JP2023510253A - アルキル化ヌクレオシド、ならびにそれらの組成物および核酸送達のための方法 - Google Patents

アルキル化ヌクレオシド、ならびにそれらの組成物および核酸送達のための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、様々な核酸および遺伝子（例えば、一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉ－ＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ構築物）の送達に有用な、新規な化合物、それらのリポソーム、マイクロバブルおよび／またはナノ液滴、およびエマルジョンの組成物および調合物、ならびに、それらの調製方法ならびに超音波活性化を使用する画像化および遺伝子送達の方法を含むそれらの使用方法を提供する。【選択図】なし

Description

優先権主張および関連する特許出願
本出願は、２０２０年１月８日に出願された米国仮出願シリアル番号６２／９５８，３２８からの優先権の利益を主張し、その全内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。
本発明の技術分野
本発明は、化合物および医薬組成物ならびにそれらの調製および診断的または治療的使用の方法に関する。より具体的には、本発明は、様々な核酸および遺伝子（例えば、一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉ－ＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ構築物）の送達に有用な、新規な化合物、それらのリポソーム、マイクロバブルおよび／またはナノ液滴、およびエマルジョンの組成物および調合物、ならびに、それらの調製方法ならびに超音波活性化を使用する画像化および遺伝子送達の方法を含む使用方法に関する。
発明の背景
遺伝子治療は、疾患を治療または予防するための薬剤として核酸を患者の細胞へ治療目的で送達することへの利用に焦点を合わせた新たな医療分野である。遺伝子治療には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ、およびそれらの組み合わせなどのオリゴヌクレオチドに基づく薬剤が含まれる。現在非常に興味深い分野は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された、規則的に間隔があいた短いパリンドロームリピート）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）であり、ＲＮＡがこのＣａｓ９酵素に結合する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９では、改変されたＲＮＡを使用してＤＮＡ配列を認識し、前記Ｃａｓ９酵素が標的位置でＤＮＡを切断する。二本鎖ＲＮＡは、標的遺伝子の発現を防ぐための触媒ＲＮＡとして使用できるｓｉ－ＲＮＡとして使用できる。現在、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に基づいていくつかの承認された製品が利用可能である。ＡＳＯは通常、標的に応じて、遺伝子発現およびタンパク質翻訳をブロックしうるか高めうる、一本鎖ＲＮＡの構築物を含む。これまでに承認されたＡＳＯはすべて、局所投与を利用している。
ＡＳＯを含む様々な遺伝子に基づく治療薬の全身的および／または局所的な送達を可能にする、新規で改善された送達技術が依然として継続的に必要とされている。
ミセル、リポソーム、ナノ粒子、マイクロスフェア、エマルジョン、フルオロカーボンエマルジョンおよびマイクロバブルの生成を可能にする、１つ以上のヌクレオシド類似体（デオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシドの両方を含む）を含むアルキル化された化合物について記載する。本明細書に開示されるアルキル化ヌクレオシドは、遺伝物質（「ペイロード」）上の対応する相補的ヌクレオシドに結合することにより、前記遺伝物質を対応する構造に組み込む。前記アルキル化ヌクレオシド（「担体」）は、好ましくは電荷中性であり、前記遺伝物質を安定化し、前記担体が前記ペイロードを前記標的細胞に送達するまでそれを保存する。さらに、本発明は、任意に、選択された所望の細胞への送達を補助するための１つ以上の標的化リガンドを含む。任意に、超音波または他のエネルギー源を使用して、遺伝的なペイロードの送達を監視し、前記標的部位で前記担体を「活性化」して、前記遺伝的なペイロードを放出する。活性化とは、遺伝的なペイロードの放出、細胞への送達および細胞内への送達を促進する前記担体とのエネルギー媒介相互作用を指す。
一態様では、本発明は、概して、それぞれが少なくとも９個（例えば、少なくとも１２個、少なくとも１８個）の炭素原子を有する１つ以上のアルキル基に共有結合している、１つ以上のヌクレオシド、またはそのもしくはそれらの誘導体または類似体、またはその薬学的に許容されうる形態を含む、化合物に関する。
特定の実施形態において、前記１つ以上のヌクレオシド、またはそのもしくはそれらの誘導体または類似体は、二リン酸部分を含む連結基を介して前記１つ以上のアルキル基に共有結合している。
特定の実施形態において、前記１つ以上のヌクレオシド、またはそのもしくはそれらの誘導体または類似体は、シトシン、アデニン、グアニン、ウラシルおよびチミンから選択される１つ以上の部分を含む。特定の実施形態において、前記１つ以上のヌクレオシド、またはそのもしくはそれらの誘導体または類似体は、シトシン、アデニン、グアニン、ウラシルおよびチミンから選択される２つ以上の部分を含む。特定の実施形態において、前記１つ以上のヌクレオシド、またはそのもしくはそれらの誘導体または類似体は、シトシン、アデニン、グアニン、ウラシルおよびチミンから選択される４つの部分を含む。
特定の実施形態において、前記１つ以上のヌクレオシド、またはそのもしくはそれらの誘導体または類似体は、シチジン、アデノシン、５‐メチルウリジン、ウリジンおよびグアノシンから選択される１つ以上の部分を含む。
特定の実施形態において、前記１つ以上のヌクレオシド、またはそのもしくはそれらの誘導体または類似体は、シチジン、アデノシン、５‐メチルウリジン、ウリジンおよびグアノシンから選択される２つ以上の部分を含む。
特定の実施形態において、前記１つ以上のヌクレオシドは、電荷中性ヌクレオシドである。
特定の実施形態において、前記１つ以上のアルキル基は、それぞれ、約１２個から約２４個（例えば、１２個～１６個、１６個～１８個、１８個～２４個）の炭素原子を有する。特定の実施形態では、前記化合物は、それぞれが約１２個から約２４個の炭素原子を有する２つのアルキル基を有する。
特定の実施形態において、前記１つ以上のヌクレオシドは、デオキシリボ核酸を含む。特定の実施形態において、前記１つ以上のヌクレオシドは、リボ核酸を含む。
特定の実施形態において、前記化合物はさらに、標的化リガンドを含む。
別の態様では、本発明は、概して、本明細書に開示される化合物を含む複合体に関し、前記化合物は核酸分子と非共有的に結合して複合体を形成する。特定の実施形態において、前記核酸分子は、遺伝子、ＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ配列を含む。
さらに別の態様では、本発明は、概して、本明細書に開示される化合物または核酸にコンジュゲートされたその複合体を含む組成物に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、本明細書に開示される化合物または核酸にコンジュゲートされたその複合体を含むミセルまたはリポソームに関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、本明細書に開示される化合物または核酸にコンジュゲートされたその複合体を含むマイクロバブルに関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、本明細書に開示される化合物または核酸にコンジュゲートされたその複合体を含むナノ液滴に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、本明細書に開示されるミセルまたはリポソームを含む組成物に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、本明細書に開示されるマイクロバブルを含む組成物に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、本明細書に開示されるナノ液滴を含む組成物に関する。
特定の実施形態では、フルオロカーボンを使用して、マイクロバブルまたはナノ液滴を形成する。特定の実施形態では、前記フルオロカーボンは、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタンおよびパーフルオロペンタンから選択される。
さらに別の態様では、本発明は、概して、本明細書に開示される化合物または核酸にコンジュゲートされたその複合体、またはそのような化合物または複合体を含むミセル、リポソーム、マイクロバブルまたはナノ液滴と、薬学的に許容されうる賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、本明細書に開示される化合物または核酸にコンジュゲートされたその複合体、またはそのような化合物または複合体を含むミセル、リポソーム、マイクロバブルまたはナノ液滴と、薬学的に許容されうる賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患または状態を治療するための方法に関する。
特定の実施形態において、前記疾患または状態は、眼疾患（ブドウ膜炎、網膜炎および網膜ジストロフィー）、血管および心臓疾患、癌（急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌および多種多様な腫瘍性状態）、肺疾患、アルツハイマー病、その他の神経変性状態、およびリポタンパク質リパーゼ欠損症から選択される。
さらに別の態様では、本発明は、概して、核酸を標的側に送達するための方法に関し、この方法は、本明細書に開示される化合物または核酸にコンジュゲートされたその複合体、またはそのような化合物または複合体を含むミセル、リポソーム、マイクロバブルまたはナノ液滴と、薬学的に許容されうる賦形剤、担体、または希釈剤とを含む組成物を対象に投与することを含む。
本発明は、同様の参照番号が同様の要素を設計するために使用される図面と併せて以下の詳細な説明を読むことからよりよく理解される。
図１は、ジパルミトイルホスファチジル－シチジン（ホスファチジルシチジン）の化学構造の図を示す。
図２は、アルキル化ヌクレオシド部分の調製に有用なリボースヌクレオシドの図を示す。
図３Ａは、脂質１６：０ ＣＤＰ ＤＰへの蛍光ポリ－グアノシン（ポリ－Ｇ）の結合を示す。９６ウェルプレートを１６：０ ＣＤＰ ＤＰ脂質でコーティングし、一晩乾燥させた。ポリ－Ｇ（蛍光）の濃度を増加させながら、ＤＮＡ配列を前記プレートに加え、前記配列が前記脂質に結合しているか否かを確認するために１時間インキュベートした。対照脂質（ＤＰＰＣ）を使用して、前記配列が結合しているか否かを確認した。１時間インキュベートした後、プレートリーダーを使用してＥｘ＝４８８ｎｍ、Ｅｍ＝５２５ｎｍで蛍光強度を測定した。
図３Ｂは、ホスファチジルシチジンを含むマイクロバブルへの異なる濃度の蛍光ポリ－グアノシン（ポリ－Ｇ）の結合のグラフを示す。
図４Ａは、脂質１６：０ ＣＤＰ ＤＰ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－（シチジン二リン酸）（アンモニウム塩））を含むマイクロバブル（ＭＢ）に結合した蛍光ポリ－Ｇの量を示す。ＣＤＰ ＤＰ脂質が配合されたマイクロバブルを活性化し、次いで、前のアッセイからの同じ希釈液で１時間インキュベートした。結合していない蛍光配列を取り除くために、前記ＭＢを３回洗浄した。前記ＭＢの一部を９６ウェルプレートにプレーティングし（図４Ａ）、Ｅｘ＝４８８ｎｍ、Ｅｍ＝５２５ｎｍで１時間インキュベートした後、プレートリーダーを使用して蛍光強度を測定した。他の部分は蛍光顕微鏡下で観察された（図４Ｂ）。
図４Ｂは、蛍光ポリ－Ｇと結合するホスファチジルシチジンを含むマイクロバブルの顕微鏡写真を示す。
図５は、ポリ－Ｇと結合するホスファチジルシチジンを含むマイクロバブルが標的細胞内および標的細胞上に示されている細胞の顕微鏡写真を示す。
図６は、ジ－アルキル－二リン酸ヌクレオシド部分を生成するための合成スキームを示す。記載されたヌクレオシド二リン酸の記載されたジアシルグリセロールの遊離－ＯＨへのコンジュゲーションは、第三級アミン塩基の存在下で、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を介したカップリングを介して進行し、記載されたジ－アルキル－二リン酸ヌクレオチド生成物を生成する。粗製物質の精製は、シリカゲルクロマトグラフィーを介して達成される。
図７Ａは、中性のジアルキル－ヌクレオシド部分を生成するための合成スキームを示す。記載されたジアシルグリセロールと記載されたヌクレオシド部分の両方のプロピオン酸－ＰＥＧ４－プロピオン酸リンカーへのコンジュゲーションは、第三級アミン塩基の存在下でＤＣＣを介したカップリングの下で進行する。前記リンカーの対称性により、前記ジアシルグリセロールリンカーまたはヌクレオシドリンカーの生成物のいずれかを独立して生成および単離して、その後の適切な部分への結合、または適切な化学量論的制御下での前記ジアルキル－ヌクレオシドの潜在的なワンポット合成が可能になる。プロピオン酸－ＰＥＧ４－プロピオン酸（５０ｍｇ）を１ｍＬのジエチルエーテルに溶解し、５５μＬのＳＯＣｌ２（５当量）を添加し、４０分間撹拌した。２ｍＬのエーテルに溶解した８４ｍｇの１，２－ジパルミトイルグリセロール（１当量）とともにピリジンを添加した（１．５当量）。発煙がおさまった時点で、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解した５０ｍｇのグアノシン（１当量）を添加し、反応物を１時間撹拌した。前記反応物を各５ｍＬのＤＭＳＯおよびエーテルで希釈し、次に５ｍＬの水で希釈して未反応の塩化チオニルを除去した。水層を分離して酢酸エチルで洗浄し、両方の有機層を合わせて水で洗浄した。溶媒を蒸発させて、５８．７ｍｇの白色粉末（３４％の収率）を得た。
図７Ｂは、図７Ａの化学スキームを使用して得られたヌクレオシド生成物を表す質量分析グラフを示す。
図８は、リボース部分における副反応を防止するための合成スキームを示す。ヌクレオシドコンジュゲーションの両方の合成手順では、リボースの遊離ヒドロキシルおよび核酸塩基のアミンとの望ましくない反応が起こりうる。炭水化物部分を２，２－ジメトキシプロパン（アセトンジメチルアセタール）で保護することにより、その後の結合ステップに使用できる遊離の５－ＯＨを伴う主要な２，３－イソプロピリデン生成物が得られる。この保護戦略は、核酸塩基アミンのイミン誘導体を提供する可能性が高く、これらの部位での側方反応性を妨げる可能性もある。保護された部分の結合は、記載されているように進行し、続いて、弱酸性の水性条件下で保護基を加水分解して、生成物を得ることができる。
本発明は、図を参照して以下の説明において好ましい実施形態において説明され、前記図中、同様の番号は、同じまたは類似の要素を表す。本明細書全体を通して「一実施形態」、「実施形態」、または同様の言語への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる「一実施形態において」、「実施形態において」という句、および同様の言語の出現は、必ずしもそうではないが、すべてが同じ実施形態を指す場合がある。本発明の説明された特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。以下の説明では、本発明の実施形態の完全な理解を提供するために、多数の特定の詳細が列挙されている。しかしながら、関連技術の当業者は、本発明が、１つ以上の特定の詳細なしで、または他の方法、構成要素、材料などを用いて実施され得ることを認識するであろう。他の例では、本発明の態様を曖昧にすることを避けるために、周知の構造、材料、または操作は詳細に示されていないか、または説明されていない。特定の実施形態において、本出願人の発明は、１つ以上の遺伝子構築物と混合された１つ以上のアルキル化ヌクレオシド類似体を含む。
一実施形態では、アルキル化ヌクレオシド材料は、それら自体で、または１つ以上の他のアルキル化部分とともに調合される。好ましいアルキル化部分には、脂肪酸、コレステロールおよびその誘導体、リン脂質およびフッ素系界面活性剤が含まれる。概して、１つ以上のアルキル化ヌクレオシド類似体は、遺伝子構築物とともに調合され、概して、ナノスケールのドメインからミクロスケールのサイズまでのサイズ、例えばサイズは約５ｎｍから約５ミクロンの範囲である、対応する構造を形成する。一実施形態では、フッ素化材料は、遺伝物質を伴うアルキル化ヌクレオシド部分を含む組成物に組み入れられ、エマルジョン、ナノ液滴（ＮＤ）およびマイクロバブル（ＭＢ）を形成する。本明細書において、エマルジョンは、対象への投与後に概してそのまま残る液体構造の液体を指す場合がある。ＮＤは、液体であるが、温度の変化または光、磁気、電気エネルギーまたは超音波エネルギーなどのエネルギーによる活性化の際に気体または他の状態に変わりうる材料を指す場合がある。ＭＢは、構造内のガスを指す。好ましいガスには、フルオロカーボンガスが含まれる。
本発明の一実施形態では、ヌクレオシド類似体は、モノアルキル基、例えば、ヌクレオシドに結合した脂肪酸を含む。別の実施形態では、それらはコレステロールヌクレオシド類似体を含んだ。別の実施形態において、本発明は、ヌクレオシドに付加されたフルオロアルキル部分を含む。好ましい実施形態では、本発明は、ヌクレオシドヘッド基に結合したジアルキル部分を含む。
前記アルキル化ヌクレオシドは、任意に、１つ以上の追加の脂質とともに調合される。特定の実施形態において、本出願人のリン脂質組成物は、１つ以上の実質的に電荷中性のリン脂質を含む。特定の実施形態では、本出願人のリン脂質組成物は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）を含む。ＤＰＰＣは双性イオン性化合物であり、実質的に中性のリン脂質である。特定の実施形態において、本出願人のリン脂質組成物は、ポリヒドロキシヘッド基、および／または３５０ダルトンを超えるヘッド基を含む第２のリン脂質を含み、ここで、Ｍは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、およびＮＨ４ ＋からなる群から選択される。リン脂質は、ホスホリル部分に結合したアンモニウム対イオンおよびポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）ヘッド基を含みうる。特定の実施形態では、本出願人の組成物は、ペグ化脂質を含む。特定の実施形態では、ＰＥＧ基ＭＷは、約１，０００から約１０，０００ダルトンである。特定の実施形態では、ＰＥＧ基ＭＷは、約２，０００から約５，０００ダルトンである。特定の実施形態では、ＰＥＧ基ＭＷは、約５，０００ダルトンである。特定の実施形態において、本出願人の脂質組成物は、以下のペグ化脂質のうちの１つ以上を含む：１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－１０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－１０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－３０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－３０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－３０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）５０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール））－５０００］（アンモニウム塩）および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）グリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－３０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－３０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－３０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５０００］（アンモニウム塩）および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５０００］（アンモニウム塩）。
上に示したリン脂質５は、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、またはＤＰＰＥを表す。ＰＥ、特にＤＰＰＥは、本発明において、好ましい脂質であり、好ましくは５から２０モル％の間、最も好ましくは１０モル％の濃度の他の脂質との配合物において好ましい脂質である。特定の実施形態では、本出願人の発明は、１つ以上の円錐形または六方晶のＨＩＩ形成脂質を含む。本発明において有用な円錐形の脂質には、モノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）、モノグルコシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）、カルジオリピンとも呼ばれるジホスファチジルグリセロール（ＤＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびジアシルグリセロールが含まれる。ホスファチジン酸（ＰＡ）も円錐形の脂質であるが、加水分解の傾向があり、生体影響を引き起こす可能性があるため、好ましくない。最も好ましい円錐形のリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）である。
潜在的に有用な円錐形のカチオン性脂質の例には、これらに限定されないが、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（塩化物塩）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（メチル硫酸塩）、１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（塩化物塩）、１，２－ジパルミトイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（塩化物塩）、１，２－ジステアロイル－３－トリメチルアニモニウム－プロパン（塩化物塩）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン、１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン、１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン、１，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ナトリウム塩または臭化物塩）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアニモニウムプロパン（塩化物塩）、Ｏ，Ｏ－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－ｔａ－トリメチルアンモニオアセチル－ジエタノールアミンが含まれる。有用でありうる追加のカチオン性脂質には、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３アミノプロピル）アミノ］ブチル－カルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチル－アンモニウムプロパン（塩化物塩）（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（塩化物塩）（炭素数１２～１８のさまざまな鎖長の、飽和、不飽和、または混合鎖、例えば不飽和を伴う飽和を利用しうる）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（臭化物塩）、Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロパン－１－アンモニウム（炭素数１４～１８のさまざまな鎖長の、飽和、不飽和、または混合鎖、たとえば不飽和を伴う飽和を利用しうる）、１，２－ジパルミトイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（塩化物塩）（炭素数１４～１８のさまざまな鎖長の、飽和、不飽和、または混合鎖、例えば不飽和を伴う飽和を利用しうる）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩、Ｎ４－コレステリル－スペルミンＨＣｌ塩および１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパンが含まれる。
カチオン性脂質は、概してポリアニオンであるＲＮＡまたはＤＮＡ構築物の電荷を中和するために使用されうる。前記アルキル化ヌクレオシドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ構築物中の相補的ヌクレオシドと塩基対を形成し、塩基対は、カチオン性脂質によってもたらされる静電相互作用よりも強い引力になると考えられる。これに関して、カチオン性脂質が使用される場合、これは、遺伝物質を結合するためではなく、結果として生じるナノ構造の電荷を調整するために使用される。
概して、前記アルキル化ヌクレオシドが脂質とともに使用される場合、前記アルキル化ヌクレオシドの濃度は、製剤中の総脂質の約１から約９５モル％を表す。より好ましくは、前記アルキル化ヌクレオシドは、総脂質の約５から５０モル％の範囲であり、さらにより好ましくは、前記アルキル化ヌクレオシドは、製剤中の総脂質の約１０モル％を表す。当業者は、前記アルキル化ヌクレオシド部分のアルキル鎖が飽和または不飽和でありうることを認識し、ジアルキルヌクレオシドが使用される場合、それらはまた、混合系であってもよく、例えば、飽和および不飽和アルキル鎖の両方を含む。同様に、前記アルキル化ヌクレオシドに加えて製剤に使用される脂質は、飽和または不飽和であってもよく、ジアルキル化脂質が使用される場合（例えば、ホスホコリン）、これらはまた、例えば、飽和および不飽和アルキル鎖の両方を含む混合系であってもよい。
一実施形態では、前記アルキル化ヌクレオシド類似体は、概して、約５モル％から約５０モル％のモル比でリポソームに組み入れられる。当該技術分野で知られているように、この実施形態では様々な脂質を使用することができる。
別の実施形態において、前記ヌクレオシド脂質は、エマルジョンにおいて使用され、脂質の最大１００％を含みうるが、概して、総脂質の９０、８０、または好ましくは約７０～７５％未満である。
他の実施形態では、前記アルキル化ヌクレオシド類似体は、実施例に示されるように、マイクロバブルまたはナノ液滴に使用される。
本発明は、複数の異なる用途に有用な様々な異なる構築物を生成する。投与経路は、治療する状態によって異なる。本発明の材料は、静脈内投与、肺投与（例えば、吸入）、経口、皮下、経皮、吸入、経鼻投与、腹腔内、膣内、嚢内および直腸に投与することができる。
前記ヌクレオシド脂質を用いて調製されたマイクロバブルおよびリポソームは、肺疾患を治療するのに有用である。マイクロバブルはガスで満たされているため、有効な流体力学的直径が非常に小さく、肺への送達に適した特性を備えている。前記構築物は、吸入を介して肺に投与することができる。吸入には、ネブライザーを使用できる。有用なネブライザーには、圧縮ガスを使用してエアロゾル（空気中の薬剤の小さな粒子）を生成するジェットネブライザー、高周波振動によってエアロゾルを生成する超音波ネブライザー、および液体が非常に細かいメッシュを通過してエアロゾルを形成するメッシュネブライザーが含まれる。さらに、吸入器を使用して製品を肺に投与することができる。例示的な吸入器には、ヒドロフルオロアルカン吸入器またはＨＦＡ吸入器（以前は定量吸入器またはＭＤＩと呼ばれていた）、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）およびソフトミスト吸入器（ＳＭＩ）が含まれる。乾燥粉末吸入器で使用するために、製剤は乾燥粉末として提供されうる。
１つ以上の二官能性ＰＥＧ化脂質を使用することができる。二官能性ＰＥＧ化脂質には、これらに限定されないが、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）、サクシニル１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［サクシニル（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）、ＰＤＰ１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［ＰＤＰ（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）マレイミド１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［マレイミド（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）ビオチン１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［マレイミド（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）シアヌール１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンＮ－［シアヌール（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）アミン１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ（５，０００）－マレイミド、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［ジベンゾシクロオクチル（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アジド（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［サクシニル（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［カルボキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［マレイミド（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［ＰＤＰ（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［ビオチニル（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［シアヌール（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［フォレート（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［フォレート（ポリエチレングリコール）－５０００］（アンモニウム塩）、Ｎ－パルミトイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００およびＮ－パルミトイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）５０００］｝が含まれる。
前記二官能性脂質は、抗体、ペプチド、ビタミン、糖ペプチド、および他の標的化リガンドを、前記アルキル化ヌクレオシドを含む構造に付着させるために使用することができる。１つ以上の標的化リガンドを対応する構造に組み込むことができる。ＰＥＧ鎖のＭＷは、約１，０００から約１０，０００ダルトンまで変化しうる。特定の実施形態では、前記ＰＥＧ鎖のＭＷは、約２，０００から約５，０００ダルトンである。
本発明で使用される脂質の脂質鎖は、長さが約１２から約２４個の炭素まで変化しうる。最も好ましくは、鎖長は約１６から約１８個の炭素である。鎖は飽和または不飽和でありうるが、好ましくは飽和している。コレステロールおよびコレステロール誘導体はまた、それらが中性であるか、または荷電されている場合は生物学的環境から電荷を保護するためにその電荷と並置して約３５０ＭＷを超えるヘッド基を含むという条件で本発明において使用されうる。
二官能性脂質を使用して、バイオコンジュゲートとも呼ばれる標的化リガンドを作製する場合、これらの標的化部分は、概して、総脂質の約０．２５から約１０モル％、より好ましくは約０．５から約５モル％で、最も好ましくは総脂質の約１モル％で前記構造に組み入れられる。
様々な実施形態において、前記アルキル化ヌクレオシドは、ＭＢまたはＮＤとして調合される。前記した構造のコアは、ガスまたはガス状前駆体を含みうる。代表的なガスおよびガス状前駆体には、窒素、酸素、六フッ化硫黄、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサンまたはそれらの混合物が含まれる。画像化および遺伝子／ＡＳＯ／ｓｉ－ＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ送達の目的で、理想的なＭＢ／ガス状前駆体は、体温未満の沸点と相まって低い水溶性を持つコアガスを含む。これにより、循環時間が長く、有用な寿命が長く、超音波での可視化のためおよび遺伝子送達を容易にする超音波活性化のための高いエコー源性を備えたＭＢ／ＮＤが得られる。本出願人のガス状前駆体には、例えば、フッ素化炭素、パーフルオロカーボン、六フッ化硫黄、パーフルオロエーテル、およびそれらの組み合わせが含まれる。当業者が理解するように、六フッ化硫黄、パーフルオロカーボンまたはパーフルオロエーテルなどの特定のフッ素化化合物は、組成物が最初に製造されるときは液体状態で存在するため、ガス状前駆体として使用される。前記フッ素化合物が液体であるか否かは、概してその液相／気相転移温度または沸点に依存する。例えば、好ましいパーフルオロカーボンであるパーフルオロペンタンの液相／気相転移温度（沸点）は２９．５℃である。これは、パーフルオロペンタンは概して室温（約２５℃）で液体であるが、ヒトの正常体温は約３７℃であり、パーフルオロペンタンの転移温度を上回っている人体の内部でガスに変わりうることを意味する。したがって、通常の状況では、パーフルオロペンタンはガス状前駆体である。当業者に知られているように、物質の有効沸点は、その物質がさらされる圧力に関連しうる。この関係は、理想気体の法則によって例示される：ＰＶ＝ｎＲＴ、ここで、Ｐは圧力、Ｖは体積、ｎは物質のモル、Ｒは気体定数、そしてＴは温度（°Ｋ）である。理想気体の法則は、圧力が上がると、有効沸点も上昇することを示している。逆に、圧力が下がると、有効沸点は下がる。本発明の組成物においてガス状前駆体として使用するためのフルオロカーボンには、部分的または完全にフッ素化されたカーボン、好ましくは飽和、不飽和、または環状のパーフルオロカーボンが含まれる。好ましいパーフルオロカーボンには、例えば、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロシクロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロシクロブタン、パーフルオロペンタン、パーフルオロシクロペンタン、パーフルオロヘキサン、パーフルオロシクロヘキサン、およびそれらの混合物が含まれる。より好ましくは、前記パーフルオロカーボンは、パーフルオロヘキサン、パーフルオロペンタン、パーフルオロプロパンまたはパーフルオロブタンである。
好ましいエーテルには、部分的または完全にフッ素化されたエーテル、好ましくは約３６℃から約６０℃の沸点を有する過フッ素化エーテルが含まれる。フッ素化エーテルは、１つ以上の水素原子がフッ素原子で置き換えられているエーテルである。本発明においてガス状前駆体として使用するための好ましい過フッ素化エーテルには、例えば、パーフルオロテトラヒドロピラン、パーフルオロメチルテトラヒドロフラン、パーフルオロブチルメチルエーテル（例えば、パーフルオロｔ－ブチルメチルエーテル、パーフルオロイソブチルメチルエーテル、パーフルオロ－ｎ－ブチル－メチルエーテル、パーフルオロプロピルメチルエーテル、パーフルオロイソプロピルエチルエーテル、パーフルオロｎ－プロピルエチルエーテル、パーフルオロシクロブチルメチルエーテル、パーフルオロシクロプロピルエチルエーテル、パーフルオロプロピルメチルエーテル（例えば、パーフルオロイソプロピルメチルエーテル、パーフルオロｎ－プロピルメチルエーテル）、パーフルオロジエチルエーテル、パーフルオロシクロプロピルメチルエーテル、パーフルオロエチルエチルエーテルおよびパーフルオロジメチルエーテルが含まれる。
他の好ましいパーフルオロエーテル類似体は、４から６個の炭素原子を含み、任意に、１つのハロゲン化物イオン、好ましくはＢｒ－を含む。例えば、構造Ｃｎ Ｆｙ Ｈｘ ＯＢｒを有する化合物（この構造中、ｎは１から約４０の整数であり、ｙは０から約１３の整数であり、ｘは０から約１３の整数である）は、ガス状前駆体として有用である。本発明においてガス状前駆体として使用するための他の好ましいフッ素化化合物は、六フッ化硫黄およびオクタフルオロプロパンである。
異なるタイプの化合物の混合物、例えば、フッ素化化合物（例えば、パーフルオロカーボンまたはパーフルオロエーテル）と窒素などの別のタイプのガスとの混合物を使用することができる。
概して、好ましいガス状前駆体は、約５７℃まで、好ましくは約２０℃から約５２℃、好ましくは約３７℃から約５０℃、より好ましくは約３８℃から約４８℃、さらにより好ましくは約３８℃から約４６℃、さらにより好ましくは約３８℃から約４４℃、さらにより好ましくは約３８℃から約４２℃の温度で、ガスへの相転移を起こす。最も好ましくは、前記ガス状前駆体は、約４０℃未満の温度で、相転移を起こす。当業者によって認識されるように、特定の用途で使用するためのガス状前駆体の最適な相転移温度は、検討材料、例えば、治療される特定の患者、標的とされる組織、温度上昇を引き起こす生理学的ストレス状態（例えば、癌、感染または炎症）の性質、使用される安定化材料、および／または送達される遺伝剤などに依存する。
さらに、当業者は、化合物の相転移温度が、例えば、局所圧力（例えば、間質、界面、または領域内の他の圧力）などの組織内の局所条件によって影響を受ける可能性があることを認識するであろう。例として、組織内の圧力が周囲圧力よりも高い場合、これにより相転移温度が上昇すると予想される。このような影響の程度は、シャルルの法則やボイルの法則などの標準的な気体の法則の予測を使用して推定できる。概算として、液体から気体への相転移温度が約３０℃から約５０℃の化合物は、圧力が２５ｍｍＨｇ上昇するごとに、相転移温度が約１℃上昇すると予想される。例えば、パーフルオロペンタンの液相から気相への相転移温度（沸点）は、標準圧力約７６０ｍｍＨｇで２９．５℃であるが、間質圧７９５ｍｍＨｇで沸点は約３０．５℃である。
本発明の一実施形態において、前記アルキル化ヌクレオシドは、脂質のブレンド物に組み入れられ、フルオロカーボンガスとともに撹拌されて、ＭＢを形成する。次に、得られたＭＢは、低温と高圧にさらされ、それらのガス状コアがＮＤに液化される。この用途では、好ましいガスは、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタンおよびパーフルオロペンタンである。パーフルオロプロパンのＮＤを形成するために、例えば、マイクロバブル懸濁液は、約－１７℃に冷却され、次いで、（例えば、窒素ガスまたは空気をバイアルに注入することによって）約５０ＰＳＩに加圧されうる。その後、ＭＢの乳白色の懸濁液は、ＮＤが形成されるにつれて半透明の青みがかった色になる。パーフルオロブタンＭＢからＮＤを形成するために必要な温度と圧力はそれほど低温と高圧ではなく、パーフルオロペンタンＭＢの場合はさらにそのような低温と高圧を必要しない。ＩＶ投与すると、ＮＤは液化されたままであるが（ＬａＰｌａｃｅ圧力のため）、超音波を照射するとＭＢに戻る。ＭＢのＮＤへの活性化に必要な音響圧力は、パーフルオロプロパンで最も低く、パーフルオロブタンで中間であり、パーフルオロペンタンＮＤで最も高くなる。さまざまな濃度のこれらのガスを混合することにより、ＮＤがＭＢに変換される特定の音響圧力に合わせて構成を調整することができる。生物医学画像化に超音波を適用する場合、生体影響を回避するために電力レベルが制限される。遺伝的薬物のペイロードを担持するパーフルオロプロパンのコアを含むアルキル化ヌクレオシドは、安全な音響圧力、例えば、約１．０未満の超音波の機械的指標で活性化することができる。ＮＤの利点は、ＭＢのミクロンサイズに対して直径が小さい（例えば、ナノメートルサイズ）ことである。遺伝物質のペイロードを送達するために、物質が細胞内空間に通過することが望ましい。より小さな粒子は、細胞送達に有利であると考えられる。これに関して、標的化リガンドは、粒子を細胞標的に結合させることが望ましい。細胞内送達を引き起こす標的化レジームが有利に働く。一例として、Ｅ－セレクチン標的粒子は細胞によって内在化される。ビタミンなどの第２のリガンドを組み入れることにより、例えば、葉酸、またはトランスフェリンの細胞内送達が達成されうる。これらの粒子が内部移行すると、エンドソームに入り、加水分解される可能性がある。しかしながら、超音波による活性化により、前記粒子の内容物（例えば、遺伝子ペイロード）がエンドソームから細胞内環境に放出される。次に、遺伝的ペイロードは、必要な細胞内空間、例えば、ＣＲＩＳＰＲの核またはＡＳＯのリボソームなどに入りうる。
本発明の一実施形態では、前記アルキル化ヌクレオシド（任意に１つ以上の他の脂質とともに調合される）は、高沸点のフルオロカーボン材料、例えば、パーフルオロデカリン、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロトリプロピルアミン、および当業者に知られているような他のそのようなフルオロカーボンを含みうる。治療用遺伝物質が前記アルキル化ヌクレオシドに付けられる場合、これらの構造が位置を変えて「ラフト」を形成しうることに注意されたい。そうすることで、前記アルキル化ヌクレオシドは、送達される構築物中のＲＮＡまたはＤＮＡと塩基対を形成するように再配向しうる。この点で、前記フルオロカーボンは、表面張力を低下させ、熱力学に有利に働き、前記アルキル化ヌクレオシドが最も効果的な塩基対を提供するように位置をシフトできるようにする界面として機能しうる。
別の実施形態において、前記アルキル化ヌクレオシドおよび関連する遺伝的薬物は、噴霧乾燥および／または凍結乾燥を使用して乾燥粉末として提供される。トレハロース、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、およびホルムアミドとＤＭＳＯ、プロピレングリコール、グリセロール、エチレングリコール、トレイトールおよび２－メチル－２，４－ペンタンジオールとの混合物を含むがこれらに限定されない、当技術分野でよく知られている様々な凍結防止剤および安定剤をそれらの中に使用することができる。当業者は、上記の凍結防止剤を別個にまたは混合して、または当該技術分野で知られている他の凍結防止剤と組み合わせて使用できることを認識するであろう。場合により、グリセロールおよびプロピレングリコールなどの溶媒を使用することにより、本発明は、実質的に水を含まず、使用前に水または生理食塩水で再水和される形態で提供されうる。
本出願人の発明は、様々なＲＮＡおよびＤＮＡに基づく治療薬を送達するために有用である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの特定の分子に結合するＤＮＡまたはＲＮＡの小片である。これは通常、ＲＮＡが特定のタンパク質を作る能力をブロックする。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、その塩基配列が「センス」配列と呼ばれる遺伝子のメッセンジャーＲＮＡに相補的であるため、そのように呼ばれることがある（したがって、メッセンジャーＲＮＡのセンスセグメント「５’－ＡＡＧＧＵＣ－３’」はアンチセンスメッセンジャーＲＮＡセグメント「３’－ＵＵＣＣＡＧ－５’」）によってブロックされる）。歴史的に、未修飾のホスホジエステルＲＮＡ ＡＳＯは、ＩＶ投与後、それらの標的に到達する前に分解される。本出願人の発明は、ＡＳＯを安定させて、ＡＳＯが目的の標的に到達できるようにするのに役立つと考えられる。だが、モルフォリノオリゴマー、例えば、ホスホロジアミデート基を介して結合したメチレンモルホリン環の骨格に結合したＤＮＡまたはＲＮＡ塩基を含む他のＤＮＡおよびＲＮＡ誘導体を本発明で使用することができる。核内低分子リボ核タンパク質複合体の結合がプレｍＲＮＡ鎖のイントロンの境界での結合を防ぎ、他の機構を介して、ブロッキングまたはリボソーム活性により、そして他の機構を介して、ＡＳＯ（修飾または非修飾）は、プレｍＲＮＡを妨害できる。ペプチド核酸（ペプチド核酸骨格は、ペプチド結合によって連結された繰り返しのＮ－（２－アミノエチル）－グリシンユニットから構成される）も、本発明において使用されうる。ロックされた核酸、リボース部分が２’酸素と４’炭素を接続する追加のブリッジで改変された改変ＲＮＡヌクレオチドも本発明において使用できる。ロックされた核酸では、前記ブリッジはリボースを３’－エンドコンフォメーションにロックする。ロックされた核酸は、オリゴヌクレオチドにおけるＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合されてハイブリダーゼーション特性を高めることができる。ＲＮＡ干渉は、２種類の小さなリボ核酸分子（マイクロＲＮＡと小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））がＲＮＡ干渉に利用される本出願人の発明からも恩恵を受けることができる。ｓｉＲＮＡは概して二本鎖であり、パッセンジャー鎖とガイド鎖を含む。前記パッセンジャー鎖が分解され、前記ガイド鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体に組み込まれる。本出願人の発明における塩基対形成のため、これにより、ＲＮＡ干渉のためにパッセンジャー鎖なしでガイド鎖を使用できうる。プラスミド、二本鎖ＤＮＡの環状構築物は、概して１から１，０００キロベースペアを超えるサイズの範囲内にあり、本出願人の発明において使用できる。必要に応じて、プラスミドＤＮＡを加熱するか、化学的手段に供して二本の鎖を部分的に分解し、本出願人のアルキル化ヌクレオシドとＤＮＡの間の塩基対形成を最適化することができる。また、ＣＲＩＳＰＲ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を本発明で使用することができ、この系では、前記系の単一のガイドＲＮＡがゲノム内のその標的配列を認識して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＤＮＡの二本鎖を切断するためのはさみとして機能する。前記ガイドＲＮＡは、本発明のアルキル化ヌクレオシドと塩基対を形成し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が細胞に入ると前記ガイドＲＮＡを放出するように設計することができる。本出願人のアルキル化ヌクレオシドとともにカチオン性脂質を配合物に組み入れて、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ構築物の結合を改善することができる。同様に、細胞透過性ペプチドおよび核局在化モチーフを本出願人の発明に組み込むことができる。
当業者が認識するように、本出願人の発明は、治療を実施するために対応する遺伝子構築物を使用する多種多様な疾患を治療するために使用されうる。限定されることなく、本発明は、眼疾患（ブドウ膜炎、網膜炎および網膜ジストロフィー）、血管および心臓疾患、癌（急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌および多種多様な腫瘍性状態）、肺疾患、アルツハイマー病および他の神経変性状態およびリポタンパク質リパーゼ欠損症を治療するために使用することができる。本出願人の発明はまた、例えば、疾患を治療するために患者に投与するための１つ以上の遺伝子または他の遺伝子構築物を細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞に導入するために、エクスビボで使用されうる。可能性のある例は、本出願人の発明を使用して、ＣＡＲ Ｔ細胞を標的にしてｐ５３陽性の癌を治療することである。本発明は、インビボおよびインビトロ研究における前臨床発見ツールとして使用することができる。
以下の実施例は、本発明の実施を例示することを意図しており、決して限定するものではない。
実施例１． ＭＶＴ‐１００と呼ぶホスファチジルコリンでコーティングされたパーフルオロプロパンのマイクロバブル（ＭＢ）の調製。
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール－５，０００（ＤＰＰＥ－ＭＥＰＧ－５０００）を含む脂質のブレンド物を調製した。プロピレングリコールに懸濁した前記脂質を、溶解するまで７０±５０℃に加熱した。次に、得られた脂質溶液を、塩化ナトリウム、リン酸緩衝液およびグリセロールを含む水溶液に加え、撹拌により完全に混合させた。得られた脂質のブレンド物の各１ｍｌには、０．７５ｍｇの総脂質（０．４００ｍｇのＤＰＰＣ、０．０４６ｍｇのＤＰＰＥ、および０．３２ｍｇのＭＰＥＧ－５０００－ＤＰＰＥからなる）が含まれた。また、前記脂質のブレンド物の各１ｍｌは、注射用水中に１０３．５ｍｇのプロピレングリコール、１２６．２ｍｇのグリセリン、２．３４ｍｇのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物、２．１６ｍｇのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物、および４．８７ｍｇの塩化ナトリウムを含んだ。ｐＨは６．２～６．８であった。バランスエアとともにオクタフルオロプロパン（ＯＦＰ）ガス（＞８０％）を含むヘッドスペースを備えた密閉バイアル中で材料を準備した。
ＭＶＴ‐１００調合物により生成されたマイクロバブルは、通常の生理食塩水に懸濁されている間であっても、濃度およびサイズ分布に関して経時的に安定したままである。ＭＶＴ‐１００と呼ぶこの脂質のブレンド物を、ＮＤの調製およびＡＳＯの結合のためのベースＭＢとして使用した。ヌクレオシドリン脂質のモル比を変化させてＡＳＯに結合させるために、具体的には、ホスファチジルシチジンを加えた。
実施例２． ホスファチジルシチジン含有ＭＢの調製およびＡＳＯのローディング。
蛍光標識ポリ－Ｇ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から入手し、脂質混合物（０．７５ｍｇ／ｍｌ、７３．８モル％ＤＰＰＣ、９モル％ＤＰＰＥ、６．３モル％ＤＰＰＥ‐ＰＥＧ５０００および１０モル％１６：０ ＣＤＰ ＤＧ（シチジン二リン酸））に添加した。ＭＢを撹拌により調製した。１０μｌのＭＢを、蛍光標識ポリ－Ｇの様々な希釈液とインキュベートし、次に１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、結合していない蛍光ポリ－Ｇを、エッペンドルフチューブ中での遠心分離（１５００ｒｐｍで３分間）によって除去した。下の透明な液体を注射器で引き出し、上の乳白色のＭＢ層を新しいＰＢＳに再懸濁した。これを３回行った。
実施例３． ホスファチジルシチジンを含むＭＢと含まないＭＢの両方のＭＢとのＡＳＯの結合。
ＡＳＯと結合したＭＢのアリコートを黒色の９６ウェルプレートに播種し、蛍光強度をプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＳｐｅｔｒａＭａｘ Ｍ３）を使用して、Ｅｘλ（ストローク付きラムダ、以下同様）＝４８８ｎｍ、Ｅｍλ＝５２５ｎｍで測定した。ＡＳＯと結合したＭＢのアリコートを、ポリ－ｄ－リジンでコーティングされたガラス底皿（Ｍａｔ Ｔｅｋ、マサチューセッツ州アッシュランド）に播種し、表面に付着させた。ライカＤＭＩ６０００多機能電動倒立顕微鏡を用いた顕微鏡下で蛍光ＭＢを観察した。
実施例４． ホスファチジルシチジンを含むナノ液滴と含まないナノ液滴の両方のナノ液滴の調製。
独自の非臨界賦形剤を含むＭＶＴ‐１００に基づくパーフルオロプロパン（ＰＦＰ）のＭＢを、－１７℃および５０ＰＳＩのエチレングリコール浴中で５分間インキュベートすることにより、低温で液化させた。ＭＢは白っぽい泡のように見えたが、液化プロセスの後、ＮＤが薄い青みがかった半透明のエマルジョンとして現れた。結果として得られたＮＤは、ヘッドスペースで平均粒子サイズ＝８３０ｎｍおよびＰＦＰ濃度＝９０％であった親ＭＶＴ‐１００のＭＢと比較して、平均粒子サイズ＝６００ｎｍでＰＦＰ濃度が９０％であった。
実施例５． ホスファチジルシチジンＭＢと細胞とのインキュベーション
前記ＡＳＯに結合させた前記ＭＢのアリコートを、ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞（ＣａＣｏ２）に添加した。２０％のウシ胎児血清および１％のペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＡＴＣＣ調合化イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）を使用してＴ２５フラスコで、細胞を増殖させた。５％二酸化炭素、加湿雰囲気中、３７℃で細胞をインキュベートした。コンフルエンス後、細胞をトリプシンで剥離し、ポリ－ｄ－リジンでコーティングされたガラス底皿に移し、次いで、インキュベーションとさらに２４時間かけて確実に付着させた。ＭＢを加え、前記細胞とともに２時間インキュベートした。２時間後、細胞を洗浄して未結合の蛍光ＭＢを除去した。ライカＤＭＩ６０００多機能電動倒立顕微鏡を用いた顕微鏡下で細胞を観察した。
予想例１． ４つの異なるヌクレオシド脂質を含むＭＢの調製。
脂質の１０モル％を４つの異なるヌクレオシド脂質で置換したことを除いて、実施例１に記載の脂質からＭＢを調製した。図６に示す合成スキームに従い、ホスファチジル－シチジン、アデニン、チミンおよびグアニンを調製した。対応するホスファチジルヌクレオシドのそれぞれをＨＰＬＣにより精製した。各ホスファチジルヌクレオシド部分を２．５モル％で調合物に添加して、総ホスファチジルヌクレオシドの集合体の総モル％が１０モル％になるようにした。得られたＭＢはＡＳＯに親和的に結合することが示された。血清安定性アッセイにより、ＭＢなしのＡＳＯと比較して、ホスファチジルヌクレオシドを含むＭＢが、安定性に有意な改善をもたらすことが示された。
予想例２． ４つの異なるヌクレオシド脂質を含むＮＤの調製。
ＭＢを予想例１のように調製した。得られたＭＢを、実施例４のように、低温と高圧にさらした。次に、得られたＮＤを、ＡＳＯとともにインキュベートした。
予想例３． ＡＳＯ送達のためのＥ－セレクチンを標的とするＮＤ（ｔＮＤ）の調製。
Ｅ－セレクチン結合ペプチドのバイオコンジュゲートを、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－マレイミドおよびＤＫ１２－ＯＨペプチドから調製し、得られるバイオコンジュゲートを生じる。ＨＰＬＣにかけて前記バイオコンジュゲートを精製し、質量分析を行って構造を確認する。ｔＮＤを作製するためには、通常、前記バイオコンジュゲートの１モル％を７６モル％ＤＰＰＣおよび７モル％ＤＰＰＥ－ＭＰＥＧ（５０００）および７モル％ＤＰＰＥおよび予想例１に記載の１０モル％ヌクレオシドホスファチジルコリン脂質と混合する。緩衝化された通常の生理食塩水、プロピレングリコールおよびグリセロール７６／７／７／１０モル比の希釈剤に前記脂質を溶解する。脂質の透明な混合物を密封されるバイアルに入れ、それらのバイアルにオクタフルオロプロパンガスを充填する。ＮＤ調合物について、Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ（商標） ７８０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、フロリダ州ポートリッチー）とＮａｎｏＢｒｏｏｋ ９０ Ｐｌｕｓ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）をそれぞれ使用して粒子サイズと濃度の特性を評価し、ＮＤ調合物の均一性を確保する。さまざまな調合物中のパーフルオロプロパンの濃度を、ラマン分光法（ＤＸＲ２ Ｓｍａｒｔ Ｒａｍａｎ， ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定する。ホスホロチオエート類似体としての、Ｅ－セレクチンおよびＩＣＡＭ－１に関するＡＳＯを、ＮＤとインキュベートし、結合していないＡＳＯを透析により除去する。得られるＮＤはＥ－セレクチンを標的とし、ブドウ膜炎、関節炎、その他の関連する状態などの炎症状態を軽減するのに有用である。
予想例４． ＡＳＯと結合するリポソームの調製。
予想例４に記載の脂質を使用して、リポソームを生成する。この用途では、フルオロカーボンガスを使用しない。前記脂質が再水和された後、前記リポソームの凍結融解とそれに続く押し出しによってリポソームを生成する。ＡＳＯを前記リポソームに添加し、結合していないＡＳＯを透析によって除去する。得られるＥ－セレクチンを標的とするリポソームは、ＡＳＯを炎症状態に送達するのに有用である。
例５． ＡＳＯと結合するのに有用なエマルジョンの調製。
図７Ａ～７Ｂの中性脂質は、シチジニル、アデニン、チミン、およびグアニンのヘッド基で調製される。前記脂質は追加の脂質なしで調合され、ミセルを形成する。得られるミセルにＡＳＯを添加して複合体を形成する。
予想例６． リボース副反応を排除するためのヌクレオシド脂質の調製。
図８に示すヌクレオシド脂質を生成しＨＰＬＣによって精製する。得られるヌクレオシド脂質は、ＡＳＯの結合に有用である。
予想例７． ブドウ膜炎の患者の画像化と治療。
ＮＤを、シチジニル、アデニン、チミンおよびグアニンのヘッド基を有する１０モル％のヌクレオシド脂質を含むように上記のように調製する。Ｅ－セレクチンおよびＩＣＡＭ－１に対するＡＳＯが前記ＮＤに添加され、それらに結合する。前記ＮＤには微量のフルオロフォアＤｉＯが含まれる。約１０１０ＮＤとＥ－セレクチンおよびＩＣＡＭ－１に対するＡＳＯをそれぞれ約２ｍｇ含む約２．５ｍｌの溶液をブドウ膜炎の患者に静脈内注射する。眼底検査により、炎症を起こした網膜におけるＮＤの取り込みが示される。２０ＭＨｚトランスデューサーを使用した超音波画像化により、眼の炎症領域へのＮＤの取り込みが示される。次に、１．０ＭＨｚトランスデューサーを７２０ミリワットの電力レベルで使用してＮＤ／ＭＢをキャビテートさせ、炎症を起こした内皮細胞およびマクロファージのエンドソームからＡＳＯを放出させる。Ｅ－セレクチンを標的としたＭＢを使用する２週間後のフォローアップ画像化では、炎症の減少を反映して取り込みがはるかに少ないことが示される。
予想例８． 肺送達と肺疾患の治療
前記ヌクレオシド脂質を用いて調製したマイクロバブルおよびリポソームは、肺疾患を治療するのに有用である。
Ａ． 前記中性ヌクレオシド脂質を、脂質ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）およびＤＰＰＥ－ＰＥＧ（５，０００）と混合する。脂質の最終濃度は、ヌクレオシド脂質が約１０～２０モル％で、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ、およびＤＰＰＥ－ＰＥＧは８０～９０モル％である。非ヌクレオシド脂質の比率は、ＤＰＰＣが約８２モル％、ＤＰＰＥが１０モル％、そしてＤＰＰＥ－ＰＥＧが８モル％である。前記脂質を、１０ｖ／ｖｏｌ％のプロピレングリコールと１０ｗ／ｖｏｌ％のグリセロールを含む約８０ｗ／ｖｏｌ％の生理食塩水を含む液体中で懸濁する。パーフルオロブタンのヘッドスペースを備えた１．５ｍｌ容量のガラス製ウィートンバイアルに総脂質＝１ｍｌ当たり約２ｍｇを入れ、前記バイアルを密封する。前記バイアルをアマルガメーターデバイス上で約４，５００ＲＰＭの速度で振とうして、約１０～２０モル％のヌクレオシド脂質を含むマイクロバブルを生成する。次に、約１：１の重量／ｖｏｌの脂質およびｗ／ｖｏｌのＴＧＦ－βｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと前記マイクロバブルを混合し、穏やかに撹拌してから、特発性肺線維症の患者に超音波ネブライザーを介して投与する。前記患者は、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを運ぶ噴霧されたマイクロバブルを吸入する。複数の治療が施され、数ヶ月の期間にわたって疾患の改善がもたらされる。
Ｂ． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を前記バイアル中の脂質の水性懸濁液に添加し、マイクロバブルが形成されると前記マイクロバブルが前記ＡＳＯと結合するように撹拌ステップが繰り返されることを除いて、上記が実質的に繰り返される。
Ｃ． 前記脂質をプロピレングリコールに溶解し、ＡＳＯとともに５５℃に加熱し、０．２ミクロンフィルターで濾過することを除いて、上記の例Ａを実質的に繰り返す。次に、この材料を使用して前記バイアルを満たし、パーフルオロブタンガスとともに密封する。得られる生成物は本質的に無水である。前記バイアルを約４，５００ＲＰＭで４５秒間振とう後、約１０％ｗ／ｖｏｌのグリセロールを含む約８０％ｗ／ｖｏｌの生理食塩水を前記バイアルに注入することで前記マイクロバブルを再水和する。前記材料を前記バイアル内で穏やかに撹拌し、注射器で引き抜き、患者に投与するために超音波ネブライザーに入れる。
本出願人の開示は、本明細書において、同様の番号が同じまたは類似の要素を表す図を参照して、好ましい実施形態において説明されている。本明細書全体を通して「一実施形態」、「実施形態」、または同様の言語への言及は、前記実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、「一実施形態において」、「実施形態において」という句、および本明細書全体にわたる同様の言語の出現は、必ずしもそうではないが、すべてが同じ実施形態を指す場合がある。
本出願人の開示の記載された特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。本明細書の説明では、本発明の実施形態の完全な理解を提供するために、多数の特定の詳細が列挙されている。しかしながら、関連技術の当業者は、本出願人の組成物および／または方法が、１つ以上の特定の詳細なしで、または他の方法、構成要素、材料などを用いて実施されうることを認識するであろう。他の例では、本開示の側面を曖昧にすることを避けるために、周知の構造、材料、または操作は詳細に示されていないか、または説明されていない。
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形の参照を含む。
本明細書で使用されるように、具体的に述べられていないか、または文脈から明らかでない限り、「約」という用語は、当該技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均の２標準偏差内であると理解される。約は、記載されている値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内として理解されうる。文脈から明らかでない限り、本明細書で提供されるすべての数値は、約という用語によって修飾されうる。
本明細書で使用されるように、具体的に述べられているかまたは文脈から明らかでない限り、「または」という用語は包括的であると理解される。
組成物および方法を定義するために使用される場合、「含む」という用語は、前記組成物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することを意図している。組成物および方法を定義するために使用される場合、「本質的にからなる」という用語は、前記組成物および方法が列挙された要素を含み、前記組成物および方法にとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。例えば、「本質的にからなる」とは、明示的に記載された薬理学的に活性な薬剤の投与を指し、明示的に記載されていない薬理学的に活性な薬剤を除外する。本質的にからなるという用語は、薬理学的に不活性またはイナートな薬剤、例えば、薬学的に許容されうる賦形剤、担体または希釈剤を除外しない。組成および方法を定義するために使用される場合、「からなる」という用語は、他の成分の微量元素および実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの遷移用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料もまた、本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここに記載する。本明細書に記載の方法は、開示された特定の順序に加えて、論理的に可能な任意の順序で実行することができる。
参照による援用
本開示では、特許、特許出願、特許刊行物、ジャーナル、本、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書への参照および引用がなされている。そのようなすべての文書は、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用される。参照により本明細書に援用されると言われているが、本明細書に明示的に記載されている既存の定義、言及、または他の開示資料と矛盾する資料またはその一部は、その援用された資料と本明細書の開示資料の間で矛盾が生じない範囲のみ援用される。矛盾が生じた場合、好ましい開示として本開示を優先して前記矛盾を解決する必要がある。
均等物
代表的な実施例は、本発明を説明するのを助けることを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、また、それらが本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。実際、本明細書に示され記載されたものに加えて、本発明の様々な修飾およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書に含まれる実施例および科学的および特許文献への参照を含むこの文書の全内容から当業者に明らかになるであろう。前記実施例は、その様々な実施形態およびその均等物における本発明の実施に適合させることができる重要な追加情報、例示およびガイダンスを含む。

Claims (37)

  1. それぞれが少なくとも９個の炭素原子を有する１つ以上のアルキル基に共有結合している、１つ以上のヌクレオシド、またはそのもしくはそれらの誘導体または類似体、またはその薬学的に許容されうる形態を含む、化合物。
  2. 前記１つ以上のヌクレオシド、またはそのもしくはそれらの誘導体または類似体は、二リン酸部分を含む連結基を介して前記１つ以上のアルキル基に共有結合している、請求項１に記載の化合物。
  3. 前記１つ以上のヌクレオシド、またはそのもしくはそれらの誘導体または類似体は、シトシン、アデニン、グアニン、ウラシルおよびチミンから選択される１つ以上の部分を含む、請求項１または２に記載の化合物。
  4. 前記１つ以上のヌクレオシド、またはそのもしくはそれらの誘導体または類似体は、シトシン、アデニン、グアニン、ウラシルおよびチミンから選択される２つ以上の部分を含む、請求項３に記載の化合物。
  5. 前記１つ以上のヌクレオシド、またはそのもしくはそれらの誘導体または類似体は、シチジン、アデノシン、５‐メチルウリジン、ウリジンおよびグアノシンから選択される１つ以上の部分を含む、請求項１または２に記載の化合物。
  6. 前記１つ以上のヌクレオシド、またはそのもしくはそれらの誘導体または類似体は、シチジン、アデノシン、５‐メチルウリジン、ウリジンおよびグアノシンから選択される２つ以上の部分を含む、請求項５に記載の化合物。
  7. 前記１つ以上のアルキル基は、それぞれが約１２個から約２４個の炭素原子を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物。
  8. 前記化合物は、それぞれが約１２個から約２４個の炭素原子を有する２つのアルキル基を含む、請求項７に記載の化合物。
  9. 前記１つ以上のヌクレオシドは、デオキシリボ核酸を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。
  10. 前記１つ以上のヌクレオシドは、リボ核酸を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。
  11. 前記１つ以上のヌクレオシドは、電荷中性である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物。
  12. 前記化合物はさらに、標的化リガンドを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物。
  13. 前記標的化リガンドは、抗体、ペプチド、ビタミンおよび糖ペプチドから選択される、請求項１２に記載の化合物。
  14. 前記標的化リガンドは、抗体である、請求項１３に記載の化合物。
  15. 核酸分子と非共有的に結合して複合体を形成した請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物を含む複合体。
  16. 前記核酸分子は、一本鎖ＲＮＡ分子を含む、請求項１５に記載の複合体。
  17. 前記核酸分子は、ＤＮＡ分子を含む、請求項１５に記載の複合体。
  18. 前記核酸分子は、ｓｉ－ＲＮＡ分子を含む、請求項１５に記載の複合体。
  19. 前記核酸分子は、ＣＲＩＳＰＲ構築物を含む、請求項１５に記載の複合体。
  20. 前記核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の複合体。
  21. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物または請求項１５～２０のいずれか一項に記載の複合体を含む組成物。
  22. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物または請求項１５～２０のいずれか一項に記載の複合体を含むミセルまたはリポソーム。
  23. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物または請求項１５～２０のいずれか一項に記載の複合体を含むマイクロバブル。
  24. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物または請求項１５～２０のいずれか一項に記載の複合体を含むマイクロ液滴またはナノ液滴。
  25. 請求項２２に記載のミセルまたはリポソームを含む組成物。
  26. 請求項２３に記載のマイクロバブルを含む組成物。
  27. 請求項２４に記載のマイクロ液滴またはナノ液滴を含む組成物。
  28. フルオロカーボンを使用して、マイクロバブル、マイクロ液滴、ナノ液滴、ミセルまたはリポソームを形成する、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 前記フルオロカーボンは、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタンおよびパーフルオロペンタンから選択される、請求項２８に記載の組成物。
  30. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の複合体、請求項２２に記載のミセルまたはリポソーム、請求項２３に記載のマイクロバブル、または請求項２４に記載のマイクロ液滴またはナノ液滴と、薬学的に許容されうる賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物。
  31. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の複合体、請求項２２に記載のミセルまたはリポソーム、請求項２３に記載のマイクロバブル、または請求項２４に記載のマイクロ液滴またはナノ液滴、または請求項２５～２９のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患または状態を治療するための方法。
  32. 前記疾患または状態は、眼疾患（ブドウ膜炎、網膜炎および網膜ジストロフィー）、血管および心臓疾患、癌（急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌および多種多様な腫瘍性状態）、肺疾患、アルツハイマー病および他の神経変性状態、およびリポタンパク質リパーゼ欠損症から選択される、請求項３１に記載の方法。
  33. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の複合体、請求項２２に記載のミセルまたはリポソーム、請求項２３に記載のマイクロバブル、または請求項２４に記載のマイクロ液滴またはナノ液滴、または請求項２５～２９のいずれか一項に記載の組成物を含む組成物を対象に投与することを含む、核酸を送達するための方法。
  34. 前記方法はさらに、光、磁気、電気エネルギーおよび超音波エネルギーから選択されるエネルギーを前記対象の標的部位に適用して、前記核酸分子の送達を活性化することを含む、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 適用される前記エネルギーは、超音波エネルギーである、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記投与することは、肺送達を介する、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記投与することは、対象の肺への吸入を介する、請求項３６に記載の方法。
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