JP2023514348A - ２０１９－ｎＣｏＶ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ワクチン - Google Patents

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Abstract

本発明は、コロナウイルス２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質、前記スパイクタンパク質をコードするポリヌクレオチド、２０１９－ｎＣｏＶ感染症の処置又は予防のための抗体及びワクチンに関する。一実施形態は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントをコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、組換え発現のために最適化されているポリヌクレオチドに関する。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、（ａ）大腸菌、（ｂ）酵母、好ましくは、コマガタエラ若しくはサッカロマイセス、及び／又は（ｃ）哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞から選択される宿主細胞における発現のために最適化されている。

Description

本発明は、コロナウイルス２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質、前記スパイクタンパク質をコードするポリヌクレオチド、２０１９－ｎＣｏＶ感染症の処置又は予防のための抗体、及びワクチンに関する。
２０１９年１２月８日以来、病因不明の肺炎の複数の症例が、中国湖北省武漢において報告されている。ほとんどの患者は、地元の華南海鮮卸売市場周辺で勤務しているか又は居住しており、そこでは生きた動物も販売されていた。この肺炎の初期段階において、重症急性呼吸器感染症の症状が生じ、一部の患者は、急性呼吸促迫症候群（acute respiratory distress syndrome、ＡＲＤＳ）、急性呼吸器不全、及び他の重篤な併発症を急速に発症する。２０２０年１月７日、中国疾病予防管理センター（Chinese Center for Disease Control and Prevention、ＣＤＣ）によって、患者の喉のスワブ試料から、新型コロナウイルスが特定され、その後、ＷＨＯによって２０１９－ｎＣｏＶと命名され、現在ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と表記されている。
コロナウイルスは、様々な動物においては多様な全身感染症、並びにヒトにおいては主として呼吸器感染症、例えば、重症急性呼吸器症候群（severe acute respiratory syndrome、ＳＡＲＳ）及び中東呼吸器症候群（Middle East respiratory syndrome、ＭＥＲＳ）を引き起こし得る。多くの患者は、軽度の症状を有し、予後は良好である。
これまでのところ、２０１９－ｎＣｏＶを有する少数の患者が、重度の肺炎、肺水腫、ＡＲＤＳ、又は多臓器不全を発症しており、死亡している。２０１９－ｎＣｏＶ処置のすべての費用は、中国では医療保険によって賄われる。現時点では、２０１９－ｎＣｏＶによって引き起こされる肺炎の疫学及び臨床特性に関する情報は、不足しており、利用可能なワクチンは存在しない。したがって、２０１９－ｎＣｏＶ感染症を予防及び処置するためにワクチンにおいて使用することができる抗原の開発には、継続的な必要性が存在する。さらに、安価で大規模に産生することができる抗原を提供する必要性が存在する。
本発明は、２０１９－ｎＣｏＶ抗原、特に、２０１９－ｎＣｏＶのスパイクタンパク質に由来する抗原をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記抗原をコードするベクター、並びにその抗原に対して生じる結合化合物（特に、抗体、並びにアプタマー及びペプチドを含む抗体様分子）を、２０１９－ｎＣｏＶによる感染症の予防又は処置におけるその使用（単独又は組合せのいずれかで）とともに提供することによって、上記の必要性のうちの１つ又は２つ以上に対処する。抗原をコードするポリヌクレオチドは、目的の宿主細胞における発現のために最適化されている。抗原に対して生じる抗体及び抗体様分子は、抗原に結合（例えば、特異的に結合）し得る。
現在までに、２０１９－ｎＣｏＶのワクチンは開発されていない。本発明者らは、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、一般的に使用されている発現系における発現のために最適化されているポリヌクレオチドを開発した。これらのポリヌクレオチドは、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の発現のレベル及び期間の増加を提供し、それによってそれらは、この抗原の大規模産生に有利となっている。さらに、本発明者らによって考案されたポリヌクレオチドは、天然のスパイクタンパク質の立体構造を保持する形態で、スパイクタンパク質アミノ酸配列をコードする。したがって、本発明によって産生されるスパイクタンパク質は、特に、中和抗体の産生を通じて、免疫保護応答をもたらすことができる。
したがって、本発明は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントをコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、組換え発現のために最適化されているポリヌクレオチドを提供する。
前記ポリヌクレオチドは、大腸菌、酵母、好ましくは、コマガタエラ（Komagataella）若しくはサッカロマイセス（Saccharomyces）、及び／又は哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞から選択される宿主細胞における発現のために最適化されていてもよい。最適化は、１つ又は２つ以上のシス作用配列モチーフを削除することによって生じ得、前記１つ又は２つ以上のシス作用配列モチーフは、内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、リボソーム進入部位、ＡＴリッチ及び／若しくはＧＣリッチな配列ストレッチ、ＲＮＡ不安定性モチーフ、反復配列及び／若しくはＲＮＡ二次構造、隠れたスプライスドナー部位、隠れたスプライスアクセプタンス部位、並びに／又は（ａ）～（ｉ）の任意の組合せから独立して選択される。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。前記ポリヌクレオチドは、少なくとも約０．８０、好ましくは、少なくとも約０．９、より好ましくは、少なくとも約０．９３のコドン適合インデックス（codon adaptation index、ＣＡＩ）を有し得る。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２～８、１３、１４、２６、２７、２８、３０、又は３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。本発明のポリヌクレオチドは、典型的に、（ｉ）天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質に存在する立体構造エピトープを保持する、（ii）核酸又はコードされるスパイクタンパク質若しくはそのフラグメントが対象に投与されると、スパイクタンパク質若しくはそのフラグメントに特異的な中和抗体の産生をもたらす、並びに／又は（iii）好ましくは、配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（receptor-binding domain、ＲＢＤ）を含むか若しくはそれからなるスパイクタンパク質、又はそのフラグメントをコードする。
本発明は、プロモーターに作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む発現コンストラクトをさらに提供する。
本発明は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを含むワクチン組成物であって、前記フラグメントが、好ましくは配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含んでもよいか、又はそれからなってもよい、ワクチン組成物をさらに提供する。前記ワクチンは、典型的に、対象に投与されると、スパイクタンパク質又はそのフラグメントに特異的な中和抗体の産生をもたらす。
本発明はまた、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを発現するウイルスベクター、ＲＮＡワクチン、又はＤＮＡプラスミドであって、前記フラグメントが、好ましくは配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含んでもいか、又はそれからなってもよい、ウイルスベクター、ＲＮＡワクチン、又はＤＮＡプラスミドを提供する。前記ウイルスベクター、ＲＮＡワクチン、又はＤＮＡプラスミドは、さらに、シグナルペプチドをコードし得る。シグナルペプチドは、ヒト細胞からの分泌を誘導し得る。本発明のウイルスベクター、ＲＮＡワクチン、又はＤＮＡプラスミドは、さらに、１つ又は２つ以上の追加の抗原又はそのフラグメント、好ましくは、２０１９－ｎＣｏＶに由来する１つ又は２つ以上の追加の抗原又はそのフラグメントを発現し得る。スパイクタンパク質又はそのフラグメント及び１つ又は２つ以上の追加の抗原又はそのフラグメントは、融合タンパク質として、又は組み合わせて使用するための別個のウイルスベクター、ＲＮＡワクチン、若しくはＤＮＡプラスミドにおいて、発現され得る。前記ウイルスベクター、ＲＮＡワクチン、又はＤＮＡプラスミドは、本発明の１つ又は２つ以上のポリヌクレオチド又は発現コンストラクトを含み得る。
本発明はまた、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを含む融合タンパク質であって、前記フラグメントが、好ましくは配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含んでもよいか、又はそれからなってもよい、融合タンパク質も提供する。前記ＶＬＰ又は融合タンパク質は、Ｂ型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen、ＨＢＳＡｇ）、若しくは前記ＨＢＳＡｇと共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメント、ＨＰＶ １８ Ｌ１タンパク質、若しくは前記ＨＰＶ １８ Ｌ１タンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメント、Ｅ型肝炎Ｐ２３９タンパク質（ＨＥＶ）、若しくはＥ型肝炎Ｐ２３９タンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメント、並びに／又はＨＰＶ １６ Ｌ１タンパク質、若しくは前記ＨＰＶ １６ Ｌ１タンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントをさらに含み得る。融合タンパク質は、配列番号３、５、６、８、２６、２７、２９、３０、若しくは３２のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによってコードされ得、並びに／又は融合タンパク質は、配列番号９、１０、１１、１２、２８、３１、若しくは３３のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよいか、又はそれからなってもよい。
本発明はまた、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを含むウイルス様粒子であって、前記フラグメントが、好ましくは配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含んでもよいか、又はそれからなってもよい、ウイルス様粒子も提供する。好ましくは、ＶＬＰは、本発明の融合タンパク質を含むか、又はそれからなる。
本発明はまた、本明細書における２０９１－ｎＣｏＶスパイクタンパク質抗原、又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体、又はその結合フラグメントも提供する。前記抗体又はその結合フラグメントは、モノクローナル又はポリクローナル抗体であり得る。前記抗体、又はその結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、又はｄＡｂであり得る。
本発明はさらに、本明細書において定義される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントに特異的に結合するオリゴヌクレオチドアプタマーを提供する。
本発明は、本発明のウイルスベクター、及び／又はＲＮＡワクチン、及び／又はＤＮＡプラスミドを含むワクチン組成物を提供する。
本発明はまた、２０１９－ｎＣｏＶ感染症の処置及び／又は予防において使用するための、本発明のポリヌクレオチド、並びに／又は本発明の発現コンストラクト、並びに／又は本発明のワクチン組成物、並びに／又は本発明のウイルスベクター、及び／若しくはＲＮＡワクチン、及び／若しくはＤＮＡプラスミド、並びに／又は本発明のウイルス様粒子、並びに／又は本発明の融合タンパク質、並びに／又は本発明の抗体、並びに／又は本発明のアプタマーも提供する。
本発明はまた、２０１９－ｎＣｏＶ感染症の予防及び／又は処置のための医薬の製造における、本発明のポリヌクレオチド、並びに／又は本発明の発現コンストラクト、並びに／又は本発明のワクチン組成物、並びに／又は本発明のウイルスベクター、及び／若しくはＲＮＡワクチン、及び／若しくはＤＮＡプラスミド、並びに／又は本発明のウイルス様粒子、並びに／又は本発明の融合タンパク質、並びに／又は本発明の抗体、並びに／又は本発明のアプタマーの使用も提供する。
本発明はまた、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又はそのフラグメントを産生させる方法であって、本発明のポリヌクレオチドを、宿主細胞において発現させるステップと、任意の、スパイクタンパク質又はフラグメントを精製するステップとを含む方法も提供する。前記方法は、前記スパイクタンパク質又はそのフラグメントを、薬学的に許容される担体又は希釈剤とともに製剤化するステップをさらに含み得る。
コロナウイルスの構造及び構造タンパク質の機能の概要である。 本発明に従って産生された２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質及び２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質を含む融合タンパク質の投与後０日目及び１４日目の抗体力価を報告する、表形式でのＥＬＩＳＡの結果である。 ４０時間後（遠心分離濾過による濃縮後）の、培養培地中に放出された分泌タンパク質ＨＢＳＡｇ（ＥＡＡＡＫ）３ＲＢＤを示す、ウエスタンブロットである。左側のブロット＝ＨＢＳＡｇ抗体。右側のブロット＝２０１９－ｎＣｏＶ抗体。両方のブロットについて、レーンＭ＝マーカー、レーン１＝ＨＥＶ－ＧＧＧＳ－ＲＢＤ ＃１０Ｂ、レーン２＝ＨＢＳＡｇ－ＥＡＡＫ－ＲＢＤ ＃２Ａ（分泌された２９３Ｆ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによる総タンパク質含量＝７５０μｇ／ｍｌ）、レーン３＝ＨＢＳＡｇ－ＥＡＡＡＫ－ＲＢＤ ＃２Ｂ（分泌された２９３Ｆ、Bradfordアッセイによる総タンパク質含量＝５００μｇ／ｍｌ）、レーン４＝ＣｏＶ－ｓ ＃１７（２９３Ｆ表面結合型ＨｉｓＴａｇ）。 単独で、又は水酸化アルミニウム若しくはAddavax（商標）アジュバントを使用してのいずれかで、ＨＥＫ細胞において生成されたＨＢＳＡｇ（ＥＡＡＡＫ）３ＲＢＤを接種したマウスにおける１４日目（Ａ）及び４２日目（Ｂ）の力価を示すグラフである。 大腸菌によって産生された分泌タンパク質ＨＥＶ－（ＧＧＧＧＳ）３－ＲＢＤを示すウエスタンブロットである。左側のブロット＝＃１０Ａ。中央のブロット＝＃１０Ｂ。右側のブロット＝＃１０Ｃ。すべてのブロットについて、抗ＨＥＶ ｍＡＢを、１：４０００の希釈で使用した。 単独で、又は水酸化アルミニウム若しくはAddavax（商標）アジュバントを使用してのいずれかで、大腸菌において生成されたＨＥＶ－ＧＧＧＧＳ－ＲＢＤを接種したマウスにおける１４日目（Ａ）及び４２日目（Ｂ）の力価を示すグラフである。 ＨＥＫ ２９３細胞において発現された組換えＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ） ３－全長２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質融合タンパク質（ＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＣｏＶ－ｓ）クローンＤ８－ＳＡ０１－０１－０１（４×）及びクローンＤ８－ＳＡ０１－０２－０１（５×）のウエスタンブロットである。
本明細書に別途定義されない限り、本発明と関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。用語の意味及び範囲は、明確であるべきだが、しかしながら、潜在的曖昧さがある場合には、本明細書に提供される定義が、任意の辞書又は外部の定義よりも優先される。本発明は、本明細書に記載される特定の手法、プロトコール、及び試薬などに限定されるものではなく、したがって、変動し得ることを理解されたい。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明することを目的としたものにすぎず、特許請求の範囲によってのみ定められる本発明の範囲を制限することを意図するものではない。さらに、文脈によって別途必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本出願において、「又は」の使用は、別途示されない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、「含むこと（including）」という用語、並びに他の形態、例えば、「含む（includes）」及び「含まれる（included）」の使用は、制限するものではない。
本開示の実施形態の説明は、網羅的であることも、本開示を開示されている厳密なものに限定することも意図するものではない。本開示の特定の実施形態及びその実施例が例示目的で本明細書に記載されているが、当業者には理解されるように、様々な同等の改変形態が、本開示の範囲内で可能である。例えば、方法ステップ又は機能が所与の順序で提示されているが、代替的な実施形態では、機能が異なる順序で実行されてもよく、又は機能が実質的に同時に実行されてもよい。本明細書に提供される本開示の教示は、適宜他の手順又は方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参照及び適用の組成物、機能、及び概念を利用して、本開示のなおもさらなる実施形態を提供するように、改変されてもよい。さらに、生物学的機能の同等性の考察に起因して、種類及び量に関して生物学的又は化学的作用影響を及ぼすことなく、タンパク質構造に何らかの変更がなされてもよい。これら及び他の変更は、詳細な説明を踏まえて本開示になされ得る。すべてのそのような改変形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
本明細書において考察される刊行物は、本出願の出願日よりも以前のそれらの開示のために提供されているにすぎない。そのような刊行物が本明細書に添付される特許請求の範囲に対する先行技術を構成することを認めるにものとして解釈されるものは、本明細書には存在しない。
コロナウイルス
コロナウイルス（ＣｏＶ）は、ニドウイルス目のコロナウイルス科コロナウイルス亜科に属する。アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及びデルタコロナウイルスの４つの属がある。アルファコロナウイルス及びベータコロナウイルスは、哺乳動物の種に感染し、ガンマコロナウイルスは、鳥類の種に感染し、デルタコロナウイルスは、哺乳動物及び鳥類の両方の種に感染する。
ＣｏＶは、大型でエンベロープ型の一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスである。ＲＮＡウイルスの変異率は、ＤＮＡウイルスよりも高く、生存のためのより効率的な適応プロセスが示唆される。
ＣｏＶは、すべてのＲＮＡウイルスのなかでもっとも大きなゲノムを有し、典型的には２７～３２ｋｂの範囲に及ぶ。ＣｏＶゲノムは、少なくとも４つの主要な構造タンパク質：スパイク（Ｓ）、膜（Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）、ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、並びに複製プロセスを補助し、細胞への進入を促進する他の補助タンパク質をコードする。図１は、コロナウイルスの構造及び構造タンパク質の機能を要約する。簡単に述べると、ＣｏＶゲノムは、ヌクレオキャプシドによって形成されるらせん状のキャプシドの中に封入され、さらに、エンベロープによって包囲されている。ウイルスエンベロープと関連して、以下の少なくとも３つの構造タンパク質が存在する：ウイルスのアセンブリに関与する膜タンパク質及びエンベロープタンパク質、並びに宿主細胞へのウイルスの進入を媒介するスパイクタンパク質。一部のコロナウイルスはまた、エンベロープ会合ヘマグルチニン－エステラーゼタンパク質（hemagglutinin-esterase、ＨＥ）もコードする。スパイクタンパク質は、ウイルス表面から大きな突起を形成し、これによって、コロナウイルスは王冠を有する外観となり、「コロナウイルス」という名称はそれに由来する。ウイルス進入を媒介するのみならず、スパイクタンパク質は、ウイルス宿主範囲及び組織向性の極めて重要な決定因子であり、宿主免疫応答の主要な誘導因子である。
２０１９－ｎＣｏＶ（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が正式名称であり、２つの用語は、本明細書において互換可能に使用されている）は、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因物質であり、ヒト間で伝染する。２０１９－ｎＣｏＶは、動物起源であると考えられており、２０１９－ｎＣｏＶのＳＡＲＳ－ＣｏＶ（７９．５％）及びコウモリコロナウイルス（９６％）との遺伝的類似性を考慮すると、コウモリが起源である可能性が高い。ＣｏＶに関連する本明細書における任意の開示はまた、直接的にかつ制限することなく、２０１９－ｎＣｏＶに適用される。
ＣｏＶスパイクタンパク質は、３つのドメインを有する：（ｉ）大きなエクトドメイン、（ii）膜貫通ドメイン（ウイルスエンベロープを１回で通過する）、及び（iii）短い細胞内尾部。エクトドメインは、３つの受容体結合サブユニット（３×Ｓ１）及び３つの膜融合サブユニット（３×Ｓ２）でできている三量体ストークとからなる。ウイルス進入の際、Ｓ１は、ウイルスの結合のための宿主細胞表面上の受容体に結合し、Ｓ２は、宿主及びウイルスの膜を融合させ、ウイルスゲノムを宿主細胞に進入させる。受容体結合及び膜融合は、コロナウイルス感染サイクルにおける初期ステップであり、極めて重要なステップである。異なるＣｏＶによって標的とされる受容体には大きな違いがある。
２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントは、２０１９－ｎＣｏＶ感染症に対するワクチンのための抗原として治療上有望である。
したがって、本明細書に記載される場合、本発明は、配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはそれ以上の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントに関する。好ましくは、本発明は、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはそれ以上の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントに関する。より好ましくは、本発明は、配列番号１と少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはそれ以上を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントに関する。２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質は、配列番号１、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを含み得るか、又はそれからなり得る。
本発明によると、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントは、天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質に存在する１つ又は２つ以上の立体構造エピトープを維持する。そのため、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントは、免疫保護作用を生じることができる。典型的には、前記免疫保護作用は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントの１つ又は２つ以上の立体構造エピトープに特異的に結合する中和抗体（neutralising antibody、ｎＡｂ）の産生を含む。ＣｏＶスパイクタンパク質の立体構造エピトープは、ＣｏＶスパイクタンパク質の三次構造において見出される特定の三次元構造を有する。前記１つ又は２つ以上の立体構造エピトープは、典型的には、スパイクタンパク質のエクトドメイン内にある。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントは、天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質に存在する立体構造エピトープのすべてを保持する。
いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の免疫原性フラグメントに関する。このＲＢＤは、宿主細胞への２０１９－ｎＣｏＶの結合を担い、したがって、宿主細胞への２０１９－ｎＣｏＶ粒子の進入を促進する。ＲＢＤは、配列番号１のアミノ酸残基３１９～５２９に対応し、本明細書に記載される場合、配列番号１５と称される。ＲＢＤは、２０１９－ｎＣｏＶウイルスのゲノム（Genbank受託番号ＭＮ９０８９４７、そのバージョン３（ＭＮ９０８９４７．３）が、２０２０年１月１７日に寄託されている）における９５５～１５９７位に対応する塩基によってコードされる。したがって、本明細書に記載される場合、本発明は、配列番号１５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のＲＢＤに関する。好ましくは、本発明は、配列番号１５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のＲＢＤに関する。より好ましくは、本発明は、配列番号１５と少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上を有する、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のＲＢＤに関する。２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のＲＢＤは、配列番号１５を含み得るか、又はそれからなり得る。２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質（例えば、ポリヌクレオチド、ウイルスベクター、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡワクチン、ウイルス様粒子（Virus-like particle、ＶＬＰ）、融合タンパク質、抗体、組成物及び医薬組成物、製剤、並びに治療適応症に関して）に関連する本明細書におけるありとあらゆる開示は、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のＲＢＤに同等かつ無条件に適用される。本明細書におけるＲＢＤへの言及は、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のＲＢＤを指す。
ＣｏＶは、大型でエンベロープ型の一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスである。ＲＮＡウイルスの変異率は、ＤＮＡウイルスよりも高く、生存のためのより効率的な適応プロセスが示唆される。したがって、抗原ドリフトが２０１９－ｎＣｏＶの特性となるか、又はパンデミックが静まった後に２０１９－ｎＣｏＶが風土病となるかもしれない危険性がある。実際に、現在までの研究で、２０１９－ｎＣｏＶのスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内における変異、特に、Ｇ４７６Ｓ及びＶ４８３Ａ／Ｇ、並びにＳ１／Ｓ２部位の近傍における高頻度のＤ６１４Ｇ変異（Saha et al., ChemRxivTM http://doi.org/10.26434/chemrxiv.12320567.v1）がすでに特定されており、これは、２０１９－ｎＣｏＶビリオンによる細胞進入を増強させ得、さらには宿主細胞向性を拡げ得ることが、根拠によって示唆される。２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質において報告されている他の変異としては、Ｓ９４３（特に、Ｓ９４３Ｐ）、Ｌ５（特に、Ｌ５Ｆ）、Ｌ８（特に、Ｌ８Ｆ）、Ｖ３６７（特に、Ｖ３６７Ｆ）、Ｈ４９（特に、Ｈ４９Ｙ）、Ｙ１４５（特に、Ｙ１４５Ｈ／ｄｅｌ）、Ｑ２３９（特に、Ｑ２３９Ｋ）、Ａ８３１（特に、Ａ８３１Ｖ）、Ｄ８３９（特に、Ｄ８３９Ｙ／Ｎ／Ｅ）、及びＰ１２６３（特に、Ｐ１２６３Ｌ）、又はこれらの任意の組合せが挙げられる（Korber et al., BioRxivTMhttps://doi.org/10.1101/2020.04.29.069054）。
したがって、本発明は、有利なことに、変異したスパイクタンパク質が生じた場合にそれを有する株に対する免疫の増強をもたらすように必要に応じて２０１９－ｎＣｏＶワクチン抗原を改変することを可能にする。非限定的な例として、本発明による任意の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントは、（ｉ）Ｄ６１４、（ii）Ｖ４８３、（iii）Ｇ４７６、（iv）Ｋ４１７、（ｖ）Ｅ４８４、（vi）Ｎ５０１、（vii）Ａ５７０、及び（viii）Ｐ６８１、又は（ｉ）～（viii）の（任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、任意の６つ、任意の７つ、又は８つすべてを含む）任意の組合せの位置で（特に、置換によって）改変され得る。代替的に、又は追加として、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントは、アミノ酸残基６９、７０、及び／又は１４４のうちの１つ又は２つ以上における欠失を含む、欠失変異を含んでもよい。本明細書に記載される場合、変異／改変の位置は、典型的には、本発明の配列番号１におけるアミノ酸の番号付けに対応する。
Ｄ６１４位における改変、特に、Ｄ６１４Ｇ置換が、好ましい。具体的には、本発明による任意の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントは、以下の置換（ｉ）Ｇ４７６Ｓ、（ii）Ｖ４８３Ａ／Ｇ、（iii）Ｄ６１４Ｇ、（iv）Ｋ４１７Ｎ／Ｔ、（ｖ）Ｅ４８４Ｋ、（vi）Ｎ５０１Ｙ、（ vii）Ａ５７０Ｄ、及び（viii）Ｐ６８１Ｈ、又は（ｉ）～（viii）の（任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、任意の６つ、任意の７つ、又は８つすべてを含む）任意の組合せを含み得る。
本発明はまた、バリアント２０１９－ｎＣｏＶに由来する２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントにも関する。具体的には、本発明は、Ｂ．１．１．７株（２０１／５０１Ｙ．Ｖ１としても知られており、英国において最初に検出された）、Ｂ．１．３５１株（２０Ｈ／５０１．Ｖ２としても知られており、南アフリカにおいて最初に検出された）、並びに／又はＰ１株（２０Ｊ／５０１Ｙ．Ｖ３としても知られており、日本及びブラジルで最初に検出された）に由来する２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントに関連し得る。Ｂ．１．１．７染色における鍵となる変異は、残基６９／７０欠失、及び１４４Ｙ、並びにＮ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、及びＰ６８１Ｈ置換を含む。Ｂ．１．３５１株における鍵となる変異は、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、及びＤ６１４Ｇ置換を含む。Ｐ．１株における鍵となる変異は、Ｅ４８４Ｋ、Ｋ４１７Ｎ．Ｔ、Ｎ５０１Ｙ、及びＤ６１４Ｇを含む。
ポリヌクレオチド、スパイクタンパク質及びそのフラグメント、ＶＬＰ、融合タンパク質、並びにＤＮＡ／ＲＮＡワクチンに関連する本明細書におけるすべての開示は、別途明示されない限り、２０１９－ｎＣｏＶの異なるバリアント及び株に同等に適用される。
ポリヌクレオチド
本発明は、本発明のタンパク質又は免疫原性フラグメントをコード又は発現する（「コードする」及び「発現する」という用語は、本明細書において互換可能に使用される）ポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドという用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列の両方を包含する。本明細書において、「核酸」、「核酸分子」、及び「ポリヌクレオチド」は、互換可能に使用される。
本発明は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。例えば、ポリヌクレオチドは、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のＲＢＤをコードし得、好ましくは、前記ＲＢＤは、配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する。ＲＢＤをコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１３及び配列番号１４のコドン最適化された配列に示されている。
本発明はまた、上述のように、２０１９－ｎＣｏＶに由来するバリアントスパイクタンパク質、又は前記バリアントスパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチドも包含する。前記バリアントスパイクタンパク質は、典型的に、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質又は免疫原性フラグメント（ＶＬＰ若しくは融合タンパク質の形態を含む）の組換え発現に使用され得るか、又はＤＮＡ／ＲＮＡワクチンとして使用され得る。
２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードする、改善されたポリヌクレオチドを最初に提供したのは本発明者らである。具体的には、本発明者らは、組換え発現のために最適化されたポリヌクレオチドを設計した。本発明のポリヌクレオチドは、１つ又は２つ以上の特定の細胞型、例えば、真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、若しくは植物細胞）、又は原核生物細胞（細菌細胞）における発現のために最適化されていてもよい。典型的には、ポリヌクレオチドは、細菌細胞、酵母細胞、又は哺乳動物細胞における発現のために最適化されている。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、大腸菌（例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＲＶ３０８（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、若しくはＫ１２株）、コマガタエラ（以前はピキアとして割り当てられていた、特に、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）若しくはコマガタエラ・ファフィー（Komagataella phaffii））、サッカロマイセス（特に、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、又はヒト細胞（好ましくは、２９３ Ｆ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞、若しくはＨｅＬａ細胞）における発現のために最適化されている。目的とされる他の細胞型／発現系としては、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta）、ハンセニュラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary、ＣＨＯ）細胞、及び／又は昆虫細胞バキュロウイルス系発現系が挙げられる。
本明細書において使用される「最適化された」という用語は、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントの組換え発現のための最適化に関し、宿主細胞／生物内でのポリヌクレオチドからの２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の発現のレベル及び／若しくは期間を増加させるか、又はそれ以外では本発明のポリヌクレオチドから２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはそのフラグメントを発現させるときに利点を提供する、ポリヌクレオチドに対するコドン最適化及び／又は他の改変（核酸配列及び他の改変の両方に関する）を含む。
「コドン最適化された」という用語は、基本のポリヌクレオチド配列内の少なくとも１つのコドンの、ポリヌクレオチドを発現させようとする宿主生物又は細胞によって優先的に使用されるコドンとの置き換えを指す。典型的には、宿主生物においてもっとも頻繁に使用されるコドンが、コドン最適化されたポリヌクレオチド配列において使用される。コドン最適化の方法は、当該技術分野において周知である。
非限定的な例として、ポリヌクレオチド最適化の別の形態は、ＲＮＡ構造を最小化する改変であるが、これは、原核生物において発現される遺伝子におけるＲＢＳ及び／又は開始コドンを含むか又はそうでなければそれを抑止する構造が、発現を損ない得るためである。最適化はまた、翻訳の速度を増加させることによって、又は翻訳の速度と効率的な「自己」若しくはシャペロンに補助されるタンパク質フォールディングを可能にする必要性とのバランスをとることのいずれかによって、翻訳を最適化するポリヌクレオチドに対する改変を包含し、戦略的に配置されたより緩徐なコドン又はコドンラン（例えば、タンパク質ドメイン境界部）により、高い全体的な翻訳速度を維持しながら、フォールディング効率を最大化することができる。最適化はまた、ポリヌクレオチドの核酸配列内の有害なモチーフの除去も包含する。非限定的な例として、大腸菌においてＴ７プロモーターの制御下で遺伝子を発現させる場合、クラスＩ及びクラスIIの両方の転写終結部位を避けることが好ましい。コーディング配列内のシャイン・ダルガーノ様配列は、原核生物宿主において誤った下流の開始又は翻訳の一時停止を引き起こし得る。真核生物宿主／細胞における発現については、ｍＲＮＡプロセシング及び安定性に影響を及ぼす、可能性のあるスプライスシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び他のモチーフが、除去され得る。有害なモチーフの他のクラスとしては、リボソームフレームシフト及び一時停止を促進する配列が挙げられる。改変の任意の組合せを、目的の宿主細胞における発現を最適化するために、本発明のポリヌクレオチドに行ってもよい。
典型的に、細菌細胞、特に、大腸菌における発現のために最適化された本発明のポリヌクレオチドは、クローニングされたＮ末端及び／又はＣ末端欠失アミノ酸を含む。好ましくは、約１～２０個、より好ましくは、約１～１５個、もっとも好ましくは、約５～１０個のクローニングされたＮ末端及び／又はＣ末端欠失アミノ酸が、含まれる。
当業者であれば、多数の異なるポリヌクレオチドが、遺伝子コードの縮重の結果として、同じポリペプチドをコードし得ることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、慣例的な技法を使用して、核酸分子によってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさずに、ポリペプチドを発現させようとする任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するようにヌクレオチド置換を行うことができることもまた、理解される。したがって、別途示されない限り、「本発明のタンパク質又は免疫原性フラグメントをコードするポリヌクレオチド」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのポリヌクレオチド配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、典型的に、目的の宿主細胞のゲノムに組み込むことができるように設計される。所望される宿主細胞に応じて、異なる最適化戦略を使用して、組込みを促進してもよい。
典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、１つ又は２つ以上のシス作用配列モチーフ（シス作用エレメント又はシス作用調節エレメントとも互換可能に称される）の除去又は削除によって、最適化される。シス作用配列モチーフは、遺伝子発現に必要とされる遺伝子の構造部分の近傍にある配列である。前記１つ又は２つ以上のシス作用配列モチーフは、（ａ）内部ＴＡＴＡボックス、（ｂ）カイ部位、（ｃ）リボソーム進入部位、（ｄ）ＡＴリッチ及び／若しくはＧＣリッチな配列ストレッチ、（ｅ）ＲＮＡ不安定性モチーフ、（ｆ）反復配列及び／若しくはＲＮＡ二次構造、（ｇ）隠れたスプライスドナー部位、（ｈ）隠れたスプライスアクセプタンス部位、並びに／又は（ｉ）（ａ）～（ｉ）の任意の組合せから独立して選択され得る。これらのシス作用配列モチーフは、当該技術分野において公知である。非限定的な例として、高いＧＣ含量（例えば、約７０％を上回る、好ましくは、約８０％を上回る）、及び／又は低いＧＢ含量（例えば、約４０％を下回る、好ましくは、約３０％を下回る）の領域が、削除される。好ましくは、１つ又は２つ以上の他のシス作用配列モチーフの除去又は削除と組み合わせて、高い及び低いＧＣ含量の両方の領域が、削除される。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本明細書に記載されるように「コドン最適化」されていてもよい。コドン最適化は、好ましくは、本明細書に記載される１つ又は２つ以上のシス作用配列モチーフの除去又は削除に加えて、生じる。
本発明のポリヌクレオチドの平均ＧＣ含量はまた、前記ポリヌクレオチドの発現を最適化するように改変されてもよい。例えば、ポリヌクレオチドの平均ＧＣ含量は、約４０％～約６０％、好ましくは、約４０％～約５７％、より好ましくは、約４５％～約５６％の領域にあり得る。
本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、少なくとも約０．８０、好ましくは、少なくとも約０．９、より好ましくは、少なくとも約０．９１、少なくとも約０．９２、少なくとも約０．９３、少なくとも約０．９４、少なくとも約０．９５、少なくとも約０．９６、少なくとも約０．９７、少なくとも約０．９８、少なくとも約０．９９、又は最大で約１．０までのコドン適合インデックス（ＣＡＩ）を有する。
最適化改変の結果として、本発明のポリヌクレオチドは、コードされる２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントの発現を、対応する最適化されていないポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又はそれ以上増加させ得る。好ましくは、発現レベルは、対応する最適化されていないポリヌクレオチドと比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又はそれ以上、より好ましくは、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又はそれ以上増加する。
本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、又はそれ以上、好ましくは、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、又はそれ以上、宿主細胞における発現が可能であり得る。
本発明者らは、合理的に設計された最適化されたポリヌクレオチドを使用して、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質及び２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質を含む融合タンパク質が、様々な発現系／宿主細胞において、高いレベルで発現され得ることを実証した。さらに、本発明は、驚くべきことに、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質及び２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質を含む融合タンパク質が、マウスにおいて強力な抗体応答をもたらし得ることを実証しており、これによって、それらの有望な治療的有用性が示される。本発明者らは、以下の実施例に記載されるように、最適化されたポリヌクレオチド及び融合タンパク質を設計及び生成することによって、それらの最適化手法を例証している。
したがって、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１３、１４、２６、２７、２９、３０、又は３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１３、１４、２６、２７、２９、３０、又は３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１３、１４、２６、２７、２９、３０、又は３２のうちのいずれか１つの核酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。加えて、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１３、１４、２６、２７、２９、３０、若しくは３２のうちのいずれか、又は本明細書に記載されるそれらの任意のバリアントにおいて特定される、５’クローニング部位、３’クローニング部位、又は５’及び３’クローニング部位が、欠失していてもよい。したがって、本発明は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１３、１４、２６、２７、２９、３０、又は３２のうちのいずれか１つを含むか又はそれからなるが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１３、１４、２６、２７、２９、３０、又は３２のうちのいずれかにおいて特定される５’クローニング部位、３’クローニング部位、又は５’及び３’クローニング部位が欠如している、ポリヌクレオチドを提供する。あるいは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１３、１４、２６、２７、２９、３０、若しくは３２のうちのいずれか、又は本明細書に記載されるその任意のバリアントにおいて特定される５’クローニング部位、３’クローニング部位、又は５’及び３’クローニング部位は、独立して、別の適切なクローニング部位と置き換えられてもよい。好適な代替的クローニング部位は、当該技術分野において周知である。
本発明は、特に、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のＲＢＤをコードするポリヌクレオチドを提供する。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１３に対して、又は配列番号１４のコドン最適化された配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１３に対して、又は配列番号１４のコドン最適化された配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１３に対して、又は配列番号１４のコドン最適化された配列に対して、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１３の核酸配列、又は配列番号１４のコドン最適化された配列を含み得るか、又はそれからなり得る。
本発明のポリヌクレオチドは、典型的に、（ａ）天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質に存在する立体構造エピトープを保持する、及び／又は（ｂ）核酸又はコードされるスパイクタンパク質若しくはそのフラグメントが対象に投与されると、スパイクタンパク質若しくはそのフラグメントに特異的な中和抗体の産生をもたらす、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質、又はその免疫原性フラグメントをコードする。
本発明のポリヌクレオチドは、典型的に、配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはそれ以上の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを発現する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはそれ以上の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを発現する。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはそれ以上を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを発現する。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１を含むか若しくはそれからなる２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを発現し得る。
本発明のポリヌクレオチドは、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントの発現を促進するように、発現コンストラクトに含まれ得る。したがって、本発明は、さらに、本発明のポリヌクレオチドを含む発現コンストラクトを提供する。典型的には、そのような発現コンストラクトにおいて、本発明のポリヌクレオチドは、好適なプロモーターに作動可能に連結されている。ポリヌクレオチドは、好適なターミネーター配列に連結されていてもよい。ポリヌクレオチドは、プロモーター及びターミネーターの両方に連結されていてもよい。好適なプロモーター及びターミネーター配列は、当該技術分野において周知である。
プロモーターの選択は、最終的なポリヌクレオチドの発現が生じる場所に依存するであろう。一般に、構成的プロモーターが好ましいが、誘導性プロモーターも同様に使用され得る。この様式で産生されるコンストラクトは、ベクターの少なくとも一部、特に、調節エレメントを含む。ベクターは、好ましくは、所与の宿主細胞において核酸を発現させることができる。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母、及び／又は植物宿主細胞など、任意の適切な宿主細胞が使用され得る。加えて、無細胞発現系が使用されてもよい。そのような発現系及び宿主細胞は、当該技術分野において標準的である。
本発明のポリヌクレオチドによってコードされる又は発現される（これら２つの用語は本明細書において互換可能に使用される）２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントは、典型的に、その受容体に対して、天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質と同じ結合親和性を保持する。本発明の文脈において、これは、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質受容体に対して、天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のものの少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の結合親和性を有することを意味し得る。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドによって発現される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントは、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質に対して、天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のものの少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の結合親和性を有する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドによって発現される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントは、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質受容体に対して、全長タンパク質のものを上回る結合親和性を有する。例えば、本発明のポリヌクレオチドによって発現される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントは、天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のものの少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、又は少なくとも１５０％、又はそれ以上の結合親和性を有し得る。
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドによって発現される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又は免疫原性フラグメントは、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質受容体に対して、天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のものよりも低い結合親和性を有し得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドによって発現される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントは、天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のものの８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、又はそれよりも低い、結合親和性を有し得る。
本発明のポリヌクレオチドによって発現される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントの、その受容体に対する結合親和性は、解離定数（Ｋｄ）で定量化することができる。Ｋｄは、任意の適切な技法を使用して決定され得るが、ＳＰＲが、一般には、本発明の文脈において好まれる。
本発明のポリヌクレオチドによって発現される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の免疫原性フラグメントは、典型的に、長さが２００個を上回るアミノ酸である。本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質フラグメントは、長さが少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、少なくとも１０００個、少なくとも１１００個、又はそれ以上のアミノ酸残基を含み得るか、又はそれからなり得る。本発明のフラグメントは、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドによって発現される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の免疫原性フラグメントは、本明細書に定義される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のＲＢＤであり、好ましくは、前記ＲＢＤは、配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する。
本発明のポリヌクレオチドによって発現される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントは、さらに、例えば、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントの組換え産生及び／又は分泌を補助するための、リーダー配列を含んでもよい。当該技術分野において公知の従来的なリーダー配列を含む、任意の好適なリーダー配列が、使用され得る。好適なリーダー配列としては、昆虫細胞からの分泌を補助するために当該技術分野において広く使用されているＢｉｐリーダー配列、並びにウイルス及びＤＮＡに基づくワクチンにおいて、並びにタンパク質ワクチンで、哺乳動物細胞発現プラットフォームからの分泌を補助するために慣例的に使用されているヒト組織プラスミノーゲン活性化因子リーダー配列（tissue plasminogen activator leader sequence，ｔＰＡ）が挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドによって発現される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントは、さらに、例えば、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントの組換え産生及び／又は精製を補助するための、Ｎ末端又はＣ末端タグを含んでもよい。当該技術分野において公知の従来的なタグを含む、任意のＮ末端又はＣ末端タグが、使用され得る。好適なタグ配列としては、異種発現系、例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌、又は酵母からの精製を補助するために当該技術分野において広く使用されている、Ｃ末端ヘキサ－ヒスチジンタグ及び「Ｃタグ」（Ｃ末端における４つのアミノ酸ＥＰＥＡ）が挙げられる。他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドによって発現される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントは、精製タグの使用を必要とすることなく、異種発現系から精製される。
本発明のポリヌクレオチドによって発現される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントは、本明細書に定義されるリーダー配列及び／又はタグを含み得る。
ウイルスベクター、ＤＮＡプラスミド、及びＲＮＡワクチン
本発明はまた、（ａ）本発明のポリヌクレオチドを含む、及び／又は（ｂ）本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメントをコードする、ベクターも提供する。ベクターは、ワクチン組成物又は製剤の形態で存在してもよい。
本発明のベクターは、典型的に、配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはそれ以上の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを発現する。好ましくは、本発明のベクターは、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはそれ以上の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを発現する。より好ましくは、本発明のベクターは、配列番号１と少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはそれ以上を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを発現する。本発明のベクターは、配列番号１を含むか若しくはそれからなる２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを発現し得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のベクターによって発現される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の免疫原性フラグメントは、本明細書に定義される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のＲＢＤであり、好ましくは、前記ＲＢＤは、配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する。
本発明のベクターは、シグナルペプチドをさらに含む、本明細書に定義されるスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントを発現し得る。典型的に、前記シグナルペプチドは、目的の宿主細胞、例えば、ヒト細胞、大腸菌細胞、又は酵母細胞からの２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントの分泌を誘導する。
本発明のベクターはさらに、１つ又は２つ以上の追加の抗原又はそのフラグメントを発現し得る。スパイクタンパク質又はそのフラグメント及び１つ又は２つ以上の追加の抗原又はそのフラグメントは、融合タンパク質として発現され得る。あるいは、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメント及び１つ又は２つ以上の追加の抗原又はそのフラグメントを発現する別個のベクターを、使用してもよい。そのような事例において、前記別個のベクターは、逐次的又は同時のいずれかで、組み合わせて使用され得る。１つ又は２つ以上の追加の抗原は、２０１９－ｎＣｏＶに由来する同じ抗原又は異なる抗原、又はそのフラグメントであり得る。より好ましくは、前記１つ又は２つ以上の追加の抗原は、２０１９－ｎＣｏＶに由来する異なる抗原、例えば、２０１９－ＣｏＶ膜タンパク質又はエンベロープタンパク質に由来する抗原である。
本発明のベクターは、本明細書に定義される任意のポリヌクレオチド若しくは発現コンストラクト、又はそれらの任意の組合せを含み得る。
ベクターは、ウイルスベクターであり得る。そのようなウイルスベクターは、アデノウイルス（ヒト血清型、例えば、ＡｄＨｕ５、サル血清型、例えば、ＣｈＡｄ６３、ＣｈＡｄＯＸ１、若しくはＣｈＡｄＯＸ２、又は別の形態のもの）、アデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus、ＡＡＶ）、又はポックスウイルス（例えば、改変ワクシニア・アンカラ（modified vaccinia Ankara、ＭＶＡ））、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり得る。ＣｈＡｄＯＸ１及びＣｈＡｄＯＸ２は、国際公開第ＷＯ２０１２／１７２２７７号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。ＣｈＡｄＯＸ２は、ＢＡＣ由来及びＥ４改変ＡｄＣ６８系ウイルスベクターである。好ましくは、前記ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターアデノウイルスである。
ウイルスベクターは、通常、非複製性であるか、又は複製損傷ベクターであり、これは、ウイルスベクターが、従来的な手段によって、例えば、ＤＮＡ合成及び／又はウイルス力価を測定することによって測定される場合に、正常な細胞（例えば、正常なヒト細胞）においていずれの有意な程度にも複製できないことを意味する。非複製性又は複製損傷ベクターは、天然にそうなっていてもよく（すなわち、それらは自然界からそのようなものとして単離されている）、又は人工的にそうなっていてもよい（例えば、インビトロで繁殖させること若しくは遺伝子操作によって）。一般に、複製損傷ウイルスベクターを増殖させることができる細胞型が、少なくとも１つ存在し、例えば、改変ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）は、ＣＥＦ細胞において増殖させることができる。非限定的な例として、ベクターは、ヒト又はサルアデノウイルス又はポックスウイルスベクターから選択され得る。
典型的に、ウイルスベクターは、動物対象において、典型的には、哺乳動物対象、例えば、ヒト又は他の霊長類において、有意な感染を引き起こすことは不可能である。
ベクターは、ＤＮＡベクター、例えば、ＤＮＡプラスミドであってもよい。ベクターは、ＲＮＡベクター、例えば、ｍＲＮＡベクター又は自己増幅ＲＮＡベクターであってもよい。本発明のＤＮＡ及び／又はＲＮＡベクターは、真核生物細胞及び／又は原核生物細胞、特に、本明細書に記載される任意の宿主細胞型、又は処置しようとする対象において、発現させることが可能であり得る。
典型的に、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡベクターは、ヒト、大腸菌、又は酵母細胞において、発現させることができる。
本発明は、ファージベクター、例えば、Hajitou et al., Cell 2006; 125(2) pp. 385-398に記載されるＡＡＶ／ファージハイブリッドベクターであってもよく、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の核酸分子は、当該技術分野において公知の任意の好適なプロセスを使用して、作製され得る。したがって、核酸分子は、化学合成技法を使用して、作製され得る。あるいは、本発明の核酸分子は、分子生物学技法を使用して作製されてもよい。
本発明のベクターは、インシリコで設計され、次いで、従来的なポリヌクレオチド合成技法によって合成されてもよい。
ウイルス様粒子
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルスに似ているが、ウイルス核酸を含まず、したがって、非感染性である、粒子である。それらは、一般に、自己アセンブリしてＶＬＰを形成することができる、１つ又は２つ以上のウイルスキャプシド又はエンベロープタンパク質を含む。ＶＬＰは、広範なウイルスファミリーの構成成分から産生されている（Noad and Roy (2003), Trends in Microbiology, 11:438-444；Grgacic et al., (2006), Methods, 40:60-65）。いくつかのＶＬＰ、例えば、エンゲリックス－Ｂ（Ｂ型肝炎用）、サーバリックス及びガーダシル（ヒトパピローマウイルス用）が、治療用ワクチンとして承認されている。
したがって、本発明は、本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントを含む、ＶＬＰを提供する。本発明のＶＬＰは、典型的に、配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはそれ以上の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを含む。好ましくは、本発明のＶＬＰは、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはそれ以上の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを含む。より好ましくは、本発明のＶＬＰは、配列番号１と少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはそれ以上を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを含む。本発明のＶＬＰは、配列番号１を含むか若しくはそれからなる２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＶＬＰに含まれる２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の免疫原性フラグメントは、本明細書に定義される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のＲＢＤであり、好ましくは、前記ＲＢＤは、配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する。
当業者であれば、ＶＬＰが、ウイルス構造タンパク質の個別の発現を通じて合成することができ、これが、次いで、ウイルス様構造体に自己アセンブリし得ることを理解するであろう。異なるウイルスに由来する構造キャプシドタンパク質の組合せを使用して、組換えＶＬＰを作成することができる。加えて、抗原又はその免疫原性フラグメントを、ＶＬＰの表面に融合することができる。非限定的な例として、本発明の抗原又はその免疫原性フラグメントは、SpyCatcher-SpyTagシステム（Brune、Biswas、Howarthによって記載される）を使用して、ＶＬＰに連結させてもよい。
本発明のＶＬＰは、１つ又は２つ以上の追加のタンパク質抗原を含み得る。１つ又は２つ以上の追加の抗原は、２０１９－ｎＣｏＶに由来する同じ抗原又は異なる抗原、又はそのフラグメントであり得る。より好ましくは、前記１つ又は２つ以上の追加の抗原は、２０１９－ｎＣｏＶに由来する異なる抗原、例えば、２０１９－ＣｏＶ膜タンパク質又はエンベロープタンパク質に由来する抗原である。
本発明のＶＬＰは、本明細書に記載される融合タンパク質を含み得る。本発明のＶＬＰは、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントと、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）、ヒトパピローマウイルス（human papillomavirus、ＨＰＶ）１８ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ １６ Ｌ１タンパク質、及び／又はＥ型肝炎Ｐ２３９、好ましくは、Ｂ型肝炎表面抗原との融合タンパク質を含み得る。これらの他のウイルスタンパク質は、これまでに、融合タンパク質において説明されているが、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のサイズのタンパク質を含む融合タンパク質の生成が成功したという報告はない。さらに、そのような融合タンパク質の発現系の選択に関して、制限があることが知られている。本発明者らは、驚くべきことに、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質を含むＶＬＰ／融合タンパク質を、大腸菌、酵母、及びヒト細胞において組換え産生することができること、並びにこれらのＶＬＰ／融合タンパク質が、動物モデルにおいて、（免疫保護的）抗体応答を誘起し得ることを、実証した。
したがって、本発明のＶＬＰは、配列番号３、５、６、又は８のうちのいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。好ましくは、本発明のＶＬＰは、配列番号３、５、６、又は８のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。より好ましくは、本発明のＶＬＰは、配列番号３、５、６、又は８のうちのいずれか１つに対して少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。本発明のＶＬＰは、配列番号３、５、６、又は８のうちのいずれか１つの核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。
本発明のＶＬＰは、配列番号２６、２７、２９、３０、又は３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。好ましくは、本発明のＶＬＰは、配列番号２６、２７、２９、３０、又は３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。より好ましくは、本発明のＶＬＰは、配列番号２６、２７、２９、３０、又は３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。本発明のＶＬＰは、配列番号２６、２７、２９、３０、又は３２のうちのいずれか１つの核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。
本発明のＶＬＰは、配列番号９、１０、１１、又は１２のうちのいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。好ましくは、本発明のＶＬＰは、配列番号９、１０、１１、又は１２のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。より好ましくは、本発明のＶＬＰは、配列番号９、１０、１１、又は１２のうちのいずれか１つに対して少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。本発明のＶＬＰは、配列番号９、１０、１１、又は１２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。
本発明のＶＬＰは、配列番号２８、３１、又は３３のうちのいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。好ましくは、本発明のＶＬＰは、配列番号２８、３１、又は３３のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。より好ましくは、本発明のＶＬＰは、配列番号２８、３１、又は３３のうちのいずれか１つに対して少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。本発明のＶＬＰは、配列番号２８、３１、又は３３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。
ＶＬＰの使用は、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメントによって誘導される免疫保護応答の有効性を増加させ得る、及び／又は本明細書に定義される免疫保護応答の期間を増加させ得る。
融合タンパク質
本発明はさらに、本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントを含む融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、典型的に、配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを含む。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはそれ以上の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを含む。より好ましくは、本発明の融合タンパク質は、配列番号１と少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはそれ以上を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを含む。本発明の融合タンパク質は、配列番号１を含むか若しくはそれからなる２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質に含まれる２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の免疫原性フラグメントは、本明細書に定義される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のＲＢＤであり、好ましくは、前記ＲＢＤは、配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する。
本発明の融合タンパク質は、典型的に、非２０１９－ｎＣｏＶドメイン又はエレメント、典型的に、非２０１９－ｎＣｏＶタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドドメイン又はエレメントも含む。本発明の融合タンパク質は、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントと、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１８ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ １６ Ｌ１タンパク質、及び／又はＥ型肝炎Ｐ２３９（ＨＥＶ）、好ましくは、Ｂ型肝炎表面抗原のうちの１つ又は２つ以上とを含み得る。ＶＬＰの文脈において上記で説明されたように、本発明者らは、驚くべきことに、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質を含む融合タンパク質を、大腸菌、酵母、及びヒト細胞において組換え産生することができること、並びにこれらの融合タンパク質が、動物モデルにおいて、（免疫保護的）抗体応答を誘起し得ることを、実証した。
本発明の融合タンパク質は、配列番号３、５、６、又は８のうちのいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、配列番号３、５、６、又は８のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。より好ましくは、本発明の融合タンパク質は、配列番号３、５、６、又は８のうちのいずれか１つに対して少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。本発明のＶＬＰは、配列番号３、５、６、又は８のうちのいずれか１つの核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。
本発明の融合タンパク質は、配列番号２６、２７、２９、３０、又は３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、配列番号２６、２７、２９、３０、又は３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。より好ましくは、本発明の融合タンパク質は、配列番号２６、２７、２９、３０、又は３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。本発明の融合タンパク質は、配列番号２６、２７、２９、３０、又は３２のうちのいずれか１つの核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによって、コードされ得る。
本発明の融合タンパク質は、配列番号９、１０、１１、又は１２のうちのいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、配列番号９、１０、１１、又は１２のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。より好ましくは、本発明の融合タンパク質は、配列番号９、１０、１１、又は１２のうちのいずれか１つに対して少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。本発明の融合タンパク質は、配列番号９、１０、１１、又は１２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。
本発明の融合タンパク質は、配列番号２８、３１、又は３３のうちのいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、配列番号２８、３１、又は３３のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。より好ましくは、本発明の融合タンパク質は、配列番号２８、３１、又は３３のうちのいずれか１つに対して少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。本発明の融合タンパク質は、配列番号２８、３１、又は３３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。
本発明の融合タンパク質は、リンカー（本明細書においてリンカーペプチド、スペーサー、又はスペーサーペプチドとも互換可能に称される）を含み得る。リンカーは、本発明の融合タンパク質の２つ又は３つ以上の機能性ドメインを結合させるために使用され得る。典型的には、リンカーが存在する場合、それは、融合タンパク質の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントのドメインを、融合タンパク質の非２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質ドメインに結合させるために使用される。融合タンパク質におけるリンカーの使用は、当該技術分野において慣例的であり、任意の従来的なリンカータンパク質が、本発明の融合タンパク質において使用され得るが、ただし、結果として得られる融合タンパク質が、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントの所望される機能特性及び非２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質ドメインの所望される機能特性を保持することを条件とする。
リンカーは、最大約３０個のアミノ酸、例えば、約５～３０個のアミノ酸、約５～２５個のアミノ酸、約５～２０個のアミノ酸、約１０～２０個のアミノ酸、約５～１５個のアミノ酸、又は約１０～１５個のアミノ酸の長さの短いペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、又は約２０個のアミノ酸の長さである。
いくつかの実施形態において、剛性リンカーが、本発明の融合タンパク質において使用され得る。剛性リンカーは、融合タンパク質の異なるドメイン／部分間で固定の距離を保ち、それらの独立した機能を維持する必要がある場合に従来的に使用されている。剛性リンカーはまた、融合タンパク質ドメインの空間的分離が極めて重要である場合にも、融合タンパク質の安定性又は生体活性を保存するために使用され得る。Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２～５）（配列番号１６）の配列を有する実証的な剛性リンカーは、α－ヘリックス立体構造を示し、これは、Ｇｌｕ－－Ｌｙｓ＋塩架橋によって安定化される。リンカーの長さは、ドメイン間の最適な距離を達成するようにコピー数を変更させることによって調節され得る。ヘリックスリンカーはまた、融合タンパク質のフォールディング及び安定性を改善し得る。
剛性リンカーの非限定的な例は、核酸配列（配列番号１７）によってコードされ得るＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（（ＥＡＡＡＫ）３とも称される、配列番号１８）である。機能性ドメイン間の距離を制御する、リンカーの長さ及び構造は、融合タンパク質の安定性に影響を及ぼす。本発明のＲＢＤ融合タンパク質の安定性及び活性は、典型的に、以下の実施例に示されるように、（ＥＡＡＡＫ）３リンカーの挿入後に、有意に改善される。リンカー、特に、（ＥＡＡＡＫ）３の使用はまた、本発明の組換え融合タンパク質の収率を増強させ得る。
したがって、剛性リンカー、特に、（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号１８）は、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ ２９３細胞における本発明の融合タンパク質の発現のために使用され得る。
いくつかの実施形態において、可動性リンカーが、本発明の融合タンパク質において使用され得る。可動性リンカーは、従来的には、結合されたドメインがある特定の程度の移動又は相互作用を必要とする場合に使用される。可動性リンカーは、通常、小さなアミノ酸残基、例えば、グリシン、スレオニン、アルギニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、アスパラギン酸、プロリン、グルタミン酸、リジン、ロイシン、及び／又はバリン、特に、グリシン、セリン、アラニン、ロイシン、及び／又はバリンを含むか、又はそれからなる。グリシン、セリン、及び／又はアラニンを含むか又はそれからなる可動性リンカーが、好ましく、グリシン及びセリンが特に好ましい。したがって、もっとも一般に使用される可動性リンカーは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１９）の配列を含む、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基のストレッチから主としてなる配列を有する（「ＧＳ」リンカー）。ＧＳリンカーの非限定的な例としては、ＧＳ５又は（ＧＧＧＧＳ）１（配列番号２０）、ＧＳ１０又は（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号２１）、ＧＳ１５又は（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２３）、ＧＳ２０又は（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号２４）、及びＧＳ２５又は（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号２５）が挙げられる。好ましくは、（配列番号２２）によってコードされ得るＧＳ１５が、使用され得る。可動性リンカーは、好ましくは、細菌細胞、例えば、大腸菌細胞における本発明の融合タンパク質の発現のために使用され得る。
任意の適切なリンカー、例えば、本明細書に記載される例示的なリンカーが、本発明の任意の融合タンパク質（任意の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又は免疫原性フラグメントドメインと、任意の非２１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質ドメインとを含む）とともに使用され得る。非限定的な例として、本発明の融合タンパク質は、ＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＲＢＤ（配列番号２８）、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントを含み得るか、又はそれからなり得、これは、配列番号２６若しくは２７、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントによってコードされ得る。さらなる非限定的な例として、本発明の融合タンパク質は、ＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－全長２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質（配列番号３３）、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントを含み得るか、又はそれからなり得、これは、配列番号３２又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントによってコードされ得る。さらなる非限定的な例として、本発明の融合タンパク質は、ＨＥＶ－ＧＳ１５－ＲＢＤ（配列番号３１）、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントを含み得るか、又はそれからなり得、これは、（配列番号２９若しくは３０）、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントによってコードされ得る。
本発明の融合タンパク質は、好ましくは、ＶＬＰの形態をとり得る。理論によって束縛されるものではないが、これは、ＨＢＳＡｇ、ＨＰＶ １８ Ｌ１タンパク質、ＨＰＢ １６ Ｌ１タンパク質、及びＥ型肝炎Ｐ２３９タンパク質が、組換えで発現された場合に、自発的にＶＬＰの形態をとることが知られており、この構造は、ＨＢＳＡｇ、ＨＰＶ １８ Ｌ１タンパク質、ＨＰＢ １６ Ｌ１タンパク質、及び／又はＥ型肝炎Ｐ２３９タンパク質が、本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質（又はその免疫原性フラグメント）と組み合わされた融合タンパク質の形態で存在する場合にも保持されるためである。
抗体
本明細書に記載される場合、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントは、天然の２０１９－ｎＣｏＶにおいて見出される１つ又は２つ以上の立体構造エピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘起する。前記抗体は、典型的に、以下で考察される中和抗体（ｎＡｂ）である。これらのｎＡｂは、２０１９－ｎＣｏＶに対する免疫保護作用を媒介することができる。
「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）の４つのポリペプチド鎖から構成される任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、又はＩｇ分子の本質的なエピトープ結合特性を保持するその任意の機能的フラグメント、ミュータント、バリアント、若しくは派生物を広く指す。そのようなミュータント、バリアント、又は派生物抗体は、当該技術分野において公知であり、その非限定的な実施例は、以下に考察されている。
全長抗体において、それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと略される）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインから構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＶＬと略される）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）と称される保存性の高い領域が点在した、相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに分割することができる。それぞれのＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。抗体は、ポリクローナル（ｐＡｂ）であってもよく、又はモノクローナル（ｍＡｂ）であってもよい。治療的に（すなわち、受動免疫を提供するために）使用される場合、ｍＡｂの投与が好ましい。
本発明によると、抗体は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであり得、任意の種（例えば、マウス、ヒト、ニワトリ、ラット、ウサギ、ヒツジ、サメ、及びラクダ）に由来し得る。
抗体の「抗原結合フラグメント」（又は単純に「結合フラグメント」）という用語は、本明細書において使用される場合、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又は２つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の１つ又は２つ以上のフラグメントによって実施され得ることが示されている。一本鎖抗体もまた、包含される。そのような抗原結合フラグメントはまた、二特異性、二重特異性、又は多重特異性であってもよく、２つ又は３つ以上の異なる抗原に特異的に結合してもよい。したがって、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に包含される結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２、タンデムｓｃＦｖ、及びダイアボディが挙げられる。
リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインに連結された本発明の１つ又は２つ以上の抗原結合フラグメントを含むポリペプチドとして定義される抗体コンストラクトもまた、包含される。リンカーポリペプチドは、２つ又は３つ以上のアミノ酸残基がペプチド結合によって結合されたものを含み、１つ又は２つ以上の抗原結合部分を連結させるために使用される。
「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有するが、例えば、ＣＤＲ、及び特にはＣＤＲ３に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロにおいてランダム若しくは部位特異的変異生成によって、又はインビボにおいて体細胞変異によって導入される変異）を含み得る抗体として定義される、ヒト抗体であり得る。組換えヒト抗体もまた、包含される。
本発明の抗体は、１つの種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列と別の種に由来する定常領域配列とを含む抗体として定義される「キメラ抗体」であってもよい。本発明は、例えば、マウス重鎖及び軽鎖可変領域がヒト定常領域に連結されたものを有する、キメラ抗体を包含する。
本発明の抗体は、マウスＣＤＲのうちの１つ又は２つ以上（例えば、ＣＤＲ３又は３つすべてのＣＤＲ）が、ヒトＣＤＲ配列と置き換えられているマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、１つの種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域のうちの１つ又は２つ以上の配列が、別の種のＣＤＲ配列と置き換えられている抗体として定義される「ＣＤＲグラフト抗体」であってもよい。
本発明の抗体は、非ヒト種（例えば、マウス）に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部分が、より「ヒト様」となるように、すなわち、ヒト生殖細胞系可変配列により類似するように変更されている抗体として定義される「ヒト化抗体」であってもよい。ヒト化抗体の１つの種類は、ヒトＣＤＲ配列が、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置き換えるように非ヒトＶＨ及びＶＬ配列に導入されている、ＣＤＲグラフト抗体である。
「Kabatの番号付け」、「Kabatの定義」、及び「Kabatのラベル付け」という用語は、本明細書において互換可能に使用される。当該技術分野において認識されているこれらの用語は、抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域における、他のアミノ酸残基よりも可変性が高い（すなわち、超可変性である）アミノ酸残基の番号付けのシステムを指す（Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391及びKabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。
本発明の抗体は、特定の生成又は産生方法に限定されない。したがって、本発明は、抗体を分泌するハイブリドーマから製造されている抗体、並びに抗体をコードするポリヌクレオチドが形質導入又はトランスフェクトされている組換え産生細胞から産生された抗体を提供する。そのようなハイブリドーマ、組換え産生細胞、及びポリヌクレオチドは、本発明の一部をなす。
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質、又は本明細書に記載される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の特定のエピトープ（好ましくは、立体構造エピトープ）に選択的又は特異的である。具体的には、抗体が、任意の他の分子、特に、任意の他のタンパク質に対して有意な交差反応性を有することなく、目的の分子、この事例では２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントに結合することが、理解されるであろう。例えば、本発明の特定の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質エピトープに特異的である本発明の結合化合物又は抗体は、他の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質エピトープとの有意な交差反応性を示さないであろう。別の例として、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質に特異的である本発明の結合化合物又は抗体は、２０１９－ｎＣｏＶ膜タンパク質との有意な交差反応性を示さないであろう。交差反応性は、任意の好適な方法によって評価され得る。２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質エピトープに対する結合化合物（例えば、抗体）の、別の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質エピトープ又は２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質以外のタンパク質との交差反応性は、結合化合物（例えば、抗体）が、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質エピトープへの結合の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は１００％程度の強さで、他の分子に結合する場合に、有意であると考えることができる。２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントに特異的である結合化合物（例えば、抗体）は、それが２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質エピトープに結合する強さの９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、又は２０％未満で、別の分子、例えば、２０１９－ｎＣｏＶ膜タンパク質に結合し得る。好ましくは、結合化合物（例えば、抗体）は、それが２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質エピトープに結合する強さの２０％未満、１５％未満、１０％未満、又は５％未満、２％未満、又は１％未満で、他の分子に結合する。結合親和性は、任意の好適な手段で、例えば、ＫＤによって、定量化され得る。
本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質抗体（好ましくは、中和）の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質に対する結合親和性は、解離定数（ＫＤ）で定量化することができる。ＫＤは、任意の適切な技法を使用して決定され得るが、ＳＰＲが、一般には、本発明の文脈において好まれる。本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質抗体は、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、又はそれ未満のＫＤで、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質に結合し得る。典型的には、本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質抗体は、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満のＫＤで、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質に結合する。
本発明のエピトープ／抗原に結合するさらなる抗体は、本発明の抗体のバリアントを産生させることによって生成され得る。そのようなバリアントは、本発明の抗体のＣＤＲと高いレベルの同一性を共有するＣＤＲを有し得、例えば、それぞれが独立して、バリアント抗体が由来する本発明の抗体とは１つ又は２つ以上のアミノ酸が異なり得る、ＣＤＲを有し得、ここで、バリアントは、本発明の抗体の結合及び機能特性を保持する。加えて、そのような抗体は、フレームワーク領域に１つ又は２つ以上のバリエーション（例えば、保存的アミノ酸置換）を有し得る。本発明の抗体のアミノ酸配列におけるバリエーションは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び最大９９％の配列同一性を維持するべきである。本発明の抗体との少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアント、特に、本明細書において例証される特定の抗体が、具体的に企図される。バリエーションは、フレームワーク領域に限定され、ＣＤＲには存在しない場合があってもよく、又はそうでなくてもよい。
「中和抗体」という用語は、それ自体が（任意の他の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質抗体又は別の２０１９－ｎＣｏＶタンパク質に対する他の抗体の非存在下において）、それが結合するスパイクタンパク質の機能に影響を及ぼす能力を有する、抗体を意味して、本明細書に定義される。具体的には、中和抗体は、スパイクタンパク質の生物学的活性を中和又は阻害することによって、スパイクタンパク質を発現する２０１９－ｎＣｏＶウイルス粒子が細胞に感染する能力を低減させる。
この中和活性は、任意の適切な技法を使用し、任意の適切な単位で測定して、定量化され得る。本開示は、本発明の中和抗体（及び本明細書に記載される他の結合化合物）に同等に適用される。例えば、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントの有効性は、それらの半数効果濃度（ＥＣ５０）、刺激される抗体力価（抗体単位、ＡＵでの）、及び／又はＡＵでのＥＣ５０として、得ることができる。これらのうちの後者は、本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントによって刺激される抗体応答の品質の指標を提供する。任意の適切な技法を使用して、ＥＣ５０、ＡＵ、又はＥＣ５０／ＡＵを判定することができる。従来的な技法は、当該技術分野において公知である。
産生される抗体の量は、任意の適切な方法を使用して定量化することができ、標準的な技法は、当該技術分野において公知である。例えば、産生される抗体の量は、本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントによって誘導される血清ＩｇＧ応答として、ＥＬＩＳＡによって測定され得る。産生される抗体の量は、任意の抗体単位（ＡＵ）で得ることができる。
本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントに対する免疫応答（又は免疫原性）、特に、抗体応答は、産生される抗体の量に関する半数効果濃度、すなわち、ＥＣ５０／ＡＵとして、提供され得る。これは、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントに対して生成される免疫応答の品質の指標を提供する。例えば、低いＥＣ５０（すなわち、有効な応答）であるが、高い抗体単位数の生成は、低いＥＣ５０で低い抗体単位数よりも有効性が低い（高いＥＣ５０／ＡＵをもたらす）。この値は、したがって、中和抗体活性（ＥＣ５０として測定される）を、産生される抗２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントＩｇＧ抗体の総量（ＥＬＩＳＡによってＡＵで測定される）に対する比率として表すことによって、抗体応答の品質を示す。より有効なワクチンは、したがって、より少ない抗体（より低いＡＵ）でＥＣ５０を誘導する。
典型的には、本発明の中和２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質抗体は、２０１９－ｎＣｏＶ粒子の感染性を、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又はそれ以上低減させる。
本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はその免疫原性フラグメントは、天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメント、又は最適化されていないポリヌクレオチドによって産生される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメントと比較して、改善された免疫応答、特に、改善された抗体応答を誘起し得る。
結合化合物に関連する本明細書におけるありとあらゆる開示は、好ましくは、本明細書に記載される抗体に関する。
あるいは、他の結合化合物、例えば、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメント、特に、前記２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はフラグメント内のエピトープに対するＤＮＡオリゴヌクレオチドアプタマー、ＲＮＡオリゴヌクレオチドアプタマー、及び他の操作されたバイオポリマーはまた、本明細書に記載される抗体及びそれらの組合せの活性を複製し得る。前記代替的な結合化合物は、本発明のタンパク質又は免疫原性フラグメントに特異的に結合し得る。
オリゴヌクレオチドアプタマーは、十分に確立されている方法を使用して、特定又は合成され得る。アプタマーは、治療的使用に好適となるようにさらに最適化されてもよく、例えば、それは、その薬物動態を改変する、及び／又はＦｃ依存性免疫機能を導入するために、モノクローナル抗体にコンジュゲートされてもよい。
組成物及び治療適応症
本明細書に記載されるように、本発明者らは、本発明のポリヌクレオチドによって発現される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質での免疫付与により、強力な抗体応答を生成することができることを実証した。
したがって、本発明は、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメントを発現するポリヌクレオチド、発現コンストラクト、ウイルスベクター、ＤＮＡプラスミド、若しくはＲＮＡワクチン、又は２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメント、又は結合化合物のワクチンとしての使用を提供する。
本発明はまた、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメントを発現する前記ポリヌクレオチド、発現コンストラクト、ウイルスベクター、ＤＮＡプラスミド、若しくはＲＮＡワクチン、又は２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメント、又は結合化合物を含むワクチン組成物を提供する。ワクチン組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、噴射剤、塩、及び／又は添加剤を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、本発明による少なくとも２つの異なるタンパク質又は免疫原性フラグメント、及び／又は本発明による少なくとも２つの異なるポリヌクレオチド分子を含む。非限定的な例として、ワクチン組成物は、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び２０１９－ｎＣｏＶ膜タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み得る。
本発明はまた、本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメントを発現するポリヌクレオチド、発現コンストラクト、ウイルスベクター、ＤＮＡプラスミド、若しくはＲＮＡワクチン、又は２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメント、又は結合化合物（上述の通り）を使用して、対象において免疫応答を刺激又は誘導する方法も提供する。
対象において免疫応答を刺激又は誘導する前記方法は、本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメントを発現するポリヌクレオチド、発現コンストラクト、ウイルスベクター、ＤＮＡプラスミド、若しくはＲＮＡワクチン、又は２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメント、又は結合化合物（上述の通り）を、対象に投与するステップを含み得る。
治療的使用及び方法の文脈において、「対象」は、２０１９－ｎＣｏＶに対する免疫保護応答の刺激又は誘導から利益を得るであろう任意の動物対象である。典型的な動物種は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。
したがって、本発明は、２０１９－ｎＣｏＶ感染症を処置又は予防するための方法を提供する。前記方法は、典型的に、本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメントを発現するポリヌクレオチド、発現コンストラクト、ウイルスベクター、ＤＮＡプラスミド、若しくはＲＮＡワクチン、又は２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメント、ワクチン組成物、又は結合化合物の、それを必要とする対象への投与を含む。
本発明はまた、２０１９－ｎＣｏＶ感染症の予防又は処置において使用するための、本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメントを発現するポリヌクレオチド、発現コンストラクト、ウイルスベクター、ＤＮＡプラスミド、若しくはＲＮＡワクチン、又は２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメント、ワクチン組成物、又は結合化合物を提供する。
本発明はまた、２０１９－ｎＣｏＶ感染症の予防又は処置のための医薬の製造のための、本発明の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメントを発現するポリヌクレオチド、発現コンストラクト、ウイルスベクター、ＤＮＡプラスミド、若しくはＲＮＡワクチン、又は２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメント、ワクチン組成物、又は結合化合物の使用を提供する。
本明細書において使用される場合、「処置」又は「処置すること」という用語は、治療的又は防止的／予防的措置を含み、２０１９－ｎＣｏＶ感染症の感染後の治療及び緩和を含む。
本明細書において使用される場合、「予防すること」という用語は、２０１９－ｎＣｏＶによる感染症の開始を予防すること、及び／又は２０１９－ｎＣｏＶによる感染症の重症度若しくは強度を低減させることを含む。「予防すること」という用語は、２０１９－ｎＣｏＶによる感染症に対する保護免疫を誘導又は提供することを含む。２０１９－ｎＣｏＶによる感染症に対する免疫は、任意の適切な技法を使用して定量化することができ、その例は、当該技術分野において公知である。
本明細書において定義される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメントを発現するポリヌクレオチド、発現コンストラクト、ウイルスベクター、ＤＮＡプラスミド、若しくはＲＮＡワクチン、又は２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメント、ワクチン組成物、又は結合化合物は、２０１９－ｎＣｏＶによる感染症を処置又は予防するために、すでに２０１９－ｎＣｏＶ感染症、２０１９－ｎＣｏＶによる感染症と関連する状態又は症状を有している対象（典型的に、哺乳動物対象、例えば、ヒト又は他の霊長類）に投与され得る。例えば、対象は、２０１９－ｎＣｏＶと接触したことが疑われ得るか、又は２０１９－ｎＣｏＶと接触したことが判明しているが、依然として曝露の症状を示していない。
２０１９－ｎＣｏＶ感染症をすでに有しているか、又は２０１９－ｎＣｏＶ感染症と関連する症状を示している対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト又は他の霊長類）に投与されると、定義される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメントを発現するポリヌクレオチド、発現コンストラクト、ウイルスベクター、ＤＮＡプラスミド、若しくはＲＮＡワクチン、又は２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメント、ワクチン組成物、又は結合化合物は、１つ若しくは２つ以上の症状を治癒、遅延、その重症度を低減、若しくは軽減させること、並びに／又は対象の生存期間をそのような処置の非存在下において予測されるものを上回って延長させることができる。
あるいは、本明細書において定義される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメントを発現するポリヌクレオチド、発現コンストラクト、ウイルスベクター、ＤＮＡプラスミド、若しくはＲＮＡワクチン、又は２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその免疫原性フラグメント、ワクチン組成物、又は結合化合物は、最終的に２０１９－ｎＣｏＶに感染する可能性のある対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト又は他の霊長類）に、前記２０１９－ｎＣｏＶ感染症の１つ若しくは２つ以上の症状を予防、治癒、遅延、低減、その重症度を低減、若しくは軽減させるため、又は対象の生存期間をそのような処置の非存在下において予測されるものを上回って延長させるため、又は対象が２０１９－ｎＣｏＶ感染症を伝播させるのを防止するのを補助するために投与され得る。
本発明の処置及び予防的治療は、様々な異なる年齢の異なる対象に適用可能である。ヒトに関して、治療は、小児（例えば、乳児、５歳未満の子供、それより年上の子供、又はティーンエージャー）、並びに成人に適用可能である。他の動物対象（例えば、哺乳動物、例えば、霊長類）に関して、治療は、未成熟対象及び成熟／成体対象に適用可能である。本明細書において使用される場合、「予防すること」という用語は、２０１９－ｎＣｏＶ感染症の開始を予防すること、及び／又は２０１９－ｎＣｏＶ感染症の重症度若しくは強度を低減させることを含む。「予防すること」という用語は、２０１９－ｎＣｏＶ感染症に対する保護免疫を誘導又は提供することを含む。２０１９－ｎＣｏＶ感染症に対する免疫は、任意の適切な技法を使用して定量化することができ、その例は、当該技術分野において公知である。
本明細書において使用される場合、「ワクチン」は、動物対象、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト又は他の霊長類）に投与されると、２０１９－ｎＣｏＶ感染症に対する保護免疫応答を刺激する、製剤である。免疫応答は、体液性及び／又は細胞媒介型の免疫応答であり得る。本発明のワクチンは、例えば、２０１９－ｎＣｏＶ感染症の作用から対象を保護するために使用され得る。
医薬組成物及び製剤
「ワクチン」という用語は、本明細書において、「治療用／予防用組成物」、「製剤」、又は「医薬」と互換可能に使用される。
本発明のワクチン（上記に定義される）は、薬学的に許容される担体と組み合わせることができるか、又はそれに加えて投与することができる。代替として、又は追加として、本発明のワクチンは、さらに、塩、賦形剤、希釈剤、アジュバント、免疫調節剤、及び／又は抗微生物化合物のうちの１つ又は２つ以上と組み合わせることができる。
薬学的に許容される塩としては、無機酸、例えば、塩酸若しくはリン酸など、又は有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸などを用いて形成される、酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は第二鉄など、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来し得る。
免疫原性組成物、治療用製剤、医薬、及び予防用製剤（例えば、ワクチン）の投与は、一般に、従来的な経路、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、又は粘膜経路によるものである。投与は、非経口注射、例えば、皮下、皮内、又は筋肉内注射によるものであってもよい。中和抗体を含む製剤は、静脈内、筋肉内、皮内、又は皮下投与に特に好適であり得る。
したがって、本発明の免疫原性組成物、治療用製剤、医薬、及び予防用製剤（例えば、ワクチン）は、典型的に、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射用として調製される。注射の前に液体中の溶液又は懸濁液にするのに好適な固体形態が、代替として調製されてもよい。調製物はまた、乳化させてもよく、又はペプチドをリポソーム若しくはマイクロカプセルに封入してもよい。
活性免疫原性成分（例えば、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質、そのフラグメント、前記スパイクタンパク質をコードする核酸、発現ベクター、ウイルスベクター、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡワクチン、融合タンパク質、及びワクチン組成物）は、薬学的に許容可能であり活性成分と適合性のある担体、希釈剤、賦形剤、又は類似物と混合されることが多い。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びこれらの組合せである。加えて、所望される場合、ワクチンは、微量の補助物質、例えば、湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの有効性を増強させるアジュバントを含有してもよい。
一般に、担体、希釈剤、賦形剤、又は類似物は、薬学的に許容される担体である。薬学的に許容される担体の非限定的な例としては、水、生理食塩水、及びリン酸緩衝食塩水が挙げられる。いくつかの実施形態において、しかしながら、組成物は、凍結乾燥形態であり、その場合、これには、安定化剤、例えば、ＢＳＡが含まれ得る。いくつかの実施形態において、長期保管を促進するために、組成物を保存剤、例えば、チオメルサール又はアジ化ナトリウムとともに製剤化することが望ましい場合がある。
有効であり得る追加のアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント（complete Freunds adjuvant、ＣＦＡ）、フロイント不完全アジュバント（Incomplete Freunds adjuvant、ＩＦＡ）、サポニン、サポニンの精製抽出画分、例えば、Quil A、サポニンの派生物、例えば、ＱＳ－２１、サポニンに基づく脂質粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ／ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、大腸菌熱不安定性毒素（labile toxin、ＬＴ）ミュータント、例えば、ＬＴＫ６３及び／又はＬＴＫ７２、水酸化アルミニウム、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ノル－ＭＤＰと称される）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ－ＰＥと称される）、並びに細菌から抽出された３つの成分ＧＬＡ－ＳＥ（ＧＬＡは、合成リピドＡ派生物であり、ＧＬＡ－ＳＥにおいて、これは、スクアレン油を使用して、水中油型エマルションとして製剤化される）、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Tween ８０エマルション中に含むＲＩＢＩ、Novartis社によって開発されたＭＦ５９製剤、並びにGSK Biologicals社（Rixensart, Belgium）によって開発されたＡＳ０２、ＡＳ０１、ＡＳ０３、及びＡＳ０４アジュバント製剤が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいアジュバントとしては、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムゲル、水酸化アルミニウム及びモノホスホリルリピドＡ（monophosphoryl lipid A、ＭＰＬ）、並びに５％スクアレン（ＭＦ５９）が挙げられる。他の好ましいアジュバントとしては、ミョウバン又は水酸化アルミニウム及び／若しくはリン酸アルミニウム、ＧＬＡ－ＳＥ及び／若しくはスクアレンに基づくアジュバント、例えば、ＭＦ５９若しくはAddaVax（商標）、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。好ましくは、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸アルミニウム、ＧＬＡ－ＳＥ、並びにAddaVax（商標）の組合せが、使用される。
緩衝剤の例としては、コハク酸ナトリウム（ｐＨ６．５）並びにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ６．５及び７．５）が挙げられるが、これらに限定されない。
他の投与形態に好適である追加の製剤としては、坐剤、及び一部の事例では、経口製剤、又はエアロゾルとしての分配に好適な製剤が挙げられる。坐剤については、従来的な結合剤及び担体としては、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを挙げることができ、そのような坐剤は、０．５％～１０％、好ましくは、１％～２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成され得る。
経口製剤には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどといった通常利用される賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出製剤、又は粉末の形態をとる。
定義
本明細書において使用される場合、動詞とともに使用される「することができる」という用語は、対応する動詞の動作を包含又は意味する。例えば、「相互作用することができる」はまた、相互作用することも意味し、「切断することができる」はまた、切断することも意味し、「結合することができる」はまた、結合することも意味し、「特異的に標的化することができる」はまた、特異的に標的化することも意味する。
「バリアント」という用語は、タンパク質に関連して使用される場合、アミノ酸（例えば、非天然のアミノ酸）の１つ又は２つ以上のアナログ又は置換される連結を含む、タンパク質のペプチド又はペプチドフラグメントを意味する。
「派生物」という用語は、タンパク質に関連して使用される場合、問題のタンパク質、及びさらなるペプチド配列を含む、タンパク質を意味する。さらなるペプチド配列は、好ましくは、本来のタンパク質の基本的なフォールディング及びしたがって立体構造に干渉しないものとする。２つ又は３つ以上のペプチド（又はフラグメント若しくはバリアント）が、互いに結合されて、派生物を形成し得る。あるいは、ペプチド（又はフラグメント若しくはバリアント）は、無関係の分子（例えば、第２の無関係のペプチド）に結合されてもよい。派生物は、化学的に合成してもよいが、典型的には、組換え核酸方法によって調製される。追加の成分、例えば、脂質、及び／又は多糖、及び／又はポリペプチド成分が、含まれてもよい。
本明細書における２０１９－ｎＣｏＶポリヌクレオチド及び／又はタンパク質への言及は、そのフラグメント及びバリアントを包含する。バリアント２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質は、天然のスパイクタンパク質の１つ又は２つ以上の立体構造エピトープ、並びに中和抗体の産生及び／又は免疫保護応答を誘起する能力を保持する。本発明のバリアント２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質ポリヌクレオチドは、そのようなスパイクタンパク質をコードする。例として、バリアントは、参照配列（例えば、本発明の２０１９－ｎＣｏＶポリヌクレオチド及び／又はタンパク質、特に、２０１９－ｎＣｏＶポリヌクレオチド及び／又はタンパク質を定義する本明細書に提示される任意の配列番号）と少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、及びもっとも好ましくは、少なくとも９７又は少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有し得る。したがって、バリアントは、ポリヌクレオチドの１つ若しくは２つ以上のアナログ（例えば、非天然の核酸）、又は置換された連結を含み得る。また、例として、フラグメントという用語は、２０１９－ｎＣｏＶポリヌクレオチド及び／又はタンパク質に関連して使用される場合、参照２０１９－ｎＣｏＶポリヌクレオチド及び／又はタンパク質の少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個の核酸残基を有する、ポリヌクレオチドを意味する。フラグメントという用語はまた、上述のバリアントにも関する。したがって、例として、本発明の２０１９－ｎＣｏＶポリヌクレオチド及び／又はタンパク質のフラグメントは、少なくとも１０個、２０個、又は３０個の核酸を有する核酸配列を含み得、ここで、ポリヌクレオチド配列は、参照２０１９－ｎＣｏＶポリヌクレオチド及び／又はタンパク質配列の（連続した）核酸の対応する核酸配列に対して、少なくとも８０％の配列相同性を有する。フラグメント及びバリアントのこれらの定義は、本発明の他のポリヌクレオチドにも適用される。ペプチド配列の文脈において、フラグメントという用語は、参照タンパク質の少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。フラグメントという用語はまた、上述のバリアントにも関する。したがって、例として、フラグメントは、少なくとも１０個、２０個、又は３０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み得、ここで、アミノ酸配列は、参照配列の（連続した）アミノ酸の対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列相同性を有する。
本明細書におけるいくつかの例証されるポリヌクレオチドは、タンパク質分泌を作動させるための追加のモチーフ、特に、制限酵素部位、ＫＯＺＡＣ配列、及び／又はモチーフ（例えば、ｔｇａ ｔａａ）を含む。当業者であれば、これらの追加の配列を削除してもよいことを、理解するであろう。そのため、本発明は、指定されたモチーフを含む例証される核酸配列、並びにこれらのモチーフのうちの１つ又は２つ以上が欠如した核酸配列を包含する。
「減少」、「低減された」、「低減」、又は「阻害する」という用語は、すべて、統計学的に有意な量での減少を意味して本明細書において使用される。「低減させる」、「低減」、又は「減少させる」、又は「阻害する」という用語は、典型的に、参照レベル（例えば、所与の処置の不在）と比較して、少なくとも１０％の減少を意味し、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれ以上の減少を含み得る。本明細書において使用される場合、「低減」又は「阻害」は、参照レベルと比較した完全な阻害又は低減を包含しない。「完全な阻害」とは、参照レベルと比較して、１００％の阻害である。減少は、好ましくは、所与の障害を有さない個体の正常範囲内として許容されるレベルまでの低下であり得る。
「増加した」、「増加させる」、「増強させる」、又は「活性化する」という用語は、すべて、本明細書において、統計学的に有意な量の増加を意味する。「増加した」、「増加させる」、「増強させる」、又は「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して、少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも約２０％、若しくは少なくとも約３０％、若しくは少なくとも約４０％、若しくは少なくとも約５０％、若しくは少なくとも約６０％、若しくは少なくとも約７０％、若しくは少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％、若しくは最大１００％以下の増加、又は１０～１００％の任意の増加、又は参照レベルと比較して、少なくとも約２倍、若しくは少なくとも約３倍、若しくは少なくとも約４倍、若しくは少なくとも約５倍、若しくは少なくとも約１０倍の増加、又は２倍～１０倍若しくはそれ以上の任意の増加を意味し得る。マーカー又は症状の文脈において、「増加」は、そのようなレベルにおける統計学的に有意な増加である。
本明細書において使用される場合、「対象」は、ヒト又は動物を意味する。通常、動物は、脊椎動物、例えば、霊長類、げっ歯類、家畜動物、又は競技動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えば、アカゲザルが挙げられる。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、及びハムスターが挙げられる。家畜動物及び競技動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、イエネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥種、例えば、ニワトリ、エミュー、オーストリッチ、及び魚類、例えば、マス、ナマズ、及びサケが挙げられる。好ましくは、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。「個体」、「患者」、及び「対象」という用語は、本明細書において互換可能に使用される。
好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疼痛の動物モデルを表す対象として、有利に使用され得る。対象は、雄性であっても雌性であってもよく、成体であっても若齢であってもよい。
対象は、処置を必要とする状態又はそのような状態と関連する１つ若しくは２つ以上の併発症を罹患しているか又はそれを有するとこれまでに診断又は特定されているものであり得、本明細書において定義される状態又は前記状態と関連する１つ若しくは２つ以上の併発症の処置をすでに受けていてもよい。あるいは、対象はまた、本明細書において定義される状態又は前記状態と関連する１つ若しくは２つ以上の併発症を有するとしてこれまでに診断されていなかったものであってもよい。例えば、対象は、ある状態又は前記状態と関連する１つ若しくは２つ以上の併発症に関して１つ又は２つ以上の危険因子を呈するものであってもよく、又は危険因子を呈さないものであってもよい。
特定の状態に対する処置を「必要とする対象」は、その状態を有するか、その状態を有すると診断されているか、又はその状態を発症する危険性にある、対象であり得る。
本明細書において使用される場合、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、隣接する残基のアルファ－アミノ基及びカルボキシル基の間でペプチド結合によって互いに接続された、一連のアミノ酸残基を表して、本明細書において互換可能に使用される。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、そのサイズ又は機能に関係なく、改変されたアミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）及びアミノ酸アナログを含む、アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドを参照して使用されることが多いが、一方で、「ペプチド」という用語は、小型のポリペプチドを指して使用されることが多く、しかしながら、当該技術分野におけるこれらの用語の使用は、オーバーラップする。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、遺伝子産物及びそのフラグメントを指す場合、本明細書において互換可能に使用される。したがって、例示的なポリペプチド又はタンパク質は、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメント、並びに前述のものの他の等価物、バリアント、フラグメント、及びアナログを含む。
ポリペプチド、例えば、融合ポリペプチド又はその部分（例えば、ドメイン）は、本明細書に記載される配列のバリアントであり得る。好ましくは、バリアントは、保存的置換バリアントである。「バリアント」は、本明細書において言及される場合、天然又は参照ポリペプチドに対して実質的に相同であるが、１つ又は複数の欠失、挿入、又は置換に起因して、天然又は参照ポリペプチドのものとは異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドである。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然又は参照ＤＮＡ配列と比較したときに、ヌクレオチドの１つ又は２つ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、参照タンパク質と比べて関連する生物学的活性を、例えば、野生型参照タンパク質の少なくとも５０％保持する、そのバリアントタンパク質又はフラグメントをコードする配列を包含する。アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コードされる配列内のアミノ酸のうち、単一のアミノ酸又はわずかなパーセンテージ（すなわち、５％以下、例えば、４％以下、又は３％以下、又は１％以下）を変化させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、又は付加は、変更が、あるアミノ酸と、化学的に類似するアミノ酸との置換をもたらす、「保存的に改変されたバリアント」であることを認識するであろう。いくつかの変更は、関連する活性を改善する可能性があり、その結果、保存的かどうかに関係なく、バリアントは、野生型の１００％を上回る活性、例えば、１１０％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、５００％、１０００％、又はそれ以上を有することが、企図される。
所与のアミノ酸は、類似の物理化学的特徴を有する残基で、例えば、１つの脂肪族残基を別のもの（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、若しくはＡｌａを、互いに）置換すること、又は１つの極性残基と別のものと（例えば、ＬｙｓとＡｒｇとの間、ＧｌｕとＡｓｐとの間、若しくはＧｌｎとＡｓｎとの間）の置換によって、置き換えられ得る。他のそのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特徴を有する領域全体の置換が、公知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、本明細書に記載されるアッセイのうちのいずれか１つにおいて試験して、天然又は参照ポリペプチドの所望される活性が保持されることを確認することができる。機能的に類似のアミノ酸をもたらす保存的置換の一覧は、当該技術分野において周知である。そのような保存的に改変されたバリアントは、本開示と一致する多型バリアント、種間ホモログ、及びアレルに対する追加であり、それらを除外しない。典型的には、互いに保存的な置換としては、１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）が挙げられる（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。
ポリペプチドの適正な立体構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基もまた、一般にはセリンと置換されて、分子の酸化安定性が改善され、異常な架橋が防止され得る。対照的に、ポリペプチドの安定性を改善するか、又はオリゴマー化を促進するために、システイン結合が、ポリペプチドに添加されてもよい。
本明細書に記載されるポリペプチドは、少なくとも１つのペプチド結合の置き換えを含み得る。単一のペプチド結合又は複数のペプチド結合、例えば、２つの結合、３つの結合、４つの結合、５つの結合、又は６つ若しくは７つ以上の結合、又はすべてのペプチド結合が、置き換えられ得る。本明細書に記載される単離されたペプチドは、１種類のペプチド結合置き換え、又は複数種類のペプチド結合置き換え、例えば、２種類、３種類、４種類、５種類、若しくは６種類以上の種類のペプチド結合置き換えを含み得る。ペプチド結合置き換えの非限定的な例としては、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素、トリフルオロエチルアミン、オルト－（アミノアルキル）－フェニル酢酸、パラ－（アミノアルキル）－フェニル酢酸、メタ－（アミノアルキル）－フェニル酢酸、チオアミド、テトラゾール、ボロン酸エステル、オレフィン基、及びこれらの誘導体が挙げられる。
本明細書に記載されるポリペプチドは、生存生物によって産生されるポリペプチド及び／又はタンパク質において一般に見出される天然に存在するアミノ酸、例えば、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、及びＨｉｓ（Ｈ）を含み得る。本明細書に記載されるポリペプチドは、代替的なアミノ酸を含んでもよい。代替的なアミノ酸の非限定的な例としては、Ｄアミノ酸、ベータ－アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、ガンマ－カルボキシグルタメート；馬尿酸、オクタヒドロインドール－２－カルボン酸、スタチン、１，２，３，４，－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、ペニシラミン（３－メルカプト－Ｄ－バリン）、オルニチン、シトルリン、アルファ－メチル－アラニン、パラ－ベンゾイルフェニルアラニン、パラアミノフェニルアラニン、ｐ－フルオロフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、及びｔｅｒｔ－ブチルグリシン）、ジアミノ酪酸、７－ヒドロキシ－テトラヒドロイソキノリンカルボン酸、ナフチルアラニン、ビフェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、アミノ－イソ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン、テトラヒドロイソキノリンカルボン酸、ピペコリン酸、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、シクロヘキシルグリシン、デヒドロロイシン、２，２－ジエチルグリシン、ｌ－アミノ－１－シクロペンタンカルボン酸、ｌ－アミノ－１－シクロヘキサンカルボン酸、アミノ－安息香酸、アミノ－ナフトエ酸、ガンマ－アミノ酪酸、ジフルオロフェニルアラニン、ニペコ酸、アルファアミノ酪酸、チエニル－アラニン、ｔ－ブチルグリシン、トリフルオロバリン；ヘキサフルオロロイシン、フッ素化アナログ；アジド改変アミノ酸；アルキン改変アミノ酸；シアノ改変アミノ酸、並びにこれらの誘導体が挙げられる。
ポリペプチドは、例えば、ある部分の、ペプチドを含むアミノ酸の１つ又は２つ以上への付加によって、改変され得る。本明細書に記載されるポリペプチドは、１つ又は２つ以上の部分分子、例えば、ペプチド１つ当たり１つ若しくは２つ以上の部分分子、ペプチド１つ当たり２つ若しくは３つ以上の部分分子、ペプチド１つ当たり５つ若しくは６つ以上の部分分子、ペプチド１つ当たり１０個若しくは１１個以上の部分分子、又はペプチド１つ当たりそれ以上の部分分子を含み得る。本明細書に記載されるポリペプチドは、１つ多くの種類の改変及び／又は部分、例えば、１種類の改変、２種類の改変、３種類の改変、又はそれ以上の種類の改変を含み得る。改変及び／又は部分の非限定的な例としては、ＰＥＧ化、グリコシル化、ＨＥＳ化、ＥＬＰ化、脂質付加、アセチル化、アミド化、末端キャップ改変、シアノ基、リン酸化、アルブミン、及び環化が挙げられる。
元のアミノ酸配列の変更は、当業者に公知のいくつかの技法のうちのいずれかによって達成することができる。アミノ酸置換は、例えば、特定の位置において、変更しようとするアミノ酸をコードするヌクレオチド配列におけるコドン変更を含む、元の配列のフラグメントへのライゲーションを可能にする制限部位が隣接する、オリゴヌクレオチドを合成することによって導入することができる。ライゲーションの後に、結果として得られる再構成された配列は、所望されるアミノ酸の挿入、置換、又は欠失を有するアナログをコードする。あるいは、オリゴヌクレオチドに指向される部位特異的変異生成手順を利用して、必要とされる置換、欠失、又は挿入に応じて特定のコドンが変化している、変化したヌクレオチド配列を得ることができる。そのような変化を行うための技法としては、Walder et al. (Gene 42:133, 1986)；Bauer et al. (Gene 37:73, 1985)；Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19)；Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)、並びに米国特許第４，５１８，５８４号及び同第４，７３７，４６２号によって開示されているものが挙げられ、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるポリペプチドは、化学的に合成され得、変異は、化学的合成プロセスの一部として組み込むことができる。
本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、及び「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、又はそれらのアナログの単位を組み込む、任意の分子、好ましくは、ポリマー分子を指す。核酸は、一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。一本鎖核酸は、変性した二本鎖ＤＮＡの一方の核酸鎖であってもよい。あるいは、いずれの二本鎖ＤＮＡにも由来しない、一本鎖核酸であってもよい。一態様において、核酸は、ＤＮＡであり得る。別の態様において、核酸は、ＲＮＡであり得る。好適な核酸分子は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを含むＤＮＡである。他の好適な核酸分子は、ｍＲＮＡを含むＲＮＡである。
本明細書において使用される場合、「含むこと」又は「含む」という用語は、組成物、方法、及びそのそれぞれの構成要素を指して使用され、これらは、方法又は組成物に必須であるが、必須かどうかにかかわらず、示されていない要素の包含を排除しない。
「からなる」という用語は、本発明のその説明において列挙されていないあらゆる要素を除外した、本明細書に記載される組成物、方法、及びそのそれぞれの構成要素を指す。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の発明にそれらの要素が必要とされることを指す。この用語は、本発明の基本的かつ新規な又は機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。
配列相同性
限定されないが、グローバル方法、ローカル方法、及びハイブリッド方法、例えば、セグメントアプローチ方法などを含む、様々な配列アライメント方法のうちのいずれかを使用して、同一性パーセントを判定することができる。同一性パーセントを判定するプロトコールは、当業者の範囲内の慣例的な手順である。グローバル方法は、配列を、分子の開始部から末端へアライメントし、個々の残基ペアのスコアを合計し、ギャップペナルティを付与することによって、最良のアライメントを判定する。非限定的な方法としては、例えば、CLUSTAL W、例えば、Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)を参照；並びに反復改良法、例えば、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)を参照、が挙げられる。ローカル方法は、入力配列のすべてによって共有されている１つ又は２つ以上の保存されたモチーフを特定することによって、配列をアライメントする。非限定的な方法としては、例えば、マッチボックス、例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)を参照；Gibbsサンプリング、例えば、C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993)を参照；Align-M、例えば、Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics: 1428-1435 (2004)を参照、が挙げられる。
したがって、配列同一性パーセントは、従来的な方法によって判定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986及びHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992を参照されたい。簡単に述べると、ギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ１、及び以下に示されるHenikoff and Henikoff（同書）の「ｂｌｏｓｕｍ ６２」スコア付けマトリックス（アミノ酸は、標準的な一文字コードで示されている）を使用して、２つのアミノ酸配列を、アライメントスコアを最適化するようにアライメントする。
配列同一性を判定するためのアライメントスコア
ＢＬＯＳＵＭ６２表
Figure 2023514348000002
同一性パーセントは、したがって、
Figure 2023514348000003
として計算される。
実質的に相同なポリペプチドは、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するとして特徴付けられる。これらの変更は、好ましくは、保存的アミノ酸置換（以下を参照されたい）である軽微な性質のもの、及びポリペプチドのフォールディング又は活性に有意に影響を及ぼさない他の置換；典型的には１個～約３０個のアミノ酸の小さな欠失、及び小さなアミノ又はカルボキシル末端の伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基、最大約２０～２５個の残基の小さなリンカーペプチド、又は親和性タグである。
保存的アミノ酸置換
塩基性：アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性：グルタミン酸
アスパラギン酸
極性：グルタミン
アスパラギン
疎水性：ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族：フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小型：グリシン
アラニン
セリン
スレオニン
メチオニン
２０個の標準的なアミノ酸に加えて、非標準的なアミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン、６－Ｎ－メチルリジン、２－アミノイソ酪酸、イソバリン、及びａ－メチルセリン）が、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基と置換されてもよい。限定数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによってコードされないアミノ酸、及び非天然のアミノ酸が、クロストリジウムポリペプチドアミノ酸残基と置換されてもよい。本発明のポリペプチドはまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る。
天然に存在しないアミノ酸としては、限定することなく、トランス－３－メチルプロリン、２，４－メタノ－プロリン、シス－４－ヒドロキシプロリン、トランス－４－ヒドロキシ－プロリン、Ｎ－メチルグリシン、アロスレオニン、メチル－スレオニン、ヒドロキシ－エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ－システイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ－ロイシン、ノルバリン、２－アザフェニルアラニン、３－アザフェニル－アラニン、４－アザフェニル－アラニン、及び４－フルオロフェニルアラニンが挙げられる。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込むためのくつかの方法が、当該技術分野において公知である。例えば、ナンセンス変異が、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを使用して抑制される、インビトロ系を利用することができる。アミノ酸を合成し、ｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法は、当該技術分野において公知である。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、大腸菌Ｓ３０抽出物並びに市販入手可能な酵素及び他の試薬を含む、無細胞系において実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーによって精製される。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991；Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991；Chung et al., Science 259:806-9, 1993；及びChung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993)を参照されたい。第２の方法において、翻訳は、アフリカツメガエル卵母細胞において、変異させたｍＲＮＡ及び化学的にアミノアシル化したサプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクションによって実施される（Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996）。第３の方法では、大腸菌細胞を、置き換えようとする天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の非存在下、及び所望される天然に存在しないアミノ酸（例えば、２－アザフェニルアラニン、３－アザフェニルアラニン、４－アザフェニルアラニン、又は４－フルオロフェニルアラニン）の存在下において、培養する。天然に存在しないアミノ酸は、その天然の対応物の代わりに、ポリペプチドに組み込まれる。Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994を参照されたい。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロでの化学的改変によって、天然に存在しない種に変換され得る。化学的改変は、置換の範囲をさらに拡大するために、部位指向性変異生成と組み合わせることができる（Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993）。
限定数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによってコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び非天然のアミノ酸が、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基と置換され得る。
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、部位指向性変異生成又はアラニンスキャニング変異生成など、当該技術分野において公知の手順に従って特定することができる（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989）。生物学的相互作用の部位はまた、推定上の接触部位のアミノ酸の変異と併せて、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性標識などの技法によって判定される構造の物理的分析によって、判定することができる。例えば、de Vos et al., Science 255:306-12, 1992；Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992；Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992を参照されたい。必須アミノ酸の同一性はまた、本発明のポリペプチドの関連する構成成分（例えば、転位又はプロテアーゼ成分）との相同性の分析からも推測することができる。
公知の変異生成及びスクリーニング方法、例えば、Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241 :53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)によって開示されているものを使用して、複数のアミノ酸置換を行い、試験することができる。簡単に述べると、これらの著者は、ポリペプチド内の２つ又は３つ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択し、次いで、変異生成したポリペプチドをスクリーニングして、それぞれの位置における許容可能な置換の範囲を判定するための方法を開示している。使用することができる他の方法としては、ファージディスプレイ（例えば、Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991、Ladnerらの米国特許第５，２２３，４０９号、HuseのＷＩＰＯ国際公開第９２／０６２０４号）、及び領域指向性変異生成（Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986、Ner et al., DNA 7:127, 1988）が挙げられる。
以下の実施例により、本発明を例証する。
［実施例］
２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質（Ｓ）をコードする核酸は、中和抗体応答を誘導して２０１９－ｎＣｏＶ感染症から保護するように、大腸菌、酵母、及びヒト細胞を含む、様々な発現系における発現のために改変されている。
Ｎ及びＣ末端が欠失したアミノ酸（５～１０個）を、クローニングして、大腸菌系においてはＳタンパク質を発現しコロナウイルスの天然の立体構造でリフォールディングするようにし、その他（酵母及びヒト細胞）では、タンパク質全体とし発現するようにした。さらに、免疫保護応答の有効性及び持続期間を増加させるために、コロナウイルスに由来するＳタンパク質を、Ｅ型肝炎のウイルス様粒子（Ｐ２３９）及びヒトパピローマウイルス様粒子（１８Ｌ１）と組み合わせ、それとの融合タンパク質として発現させた。
大腸菌に基づく２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の発現
コロナウイルスＳタンパク質の核酸配列（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１－ＣｏＶ－Ｓ、GenBank：ＭＮ９０８９４７．３）を、コドン最適化のためのGeneartを使用し、SacI及びNotI単一クローニング部位を含めて大腸菌における発現のために最適化させて、配列番号２の核酸配列を設計した。
コドン使用頻度は、大腸菌遺伝子のコドンバイアスに適合させた。加えて、非常に高い（＞８０％）又は非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域は、可能な場合には回避した。発現に負の影響を及ぼし得る負のシス作用部位（例えば、スプライス部位、ＴＡＴＡボックスなど）を、可能な場合には排除した。ＧＣ含量を、ｍＲＮＡ半減期を延長するように調節した（平均ＧＣ含量４５％）。コドン使用頻度を、大腸菌のバイアスに適合させ、０．９６のＣＡＩ（コドン適合インデックス）値を得た。最適化された遺伝子は、大腸菌において高く安定した発現率が可能となるように設計されている。
Ｅ型肝炎ウイルス様粒子における２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質
コロナウイルスＳタンパク質の核酸配列を、大腸菌における発現のために最適化させ、これを使用して、Ｓタンパク質を含むＥ型肝炎ウイルス様粒子を生成した（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１－ＨＥＶ－ＣｏＶ－Ｓ）。
遺伝子合成を、SacI及びNotI単一クローニング部位を用いてGeneartによって大腸菌における発現のためにコドン最適化させて、配列番号３の核酸配列を設計した。
コドン使用頻度は、大腸菌遺伝子のコドンバイアスに適合させた。加えて、非常に高い（＞８０％）又は非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域は、可能な場合には回避した。発現に負の影響を及ぼし得る負のシス作用部位（例えば、スプライス部位、ＴＡＴＡボックスなど）を、可能な場合には排除した。ＧＣ含量（４６％）を、ｍＲＮＡ半減期を延長するように調節した。コドン使用頻度を、大腸菌のバイアスに適合させ、０．９６のＣＡＩ値を得た。最適化された遺伝子は、大腸菌において高く安定した発現率が可能となるように設計されている。
コマガタエラ・パストリスに基づく２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の発現
コロナウイルスＳタンパク質の核酸配列（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＣｏＶ－Ｓ）を、Ｋ．パストリスにおける発現のために、コドン最適化のためのGeneartを使用し、BstBI－NotI単一クローニング部位を含めて最適化させ、配列番号４の核酸配列を設計した。
コドン使用頻度は、Ｋパストリス遺伝子のコドンバイアスに適合させた。加えて、非常に高い（＞８０％）又は非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域は、可能な場合には回避した。発現に負の影響を及ぼし得る負のシス作用部位（例えば、スプライス部位、ＴＡＴＡボックスなど）を、可能な場合には排除した。ＧＣ含量（４８％）を、ｍＲＮＡ半減期を延長するように調節した。コドン使用頻度を、Ｋ．パストリスのバイアスに適合させ、０．８４のＣＡＩ値を得た。最適化された遺伝子は、Ｋ．パストリスにおいて高く安定した発現率が可能となるように設計されている。
Ｋ．パストリスにおける２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質を含む融合タンパク質の発現
コロナウイルスＳタンパク質の核酸配列（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１－ＨＰＶ１８ Ｌ１－ＣｏＶ－Ｓ）を、Ｋ．パストリスにおけるＨＰＶ １８ Ｌ１との融合タンパク質としての発現のために最適化させた。BstBI及びNotIは、配列番号５の核酸配列を設計するための単一クローニング部位である。
コドン使用頻度は、Ｋ．パストリス遺伝子のコドンバイアスに適合させた。加えて、非常に高い（＞８０％）又は非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域は、可能な場合には回避した。発現に負の影響を及ぼし得る負のシス作用部位（例えば、スプライス部位、ＴＡＴＡボックスなど）を、可能な場合には排除した。ＧＣ含量（４８％）を、ｍＲＮＡ半減期を延長するように調節した。コドン使用頻度を、Ｋ．パストリスのバイアスに適合させ、０．８４のＣＡＩ値を得た。最適化された遺伝子は、Ｋ．パストリスにおいて高く安定した発現率が可能となるように設計されている。
Ｋ．パストリスにおける２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質を含む融合タンパク質の発現
コロナウイルスＳタンパク質の核酸配列（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１－ＨＰＶ１６ Ｌ１－ＣｏＶ－Ｓ）を、Ｋ．パストリスにおけるＨＰＶ １６ Ｌ１との融合タンパク質としての発現のために最適化させた。BstBI及びNotIは、配列番号６の核酸配列を設計するための単一クローニング部位である。
コドン使用頻度は、Ｋ．パストリス遺伝子のコドンバイアスに適合させた。加えて、非常に高い（＞８０％）又は非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域は、可能な場合には回避した。発現に負の影響を及ぼし得る負のシス作用部位（例えば、スプライス部位、ＴＡＴＡボックスなど）を、可能な場合には排除した。ＧＣ含量（４８％）を、ｍＲＮＡ半減期を延長するように調節した。コドン使用頻度を、Ｋ．パストリスのバイアスに適合させ、０．８４のＣＡＩ値を得た。最適化された遺伝子は、ピキア・パストリスにおいて高く安定した発現率が可能となるように設計されている。
ヒト２９３ Ｆ細胞における２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の発現
コロナウイルスＳタンパク質の核酸配列（発現され２９３ Ｆ細胞の外表面に結合している、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＣｏＶ－Ｓ表面結合型タンパク質）を、ヒト２９３ Ｆ細胞における発現のために、コドン最適化のためのGeneartを使用し、NheI－NotI単一クローニング部位を含めて最適化させて、配列番号７の核酸配列を設計した。
コドン使用頻度は、ホモ・サピエンス遺伝子のコドンバイアスに適合させた。加えて、非常に高い（＞８０％）又は非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域は、可能な場合には回避した。発現に負の影響を及ぼし得る負のシス作用部位（例えば、スプライス部位、ＴＡＴＡボックスなど）を、可能な場合には排除した。ＧＣ含量（５６％）を、ｍＲＮＡ半減期を延長するように調節した。コドン使用頻度を、ホモ・サピエンスのバイアスに適合させ、０．９４のＣＡＩ値を得た。最適化された遺伝子は、ヒト細胞において高く安定した発現率が可能となるように設計されている。
２９３ Ｆ細胞における２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質を含む融合タンパク質の発現
コロナウイルスＳタンパク質の核酸配列（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１－ＨＢＳＡｇ－ＣｏＶ－Ｓ）を、２９３ Ｆ細胞におけるＢ型肝炎表面抗原との融合タンパク質としての発現のために最適化させた。配列は、配列番号８の核酸配列を設計するために、NheI－NotI単一クローニング部位を含む。
コドン使用頻度は、ホモ・サピエンス遺伝子のコドンバイアスに適合させた。加えて、非常に高い（＞８０％）又は非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域は、可能な場合には回避した。発現に負の影響を及ぼし得る負のシス作用部位（例えば、スプライス部位、ＴＡＴＡボックスなど）を、可能な場合には排除した。ＧＣ含量（５６％）を、ｍＲＮＡ半減期を延長するように調節した。コドン使用頻度を、ホモ・サピエンスのバイアスに適合させ、０．９４のＣＡＩ＊（コドン適合インデックス）値を得た。最適化された遺伝子は、ヒト細胞において高く安定した発現率が可能となるように設計されている。
水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムゲルを使用した２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のアジュバント付加
実施例１、３、及び６の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質及びその融合タンパク質を、アジュバント付加のために０．５ｍｇの水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムゲルに吸着させた。
モノホスホリルリピド及び水酸化アルミニウムを使用した２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のアジュバント付加
実施例１、３、及び６の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質及びその融合タンパク質を、アジュバント付加のためにモノホスホリルリピド（ＭＰＬ）及び水酸化アルミニウム中に混合した。
ＭＦ５９を使用した２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のアジュバント付加
実施例１、３、及び６の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質及びその融合タンパク質を、アジュバント付加のために、ＭＦ５９（５％スクアレン）中に混合した。
２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質で免疫付与したマウスにおける抗体応答の生成
アジュバントなしの実施例２、４、５、及び７の２０１９－ＣｏＶスパイクタンパク質及びその融合タンパク質を含む製剤、並びに実施例１、３、及び６のアジュバント付加製剤の免疫原性を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり５匹のマウス）において試験した。ワクチン接種は、１回の投与当たり２μｇの抗原で、０日目及び７日目に行った。０日目及び１４日目の血清試料を、間接的ＥＬＩＳＡによって、血清陰性（０日目）及びＳタンパク質に対する抗体応答（１４日目）について、試験した。すべての製剤は、１４日目に、高い抗体力価を誘導したが、アジュバント付加したものは、最大応答を誘導した（図２）。
ＨＥＫ細胞（２９３Ｆ）におけるＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＲＢＤ融合タンパク質の発現
配列番号２８のＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＲＢＤ融合タンパク質を、配列番号２７のコドン最適化された核酸配列を使用して、ＨＥＫ細胞において発現させた。簡単に述べると、ＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＲＢＤ遺伝子を、ヒト細胞（２９３Ｆ）での発現のために最適化させ、Nhe－NotIを使用してｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローニングし、クローン選択に供した後、懸濁培養物において２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。分泌されたＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＲＢＤ融合タンパク質を、４０時間後に採取した。
２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質に対するポリクローナル抗体（１：２５０）及びＨＢＳＡｇに対するマウスモノクローナル抗体（１：１，０００）を使用したウエスタンブロッティングは、２つの別個の培養物、＃２Ａ及び＃２Ｂにおいて、ＨＥＫ細胞による融合タンパク質の強力な分泌を示した（図３）。
ＨＥＫ細胞におけるＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＲＢＤ融合体で免疫付与したマウスにおける抗体応答の生成
実施例１２からのＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＲＢＤ（＃２Ａ）を、４０００ｒｐｍ×４０分間で回転する３Ｋ Ａｍｉｃｏｎ １５ｍｌ遠心分離フィルターデバイスによって濃縮した。
次いで、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、（ｉ）５０μｇ／用量（１００μｌ）、又は（ii）５０μｇ／用量（７０μｌ）のいずれかを使用して、水酸化アルミニウム又はAddavax（商標）のいずれかと１：１の体積／体積比で（投与される総体積＝１４０μｌ）、免疫付与を行った。マウスを、０日目にワクチンでプライミングし、続いて７日目に初回追加免疫付与、１４日目に２回目の追加免疫付与（分析のための採血あり）、及び２８日目に３回目の追加免疫付与を行った。分析のための最終採血は、４２日目に行った。実験群を、以下の表１に示す。
Figure 2023514348000004
抗体力価を、ＥＬＩＳＡを使用して、１４日目及び４２日目に評価した。図４に示されるように、ＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＲＢＤのＶＬＰは、１４日目及び４２日目に有意なＩｇＧ力価を達成することができ、４２日目に観察された力価の方が高かった。いずれかのアジュバント（水酸化アルミニウム又はAddaVax（商標））ありでの投与は、ここでも図４に示されるように、力価をさらに増加させた。
ＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＲＢＤのＶＬＰ（単独又は水酸化アルミニウム若しくはAddaVax（商標）あり）で免疫付与したマウスを使用して、中和アッセイも行った。結果を、以下の表２に示す。平均中和力価は、１：１，２００～１：２，７００であった。達成されたもっとも高い力価は、１：５，１２０であり、もっとも低いものは１：６４０であった。
Figure 2023514348000005
大腸菌におけるＨＥＶ－（ＧＧＧＧＳ）３－ＲＢＤ融合体の発現
配列番号３１のＨＥＶ－（ＧＧＧＧＳ）３－ＲＢＤ融合タンパク質を、大腸菌における発現のためにコドン最適化されている、配列番号３０の核酸配列を使用して、大腸菌において発現させた。この核酸配列を、SacI－NotIを使用して、ｐＥＴ２６（＋）にクローニングした。陽性クローンを選択し（＃１０）、ＢＬ２１において発現させた。３つの異なる陽性コロニー（＃１０Ａ、＃１０Ｂ、及び＃１０Ｃ）を、タンパク質発現に関してスクリーニングし、ＨＥＶ－ＲＢＤ発現を、＃１０Ａ、＃１０Ｂ、及び＃１０Ｃのすべてに関して、ＩＰＴＧ誘導（６時間）を使用して評価した。ＨＥＶに対する抗体を使用したウエスタンブロッティングを使用して、＃１０Ａ、＃１０Ｂ、及び＃１０Ｃのすべてにおける融合タンパク質の発現を確認した（図５）。クローン＃１０Ｂを、今後の調査に選択し、これを、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２を結合緩衝液として使用し、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して精製した（データは示されない）。
大腸菌において生成されたＨＥＶ－（ＧＧＧＧＳ）３－ＲＢＤ融合タンパク質で免疫付与したマウスにおける抗体応答の生成
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、実施例１４からのＨＥＶ－（ＧＧＧＧＳ）３－ＲＢＤ（＃１０Ｂ）を使用し、５０μｇ／用量を使用して、水酸化アルミニウム又はAddavax（商標）のいずれかと１：１の体積／体積比で（投与される総体積＝１００μｌ）、免疫付与を行った。マウスを、０日目にワクチンでプライミングし、続いて７日目に初回追加免疫付与、１４日目に２回目の追加免疫付与（分析のための採血あり）、及び２８日目に３回目の追加免疫付与を行った。分析のための最終採血は、４２日目に行った。実験群を、以下の表３に示す。
Figure 2023514348000006
抗体力価を、ＥＬＩＳＡを使用して、１４日目及び４２日目に評価した。ＨＥＶ－（ＧＧＧＧＳ）３－ＲＢＤのＶＬＰは、１４日目及び４２日目に有意な中和力価を達成することができ、４２日目に観察された力価の方が高かった。いずれかのアジュバント（水酸化アルミニウム又はAddaVax（商標））ありでの投与は、図６に示されるように、力価をさらに増加させた。
ＨＥＫ ２９３細胞におけるＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－全長２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質を含む融合タンパク質の発現
配列番号３３のＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－全長２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質融合タンパク質（ＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＣｏＶ－ｓ）を、配列番号３２のコドン最適化された核酸配列を使用して、ＨＥＫ細胞において発現させた。簡単に述べると、ＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＣｏＶ－ｓを、ヒト細胞（２９３Ｆ）での発現のために最適化させ、クローン選択に供した後、懸濁培養物において２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。分泌されたＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＣｏＶ－ｓを、４０時間後に採取した。
精製された組換えタンパク質ＨＢＳＡｇ－Ｃｏ－Ｖ－ｓの２つの異なるクローン、Ｄ８－ＳＡ０１－０１－０１（４×）及びＤ８－ＳＡ０１－０２－０１（５×）を、１：２５０の希釈で使用されるウサギＣＯＶＩＤ－１９スパイクタンパク質ポリクローナル抗体（My Biosource社、ＭＢＳ４３４２４３）を使用したウエスタンブロットによって、分析した。図７に示されるように、いずれのクローンも、予測されたサイズの鋭く高い発現バンドを生じ、融合タンパク質の強力な発現が示された。
配列情報
配列番号１ － ２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のアミノ酸配列
Figure 2023514348000007
スパイクタンパク質のＲＤＢドメイン（残基３１９～５２９）が、下線で示されている。
配列番号２ － 大腸菌における発現のために最適化されており、SacI及びNotI単一クローニング部位を含む、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の核酸配列。実施例１に記載されている
Figure 2023514348000008
Figure 2023514348000009
Figure 2023514348000010
５’ SacI単一クローニング部位が、一本線の下線で示されている。
３’ NotI単一クローニング部位が、破線の下線で示されている。
ＡＴＧ開始コドンが、太字の斜体で示されている。
配列番号２の核酸配列は、翻訳されて、配列番号１の天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質が生じる。
配列番号３ － 大腸菌における発現のために最適化されており、SacI及びNotI単一クローニング部位を含む、融合タンパク質ＨＥＶ－２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質をコードする核酸。実施例２に記載されている
Figure 2023514348000011
Figure 2023514348000012
Figure 2023514348000013
５’ SacI単一クローニング部位が、一本線の下線で示されている。
ＨＥＶ（ｐ２３９フラグメント）配列が、大文字で示されている。
２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質をコードする配列が、小文字で示されている。
３’ NotI単一クローニング部位が、破線の下線で示されている。
配列番号４ － コマガタエラ・パストリスにおける発現のために最適化されており、BstB1及びNotI単一クローニング部位を含む、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の核酸配列。実施例３に記載されている
Figure 2023514348000014
Figure 2023514348000015
Figure 2023514348000016
５’ BstBI単一クローニング部位が、一本線の下線で示されている。
３’ NotI単一クローニング部位が、破線の下線で示されている。
５’ SacIの直後に、ＡＣＧコドンがある（コーディング配列が、ＡＣＧの直後にあるＡＴＧ開始コドンとインフレームになるようにするために必要である）。これらの２つのコドンが、太字の斜体で示されている。
配列番号４の核酸配列は、翻訳されて、配列番号１の天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質が生じる。
配列番号５ － Ｋ．パストリスにおける発現のために最適化されており、BstB1及びNotI単一クローニング部位を含む、融合タンパク質ＨＰＶ１８Ｌ１／２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質をコードする核酸。実施例４に記載されている
Figure 2023514348000017
Figure 2023514348000018
Figure 2023514348000019
Figure 2023514348000020
５’ BstBI単一クローニング部位が、一本線の下線で示されている。
ＨＰＶ１８Ｌ１配列が、小文字で示されている。
２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質をコードする配列が、大文字で示されている。
３’ NotI単一クローニング部位が、破線の下線で示されている。
５’ BstBIの直後に、ＡＣＧコドンがある（コーディング配列が、ＡＣＧの直後にあるＡＴＧ開始コドンとインフレームになるようにするために必要である）。これらの２つのコドンが、太字の斜体で示されている。
配列番号６ － Ｋ．パストリスにおける発現のために最適化されており、BstB1及びNotI単一クローニング部位を含む、融合タンパク質ＨＰＶ１６Ｌ１／２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質をコードする核酸。実施例５に記載されている
Figure 2023514348000021
Figure 2023514348000022
Figure 2023514348000023
Figure 2023514348000024
５’ BstBI単一クローニング部位が、一本線の下線で示されている。
ＨＰＶ１６Ｌ１配列が、小文字で示されている。
２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質をコードする配列が、大文字で示されている。
３’ NotI単一クローニング部位が、破線の下線で示されている。
５’ BstBIの直後に、ＡＣＧコドンがある（コーディング配列が、ＡＣＧの直後にあるＡＴＧ開始コドンとインフレームになるようにするために必要である）。これらの２つのコドンが、太字の斜体で示されている。
配列番号７ － ヒト（２９３Ｆ）における発現のために最適化されており、NheI及びNotI単一クローニング部位を含む、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の核酸配列。実施例６に記載されている
Figure 2023514348000025
Figure 2023514348000026
Figure 2023514348000027
５’ NheI単一クローニング部位が、一本線の下線で示されている。
３’ NotI単一クローニング部位が、破線の下線で示されている。
５’ NheIの直後に、ＧＡＣコドンがある（コーディング配列が、ＧＡＣの直後にあるＡＴＧ開始コドンとインフレームになるようにするために必要である）。これらの２つのコドンが、太字の斜体で示されている。
配列番号７の核酸配列は、翻訳されて、配列番号１の天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質が生じる。
配列番号８ － ヒト（２９３Ｆ）における発現のために最適化されており、NheI及びNotI単一クローニング部位を含む、融合タンパク質ＨＢＳＡｇ／２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質をコードする核酸。実施例７に記載されている
Figure 2023514348000028
Figure 2023514348000029
Figure 2023514348000030
５’ NheI単一クローニング部位が、一本線の下線で示されている。
ＨＳＢＡｇ配列が、小文字で示されている。
２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質をコードする配列が、大文字で示されている。
３’ NotI単一クローニング部位が、破線の下線で示されている。
５’ NheIの直後に、ＧＡＣコドンがある（コーディング配列が、ＧＡＣの直後にあるＡＴＧ開始コドンとインフレームになるようにするために必要である）。これらの２つのコドンが、太字の斜体で示されている。
配列番号９ － 配列番号３に対応するアミノ酸配列
（大腸菌における発現のために最適化されており、SacI及びNotI単一クローニング部位を含む、融合タンパク質ＨＥＶ－２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質。実施例２に記載されている）
Figure 2023514348000031
Figure 2023514348000032
配列番号１０ － 配列番号５に対応するアミノ酸配列
（Ｋ．パストリスにおける発現のために最適化されており、BstB1及びNotI単一クローニング部位を含む、融合タンパク質ＨＰＶ１８Ｌ１／２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質。実施例４に記載されている）
Figure 2023514348000033
Figure 2023514348000034
配列番号１１ － 配列番号６に対応するアミノ酸配列
（Ｋ．パストリスにおける発現のために最適化されており、BstB1及びNotI単一クローニング部位を含む、融合タンパク質ＨＰＶ１６Ｌ１／２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質。実施例５に記載されている）
Figure 2023514348000035
Figure 2023514348000036
配列番号１２ － 配列番号８に対応するアミノ酸配列
（ヒト（２９３Ｆ）における発現のために最適化されており、NheI及びNotI単一クローニング部位を含む、融合タンパク質ＨＢＳＡｇ／２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質、実施例７に記載されている）
Figure 2023514348000037
配列番号１３ － ＲＢＤ ２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の核酸配列
Figure 2023514348000038
開始ＡＴＧ（太字）の前にＫＯＺＡＣ配列が追加されている（ｇｃｃ ａｃｃ、下線）。
NotIの前に分泌型形態ｔｇａ ｔａａが追加されており（二重下線）、このｔｇａ ｔａａ配列は、タンパク質合成を妨害する「２停止コドン」モチーフであり、細胞外培地への分泌を促進する（以下に記載されるように、他の配列にも含まれる）。
固有の制限部位が、それぞれ、５’末端のNheI及び３’末端NotIに付加されている（破線の下線）。
配列番号１４ － ２９３Ｆ（ＨＥＫ）細胞における発現のためにヒトコドン最適化されている、ＲＢＤ ２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の核酸配列。
Figure 2023514348000039
開始ＡＴＧ（太字）の前にＫＯＺＡＣ配列が追加されている（ｇｃｃ ａｃｃ、下線）。
NotIの前に、分泌型形態のｔｇａ ｔａａが付加されている（二重下線）。
固有の制限部位が、それぞれ、５’末端のNheI及び３’末端NotIに付加されている（破線の下線）。
配列番号１５ － 配列番号１３及び１４に対応するＲＢＤ ２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のアミノ酸配列
MRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKK
配列番号１６ － 剛性ＥＡＡＡＫリンカーのコンセンサスアミノ酸配列
Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２～５）
配列番号１７ － 剛性（ＥＡＡＡＫ）３リンカーの核酸配列
GAA GCC GCC GCT AAA GAG GCC GCT GCC AAA GAA GCT GCT GCT AAG
配列番号１８ － 剛性（ＥＡＡＡＫ）３リンカーのアミノ酸配列
EAAAKEAAAKEAAAK
配列番号１９ － 可動性ＧＳｎリンカーのコンセンサスアミノ酸配列
（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（ｎ＝１～６）
配列番号２０ － 可動性ＧＳ５（（ＧＧＧＧＳ）１）リンカーのアミノ酸配列
GGGGS
配列番号２１ － 可動性ＧＳ１０（（ＧＧＧＧＳ）２）リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGS
配列番号２２ － 可動性ＧＳ１５リンカーの核酸配列
GGT GGT GGT GGT AGC GGT GGT GGC GGT TCA GGT GGC GGT GGT TCA
配列番号２３ － 可動性ＧＳ１５（（ＧＧＧＧＳ）３）リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２４ － 可動性ＧＳ２０（（ＧＧＧＧＳ）４）リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２５ － 可動性ＧＳ２５（（ＧＧＧＧＳ）５）リンカーのアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２６ － ＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＲＢＤの核酸配列
Figure 2023514348000040
Figure 2023514348000041
開始ＡＴＧ（太字）の前にＫＯＺＡＣ配列が追加されている（ｇｃｃ ａｃｃ、下線）。
NotIの前に、分泌型形態のｔｇａ ｔａａが付加されている（二重下線）
固有の制限部位が、それぞれ、５’末端のNheI及び３’末端NotIに付加されている（破線の下線）。
太字及び点線の下線で示される配列は、（ＥＡＡＡＫ）３リンカーに対応する。
配列番号２７ － ２９３ｆ（ＨＥＫ）細胞における発現のためにヒトコドン最適化されている、ＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＲＢＤの核酸配列
Figure 2023514348000042
開始ＡＴＧ（太字）の前にＫＯＺＡＣ配列が追加されている（ｇｃｃ ａｃｃ、下線）。
NotIの前に、分泌型形態のｔｇａ ｔａａが付加されている（二重下線）
固有の制限部位が、それぞれ、５’末端のNheI及び３’末端NotIに付加されている（破線の下線）。
太字及び点線の下線で示される配列は、（ＥＡＡＡＫ）３リンカーに対応する。
配列番号２８ － 配列番号２６及び２７に対応する、ＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＲＢＤのアミノ酸配列
Figure 2023514348000043
（ＥＡＡＡＫ）３リンカーが、下線で示されている。
配列番号２９ － ＨＥＶ－ＧＳ１５－ＲＢＤの核酸配列
Figure 2023514348000044
Figure 2023514348000045
開始ＡＴＧ（太字）。
固有制限部位が、それぞれ、５’末端のSacI及び３’末端NotIに付加されている（破線の下線）。
NotIの前に、分泌型形態のｔｇａ ｔａａが付加されている（二重下線）
太字及び点線の下線で示される配列は、ＧＳ１５リンカーに対応する。
配列番号３０ － 大腸菌における発現のために最適化されたＨＥＶ－ＧＳ１５－ＲＢＤの核酸配列
Figure 2023514348000046
開始ＡＴＧ（太字）。
NotIの前に、分泌型形態のｔｇａ ｔａａが付加されている（二重下線）。
固有制限部位が、それぞれ、５’末端のSacI及び３’末端NotIに付加されている（破線の下線）。
太字及び点線の下線で示される配列は、ＧＳ１５リンカーに対応する。
配列番号３１ － 配列番号２９及び３０に対応する、ＨＥＶ－ＧＳ１５－ＲＢＤのアミノ酸配列
Figure 2023514348000047
ＧＳ１５リンカーが、下線で示されている。
配列番号３２ － ２９３ｆ（ＨＥＫ）細胞における発現のためにヒトコドン最適化されている、ＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ）３－全長２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の核酸配列
Figure 2023514348000048
Figure 2023514348000049
Figure 2023514348000050
開始ＡＴＧ（太字）の前にＫＯＺＡＣ配列が追加されている（ｇｃｃ ａｃｃ、下線）。
太字及び点線の下線で示される配列は、（ＥＡＡＡＫ）３リンカーに対応する。
配列番号３３ － 配列番号３２に対応するＨＢＳＡｇ－（ＥＡＡＡＫ） ３－全長２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質のアミノ酸配列
Figure 2023514348000051
（ＥＡＡＡＫ）３リンカーは、下線で示されている。

Claims (28)

  1. 配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質；又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメント；をコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、組換え発現のために最適化されている、前記ポリヌクレオチド。
  2. （ａ）大腸菌、
    （ｂ）酵母、好ましくは、コマガタエラ若しくはサッカロマイセス、並びに／又は
    （ｃ）哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞
    から選択される宿主細胞における発現のために最適化されている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. １つ又は２つ以上のシス作用配列モチーフが削除されており、前記１つ又は２つ以上のシス作用配列モチーフが、
    （ａ）内部ＴＡＴＡボックス、
    （ｂ）カイ部位、
    （ｃ）リボソーム進入部位、
    （ｄ）ＡＴリッチ及び／若しくはＧＣリッチの配列ストレッチ、
    （ｅ）ＲＮＡ不安定性モチーフ、
    （ｆ）反復配列及び／若しくはＲＮＡ二次構造、
    （ｇ）隠れたスプライスドナー部位、
    （ｈ）隠れたスプライスアクセプタンス部位、並びに／又は
    （ｉ）（ａ）～（ｉ）の任意の組合せ
    から独立して選択される、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
  4. ポリヌクレオチドが、宿主細胞ゲノムに組み込まれる、請求項１～３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  5. 少なくとも約０．８０、好ましくは、少なくとも約０．９、より好ましくは、少なくとも約０．９３のコドン適合インデックス（ＣＡＩ）を有する、請求項１～４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  6. （ａ）配列番号２に対する少なくとも９０％の同一性、
    （ｂ）配列番号３に対する少なくとも９０％の同一性、
    （ｃ）配列番号４に対する少なくとも９０％の同一性、
    （ｄ）配列番号５に対する少なくとも９０％の同一性、
    （ｅ）配列番号６に対する少なくとも９０％の同一性、
    （ｆ）配列番号７に対する少なくとも９０％の同一性、
    （ｇ）配列番号８に対する少なくとも９０％の同一性、
    （ｈ）配列番号１３に対する少なくとも９０％の同一性、
    （ｉ）配列番号１４に対する少なくとも９０％の配列同一性、
    （ｊ）配列番号２６に対する少なくとも９０％の同一性、
    （ｋ）配列番号２７に対する少なくとも９０％の同一性、
    （ｌ）配列番号２９に対する少なくとも９０％の同一性、
    （ｍ）配列番号３０に対する少なくとも９０％の同一性、又は
    （ｎ）配列番号３２に対する少なくとも９０％の同一性
    を有する核酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  7. コードされるスパイクタンパク質、又はそのフラグメントが、
    （ａ）天然の２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質に存在する立体構造エピトープを保持する、
    （ｂ）核酸又は前記コードされるスパイクタンパク質若しくはそのフラグメントが対象に投与されると、前記スパイクタンパク質若しくはそのフラグメントに特異的な中和抗体の産生をもたらす、並びに／又は
    （ｃ）好ましくは配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むか、若しくはそれからなる、
    請求項１～６のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  8. プロモーターに作動可能に連結された、請求項１～７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現コンストラクト。
  9. 配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを含むワクチン組成物であって、前記フラグメントが、好ましくは配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する、前記２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含んでもよいか、又はそれからなってもよい、前記ワクチン組成物。
  10. 対象に投与されると、スパイクタンパク質又はそのフラグメントに特異的な中和抗体の産生をもたらす、請求項９に記載の組成物。
  11. 配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを発現する、ウイルスベクター、ＲＮＡワクチン、又はＤＮＡプラスミドであって、前記フラグメントが、好ましくは配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する、前記２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含んでもよいか、又はそれからなってもよい、前記ウイルスベクター、ＲＮＡワクチン、又はＤＮＡプラスミド。
  12. シグナルペプチドをさらに含む、スパイクタンパク質又はそのフラグメントを発現する、請求項１１に記載のウイルスベクター、ＲＮＡワクチン、又はＤＮＡプラスミド。
  13. シグナルペプチドが、ヒト細胞からの分泌を誘導する、請求項１２に記載のウイルスベクター、ＲＮＡワクチン、又はＤＮＡプラスミド。
  14. さらに、１つ又は２つ以上の追加の抗原又はそのフラグメント、好ましくは、２０１９－ｎＣｏＶに由来する１つ又は２つ以上の追加の抗原又はそのフラグメントを発現する、請求項１１～１３のいずれかに記載のウイルスベクター、ＲＮＡワクチン、又はＤＮＡプラスミド。
  15. スパイクタンパク質又はそのフラグメント、並びに１つ又は２つ以上の追加の抗原又はそのフラグメントが、
    （ａ）融合タンパク質として発現される、又は
    （ｂ）組み合わせて使用するための、別個のウイルスベクター、別個のＲＮＡワクチン、又は別個のＤＮＡプラスミドにおいて発現される、
    請求項１４に記載のウイルスベクター、ＤＮＡワクチン、又はＤＮＡプラスミド。
  16. 請求項１～７のいずれかに定義される１つ若しくは２つ以上のポリヌクレオチド、又は請求項８に記載の発現コンストラクトを含む、請求項１１～１５のいずれかに記載のウイルスベクター、ＲＮＡワクチン、又はＤＮＡプラスミド。
  17. 配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質；又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメント；を含む融合タンパク質であって、前記フラグメントが、好ましくは配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する、前記２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含んでもよいか、又はそれからなってもよい、前記融合タンパク質。
  18. （ａ）Ｂ型肝炎表面抗原、若しくは前記Ｂ型肝炎表面抗原と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメント、
    （ｂ）ＨＰＶ １８ Ｌ１タンパク質、若しくは前記ＨＰＶ １８ Ｌ１タンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメント、
    （ｃ）Ｅ型肝炎Ｐ２３９タンパク質、若しくは前記Ｅ型肝炎Ｐ２３９タンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメント、及び／又は
    （ｄ）ＨＰＶ １６ Ｌ１タンパク質、若しくは前記ＨＰＶ １６ Ｌ１タンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメント
    をさらに含み、
    （ｉ）配列番号３、５、６、８、２６、２７、２９、３０、又は３２のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含むか若しくはそれからなるポリヌクレオチドによってコードされてもよい、及び／あるいは
    （ii）配列番号９、１０、１１、１２、２８、３１、又は３３のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなってもよい、
    請求項１７に記載の融合タンパク質。
  19. 配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又は前記スパイクタンパク質と共通の抗原交差反応性を有するそのフラグメントを含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記フラグメントが、好ましくは配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有する、前記２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含んでもよいか、又はそれからなってもよく、
    前記ＶＬＰが、請求項１７又は１８に定義される融合タンパク質を含んでもよいか、若しくはそれからなってもよい、
    前記ウイルス様粒子。
  20. 請求項１に定義される２０９１－ｎＣｏＶスパイクタンパク質抗原；又はそのフラグメント；に特異的に結合する抗体、若しくはその結合フラグメント。
  21. 抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項２０に記載の抗体、又はその結合フラグメント。
  22. 抗体が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、又はｄＡｂである、請求項２０又は２１に記載の抗体、若しくはその結合フラグメント。
  23. 請求項１に定義される２０１９－ｎＣｏＶスパイクタンパク質又はそのフラグメントに特異的に結合するオリゴヌクレオチドアプタマー。
  24. 請求項１１～１６のいずれかに記載のウイルスベクター、及び／又はＲＮＡワクチン、及び／又は、ＤＮＡプラスミドを含む、ワクチン組成物。
  25. ２０１９－ｎＣｏＶ感染症の処置及び／又は予防において使用するための、請求項１～７のいずれかに記載のポリヌクレオチド、並びに／又は請求項８に記載の発現コンストラクト、並びに／又は請求項９、１０、及び／若しくは２４のいずれかに記載のワクチン組成物、並びに／又は請求項１１～１６のいずれかに記載のウイルスベクター、及び／若しくはＲＮＡワクチン、及び／若しくはＤＮＡプラスミド、並びに／又は請求項１９に記載のウイルス様粒子、並びに／又は請求項１７若しくは１８に記載の融合タンパク質、並びに／又は請求項２０～２２のいずれかに記載の抗体、並びに／又は請求項２３に記載のアプタマー。
  26. ２０１９－ｎＣｏＶ感染症の予防及び／又は処置のための医薬の製造における、請求項１～７のいずれかに記載のポリヌクレオチド、並びに／又は請求項８に記載の発現コンストラクト、並びに／又は請求項９、１０、及び／若しくは２４のいずれかに記載のワクチン組成物、並びに／又は請求項１１～１６のいずれかに記載のウイルスベクター、及び／若しくはＲＮＡワクチン、及び／若しくはＤＮＡプラスミド、並びに／又は請求項１９に記載のウイルス様粒子、並びに／又は請求項１７若しくは１８に記載の融合タンパク質、並びに／又は請求項２０～２２のいずれかに記載の抗体、並びに／又は請求項２３に記載のアプタマーの使用。
  27. 配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、２０１９－ｎＣｏＶに由来するスパイクタンパク質、又はそのフラグメントを産生させる方法であって、請求項１～７のいずれかに定義されるポリヌクレオチドを、宿主細胞において発現させるステップと、任意に、前記スパイクタンパク質又はフラグメントを精製するステップとを含む、前記方法。
  28. スパイクタンパク質又はそのフラグメントを、薬学的に許容される担体若しくは希釈剤とともに製剤化するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
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