KR20220130696A - 알킬화 뉴클레오사이드, 및 핵산 전달을 위한 조성물 및 그 방법 - Google Patents

알킬화 뉴클레오사이드, 및 핵산 전달을 위한 조성물 및 그 방법 Download PDF

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KR20220130696A
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에반 씨. 웅거
엠마뉴엘 제이. 뮤일렛
마리아 에프. 아코스타
딜런 한라한
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마이크로바스큘러 테라퓨틱스 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 다양한 핵산 및 유전자(예를 들어, 단일 가닥 RNA, DNA, si-RNA 및 CRISPR 구조체)의 전달에 유용한 리포솜, 마이크로버블 및/또는 나노액적, 및 이들의 에멀젼으로 이루어진 신규한 화합물, 조성물 및 제형을 제공할 뿐만 아니라, 그 제조 방법 및 초음파 활성화를 사용한 영상화 및 유전자 전달 방법을 포함하는 사용 방법을 제공한다.

Description

알킬화 뉴클레오사이드, 및 핵산 전달을 위한 조성물 및 그 방법
우선권 주장 및 관련 특허 출원
본 출원은 2020년 1월 8일자로 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/958,328로부터 우선권의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 모든 목적을 위해 참조로 여기에 포함된다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 화합물 및 약제학적 조성물 및 이들의 제조 방법 및 진단 또는 치료 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 다양한 핵산 및 유전자(예를 들어, 단일 가닥 RNA, DNA, si-RNA 및 CRISPR 구조체)의 전달에 유용한 리포솜, 마이크로버블 및/또는 나노액적, 및 이들의 에멀젼으로 이루어진 신규한 화합물, 조성물 및 제형을 제공할 뿐만 아니라, 그 제조 방법 및 초음파 활성화를 사용한 영상화 및 유전자 전달 방법을 포함하는 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명의 배경기술
유전자 요법은 질병을 치료하거나 예방하기 위한 약물로서 환자의 세포 내로 핵산의 치료적 전달을 이용하는 것에 초점을 맞춘 새로운 의료 분야이다. 유전자 요법에는 DNA, RNA, CRISPR 및 이들의 조합과 같은 올리고뉴클레오티드-기반 약물이 포함된다. 현재 큰 관심 분야는 CRISPR(clustered regular interspaced short palindromic repeats), 예를 들어 RNA가 Cas9 효소에 결합하는 CRISPR-Cas9, CRISPR-연관 단백질 9이다. CRISPR-Cas9에서는, 변형된 RNA를 사용하여 DNA 서열을 인식하고, Cas9 효소가 타겟 위치에서 DNA를 절단한다. 이중 가닥 RNA는 타겟 유전자의 발현을 방지하기 위한 촉매 RNA로 사용될 수 있는 si-RNA로 사용될 수 있다. 안티-센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)를 기반으로 승인된 여러 제품이 현재 이용 가능하다. ASO는 일반적으로 타겟에 따라서, 유전자 발현 및 단백질 번역을 차단하거나 강조할 수 있는 단일-가닥 RNA의 구조체(constructs)를 포함한다. 현재까지 승인된 모든 ASO는 국소 투여를 이용한다.
ASO를 포함하는 다양한 유전자-기반 치료제의 전신 및/또는 국소 전달을 가능하게 하는 신규하고 개선된 전달 기술에 대한 지속적인 요구가 존재한다.
미셀, 리포솜, 나노입자, 미소구체, 에멀젼, 플루오로카본 에멀젼 및 마이크로버블의 생성을 가능하게 하는 하나 이상의 뉴클레오사이드 유사체(데옥시리보뉴클레오사이드 및 리보뉴클레오사이드 둘 다를 포함함)를 포함하는 알킬화된 화합물이 기재되어 있다. 본 명세서에 개시된 알킬화된 뉴클레오사이드는 유전 물질("페이로드") 상의 대응하는 상보적 뉴클레오사이드에 결합함으로써, 유전 물질을 대응하는 구조 내에 혼입시킨다. 바람직하게는 전하 중성인 알킬화된 뉴클레오사이드("담체")는 유전 물질을 안정화시키고 담체가 타겟 세포에 페이로드를 전달할 때까지 이를 보존한다. 또한, 본 발명은 선택된 원하는 세포로의 전달을 돕기 위해 하나 이상의 타겟팅 리간드를 선택적으로 포함한다. 선택적으로, 초음파 또는 기타 에너지원이 유전자 페이로드의 전달을 모니터링하고, 타겟 부위에서 담체를 "활성화"하여 유전자 페이로드를 방출하는 데 사용된다. 활성화에 의해, 방출을 촉진하는 담체와의 에너지-매개 상호작용, 유전자 페이로드의 세포 및 세포내 전달을 참조한다.
일 측면에서, 본 발명은 일반적으로 적어도 9개(예를 들어, 적어도 12개, 적어도 18개)의 탄소 원자를 각각 갖는 하나 이상의 알킬 기에 공유 결합된, 하나 이상의 뉴클레오사이드, 또는 이의 유도체 또는 유사체, 또는 이들의 제약상 허용되는 형태를 포함하는 화합물에 관한 것이다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 뉴클레오사이드, 또는 이의 유도체 또는 유사체는 디포스페이트 모이어티를 포함하는 연결 기를 통해 상기 하나 이상의 알킬 기에 공유 결합된다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 뉴클레오사이드, 또는 이의 유도체 또는 유사체는 시토신, 아데닌, 구아닌, 우라실 및 티민으로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 뉴클레오사이드, 또는 이의 유도체 또는 유사체는 시토신, 아데닌, 구아닌, 우라실 및 티민으로부터 선택된 2개 이상의 모이어티를 포함한다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 뉴클레오사이드, 또는 이의 유도체 또는 유사체는 시토신, 아데닌, 구아닌, 우라실 및 티민으로부터 선택된 4개의 모이어티를 포함한다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 뉴클레오사이드, 또는 이의 유도체 또는 유사체는 시티딘, 아데노신, 5-메틸우리딘, 우리딘 및 구아노신으로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함한다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 뉴클레오사이드, 또는 이의 유도체 또는 유사체는 시티딘, 아데노신, 5-메틸우리딘, 우리딘 및 구아노신으로부터 선택된 둘 이상의 모이어티를 포함한다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 뉴클레오사이드는 전하 중성 뉴클레오사이드이다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 알킬 기는 각각 약 12 내지 약 24개(예를 들어, 12-16, 16-18, 18-24)의 탄소 원자를 갖는다. 특정 실시예에서, 화합물은 약 12 내지 약 24개의 탄소 원자를 각각 갖는 2개의 알킬 기를 갖는다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 뉴클레오사이드는 데옥시리보핵산을 포함한다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 뉴클레오사이드는 리보핵산을 포함한다.
특정 실시예에서, 화합물은 타겟팅 리간드를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 일반적으로 핵산 분자에 비-공유적으로 복합체화된(complexed), 본원에 개시된 화합물을 포함하는 복합체에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 핵산 분자는 유전자, RNA 또는 CRISPR 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 일반적으로 핵산에 접합된(conjugated) 본원에 개시된 화합물 또는 그 복합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 일반적으로 핵산에 접합된 본원에 개시된 화합물 또는 그 복합체를 포함하는 미셀 또는 리포솜에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 일반적으로 핵산에 접합된 본원에 개시된 화합물 또는 그 복합체를 포함하는 마이크로버블에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 일반적으로 핵산에 접합된 본원에 개시된 화합물 또는 그 복합체를 포함하는 나노액적에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 일반적으로 본원에 개시된 미셀 또는 리포솜을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 일반적으로 본원에 개시된 마이크로버블을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 일반적으로 본원에 개시된 나노액적을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
특정 실시예에서, 플루오로카본을 사용하여 마이크로버블 또는 나노액적을 형성한다. 특정 실시예에서, 플루오로카본은 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄 및 퍼플루오로펜탄으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 일반적으로 핵산에 접합된 본원에 개시된 화합물 또는 그 복합체, 또는 이러한 화합물 또는 복합체를 포함하는 미셀, 리포솜, 마이크로버블 또는 나노액적, 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 일반적으로 핵산에 접합된 본원에 개시된 화합물 또는 그 복합체, 또는 이러한 화합물 또는 복합체를 포함하는 미셀, 리포솜, 마이크로버블 또는 나노액적, 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 질병 또는 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
특정 실시예에서, 질병 또는 질환은 안과 질환(포도막염, 망막염 및 망막 이영양증), 혈관 및 심장 질환, 암(급성 림프모구 백혈병, B-세포 림프종, 두경부 편평 세포 암종 및 다양한 종양 질환), 폐 질환, 알츠하이머병 및 기타 신경퇴행성 질환 및 지질단백질 리파제 결핍으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 일반적으로 핵산에 접합된 본원에 개시된 화합물 또는 그 복합체, 또는 이러한 화합물 또는 복합체를 포함하는 미셀, 리포솜, 마이크로버블 또는 나노액적, 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 타겟 부위에 핵산을 전달하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 도면과 함께 다음의 상세한 설명을 읽음으로써 더 잘 이해될 것이며, 여기서 동일한 참조 부호는 동일한 요소를 설계하는 데 사용된다.
도 1은 디팔미토일포스파티딜-시티딘(포스파티딜시티딘)의 화학 구조를 나타내는 다이어그램을 도시한다.
도 2는 알킬화된 뉴클레오사이드 모이어티의 제조에 유용한 리보스 뉴클레오사이드의 다이어그램을 도시한다.
도 3a는 지질 16:0 CDP DP에 대한 형광성 폴리-구아노신(폴리-G)의 결합을 도시한다. 96-웰 플레이트를 16:0 CDP DP 지질로 코팅하고 밤새 건조시켰다. 증가하는 농도의 폴리-G(형광성) DNA 서열을 플레이트에 첨가하고, 서열이 지질에 결합되었는지 확인하기 위해 1시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군 지질(DPPC)을 사용하여 서열이 결합하는지 여부를 확인하였다. 형광 강도는 Ex=488 nm, Em=525 nm에서 1시간 인큐베이션한 후 플레이트 판독기를 사용하여 측정되었다.
도 3b는 포스파티딜시티딘을 함유하는 마이크로버블에 대한 상이한 농도의 형광성 폴리-구아노신(폴리-G)의 결합의 그래프를 도시한다.
도 4a는 지질 16:0 CDP DP(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-(시티딘 디포스페이트)(암모늄염))를 함유하는 마이크로버블에 결합된 형광성 폴리-G의 양을 도시한다. CDP DP 지질로 제형화된 마이크로버블을 활성화한 다음, 이전 분석에서의 동일한 희석액과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 형광 서열을 제거하기 위해, MB를 세 번 세척하였다. MB의 일부를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고(도 4a), Ex=488 nm, Em=525 nm에서 1시간 인큐베이션한 후 플레이트 판독기를 사용하여 형광 강도를 측정하였다. 나머지 부분은 형광 현미경으로 관찰하였다(도 4b).
도 4b는 포스파티딜시티딘 결합 형광성 폴리-G를 함유하는 마이크로버블의 현미경 사진을 도시한다.
도 5는 포스파티딜시티딘 결합 폴리-G를 함유하는 마이크로버블이 타겟 세포 내 및 타겟 세포 상에 나타난, 세포의 현미경 사진을 도시한다.
도 6은 디-알킬-디포스페이트 뉴클레오사이드 모이어티의 생성을 위한 합성 반응식을 나타낸다. 디아실글리세롤의 유리(free) -OH에 대한 뉴클레오사이드 디포스페이트의 접합은 3차 아민 염기의 존재 하에, 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)-매개 커플링을 통해 진행되어, 디-알킬-디포스페이트 뉴클레오티드 생성물을 제공한다. 미정제(crude) 물질의 정제는 실리카-겔 크로마토그래피를 통해 달성된다.
도 7a는 중성 디알킬-뉴클레오사이드 모이어티의 생성을 위한 합성 반응식을 나타낸다. 프로피온산-PEG4-프로피온산 링커에 대한 디아실글리세롤 및 뉴클레오사이드 모이어티의 접합은 3차 아민 염기의 존재 하에, DCC-매개 커플링을 통해 진행된다. 링커의 대칭은 디아실글리세롤-링커 또는 뉴클레오사이드-링커 생성물이 적절한 화학량론적 제어 하에, 적절한 모이어티에 대한 후속 접합 또는 디알킬-뉴클레오사이드의 잠재적인 원-포트(one-pot) 합성을 위해 독립적으로 생성 및 분리될 수 있게 한다. 프로피온산-PEG4-프로피온산(50mg)을 1mL 디에틸 에테르에 용해하고, 55μL SOCl2(5 eq)를 첨가하고 40분 동안 교반하였다. 2mL 에테르에 용해된 84mg의 1,2-디팔미토일 글리세롤(1 eq)과 함께 피리딘(1.5 eq)을 첨가하였다. 발연이 진정되면, 1mL DMSO에 용해된 50mg의 구아노신(1 eq)을 첨가하고 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 각각의 DMSO 및 에테르 5mL로 희석한 다음, 물 5mL로 희석하여 미반응 염화티오닐을 제거하였다. 수층을 분리하고 에틸 아세테이트로 세척하고, 두 유기층을 합하여 물로 세척하였다. 용매를 증발시켜 58.7mg의 백색 분말을 얻었다(34% 수율).
도 7b 및 [도 7b의 연속된 도면인 도 7c]는 도 7a의 화학 반응식을 사용하여 수득된 뉴클레오사이드 생성물을 나타내는 질량 분석 그래프를 나타낸다.
도 8은 리보스 모이어티에서 부반응을 방지하기 위한 합성 반응식을 나타낸다. 뉴클레오사이드 접합을 위한 두 합성 절차 모두에서, 리보스의 유리 하이드록실 및 핵염기의 아민과 원치 않는 반응이 일어날 가능성이 있다. 2,2-디메톡시프로판(아세톤 디메틸아세탈)으로 탄수화물 모이어티를 보호하면, 후속 접합 단계를 위해 유리 5-OH를 갖는 주요 2,3-이소프로필리덴 생성물이 생성된다. 이러한 보호 전략은 핵염기 아민의 이민 유도체를 제공할 가능성이 있으며, 또한 해당 부위에서의 부반응을 방해한다. 보호된 모이어티의 접합은 설명된 대로 진행될 수 있으며, 이어서 약산성 수성 조건하에서 보호 기의 가수분해가 수행되어, 생성물을 얻을 수 있다.
본 발명은 도면을 참조하여 다음의 설명에서 바람직한 실시예로 설명되며, 도면에서 동일한 번호는 동일하거나 유사한 요소를 나타낸다. 본 명세서 전체에서 "일 실시예", "실시예" 또는 유사한 언어에 대한 참조는 실시예와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에서 "일 실시예에서", "실시예에서" 및 유사한 언어라는 문구의 출현은 반드시 그런 것은 아니지만, 모두 동일한 실시예를 지칭할 수 있다. 본 발명의 설명된 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시예에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다. 다음의 설명에서, 본 발명의 실시예의 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 인용된다. 그러나, 관련 기술 분야의 당업자는 본 발명이 하나 이상의 특정 세부 사항 없이, 또는 다른 방법, 구성 요소, 재료 등과 함게 실시될 수 있음을 인지할 것이다. 다른 예에서, 잘 알려진 구조, 재료 또는 동작은 본 발명의 양태를 모호하게 하는 것을 피하기 위해 상세하게 도시되거나 설명되지 않는다. 특정 실시예에서, 출원인의 발명은 하나 이상의 유전자 구조체와 혼합된 하나 이상의 알킬화된 뉴클레오사이드 유사체를 포함한다.
일 실시예에서, 알킬화된 뉴클레오사이드 물질은 그 자체로 또는 하나 이상의 다른 알킬화된 모이어티와 함께 제형화된다. 바람직한 알킬화된 모이어티는 지방산, 콜레스테롤 및 이의 유도체, 인지질 및 플루오로계면활성제를 포함한다. 일반적으로, 하나 이상의 알킬화된 뉴클레오사이드 유사체는 일반적으로 나노 크기의 도메인으로부터 마이크로 크기, 예를 들어 약 5 nm 내지 약 5 미크론 크기 범위의 대응 구조를 형성하기 위해 유전자 구조체와 함께 제형화된다. 일 실시예에서, 플루오르화 물질은 에멀젼, 나노액적(ND) 및 마이크로버블(MB)를 형성하기 위해 유전 물질과 함께 알킬화된 뉴클레오사이드 모이어티를 포함하는 조성물에 혼입된다. 여기서, 에멀젼은 일반적으로 대상체에 투여된 후에도 그대로 남아있는 액체 구조의 액체를 지칭할 수 있다. ND는 액체이지만 온도 변화에 따라 또는 빛, 자기, 전기 에너지 또는 초음파 에너지와 같은 에너지 활성화에 따라 가스 또는 다른 상태로 전환될 수 있는 물질을 지칭할 수 있다. MB는 구조체 내의 가스를 지칭한다. 바람직한 가스는 플루오로카본 가스를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 뉴클레오사이드 유사체는 모노알킬 기, 예를 들어 뉴클레오사이드에 부착된 지방산을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 이들은 콜레스테롤 뉴클레오사이드 유사체를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 뉴클레오사이드에 부착된 플루오로-알킬 모이어티를 포함한다. 바람직일 실시예에서, 본 발명은 뉴클레오사이드 헤드기에 결합된 디-알킬 모이어티를 포함한다.
알킬화된 뉴클레오사이드는 하나 이상의 추가 지질과 함께 선택적으로 제형화된다. 특정 실시예에서, 출원인의 인지질 조성물은 하나 이상의 실질적으로 전하-중성 인지질을 포함한다. 특정 실시예에서, 출원인의 인지질 조성물은 디팔미토일포스파티딜콜린("DPPC")을 포함한다. DPPC는 양쪽 이온성 화합물이며 실질적으로 중성 인지질이다. 특정 실시예에서, 출원인의 인지질 조성물은 폴리히드록시 헤드기, 및/또는 350 달톤 초과의 헤드기를 포함하는 제2 인지질을 포함하며, 여기서 M은 Na+, K+, Li+, 및 NH4 +로 이루어진 군으로부터 선택된다. 인지질은 포스포릴 모이어티에 결합된 폴리에틸렌글리콜("PEG") 헤드기 및 암모늄 반대이온을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 출원인의 조성물은 PEG화(PEG'ylated) 지질을 포함한다. 특정 실시예에서, PEG 기 MW는 약 1,000 내지 약 10,000 달톤이다. 특정 실시예에서, PEG 기 MW는 약 2,000 내지 약 5,000 달톤이다. 특정 실시예에서, PEG 기 MW는 약 5,000 달톤이다. 특정 실시예에서, 출원인의 지질 조성물은 다음의 PEG화 지질 중 하나 이상을 포함한다: 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-1000](암모늄염), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-1000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-3000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-3000](암모늄염), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-3000](암모늄염), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-5000](암모늄염), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-5000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-5000](암모늄염) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-5000](암모늄염), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-3000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-3000](암모늄염), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-3000](암모늄염), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-5000](암모늄염), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-5000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-5000](암모늄염) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-5000](암모늄염).
위에 표시된 인지질 5는 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민 또는 DPPE를 나타낸다. PE, 특히 DPPE는 바람직하게는 5 내지 20몰%, 가장 바람직하게는 10몰% 농도의 다른 지질과의 제형화에서 본 발명의 바람직한 지질이다. 특정 실시예에서, 출원인의 발명은 하나 이상의 원뿔형 또는 육각형 HII 형성 지질을 함유한다. 본 발명에 유용한 원뿔형은 모노갈락토실-디아실글리세롤(MGDG), 모노글루코실디아실글리세롤(MGDG), 카디오리핀으로도 불리는 디포스파티딜글리세롤(DPG), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜에탄올아민(PE) 및 디아실글리세롤을 포함한다. 포스파티딘산(PA)도 원뿔 모양의 지질이지만 가수분해 경향과 생물학적 효과를 유발할 가능성 때문에 선호되지 않는다. 가장 바람직한 원뿔형 인지질은 포스파티딜에탄올아민(PE)이다.
잠재적으로 유용한 원뿔형 양이온성 지질의 예는 1,2-디올레오일-3-트리메틸 암모늄-프로판(염화물 염), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(메틸 설페이트 염), 1,2-디미리스토일-3-트라이메틸암모늄-프로판(염화물 염), 1,2-다이팔미토일1-3-트라이메틸암모늄-프로판(염화물), 1,2-디스테아로일-3-트라이메틸아니모늄-프로판(염화물), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판, 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로판, 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로판, 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로판, 디메틸디옥타데실암모늄(나트륨 또는 브로마이드 염), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸아니모늄 프로판(염화물 염), O,O-di-O-옥타데세닐-3-ta-트리메틸암모니오아세틸-디에탄올아민을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 유용할 수 있는 추가의 양이온성 지질은 N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3아미노프로필)아미노]부틸-카르복스아미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤즈아미드, 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸-암모늄 프로판(염화물 염)(DOTMA), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(염화물 염)(이는 포화, 불포화, 또는 예를 들어 불포화로 포화된 혼합 사슬인 12-18개의 탄소로부터 변하는 사슬 길이로 활용될 수 있음), 디메틸디옥타데실암모늄(브롬화물 염), N-(4-카르복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-bis(올레오일옥시)프로판-1-아미늄(이는 포화, 불포화, 또는 예를 들어 불포화로 포화된 혼합 사슬인 14-18개의 탄소로부터 변하는 사슬 길이로 활용될 수 있음), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판(염화물 염)(이는 포화, 불포화, 또는 예를 들어 불포화로 포화된 혼합 사슬인 14-18개의 탄소로부터 변하는 사슬 길이로 활용될 수 있음), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤 염산염, N4-콜레스테릴-스페르민 HCl 염 및 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노프로판을 포함한다.
양이온성 지질은 일반적으로 다중음이온인 RNA 또는 DNA 구조체의 전하를 중화하기 위해 사용될 수 있다. 알킬화된 뉴클레오사이드는 RNA 또는 DNA 구조체에서 상보적 뉴클레오사이드와 염기쌍을 형성할 것이고, 염기쌍은 양이온성 지질에 의해 제공되는 정전기적 상호작용보다 더 강한 인력이 될 것이라고 믿어진다. 이와 관련하여, 양이온성 지질이 사용될 때, 이것은 유전 물질을 결합하는 것이 아니라 생성된 나노구조의 전하를 조정하기 위해 수행된다.
일반적으로, 알킬화된 뉴클레오사이드가 지질과 함께 사용될 때, 알킬화된 뉴클레오사이드의 농도는 제형 내 총 지질 또는 약 1 내지 약 95몰%를 나타낸다. 보다 바람직하게는 알킬화된 뉴클레오사이드는 총 지질의 약 5 내지 50몰% 범위이고, 더욱 더 바람직하게는 알킬화된 뉴클레오사이드는 제형 내 총 지질의 약 10몰%를 나타낸다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 알킬화된 뉴클레오사이드 모이어티의 알킬 사슬은 포화되거나 불포화될 수 있고, 디-알킬 뉴클레오사이드가 사용되는 경우, 이들은 또한 혼합 시스템, 예를 들어 포화 및 불포화 알킬 사슬 둘 다를 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 유사하게, 알킬화된 뉴클레오사이드 이외에 제형에 사용된 지질은 포화되거나 불포화될 수 있고, 디-알킬화된 지질이 사용되는 경우(예를 들어, 포스포콜린), 이들은 또한 예를 들어, 포화 및 불포화 알킬 사슬 둘 다를 포함하는 혼합 시스템일 수 있다.
일 실시예에서, 알킬화된 뉴클레오사이드 유사체는 일반적으로 약 5몰% 내지 약 50몰%의 몰비로 리포솜에 혼입된다. 다양한 지질이 당업계에 공지된 바와 같이 이 실시예에서 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 뉴클레오사이드 지질은 에멀젼에 사용되며, 지질의 100% 까지 포함할 수 있지만, 일반적으로 총 지질의 90, 80 미만 또는 바람직하게는 약 70-75%일 것이다.
다른 실시예에서, 알킬화된 뉴클레오사이드 유사체는 실시예에 나타낸 바와 같이, 마이크로버블 또는 나노액적에 사용될 것이다.
본 발명은 다수의 상이한 적용에 유용한 다양한 상이한 구조체를 생성한다. 투여 경로는 치료할 질환에 따라 상이하다. 본 발명의 물질은 정맥내, 폐 투여(예를 들어, 흡입), 경구, 피하, 경피, 흡입, 비강 투여, 복강내, 질내, 저장기 내(intra-cisternally) 및 직장으로 투여될 수 있다.
뉴클레오사이드 지질로 제조된 마이크로버블 및 리포솜은 폐 질환 치료에 유용하다. 마이크로버블은 가스로 채워져 있기 때문에, 유효 유체역학적 직경이 작고 폐 전달에 유리한 특성을 갖는다. 구조체는 흡입을 통해 폐로 투여될 수 있다. 흡입의 경우 분무기를 사용할 수 있다. 유용한 분무기는 압축 가스를 사용하여 에어로졸(공기 중 약물의 작은 입자)을 만드는 제트 분무기, 고주파 진동을 통해 에어로졸을 만드는 초음파 분무기 및 액체가 매우 미세한 메쉬를 통과하여 에어로졸을 형성하는 메쉬 분무기를 포함한다. 또한, 흡입기를 사용하여 제품을 폐에 투여할 수 있다. 예시적인 흡입기는 히드로플루오로알칸 흡입기 또는 HFA 흡입기(이전에는 계량 도스 흡입기 또는 MDI로 지칭됨), 건조 분말 흡입기(DPI) 및 연질 미스트 흡입기(SMI)를 포함한다. 건조 분말 흡입기와 함께 사용하기 위해 제형은 건조 분말로 제공될 수 있다.
하나 이상의 이작용성(bifunctional) PEG화 지질이 사용될 수 있다. 이작용성 PEG화 지질은 DSPE-PEG(2000), 숙시닐 1,2-디스테아로일-sn 글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[숙시닐(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), DSPE-PEG(2000), PDP 1,2-디스테아롤리-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[PDP(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), DSPE-PEG(2000)말레이미드 1,2-디스테아롤리-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), DSPE-PEG(2000)비오틴 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), DSPE-PEG(2000)시아누르 1,2-디스테아롤리-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 N-[시아누르(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), DSPE-PEG(2000)아민 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), DPPE-PEG(5,000)-말레이미드, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[디벤조시클로옥틸(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아지도(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[숙시닐(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카르복시(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[PDP(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리-에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[비오티닐(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[시아누르(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[폴레이트(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[폴레이트(폴리에틸렌글리콜)-5000](암모늄염), N-팔미토일-스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리-에틸렌글리콜)2000} 및 N-팔미토일-스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리에틸렌글리콜)5000]}을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.
이작용성 지질은 항체, 펩티드, 비타민, 글리코펩티드 및 기타 타겟팅 리간드를 알킬화된 뉴클레오사이드를 포함하는 구조에 부착시키는 데 사용될 수 있다. 하나 이상의 타겟팅 리간드가 대응하는 구조에 혼입될 수 있다. PEG 사슬 MW는 약 1,000 내지 약 10,000 달톤으로 다양할 수 있다. 특정 실시예에서, PEG 사슬 MW는 약 2,000 내지 약 5,000 달톤이다.
본 발명에 사용된 지질의 지질 사슬은 길이가 약 12개 내지 약 24개 탄소로 다양할 수 있다. 가장 바람직하게는, 사슬 길이는 약 16 내지 약 18개의 탄소이다. 사슬은 포화되거나 불포화될 수 있지만 바람직하게는 포화된다. 콜레스테롤 및 콜레스테롤 유도체는 중성이거나, 하전된 경우 생물학적 환경으로부터 전하를 보호하기 위해 전하에 병치된 약 350MW 초과의 헤드 기를 함유하는 조건으로 본 발명에서 사용될 수 있다.
생체접합체라고도 지칭되는 타겟팅 리간드를 생성하기 위해 이작용성 지질이 사용되는 경우, 이러한 타겟팅 모이어티는 일반적으로 전체 지질의 약 0.25 내지 약 10몰%, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5몰% 및 가장 바람직하게는 총 지질의 약 1몰%로 구조 내로 혼입된다.
다양한 실시예에서, 알킬화된 뉴클레오사이드는 MB 또는 ND로서 제형화된다. 구조의 코어는 가스 또는 가스 전구체를 포함할 수 있다. 대표적인 가스 및 가스 전구체는 질소, 산소, 육불화황, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄, 퍼플루오로펜탄, 퍼플루오로헥산 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 이미징 및 유전자/ASO/si-RNA/CRISPR 전달의 목적을 위해 이상적인 MB/가스 전구체는 체온 아래의 비등점으로 결합된 낮은 수용해도를 갖는 코어 가스를 포함한다. 결과적으로, 긴 순환 시간, 긴 유효 수명, 및 초음파 시각화와 유전자 전달을 촉진하는 초음파 활성화를 위한 높은 에코 발생 품질을 갖는 MB/ND가 생성된다. 출원인의 가스 전구체는 예를 들어, 플루오르화 탄소, 퍼플루오로카본, 육불화황, 퍼플루오로 에테르 및 이들의 조합을 포함한다. 숙련된 기술자가 이해하는 바와 같이, 육불화황, 퍼플루오로카본 또는 퍼플루오로 에테르와 같은 특정 플루오르화 화합물은 조성물이 처음 만들어질 때 액체 상태로 존재할 수 있고, 따라서 가스 전구체로 사용된다. 플루오르화 화합물이 액체인지 여부는 일반적으로 액체/가스 상 전이 온도 또는 비등점에 따라 달라진다. 예를 들어, 바람직한 퍼플루오로카본, 퍼플루오로펜탄은 29.5℃의 액체/가스 상 전이 온도(비등점)를 갖는다. 이는 퍼플루오로펜탄이 일반적으로 상온(약 25℃)에서 액체이지만 인체 내에서 가스로 전환될 수 있음을 의미하며, 그 정상 온도는 퍼플루오로펜탄의 전이 온도보다 높은 약 37℃이다. 따라서, 정상적인 상황에서, 퍼플루오로펜탄은 가스 전구체이다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 물질의 유효 비등점은 그 물질이 노출되는 압력과 관련될 수 있다. 이러한 관계는 이상 기체 법칙으로 예시된다: PV=nRT, 여기서 P는 압력, V는 부피, n은 물질의 몰, R은 가스 상수, T는 °K 단위의 온도이다. 이상 기체 법칙은 압력이 증가하면 유효 비등점도 증가한다는 것을 나타낸다. 반대로, 압력이 감소하면 유효 비등점이 낮아진다. 본 발명의 조성물에서 가스 전구체로서 사용하기 위한 플루오로카본은 부분적으로 또는 완전히 플루오르화된 탄소, 바람직하게는 포화, 불포화 또는 환형인 퍼플루오로카본을 포함한다. 바람직한 퍼플루오로카본은 예를 들어, 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로사이클로프로판, 퍼플루오로부탄, 퍼플루오로사이클로부탄, 퍼플루오로펜탄, 퍼플루오로사이클로펜탄, 퍼플루오로헥산, 퍼플루오로사이클로헥산, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 퍼플루오로카본은 퍼플루오로헥산, 퍼플루오로펜탄, 퍼플루오로프로판 또는 퍼플루오로부탄이다.
바람직한 에테르는 부분적으로 또는 완전히 플루오르화 에테르, 바람직하게는 약 36℃ 내지 약 60℃의 비등점을 갖는 퍼플루오르화 에테르를 포함한다. 플루오르화 에테르는 하나 이상의 수소 원자가 불소 원자로 대체된 에테르이다. 본 발명에서 가스 전구체로서 사용하기에 바람직한 퍼플루오르화 에테르는 예를 들어, 퍼플루오로테트라히드로피란, 퍼플루오로메틸테트라히드로푸란, 퍼플루오로부틸메틸 에테르 (예를 들어, 퍼플루오로 t-부틸메틸 에테르, 퍼플루오로 이소부틸 메틸 에테르, 퍼플루오로-n-부틸-메틸-에테르, 퍼플루오로프로필메틸 에테르, 퍼플루오로 이소프로필 에틸 에테르, 퍼플루오로 n-프로필 에틸 에테르, 퍼플루오로시클로부틸메틸 에테르, 퍼플루오로시클로프로필에틸 에테르, 퍼플루오로프로필메틸 에테르(예를 들어, 퍼플루오로 이소프로필 메틸 에테르, 퍼플루오로 n-프로필 메틸 에테르), 퍼플루오로디에틸 에테르, 퍼플루오로시클로프로필메틸 에테르, 퍼플루오로디메틸에틸 에테르 및 퍼플루오로디메틸에틸 에테르를 포함한다.
다른 바람직한 퍼플루오로에테르 유사체는 4 내지 6개의 탄소 원자를 함유하고, 선택적으로 1개의 할로겐화물 이온, 바람직하게는 Br-를 함유한다. 예를 들어, Cn Fy Hx OBr 구조를 갖는 화합물[여기서, n은 1 내지 약 40의 정수이고, y는 O 내지 약 13의 정수이고, x는 O 내지 약 13의 정수임]은 가스 전구체로서 유용하다. 본 발명에서 가스 전구체로서 사용하기 위한 다른 바람직한 플루오르화 화합물은 육불화황 및 옥타플루오로프로판이다.
플루오르화 화합물(예를 들어, 퍼플루오로카본 또는 퍼플루오로에테르) 및 질소와 같은 다른 유형의 가스의 혼합물과 같은 상이한 유형의 화합물의 혼합물이 사용될 수 있다.
일반적으로, 바람직한 가스 전구체는 약 57℃ 이하의 온도, 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 52℃, 바람직하게는 약 37℃ 내지 약 50℃, 보다 바람직하게는 약 38℃ 내지 약 48℃, 훨씬 더 바람직하게는 약 38℃ 내지 약 46℃, 여전히 훨씬 더 바람직하게는 약 38℃ 내지 약 44℃, 보다 훨씬 더 바람직하게는 약 38℃ 내지 약 42℃의 온도에서 가스로의 상 전이를 겪는다. 가장 바람직하게는, 가스 전구체는 약 40℃ 미만의 온도에서 상 전이를 겪는다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 특정 용도에 사용하기 위한 가스 전구체의 최적 상 전이 온도는 예를 들어, 치료되는 특정 환자, 타겟팅된 조직, 증가된 온도를 유발하는 생리학적 스트레스 상태(예를 들어, 암, 감염 또는 염증)의 특성, 사용된 안정화 물질, 및/또는 전달될 유전자 작용제와 같은 고려사항들에 따라 달라질 것이다.
추가로, 당업자는 화합물의 상 전이 온도가 예를 들어 국부적 압력(예를 들어, 부위에서의 간질(間質), 계면 또는 기타 압력)과 같은 조직 내의 국부적 조건에 영향받을 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 조직 내의 압력이 주변 압력보다 높으면, 상 전이 온도가 상승할 것으로 예상된다. 이러한 영향의 범위는 찰스(Charles)의 법칙 및 보일(Boyle)의 법칙과 같은 표준 가스 법칙 예측을 사용하여 추정할 수 있다. 대략적으로, 약 30℃와 약 50℃ 사이의 액체-가스 상 전이 온도를 갖는 화합물은 압력이 25mmHg 증가할 때마다 상 전이 온도가 약 1℃ 증가할 것으로 예상할 수 있다. 예를 들어, 퍼플루오로펜탄의 액체-가스 상 전이 온도(비등점)는 약 760mmHg의 표준 압력에서 29.5℃이지만, 비등점은 795mmHg의 간질 압력에서 약 30.5℃이다.
본 발명의 일 실시예에서, 알킬화된 뉴클레오사이드는 지질 블렌드에 혼입되고 플루오로카본 가스와 함께 교반되어 MB를 형성한다. 생성된 MB는 온도를 낮추고 압력을 증가시켜, 가스 코어를 ND로 응축시킨다. 이러한 적용을 위해 바람직한 가스는 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄 및 퍼플루오로펜탄이다. 퍼플루오로프로판의 ND를 형성하기 위해, 예를 들어 마이크로버블 현탁액이 약 -17℃로 냉각된 다음, (예를 들어, 질소 가스 또는 공기를 바이알에 주입함으로써) 약 50PSI로 가압될 수 있다. 그 다음, MB의 유백색 현탁액은 ND가 형성됨에 따라 반투명한 푸르스름한 색이 된다. 퍼플루오로부탄 MB로부터 ND를 형성하는 데 덜 가혹한 온도와 압력이 필요하고 퍼플루오로펜탄 MB의 경우에는 훨씬 덜 가혹하다. IV 투여 시, ND는 (LaPlace 압력으로 인해) 응축된 상태로 유지되지만, 초음파로 초음파를 쏘면 MB로 다시 활성화된다. MB를 ND로 활성화하는 데 필요한 음압은 퍼플루오로프로판이 가장 낮고, 퍼플루오로부탄이 중간이며, 퍼플루오로펜탄 ND가 가장 높다. 다양한 농도의 이러한 가스를 혼합함으로써, ND가 MB로 변환되는 주어진 음압으로 구조체를 조정할 수 있다. 생체 의학 이미징 초음파 적용의 경우, 전력 레벨은 생체 영향을 피하기 위해 제한된다. 유전 약물의 페이로드를 운반하는 퍼플루오로프로판의 코어를 포함하는 알킬화된 뉴클레오사이드는 안전한 음압, 예를 들어 약 1.0 미만의 기계적 초음파 지수에서 활성화될 수 있다. ND의 장점은 MB의 경우 미크론 크기인 것에 비해, 직경 더 작다는 것이다(예를 들어, 나노미터 크기). 유전 물질의 페이로드를 전달하기 위해, 물질이 세포내 공간으로 통과하는 것이 바람직하다. 더 작은 입자는 세포 전달에 유리한 것으로 여겨진다. 이와 관련하여, 타겟팅 리간드는 입자를 세포 타겟에 결합하는 데 필요하다. 세포내 전달을 유발하는 타겟팅 체제가 선호된다. 예를 들어, E-셀렉틴(selectin) 타겟 입자는 세포에 의해 내재화된다. 예를 들어, 비타민(예를 들어, 엽산) 또는 트랜스페린과 같은 두 번째 리간드를 혼입함으로써 세포내 전달을 달성할 수 있다. 입자가 내재화되면 엔도솜에 들어가 가수분해될 수 있다. 그러나, 초음파 활성화는 엔도솜으로부터 세포 내 환경으로 입자의 내용물(예를 들어, 유전자 페이로드)을 방출한다. 그 다음, 유전자 페이로드는 필요한 세포내 공간, 예를 들어 CRISPR의 핵 또는 ASO의 리보솜 등으로 들어갈 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 알킬화된 뉴클레오사이드(선택적으로 하나 이상의 다른 지질과 함께 제형화됨)는 높은 비등점의 플루오로카본 물질, 예를 들어 퍼플루오로데칼린, 퍼플루오로옥틸브로마이드, 퍼플루오로트리프로필아민 및 당업자에게 알려진 기타 플루오로카본을 포함할 수 있다. 치료 유전 물질이 알킬화된 뉴클레오사이드에 첨가되면, 이러한 구조가 위치 이동하여 "래프트(rafts)"를 형성할 수 있다. 그렇게 함으로써, 알킬화된 뉴클레오사이드는 전달될 구조체에서 RNA 또는 DNA와 염기쌍을 형성하도록 재-배향될 수 있다. 이와 관련하여, 플루오로카본은 가장 효과적인 염기-쌍을 제공하기 위해 알킬화된 뉴클레오사이드가 위치 이동할 수 있도록, 표면 장력을 낮추고 열역학을 선호하는(favoring) 계면으로서 작용할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 알킬화된 뉴클레오사이드 및 관련 유전 약물은 분무 건조 및/또는 동결건조를 사용하여 건조 분말로서 제공된다. 트레할로스, 포름아미드, 디메틸 설폭사이드 및 포름아마이드와 DMSO, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 트레이톨 및 2-메틸-2,4-펜탄디올의 혼합물을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는 당업계에 잘 알려진 다양한 동결 보호제 및 안정화제가 사용될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 상기 언급된 동결 보호제는 당해 분야에 공지된 바와 같이, 개별적으로 또는 혼합물로 또는 다른 동결 보호제와 함께 사용될 수 있다. 선택적으로, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜과 같은 용매를 사용함으로써, 본 발명은 실질적으로 물이 없는 형태로 제공될 수 있고, 사용 전에 물 또는 식염수로 다시 수화될 수 있다.
본 출원인의 발명은 다양한 RNA 및 DNA 기반 치료제를 전달하는 데 유용하다. 안티-센스 올리고뉴클레오티드는 RNA의 특정 분자에 결합하는 작은 DNA 또는 RNA 조각이다. 이것은 일반적으로 특정 단백질을 만드는 RNA의 능력을 차단한다. 안티-센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)는 그 염기서열이 유전자의 메신저 RNA에 상보적이기 때문에 그렇게 지칭될 수 있으며, 이는 "센스" 서열로 지칭된다(따라서, 메신저 RNA의 센스 세그먼트 "5'-AAGGUC-3'"는 안티-센스 메신저 RNA 세그먼트 "3'-UUCCAG-5'"에 의해 차단된다). 역사적으로, 변형되지 않은 포스포디에스테르 RNA ASO는 IV 투여 후 타겟에 도달하기 전에 분해된다. 출원인의 발명은 ASO가 원하는 타겟에 도달할 수 있도록, ASO를 안정화하는 데 도움이 될 것으로 믿어진다. 그럼에도 불구하고, 모르폴리노 올리고머, 예를 들어 포스포로디아미데이트 기를 통해 연결된 메틸렌모르폴린 고리의 백본에 부착된 DNA 또는 RNA 염기를 포함하여 다른 DNA 및 RNA 유도체가 본 발명에서 사용될 수 있다. ASO(변형 또는 비-변형)는 작은 핵 리보핵단백질 복합체가 다른 메커니즘, 차단 또는 리보솜 활성 및 기타 메커니즘을 통해 pre-mRNA 가닥의 인트론 경계에서 결합하는 것을 방지함으로써 pre-mRNA를 방해할 수 있다. 펩티드 핵산(펩티드 핵산 백본은 펩티드 결합에 의해 연결된 반복적인 N-(2-아미노에틸)-글리신 유닛으로 구성됨) 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 리보스 모이어티가 2' 산소와 4' 탄소를 연결하는 잉여 브릿지로 변형된 잠긴(locked) 핵산, 변형 RNA 뉴클레오티드 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 잠긴 핵산에서, 브릿지는 3'-엔도 형태에서 리보스를 잠금한다. 잠긴 핵산은 혼성화 특성을 향상시키기 위해 올리고뉴클레오티드의 DNA 또는 RNA 잔기와 혼합될 수 있다. RNA 간섭은 또한 출원인의 발명으로부터 이익을 얻을 수 있는데, 출원인의 발명에서는 두 가지 유형의 작은 리보핵산 분자 - microRNA 및 작은 간섭 RNA(siRNA)가 RNA 간섭을 위해 이용된다. siRNA는 일반적으로 이중 가닥이며 패신저 가닥 및 가이드 가닥을 포함한다. 패신저 가닥이 분해되고, 가이드 가닥이 RNA-유도 사일런싱 복합체에 혼입된다. 본 출원인의 발명에서의 염기쌍으로 인해, RNA 간섭을 위한 패신저 가닥 없이 가이드 가닥을 사용할 가능성을 제공한다. 플라스미드, 일반적으로 1 내지 1,000 킬로염기 쌍 이상의 크기 범위인 이중 가닥 DNA의 원형 구조체도 본 출원인의 발명에 사용될 수 있다. 선택적으로, 플라스미드 DNA는 가열되거나 화학적 수단에 노출되어, 두 가닥이 부분적으로 떨어져서 출원인의 알킬화된 뉴클레오사이드와 DNA 사이의 염기 쌍이 최적화될 수 있게 한다. 또한, CRISPR, 예를 들어 시스템의 단일 가이드 RNA가 게놈에서 타겟 서열을 인식하고 Cas9 뉴클레아제가 한 쌍의 가위 역할을 하여 DNA의 이중 가닥을 절단하는 CRISPR-Cas9가 본 발명에서 사용될 수 있다. 가이드 RNA는 본 발명의 알킬화된 뉴클레오사이드와 염기쌍을 형성할 것이고, CRISPR-Cas9 복합체가 세포에 들어갈 때 가이드 RNA를 방출하도록 설계될 수 있다. 양이온성 지질은 이중 가닥 DNA, RNA 및 CRISPR 구조체의 결합을 개선하기 위해 출원인의 알킬화된 뉴클레오사이드와 함께 제형에 혼입될 수 있다. 마찬가지로, 세포-투과 펩티드 및 핵 국소화 모티프가 출원인의 발명에 혼입될 수 있다.
당업자가 인지할 수 있는 바와 같이, 출원인의 발명은 치료에 유효한 대응하는 유전자 구조체를 사용하여 매우 다양한 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 제한 없이, 본 발명은 안과 질환(포도막염, 망막염 및 망막 이영양증), 혈관 및 심장 질환, 암(급성 림프모구 백혈병, B-세포 림프종, 두경부 편평 세포 암종 및 다양한 종양 질환), 폐 질환, 알츠하이머병 및 기타 신경퇴행성 질환 및 지질단백질 리파제 결핍을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 출원인의 발명은 또한 예를 들어, 하나 이상의 유전자 또는 다른 유전적 구조체를 세포, 예를 들어 질병 치료를 위해 환자에게 투여하기 위한 CAR T 세포 내에 도입하기 위해 생체 외에서 사용될 수 있다. 잠재적인 예는 p53 양성 암을 치료하기 위해 CAR T 세포를 타겟팅하는 데 출원인의 발명을 사용하는 것이다. 본 발명은 생체내 및 시험관내 연구에서 임상 전 발견 도구로 사용될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 실시를 예시하기 위한 것이며, 어떤 식으로든 제한하지 않는다.
실시예들
실시예 1. MVT-100으로 지칭되는 포스파티딜콜린 코팅된 퍼플루오로프로판 마이크로버블(MB)의 제조.
디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE) 및 디팔미토일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜-5,000(DPPE-MPEG-5000)을 함유하는 지질의 블렌드를 제조하였다. 프로필렌 글리콜에 현탁된 지질을 용해될 때까지 70±50℃로 가열하였다. 이어서, 지질 용액을 염화나트륨, 인산 완충액 및 글리세롤을 함유하는 수용액에 첨가하고, 교반하여 완전히 혼합되도록 하였다. 생성된 지질 블렌드의 각 ml는 0.75mg 총 지질(0.400mg DPPC, 0.046mg DPPE 및 0.32mg MPEG-5000-DPPE로 구성됨)을 함유하였다. 지질 블렌드의 각 ml는 또한 주사용수 중 103.5 mg 프로필렌 글리콜, 126.2 mg 글리세린, 2.34 mg 인산나트륨 일염기성 일수화물, 2.16 mg 인산나트륨 이염기성 칠수화물, 및 4.87 mg 염화나트륨을 함유하였다. pH는 6.2-6.8이었다. 재료는 균형 공기와 함께 옥타플루오로프로판(OFP) 가스(>80%)를 함유하는 헤드스페이스가 있는 밀봉된 바이알에 제공되었다.
MVT-100 제형에 의해 생성된 마이크로버블은 생리 식염수에 현탁되어 있는 동안에도 농도 및 크기 분포와 관련하여 시간이 지남에 따라 안정적으로 유지된다. MVT-100로 지칭되는 이러한 지질 블렌드는 ND 제조 및 ASO 결합을 위한 베이스 MB로 사용되었다. ASO에 결합하기 위해 뉴클레오사이드 인지질, 예를 들어 포스파티딜시티딘의 몰비를 달리하는 것이 추가되었다.
실시예 2. MB를 함유하고 ASO로 로딩한 포스파티딜시티딘의 제조.
형광 표지된 폴리-G(Alexa Fluor 488)를 통합 DNA 기술[Integrated DNA Technologies(IDT)]로부터 입수하고 지질 혼합물(0.75mg/ml, 73.8몰% DPPC, 9몰% DPPE, 6.3몰% DPPE-PEG5000 및 10몰% 16:0 CDP DG(시티딘 디포스페이트))에 첨가하였다. MB를 교반하여 제조하였다. 10 μl의 MB를 형광 표지된 poly-G의 다른 희석액과 함께 인큐베이션한 다음 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간의 인큐베이션 후, 결합되지 않은 형광 폴리-G를 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에서 원심분리(3분 동안 1500rpm)하여 제거하였다. 바닥의 투명한 액체는 주사기로 빼냈고, 위쪽의 유백색 MB 층은 신선한 PBS에 재현탁되었다. 이 작업은 3번 수행되었다.
실시예 3. 포스파티딜시티딘을 포함하거나 포함하지 않는 MB에 대한 ASO의 결합.
ASO에 결합된 MB의 분취량을 96 블랙 웰 플레이트에 시딩하고(seed), Ex λ = 488 nm, Em λ = 525 nm에서 플레이트 판독기(Molecular Devices, SpectraMax M3)를 사용하여 형광 강도를 측정하였다. ASO에 결합된 MB의 분취량을 폴리-d-리신 코팅된 유리 바닥 접시(Mat Tek, Ashland, MA)에 시딩하고, 그것들이 표면에 부착되도록 하였다. 형광성 MB는 레이카(Leica) DMI6000 다기능 전동 도립 현미경을 사용하여 현미경으로 관찰되었다.
실시예 4. 포스파티딜시티딘을 포함하거나 포함하지 않는 나노액적의 제조.
전매(proprietary) 비-임계 부형제를 갖는 MVT-100을 기반으로 하는 퍼플루오로프로판(PFP) MB를 -17 ℃ 및 50 PSI에서 5분 동안 에틸렌글리콜 수조에서 인큐베이션하여 저온에서 응축하였다. MB는 희끄무레한 거품으로 나타났으나, 응축 과정 후, ND는 연한 푸른빛을 띤 반투명 에멀젼으로 나타났다. 생성된 ND는 헤드스페이스에서 평균 입자 크기 = 830 nm 및 PFP 농도 = 90%를 갖는 모 MVT-100MB와 비교하여, 평균 입자 크기 = 600 nm 및 PFP 농도 = 90%를 가졌다.
실시예 5. 세포와 포스파티딜시티딘 MB의 인큐베이션
ASO에 결합된 MB의 분취량을 인간 상피 결장직장 선암종 세포(CaCo2)에 첨가하였다. 세포는 20%의 태아 소 혈청 및 1%의 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 ATCC-제형 이글스 최소 필수 배지(EMEM)를 사용하여 T25 플라스크에서 성장되었다. 세포를 5% 이산화탄소, 37℃의 가습 분위기에서 인큐베이션하였다. 컨플루언스 후, 세포를 트립신으로 분리하고 폴리-d-리신 코팅된 유리 바닥 접시로 옮긴 다음, 이어서 인큐베이션하고 부착을 보장하기 위해 추가로 24시간 동안 인큐베이션하였다. MB를 첨가하고 세포와 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 후, 세포를 세척하여 결합되지 않은 형광성 MB를 제거하였다. 세포는 레이카 DMI6000 다기능 전동 도립 현미경을 사용하여 현미경으로 관찰되었다.
예언적 실시예 1. 4개의 상이한 뉴클레오사이드 지질을 함유하는 MB의 제조.
10몰%의 지질이 4개의 상이한 뉴클레오사이드 지질로 대체된 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 지질로부터 MB를 제조하였다. 도 6에 도시된 합성 계획에 따라, 포스파티딜-시티딘, 아데닌, 티민 및 구아닌을 제조하였다. 대응하는 각각의 포스파티딜 뉴클레오사이드를 HPLC로 정제하였다. 총 포스파티딜 뉴클레오사이드의 총 몰%가 10몰%가 되도록, 각각의 포스파티딜 뉴클레오사이드 모이어티를 2.5몰%로 제형에 첨가하였다. 생성된 MB는 ASO에 강력하게 결합하는 것으로 나타났다. 혈청 안정성 분석은 포스파티딜 뉴클레오사이드를 함유한 MB가 MB가 없는 ASO에 비해 안정성에서 상당한 개선을 제공함을 보여주었다.
예언적 실시예 2. 4개의 상이한 뉴클레오사이드 지질을 함유하는 ND의 제조.
MB는 예언적 실시예 1에서와 같이 제조되었다. 생성된 MB는 실시예 4에서와 같이 감소된 온도 및 증가된 압력에 노출되었다. 그 다음, ND는 ASO와 함께 인큐베이션되었다.
예언적 실시예 3. ASO 전달을 위한 E-셀렉틴에 타겟팅된 ND(tND)의 제조.
E-셀렉틴 결합 펩티드의 생체접합체는 DSPE-PEG-말레이미드 및 DK12-OH 펩티드로부터 제조되어, 결과적인 생체접합체를 생성한다. 생체접합체를 정제하기 위해 HPLC를 수행하고 구조를 확인하기 위해 질량분석을 수행한다. tND를 만들기 위해, 전형적으로 1몰%의 생체접합체는 76몰%의 DPPC 및 7몰%의 DPPE-MPEG(5000) 및 7몰%의 DPPE 및 예언적 실시예 1에 기술된 10몰%의 뉴클레오사이드 포스파티딜콜린 지질과 혼합된다. 지질은 완충 생리 식염수, 프로필렌 글리콜 및 글리세롤 76/7/7/10 몰 비율의 희석제에 용해된다. 투명한 지질 혼합물을 옥타플루오로프로판 가스로 채워진 밀봉된 바이알에 넣는다. ND 제형은 ND 제제의 균일성을 보장하기 위해 각각 Accusizer™ 780(Particle Sizing Systems, Port Richey, FL) 및 NanoBrook 90 Plus(Brookhaven)를 사용하여 입자 크기 및 농도에 대해 특성화된다. 다른 제형에서의 퍼플루오로프로판의 농도는 라만 분광법(DXR2 Smart Raman, ThermoScientific)에 의해 측정된다. 포스포로티오에이트 유사체로서, E-셀렉틴 및 ICAM-1에 대한 ASO는 ND와 함께 인큐베이션되고, 결합되지 않은 ASO는 투석된다. 생성된 ND는 E-셀렉틴을 타겟으로 하며, 포도막염, 관절염 및 기타 관련 질환과 같은 염증 질환를 줄이는 데 유용하다.
예언적 실시예 4. ASO에 결합하는 리포솜의 제조.
예언적 실시예 4에 기재된 지질은 리포솜을 생성하는데 사용된다. 이러한 적용을 위해, 플루오르카본 가스가 사용되지 않는다. 지질이 다시 수화된 후, 리포좀은 동결-해동에 이어 리포좀 압출에 의해 생성된다. ASO는 리포솜에 추가되고, 결합되지 않은 ASO는 투석에 의해 제거된다. E-셀렉틴을 타겟으로 하는 생성된 리포솜은 ASO를 염증 병태에 전달하는 데 유용하다.
실시예 5. ASO 결합에 유용한 에멀젼의 제조.
도 7a 및 도 7b의 중성 지질은 시티디닐, 아데닌, 티민 및 구아닌 헤드기로 제조된다. 지질은 추가 지질 없이 제형화되어 미셀을 형성한다. ASO는 생성된 미셀에 추가되어, 복합체를 형성한다.
예언적 실시예 6. 리보스 부반응을 제거하기 위한 뉴클레오사이드 지질의 제조.
도 8에 도시된 뉴클레오사이드 지질이 생성되고 HPLC로 정제된다. 생성된 뉴클레오사이드 지질은 ASO를 결합하는 데 유용하다.
예언적 실시예 7. 포도막염 환자의 영상화 및 치료.
ND는 시티디닐, 아데닌, 티민 및 구아닌 헤드기를 갖는 10몰%의 뉴클레오사이드 지질을 함유하여 상기와 같이 제조된다. E-셀렉틴 및 ICAM-1에 대한 ASO가 ND에 첨가되어 결합된다. ND는 미량의 형광단 DiO를 포함한다. 약 1010 ND 및 E-셀렉틴과 ICAM-1에 대한 ASO 각각 약 2mg을 함유하는 약 2.5ml의 용액을 포도막염 환자에게 IV 주사한다. 안저경 검사는 염증이 있는 망막에서 ND의 흡수를 보여준다. 20MHz 변환기를 사용한 초음파 영상은 ND가 눈의 염증 부위로 흡수되었음을 보여준다. 그 다음, 1.0MHz 변환기를 720밀리와트의 전력 레벨에서 사용하여 ND/MB를 공동화하여(cavitate), 염증이 있는 내피 세포 및 대식세포의 엔도좀으로부터 ASO를 방출한다. E-셀렉틴 타겟화된 MB를 사용한 2주 후의 추적 영상은 염증 감소를 반영하는 훨씬 적은 흡수를 보여준다.
예언적 실시예 8. 폐 전달 및 폐질환의 치료
뉴클레오사이드 지질로 제조된 마이크로버블 및 리포솜은 폐 질환 치료에 유용하다.
A. 중성 뉴클레오사이드 지질은 지질들 디팔미톨리포샤티딜콜린(DDPC), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE) 및 DPPE-PEG(5,000)와 혼합된다. 지질의 최종 농도는 약 10-20몰%의 뉴클레오사이드 지질 및 80-90몰%의 DPPC, DPPE 및 DPPE-PEG이다. 비-뉴클레오사이드 지질의 비율은 약 82몰%의 DPPC, 10몰%의 DPPE 및 8몰%의 DPPE-PEG이다. 지질은 10 v/vol% 프로필렌 글리콜 및 10 w/vol% 글리세롤과 함께 약 80 w/vol%의 생리 식염수를 포함하는 액체에서 현탁된다. 총 지질 = ml당 약 2mg이고, 퍼플루오로부탄의 헤드 스페이스를 갖는 1.5ml 부피의 유리 휘튼(Wheaton) 바이알에 넣고, 바이알을 밀봉한다. 바이알을 혼합기 장치에서 약 4,500RPM의 속도로 진탕하여, 뉴클레오사이드 지질이 약 10 내지 20몰%인 마이크로버블을 생성한다. 그 다음, 마이크로버블을 TGF-β mRNA를 타겟으로 하는 안티-센스 올리고뉴클레오티드 w/vol와 함께 대략 1:1 중량/부피의 지질과 혼합하고, 부드럽게 교반한 다음 초음파 분무기를 통해 특발성 폐 섬유증을 앓고 있는 환자에게 투여한다. 환자는 안티-센스 올리고뉴클레오티드를 운반하는 분무된 마이크로버블을 흡입한다. 여러 번 치료를 시행하여 몇 개월에 걸쳐 질병을 호전시킨다.
B. 안티-센스 올리고뉴클레오티드(ASO)가 바이알 내의 지질의 수성 현탁액에 첨가되고, 마이크로버블이 형성됨에 따라 마이크로버블이 ASO에 결합하도록 교반 단계가 반복되는 것을 제외하고는, 상기 단계가 실질적으로 반복된다.
C. 지질을 프로필렌 글리콜에 용해시키고, ASO와 함께 55℃로 가열하고, 0.2 미크론 필터를 통해 여과한 것을 제외하고는, 상기 실시예 A의 단계가 실질적으로 반복된다. 그 다음, 재료를 사용하여 바이알을 채우고 퍼플루오로부탄 가스로 밀봉한다. 생성된 생성물은 본질적으로 무수이다. 바이알을 45초 동안 약 4,500 RPM으로 진탕한 다음, 약 80% w/vol의 식염수와 약 10% w/vol의 글리세롤을 바이알에 주입하여, 마이크로버블을 다시 수화한다. 물질을 바이알 내에서 부드럽게 교반하여 주사기를 통해 빼내고 환자에게 투여하기 위해 초음파 분무기에 넣는다.
출원인의 개시 내용은 도면을 참조하여 바람직일 실시예에서 설명되며, 동일한 번호는 동일하거나 유사한 요소를 나타낸다. 본 명세서 전체에 걸쳐서, "일 실시예", "실시예" 또는 유사한 언어는 실시예와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐서, "일 실시예에서", "실시예에서" 및 유사한 언어와 같은 표현은 반드시 동일일 실시예를 지칭할 수도 있지만, 반드시 그러한 것이 아닐 수 있다.
출원인의 개시 내용의 설명된 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시예에서 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있다. 본 명세서의 설명에서, 다수의 특정 세부 사항이 본 발명의 실시예들의 완전한 이해를 제공하기 위해 인용된다. 그러나, 관련 기술 분야의 당업자는 하나 이상의 특정 세부 사항 없이도, 또는 다른 방법, 구성 요소, 재료 등과 함께, 출원인의 구성 및/또는 방법이 실시될 수 있음을 인식할 것이다. 다른 예들에서, 공지된 구조들, 재료들 또는 동작들은 본 개시 내용의 모한일 측면들을 피하기 위해 상세히 도시되거나 설명되지 않는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에 명백하게 달리 지시되어 있지 않는 한, 복수 기준을 포함한다.
구체적으로 언급되지 않거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 용어 "약"은 예를 들어, 평균의 2 표준 편차 내에서 당업계의 정상적인 허용 오차 범위 내로 이해된다. 약은 명시된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다. 문맥상 명백하지 않는 한, 여기에 제공된 모든 수치는 약이라는 용어로 변경될 수 있다.
구체적으로 언급되지 않거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다.
구성 및 방법을 정의하는 데 사용되는 용어 "포함하는"은 구성 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만 다른 요소를 배제하지 않음을 의미하도록 의도된다. 구성 및 방법을 정의하는 데 사용되는 "필수적으로 구성되는"이라는 용어는 구성 및 방법이 인용된 요소를 포함하고 구성 및 방법에 본질적으로 중요한 다른 요소를 배제함을 의미한다. 예를 들어, "필수적으로 구성되는"은 명시적으로 언급된 약리학적 활성제의 투여를 지칭하고 명시적으로 언급되지 않은 약리학적 활성제는 제외한다. 필수적으로 구성되는이라는 용어는 약리학적으로 비활성이거나 불활성인 제제, 예를 들어 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 배제하지 않는다. 구성 및 방법을 정의하는 데 사용되는 용어 "구성된"은 다른 성분의 미량 원소 및 실질적인 방법 단계를 배제하는 것을 의미한다. 이러한 과도(transition) 용어 각각에 의해 정의된 실시예는 본 발명의 범위 내에 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 개시 내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기술되어 있다. 본 명세서에 인용된 방법은 개시된 특정 순서에 추가하여 논리적으로 가능한 임의의 순서로 수행될 수 있다.
참조로 포함됨
특허, 특허 출원, 특허 공보, 저널, 서적, 논문, 웹 컨텐츠와 같은 다른 문서에 대한 참조 및 인용이 본 개시 내용에 기재되어있다. 모든 상기 문헌은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고 문헌으로 포함된다. 여기에 참조로 포함되었으나, 여기에 명시적으로 제시된 기존 정의, 진술 또는 기타 공개 자료와 충돌하는 모든 자료 또는 그 일부는 통합된 자료와 본 발명의 자료 간에 충돌이 발생하지 않는 범위 내에서만 통합된다. 충돌이 발생하는 경우, 그러한 충돌은 우선적인 개시사항으로서 본 발명의 개시내용에 유리하게 해석되어야 한다.
등가물
대표적인 실시예는 본 발명을 예시하는 것을 돕기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 또한 이들로 해석되어서는 안된다. 실제로, 여기에 도시되고 설명된 것 이외에, 본 발명의 다양한 변형 및 그 많은 실시예는 본 명세서의 전체 내용으로부터 당업자에게 명백하게 될 것이며, 본 발명은 실시예 및 과학적 및 특허 문헌에 대한 참조를 포함한다. 이 예들은 그 다양일 실시예들 및 그 등가물들에서 본 발명의 실시에 적용될 수 있는 중요한 추가 정보, 예시 및 지침을 포함한다.

Claims (37)

  1. 적어도 9개의 탄소 원자를 각각 갖는 하나 이상의 알킬 기에 공유 결합된, 하나 이상의 뉴클레오사이드, 또는 이의 유도체 또는 유사체, 또는 이들의 제약상 허용되는 형태를 포함하는 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오사이드, 또는 이의 유도체 또는 유사체는 디포스페이트 모이어티를 포함하는 연결 기를 통해 상기 하나 이상의 알킬 기에 공유 결합되는 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오사이드, 또는 이의 유도체 또는 유사체는 시토신, 아데닌, 구아닌, 우라실 및 티민으로부터 선택되는 하나 이상의 모이어티를 포함하는 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오사이드, 또는 이의 유도체 또는 유사체는 시토신, 아데닌, 구아닌, 우라실 및 티민으로부터 선택되는 둘 이상의 모이어티를 포함하는 화합물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오사이드, 또는 이의 유도체 또는 유사체는 시티딘, 아데노신, 5-메틸우리딘, 우리딘 및 구아노신으로부터 선택되는 하나 이상의 모이어티를 포함하는 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오사이드, 또는 이의 유도체 또는 유사체는 시티딘, 아데노신, 5-메틸우리딘, 우리딘 및 구아노신으로부터 선택되는 둘 이상의 모이어티를 포함하는 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 알킬 기는 각각 약 12 내지 약 24개의 탄소 원자를 갖는 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 약 12 내지 약 24개의 탄소 원자를 각각 갖는 2개의 알킬 기를 포함하는 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오사이드는 데옥시리보핵산을 포함하는 화합물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오사이드는 리보핵산을 포함하는 화합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오사이드는 전하 중성인 화합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 타겟팅 리간드를 추가로 포함하는 화합물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 타겟팅 리간드가 항체, 펩티드, 비타민 및 글리코펩티드로부터 선택되는 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 타겟팅 리간드가 항체인 화합물.
  15. 핵산 분자에 비-공유적으로 복합체화된 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 복합체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 핵산 분자가 단일 가닥 RNA 분자를 포함하는 복합체.
  17. 제15항에 있어서, 상기 핵산 분자가 DNA 분자를 포함하는 복합체.
  18. 제15항에 있어서, 상기 핵산 분자가 si-RNA 분자를 포함하는 복합체.
  19. 제15항에 있어서, 상기 핵산 분자가 CRISPR 구조체를 포함하는 복합체.
  20. 제15항에 있어서, 상기 핵산 분자가 안티-센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 복합체.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 조성물.
  22. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 미셀 또는 리포솜.
  23. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 마이크로버블.
  24. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 마이크로액적 또는 나노액적.
  25. 제22항의 미셀 또는 리포솜을 포함하는 조성물.
  26. 제23항의 마이크로버블을 포함하는 조성물.
  27. 제24항의 마이크로액적 또는 나노액적을 포함하는 조성물.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로버블, 마이크로액적, 나노액적, 미셀 또는 리포솜을 형성하기 위해 플루오로카본가 사용된 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 플루오로카본은 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄 및 퍼플루오로펜탄으로부터 선택되는 조성물.
  30. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 화합물, 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항의 복합체, 제22항의 미셀 또는 리포솜, 제23항의 마이크로버블, 또는 제24항의 마이크로액적 또는 나노액적, 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물
  31. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 화합물, 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항의 복합체, 제22항의 미셀 또는 리포솜, 제23항의 마이크로버블, 또는 제24항의 마이크로액적 또는 나노액적을 포함하는 약제학적 조성물, 또는 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 질병 또는 질환의 치료 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 질병 또는 질환은 안과 질환(포도막염, 망막염 및 망막 이영양증), 혈관 및 심장 질환, 암(급성 림프모구 백혈병, B-세포 림프종, 두경부 편평 세포 암종 및 다양한 종양 질환), 폐 질환, 알츠하이머병 및 기타 신경퇴행성 질환 및 지질단백질 리파제 결핍으로부터 선택되는 질병 또는 질환의 치료 방법.
  33. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 화합물, 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항의 복합체, 제22항의 미셀 또는 리포솜, 제23항의 마이크로버블, 또는 제24항의 마이크로액적 또는 나노액적을 포함하는 조성물, 또는 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체 투여하는 것을 포함하는 핵산 전달 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자의 전달을 활성화하기 위해, 빛, 자기, 전기 에너지 및 초음파 에너지로부터 선택된 에너지를 대상체의 타겟 부위에 인가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 인가된 에너지는 초음파 에너지인 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 폐 전달을 통하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 투여가 대상체의 폐로의 흡입을 통한 것인 방법.
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