JP2023515684A - 真核生物における免疫グロブリンの発現収率の改善 - Google Patents
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Abstract
真核生物発現系において組換え多成分タンパク質を生産する方法であって、2つ以上の異なる核酸構築物で真核細胞を共形質転換することを含む(ここで、各核酸構築物は、成分のそれぞれが発現および細胞内組み立てのために細胞の同じオルガネラに標的化されるように、タンパク質成分をコードする各転写単位、同じプロモーターおよびシグナル配列を含む)、方法。1以上の実施形態では、各核酸構築物は、タンパク質貯蔵特異的シグナル配列をコードするDNA配列に作動可能に連結された、タンパク質貯蔵遺伝子由来のプロモーターを含む。【選択図】図1A
Description
関連出願の相互参照
本願は、2020年3月2日に出願された「真核生物における免疫グロブリンの発現収率の改善」と題された米国仮特許出願第62/984,162号の優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書の一部として援用される。
本願は、2020年3月2日に出願された「真核生物における免疫グロブリンの発現収率の改善」と題された米国仮特許出願第62/984,162号の優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書の一部として援用される。
配列表
以下の出願は、2021年3月2日に46KBで作成された「SequenceListing」という名称のASCII形式のテキストファイルとして提出された、コンピューター可読形式(CRF)の配列表が含まれる。CRFの内容は、参照により本明細書の一部として援用される。
以下の出願は、2021年3月2日に46KBで作成された「SequenceListing」という名称のASCII形式のテキストファイルとして提出された、コンピューター可読形式(CRF)の配列表が含まれる。CRFの内容は、参照により本明細書の一部として援用される。
発明の分野
本発明は、組換えタンパク質および組み立てられた組換えタンパク質、例えば、IgAの細胞内発現に関する。
本発明は、組換えタンパク質および組み立てられた組換えタンパク質、例えば、IgAの細胞内発現に関する。
関連技術の説明
免疫グロブリン(Ig)とも呼ばれる抗体は、現在、医学的使用ならびに臨床および前臨床開発中の生体分子の最も活発なカテゴリーの1つである。抗体は、体液性免疫応答の重要なメディエーターである。免疫グロブリンは、細菌、真菌、寄生虫、ウイルス、および毒素などの病原体および外来抗原に結合して中和する。さらに、抗体に結合した病原体は、病原体を飲み込んだり破壊したりすることができる特定の免疫細胞上の受容体によって検出される。抗体の5つの主要なクラスまたはアイソタイプである免疫グロブリンG(IgG)、免疫グロブリンA(IgA)、免疫グロブリンD(IgD)、免疫グロブリンE(IgE)、および免疫グロブリンM(IgM)は、サイズ、構造、組織/器官分布および機能的役割が異なる。
免疫グロブリン(Ig)とも呼ばれる抗体は、現在、医学的使用ならびに臨床および前臨床開発中の生体分子の最も活発なカテゴリーの1つである。抗体は、体液性免疫応答の重要なメディエーターである。免疫グロブリンは、細菌、真菌、寄生虫、ウイルス、および毒素などの病原体および外来抗原に結合して中和する。さらに、抗体に結合した病原体は、病原体を飲み込んだり破壊したりすることができる特定の免疫細胞上の受容体によって検出される。抗体の5つの主要なクラスまたはアイソタイプである免疫グロブリンG(IgG)、免疫グロブリンA(IgA)、免疫グロブリンD(IgD)、免疫グロブリンE(IgE)、および免疫グロブリンM(IgM)は、サイズ、構造、組織/器官分布および機能的役割が異なる。
IgGは、血中の主要な抗体であり、ヒト血清中の全抗体の75%~80%を占める。IgDは主として成熟Bリンパ球の膜に見られ、これらの抗体産生免疫細胞の活性化に機能する。IgEは血中に微量に存在し、抗寄生虫免疫に関与している。大きな五量体IgMは、血中の分泌型の抗体の約8%を占めている。血中IgMは、感染の初期に作用して病原体を中和し、補体カスケードを活性化して、抗体結合病原体または抗原をタンパク質分解的に破壊する。最後に、IgAはヒト血清で2番目に多いタイプの抗体であり、全血清抗体の約13%を占める。しかしながら、IgAは、消化管、気道、および生殖管を含む粘膜に最も多い抗体である。IgAはまた、唾液、涙、汗、母乳、および初乳(「通常の」母乳の前の初期乳腺分泌物であるが、新生児の免疫防御の豊富な供給源である)を含む血管外分泌物中にも豊富である。従って、IgAは人体で最も多い抗体クラスであり、他の全ての抗体アイソタイプを合わせた数を上回っている。IgAはまた、粘液中に最も多い抗体であり、感染病原体に対する防御の最前線の一部を形成している。
IgAを含む全ての抗体アイソタイプの約150キロダルトン(kDa)の形態は、4つのポリペプチド鎖:2コピーの約25kDaの軽鎖(LC)と2コピーの約50kDaの重鎖(HC)で構成される。各LCはHCと会合して、ジスルフィド結合によって共有結合されたヘテロ二量体を形成する。次に、HCは、個々のヘテロ二量体が特徴的なY字型のヘテロ四量体構造に組み立てられるようにホモ二量体を形成する(図1)。LCはアミノ末端可変(VL)ドメインと1つのカルボキシル末端定常(CL)ドメインで構成され、HCはアミノ末端可変ドメイン(VH)と3つの定常ドメイン(CH1、CH2およびCH3)で構成される。VLおよびVHドメインは、保存されたフレームワーク配列と超可変または相補性決定領域(CDR)に細分される。免疫グロブリンYの「腕」の先端付近に位置し、各LC-HCヘテロ二量体の密接に並置されたVLドメインとVHドメインが特定の抗原結合部位を形成するため、各単量体免疫グロブリンは2つの結合部位を含む。まとめると、VLドメインとVHドメインはCLドメインとCH1ドメインとともにFab(フラグメント抗原結合)領域と呼ばれる。2つのHCのホモ二量体形成CH2ドメインおよびCH3ドメインで構成されるY字型抗体の「ステム」または「テール」領域は、Fc(フラグメント結晶化可能)領域とも呼ばれる。他の機能の中でも、Fcは特定の免疫グロブリン受容体および他のエフェクター分子に結合することによって免疫系を活性化するために不可欠である。
イン・ビボ(in vivo)では、IgAは重鎖(HC)と軽鎖(LC)のみを含む単量体型(mIgA)、または分泌IgA(sIgA)として存在する。血液/血清IgAは主として単一のY字型の免疫グロブリンであるが、粘膜および初乳などの分泌物のほとんどのIgAは分泌IgAとして存在する。構造的に、sIgAは、2つの完全なIgA分子を含む。各IgAのHCは、結合鎖(JCまたはJ鎖)と呼ばれる単一の15kDaのポリペプチドとのジスルフィド結合を介して、他のIgAのHCに連結される。分泌成分(SC)と呼ばれる80kDaのポリペプチドは、JC結合IgA二量体と会合してsIgAを完成させる(図1)。SCは、腸内腔などのタンパク質分解活性の高い表面で、タンパク質分解に対する安定性と耐性の付与、および/またはsIgAの寿命を延長に役立つことが示唆されている。sIgAは、その4つの抗原結合部位と、より大きな標的に結合した際にオリゴマーネットワークを形成する備えをする能力に関連して、多価抗原および標的に対して高いアビディティを示す。これに対応して、sIgAは、ウイルスを中和し、細菌の付着を阻害し、様々な病原体による粘膜表面のコロニー形成および浸透を防ぐことにより、免疫防御において主要な役割を果たす。
様々な病原生物および病原体に対する防御における重要な役割と、それらの特定の抗原に対する極めて高い親和性のために、抗体は、研究、診断および治療に、また癌、免疫および炎症性障害を含む多様な病理系列において、また感染性病原体に対して、多様な用途に使用されてきた。これまでのところ、承認された抗体は、キメラまたはヒト化IgG、または完全ヒトモノクローナルIgGを含むIgGクラスのものだけである。しかしながら、感染症および病原体の95%を超えるものは、IgAが主要な抗体クラスである粘膜系で発生するか、または粘膜系と接触する。ヒト粘膜系は約400m2の表面積を有し、身体が病原体に曝される最大面積に当たる可能性がある。従って、IgA抗体は、広範な疾患の治療のための治療薬タンパク質の有価なクラスに相当する。
人体の粘膜表面で高度に濃縮されている分泌IgA(sIgA)は、粘膜環境でのそれらの潜在的堅牢性、潜在的に高い治療効果、潜在的に有利な薬理学的プロファイル、およびIgGにアクセスできない免疫応答経路を活性化する能力のために、特に重要である。多くの病原性感染因子および疾患が粘膜で人体に関与しているので、適切な用量で送達できる治療薬としてのsIgAの開発は非常に興味深い分野である。しかしながら、このような取り組みは、堅牢で効果的でスケーラブルなsIgA発現システムがないことで大きく妨げられる。
全ての抗体、特にsIgAなどの多量体免疫グロブリンの組み立ては、多数の鎖内および鎖間ジスルフィド結合と翻訳後修飾、特にオリゴ糖(グリコシル化)を含む。抗体の構造の複雑さと修飾には、精緻な折り畳み装置ならびにジスルフィド結合の生成のための酸化環境が必要である。それらが自然に合成される細胞では、抗体は小胞体(ER)に同時翻訳的に挿入され、そこで折り畳み、多重鎖の組み立て、およびN様グリコシル化を受け、その後、抗体は分泌経路に分類されて原形質膜または細胞外培地に輸送され、途中で、抗体はさらなる翻訳後修飾を受けることがある。不適切に折り畳まれた、または組み立てられた抗体は、ERに保持されるか、または分泌経路からERに戻され、その後タンパク質分解によって廃棄され得る。ERなどの複雑な処理コンパートメントの要件により、大腸菌(E. coli)などの多くの一般に使用される原核生物発現宿主は、抗体を効率的に産生することができない。一本鎖可変フラグメント(scFv)およびフラグメント抗原結合(Fab)構築物などの、より小さな操作された抗体フラグメントは、親抗体の抗原結合能力を保有している可能性がある。このようなフラグメントは、より単純な発現系で生産され得るが、多くの治療適用で重要な免疫エフェクター機能を媒介するFc領域を欠いている。真核細胞系は、完全な抗体を産生する要件を満たす高度な折り畳み、翻訳後、および分泌装置を備えているが、効率と収率は大きく異なる。
抗体薬物を使用する治療プロトコールは、最適な臨床効果を達成するために用量当たり数百ミリグラムの範囲の極めて高い用量を必要とする。現在承認されている治療用抗体の95%以上が、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞培養などの哺乳動物細胞株で生産されている。大量の抗体は、抗体を発現する大量の哺乳動物培養細胞を必要とする。発現した抗体はまた、医薬品適正製造基準(Current Good Manufacturing Practice)(cGMP)の条件下で、実験的に精密化された抽出および精製手順を使用して、規制レベルの純度および均一性まで精製しなければならない。その結果、非常に高い生産コストが、哺乳動物細胞に基づく抗体生産の主な欠点となっている。第2の主な欠点は、哺乳動物細胞培養、ならびに他の動物に基づく発現系および抗体源が、ウイルスおよびプリオンを含む外来病原体による汚染のリスクが比較的高く、ひいては産生された抗体も汚染することである。
承認済みのまたは治療用途向けに臨床開発下にある抗体のほとんどはIgGクラスに属しているが、SIgA抗体の探索、特に粘膜免疫と病理を直接標的とする治療的処置に対する関心が高まっている。sIgAは2つの異なるタイプのポリペプチド鎖だけでなく、4つのポリペプチド鎖から組み立てられ、その構造がより複雑であるため、sIgAの生産はIgG抗体の生産よりもはるかに難しい。植物および哺乳動物細胞を含む選択された真核生物発現系が、少量の生物活性組換えsIgAを発現させるために使用されてきた。これらのシステムにsIgA抗体の商業的な治療規模の生産に必要な収量に近づくものはない。
イン・ビボでは、天然sIgAの成分は、血漿免疫細胞と粘膜上皮細胞の2つの異なる細胞種によって生産される。完全なsIgA構造の最終的な組み立ては、上皮の表面で起こる。天然の組み立てプロセスを模倣するために、いくつかの初期のsIgA生産の試みでは、組換えsIgA成分を利用し、各成分を異なる細胞種で発現させ、精製された高分子IgA(pIgA)とSCの混合を含むイン・ビトロ(in vitro)再構成によるSIgA生産も試験した。複数の発現細胞株を使用する生産方法は、必然的に製造の複雑さとコストを増大させる。sIgAを生産する単一細胞株に基づく方法も評価され、経済的または治療的観点から実用的な収量を生産することができなかった。
植物細胞は、抗体およびその他の種類の組換えタンパク質の生産のために、特に、商業的治療用途または生物試薬用途に多量が必要とされる場合に、有望な代替発現系として浮上している。植物発現系は、生産コストが低く、スケーラビリティが迅速であり、偶発的な動物病原体による汚染のリスクがないという利点があると考えられる。過去の植物および哺乳動物のIgA発現の試みの比較を表1に示す。生産されたsIgAの収量は、これらのシステムで6~57.7μg/gの範囲であると報告されている。
しかしながら、他の試みでは利用可能なデータからより高い収量が提案されており、これらのアプローチは、その後の分析に基づいて完全に組み立てられたsIgAではなく、単量体IgAをなんとか生産するにすぎない。他のアプローチには、個々の植物の組織中の個々のsIgA成分の発現と、その後の植物の交配による4つ全ての成分タンパク質を含む後代の作出が含まれている。しかしながら、この研究から、生産される抗体の多くが実際に完全に組み立てられた生物活性のあるsIgAであるかどうかはまだ不明である。さらに、実証された発現収量は、後代であっても、商業的に実現可能なレベルをなお下回っている。さらに、収穫された葉からの抽出は、安定であり活性を維持する完全に組み立てられたsIgAを取得するために、非常に短い時間内、通常は12時間以内に行わなければならない。葉の組織は、標的タンパク質の急速な分解で知られている。これは、パイロットおよび生産規模では明らかに難しい。このプロセスは、抽出および精製前の生物活性タンパク質の損失を減らすために葉を冷凍保存できる研究室規模の実験条件下で最も実用的である。最後に、LC、HC、JC、およびSCをそれぞれコードする4つの遺伝子全てを含む遺伝子構築物を使用したアグロバクテリウム媒介形質転換に従う試みがあったが、やはり発現収量の不足および完全に組み立てられたsIgAを安定形態で蓄積できないことが示された。
従って、真核生物系で免疫グロブリン、特にsIgAを商業的に妥当な収率で発現させるための実行可能なアプローチに対する高い需要が依然として残っている。
本発明は、他の産業動物または植物(真核生物)発現系よりも2倍以上高いレベルで、真核細胞において完全に組み立てられた完全分泌抗体(sIgA)の生産のための方法に関する。分泌IgA組成物は、治療薬、予防薬、および診断薬として使用するために、これらの発現系から抽出および精製することができる。
一般に、発現ベクターは、キメラ核酸構築物を構成する作動可能に連結された以下の成分:宿主特異的タンパク質貯蔵遺伝子由来のプロモーター、タンパク質貯蔵体などのタンパク質貯蔵オルガネラに標的化することができるシグナルペプチド配列、およびシグナルペプチド配列と翻訳フレーム内で連結された免疫グロブリン成分の1つをコードする配列を含み得る。それぞれ同じプロモーターおよびシグナルペプチドを有する免疫グロブリン成分のうちの1つを含む複数の核酸構築物で、必要な全て免疫グロブリン成分が細胞に導入されるように共形質転換された宿主細胞は、その後、完全に組み立てられたIg分子を発現する。これらの構築物はまたそれぞれ、一般にベクターの、転写開始調節領域とは反対の末端に転写終結領域を含む。
1以上の実施形態において、適切な植物形質転換ベクターは、植物において、植物タンパク質貯蔵体における発現およびタンパク質の組み立てのための関連する上流および下流配列を用いて操作用に設計される。
この発現系(ExpressTecと呼称)は、予期しないことに、完全に組み立てられた生物活性のある分泌IgA抗体の商業的に実行可能な発現レベルを達成する。有利には、この系は、商業生産規模での抽出および精製まで、完全に組み立てられたsIgA産物を保存することができる。
よって、本発明の利点には、限定するものではないが、完全に組み立てられ機能的なSIgAを生成できる真核発現宿主で発現される分泌IgAの商業的に実現可能な発現収率(>100mg/kg);炎症状態、感染症または自己免疫疾患を含む疾患のための経口送達のためのsIgAを含有する医薬組成物;皮膚、肺および鼻腔の疾患を治療するための局所送達のためのsIgAを含有する医薬組成物;ならびに皮膚、肺および鼻腔の疾患を治療するための非経口送達のためのsIgAを含有する医薬組成物が含まれる。
特許または出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも1つの図面が含まれる。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、請求して必要な手数料を支払えば特許庁により提供される。
詳細な説明
記載したように、植物または他の真核生物系での組換えsIgA生産には、軽鎖(LC)、重鎖(HC)、連結鎖(JC)、および分泌成分(SC)をそれぞれコードする4つの転写単位の共発現とその後の機能的タンパク質への発現成分の細胞内組み立てが必要である。
記載したように、植物または他の真核生物系での組換えsIgA生産には、軽鎖(LC)、重鎖(HC)、連結鎖(JC)、および分泌成分(SC)をそれぞれコードする4つの転写単位の共発現とその後の機能的タンパク質への発現成分の細胞内組み立てが必要である。
一態様において、真核生物発現系において組換えsIgAタンパク質を生産する方法が記載される。これらの方法は一般に、それぞれsIgAの軽鎖(LC)、重鎖(HC)、連結鎖(JC)、または分泌成分(SC)をコードする各転写単位を含む少なくとも4つの異なる核酸構築物で真核細胞を共形質転換することを含む。有利には、各核酸構築物は、LC、HC、JC、およびSCポリペプチドのそれぞれが発現および組み立てのために細胞の同じオルガネラを標的とするように、同じプロモーターおよびシグナル配列を含む。1以上の実施形態において、各核酸構築物は、それに連結されたポリペプチドを真核細胞のタンパク質貯蔵オルガネラに標的化することができるタンパク質貯蔵特異的シグナル配列をコードするDNA配列に作動可能に連結されたタンパク質貯蔵遺伝子由来プロモーターと、シグナル配列と翻訳フレーム内で連結された第2のDNA配列とを含む(前記第2のDNA配列は、軽鎖(LC)、重鎖(HC)、連結鎖(JC)、またはsIgAの分泌成分(SC)をコードする転写単位である)。1以上の実施形態では、sIgA成分をコードする転写単位は、コドンが最適化されたDNA配列を含む。
1以上の実施形態において、第2のDNA配列は、sIgAの重鎖をコードし、例えば、配列番号1、配列番号2、配列番号3、およびその保存的に改変された変異体または相同体からなる群から選択される重鎖定常領域;ならびに配列番号4、配列番号9、およびその保存的に改変された変異体または相同体からなる群から選択される重鎖可変領域をコードする。1以上の実施形態において、sIgAの重鎖(可変領域および定常領域の両方)をコードするDNA配列は、配列番号12、またはその保存的に改変された変異体もしくは相同体を含む、から本質的になる、またはさらにはからなる。1以上の実施形態において、第2のDNA配列は、配列番号5、およびその保存的に改変された変異体または相同体からなる群から選択される軽鎖定常領域;ならびに配列番号6、配列番号10、配列番号11、およびその保存的に改変された変異体または相同体からなる群から選択される軽鎖可変領域をコードする。1以上の実施形態において、sIgAの軽鎖(可変領域および定常領域の両方)をコードするDNA配列は、配列番号13、またはその保存的に改変された変異体もしくは相同体を含む、から本質的になる、またはさらにはからなる。1以上の実施形態において、第2のDNA配列は、配列番号7およびその保存的に改変された変異体または相同体からなる群から選択される連結鎖をコードする。1以上の実施形態において、sIgAのJ鎖をコードするDNA配列は、配列番号14、またはその保存的に改変された変異体もしくは相同体を含む、から本質的になる、またはさらにはからなる。1以上の実施形態において、第2のDNA配列は、配列番号8、その保存的に改変された変異体または相同体からなる群から選択される分泌成分をコードする。1以上の実施形態において、sIgAの分泌成分をコードするDNA配列は、配列番号15、またはその保存的に改変された変異体もしくは相同体を含む、から本質的になる、またはさらにはからなる。
記載したように、発現構築物は、それに連結されたポリペプチド(例えば、発現されたsIgA成分)を真核宿主発現細胞のタンパク質貯蔵オルガネラに標的化することができる特定のプロモーター/シグナル配列を含み、従って、上記の配列はそれぞれ、各プロモーター/シグナル配列とともに翻訳フレーム内で連結されている。1以上の実施形態では、タンパク質貯蔵遺伝子および/またはシグナルペプチドは、真核細胞に対して天然である。他の実施形態では、タンパク質貯蔵遺伝子およびシグナルペプチドは、真核細胞に対して異種である。1以上の実施形態では、シグナル配列は、イネ・グルテリンシグナル配列をコードし、例えば、配列番号18またはその保存的に改変された変異体もしくは相同体を含む、から本質的になる、またはさらにはそれからなるイネ・グルテリンをコードする。1以上の実施形態では、プロモーターおよびシグナル配列の両方が、グルテリン(Gt1)プロモーターおよびシグナル配列をコードし、配列番号16およびその保存的に改変された変異体または相同体からなる群から選択される核酸配列を有する。相同種子タンパク質貯蔵配列も使用可能である。同様に、例示された配列のコドン最適化変異体は、以下でより詳細に述べるように、他の植物種に直接適用することができる(例えば、イネGt1プロモーターのコドン最適化型をコムギ、オオムギなどに適用することができる)。配列番号17およびその保存的に改変された変異体または相同体からなる群から選択される例示的な配列とともに、様々な適切なターミネーター配列を使用することができる。
好ましい核酸構築物は、実施例に例示されている。1以上の実施形態において、真核生物発現系においてsIgA重鎖を発現させるために例示される発現構築物は、配列番号19またはその保存的に改変された変異体もしくは相同体を含む、から本質的になる、またはさらにはからなる。1以上の実施形態において、真核生物発現系においてsIgA軽鎖を発現させるために例示される発現構築物は、配列番号20またはその保存的に改変された変異体もしくは相同体を含む、から本質的になる、またはさらにはからなる。1以上の実施形態において、真核生物発現系においてsIgA J鎖を発現させるために例示される発現構築物は、配列番号21またはその保存的に改変された変異体もしくは相同体を含む、から本質的になる、またはさらにはからなる。1以上の実施形態において、真核生物発現系においてsIgA分泌成分を発現させるために例示される発現構築物は、配列番号22またはその保存的に改変された変異体もしくは相同体を含む、から本質的になる、またはさらにはからなる。
1以上の実施形態において、真核細胞は、好ましくは、sIgA成分に使用された同じプロモーターおよびシグナルペプチドによって駆動される選択マーカーを含む核酸構築物でさらに形質転換される。あるいは、選択マーカーは、異なるプロモーターおよびシグナルペプチドによって駆動されてもよい。
形質転換は、好ましくはマイクロプロジェクタイル衝撃を用いて行われる。1以上の実施形態において、衝撃に使用される各微粒子またはナノ粒子は、4つの核酸構築物のそれぞれを含む。1以上の実施形態において、選択マーカーを含む核酸構築物がこの粒子にさらに含まれる。言い換えれば、核酸構築物の全てが、好ましくは、衝撃のために使用される粒子のそれぞれに含まれる。1以上の実施形態において、多数回の衝撃、例えば少なくとも12回の衝撃が各カルスに行われる。
一態様では、植物種子においてsIgAタンパク質を発現させる方法が記載される。これらの方法は一般に、sIgAの軽鎖(LC)、重鎖(HC)、連結鎖(JC)、または分泌成分(SC)をコードする各転写単位をそれぞれ含む少なくとも4つの異なる核酸構築物で植物細胞を共形質転換することを含む。核酸構築物はそれぞれ、それに連結されたポリペプチドを植物種子内胚乳細胞に標的化することができるシグナル配列に作動可能に連結された種子貯蔵プロモータータンパク質をコードする配列と、シグナル配列とともに翻訳フレーム内で連結された第2のDNA配列とを含む(前記第2のDNA配列は、IgAの軽鎖(LC)、重鎖(HC)、連結鎖(JC)、または分泌成分(SC)をコードする転写単位である)。1以上の実施形態において、植物細胞は、好ましくはsIgA成分に使用された同じプロモーターおよびシグナルペプチドによって駆動される選択マーカーを含む核酸構築物でさらに形質転換される。
1以上の実施形態において、これらの方法は、好ましくは、完全に組み立てられたおよび生物活性のあるsIgAを含むsIgA成分を含有する種子を生産するために形質転換植物細胞から植物を十分な時間生育させることを含む。種子は植物から採取することができ、組み立てられたsIgAは、採取された種子の乾燥種子重の少なくとも0.1%、好ましくは、乾燥種子重の少なくとも0.3%を占める。1以上の実施形態において、sIgAは、種子中の総可溶性タンパク質産物の少なくとも約25%を占める。
sIgAに関して本明細書に述べられる特定の技術は、他の免疫グロブリンを含む他の複数のタンパク質に適用可能であると考えられる。参照しやすいように、本明細書の考察では例示的実施形態としてsIgAを使用する。1以上の実施形態において、本発明の技術は、少なくとも約100mg/kg、好ましくは少なくとも約200mg/kg、より好ましくは少なくとも約500mg/kg、より好ましくは少なくとも約1g/kg、より好ましくは少なくとも約2g/kg、より好ましくは少なくとも約3g/kg、いっそうより好ましくは約3g/kg~約18g/kg、いっそうより好ましくは約3.5g/kg~約16g/kg(1kgのバイオマス、すなわち穀粉から抽出可能なタンパク質の漁から測定した場合)の発現収率の達成を可能とする。
上記のアプローチは、トランスジェニック植物の様々な組織で組換えタンパク質を無差別に発現させていた以前のアプローチとは対照的に、所望のタンパク質の部位特異的発現を容易にする。1以上の実施形態において、このアプローチは、好ましくは、発現の標的とされるタンパク質に特異的な配列を選択する代わりに、または他の一般的なウイルスプロモーター系を使用する代わりに、宿主細胞に特異的なプロモーターおよびシグナルペプチドを利用する。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、オペーク2(O2)、プロラミンボックス因子(PBF)、およびイネ胚乳bZIPタンパク質(Reb)などの少なくとも1つの転写因子をコードする核酸をさらに含み得る。1以上の実施形態では、種子特異的プロモーターに作動可能に連結された1以上の植物転写因子の異種核酸コード配列を含むトランスジェニック植物が本明細書に記載されており、植物細胞における転写因子の発現は、軽鎖(LC)、重鎖(HC)、結合鎖(JC)、または1以上の転写因子が相互作用する種子特異的プロモーターに作動可能に連結されたsIgAの分泌成分(SC)をコードするDNA配列の転写を活性化するために有効である。
記載されているように、発現ベクターは、タンパク質貯蔵オルガネラ特異的プロモーターを含む。トランスジェニック植物の場合、発現ベクターは、種子特異的プロモーターを含む。異種核酸構築物の転写調節領域またはプロモーター領域は、好ましくは、種子特異的プロモーター、例えば、種子胚、アリューロン、内胚乳の細胞外層もしくは内胚乳の中心に特異的な、その制御下で遺伝子産物の発現を指示することができるプロモーター、または、デンプンもしくはタンパク質合成に特異的な、その制御下で遺伝子産物の発現を指示することができるプロモーターである。一般に、発現構築物は、好ましくは、種子の成熟中に特異的に上方調節された活性(25%を超える)を示すプロモーターを含む。植物系のプロモーターは、通常、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、エンバク、ライムギ、トウモロコシ、キビ、ライコムギまたはモロコシなどの穀類に由来する。このようなプロモーターの例としては、以下の成熟特異的単子葉植物貯蔵タンパク質:イネ・グルテリン、オリジン、およびプロラミン、オオムギ・ホルデイン、コムギ・グリアジンおよびグルテリン、トウモロコシ・ゼインおよびグルテリン、エンバク・グルテリン、およびソルガム・カフィリン、キビ・ペニセチン、およびライムギ・セカリンの1つに関連する成熟特異的プロモーター領域が挙げられる。成熟種子における発現に適したいくつかのプロモーターには、内胚乳の外層で遺伝子発現をもたらすグルテリン(Gt-1)プロモーターおよび内胚乳の中心で遺伝子発現をもたらすグロブリン(Glb)プロモーターが含まれる。作動可能に連結されたコード配列の転写を調節するためのプロモーター配列には、天然プロモーター、または種子特異的転写を指示することができるその領域、および1以上のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターが含まれる。
いくつかの場合において、プロモーターは、核酸構築物が導入される植物と同じ植物種に由来する。
あるいは、1つのタイプの植物由来の種子特異的プロモーターは、異なる植物に由来する遺伝子コード配列の転写を調節するために使用可能である。様々な植物宿主細胞に関して多くのタイプの適当な発現ベクターおよび適切な調節配列が当技術分野で知られている。一般に、転写および翻訳調節配列としては、限定されるものではないが、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列が挙げられる。例えば、イネ(Oryza種)における完全に機能する/組み立てられたsIgAの異所性発現に関するデータが提示されているが、イネGt1リーダーに連結されたイネG1bプロモーターは、オオムギおよびコムギなどの他のイネ属で使用可能であり、さらに、コドンが所与の宿主種に対して最適化されているとすれば、同等のレベルのタンパク質発現が達成されるであろうと考えられる。当業者は、イネで例示された情報を他のイネ属に適用して、過度の実験を行うことなく同様の結果を達成できることを理解するであろう。この情報をオオムギに適用する特定の非限定的な例が実施例に示される。
効果的な種子誘導性または種子調節転写開始領域(例えば、プロモーター)は、様々な種子組織からおよび/または種子発達の様々な段階で単離され得る。種子組織特異的遺伝子由来のプロモーターは、本明細書での使用に適している。より具体的には、本発明で使用するための代表的な種子関連プロモーターには、イネ・グルテリン多重遺伝子ファミリー、Gt1、Gt2、Gt3、GluA-3、およびGluB-1由来のプロモーターが含まれる。これらの遺伝子のプロモーター領域は、例えば、GenBank登録番号D26365およびD26364(イネ・グルテリン遺伝子)、GenBank登録番号X54313(イネGluA-3遺伝子)、GenBank登録番号Y00687(イネ・グルテリン遺伝子)、GenBank登録番号X54193(イネGlu-B遺伝子);GenBank登録番号X54192(イネGluB-2遺伝子);GenBank登録番号X54314(イネGluB-1遺伝子);GenBank登録番号L36819 M28157(イネGt2遺伝子);GenBank登録番号M28158(イネGt3遺伝子);GenBank登録番号M28156(イネGt1遺伝子);GenBank登録番号D26363、D26366+D26367、D26368およびD26369(イネ・グルテリン遺伝子);GenBank登録番号D00584(イネ・プレプログルテリン遺伝子);GenBank登録番号X52153(イネ・グルテリン遺伝子)として記載されている。一般に、これらのプロモーターは、種子発達中に活性化し、直接内胚乳特異的発現を指示する。
他の適切な種子関連プロモーターとしては、イネ・プロラミン遺伝子(GenBank登録番号D73384)由来のプロモーター領域;未熟なアリューロン層で発現を指示するオオムギB22EL8遺伝子プロモーター;オオムギLTp遺伝子(GenBank登録番号X57270)のプロモーター;オオムギβ-アミラーゼ(GenBank登録番号X52321およびM36599)およびβ-グルカナーゼ遺伝子プロモーター、例えば、オオムギGlb遺伝子プロモーター(GenBank登録番号X56775);オオムギCMd遺伝子プロモーター(GenBank登録番号X13198)、ならびに種子貯蔵タンパク質のオオムギ・ホルデイン遺伝子ファミリー、例えば、B-、C-、およびD-ホルデイン遺伝子由来のプロモーター(ホルデインB1遺伝子プロモーター、GenBank登録番号X87232;オオムギ・ホルデインCプロモーター、GenBank登録番号M36941;オオムギhor1-17遺伝子、GenBank登録番号X60037)が含まれる。ホルデイン遺伝子プロモーター、例えば、Hor3遺伝子プロモーター(GenBank登録番号X84368)は、内胚乳での対応する遺伝子の特異的発現を指示する。本発明において使用するためのさらなる種子誘導型プロモーターとしては、トウモロコシ・ゼイン遺伝子プロモーターおよびコムギ・グルテニン遺伝子由来のプロモーターがある。本発明の実施において使用するためのプロモーター供給源としての代表的なコムギ・グルテニン遺伝子配列には、GenBank登録番号U86O28、U86O29、およびU86O30が含まれる。上記プロモーターの配列、および/またはそのようなプロモーターが得られる得る構造配列は、明示的に参照により本明細書の一部として援用される。
種子関連トウモロコシプロモーターも本発明で使用される。例えば、トウモロコシO2-オペーク2遺伝子プロモーター(GenBank登録番号M29411);トウモロコシSh2-シュランケン2遺伝子プロモーター(GenBank登録番号S48563);Bt2-ブリットル2遺伝子プロモーター;およびZp1ゼイン遺伝子プロモーターがあり、これらは全て内胚乳特異的発現を誘導する。さらなる例としては、Agp1およびAgp2遺伝子プロモーターが含まれ、これらは胚特異的プロモーターである。上記プロモーターの配列、および/またはそのようなプロモーターが得られる得る構造配列は、明示的に参照により本明細書の一部として援用される。
上記プロモーターはいずれも別種から得てもよい。例えば、イネのGt1遺伝子プロモーターなどのプロモーターは、当技術分野で公知の従来のハイブリダイゼーション技術を用いて、例えばコムギ、エンバクなどの他の穀類由来核酸含有抽出物から単離され得る。それにもかかわらず、本発明の実施形態で使用するためのプロモーターは、植物種子組織で優先的に発現されるため、本明細書に記載の方法は、内胚乳細胞、いくつかの実施形態ではタンパク質貯蔵体などの内胚乳細胞オルガネラにおけるタンパク質の局在を対象とする。
対象タンパク質をコードすることに加え、発現カセットまたは異種核酸構築物は、要すればタンパク質のプロセシングおよびタンパク質の輸送を可能とするシグナルペプチドをコードするDNAを含む。例示的シグナル配列は、単子葉成熟特異的遺伝子:グルテリン、プロラミン、ホルデイン、グリアジン、グルテニン、ゼイン、アルブミン、グロブリン、AOPグルコースピロホスホリラーゼ、デンプンシンターゼ、分岐酵素、Em、およびleaに関連する配列である。タンパク質貯蔵体のシグナルペプチドをコードする例示的配列は本明細書で特定され、bx7シグナルペプチド配列(配列番号23)、Glub-2シグナルペプチド配列(配列番号24)、Gt3シグナルペプチド配列(配列番号25)、Glub-1シグナルペプチド配列(配列番号26)、プロラミンシグナルペプチド配列(配列番号27)、イネシステインペプチダーゼシグナルペプチド配列(配列番号28)、D-ホルデインシグナルペプチド配列(配列番号29)が含まれる。
シグナル/標的化/輸送配列の別の例は、α-アミラーゼ、プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、DNアーゼ/RNアーゼ、(1-3)-β-グルカナーゼ、(1-3)(1-4)-β-グルカナーゼ、エステラーゼ、酸性ホスファターゼ、ペントサミン、エンドキシラナーゼ、β-キシロピラノシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、β-グルコシダーゼ、(1-6)-β-グルカナーゼ、ペリオキシダーゼ、およびリゾホスホリパーゼに関連するシグナル配列を含み、種子発芽中にアリューロン細胞からの異種タンパク質の分泌を促進するために有効な配列である。
多くのタンパク質貯蔵タンパク質が成熟特異的プロモーターの制御下にあり、このプロモーターはタンパク質体に標的化するためにシグナル配列に作動可能に連結されるので、プロモーターおよびシグナル配列は、単一のタンパク質貯蔵遺伝子から単離することができ、その後、キメラ遺伝子の構築において免疫グロブリンタンパク質に作動可能に連結される。プロモーターとシグナル配列の組合せの一例が本明細書に挙げられ、この場合、プロモーターおよびシグナル配列は両方ともイネGt1遺伝子調節領域に由来する。あるいは、プロモーターおよびリーダー配列は、異なる遺伝子に由来してもよい。プロモーターとシグナル配列の組合せの一例は、イネGt1リーダー配列(配列番号16および18)に連結されたイネGlbプロモーターに連結される。
植物で操作するために設計された発現ベクターまたは異種核酸構築物は、発現カセットの上流および下流にコンパニオン配列をさらに含む。転写終結領域は、転写開始領域と通常関連する遺伝子から取得してもよいし、または異なる遺伝子から取得してもよい。例示的な転写終結領域としては、アグロバクテリウムTiプラスミド由来のNOSターミネーターおよびイネα-アミラーゼターミネーターが含まれる。
また、それぞれ高レベルの転写および適正な転写終結を最適化するために発現カセットにポリアデニル化テールを付加してもよい。ポリアデニル化配列としては、限定されるものではないが、アグロバクテリウム・オクトピンシンセターゼシグナル、または同種のノパリンシンターゼが挙げられる。
記載したように、これらの細胞はまた、選択マーカーをコードする核酸で共形質転換することができる。植物細胞における選択のために適切な選択マーカーとしては、限定されるものではないが、例えば、カナマイシン(nptII)、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、アンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。さらなる選択マーカーとしては、ビアラホス耐性をコードするbar遺伝子;グリホセート耐性をコードする変異型EPSPシンターゼ遺伝子;ブロモキシニル耐性を付与するニトリラーゼ遺伝子;イミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を付与する変異型アセト乳酸シンターゼ遺伝子(ALS);およびメトトレキサート耐性DHFR遺伝子が挙げられる。
使用される特定のマーカー遺伝子は、導入された核酸を欠く細胞と比較して、形質転換細胞の選択を可能にするものである。選択マーカー遺伝子は、組織培養段階での選択を容易にする遺伝子、例えば、カナマイシン、ハイグロマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子である。
ベクター配列は好ましくは安定に形質転換され、構造的発現のために宿主ゲノムに組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単子葉植物細胞、例えば、単子葉内胚乳細胞である。単子葉起源の例示的植物としては、イネ科として知られる分類学的な科のメンバーを含む。この科には、食用品種が穀類または穀物として知られているイネ科草本の全てのメンバーが含まれる。穀類には、コムギ(Triticum種)、イネ(Oryza種)、オオムギ(Hordeum種)、エンバク(Avena種)、ライムギ(Secale種)、トウモロコシ(Zea種)、およびキビ(Pennisettum種)などの広範な種が含まれる。本発明の一実施形態では、好ましい科のメンバーは、イネ、コムギおよびオオムギである。
科のメンバーに由来する植物細胞または組織は、本明細書に記載の発現ベクターで形質転換することができる。トランスジェニック植物細胞は、異種核酸配列を発現する植物細胞を同定および選択するための適切な選択剤を含む培地で培養される。異種核酸配列を発現する植物細胞が選択された後、選択されたトランスジェニック植物細胞から全植物が再分化される。選択培地上または選択培地中で増殖する植物細胞は、通常、同じ培地の新鮮な供給源に移され、再度培養される。次いで、外植片を再分化条件下で培養して、再分化植物苗条を生成する。苗条が形成された後、苗条を選択発根培地に移して、完全な幼植物体を得る。次いで、幼植物体を生育させて、形質転換植物を繁殖させるための種子、挿し穂などを得ることができる。この方法は、植物細胞の効率的な形質転換およびsIgAを生産できるトランスジェニック植物の再分化を提供する。
続いて、従来の植物育種技術を用いて遺伝子交配を行う。しかしながら、本発明の方法は、交配の必要なく、所与の植物細胞(およびその後の植物)における機能的sIgAの発現および組み立てを可能にすると理解される。言い換えれば、第1世代の植物は、完全な生物活性sIgA分子を商業的に適切な発現収率で発現するために必要な4つの成分全てで共形質転換されます。必要に応じて発現収率をさらに高めるために交配を行うことができる。
このアプローチの一例では、植物が種子特異的プロモーターの制御下でsIgAを発現する、第1の安定したトランスジェニック植物系統が作出される。様々なレベルのsIgA発現を有するそのような多数の株を作出することができる。植物は、種子特異的プロモーターの制御下でsIgAを発現する第2のトランスジェニック植物系統と交配される。得られた交配(F2)は、使用したプロモーターに応じて、1以上の特定の種子組織でsIgAの発現レベルが高い。
sIgAタンパク質の発現は、ウエスタンブロット、ELISA、PCR、HPLC、NMR、または質量分析などの標準的な分析技術を、発現する特定のタンパク質に特異的な生物活性に関するアッセイとともに使用して確認することができる。
採取された種子から調製された植物種子製品もまた、本開示において提供される。好ましくは、IgA(単量体およびsIgA)の総量は、種子製品中の総可溶性タンパク質の少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約25%、さらにより好ましくは少なくとも約35%である。好ましくは、sIgAタンパク質は、種子製品中の総可溶性タンパク質の少なくとも約5%、より好ましくは少なくとも約10%、最も好ましくは少なくとも約25%を占める。データに示されるように、米粒におけるsIgAタンパク質の発現は、総可溶性タンパク質の少なくとも約25%を占める。1以上の実施形態では、sIgAは米粉から抽出可能である。
本発明の実施形態はまた、植物種子発現系などの真核生物発現系において、分泌IgAの100mg/kgを超え、最大約16g/kgの発現収率で組換え的に生産された精製sIgAタンパク質に関する。本開示はまた、記載された発現系において組換え的に生産された免疫グロブリンタンパク質を含む組成物、およびそのような組成物を作製する方法を提供する。
1以上の実施形態において、本発明に従って生産される免疫グロブリンは、実質的に未精製の形態(すなわち、組成物の少なくとも10~20%が植物材料を含む)で対象に投与してもよいし、または免疫グロブリンタンパク質は、成熟種子の生成物(例えば、穀粉、抽出物、麦芽もしくは全種子組成物など)から単離もしくは精製し、対象への送達のために製剤化してもよい。免疫グロブリンは、粉砕、濾過、熱、圧力、塩抽出、蒸発、またはクロマトグラフィーを含む様式によって種子生成物から精製することができる。
いくつかの実施形態では、成熟単子葉種子から得られた穀粉、抽出物、または麦芽、および未精製形態の1以上の種子生産免疫グロブリンタンパク質を含有する種子組成物が提供される。穀粉から免疫グロブリンタンパク質を単離することは、種子を製粉して穀粉を形成し、その穀粉を緩衝水溶液で抽出し、任意にその抽出物をさらに処理して抽出物を部分的に濃縮し、および/または望ましくない成分を除去することによって抽出物組成物を形成することを伴い得る。好ましい方法では、イネの種子などの成熟した単子葉植物の種子を製粉し、次いでその粉を生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水(「PBS」)、重炭酸アンモニウムバッファー、酢酸アンモニウムバッファーまたはトリスバッファーなどのバッファーに懸濁させる。重炭酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムなどの揮発性バッファーまたは塩は、塩除去工程の必要性をなくし、従って抽出処理方法を簡素化する場合がある。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物で発現されるタンパク質のレベルは、植物種子からの粗抽出物または実質的に精製されていない組成物から評価される。いくつかの実施形態では、成熟した単子葉種子から得られる穀粒または製粉穀粒または穀粉組成物、抽出物組成物、または麦芽組成物は、実質的に精製されていない形態で生産される。免疫グロブリンタンパク質は、総可溶性タンパク質1kgあたり約0.5~3グラムタンパク質の量で存在し得る。穀物組成物について、存在する免疫グロブリンタンパク質のレベルは、総種子重の0.05~0.3%であり得る。抽出組成物の場合、免疫グロブリンタンパク質は、総抽出物重量よりもさらに濃縮され得る。
穀粉懸濁液は、4~55℃の温度で、通常30分~4時間振盪しながらインキュベートする。得られたホモジネートを濾過または遠心分離のいずれかによって清澄化する。清澄化した濾液または上澄み液は、脂質、糖および塩などの夾雑物を除去するために、例えば限外濾過または透析またはその両方によってさらに処理してもよい。最後に、例えば凍結乾燥によって材料を乾燥させて、ドライケーキまたは粉末を形成することができる。抽出物は、高タンパク質収量の利点を組み合わせ、本質的にタンパク質精製に伴う損失は限られたものである。
一般に、成熟種子の産物で一旦産生されたタンパク質は、濾過、アフィニティーカラム、ゲル電気泳動、および他のそのような標準的な手順など、当技術分野で知られている標準的な方法によってさらに精製することができる。次いで、精製されたタンパク質は、ヒトまたは動物などの対象への送達のために必要に応じて製剤化することができる。本発明は、ヒトおよび獣医学の両方の用途に使用される。ヒトまたは獣医学的治療製剤のために、2種類以上のタンパク質を組み合わせることができる。タンパク質は精製し、タンパク質の非食物投与を必要とする生物医学的用途に使用してもよい。
1以上の実施形態において、単離または精製したタンパク質は、治療または予防組成物において使用され得る。そのような組成物は多くの場合、担体または賦形剤を含む。担体という用語は、免疫グロブリンが投与のために分散され得る、希釈剤、賦形剤、ビヒクルなどを指して本明細書で使用される。適切な担体は薬学的に許容されるものである。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、過度の毒性、刺激、またはアレルギー反応なく対象に投与することができ、許容できない生物学的効果を引き起こさないか、それが含まれている組成物の他の成分のいずれかと有害な相互作用を生じない、生物学的にまたはその他の点で望ましくないものではないことを意味する。薬学的に許容される担体は、当業者に周知であるように、本質的には、免疫グロブリンまたは他の薬剤の分解を最小限に抑え、対象における有害な副作用を最小限に抑えるように選択される。薬学的に許容される成分には、獣医学的使用およびヒトの薬学的使用に許容されるものが含まれ、投与経路に依存する。例えば、注射による投与に適した組成物は、通常、滅菌等張水性バッファー中の溶液である。例示的な担体には、規定の(n.)生理食塩水(約0.9%NaCl)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、滅菌水/蒸留オートクレーブ水(DAW)、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、正常尿膜液、様々な水中油型または油中水型エマルション、ならびにジメチルスルホキシド(DMSO)または他の許容されるビヒクルなどの水溶液が含まれる、
組成物は、担体中に分散された治療上有効な量の免疫グロブリンを含むことができる。本明細書で使用される場合、「治療上有効な」量とは、研究者または臨床医によって求められる組織、系、または対象の生物学的または医学的応答を誘発する、特に、感染症に対して何らかの望ましい保護効果または治療効果を誘発する量を指す。当業者は、病態が完全に根絶または予防されなくても、対象においてその病態またはその症状および/または効果が部分的に改善または軽減される場合に、ある量が治療上「有効」であると考えられ得ることを認識している。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の免疫グロブリンを、組成物の総重要を100重量%として、約5重量%~約95重量%、好ましくは免疫グロブリンを約30重量%~約90重量%含む。いくつかの実施形態では、記載された免疫グロブリンの2つ以上のタイプの組合せを組成物に含めることができる。
このような組成物は、意図する送達のタイプのための製剤を含むことができる。送達タイプとしては、例えば、非経口、腸内、吸入、鼻腔内または局所送達を含み得る。非経口送達には、例えば、静脈内、筋肉内、または坐剤投与を含み得る。腸溶送達には、例えば、非栄養性の薬学的に許容される賦形剤を用いて作製された丸薬、カプセル、もしくは他の製剤、またはトランスジェニック植物からの栄養素を伴う、例えば、そのタンパク質が製造される穀粒抽出物中、もしくはトランスジェニック植物以外の供給源からの栄養素を伴う組成物の経口投与を含み得る。このような栄養素には、例えば、塩類、糖類、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸、ペプチド、および免疫グロブリンタンパク質以外のタンパク質が含まれる。鼻腔内および吸入送達システムには、鼻孔または口腔へのスプレーまたはエアロゾルを含み得る。局所送達には、例えば、クリーム、局所スプレー、または軟膏を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物はトランスジェニック植物の夾雑物を実質的に含まず、好ましくは植物材料の含有は20%未満、より好ましくは10%未満、最も好ましくは5%未満である。いくつかの実施形態では、好ましい投与経路は腸管であり、好ましくは、組成物は非栄養性である。免疫グロブリン型タンパク質の様々な安定化製剤は、2019年9月5日に出願された同時係属PCT/US2019/049709に詳細に記載されており、その全内容は参照により本明細書の一部として援用される。
当業者によって理解されるように、場合によっては、非天然コドンを有する免疫グロブリンタンパク質コードヌクレオチド配列を使用することが有利であり得る。例えば、免疫グロブリンタンパク質の発現率を高めるため、または天然配列から生成された転写物よりも長い半減期などの望ましい特性を有する組換えRNA転写物を生成するために、特定の真核宿主に好まれるコドンを選択することができる。一例として、イネで発現する遺伝子のコドンは、3番目のコドン位置にグアニン(G)またはシトシン(C)が豊富であることが示されている。低G+C含量を高G+C含量に変更すると、オオムギ粒の外来タンパク質遺伝子の発現レベル高まることが判明している。遺伝子をコードするタンパク質は、遺伝子クローニングのための適切な制限部位とともにイネ遺伝子コドンのバイアスに基づいて合成することができる。次に、これらの「コドンが最適化された」遺伝子を、種子指向発現用の調節/分泌配列に連結した後、これらのキメラ遺伝子を適切な植物形質転換ベクターに挿入する。
異種核酸構築物は、免疫グロブリンタンパク質のコード配列を(i)単独で、(ii)免疫グロブリンタンパク質コード配列が優性なコード配列である融合タンパク質もしくはシグナルペプチドなどの付加的コード配列と組み合わせて;(iii)適切な宿主におけるコード配列の発現に有効な、プロモーターおよびターミネーター要素もしくは5’および/もしくは3’非翻訳領域などのイントロンおよび制御要素などの非コード配列と組み合わせて;および/または(iv)免疫グロブリンタンパク質コード配列が異種遺伝子であるベクターまたは宿主環境において含んでもよい。
意図する用途に応じて、発現構築物は、全免疫グロブリン成分タンパク質またはその一部をコードする核酸配列を含み得る。例えば、免疫グロブリンタンパク質配列がプローブとして使用するための構築物に使用される場合、免疫グロブリンタンパク質コード配列の特定の部分のみ、例えば,保存性の高い免疫グロブリンタンパク質領域をコードすることが見出された配列のみを含む構築物を作製することが有利であり得る。
定義
「異種DNA」とは、別の供給源から宿主真核細胞に導入されたDNA、または同じ植物供給源を含む植物供給源に由来し得るが、通常は異種DNAの発現を調節しないプロモーターの制御下にあるDNAを指す。
「異種DNA」とは、別の供給源から宿主真核細胞に導入されたDNA、または同じ植物供給源を含む植物供給源に由来し得るが、通常は異種DNAの発現を調節しないプロモーターの制御下にあるDNAを指す。
「異種タンパク質」は、異種DNAによりコードされるタンパク質である。
本明細書で使用される場合、「組換え」は、異種核酸配列の導入によって改変された細胞もしくはベクター、または細胞がそのように改変された細胞に由来することへの言及を含む。従って、例えば、組換え細胞は、細胞の天然の(非組換え)形態内では同一の形態で見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異常な発現を示すか、発現が不十分であるか、もしくは意図的な人の介入の結果として全く発現されない天然遺伝子を発現する。
免疫グロブリン成分のコード配列を含む異種核酸構築物が導入された細胞、組織、器官、または植物は、形質転換、トランスフェクト、またはトランスジェニックであると考えられる。トランスジェニックまたは形質転換細胞または植物にはまた、その細胞または植物の後代、およびそのようなトランスジェニック植物を交配親として採用した育種プログラムから生成され、免疫グロブリンのコード配列の存在に起因する変更された表現型を示す子孫が含まれる。従って、本開示の植物は、配列が形質転換手段を介して直接植物に導入されたか、または直接的形質転換によって構築物を最初に受け取った前駆細胞からの世代移入によって導入されたかにかかわらず、導入された核酸配列を含む細胞を有するいずれの植物も含む。
本明細書において「保存的に改変された変異体または相同体」へという場合には、示された正確な配列から改変されているが、それにもかかわらず機能的に同等のタンパク質を発現する、開示された配列の変異体、または同じ遺伝子に類似した構造および進化的起源の配列、もしくは別の種のタンパク質配列であり、よって同等の機能特性を有する配列を指す。アミノ酸またはヌクレオチド配列は、一定レベルの類似性を示す場合、相同であると言われる。2つの相同配列が近縁であるか、より遠縁であるかは、同一性パーセント(%)または配列同一性によって示され、それぞれ高いか低いかである。従って、配列「同一性」またはアミノ酸「同一性」は、本明細書では、特定の比較ウィンドウにわたって最大の一致のために整列させた場合の、2つ以上の核酸またはアミノ酸配列間の配列の関係を表すために使用される。2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適な比較のために配列を整列させる。2つの配列間の整列を最適化するために、比較される2配列のいずれかにギャップを導入することができる。整列後、一致した位置(すなわち、両配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置)の数が決定され、比較ウィンドウ内の位置の総数で除算される。次に、この商に100を掛けて、配列またはアミノ酸同一性のパーセンテージを計算する。参照配列に対して特定の%の配列同一性を有する配列は、必ずしもヌクレオチドまたはアミノ酸の総数が同じであるとは限らないことと理解される。従って、特定のレベルの「同一性」を有する配列には、参照配列の一部(すなわち、5’非コード領域、3’非コード領域、コード領域など)のみに対応する配列が含まれる。好ましくは、保存された配列の場合、アミノ酸の保存的に改変された変異体または相同体の配列同一性は、少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、場合によっては少なくとも95%であることである。可変配列の場合、アミノ酸の保存的に改変された変異体または相同体の配列同一性は、少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、場合によっては少なくとも73%である。核酸配列について、相同体または保存的に改変された変異体の場合、配列同一性は少なくとも75%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%である。
「トランスジェニック植物」という用語は、外因性核酸配列、すなわち天然の(「非形質転換」)植物または植物細胞には存在しない核酸配列を組み込んだ植物を指す。従って、その細胞内に異種ポリヌクレオチドを有する植物は、本明細書では「トランスジェニック植物」と呼ばれる。異種ポリヌクレオチドは、ゲノムに安定して組み込まれることが好ましいが、染色体外にあってもよい。本開示のポリヌクレオチドは、好ましくは、ポリヌクレオチドが連続する世代に受け継がれるようにゲノムに安定に組み込まれる。「トランスジェニック」という用語は、本明細書で使用される場合、従来の植物育種法による、または無作為交雑受精、非組換えウイルス感染、非組換え細菌感染、組換え転位、または自然突然変異などの自然に発生する事象によるゲノム(染色体または染色体外)の改変を含まない。
「トランスジェニック」は、本明細書において、最初にそのように改変されたトランスジェニック体および最初のトランスジェニック体の有性生殖または無性再生産によって作出されたトランスジェニック体を含む、異種核酸の存在によってその遺伝子型が改変されたいずれの細胞、細胞株、カルス、組織、植物部分または植物体を含んで使用される。
植物細胞に関して「形質転換された」または「安定に形質転換された」という用語は、植物細胞がそのゲノムに組み込まれた非天然(異種)核酸配列を有し、それが2世代以上にわたって維持されることを意味する。安定に形質転換された細胞は、導入された配列の構成的発現を示す。
タンパク質またはペプチドに関する「発現」という用語は、タンパク質またはペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて産生されるプロセスを指す。このプロセスには、転写と翻訳の両方が含まれる。「発現」という用語は、DNA配列からのRNAの生成に関しても使用される場合がある。
核酸配列を細胞に挿入するという文脈で「導入された」という用語は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の組み込みを含み、そこでその核酸配列は、細胞のゲノム(例えば、染色体、プラスミド、色素体、またはミトコンドリアDNA)に組み込まれる得か、自律レプリコンに変換され得るか、または一過性に発現され得る(例えば、トランスフェクトmRNA)。
「宿主細胞」とは、ベクターを含み、本発明による異種核酸配列の複製および/または転写および/または発現を補助する細胞を意味する。
「植物細胞」とは、未分化組織(例えば、カルス)、ならびに植物種子、花粉、繁殖体、胚、懸濁培養、分裂組織領域、葉、根、苗条、配偶体、胞子体および小胞子を含む、植物に由来するいずれの細胞も指す。
「成熟植物」という用語は、完全に分化した植物を指す。
「種子生成物」という用語には、限定するものではないが、脱皮全粒種子、穀粉組成物(摩砕によって脱皮され、製粉された種子)、種子抽出物組成物などの種子画分、いくつかの実施形態では、タンパク質抽出物(穀粉のタンパク質画分が炭水化物画分から分離されている場合)、麦芽組成物(麦芽抽出物または麦芽シロップを含む)、および/またはトランスジェニック穀粒に由来する精製タンパク質画分が含まれる。
「生物学的活性」という用語は、当業者によって典型的にそのタンパク質に属する(天然の)いずれの生物学的活性も指す。
「非栄養」という用語は、その主な効果としてレシピエントに栄養を提供しない薬学的に許容される賦形剤を指す。賦形剤は、治療タンパク質の担体として働くこと、消化管内の酸からタンパク質を保護すること、送達される有効成分の時限放出性を提供すること、またはそうでなければ他の方法で免疫グロブリンタンパク質を患者に投与するために製剤に有用な品質を提供することを含め、腸に送達される製剤に以下の働きのうち1つを提供し得る。
「単子葉種子成分」とは、単子葉種子、通常は成熟単子葉種子から抽出可能な炭水化物、タンパク質、および脂質成分を指す。
「種子の成熟」とは、受精から始まり、そこでは、例えば、糖、オリゴ糖、デンプン、フェノール類、アミノ酸、およびタンパク質などの代謝可能な貯蔵物が、液胞標的化の有無にかかわらず、種子(穀粒)の様々な組織、例えば、内胚乳、種皮、アリューロン層、および胚盤上皮に蓄積されて穀粒の肥大、穀粒の充填、および穀粒の乾燥で終わる。
「シグナル配列」は、選択された細胞内または細胞外領域に結合されたペプチドまたはタンパク質を局在化するのに有効なN末端またはC末端ポリペプチド配列である。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、結合したペプチドまたはタンパク質を、内胚乳細胞、特定の実施形態では、細胞内液胞もしくは他のタンパク質貯蔵体、葉緑体、ミトコンドリア、または小胞体などの内胚乳細胞オルガネラ、あるいは宿主細胞からの分泌後に細胞外間隙などの位置に標的化する。
「植物由来」とは、成分の供給源が植物であることを意味する。
「乾燥重量パーセント」または「%乾燥重量」または「パーセント種子乾燥重量」は、例えば、乾燥種子1キログラム当たりの免疫グロブリングラムのタンパク質収量を意味する。例えば、イネで発現させた免疫グロブリンの1%種子乾燥重量は、1キログラムの米粒から10グラムの組み立てられた免疫グロブリンタンパク質が得られることを意味する。
「総タンパク質」および「総可溶性タンパク質」は、別段の明記がない限り、互換的に使用される。従って、別段の記載がない限り、測定された総タンパク質の任意の所与の重量は、当業者によって総可溶性タンパク質を意味すると解釈されるべきである。さらに、μg/mg TSPで与えられた値は、%TSPで与えられた対応する値に相当する。例として、1μg/1mg TSPは、1000μg TSP当たり1μg(または0.001μg/μg TSP)に相当し、これは、μg重量でのTSPのパーセンテージとして表され、μgで測定された0.1%TSPとなる。例えば、30.3μg/mgの総(可溶性)タンパク質。これは、TSP 1μg当たり0.0303μgに換算され、パーセンテージで表すと3.03%TSPに相当する。
単位は、単子葉種子1粒当たりμgとして表すこともできる。この重量は、種子/穀粒の平均重量およびこの重量のどれだけがTSPによって表されるかが当業者に容易に知られている事項であることを考えると、総可溶性タンパク質のパーセンテージと相関させることができる。例えば、米の千粒重は、平均して約20~25グラムであり、これは米粒当たり20~25mg(または20,000~25,000μg)に相当する。一例として、トランスジェニックイネ植物は、通常、一粒当たり190μgの総可溶性タンパク質を産生し、これは、0.8%穀粒重量にほぼ相当する(190μgを25,000μgで割ると0.0076、これを0.8%に切り上げる)。
当技術分野でよく知られているように、「内胚乳」または「内胚乳組織」は、成熟した種子中に見られる種子貯蔵組織である。
「粗抽出物」、「部分的に精製された」または「実質的に精製されていない」という用語は、トランスジェニック単子葉種子から作製された組成物が、クロマトグラフィータンパク質精製および分画工程などの重要な精製工程にかけられていないことを意味する。
本明細書で使用される「および/または」という語句は、2つ以上の項目のリストで使用される場合、挙げられた項目のいずれか1つを単独で使用することもできるし、または挙げられた項目の2つ以上の任意の組合せを使用することもできることを意味する。例えば、組成物が成分A、B、および/またはCを含有または除外すると記載されている場合、その組成物はAのみ;Bのみ;Cのみ;AとBの組合せ;AとCの組合せ;BとCの組合せ;または、A、B、およびCの組合せを含有または除外することができる。
本発明の様々な実施形態のさらなる利点は、本発明の開示及び以下の実施例を検討すれば、当業者には明らかであろう。本明細書に別段の指示がない限り、本明細書に記載の様々な実施形態は必ずしも相互に排他的ではないと考えられる。例えば、一実施形態で説明または描写された特徴は、他の実施形態にも含まれる場合があるが、必ずしも含まれるわけではない。従って、本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態の様々な組合せおよび/または配合を包含する。
本明細書はまた、本発明の様々な実施形態に関連する特定のパラメーターを定量化するために数値範囲を使用する。数値範囲が示される場合、そのような範囲は、範囲の下限値のみを記載するクレーム限定ならびにおよび範囲の上限値のみを記載するクレーム限定を文字通り裏付けるものとして解釈されるべきであることが理解されるべきである。例えば、開示された約10~約100の数値範囲は、「約10より大きい」(上限なし)と記載されているクレームおよび「約100未満」(下限なし)と記載されているクレームを文字通りの裏付けを提供する。
以下、実施例により本発明による方法を説明する。しかしながら、これらの実施例は例として示され、本発明の全範囲に対する限定と見なされるべきではないと理解される。
実施例1
概念実証-米粒における分泌IgAの発現
遺伝子構築物の開発--米粒で組換えSIgAの高発現レベルを得るために、sIgAのLC、HC、J鎖、および分泌成分の4つの遺伝子構築物がそれぞれ開発された(図2~5)。上記の4つのタンパク質アミノ酸配列のそれぞれは、宿主発現系イネ(O.Sativa)のコドン使用優先度に合わせてコドンが最適化されたヌクレオチド配列に逆翻訳されたが、mRNAの安定性または翻訳効率に影響を及ぼし得る内部リピートおよびその他の特徴が変更された。全ヌクレオチド配列を合成し、次いでイネ種子貯蔵タンパク質遺伝子(GenBank登録番号Y00687)プロモーター(Gt1)配列番号16、シグナルペプチドコード配列、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスのT-DNAのノパリンシンターゼ(nos)遺伝子のターミネーター(配列番号:17)を含むpAPI405と呼ばれる骨格プラスミドベクターにインフレームで連結した(図6)。従って、各発現ベクターにおいて、sIgA成分最適化コード配列は、そのシグナルペプチドコード配列(GenBank登録番号Y00687)を含むイネ種子貯蔵タンパク質グルテリン1遺伝子プロモーター(Gt1)の下流およびノパリン合成酵素(nos)遺伝子ターミネーターの上流に作動可能に連結される。重鎖および軽鎖の場合、それぞれの可変領域と定常領域が直列に連結され、プロモーターとターミネーターの間に挿入される。
重鎖:プロモーター---可変-定常---ターミネーター(配列番号19)
軽鎖:プロモーター---可変-定常---ターミネーター(配列番号20)
連結鎖:プロモーター---連結鎖---ターミネーター(配列番号21)
分泌型成分:プロモーター---分泌成分---ターミネーター(配列番号22)
得られたプラスミドを両方向の配列決定により確認し、重鎖の発現についてはpVB85(配列番号19)、軽鎖の発現についてはpVB86(配列番号20)、J鎖の発現についてはVB87(配列番号21)、および分泌成分の発現についてはpVB88(配列番号22)と呼称した。
概念実証-米粒における分泌IgAの発現
遺伝子構築物の開発--米粒で組換えSIgAの高発現レベルを得るために、sIgAのLC、HC、J鎖、および分泌成分の4つの遺伝子構築物がそれぞれ開発された(図2~5)。上記の4つのタンパク質アミノ酸配列のそれぞれは、宿主発現系イネ(O.Sativa)のコドン使用優先度に合わせてコドンが最適化されたヌクレオチド配列に逆翻訳されたが、mRNAの安定性または翻訳効率に影響を及ぼし得る内部リピートおよびその他の特徴が変更された。全ヌクレオチド配列を合成し、次いでイネ種子貯蔵タンパク質遺伝子(GenBank登録番号Y00687)プロモーター(Gt1)配列番号16、シグナルペプチドコード配列、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスのT-DNAのノパリンシンターゼ(nos)遺伝子のターミネーター(配列番号:17)を含むpAPI405と呼ばれる骨格プラスミドベクターにインフレームで連結した(図6)。従って、各発現ベクターにおいて、sIgA成分最適化コード配列は、そのシグナルペプチドコード配列(GenBank登録番号Y00687)を含むイネ種子貯蔵タンパク質グルテリン1遺伝子プロモーター(Gt1)の下流およびノパリン合成酵素(nos)遺伝子ターミネーターの上流に作動可能に連結される。重鎖および軽鎖の場合、それぞれの可変領域と定常領域が直列に連結され、プロモーターとターミネーターの間に挿入される。
重鎖:プロモーター---可変-定常---ターミネーター(配列番号19)
軽鎖:プロモーター---可変-定常---ターミネーター(配列番号20)
連結鎖:プロモーター---連結鎖---ターミネーター(配列番号21)
分泌型成分:プロモーター---分泌成分---ターミネーター(配列番号22)
得られたプラスミドを両方向の配列決定により確認し、重鎖の発現についてはpVB85(配列番号19)、軽鎖の発現についてはpVB86(配列番号20)、J鎖の発現についてはVB87(配列番号21)、および分泌成分の発現についてはpVB88(配列番号22)と呼称した。
プラスミドpAPI146は、植物形質転換における選択マーカーを提供するために使用した。pAPI146は、イネ・ベータグルカナーゼ9遺伝子プロモーターの制御下にあるハイグロマイシンB耐性タンパク質をコードするhpt(ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ)遺伝子からなり、これはイネカルスのみでhpt遺伝子の発現を制限する。
植物の遺伝的形質転換--VB85、VB86、V87、およびVB88プラスミドベクターのプロモーターからターミネーターまでの領域(骨格プラスミド配列を含まない)を含むDNA断片の線形発現カセットは、EcoRIおよびHindIII二重消化で放出させ、マイクロプロジェクタイル衝撃により媒介される、成熟種子(Oryza sativa, subsp. Japonica)から誘導された胚形成カルスの共形質転換に使用した。
次に、sIgAの4つの成分、すなわち、LC、HC、J鎖、および分泌成分をコードする4つの導入遺伝子を含むトランスジェニックイネを、4つの遺伝子のヌクレオチドに特異的なプライマーを使用したPCRによって同定し、その後、土壌に移して温室生育させた(図7)。再分化したトランスジェニック植物は、R0植物またはトランスジェニック事象と呼称し、連続した世代の後代はR1、R2などと呼称する。
トランスジェニック種子の発現スクリーニング分析--354のトランスジェニック事象(R0)から135を発現分析のために収穫した(R1)。完全なsIgAを発現するトランスジェニック植物を同定するために、自家受粉したR1種子におけるヘミ接合導入遺伝子の遺伝的分離のために、複数の種子を分析した。各トランスジェニック事象から8つのR1種子を無作為に選び、脱穀し、96ウェルの1mlマイクロプレートの同じ列の8つのウェルに置床した。200マイクロリットルのPBSバッファー(pH8.3)および2つの直径4mmのスチールビーズを各ウェルに分注した。次に、このプレートをGeno/Grinder(SPEX、NJ)で1,300ストローク/分にて10分間攪拌した後、マイクロプレート遠心機で4,000rpmにて20分間遠心分離することによって、均一な種子タンパク質抽出物を生成した。各種子からの等量の上清タンパク質抽出物をプールした。各トランスジェニック事象からプールされた粗タンパク質抽出物3マイクロリットルをニトロセルロース膜にスポットした。このブロットをトリス緩衝生理食塩水tween-20(TBST)中5%脱脂乳で1時間ブロッキングし、次いで抗軽鎖抗体、抗重鎖抗体、抗連結鎖抗体、および抗分泌成分抗体の4つの抗体の1つとともに1時間インキュベートした。TBSTバッファーで5分間ずつ4回洗浄した後、ドットブロットを対応するHRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)結合抗体とともにTBSTバッファー中で1時間インキュベートした後、TBSTバッファーで4回、各5分間洗浄した。次に、これらのブロットを化学発光基質(SuperSignal、MA)とともに5分間インキュベートし、免疫反応シグナルをProtein Simple Imagerで検出した。免疫ドットブロット発現解析により、完全なsIgAを発現する合計68の陽性トランスジェニック事象が同定された。
ウエスタンブロット解析は、組換えsIgAが還元条件下および変性条件下で各個の抗sIgA成分(重鎖、軽鎖、連結鎖および分泌成分)抗体と特異的に交差反応することをさらに示した。さらに、非変性条件下での免疫ウエスタンブロットは、イネ生産組換えsIgAの4つの成分全てが、ヒト初乳由来sIgAと同じ分子サイズの多重複合体抗体に完全に組み立てられたことを示した(図8)。
同型接合系統の選択--rsIgAを発現する同系接合系統を選択するために、選択された各トランスジェニックイネ事象のR1種子を生育させて次世代を得た。各R1系統について、rsIgA発現の遺伝的分離を評価するために、20を超えるR2種子を免疫ドットブロットによりアッセイした。免疫ドットブロットプロトコールは上記と同じであった。20個のR2種子全てが陽性を示した系統を同系接合体と見なした。
イネで生産されたrsIgAの機能的特性決定--イネ由来のsIgAに生物活性(強力)があるかどうかを評価するために、rsIgAがその標的抗原であるヒト腫瘍壊死因子α(TNF-α)に結合する能力に関して評価した。この評価のためにサンドイッチELISAアッセイを実施した。簡単に説明すると、ELISAマイクロプレートを100mM重炭酸塩/炭酸塩バッファー中のTNF-αでコーティングした。次に、sIgAを発現するイネ種子からの種々の量のタンパク質抽出物を、TNF-αでコーティングされたマイクロプレートのウェルに加え、1時間接種した。TBSTバッファーで4回、各5分間洗浄した後、HRP結合抗ヒト分泌成分抗体をマイクロプレートウェルに加えた。室温で1時間インキュベーションした後、プレートをTBSTバッファーで5分間ずつ4回洗浄した。次いで、TMB基質を使用してプレートを現像し、OD450での吸光度の読み取りを記録した。
イネ由来sIgAの定量-イネ由来sIgA抗体の発現レベルを決定するために、サンドイッチELISAを実施した。ELISAプレートは、100mM重炭酸塩/炭酸バッファーを含む抗ヒトIgA抗体の2μg/ml溶液50μlを使用してコーティングした。一晩インキュベーションした後、プレートをTBS-Tで洗浄した。次いで、1×BSAを含むブロッキングバッファーを添加し、室温で2時間インキュベートした。その後、プレートをTBS-Tで2回洗浄した。陽性対照と粗米抽出物を数段階希釈してプレートに加えた。室温で2時間振盪した後、プレートをTBS-Tで4回洗浄した。次いで、HRP結合抗ヒト重鎖抗体を添加した。室温で1時間インキュベートした後、プレートをTBS-Tで4回洗浄した。次いで、TMB基質を使用してプレートを現像し、OD450での吸光度の読み取りを記録した。標準曲線を作成し、粗抽出物を比較および定量した。
米粒からの組換えsIgAの精製-精製されたイネ由来sIgA抗体を生成するために、2グラムの精米粉を、200mM Tris、150mM塩化ナトリウム、5mM EDTA、0.1%Tween20、および0.00%アジ化ナトリウム、最終pH8.8を含有する20mlの抽出バッファーに加えた。サンプルをオービタルシェーカーで30分間抽出した。次に、4,000xgで20分間の遠心分離を使用して、サンプルを回転沈降させた。上清を、0.2μmフィルターを用いて濾過し、50K脱濾過膜を用いてバッファー交換を行った。最終的なバッファー溶液はpH8.5のTBSであった。この精製には、1mlのプロテインLプレパックHi-Trapカラム(GE、CT)を使用した。カラムは、5カラム容量(cv)の結合バッファーで平衡化した。次いで、サンプルを毎分1mlの速度でロードし、5cvの結合バッファーで洗浄した。次いで、サンプルを、クエン酸ナトリウムバッファー(pH2.0)を用いて500μlの10画分に溶出した。各画分には、溶出バッファーの低いpHを相殺するために、pH12の中和バッファー500μlを含有する。その後、カラムを再平衡化し、洗浄し、20%エタノール溶液中で保存した。各画分、プレカラムサンプル、フロースルー、および洗浄液3μlをニトロセルロース上に置き、抗重鎖抗体を使用してプローブした。結果は、sIgA抗体の大部分が最初の2~3mlに溶出したことを示す。
実施例2
sIgAの全ての発現鎖成分の包含と組み立てを確認し、イネ形質転換体の種子抽出物における組み立てられたsIgAとIgAの高レベルの発現を確認する作業を実施した。非還元SDS-PAGEに続いて、各sIgA成分に特異的な抗体を用いた精米粉抽出物のウエスタンブロッティングにより、4つの鎖タイプの全てが高分子量種に存在し、ヒト初乳から精製されたsIgAおよびヒト血漿血清から精製されたIgAの市販サンプルと同様に移動することが示される。
sIgAの全ての発現鎖成分の包含と組み立てを確認し、イネ形質転換体の種子抽出物における組み立てられたsIgAとIgAの高レベルの発現を確認する作業を実施した。非還元SDS-PAGEに続いて、各sIgA成分に特異的な抗体を用いた精米粉抽出物のウエスタンブロッティングにより、4つの鎖タイプの全てが高分子量種に存在し、ヒト初乳から精製されたsIgAおよびヒト血漿血清から精製されたIgAの市販サンプルと同様に移動することが示される。
プロトコール:sIgA101発現米から選択した量の精米粉を、規定の抽出バッファー(例えば、150mM NaCl、200mM Tris-HCl pH8.3、0.1%Tween-20、5mM EDTA)中10:1の容量:重量で振盪することにより抽出した。使用済みの米粉を低速遠心分離により抽出物から分離し、次いで、シリンジフィルター(例えば、Millipore 0.2または0.45μm、直径25mmの酢酸セルロースディスクフィルター)を使用して上清を迅速に濾過した。清澄化された抽出物は、単量体IgAおよびsIgA参照標準(精製された市販血清IgAおよび初乳IgA調製物)とともに、100~500kDaの範囲の高分子量種の分離を最大化するために低パーセンテージTris-Acetateミニゲル(例えば、Invitrogen NuPage 3~8%Tris-Acetateゲル)上で非還元SDS-PAGEに付した。典型的なプロトコールでは、サンプルは180ボルトで90分間分離した。
SDS-PAGEの後、20%v/vメタノールを含むTris-Glycine-SDSトランスファーバッファー中でサンプルをPVDF膜に電気転写した。典型的な転写は、100ボルトで60分間実施した。転写効率は、クーマシーR-250系(例えば、Pierce Gelcode Blue)またはSYPRO-Ruby蛍光タンパク質染色剤でゲル(転写後)を染色して転写されていないタンパク質を検出することによって確認した。このPVDF膜を1×TBS-T(Tris緩衝生理食塩水+0.05%v/v Tween-20)中5%w/v粉乳で60~90分間ブロッキングした。ブロッキング後、この膜をTBS-Tで1回の洗浄につき少なくとも5分間として3~4回洗浄し、sIgA鎖特異的抗体-HRPコンジュゲート(抗HC、-LC、もしくは-SC)または一次抗体(抗JC)とともに2~12時間インキュベートした。膜を1回の洗浄につき少なくとも15分間としてTBS-Tで3~4回再洗浄した。抗JCブロットを特異的二次抗体-HRPコンジュゲートで30~60分間再プローブした後、1回の洗浄につき少なくとも15分間として3~4回再洗浄した。結合した抗体の検出は、市販の化学発光現像試薬(例えば、ThermoFisher Super Signal West)を使用して行い、CCDカメラを装備したイメージャー(ProteinSimple Fluorchem Qイメージャー)を使用して画像化した。結果を図8に示す。
次に、イネ植物抽出物を分析した。ピークAは、移動相Aにロードされた保持されていない物質のフロースルーである。ピークBは、移動相Bによる非特異的結合タンパク質の溶出を表す。ピークCは、移動相Cで溶出された特定のプロテインL結合標的タンパク質(例えば、sIgA)の溶出を示す。ピークCの下の面積の測定により、ExpressTecシステムを使用して得られる高発現レベルのIgA種の定量が可能となる。クロマトグラフィー条件:カラムサイズは1mL、10mm×50mm。樹脂は東ソーのTOYOPEARL AF-rProtein L-650Fである。移動相A:10mMリン酸ナトリウム pH7.0;移動相B:10mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム pH7.0;移動相C:20mMリン酸ナトリウム pH2.0。
プロトコール:100mgのsIgA101粉を、150mM NaCl、200mM TRIS-HCl pH8.3を含む抽出バッファーに再懸濁し、ガラスDounceホモジナイザーを使用して50ストロークでホモジナイズした。ホモジナイズされた穀粉懸濁液の可溶性部分(上清)を遠心分離によって固形物から分離し、デカントし、超遠心濃縮器(例えば、MilliporeのAmicon/Microcon 10K NMWL)を使用して濃縮した。抽出物を100μLに濃縮し、4倍量の移動相A(10mMリン酸ナトリウム pH7.0)に対して透析濾過して、バッファー交換を完了した。最終サンプルの容量を200μLに調整し、サンプルを分析用プロテインL HPLCカラム (例えば、TOSOH TOYOPEARL AF-rProtein L-650F)に注入した。非特異的に結合したタンパク質は、高塩バッファー、移動相B(10mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH7.0)で溶出した。プロテインLに特異的に結合するκ軽鎖含有タンパク質複合体は、酸性バッファー、移動相C(20mMリン酸ナトリウム2.0)で溶出された。抽出物中のsIgA含量は、既知量のsIgA参照標準から得られた検量線に、移動相Cでの溶出によって得られたピーク下の面積を参照することによって定量した。結果を下表にまとめ、図9に示す。
次に、IgA種からのプロテインL精製sIgAのクロマトグラフィー分離を、分取ゲル濾過クロマトグラフィー(直径10mm、長さ30mmのカラムに25mL Superose 6樹脂)を使用して行った。プロテインLで精製された総IgA混合物は、sIgAとIgAに十分な分離を示した。部分的にまたは不正確に組み立てられたIgA様種を含む微量の凝集物および低分子量の夾雑物も分離された。非還元および還元SDS-PAGEを使用して主要ピークを分析し、ヒト初乳から精製されたsIgAおよびヒト血漿血清から精製されたIgAの市販サンプルと比較する。分析は、各ピークの同一性と相対的純度について報告し、予想される成分鎖の存在を検証し、適切な組み立て状態を確認する。
プロトコール:プロテインLで精製されたsIgAピークを、例えばMillipore Amicon/Microcon Cellulose Acetate濃縮器を使用した遠心濃縮によって適切な容量に濃縮した。濃縮容量は、ゲル濾過カラムのベッド容量の2~5%になるように選択した(例えば、25mLのSuperose 6カラムでは<0.5mL)。濃縮されたサンプルを手動にて低流速でカラムにロードした。分離を最大化するために、低流速(<0.5mL/分)のゲル濾過バッファー(例えば、150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH8.5、0.1%Tween-20)の無勾配流でカラムを溶出した。ピーク画分をプールし、非還元および還元SDS-PAGEおよび総タンパク質染色(クーマシーR250、Gelcode Blue染色剤、またはSYPRO-Ruby蛍光タンパク質染色剤)によって分析した。結果を図10A~10Cに示す。
次に、プロテインLで精製され、サイズ分画されたIgAサンプル(図10A~Cに示される通り)におけるsIgAおよびIgAの同一性をウエスタンブロッティングによって確認した。イムノブロットは、sIgAの全ての発現鎖成分の包含および組み立てを確認し、精製画分が、ヒト初乳から精製されたsIgAおよびヒト血漿血清から精製されたIgAの市販サンプルと同様に移動する高分子量種の適正な鎖タイプを含むことを示す。
プロトコール:プロテインLで精製したsIgA種の分取ゲル濾過からプールしたピークを、低割合のTris-Acetateミニゲル(例えば、Invitrogen NuPage 3~8%Tris-Acetateゲル)で非還元SDS-PAGEに付し、00~500kDaの範囲の高分子量種の分離を最大化した。典型的なプロトコールでは、サンプルを180ボルトで90分間分離した。
SDS-PAGEの後、20%v/vメタノールを含むTris-Glycine-SDSトランスファーバッファー中でサンプルをPVDF膜に電気転写した。典型的な転写は、100ボルトで60分間実施した。転写効率は、クーマシーR-250系(Pierce Gelcode Blueなど)またはSYPRO-Ruby蛍光タンパク質染色剤でゲル(転写後)を染色して転写されていないタンパク質を検出することによって確認した。このPVDF膜を1×TBS-T(Tris緩衝生理食塩水+0.05%v/v Tween-20)中5%w/v粉乳で60~90分間ブロッキングした。ブロッキング後、この膜をTBS-Tで1回の洗浄につき少なくとも5分間として3~4回洗浄し、sIgA鎖特異的抗体-HRPコンジュゲートとともに2~12時間インキュベートした。膜を1回の洗浄につき少なくとも15分間としてTBS-Tで3~4回再洗浄した。結合した抗体の検出は、市販の化学発光現像試薬(例えば、ThermoFisher Super Signal West)を使用して行い、CCDカメラを装備したイメージャー(ProteinSimple Fluorchem Qイメージャー)を使用して画像化した。結果を図11A~11Bに示す。配列表のIgA配列を使用して、さらなる研究を行った。
実施例3
イン・ビトロ研究:L929
マウス線維肉腫L929細胞(ATCC、マナサス、VA)をL929増殖培地(2mMグルタミンおよび10%ウマ血清(Sigma Aldrich、セントルイス、MO)を添加したEMEM)および1×抗生物質(Life Technologies、グランドアイランド、NY)で培養した。細胞を、L929増殖培地中の平底組織培養処理96ウェルプレートに10,000細胞/ウェルの初期細胞密度で播種し、37℃で少なくとも3時間プレートに接着させた。Adalimumab(Abbvie、シカゴ、IL)、初乳IgAアイソタイプ対照(Sigma Aldrich、セントルイス、MO)、またはSIgA101(Ventria Bioscience、ジャンクションシティー、KS)を28.4nMの最高濃度に希釈し、別の96ウェルプレートのL929増殖培中に連続3倍希釈液を作製した。抗体を4倍濃縮物としてL929細胞に添加した。ヒトTNF(Peprotech、ロッキーヒル、NJ)をL929細胞に最終濃度5ng/mLとなるように添加した。細胞を37℃、5%CO2で72時間インキュベートした。72時間の終了時に、2.5μLのMTT試薬(EMD Millipore、ビレリカ、MA)を細胞のウェルあたりL929増殖培地で7.5μLに希釈した。細胞をMTT試薬の存在下、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした。0.4N HClを添加したイソプロパノールを使用して、L929細胞を溶解した。細胞の生存率は、波長570nm、補正波長630nmを用いて決定した。各薬物処理の各濃度点は、3連のプレートで1プレートにつき2連で実行した。各濃度点は、TNF未処理対照に対して正規化した(プレートあたりn8)。結果を図12に示す。データは、シグモイド用量反応モデルを使用して非線形回帰に適合させ、EC50を計算した(GraphPad Prism)。提示されたデータは、4回の独立した実験の平均である。EC50は、4回の実験間で平均したものである。
イン・ビトロ研究:L929
マウス線維肉腫L929細胞(ATCC、マナサス、VA)をL929増殖培地(2mMグルタミンおよび10%ウマ血清(Sigma Aldrich、セントルイス、MO)を添加したEMEM)および1×抗生物質(Life Technologies、グランドアイランド、NY)で培養した。細胞を、L929増殖培地中の平底組織培養処理96ウェルプレートに10,000細胞/ウェルの初期細胞密度で播種し、37℃で少なくとも3時間プレートに接着させた。Adalimumab(Abbvie、シカゴ、IL)、初乳IgAアイソタイプ対照(Sigma Aldrich、セントルイス、MO)、またはSIgA101(Ventria Bioscience、ジャンクションシティー、KS)を28.4nMの最高濃度に希釈し、別の96ウェルプレートのL929増殖培中に連続3倍希釈液を作製した。抗体を4倍濃縮物としてL929細胞に添加した。ヒトTNF(Peprotech、ロッキーヒル、NJ)をL929細胞に最終濃度5ng/mLとなるように添加した。細胞を37℃、5%CO2で72時間インキュベートした。72時間の終了時に、2.5μLのMTT試薬(EMD Millipore、ビレリカ、MA)を細胞のウェルあたりL929増殖培地で7.5μLに希釈した。細胞をMTT試薬の存在下、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした。0.4N HClを添加したイソプロパノールを使用して、L929細胞を溶解した。細胞の生存率は、波長570nm、補正波長630nmを用いて決定した。各薬物処理の各濃度点は、3連のプレートで1プレートにつき2連で実行した。各濃度点は、TNF未処理対照に対して正規化した(プレートあたりn8)。結果を図12に示す。データは、シグモイド用量反応モデルを使用して非線形回帰に適合させ、EC50を計算した(GraphPad Prism)。提示されたデータは、4回の独立した実験の平均である。EC50は、4回の実験間で平均したものである。
イン・ビトロ研究:TEER
TNF誘導T84単層透過性における抗体介在性経上皮抵抗保護の決定
ヒト腸管上皮細胞(T84)は、T75細胞培養フラスコ(Costar、ケンブリッジ MA)の、5%ウシ胎仔血清(FBS;Mediatech、マナサス、VA)を含むDMEM/F12(Ham)培地中で増殖させ維持した。細胞は5%(v/v)CO2の加湿雰囲気下、37℃で培養した。培地は3~4日毎に補充した。
TNF誘導T84単層透過性における抗体介在性経上皮抵抗保護の決定
ヒト腸管上皮細胞(T84)は、T75細胞培養フラスコ(Costar、ケンブリッジ MA)の、5%ウシ胎仔血清(FBS;Mediatech、マナサス、VA)を含むDMEM/F12(Ham)培地中で増殖させ維持した。細胞は5%(v/v)CO2の加湿雰囲気下、37℃で培養した。培地は3~4日毎に補充した。
24ウェルのTranswellチャンバー(Millicell PET;孔径0.4μM;Millipore)に8.0×104/cm2の密度で細胞を播種した。単層の抵抗が高抵抗(<2,000Ω.cm2)に達するまで、EVOMボルトオームメーター(World Precision Instruments、サラソタ、FL)を使用してTEERを監視し、その間に下部培地を3~4日毎に交換した。単層が高抵抗に達したところで(>21日)、培地を除去して、上部コンパートメントの新鮮なDMEM/F12+5%FBSおよび10ng/mLの組換えインターフェロン-γ(IFN-γ;Peprotech、ロッキーヒル、NJ)を含有するDMEM/F12+5%FBSに置き換え、前述のように一晩インキュベートした。
腫瘍壊死因子-α(TNF-α;DMEM/F12中50ng/mL+5%FBS)の10×濃縮カクテルを、10×の各個の試験材料(抗体)を用いて調製した:ヒト初乳由来のヒト分泌免疫グロブリンA(sIgA;Sigma Aldrich、セントルイス、MO)、アダリムマブ(組換え抗ヒトTNFα抗体、クローンD2E7;Cedarlane、バーリントン、NC)、イネ由来組換え抗ヒトTNFα(SIgA101;Ventria Bioscience、フォートコリンズ、CO)。抗体の10×濃縮物は、0.03~0.01nMの範囲であった。
TNFおよび抗体とのインキュベーション前に、各単層についてTEERSを得た。次に、下部培地に、最終濃度5ng/mLのTNFαとなるように10×カクテルおよび各抗体0.3~0.01nMを添加した。細胞を16時間インキュベートし、TEER測定値を得た。TEERは、対照サンプル(INFγを含み、TNFも抗体も含まない)のパーセンテージとして表し、Prismソフトウェア(Graphpad、ラホヤ、CA)を使用して分析した。結果を図13に示す。提示されたデータは、2回の独立した実験におけるT84細胞の平均応答である。***一元配置ANOVAによるp≦0.001。
イン・ビボ研究:DSSパイロット試験
6~8週齢のC57/BL6マウス(Jackson Laboratories、バーハーバー、ME、USA)を、研究施設のビバリウムに1週間順応させた。0日目に、マウスを飲料水中のデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)(1.25%w/v36~50kDa、#0216011050 MP Biomedicals、サンタアナ、CA、USA)を6日間自由に摂らせた。D3に、研究の途中で新鮮なDSS溶液に交換した。また、0日目から、DSS群には、シクロスポリン #C3662 Sigma Aldrich 50mg/kg、強制経口投与、容量200μL)、VEN-α(50μg~300μg/日、強制経口投与容量100μl)または偽薬(モックバッファー、Ventria Bioscience)を毎日同じ時間に強制経口投与した。経口治療(試験品および経口対照)は、d7に実験が終了するまで毎日続けた。全体的な臨床スコアは、最初の体重からの体重減少のパーセンテージ(毎日測定)、7日目の結腸長の減少、および腸出血の存在(毎日測定し、累積スコアを決定)によって評価した。各パラメーターを合計して累積臨床スコアを出し、これを提示する。結果を図14および下表にまとめる。
6~8週齢のC57/BL6マウス(Jackson Laboratories、バーハーバー、ME、USA)を、研究施設のビバリウムに1週間順応させた。0日目に、マウスを飲料水中のデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)(1.25%w/v36~50kDa、#0216011050 MP Biomedicals、サンタアナ、CA、USA)を6日間自由に摂らせた。D3に、研究の途中で新鮮なDSS溶液に交換した。また、0日目から、DSS群には、シクロスポリン #C3662 Sigma Aldrich 50mg/kg、強制経口投与、容量200μL)、VEN-α(50μg~300μg/日、強制経口投与容量100μl)または偽薬(モックバッファー、Ventria Bioscience)を毎日同じ時間に強制経口投与した。経口治療(試験品および経口対照)は、d7に実験が終了するまで毎日続けた。全体的な臨床スコアは、最初の体重からの体重減少のパーセンテージ(毎日測定)、7日目の結腸長の減少、および腸出血の存在(毎日測定し、累積スコアを決定)によって評価した。各パラメーターを合計して累積臨床スコアを出し、これを提示する。結果を図14および下表にまとめる。
実施例4
概念実証-オオムギ粒における分泌IgAの発現
遺伝子構築物の開発--オオムギ粒で組換えSIgAの高発現レベルを得るために、上記の実施例1に記載したように、それぞれsIgAのLC、HC、J鎖、および分泌成分の4つの遺伝子構築物を開発する。4つのタンパク質アミノ酸配列のそれぞれは、宿主発現系であるHordeum sativaのコドン使用優先度に合わせてコドンが最適化されたヌクレオチド配列に逆翻訳されるが、mRNAの安定性および翻訳効率に影響を及ぼし得る内部リピートおよびその他の特徴が変更されている。それ以外の点では、その後のDNA形質転換は、イネについて実施例1で示したものと同じである。
概念実証-オオムギ粒における分泌IgAの発現
遺伝子構築物の開発--オオムギ粒で組換えSIgAの高発現レベルを得るために、上記の実施例1に記載したように、それぞれsIgAのLC、HC、J鎖、および分泌成分の4つの遺伝子構築物を開発する。4つのタンパク質アミノ酸配列のそれぞれは、宿主発現系であるHordeum sativaのコドン使用優先度に合わせてコドンが最適化されたヌクレオチド配列に逆翻訳されるが、mRNAの安定性および翻訳効率に影響を及ぼし得る内部リピートおよびその他の特徴が変更されている。それ以外の点では、その後のDNA形質転換は、イネについて実施例1で示したものと同じである。
植物の遺伝的形質転換--VB85、VB86、V87、およびVB88プラスミドベクターのプロモーターからターミネーターまでの領域(骨格プラスミド配列は含まない)を含むDNA断片の線形発現カセットは、EcoRIおよびHindIII二重消化によって放出させ、マイクロプロジェクタイル衝撃を用い、WanおよびLemauzによって開発されたように(Generation of Large Numbers of Independently Transformed Fertile Barley Plants, Plant Physol. Vol. 104, 1994)、マイクロプロジェクタイル衝撃によって媒介される、成熟種子(H. sativa、Golden Promise)から誘導された胚形成カルスの共形質転換に使用する。
植物材料
オオムギ(Hordeum vulgare L.)の春栽培品種Golden Promiseの植物は、12℃、湿度60~80%、16時間明期/8時間暗期下、生育室で栽培する。頭の高さでの光レベルは約350~400μEである。高さが約10cmになったところで、実生を4℃、10時間明期(10~15μE)/14時間暗期下で8週間春化させる。春化後は元の生育条件に戻す。植物には、Osmocote(Sierra、17-6-12および微量元素)を施与し、その後隔週でPeterの20-20-20を与える。
オオムギ(Hordeum vulgare L.)の春栽培品種Golden Promiseの植物は、12℃、湿度60~80%、16時間明期/8時間暗期下、生育室で栽培する。頭の高さでの光レベルは約350~400μEである。高さが約10cmになったところで、実生を4℃、10時間明期(10~15μE)/14時間暗期下で8週間春化させる。春化後は元の生育条件に戻す。植物には、Osmocote(Sierra、17-6-12および微量元素)を施与し、その後隔週でPeterの20-20-20を与える。
未熟胚から誘導されたカルス
未熟胚(1.5~2.5mm)を有する穂を20%(v/v)漂白剤で5分間表面殺菌し、3回簡単にすすぎ、滅菌水で5分間洗浄する。若い頴花から未熟胚を切り出し、そのままにするか、縦方向に二等分する。衝撃用のカルスの誘導のために、30g/Lのマルトース、1.0mg/Lのチアミン-HCl、0.25g/Lのミオイノシトール、1.0g/Lのカゼイン加水分解物、0.69g/LのPro、および2.5mg/Lのジカンバを添加し、3.5g/Lのゲルライトで固化したムラシゲ・スクーグ培地からなるカルス誘導培地に、胚(無傷または二等分)を、胚盤側を下にして置床した。胚を暗所、25℃でインキュベートし、2週間後の衝撃のために胚形成カルスを選択した。
未熟胚(1.5~2.5mm)を有する穂を20%(v/v)漂白剤で5分間表面殺菌し、3回簡単にすすぎ、滅菌水で5分間洗浄する。若い頴花から未熟胚を切り出し、そのままにするか、縦方向に二等分する。衝撃用のカルスの誘導のために、30g/Lのマルトース、1.0mg/Lのチアミン-HCl、0.25g/Lのミオイノシトール、1.0g/Lのカゼイン加水分解物、0.69g/LのPro、および2.5mg/Lのジカンバを添加し、3.5g/Lのゲルライトで固化したムラシゲ・スクーグ培地からなるカルス誘導培地に、胚(無傷または二等分)を、胚盤側を下にして置床した。胚を暗所、25℃でインキュベートし、2週間後の衝撃のために胚形成カルスを選択した。
マイクロプロジェクタイル衝撃
約0.5gの胚形成カルスを2mm片に刻み、カルス誘導培地を含むペトリ皿(100×15mm)の中央に置床した。対象遺伝子およびハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子をコードする精製DNA断片を金粒子に吸着させ、DuPont PDS 1000 He Biolistic Delivery Systemで1回衝撃を行った。目的材料は、マイクロプロジェクタイル停止プレートの約13cm下に配置し、1100p.s.i.ラプチャーディスクを使用する。
約0.5gの胚形成カルスを2mm片に刻み、カルス誘導培地を含むペトリ皿(100×15mm)の中央に置床した。対象遺伝子およびハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子をコードする精製DNA断片を金粒子に吸着させ、DuPont PDS 1000 He Biolistic Delivery Systemで1回衝撃を行った。目的材料は、マイクロプロジェクタイル停止プレートの約13cm下に配置し、1100p.s.i.ラプチャーディスクを使用する。
形質転換体の選択
衝撃の1日後に、カルス片を、ハイグロマイシンBを含むカルス誘導培地に個々に移す。組織は10~14dの選択時に残っている。2番目の選択プレートへの移行時に、カルス片をいくつかの小片に分割し、別々に維持する。その後の選択経過中に、より増殖旺盛な証拠を示すカルス片は新しい選択プレートに早く移し、組織も同じ方法で取り扱う。
衝撃の1日後に、カルス片を、ハイグロマイシンBを含むカルス誘導培地に個々に移す。組織は10~14dの選択時に残っている。2番目の選択プレートへの移行時に、カルス片をいくつかの小片に分割し、別々に維持する。その後の選択経過中に、より増殖旺盛な証拠を示すカルス片は新しい選択プレートに早く移し、組織も同じ方法で取り扱う。
再分化
胚形成カルスを蛍光灯下(45~55μE、16時間/日)、23℃の苗条形成培地に移すことにより、HygB耐性カルス系統から植物を再生させる。約2週間で、幼植物体が観察される。約2cmの緑の幼植物体を、幼植物体生育培地(ホルモンフリーのカルス誘導培地)を含むマゼンタボックスに移行する。箱の上部まで成長する前に、スーパーソイルを含む6インチのポットに幼植物体を移し、温室(16時間明期、18℃)に置く。再分化個体を成熟するまで生育させ、自家受粉させる。
胚形成カルスを蛍光灯下(45~55μE、16時間/日)、23℃の苗条形成培地に移すことにより、HygB耐性カルス系統から植物を再生させる。約2週間で、幼植物体が観察される。約2cmの緑の幼植物体を、幼植物体生育培地(ホルモンフリーのカルス誘導培地)を含むマゼンタボックスに移行する。箱の上部まで成長する前に、スーパーソイルを含む6インチのポットに幼植物体を移し、温室(16時間明期、18℃)に置く。再分化個体を成熟するまで生育させ、自家受粉させる。
sIgAの4つの成分、すなわち、LC、HC、J鎖、および分泌成分をコードする4つの導入遺伝子を含むトランスジェニックオオムギ植物は、上記の4つの遺伝子のヌクレオチドに特異的なプライマーを使用したPCRによって同定し(図2~5)、その後、土に移して温室で生育させる。再生されたトランスジェニック植物はR0植物またはトランスジェニック事象と呼称し、連続した世代のそれらの後代はR1、R2などと呼称する。
トランスジェニック種子の発現スクリーニング分析-これはイネの場合と同様の方法で行う。
同系接合系統の選択--rsIgAを発現する同系接合系統を選択するために、選択された各トランスジェニックオオムギ事象のR1種子を生育させて次世代を得る。各R1系統について、rsIgA発現の遺伝的分離を評価するために、20を超えるR2種子を免疫ドットブロットでアッセイする。免疫ドットブロットプロトコールは上記と同じである。20個全てのR2種子が陽性として示される系統は、同系接合体と見なされる。
同系接合系統の選択--rsIgAを発現する同系接合系統を選択するために、選択された各トランスジェニックオオムギ事象のR1種子を生育させて次世代を得る。各R1系統について、rsIgA発現の遺伝的分離を評価するために、20を超えるR2種子を免疫ドットブロットでアッセイする。免疫ドットブロットプロトコールは上記と同じである。20個全てのR2種子が陽性として示される系統は、同系接合体と見なされる。
オオムギにより生産されるrsIgAの機能的特性評価--オオムギ由来のsIgAに生物活性(強力)があるかどうかを評価するために、rsIgAをその標的抗原であるヒト腫瘍壊死因子α(TNF-α)に結合する能力に関して評価する。これはイネと同様にサンドイッチELISAアッセイによって達成される。
オオムギ由来sIgAの定量-オオムギ由来sIgA抗体の発現レベルを決定するために、イネの場合と同様にサンドイッチELISAを行う。
オオムギ粒からの組換えsIgAの精製-精製されたオオムギ由来sIgA抗体を生産するために、200mM Tris、150mM塩化ナトリウム、5mM EDTA、0.1%Tween20、および0.00%アジ化ナトリウム、最終pH8.8を含む20mlの抽出バッファーに2グラムの精白オオムギ粉を加える。サンプルをオービタルシェーカーで30分間抽出する。次に、4,000xgで20分間の遠心分離を使用して、サンプルを回転沈降させる。0.2μmフィルターを用いて上清を濾過し、50K脱濾過膜を用いてバッファー交換を行う。最終緩衝液は、pH8.5のTBSである。この精製には、1mlのプロテインLプレパックHi-Trapカラム(GE、CT)を使用する。カラムは5カラム容量(cv)の結合バッファーで平衡化する。次に、サンプルを毎分1mlの速度でロードし、5mlの結合バッファーで洗浄する。次に、サンプルを、クエン酸ナトリウムバッファー(pH2.0)を使用して500μlの10画分に溶出する。各画分には、溶出バッファーの低いpHを相殺するために、pH12の中和バッファー500μlを含有する。その後、カラムを再平衡化し、洗浄し、20%エタノール溶液中で保存する。3μlの各画分、プレカラムサンプル、フロースルーをニトロセルロース上に置き、抗重鎖抗体を使用してプローブする。結果は、sIgA抗体の大部分が最初の2~3mlに溶出することを示す。
例示的免疫グロブリン配列
上記のように、本アプローチは、他の免疫グロブリンに拡張することができる。例には以下が含まれ、これらは参照により本明細書の一部として援用される。
上記のように、本アプローチは、他の免疫グロブリンに拡張することができる。例には以下が含まれ、これらは参照により本明細書の一部として援用される。
前述の配列は、それらの全内容が参照により本明細書の一部として援用される。
Claims (25)
- 真核生物発現系において組換え免疫グロブリンタンパク質、好ましくは、IgAを生産する方法であって、
前記免疫グロブリンの各成分をコードする配列を含む核酸構築物で真核細胞を共形質転換することを含む(ここで、各核酸構築物は、前記免疫グロブリン成分ポリペプチドのそれぞれが発現および組み立てのために細胞の同じオルガネラに標的化されるように、同じプロモーターおよび同じシグナル配列を含む)、方法。 - 各プロモーターが、それに連結されたポリペプチドを真核細胞のタンパク質貯蔵オルガネラに標的化することができるタンパク質貯蔵特異的シグナル配列をコードするDNA配列に作動可能に連結されたタンパク質貯蔵遺伝子に由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質貯蔵遺伝子および/またはシグナルペプチドが真核細胞に対して天然である、請求項2に記載の方法。
- 前記タンパク質貯蔵遺伝子およびシグナルペプチドが真核細胞に対して異種である、請求項2に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンがsIgAであり、前記方法が少なくとも4つの異なる核酸構築物で前記細胞を同時形質転換することを含み、各構築物が、sIgAの軽鎖(LC)、重鎖(HC)、連結鎖(JC)、または分泌成分(SC)をコードする各転写単位を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が100mg/kgを超える分泌IgAの発現収率を有する、請求項5に記載の方法。
- 各sIgA成分をコードする転写単位がコドン最適化DNA配列を含む、請求項5に記載の方法。
- 選択マーカーを含む核酸構築物で前記真核細胞を形質転換することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記選択マーカーが前記免疫グロブリン成分に使用された同じプロモーターおよびシグナルペプチドによって駆動される、請求項8に記載の方法。
- 前記真核細胞が植物細胞であり、前記構築物のそれぞれは、連結されたポリペプチドを植物種子内胚乳細胞に標的化することができるシグナル配列に作動可能に連結された種子貯蔵プロモータータンパク質を含み、前記免疫グロブリン成分は、前記シグナル配列と翻訳フレーム内で連結された配列をコードする、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナル配列がイネ・グルテリンシグナル配列をコードする、請求項10に記載の方法。
- 免疫グロブリンを含有する種子を生産するのに十分な期間、前記形質転換植物細胞から植物を生育させること、および前記植物から前記種子を収穫することをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記共形質転換がマイクロプロジェクタイル衝撃を用いて行われる、請求項10に記載の方法。
- 衝撃に使用される各微粒子またはナノ粒子が前記核酸構築物のそれぞれを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記真核細胞が、コムギ(Triticum種)、イネ(Oryza種)、オオムギ(Hordeum種)、エンバク(Avena種)、ライムギ(Secale種)、トウモロコシ(メイズ)(Zea種)、およびキビ(Pennisettum種)、ライコムギ、およびモロコシからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1~15のいずれか一項に従って生産された免疫グロブリンを含む、ヒトまたは獣医学的使用のための治療または予防組成物。
- ヒトまたは非ヒト動物対象において病態を治療する方法であって、前記対象に請求項1~15のいずれか一項に従って生産された免疫グロブリンを投与することを含む、方法。
- 前記病態が、炎症病態、感染症、癌、自己免疫疾患、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記病態が皮膚病態である、請求項17に記載の方法。
- 前記病態が肺または鼻腔粘膜の病態である、請求項17に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンが、経口、局所、または非経口投与される、請求項17に記載の方法。
- 請求項1~15のいずれか一項の方法に従って生産されたトランスジェニック細胞。
- 請求項1~15のいずれか一項に記載の方法に従って生産されたトランスジェニック種子。
- 請求項1~15のいずれか一項の方法に従って生産された組換え免疫グロブリンタンパク質。
- 必要とするヒトまたは非ヒト動物対象において病態の予防的または治療的処置に使用するための、請求項1~15のいずれか一項の方法に従って生産された組換え免疫グロブリンタンパク質。
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