JP2023505522A - Ｎａｄｈデヒドロゲナーゼタンパク質でレーベル遺伝性視神経症を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

提供されるのは、以下を含む組換え核酸である：ミトコンドリア標的化配列；ミトコンドリアタンパク質コード配列であって、ミトコンドリアタンパク質を含むポリペプチドをコードする、前記ミトコンドリアタンパク質コード配列；及び３’ＵＴＲ核酸配列。組換え核酸を含む医薬組成物、及びこの医薬組成物を使用してレーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）を治療する方法もまた提供される。【選択図】図５

Description

相互参照
本出願は、２０１９年１２月９日に出願された中国出願第ＣＮ２０１９１１２５００８２．４号の利益を主張し、これは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表に対する参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、これは参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年１２月４日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、ＷＮＢＴ－０１１＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前で、サイズは約３０３キロバイトである。
レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）とその軸索のミトコンドリア遺伝性（母親から子孫に伝達される）変性であり、中心視力の急性または亜急性の喪失につながる；これは主に若い成人男性に発症する。ＬＨＯＮは、主にミトコンドリア（核ではない）ゲノムの変異に起因しており、卵子のみが胚にミトコンドリアを提供するので、母親を介してのみ感染する。ＬＨＯＮは通常、３つの病原性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）点変異の１つが原因である。これらの変異は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット－４タンパク質（ＮＤ４）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット－１タンパク質（ＮＤ１）及びミトコンドリアの酸化的リン酸化鎖の複合体ＩのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット－６タンパク質（ＮＤ６）サブユニット遺伝子のヌクレオチド位置１１７７８ Ｇ→Ａ（Ｇ１１７７８Ａ）、３４６０ Ｇ→Ａ（Ｇ３４６０Ａ）、及び１４４８４ Ｔ→Ｃ（Ｔ１４４８４Ｃ）にそれぞれある。それぞれの変異は、永久に視力を失うという重大なリスクがあると考えられている。通常、両眼視力が０．１未満に悪化するまで、数週間から数か月以内に痛みを伴わずに進行し、患者の生活の質に深刻な影響を及ぼす。２つのＬＨＯＮ変異体、Ｇ３４６０Ａ及びＴ１４４８４Ｃは、患者の血小板単離ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を８０％低下させる。中国のＬＨＯＮ患者の９０パーセントはＧ１１７７８Ａ変異を保有する。Ｇ１１７７８Ａ変異は、ＮＤ４タンパク質でアルギニンをヒスチジンに変化させ、ＬＨＯＮ患者の機能障害及び視神経損傷を引き起こす。より高いトランスフェクション効率及び治療効果でＬＨＯＮを治療するための組成物及び方法を開発する必要がある。
ここに、組換え核酸、医薬組成物、及びＬＨＯＮを治療するための方法を開示した。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、以下を含む組換え核酸である：配列番号１１または１２と少なくとも９９％同一である配列を含むミトコンドリアタンパク質コード配列；及び３’ＵＴＲ核酸配列。
いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号１２９～１５９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリアタンパク質コード配列は、配列番号１２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリアタンパク質コード配列は、配列番号１１に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番号１１１～１２５からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番号１３または配列番号１４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号２５～２８、３９～４２、５３～５６、６７～７０、及び８１～８４からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、ミトコンドリア標的化配列；配列番号１１または１２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むミトコンドリアタンパク質コード配列；及び３’ＵＴＲ核酸配列；を含む組換え核酸を提供する。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＣＯＸ８、ｓｃＲＰＭ２、ｌｃＳｉｒｔ５、ｔｂＮＤＵＳ７、ｎｃＱＣＲ２、ｈｓＡＴＰ５Ｇ２、ｈｓＬＡＣＴＢ、ｓｐｉｌｖ１、ｇｍＣＯＸ２、ｃｒＡＴＰ６、ｈｓＯＰＡ１、ｈｓＳＤＨＤ、ｈｓＡＤＣＫ３、ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＡＴＰ９（ｎｃＡＴＰ９）、ｈｓＧＨＩＴＭ、ｈｓＮＤＵＦＡＢ１、ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＤＣＫ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ＧＮＦＰ＿ｎｃＡＴＰ９、及びｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｌｃＳｉｒｔ５＿ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ２＿ｎｃＡＴＰ９からなる群より選択されるポリペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号１２９～１５９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号２または３に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲ核酸配列は、前記ミトコンドリア標的化配列の３’に位置する。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲ核酸配列は、ｈｓＡＣＯ２、ｈｓＡＴＰ５Ｂ、ｈｓＡＫ２、ｈｓＡＬＤＨ２、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＵＱＣＲＦＳ１、ｈｓＮＤＵＦＶ１、ｈｓＮＤＵＦＶ２、ｈｓＳＯＤ２、ｈｓＣＯＸ６ｃ、ｈｓＩＲＰ１、ｈｓＭＲＰＳ１２、ｈｓＡＴＰ５Ｊ２、ｒｎＳＯＤ２、及びｈｓＯＸＡ１Ｌからなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番号１１１～１２５からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番号１３または配列番号１４に記載されている配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、前記３’ＵＴＲ核酸配列の５’に位置する。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、前記ミトコンドリア標的化配列の３’に位置する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号２５～２８、３９～４２、５３～５６、６７～７０、及び８１～８４からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリアタンパク質コード配列は、配列番号１６２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むかまたはそれらの配列からなるミトコンドリアタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態において、本開示は、ミトコンドリアタンパク質コード配列を含む組換え核酸を提供し、前記ミトコンドリアタンパク質コード配列は、ミトコンドリアタンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記ミトコンドリアタンパク質コード配列は、配列番号１１または１２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ミトコンドリア標的化配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＣＯＸ８、ｓｃＲＰＭ２、ｌｃＳｉｒｔ５、ｔｂＮＤＵＳ７、ｎｃＱＣＲ２、ｈｓＡＴＰ５Ｇ２、ｈｓＬＡＣＴＢ、ｓｐｉｌｖ１、ｇｍＣＯＸ２、ｃｒＡＴＰ６、ｈｓＯＰＡ１、ｈｓＳＤＨＤ、ｈｓＡＤＣＫ３、ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＡＴＰ９（ｎｃＡＴＰ９）、ｈｓＧＨＩＴＭ、ｈｓＮＤＵＦＡＢ１、ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＤＣＫ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ＧＮＦＰ＿ｎｃＡＴＰ９、及びｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｌｃＳｉｒｔ５＿ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ２＿ｎｃＡＴＰ９からなる群より選択されるポリペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号１２９～１５９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、この組換え核酸はさらに、３’ＵＴＲ核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲ核酸配列は、前記ミトコンドリア標的化配列の３’に位置する。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲ核酸配列は、ｈｓＡＣＯ２、ｈｓＡＴＰ５Ｂ、ｈｓＡＫ２、ｈｓＡＬＤＨ２、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＵＱＣＲＦＳ１、ｈｓＮＤＵＦＶ１、ｈｓＮＤＵＦＶ２、ｈｓＳＯＤ２、ｈｓＣＯＸ６ｃ、ｈｓＩＲＰ１、ｈｓＭＲＰＳ１２、ｈｓＡＴＰ５Ｊ２、ｒｎＳＯＤ２、及びｈｓＯＸＡ１Ｌからなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番号１１１～１２５からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番号１３または配列番号１４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、前記３’ＵＴＲ核酸配列の５’に位置する。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア標的化配列は、前記ミトコンドリア標的化配列の３’に位置する。いくつかの実施形態において、この組換え核酸は、配列番号２５～２８、３９～４２、５３～５６、６７～７０、及び８１～８４からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の組換え核酸を含むウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６ベクターからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶ２ベクターである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される任意の組換え核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む医薬組成物である。ある場合には、この医薬組成物は医薬的に許容されるその賦形剤をさらに含む。本明細書に開示されるウイルスベクター、及びその薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物であって、ここで、このウイルスベクターは、本明細書に開示される任意の組換え核酸を含む医薬組成物も開示される。
場合によっては、薬学的に許容される賦形剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、α，α－トレハロース二水和物、Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ポロキサマー１８８、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。場合によっては、薬学的に許容される賦形剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、α，α－トレハロース二水和物、Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ポロキサマー１８８、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される。場合によっては、薬学的に許容される賦形剤はポロキサマー１８８を含む。場合によっては、薬学的に許容される賦形剤は、０．０００１％～０．０１％のポロキサマー１８８を含む。場合によっては、薬学的に許容される賦形剤は、０．００１％のポロキサマー１８８を含む。場合によっては、薬学的に許容される賦形剤は、１つ以上の塩をさらに含む。場合によっては、１つ以上の塩はＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、及びＫＨ２ＰＯ４を含む。場合によっては、１つ以上の塩は８０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、及び５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４を含む。場合によっては、医薬組成物は、６～８のｐＨである。場合によっては、医薬組成物のｐＨは７．２～７．４である。場合によっては、医薬組成物のｐＨは７．３である。場合によっては、医薬組成物は少なくとも１．０×１０１０ｖｇ／ｍＬのウイルス力価を有する。場合によっては、医薬組成物は少なくとも５．０×１０１０ｖｇ／ｍＬのウイルス力価を有する。
場合によっては、医薬組成物を５回の凍結／解凍サイクルに供して、この医薬組成物は、この５回の凍結／解凍サイクル前のウイルス力価と比較して、ウイルス力価の少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％を保持する。場合によっては、レーベル遺伝性視神経症の患者に医薬組成物を投与すると、組換え核酸を含まない同等の医薬組成物よりも高い平均視力回復が得られる。場合によっては、レーベル遺伝性視神経症の患者に医薬組成物を投与すると、配列番号１５に示される組換え核酸を含む同等の医薬組成物よりも高い平均視力回復が得られる。
別の態様では、本明細書に開示されるのは、眼障害を治療する方法であって、本明細書に開示される任意の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法である。場合によっては、眼の障害はレーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）である。場合によっては、この方法は、医薬組成物を患者の片方または両方の眼に投与することを含む。場合によっては、医薬組成物は、筋肉内注射または皮下注射で投与される。場合によっては、医薬組成物は、硝子体内注射で投与される。場合によっては、約０．０１～０．１ｍＬの医薬組成物が、硝子体内注射で投与される。場合によっては、約０．０５ｍＬの医薬組成物が、硝子体内注射で投与される。
場合によっては、この方法は、メチルプレドニゾロンを患者に投与することをさらに含む。場合によっては、メチルプレドニゾロンは、医薬組成物の硝子体内注射の前に投与される。場合によっては、メチルプレドニゾロンを経口投与する。場合によっては、メチルプレドニゾロンは、医薬組成物の硝子体内注射の前に、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日間毎日投与される。場合によっては、メチルプレドニゾロンが毎日投与される。場合によっては、約３２ｍｇ／６０ｋｇのメチルプレドニゾロンの１日用量が投与される。場合によっては、メチルプレドニゾロンは、医薬組成物の硝子体内注射の後に投与される。場合によっては、この方法は、クレアチンリン酸ナトリウムを患者に投与することをさらに含む。場合によっては、クレアチンリン酸ナトリウムが静脈内投与される。場合によっては、メチルプレドニゾロンは静脈内にまたは経口で投与される。場合によっては、この方法は、メチルプレドニゾロンを少なくとも１日間静脈内投与し、その後、メチルプレドニゾロンを少なくとも１週間経口投与することを含む。場合によっては、この方法は、メチルプレドニゾロンを約３日間静脈内投与し、その後、メチルプレドニゾロンを少なくとも約６週間経口投与することを含む。場合によっては、メチルプレドニゾロンは、約８０ｍｇ／６０ｋｇの１日用量で静脈内投与される。場合によっては、この医薬組成物を投与すると、組換え核酸を含まない同等の医薬組成物よりも高い平均視力回復が得られる。場合によっては、この医薬組成物を投与すると、配列番号２５に示される組換え核酸を含む同等の医薬組成物よりも高い平均視力回復が得られる。
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されている場合と同じ程度で、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に特に記載される。本発明の特徴及び長所のよりよき理解は、図解実施形態を明らかにする以下の詳細な記述を参照することによって得られ、その中で、発明の原理が利用され、以下の図面が付随する。
最適化されていないＮＤ１遺伝子のコドン使用頻度を示している。 最適化されたＮＤ１遺伝子のコドン使用頻度を示す。 最適化されたｏｐｔ＿ＮＤ１遺伝子（配列番号１２）及びＮＤ１遺伝子（配列番号１１）の配列アラインメントを示している。 ＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ１（配列番号１６８）及びＣＯＸ１０－ＮＤ１（配列番号１６９）の配列アラインメントを示す。 ヒトＨＥＫ２９３細胞におけるＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ１構築物及びＣＯＸ１０－ＮＤ１構築物のタンパク質発現レベル分析を示す。上図はウエスタンブロッティング結果を示し、下図は分析結果を示す棒グラフである。 ＮＤ１タンパク質のミトコンドリア局在化アッセイを示しており、緑色蛍光シグナル（左）、マイトトラッカー（Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ）シグナル（中央）、及びマージされたシグナル（右）を示し、これがミトコンドリアの共局在化を示している。 ｒＡＡＶ２－ＮＤ１で形質導入されたＨＥＫ２９３細胞におけるＮＤ１発現ダイナミクスを示す。 ｒＡＡＶ２－ＮＤ１を硝子体内注射されたＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＮＤ１ ｍＲＮＡ発現レベルの変化を示している。 ＡＡＶ２－ＮＤ１で形質導入されたＨＥＫ２９３細胞におけるＮＤ１タンパク質発現レベルを示している。 ｒＡＡＶ２－ＮＤ１を硝子体内注射したウサギのサイトカイン発現分析（注射後１ヶ月及び注射後２ヶ月）を示している。
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び材料を、本明細書の製剤または単位用量の実施または試験において使用し得るが、いくつかの方法及び材料をここで記載する。特に明記しない限り、本明細書で使用または企図される技術は、標準的な方法論である。材料、方法、及び例は、例示に過ぎず、限定的ではない。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ある、１つの（ａ：不定冠詞）」、「及び」、及び「この、その（ｔｈｅ：定冠詞）」は、その文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。このため、例えば、「化合物」への言及は、複数のそのような因子を含み、「塩」への言及は、１つ以上の塩に対する（または複数の塩に対する）及び当業者に公知のそれらの同等物などへの言及を含む。
本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「または」という用語は、接続語であっても、または離接語であってもよい。別段に示されない限り、いずれの実施形態も、いずれかの他の実施形態と組み合わされてもよい。
本明細書において用いる場合、他のいずれかに示す限り、一部の本発明の実施形態は、数値範囲を企図している。範囲が存在するとき、その範囲は、その範囲の端点を含む。さらに、その範囲内のあらゆる下位範囲及び値が、あたかも明確に書き出されているかのように存在する。
参照数値に関連する「約」という用語及びその文法的同等物、ならびに本明細書で使用されるその文法的同等物は、値の範囲±１０％など、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の値の範囲を含んでもよい。例えば、「約１０」という量は、９～１１の量を含む。
「含む」という用語（及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「有している（ｈａｖｉｎｇ）」または「含んでいる、包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの関連する用語）は、他の特定の実施形態では、例えば、本明細書に記載の物質の任意の組成物、組成、方法、またはプロセスなどの実施形態は、記載された特徴「からなる」または「から本質的になる」を除外するものではない。
「対象」という用語は、治療、観察、または実験の対象であったか、または対象となる哺乳動物を指す。「哺乳動物」という用語は、その標準的な意味を持つことを意図しており、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ、及びウシを含む。本明細書に記載の方法は、ヒトの治療及び獣医の用途の両方で有用であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
「治療する」または「治療」という用語は、本明細書に開示される少なくとも１つの化合物またはその薬学的に許容される塩を、そのような投与を必要とする哺乳動物対象、特にヒト対象へ投与することを含み、（ｉ）がんなどの疾患の臨床症状の発生を阻止すること、（ｉｉ）がんなどの疾患の臨床症状の退行をもたらすこと、及び／または（ｉｉｉ）がんなどの疾患の発症を予防するための予防的治療、を含む。
本明細書に記載の化学物質の「治療有効量」という用語は、ヒトまたは非ヒト対象に投与された場合に、症状の改善、疾患進行の遅延、または疾患の予防などの治療的利益を提供するのに有効な量を指す。
本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は交換可能に使用され得る。
核酸及びポリペプチド配列
表１は、本明細書に開示される全ての核酸及びポリペプチド配列を開示する。最初の列は、各配列の配列番号を示す。第２の列は、核酸またはポリペプチド構築物について説明している。例えば、構築物ＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ１－３’ＵＴＲ（配列番号２７）は、ＣＯＸ１０（配列番号１）、ｏｐｔ＿ＮＤ１（配列番号１２）、及び３’ＵＴＲ（配列番号１３）（５’→３’）の核酸配列を組み合わせた核酸（核酸配列間にリンカーがない）である。
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アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト及びいくつかの他の霊長類の種に感染する小さなウイルスである。本明細書に開示される組成物は、最初に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムまたはその誘導体を含む。
ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶウイルス粒子の産生に必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列である。これらの機能としては、ＡＡＶゲノムのＡＡＶウイルス粒子へのキャプシド形成を含む、宿主細胞におけるＡＡＶの複製及びパッケージングサイクルで作動する機能が挙げられる。自然に発生するＡＡＶウイルスは複製が不十分であり、複製とパッケージングのサイクルを完了するためにトランスでヘルパー機能を提供することに依存する。したがって、本発明のベクターのＡＡＶゲノムは、典型的には複製欠損である。
ＡＡＶゲノムは、一本鎖の形、ポジティブセンスまたはネガティブセンスのいずれか、あるいは二本鎖の形であってもよい。二本鎖型を使用すると、標的細胞でのＤＮＡ複製ステップをバイパスし得るので、導入遺伝子の発現を促進できる。
ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶの任意の天然由来の血清型または分離株またはクレードに由来し得る。したがって、ＡＡＶゲノムは、天然に存在するＡＡＶウイルスの完全なゲノムであり得る。当業者に知られているように、自然界で発生するＡＡＶウイルスは、様々な生物学的システムに従って分類され得る。
一般的に、ＡＡＶウイルスは血清型の観点で呼ばれる。血清型はＡＡＶのバリアント亜種に対応し、キャプシド表面抗原の発現プロファイルにより、他のバリアント亜種と区別するために使用され得る独特の反応性を有する。通常、特定のＡＡＶ血清型を有するウイルスは、任意の他のＡＡＶ血清型に特異的な中和抗体と効率的に交差反応しない。ＡＡＶ血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、また、霊長類の脳から最近同定されたＲｅｃ２及びＲｅｃ３などの組換え血清型も挙げられる。いくつかの実施形態において、本開示の組換え核酸を含むＡＡＶウイルスは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される血清型を有する。
本発明で使用するためのＡＡＶの好ましい血清型はＡＡＶ２である。本発明で使用するために特に目的の他の血清型としては、網膜色素上皮などの眼の組織を効率的に形質導入するＡＡＶ４、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８が挙げられる。使用されるＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ４ではないＡＡＶ血清型である場合がある。ＡＡＶ血清型のレビューは、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ（Ｃｕｒｒ ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００５；５（３）；２９９－３１０）及びＷｕ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００６；１４（３）、３１６－３２７）に見出され得る。本発明で使用するためのＡＡＶゲノムの配列、またはＩＴＲ配列、ｒｅｐもしくはｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶゲノムのエレメントの配列は、ＡＡＶ全ゲノム配列についての以下のアクセッション番号から誘導され得る：アデノ随伴ウイルス１ ＮＣ＿００２０７７、ＡＦ０６３４９７；アデノ随伴ウイルス２ＮＣ＿００１４０１；アデノ随伴ウイルス３ＮＣ＿００１７２９；アデノ随伴ウイルス３ＢＮＣ＿００１８６３；アデノ随伴ウイルス４ＮＣ＿００１８２９；アデノ随伴ウイルス５Ｙ１８０６５、ＡＦ０８５７１６；アデノ随伴ウイルス６ＮＣ＿００１８６２；トリＡＡＶ ＡＴＣＣ ＶＲ－８６５ ＡＹ１８６１９８、ＡＹ６２９５８３、ＮＣ＿００４８２８；トリＡＡＶ株ＤＡ－１ＮＣ＿００６２６３、ＡＹ６２９５８３；ウシＡＡＶＮＣ＿００５８８９、ＡＹ３８８６１７。
ＡＡＶウイルスは、クレードまたはクローンの観点からも言及される場合がある。これは、天然由来のＡＡＶウイルスの系統発生関係を指し、通常、共通の祖先にまでさかのぼることができ、その全ての子孫を含むＡＡＶウイルスの系統発生の群を指す。さらに、ＡＡＶウイルスは、特定の分離株、すなわち自然界に見られる特定のＡＡＶウイルスの遺伝子分離株の観点から参照される場合がある。遺伝子分離株という用語は、他の天然に存在するＡＡＶウイルスとの限られた遺伝的混合を受けたＡＡＶウイルスの集団を表し、それによって遺伝子レベルで認識できるほど異なる集団を定義する。
本発明で使用され得るＡＡＶのクレード及び分離株の例としては、以下が挙げられる：クレードＡ：ＡＡＶ１ ＮＣ＿００２０７７、ＡＦ０６３３７、ＡＡＶ６ ＮＣ＿００１８６２、Ｈｕ．４８ ＡＹ５３０６１１、Ｈｕ ４３ ＡＹ５３０６０６、Ｈｕ ４４ ＡＹ５３０６０７、Ｈｕ ４６ ＡＹ５３０６０９；クレードＢ：Ｈｕ．１９ ＡＹ５３０５８４、Ｈｕ．２０ ＡＹ５３０５８６、Ｈｕ ２３ ＡＹ５３０５８９、Ｈｕ２２ ＡＹ５３０５８８、Ｈｕ２４ ＡＹ５３０５９０、Ｈｕ２１ ＡＹ５３０５８７、Ｈｕ２７ ＡＹ５３０５９２、Ｈｕ２８ ＡＹ５３０５９３、Ｈｕ ２９ ＡＹ５３０５９４、Ｈｕ６３ ＡＹ５３０６２４、Ｈｕ６４ ＡＹ５３０６２５、Ｈｕ１３ ＡＹ５３０５７８、Ｈｕ５６ ＡＹ５３０６１８、Ｈｕ５７ ＡＹ５３０６１９、Ｈｕ４９ ＡＹ５３０６１２、Ｈｕ５８ ＡＹ５３０６２０、Ｈｕ３４ ＡＹ５３０５９８、Ｈｕ３５ ＡＹ５３０５９９、ＡＡＶ２ ＮＣ＿００１４０１、Ｈｕ４５ ＡＹ５３０６０８、Ｈｕ４７ ＡＹ５３０６１０、Ｈｕ５１ ＡＹ５３０６１３、Ｈｕ５２ ＡＹ５３０６１４、Ｈｕ Ｔ４１ ＡＹ６９５３７８、Ｈｕ Ｓ１７ ＡＹ６９５３７６、Ｈｕ Ｔ８８ ＡＹ６９５３７５、Ｈｕ Ｔ７１ ＡＹ６９５３７４、Ｈｕ Ｔ７０ ＡＹ６９５３７３、Ｈｕ Ｔ４０ ＡＹ６９５３７２、Ｈｕ Ｔ３２ ＡＹ６９５３７１、Ｈｕ Ｔ１７ ＡＹ６９５３７０、Ｈｕ ＬＧ１５ ＡＹ６９５３７７；Ｃｌａｄｅ Ｃ：Ｈｕ９ ＡＹ５３０６２９、Ｈｕ１０ ＡＹ５３０５７６、Ｈｕ１１ ＡＹ５３０５７７、Ｈｕ５３ ＡＹ５３０６１５、Ｈｕ５５ ＡＹ５３０６１７、Ｈｕ５４ ＡＹ５３０６１６、Ｈｕ７ ＡＹ５３０６２８、Ｈｕ１８ ＡＹ５３０５８３、Ｈｕ１５ ＡＹ５３０５８０、Ｈｕ１６ ＡＹ５３０５８１、Ｈｕ２５ ＡＹ５３０５９１、Ｈｕ６０ ＡＹ５３０６２２、Ｃｈ５ ＡＹ２４３０２１、Ｈｕ３ ＡＹ５３０５９５、Ｈｕ１ ＡＹ５３０５７５、Ｈｕ４ ＡＹ５３０６０２ Ｈｕ２、ＡＹ５３０５８５、Ｈｕ６１ ＡＹ５３０６２３；Ｃｌａｄｅ Ｄ：Ｒｈ６２ ＡＹ５３０５７３、Ｒｈ４８ ＡＹ５３０５６１、Ｒｈ５４ ＡＹ５３０５６７、Ｒｈ５５ ＡＹ５３０５６８、Ｃｙ２ ＡＹ２４３０２０、ＡＡＶ７ ＡＦ５１３８５１、Ｒｈ３５ ＡＹ２４３０００、Ｒｈ３７ ＡＹ２４２９９８、Ｒｈ３６ ＡＹ２４２９９９、Ｃｙ６ ＡＹ２４３０１６、Ｃｙ４ ＡＹ２４３０１８、Ｃｙ３ ＡＹ２４３０１９、Ｃｙ５ ＡＹ２４３０１７、Ｒｈ１３ ＡＹ２４３０１３；Ｃｌａｄｅ Ｅ：Ｒｈ３８ ＡＹ５３０５５８、Ｈｕ６６ ＡＹ５３０６２６、Ｈｕ４２ ＡＹ５３０６０５、Ｈｕ６７ ＡＹ５３０６２７、Ｈｕ４０ ＡＹ５３０６０３、Ｈｕ４１ ＡＹ５３０６０４、Ｈｕ３７ ＡＹ５３０６００、Ｒｈ４０ ＡＹ５３０５５９、Ｒｈ２ ＡＹ２４３００７、Ｂｂ１ ＡＹ２４３０２３、Ｂｂ２ ＡＹ２４３０２２、Ｒｈ１０ ＡＹ２４３０１５、Ｈｕ１７ ＡＹ５３０５８２、Ｈｕ６ ＡＹ５３０６２１、Ｒｈ２５ ＡＹ５３０５５７、Ｐｉ２ ＡＹ５３０５５４、Ｐｉ１ ＡＹ５３０５５３、Ｐｉ３ ＡＹ５３０５５５、Ｒｈ５７ ＡＹ５３０５６９、Ｒｈ５０ ＡＹ５３０５６３、Ｒｈ４９ ＡＹ５３０５６２、Ｈｕ３９ ＡＹ５３０６０１、Ｒｈ５８ ＡＹ５３０５７０、Ｒｈ６１ ＡＹ５３０５７２、Ｒｈ５２ ＡＹ５３０５６５、Ｒｈ５３ ＡＹ５３０５６６、Ｒｈ５１ ＡＹ５３０５６４、Ｒｈ６４ ＡＹ５３０５７４、Ｒｈ４３ ＡＹ５３０５６０、ＡＡＶ８ ＡＦ５１３８５２、Ｒｈ８ ＡＹ２４２９９７、Ｒｈ１ ＡＹ５３０５５６；Ｃｌａｄｅ Ｆ：Ｈｕ１４（ＡＡＶ９） ＡＹ５３０５７９、Ｈｕ３１ ＡＹ５３０５９６、Ｈｕ３２ ＡＹ５３０５９７、Ｃｌｏｎａｌ Ｉｓｏｌａｔｅ ＡＡＶ５ Ｙ１８０６５、ＡＦ０８５７１６、ＡＡＶ ３ ＮＣ＿００１７２９、ＡＡＶ ３Ｂ ＮＣ＿００１８６３、ＡＡＶ４ ＮＣ＿００１８２９、Ｒｈ３４ ＡＹ２４３００１、Ｒｈ３３ ＡＹ２４３００２、Ｒｈ３２ ＡＹ２４３００３。
当業者は、それらの一般的な知識に基づいて、本発明で使用するための適切な血清型、クレード、クローンまたはＡＡＶの単離物を選択し得る。例えば、ＡＡＶ５キャプシドは、遺伝性の色覚異常の矯正に成功したことからも明らかなように、霊長類の錐体光受容体を効率的に形質導入することが示されている（Ｍａｎｃｕｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００９，４６１：７８４－７）。
しかしながら、本発明はまた、まだ同定も特徴付けられてもいない可能性がある他の血清型のＡＡＶゲノムの使用も包含することを理解されたい。ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶウイルスの感染（または向性）の組織特異性を決定する。したがって、本発明に従って患者に投与されるＡＡＶウイルスで使用するための好ましいＡＡＶ血清型は、ＬＨＯＮの眼内の標的細胞の感染に対する自然な向性または高い効率を有する血清型である。したがって、患者に投与されるＡＡＶウイルスで使用するためのＡＡＶ血清型は、神経感覚網膜及び網膜色素上皮の細胞に感染する血清型であり得る。
通常、天然由来の血清型または分離株のＡＡＶゲノム、またはＡＡＶのクレードは、少なくとも１つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲ配列はシスで作用して複製の機能的起点を提供し、細胞のゲノムからのベクターの組み込み及び切除を可能にする。好ましい実施形態では、１つ以上のＩＴＲ配列は、ＮＤ４、ＮＤ６、もしくはＮＤ１またはそれらのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列に隣接する。好ましいＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２の配列及びそのバリアントである。ＡＡＶゲノムはまた、典型的には、ＡＡＶウイルス粒子のパッケージング機能をコードするｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子などのパッケージング遺伝子も含む。ｒｅｐ遺伝子は、タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０またはそれらのバリアントの１つ以上をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３またはそれらのバリアントなどの１つ以上のキャプシドタンパク質をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶウイルス粒子のキャプシドを構成する。キャプシドバリアントは以下で考察される。
プロモーターは、各パッケージング遺伝子に作動可能に連結される。そのようなプロモーターの特定の例としては、ｐ５、ｐ１９、及びｐ４０プロモーターが挙げられる（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９，ＰＮＡＳ，７６：５５６７－５５７１）。例えば、ｐ５及びｐ１９プロモーターは一般的にｒｅｐ遺伝子を発現するために使用されるが、ｐ４０プロモーターは一般的にｃａｐ遺伝子を発現するために使用される。
したがって、上記のように、本発明のベクターで使用されるＡＡＶゲノムは、天然に存在するＡＡＶウイルスの完全なゲノムであり得る。例えば、完全なＡＡＶゲノムを含むベクターを使用して、インビトロでＡＡＶウイルスを調製し得る。しかし、そのようなベクターは原則として患者に投与され得るが、これが実際に行われることはめったにない。好ましくは、ＡＡＶゲノムは、患者への投与の目的のために誘導体化されるであろう。そのような誘導体化は当該技術分野で標準的であり、本発明は、ＡＡＶゲノムの任意の公知の誘導体、及び当該技術分野で公知の技術を適用することによって生成され得る誘導体の使用を包含する。ＡＡＶゲノム及びＡＡＶキャプシドの誘導体化は、Ｃｏｕｒａ及びＮａｒｄｉ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００７，４：９９）、及び上記のＣｈｏｉ ｅｔ ａｌ及びＷｕ ｅｔ ａｌで概説されている。
ＡＡＶゲノムの誘導体としては、インビボでの本発明のベクターからのＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１導入遺伝子の発現を可能にするＡＡＶゲノムの任意の短縮型または改変型が挙げられる。通常、ＡＡＶゲノムを大幅に短縮して、最小限のウイルス配列を含めながら、上記の機能を保持することが可能である。これは、安全上の理由から、野生型ウイルスとのベクターの組換えのリスクを低減し、標的細胞にウイルス遺伝子タンパク質が存在することにより細胞性免疫応答の誘発を回避することも好ましい。
典型的には、誘導体は、少なくとも１つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、好ましくは２つ以上のＩＴＲ、例えば２つ以上のＩＴＲを含むであろう。１つ以上のＩＴＲは、異なる血清型を有するＡＡＶゲノムに由来してもよいし、またはキメラもしくは変異ＩＴＲであってもよい。好ましい変異ＩＴＲとは、ｔｒｓ（末端分解部位）が欠失しているものである。この欠失により、ゲノムを継続的に複製して、コーディング配列と相補的配列の両方を含む一本鎖ゲノム、すなわち自己相補的ＡＡＶゲノムを生成することが可能になる。これにより、標的細胞でのＤＮＡ複製のバイパスが可能になり、それにより導入遺伝子の発現を促進することも可能になる。
１つ以上のＩＴＲは、好ましくは、ＮＤ４、ＮＤ６、ＮＤ１、またはそれらのバリアントをいずれかの末端でコードするポリヌクレオチド配列に隣接するであろう。１つ以上のＩＴＲを含めることは、例えば、宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼの作用による、一本鎖ベクターＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換に続く、宿主細胞の核における本発明のベクターのコンカテマー形成を助けるために好ましい。そのようなエピソームコンカテマーの形成は、宿主細胞の寿命の間、ベクター構築物を保護し、それにより、インビボでの導入遺伝子の長期発現を可能にする。
好ましい実施形態において、ＩＴＲエレメントは、誘導体において天然のＡＡＶゲノムから保持される唯一の配列である。したがって、誘導体は、好ましくは、ネイティブゲノムのｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子、ならびにネイティブゲノムの任意の他の配列を含まないであろう。これは、上記の理由から、またベクターが宿主細胞ゲノムに組み込まれる可能性を減らすためにも好ましい。さらに、ＡＡＶゲノムのサイズを小さくすると、導入遺伝子に加えて、ベクター内に他の配列エレメント（調節エレメントなど）を組み込む際の可塑性を増大することが可能である。
したがって、ＡＡＶ２ゲノムを参照すると、本発明の誘導体において以下の部分を除去してもよい：１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、複製（ｒｅｐ）及びキャプシド（ｃａｐ）遺伝子（ＮＢ：野生型ＡＡＶゲノムのｒｅｐ遺伝子は、ＬＨＯＮに罹るヒト遺伝子であるＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１と混同しないこと）。しかしながら、インビトロの実施形態を含むいくつかの実施形態において、誘導体は、１つ以上のｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ遺伝子またはＡＡＶゲノムの他のウイルス配列をさらに含み得る。天然に存在するＡＡＶウイルスは、ヒト１９番染色体上の特定の部位に高頻度で組み込み、ランダムな組み込みの頻度はごくわずかであるため、ベクターでの組み込み能力の保持は治療環境で許容され得る。
誘導体ゲノムがキャプシドタンパク質、すなわちＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３をコードする遺伝子を含む場合、その誘導体は、１つ以上の天然に存在するＡＡＶウイルスのキメラ、シャッフル、またはキャプシド修飾誘導体であり得る。特に、本発明は、同じベクター内のＡＡＶの異なる血清型、クレード、クローン、または分離株からのキャプシドタンパク質配列の提供、すなわちシュードタイピングを包含する。
キメラ、シャッフルまたはキャプシド修飾誘導体を、通常、選択して、ウイルスベクターに１つ以上の所望の機能を提供する。したがって、これらの誘導体は、遺伝子送達の効率の向上、免疫原性の低下（体液性または細胞性）、向性範囲の変化、及び／または天然に存在するＡＡＶゲノム（例えば、ＡＡＶ２のゲノム）を含むＡＡＶウイルスベクターと比較した特定の細胞型の標的化の改善を示し得る。遺伝子送達の効率の向上は、細胞表面での受容体または補助受容体の結合の改善、内在化の改善、細胞内及び核への輸送の改善、ウイルス粒子の脱コーティングの改善、及び一本鎖ゲノムの二本鎖形態への変換の改善によって影響を受ける場合がある。効率の向上は、特定の細胞集団の向性範囲または標的化の変更にも関連し得、その結果、ベクター用量は、それが必要とされない組織への投与によって希釈されることはない。
キメラキャプシドタンパク質としては、天然に存在するＡＡＶ血清型の２つ以上のキャプシドコード配列間の組換えによって生成されたタンパク質が挙げられる。これは、例えば、ある血清型の非感染性キャプシド配列を異なる血清型のキャプシド配列と同時トランスフェクトするマーカーレスキューアプローチによって実施してもよく、指示された選択を使用して、所望の特性を有するキャプシド配列を選択する。異なる血清型のキャプシド配列を、細胞内での相同組換えによって変化させて、新規のキメラキャプシドタンパク質を生成してもよい。
キメラキャプシドタンパク質としては、特定のキャプシドタンパク質ドメイン、表面ループ、または特定のアミノ酸残基を２つ以上のキャプシドタンパク質の間、例えば異なる血清型の２つ以上のキャプシドタンパク質の間で転移させるためのキャプシドタンパク質配列の操作によって生成されるタンパク質も挙げられる。
シャッフルまたはキメラキャプシドタンパク質は、ＤＮＡシャッフリングによって、またはエラープローン（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲによって生成されてもよい。ハイブリッドＡＡＶキャプシド遺伝子は、関連するＡＡＶ遺伝子の配列、例えば、複数の異なる血清型のキャプシドタンパク質をコードする遺伝子の配列をランダムに断片化し、その後、自己プライミングポリメラーゼ反応でそのフラグメントを再構築することによって生成し得、これにより、配列相同性の領域でクロスオーバーが発生する場合もある。いくつかの血清型のキャプシド遺伝子をシャッフルすることによってこのように作成されたハイブリッドＡＡＶ遺伝子のライブラリーをスクリーニングして、所望の機能を有するウイルスクローンを同定してもよい。同様に、エラープローンＰＣＲを使用して、ＡＡＶキャプシド遺伝子をランダムに変異させ、バリアントの多様なライブラリーを作成し、それを目的の特性に合わせて選択してもよい。
キャプシド遺伝子の配列はまた、天然の野生型配列に関して特定の欠失、置換または挿入を導入するように遺伝子改変され得る。特に、キャプシド遺伝子は、キャプシドコード配列のオープンリーディングフレーム内、またはキャプシドコード配列のＮ末端及び／もしくはＣ末端に、無関係のタンパク質またはペプチドの配列を挿入することによって改変され得る。
無関係のタンパク質またはペプチドは、有利には、特定の細胞型のリガンドとして作用し、それにより、標的細胞への改善された結合を与えるか、または特定の細胞集団へのベクターの標的化の特異性を改善するものであり得る。例としては、ＲＧＤペプチドを使用して網膜色素上皮への取り込みをブロックし、それによって周囲の網膜組織の形質導入を増強することも挙げられる（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００８ ＡＲＶＯ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｄ１０４８）。無関係のタンパク質はまた、産生プロセスの一部としてウイルス粒子の精製を支援するもの、すなわちエピトープであっても、またはアフィニティータグであってもよい。挿入部位は、通常、ウイルス粒子の他の機能、例えば、ウイルス粒子の内在化、輸送を妨害しないように選択される。当業者は、彼らの一般的な知識に基づいて、挿入に適した部位を特定し得る。特定の部位は、上記で参照されているＣｈｏｉ ｅｔ ａｌに開示されている。
本発明はさらに、天然のＡＡＶゲノムのものとは異なる順序及び構成でのＡＡＶゲノムの配列の提供を包含する。本発明はまた、１つ以上のＡＡＶ配列または遺伝子を、別のウイルス由来の配列または２つ以上のウイルス由来の配列から構成されるキメラ遺伝子で置き換えることを包含する。そのようなキメラ遺伝子は、異なるウイルス種の２つ以上の関連するウイルスタンパク質由来の配列から構成され得る。
本発明のベクターは、ＡＡＶゲノムまたはその誘導体を含むポリヌクレオチド配列と、ＮＤ４、ＮＤ６、ＮＤ１またはそのバリアントをコードする配列の形態をとる。
誤解を避けるために、本発明はまた、本発明のベクターを含むＡＡＶウイルス粒子を提供する。本発明のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶゲノムまたはある血清型のＩＴＲを有する誘導体が異なる血清型のキャプシドにパッケージされているトランスキャプシド形態を含む。本発明のＡＡＶ粒子はまた、２つ以上の異なる血清型由来の未修飾キャプシドタンパク質の混合物がウイルスエンベロープを構成するモザイク形態を含む。ＡＡＶ粒子にはまた、キャプシド表面に吸着したリガンドを保有する化学修飾型も含まれる。例えば、そのようなリガンドは、特定の細胞表面受容体を標的とするための抗体を含んでもよい。
本発明はさらに、本発明のベクターまたはＡＡＶウイルス粒子を含む宿主細胞を提供する。
組換え核酸配列
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット－４（ＮＤ４）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット－１（ＮＤ１）及びＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット－６（ＮＤ６）ポリペプチドまたはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸配列も本明細書に開示される。
ＮＤ４のポリヌクレオチド配列は、配列番号６に示され、配列番号１６０に示されるタンパク質をコードする。ＮＤ４のさらなる核酸配列は、配列番号７及び８である。ＮＤ６のポリヌクレオチド配列は、配列番号９に示され、配列番号１６１に示されるタンパク質をコードする。ＮＤ６のさらなる核酸配列は、配列番号１０である。ＮＤ１のポリヌクレオチド配列は、配列番号１１に示され、配列番号１６２に示されるタンパク質をコードする。ＮＤ１のさらなる核酸配列は、配列番号１２である。
配列番号１６０、１６１、または１６２のいずれか１つのバリアントは、その短縮、変異体または相同体、及び機能的なＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１ポリペプチドをコードするその任意の転写バリアントを含み得る。本明細書で言及される任意の相同体は、典型的には、ＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１の関連領域に対して少なくとも７０％相同であり、ポリペプチド欠損を機能的に補償し得る。
相同性は、公知の方法を使用して測定され得る。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性の計算に使用され得るＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、そのデフォルト設定で使用される）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２、３８７－３９５）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０－３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－１０に記載のとおり、相同性または整列配列を計算してもよい（通常はデフォルト設定で）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて公的に入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
好ましい実施形態において、組換え核酸配列は、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、６０、１００、２００、３００、４００以上の連続したアミノ酸にわたって、または組換え核酸の配列全体にわたってさえ、ＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１（配列番号１６０、１６１、または１６２）の関連領域に対して少なくとも５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、９９％、９９．５％、または１００％相同であるポリペプチドをコードし得る。関連する領域は、ＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１の機能的活性を提供する領域となる。
あるいは、好ましくは、組換え核酸配列は、その配列全体にわたって全長ＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１（配列番号１６０、１６１、または１６２）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、９９％、９９．５％、または１００％相同であるポリペプチドをコードし得る。典型的には、組換え核酸配列は、ＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１の関連領域（配列番号１６０、１６１、または１６２）と少なくとも２、５、１０、２０、４０、５０、または６０の変異（それぞれが置換、挿入、または削除である可能性がある）またはそれ未満異なる。
組換え核酸ＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１ポリペプチドは、上記の配列の長さのいずれかにわたって、任意の特定の相同性値パーセンテージと同じである、配列番号１６０、１６１、または１６２の特定の領域との同一性パーセンテージを有し得る（すなわち、少なくとも７０％、８０％、または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、９９％の同一性を有し得る）。
ＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１のバリアント（配列番号１６０、１６１、または１６２）もまた、短縮を含む。バリアントがまだ機能している限り、任意の短縮を使用してもよい。短縮は、通常、タンパク質活性に必須ではない、及び／または折り畳まれたタンパク質の高次構造、特に活性部位の折り畳みに影響を及ぼさない配列を除去するために行われる。適切な短縮は、Ｎ末端またはＣ末端からのさまざまな長さの配列を体系的に短縮することによって慣用的に同定可能である。好ましい短縮はＮ末端であり、触媒ドメインを除く他の全ての配列を除去する場合がある。
ＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１のバリアント（配列番号１６０、１６１、または１６２）はさらに、ＮＤ４、ＮＤ６、もしくはＮＤ１（配列番号１６０、１６１、または１６２）の特定の領域に関する１つ以上、例えば、２、３、４、５～１０、１０～２０、２０～４０、以上のアミノ酸の挿入、置換または欠失を有する変異を含む。欠失及び挿入は、以下に記載されるように、好ましくは触媒ドメインの外側で行われる。置換はまた、典型的には、プロテアーゼ活性に必須ではない、及び／または折り畳まれたタンパク質の高次構造に影響を及ぼさない領域で行われる。
置換は、好ましくは、１つ以上の保存的変化を導入し、これは、アミノ酸を、類似の化学構造、類似の化学的性質、または類似の側鎖容積の他のアミノ酸で置き換える。導入されたアミノ酸は、それらが置換するアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性、または電荷を有し得る。あるいは、保存的変化は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入し得る。保存的アミノ酸変化は当該技術分野で周知であり、アミノ酸の特性に従って選択され得る。
同様に、ＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１のポリヌクレオチド配列の好ましいバリアント（配列番号６、９、または１１）は、ＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１（配列番号６、９、または１１）の関連領域に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％相同であるポリヌクレオチドを含む。好ましくは、このバリアントは、その配列全体にわたって、全長ＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１（配列番号６、９、または１１）に対してこれらのレベルの相同性を示す。
ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）と３つの主要な非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を使用して、タンパク質またはｍＲＮＡをミトコンドリアに標的化し得る。ＭＴＳの電荷、長さ、及び構造は、ミトコンドリアへのタンパク質の移入に重要であり得る。特定の３’ＵＴＲは、ミトコンドリア表面へのｍＲＮＡの局在化を駆動し、これによってミトコンドリアへの同時翻訳タンパク質の移入を促進し得る。
ミトコンドリア標的化配列のポリヌクレオチド配列は、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＣＯＸ８、ｓｃＲＰＭ２、ｌｃＳｉｒｔ５、ｔｂＮＤＵＳ７、ｎｃＱＣＲ２、ｈｓＡＴＰ５Ｇ２、ｈｓＬＡＣＴＢ、ｓｐｉｌｖ１、ｇｍＣＯＸ２、ｃｒＡＴＰ６、ｈｓＯＰＡ１、ｈｓＳＤＨＤ、ｈｓＡＤＣＫ３、ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＡＴＰ９（ｎｃＡＴＰ９）、ｈｓＧＨＩＴＭ、ｈｓＮＤＵＦＡＢ１、ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＤＣＫ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ＧＮＦＰ＿ｎｃＡＴＰ９、及びｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｌｃＳｉｒｔ５＿ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ２＿ｎｃＡＴＰ９（配列番号については表１を参照）から選択されるポリペプチドをコードし得る。一例では、ポリヌクレオチド配列、ＣＯＸ１０（配列番号１、２、または３）は、ミトコンドリア標的化配列、ＭＴＳ－ＣＯＸ１０（配列番号１２６）をコードし得る。別の例では、ポリヌクレオチド配列、ＣＯＸ８（配列番号４）は、ミトコンドリア標的化配列、ＭＴＳ－ＣＯＸ８（配列番号１２７）をコードし得る。別の例では、ポリヌクレオチド配列、ＯＰＡ１（配列番号５）は、ミトコンドリア標的化配列、ＭＴＳ－ＯＰＡ１（配列番号１２８）をコードし得る。
３’ＵＴＲ核酸配列は、ｈｓＡＣＯ２（配列番号１１１）、ｈｓＡＴＰ５Ｂ（配列番号１１２）、ｈｓＡＫ２（配列番号１１３）、ｈｓＡＬＤＨ２（配列番号１１４）、ｈｓＣＯＸ１０（配列番号１１５）、ｈｓＵＱＣＲＦＳ１（配列番号１１６）、ｈｓＮＤＵＦＶ１（配列番号１１７）、ｈｓＮＤＵＦＶ２（配列番号１１８）、ｈｓＳＯＤ２（配列番号１１９）、ｈｓＣＯＸ６ｃ（配列番号１２０）、ｈｓＩＲＰ１（配列番号１２１）、ｈｓＭＲＰＳ１２（配列番号１２２）、ｈｓＡＴＰ５Ｊ２（配列番号１２３）、ｒｎＳＯＤ２（配列番号１２４）、及びｈｓＯＸＡ１Ｌ（配列番号１２５）から選択され得る。３’ＵＴＲ核酸配列はまた、ここに列挙されている任意の３’ＵＴＲ核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の相同性を有するバリアントであり得る。例えば、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番号１３または１４であり得る。
ミトコンドリア標的化配列、ミトコンドリアタンパク質コード配列、及び３’ＵＴＲ核酸配列を含む組換え核酸配列も本明細書に開示される。例えば、組換え核酸配列は、配列番号１５～８４から選択され得る。組換え核酸配列はまた、ここに列挙されている任意の組換え核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の相同性を有するバリアントであってもよい。
プロモーター及び調節配列
本発明のベクターはまた、インビトロまたはインビボで開示された導入遺伝子の発現を可能にするエレメントを含む。したがって、このベクターは、典型的には、ＮＤ４、ＮＤ６、もしくはＮＤ１導入遺伝子またはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。
任意の適切なプロモーターを使用してもよい。プロモーター配列は、構成的に活性であり、すなわち任意の宿主細胞バックグラウンドで作動可能であるか、あるいは特定の宿主細胞環境でのみ活性であり得、したがって特定の細胞型における導入遺伝子の標的発現を可能にする。プロモーターは、別の因子、例えば宿主細胞に存在する因子の存在に応答して誘導性の発現を示し得る。いずれにせよ、ベクターが治療のために投与される場合、プロモーターは網膜細胞のバックグラウンドで機能していなければならない。
いくつかの実施形態において、導入遺伝子が網膜細胞集団においてのみ発現されることを可能にするために、プロモーターが網膜細胞特異的発現を示すことが好ましい。したがって、プロモーターからの発現は、網膜細胞特異的であり得、例えば、神経感覚網膜及び網膜色素上皮の細胞のみに限定され得る。
ＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１導入遺伝子の好ましいプロモーターとしては、任意選択でサイトメガロウイルス（ＣＭＥ）エンハンサーエレメントと組み合わせたニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターが挙げられる。場合によっては、ＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１導入遺伝子の好ましいプロモーターはＣＡＧプロモーターを含む。特に好ましいプロモーターは、ハイブリッドＣＢＡ／ＣＡＧプロモーター、例えば、ｒＡＶＥ発現カセットで使用されるプロモーターである。網膜特異的遺伝子発現を誘導するヒト配列に基づくプロモーターの例としては、桿体及び錐体用のロドスピンキナーゼ（Ａｌｌｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｖｉｏｌ ８１：１１３７２－８０）、錐体のみ用のＰＲ２．１（Ｍａｎｃｕｓｏ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｎａｔｕｒｅ）及び／または網膜色素上皮のＲＰＥ６５（Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ）が挙げられる。
本発明のベクターはまた、転写前または転写後に作用し得る１つ以上の追加の調節配列も含んでもよい。調節配列は、天然のＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１遺伝子座の一部であってもよいし、または異種の調節配列であってもよい。本発明のベクターは、天然のＮＤ４、ＮＤ６、またはＮＤ１転写物由来の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの一部を含み得る。
調節配列は、導入遺伝子の発現を促進する、すなわち、転写物の発現を増大させるか、ｍＲＮＡの核外輸送を改善するか、またはその安定性を向上するように作用する任意の配列である。そのような調節配列には、例えば、エンハンサーエレメント、後調節エレメント、及びポリアデニル化部位が含まれる。好ましいポリアデニル化部位は、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルである。本発明のベクターの文脈において、そのような調節配列はシス作用性である。しかしながら、本発明はまた、追加の遺伝子構築物上に位置するトランス作用性調節配列の使用を包含する。
本発明のベクターで使用するための好ましい後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎調節後エレメント（ＷＰＲＥ）またはそのバリアントである。本発明のベクターで使用され得る別の調節配列は、足場付着領域（ＳＡＲ）である。追加の調節配列は、当業者が一般的な知識に基づいて選択し得る。
ベクターの調製
本発明のベクターは、遺伝子治療のためのベクターを提供するための当該技術分野で公知の標準的な手段によって調製し得る。したがって、十分に確立された公的ドメインのトランスフェクション、パッケージング、及び精製方法を使用して、適切なベクター調製物を調製してもよい。
上記で考察されるとおり、本発明のベクターは、ＮＤ４、ＮＤ６、もしくはＮＤ１またはそれらのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列に加えて、天然に存在するＡＡＶウイルスの全ゲノムを含み得る。しかしながら、一般的に、誘導体化されたゲノムが使用され、例えば、少なくとも１つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を有するが、ｒｅｐまたはｃａｐなどのＡＡＶ遺伝子を欠く場合がある誘導体が使用される。
そのような実施形態において、誘導体化されたゲノムのＡＡＶウイルス粒子へのアセンブリを得るために、ＡＡＶ及び／またはヘルパーウイルス機能を提供する追加の遺伝子構築物が、誘導体化されたゲノムと組み合わせて宿主細胞に提供される。これらの追加の構築物は、通常、構造的ＡＡＶキャプシドタンパク質、すなわち、ｃａｐ、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３をコードする遺伝子、及びｒｅｐなどのＡＡＶライフサイクルに必要な他の機能をコードする遺伝子を含む。追加の構築物で提供される構造キャプシドタンパク質の選択により、パッケージングされたウイルスベクターの血清型が決定される。
本発明で使用するための特に好ましいパッケージングされたウイルスベクターは、ＡＡＶ５またはＡＡＶ８キャプシドタンパク質と組み合わせたＡＡＶ２の誘導体化されたゲノムを含む。このパッケージングされたウイルスベクターは、通常、１つ以上のＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。
上記のように、ＡＡＶウイルスは複製能力がないため、ヘルパーウイルス機能、好ましくはアデノウイルスヘルパー機能も通常、ＡＡＶ複製を可能にするために１つ以上の追加の構築物に提供される。
上記の追加の構築物の全ては、宿主細胞においてプラスミドまたは他のエピソームエレメントとして提供されてもよいし、あるいは１つ以上の構築物が宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
これらの局面において、本発明は、本発明のベクターを産生するための方法を提供する。この方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムまたはその誘導体を含むベクター、ならびに宿主細胞においてＮＤ４、ＮＤ６、もしくはＮＤ１またはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を提供することと、ＡＡＶウイルス粒子へのベクターの複製及びアセンブリのための手段を提供することとを含む。好ましくは、この方法は、ＡＡＶゲノムの誘導体及びＮＤ４、ＮＤ６、もしくはＮＤ１またはそれらのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを、ＡＡＶ及び／またはヘルパーウイルス機能をコードする１つ以上の追加の遺伝子構築物と共に提供することを含む。通常、ＡＡＶゲノムの誘導体は少なくとも１つのＩＴＲを含む。場合により、この方法は、アセンブルされたウイルス粒子を精製するステップをさらに含む。さらに、この方法は、治療的使用のためにウイルス粒子を処方するステップを含み得る。
治療法及び医療用途
上記で考察されるように、本発明者らは、驚くべきことに、本発明のベクターを使用して、ＬＨＯＮの根底にある細胞機能障害に対処し得ることを実証した。特に、彼らは、ベクターの使用がＬＨＯＮに関連する欠陥を修正し得ることを示した。これは、病気の変性過程を治療、阻止、緩和、または予防し得る手段を提供する。
したがって、本発明は、直接網膜、網膜下または硝子体内注射によって治療有効量の本発明のベクターを患者に投与することを含む、それを必要とする患者におけるＬＨＯＮを治療または予防する方法を提供する。したがって、ＬＨＯＮはそれによって患者において治療または予防される。
関連する態様において、本発明は、直接網膜、網膜下または硝子体内注射によって前記ベクターを患者に投与することによってＬＨＯＮを治療または予防する方法における本発明のベクターの使用を提供する。さらに、本発明は、直接網膜、網膜下または硝子体内注射によってＬＨＯＮを治療または予防するための医薬の製造における本発明のベクターの使用を提供する。
これら全ての実施形態において、本発明のベクターは、ＬＨＯＮの１つ以上の症状の発症を防ぐために投与され得る。患者は無症候性である場合もある。対象は疾患の素因を有する場合もある。この方法または使用は、対象がＬＨＯＮを発症するリスクがあるか、または持っているか否かを同定するステップを含み得る。予防的に有効な量のベクターがそのような対象に投与される。予防的に有効な量とは、疾患の１つ以上の症状の発症を防ぐ量である。
あるいは、疾患の症状が対象に一旦現れたら、すなわち、疾患の既存の症状を治癒するために、このベクターを投与してもよい。治療有効量のアンタゴニストをこのような対象に投与する。治療有効量は、疾患の１つ以上の症状を改善するのに有効な量である。そのような量はまた、ＬＨＯＮに関連する周辺視野のある程度の喪失を阻止、遅延、または逆転させ得る。そのような量はまた、ＬＨＯＮの発症を阻止するか、遅らせるか、または逆転させ得る。
典型的な単回投与量は、形質導入を必要とする残りの網膜組織の量に応じて、１０１０～１０１２個のゲノム粒子である。ゲノム粒子は、本明細書では、配列特異的方法（リアルタイムＰＣＲなど）で定量化され得る一本鎖ＤＮＡ分子を含むＡＡＶキャプシドとして定義されている。その用量は単回投与として提供されてもよいが、僚眼に対して、またはベクターが何らかの理由（外科的合併症など）で網膜の正しい領域を標的にしていない場合に繰り返されてもよい。治療は、好ましくは、各眼に対する単一の恒久的な治療であるが、例えば、将来にわたり、及び／または異なるＡＡＶ血清型での反復注射が考慮され得る。
本発明はまた、直接の網膜、網膜下または硝子体内注射による本発明のＡＡＶベクターの投与後に前記患者から得られた網膜細胞におけるエクスビボでの活性を測定することを含む、患者におけるＬＨＯＮの治療または予防をモニターする方法を提供する。この方法は、治療の有効性の決定を可能にし得る。
医薬組成物
本発明のベクターは、医薬組成物に処方してもよい。これらの組成物は、ベクターに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、または当業者に周知の他の材料を含み得る。そのような材料は無毒でなければならず、有効成分の有効性を妨げてはならない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、すなわちここでは直接網膜、網膜下または硝子体内注射に従って当業者によって決定され得る。
医薬組成物は、通常、液体の形態である。液体医薬組成物は、概して液体担体、例えば、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱物油、または合成油を含む。生理食塩液、塩化マグネシウム、デキストロース溶液もしくは他の糖溶液、またはグリコール類、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールが含まれ得る。場合によっては、プルロン酸（ＰＦ６８）０．００１％などの界面活性剤を使用してもよい。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、１０９～１０１６個のウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、１ミリリットルあたり１０１０～１０１２個のウイルスベクターを含む。
苦痛の部位への注射の場合、有効成分は、パイロジェンを含まず、適切なｐＨ、等張性、及び安定性を備えた水溶液の形態になる。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、乳酸リンガー注射などの等張性ビヒクルを使用して、適切な溶液を十分に調製し得る。防腐物質、安定化物質、緩衝液、抗酸化剤、及び／または他の添加物が、必要に応じて含まれてもよい。
遅延放出の場合、ベクターは、生体適合性ポリマーから形成されたマイクロカプセルまたは当該技術分野で公知の方法によるリポソーム担体システムなど、徐放用に処方された医薬組成物に含まれ得る。
試料
本明細書に記載の方法での使用に適した試料は、対象由来の核酸試料であってもよい。本明細書で使用される「核酸試料」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。別の実施形態では、「ポリペプチド試料」（例えば、ペプチドまたはタンパク質、またはそれらからのフラグメント）を使用して、遺伝的バリアントの結果であるアミノ酸変化が起こったという情報を確認し得る。核酸及びポリペプチドは、限定するものではないが、血液、唾液、尿、口内膜の粘膜掻き取り、去痰薬、血清、涙、皮膚、組織、または毛髪を含む１つ以上の試料から抽出し得る。核酸試料は、核酸情報についてアッセイされ得る。本明細書で使用される「核酸情報」としては、核酸配列自体、核酸配列における遺伝的変動の有無、核酸配列（例えば、Ｔｍ）に応じて変化する物理的特性、及び核酸の量（例えば、ｍＲＮＡコピーの数）が挙げられる。「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工ヌクレオチドを含むＤＮＡ、または人工ヌクレオチドを含むＲＮＡのいずれか１つを意味する。本明細書で使用される場合、「精製核酸」としては、ｃＤＮＡ、ゲノム核酸のフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して生成された核酸、ゲノム核酸の制限酵素処理によって形成された核酸、組換え核酸、及び化学的に合成された核酸分子が挙げられる。「組換え」核酸分子としては、例えば、化学合成によって、または遺伝子工学技術による核酸の単離されたセグメントの操作によって、配列の他の方法で分離された２つのセグメントの人工的な組み合わせによって作製された核酸分子を含む。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」とは、天然源から単離されたか、組換え技術によって生成されたか、または化学的に合成されたかにかかわらず、タンパク質、タンパク質のフラグメント、及びペプチドを含む。ポリペプチドは、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化など）または任意の他の修飾（例えば、ペグ化など）などの１つ以上の修飾を有し得る。ポリペプチドは、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸（例えば、側鎖修飾を有するアミノ酸など）を含み得る。
いくつかの実施形態において、核酸試料は、細胞または組織、例えば、細胞株を含み得る。本明細書に記載の方法を使用して核酸を得ることができる例示的な細胞型としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：血球、例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、白血球、赤血球、マクロファージ、または好中球；筋細胞、例えば、骨格筋、平滑筋細胞または心筋細胞；生殖細胞、例えば、精子または卵子；上皮細胞；結合組織細胞、例えば、脂肪細胞、軟骨細胞；線維芽細胞または骨芽細胞；ニューロン；アストロサイト；間質細胞；臓器特異的細胞、例えば、腎臓細胞、膵臓細胞、肝臓細胞、またはケラチノサイト；幹細胞；またはそこから発生する任意の細胞。核酸を得ることができる細胞は、血液細胞であっても、または特定のタイプの血液細胞であってもよく、これには、例えば、造血幹細胞、または造血幹細胞から生じる細胞、例えば、赤血球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、または血小板が挙げられる。一般に、胚性幹細胞、成体幹細胞、または多能性幹細胞を含むがこれらに限定されない、任意のタイプの幹細胞を使用してもよい。
いくつかの実施形態では、核酸試料は、ＲＮＡまたはＤＮＡの単離のために処理してもよく、例えば、細胞または組織試料中のＲＮＡまたはＤＮＡは、核酸試料の他の成分から分離してもよい。細胞は、標準的な技術を使用して、例えば、細胞試料を遠心分離し、ペレット化された細胞を、例えば、緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁することによって、核酸試料から収集し得る。いくつかの実施形態において、細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを得た後、細胞を溶解してＤＮＡを抽出し得る。いくつかの実施形態において、核酸試料は、ＤＮＡを単離するために濃縮及び／または精製され得る。あらゆる種類のさらなる処理を受けたものを含む、対象から得られた全ての核酸試料は、対象から得られたと見なされる。いくつかの実施形態において、当該技術分野で公知の標準的な技術及びキットを使用して、例としては、例えば、フェノール抽出、ＱＩＡＡＭＰ（登録商標）組織キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．）、ＷＩＺＡＲＤ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、またはアーカイブに最適な非常に安定したＤＮＡの精製が可能になるＰｕｒｅｇｅｎｅケミストリーを使用したＱｉａｇｅｎ Ａｕｔｏｐｕｒｅメソッドを使用して、核酸試料からＲＮＡまたはＤＮＡを抽出してもよい。
いくつかの実施形態において、対立遺伝子の同一性の決定またはコピー数の決定は、対象由来のＲＮＡ及び／もしくはＤＮＡを含む核酸試料を取得すること、ならびに／または核酸試料に由来するゲノムＤＮＡ（すなわち、対象のゲノム）内の１つ以上の遺伝子バリエーションの同一性、コピー数、有無及びそれらの染色体位置を評価することを含み得るが、必須ではない。
決定を行う個人または組織は、対象からの核酸試料の物理的分析を実際に実行する必要はない。いくつかの実施形態では、この方法は、第三者による核酸試料の分析によって得られた情報を使用することを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、複数の部位で起こるステップを含み得る。例えば、核酸試料は、医療提供者または自己検査キットの場合は対象の自宅などの第１の場所で対象から得てもよい。核酸試料は、同じ場所または第２の場所、例えば、実験室または他の試験施設で分析され得る。
核酸
本明細書に記載の核酸及びポリペプチドは、本開示の方法及びキットで使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸及びポリペプチドに特異的に結合するアプタマーは、本開示の方法及びキットにおいて使用され得る。本明細書で使用される場合、核酸とは、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を、単一またはポリマーであるか、天然に存在するかまたは天然には存在しないか、二本鎖または一本鎖か、コードするか（例えば、翻訳遺伝子）、またはコードしないか（例えば、調節領域）にかかわらず、あるいはそれらの任意のフラグメント、誘導体、模倣物または相補体を、含み得る。いくつかの実施形態において、核酸は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸配列、ゲノム配列、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、アンチセンス核酸、ＤＮＡ領域、プローブ、プライマー、遺伝子、調節領域、イントロン、エキソン、オープンリーディングフレーム、結合部位、標的核酸及び対立遺伝子特異的核酸を含み得る。
本明細書で使用される「プローブ」とは、核酸の相補性に基づくハイブリダイゼーション反応を使用して標品中の核酸を検査するための核酸フラグメントを含む。
本明細書で使用される「ハイブリッド」とは、上記の核酸のいずれか１つの間、同じタイプ内、またはＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、ＲＮＡ－ＲＮＡなどを含む異なるタイプ間で形成される二本鎖を含む。
本明細書で使用される「単離された」核酸は、（ゲノム配列のように）遺伝子またはヌクレオチド配列に通常隣接する核酸から分離され、及び／または（例えば、ＲＮＡライブラリーのように）他の転写配列から完全にまたは部分的に精製されている。例えば、本開示の単離された核酸は、それが自然に生じる複雑な細胞環境、または組換え技術によって産生される場合は培養培地、または化学的に合成される場合は化学前駆体もしくは他の化学物質に関して実質的に単離され得る。場合によっては、単離された材料は、組成物の一部、例えば、他の物質を含む粗抽出物、緩衝系または試薬混合物を形成し得る。いくつかの実施形態において、材料は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）またはカラムクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）によって、当該技術分野で公知の方法を使用して、本質的な均質性まで精製され得る。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に関して、「単離された」という用語はまた、ゲノムＤＮＡが自然に関連している染色体から分離されている核酸を指す場合がある。例えば、単離された核酸分子は、核酸分子が由来する細胞のｇＤＮＡ中の核酸分子に隣接するヌクレオチドの約２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１５０ｋｂ、１００ｋｂ、７５ｋｂ、５０ｋｂ、２５ｋｂ、１０ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満を含んでもよい。
核酸は他のコーディング配列に融合させてもよく、または調節配列は単離されていると見なしてもよい。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡは、本明細書で使用される「単離された」の定義に含まれる。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、異種宿主細胞または異種生物における組換えＤＮＡ分子、ならびに溶液中の部分的または実質的に精製されたＤＮＡ分子を含み得る。単離された核酸はまた、本開示のＤＮＡ分子のインビボ及びインビトロＲＮＡ転写物も包含する。単離された核酸分子またはヌクレオチド配列は、化学的にまたは組換え手段によって合成され得る。そのような単離されたヌクレオチド配列は、例えば、コードされたポリペプチドの製造において、（例えば、他の哺乳動物種から）相同配列を単離するためのプローブとして、遺伝子マッピングのために（例えば、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによって）、またはノーザンブロット分析もしくは本明細書に開示される他のハイブリダイゼーション技術などによる、組織（例えば、ヒト組織）における遺伝子の発現の検出のために有用であり得る。本開示はまた、選択的ハイブリダイゼーションなどの高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸配列に関する。このような核酸配列は、対立遺伝子または配列特異的ハイブリダイゼーションによって検出及び／または単離され得る（例えば、高ストリンジェンシー条件下で）。核酸ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件及び方法は、当業者に周知である（例えば、これらの全教示は参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，（１９９８）、ならびにＫｒａｕｓ，Ｍ．及びＡａｒｏｎｓｏｎ，Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２００：５４６－５５６（１９９１）を参照のこと）。
２つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の「同一性」または「同一性パーセント」の計算は、最適な比較目的のために配列を整列させることによって決定され得る（例えば、ギャップを第１の配列の配列に導入してもよい）。次に、対応する位置のヌクレオチドを比較して、２つの配列間の同一性パーセントは、その配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。例えば、第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同じヌクレオチドで占められているならば、その分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、及び２つの配列の最適な整列のために導入する必要がある各ギャップの長さを考慮した配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
いくつかの実施形態において、比較目的のために整列された配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。２つの配列の実際の比較は、例えば数学的アルゴリズムを使用した、周知の方法で達成され得る。このような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ、Ｓ．及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０－５８７３－５８７７（１９９３）に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載されているように、このようなアルゴリズムはＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの任意の関連のパラメータ（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）を使用してもよい。例えば、配列比較のパラメータは、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定してもよく、または変更してもよい（例えば、Ｗ＝５またはＷ＝２０）。他の例としては、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９），ＡＤＶＡＮＣＥ，ＡＤＡＭ，ＢＬＡＴ、及びＦＡＳＴＡ．のアルゴリズムが挙げられる。いくつかの実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）のＧＡＰプログラムを使用して達成され得る。
「プローブ」または「プライマー」は、核酸分子の相補鎖に塩基特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり得る。プローブには、プライマーを含めてもよく、プライマーは、標的配列の増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含むがこれらに限定されない方法を使用して、テンプレート指向ＤＮＡ合成の開始点として機能し得る一本鎖オリゴヌクレオチドプローブであり得る。本明細書に記載されるように、オリゴヌクレオチドは、核酸配列のセグメントもしくはフラグメント、またはそれらの相補体を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＤＮＡセグメントは、５から１０，０００の連続した塩基であってもよく、そして５、１０、１２、１５、２０、または２５ヌクレオチドから１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００または１０，０００ヌクレオチドの範囲であり得る。ＤＮＡ及びＲＮＡに加えて、プローブ及びプライマーは、Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７－１５００（１９９１）に記載されているように、ポリペプチド核酸（ＰＮＡ）を含んでもよい。プローブまたはプライマーは、核酸分子の少なくとも約１５、典型的には約２０～２５、及び特定の実施形態では約４０、５０、６０または７５の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含み得る。
本開示はまた、ヌクレオチド配列を含む、またはヌクレオチド配列からなる核酸に選択的にハイブリダイズし得るフラグメントまたは部分を含む、単離された核酸、例えば、プローブまたはプライマーを提供し、ここで、このヌクレオチド配列は、本明細書に記載の遺伝的変動に含まれる少なくとも１つの多型もしくは多型対立遺伝子、または同じ位置に位置する野生型ヌクレオチド、またはそれらの相補体を含み得る。いくつかの実施形態において、プローブまたはプライマーは、隣接するヌクレオチド配列に対して、または隣接するヌクレオチド配列の相補体に対して、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であり得る。
いくつかの実施形態において、核酸プローブは、本明細書に記載の遺伝的変動を含む状態（例えば、ＬＨＯＮ）に関連する遺伝子の相補的領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであり得る。本開示の核酸フラグメントは、本明細書に記載されているようなアッセイにおいてプローブまたはプライマーとして使用され得る。
上記のような本開示の核酸は、当業者に周知の標準的な分子生物学技術を使用して同定及び単離され得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、増幅されてもよく、及び／または標識されてもよく（例えば、放射性標識され、蛍光標識され）、そしてスクリーニングのためのプローブとして、例えば、生物に由来するｃＤＮＡライブラリーとして使用され得る。ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡに由来し得、適切なベクターに含まれ得る。例えば、対応するクローンを単離して、ＤＮＡをインビボ切除後に得て、及びクローニングされた挿入物を、当該技術分野で認められた方法によっていずれかまたは両方の方向で配列決定して、適切な分子量のポリペプチドをコードする正しいリーディングフレームを同定してもよい。これらまたは同様の方法を使用して、ポリペプチド及びこのポリペプチドをコードするＤＮＡを単離し、配列決定し、さらに特徴付けてもよい。
いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の多型、変動、または変異、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、一塩基変異（ＳＮＶ）、コピー数多型（ＣＮＶ）、例えば、挿入、欠失、反転、及び転置を含んでもよい。いくつかの実施形態において、核酸は、類似体、例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２－０－メチルリボヌクレオチド、または修飾された核酸、例えば、修飾された骨格残基もしくは結合、または炭水化物、脂質、ポリペプチドもしくは他の材料と組み合わされた核酸、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）、例えば、クロマチン、リボソーム、及びトランスクリプトソームを含み得る。いくつかの実施形態において、核酸は、様々な構造、例えば、Ａ ＤＮＡ、Ｂ ＤＮＡ、Ｚ型ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びリボザイムの核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸は、例えば、参照配列と比較して、１つ以上の配列の相違、例えば、付加、欠失、及び／または置換を有する、天然または非天然の多形性であり得る。いくつかの実施形態では、参照配列は、公的に入手可能な情報、例えば、Ｕ．Ｃ．Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ Ｇａｔｅｗａｙ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ）またはＮＣＢＩのウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に基づき得る。いくつかの実施形態において、参照配列は、当該技術分野で周知の方法を使用して、例えば、参照核酸を配列決定することによって、本開示の開業医によって決定され得る。
いくつかの実施形態において、プローブは、本明細書に記載されるように、対立遺伝子、ＳＮＰ、ＳＮＶ、またはＣＮＶにハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態において、プローブは、本明細書に記載されるように、ＬＨＯＮに関連する別のマーカー配列に結合し得る。
当業者は、特定の対立遺伝子が試験核酸試料由来のゲノム配列に存在する場合にのみ配列特異的ハイブリダイゼーションが起こり得るようにプローブを設計する方法を承知している。本開示はまた、市販の技術及び特定の遺伝的変動を遺伝子型決定するための方法を含む、任意の便利な遺伝子型決定方法を使用して実施するように縮小してもよい。
対照プローブも使用してもよく、例えば、より可変性の低い配列に結合するプローブ、例えば、染色体のセントロメアに関連する反復ＤＮＡを対照として使用してもよい。いくつかの実施形態では、プローブは商業的供給源から入手され得る。いくつかの実施形態において、プローブは、例えば、化学的もしくはインビトロで合成されてもよいし、または標準的な技術を通じて染色体もしくはゲノムＤＮＡから作製してもよい。いくつかの実施形態では、使用され得るＤＮＡの供給源としては、ゲノムＤＮＡ、クローニングＤＮＡ配列、宿主の正常な染色体補体と共にヒト染色体の１つまたはその一部を含む体細胞ハイブリッド、及びフローサイトメトリーもしくは顕微解剖によって精製された染色体が挙げられる。目的の領域は、クローニングによって、またはＰＣＲを使用した部位特異的増幅によって分離され得る。
１つ以上の核酸、例えば、プローブまたはプライマーはまた、例えば、直接標識によって標識されて、検出可能な標識を含んでもよい。検出可能な標識は、物理的、化学的、または生物学的プロセスによって検出可能な任意の標識、例えば、３２Ｐまたは３Ｈなどの放射性標識、ＦＩＴＣなどの蛍光標識、発色団標識、アフィニティーリガンド標識、酵素標識、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはＩ２ガラクトシダーゼ、酵素補因子標識、ハプテンコンジュゲート標識、例えば、ジゴキシゲニンまたはジニトロフェニル、ラマンシグナル生成標識、磁気標識、スピン標識、エピトープ標識、例えば、ＦＬＡＧまたはＨＡエピトープ、発光標識、重原子標識、ナノ粒子標識、電気化学的標識、光散乱標識、球状シェル標識、半導体ナノ結晶標識、例えば、量子ドット（米国特許第６，２０７，３９２号に記載されている）、及び当業者に公知の任意の他のシグナル生成標識で標識されたプローブであって、標識が、二次検出分子の有無にかかわらずプローブを視覚化することを可能にし得るプローブを含んでもよい。ヌクレオチドは、ニックトランスレーション、ランダムプライミング、ＰＣＲラベリングなどの標準的な手法でプローブに直接組み込んでもよい。本明細書で使用される「シグナル」としては、蛍光、放射性、化学発光などを含む適切な手段によって適切に検出及び測定可能なシグナルが挙げられる。
検出に有用な標識部分の非限定的な例としては、限定するものではないが、適切な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ；複合体を形成し得る結合対のメンバー、例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、または抗原／抗体複合体、例としては、例えば、ウサギＩｇＧ及び抗ウサギＩｇＧ；フルオロフォア、例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、緑色蛍光タンパク質、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー、テキサスレッド、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、蛍光ランタニド複合体、例えば、ユーロピウム及びテルビウムを含むもの、シアニン色素ファミリーメンバー、例えば、Ｃｙ３及びＣｙ５、分子ビーコン及びそれらの蛍光誘導体、ならびに記載されているように当技術分野で公知の他のもの、例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ Ｃｏｒｐ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｌｙ １９９９） 及びｔｈｅ ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈｏａｇｌａｎｄに記載されるような当該技術分野で公知の他のもの；ルミノールなどの発光物質；金または銀の粒子または量子ドットなどの光散乱またはプラズモン共鳴材料が挙げられる。または放射性物質としては、１４Ｃ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、Ｔｃ９９ｍ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
他の標識、例えば、バックボーン標識も本開示の方法で使用され得る。バックボーン標識は、配列に依存しない方法で核酸に結合する核酸染色剤を含む。非限定的な例としては、挿入色素、例えば、フェナントリジン及びアクリジン（例えば、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、エチジウムホモ二量体－１及び－２、エチジウムモノアジド、及びＡＣＭＡ）；いくつかのマイナーグローブバインダー、例えば、インドール及びイミダゾール（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３４５８０、及びＤＡＰＩ）；ならびにその他の核酸染色剤、例えば、アクリジンオレンジ（インターカレートも可能）、７－ＡＡＤ、アクチノマイシンＤ、ＬＤＳ７５１、及びヒドロキシスチルバミジンが挙げられる。前述の核酸染色剤は全て、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．などのサプライヤーから市販されている。核酸染色剤のさらに他の例としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓの次の色素が挙げられる：シアニン色素、例えば、ＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅ、ＰＯＰＯ－１、ＰＯＰＯ－３、ＹＯＹＯ－１、ＹＯＹＯ－３、ＴＯＴＯ－１、ＴＯＴＯ－３、ＪＯＪＯ－１、ＬＯＬＯ－１、ＢＯＢＯ－１、ＢＯＢＯ－３、ＰＯ－ＰＲＯ－１、ＰＯ－ＰＲＯ－３、ＢＯ－ＰＲＯ－１、ＢＯ－ＰＲＯ－３、ＴＯ－ＰＲＯ－１、ＴＯ－ＰＲＯ－３、ＴＯ－ＰＲＯ－５、ＪＯ－ＰＲＯ－１、ＬＯ－ＰＲＯ－１、ＹＯ－ＰＲＯ－１、ＹＯ－ＰＲＯ－３、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、ＳＹＢＲ ＤＸ、ＳＹＴＯ－４０、－４１、－４２、－４３、－４４、－４５（青）、ＳＹＴＯ－１３、－１６、－２４、－２１、－２３、－１２、－１１、－２０、－２２、－１５、－１４、－２５（緑）、ＳＹＴＯ－８１、－８０、－８２、－８３、－８４、－８５（オレンジ）、ＳＹＴＯ－６４、－１７、－５９、－６１、－６２、－６０、－６３（赤）。
いくつかの実施形態において、セット内またはセット内にない各プローブが明確に視覚化され得るように、異なる色のフルオロフォア、例えば、７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸（ＡＭＣＡ）、５－（及び－６）－カルボキシ－Ｘ－ローダミン、リサミンローダミンＢ、５－（及び－６）－カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン－５－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、７－ジエチルアミノクマリン－３－カルボン酸、テトラメチルローダミン－５－（及び－６）－イソチオシアネート、５－（及び－６）－カルボキシテトラメチルローダミン、７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸、６－［フルオレセイン５－（及び－６）－カルボキサミド］ヘキサン酸、Ｎ－（４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａジアザ－３－インダセンプロピオン酸、エオシン－５－イソチオシアネート、エリスロシン－５－イソチオシアネート、ＴＲＩＴＣ、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒ－フィコエリトリン、Ｃｙ－３、Ｃｙ－５、Ｃｙ－７、テキサスレッド、ファー－レッド（Ｐｈａｒ－Ｒｅｄ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、及びＣＡＳＣＡＤＥＴＭブルーアセチラジドを選択し得る。いくつかの実施形態において、蛍光標識されたプローブは、蛍光顕微鏡及び各フルオロフォアに適切なフィルターを用いて、または複数のフルオロフォアを観察するためにデュアルまたはトリプルバンドパスフィルターセットを使用することによって見ることができる。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーなどの技術を使用して、プローブのハイブリダイゼーションパターンを調べてもよい。
他の実施形態において、プローブは、例えば、ビオチンもしくはジゴキシゲニンで間接的に標識してもよく、または３２Ｐ及び／もしくは３Ｈなどの放射性同位体で標識してもよい。非限定的な例として、ビオチンで間接的に標識されたプローブは、検出可能なマーカーに結合したアビジンによって検出され得る。例えば、アビジンは、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素マーカーに結合させてもよい。いくつかの実施形態において、酵素マーカーは、酵素のための基質及び／または触媒を使用する比色反応を使用して検出され得る。いくつかの実施形態において、アルカリホスファターゼのための触媒、例えば、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウムを使用し得る。いくつかの実施形態において、触媒は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、例えば、ジアミノ安息香酸に使用され得る。
製剤、投与経路、及び有効量
本開示のさらに別の態様は、本開示の薬剤または薬剤の組み合わせを含む医薬組成物の製剤、投与経路、及び有効用量に関する。そのような医薬組成物は、上記のように状態（例えば、ＬＨＯＮ）を治療するために使用され得る。
本開示の化合物は、経口（頬側及び舌下を含む）、直腸、鼻、局所、経皮パッチ、肺、膣、坐剤、もしくは非経口（眼内、硝子体内、筋肉内、動脈内、髄腔内、皮膚内、腹腔内、皮下及び静脈内を含む）投与に適したものを含む医薬製剤として、またはエアロゾル化、吸入もしくは吹送による投与に適した形態で、投与されてもよい。ドラッグデリバリーシステムに関する一般的な情報は、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｍｄ．（１９９９））に見出され得る。
様々な実施形態において、医薬組成物は、担体及び賦形剤（限定するものではないが、緩衝液、炭水化物、マンニトール、ポリペプチド、アミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤、懸濁剤、増粘剤及び／または保存剤を含む）、水、油、例としては、石油、動物、植物または合成由来の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、ミネラル油、ゴマ油など、生理食塩水、デキストロース及びグリセロール水溶液、香味剤、着色剤、脱脂剤及び他の許容可能な添加剤、アジュバント、または結合剤、生理学的条件を近似するための他の薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ緩衝剤、張度調整剤、乳化剤、湿潤剤などを含む。賦形剤の例としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、医薬調製物は、防腐剤を実質的に含まない。他の実施形態では、医薬調製物は、少なくとも１つの防腐剤を含んでもよい。医薬剤形に関する一般的な方法論は、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｍｄ．（１９９９））に見出される。本開示の組成物を投与するために当業者に公知の任意の適切な担体を使用してもよいが、担体のタイプは投与様式に応じて変化し得ることが認識され得る。
化合物は、周知の技術を使用してリポソーム内にカプセル化してもよい。生分解性ミクロスフェアをまた、本開示の医薬組成物のための担体として使用してもよい。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号、同第５，０７５，１０９号、同第５，９２８，６４７号、同第５，８１１，１２８号、同第５，８２０，８８３号、同第５，８５３，７６３号、同第５，８１４，３４４号、及び同第５，９４２，２５２号に開示されている。
化合物は、リポソームまたはミクロスフェア（または微粒子）で投与されてもよい。対象に投与するためのリポソーム及びミクロスフェアを調製するための方法は、当業者に周知である。その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７８９，７３４号は、生物学的材料をリポソームに封入するための方法を記載している。基本的に、材料を水溶液に溶解し、適切なリン脂質と脂質を添加し、必要に応じて界面活性剤と共に添加し、必要に応じて材料を透析または超音波処理する。既知の方法のレビューは、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，”Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．２．ｓｕｐ．８７－３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７９）によって示される。
ポリマーまたはポリペプチドで形成されたミクロスフェアは、当業者に周知であり、胃腸管を通過して血流に直接入るように調整され得る。あるいは、化合物を組み込んで、ミクロスフェアまたはミクロスフェアの複合体を、数日から数ヶ月の範囲の期間にわたって徐放するように移植してもよい。例えば、米国特許第４，９０６，４７４号、同第４，９２５，６７３号、及び同第３，６２５，２１４号、ならびにＪｅｉｎ，ＴＩＰＳ １９：１５５－１５７（１９９８），（これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
薬物の濃度を調整し、溶液のｐＨを緩衝し、等張性を調整して、眼内または硝子体内注射に適合させてもよい。
本開示の化合物は、適切なビヒクルにおいて、滅菌溶液または懸濁液として処方され得る。この医薬組成物は、従来の周知の殺菌技術によって殺菌してもよいし、または無菌濾過してもよい。得られた水溶液は、そのままで使用するために包装されてもよく、または凍結乾燥させられてもよく、この凍結乾燥調製品は、投与の前に滅菌溶液と組み合わされる。適切な製剤及び追加の担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ “Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”（２０ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ＭＤ）に記載されており、その教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
薬剤またはそれらの薬学的に許容される塩は、単独で、または１つ以上の他の薬剤と組み合わせて、または１つ以上の他の形態と組み合わせて提供されてもよい。例えば、製剤は、各薬剤の相対的な効力及び意図された適応症に応じて、特定の比率で１つ以上の薬剤を含んでもよい。例えば、２つの異なる宿主標的を標的とするための組成物において、そして効力が類似している場合、約１：１の比率の薬剤を使用してもよい。２つの形態は、同じ投薬単位で、例えば、１つのクリーム、坐剤、錠剤、カプセル、エアゾールスプレー、または飲料に溶解される粉末のパケットで一緒に処方されてもよく；または、各形態は、別々の単位、例えば、２つのクリーム、２つの坐剤、２つの錠剤、２つのカプセル、錠剤を溶解するための錠剤及び液体、２つのエアゾールスプレー、または粉末のパケット及び粉末溶解するための液体、等で製剤化されてもよい。
「薬学上許容される塩」という用語は、本開示で使用される薬剤の生物学的有効性及び特性を保持し、かつ生物学的にでも、その他の点でも望ましくないものではない塩を意味する。
典型的な塩とは、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムイオンなどの無機イオンの塩である。このような塩としては、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐトルエンスルホン酸、酢酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マンデル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸またはマレイン酸などの無機酸または有機酸との塩が挙げられる。さらに、薬剤（複数可）がカルボキシル基または他の酸性基を含む場合、それは、無機または有機塩基を用いて薬学的に許容される付加塩に変換され得る。適切な塩基の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシル－アミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどが挙げられる。
薬学上許容されるエステルまたはアミドとは、本開示で使用される薬剤の生物学的有効性及び特性を保持しており、かつ生物学的にもその他の点でも望ましくないものではない塩を示す。典型的なエステルとしては、エチル、メチル、イソブチル、エチレングリコールなどが挙げられる。典型的なアミドとしては、非置換アミド、アルキルアミド、ジアルキルアミドなどが挙げられる。
いくつかの実施形態において、薬剤は、１つ以上の他の化合物、形態、及び／または薬剤と組み合わせて、例えば、上記のように投与してもよい。１つ以上の他の活性剤を含む医薬組成物は、特定のモル比を含むように製剤化してもよい。例えば、他の活性剤に対する第１の活性剤が約９９：１～約１：９９のモル比を使用してもよい。実施形態のいくつかのサブセットでは、第１の活性剤：他の活性剤のモル比の範囲は、約８０：２０～約２０：８０、約７５：２５～約２５：７５、約７０：３０～約３０：７０、約６６：３３～約３３：６６、約６０：４０～約４０：６０；約５０：５０；及び約９０：１０～約１０：９０から選択される。第１の活性剤：他の活性剤のモル比は、約１：９であってもよく、いくつかの実施形態では、約１：１であってもよい。２つの薬剤、形態及び／または化合物は、同じ投薬単位で、例えば、飲料に溶解される１つのクリーム、坐剤、錠剤、カプセル、もしくは粉末のパケットで一緒に製剤化してもよく；または、各薬剤、形態、及び／もしくは化合物は、別々の単位、例えば、２つのクリーム、坐剤、錠剤、２つのカプセル、錠剤及び錠剤を溶解するための液体、エアゾールスプレー、粉末のパケット及び粉末を溶解するための液体などに製剤化してもよい。
必要または望ましい場合、薬剤及び／または薬剤の組み合わせは、さらに他の薬剤と一緒に投与してもよい。本開示の薬剤及び／または薬剤の組み合わせと同時投与され得る薬剤の選択は、少なくとも部分的に、治療される状態に依存し得る。
薬剤（複数可）（またはその薬学的に許容される塩、エステルまたはアミド）は、それ自体で、または活性剤（複数可）が１つ以上の薬学的に許容される担体との混合もしくは混合物である医薬組成物の形態で投与されてもよい。本明細書で使用される場合、医薬組成物は、対象への投与のために調製された任意の組成物であってもよい。本開示による使用のための医薬組成物は、例えば、投与され得る調製物への活性剤の加工を促進する、賦形剤、希釈剤及び／または助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して従来の方法で製剤化され得る。適切な製剤は、選択された投与経路に少なくとも部分的に依存し得る。本開示で有用な薬剤（複数可）、またはその薬学的に許容される塩、エステル、またはアミドは、経口、頬、局所、直腸、経皮、経粘膜、皮下、静脈内、眼内、硝子体内、及び筋肉内への適用、ならびに吸入による適用を含む、多数の投与経路または投与様式を使用して対象に送達され得る。
いくつかの実施形態において、例えば、大きな親油性部分の存在に起因して、油または非水性溶媒を使用して、薬剤を溶液にしてもよい。あるいは、エマルジョン、懸濁液、または他の調製物、例えば、リポソーム調製物を使用してもよい。リポソーム調製物に関して、状態の治療のためのリポソームを調製するための任意の公知の方法を使用してもよい。例えば、Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８－２５２（１９６５）及びＳｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４－４１９８（１９７８）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。リガンドをリポソームに結合させて、これらの組成物を特定の作用部位に向けてもよい。本開示の薬剤はまた、特定の対象集団における可溶化、投与、及び／またはコンプライアンスを促進するために、食品、例えば、クリームチーズ、バター、サラダドレッシング、またはアイスクリームに組み込んでもよい。
本開示の化合物は、非経口投与（例えば、注射、例えば、眼内または硝子体内注射による）用に製剤化してもよく、また、アンプル、プレフィルドシリンジ、少容量注入中の単位用量形態で、または防腐剤が添加された複数回用量容器中で、存在してもよい。この組成物は、油性または水性ビヒクル中のエマルジョン、溶液、または乳濁液、例えば、ポリエチレングリコール水溶液中の溶液などの形態をとってもよい。
注射可能な製剤の場合、ビヒクルは、ゴマ油、コーン油、綿実油、もしくはピーナッツ油、ならびにエリキシル剤、マンニトール、デキストロース、または無菌水性溶液、及び類似の薬学的ビヒクルを含む、水溶液または油性懸濁液、またはエマルジョンなど当技術分野で適切であることが公知であるビヒクルから選択してもよい。製剤はまた、ポリ（乳酸－コ－グリコール）酸などの生体適合性、生分解性であるポリマー組成物を含んでもよい。これらの材料を、マイクロスフェアまたはナノスフェアに作成し、薬物をロードし、さらにコーティングまたは誘導体化して、優れた徐放性能を提供し得る。眼周囲または眼内注射に適したビヒクルとしては、例えば、注射グレードの水中の治療剤の懸濁液、リポソーム、及び親油性物質に適したビヒクルが挙げられる。眼周囲または眼内注射のための他のビヒクルは、当該技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、この組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として慣用的な手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、この組成物はまた、注射部位の疼痛を和らげるために、可溶化剤及びリドカインなどの局所麻酔薬を含んでもよい。概して、この成分は、単位剤形で、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルもしくはサシェなどの気密封止容器内に乾燥した凍結乾燥粉末または水非含有濃縮物として、別々に供給されるか、あるいは一緒に混合されて供給される。この組成物は、注入によって投与すべき場合、無菌の薬学的グレードの水または生理食塩水を含む点滴ボトルで分注してもよい。この組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合され得るように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供されてもよい。
投与が注射による場合、活性化合物は、水溶液、特にハンクス溶液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合性のある緩衝液に製剤化され得る。この溶液は、懸濁剤、安定化剤及び／または分散剤のような処方剤を含んでもよい。あるいは、この活性化合物は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌されたパイロジェンフリーの水と共に構成するための粉末形態であってもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ペプチドによって刺激される免疫応答を増強するために添加されるアジュバントもなんら他の物質も含まない。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ペプチドに対する免疫応答を阻害する物質を含む。製剤化の方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ Ｐ．に開示されているように、当該技術分野で公知である。
いくつかの実施形態において、眼障害は、本開示の薬剤または薬剤の組み合わせを含む点眼液、懸濁液、軟膏または挿入物で効果的に治療され得る。目薬は、生理食塩水、緩衝溶液などの無菌水性溶液中で活性成分を溶解すること、または粉末組成物を組み合わせて、使用前に溶解することにより調製され得る。平衡塩溶液、生理食塩水溶液、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリエーテル類、ポリビニルアルコール及びポビドンなどのポリビニル類、メチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体類、鉱物油及び白色ワセリンなどの石油誘導体類、ラノリンなどの動物性脂肪類、カルボキシポリメチレンゲルなどのアクリル酸のポリマー類、ピーナッツ油などの植物性脂肪類、及びデキストランなどのポリサッカライド類、ならびにヒアルロン酸ナトリウムなどのグルコサミノグリカン類を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で公知であるような他のビヒクルが選択され得る。必要に応じて、点眼剤で通常使用される添加剤が添加されてもよい。かかる添加剤としては、等張化剤（例えば、塩化ナトリウムなど）、緩衝剤（例えば、ホウ酸、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、チオロブタノールなど）、増粘剤（例えば、ラクトース、マンニトール、マルトースなどの単糖；例えば、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウムなどのヒアルロン酸もしくはその塩；例えば、硫酸コンドリチンなどのムコポリサッカライド；例えば、ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、架橋ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、または当業者に公知の他の薬剤）が挙げられる。
本組成物の成分の溶解度は、組成物中の界面活性剤または他の適切な共溶媒によって増強され得る。そのような共溶媒としては、ポリソルベート２０、６０、及び８０、プルロニックＦ６８、Ｆ－８４及びＰ－１０３、シクロデキストリン、または当業者に公知の他の薬剤が挙げられる。そのような共溶媒は、約０．０１重量％～２重量％のレベルで使用され得る。
本開示の組成物は、複数回投与形態で包装してもよい。使用中の微生物汚染を防ぐために防腐剤が好ましい場合がある。適切な防腐剤としては、以下：塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、Ｏｎａｍｅｒ（オナマー）Ｍ、または当業者に公知の他の薬剤が挙げられる。従来技術の眼科用製品では、そのような防腐剤は、０．００４％～０．０２％のレベルで使用され得る。本出願の組成物において、防腐剤、好ましくは塩化ベンザルコニウムは、０．００１重量％～０．０１重量％未満、例えば、０．００１重量％～０．００８重量％、好ましくは約０．００５重量％のレベルで使用され得る。０．００５％の塩化ベンザルコニウムの濃度は、微生物の攻撃から本開示の組成物を保存するのに十分であり得ることが見出された。
いくつかの実施形態において、本開示の薬剤は、懸濁液形態ではなく可溶性形態で送達され、これにより、作用部位へのより迅速かつ定量的な吸収が可能になる。一般に、ゼリー、クリーム、ローション、坐剤及び軟膏などの製剤は、本開示の薬剤へのより広範な曝露を有する領域を提供し得、一方、溶液中の製剤、例えば、スプレーは、より即時の短期間の曝露を提供する。
さらに、本開示の化合物は、局所投与、眼内投与、眼周囲投与、または全身投与用の挿入物上、挿入物中、または挿入物に付着する徐放性製剤で使用するために生体適合性ポリマーに放出可能に付着させ得ると想定される。生体適合性ポリマーからの制御放出を、水溶性ポリマーと共に利用して、点眼可能な製剤も同様に形成し得る。例えば、ＰＬＧＡミクロスフェアまたはナノスフェアなどの生体適合性ポリマーからの制御放出は、徐放性投与のための眼内移植または注射に適した製剤で利用されてもよく、任意の適切な生分解性及び生体適合性ポリマーを使用してもよい。
さらに付番した実施形態
本開示のさらに付番した実施形態は以下のとおり本明細書に示す：
実施形態１。以下を含む組換え核酸：
ミトコンドリア標的化配列と；
配列番号１１または１２と少なくとも９９％同一である配列を含むミトコンドリアタンパク質コード配列と；
核酸配列と。
実施形態２。実施形態１の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号１２９～１５９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコードする、前記組換え核酸。
実施形態３。実施形態１に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態４。実施形態１に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるペプチド配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態５。実施形態１に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態６。実施形態１に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態７。実施形態１に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態８。実施形態１に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号１２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態８．１。実施形態１に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号１１に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態９。実施形態１～８及び８．１のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１１１～１２５からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、組換え核酸。
実施形態１０。前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１３または配列番号１４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、実施形態１－８～８．１のいずれか１項に記載の組換え核酸。
実施形態１１。実施形態１に記載の組換え核酸であって、前記組換え核酸が、配列番号２５～２８、３９～４２、５３～５６、６７～７０、及び８１～８４からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態１２。組換え核酸であって、以下：
ミトコンドリア標的化配列と；
配列番号１１または１２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むミトコンドリアタンパク質コード配列；と
３’ＵＴＲ核酸配列と、を含む前記組換え核酸。
実施形態１３。実施形態１２に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＣＯＸ８、ｓｃＲＰＭ２、ｌｃＳｉｒｔ５、ｔｂＮＤＵＳ７、ｎｃＱＣＲ２、ｈｓＡＴＰ５Ｇ２、ｈｓＬＡＣＴＢ、ｓｐｉｌｖ１、ｇｍＣＯＸ２、ｃｒＡＴＰ６、ｈｓＯＰＡ１、ｈｓＳＤＨＤ、ｈｓＡＤＣＫ３、ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＡＴＰ９（ｎｃＡＴＰ９）、ｈｓＧＨＩＴＭ、ｈｓＮＤＵＦＡＢ１、ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＤＣＫ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ＧＮＦＰ＿ｎｃＡＴＰ９、及びｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｌｃＳｉｒｔ５＿ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ２＿ｎｃＡＴＰ９からなる群より選択されるポリペプチドをコードする配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態１４。実施形態１２または１３に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号１２９～１５９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコードする、前記組換え核酸。
実施形態１５。実施形態１２～１４のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号２または３に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態１６。実施形態１２～１４のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態１７。実施形態１２～１４のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態１８。実施形態１２～１４のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態１９。前記３’ＵＴＲ核酸配列が前記ミトコンドリア標的化配列の３’に位置する、実施形態１２～１８のいずれか１項に記載の組換え核酸。
実施形態２０。実施形態１２～１９のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列が、ｈｓＡＣＯ２、ｈｓＡＴＰ５Ｂ、ｈｓＡＫ２、ｈｓＡＬＤＨ２、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＵＱＣＲＦＳ１、ｈｓＮＤＵＦＶ１、ｈｓＮＤＵＦＶ２、ｈｓＳＯＤ２、ｈｓＣＯＸ６ｃ、ｈｓＩＲＰ１、ｈｓＭＲＰＳ１２、ｈｓＡＴＰ５Ｊ２、ｒｎＳＯＤ２、及びｈｓＯＸＡ１Ｌからなる群より選択される配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態２１。実施形態１２～２０のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１１１～１２５からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態２２。実施形態１２～２１のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１３または配列番号１４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態２３。実施形態１２～２２のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、前記３’ＵＴＲ核酸配列の５’に位置する、前記組換え核酸。
実施形態２４。実施形態１２～２２のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、前記ミトコンドリア標的化配列の３’に位置する、前記組換え核酸。
実施形態２５。実施形態１２～２４のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記組換え核酸が、配列番号２５～２８、３９～４２、５３～５６、６７～７０、及び８１～８４からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態２６。実施形態１２～２５のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号１６２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むかまたはそれらからなるミトコンドリアタンパク質をコードする、前記組換え核酸。
実施形態２７。組換え核酸であって、ミトコンドリアタンパク質コード配列を含み、前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、ミトコンドリアタンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号１１または１２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％と同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態２８。ミトコンドリア標的化配列をさらに含む、実施形態２７に記載の組換え核酸。
実施形態２９。実施形態２７または２８に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＣＯＸ８、ｓｃＲＰＭ２、ｌｃＳｉｒｔ５、ｔｂＮＤＵＳ７、ｎｃＱＣＲ２、ｈｓＡＴＰ５Ｇ２、ｈｓＬＡＣＴＢ、ｓｐｉｌｖ１、ｇｍＣＯＸ２、ｃｒＡＴＰ６、ｈｓＯＰＡ１、ｈｓＳＤＨＤ、ｈｓＡＤＣＫ３、ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＡＴＰ９（ｎｃＡＴＰ９）、ｈｓＧＨＩＴＭ、ｈｓＮＤＵＦＡＢ１、ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＤＣＫ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ＧＮＦＰ＿ｎｃＡＴＰ９、及びｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｌｃＳｉｒｔ５＿ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ２＿ｎｃＡＴＰ９からなる群より選択されるポリペプチドをコードする配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態３０。実施形態２７～２９のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号１２９～１５９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコードする、前記組換え核酸。
実施形態３１。実施形態２７～３０のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態３２。実施形態２７～３１のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態３３。実施形態２７～３２のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態３４。実施形態２７～３３のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態３５。実施形態２７～３４のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態３６。３’ＵＴＲ核酸配列をさらに含む、実施形態２７～３５のいずれか１項に記載の組換え核酸。
実施形態３７。前記３’ＵＴＲ核酸配列が前記ミトコンドリア標的化配列の３’に位置する、実施形態３６に記載の組換え核酸。
実施形態３８。実施形態３６または３７に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列は、ｈｓＡＣＯ２、ｈｓＡＴＰ５Ｂ、ｈｓＡＫ２、ｈｓＡＬＤＨ２、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＵＱＣＲＦＳ１、ｈｓＮＤＵＦＶ１、ｈｓＮＤＵＦＶ２、ｈｓＳＯＤ２、ｈｓＣＯＸ６ｃ、ｈｓＩＲＰ１、ｈｓＭＲＰＳ１２、ｈｓＡＴＰ５Ｊ２、ｒｎＳＯＤ２、及びｈｓＯＸＡ１Ｌからなる群より選択される配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態３９。実施形態３６～３８のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１１１～１２５からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態４０。実施形態３６～３９のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１３または配列番号１４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態４１。実施形態３６～４０のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、前記３’ＵＴＲ核酸配列の５’に位置する、前記組換え核酸。
実施形態４２。実施形態３６～４１のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、前記ミトコンドリア標的化配列の３’に位置する、前記組換え核酸。
実施形態４３。実施形態３６～４２のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記組換え核酸が、配列番号２５～２８、３９～４２、５３～５６、６７～７０、及び８１～８４からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
実施形態４４。実施形態１～４３のいずれか１項に記載の組換え核酸を含む、ウイルスベクター。
実施形態４５。前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、実施形態４４に記載のウイルスベクター。
実施形態４６。前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６ベクターからなる群より選択される、実施形態４５に記載のウイルスベクター。
実施形態４７。前記ＡＡＶベクターが組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである、実施形態４５または４６に記載のウイルスベクター。
実施形態４８。前記ｒＡＡＶベクターが、ｒＡＡＶ２ベクターである、実施形態４７に記載のウイルスベクター。
実施形態４９。実施形態１～４３のいずれか１項に記載の組換え核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む医薬組成物。
実施形態５０。実施形態４９に記載の医薬組成物であって、その薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、前記医薬組成物。
実施形態５１。医薬組成物であって、実施形態４４～４８のいずれか１項に記載のウイルスベクター、及びその薬学的に許容される賦形剤を含む、前記医薬組成物。
実施形態５２。実施形態５０または５１に記載の医薬組成物であって、前記薬学的に許容される賦形剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、α，α－トレハロース二水和物、Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ポロキサマー１８８、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、前記医薬組成物。
実施形態５３。実施形態５０または５１に記載の医薬組成物であって、前記薬学的に許容される賦形剤が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、α，α－トレハロース二水和物、Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ポロキサマー１８８、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される、前記医薬組成物。
実施形態５４。前記医薬的に許容される賦形剤がポロキサマー１８８を含む、実施形態５０または５１に記載の医薬組成物。
実施形態５５。前記薬学的に許容される賦形剤が、０．０００１％～０．０１％のポロキサマー１８８を含む、実施形態５４に記載の医薬組成物。
実施形態５６。前記薬学的に許容される賦形剤が、０．００１％のポロキサマー１８８を含む、実施形態５５に記載の医薬組成物。
実施形態５７。前記薬学的に許容される賦形剤がさらに１つ以上の塩を含む、実施形態５０～５６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
実施形態５８。前記１つ以上の塩が、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、及びＫＨ２ＰＯ４を含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
実施形態５９。前記１つ以上の塩が、８０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、及び５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４を含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
実施形態６０。前記医薬組成物が６～８のｐＨを有する、実施形態４９～５９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
実施形態６１。前記医薬組成物が７．２～７．４のｐＨを有する、実施形態６０に記載の医薬組成物。
実施形態６２。前記医薬組成物が、７．３のｐＨを有する、実施形態６１に記載の医薬組成物。
実施形態６３。前記医薬組成物が少なくとも１．０×１０１０ｖｇ／ｍＬのウイルス力価を有する、実施形態４９～６２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
実施形態６４。前記医薬組成物が少なくとも５．０×１０１０ｖｇ／ｍＬのウイルス力価を有する、実施形態６３に記載の医薬組成物。
実施形態６５。実施形態４９～６４のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物が５回の凍結／解凍サイクルに供される場合、前記医薬組成物が、前記５回の凍結／解凍サイクル前のウイルス力価と比較して、ウイルス力価の少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％を保持する、前記医薬組成物。
実施形態６６。レーベル遺伝性視神経症の患者に投与された場合、前記医薬組成物が、前記組換え核酸を含まない同等の医薬組成物よりも高い平均視力回復を生じる、実施形態４９～６５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
実施形態６７。実施形態４９～６６のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物は、レーベル遺伝性視神経症の患者に投与された場合、配列番号１５に示される組換え核酸を含む同等の医薬組成物よりも高い平均視力回復を生じる、前記医薬組成物。
実施形態６８。実施形態４９～６７のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、眼の障害を治療する方法。
実施形態６９。前記眼の障害がレーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）である、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７０。前記患者の片方または両方の眼に前記医薬組成物を投与することを含む、実施形態６８または６９に記載の方法。
実施形態７１。前記医薬組成物が眼内または硝子体内注射を介して投与される、実施形態６８～７０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態７２。前記医薬組成物が、硝子体内注射で投与される、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３。前記医薬組成物の約０．０１～０．１ｍＬが、硝子体内注射で投与される、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７４。前記医薬組成物の約０．０５ｍＬが、硝子体内注射で投与される、実施形態７３に記載の方法。
実施形態７５。前記患者にメチルプレドニゾロンを投与することをさらに含む、実施形態６８～７４のいずれか１項に記載の方法。
実施形態７６。前記メチルプレドニゾロンが、前記医薬組成物の前記硝子体内注射の前に投与される、実施形態７５に記載の方法。
実施形態７７。前記メチルプレドニゾロンが経口投与される、実施形態７５または７６に記載の方法。
実施形態７８。前記メチルプレドニゾロンが、前記医薬組成物の前記硝子体内注射の前に、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日間毎日投与される、実施形態７５～７７のいずれか１項に記載の方法。
実施形態７９。前記メチルプレドニゾロンが毎日投与される、実施形態７５～７８のいずれか１項に記載の方法。
実施形態８０。約３２ｍｇ／６０ｋｇのメチルプレドニゾロンの１日投与量が投与される、実施形態７５～７９のいずれか１項に記載の方法。
実施形態８１。前記メチルプレドニゾロンが、前記医薬組成物の前記硝子体内注射の後に投与される、実施形態７５～８０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態８２。クレアチンリン酸ナトリウムを前記患者に投与することをさらに含む、実施形態７５～８１のいずれか１項に記載の方法。
実施形態８３。前記クレアチンリン酸ナトリウムが静脈内投与される、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８４。前記メチルプレドニゾロンが静脈内または経口投与される、実施形態７５～８３のいずれか１項に記載の方法。
実施形態８５。メチルプレドニゾロンを少なくとも１日間静脈内投与し、続いてメチルプレドニゾロンを少なくとも１週間経口投与することを含む、実施形態７５～８４のいずれか１項に記載の方法。
実施形態８６。メチルプレドニゾロンを少なくとも約３日間静脈内投与し、その後、メチルプレドニゾロンを少なくとも約６週間経口投与することを含む、実施形態８５に記載の方法。
実施形態８７。前記メチルプレドニゾロンが、約８０ｍｇ／６０ｋｇの１日量で静脈内投与される、実施形態７５～８６のいずれか１項に記載の方法。
実施形態８８。前記医薬組成物を前記投与することにより、前記組換え核酸を含まない同等の医薬組成物よりも高い平均視力回復が生じる、実施形態７５～８７のいずれか１項に記載の方法。
実施形態８９。前記医薬組成物を前記投与することにより、配列番号２５に記載の組換え核酸を含む同等の医薬組成物よりも高い平均視力回復が生じる、実施形態７５～８８のいずれか１項に記載の方法。
以下の例示的な実施形態は、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明することのみを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図していないことを理解されたい。特に明記しない限り、例えば、ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，１９８９） に開示された方法及び条件、または製造業者が推奨する条件を以下の例で使用してもよい。
実施例１－ＮＤ１プラスミド及びウイルスの調製
１．１プラスミドの調製
ヒトＮＤ１のヌクレオチド配列は、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏ）の参照遺伝子ＩＤ ４５３５（配列番号１６３）に基づいて得られた。ミトコンドリア標的化配列は、ＣＯＸ１０に由来する（例えば、配列番号１及び３に示されるように）。ヒトＮＤ１の最適化されたヌクレオチド配列（例えば、配列番号１１及び１２、本明細書ではＮＤ１及び最適化されたＮＤ１と呼ばれる）を、転写効率及び／または翻訳効率を改善するように設計した。最適化されたＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ１配列は、ＣＯＸ１０－ＮＤ１と約８１％の相同性があり（図４を参照）、コドン最適化後にＧＣ含量が４９．４５％～６４．２６％に上昇するため、遺伝子転写効率及びタンパク質翻訳効率が向上する。最適化されたｏｐｔ＿ＮＤ１遺伝子の３’の後に非翻訳領域（すなわち、３’ＵＴＲ、配列番号１３）が続き、組換え核酸、ＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ１－３’ＵＴＲ（配列番号２７に示す）を形成した。
合成された組換え核酸ＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ１－３’ＵＴＲ及びＡＡＶベクターを制限酵素で切断して凝集末端を形成し、次に組換え核酸をｒＡＡＶベクターに包埋してｒＡＡＶ最適化ＮＤ１プラスミドを形成した（すなわち、ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ１プラスミド）。ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ１プラスミドを、ＣＯＸ１０－ＮＤ１核酸を含むｒＡＡＶ２－ＮＤ１プラスミドと比較した。プラスミドはカナマイシンを含むＬＢプレートで３７℃で培養した。青いコロニー及び白いコロニーが現れ、白いコロニーは組換えクローンであった。白いコロニーを選び、１００ｍｇ／Ｌカナマイシン含有ＬＢ培地に加え、３７℃、２００ｒｐｍで８時間培養した後、培養細菌培地からプラスミドを抽出した。
１．２ 細胞トランスフェクション
トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３細胞を２２５ｃｍ２細胞培養ボトルに接種した。接種密度３．０×１０７細胞／ｍｌで、培養培地は１０％ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーターで一晩であった。トランスフェクションの日に、培養培地を、１０％ウシ血清を含む新鮮なＤＭＥＭに交換した。細胞が８０～９０％に増殖した後、培養培地を廃棄し、細胞にｒＡＡＶ２－ＮＤ１及びｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ１プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収した。
１．３ 組換えアデノ随伴ウイルスの収集、濃縮及び精製
ウイルス収集：１）ドライアイスエタノール浴（または液体窒素）及び３７℃の水浴を準備した。２）トランスフェクトされた細胞を培地と共に１５ｍｌの遠心チューブに回収した。３）この細胞を１０００ｒｐｍ／分で３分間遠心分離した。その細胞及び上清を分離した。その上清は別々に保存した。その細胞を１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。４）細胞懸濁液をドライアイス－エタノール浴と３７℃水浴との間で繰り返し移し、１０分間ずつ４回凍結融解し、解凍後にわずかに振とうした。
ウイルス濃度：１）１０，０００ｇの遠心分離で細胞破片を除去した。遠心上清を新しい遠心チューブに移した。２）ベンゾナーゼヌクレアーゼを添加して、残留プラスミドＤＮＡを除去した（最終濃度５０Ｕ／ｍｌ）。チューブを数回反転させて完全に混合し、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。３）その試料を０．４５μｍのろ過ヘッドでろ過した。そのろ液は濃縮されたｒＡＡＶ２ウイルスである。
ウイルス精製：１）６０％、５０％、４０％、または２５％の最終濃度のイオジキサノールを濃縮ウイルス溶液に添加した。２）試料を５０，０００ｇで４時間遠心分離して、密度勾配を形成した。濃縮されたｒＡＡＶ２粒子は、５０％イオジキサノールを含む画分の近くに集めた。３）ウイルスを透析カラムバッグにロードし、１０回溶出して、精製された組換えＡＡＶウイルスを得た。
したがって、ｒＡＡＶ２－ＮＤ１及びｒＡＡＶ２－ｏｐ＿ＮＤ１を含む濃縮され精製されたＡＡＶ粒子を得た。
同様に、ＯＰＡ１（配列番号５）などの他のミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）を使用して、上記の例のＣＯＸ１０を置き換え、組換えプラスミドでＡＡＶを作成してもよい。ＣＯＸ１０及びＯＰＡ１によってコードされるミトコンドリア標的ペプチドは、最適化されたＮＤ１核酸によってコードされるタンパク質をミトコンドリアの内膜に指向し得、それによってミトコンドリアを標的としたタンパク質の発現を達成する。
実施例２－ＣＯＸ１０－ＮＤ１及びさらに最適化されたＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ１ベクターを使用したＨＥＫ２９３細胞でのＮＤ１タンパク質の発現
ＨＥＫ２９３細胞に、１）ｒＡＡＶ２－ＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ１（配列番号２７を含む）または２）ｒＡＡＶ２－ＣＯＸ１０－ＮＤ１（配列番号２５を含む）を含むウイルス粒子を１０，０００のＭＯＩで形質導入した。対照群にはＰＢＳを使用した。ウエスタンブロッティングによる分析のために、形質導入の４８時間後に細胞タンパク質を抽出した。ローディングコントロールとしてβ－アクチンを使用した。図５に示すように、この結果、最適化されたｒＡＡＶ２－ＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ１で形質導入された細胞におけるＮＤ１発現レベルが、最適化されていないＣＯＸ１０－ＮＤ１で形質導入された細胞におけるＮＤ１発現レベルの２．１倍であることが示された。図５において、レーン１はＰＢＳコントロール、レーン２はｒＡＡＶ２－ＣＯＸ１０－ＮＤ１グループ、レーン３はｒＡＡＶ２－ＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ１グループである。
実施例３－ＨＥＫ２９３細胞におけるヒトＡＡＶ２－ＮＤ１の発現及びミトコンドリア局在
ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）がＮＤ１タンパク質をミトコンドリアに差し向け得ることを示すために、本発明者らは、蛍光顕微鏡／染色実験を実施したが、これは、これらの構築物を使用してＬＨＯＮを治療することが可能であることを示唆している。
ここでは、２９３細胞及びＲＧＣ－５細胞に、対応するｒＡＡＶ２－ＮＤ１－ＺｓＧｒｅｅｎをＭＯＩ１０６で形質導入した。ウイルス形質導入の４８時間後、蛍光顕微鏡を使用して緑色蛍光タンパク質の発現及び細胞の状態をモニターした。ミトコンドリアはマイトトラッカー（Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ）で染色して、細胞核は４％パラホルムアルデヒドを使用して固定した後にＤＡＰＩで染色した。
図６に示すように、ミトコンドリアをマイトトラッカー（Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ）で標識して、赤色で示し、ＮＤ１－ＺｓＧｒｅｅｎタンパク質を緑色で示した。レーザー共焦点顕微鏡によれば、ＮＤ１タンパク質は２９３細胞及びＲＧＣ－５細胞でミトコンドリアと共局在していた（合わせた黄色で示されている）。その結果、ＭＴＳを運ぶＮＤ１構築物がミトコンドリアでＮＤ１タンパク質の発現をもたらすことが示された。
実施例４－ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶ２－ＮＤ１の発現のダイナミクス
細胞におけるｒＡＡＶ２－ＮＤ１形質導入後の経時的なＮＤ１ ｍＲＮＡ発現の変化を研究するために、さまざまな時点で細胞試料を収集し、ＲＴ－ＰＣＴを使用してＮＤ１ ｍＲＮＡ発現レベルを分析した。
簡単に説明すると、２９３細胞を培養し、ＭＯＩが１０４または１０５のウイルス粒子で形質導入した。ＲＴ－ＰＣＲは、ＮＤ１及びＧＡＰＤＨ（コントロールとして）用に次のプライマーを使用して実施した。
ＮＤ１－Ｆ：ＧＡＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＧＧＴＡＴＣＴＴＧＡＡ（配列番号１６４）
ＮＤ１－Ｒ：ＧＴＣＧＧＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＴＡＧ（配列番号１６５）
ＧＡＰＤＨ－Ｆ：ＣＣＴＧＴＡＣＧＣＣＡＡＣＡＣＡＧＴＧＣ（配列番号１６６）
ＧＡＰＤＨ－Ｒ：ＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣ（配列番号１６７）
図７によると、その結果は、ＮＤ１ｍＲＮＡ発現が１０５のＭＯＩで形質導入後約７２時間でピーク値に達し、その後減少することを示し、ｒＡＡＶ２－ＮＤ１が細胞を効果的に形質導入できることを示唆している。
実施例５－ｒＡＡＶ２－ＮＤ１の硝子体内注射によるＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＮＤ１発現の探索的研究
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにｒＡＡＶ２－ＮＤ１の硝子体内注射（１μＬの注射量）を行い、注射の１日後、５日後、１０日後、または３０日後に眼の試料を分析した。試料からＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＴを行って発現レベルを分析した。図８に示すように、その結果、ｒＡＡＶ－ＮＤ１がマウスの眼で発現され得、ｍＲＮＡ発現レベルが注射後７日から注射後３０日まで増加し続けたことが示された。
実施例６－ｒＡＡＶ２－ＮＤ１で形質導入されたＨＥＫ２９３細胞におけるＮＤ１タンパク質の発現
２９３細胞に１０５のＭＯＩでｒＡＡＶ２－ＮＤ１ウイルスを形質導入し、ＮＤ１タンパク質の発現をウエスタンブロッティングで分析した。図９に示すように、その結果、ｒＡＡＶ２－ＮＤ１が首尾よく細胞を形質導入し、ＮＤ１の発現を誘導し得ることが示された。
実施例７－ウサギモデルを使用したｒＡＡＶ２－ＮＤ１の安全性試験
８匹のウサギを２つの群に分けた。ｒＡＡＶ２－ＮＤ１ウイルス溶液（１×１０１０ｖｇ／０．０５ｍＬ）またはＰＢＳ対照溶液を、毛様体扁平部の角膜輪部の外側３ｍｍから硝子体腔に穿刺した。血液試料を、注射後１か月及び２か月の定期的な血液検査及びサイトカイン分析のために収集した。
以下の表２及び３は、白血球数（ＷＢＣ）、赤血球数（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、血小板（ＰＬＴ）、平均赤血球容積（ＭＰＶ）、血小板ヘマトクリット値（ＰＣＴ）、平均血小板容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、及び好中球比（ＮＥＵＴ％）を含む慣用的な血液検査の結果を示した。この結果、ｒＡＡＶ２－ＮＤ１ウイルス注射群とＰＢＳ対照群の間に有意差がなかったことが示され、ｒＡＡＶ２－ＮＤ１の注射が安全であることを示している。
Figure 2023505522000137

Figure 2023505522000138
図１０に示すように、注射後１か月及び２か月の血液試料のサイトカイン分析では、ｒＡＡＶ２－ＮＤ１ウイルス注射群とＰＢＳ対照群との間でサイトカインレベル（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６）に有意差がなかったことが示され、ｒＡＡＶ２－ＮＤ１の注射が免疫応答を生成せず、安全で免疫原性がないことを示している。
実施例８－その他の融合タンパク質
実施例１～７の同様の実験方法は、配列番号１５～８４に記載されている他の融合タンパク質を使用して追跡され得る。そして、同様の結果が達成されることが期待される。
本発明の好適な実施形態が本明細書に示され記載されたが、そのような実施形態は、ほんの一例として提供されることが当業者に自明であろう。ここで、当業者は、多数の変化形、変更、及び置換を本発明から逸脱することなく想定するであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替手段が、本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、これらの特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにそれらの等価物が、それにより包含されることが意図される。

Claims (89)

  1. 組換え核酸であって、以下：
    ミトコンドリア標的化配列と；
    配列番号１１または１２と少なくとも９９％同一である配列を含むミトコンドリアタンパク質コード配列と；
    ３’ＵＴＲ核酸配列と、を含む前記組換え核酸。
  2. 請求項１に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号１２９～１５９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコードする、前記組換え核酸。
  3. 請求項１に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  4. 請求項１に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  5. 請求項１に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  6. 請求項１に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  7. 請求項１に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  8. 請求項１に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号１２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１１１～１２５からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  10. 請求項１～８のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１３または配列番号１４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  11. 請求項１に記載の組換え核酸であって、前記組換え核酸が、配列番号２５～２８、３９～４２、５３～５６、６７～７０、及び８１～８４からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  12. 組換え核酸であって、以下：
    ミトコンドリア標的化配列と；
    配列番号１１または１２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むミトコンドリアタンパク質コード配列；と
    ３’ＵＴＲ核酸配列と、を含む前記組換え核酸。
  13. 請求項１２に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＣＯＸ８、ｓｃＲＰＭ２、ｌｃＳｉｒｔ５、ｔｂＮＤＵＳ７、ｎｃＱＣＲ２、ｈｓＡＴＰ５Ｇ２、ｈｓＬＡＣＴＢ、ｓｐｉｌｖ１、ｇｍＣＯＸ２、ｃｒＡＴＰ６、ｈｓＯＰＡ１、ｈｓＳＤＨＤ、ｈｓＡＤＣＫ３、ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＡＴＰ９（ｎｃＡＴＰ９）、ｈｓＧＨＩＴＭ、ｈｓＮＤＵＦＡＢ１、ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＤＣＫ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ＧＮＦＰ＿ｎｃＡＴＰ９、及びｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｌｃＳｉｒｔ５＿ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ２＿ｎｃＡＴＰ９からなる群より選択されるポリペプチドをコードする配列を含む、前記組換え核酸。
  14. 請求項１２または１３に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号１２９～１５９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコードする、前記組換え核酸。
  15. 請求項１２～１４のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号２または３に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  16. 請求項１２～１４のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  17. 請求項１２～１４のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  18. 請求項１２～１４のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  19. 前記３’ＵＴＲ核酸配列が前記ミトコンドリア標的化配列の３’に位置する、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の組換え核酸。
  20. 請求項１２～１９のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列は、ｈｓＡＣＯ２、ｈｓＡＴＰ５Ｂ、ｈｓＡＫ２、ｈｓＡＬＤＨ２、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＵＱＣＲＦＳ１、ｈｓＮＤＵＦＶ１、ｈｓＮＤＵＦＶ２、ｈｓＳＯＤ２、ｈｓＣＯＸ６ｃ、ｈｓＩＲＰ１、ｈｓＭＲＰＳ１２、ｈｓＡＴＰ５Ｊ２、ｒｎＳＯＤ２、及びｈｓＯＸＡ１Ｌからなる群より選択される配列を含む、前記組換え核酸。
  21. 請求項１２～２０のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１１１～１２５からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  22. 請求項１２～２１のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１３または配列番号１４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  23. 前記ミトコンドリア標的化配列が、前記３’ＵＴＲ核酸配列の５’に位置する、請求項１２～２２のいずれか１項に記載の組換え核酸。
  24. 請求項１２～２２のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、前記ミトコンドリア標的化配列の３’に位置する、前記組換え核酸。
  25. 請求項１２～２４のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記組換え核酸が、配列番号２５～２８、３９～４２、５３～５６、６７～７０、及び８１～８４からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  26. 請求項１２～２５のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号１６２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むかまたはそれらからなるミトコンドリアタンパク質をコードする、前記組換え核酸。
  27. 組換え核酸であって、ミトコンドリアタンパク質コード配列を含み、前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、ミトコンドリアタンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号１１または１２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％と同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  28. ミトコンドリア標的化配列をさらに含む、請求項２７に記載の組換え核酸。
  29. 請求項２７または２８に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＣＯＸ８、ｓｃＲＰＭ２、ｌｃＳｉｒｔ５、ｔｂＮＤＵＳ７、ｎｃＱＣＲ２、ｈｓＡＴＰ５Ｇ２、ｈｓＬＡＣＴＢ、ｓｐｉｌｖ１、ｇｍＣＯＸ２、ｃｒＡＴＰ６、ｈｓＯＰＡ１、ｈｓＳＤＨＤ、ｈｓＡＤＣＫ３、ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＡＴＰ９（ｎｃＡＴＰ９）、ｈｓＧＨＩＴＭ、ｈｓＮＤＵＦＡＢ１、ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＤＣＫ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６ ＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ＧＮＦＰ＿ｎｃＡＴＰ９、及びｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｌｃＳｉｒｔ５＿ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ２＿ｎｃＡＴＰ９からなる群より選択されるポリペプチドをコードする配列を含む、前記組換え核酸。
  30. 請求項２７～２９のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号１２９～１５９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコードする、前記組換え核酸。
  31. 請求項２７～３０のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  32. 請求項２７～３１のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  33. 請求項２７～３２のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  34. 請求項２７～３３のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  35. 請求項２７～３４のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  36. ３’ＵＴＲ核酸配列をさらに含む、請求項２７～３５のいずれか１項に記載の組換え核酸。
  37. 前記３’ＵＴＲ核酸配列が前記ミトコンドリア標的化配列の３’に位置する、請求項３６に記載の組換え核酸。
  38. 請求項３６または３７に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列が、ｈｓＡＣＯ２、ｈｓＡＴＰ５Ｂ、ｈｓＡＫ２、ｈｓＡＬＤＨ２、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＵＱＣＲＦＳ１、ｈｓＮＤＵＦＶ１、ｈｓＮＤＵＦＶ２、ｈｓＳＯＤ２、ｈｓＣＯＸ６ｃ、ｈｓＩＲＰ１、ｈｓＭＲＰＳ１２、ｈｓＡＴＰ５Ｊ２、ｒｎＳＯＤ２、及びｈｓＯＸＡ１Ｌからなる群より選択される配列を含む、前記組換え核酸。
  39. 請求項３６～３８のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１１１～１２５からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  40. 請求項３６～３９のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１３または配列番号１４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  41. 前記ミトコンドリア標的化配列が、前記３’ＵＴＲ核酸配列の５’に位置する、請求項３６～４０のいずれか１項に記載の組換え核酸。
  42. 請求項３６～４１のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記ミトコンドリア標的化配列が、前記ミトコンドリア標的化配列の３’に位置する、前記組換え核酸。
  43. 請求項３６～４２のいずれか１項に記載の組換え核酸であって、前記組換え核酸が、配列番号２５～２８、３９～４２、５３～５６、６７～７０、及び８１～８４からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、前記組換え核酸。
  44. 請求項１～４３のいずれか１項に記載の組換え核酸を含む、ウイルスベクター。
  45. 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４４に記載のウイルスベクター。
  46. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６ベクターからなる群より選択される、請求項４５に記載のウイルスベクター。
  47. 前記ＡＡＶベクターが組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項４５または４６に記載のウイルスベクター。
  48. ｒＡＡＶベクターが、ｒＡＡＶ２ベクターである、請求項４７に記載のウイルスベクター。
  49. 請求項１～４３のいずれか１項に記載の組換え核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む医薬組成物。
  50. 請求項４９に記載の医薬組成物であって、その薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、前記医薬組成物。
  51. 医薬組成物であって、請求項４４～４８のいずれか１項に記載のウイルスベクター、及びその薬学的に許容される賦形剤を含む、前記医薬組成物。
  52. 請求項５０または５１に記載の医薬組成物であって、前記薬学的に許容される賦形剤が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、α，α－トレハロース二水和物、Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ポロキサマー１８８、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、前記医薬組成物。
  53. 請求項５０または５１に記載の医薬組成物であって、前記薬学的に許容される賦形剤が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、α，α－トレハロース二水和物、Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ポロキサマー１８８、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される、前記医薬組成物。
  54. 前記薬学的に許容される賦形剤がポロキサマー１８８を含む、請求項５０または５１に記載の医薬組成物。
  55. 前記薬学的に許容される賦形剤が、０．０００１％～０．０１％のポロキサマー１８８を含む、請求項５４に記載の医薬組成物。
  56. 前記薬学的に許容される賦形剤が、０．００１％のポロキサマー１８８を含む、請求項５５に記載の医薬組成物。
  57. 前記薬学的に許容される賦形剤が１つ以上の塩をさらに含む、請求項５０～５６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  58. 前記１つ以上の塩が、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、及びＫＨ２ＰＯ４を含む、請求項５７に記載の医薬組成物。
  59. 前記１つ以上の塩が、８０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、及び５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４を含む、請求項５７に記載の医薬組成物。
  60. 前記医薬組成物が、６～８のｐＨを有する、請求項４９～５９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  61. 前記医薬組成物が、７．２～７．４のｐＨを有する、請求項６０に記載の医薬組成物。
  62. 前記医薬組成物が、７．３のｐＨを有する、請求項６１に記載の医薬組成物。
  63. 前記医薬組成物が少なくとも１．０×１０１０ｖｇ／ｍＬのウイルス力価を有する、請求項４９～６２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  64. 前記医薬組成物が少なくとも５．０×１０１０ｖｇ／ｍＬのウイルス力価を有する、請求項６３に記載の医薬組成物。
  65. 請求項４９～６４のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物が５回の凍結／解凍サイクルに供される場合、前記医薬組成物が、前記５回の凍結／解凍サイクル前のウイルス力価と比較して、前記ウイルス力価の少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％を保持する、前記医薬組成物。
  66. 請求項４９～６５のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物が、レーベル遺伝性視神経症の患者に投与された場合、前記組換え核酸を含まない同等の医薬組成物よりも高い平均視力回復を生じる、前記医薬組成物。
  67. 請求項４９～６６のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物は、レーベル遺伝性視神経症の患者に投与された場合、配列番号１５に示される組換え核酸を含む同等の医薬組成物よりも高い平均視力回復を生じる、前記医薬組成物。
  68. 眼の障害の治療方法であって、請求項４９～６７のいずれか１項に記載の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、前記治療方法。
  69. 前記眼の障害がレーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）である、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記患者の片方または両方の眼に前記医薬組成物を投与することを含む、請求項６８または６９に記載の方法。
  71. 前記医薬組成物が眼内または硝子体内注射を介して投与される、請求項６８～７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 前記医薬組成物が、硝子体内注射で投与される、請求項７１に記載の方法。
  73. 約０．０１～０．１ｍＬの前記医薬組成物が、硝子体内注射で投与される、請求項７２に記載の方法。
  74. 約０．０５ｍＬの前記医薬組成物が、硝子体内注射で投与される、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記患者にメチルプレドニゾロンを投与することをさらに含む、請求項６８～７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. 前記メチルプレドニゾロンが、前記医薬組成物の前記硝子体内注射の前に投与される、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記メチルプレドニゾロンが経口投与される、請求項７５または７６に記載の方法。
  78. 前記メチルプレドニゾロンが、前記医薬組成物の前記硝子体内注射の前に、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日間毎日投与される、請求項７５～７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. 前記メチルプレドニゾロンが毎日投与される、請求項７５～７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. 約３２ｍｇ／６０ｋｇのメチルプレドニゾロンの１日投与量が投与される、請求項７５～７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記メチルプレドニゾロンが、前記医薬組成物の前記硝子体内注射の後に投与される、請求項７５～８０のいずれか１項に記載の方法。
  82. クレアチンリン酸ナトリウムを前記患者に投与することをさらに含む、請求項７５～８１のいずれか１項に記載の方法。
  83. 前記クレアチンリン酸ナトリウムが静脈内投与される、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記メチルプレドニゾロンが静脈内または経口投与される、請求項７５～８３のいずれか１項に記載の方法。
  85. メチルプレドニゾロンを少なくとも１日間静脈内投与すること、続いてメチルプレドニゾロンを少なくとも１週間経口投与することを含む、請求項７５～８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. メチルプレドニゾロンを少なくとも約３日間静脈内投与すること、その後、メチルプレドニゾロンを少なくとも約６週間経口投与することを含む、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記メチルプレドニゾロンが、約８０ｍｇ／６０ｋｇの１日量で静脈内投与される、請求項７５～８６のいずれか１項に記載の方法。
  88. 前記医薬組成物を前記投与することにより、前記組換え核酸を含まない同等の医薬組成物よりも高い平均視力回復が生じる、請求項７５～８７のいずれか１項に記載の方法。
  89. 前記医薬組成物を前記投与することにより、配列番号２５に記載の組換え核酸を含む同等の医薬組成物よりも高い平均視力回復が生じる、請求項７５～８８のいずれか１項に記載の方法。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2019296451B2 (en) 2018-06-29 2021-04-29 Wuhan Neurophth Biotechnology Limited Company Compositions and methods for treating leber's hereditary optic neuropathy
SG11202101032VA (en) 2018-08-20 2021-02-25 Wuhan Neurophth Biotechnology Ltd Company Compositions and methods for treating leber's hereditary optic neuropathy
CN114213549B (zh) * 2021-12-24 2024-01-05 上海生物芯片有限公司 定位于线粒体的融合蛋白、接头及其用途
WO2024144330A1 (ko) * 2022-12-29 2024-07-04 주식회사 엣진 레베르 유전성 시신경병증의 미토콘드리아 염기 변이 교정 시스템

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3625214A (en) 1970-05-18 1971-12-07 Alza Corp Drug-delivery device
US4906474A (en) 1983-03-22 1990-03-06 Massachusetts Institute Of Technology Bioerodible polyanhydrides for controlled drug delivery
US4789734A (en) 1985-08-06 1988-12-06 La Jolla Cancer Research Foundation Vitronectin specific cell receptor derived from mammalian mesenchymal tissue
WO1988001213A1 (en) 1986-08-18 1988-02-25 Clinical Technologies Associates, Inc. Delivery systems for pharmacological agents
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US5811128A (en) 1986-10-24 1998-09-22 Southern Research Institute Method for oral or rectal delivery of microencapsulated vaccines and compositions therefor
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
US5928647A (en) 1993-01-11 1999-07-27 Dana-Farber Cancer Institute Inducing cytotoxic T lymphocyte responses
WO1997039776A1 (en) 1996-04-19 1997-10-30 Genetic Therapy, Inc. Gene therapy involving concurrent and repeated administration of adenoviruses and immunosuppressive agents
US5814451A (en) * 1997-01-17 1998-09-29 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Subunits of NADH dehydrogenase
US6207392B1 (en) 1997-11-25 2001-03-27 The Regents Of The University Of California Semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
CN1270222A (zh) * 2000-03-17 2000-10-18 国家人类基因组南方研究中心 一种新的人辅酶ⅰ亚基异构体蛋白及其编码序列
AU5091201A (en) 2000-03-21 2001-10-03 Curagen Corp Vegf-modulated genes and methods employing them
WO2002082904A2 (en) 2001-04-13 2002-10-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of treating or retarding the development of blindness
MX360727B (es) 2004-06-01 2018-11-14 Genzyme Corp Composiciones y metodos para evitar la agregacion del vector aav.
US20130022979A1 (en) 2005-04-18 2013-01-24 Genesis Genomics Inc. 3.4kb MITOCHONDRIAL DNA DELETION FOR USE IN THE DETECTION OF CANCER
EP2339032B1 (en) * 2005-04-18 2016-12-28 MDNA Life Sciences Inc. Mitochondrial mutations and rearrangements as a diagnostic tool for the detection of sun exposure, prostate cancer and other cancers
ES2541771T3 (es) 2005-05-03 2015-07-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Expresión de una proteína mitocondrial mediante un enfoque alotópico mejorado
WO2008063802A2 (en) 2006-10-23 2008-05-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Suppression of mitochondrial oxidative stress
EP2162747B1 (en) 2007-06-20 2014-04-30 Galapagos N.V. Molecular targets and methods to identify compounds for treating bone and joint degenerative diseases
WO2010040901A1 (en) * 2008-10-07 2010-04-15 Pierre Rustin Alternative oxidase and uses thereof
AU2009308380B2 (en) 2008-10-22 2015-05-28 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Methods for treating eye disorders
EP3272871B1 (en) * 2009-03-27 2020-01-15 MDNA Life Sciences Inc. Aberrant mitochondrial dna, associated fusion transcripts and translation products and hybridization probes therefor
BR112012018899A2 (pt) 2010-01-28 2015-09-15 Philadelphia Children Hospital "método para purificar partículas de vetor de vírus adeno-associado."
CN102517304B (zh) 2011-12-16 2013-08-28 中国农业科学院生物技术研究所 重组葡萄糖氧化酶的优化基因及其表达载体和应用
DE18200782T1 (de) * 2012-04-02 2021-10-21 Modernatx, Inc. Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen
US20160289674A1 (en) 2012-04-02 2016-10-06 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of membrane proteins
CN102634527B (zh) 2012-04-11 2013-11-06 华中科技大学同济医学院附属同济医院 重组人nadh脱氢酶亚单位4基因及其表达载体构建方法
TWI690322B (zh) 2012-10-02 2020-04-11 法商傳斯堅公司 含病毒的調配物及其使用
WO2016044023A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 The University Of Iowa Research Foundation Viral rna segments as immunomodulatory agents and vaccine components
CN104450747B (zh) * 2014-09-23 2018-02-09 武汉纽福斯生物科技有限公司 用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病毒‑NADH脱氢酶亚单位4基因全长以及药剂
CA2991301A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
CN110049769A (zh) 2016-12-04 2019-07-23 阿拉维·霍拉萨尼·默哈达姆·马塞尔·维克托 治疗与线粒体应激相关的疾病的方法
US20180207293A1 (en) 2017-01-25 2018-07-26 2C Tech Corp. Nanoparticles for sustained ophthalmic drug delivery and methods of use
WO2019033119A1 (en) 2017-08-11 2019-02-14 Unity Biotechnology, Inc. TREATMENT OF OPHTHALMIC CONDITIONS SUCH AS MACULAR DEGENERATION, GLAUCOMA AND DIABETIC RETINOPATHY USING PHARMACEUTICAL AGENTS THAT ELIMINATE SENESCENT CELLS
CN109970861B (zh) * 2017-12-27 2021-06-11 武汉纽福斯生物科技有限公司 一种靶向线粒体的nd4融合蛋白及其制备方法和应用
US20210163898A1 (en) 2018-04-16 2021-06-03 The Children's Hospital Of Philadelphia Mitochondrial rna import for treating mitochondrial disease
CN112384625A (zh) 2018-06-11 2021-02-19 珍视生物股份公司 重组aav载体及其使用方法
WO2020010491A1 (zh) 2018-07-09 2020-01-16 武汉纽福斯生物科技有限公司 编码人nadh脱氢酶亚单位4蛋白的核酸及其应用
CN110846392A (zh) 2018-08-20 2020-02-28 武汉纽福斯生物科技有限公司 一种重组腺相关病毒或含其的试剂盒及其应用
CN111068071A (zh) 2018-10-22 2020-04-28 武汉纽福斯生物科技有限公司 基因治疗Leber遗传学视神经病变
CN110876269B (zh) * 2018-06-29 2021-07-30 武汉纽福斯生物科技有限公司 治疗遗传性视神经病变的组合物和方法
WO2020000641A1 (zh) 2018-06-29 2020-01-02 武汉纽福斯生物科技有限公司 编码人nadh脱氢酶亚单位蛋白的核酸及其应用
AU2019296451B2 (en) 2018-06-29 2021-04-29 Wuhan Neurophth Biotechnology Limited Company Compositions and methods for treating leber's hereditary optic neuropathy
CN111073899B (zh) 2018-10-19 2021-01-01 武汉纽福斯生物科技有限公司 一种编码人nadh脱氢酶亚单位4蛋白的核酸及其应用
WO2020001657A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Wuhan Neurophth Biological Technology Limited Company Compositions and methods for treating leber's hereditary optic neuropathy
WO2020038352A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 Wuhan Neurophth Biological Technology Limited Company Compositions and methods for treating leber's hereditary optic neuropathy
SG11202101032VA (en) * 2018-08-20 2021-02-25 Wuhan Neurophth Biotechnology Ltd Company Compositions and methods for treating leber's hereditary optic neuropathy

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