATRD)。
在本文公开的方法的任何前述实施方案中，本发明技术的所述至少一种治疗剂(例如，达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐)降低与视网膜变性、炎症/血管生成、ER应激和/或坏死性凋亡相关的一种或多种基因的mRNA或蛋白质水平。与视网膜变性、炎症/血管生成、ER应激和/或坏死性凋亡相关的基因的例子包括但不限于EDN2、FGF2、GFAP、SERP、VEGF、CXCL15、XBP1s、SCAND1、CEBPA和HMGA。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，本发明技术的所述至少一种治疗剂(例如，达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐)抑制或减轻脂褐素诱导的坏死性凋亡和/或减少视网膜色素上皮细胞中激活的小胶质细胞/巨噬细胞的浸润。
在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，将本发明技术的所述至少一种治疗剂(例如，达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐)经由局部、玻璃体内、眼内、视网膜下或巩膜下施用来施用。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，本发明技术的所述至少一种治疗剂(例如，达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐)与靶向视网膜色素上皮细胞的药剂缀合。靶向视网膜色素上皮细胞的药剂的例子包括但不限于他莫昔芬、氯喹(CQ)/羟氯喹(HCQ)、乙胺丁醇(EMB)或碘酸钠(NaIO3)。RPE靶向剂的其他例子描述于Crisóstomo S,Vieira L,Cardigos J(2019)Retina:23-28；Michaelides M(2011)ArchOphthalmol 129(1):30；Tsai RK,He MS,Chen ZY,Wu WC,Wu WS(2011)Mol Vis 17(6月):1564-1576；MacHalińska A等人(2010)Neurochem Res 35(11):1819-1827；Tsang SH,Sharma T(2018)Drug-Induced Retinal Toxicity.Atlas of Inherited RetinalDiseases,编辑Tsang SH,Sharma T(Springer International Publishing,Cham),第227-232页中。
术语“药学上可接受的盐”意指可接受用于施用至患者(如哺乳动物)的从碱或酸制备的盐(例如，对于给定的剂量方案具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。然而，应理解，不需要盐是药学上可接受的盐，如不旨在用于施用至患者的中间化合物的盐。药学上可接受的盐可以源自药学上可接受的无机或有机碱以及药学上可接受的无机或有机酸。另外，当本发明技术的一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)含有碱性部分(如胺、吡啶或咪唑)和酸性部分(如羧酸或四唑)两者时，可以形成两性离子并且其被包括在如本文所用的术语“盐”内。
在一个实施方案中，本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)可以含有一个或多个碱性官能团(如氨基或烷基氨基)，从而可以通过与药学上可接受的酸反应而形成药学上可接受的盐。这些盐可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过以下方式来制备：使呈其游离碱形式的纯化的本发明技术的化合物与合适的有机或无机酸单独反应，并且分离由此在后续纯化期间形成的盐。在另一个实施方案中，本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)可以含有一个或多个酸性官能团，从而可以通过与药学上可接受的碱反应而形成药学上可接受的盐。这些盐也可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过以下方式来制备：使呈其游离酸形式(例如，羟基或羧基)的纯化的化合物与合适的碱单独反应，并且分离由此在后续纯化期间形成的盐。
源自药学上可接受的无机碱的盐包括铵盐、铝盐、钙盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐、亚锰盐、钾盐、钠盐和锌盐等。源自药学上可接受的有机碱的盐包括以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺，包括经取代的胺、环状胺、天然存在的胺等，如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、乙胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、二乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡萄糖胺(glucamine)、葡糖胺(glucosamine)、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡萄糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。源自药学上可接受的无机酸的盐包括以下的盐：硼酸、碳酸、氢卤酸(氢溴酸、盐酸、氢氟酸或氢碘酸)、硝酸、磷酸、氨基磺酸和硫酸。源自药学上可接受的有机酸的盐包括以下的盐：脂肪族羟酸(例如，柠檬酸、葡糖酸、羟乙酸、乳酸、乳糖酸、苹果酸和酒石酸)、脂肪族一元羧酸(例如，乙酸、丁酸、甲酸、丙酸和三氟乙酸)、氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、芳香族羧酸(例如，苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、对氯苯甲酸、二苯乙酸、龙胆酸、马尿酸和三苯基乙酸)、芳香族羟酸(例如，邻羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、1-羟基萘-2-甲酸和3-羟基萘-2-甲酸)、抗坏血酸、二羧酸(例如，富马酸、马来酸、草酸和琥珀酸)、葡糖醛酸、扁桃酸、粘酸、烟酸、乳清酸、双羟萘酸、泛酸、磺酸(例如，苯磺酸、樟脑磺酸、乙二磺酸(edisylic)、乙磺酸、羟乙磺酸、甲磺酸、萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸和对甲苯磺酸)、羟基萘甲酸(xinafoicacid)、戊酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、月桂酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、草酸、富马酸、苯基乙酸、异硫羰酸(isothionic)、琥珀酸、酒石酸、谷氨酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、萘酸(napthylic)、乳糖酸、葡糖酸、月桂基磺酸等。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，有效量的本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐的施用防止受试者的脂褐素相关视网膜细胞毒性的恶化。在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，有效量的本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐的施用阻断、减轻或逆转视网膜色素上皮细胞中的脂褐素相关细胞毒性。
在本文公开的方法的一些实施方案中，有效量的本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐的施用预防受试者的RPE细胞中的脂褐素相关损伤或与脂褐素相关损伤直接或间接相关的疾病或病症，减慢其发作，或者减轻其严重程度。受试者可以具有任何性别(例如，男性或女性)，和/或也可以是任何年龄，如老人(通常，至少或高于60、70或80岁)、老年至成年过渡年龄的受试者、成年人、成年至未成年过渡年龄的受试者以及未成年人(包括青少年(例如，13且最高16、17、18或19岁)、儿童(通常，在13岁以下或在青春期开始前)和婴儿)。受试者也可以是任何种族群体或基因型。人类种族群体的一些例子包括高加索人、亚洲人、西班牙人、非洲人、非裔美国人、美洲原住民、闪米特人和太平洋岛民。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐被配置为定位至RPE细胞。
另外地或可替代地，在某些实施方案中，本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐通过被直接施用于RPE细胞处、施用至RPE细胞中或施用在RPE细胞的相邻周边中(如通过注射或植入)来定位至RPE细胞。
在其他实施方案中，本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐通过将本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐与选择性地靶向RPE细胞的靶向剂偶联来定位至RPE细胞，并且可以将本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐施用于RPE细胞处、施用至RPE细胞中或施用在RPE细胞的相邻周边中，或者远离RPE细胞而施用(例如，通过全身施用)。细胞靶向剂(即，“靶向剂”)是具有结合至(即，“靶向”)RPE细胞的能力的任何化学实体。细胞靶向剂可以靶向RPE细胞的任何部分，例如细胞膜、细胞器(例如，溶酶体或内体)或细胞质。在一个实施方案中，细胞靶向剂以选择性方式靶向RPE细胞的组分。通过选择性地靶向RPE细胞的组分，细胞靶向剂可以例如相对于其他类型的细胞组分选择性地靶向细胞的某些组分。在其他实施方案中，靶向剂非选择性地靶向细胞组分，例如通过靶向在大多数或所有细胞中发现的细胞组分。
在各种实施方案中，靶向剂可以是或者包括例如肽、二肽、三肽(例如，谷胱甘肽)、四肽、五肽、六肽、更高的寡肽、蛋白质、单糖、二糖、三糖、四糖、更高的寡糖、多糖(例如，碳水化合物)、核碱基、核苷(例如，腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、肌苷和S-腺苷甲硫氨酸)、核苷酸(即，单磷酸、二磷酸或三磷酸形式)、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、更高的寡核苷酸、核酸、辅因子(例如，TPP、FAD、NAD、辅酶A、生物素、硫辛酰胺、金属离子(例如，Mg2+)、含金属簇(例如，铁-硫簇))或非生物(即，合成)靶向基团。蛋白质的一些特定类型包括酶、激素、抗体(例如，单克隆抗体)、凝集素和类固醇。
用作靶向剂的抗体通常对一种或多种细胞表面抗原具有特异性。在特定实施方案中，抗原是受体。抗体可以是完整抗体，或者可替代地，保留抗体识别部分(即，超变区)的抗体片段。抗体片段的一些例子包括Fab、Fc和F(ab')2。在特定实施方案中，特别是出于有利于抗体与本文所述的本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐交联的目的，可以将抗体或抗体片段化学还原以衍生出具有巯基的抗体或抗体片段。在某些实施方案中，靶向剂是靶细胞的内化受体的配体。例如，靶向剂可以是将各种材料转运至溶酶体的酸性水解酶前体蛋白的靶向信号。特别关注的一种此类靶向剂是甘露糖-6-磷酸(M6P)，其被反式高尔基体中的甘露糖-6-磷酸受体(MPR)蛋白识别。已知内体参与将M6P标记的物质转运至溶酶体。
在其他实施方案中，靶向剂是含有RGD序列的肽或其变体，其结合许多细胞类型表面上的RGD受体。其他靶向剂包括例如转铁蛋白、胰岛素、胰岛淀粉素等。受体内化可以用于促进本文所述的本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐的细胞内递送。在某些实施方案中，一种细胞靶向分子或基团或者几种(例如，两种、三种或更多种)相同类型的细胞靶向分子或基团直接或经由接头附接至本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐。在其他实施方案中，两种或更多种不同类型的靶向分子直接或经由接头附接至本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，荧光团可以附接至本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐。一种或多种荧光团的掺入可以具有几种目的。在一些实施方案中，包括一种或多种荧光团以定量本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐的细胞摄取和保留(例如，通过荧光光谱法)。
如本文所用，“荧光团”是指具有发荧光的能力(即，具有荧光特性)的任何种类。例如，在一个实施方案中，荧光团是有机荧光团。有机荧光团可以是例如带电荷的(即，离子型)分子(例如，磺酸根或铵基团)、不带电荷的(即，中性)分子、饱和分子、不饱和分子、环状分子、二环分子、三环分子、多环分子、无环分子、芳香族分子和/或杂环分子(即，通过用选自例如氮、氧和硫的一个或多个杂原子进行环取代)。在不饱和荧光团的特定情况下，荧光团含有一个、两个、三个或更多个碳-碳和/或碳-氮双键和/或三键。在特定实施方案中，除了可能位于荧光团中的任何芳香族基团外，荧光团含有至少两个(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)共轭双键。在其他实施方案中，荧光团是含有至少两个、三个、四个、五个或六个环的稠合多环芳香族烃(PAH)(例如，萘、芘、蒽、苯并菲、并四苯、薁和菲)，其中PAH可以任选地通过一个、两个、三个或更多个杂原子或含有杂原子的基团进行环取代或衍生。
在其他实施方案中，有机荧光团是呫吨衍生物(例如，荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、伊红和德克萨斯红)、花青或其衍生物或子类(例如，链花青、半花青、闭链花青、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、吲哚碳菁、氧杂碳菁、硫碳菁、部花青和酞菁)、萘衍生物(例如，丹酰基和prodan衍生物)、香豆素及其衍生物、噁二唑及其衍生物(例如，吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑)、芘及其衍生物、噁嗪及其衍生物(例如，尼罗红、尼罗蓝和甲酚紫)、吖啶衍生物(例如，原黄素、吖啶橙和吖啶黄)、芳基甲川衍生物(例如，碱性嫩黄、结晶紫和孔雀绿)和四吡咯衍生物(例如，卟啉和胆红素)。本文考虑的一些特定的染料家族是染料家族、染料家族、染料家族和染料家族。具体地，染料可以具有几个结构基序，包括基于香豆素的、基于罗丹明的、基于carbopyronin的以及基于噁嗪的结构基序。
荧光团可以通过本领域已知的任何连接方法附接至本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐。例如，可以使用市售单反应性荧光团(例如，NHS-Cy5)或双反应性荧光团(例如，双NHS-Cy5或双马来酰亚胺-Cy5)将荧光团连接至含有适当反应基团(例如，氨基、硫醇、羟基、醛基或酮基)的一种或多种分子。可替代地，本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐可以用一个、两个或更多个此类反应基团衍生化，并且这些反应部分与含有适当反应基团的荧光团(例如，含氨基的荧光团)反应。
本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐可以通过允许与RPE细胞接触的任何途径施用。施用可以是例如经眼、肠胃外(例如，皮下、肌内或静脉内)、局部、透皮、玻璃体内、眶后、视网膜下、巩膜下、口服、舌下或经颊施用方式。一些前述示例性施用方式可以通过注射来实现。然而，在一些实施方案中，通过在视网膜附近使用缓释植入物(例如，巩膜下途径)或者通过将滴剂施用至结膜来避免注射。本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或本发明技术的其药学上可接受的盐可以局部施用至患者的眼睛，所述患者遭受脂褐素细胞毒性(包括斯塔加特病)、是ABCA4缺陷基因的携带者、患有干性AMD或由于脂褐素细胞毒性而有发生视网膜变性的风险。局部施用包括玻璃体内、局部经眼、透皮贴剂、真皮下、肠胃外、眼内、结膜下、或者眼球后眼球筋膜囊下注射、经巩膜(包括离子透入法)、后近巩膜递送，或者缓释生物可降解聚合物或脂质体。本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐也可以在眼部冲洗溶液中递送。浓度范围可以为约0.001μM至约100μM，优选地约0.01μM至约5μM。
在一些实施方案中，将本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐至少最初以低于实现期望治疗效果所需水平的水平施用，并且逐渐或突然增加剂量直至实现期望效果。在其他实施方案中，将本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐至少最初以高于加速期望治疗效果所需水平的水平施用，并且逐渐或突然缓和剂量直至实现期望效果。
所选剂量水平将取决于几种因素，如开业医师所确定。这些因素中的一些包括所治疗疾病或病症的类型、病症或疾病的分期或严重程度、所用治疗化合物的功效及其生物利用性概况，以及所治疗受试者的详情(例如，基因型和表型)，例如年龄、性别、体重和总体状况。
特别对于全身性施用方式，剂量可以例如在以下范围内：约0.01、0.1、0.5、1、5或10mg/kg体重/天至约20、50、100、500或1000mg/千克体重/天，或者每两天一次，或者一天两次、三次、四次或更多次。特别是在将本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐非全身地直接施用至视网膜的实施方案中，剂量可以忽略体重，并且可以是较小的量(例如，1-1000μg/剂)。在一些实施方案中，本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐的日剂量是有效产生治疗效果的最低剂量。在一些实施方案中，本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐不是以离散剂量施用，而是以连续模式施用，如通过缓释植入物或静脉注射管提供。
在一方面，本公开文本提供了包含阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal、SAL003及其药学上可接受的盐的药物组合物。
本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐可以与本领域已知的一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制。本发明技术的药物组合物可以特别配制用于以固体或液体形式施用，所述形式包括适于以下的那些：(1)口服施用，例如灌服药(drench)(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如，靶向经颊、舌下和全身吸收的那些)、推注剂、粉末、颗粒、用于应用至舌的糊剂；(2)肠胃外施用，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，作为例如无菌溶液或悬浮液或者持续释放配制品；(3)局部敷贴，例如作为乳膏、软膏剂或者施加至皮肤的控释贴剂或喷雾剂；(4)舌下；(5)经眼；(6)透皮；或者(7)经鼻。
在一些实施方案中，本发明技术的药物组合物可以含有一种或多种“药学上可接受的载体”，其如本文所用，大体上是指用于将活性剂引入体内的药学上可接受的组合物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或者硬脂酸)或者溶剂包封材料。在与配制品中其他成分相容且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可以用于本发明技术的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的例子包括例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
在一些实施方案中，配制品可以包括以下中的一种或多种：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；海藻酸；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；防腐剂；助流剂；填充剂；以及在药物配制品中采用的其他无毒相容物质。
药物组合物中也可以包括各种辅助剂，如润湿剂、乳化剂、润滑剂(例如，月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、防腐剂和抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的一些例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。在一些实施方案中，药物配制品包括选自例如以下的赋形剂：纤维素、脂质体、胶束形成剂(例如，胆汁酸)以及聚合载体(例如，聚酯和聚酸酐)。除活性化合物外，悬浮液可以含有悬浮剂，如例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇、脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄蓍胶及其混合物。可以通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂(如例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等)来确保纺织微生物对活性化合物的作用。还可能期望在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的药剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。
本发明技术的药物配制品可以通过制药领域已知的任何方法来制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗主体和特定施用方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效果的化合物的量。通常，活性化合物的量将在以下范围内：约0.1％至99％，更典型地约5％至70％，并且更典型地约10％至30％。
可以将本发明技术的组合物局部施用至患者的眼睛，所述患者遭受脂褐素细胞毒性(包括斯塔加特病)、是ABCA4缺陷基因的携带者、患有干性AMD或由于脂褐素细胞毒性而有发生视网膜变性的风险。本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐可以掺入各种类型的眼科配制品中以递送到眼睛(例如，局部、前房内、近巩膜或经由植入物)。可以将本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐与眼科上可接受的防腐剂、表面活性剂、粘度增强剂、胶凝剂、渗透促进剂、缓冲液、氯化钠和水组合，以形成水性无菌眼科悬浮液或溶液，或者预先形成的凝胶或原位形成的凝胶。
在一些实施方案中，将本发明技术的组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal、SAL003及其药学上可接受的盐)一天1-10次、一天一次、一天两次、三次、四次或更多次、一天1-3次、一天2-4次、一天3-6次、一天4-8次或一天5-10次施用。在一些实施方案中，将本发明技术的组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal、SAL003及其药学上可接受的盐)每天、每隔一天、每周2-3次或每周3-6次施用。
在一些实施方案中，本发明技术的组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal、SAL003及其药学上可接受的盐)的剂量可以例如在以下范围内：约0.01、0.1、0.5、1、5、10或100mg/kg体重/天至约20、50、100、500或1000mg/千克体重。特别在将活性物质直接施用至视网膜的实施方案中，所施用的剂量可能与体重无关，并且可以是较小量(例如，1-1000μg/剂)。
如果局部给药，可以将本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐配制为局部眼科悬浮液或溶液，其pH为约4至8。本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐通常将以按重量计0.001％至5％的量或按重量计0.01％至2％的量包含在这些配制品中。因此，对于局部呈递，根据熟练临床医师的慎重考虑，将每天1至4次把1至2滴的这些配制品递送至眼表面。在一些实施方案中，将含有治疗有效量的本发明技术的至少一种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003或其药学上可接受的盐)的本发明技术的药物组合物通过以下方式玻璃体内地递送：通过注射剂(可能是微球体)、玻璃体内装置，或者通过注射、凝胶或植入物置于眼球筋膜囊下空间中，或者通过上文讨论的其他方法。如果作为溶液来递送，组合物中本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐的治疗有效量可以为约18-44μM，浓度为约20-50％。如果配制为悬浮液，本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐的治疗有效量为约20％-80％。
在另一个实施方案中，将治疗有效量的本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或其药学上可接受的盐以微型片剂的形式施用，每个微型片剂的重量为约1mg至约40mg，或者约5mg。可以在一个剂量中将一至二十个此类微型片剂经由套管针注射[干式]至眼球筋膜囊下空间中，使得注射50-100mg[44-88μM]的总单剂量。
在一些实施方案中，将本发明技术的组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal、SAL003及其药学上可接受的盐)一天1-10次、一天一次、一天两次、三次、四次或更多次、一天1-3次、一天2-4次、一天3-6次、一天4-8次或一天5-10次施用。在一些实施方案中，将本发明技术的组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal、SAL003及其药学上可接受的盐)每天、每隔一天、每周2-3次或每周3-6次施用。
在一些实施方案中，本发明技术的组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal、SAL003及其药学上可接受的盐)的剂量可以例如在以下范围内：约0.01、0.1、0.5、1、5、10或100mg/kg体重/天至约20、50、100、500或1000mg/千克体重。特别在将活性物质直接施用至视网膜的实施方案中，所施用的剂量可能与体重无关，并且可以是较小量(例如，1-1000μg/剂)。
适合口服施用的本发明技术的配制品可以呈以下形式：胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味的基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉末、颗粒，或为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或为水包油或油包水液体乳液，或为酏剂或糖浆，或为软锭剂(pastille)(使用惰性基质，如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或为漱口剂等，其各自含有预定量的本发明技术的化合物作为活性成分。活性化合物还可以作为推注剂、药糖剂或糊剂来施用。
制备这些配制品的方法通常包括将本发明技术的组合物或其药学上可接受的盐与载体和任选地一种或多种辅助剂混合的步骤。在固体剂型(例如，胶囊、片剂、丸剂、粉末、颗粒、含片(trouch)等)的情况下，可以将活性化合物与微细固体载体混合，并且通常如通过制粒、压片、粒化、粉化或包衣来成型。通常，固体载体可以包括例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下中的任一种：(1)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，如例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，如石蜡；(6)吸收加速剂，如季铵化合物和表面活性剂，如泊洛沙姆和月桂基硫酸钠；(7)润湿剂，如例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子表面活性剂；(8)吸收剂，如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、硬脂酸锌、硬脂酸钠、硬脂酸及其混合物；(10)着色剂；以及(11)控释剂，如交聚维酮或乙基纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。相似类型的固体组合物也可使用此类赋形剂如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等来用作软壳和硬壳的明胶胶囊中的填充剂。
可以通过压缩或模制，任选地用一种或多种辅助成分制备片剂。可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备压缩片剂。活性剂的片剂和其他固体剂型(如胶囊、丸剂和颗粒)可以任选地用包衣和外壳(如肠溶衣和药物配制领域熟知的其他包衣)刻痕或制备。也可以使用例如不同比例的羟丙甲基纤维素(以提供所需释放曲线)、其他聚合物基质、脂质体和/或微球来配制剂型，以提供其中的活性成分的缓释或控释。可以可替代地配制剂型用于快速释放，例如冷冻干燥。
通常，要求剂型是无菌的。出于此目的，可以通过例如经由保留细菌的过滤器过滤或通过掺入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来对剂型进行灭菌，可以将所述无菌固体组合物在即将使用前溶解于无菌水或一些其他无菌可注射介质中。药物组合物还可以含有遮光剂，并且可以具有如下组成：其在胃肠道的某个部分中任选地以延迟方式仅释放或优先释放一种或多种活性成分。可以使用的包埋组合物的例子包括聚合物质和蜡。如果合适，活性成分也可以处于使用一种或多种上述赋形剂的微胶囊形式。
液体剂型通常是活性剂的药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆剂或酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可以含有在本领域中常用的惰性稀释剂，如例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油类(具体地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯类及其混合物。
专门意图用于局部或透皮施用的剂型可以呈例如以下形式：粉末、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液或贴剂。本文中还考虑眼科配制品，如眼科软膏剂、粉末、溶液等。可以将活性化合物在无菌条件下与药学上可接受的载体以及与可能需要的任何防腐剂、缓冲液或推进剂混合。除了本发明技术的活性化合物以外，局部或透皮剂型可以含有一种或多种赋形剂，如选自以下的那些：动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、皂粘土、硅酸、滑石和氧化锌及其混合物。喷雾剂还可以含有惯用推进剂，如氯氟烃和挥发性的未取代的烃，如丁烷和丙烷。
出于本发明技术的目的，透皮贴剂可以提供允许将本发明技术的化合物受控递送至体内的优点。此类剂型可以通过将化合物溶解或分散于合适的介质中来制备。还可以包括吸收促进剂以增加化合物跨越皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制这种通量的速率。
适合于肠胃外施用的本发明技术的药物组合物通常包括本发明技术的一种或多种化合物与以下的组合：一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，或者无菌粉末可以在使用前重构为无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，其可以含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂或使配制品与既定接受者的血液等渗的溶质。
在一些情况下，为了延长药物的作用，可能期望减慢从皮下或肌内注射吸收药物。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。则药物的吸收速率取决于其溶解速率，溶解速率又可以取决于晶体粒度和结晶型。可替代地，通过将药物溶解或悬浮在油性媒介物中来实现肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。
可以通过形成活性化合物在生物可降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中的微囊基质来制备可注射储库形式。根据药物与聚合物的比率，以及所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他生物可降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可以通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库式可注射配制品。
药物组合物还可以呈微乳液形式。在微乳液的形式中，可以改进活性剂的生物利用性。参考Dordunoo,S.K.等人,Drug Development and Industrial Pharmacy,17(12),1685-1713,1991，和Sheen,P.C.等人,J.Pharm.Sci.,80(7),712-714,1991，将其内容通过引用以其整体并入本文。
药物组合物还可以含有从本发明技术的化合物和至少一种两亲性载体形成的胶束，其中胶束的平均直径小于约100nm。在一些实施方案中，胶束具有小于约50nm的平均直径、或小于约30nm的平均直径、或小于约20nm的平均直径。
尽管本文中考虑任何合适的两亲性载体，但是两亲性载体通常是已授予公认为安全(GRAS)身份的载体，并且其既可以溶解本发明技术的化合物也可以在后续阶段当溶液与复杂水相(如在活生物组织中发现的水相)接触时将化合物微乳化。通常，满足这些要求的两亲性成分的HLB(亲水性与亲脂性的平衡)值为2-20，并且其结构含有在C-6至C-20范围内的直链脂肪族基团。两亲性药剂的一些例子包括聚乙二醇化的脂肪酸甘油酯和聚乙二醇。
一些两亲性载体是饱和的和单不饱和的聚乙二醇化的脂肪酸甘油酯，如从完全或部分氢化的各种植物油获得的那些。此类油可以有利地由三脂肪酸甘油酯、二脂肪酸甘油酯和单脂肪酸甘油酯以及相应脂肪酸的二聚乙二醇酯和单聚乙二醇酯组成，如包括癸酸4-10％、癸酸3-9％、月桂酸40-50％、肉豆蔻酸14-24％、棕榈酸4-14％和硬脂酸5-15％的脂肪酸组合物。另一有用类别的两亲性载体包括部分酯化的山梨聚糖和/或山梨醇，其具有饱和或单不饱和脂肪酸(SPAN系列)或相应乙氧基化的类似物(TWEEN系列)。特别考虑市售的两亲性载体，包括系列、或PEG-单油酸酯、PEG-二油酸酯、PEG-单月桂酸酯和二月桂酸酯、卵磷脂、聚山梨酯80。
适合用于药物组合物中的亲水性聚合物通常是如下的那些：易于水溶，可以共价附接至囊泡形成脂质，并且在没有严重毒性影响的情况下在体内被耐受(即，是生物相容的)。合适的聚合物包括例如聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(也称为聚丙交酯)、聚乙醇酸(也称为聚乙交酯)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇。示例性聚合物是具有如下分子量的那些：约100或120道尔顿直至约5,000或10,000道尔顿，并且更优选地约300道尔顿至约5,000道尔顿。在某些实施方案中，聚合物是具有约100至约5,000道尔顿的分子量、或约300至约5,000道尔顿的分子量、或750道尔顿的分子量(即PEG(750))的聚乙二醇。还可以通过其中的单体数量来定义聚合物。在一些实施方案中，本发明技术的药物组合物利用至少约三个单体的聚合物，如由至少三个单体或大约150道尔顿构成的PEG聚合物。可以适用于本发明技术中的其他亲水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚甲噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺以及衍生的纤维素，如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。
在某些实施方案中，药物组合物包括选自以下的生物相容的聚合物：聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、聚乙烯聚合物、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯及其共聚物、纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、乳酸与羟乙酸的聚合物、聚酸酐、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、多糖、蛋白质、聚透明质酸、聚氰基丙烯酸酯及其共混物、混合物和共聚物。
药物组合物还可以呈脂质体形式。脂质体含有包围水性内部区室的至少一个脂质双层膜。脂质体可以通过膜类型和大小来表征。小单层囊泡(SUV)具有单一膜并且直径范围通常为0.02至0.05μm；大单层囊泡(LUV)通常大于0.05μm。少层大囊泡和多层囊泡具有多个通常同心的膜层，并且通常大于0.1μm。脂质体还可以含有含于较大囊泡内的几个较小囊泡，即，多泡囊泡。
在一些实施方案中，药物组合物包括含有本发明技术的一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或药学上可接受的盐的脂质体，其中脂质体膜被配制以提供增加的携带能力。可替代地或另外地，本发明技术的所述一种或多种组合物(例如，阿瑞洛莫、达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、KIRA化合物(例如，KIRA3/6/7/8)、Salubrinal或SAL003)或药学上可接受的盐可以包含在脂质体的脂质体双层内或吸附在其上。在一些实施方案中，活性剂可以与脂质表面活性剂聚集并且携带于脂质体的内部空间中。在此类情况下，脂质体膜被配制以抵抗活性剂-表面活性剂聚集体的破坏效应。在某些实施方案中，脂质体的脂质双层含有用聚乙二醇(PEG)衍生的脂质，使得PEG链从脂质双层的内表面延伸至脂质体包封的内部空间中，并且从脂质双层的外部延伸至周围环境中。
含于脂质体内的活性剂优选地呈溶解形式。表面活性剂与活性剂的聚集体(如含有目的活性剂的乳液或胶束)可以被包埋在脂质体的内部空间内。表面活性剂通常用于分散和溶解活性剂。表面活性剂可以选自任何合适的脂肪族、环脂族或芳香族表面活性剂，包括但不限于不同链长度(例如，约14至20个碳)的生物相容性溶血磷脂酰胆碱(LPC)。聚合物衍生的脂质(如PEG-脂质)也可以用于胶束形成，因为它们会作用于抑制胶束/膜融合，并且因为将聚合物添加至表面活性剂分子会降低表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)并帮助胶束形成。CMC在微摩尔范围内的表面活性剂是优选的；可以利用更高CMC的表面活性剂来制备包埋于本发明技术的脂质体内的胶束，然而，胶束表面活性剂单体可以影响脂质体双层稳定性，并且会是设计具有所需稳定性的脂质体中的考虑因素。
根据本发明技术的脂质体可以通过本领域已知的多种技术中的任一种来制备，如例如美国专利号4,235,871和国际公开申请WO 96/14057中所述，将其内容通过引用以其整体并入本文。例如，脂质体可以通过以下方式来制备：将用亲水性聚合物衍生的脂质扩散至预先形成的脂质体中，如通过使预先形成的脂质体暴露于由脂质接枝聚合物构成的胶束，其脂质浓度对应于在脂质体中期望的衍生脂质的最终摩尔百分比。含有亲水性聚合物的脂质体也可以通过如本领域中已知的均质化、脂质-场水合(lipid-field hydration)或挤出技术来形成。通过另一种方法，首先通过在溶血磷脂酰胆碱或易于溶解疏水性分子的其他低临界胶束浓度(CMC)表面活性剂(包括聚合物接枝的脂质)中进行超声处理来分散活性剂。然后使用活性剂的所得胶束悬浮液再水化干燥的脂质样品，其含有合适的摩尔百分比的聚合物接枝脂质或胆固醇。然后使用本领域中熟知的挤出技术使脂质和活性剂悬浮液形成脂质体，并且通过标准柱分离从未包封的溶液分离所得脂质体。
在一些实施方案中，脂质体被制备为具有在所选大小范围内的基本上均匀的大小。一种有效定大小的方法涉及经由一系列具有所选均匀孔径的聚碳酸酯膜挤出脂质体的水性悬浮液。膜的孔径将大致对应于通过经由膜挤出产生的脂质体的最大大小(美国专利号4,737,323，其内容通过引用以其整体并入本文)。
本发明技术的配制品的释放特征取决于几种因素，包括例如，包封材料的类型和厚度、包封的药物的浓度以及释放改性剂的存在。如果期望，可以操纵释放为pH依赖性，如通过使用pH敏感的包衣，其仅在低pH下(如在胃中)释放，或者在较高pH下(如在肠中)释放。可以使用肠溶包衣来防止在通过胃之前发生释放。可以使用包封在不同材料中的氰胺的多种包衣或混合物来获得在胃中的初始释放，之后在肠中进行后续释放。也可以通过包括盐或成孔剂来操纵释放，所述盐或成孔剂可以通过从胶囊扩散来增加水摄取或药物释放。还可以使用修饰药物的溶解度的赋形剂来控制释放速率。也可以掺入增强基质降解或从基质释放的药剂。可以将药剂添加至药物，作为单独相(即，作为微粒)来添加，或者可以共溶解于聚合物相中，根据化合物而定。在所有情况下，量优选地在0.1％与30％(w/w聚合物)之间。一些类型的降解增强剂包括无机盐，如硫酸铵和氯化铵；有机酸，如柠檬酸、苯甲酸和抗坏血酸；无机碱，如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸锌和氢氧化锌；有机碱，如硫酸鱼精蛋白、精胺、胆碱、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；以及表面活性剂，如TweenTM或PluronicTM市售表面活性剂。通常作为微粒包括向基质添加微结构的成孔剂(即，水溶性化合物，如无机盐和糖)。
也可以通过改变颗粒在体内的滞留时间来操纵摄取。这可以通过例如用粘膜粘性聚合物包被颗粒或者选择粘膜粘性聚合物作为包封材料来实现。例子包括具有游离羧基的大多数聚合物，如壳聚糖、纤维素以及尤其聚丙烯酸酯(如本文所用，聚丙烯酸酯是指包括丙烯酸基团和修饰的丙烯酸基团(如氰基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯)的聚合物)。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明技术，所述实施例不应当被解释为以任何方式进行限制。
实施例1：材料与方法
细胞培养。从ATCC获得人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞，并且将其在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中培养。将细胞保存在37℃的具有5％ CO2和95％加湿空气的培养箱中。将来自妊娠16至18周供体的人胎儿RPE(hfRPE)细胞在37℃、5％ CO2下在RPE培养基中培养。为了使极化的hfRPE细胞生长，将细胞接种在12孔transwell板中的含Rock激酶抑制剂的1％ RPE培养基中持续第一周。第一周后，将细胞在正常的1％ RPE培养基中培养3周。使用处于第1次传代的细胞。
蓝光处理。使ARPE19细胞以70％汇合度生长，并且将其在培养基中用或不用20μMA2E处理24h。然后，HBSS替换细胞培养基，之后进行蓝光处理。将摄入或没有摄入A2E的ARPE19细胞用460+20nm波长的光照射20min。
细胞活力测定。用或不用抑制剂(图12)预处理的ARPE19细胞(80％汇合的)接受A2E/ATRD或媒介物(对照)，并且将其在37℃下在无血清OptiMEM培养基中孵育24h。用(Sigma，目录号199303)或采用NUC405/DRAQ7的显微术在24h时评估活力。使用在OptiMEM中制备的1X AlamarBlue溶液替换培养基上清液，并且在1h后，用SpectraMaxM(Molecular Devices，美国加利福尼亚州)在555nm激发/585nm发射下测定板的荧光。为了通过自动荧光显微术实时监测细胞死亡，每孔添加终浓度2μM的NUCView半胱天冬酶-3底物405(Biotium，目录号10407)和0.6μM的DRAQ7(Invitrogen，目录号D15106)，并且根据制造商的说明书每30min监测荧光信号。远红色(DRAQ7＝质膜渗漏)和蓝色(NUC405＝半胱天冬酶3激活)荧光信号的确切出现时间对于区分细胞凋亡和坏死与继发事件(如分别地，在细胞凋亡和坏死晚期期间的膜损伤和广泛蛋白水解激活)至关重要。对于蓝光处理，将A2E/ATRD或媒介物负载细胞的培养基替换为HBSS，并且将细胞暴露于90瓦高功率LED灯(目录号2506BU)持续15min(以430±20nm波长照明)，并且在零处理时间时用OptiMEM培养基替换HBSS。
坏死性和凋亡性细胞死亡的实时监测。进行细胞死亡测定以研究脂褐素的黑暗毒性。将90％汇合的ARPE-19或hfRPE在补充有所指示LB浓度的无血清培养基中孵育过夜。通过或采用NUC405/DRAQ7的显微术在24h时评估活力。通过自动荧光显微术对坏死性(红色)和凋亡性(蓝色)细胞死亡进行实时监测。远红色(DRAQ7＝质膜渗漏)和蓝色(NUC405＝半胱天冬酶3激活)荧光信号的确切出现时间对于区分细胞凋亡和坏死与继发事件(如分别地，在细胞凋亡和坏死晚期期间的膜损伤和广泛蛋白水解激活)至关重要。
化学抑制剂。本研究中使用的化学抑制剂描述于图12中。将ARPE19细胞在含或不含测试抑制剂的48孔板中用A2E/ATRD处理24h。
激酶活性测定。将ARPE19细胞用A2E处理6h，随后使用裂解缓冲液(20mM TrisHCl(pH 7.5)，150mM NaCl，1％ Triton，蛋白酶-磷酸酶抑制剂1X)通过注射器(20次)制备总细胞裂解物。以15000×g离心10min后收集上清液。取200μl(3mg/ml)蛋白质，并且将其与RIP3(13526，CS)或MLKL一抗在4℃下旋转孵育过夜。接下来，添加20μl琼脂糖珠A(9863，CS)，并且在4℃下旋转保持3h，随后以15000×g离心30s。将沉淀洗涤并溶解在20μl含底物和ATP(1mM)的激酶缓冲液(40mM TrisHCl(pH 7.4)，20mM MgCl2，0.1mg/ml BSA)中，并且在30℃下孵育1h(700转速)进行激酶测定。在孵育结束时，在384孔板中取10μl样品，并且添加5μlADP glo溶液(V6930，Promega)，并且在室温下在黑暗中保持40min，随后加入10μl激酶检测试剂。在室温下20min后，读取光度计读数。
动物。从Jackson laboratories购买没有rd8突变的色素ABCA4-/-RDH8-/-双敲除小鼠(DKO)，并且每10代在内部与C57BL6J对照品系回交，以防止遗传漂变。在Transnetyx(田纳西州孟菲斯)进行基因型分型。仅在群体中维持具有ABCA4、RDH8、RPE65-Leu450但没有crb1突变(缓慢型视网膜变性)的小鼠。对照C57BL/6J(Rpe65-Leu450，crb1阴性)也是Jackson’s lab的。在威尔康奈尔医学院(Weill Cornell Medicine)的动物设施中在12h光照(约10勒克斯)/12h黑暗循环环境或完全黑暗下饲养所有小鼠。在黑暗中的实验操作是在通过柯达1号安全灯滤片(透射率>560nm)透射的昏暗红光下进行的。在从NAI/NIH获得的20月龄以上的C57BL6/N(Rpe65-Met450，crb1阳性)中没有明显检测到视网膜变性或坏死性凋亡标记物。所有动物程序和实验都得到了威尔康奈尔医学院动物护理和使用委员会(Animal Care and Use Committee of Weill Cornell Medical College)的批准，符合NIH实验动物福利办公室(NIH Office of Laboratory Animal Welfare)制定的指南和视觉与眼科研究协会(Association of Research for Vision and Ophthalmology，ARVO)关于在眼科研究中使用动物的声明。
组织制备。用CO2对小鼠实施安乐死，并且立即摘除小鼠眼睛。对于H&E染色，将小鼠眼睛直接浸入含4％多聚甲醛(PFA)、16.8％异丙醇、2％三氯乙酸和2％ ZnCl2的磷酸盐缓冲液中，并且送去进行石蜡包埋和切片。对于脂褐素图像，将小鼠眼睛浸入4％PFA中持续一小时，之后解剖。从小鼠眼睛中解剖出RPE层，并且将其小心地在载玻片上平面封片，以便在荧光显微镜下评估脂褐素。使用Zeiss转盘共聚焦显微镜(Zeiss，德国耶拿)拍摄免疫荧光图像。
RPE和神经视网膜平面封片。摘除小鼠眼睛，并且将其在室温下置于含4％ PFA的PBS中持续1h。固定后，使用23G针在角膜缘区域打孔，并且使用虹膜剪在角膜缘周围剪开，取出角膜、虹膜和晶状体，用微型外科镊分离神经元视网膜和巩膜。将神经元视网膜和RPE层解剖出来，并且与封闭缓冲液(含1％ BSA和0.3％ Triton-X-100的PBS)一起孵育至少20min。将一抗添加到封闭缓冲液中，并且在4℃下保持过夜。洗涤视网膜和RPE层，并且将其在室温下与二抗一起孵育至少30min，然后用PBS洗涤三次。在解剖显微镜下，将视网膜或RPE层切成四叶草形状，并且在载玻片上的封片剂(含DAPI和DABCO的EMS甘油封片剂，目录号17989-61)中封片。将载玻片储存在4℃下直到成像。
冷冻切片和免疫荧光染色。将小鼠眼睛用4％ PFA固定，并且在4℃下用30％蔗糖渗透过夜，然后在Tissue-Tek OCT化合物(Sakura Finetek，美国加利福尼亚州托伦斯)中冷冻保存并切成15μm切片。用1％ BSA和0.1％ Triton-X-100PBS封闭切片，然后使用标准方法和适当稀释度的针对p-p-MLKL(cell signaling)、XBP1s(Biogend)、Iba-1(Abcam)、CD11b(Millipore)、Lamp2(杂交瘤库)、CellRox和DRAQ7(Invitrogen)、视紫红质(Abcam)、鬼笔环肽-CF660(Biotium，目录号0052)、Hoechst33324、半胱天冬酶3(克隆9664，Cellsignaling)的一抗进行免疫荧光染色。随后，将载玻片与Alexa-647、Alexa-594二抗一起孵育，并且用Hoechst33324进行复染。每个染色中都包括阴性对照，并且将载玻片用抗褪色封片剂封片。将载玻片储存在4℃下，之后使用Zen软件在SD显微镜上进行分析。对于石蜡切片，将小鼠眼睛包埋在石蜡中并切成5μm切片。使用标准方案脱蜡后，将载玻片与封闭缓冲液一起孵育2h，然后与一抗一起孵育过夜。用于免疫荧光染色的所有抗体都在图10和图13中列出。
脱黑。使用标准方案去除石蜡载玻片的石蜡，如本文所述。将载玻片在二甲苯中洗涤4次(4min/洗涤)，在100％乙醇中浸渍20次并重复4次，然后将载玻片风干10min。对于黑色素漂白，将载玻片在55℃下浸入含10％ H2O2的PBS中持续5min，或直到黑色素被漂白。用封闭缓冲液封闭载玻片，并且如上所述进行免疫荧光染色。
H&E。使用标准方案进行H&E染色，如本文所述。使用如上所述的方案去除载玻片的石蜡。将载玻片风干。将支架上的载玻片放入二甲苯中持续2min(重复一次)；然后放入100％乙醇中持续2min(重复一次)；然后放入95％乙醇中持续2min，进行一次。然后将载玻片放入苏木精中持续3min，随后放入伊红中持续45秒，放入95％乙醇中持续1min，放入100％乙醇中持续1min，进行两次，然后放入封片剂中，并且最终盖上盖玻片。
小鼠的药物治疗。玻璃体内注射KIRA6(Cayman Chemical，货号19151)，总体积为1μL。KIRA6浓度为20μg/ml。对照眼睛接受等量的模拟试剂(DMSO)。为小鼠称重，并且将其用10mg/kg氯胺酮混合物麻醉，然后用托吡卡胺扩张小鼠眼睛。通过10μl Hamilton注射器测定模拟试剂或Kira6的确切体积。在手术显微镜下，将小鼠眼睛置于视场中央，将34号针在锯齿缘处并朝向ONH插入小鼠眼睛中。在针进入小鼠眼睛内后，注射Hamilton注射器中的2μl内容物。将针缓慢抽出以防止溶液回流。将Nec7(2μL的33mM DMSO原液)玻璃体内地注射在左眼中，并且向右眼施用等量的媒介物(DMSO)。玻璃体内注射后，将小鼠放在温暖的地方，直到它完全醒过来。对相应的伴眼进行单次玻璃体内注射Nec7减少pMLKL染色。显示了来自700日龄小鼠的RPE平面封片样品的采用抗p-MLKL(红色)和XBP1s(绿色)和LB(白色)的免疫荧光染色(n＝3)。条＝20μm。
脂褐素合成。根据已公布的方案合成并通过HPLC纯化(>97％)A2E。通过质谱和250与600nm之间的UV吸光度评估材料的质量。
双类视黄醇含量的HPLC分析。在昏暗的红光下从小鼠视杯中提取双类视黄醇。简而言之，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤单个小鼠视杯(含有RPE/脉络膜/巩膜，无神经视网膜)或ARPE-19细胞，并且在1mL PBS中匀浆。添加4毫升氯仿/甲醇(2:1，体积/体积)，并且通过添加4mL氯仿和3mL dH2O，随后以1000×g离心10min提取样品。通过添加4mL氯仿重复提取。将有机相合并，过滤，在氩气流下干燥，并且再溶解在100μL 2-丙醇中。通过采用硅胶柱(Zorbax-Sil 5μm，250×4.6mm；Agilent Technologies，特拉华州威尔明顿)的正相HPLC分析双类视黄醇提取物，如先前所述(Sparrow JR等人(2003)J Biol Chem 278(20):18207-13)。流动相为己烷/2-丙醇/乙醇/25mM磷酸钾/冰醋酸(485:376:100:45:0.275，体积/体积)，将其在使用前过滤。流速为1mL/min。柱和溶剂温度保持在40℃。使用可靠A2E标准品的校准曲线和已公布的A2E摩尔消光系数将435nm处的吸收单位转换为皮摩尔；通过在线光谱分析确认每个双类视黄醇峰的身份。
RNA分离和定量PCR。使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)从培养细胞或小鼠眼睛RPE层中提取总RNA。用脱氧核糖核酸酶I消化总RNA，以防止基因组DNA扩增。然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific，目录号4368814)对总RNA进行逆转录，并且在Applied Biosystems StepOne实时PCR仪中使用SYBR Green Master Mix(ThermoFisherScientific，目录号4472908)分析基因表达。将GAPDH用作参考基因。引物序列显示在图11中。通过实时PCR扩增基因后，用2.5％琼脂糖凝胶分离部分PCR产物。
RNAseq。将培养的ARPE19细胞用或不用15uM A2E处理24小时，然后收获细胞并提取总RNA。制备蛋白质用于质谱分析。用Ingenuity Pathway Analysis(IPA，Qiagen)进一步分析RNAseq谱。
每个细胞的脂褐素量。将RPE细胞接种在DMEM-10％ FBS中过夜。第二天，用补充有所指示量的A2E(0、10、20、30μM)的Opti-MEM替换培养基持续24小时。将负载A2E的细胞用胰蛋白酶解离，计数并重悬于裂解缓冲液中。对于眼睛RPE，处死12月龄WT和DKO小鼠，摘除它们的眼睛，并且使用来自Qiagen的RNA保护细胞试剂(目录号76526)在100uL/视杯下持续10分钟从神经视网膜和下层脉络膜中分离出它们的RPE，如先前所述(Xin-Zhao Wang C等人,(2012)Exp Eye Res 102:1-9)。对小鼠RPE细胞进行计数，并且将其重悬于裂解缓冲液中。所使用的裂解缓冲液是2％ Triton X-100 1％ SDS水溶液，因为它有效溶解细胞膜和脂质双类视黄醇。使用Spectramax M5s读板器在430nm激发和600nm检测下测量裂解物的荧光(任意荧光单位)。
脂质双类视黄醇聚集的检测。为了证明脂质双类视黄醇的聚集体形成，在通过13mm尼龙注射器盘式过滤器0.45μm和3μm(Tisch scientific，俄亥俄州)之前和之后测定500μm A2E或ATRD在PBS中的溶液的荧光。
免疫印迹。在48孔板中孵育特定样品组后，使用RIPA裂解缓冲液(50mM TrisHCl(pH 8.0)，150mM NaCl，1％ NP40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％ SDS，蛋白酶-磷酸酶抑制剂)提取总细胞裂解物。进行超声处理或注射(20次)，随后以12,000×g离心10min，并且收集上清液并将其储存在-80℃下。通过Pierce Rapid Gold BCA蛋白质测定试剂盒(ThermoFisherScientific，目录号A53225)评估匀浆中的蛋白质浓度。然后通过标准SDS-PAGE凝胶分析30μg蛋白质。将样品与含或不含8％β-巯基乙醇的Nupage负载缓冲液以4:1(v:v)混合，并且在72℃下加热10min。使用4％-12％ Nupage凝胶和缓冲液(Life，NP0335BOX)进行SDS-PAGE。接下来，将SDS-PAGE凝胶在20V下转移到硝酸纤维素膜(Whatman，PROTAN BA83)上过夜。第二天，使用含5％乳的TBS将膜封闭2h，然后在TBST(TBS，0.1％ Tween-20)中添加一抗在4℃下过夜。第二天，将膜洗涤，并且在室温下与HRP缀合的二抗(目录号G21234，Invitrogen)以1:10,000稀释度一起孵育2小时。再洗涤3次后，用增强化学发光(ECL)试剂探测膜，并且使用X射线胶片检测化学发光图像(GE healthcare，RPN2106)。使用silverfast 8应用软件和Fiji Image J进行图像的扫描/成像和定量。用于蛋白质印迹的抗体列于图10中。
视网膜ONL变薄定量。将整只眼睛包埋在石蜡中并以5μm的厚度切片。将切片用苏木精和伊红(H&E)进行复染。使用光学显微镜拍摄数字图像，并且通过Zen软件拼接图像。沿垂直子午线在视神经头(ONH)的边缘上方和下方以0.2mm间隔测量外核层(ONL)厚度。将ONH的中心用作测量的开始。通过Zen软件测量ONL的厚度。
视网膜RPE层细胞核定量。在H&E复染的横切片的视杯中定量RPE细胞核。以40×拍摄图像，并且将其通过Zen软件拼接。在23月龄DKO(n＝10)和27月龄WT(n＝8)视网膜中每0.1mm间隔对RPE细胞核数进行计数，并且随距ONH的距离变化进行绘制。各点的平均值(±SEM)显著不同(p<0.05)。
视网膜RPE细胞大小定量。小心地从小鼠眼睛中解剖出视网膜RPE视杯，并且将其在室温下用Alexa647-鬼笔环肽染色1小时，之后在载玻片上平面封片。使用具有63x透镜的转盘共聚焦显微镜，对RPE层从视神经头到层外围进行成像。用鬼笔环肽可视化单个RPE细胞的轮廓。使用ImageJ软件手动选择细胞边界以计算细胞面积，并且手动选择细胞边界后，使用ImageJ测量面积。在23月龄DKO(n＝10)和27月龄WT(n＝8)视网膜中每0.1mm间隔对RPE细胞核数进行计数，并且随距ONH的距离变化进行绘制。各点的平均值(±SEM)显著不同(p<0.05)。
统计学。在Prism7.0软件中处理所有数据。在适当时使用方差分析、学生t检验或多重t检验。小于0.05的P值被认为具有统计学显著性。
实施例2：LF积累和视网膜变性。
HPLC和最近的定量眼底自发荧光(qFAF)已成为测量动物模型视网膜中LB含量的金标准(Sparrow JR等人(2013)Investig Ophthalmol Vis Sci 54(4):2812-2820)，但是每种方法报告的量并不完全匹配。在LF过度积累的小鼠品系(例如，Abca4-/-或Abca4-/-RDH8-/-(双KO或DKO小鼠))中进行的实验报道了一种奇怪的二分现象：虽然qFAF表明RPE和PR中LB的组合含量在整个生命中持续增加，但HPLC显示RPE的LB在最初几个月后急剧下降(Sparrow JR等人(2013)Investig Ophthalmol Vis Sci 54(4):2812-2820)。这种二分现象归因于含有高于阈值水平的LF的RPE细胞的早期突然损失，这将永久损害上皮的功能，促进PR中新LF的形成并损害其吞噬去除(Flynn E,Ueda K,Auran E,Sullivan JM,SparrowJR(2014)Invest Ophthalmol Vis Sci 55(9):5643-52)。
为了阐明这个过程的细胞学和病理学方面，在DKO与对照小鼠中进行实验，以比较随视网膜年龄变化HPLC可提取LB的积累与RPE细胞的细胞质中荧光颗粒的积累，通过共聚焦显微术进行测量。使用共聚焦显微术，每个RPE细胞的LF颗粒数增加以完全占据年老DKO的整个细胞质(图1A)。与年老WT RPE细胞相比，DKO中的LF水平高出5-10倍(图1B)。DKO的视网膜横切片图像揭示到，RPE与PR之间的LF相对量在第8个月后没有明显变化，RPE仍然是自发荧光的主要来源(图1C)。可视化肌动蛋白细胞骨架和细胞边界的鬼笔环肽染色(图1D)揭示到，WT RPE展现出随年龄而保持的典型的均匀六边形几何形状。相比之下，DKO RPE的组织逐渐恶化，使得在24个月时，普遍的表型由具有最高LF含量的分散的巨多核细胞和细胞内应力纤维组成。在整个生命中每个RPE细胞的颗粒持续积累与qFAF数据相符，并且支持以下观点：LF负荷的严重程度随着年龄的增长而逐渐增加，而不是在较年轻时达到损害RPE的阈值。另外地，通过高压液相色谱法评价RPE细胞的脂褐素含量(图1E)。总体趋势是脂褐素随着年龄而持续增加，与共聚焦显微术数据一致。
为了定量这种现象的程度，使用在8与23个月之间从神经视网膜分离的DKO RPE的平面封片和年龄匹配的对照(8至27个月)调查了随机中心位置的细胞的大小(面积，以μm2计)(图2A)。平均细胞大小范围在WT中为324至411μm2，并且在DKO中为330至1000μm2(p<0.01)，证明具有LF的视网膜中的RPE细胞有明显增大。这与和年龄匹配的WT相比，比25个月大的DKO中RPE细胞核数的显著减少相关(p<0.05)(图2B)。进行性视网膜变性也通过以下观察结果得到证实：27月龄DKO小鼠从中心到外周的PR显著少于同龄匹配的WT对照(图2C)。此外，来自年老DKO视网膜的冷冻切片的共聚焦显微术揭示到，在神经视网膜中存在小的(约1-3μm)脂褐素点，这在年老WT对照中不存在(图2D)。这些颗粒对Iba-1、视紫红质(图2E)和CD11b(图2I)染色呈阳性，但是对黑色素呈阴性(图2E)，证明它们代表携带降解的光感受器外段的吞噬块的激活的小胶质细胞(图2E)。
此外，在神经视网膜中观察到填充有LF(图2F-图2G)和黑色素(图2H)的较大的(约5-10μm)上皮大小的片段。这些LF片段可能潜在地代表经历上皮间充质转化(EMT)的迁移RPE细胞/片段；这一观察结果可以分别解释斯塔加特病和AMD视网膜所特有的斑点和脱落RPE的起源。重要的是，非常靠近具有RPE迁移活性的区域的外核层(ONL)看起来薄且无组织(图2H)，反映了炎症过程对光感受器(PR)造成的损伤。事实上，冷冻切片上的TUNEL染色证明在迁移性RPE片段周围有死PR(图2J)。总体而言，这些结果证明，在RPE中LF颗粒的积累与视网膜的加速侵蚀之间存在直接联系，这可能是由于直接的LF毒性以及激活的小胶质细胞的募集和RPE中EMT行为的促进。
通过显微镜在不同年龄的DKO和WT小鼠的小鼠RPE细胞中定量脂褐素。从小鼠视杯的中心(ONH)到外周为小鼠RPE细胞拍照。通过Image J定量中心RPE细胞的脂褐素，并且进行制图。在每组中定量超过300个RPE细胞，图中的每个点代表单个细胞。8个月、13个月和26个月的DKO中所含的脂褐素远高于3个月的DKO(p<0.01，通过非配对t检验得知)。3个月的DKO高于8个月和33个月的WT(p<0.01，通过t检验得知)。33个月的WT组显著高于8个月的WT组(p<0.01，通过非配对t检验得知)。
总之，来自DKO视杯的RPE的共聚焦图像显示，每个细胞的LF颗粒数随着年龄而不间断地增加(图1A-图1D)，这伴随着RPE的大小增大和数量减少，反映了存活细胞的扩张以密封由RPE死亡或迁移到神经视网膜中产生的间隙。观察到的RPE死亡可能是由募集到具有LF的层中的激活的小胶质细胞/巨噬细胞引起的直接毒性或间接损伤导致的(图2A-图2H)。然而，在生命的第8个月后，RPE中LB的含量显著下降(图2I-图2J)，而每个细胞的颗粒数保持增加。这种二分现象可能可归因于与衰老相关的LF颗粒内容物的氯仿不溶性递增，而不是负载LF的RPE的损失。
实施例3：LF光氧化和视网膜变性。
LB的光氧化降解导致白化动物的视网膜变性，但是尚不清楚光氧化是否在色素视网膜中以显著水平发生。由于光氧化可以通过在完全黑暗中饲养动物来阻止(Ueda K等人,(2016)Proc Natl Acad Sci U S A.113(25):6904-9，Boyer NP等人,(2012)J Biol Chem287(26):22276-22286)而不影响新LB的积累，进行研究以确定RPE和PR是否仍会在从未暴露于光的DKO视网膜中变性。因此，WT和DKO色素小鼠从出生起就饲养在连续黑暗或12h循环光照条件下。评价其ONL厚度以及RPE细胞核数的变化长达一年。如图3A所示，与LF相关的ONL变薄和RPE数减少以相似的速率进行，而与小鼠是光照循环还是黑暗饲养无关。WT组在同一时期期间没有显示出显著的PR或RPE损失，无论照明条件如何。为了验证LB在没有光照的情况下仍然积累，在来自12月龄动物的RPE平面封片中，在四组中的每一组中定量LF自发荧光(图3B)。黑暗饲养的小鼠(WT和DKO两者)的自发荧光材料的含量是在循环光照条件下其相应的对应部分的约2.8倍(p<0.05)，并且DKO的LF含量是WT的约5倍(图3B)。这些结果揭示到，体内光非依赖性毒性级联导致LF水平过高的色素视网膜中RPE和PR的恶化。
总之，黑暗与光照饲养的DKO视网膜之间PR和RPE细胞的可比损失(图3A)和暴露于光的眼睛中LF自发荧光的显著光漂白(图3B)表明，颗粒的内在毒性(独立于其光氧化倾向)在变性过程中起作用，同时表明色素视网膜可能能够处理中等水平的LB光氧化。
实施例4：体外光非依赖性细胞死亡。
为了研究光非依赖性细胞死亡所涉及的机制，采用将LB掺入RPE细胞溶酶体中的现有方案(Sparrow JR等人,(1999)Invest Ophthalmol Vis Sci 40(12):2988-95，Sparrow JR,Kim SR,Wu Y第18章Experimental Approaches to the Study of A2E,aBisretinoid Lipofuscin Chromophore of Retinal Pigment Epithelium.315-327，Boulton ME(2014)Exp Eye Res 126:61-7)，并且再现地引起在无光照条件下的剂量依赖性RPE细胞死亡(图4A)。
对LF的易感性在很大程度上取决于细胞汇合度(图4J)，因为密度更大的细胞培养物对掺入LB更具抗性(图4K)。然而，对于不同的LB剂量，掺入效率是恒定的(图4L)。在默认情况下，选择80％汇合度进行测定，因为在这些条件下，ARPE-19吸收80％的补充LB，达到DKO视网膜的RPE中发现的浓度范围内的LB水平(图4M)。重要的是，来自ARPE19的裂解物和来自视网膜的色素RPE的荧光读数不受黑色素的影响(图4V)。使用这种体外设置，LF在高度分化的hfRPE中也引起光非依赖性细胞死亡(图4N)。
通过向培养物中添加405(在细胞凋亡的执行阶段期间被半胱天冬酶-3切割时将核DNA染成蓝色的非荧光细胞渗透性底物)和DRAQ7(仅在细胞的膜完整性受损时才将DNA染成红色的染料)来研究LF诱导的单细胞水平的细胞凋亡和坏死。LF在没有光照的情况下诱导坏死，但是如果暴露于蓝光，则诱导细胞凋亡(图4B)。ATRD是不如A2E有效的坏死和细胞凋亡诱导剂，尽管它与其前体全反式视黄醛(ATR)具有相同的醛基(其被认为导致高毒性)(Maeda A等人(2012)Nat Chem Biol 8(2):170-8)。另一方面，A2E而非ATRD含有疏水性类视黄醇衍生链和亲水性吡啶鎓头基两者，这赋予两亲特性(Soma De S,Sakmar T(2002)J Gen Physiol 120(2):147-157)。
为了确定A2E是否通过嵌入膜中来诱导坏死，使用甲基β-环糊精(MβCD)。MβCD是一种环状糖，其通过与两亲性分子形成可溶性复合物来保护免受洗涤剂效应的影响。值得注意的是，尽管MβCD与A2E和Triton-X100两者都复合，但它没有保护免受A2E的影响，而是完全屏蔽了Triton-X100引起的致死性(图4C)。这一结果以及细胞死亡的缓慢动力学(几小时相比于在Triton-X100情况下的瞬时)表明，LF触发程序性坏死。因此，测试了调节性坏死的两个主要效应级联的抑制剂的保护作用：半胱天冬酶/gasdermin-D和RIPK3/MLKL(图4D)。
用泛半胱天冬酶抑制剂z-VAD(OMe)-FMK和gasdermin-D抑制剂双硫仑预处理没有提供保护。作为RIPK3(唯一已知的在Ser358处使人MLKL磷酸化(pMLKL)的激酶)的选择性抑制剂的GSK’872也没有提供保护。
然而，达拉非尼(B-Raf和RIPK3的ATP竞争性抑制剂)或坏死磺酰胺(NSA)(阻止pMLKL自发组装成插入膜中并最终杀死的低聚孔的药物)以剂量依赖性方式增加RPE存活。为了磷酸化，MLKL及其激酶需要被募集到称为坏死小体的多蛋白复合物中(图4O)。坏死小体在物种之间并不十分保守，并且也随着触发其形成的刺激物的性质而变化。抗MLKL免疫沉淀(IP)仅在从来自含有LF的细胞的裂解物制备时才产生具有激酶相关活性的拉下物，证明MLKL是坏死小体的一部分(图4E)。考虑到人MLKL在Ser358处的磷酸化(pMLKL)是坏死性凋亡的标志性触发事件和标记物，确定具有LF的细胞中MLKL的Ser358磷酸化和聚合状态。在用以保存磷酸化低聚物并增加检测到磷酸化低聚物的机会的非还原条件下使用蛋白质印迹(WB)，证明A2E(图4F)以及ATRD(图4P)在没有光照的情况下引起MLKL的剂量依赖性磷酸化和聚合。抗MLKL拉下物(Co-IP)的WB分析揭示到，没有对应于坏死小体中最常见的伴侣RIPK1或RIPK3的条带(数据未显示)。将这些RIP激酶组装成坏死小体的先决条件是它们的磷酸化。
为了排除这些蛋白质在ARPE19中的低表达妨碍它们的检测的可能性，在用LB或TNFα/半胱天冬酶抑制剂处理后在人肠道HT29细胞中进行实验(图4T)。尽管HT29细胞表达高水平的这些蛋白质，但在具有LF的细胞中仍然无法检测到pRIPK1和pRIPK3，但是在用TNFα抑制剂混合物处理后很容易看到。还研究了坏死抑素提供的保护范围。坏死抑素最初因对FADD缺陷型Jurkat T细胞中TNFα诱导的坏死性凋亡具有强大的抑制作用而被鉴定出(Zheng W,Degterev A,Hsu E,Yuan J,Yuan C(2008)Bioorganic Med Chem Lett 18(18):4932-4935，Teng X等人(2005)Bioorganic Med Chem Lett 15(22):5039-5044)。坏死抑素-1(Nec1)、Nec1s、Nec2和Nec5都靶向RIPK1(Degterev A等人(2008)Nat Chem Biol 4(5):313-321)，而Nec7靶向途径中的未知调节分子。因此，靶向RIPK1的坏死抑素没有提供存活益处，而Nec7具有高度的保护作用(图4G)。WB结果表明，虽然用Nec7处理(图4H和图4U)减少了LF诱导的MLKL磷酸化和聚合，但Nec1或GSK’872没有(图4U)。
相比之下，Nec1没有阻断MLKL的磷酸化和聚合(图4R)。最后，使用共聚焦荧光显微术，Ser358磷酸化MLKL被证明定位到具有异常水平A2E和ATRD的细胞的膜中，但是在健康对照中没有(图4I)，并且Nec7处理有效地恢复了pMLKL膜定位模式。总的来说，这些结果证明，LF诱导一种新型且未表征类型的坏死小体，其不含RIPK1并且可能缺乏RIPK3。聚合pMLKL的长期积累可能解释色素视网膜在积聚LF时的进行性损伤。
这些结果证明，负载A2E或ATRD的LF颗粒的光非依赖性细胞毒性引发坏死性凋亡，这与GA的病理学有关。坏死性凋亡是一种类型的程序性细胞死亡，其导致细胞膜破裂，引起萎缩区域和已知引发局部炎症的细胞成分的释放。光非依赖性LF介导的坏死性凋亡的证据如下：(i)细胞死亡的实时监测显示膜完整性在没有半胱天冬酶-3激活的情况下出现早期损伤；(ii)在无光照条件下LF诱导假激酶混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)的剂量依赖性Ser358磷酸化、聚合和质膜易位；(iii)细胞死亡可用达拉非尼和NSA阻止；(iv)免疫沉淀实验揭示到，LF促进MLKL与激酶的结合，这指示坏死小体的形成；(v)黑暗细胞死亡不能被泛半胱天冬酶抑制剂z-VAD(OMe)-FMK和抗氧化剂阻止；以及(vi)Nec7有效阻止因LF的MLKL磷酸化、聚合、质膜定位和细胞死亡。参见图4A-图4I。
LF细胞死亡和MLKL磷酸化/聚合不受GSK'872(图4D和图4Q)以及RIP1激酶抑制剂Nec1、Nec1s、Nec2和Nec5(图4G和图4Q-图4R)的影响，并且对抗氧化剂不敏感(图5A)。此外，即使在促坏死性凋亡LB处理后，在ARPE19和hfRPE细胞中在mRNA和蛋白质水平下也检测不到RIPK3(图4S)。在具有高水平RIPK1和RIPK3表达的细胞中，LF仍然没有诱导这些分子的可检测磷酸化，而TNFα加Smac模拟物和用于诱导RIPK1-RIPK3介导的坏死性凋亡的半胱天冬酶抑制剂z-VAD(TSZ)的经典组合显然诱导了(图4T)。所有这些综合结果都证明，RIPK1和RIPK3不是LF诱导的坏死小体的一部分。
最后，由于已提出除了脂质双类视黄醇的不良作用外，ABCA4-/-RDH8-/-小鼠的视网膜还因照明时释放的全反式视黄醛(ATR)的毒性而死亡，研究了ATR与坏死性凋亡之间的联系。使用细胞死亡测定，发现ATR在ARPE19细胞中触发光非依赖性细胞死亡(图4W)，但是机制与典型或脂褐素引发的坏死性凋亡不同，因为它对Nec1以及Nec7不敏感(图4X)。用ATR处理的细胞的蛋白质印迹显示MLKL的磷酸化/聚合没有增加(图4Y)。总体而言，这些表明，坏死性凋亡是眼部脂褐素毒性的特有读出，很容易与ATR的毒性作用区分。
这些结果证明，达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)和阻断IRE1α二聚化的IRE1α抑制剂可用于预防或治疗有需要的受试者的与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的眼病的方法。
实施例5：LF触发MLKL诱导的坏死性凋亡
LF沉积物被认为诱导氧化应激(Ueda K等人(2018)Proc Natl Acad Sci U S A115(19):4963-4968)。因此，研究了多种抗氧化剂对LF细胞毒性的保护作用：N-乙酰半胱氨酸(NAC)、Trolox、L-半胱氨酸、维生素C、BHA和TMB。尽管NAC有效地阻止了H2O2的氧化损伤，但相对于LF积累，没有一种测试抗氧化剂对RPE存活有任何影响(图5A)。另外地，用CellROXDeep-可视化亚细胞水平的活性氧(ROS)。在黑暗中，细胞ROS显现仅与线粒体相关，而不在脂褐素颗粒中。然而，当用蓝光照射细胞时，LF颗粒破裂，并且自发荧光材料在胞质上扩散并对ROS呈阳性(图14A)。因此，即使该方法可以有效地检测到LF诱导的ROS产生，也没有证据表明在诱导坏死性凋亡期间氧化应激与这些颗粒相关。
由于结晶材料在细胞中的积累可引发坏死性凋亡，并且原子力显微术揭示到脂褐素颗粒的核心包含固体聚集体，研究了脂质双类视黄醇形成杀死细胞的晶体的能力。A2E(MW 592Da)在水性环境中形成细菌大小的聚集体，其不能穿过450nm过滤孔(图14B和图14C)。这种无法通过的原因是尺寸排阻而不是非特异性结合，因为A2E确实穿过3μm截止值的相同材料的膜。接下来，使用DIC和荧光的组合对A2E积聚物进行成像：A2E显现为具有明确边缘的颗粒，无论是在细胞内还是在盖玻片上干燥后(图14D和图14E)。接下来，研究了疑似A2E晶体破坏溶酶体膜的能力。使用最近开发的半乳糖凝集素-3斑点测定，用于溶酶体膜透化(LMP)的早期检测。简而言之，胞质半乳糖凝集素-3在溶酶体膜渗漏时迅速与溶酶体膜腔面的糖萼结合，这很容易用抗半乳糖凝集素高亲和力抗体检测到。将L-亮氨酰-L-亮氨酸甲酯(LLO)(一种引起LMP的亲溶酶体肽)用作斑点形成的阳性对照(图14E)。50μM A2E积聚物也明显导致斑点染色，从而引起LMP(图14F)。LMP通过显示作为溶酶体酶替代物的组织蛋白酶D的失活来证实。LLO(图14G)和A2E(图14H)两者都导致组织蛋白酶D活性降低。有趣的是，组织蛋白酶D的损失被阿瑞洛莫(通过上调热休克蛋白促进溶酶体完整性的药物)以及Nec-7(唯一保护免受脂褐素影响的坏死抑素)阻止(图14I)。此外，阿瑞洛莫像Nec-7一样保护免受因脂褐素的坏死性凋亡的影响(图14J)。此外，非常值得注意的是以下观察结果：对于LLO，在阿瑞洛莫和Nec-7而非Nec-1情况下可观察到相同的独特保护模式(图14K)，这与因A2E的坏死性凋亡是由LMP引起的观点一致。
为了研究导致坏死性凋亡的细胞过程，使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)比较遭受黑暗LF细胞毒性的细胞与通过Nec7处理挽救的细胞的转录组。如图5B所示，未折叠蛋白反应(UPR)的抑制是迄今为止由用Nec7处理诱导的最显著的变化。UPR是对内质网中错误折叠的蛋白质或脂质异常积累的保守转录反应。UPR由三种ER驻留传感器引发：PERK、IRE1α和ATF。IPA中UPR的可视化揭示到，PERK和IRE1α途径在多个点受到Nec7的负调节(图5C)。为了评价UPR下调的影响，提取受Nec7抑制的UPR转录物的列表，并且对下游结果进行新的IPA分析(图5D)。UPR与其他细胞功能和通信信号一起对细胞死亡产生重大影响。
分析了在没有光辅助的情况下LF积累与ER应激之间的因果联系(图6A)。PERK分支被LB显著激活。事实上，A2E对eIF2α产生最强的Ser51磷酸化，而ATRD对ATF4和BiP产生最高的诱导。qPCR证实两种LB都在mRNA水平下诱导ATF4(图6B)。通过qPCR可视化IRE1α分支的激活。如图6C-图6D所示，在黑暗中观察到A2E和ATRD对XBP1s的剂量和时间依赖性诱导。
常规PCR外加琼脂糖凝胶揭示了ARPE19和hfRPE中XBP1的剪接(图6E)。在用20μMA2E或衣霉素(Tn)处理6h后，ATF6也展示出显著的切割(图6F)。Nec7预处理完全消除了XBP1的剪接(图6G)和CHOP的上调(图6H)，表明对ER应激有稳健抑制。相比之下，与A2E一起孵育并用RIPK3或RIPK1抑制剂处理的细胞响应于LF展现出正常的CHOP上调。总之，这些结果证明，在没有照明的情况下，LB的积累激活UPR的三个分支，并且Nec7能够消除UPR。
为了确定UPR如何参与LF诱导的坏死性凋亡，在ARPE-19细胞中单独敲除(KO)三种内源性ER应激传感器/效应物PERK、ATF6和IRE1α中的每一种，并且用我们的无光细胞死亡测定测试它们对LB的易感性。值得注意的是，IRE1α-KO显示出经受毒性剂量的LB而存活显著增加(图6I)。IRE1α是一种双功能激酶/RNA酶，其在ER应激下启动激活事件的串联链，从其二聚化开始，激酶激活与自磷酸化，最终是激活其RNA酶功能。IRE1α是一种I型ER跨膜多结构域蛋白，其传感结构域朝向ER腔，在存在未折叠蛋白质或混乱的脂质组合物的情况下，聚集以促进其激酶活性，从而使该分子反式自磷酸化，并且经由变构调节激活其胞质区远端的RNA酶。
使用在各个激活阶段选择性地阻断IRE1α的小分子来评价IRE1α在光非依赖性细胞死亡过程中的关键作用。测试了一组对激酶(APY29、舒尼替尼)或RNA酶(STF-0831、4μ8C、MKC-3946)功能具有选择性的抑制剂。令人惊讶的是，激酶、RNA酶或两种活性的单独或组合抑制并未转化为存活，表明LF介导的坏死性凋亡不依赖于IRE1α典型信号传导途径作为UPR反应(图6J)。相比之下，阻断二聚化(例如，KIRA3、KIRA6)足以保护免受因LF的坏死性凋亡的影响(图6J)。这一结果与UPR小体(UPRosome)的形成一致，UPR小体是多分子结构，其中IRE1α的二聚体或低聚物充当支架，其中相互作用的蛋白质组装以与其他途径交叉环行并赋予新型功能输出(Urra H等人(2018)Nat Cell Biol 20(8):942-953；Hetz C,Chevet E,Oakes SA(2015)Nat Cell Biol 17(7):829-838；Petersen SL等人(2015)Cell DeathDiffer 22(11):1846-1857；Sepulveda D等人(2018)Mol Cell69(2):238-252.e7；Hetz C,Glimcher LH(2009)Mol Cell 35(5):551-561)。因此，LF可以诱导衔接蛋白的表达，该衔接蛋白组装成IRE1α-UPR小体并为ER应激与坏死小体形成搭桥(图8A-图8E；图9B)。
这些结果证明，达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、阿瑞洛莫和阻断IRE1α二聚化的IRE1α抑制剂可用于预防或治疗有需要的受试者的与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的眼病的方法。
实施例6：具有LF的视网膜中IRE1α介导的坏死性凋亡。
为了研究受LF影响的色素视网膜是否经历IRE1α介导的进行性pMLKL低聚物沉积，解剖出2、12和27月龄ABCA4-/-RDH8-/-DKO和WT C57BL6小鼠的眼睛以及它们的整个RPE，平面封片，并且用抗XBP1s(图7A)或抗磷酸化Ser358 MLKL(图7B)进行染色。XBP1s和pMLKL的表达在WT视网膜中几乎检测不到，即使在27月龄小鼠中也是如此。相比之下，DKO动物在2个月时显示出扩散的XBP1s染色，到1年时，在RPE细胞的离散簇中强度增加，并且到27个月时变得广泛。类似地，pMLKL在2个月时变暗，并且首先在细胞内并且随后在质膜中变得越来越呈阳性(图7B)。针对XBP1s和pMLKL的染色随着年龄而变得更强且更广泛，并且pMLKL清楚地显示出与最年老DKO的细胞膜的结合。
在细胞培养物中观察到的非典型坏死性凋亡被Nec7阻断。为了验证Nec7在体内检测到的坏死性凋亡中的作用，将1μl媒介物和1μl Nec7分别眼内地注射在12月龄DKO的右眼和左眼中，并且在一周后分析其pMLKL水平。如图7H所示，Nec7处理后，膜和胞质pMLKL标记降低到检测不到的水平，证实非典型坏死性凋亡途径在具有LF的视网膜中具有活性。另外，Nec7处理显示出用pMLKL抗体染色的特异性。pMLKL水平的降低在整个视网膜中是完全的(图7I)。为了表征ER应激和坏死性凋亡标记物在整个视网膜上的分布，在来自20月龄DKO的脱黑石蜡视网膜横切片上进行针对XBP1s和pMLKL的双重染色。最强的pMLKL(图7C，左)和XBP1s(图7C，右)标记出现在RPE和之前描述为具有丰富脂褐素含量的小胶质细胞/巨噬细胞的小迁移性群体LF+、Iba-1+、CD11b+中。
磷酸化MLKL染色对于浸润到视网膜下间隙中的小胶质细胞/巨噬细胞特别明显，这些小胶质细胞/巨噬细胞在来自20月龄DKO的平面封片中看起来附着在RPE上(图7J)。在脱落大块RPE细胞的RPE区域中的磷酸化MLKL标记在病变周围而不是病变本身中显示出特别强的染色，表明染色主要来源于包封脱落的RPE细胞的小胶质细胞/巨噬细胞(图7K)。
XBP1s在PR的本体、内段和大部分外段周围也呈阳性。为了进一步确认小胶质细胞的激活状态，分析了浸润在视网膜下间隙的Iba-1+细胞的表型。制备来自25至27个月DKO的RPE平面封片，并且将其用Iba-1/XBP1s或Iba-1/pMLKL进行双重染色(图7D)。Iba-1+细胞显示出激活的形态，并且对ER应激和坏死性凋亡标记物染色呈阳性。
非常令人印象深刻的是在神经视网膜区域周围发现了大量的磷酸化MLKL染色，在这些区域中RPE细胞已迁移(图7E-图7F)，证明在周围区域中诱导了坏死性凋亡晕。它可以代表经历坏死性凋亡的相邻光感受器细胞，或由迁移RPE包裹的神经破坏性的激活的巨噬细胞/小胶质细胞的扩散。在任一种情况下，强烈的磷酸化MLKL染色显现先于在迁移性RPE边界的ONL区域中光感受器的损失恶化，并且与之十分相关，如图2C和图2H所示。
为了确定抑制非典型坏死性凋亡途径的治疗潜力，将2μl坏死抑素或媒介物眼内地注射在26月龄DKO小鼠的眼睛中。一周后，通过用抗磷酸化MLKL抗体对RPE和神经视网膜平面封片进行染色来评价其视网膜的状态。经验证，Nec7而非Nec1将膜和胞质磷酸化MLKL染色降低到检测不到的水平(图7L)，支持以下观点：在我们的体外系统中检测到的非典型坏死性凋亡途径在负载脂褐素的视网膜中具有活性。图7I描绘了四只经媒介物处理的眼睛和四只经Nec7处理的眼睛的磷酸化MLKL平均荧光表达值，在来自24月龄DKO的RPE平面封片的下半视网膜中从ONH每0.1mm间隔进行测量。在经Nec7处理的眼睛中，染色从中心到外周变为阴性，而在经模拟处理的伴眼中保持强阳性。为了分析处理对光感受器的影响，比较了来自对照眼睛和经Nec7处理的眼睛的神经视网膜平面封片中的磷酸化MLKL表达。Nec7显著减少了坏死性凋亡标记(图7M)。类似地，Nec7减少了CD11b细胞在视网膜下间隙中的浸润，如来自25至27月龄DKO小鼠的RPE平面封片上的巨噬细胞/小胶质细胞的减少所示(图7N)。总之，结果表明，用Nec7阻断坏死性凋亡显著减少视网膜变性的迹象。基于这些观察结果，产生了一种模型，其总结了这些数据并解释了光非依赖性脂褐素细胞毒性的机制(图9B)。根据这种工作模型，脂褐素积累引起LMP，其引发非典型坏死小体的组装，进而介导MLKL磷酸化/聚合。磷酸化MLKL-低聚孔将逐渐插入溶酶体和质膜的细胞膜中，引起更多的LMP，进而促进更多的磷酸化MLKL沉积在细胞膜上。这产生一个恶性循环，直到每个细胞的磷酸化MLKL孔数使得细胞经历坏死性凋亡分解。
这些结果证明，达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、阿瑞洛莫和阻断IRE1α二聚化的IRE1α抑制剂可用于预防或治疗有需要的受试者的与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的眼病的方法。
实施例7：具有LF的视网膜中IRE1α抑制的功效
为了确定抑制IRE1α驱动的细胞死亡对具有LF积累的色素视网膜的治疗潜力，将IRE1α抑制剂KIRA6或媒介物眼内地注射在26月龄DKO小鼠的眼睛中。一周后，通过用特异性抗体对整个RPE平面封片进行染色来评价其视网膜状态。与经模拟处理的眼睛相比，KIRA6处理使从中心到外周的XBP1s染色减少。这些结果证明，KIRA6可有效阻断体内IRE1α信号，并且XBP1s检测具有特异性(图8A)。
此外，KIRA6消除了坏死性凋亡，如通过pMLKL抗体进行的细胞内和质膜标记从中心到外周的消失所描绘(图8B)。通过来自20月龄DKO的脱黑石蜡横切片的共聚焦显微术获得的双色点图(pMLKL相比于XBP1s)的比较分析显示，IRE1α抑制剂使双阳性细胞(即，RPE和小胶质细胞)从33％降低到4％(图8C)。为了确定双阳性小胶质细胞的减少是否是由Iba1+细胞浸润减少或XBP1s/pMLKL标记物表达下调引起的，用Iba-1和XBP1s抗体对来自经KIRA6和模拟处理的眼睛的RPE平面封片进行染色。在从视网膜中心到外周拍摄的连续图像中，没有检测到附着在RPE顶端侧的Iba-1+细胞，表明KIRA6处理用于减少激活的小胶质细胞的浸润，从而减少视网膜的炎症(图8D)。为了验证视网膜变性(EDN2、FGF2)、炎症/血管生成(GFAP、SERP、VEGF、CXCL15)、ER应激(XBP1s、SCAND1、CEBPA)和坏死性凋亡(HMGA)的减少，从注射KIRA6和对照的眼睛的整个视网膜(神经视网膜加RPE)分离总RNA，并且通过qPCR定量mRNA水平。结果表明，视网膜变性、炎症/血管生成、ER应激和坏死性凋亡的所有测试标记物普遍减少(图8E)。
总的来说，这些结果证明，ER应激和坏死性凋亡在具有LF的视网膜中恶化。用Nec7处理减少pMLKL染色，表明标记具有特异性，并且Nec7抑制视网膜中的坏死性凋亡，如在RPE培养物中。具有高LF含量的视网膜的组织学揭示到，IRE1α和pMLKL膜沉积在RPE和侵入的小胶质细胞中越来越多，并且随着LF驱动的变性进行，IRE1α和pMLKL两者倾向于共定位在相同的细胞中。在视网膜中发现的坏死性凋亡类型易受Nec7抑制，表明它代表了在培养细胞中观察到的相同类型的非典型坏死性凋亡。通过qPCR所检测的，用KIRA6处理使IRE1a激活、pMLKL低聚化和Iba1+小胶质细胞浸润以及正在进行的视网膜变性的多种标记物的水平正常化(图8E)。视网膜横切片的染色揭示到，不仅RPE而且小胶质细胞(CD11b+、Iba-1+)LF+细胞对XBP1s和磷酸化MLKL Ser345呈阳性。用KIRA6处理消除了所有细胞类型中的XBP1s和磷酸化MLKL Ser345标记。
图15A-图15E和图16A-图16B显示了含与不含脂褐素的ARPE-19细胞之间的比较蛋白质组学分析，并且显示了在RPE细胞中受调节以经受脂褐素积累而存活的蛋白质。如图17所示，在ABCA4-/-RDH8-/-双敲除(DKO)小鼠的眼睛的RPE中，在培养细胞中通过蛋白质组学方法鉴定出的前几种抗坏死性凋亡途径eIF2a、eIF4、mTOR和UPS显现伴随脂褐素增加。评价了eIF2a、eIF4或mTOR途径的诱导剂对致死量的脂褐素的保护作用。
只有靶向由与GADD34或CreP(催化亚基)结合的PP1组成的两种细胞eIF2α磷酸酶的Salubrinal(SAL)和SAL003才保护免受脂褐素的影响。相比之下，仅破坏PP1-GADD34结合的胍那苄或eIF4和mTOR激活剂没有赋予显著的保护(参见图18A-图18B)。因此，并非所有eIF2a、eIF4或mTOR途径的抑制剂都能够赋予针对脂褐素细胞毒性的保护。图18C-图18D显示，SAL没有保护免受脂质双类视黄醇的光毒性分解的影响，但是即使细胞在胞质中含有大量的脂褐素，它也能够保护细胞。图19A-图19B显示，SAL需要PERK而非ATF4来发挥针对脂褐素的保护。SAL抑制IRE1a信号传导，从而阻止因脂褐素的RPE的坏死性凋亡。敲低IRE1a而非PERK或ATF6(ER应激的三种传感器)阻止因脂褐素的坏死性凋亡。参见图20A-图20B。
这些结果证明，达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、坏死抑素7(Nec7)、Salubrinal、SAL003、阿瑞洛莫和阻断IRE1α二聚化的IRE1α抑制剂可用于预防或治疗有需要的受试者的与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的眼病的方法。
等效方案
本发明技术并不受限于本申请中描述的特定实施方案，所述实施方案旨在作为本发明技术的单独方面的单一说明。如本领域技术人员将清楚的，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行许多修改和改变。除了本文所列举的方法和设备外，本领域技术人员根据前述描述将清楚在本发明技术范围内的功能上等效的方法和设备。此类修改和改变旨在落入本发明技术的范围内。应理解，本发明技术并不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，它们当然可以改变。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在是限制性的。
另外，在本公开文本的特征或方面按马库什群组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开文本因此也按马库什群组的任何单独成员或成员亚组来描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围都还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何所列范围都可以容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围都可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样如本领域技术人员将理解的，所有诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等言辞都包括所述数字并且涉及随后可以分解为如上所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独成员。因此，例如，具有1-3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。类似地，具有1-5个单元的组是指具有1、2、3、4或5个单元的组，等等。
将本文所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都通过引用以其整体而并入，包括所有图形和表格，并入程度使其不会与本说明书的明确教导内容不一致。

Claims (22)

1.一种用于预防或治疗有需要的受试者的与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的眼病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的选自以下的至少一种治疗剂：达拉非尼、坏死磺酰胺(NSA)、阿瑞洛莫、激酶抑制性RNA酶衰减剂(KIRA)化合物、salubrinal、SAL003及其任何药学上可接受的盐，其中所述与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的眼病是常染色体隐性视网膜色素变性(RP)、斯塔加特病(STGD)、贝斯特病(BD)、视锥视杆细胞营养不良或ABCA4突变型年龄相关性黄斑变性(AMD)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述KIRA化合物是KIRA3、KIRA6、KIRA7或KIRA8。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者包含ABCA4和/或RDH12的突变。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述ABCA4和/或RDH12的突变是纯合的或杂合的。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述有效量的所述至少一种治疗剂的施用防止所述受试者的视网膜细胞中脂褐素相关细胞毒性的恶化。
6.一种用于预防或治疗有需要的受试者的与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的ABCA4突变型眼病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的坏死抑素7(Nec7)或其药学上可接受的盐，其中所述与视网膜细胞脂褐素相关细胞毒性相关的ABCA4突变型眼病是常染色体隐性视网膜色素变性(RP)、视锥视杆细胞营养不良或年龄相关性黄斑变性(AMD)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述有效量的Nec7或其药学上可接受的盐的施用防止所述受试者的视网膜细胞中脂褐素相关细胞毒性的恶化。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述眼病是遗传性的、非遗传性的或与衰老相关的。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述AMD是干性AMD。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述视锥视杆细胞营养不良是常染色体隐性视锥视杆细胞营养不良。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述受试者携带选自以下的至少一个ABCA4突变：ABCA4 D2177N、ABCA4 G1961E、ABCA4 G863A、ABCA4 1847delA、ABCA4L541P、ABCA4 T2028I、ABCA4 N247I、ABCA4 E1122K、ABCA4 W499*、ABCA4 A1773V、ABCA4 H55R、ABCA4 A1038V、ABCA4 IVS30+1G→T、ABCA4 IVS40+5G→A、ABCA4IVS14+1G→C和ABCA4F1440del1cT。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述受试者携带选自以下的至少一个RDH12突变：RDH12 G127*、RDH12 Q189*、RDH12 Y226C、RDH12 A269Gfs*、RDH12L274P、RDH12 R65*、RDH12 H151D、RDH12 T155I、RDH12 V41L、RDH12 R314W和RDH12 V146D。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中将达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、所述KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐经由局部、玻璃体内、眼内、视网膜下或巩膜下施用来施用。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、所述KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐减少或消除脂褐素双类视黄醇(LB)脂质诱导的MLKL的磷酸化和/或聚合。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、所述KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐逆转LB脂质诱导的磷酸化MLKL(pMLKL)向视网膜色素上皮细胞中的质膜的易位。
16.根据权利要求14-15中任一项所述的方法，其中所述LB脂质选自N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)、A2E异构体、A2E的氧化衍生物和全反式视黄醛二聚体(ATRD)。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、所述KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐降低与视网膜变性、炎症/血管生成、ER应激和/或坏死性凋亡相关的一种或多种基因的mRNA或蛋白质水平。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述与视网膜变性、炎症/血管生成、ER应激和/或坏死性凋亡相关的一种或多种基因选自EDN2、FGF2、GFAP、SERP、VEGF、CXCL15、XBP1s、SCAND1、CEBPA和HMGA。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、所述KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐抑制或减轻脂褐素诱导的坏死性凋亡。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、所述KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐减少视网膜色素上皮细胞中激活的小胶质细胞/巨噬细胞的浸润。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中达拉非尼、NSA、阿瑞洛莫、所述KIRA化合物、salubrinal、SAL003、Nec7或其药学上可接受的盐与靶向视网膜色素上皮细胞的药剂缀合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述靶向视网膜色素上皮细胞的药剂是他莫昔芬、氯喹(CQ)/羟氯喹(HCQ)、乙胺丁醇(EMB)或碘酸钠(NaIO3)。
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