JP2023505206A - 小化合物を使用するｉＰＳＣ由来エフェクター免疫細胞の増強 - Google Patents

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Abstract

ゲノム操作されたｉＰＳＣの指向された分化から得られた機能的に増強された派生エフェクター細胞を得るための方法及び組成物が提供される。本明細書で提供される派生細胞は、改善又は増強された治療効果をもたらす安定した機能的なゲノム編集を備えている。機能的に増強された派生エフェクター細胞を単独で、又は併用療法における抗体若しくはチェックポイント阻害剤と含む治療用組成物及びそれらの使用も提供される。【選択図】図２Ａ

Description

（関連出願の相互参照）
この出願は、２０１９年１２月６日に出願された米国仮出願第６２／９４５，０４０号の優先権を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、既製の免疫細胞製品の分野に広く関係している。より具体的には、本開示は、インビボで治療的に関連する特性を送達することができる多機能エフェクター細胞を開発するための戦略に関係している。本開示の下で開発された細胞製品は、患者由来の細胞療法の重大な制限に対処している。
養子細胞療法の分野は現在、患者由来及びドナー由来の細胞の使用に重点が置かれているため、癌免疫療法の一貫した製造を達成し、利益を得る可能性のあるすべての患者に治療を提供することが特に困難である。患者の良好な転帰を促進するために、養子移入されたリンパ球の有効性及び持続性を改善する必要もある。Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等のリンパ球は、自然免疫及び獲得免疫において重要な役割を果たす強力な抗腫瘍エフェクターである。しかしながら、養子細胞療法のためのこれらの免疫細胞の使用は依然として困難であり、改善に対する満たされていない要求が存在する。したがって、養子免疫療法においてＴ細胞及びＮＫ細胞、又は他のリンパ球の可能性を最大限に利用する重要な機会が残っている。
応答率、細胞枯渇、輸血された細胞の喪失（生存及び／又は持続性）、標的喪失又は系譜転換による腫瘍エスケープ、腫瘍標的化の精度、標的外毒性、腫瘍外効果から、固形腫瘍に対する有効性、すなわち、腫瘍微小環境及び関連する免疫抑制、動員、輸送、及び浸潤に及ぶ問題に対処する機能的に改善されたエフェクター細胞が必要である。治療用細胞集団のインビトロの挙動の特性決定は重要であるが、多くの場合、動物モデル及び／又は初期の臨床試験を使用して、インビボの機能及び性能（すなわち、効力、有効性、及び安全性プロファイル）を評価することは更に重要である。更に、細胞治療のためのエフェクター細胞の使用は、好ましくは、スケールアップを可能にするだけでなく、細胞の効力、細胞の有効性、及び患者の安全性を維持及び／又は促進する製造プロセスを利用するであろう。細胞治療の製造プロセスにおける多くの重要な側面の中で、本出願は、細胞の増殖及び凍結保存を重要な関心領域として特定し、これは凍結－融解サイクル中に細胞の生存率及び機能性に大きな影響を与え、ｉＰＳＣ分化に由来するエフェクター細胞のインビボ細胞の有効性及び持続性は、ｉＰＳＣ分化後のエフェクター細胞増殖段階で複雑に影響を受ける。本出願は、細胞増殖中に１つ又は複数の選択された化合物でｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を処置することにより、エフェクター細胞を微調整し、化合物処置なしのｉＰＳＣ由来エフェクター細胞と比較した、持続性、腫瘍浸潤、腫瘍殺傷及び腫瘍クリアランスを含むがこれらに限定されないインビボの効力及び有効性を高めながら、極低温凍結融解製造プロセスを通じて持続可能な治療用エフェクター細胞をもたらすことを提供する。
本発明の目的は、単一細胞由来のｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）クローン株から分化した派生非多能性細胞を生成するための方法及び組成物を提供することであり、ｉＰＳＣ株はそのゲノムに１つ又はいくつかの遺伝子修飾を含む。該１つ又はいくつかの遺伝子修飾には、ＤＮＡの挿入、欠失、及び置換が含まれ、これらの修飾は、分化、拡大、継代、及び／又は移植後の、その後の由来細胞において保持され、機能し続ける。
本出願のｉＰＳＣ由来の非多能性細胞には、ＣＤ３４細胞、造血性内皮細胞、ＨＳＣ（造血幹細胞及び前駆細胞）、造血多分化能前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＢ細胞が含まれるが、これらに限定されない。本出願のｉＰＳＣ由来の非多能性細胞は、同じ遺伝子修飾を含むｉＰＳＣからの分化を通じて、それらのゲノムに１つ又はいくつかの遺伝子修飾を含む。遺伝子操作された派生細胞を得るための操作されたクローンｉＰＳＣ分化戦略では、指示された分化におけるｉＰＳＣの発生の可能性が、ｉＰＳＣの操作されたモダリティによって悪影響を受けないこと、及び操作されたモダリティが派生細胞で意図したとおりに機能することも必要である。更に、この戦略は、末梢血から得られたＴ細胞又はＮＫ細胞等の初代リンパ球を操作する際の現在の障壁、すなわち、そのような細胞はしばしば、再現性と均一性を欠き、高い細胞死と低い細胞増殖を伴う不十分な細胞の持続性を呈する細胞をもたらし、そのような細胞を操作することが困難であることに起因する障壁を克服する。更に、この戦略は、最初は不均一な一次細胞源を使用して別の方法で得られる不均一なエフェクター細胞集団の生成を回避する。
本発明のいくつかの態様は、それぞれ、再プログラミングプロセスの後、それと同時、及びその前のゲノム操作の戦略を使用して得られたゲノム操作されたｉＰＳＣを提供する。上述の方法の一実施形態では、１つ又は複数の選択された部位での少なくとも１つの標的化されたゲノム編集は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、あるいは、ゲノム操作されたｉＰＳＣ又はその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／又は生存率を促進するタンパク質をコードする１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドの挿入を含む。一実施形態では、少なくとも１つの標的化されたゲノム編集を含む、得られたゲノム操作されたｉＰＳＣは、機能的であり、分化能があり、同じ機能的なゲノム編集を含む非多能性細胞に分化することができる。
したがって、一態様では、本発明はまた、免疫細胞又はその集団を製造する方法であって、免疫細胞に、デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、あるいはそれらの誘導体又は類似体のうちの少なくとも１つを含む、小化合物処置を行って、それにより、同じ小化合物処置なしの対応する免疫細胞と比較して、解凍後の細胞毒性が増強された免疫細胞を得る、方法を提供する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化した派生エフェクター免疫細胞であり、エフェクター免疫細胞は、派生ＣＤ３４細胞、派生造血幹及び前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆細胞、派生ＮＫ細胞前駆細胞、派生Ｔ細胞、派生ＮＫＴ細胞、派生ＮＫ細胞、派生Ｂ細胞、あるいは対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ又は複数の機能的特徴を有する派生エフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは以下の編集、（ｉ）第１の標的特異性を有する第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；（ｉｉ）ＣＤ３８ノックアウト；（ｉｉｉ）天然の対応する細胞と比較した、ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損；（ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの発現の導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方又は両方のノックアウト；（ｖ）ＣＤ１６又はそのバリアント；（ｖｉ）第２の標的特異性を有する第２のＣＡＲ；（ｖｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的又は完全なペプチドを含むシグナル伝達複合体；（ｖｉｉｉ）表２に列記された遺伝子型のうちの少なくとも１つ；（ｉｘ）天然の対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つにおける欠失又は低減された発現；あるいは（ｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及び二重若しくは多重特異性又はユニバーサルエンゲージャと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入された又は増加した発現のうちの少なくとも１つを含み、ｉＰＳＣから分化したエフェクター免疫細胞は、ｉＰＳＣと同じ１つ又は複数の編集を含む。
いくつかの実施形態では、小化合物処置は、（ｉ）デキサメタゾン又はその誘導体若しくは類似体を含み；（ｉｉ）サイトカインＩＬ７を含まないか、又は本質的に含まず、任意選択で、処置中の免疫細胞はＴ細胞であり；（ｉｉｉ）サイトカインＩＬ２及び／又はサイトカインＩＬ１５を含まないか、又は本質的に含まず、場合により、処置中の免疫細胞はＮＫ細胞であり；（ｉｖ）デキサメタゾンを含むが、サイトカインＩＬ７を含まず；（ｖ）サイトカインを含まないか本質的に含まず；（ｖｉ）細胞培養中及び／又は細胞保存の前又は後であり；（ｖｉｉ）細胞をｉＰＳＣから分化させた後の免疫細胞増殖中であり、及び／又は（ｖｉｉｉ）凍結保存前の約１～約１２日、又は約３～約６日続く。いくつかの実施形態では、デキサメタゾンは、約１０ｎＭ～約２０μＭの濃度範囲で存在する。
これらの実施形態ではｉＰＳＣが、第１の標的特異性を有する第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、第１のＣＡＲは、（ｉ）少なくとも１つの抗原認識領域と、膜貫通ドメインと、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、Ｔ及び／又はＮＫ細胞活性化又は官能化に特異的なシグナル伝達形質導入タンパク質の細胞質ドメインに由来するエンドドメインと、を含むエクトドメイン；（ｉｉ）疾患、病原体、液性腫瘍、固体腫瘍に関連する抗原に特異的に結合する抗原認識ドメイン；あるいは（ｉｉｉ）ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ及びＰＤＬ１のうちのいずれか１つ；又はＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、癌－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、及びウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）を含み得る。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲは、以下を共発現するバイシストロン性構築物に含まれる。（１）外因性サイトカイン又はその受容体を発現する細胞表面の部分的又は全長ペプチドであって、（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、又はそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つ；並びに（ｂ）（ｉ）自己切断ペプチドを使用したＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの共発現と、（ｉｉ）ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの融合タンパク質と、（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが切断又は排除されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質と、（ｉｖ）ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインの融合タンパク質と、（ｖ）ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒβの融合タンパク質と、（ｖｉ）ＩＬ１５及び共通受容体γＣの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが天然又は修飾されている、ＩＬ１５及び共通受容体γＣの融合タンパク質と、（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体と、とのうちの少なくとも１つを含む、外因性サイトカイン又はその受容体を発現する細胞表面の部分的又は全長ペプチド；（２）抗体又はその断片；あるいは（３）エンゲージャ；あるいは（４）チェックポイント阻害剤。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の小化合物処置は、免疫細胞の凍結保存の前又は後である。いくつかの実施形態では、方法は、小化合物処置を受けた免疫細胞を凍結保存することを更に含む。特定の実施形態では、凍結保存は、処置の１つ又は複数の小化合物を含まないか、又は実質的に含まない。
いくつかの実施形態では、増強された解凍後細胞毒性は、凍結保存後に解凍された免疫細胞の増強されたインビボ有効性を含み、ここで、小化合物処置を有する解凍後免疫細胞は、以下の特徴、（ｉ）腫瘍制御、腫瘍クリアランス、及び／又は腫瘍再発の減少における増強された能力、（ｉｉ）腫瘍浸透の改善、あるいは（ｉｉｉ）同じ小化合物処置なしの解凍後の対応する免疫細胞と比較して、骨髄及び／又は腫瘍部位への移動における増強された能力のうちの少なくとも１つを含む。
別の態様では、本発明は、細胞又はその集団を提供し、（ｉ）細胞は、デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、及びそれらの誘導体若しくは類似体のうちの少なくとも１つを含む小化合物処置を受けた免疫細胞であり、（ｉｉ）免疫細胞は、同じ小化合物処置なしの対応する免疫細胞と比較して、解凍後の細胞毒性が増強されている。いくつかの実施形態では、細胞又はその集団のうち、（ｉｉｉ）免疫細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化した派生エフェクター免疫細胞であり、（ｉｖ）エフェクター免疫細胞は、派生ＣＤ３４細胞、派生造血幹及び前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆細胞、派生ＮＫ細胞前駆細胞、派生Ｔ細胞、派生ＮＫＴ細胞、派生ＮＫ細胞、派生Ｂ細胞、あるいは対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ又は複数の機能的特徴を有する派生エフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは以下の編集、（ｉ）第１の標的特異性を有する第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；（ｉｉ）ＣＤ３８ノックアウト；（ｉｉｉ）天然の対応する細胞と比較した、ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損；（ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの発現の導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方又は両方のノックアウト；（ｖ）ＣＤ１６又はそのバリアント；（ｖｉ）第２の標的特異性を有する第２のＣＡＲ；（ｖｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的又は完全なペプチドを含むシグナル伝達複合体；（ｖｉｉｉ）表２に列記された遺伝子型のうちの少なくとも１つ；（ｉｘ）天然の対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つにおける欠失又は低減された発現；あるいは（ｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及び二重若しくは多重特異性又はユニバーサルエンゲージャと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入された又は増加した発現のうちの少なくとも１つを含み、ｉＰＳＣから分化したエフェクター免疫細胞は、ｉＰＳＣと同じ１つ又は複数の編集を含む。
細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、小化合物処置は、（ｉ）デキサメタゾンを含み；（ｉｉ）サイトカインＩＬ７を含まないか、又は本質的に含まず、任意選択で、処置中の免疫細胞はＴ細胞であり；（ｉｉｉ）サイトカインＩＬ２及び／又はサイトカインＩＬ１５を含まないか、又は本質的に含まず、場合により、処置中の免疫細胞はＮＫ細胞であり；（ｉｖ）デキサメタゾンを含むが、サイトカインＩＬ７を含まず；（ｖ）サイトカインを含まないか本質的に含まず；（ｖｉ）細胞培養中及び／又は細胞保存の前又は後であり；（ｖｉｉ）細胞をｉＰＳＣから分化させた後の免疫細胞増殖中であり、及び／又は（ｖｉｉｉ）凍結保存前の約１～約１２日、又は約３～約６日続く。いくつかの実施形態では、デキサメタゾンは、約１０ｎＭ～約２０μＭの濃度範囲で存在する。
細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、免疫細胞は、培地に含まれ、培地は、（ｉ）デキサメタゾンを含み；（ｉｉ）レナリドミドを含み；（ｉｉｉ）ＡＱＸ－１１２５を含み；（ｉｖ）デキサメタゾン及びレナリドミドを含み；（ｖ）デキサメタゾンを含むが、サイトカインＩＬ７を含まず、任意選択で、免疫細胞がＴ細胞であり；（ｖｉ）デキサメタゾンを含むが、サイトカインＩＬ２又はサイトカインＩＬ１５を含まず、任意選択で、免疫細胞がＮＫ細胞であり；（ｖｉｉ）デキサメタゾンを含み、サイトカインを含まないか、又は本質的に含まない。
これらの実施形態ではｉＰＳＣが、第１の標的特異性を有する第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、第１のＣＡＲは、（ｉ）少なくとも１つの抗原認識領域と、膜貫通ドメインと、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、Ｔ及び／又はＮＫ細胞活性化又は官能化に特異的なシグナル伝達形質導入タンパク質の細胞質ドメインに由来するエンドドメインと、を含むエクトドメイン；（ｉｉ）疾患、病原体、液性腫瘍、固体腫瘍に関連する抗原に特異的に結合する抗原認識ドメイン；あるいは（ｉｉｉ）ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ及びＰＤＬ１のうちのいずれか１つ；又はＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、癌－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、及びウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）を含み得る。
いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲは、以下を共発現するバイシストロン性構築物に含まれる。（１）外因性サイトカイン又はその受容体を発現する細胞表面の部分的又は全長ペプチドであって、（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、又はそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つ；並びに（ｂ）（ｉ）自己切断ペプチドを使用したＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの共発現と、（ｉｉ）ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの融合タンパク質と、（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが切断又は排除されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質と、（ｉｖ）ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインの融合タンパク質と、（ｖ）ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒβの融合タンパク質と、（ｖｉ）ＩＬ１５及び共通受容体γＣの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが天然又は修飾されている、ＩＬ１５及び共通受容体γＣの融合タンパク質と、（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体と、とのうちの少なくとも１つを含む、外因性サイトカイン又はその受容体を発現する細胞表面の部分的又は全長ペプチド；（２）抗体又はその断片；あるいは（３）チェックポイント阻害剤。
細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、免疫細胞の小化合物処置は、免疫細胞の凍結保存の前である。いくつかの実施形態では、小化合物で処置された免疫細胞は、（ｉ）凍結保存前培地に含まれるか、（ｉｉ）凍結保存培地に含まれるか、（ｉｉｉ）凍結保存中であるか、又は（ｉｖ）凍結保存からの解凍後である。いくつかの実施形態では、凍結保存は、処置の１つ又は複数の小化合物を含まないか、又は実質的に含まない。いくつかの実施形態では、増強された解凍後細胞毒性は、凍結保存後に解凍された免疫細胞の増強されたインビボ有効性を含み、ここで、凍結保存前の小化合物処置を有する解凍後免疫細胞は、以下の特徴、（ｉ）腫瘍制御、腫瘍クリアランス、及び／又は腫瘍再発の減少における増強された能力、（ｉｉ）腫瘍浸透の改善、あるいは（ｉｉｉ）同じ小化合物処置なしの解凍後の対応する免疫細胞と比較して、骨髄及び／又は腫瘍部位への移動における増強された能力のうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、同じ小化合物処置なしの対応する免疫細胞と比較した場合、以下のもの、（ｉ）ＳＰＯＣＫ２、ＰＴＧＤＳ、ＩＬ７Ｒ、ＬＣＮＬ１，、ＲＡＳＧＲＰ２、ＳＭＡＰ２、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ－７Ｒ、及びＩＬ２ＲＡ上方制御、又は（ｉｉ）ＪＣＨＡＩＮ、ＫＬＦ３、ＫＬＲＢ１、ＩＧＦＢＰ４、ＮＵＣＢ２、ＣＳＦ２ＲＢ、及びＣＸＣＲ６の下方制御のうちの少なくとも１つを含む１つ又は複数の差次的に発現される遺伝子を含む。
更に別の態様では、本発明は、免疫細胞又はその集団を製造する方法を提供し、方法は、（ａ）遺伝子操作されたｉＰＳＣを分化させて免疫細胞を取得することを含み、ｉＰＳＣは、以下の編集、（ｉ）第１の標的特異性を有する第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；（ｉｉ）ＣＤ３８ノックアウト；（ｉｉｉ）天然の対応する細胞と比較した、ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損；（ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの発現の導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方又は両方のノックアウト；（ｖ）ＣＤ１６又はそのバリアント；（ｖｉ）第２の標的特異性を有する第２のＣＡＲ；（ｖｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的又は完全なペプチドを含むシグナル伝達複合体；（ｖｉｉｉ）表２に列記された遺伝子型のうちの少なくとも１つ；（ｉｘ）天然の対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つにおける欠失又は低減された発現；あるいは（ｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及び二重若しくは多重特異性又はユニバーサルエンゲージャと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入された又は増加した発現のうちの少なくとも１つを含み、ｉＰＳＣから分化した免疫細胞は、ｉＰＳＣと同じ１つ又は複数の編集を含み、（ｂ）免疫細胞は、デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、又はそれらの誘導体若しくは類似体の少なくとも１つを含む小化合物処置を受け、それにより、同じ小化合物処置なしの対応する免疫細胞と比較して増強された解凍後細胞毒性を有する免疫細胞を得る。いくつかの実施形態では、方法は、（ｃ）ステップ（ｂ）からの処置された免疫細胞を凍結保存することを更に含む。
いくつかの実施形態では、方法は、クローンｉＰＳＣをゲノム操作して、第１のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをノックインすること、任意選択で（ｉｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡをノックアウトすること、（ｉｉｉ）ＣＤ５８及びＣＤ５４の一方又は両方をノックアウトすること、並びに／あるいは（ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇ又は切断不可能ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ１６又はそのバリアント、第２のＣＡＲ、及び／又は外因性サイトカイン発現細胞表面の部分ペプチド又は完全なペプチド若しくはその受容体の発現を導入することを更に含む。いくつかの実施形態では、ゲノム操作は、標的化された欠失、挿入、又はイン／デルを含み、ゲノム操作は、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同性組換え、又はこれらの方法の他の任意の機能的変異によって実施される。いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化した免疫細胞は、派生ＣＤ３４細胞、派生造血幹及び前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆細胞、派生ＮＫ細胞前駆細胞、派生Ｔ細胞、派生ＮＫＴ細胞、派生ＮＫ細胞、派生Ｂ細胞、あるいは対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ又は複数の機能的特徴を有する派生エフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｄ）ステップ（ｃ）からの凍結保存された免疫細胞を解凍することを更に含む。
更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載の免疫細胞、及び１つ又は複数の治療薬を含む、治療的使用のための組成物を提供する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の治療薬は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、小ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞構成要素若しくはその置換因子、目的の１つ又は複数のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤若しくは放射性部分、又は免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む。いくつかの実施形態では、治療薬はチェックポイント阻害剤であり、チェックポイント阻害剤は、（ａ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、又は阻害性ＫＩＲを含むチェックポイント分子に対する１つ又は複数のアンタゴニスト；（ｂ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びそれらの誘導体又は機能的同等物のうちの１つ又は複数；あるいは（ｃ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペムブロリズマブのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、治療薬は、ベネトクラクス、アザシチジン、及びポマリドミドのうちの１つ又は複数を含み得る。治療薬が抗体であるこれらの実施形態では、抗体は、（ａ）抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＧＤ２、抗ＰＤＬ１、及び／又は抗ＣＤ３８抗体；（ｂ）リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セルツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、及びそれらのヒト化若しくはＦｃ修飾バリアント又は断片及びそれらの機能的同等物及びバイオシミラーのうちの１つ又は複数；あるいは（ｃ）ダラツムマブを含み得、誘導造血細胞は、ＣＤ３８ノックアウトを含む誘導ＮＫ細胞又は誘導Ｔ細胞、及び任意選択でＣＤ１６又はそのバリアントの発現を含む。したがって、別の態様では、本発明は、養子細胞療法に好適な対象に組成物を導入することによる、本明細書で提供される組成物の治療的使用を提供し、対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、癌、又はウイルス感染を有する。
更に別の態様では、本発明は、（ｉ）本明細書に開示される方法に従って製造された凍結保存免疫細胞の１つ又は複数ユニットを解凍することであって、凍結保存免疫細が、凍結保存の前に本明細書に記載されている小化合物処置で処置することと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の解凍後免疫細胞を含む組成物を対象に投与することと、を含む疾患又は状態を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞、又は対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ又は複数の機能的特徴を有するｉＰＳＣ由来エフェクター細胞である。
本明細書で提供される組成物及び方法の様々な目的及び利点は、例示及び例として、本発明のある特定の実施形態が示される添付の図面と併せて以下の説明から明らかになるであろう。
デキサメタゾン処置が、ｉＮＫ細胞においてグランザイムＢタンパク質レベルを低下させることを示す図である。 デキサメタゾン処置が、初代ＮＫ細胞においてグランザイムＢタンパク質レベルを低下させることを示す図である。グランザイムＢレベルはフローサイトメトリ染色によって決定され、幾何平均蛍光強度（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＧＭＦＩ）が示される。 ＣＡＲ発現ｉＮＫ細胞の小化合物処置が、（図２Ａ）解凍後ｉＮＫ細胞の抗原特異的認識を改善することを示す図である。 ＣＡＲ発現ｉＮＫ細胞の小化合物処置が、一晩休止した解凍後ｉＮＫ細胞の抗原特異的認識を改善することを示す図である。 ＣＤ１９＋リンパ腫標的細胞を標的とする、処置された解凍後のＣＤ１９－ＣＡＲ発現ｉＮＫ細胞を使用する長期殺傷アッセイを示す図である。 ＣＤ１９＋リンパ腫標的細胞を標的とする、処置された解凍後のＣＤ１９－ＣＡＲ発現ｉＮＫ細胞を使用する長期殺傷アッセイを示す図である。処置された解凍後のｉＮＫの細胞毒性の増加は、（図３Ａ）各時点で残っている標的細胞の正規化された数（標的単独＝１００）、及び（図３Ｂ）曲線上の面積（ＡＯＣ）を使用して示される。 １Ｅ５ Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ細胞を移植したＮＳＧマウスの生物発光イメージングを使用した未処置の対応細胞と比較した、以前に小化合物処置を行った解凍後のＣＡＲ発現ｉＮＫ細胞のインビボの有効性を示す図である。 リツキシマブとの併用療法において以前に小化合物処置を受けた、解凍後のＣＡＲ／ｈｎＣＤ１６発現ｉＮＫ細胞のインビボ有効性を示す図である。 固形腫瘍転移のマウスモデルにおける未処置の対応する細胞と比較して、以前に小化合物処置を行った解凍後のＣＡＲ発現ｉＮＫ細胞のインビボ有効性を示す図である。 マウスモデルの脾臓における未処置の対応する細胞と比較して、以前に小化合物で処置された、解凍後のＣＡＲ発現ｉＮＫ細胞のインビボ持続性を示す図である。 腫瘍の非存在下のマウスの末梢血における未処置の対応する細胞と比較して、以前に小化合物処置を行った解凍後のＣＡＲ発現ｉＮＫ細胞のインビボ持続性を示す図である。 ＲＮＡｓｅｑを使用して小化合物で処置されたｉＮＫ細胞の差次的遺伝子発現分析を示す図である。 デキサメタゾンで処置されたｉＴ細胞において差次的に発現される遺伝子を示す図である。 ｉＴ細胞のデキサメタゾン処置中のＩＬ７の除去が細胞増殖に影響を及ぼさないことを示す図である。 ｉＴ細胞のデキサメタゾン処置中のＩＬ７除去が細胞表現型に影響を及ぼさないことを示す図である。 ｉＴ細胞のデキサメタゾン処置中のＩＬ７除去が細胞表現型に影響を及ぼさないことを示す図である。 デキサメタゾン処置なしのＣＡＲ－ｉＴ細胞のインビボ有効性を示す図である。 デキサメタゾン処置有のＣＡＲ－ｉＴ細胞のインビボ有効性を示す図である。小化合物処置は、ＣＡＲ－ｉＴ細胞のインビボ機能を改善する。 デキサメタゾンで処置されたＣＡＲ－ｉＴ細胞が、初代ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、リンパ性白血病の全身性ゼノグラフィーモデルにおいて腫瘍増殖を制御することを示す図である。 デキサメタゾンで処置されたＣＡＲ－ｉＴ細胞が、初代ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、リンパ性白血病の全身性ゼノグラフィーモデルにおいて腫瘍増殖を制御することを示す図である。図９Ｂにおいて、最も高い群から最も低い群への線のクラスターは、腫瘍のみ、初代ＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ｉＴ＋Ｄｅｘ、及びＩＶＩＳである。 デキサメタゾンで処置されたＣＡＲ－ｉＴ細胞が、リンパ性白血病の全身性ゼノグラフィーモデルにおいてマウス骨髄組織に存続することを示す図である。 デキサメタゾンで処置されたＣＡＲ－ｉＴ細胞が、リンパ性白血病の全身性ゼノグラフィーモデルにおいてマウス骨髄組織に存続することを示す図である。 デキサメタゾン処置単独及びＩＬ７補充で増殖したＣＡＲ－ｉＴ細胞のＴ細胞表現型発現プロファイルを示す図である。 デキサメタゾン処置単独及びＩＬ７補充で増殖したＣＡＲ－ｉＴ細胞のＴ細胞表現型発現プロファイルを示す図である。 ＩＬ７を補充したデキサメタゾン処置が、サイトカインの非存在下のデキサメタゾン処置によるＣＡＲ－ｉＴ細胞増殖と比較して、改善されたＣＡＲ－ｉＴ細胞増殖をもたらしたことを示す図である。 デキサメタゾン単独及びデキサメタゾン＋ＩＬ７で処置されたＣＡＲ－ｉＴ細胞が、未処置の細胞よりも有効性が改善されていることを示す図である。
定義
本明細書で別段の定義がない限り、本出願に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬等に限定されず、したがって異なり得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的としており、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という冠詞は、冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
代替案（例えば、「又は」）の使用は、代替案の一方、両方、又はそれらの任意の組合せを意味すると理解されるべきである。
「及び／又は」という用語は、代替案の一方又は両方のいずれかを意味すると理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと比較して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％まで変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、又は±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。
本明細書で使用される場合、「実質的に」又は「本質的に」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと比較して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「本質的に同じ」又は「実質的に同じ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さとほぼ同じ数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。
本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」及び「本質的に含まない」という用語は交換可能に使用され、細胞集団又は培養培地等の組成物を説明するために使用される場合、特定の物質又はその供給源を含まない、例えば、特定の物質又はその供給源を９５％含まない、９６％含まない、９７％含まない、９８％含まない、９９％含まないか、又は従来の手段によって測定されるとき検出不能である組成物を指す。組成物中のある特定の成分又は物質を「含まない」又は「本質的に含まない」という用語はまた、そのような成分又は物質が、（１）任意の濃度で組成物に含まれない、又は（２）機能的に不活性だが、低濃度で組成物に含まれることを意味する。同様の意味は、「不在」という用語に適用することができ、特定の物質又は組成物のその供給源が不在であることを指す。
本明細書全体を通して、文脈上別段の必要がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載されたステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素の群を含むことを意味するが、任意の他のステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素の群を除外することを意味しないと理解される。特定の実施形態では、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」、「含有する」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、同義語として使用される。
「からなる」とは、「からなる」という句に続くものを含み、これに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という句は、列記された要素が必要又は必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。
「本質的にからなる」とは、句の後に列記された任意の要素を含むことを意味し、列記される要素の開示において特定された活性又は動作に干渉又は寄与しない他の要素に限定される。したがって、「本質的にからなる」という句は、列記される要素が必要又は必須であることを示すが、他の要素は任意選択ではなく、列記された要素の活性又は動作に影響を及ぼすか否かに応じて存在しても存在しなくてもよい。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、又は「更なる実施形態」、又はそれらの組合せへの言及は、実施形態に関連して説明される特定の特色、構造、又は特徴は、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれる。したがって、本明細書全体を通して様々な場所での前述の句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を参照しているわけではない。更に、特定の特色、構造、又は特徴は、１つ又は複数の実施形態では任意の好適な方法で組み合わせることができる。
「エクスビボ」という用語は、一般に、好ましくは自然条件の改変を最小限に抑えて、生体外の人工環境の生体組織内又は生体組織上で行われる実験又は測定等、生体外で行われる活動を指す。特定の実施形態では、「エクスビボ」手順は、生物から採取され、通常は無菌条件下で、典型的には数時間又は最大約２４時間（しかしながら、状況に応じて最大４８又は７２時間以上を含む）実験装置で培養された生細胞又は組織を伴う。ある特定の実施形態では、そのような組織又は細胞を収集して凍結し、後にエクスビボ処置のために解凍することができる。生細胞又は組織を使用して数日より長く続く組織培養実験又は手順は、典型的には、「インビトロ」であるとみなされるが、ある特定の実施形態では、この用語は、エクスビボと交換可能に使用され得る。
「インビボ」という用語は、一般に、生体内で行われる活動を指す。
本明細書で使用される場合、「薬剤」、「化合物」、及び「小化合物」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、多能性幹細胞又は前駆細胞の分化に由来する免疫細胞を含む、細胞の遺伝子発現プロファイル又は生物学的特性を微調整することができる化合物又は分子を指す。薬剤は、単一の化合物又は分子、あるいは複数の化合物又は分子の組合せであり得る。
本明細書で使用される場合、免疫細胞の製造又は産生に関して使用される場合、「接触」、「処置する」、又は「処置」という用語は、本明細書では、免疫細胞を本明細書に開示される薬剤のうちの１つ又は複数で培養、インキュベート又は曝露することを指すために交換可能に使用されて、細胞の遺伝子発現プロファイル又は１つ又は複数の生物学的特性が調節、微調整、又は改変される。
本明細書で使用される場合、「非接触」又は「未処置」細胞は、処置されていない、例えば、対照薬剤以外の薬剤と、培養、接触、又はインキュベートされていない細胞である。ＤＭＳＯ等の対照薬剤と接触した細胞、又は別のビヒクルと接触した細胞は、非接触細胞の例である。
本明細書で使用される場合、「再プログラミング」又は「脱分化」又は「分化能の増加」又は「発生能の増加」という用語は、細胞の分化能を増加させるか、又は細胞をより分化していない状態に脱分化する方法を指す。例えば、分化能が増加した細胞は、再プログラミングされていない状態の同じ細胞と比較して、より大きな発生可塑性を有する（つまり、より多くの細胞型に分化することができる）。言い換えれば、再プログラミングされた細胞は、再プログラミングされていない状態の同じ細胞よりもあまり分化しない状態にある細胞である。
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、特殊化していない（「コミットしていない」）又はあまり特殊化していない細胞が、例えば、血液細胞又は筋細胞等の特殊化された細胞の特色を獲得するプロセスである。分化した又は分化誘導された細胞は、細胞の系統内でより特殊化した（「コミットした」）位置をとった細胞である。「コミットした」という用語は、分化のプロセスに適用される場合、通常の状況下で、特定の細胞型又は細胞型のサブセットに分化し続ける点まで分化経路を進んでおり、通常の状況下では、異なる細胞型に分化するか、又はあまり分化しない細胞型に戻ることができない細胞を指す。本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、体又は体細胞のすべての系統（すなわち、胚そのもの）を形成する細胞の能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、外胚葉、中胚葉、内胚葉の３つの胚葉のそれぞれから細胞を形成できる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生物を生み出すことができない不完全又は部分的に多能性の細胞（例えば、エピブラスト幹細胞又はＥｐｉＳＣ）から、完全な生物（例えば、胚性幹細胞）を生み出すことができるより原始的でより多能性の細胞に及ぶ発生能の連続体である。
本明細書で使用されるとき、「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」という用語は、幹細胞が、誘導又は変更された、分化した成人、新生児又は胎児細胞から産生された、すなわち、３つのすべての胚葉又は真皮層：中胚葉、内胚葉、及び外胚葉のすべての組織に分化できる細胞にリプログラミングされたことを意味する。産生されたｉＰＳＣは、自然界に見られる細胞を指さない。
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊の天然に存在する多能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は多能性であり、発生中に外胚葉、内胚葉及び中胚葉の３つの主要な胚葉のすべての誘導体を生じさせる。それらは胚体外膜又は胎盤に寄与しない、すなわち、全能性ではない。
本明細書で使用される場合、「多分化能幹細胞」という用語は、１つ又は複数の胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）の細胞に分化するが、３つすべてにではない発生の可能性を有する細胞を指す。したがって、多分化能細胞は「部分的に分化した細胞」とも呼ばれる。多分化能細胞は当技術分野で周知であり、多分化能細胞の例には、例えば、造血幹細胞及び神経幹細胞等の成体幹細胞が含まれる。「多分化能」は、細胞が所与の系統で多くの細胞型を形成する可能性があるが、他の系統の細胞は形成しない可能性があることを示す。例えば、多分化能造血細胞は、多くの異なる血液細胞型（赤、白、血小板等）を形成することができるが、ニューロンを形成することはできない。したがって、「多分化能」という用語は、全能性及び多能性よりも低い発生能の程度を有する細胞の状態を指す。
多能性は、部分的に、細胞の多能性の特徴を評価することによって決定することができる。多能性の特徴には、（ｉ）多能性幹細胞の形態、（ｉｉ）無制限の自己再生の可能性、（ｉｉｉ）ＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０、及び／又はＣＤ５０を含むがこれらに限定されない多能性幹細胞マーカーの発現、（ｉｖ）３つすべての体細胞系統（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に分化する能力、（ｖ）３つの体細胞系統からなる奇形腫の形成、並びに（ｖｉ）３つの体細胞系統からの細胞からなる胚様体の形成が含まれるが、これらに限定されない。
後期胚盤胞のエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）に類似した多能性の「プライミング」又は「準安定」状態、及び初期／着床前胚盤胞の細胞塊に類似した多能性の「ナイーブ」又は「グラウンド」状態の２種類の多能性が以前に説明されている。両方の多能性状態は上述のような特徴を呈するが、ナイーブ又はグラウンド状態は更に、（ｉ）雌性細胞におけるＸ染色体の事前不活性化又は再活性化、（ｉｉ）単一細胞培養中のクローン性及び生存の改善、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の全体的な低下、（ｉｖ）発生制御遺伝子プロモーターへのＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制クロマチンマーク沈着の低下、及び（ｖ）プライミング状態の多能性細胞と比較して分化マーカーの発現の低下を呈する。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、その後、サイレンシングされるか、又は結果として得られる多能性細胞から除去される細胞再プログラミングの標準的な方法論は、一般に、多能性のプライミング状態の特徴を有するとみなされる。標準的な多能性細胞培養条件下では、そのような細胞は、グラウンド状態の特徴が観察される外因性導入遺伝子の発現が維持されない限り、プライミング状態のままであり、グラウンド状態の特徴が観察される。
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特色を指す。正常な胚性幹細胞の形態は、核と細胞質の比率が高く、核小体が顕著に存在し、典型的な細胞間間隔がある、形状が丸くて小さいことを特徴とする。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、任意の動物、好ましくはヒト患者、家畜、又は他の飼育動物を指す。
「多能性因子」又は「再プログラミング因子」は、単独で、又は他の薬剤と組み合わせてのいずれかで、細胞の発生能を増加させることができる薬剤を指す。多能性因子には、細胞の発生能を増加させることができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子が含まれるが、これらに限定されない。例示的な多能性因子には、例えば、転写因子及び小分子再プログラミング剤が含まれる。
「培養」又は「細胞培養」は、インビトロ環境における細胞の維持、成長、及び／又は分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」（それぞれの場合において単数の「培地」）、「補充成分」及び「培地補充成分」は、細胞培養を培養する栄養組成物を指す。
「培養する」又は「維持する」とは、例えば滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）細胞培養皿又はフラスコ内で、組織外又は体外で細胞を維持、増殖（成長）、及び／又は分化させることを指す。「培養」又は「維持」は、細胞を増殖及び／又は維持するのに役立つ栄養素、ホルモン、及び／又は他の因子の供給源として培養培地を利用し得る。
本明細書で使用される場合、「中胚葉」という用語は、初期胚発生中に現れ、循環系の血液細胞、筋肉、心臓、真皮、骨格、並びに他の支持組織及び結合組織を含む様々な特殊化した細胞型を生じさせる３つの胚葉のうちの１つを指す。
本明細書で使用される場合、「二次造血内皮細胞」（ＨＥ）又は「多能性幹細胞由来の二次造血内皮細胞」（ｉＨＥ）という用語は、内皮造血転換と呼ばれるプロセスにおいて造血幹細胞及び前駆細胞を生じさせる内皮細胞のサブセットを指す。胚における造血細胞の発達は、側板中胚葉から血管芽細胞を経て二次造血内皮細胞及び造血前駆細胞へと順次進行する。
「造血幹細胞及び前駆細胞」、「造血幹細胞」、「造血前駆細胞」、又は「造血前駆細胞」という用語は、造血系統にコミットしているが、更なる造血分化が可能であり、多分化能造血幹細胞（血球芽細胞）、骨髄系前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、及びリンパ系前駆細胞を含む細胞を指す。造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＣ）は、骨髄（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、及びリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含むすべての血液細胞型を生じさせる多分化能幹細胞である。本明細書で使用される「二次造血幹細胞」という用語は、Ｔ系統細胞、ＮＫ系統細胞、及びＢ系統細胞を含む成熟骨髄及びリンパ系細胞型の両方を生じさせることができるＣＤ３４＋造血細胞を指す。造血細胞には、原始赤血球、巨核球、及びマクロファージを生じさせる原始造血細胞の様々なサブセットも含まれる。
本明細書で使用される場合、「Ｔリンパ球」及び「Ｔ細胞」という用語は、交換可能に使用され、胸腺で成熟を完了し、体内の特定の外来抗原の特定並びにＭＨＣクラスＩ拘束性の様式における他の免疫細胞の活性化及び非活性化を含む、免疫系において様々な役割を有する主要な型の白血球を指す。Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、若しくは培養されたＴ細胞株、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等からのＴ細胞、又は哺乳動物から得られたＴ細胞、多能性幹細胞若しくは前駆細胞の直接血球分化から得られたＴ細胞等の任意のＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ３＋細胞であり得る。Ｔ細胞は、任意の型のＴ細胞であり得、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）等を含むがこれらに限定されない任意の発生段階のものであり得る。追加の型のヘルパーＴ細胞には、Ｔｈ３（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１７、Ｔｈ９、又はＴｆｈ細胞等の細胞が含まれる。追加の型のメモリＴ細胞には、セントラルメモリＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）、エフェクターメモリＴ細胞（Ｔｅｍ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞）等の細胞が含まれる。Ｔ細胞はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように修飾されたＴ細胞等の遺伝子操作されたＴ細胞を指し得る。Ｔ細胞又はＴ細胞様エフェクター細胞はまた、幹細胞又は前駆細胞から分化され得る。Ｔ細胞様派生エフェクター細胞は、いくつかの点でＴ細胞系統を有し得るが、同時に、初代Ｔ細胞には存在しない１つ又は複数の機能的特徴を有する。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」は、表面にＣＤ４を発現し、細胞媒介性免疫応答に関連するＴ細胞のサブセットを指す。それらは、刺激後の分泌プロファイルを特徴とし、これには、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ２、ＩＬ４、及びＩＬ１０等のサイトカインの分泌が含まれ得る。「ＣＤ４」は、最初はＴリンパ球上の分化抗原として定義された５５ｋＤの糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞にも見られる。ＣＤ４抗原は、免疫グロブリン超遺伝子ファミリのメンバーであり、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩＩ制限免疫応答の関連認識要素として関与している。Ｔリンパ球では、それらはヘルパー／誘発因子サブセットを定義する。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」とは、表面にＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ制限され、細胞傷害性Ｔ細胞として機能するＴ細胞のサブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞、並びに細胞傷害性及びサプレッサーＴリンパ球に見られる分化抗原である。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリン超遺伝子ファミリのメンバーであり、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ制限相互作用における関連認識要素である。
本明細書で使用される場合、「ＮＫ細胞」又は「ナチュラルキラー細胞」という用語は、ＣＤ５６又はＣＤ１６の発現及びＴ細胞受容体（ＣＤ３）の不在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。本明細書で使用される場合、「適応ＮＫ細胞」及び「メモリＮＫ細胞」という用語は、交換可能であり、表現型的にＣＤ３－及びＣＤ５６＋であり、ＮＫＧ２Ｃ及びＣＤ５７のうちの少なくとも１つ、及び任意選択でＣＤ１６を発現するが、ＰＬＺＦ、ＳＹＫ、ＦｃｅＲγ、及びＥＡＴ－２のうちの１つ又は複数の表現に欠くＮＫ細胞のサブセットを指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の単離された亜集団は、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲリガンド、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４６、活性化及び阻害性ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ、並びに／又はＤＮＡＭ－１の発現を含む。ＣＤ５６＋は、ｄｉｍ又はｂｒｉｇｈｔ発現であり得る。ＮＫ細胞、又はＮＫ細胞様エフェクター細胞は、幹細胞又は前駆細胞から分化され得る。ＮＫ細胞様派生エフェクター細胞は、いくつかの点でＮＫ細胞系統を有し得るが、同時に、初代ＮＫ細胞には存在しない１つ又は複数の機能的特徴を有する。
本明細書で使用される場合、「ＮＫＴ細胞」又は「ナチュラルキラーＴ細胞」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＣＤ１ｄ制限Ｔ細胞を指す。従来の主要組織適合（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を検出する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、非古典的なＭＨＣ分子であるＣＤ１ｄによって提示される脂質抗原を認識する。２つの型のＮＫＴ細胞が認識されている。インバリアント又はＩ型ＮＫＴ細胞は、非常に限られたＴＣＲレパートリー、つまり、限られたスペクトルのβ鎖（ヒトではＶβ１１）に関連する標準的なα鎖（ヒトではＶα２４－Ｊα１８）を発現する。非古典的又は非インバリアントＩＩ型ＮＫＴ細胞と呼ばれるＮＫＴ細胞の２番目の集団は、より不均一なＴＣＲαβの使用を示す。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、免疫療法に好適であると考えられる。適応又はインバリアント（Ｉ型）ＮＫＴ細胞は、以下のマーカー：ＴＣＲ Ｖａ２４－Ｊａ１８、Ｖｂ１１、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ａＧａｌＣｅｒ、ＣＤ１６１、及びＣＤ５６のうちの少なくとも１つ又は複数の発現により特定され得る。
本明細書で使用される場合、「単離された」等の用語は、元の環境から分離された、すなわち、単離された細胞の環境は、「単離されていない」参照細胞が存在する環境で見出される少なくとも１つの構成要素を実質的に含まない細胞又は細胞の集団を指す。この用語には、自然環境で見出される一部又はすべての構成要素から取り出された、例えば、組織や生検試料から単離された細胞が含まれる。この用語はまた、細胞が天然に存在しない環境で見出される、例えば、細胞培養又は細胞懸濁液から単離されるため、少なくとも１つ、いくつか、又はすべての構成要素から取り出される細胞を含む。したがって、単離された細胞は、自然界に見られる場合、又は天然に存在しない環境で成長するか、保存されるか、若しくは生存する場合、他の物質、細胞、又は細胞集団を含む少なくとも１つの構成要素から部分的又は完全に分離される。単離された細胞の特定の例には、部分的に純粋な細胞組成物、実質的に純粋な細胞組成物、及び天然に存在しない培地で培養された細胞が含まれる。単離された細胞は、所望の細胞又はその集団を環境中の他の物質又は細胞から分離することから、又は環境から１つ又は複数の他の細胞集団若しくは亜集団を取り除くことから得ることができる。
本明細書で使用される場合、「精製する」等の用語は、純度を高めることを指す。例えば、純度を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％に増加させることができる。
本明細書で使用される場合、「コード化」という用語は、ヌクレオチドの定義された配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）又はアミノ酸の定義された配列及びそれらから生じる生物学的特性のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖との両方を、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードすると称することができる。
「構築物」は、インビトロ又はインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子又は分子の複合体を指す。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、外来遺伝子材料の標的細胞への送達又は移動を指向することができる任意の核酸構築物を指し、標的細胞で複製及び／又は発現することができる。本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、送達される構築物を含む。ベクターは、線状又は環状分子であり得る。ベクターは、組込み又は非組込みであり得る。ベクターの主な種類には、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が含まれるが、これらに限定されない。
「組込み」とは、構築物の１つ又は複数のヌクレオチドが細胞ゲノムに安定して挿入される、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列に共有結合されることを意味する。「標的化された組込み」とは、構築物のヌクレオチドが、予め選択された部位又は「組込み部位」で細胞の染色体又はミトコンドリアＤＮＡに挿入されることを意味する。本明細書で使用される場合、「組込み」という用語は更に、組み込み部位での内因性配列又はヌクレオチドの欠失の有無にかかわらず、構築物の１つ又は複数の外因性配列又はヌクレオチドの挿入を伴うプロセスを指す。挿入部位に欠失がある場合、「組込み」は、欠失される内因性配列又はヌクレオチドを１つ又は複数の挿入されたヌクレオチドに置き換えることを更に含み得る。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、参照される分子又は参照される活性が宿主細胞に導入されるか、又は宿主細胞に非天然であることを意味することを意図する。分子は、例えば、コード化核酸を宿主の遺伝子材料に導入することにより、例えば、宿主の染色体に組み込むことにより、又はプラスミド等の非染色体遺伝子材料として導入され得る。したがって、コード化核酸の発現に関して使用される場合の用語は、コード化核酸を発現可能な形態で細胞に導入することを指す。「内因性」という用語は、宿主細胞に存在する参照される分子又は活性を指す。同様に、コード化核酸の発現に関して使用される場合の用語は、細胞内に含まれ、外因的に導入されていないコード化核酸の発現を指す。
本明細書で使用される場合、「目的の遺伝子」又は「目的のポリヌクレオチド配列」は、適切な制御配列の制御下に置かれると、ＲＮＡに転写され、場合によってはインビボでポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。目的の遺伝子又はポリヌクレオチドには、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）からのＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、目的の遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然ポリペプチド（すなわち、自然界に見られるポリペプチド）又はそれらの断片；バリアントポリペプチド（すなわち、天然ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドの変異体）又はその断片；操作されたポリペプチド又はペプチド断片、治療用ペプチド又はポリペプチド、撮像マーカー、選択可能なマーカー等をコードし得る。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又はそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの配列は、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、チミンに対してウラシル（Ｕ）で構成される。ポリヌクレオチドは、遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、又はＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを含み得る。ポリヌクレオチドはまた、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指す。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、交換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基を有する分子を指す。ポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、ポリペプチドのアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、これらの用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも称される短い鎖と、当技術分野で一般にポリペプチド又はタンパク質と称されるより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、及び融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチド、又はそれらの組合せが含まれる。
「作動可能に連結された」とは、一方の機能が他方によって影響を受けるように、単一の核酸断片上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列又は機能的ＲＮＡの発現に影響を及ぼすことができる場合（すなわち、コード配列又は機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）、コード配列又は機能的ＲＮＡと作動可能に連結されている。コード配列は、センス又はアンチセンス配向で制御配列に作動可能に連結され得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子インプリント」という用語は、供給源細胞又はｉＰＳＣにおける優先的な治療属性に寄与し、供給源細胞由来のｉＰＳＣ及び／又はｉＰＳＣ由来の造血系細胞において保持可能な遺伝的又は後成的情報を指す。本明細書で使用される場合、「供給源細胞」は、再プログラミングを通じてｉＰＳＣを生成するために使用され得る非多能性細胞であり、供給源細胞由来のｉＰＳＣは、任意の造血系統細胞を含む特定の細胞型に更に分化され得る。供給源細胞由来のｉＰＳＣ、及びそれから分化した細胞は、時折、状況に応じて、まとめて「由来」又は「派生」細胞と呼ばれる。例えば、本明細書全体を通して使用される派生エフェクター細胞、派生ＮＫ系統細胞若しくは派生Ｔ系統細胞は、末梢血、臍帯血、又は他のドナー組織等の天然／天然源から得られた一次対応細胞と比較して、ｉＰＳＣから分化した細胞である。本明細書で使用される場合、優先的な治療属性を付与する遺伝子インプリントは、ドナー特異的、疾患特異的、又は治療応答特異的な選択された供給源細胞を再プログラミングすることによって、又はゲノム編集を使用して、遺伝子修飾されたモダリティをｉＰＳＣに導入することによってのいずれかでｉＰＳＣに組み込まれる。特異的に選択されたドナー、疾患、又は治療状況から取得されたソース細胞の態様では、優先的な治療属性に寄与する遺伝的インプリントには、根本的な分子事象が同定されているかどうかに関係なく、選択されたソース細胞の派生細胞に渡される、保持可能な表現型、すなわち優先的な治療属性を表す、状況特異的な遺伝的又はエピジェネティックを含み得る。ドナー特異的、疾患特異的、又は治療応答特異的供給源細胞は、ｉＰＳＣ及び由来造血系統細胞において保持可能な遺伝子インプリントを含み得、これらの遺伝子インプリントには、例えば、ウイルス特異的Ｔ細胞又はインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞からの予め配置された単一特異性ＴＣＲ；追跡可能で望ましい遺伝子多型、例えば、選択されたドナーの高親和性ＣＤ１６受容体をコードする点変異のためのホモ接合性；所定のＨＬＡ要件、すなわち、集団が増加したハプロタイプを呈する選択されたＨＬＡ適合ドナー細胞が含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用される場合、優先的な治療属性には、由来細胞の改善された生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、免疫応答の制御、生存、並びに細胞傷害性が含まれる。優先的な治療属性は、抗原標的化受容体の発現、ＨＬＡの提示又はその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞の誘導及び免疫制御、腫瘍外効果の低減による改善された標的特異性、及び／又は化学療法等の治療に対する耐性にも関係している可能性がある。
本明細書で使用される場合、「増強された治療特性」という用語は、同じ一般的な細胞型の典型的な免疫細胞と比較して増強された細胞の治療特性を指す。例えば、「増強された治療特性」を有するＮＫ細胞は、典型的な、未修飾の、及び／又は天然に存在するＮＫ細胞と比較して、増強、改善、及び／又は増大された治療特性を有する。免疫細胞の治療特性には、細胞生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、免疫応答の制御、生存、並びに細胞傷害性が含まれ得るが、これらに限定されない。免疫細胞の治療特性は、抗原標的化受容体の発現、ＨＬＡの提示又はその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞の誘導及び免疫制御、腫瘍外効果の低減による改善された標的特異性、及び／又は化学療法等の治療に対する耐性よっても示される。
本明細書で使用される場合、「エンゲージャ」という用語は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、及び腫瘍細胞間の連結を形成し、免疫細胞を活性化することができる分子、例えば、融合ポリペプチドを指す。エンゲージャの例には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャ、多重特異性キラー細胞エンゲージャ、又は複数の免疫細胞型と適合性のあるユニバーサルエンゲージャが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「表面トリガー受容体」という用語は、免疫応答、例えば、細胞傷害性応答を誘発又は開始することができる受容体を指す。表面トリガー受容体は操作することができ、エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、又は好中球で発現させることができる。いくつかの実施形態では、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然の受容体及び細胞型とは関係なく、エフェクター細胞と特定の標的細胞、例えば、腫瘍細胞との間の二重又は多重特異性抗体の結合を容易にする。このアプローチを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むｉＰＳＣを生成し、次いでそのようなｉＰＳＣをユニバーサル表面トリガー受容体を発現する様々なエフェクター細胞型の集団に分化させることができる。「ユニバーサル」とは、表面トリガー受容体が、細胞型に関係なく任意のエフェクター細胞で発現及び活性化され得、ユニバーサル受容体を発現するすべてのエフェクター細胞が、エンゲージャの腫瘍結合特異性に関係なく、表面トリガー受容体によって認識可能な同じエピトープを有するエンゲージャに結合又は連結され得ることを意味する。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャは、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合するために使用される。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャは、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合するために使用される。したがって、１つ又は複数のエフェクター細胞型を使用して、１つの特定の型の腫瘍細胞を殺滅する場合もあれば、２つ以上の型の腫瘍を殺滅する場合もある。表面トリガー受容体は、一般に、エフェクター細胞活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャのエピトープに特異的なエピトープ結合領域と、を含む。二重特異性エンゲージャは、一方の端で表面トリガー受容体のエピトープ結合領域に特異的であり、もう一方の端で腫瘍抗原に特異的である。
本明細書で使用される場合、「安全スイッチタンパク質」という用語は、細胞療法の潜在的な毒性又はさもなければ有害作用を防止するように設計された操作されたタンパク質を指す。場合によっては、安全スイッチタンパク質の発現は、安全スイッチタンパク質をコードする遺伝子をそのゲノムに恒久的に組み込んだ、移植された操作された細胞の安全性の懸念に対処するために条件付きで制御される。この条件付き制御は可変であってよく、小分子を介した翻訳後活性化並びに組織特異的及び／又は一時的な転写制御による制御が含まれ得る。安全スイッチは、アポトーシスの誘導、タンパク質合成の阻害、ＤＮＡ複製、成長停止、転写及び転写後の遺伝子制御、並びに／又は抗体を介した枯渇を媒介し得る。場合によっては、安全スイッチタンパク質は、外因性分子、例えば、プロドラッグによって活性化され、活性化されると、治療用細胞のアポトーシス及び／又は細胞死を誘発する。安全スイッチタンパク質の例には、カスパーゼ９（又はカスパーゼ３又は７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞ＣＤ２０、修飾されたＥＧＦＲ、及びそれらの任意の組合せ等の自殺遺伝子が含まれるが、これに限定されない。この戦略では、有害事象が発生した場合に投与されるプロドラッグは、自殺遺伝子産物によって活性化され、形質導入された細胞を殺滅する。
本明細書で使用される場合、「薬学的に活性なタンパク質又はペプチド」という用語は、生物に対して生物学的及び／又は薬学的効果を達成することができるタンパク質又はペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質は、疾患に対して治癒的、根治的、又は姑息的特性を有し、疾患の重症度を回復させる、緩和する、軽減する、逆転させる、又は和らげるために投与することができる。薬学的に活性なタンパク質はまた、予防的特性を有し、疾患の発症を予防するため、又はそれが出現したときにそのような疾患若しくは病的状態の重症度を和らげるために使用される。薬学的に活性なタンパク質には、全タンパク質若しくはペプチド、又はそれらの薬学的に活性な断片が含まれる。それはまた、タンパク質若しくはペプチドの薬学的に活性な類似体、又はタンパク質若しくはペプチドの断片の類似体を含む。薬学的に活性なタンパク質という用語はまた、協調的又は相乗的に作用して治療上の利益を提供する複数のタンパク質又はペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質又はペプチドの例には、受容体、結合タンパク質、転写及び翻訳因子、腫瘍成長抑制タンパク質、抗体若しくはその断片、成長因子、及び／又はサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「シグナル伝達分子」という用語は、細胞シグナル伝達に影響を及ぼす、それに関与する、阻害する、活性化する、低減する、又は増加させる任意の分子を指す。「シグナル伝達」とは、最終的に細胞内の生化学的事象を引き起こす経路に沿ったタンパク質複合体の動員による化学修飾の形態での分子シグナルの伝達を指す。シグナル伝達経路は当技術分野で周知であり、Ｇタンパク質結合受容体シグナル伝達、チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達、インテグリンシグナル伝達、トールゲートシグナル伝達、リガンド依存性イオンチャネルシグナル伝達、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存性経路、及びＩＰ３／ＤＡＧシグナル伝達経路を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「標的化モダリティ」という用語は、細胞に遺伝的に組み込まれて、ｉ）独特のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関連する場合、抗原特異性、ｉｉ）モノクローナル抗体又は二重特異性エンゲージャに関連する場合、エンゲージャ特異性、ｉｉｉ）形質転換された細胞の標的化、ｉｖ）癌幹細胞の標的化、及びｖ）特定の抗原又は表面分子の不在下での他の標的化戦略が含まれるがこれらに限定されない抗原及び／又はエピトープ特異性を促進する分子、例えば、ポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「特異的」又は「特異性」という用語は、非特異的又は非選択的結合とは対照的に、分子、例えば、受容体又はエンゲージャが標的分子に選択的に結合する能力を指すために使用され得る。
「養子細胞療法」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子修飾されているか否かにかかわらず、注入前にインビボで拡大されたＴ細胞又はＢ細胞として特定される、自家又は同種異系リンパ球の該注入に関連する細胞ベースの免疫療法を指す。
本明細書で使用される場合、「治療的に十分な量」は、その意味の範囲内で、非毒性であるが、それが言及する特定の治療及び／又は薬学的組成物の十分な及び／又は有効な量を含み、所望の治療効果を提供する。必要な正確な量は、患者の一般的な健康状態、患者の年齢、並びに状態の段階及び重症度等の要因に応じて、対象ごとに異なる。特定の実施形態では、治療的に十分な量は、治療される対象の疾患又は状態に関連する少なくとも１つの症状を回復させる、低減する、及び／又は改善するのに十分である、及び／又は効果的である。
多能性幹細胞の分化には、培養培地中の刺激剤又は細胞の物理的状態の変化等、培養系の変化が必要である。最も一般的な戦略は、系統特異的分化を開始するための一般的かつ重要な中間体として胚様体（ＥＢ）の形成を利用する。「胚様体」は、三次元領域内に多数の系統を生じさせるため、胚発生を模倣することが示されている三次元クラスターである。典型的には数時間から数日である分化プロセスを通じて、単純なＥＢ（例えば、分化を誘発する凝集した多能性幹細胞）は成熟を続け、嚢胞性ＥＢに発達し、その時点で（典型的には数日から数週間）、更に処置されて分化を続ける。ＥＢ形成は、多能性幹細胞を三次元の多層細胞クラスター内で互いに近接させることによって開始され、典型的には、これは多能性細胞を液滴に沈降させ、細胞を「Ｕ」底ウェルプレートに沈降させるか、又は機械的攪拌等によるものを含む、いくつかの方法のうちの１つによって達成される。多能性培養維持培地中で維持された凝集体は適切なＥＢを形成しないため、ＥＢの発生を促進するために、多能性幹細胞凝集体は更なる分化の手掛かりが必要である。したがって、多能性幹細胞の凝集体は、選択した系統に向けて誘発の手掛かりを提供する分化培地に移す必要がある。多能性幹細胞のＥＢベースの培養は、典型的には、ＥＢ細胞クラスター内で中程度の増殖を伴う分化した細胞集団（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）の生成をもたらす。細胞分化を促進することが証明されているが、ＥＢは、三次元構造の細胞が環境からの分化の手掛かりに一貫して曝されていないため、異なる分化状態の異種細胞を生じさせる。加えて、ＥＢは作製及び維持が困難である。更に、ＥＢを介した細胞分化は、適度な細胞拡大を伴い、これも分化効率の低下に寄与する。
対照的に、「ＥＢ形成」とは異なる「凝集体形成」は、多能性幹細胞由来細胞の集団を拡大するために使用することができる。例えば、凝集体ベースの多能性幹細胞の拡大中に、増殖及び多能性を維持するための培養培地が選択される。細胞増殖は一般に、より大きな凝集体を形成する凝集体のサイズを増加させ、これらの凝集体は、培養内の細胞増殖を維持し、細胞数を増加させるために、日常的に機械的又は酵素的に小さな凝集体に解離され得る。ＥＢ培養とは異なり、維持培養下の凝集体内で培養された細胞は、多能性のマーカーを維持する。多能性幹細胞凝集体は、分化を誘導するために更なる分化の手掛かりを必要とする。
本明細書で使用される場合、「単層分化」は、細胞の三次元多層クラスターによる分化とは異なる分化方法、すなわち「ＥＢ形成」を指す用語である。本明細書に開示される他の利点の中でも、単層分化は、分化開始のためのＥＢ形成の必要性を回避する。単層培養はＥＢ形成等の胚発生を模倣しないため、特定の系統への分化は、ＥＢの３つすべての胚葉分化と比較して最小限であるとみなされる。
本明細書で使用される場合、「解離した」細胞は、他の細胞から、又は表面（例えば、培養プレート表面）から実質的に分離又は精製された細胞を指す。例えば、細胞は、機械的又は酵素的方法によって動物又は組織から解離され得る。代替的に、インビトロで凝集する細胞は、クラスターの懸濁液、単一細胞、又は単一細胞とクラスターとの混合物への解離等によって、酵素的又は機械的に互いに解離することができる。更に別の代替の実施形態では、付着細胞は、培養プレート又は他の表面から解離される。したがって、解離は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び基質（例えば、培養表面）との細胞相互作用の破壊、又は細胞間のＥＣＭの破壊を伴い得る。
本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」は、フィーダー細胞が、第２の細胞型を支持するための刺激、成長因子、及び栄養素を提供するため、第２の型の細胞が成長、拡大、又は分化することができる環境を提供するために第２の型の細胞と共培養される１つの型の細胞を説明する用語である。フィーダー細胞は、任意選択で、それらが支持する細胞とは異なる種からである。例えば、幹細胞を含むある特定の型のヒト細胞は、マウス胚性線維芽細胞又は不死化マウス胚性線維芽細胞の初代培養によって支持することができる。別の例では、末梢血由来細胞又は形質転換された白血病細胞がナチュラルキラー細胞の拡大及び成熟を支持する。フィーダー細胞は、典型的には、他の細胞と共培養するときに、それらが支持している細胞よりも成長するのを防ぐために、照射又はマイトマイシン等の有糸分裂剤アンタゴニストで処置することによって不活化され得る。フィーダー細胞は、内皮細胞、間質細胞（例えば、上皮細胞又は線維芽細胞）、及び白血病細胞を含み得る。前述のことを制限することなく、１つの特定のフィーダー細胞型は、ヒト皮膚線維芽細胞等のヒトフィーダーであり得る。別のフィーダー細胞型は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）であり得る。一般に、様々なフィーダー細胞を部分的に使用して、多能性を維持し、ある特定の系統への分化を指向し、増殖能力を高め、エフェクター細胞等の特殊化された細胞型への成熟を促進することができる。
本明細書で使用される場合、「フィーダーフリー」（ＦＦ）環境は、フィーダー細胞又は間質細胞を本質的に含まない、及び／又はフィーダー細胞の培養によって予め条件付けされていない培養条件、細胞培養物、又は培養培地等の環境を指す。「予め条件付けされた」培地とは、フィーダー細胞が培地内で少なくとも１日等の期間培養された後に採取された培地を指す。予め条件付けされた培地には、培地で培養されたフィーダー細胞によって分泌される成長因子及びサイトカインを含む、多くのメディエーター物質を含む。いくつかの実施形態では、フィーダーフリー環境は、フィーダー細胞又は間質細胞の両方を含まず、またフィーダー細胞の培養によって予め条件付けされていない。
ｉＰＳＣ及びそれから分化した由来非多能性細胞のゲノム編集若しくは修飾、又は非多能性細胞及びそれから再プログラミングされた由来ｉＰＳＣのゲノム編集又は修飾の文脈で使用される場合、「機能的」は、（１）直接的なゲノム編集若しくは修飾により、又は最初にゲノム操作される開始細胞からの分化若しくはその再プログラミングを介した「伝達」により達成される、遺伝子レベルでの良好なノックイン、ノックアウト、ノックダウン遺伝子発現、トランスジェニック若しくは制御された遺伝子発現、例えば、所望の細胞の発達段階での誘導性若しくは一時的な発現、あるいは（２）（ｉ）直接的なゲノム編集により該細胞において得られた遺伝子発現の修飾、（ｉｉ）最初にゲノム操作される開始細胞からの分化若しくはその再プログラミングを介した「伝達」により該細胞で維持される遺伝子発現の修飾、（ｉｉｉ）該細胞の初期の発生段階でのみ現れる、又は分化又は再プログラミングを介して該細胞を生じさせる開始細胞でのみ現れる遺伝子発現の修飾の結果としての該細胞における下流の遺伝子制御、又は（ｉｖ）最初に、ｉＰＳＣ、前駆細胞、若しくは脱分化した細胞起源で行われたゲノム編集若しくは修飾に由来する、成熟細胞産物内に提示される、増強された若しくは新たに獲得された細胞機能若しくは属性による、細胞レベルでの良好な細胞機能／特性（複数可）の除去、追加、又は改変を指す。
ＨＬＡクラスＩ欠損、ＨＬＡクラスＩＩ欠損、又はその両方を含む「ＨＬＡ欠損」とは、ＨＬＡクラスＩタンパク質ヘテロ二量体及び／又はＨＬＡクラスＩＩのヘテロ二量体を含む完全なＭＨＣ複合体の表面発現が欠如しているか、又はもはや維持されていないか、又はレベルの減少若しくは低下が他の細胞又は合成方法によって自然に検出可能なレベルよりも低いようなレベルの低下を有するいずれかの細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「修飾されたＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ」は、改善された分化の可能性、抗原標的化、抗原提示、抗体認識、持続性、免疫回避、抑制に対する耐性、増殖、共刺激、サイトカイン刺激、サイトカイン産生（オートクリン又はパラクリン）、走化性、並びに細胞傷害性に関連するがこれらに限定されないタンパク質、例えば、非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ｅ及びＨＬＡ－Ｇ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＢＣＬ１１ｂ、ＮＯＴＣＨ、ＲＵＮＸ１、ＩＬ１５、４１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２４、ＣＤ３ζ、４１ＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、及びＰＤＬ１を発現する遺伝子を導入することによって更に修飾されるＨＬＡ欠損ｉＰＳＣを指す。「修飾されたＨＬＡ欠損」の細胞には、ｉＰＳＣ以外の細胞も含まれる。
「ＦｃＲ」として略される「Ｆｃ受容体」は、それらが認識する抗体の種類に基づいて分類される。例えば、最も一般的なクラスの抗体であるＩｇＧに結合するものは、Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれ、ＩｇＡに結合するものはＦｃ－アルファ受容体（ＦｃαＲ）と呼ばれ、ＩｇＥに結合するものはＦｃ－イプシロン受容体（ＦｃεＲ）と呼ばれる。ＦｃＲのクラスは、それらを発現する細胞（マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞）及び各受容体のシグナル伝達特性によっても区別される。Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）には、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）のいくつかのメンバーが含まれ、これらは、分子構造が異なるため抗体親和性が異なる。
「ＣＦｃＲ」と略される「キメラＦｃ受容体」は、天然の膜貫通及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインが改変されたか、又は非天然の膜貫通及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインで置き換えられた操作されたＦｃ受容体を記載するために使用される用語である。キメラＦｃ受容体のいくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインの一方又は両方が非天然であることに加えて、１つ又は複数の刺激ドメインを操作されたＦｃ受容体の細胞内部分に導入して、受容体の誘発により細胞活性化、拡大、及び機能を増強することができる。標的抗原への抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは異なり、キメラＦｃ受容体は、Ｆｃ断片、又は抗体のＦｃ領域、又はエンゲージャ若しくは結合分子に含まれるＦｃ領域に結合し、標的化された細胞を近接させるかどうかに関係なく細胞を活性化する。例えば、Ｆｃγ受容体は、細胞外ドメインでのＩｇＧの結合に応答し、それによりＣＦｃＲを生成する、細胞内領域内の選択された膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、及び／又はシグナル伝達ドメインを含むように操作され得る。一例では、ＣＦｃＲは、その膜貫通ドメイン及び／又は細胞内ドメインを置き換えることにより、Ｆｃγ受容体であるＣＤ１６を操作することによって生成される。ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲの結合親和性を更に改善するために、ＣＤ６４の細胞外ドメイン又はＣＤ１６の高親和性バリアント（例えば、Ｆ１７６Ｖ）を組み込むことができる。高親和性ＣＤ１６細胞外ドメインを伴うＣＦｃＲのいくつかの実施形態では、１９７位にセリンを含むタンパク質分解切断部位が排除されるか、又は受容体の細胞外ドメインが切断不可能であるように置き換えられる、すなわち、シェディングの影響を受けず、それにより、ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲが得られる。
ＦｃγＲ受容体であるＣＤ１６は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）の２つのアイソフォームを有することが特定されている。ＣＤ１６ａは、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質であり、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合して、ＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を容易にする。本明細書で使用される場合、「高親和性ＣＤ１６」、「切断不可能なＣＤ１６」、又は「高親和性の切断不可能なＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）」はそれぞれ、ＣＤ１６の天然又は非天然バリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞の活性化により白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を制御するタンパク質分解切断プロセスであるエクトドメインシェディングを受ける。Ｆ１７６Ｖ及びＦ１５８Ｖ（シグナルペプチドなし）は、高い親和性を有する例示的な天然のＣＤ１６多形バリアントである。膜近位領域（１８９～２１２位）における切断部位（１９５～１９８位）が改変又は排除されているＣＤ１６バリアントは、シェディングを受けない。切断部位及び膜近位領域は、国際公開第２０１５／１４８９２６号に詳細に記載され、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ１６ Ｓ１９７Ｐバリアントは、ＣＤ１６の設計された切断不可能なバージョンである。Ｆ１５８Ｖ及びＳ１９７Ｐの両方を含むＣＤ１６バリアントは、親和性が高く、切断不可能である。別の例示的な高親和性で切断不可能なＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）バリアントは、ＣＤ６４エクトドメインの３つのエキソンのうちの１つ又は複数に由来するエクトドメインを含む操作されたＣＤ１６である。
Ｉ．養子免疫療法におけるエフェクター細胞の製造及びインビボの有効性を改善するための薬剤
凍結保存は、細胞の生存率、機能、安定性に大きな影響を与えることが知られているプロセスである。いくつかの実施形態では、本開示は、特にエフェクター細胞を凍結保存し、使用前に解凍する必要がある場合に、養子細胞ベースの治療に適した細胞のエフェクター細胞製造及びインビボ有効性を改善するのに十分な量の１つ又は複数の薬剤を含む組成物を提供する。
様々な実施形態では、養子細胞ベースの治療に適した免疫細胞は、デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、並びに薬剤（複数可）の塩、エステル、エーテル、溶媒和物、水和物、立体異性体、及びプロドラッグからなる群から選択されるそれらの誘導体、類似体、又は薬学的に許容される塩を含むがこれらに限定されない１つ又は複数の薬剤と接触するか、又は処置される。選択された薬剤（複数可）による治療は、細胞の拡大、維持、生存、増殖、細胞毒性、持続性、及び／又は細胞記憶を調節することを含む、細胞の生物学的特性、又は細胞の亜集団を増強することができ、したがって細胞の治療の可能性を増強する。デキサメタゾンは、細胞質ゾルグルココルチコイド受容体に結合して、リガンド受容体複合体を形成し、次いで細胞核に転位するグルココルチコイドであり、そこで複合体は、プロモータ領域でグルココルチコイド応答要素に結合し、結果として抗炎症作用及び免疫抑制作用に関連している標的遺伝子の転写活性化が生じる。デキサメタゾン、例としてグルココルチコイド受容体アゴニストは、その強力な抗炎症及び免疫抑制特性でも知られており、この用途で使用される合成グルココルチコイドであり、分化したエフェクター細胞を予期せず調整して、凍結保存の耐久性及びインビボ有効性の増強を達成する。
本開示の方法での使用に適したグルココルチコイドの追加の例示的な例には、メドリゾン、アルクロメタゾン、ジプロピオン酸アルクロメタゾン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ベタメタゾン、安息香酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、シクレソニド、クロベタゾール、酪酸クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチゾール、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコート、デソニド、デソキシメタゾン、デオキシコルトン、デスオキシメタゾン、ジフロラソン、ジフロラゾンジアセタート、ジフルコルトロン、吉草酸ジフルコルトロン、ジフルオロコルトロン、ジフルプレドナート、フルクロロロン、フルクロロロンアセトニド、フルドロキシコルチド、フルメタゾン（ｆｌｕｍｅｔａｓｏｎｅ、ｆｌｕｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、フルメタゾンピバレート、フルニソリド、フルニソリド半水和物、フルオシノロン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチン、フルオコリチンブチル、フルオコルトロン、フルオロコルチゾン、フルオロメトロン、フルペロロン、フルプレドニデン、フルプレドニデンアセタート、フルプレドニソロン、フルチカゾン、フルチカゾンプロピオナート、ホルモコルタル、ハルシノニド、ハロメタゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンアセタート、ヒドロコルチゾンアセポナート、ヒドロコルチゾンブテプラート、ヒドロコルチゾンブチラート、ロテプレドノール、メプレドニゾン、６ａ－メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンアセタート、メチルプレドニゾロンアセポナート、モメタゾン、モメタゾンフロアート、モメタゾンフロアート一水和物、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニリデン、リメキソロン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド及びウロベタゾール、並びにそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、グルココルチコイドは、メドリゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、アルクロメタゾン、又はデキサメタゾンを含む。より特定の実施形態では、グルココルチコイドは、デキサメタゾン又はその誘導体、類似体、又はそれらの薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、養子細胞ベースの治療に適した免疫細胞の治療可能性を改善するための組成物は、デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、あるいはそれらの誘導体又は類似体のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、免疫細胞の治療可能性を改善するための組成物は、デキサメタゾン及びレナリドミド、並びに／あるいはそれらの誘導体及び類似体の組合せを含む。
一実施形態では、デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、あるいはそれらの誘導体又は類似体のうちの少なくとも１つを含む組成物は、有機溶媒を更に含む。特定の実施形態では、有機溶媒は、酢酸メチルを実質的に含まない。特定の実施形態では、有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、ジメチルアセトアミド、エタノール、及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、有機溶媒はＤＭＳＯである。いくつかの実施形態では、有機溶媒はエタノールである。他のいくつかの実施形態では、有機溶媒は、ＤＭＳＯ及びエタノールの混合物である。
いくつかの実施形態では、デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、あるいはそれらの誘導体又は類似体のうちの１つ又は複数を含む組成物は、ペプチド、サイトカイン、マイトジェン、成長因子、小ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞構成要素又は置換因子、目的の１つ又は複数のポリ核酸を含むベクター、抗体及びそれらの抗体断片からなる群から選択される１つ又は複数の追加の添加剤を更に含む。いくつかの実施形態では、追加の添加剤は、抗体又は抗体断片を含む。これらの実施形態のいくつかでは、抗体又は抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体又は抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、サイトカイン及び成長因子は、以下のサイトカイン又は成長因子のうちの１つ又は複数を含む。上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ－２）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）トランスフェリン、様々なインターロイキン（ＩＬ－１～ＩＬ－１８等）、様々なコロニー刺激因子（顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、様々なインターフェロン（ＩＦＮ－γ等）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）。いくつかの実施形態では、サイトカインは、少なくともインターロイキン－２（ＩＬ－２又はＩＬ２）、インターロイキン７（ＩＬ－７又はＩＬ７）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２又はＩＬ１２）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５又はＩＬ１５）、インターロイキン１８（ＩＬ－１８又はＩＬ１８）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１又はＩＬ２１）、又はそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、組成物の成長因子は、線維芽細胞成長因子を含む。これらのサイトカインは、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）から商業的に入手することができ、天然又は組換えのいずれかであり得る。特定の実施形態では、成長因子及びサイトカインは、本明細書で企図される濃度で添加され得る。特定の実施形態では、成長因子及びサイトカインは、経験的に決定されるか、又は確立されたサイトカイン技術によって導かれる通りの濃度で添加され得る。いくつかの他の実施形態では、デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、あるいはそれらの誘導体又は類似体のうちの１つを含む組成物は、Ｔ細胞治療のためのＩＬ７を含まない。特定の実施形態では、デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、あるいはそれらの誘導体又は類似体のうちの１つを含む組成物は、Ｔ細胞治療のためのサイトカインを含まない。更にいくつかの他の実施形態では、デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、あるいはそれらの誘導体又は類似体のうちの１つを含む組成物は、ＮＫ細胞治療のためのＩＬ２及び／又はＩＬ１５を含まない。更にいくつかの他の実施形態では、デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、あるいはそれらの誘導体又は類似体のうちの１つを含む組成物は、ＮＫ細胞治療のためのＩＬ７を含まない。特定の実施形態では、デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、あるいはそれらの誘導体又は類似体のうちの１つを含む組成物は、ＮＫ細胞治療のためのいずれのサイトカインも含まない。
デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、あるいはそれらの誘導体又は類似体の１つを含む組成物を使用する治療に適した細胞には、末梢血、臍帯血、又は他の任意のドナー組織、例えば、Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、Ｂ細胞又はそれらのいずれかのサブタイプから得られる天然に存在する細胞；あるいは、分化人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から得られた派生細胞が含まれるが、これらに限定されない。派生細胞は、派生ＣＤ３４細胞、派生造血幹細胞及び前駆細胞、派生造血多分化能前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆細胞、派生ＮＫ細胞前駆細胞、派生Ｔ細胞、派生ＮＫＴ細胞、派生ＮＫ細胞、又は派生Ｂ細胞のいずれか１つであり得る。いくつかの実施形態では、治療のための免疫細胞の集団は、インビトロで、幹細胞、造血幹又は前駆細胞、又は前駆細胞から分化され得るか、あるいは造血又は非造血系統の非多能性細胞からトランス分化され得る。いくつかの実施形態では、調節のために免疫細胞を誘導する幹細胞、造血幹細胞又は前駆細胞、前駆細胞、又は非多能性細胞は、ゲノム操作され、挿入、欠失、及び／又は核酸置換を含んで、治療のために誘導された免疫細胞は、ソース細胞にゲノム操作によって導入されたものと同じ遺伝子モダリティを含む。
一実施形態では、養子細胞ベースの治療に適した免疫細胞の集団又は亜集団を調節する方法は、免疫細胞を、本明細書で提供される少なくとも１つの小化合物を含む組成物と接触させることを含み、接触された免疫細胞は増強された解凍後細胞毒性を有し、腫瘍制御、腫瘍クリアランス、及び／又は腫瘍再発の減少における増強された能力を特徴とする増強されたインビボ有効性を含み、同じ小化合物処置なしの解凍後の対応する免疫細胞と比較して、腫瘍浸透を改善し、及び／又は骨髄及び／又は腫瘍部位への移動における能力を増強した。
いくつかの実施形態では、養子細胞ベースの治療に適した免疫細胞の集団又は亜集団を処置する方法は、細胞有効性を高めるのに十分な量で、本明細書に提供される少なくとも１つの小化合物を含む組成物と免疫細胞を接触させることを含む。一実施形態では、免疫細胞治療用の小化合物は、約１０ｎＭ～約２０μＭの濃度で存在する。一実施形態では、免疫細胞治療用の化合物は、約１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、又は２０μＭ、あるいは間の任意の濃度で存在する。一実施形態では、免疫細胞治療のための化合物の濃度は、約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、約５０ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１００ｎＭ～約５００ｎＭ、約２５０ｎＭ～約１μＭ、約５００ｎＭ～約５μＭ、約１μＭ～約５μＭ、約３μ～約１０μＭ、約５μＭ～約１５μＭ、約８μＭ～約１２μＭ、又は約１５μＭ～約２０μＭである。
いくつかの実施形態では、養子細胞ベースの治療に適した免疫細胞の集団又は亜集団を調節する方法は、細胞有効性を高めるのに十分な時間の長さ、本明細書で提供される少なくとも１つの化合物を含む組成物と免疫細胞を接触させることを含む。一実施形態では、免疫細胞は、１つ又は複数の提供された化合物と、少なくとも１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１４日、又はその間の任意の期間、接触される。一実施形態では、免疫細胞は、約１８時間～約２日、約１日～約３日、約２日～約５日、約３日～約６日、日、約５日～約８日、約７日～約１０日、約８日～約１２日、約１１日～約１４日、１つ又は複数の提供された化合物と接触される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、本明細書で提供される１つ又は複数の化合物と、少なくとも２日、１日、１８時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、２時間、又はその間の任意の時間の長さで接触される。したがって、該十分な時間の長さは、例えば、４８、２４、１５、１３、１１、９、７、５、３、又は１時間以上である。この方法の他のいくつかの実施形態では、該十分な時間の長さは、少なくとも５日、４日、３日、２日、又はその間の任意の時間の長さである。したがって、該十分な時間の長さは、例えば、５、４、３、又は２日以上である。
デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、あるいはそれらの誘導体又は類似体の１つを含む組成物で処置された細胞は、静置／維持培養、又は細胞増殖のための培養にあり得る。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ分化から得られた派生細胞の小化合物組成物による処置は、分化後の増殖段階の間であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、凍結保存される前に、小化合物組成物で処置される。処置は十分な期間続き、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日以上に及ぶ可能性がある。いくつかの実施形態では、処置は２～７日間続く。いくつかの実施形態では、処置は５日間続く。いくつかの実施形態では、処置された細胞が凍結保存される場合、培地は、凍結保存の前の処置で使用される化合物（複数可）を含まないか、又は本質的に含まない。
ＩＩ．機能調節に適した養子細胞
本明細書で提供される機能調節のための適切な養子細胞は、分化するゲノム操作されたｉＰＳＣから得られる派生エフェクター細胞を含み、ｉＰＳＣ及び派生細胞の両方が、ＣＡＲ、ＣＤ３８ノックアウト；ＣＤ１６；外因性サイトカイン及び／又はそのシグナル伝達構成要素；ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損；ＨＬＡ－Ｇの過剰発現及びＣＤ５８とＣＤ５４の一方又は両方のノックアウト；ＴＣＲ ｎｕｌｌ；ＣＤ３提示表面；抗原特異的ＴＣＲ；ＮＫＧ２Ｃ；ＤＡＰ１０／１２；ＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ３３（「２Ｃ１５３３」）、この仕様で更に詳細に説明されているか、又は当技術分野で知られている追加の編集のうちの１つ又は複数を含む。
１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びその派生エフェクター細胞に適用可能なものは、当技術分野で既知の任意のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）設計であり得る。ＣＡＲは、抗原認識領域、膜貫通ドメイン、及びエンドドメインを含む一般にエクトドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、エクトドメインは、シグナルペプチド若しくはリーダー配列、及び／又はスペーサーを更に含み得る。いくつかの実施形態では、エンドドメインは、ＣＡＲを発現するエフェクター細胞を活性化するシグナル伝達ペプチドを更に含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びＣＡＲを構成するように操作されたｉＰＳＣから分化した派生エフェクター細胞において、発現され、機能するように設計される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、ｉＰＳＣ分化を妨害しないように、及び／又はそれが所望のエフェクター細胞型に向けられたｉＰＳＣの分化を促進するように設計されている。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、エフェクター細胞の増殖、持続性、生存、細胞毒性、アロ拒絶（ａｌｌｏｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）に対する耐性、腫瘍浸透、遊走、バイスタンダー免疫細胞を活性化及び／又は動員する能力、並びに／あるいは腫瘍抑制を克服する能力を増強する。実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲはまた、細胞株細胞及び一次供給源、すなわち、末梢血、臍帯血、又は他のドナー組織等の天然／ネイティブ供給源からの細胞において直接発現され得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、該ＣＡＲを発現するＴ細胞又はＮＫ系統細胞のいずれかを活性化するのに好適である。いくつかの実施形態では、ＮＫ特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲは、ＮＫ細胞特異的である。ある特定の実施形態では、該Ｔ細胞は、ＣＡＲ発現ｉＰＳＣに由来し、派生Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞、又はそれらの組合せを含み得る。ある特定の実施形態では、該ＮＫ細胞は、ＣＡＲ発現ｉＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲは、ＮＫ細胞特異的である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲはまた、Ｔ細胞又は他の細胞型に適している。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲは、Ｔ細胞特異的である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲはまた、ＮＫ細胞又は他の細胞型に適している。いくつかの実施形態では、ＮＫＴ細胞特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲは、ＮＫＴ細胞特異的である。いくつかの実施形態では、ＮＫＴ細胞特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲはまた、ＮＫ細胞若しくはＴ細胞、又は他の細胞型に適している。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、少なくともエクトドメイン、膜貫通ドメイン、及びエンドドメインを含む。ＣＡＲのエンドドメインは、ＣＡＲを発現する細胞の増殖及び機能に影響を及ぼし、抗原結合時にＣＡＲを発現するエフェクター細胞を活性化する少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲエンドドメインのいくつかの実施形態では、１つ又は複数の共刺激ドメイン（しばしば追加のシグナル伝達ドメインとも呼ばれる）が、更に含まれて、細胞の寿命、記憶分化、及び代謝特性に影響を与える。ここでは、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に特異的なシグナル伝達タンパク質を使用して、ＣＡＲ融合タンパク質のビルディングブロック、例えば、ＣＡＲのエンドドメインに含まれる膜貫通ドメイン及び１つ又は複数のシグナル伝達ドメインを提供する。ＣＡＲ設計に適している例示的なシグナル伝達タンパク質には、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１及びＣＤ８が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質の膜貫通及び細胞質配列を含む、例示的なシグナル伝達タンパク質の説明を以下に提供する。
ＣＡＲのいくつかの実施形態では、ＣＡＲのエンドドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、又はＣＤ８の細胞質ドメイン又はその一部に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、少なくとも第１のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、又はＣＤ８の細胞質ドメインの一部のみを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲシグナル伝達ドメインのために選択される細胞質ドメインの部分は、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）、ＹｘｘＭモチーフ、ＴｘＹｘｘＶ／Ｉモチーフ、ＦｃＲγ、ｈｅｍｉ－ＩＴＡＭ、及び／又はＩＴＴ様モチーフと、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列である。
ＣＡＲのいくつかの実施形態では、ＣＡＲのエンドドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ／１ＸＸ（すなわち、ＣＤ３ζ又はＣＤ３ζ１ＸＸ）、ＣＳ１、又はＣＤ８の細胞質ドメイン又はその一部に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２のシグナル伝達ドメインを更に含む第１のシグナル伝達ドメインを含み、第２のシグナル伝達ドメインは、第１のシグナル伝達ドメインとは異なる。
ＣＡＲのいくつかの実施形態では、ＣＡＲのエンドドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ／１ＸＸ（すなわち、ＣＤ３ζ又はＣＤ３ζ１ＸＸ）、ＣＳ１、又はＣＤ８の細胞質ドメイン又はその一部に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、第３のシグナル伝達ドメインを更に含む第１及び第２のシグナル伝達ドメインを含み、第３のシグナル伝達ドメインは、第１及び第２のシグナル伝達ドメインとは異なる。
１つのシグナル伝達ドメインのみからなるエンドドメインを有するＣＡＲのいくつかの例示的な実施形態では、該エンドドメインは、ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８Ｈ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＤＡＰ１２又はＤＡＰ１０を含むがこれらに限定されないタンパク質の細胞質ドメイン又はその一部と、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
２つの異なるシグナル伝達ドメインから構成されるエンドドメインを有するＣＡＲのいくつかの例示的な実施形態では、該エンドドメインは、２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－ＤＮＡＭ１、２Ｂ４－ＦｃＥＲＩγ、２Ｂ４－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１、ＣＤ１６－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＡＰ１２、ＣＤ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２８－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＡＰ１２、ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、又はＤＡＰ１０－ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１２－ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０、ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４、又はＮＫｐ４６－２Ｂ４を含むがこれらに限定されない融合した細胞質ドメイン又はその一部を含む。
３つの異なるシグナル伝達ドメインから構成されるエンドドメインを有するＣＡＲのいくつかの例示的な実施形態では、該エンドドメインは、２Ｂ４－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－ＩＬ２１Ｒ－ＤＡＰ１０、２Ｂ４－ＩＬ２ＲＢ－ＤＡＰ１０、２Ｂ４－ＩＬ２ＲＢ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－４１ＢＢ－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－２Ｂ４－ＤＡＰ１０、又はＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸを含むがこれに限定されない形態の融合細胞質ドメイン又はその一部を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、又はＴ細胞受容体ポリペプチドの膜貫通領域の全長又は一部に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。他のいくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、又はＣＤ８の膜貫通領域の全長又は一部に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＣＡＲのいくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及びそのすぐに連結されたシグナル伝達ドメインは同じタンパク質に由来する。ＣＡＲの他のいくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及びすぐに連結されているシグナル伝達ドメインは、異なるタンパク質に由来する。
一般に、ＣＡＲ構築物は、膜貫通ドメインと、及び１つ又は複数のシグナル伝達タンパク質の細胞質領域に由来する１つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲエンドドメインに含まれる１つ又は複数のシグナル伝達ドメインは、ＴＭが由来するものと同じ又は異なるタンパク質に由来する。本明細書で提供されるように、ＣＡＲの膜貫通ドメイン（ＴＭ）を表す部分には下線が引かれ、エンドドメインに含まれるドメインは括弧「（）」であり、ＴＭ及びシグナル伝達ドメインのそれぞれは、ドメイン配列が由来するシグナル伝達タンパク質の名称で示される。いくつかの実施形態では、各ＴＭ又はシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列は、指定されたシグナル伝達タンパク質の対応する膜貫通領域又は細胞質領域の全長又は一部に対して、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性であり得る。本明細書で提供される膜貫通ドメイン及びエンドドメインを含む例示的なＣＡＲ構築物には、ＮＫＧ２Ｄ－（２Ｂ４－ＩＬ２ＲＢ－ＣＤ３ζ）、ＣＤ８－（４１ＢＢ－ＣＤ３ ζ１ＸＸ）、ＣＤ２８－（ＣＤ２８－２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、ＣＤ２８Ｈ－（ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ）、ＤＮＡＭ１－（ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ）、ＤＡＰ１０－（ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４）、ＣＤ１６－（ＣＤ１６－２Ｂ４－ＤＡＰ１０）、ＣＤ１６－（ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１）、ＮＫｐ４６－（ＮＫｐ４６－２Ｂ４）、ＮＫｐ４６－（ＮＫｐ４６－２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、ＮＫｐ４６－（ＮＫｐ４６－ＣＤ２－Ｄａｐ１０）、ＣＤ２－（ＣＤ２－ＣＤ３ζ）、２Ｂ４－（２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、２Ｂ４－（２Ｂ４－ＦｃＥＲＩｇ）、及びＣＳ１－（ＣＳ１－ＣＤ３ζ）が含まれるが、これらに限定されない。
上記のＴＭ－（エンドドメイン）のいずれかを含むＣＡＲは、ＣＡＲのエクトドメインに含まれる抗原結合ドメインによって決定される少なくとも１つの抗原を特異的に標的とするように構築することができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、疾患又は病原体に関連する抗原を特異的に標的とすることができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは腫瘍抗原を特異的に標的とすることができ、腫瘍は液性又は固形腫瘍であり得る。ＣＡＲのエクトドメインは、抗原特異的結合のための１つ又は複数の抗原認識ドメインを含む。いくつかの実施形態では、エクトドメインは、シグナルペプチド若しくはリーダー配列、及び／又はスペーサーを更に含み得る。
ある特定の実施形態では、提供されるＣＡＲのエクトドメインは、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、サメ重鎖のみの抗体（ＶＮＡＲ）、ＩｇＮＡＲ、キメラ抗体、組換え抗体、又はそれらの抗体断片を含む抗原認識領域を含む。抗体断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ）´２、Ｆ（ａｂ）´３、Ｆｖ、抗原結合単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）、及び全抗体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられる。遺伝子操作されたｉＰＳＣ及び派生エフェクター細胞に含まれるＣＡＲ（複数可）によって標的とされ得る抗原の非限定的な例としては、ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２，３，４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、メラノーマ抗原ファミリＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、癌－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮成長因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び当該技術分野で既知の様々な病原体抗原が挙げられる。病原体の非限定的な例としては、病気を引き起こすことが可能なウイルス、細菌、真菌、寄生虫、及び原生動物が挙げられる。
いくつかの実施形態では、提供されるＣＡＲのエクトドメインは、シグナルペプチドを更に含む。シグナルペプチドは、適切なグリコシル化及び原形質膜の固定のために、ＣＡＲポリペプチドを小胞体（ＥＲ）に誘導する。一般に、分泌タンパク質をＥＲ経路に標的化する任意の真核生物シグナル配列を使用することができる。例示的な適切なシグナルペプチドには、ＩＬ－２シグナル配列、カッパリーダー配列、ＣＤ８αリーダー配列、アルブミンシグナル配列、プロラクチンシグナル配列、及びＩｇＧシグナルペプチド、並びにＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、提供されるＣＡＲのエクトドメインは、抗原認識ドメインとＣＡＲの膜貫通ドメインとの間の柔軟性を提供するために、任意選択でヒンジ（スペーサとも呼ばれる）領域を含み得る。いくつかの例示的かつ非限定的な実施形態では、ＣＡＲのヒンジは、免疫グロブリンの、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＮＫＧＤ２、ＩｇＧ１、又はＣＨ２／ＣＨ３ドメイン、あるいはそれらの組合せ等の既知のポリペプチドのヒンジ領域に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのヒンジ領域は、免疫グロブリンのＣＨ２／ＣＨ３ドメインに対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるような１つ又は複数のＣＡＲを含むエフェクター細胞を使用して、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、又はＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、若しくはＢＫポリオーマウイルスに関連する感染症を治療することができる。血液悪性腫瘍の例には、急性及び慢性白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群が含まれるが、これらに限定されない。固形癌の例には、脳、前立腺、乳房、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭、首、胃、子宮頸部、直腸、喉頭、及び食道の癌が含まれるが、これらに限定されない。様々な自己免疫障害の例には、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、心筋炎のいくつかの形態、多発性硬化症、類天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ様関節炎、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ウェゲナー病）が含まれるが、これらに限定されない。ウイルス感染の例には、ＨＩＶ－（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＳＶ－（単純ヘルペスウイルス）、ＫＳＨＶ－（カポシ肉腫関連ヘルペスウイルス）、ＲＳＶ－（呼吸器合胞体ウイルス）、ＥＢＶ－（エプスタイン－バーウイルス）、ＣＭＶ－（サイトメガロウイルス）、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）、アデノウイルス－、レンチウイルス－、ＢＫポリオーマウイルス関連障害）が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の一態様は、本明細書で提供されるエンドドメインの１つを含むＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む、ｉＰＳＣ及びそれから分化した派生エフェクター細胞を提供する。該ＣＡＲの一実施形態では、ＣＡＲはＣＤ１９特異的である。別の実施形態では、ＣＡＲはＭＩＣＡ／Ｂに特異的である。別の実施形態では、ＣＡＲはＢＣＭＡ特異的である。更に別の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ３８特異的である。更に別の実施形態では、ＣＡＲはＨＥＲ２特異的である。他の一実施形態では、ＣＡＲはＭＳＬＮ特異的である。更に、別の実施形態では、ＣＡＲはＰＳＭＡ特異的である。更に別の実施形態では、ＣＡＲはＶＥＧＦ－Ｒ２特異的である。
本発明の別の態様では、提供されるエンドドメインの１つを含む第１のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む、ｉＰＳＣ及びそれから分化した派生エフェクター細胞は、異なる抗原特異性を有する第２のＣＡＲを更に含み得る。第２のＣＡＲのエンドドメインは、第１のＣＡＲのエンドドメインと同じであっても、異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲは、第１のＣＡＲのものとは異なるエンドドメインを含み、これは本明細書で提供されるエンドドメインの１つである。いくつかの他の実施形態では、第２のＣＡＲは、第１のＣＡＲのものとは異なるエンドドメインを含み、これは本明細書で提供されるようなエンドドメインの１つではない。
非限定的ＣＡＲ戦略には、一対の細胞内ドメインの二量体化を介したヘテロ二量体の条件付きで活性化されたＣＡＲ（例えば、米国特許第９，５８７，０２０号を参照されたい）；抗原結合、ヒンジ、及びエンドドメインの相同組換えにより、ＣＡＲが生成されるＣＡＲスプリット（例えば、米国特許第２０１７／０１８３４０７号を参照されたい）；それぞれ抗原結合ドメイン及びシグナル伝達ドメインに接続された２つの膜貫通ドメイン間の非共有結合を可能にするマルチチェーンＣＡＲ（例えば、米国特許第２０１４／０１３４１４２号を参照されたい）；二重特異性抗原結合ドメインを有するＣＡＲ（例えば、米国特許第９，４４７，１９４号を参照されたい）、あるいは同じ又は異なる抗原又はエピトープを認識する一対の抗原結合ドメインを有するＣＡＲ（例えば、米国特許第８，４０９，５７７号を参照されたい）、あるいはタンデムＣＡＲ（例えば、Ｈｅｇｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１６；１２６（８）：３０３６－３０５２）；誘導性ＣＡＲ（たとえば、米国特許第２０１６／００４６７００、第２０１６／００５８８５７号、及び第２０１７／０１６６８７７号を参照されたい）；切り替え可能なＣＡＲ（たとえば、米国特許第２０１４／０２１９９７５号を参照されたい）；及び当技術分野で知られている他の任意の設計が含まれる。
本明細書で提供される１つ又は複数のＣＡＲの挿入に好適なゲノム遺伝子座には、本明細書で提供されるゲノムセーフハーバーの基準を満たす遺伝子座、及び／又は挿入の結果として選択された遺伝子座での遺伝子のノックダウン又はノックアウトが望まれる遺伝子座が含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ挿入のための好適なゲノム遺伝子座としては、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα又はβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴを含むがこれらに限定されない。
一実施形態では、ｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＴＣＲ定常領域（ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ）に挿入されたＣＡＲを含み、ＴＣＲノックアウトをもたらし、任意選択でＣＡＲ発現を内因性ＴＣＲプロモータの制御下に置く。ＴＣＲヌルと、提供されるようなエンドドメインの１つを含む及びＣＡＲと、を含むｉＰＳＣ派生細胞の特定の一実施形態では、該派生細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＮＫＧ２Ａ遺伝子座又はＮＫＧ２Ｄ遺伝子座に挿入されたＣＡＲを有し、ＮＫＧ２Ａ又はＮＫＧ２Ｄノックアウトをもたらし、任意選択でＣＡＲ発現を内因性ＮＫＧ２Ａ又はＮＫＧ２Ｄプロモーターの制御下に置く。ＮＫＧ２Ａ又はＮＫＧ２Ｄヌル及びＣＡＲを含むｉＰＳＣ派生細胞の特定の一実施形態では、該派生細胞はＮＫ細胞である。更なる実施形態では、ＣＡＲを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＣＤ３８コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＤ３８ノックアウトをもたらし、任意選択でＣＡＲ発現を内因性ＣＤ３８プロモーターの制御下に置く。ＣＤ３８ヌルと、提供されるエンドドメインの１つを含むＣＡＲと、を含む細胞の一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３８に特異的である。一実施形態では、提供されるエンドドメインの１つを含むＣＡＲを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＣＤ５８コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＤ５８ノックアウトをもたらす。一実施形態では、エンドドメインの１つを含むＣＡＲを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＣＤ５４コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＤ５４ノックアウトをもたらす。一実施形態では、エンドドメインの１つを含むＣＡＲを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＣＩＳ（サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質）コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＩＳノックアウトをもたらす。一実施形態では、エンドドメインの１つを含むＣＡＲを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＣＢＬ－Ｂ（Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＣＢＬ－Ｂ）コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＢＬ－Ｂノックアウトをもたらす。一実施形態では、提供されるようなＣＡＲを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＳＯＣＳ２コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＳＯＣＳ２ノックアウトをもたらす。一実施形態では、提供されるようなＣＡＲを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１）コード領域に挿入されたＣＡＲを有する。別の実施形態では、提供されるようなＣＡＲを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、及びＴＩＭ３のいずれか１つのコード領域に挿入されたＣＡＲを有し、挿入部位でのチェックポイント受容体のノックアウト又はノックダウンをもたらす。更なる実施形態では、提供されるようなＣＡＲを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＴＩＧＩＴのコード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＴＩＧＩＴノックアウトをもたらす。
更に提供される実施形態には、分化するゲノム操作されたｉＰＳＣから得られる派生エフェクター細胞が含まれ、ここで、ｉＰＳＣ及び派生細胞の両方は、本明細書に記載のＣＡＲを含み、ｉＰＳＣ及び派生細胞は、ＣＤ３８ノックアウト；ＣＤ３８－ＣＡＲ；ＣＤ１６又はそのバリアント；細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的又は完全なペプチドを含むシグナル伝達複合体；ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損；ＨＬＡ－Ｇの過剰発現並びにＣＤ５８及びＣＤ５４の一方又は両方のノックアウト；ＴＣＲヌル；表面提示ＣＤ３；抗原特異的ＴＣＲ；ＮＫＧ２Ｃ；ＤＡＰ１０／１２；ＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ３３（「２Ｃ１５３３」）を含むがこれらに限定されない１つ又は複数の追加の改変モダリティを更に含み、本明細書で更に詳しく説明される。
２．ＣＤ３８ノックアウト
細胞表面分子ＣＤ３８は、多発性骨髄腫及びＣＤ２０陰性Ｂ細胞悪性腫瘍を含む、リンパ系統及び骨髄系統の両方に由来する複数の血液悪性腫瘍において高度に上方制御されており、癌細胞を枯渇させる抗体療法の魅力的な標的となっている。抗体を介した癌細胞の枯渇は、通常、直接的な細胞アポトーシスの誘導と、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）等の免疫エフェクター機構の活性化との組合せに起因する。ＡＤＣＣに加えて、治療用抗体と協調する免疫エフェクター機構には、食作用（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）も含まれる場合がある。
悪性細胞上で高度に発現する以外に、ＣＤ３８は、形質細胞及びＮＫ細胞、並びに活性化Ｔ細胞及びＢ細胞でも発現される。造血中、ＣＤ３８は、ＣＤ３４＋幹細胞、並びにリンパ系、赤血球、及び骨髄の系統にコミットした前駆細胞で、形質細胞段階まで続く成熟の最終段階中に発現される。ＣＤ３８は、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質として、ヌクレオチド代謝物の産生に関与する受容体及び多機能酵素の両方として細胞機能を実行する。酵素として、ＣＤ３８は、ＮＡＤ＋からＡＤＰ－リボースへの反応の合成及び加水分解を触媒し、それにより細胞接着のプロセス（このプロセスはカルシウム依存である）に重要な小胞体及びリソソームからのカルシウムの放出を刺激する二次メッセンジャーＣＡＤＰＲ及びＮＡＡＤＰを産生する。受容体として、ＣＤ３８は、ＣＤ３１を認識し、活性化されたＮＫ細胞におけるサイトカイン放出及び細胞傷害性を制御する。ＣＤ３８は、脂質ラフトの細胞表面タンパク質と会合し、細胞質のＣａ２＋フラックスを制御し、リンパ系及び骨髄系細胞におけるシグナル伝達を媒介することも報告されている。
悪性腫瘍治療では、ＣＤ３８抗原結合受容体を形質導入したＴ細胞を全身使用すると、ＣＤ３４＋造血前駆細胞、単球、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞のＣＤ３８＋画分が溶解し、レシピエント免疫エフェクター細胞機能障害のため、治療応答が不完全になり、有効性が低下又は排除されることが示されている。加えて、ＣＤ３８特異的抗体であるダラツムマブで治療された多発性骨髄腫患者では、骨髄及び末梢血の両方でＮＫ細胞の低減が観察されたが、Ｔ細胞及びＢ細胞等の他の免疫細胞型は、ＣＤ３８の発現にもかかわらず影響を受けなかった（Ｃａｓｎｅｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖａｎｃｅｓ．２０１７；１（２３）：２１０５－２１１４）。理論に制限されることなく、本出願は、フラトリサイドによるＣＤ３８特異的抗体及び／又はＣＤ３８抗原結合ドメイン誘導エフェクター細胞の枯渇若しくは低減を克服することにより、ＣＤ３８標的化された癌治療の可能性を最大限に活用する戦略を提供する。加えて、ＣＤ３８は、同種異系エフェクター細胞のレシピエントにおいて、活性化リンパ球を排除するか、又はこれらのリンパ球の活性化を抑制するために使用することができる、ダラツムマブ等のＣＤ３８特異的抗体を使用してこれらのレシピエントリンパ球の活性化を抑制することにより、Ｔ細胞又はＢ細胞等の活性化リンパ球で上方制御されるため、これらのエフェクター細胞に対するアロ拒絶反応が低減及び／又は防止され、それによりエフェクター細胞の生存及び持続性が増加する。
したがって、本出願はまた、レシピエントＴ細胞及びＢ細胞の活性化に対する、並びに／あるいは活性化したレシピエントＴ細胞及びＢ細胞を排除する、ＣＤ３８特異的抗体、分泌されたＣＤ３８特異的エンゲージャ、又はＣＤ３８ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を使用すること、すなわち、しばしば養子細胞移植の前の、活性化されたＴ細胞及びＢ細胞のリンパ球枯渇によるアロ拒絶反応の低下又は防止を介してエフェクター細胞の持続性及び／又は生存を増強する戦略も提供する。具体的には、本明細書で提供される戦略は、いくつかの実施形態では、ＣＤ３８ノックアウトｉＰＳＣ株、単一選別され、拡大されたクローンＣＤ３８陰性ｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクを生成することと、操作されたｉＰＳＣ株の指向された分化を介してＣＤ３８陰性（ＣＤ３８ｎｅｇ）派生エフェクター細胞を得ることと、とを含み、ＣＤ３８標的化された治療部分がエフェクター細胞とともに用いられる場合、派生エフェクター細胞は、他の利点の中でもフラトリサイド及びアロ拒絶反応から保護される。加えて、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体療法は、患者の造血幹細胞コンパートメントに悪影響を及ぼすことなく、患者の活性化免疫系を大幅に枯渇させる。ＣＤ３８陰性派生細胞は、ＣＤ３８抗体を介した枯渇に抵抗する能力があり、有毒なコンディショニング剤を使用せずに抗ＣＤ３８又はＣＤ３８－ＣＡＲと組み合わせて効果的に投与することができるため、化学療法に基づくリンパ球枯を低減及び／又は置き換えることができる。
本明細書で提供される一実施形態では、ｉＰＳＣ株におけるＣＤ３８ノックアウトは、二対立遺伝子ノックアウトである。本明細書に開示されるように、提供されるＣＤ３８ ヌルｉＰＳＣ株は、指示された分化をして、決定的な造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、造血多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、マクロファージ、並びに初代ＮＫ、Ｔ及び／又はＮＫＴ細胞に存在しない１つ又は複数の機能的特徴を有する派生免疫エフェクター細胞を含むがこれらに限定されない機能的な派生造血細胞を産生することができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体がＡＤＣＣを誘導するために使用されるか、又は抗ＣＤ３８ ＣＡＲが標的化された細胞殺滅に使用される場合、ＣＤ３８－／－ｉＰＳＣ及び／又はその派生エフェクター細胞は、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３８ＣＡＲ、又はレシピエント活性化Ｔ細胞又はＢ細胞によって排除されず、それにより、そのような治療薬剤の存在下で、及び／又はそれへの曝露後にｉＰＳＣ及びそのエフェクター細胞の持続性及び／又は生存を増加させる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、そのような治療薬の存在下で、及び／又は曝露後の、インビボの持続性及び／又は生存率が増加している。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８ヌルエフェクター細胞は、ｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８ヌルエフェクター細胞は、ｉＰＳＣに由来するＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８ヌルｉＰＳＣ及び派生細胞は、ＣＤ１６又はそのバリアント、ＣＡＲ発現、細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的又は完全なペプチドを含むシグナル伝達複合体、ＨＬＡＩ及び／又はＨＬＡＩＩノックアウト、並びに本明細書で提供される追加のモダリティを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つ又は複数の追加のゲノム編集を含む。
別の実施形態では、ＣＤ３８の選択された位置に本明細書で提供される１つ以上の導入遺伝子を挿入すると同時にＣＤ３８をノックアウトすることは、例えば、ＣＤ３８を標的とするノックイン／ノックアウト（ＣＤ３８－ＫＩ／ＫＯ）構築物によって達成することができる。該構築物のいくつかの実施形態では、構築物は、ＣＤ３８遺伝子座内の位置選択的挿入のための一対のＣＤ３８標的化相同性アームを含む。いくつかの実施形態では、事前に選択された標的化部位は、ＣＤ３８のエキソン内にある。本明細書で提供されるＣＤ３８－ＫＩ／ＫＯ構築物は、導入遺伝子（複数可）が、ＣＤ３８内因性プロモーター下又は構築物に含まれる外因性プロモーター下のいずれかで発現することを可能にする。２つ以上の導入遺伝子がＣＤ３８遺伝子座の選択された位置に挿入される場合、リンカー配列、例えば２Ａリンカー又はＩＲＥＳは、任意の２つの導入遺伝子の間に配置される。２Ａリンカーは、ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、及びＴａＶから派生する自己切断ペプチド（それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、及び「Ｔ２Ａ」とも称される）をコードし、単一の翻訳から別個のタンパク質を産生できるようにする。いくつかの実施形態では、インスレーターは、導入遺伝子及び／又は外因性プロモーターサイレンシングのリスクを低減するために構築物に含まれる。ＣＤ３８－ＫＩ／ＫＯ構築物に含まれる外因性プロモーターは、ＣＡＧ、又はＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、及びＵＢＣを含むがこれらに限定されない他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、又は細胞型特異的プロモーターであり得る。
３．ＣＤ１６ノックイン
ＣＤ１６は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ；ＮＭ＿０００５６９．６）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ；ＮＭ＿０００５７０．４）の２つのアイソフォームとして特定されている。ＣＤ１６ａは、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質であり、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合して、ＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を容易にする。ＣＤ１６ｂはヒト好中球によって排他的に発現される。本明細書で使用される場合、「高親和性ＣＤ１６」、「切断不可能なＣＤ１６」、「高親和性の切断不可能なＣＤ１６」、又は「ｈｎＣＤ１６」は、様々なＣＤ１６バリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞の活性化により白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を制御するタンパク質分解切断プロセスであるエクトドメインシェディングを受ける。Ｆ１７６Ｖ（一部の出版物ではＦ１５８Ｖとも呼ばれる）は、高い親和性を有する例示的なＣＤ１６多型バリアントであり、一方、Ｓ１９７Ｐバリアントは、遺伝子操作された例示的な切断不可能なバージョンのＣＤ１６である。Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐの両方を含む操作されたＣＤ１６バリアントは、親和性が高く、切断不可能であり、これは、国際公開第２０１５／１４８９２６号により詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、ＣＤ１６のエクトドメインが本質的にＣＤ６４エクトドメインの少なくとも一部に置き換えられたキメラＣＤ１６受容体はまた、ＡＤＣＣを実施することが可能なＣＤ１６受容体の所望の高親和性及び切断不可能な特色を達成することができる。いくつかの実施形態では、キメラＣＤ１６の置換エクトドメインは、ＣＤ６４（ＵｎｉＰＲｏｔＫＢ＿Ｐ１２３１４又はそのアイソフォーム若しくは多型バリアント）のＥＣ１、ＥＣ２、及びＥＣ３エキソンのうちの１つ又は複数を含む。
したがって、細胞に導入された外因性ＣＤ１６の様々な実施形態には、機能的ＣＤ１６バリアント及びそのキメラ受容体が含まれる。いくつかの実施形態では、機能的ＣＤ１６バリアントは、高親和性の切断不可能なＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）である。ｈｎＣＤ１６は、いくつかの実施形態では、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐの両方を含み、いくつかの実施形態では、Ｆ１７６Ｖを含み、切断領域が排除されている。
したがって、本明細書で企図及び記載される他の編集の中でも、高親和性の切断不可能なＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）を含むように遺伝子操作されたクローンｉＰＳＣが本明細書で提供され、遺伝子操作されたｉＰＳＣは、ｉＰＳＣに導入されたｈｎＣＤ１６を含むエフェクター細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６を含む由来エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６を含む由来エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。ｉＰＳＣ又はその派生細胞に含まれる外因性ｈｎＣＤ１６又はその機能的バリアントは、ＡＤＣＣ抗体又はその断片だけでなく、該ｈｎＣＤ１６のＣＤ１６又はＣＤ６４の細胞外結合ドメインを認識する二重特異性、三重特異性、又は多重特異性のエンゲージャ又はバインダへの結合にも高い親和性を示す。二重特異性、三重特異性、又は多重特異性のエンゲージャ又はバインダーについては、本出願で以下に更に記載される。このように、本出願は、以下のセクションで更に詳述する状態、疾患、又は感染症の治療における治療的使用に十分な量で、派生エフェクター細胞上で発現する外因性ＣＤ１６を介して１つ又は複数の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、派生エフェクター細胞又はその細胞集団を提供し、該ｈｎＣＤ１６は、ＣＤ６４の、又はＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを有するＣＤ１６の細胞外結合ドメインを含む。
いくつかの他の実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ＣＦｃＲに基づくＣＤ１６又はそのバリアントを含む。天然ＣＤ１６膜貫通及び／又は細胞内ドメインを修飾又は置き換えることによって、キメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）が非天然膜貫通ドメイン、非天然刺激ドメイン、及び／又は非天然シグナル伝達ドメインを含むように産生される。本明細書で使用される場合、「非天然」という用語は、膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、又はシグナル伝達ドメインが、細胞外ドメインを提供する受容体以外の異なる受容体に由来することを意味する。ここの図では、ＣＤ１６又はそのバリアントに基づくＣＦｃＲは、ＣＤ１６に由来する膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、又はシグナル伝達ドメインを有さない。いくつかの実施形態では、外因性ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｔ細胞受容体ポリペプチドに由来する非天然膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ４、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する非天然刺激／阻害ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する非天然シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲの一実施形態では、提供されるキメラＦｃ受容体は、膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含み、両方ともＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、及びＮＫＧ２Ｄポリペプチドのうちの１つに由来する。ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の１つの特定の実施形態は、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、２Ｂ４の刺激ドメイン、及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み、ＣＦｃＲの細胞外ドメインは、ＣＤ６４又はＣＤ１６の完全長又は部分配列の細胞外ドメインに由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含む。ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の別の実施形態は、ＣＤ３ζの膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含み、ＣＦｃＲの細胞外ドメインは、ＣＤ６４又はＣＤ１６の完全長又は部分配列の細胞外ドメインに由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含む。
上述のＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の様々な実施形態は、高親和性で抗体若しくはその断片のＦｃ領域に、又は二重特異性、三重特異性、若しくは多重特異性エンゲージャ若しくはバインダーに結合することができる。結合すると、キメラ受容体の刺激ドメイン及び／又はシグナル伝達ドメインは、エフェクター細胞の活性化及びサイトカイン分泌、並びに抗体、又は腫瘍抗原結合構成要素並びにＦｃ領域を有する該二重特異性、三重特異性、若しくは多重特異性エンゲージャ若しくはバインダーによって標的とされる腫瘍細胞の殺滅を可能にする。理論に制限されることなく、ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の非天然の膜貫通、刺激及び／又はシグナル伝達ドメインを通じて、又はエクトドメインへのエンゲージャの結合を通じて、ＣＦｃＲはエフェクター細胞の殺滅能力に寄与し、エフェクター細胞の増殖及び／又は増殖の可能性を増加させる。抗体及びエンゲージャは、抗原を発現する腫瘍細胞とＣＦｃＲを発現するエフェクター細胞を近接させることができ、これも腫瘍細胞の殺滅の増強に寄与する。二重特異性、三重特異性、多重特異性エンゲージャ又はバインダーの例示的な腫瘍抗原には、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、及びＲＯＲ１が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍細胞を攻撃する際にＣＤ１６ベースのＣＦｃＲを発現するエフェクター細胞を結合させるのに好適ないくつかの非限定的な例示的な二重特異性、三重特異性、多重特異性エンゲージャ又はバインダーには、ＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＣＤ３０、ＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＢＣＭＡ、ＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭ、及びＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＩＬ１５－ＣＤ３３が含まれる。
ＮＫ細胞の活性化後に細胞表面から切断される初代ＮＫ細胞によって発現される内因性ＣＤ１６とは異なり、派生ＮＫ細胞におけるＣＤ１６の様々な切断不可能なバージョンは、ＣＤ１６のシェディングを回避し、一定の発現を維持する。派生ＮＫ細胞では、切断不可能なＣＤ１６は、細胞機能の改善を示すＴＮＦα及びＣＤ１０７ａの発現を増加させる。切断不可能なＣＤ１６は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、及び二重特異性、三重特異性、又は多重特異性エンゲージャの結合も増強する。ＡＤＣＣは、抗体でコーティングされた標的細胞へのＣＤ１６の結合を介したＮＫ細胞媒介溶解機構である。由来ＮＫ細胞における導入されたｈｎＣＤ１６の追加の高親和性の特徴により、細胞療法を必要とする対象に細胞を投与する前に、ｈｎＣＤ１６を介したＮＫ細胞へのＡＤＣＣ抗体のインビトロ充填も可能となる。本明細書で提供されるように、ｈｎＣＤ１６は、いくつかの実施形態ではＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含み得るか、又は非天然膜貫通ドメイン、刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つを更に含み得る。開示されるように、本出願はまた、以下で更に詳述されるように、状態、疾患、又は感染の治療における治療的使用に十分な量で、１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体で予め充填された派生ＮＫ細胞又はその細胞集団を提供する。
初代ＮＫ細胞とは異なり、初代供給源（すなわち、末梢血、臍帯血、又は他のドナー組織等の天然／天然源）からの成熟Ｔ細胞は、ＣＤ１６を発現しない。発現された外因性の切断不可能なＣＤ１６を含むｉＰＳＣがＴ細胞の発生生物学を損なわず、機能的派生Ｔ細胞に分化することができることは予想外であった。初代ＮＫ細胞とは異なり、初代供給源（すなわち、末梢血、臍帯血、又は他のドナー組織等の天然／天然源）からの成熟Ｔ細胞は、ＣＤ１６を発現しない。発現された外因性の切断不可能なＣＤ１６を含むｉＰＳＣがＴ細胞の発生生物学を損なわず、外因性のＣＤ１６を発現するだけでなく、獲得ＡＤＣＣ機構を介して機能を実行することができる機能的派生Ｔ系統細胞に分化することができることは予想外であった。派生Ｔ系統細胞におけるこの獲得ＡＤＣＣは、二重標的化のためのアプローチとして、及び／又はＣＡＲ－Ｔ標的化された抗原の発現低下若しくは喪失、又はＣＡＲによる認識を回避する変異抗原を伴って腫瘍が再発する、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法でしばしば発生する抗原エスケープを救済するためのアプローチとして更に使用できる。該派生Ｔ系統細胞が、機能的バリアント及びＣＤ１６ベースのＣＦｃＲを含む、外因性ＣＤ１６発現を介した獲得ＡＤＣＣを含む場合、及び抗体がＣＡＲによって標的とされるものとは異なる腫瘍抗原を標的とする場合、抗体を使用して、ＣＡＲ－Ｔ抗原エスケープを救済し、ＣＡＲ－Ｔ治療でよく見られる標的化された腫瘍の再発生又は再発を低減又は防止することができる。二重標的化を達成しながら抗原エスケープを低減及び／又は防止するそのような戦略は、１つ又は複数のＣＡＲを発現するＮＫ細胞にも同様に適用される。この抗原エスケープの低減及び防止戦略で使用することができる様々なＣＡＲは、以下で更に詳しく説明される。
したがって、本発明の実施形態は、本明細書で提供されるようなシグナル伝達複合体及びＣＡＲに加えて、外因性ＣＤ１６を含む派生Ｔ系統細胞を提供する。いくつかの実施形態では、派生Ｔ系統細胞に含まれるＣＤ１６は、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含むＣＤ１６エクトドメインを含むｈｎＣＤ１６である。いくつかの他の実施形態では、派生Ｔ細胞に含まれるｈｎＣＤ１６は、ＣＤ６４に由来する完全又は部分的なエクトドメインを含むか、又は非天然膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、及びシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つを更に含み得る。説明されるように、そのような派生Ｔ細胞は、抗体の治療効果を増強するためにＡＤＣＣによって瞑想されたモノクローナル抗体で腫瘍を標的とする獲得機構を有する。開示されるように、本出願はまた、以下で更に詳述されるように、状態、疾患、又は感染の治療における治療的使用に十分な量で、１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体で予め充填された派生Ｔ細胞又はその細胞集団を提供する。
本出願において、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含むがこれに限定されない、本明細書で提供される少なくとも１つの表現型を有する単一細胞選別され、拡大されたクローン操作されたｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクが更に提供され、細胞バンクは、追加のｉＰＳＣ操作のためのプラットフォーム、及び十分に定義され、組成が均一で、費用効果の高い方法で大規模に大量生産することができる、派生ＮＫ細胞及びＴ細胞を含むがこれらに限定されない、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
４．外因的に導入されたサイトカイン及び／又はサイトカインシグナル伝達
臨床的に関連するサイトカインの全身的な高用量投与を回避することにより、そのような実践による用量制限毒性のリスクが低減される一方で、サイトカインを介した細胞自律性が確立される。可溶性サイトカインを追加投与する必要なしにリンパ球の自律性を達成するために、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及び／又はそれらのそれぞれの受容体のうちの１つ又は複数の部分長又は完全長のペプチドを含むシグナル伝達複合体が、細胞に導入されて、サイトカイン自体の発現の有無にかかわらず、サイトカインのシグナル伝達を可能にし、それにより、サイトカイン毒性のリスクを低減しながら、細胞の成長、増殖、拡大、及び／又はエフェクター機能を維持又は改善する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達のための導入されたサイトカイン及び／又はそのそれぞれの天然又は修飾された受容体（シグナル伝達複合体）が、細胞表面で発現される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は、構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、誘導性である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性及び／又は一時的である。
ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８及びＩＬ２１を含むがこれらに限定されないサイトカインのシグナル伝達のためのタンパク質複合体を細胞に導入するための様々な構築物設計が本明細書で提供される。以下の例示的な例は、シグナル伝達複合体がＩＬ１５用である場合に提供される。
設計１：ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαは、ＩＬ１５のトランス提示を模倣する自己切断ペプチドを使用して、ＩＬ１５のシス提示を排除することなく共発現される。
設計２：ＩＬ１５Ｒαはリンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合されており、ＩＬ１５のシス提示を排除することなくトランス提示を模倣し、ＩＬ１５の膜結合を確保する。
設計３：切断型細胞内ドメインを持つＩＬ１５Ｒαは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、ＩＬ１５のトランス提示を模倣し、ＩＬ１５の膜結合を維持し、シス提示及び／又はその細胞内ドメインを介した正常ＩＬ１５Ｒによって媒介される任意の他の潜在的なシグナル伝達経路を排除する。ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインは、受容体がＩＬ１５応答細胞で発現し、応答細胞が拡大し、機能するために重要であると考えられている。設計４は、設計３の別の実用的な代替案を提供する構築物であり、Ｓｕｓｈｉドメインが、一方の端でＩＬ１５と、もう一方の端で膜貫通ドメインと融合しており（ｍｂ－Ｓｕｓｈｉ）、任意選択で、Ｓｕｓｈｉドメインと膜貫通ドメインとの間にリンカーを有することを除いて、本質的にＩＬ１５Ｒα全体が除去される。融合したＩＬ１５／ｍｂ－Ｓｕｓｈｉは、任意の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインを介して細胞表面に発現する。設計４等の構築物では、ＩＬ１５の望ましいトランス提示のみが保持されている場合、シス提示を含むＩＬ１５Ｒαを介した不要なシグナル伝達は排除される。
設計５：天然又は改変されたＩＬ１５Ｒβは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、構成的シグナル伝達を可能にし、ＩＬ１５膜結合及びトランス提示を維持する。
設計６：天然又は改変された共通受容体γＣは、サイトカインの構成的シグナル伝達及び膜結合トランス提示のために、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合される。共通受容体γＣは、共通ガンマ鎖又はＣＤ１３２とも呼ばれ、ＩＬ２受容体サブユニットガンマ又はＩＬ２ＲＧとしても知られる。γＣは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、及びＩＬ２１受容体を含むがこれらに限定されない、多くのインターロイキン受容体の受容体複合体に共通するサイトカイン受容体サブユニットである。
設計７：ＩＬ１５の不在下でホモ二量体を形成する操作されたＩＬ１５Ｒβは、サイトカインの構成的シグナル伝達を生成するのに有用である。
いくつかの実施形態では、サイトカインＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８及びＩＬ２１、及び／又はそれらの受容体の１つ又は複数は、提供されるような設計の１つ又は複数を使用してｉＰＳＣ、及びｉＰＳＣ分化時のその派生細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ２又はＩＬ１５細胞表面の発現及びシグナル伝達は、設計１～７のいずれか１つに図示される構築物を介する。いくつかの実施形態では、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、又はＩＬ２１細胞表面の発現及びシグナル伝達は、共通の受容体又はサイトカイン特異的受容体のいずれかを使用することにより、設計５、６、又は７に図示される構築物を介する。いくつかの実施形態では、ＩＬ７表面発現及びシグナル伝達は、共通の受容体又はサイトカイン特異的受容体（ＩＬ４受容体等）のいずれかを使用することにより、設計５、６、又は７に図示される構築物を介する。上記の設計のいずれかの膜貫通（ＴＭ）ドメインは、対応するサイトカイン受容体に対して天然であり得るか、又は、任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで改変又は置換されている。
ＣＡＲ及び外因性サイトカイン及び／又はサイトカイン受容体シグナル伝達（シグナル伝達複合体、又は「ＩＬ」）の両方を含むｉＰＳＣ及びそれからの派生細胞において、ＣＡＲ及びＩＬは、別個の構築物で発現され得るか、又はＣＡＲ及びＩＬの両方を含むバイシストロン性構築物において共発現され得る。いくつかの更なる実施形態では、シグナル伝達複合体は、例えば、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５又はＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲのように例示される自己切断２Ａコード配列を介してＣＡＲ発現構築物の５´又は３´末端のいずれかに連結され得る。したがって、ＩＬ１５及びＣＡＲは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にある。ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５又はＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲバイシストニック設計により、タイミング及び量の両方で、及び例えば、単一ＯＲＦの表現のための誘導性プロモーターを組み込むために選択され得る同じ制御機構の下で、協調されたＣＡＲ及びＩＬ１５のシグナル伝達複合体の発現が可能になる。自己切断ペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）、及びブタテシオウイルス－１（ＰＴＶ－Ｉ）（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ＭＬ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，８２，１０２７－１０１（２００１）；Ｒｙａｎ，ＭＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，２７２７－２７３２（２００１））等の口蹄疫ウイルス、並びにタイロウイルス（例えば、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス）及び脳心筋炎ウイルス等のカルジオウイルスのメンバーにおいて見出される。ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、及びＴａＶに由来する２Ａペプチドは、それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、及び「Ｔ２Ａ」と称されることもある。
ＩＬ１５について本明細書に開示されるバイシストロン性ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５又はＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲの実施形態はまた、本明細書で提供される任意の他のサイトカイン又はサイトカインシグナル伝達複合体、例えば、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１８、及びＩＬ２１の発現も企図する。いくつかの実施形態では、ＩＬ２細胞表面発現及びシグナル伝達は、設計１～７のいずれかに図示される構築物を介する。いくつかの実施形態では、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、又はＩＬ２１細胞表面の発現及びシグナル伝達は、共通の受容体及び／又はサイトカイン特異的受容体のいずれかを使用して、設計５、６、又は７に図示される構築物を介する。
５．ＨＬＡ－Ｉ－及びＨＬＡ－ＩＩ－欠損
しばしば、同種異系拒絶反応の問題を回避するために、同種異系レシピエントの組織適合性について、複数のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩタンパク質を一致させる必要がある。ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩタンパク質の両方の発現が排除又は実質的に低下したｉＰＳＣ細胞株及びそれから分化したその派生細胞が本明細書で提供される。ＨＬＡクラスＩ欠損症は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子座（染色体６ｐ２１）の任意の領域の機能的欠失、又はベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、及びタパシンを含むが、これらに限定されない、ＨＬＡクラスＩ関連遺伝子の欠失若しくは発現レベルの低下によって達成できる。例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子は、すべてのＨＬＡクラスＩヘテロ二量体の細胞表面発現に不可欠な共通のサブユニットをコードする。Ｂ２Ｍヌル細胞はＨＬＡ－Ｉ欠損である。ＨＬＡクラスＩＩ欠損は、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、及びＲＦＸＡＰを含むがこれらに限定されないＨＬＡ－ＩＩ関連遺伝子の機能的欠失又は減少によって達成できる。ＣＩＩＴＡは転写コアクチベーターであり、クラスＩＩタンパク質の発現に必要な転写因子ＲＦＸ５の活性化を介して機能する。ＣＩＩＴＡヌル細胞はＨＬＡ－ＩＩ欠損である。例えば、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ発現の両方を欠くためのＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損の両方を有するｉＰＳＣ株及びその派生細胞が本明細書で提供され、得られた派生エフェクター細胞は、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）一致の必要性を排除することによって同種異系細胞療法を可能にし、宿主（同種異系）Ｔ細胞による認識及び殺滅を回避する。
しかしながら、一部の細胞型では、クラスＩの発現の欠如は、ＮＫ細胞による溶解をもたらす。この「自己喪失」応答を克服するために、ＨＬＡ－Ｇを任意選択でノックインして、操作されたｉＰＳＣに由来するＨＬＡ－Ｉ欠損エフェクター細胞のＮＫ細胞の認識及び殺滅を回避することができる。一実施形態では、提供されるＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＨＬＡ－Ｇノックインを更に含む。代替的に、いくつかの実施形態では、提供されるＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＣＤ５８ノックアウト及びＣＤ５４ノックアウトの一方又は両方を更に含む。ＣＤ５８（又はＬＦＡ－３）及びＣＤ５４（又はＩＣＡＭ－１）は、シグナル依存性細胞相互作用を開始し、免疫細胞を含む細胞の遊走を容易にする接着タンパク質である。ｉＰＳＣにおけるＣＤ５８及び／又はＣＤ５４の破壊が、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む機能的免疫エフェクター細胞へと誘導されるｉＰＳＣ分化における多能性細胞及び発生生物学に影響を与えるかどうか、及びどのように影響するかは以前は不明であった。また、ＣＤ５８及び／又はＣＤ５４ノックアウトがＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣ由来のエフェクター細胞の同種異系ＮＫ細胞殺傷に対する感受性を効果的及び／又は十分に低下させることができるかどうかも以前は不明であった。ここでは、ＣＤ５８ノックアウトはＣＤ５４ノックアウトよりも同種異系ＮＫ細胞の活性化を低減する効率が高い一方で、ＣＤ５８及びＣＤ５４の両方をダブルノックアウトすると、ＮＫ細胞の活性化の低減が最も増強されることが示された。いくつかの観察では、ＣＤ５８及びＣＤ５４ダブルノックアウトは、「自己喪失」効果を克服する上で、ＨＬＡ－Ｉ欠損細胞に対するＨＬＡ－Ｇ過剰発現よりも更に効果的である。
上記に提供されるように、いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその派生細胞は、ＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその派生細胞は、ＣＤ５８ヌルである。いくつかの他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその派生細胞は、ＣＤ５４ヌルである。更にいくつかの他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその派生細胞は、ＣＤ５８ヌル及びＣＤ５４ヌルである。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損のための操作は、アロ拒絶を回避するために活性化レシピエント免疫細胞において上方制御された表面タンパク質を標的とする不活性化ＣＡＲを発現することによってバイパスされるか、又は無傷に保たれ得る。いくつかの実施形態では、活性化されたレシピエント免疫細胞における該上方制御された表面タンパク質には、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９又はＣＤ４４が含まれるが、これらに限定されない。細胞がそのような不活化ＣＡＲを発現する場合、細胞は、ＣＡＲによって標的とされる同じ表面タンパク質を発現しないか、又はノックアウトしていないことが好ましい。
６．本明細書で提供される遺伝子操作されたｉＰＳＣ系統及び派生細胞
上記に照らして、本出願は、ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、又はそれらの集団、及び該ｉＰＳＣを分化させることから得られた派生機能細胞を提供し、それぞれの細胞は、本明細に記載のエンドドメインを有する少なくとも１つのＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、派生エフェクター細胞には、決定的な造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、造血多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ球系共通前駆細胞、赤血球、骨髄細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、マクロファージ、並びに初代ＮＫ、Ｔ及び／又はＮＫＴ細胞に存在しない１つ又は複数の機能的特徴を有する派生免疫エフェクター細胞が含まれるが、これらに限定されない。
したがって、本出願は、表２の以下の遺伝子型のいずれか１つを含む、ｉＰＳＣ及びその機能的な派生造血細胞を提供する。本出願の表２に提供される「ＣＡＲ（２ｎｄ）」は、第１のＣＡＲとは異なる標的特異性を有するＣＡＲを表し、非限定な例としては、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、及びＰＤＬ１のうちの少なくとも１つを標的とするＣＡＲが挙げられる。表２に提供されるように、「ＩＬ」は、どの特定のサイトカイン／受容体発現が選択されるかに応じて、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、及びＩＬ２１のうちの１つを表す。更に、「ＩＬ」はまた、ＩＬ１５Δの実施形態も包含し、これは、ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの切断型融合タンパク質として上に詳述されているが、細胞内ドメインを含まない。更に、ｉＰＳＣ及びその機能的派生造血細胞がＣＡＲ（第１のＣＡＲ、又は第２のＣＡＲ）及びＩＬの両方を含む遺伝子型を有する場合、該細胞の一実施形態では、ＣＡＲ及びＩＬは２Ａ配列を含むバイシストロ性発現カセットに含まれる。比較として、いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲ及びＩＬは、ｉＰＳＣ及びその機能的な派生造血細胞に含まれる別個の発現カセットにある。特定の一実施形態では、ＣＡＲ及びＩＬの両方を発現するｉＰＳＣ及びその機能的派生エフェクター細胞に含まれるのは、設計３又は４に記載のＩＬ１５であり、ＩＬ１５構築物は、ＣＡＲとともに、又はそれと別個に発現カセットに含まれる。
Figure 2023505206000002
Figure 2023505206000003
Figure 2023505206000004
Figure 2023505206000005
Figure 2023505206000006
 ７．追加の修飾
いくつかの実施形態では、表２の遺伝子型のいずれか１つを含むｉＰＳＣ及びその派生エフェクター細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、及び染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失若しくは発現低下を更に含み得るか、又はＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャ、及び二重特異性、多重特異性若しくはユニバーサルエンゲージャとの結合のための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入された若しくは増加した発現を更に含み得る。
二重特異性又は多重特異性エンゲージャは、異なる抗体の２つ以上の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる融合タンパク質であり、少なくとも１つのｓｃＦｖがエフェクター細胞表面分子に結合し、少なくとも別の１つが腫瘍特異的表面分子を介して腫瘍細胞に結合する。二重特異性若しくは多重特異性エンゲージャ認識、又はカップリングに使用できる例示的なエフェクター細胞表面分子又は表面トリガー受容体には、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、及び本明細書に開示されるキメラＦｃ受容体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、エンゲージャ認識のためにエフェクター細胞の表面で発現されるＣＤ１６は、セクションＩ．２に記載される、ＣＤ１６（Ｆ１７６Ｖ及び任意選択でＳ１９７Ｐを含む）又はＣＤ６４細胞外ドメイン、並びに天然又は非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、及び／又はシグナル伝達ドメインを含むｈｎＣＤ１６である。いくつかの実施形態では、エンゲージャ認識のためにエフェクター細胞の表面で発現されるＣＤ１６は、ｈｎＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）である。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、２Ｂ４の刺激ドメイン、及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み、ｈｎＣＤ１６の細胞外ドメインは、ＣＤ６４又はＣＤ１６の完全長又は部分配列の細胞外ドメインに由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖ及び任意選択でＳ１９７Ｐを含む。二重特異性又は多重特異性エンゲージャ認識の例示的な腫瘍細胞表面分子には、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＲＯＲ１が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ３－ＣＤ１９である。別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６－ＣＤ３０又はＣＤ６４－ＣＤ３０である。別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６－ＢＣＭＡ又はＣＤ６４－ＢＣＭＡである。また別の実施形態では、二重特異性抗体はＣＤ３－ＣＤ３３である。更に別の実施形態では、二重特異性抗体は更に、エフェクター細胞と腫瘍細胞抗原結合ドメインの間にリンカー、例えば、エフェクター細胞増殖を促進するエフェクターＮＫ細胞のリンカーとしての改変ＩＬ１５（いくつかの刊行物では、ＴｒｉＫＥ、又は三重特異性キラーエンゲージャと呼ばれる）を含む。一実施形態では、ＴｒｉＫＥは、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭ又はＣＤ６４－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭである。別の実施形態では、ＴｒｉＫＥは、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＤ３３又はＣＤ６４－ＩＬ１５－ＣＤ３３である。更に別の実施形態では、ＴｒｉＫＥはＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ３３（「２Ｃ１５３３」）である。
いくつかの実施形態では、二重特異性又は多重特異性のエンゲージャのための表面トリガー受容体は、時には細胞型に応じて、エフェクター細胞に対して内因性であり得る。他のいくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物を使用して、すなわち、表２に列記された遺伝子型を含むｉＰＳＣを更に操作し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はソースｉＰＳＣと同一の遺伝子型と表面トリガー受容体を含む任意の他のエフェクター細胞へのｉＰＳＣの分化を指示し、１つ又は複数の外因性表面トリガー受容体をエフェクター細胞に導入することができる。
８．免疫療法のための抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作されたエフェクター細胞に加えて、状態、疾患、又は適応症に関連する抗原を標的とする抗体又は抗体断片を含む追加の治療薬を、組合せ療法でこれらのエフェクター細胞によって発現され、それとともに使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体又は抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍又はウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を活性化して、それらの殺滅能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞に対する追加の治療薬として、組合せ治療に好適な抗体としては、ＣＤ２０抗体（リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ）、ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ、パーツズマブ）、ＣＤ５２抗体（アレムツズマブ）、ＥＧＦＲ抗体（セルツキシマブ）、ＧＤ２抗体（ジヌツキシマブ）、ＰＤＬ１抗体（アベルマブ）、ＣＤ３８抗体（ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、ＣＤ１２３抗体（７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、ＳＬＡＭＦ７抗体（エロツズマブ）、ＭＩＣＡ／Ｂ抗体（７Ｃ６、６Ｆ１１、１Ｃ２）、及びそれらのヒト化又はＦｃ改変されたバリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物及びバイオシミラーが挙げられるがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表２に列記される遺伝子型を含む造血系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表２に列記される遺伝子型を含むＮＫ系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表２に列記される遺伝子型を含むＴ系統細胞を含む。
液性腫瘍又は固形腫瘍の治療に有用な組合せのいくつかの実施形態では、組合せは、予め選択されたモノクローナル抗体と、提供されるエンドドメインを含む少なくともＣＡＲを含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞又はＴ細胞を含む。液性腫瘍又は固形腫瘍の治療に有用な組合せのいくつかの他の実施形態では、組合せは、予め選択されたモノクローナル抗体と、少なくとも提供されるエンドドメインを含む少なくともｈｎＣＤ１６及びＣＡＲを含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞又はＴ細胞を含む。液性腫瘍又は固形腫瘍の治療に有用な組合せのいくつかの実施形態では、組合せは、モノクローナル抗体と、少なくとも提供されるエンドドメインを含む少なくともｈｎＣＤ１６及びＣＡＲを含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞又はＴ細胞を含む。理論に制限されることなく、ｈｎＣＤ１６はモノクローナル抗体の強化されたＡＤＣＣを提供するが、ＣＡＲは特定の腫瘍抗原を標的とするだけでなく、異なる腫瘍抗原を標的とするモノクローナル抗体と組み合わせたデュアルターゲティング戦略を使用して腫瘍抗原の脱出を防ぐ。液体腫瘍又は固形腫瘍の治療に有用な組合せのいくつかの実施形態では、組合せは、本明細書で提供されるエンドドメイン、ＣＤ３８ヌルを含む少なくともＣＤ３８－ＣＡＲを含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞又はＴ細胞及びＣＤ３８抗体を含む。一実施形態では、組合せは、本明細書に提供されるエンドドメイン、ＣＤ３８ヌル及びｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞を含むＣＤ３８－ＣＡＲと、ＣＤ３８抗体であるダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２のうちの１つを含む。一実施形態では、組合せは、本明細書で提供されるエンドドメイン、ＣＤ３８ヌル及びｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、並びにダラツムマブを含むＣＤ３８－ＣＡＲを含む。いくつかの更なる実施形態では、ダラツムマブとの組合せに含まれるｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞は、ＣＤ３８－ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、ｈｎＣＤ１６、ＩＬ１５、並びにＭＩＣＡ／Ｂ又はＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、及びＰＤＬ１のうちの少なくとも１つを標的化するＣＡＲを含み、ここで、ＩＬ１５シグナル伝達複合体はＣＡＲと共発現又は別々に発現され、ＩＬ１５は、本明細書に記載の設計１～７に提示される形態のうちのいずれか１つである。いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ１５は、シグナル伝達複合体がＣＡＲと同時又は別個に発現される場合、構築物３、４、又は７の形態である。
９．チェックポイント阻害剤
チェックポイントは、阻害されていない場合、免疫応答を抑制又は下方制御することができる細胞分子、多くの場合細胞表面分子である。腫瘍がある特定の免疫チェックポイント経路を、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する免疫耐性の主要機構として利用していることが今では明らかになっている。チェックポイント阻害剤（ＣＩ）は、チェックポイント遺伝子発現又は遺伝子産物を低減するか、又はチェックポイント分子の活性を減少させ、それによって阻害チェックポイントを遮断し、免疫系機能を回復させることができるアンタゴニストである。ＰＤ１／ＰＤＬ１又はＣＴＬＡ４を標的とするチェックポイント阻害剤の開発により、腫瘍学の展望が変わり、これらの薬剤は複数の適応症で長期寛解をもたらした。しかしながら、多くの腫瘍サブタイプはチェックポイント遮断療法に耐性があり、再発生は依然として重大な懸念事項である。本出願の一態様は、ＣＩとの組合せ療法で提供されるようにゲノム操作された機能的派生細胞を含めることにより、ＣＩ耐性を克服するための治療アプローチを提供し、これは細胞によって発現され得るか、又は細胞と共に使用され得る。組合せ療法の一実施形態では、派生細胞はＮＫ細胞である。組合せ療法の別の実施形態では、派生細胞はＴ細胞である。直接的な抗腫瘍能力を呈することに加えて、本明細書で提供される派生ＮＫ細胞は、ＰＤＬ１－ＰＤ１媒介阻害に抵抗し、Ｔ細胞遊走を増強し、Ｔ細胞を腫瘍微小環境に動員し、腫瘍部位でＴ細胞の活性化を増強する能力を有することが示されている。したがって、機能的に強力なゲノム操作された派生ＮＫ細胞によって促進されるＴ細胞の腫瘍浸潤は、該ＮＫ細胞がチェックポイント阻害剤を含むＴ細胞標的免疫療法と相乗作用して、局所免疫抑制を緩和し、腫瘍量を低減することができることを示している。
一実施形態では、チェックポイント阻害剤の組合せ療法のための派生ＮＫ細胞は、本明細書で提供されるエンドドメインを含むＣＡＲ、並びに任意選択でＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６発現、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、第２のＣＡＲ、及び外因性細胞表面サイトカイン及び／又は受容体発現のうちの１つ、２つ、３つ、又はそれ以上を含み、ここで、Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、又はＣＤ５８若しくはＣＤ５４のノックアウトのうちの少なくとも１つが必要に応じて含まれる。いくつかの実施形態では、派生ＮＫ細胞は、表２に列記される遺伝子型のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、上述の派生ＮＫ細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、及び染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失若しくは低減された発現を更に含むか、又はＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及び二重特異性、多重特異性若しくはユニバーサルエンゲージャとの結合のための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入された若しくは増加した発現を更に含む。
別の実施形態では、チェックポイント阻害剤の組合せ療法のための派生Ｔ細胞は、本明細書で提供されるエンドドメインを含むＣＡＲ、並びに任意選択でＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６発現、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、第２のＣＡＲ、及び外因性細胞表面サイトカイン及び／又は受容体発現のうちの１つ、２つ、３つ、又はそれ以上を含み、ここで、Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、又はＣＤ５８若しくはＣＤ５４のノックアウトのうちの１つが必要に応じて含まれる。いくつかの実施形態では、派生Ｔ細胞は、表２に列記される遺伝子型のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、上述の派生Ｔ細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、及び染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失若しくは低減された発現を更に含むか、又はＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及び二重特異性、多重特異性若しくはユニバーサルエンゲージャとの結合のための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入された若しくは増加した発現を更に含む。
上述の派生ＮＫ細胞又は派生Ｔ細胞は、本明細書に提供されるエンドドメインを含むＣＡＲ、並びに任意選択で、ＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６発現、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、第２のＣＡＲ、及び外因性細胞表面サイトカイン発現のうちの１つ、２つ、３つ、又は４つすべてを含むｉＰＳＣクローン株を分化させることから得ることができ、ここで、Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、又はＣＤ５８及びＣＤ５４のノックアウトのうちの少なくとも１つが任意選択で導入される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣクローン株は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、及び染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失若しくは低減された発現を更に含むか、又はＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及び二重特異性、多重特異性若しくはユニバーサルエンゲージャとの結合のための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入された若しくは増加した発現を更に含む。
本明細書で提供される派生ＮＫ細胞又はＴ細胞との併用療法に好適なチェックポイント阻害剤には、ＰＤ１（Ｐｄｃｄｌ、ＣＤ２７９）、ＰＤＬ－１（ＣＤ２７４）、ＴＩＭ３（Ｈａｖｃｒ２）、ＴＩＧＩＴ（ＷＵＣＡＭ及びＶｓｔｍ３）、ＬＡＧ３（Ｌａｇ３、ＣＤ２２３）、ＣＴＬＡ４（Ｃｔｌａ４、ＣＤ１５２）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、及び阻害性ＫＩＲ（例えば、２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３、３ＤＬ１、及び３ＤＬ２）のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、上記のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、サメ重鎖のみの抗体（ＶＮＡＲ）、Ｉｇ ＮＡＲ、キメラ抗体、組換え抗体、又はそれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ）´２、Ｆ（ａｂ）´３、Ｆｖ、単鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）、及び全抗体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられ、これらは、産生するのに費用対効果が高いか、使用がより容易であるか、又は全抗体よりも感度が高い可能性がある。いくつかの実施形態では、１つ、２つ、又は３つ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ（ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、アベルマブ（ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、デュルバルマブ（ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ）、イピリムマブ（ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ）、ＩＰＨ４１０２（ＫＩＲ抗体）、ＩＰＨ４３（ＭＩＣＡ抗体）、ＩＰＨ３３（ＴＬＲ３抗体）、リリムマブ（ＫＩＲ抗体）、モナリズマブ（ＮＫＧ２Ａ抗体）、ニボルマブ（ＰＤ１ ｍＡｂ）、ペンブロリズマブ（ＰＤ１ ｍＡｂ）、及びそれらの誘導体、機能的同等物、又はバイオシミラーのうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、多くのｍｉＲＮＡが免疫チェックポイントの発現を制御する制御因子として見出されるため、上記のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストはマイクロＲＮＡベースである（Ｄｒａｇｏｍｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２０１８，１５（２）：１０３－１１５）。いくつかの実施形態では、チェックポイントアンタゴニストｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－２８、ｍｉＲ－１５／１６、ｍｉＲ－１３８、ｍｉＲ－３４２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１３０ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１９７、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－２００、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－５７０、ｍｉＲ－４２４、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５１３、及びｍｉＲ－２９ｃが含まれるが、これらに限定されない。
提供される派生ＮＫ細胞又は派生Ｔ細胞との組合せ療法のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのチェックポイント分子を標的とする少なくとも１つのチェックポイント阻害剤を含み、派生細胞は表２に列記される遺伝子型を有する。提供される派生ＮＫ細胞又はＴ細胞との併用療法のいくつかの他の実施形態は、２つ、３つ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、２つ、３つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。少なくとも１つのチェックポイント阻害剤及び表２に列記された遺伝子型を有する派生細胞を含む組合せ療法のいくつかの実施形態では、該チェックポイント阻害剤は、抗体、又はヒト化若しくはＦｃ改変バリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物若しくはバイオシミラーであり、該チェックポイント阻害剤は、該抗体、又はその断片若しくはバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を発現することにより、派生細胞により産生される。いくつかの実施形態では、チェックポイントを阻害する抗体又はその断片若しくはバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド配列は、別個の構築物、又はＣＡＲ及び抗体若しくはその断片をコードする配列の両方を含むバイシストロン性構築物のいずれかにおいて、ＣＡＲと共発現される。いくつかの更なる実施形態では、抗体又はその断片をコードする配列は、例えば、ＣＡＲ－２Ａ－ＣＩ又はＣＩ－２Ａ－ＣＡＲとして図示される自己切断２Ａコード配列を介して、ＣＡＲ発現構築物の５´又は３´末端のいずれかに連結され得る。そのため、チェックポイント阻害剤及びＣＡＲのコード配列は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にある。チェックポイント阻害剤が、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に浸潤することが可能な派生エフェクター細胞によってペイロードとして送達、発現、分泌される場合、ＴＭＥに結合すると阻害性チェックポイント分子を相殺し、ＣＡＲ又は活性化受容体等のモダリティを活性化することによってエフェクター細胞の活性化を可能にする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、チェックポイント分子：ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、及び阻害性ＫＩＲのうちの少なくとも１つを阻害する。いくつかの実施形態では、表２に列記される遺伝子型を有する派生細胞においてＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、並びにそれらのヒト化又はＦｃ修飾されたバリアント、断片、及びそれらの機能的同等物又はバイオシミラーを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、又はそのヒト化若しくはＦｃ修飾されたバリアント、断片、又はそれらの機能的同等物若しくはバイオシミラーである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、又はそのヒト化若しくはＦｃ修飾されたバリアント、断片、又はそれらの機能的同等物若しくはバイオシミラーである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ、又はそのヒト化若しくはＦｃ修飾されたバリアント、断片、又はそれらの機能的同等物若しくはバイオシミラーである。
本明細書で提供される派生細胞及びチェックポイント分子を阻害する少なくとも１つの抗体を含む組合せ療法のいくつかの他の実施形態では、該抗体は、派生細胞によって、又は派生細胞内で産生されず、表２に列記されている遺伝子型を持つ派生細胞の投与の前、それと同時、又はその後に更に投与される。いくつかの実施形態では、提供される派生ＮＫ細胞又はＴ細胞との併用療法における１つ、２つ、３つ以上のチェックポイント阻害剤の投与は、同時又は連続的である。表２に列記される遺伝子型を有する派生ＮＫ細胞又はＴ細胞を含む併用治療の一実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、並びにそれらのヒト化又はＦｃ修飾されたバリアント、断片、及びそれらの機能的同等物又はバイオシミラーのうちの１つ又は複数である。表２に列記される遺伝子型を有する由来ＮＫ細胞又はＴ細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、又はそのヒト化若しくはＦｃ修飾されたバリアント、断片、及びその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。表２に列記される遺伝子型を有する由来ＮＫ細胞又はＴ細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、あるいはそのヒト化若しくはＦｃ修飾されたバリアント、断片、又はその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。表２に列記される遺伝子型を有する由来ＮＫ細胞又はＴ細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ、あるいはそのヒト化若しくはＦｃ修飾されたバリアント、断片、又はその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。
ＩＩＩ．ｉＰＳＣの選択された遺伝子座での標的化されたゲノム編集の方法
本明細書で交換可能に使用されるゲノム編集（ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、又はゲノム編集（ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｄｉｔｉｎｇ）、又は遺伝子編集は、標的化された細胞のゲノムにおいてＤＮＡが挿入される、欠失される、及び／又は置き換えられる遺伝子操作の一種である。標的化されたゲノム編集（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）（「標的化されたゲノム編集（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｄｉｔｉｎｇ）」又は「標的化された遺伝子編集」と交換可能）により、ゲノム内の予め選択された部位での挿入、欠失、及び／又は置換が可能となる。標的化された編集中に挿入部位で内因性配列が欠失されると、影響を受ける配列を含む内因性遺伝子が、配列の欠失によりノックアウト又はノックダウンされる可能性がある。したがって、標的化された編集を使用して、内因性遺伝子の発現を正確に妨害することもできる。「標的化された組み込み」という用語は、本明細書で同様に使用され、挿入部位での内因性配列の欠失の有無にかかわらず、１つ又は複数の外因性配列の挿入を伴うプロセスを指す。比較すると、ランダムに組み込まれた遺伝子は、位置効果及びサイレンシングを受け、それらの発現は信頼性がなく、予測できない。例えば、セントロメア及びサブテロメア領域は、特に導入遺伝子サイレンシングを起こしやすい。相互に、新たに組み込まれた遺伝子は、周囲の内因性遺伝子及びクロマチンに影響を及ぼし、細胞の挙動を改変するか、又は細胞の形質転換を支持する可能性がある。したがって、セーフハーバー遺伝子座又はゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）等の予め選択された遺伝子座に外因性ＤＮＡを挿入することは、安全性、効率、コピー数制御、及び信頼性の高い遺伝子応答制御にとって重要である。代替的に、外因性ＤＮＡは、遺伝子座でのノックダウン及びノックアウトを含む遺伝子発現の破壊が意図されている、予め選択された遺伝子座に挿入され得る。
標的化された編集は、ヌクレアーゼに依存しないアプローチ、又はヌクレアーゼに依存するアプローチのいずれかによって達成され得る。ヌクレアーゼに依存しない標的化された編集アプローチでは、相同組換えは、宿主細胞の酵素機構を介して、挿入される外因性ポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって誘導される。
代替的に、特定のレアカッティング（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼによる二本鎖切断（ＤＳＢ）の特異的導入を介して、より高い頻度で標的化された編集を達成することができる。そのようなヌクレアーゼに依存する標的化された編集は、ＤＳＢに応答して起こる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含むＤＮＡ修復機構を利用する。外因性遺伝子材料を含むドナーベクターがないと、ＮＨＥＪは、多くの場合、少数の内因性ヌクレオチドのランダムな挿入又は欠失（イン／デル）をもたらす。比較すると、一対の相同性アームに隣接する外因性遺伝子材料を含むドナーベクターが存在する場合、外因性遺伝子材料は、相同組換えによる相同性指向修復（ＨＤＲ）中にゲノムに導入され、「標的化された組み込み」をもたらし得る。場合によっては、標的化された組み込み部位が選択された遺伝子のコード領域内にあることが意図されているため、標的化された組み込みが遺伝子発現を妨害し、１回の編集ステップでノックイン及びノックアウト（ＫＩ／ＫＯ）を同時にもたらすことができる。
目的の遺伝子座（ＧＯＩ）の選択された位置に１つ又は複数の導入遺伝子を挿入して、同時に遺伝子をノックアウトすることが達成され得る。同時ノックイン及びノックアウト（ＫＩ／ＫＯ）に好適な遺伝子座としては、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα又はβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴが挙げられるが、これらに限定されない。位置選択的挿入のためのそれぞれの部位特異的標的化相同性アームにより、導入遺伝子が、その部位の内因性プロモーターの下、又は構築物に含まれる外因性プロモーターの下のいずれかで発現することを可能にする。２つ以上の導入遺伝子がＣＤ３８遺伝子座の選択された位置に挿入される場合、リンカー配列、例えば２Ａリンカー又はＩＲＥＳは、任意の２つの導入遺伝子の間に配置される。２Ａリンカーは、ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、及びＴａＶから派生する自己切断ペプチド（それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、及び「Ｔ２Ａ」とも称される）をコードし、単一の翻訳から別個のタンパク質を産生できるようにする。いくつかの実施形態では、インスレーターは、導入遺伝子及び／又は外因性プロモーターサイレンシングのリスクを低減するために構築物に含まれる。外因性プロモーターは、ＣＡＧ、又はＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、及びＵＢＣを含むがこれらに限定されない他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、又は細胞型特異的プロモーターであり得る。
特定の及び標的化されたＤＳＢを導入することができる利用可能なエンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の回文配列リピート）系が含まれるが、これらに限定されない。加えて、ｐｈｉＣ３１及びＢｘｂ１インテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（デュアルインテグラーゼカセット交換）系も、標的化された組み込みのための有望なツールである。
ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化されたヌクレアーゼである。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」又は「ＺＦＢＤ」とは、１つ又は複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合するポリペプチドドメインを意味する。ジンクフィンガーは、ジンクフィンガー結合ドメイン内の約３０アミノ酸のドメインであり、その構造は亜鉛イオンの配位により安定化される。ジンクフィンガーの例には、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー、Ｃ３Ｈジンクフィンガー、及びＣ４ジンクフィンガーが含まれるが、これらに限定されない。「設計された」ジンクフィンガードメインは、その設計／組成が主に合理的な基準、例えば、既存のＺＦＰ設計の情報と結合データを格納するデータベースの情報を処置するための置換規則及びコンピューター化されたアルゴリズムの適用から生じる、自然界では存在しないドメインである。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、第６，４５３，２４２号、及び第６，５３４，２６１号を参照されたい。更に、国際公開第９８／５３０５８号、第９８／５３０５９号、第９８／５３０６０号、第０２／０１６５３６号及び第０３／０１６４９６号も参照されたい。「選択された」ジンクフィンガードメインは、自然界では見られないドメインであり、その産生は、主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、又はハイブリッド選択等の経験的プロセスから生じる。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号及び米国特許第７，９７２，８５４に非常に詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。当技術分野で最も認識されているＺＦＮの例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとの融合である。
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化されたヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、又は「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」とは、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合に関与するＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインを意味する。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、感染中にＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原体から分泌される。これらのタンパク質は植物細胞の核に入り、ＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的ＤＮＡ配列に結合し、それらのトランス活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインの特異性は、リピート可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる選択リピート位置で多型を含む不完全な３４アミノ酸リピートのエフェクター可変数に依存する。ＴＡＬＥＮについては、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１１／０１４５９４０号に非常に詳細に記載されている。当技術分野で最も認識されているＴＡＬＥＮの例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインへの融合ポリペプチドである。
主題の方法で使用が見出される標的化されたヌクレアーゼの別の例は、標的化されたＳｐｏ１１ヌクレアーゼであり、目的のＤＮＡ配列に特異性を有するＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインなどに融合したヌクレアーゼ活性を有するＳｐｏ１１ポリペプチドを含むポリペプチドである。
本発明に好適な標的化されたヌクレアーゼの追加の例には、個々に又は組み合わせて使用されるかにかかわらず、Ｂｘｂ１、ｐｈｉＣ３１、Ｒ４、ＰｈｉＢＴ１、及びＷβ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０１－１が含まれるが、これらに限定されない。
標的化されたヌクレアーゼの他の非限定的な例には、天然に存在するヌクレアーゼ及び組換えヌクレアーゼ；ｃａｓ、ｃｐｆ、ｃｓｅ、ｃｓｙ、ｃｓｎ、ｃｓｄ、ｃｓｔ、ｃｓｈ、ｃｓａ、ｃｓｍ、及びｃｍｒを含むファミリからのＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ；制限エンドヌクレアーゼ；メガヌクレアーゼ；ホーミングエンドヌクレアーゼ等が含まれる。
例としてＣａｓ９を使用すると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、２つの主要な構成要素：（１）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ及び（２）ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を必要とする。共発現されると、２つの構成要素は複合体を形成し、ＰＡＭ及びＰＡＭ近くのシーディング領域を含む標的ＤＮＡ配列に動員される。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせてキメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成し、Ｃａｓ９を誘導して選択された配列を標的とすることができる。これらの２つの構成要素は、トランスフェクション又は形質導入を介して哺乳類細胞に送達され得る。
ＤＩＣＥを介した挿入では、一対のリコンビナーゼ、例えば、ｐｈｉＣ３１及びＢｘｂ１を使用して、各酵素自体の小さなａｔｔＢ及びａｔｔＰ認識部位に厳密に制限されている外因性ＤＮＡの一方向の組み込みを提供する。これらの標的ａｔｔ部位は哺乳類のゲノムには天然に存在しないため、最初に所望の組み込み部位でゲノムに導入する必要がある。例えば、米国特許公開第２０１５／０１４０６６５号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の一態様は、標的化されたゲノム組み込みのための１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を提供する。一実施形態では、構築物は、所望の組み込み部位に特異的な一対の相同アームを更に含み、標的化された組み込み方法は、細胞に構築物を導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入して、ＺＦＮを介した挿入を可能にすることとを含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入して、ＴＡＬＥＮを介した挿入を可能にすることとを含む。別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、Ｃａｓ９発現カセットを導入することと、所望の組み込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入して、Ｃａｓ９を介した挿入を可能にすることと、とを含む。また別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、一対のＤＩＣＥリコンビナーゼの１つ又は複数のａｔｔ部位を含む構築物を細胞の所望の組み込み部位に導入することと、１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、ＤＩＣＥリコンビナーゼの発現カセットを導入して、ＤＩＣＥを介した標的化された組み込みを可能にすることとを含む。
標的化された組み込みのための有望な部位には、ヒトのゲノムの遺伝子内又は遺伝子外領域であり、理論的には、宿主細胞又は生物に悪影響を与えることなく、新たに組み込まれたＤＮＡの予測可能な発現に対応できる、セーフハーバー遺伝子座又はゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）が含まれるか、これらに限定されない。有用なセーフハーバーは、ベクターにコードされたタンパク質又は非コードＲＮＡの所望のレベルを得るのに十分な導入遺伝子の発現を可能にする必要がある。セーフハーバーはまた、細胞を悪性形質転換させやすくしてはならず、また細胞機能を改変してはならない。組み込み部位が可能性のあるセーフハーバー遺伝子座となるために、理想的には、以下を含むがこれらに限定されない基準を満たす必要がある：配列アノテーションによって判断される制御要素若しくは遺伝子の破壊がない；遺伝子の密集した領域内の遺伝子間領域であるか、又は反対方向に転写された２つの遺伝子間の収束位置である；ベクターにコードされた転写活性化因子と隣接する遺伝子、特に癌関連遺伝子及びマイクロＲＮＡ遺伝子のプロモーターとの間の長距離にわたる相互作用の可能性を最小限に抑えるために距離を保つ；かつユビキタスな転写活性を示す広範な空間的及び時間的発現配列タグ（ＥＳＴ）発現パターンに反映されるように、明らかにユビキタスな転写活性を有する。この後者の特徴は、分化中にクロマチンリモデリングが、典型的にはいくつかの遺伝子座のサイレンシング及び他の遺伝子座の潜在的な活性化をもたらす幹細胞において特に重要である。外因性挿入に好適な領域内で、挿入のために選択された正確な遺伝子座は、反復要素及び保存された配列を欠き、相同アーム増幅のためのプライマーを容易に設計することができるはずである。
ヒトゲノム編集、又は具体的には標的化された組み込みに好適な部位には、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（ＣＣモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子座、及びマウスＲＯＳＡ２６遺伝子座のヒトオルソログが含まれるが、これらに限定されない。加えて、マウスＨ１１遺伝子座のヒトオルソログもまた、本明細書に開示される組成物及び標的化された組み込み方法を使用する挿入に好適な部位であり得る。更に、コラーゲン及びＨＴＲＰ遺伝子座は、標的化された組み込みのためのセーフハーバーとしても使用され得る。しかしながら、選択された各部位の検証は、特に特定の組み込み事象のための幹細胞で必要であることが示されており、プロモーターの選択、外因性遺伝子の配列及び配置、並びに構築物の設計を含む挿入戦略の最適化がしばしば必要である。
標的化されたイン／デルの場合、編集部位は、その発現及び／又は機能が妨害されることを意図している内因性遺伝子に含まれることが多い。一実施形態では、標的化されたイン／デルを含む内因性遺伝子は、免疫応答の制御及び調節に関連している。いくつかの他の実施形態では、標的化されたイン／デルを含む内因性遺伝子は、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答制御及び調節、又は幹細胞及び／若しくは前駆細胞、並びにその由来細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、及び／又は生存を抑制するタンパク質に関連する。
したがって、本発明の一態様は、ゲノムセーフハーバーを含む選択された遺伝子座、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、又はＲＵＮＸ１等の連続的又は一時的な遺伝子発現に安全であり、十分に制御されていることが既知の又は証明されている予め選択された遺伝子座、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座における標的化された組み込み方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的化された組込みは、組込みの結果としての遺伝子のノックダウン又はノックアウトが所望される遺伝子座のうちの１つにあり、そのような遺伝子座としては、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα又はβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、細胞における標的化された組込み方法は、１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的な一対の相同アーム及び１つ又は複数の外因性配列を含む構築物を導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。
別の実施形態では、細胞における標的化された組込み方法は、１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入して、ＺＦＮを介した挿入を可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化された組込み方法は、１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入して、ＴＡＬＥＮを介した挿入を可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９，、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。別の実施形態では、細胞における標的化された組込み方法は、１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ発現カセット及び所望の組み込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを介した挿入を可能にすることと、とを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。また別の実施形態では、細胞における標的化された組込み方法は、一対のＤＩＣＥリコンビナーゼの１つ又は複数のａｔｔ部位を含む構築物を、細胞の所望の組み込み部位に導入することと、１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、ＤＩＣＥリコンビナーゼの発現カセットを導入して、ＤＩＣＥを介した標的化された組み込みを可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。
更に、本明細書で提供されるように、セーフハーバーにおける標的化された組込みのための上記の方法は、目的の任意のポリヌクレオチド、例えば、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、並びに幹細胞及び／又は前駆細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能、自己複製、持続性、及び／又は生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するために使用される。いくつかの他の実施形態では、１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物は、１つ又は複数のマーカー遺伝子を更に含む。一実施形態では、本発明の構築物における外因性ポリヌクレオチドは、安全スイッチタンパク質をコードする自殺遺伝子である。誘導された細胞死に好適な自殺遺伝子系には、カスパーゼ９（又はカスパーゼ３若しくは７）及びＡＰ１９０３；チミジンキナーゼ（ＴＫ）及びガンシクロビル（ＧＣＶ）；シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）及び５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）が含まれるが、これらに限定されない。加えて、一部の自殺遺伝子系は細胞型特異的であり、例えば、Ｂ細胞分子ＣＤ２０でのＴリンパ球の遺伝子修飾により、ｍＡｂリツキシマブの投与によりそれらを排除することができる。更に、セツキシマブによって認識される修飾されたＥＧＦＲ含有エピトープは、細胞がセツキシマブに曝露されたときに遺伝子操作された細胞を枯渇させるために使用することができる。したがって、本発明の一態様は、カスパーゼ９（カスパーゼ３又は７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、修飾されたＥＧＦＲ、及びＢ細胞ＣＤ２０から選択される安全スイッチタンパク質をコードする１つ又は複数の自殺遺伝子の標的化された組み込み方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書の方法によって組み込まれる１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドは、標的化された組み込みのための構築物に含まれる作動可能に連結された外因性プロモーターによって駆動される。プロモーターは、誘導性又は構成的であってもよく、時間特異的、組織特異的、又は細胞型特異的であってもよい。本発明の方法に好適な構築的プロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、伸長因子１α（ＥＦ１α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）、及びユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、外因性プロモーターはＣＡＧである。
本明細書の方法によって組み込まれる外因性ポリヌクレオチドは、組み込み部位で、宿主ゲノムの内因性プロモーターによって駆動され得る。一実施形態では、方法は、細胞のゲノムのＡＡＶＳ１遺伝子座での１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの標的化された組込みを含む。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＡＡＶＳ１プロモーターによって駆動される。別の実施形態では、方法は、細胞のゲノムのＲＯＳＡ２６遺伝子座での標的化された組込みを含む。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＲＯＳＡ２６プロモーターによって駆動される。また別の実施形態では、方法は、細胞のゲノムのＨ１１遺伝子座での標的化された組込みを含む。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性Ｈ１１プロモーターによって駆動される。別の実施形態では、方法は、細胞のゲノムのコラーゲン遺伝子座での標的化された組込みを含む。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性コラーゲンプロモーターによって駆動される。また別の実施形態では、方法は、細胞のゲノムのＨＴＲＰ遺伝子座での標的化された組込みを含む。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＨＴＲＰプロモーターによって駆動される。理論的には、所望の位置への正しい挿入のみが、内因性プロモーターによって駆動される外因性遺伝子の遺伝子発現を可能にするであろう。
いくつかの実施形態では、標的化された組み込み方法のための構築物に含まれる１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドは、１つのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、構築物は、部分間の物理的分離を広げ、酵素機構へのアクセスを最大にするために、同じプロモーターによって駆動される２つの隣接するポリヌクレオチド間に１つ又は複数のリンカー配列を含む。リンカー配列のリンカーペプチドは、部分（外因性ポリヌクレオチド、及び／又はそれからコードされるタンパク質又はペプチド）間の物理的分離を、関連する機能に応じてより柔軟に又はより堅固にするように選択されたアミノ酸からなり得る。リンカー配列は、別個の部分を生じさせるために、プロテアーゼによって切断可能であるか、又は化学的に切断可能であり得る。リンカーにおける酵素的切断部位の例には、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トリプシン、コラゲナーゼ、及びトロンビン等のタンパク質分解酵素による切断のための部位が含まれる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、宿主によって自然に産生されるか、又は外因的に導入されるものである。代替的に、リンカーにおける切断部位は、選択された化学物質、例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、又は低ｐＨへの曝露時に切断が可能な部位であり得る。任意選択のリンカー配列は、切断部位を提供する以外の目的を果たし得る。リンカー配列は、部分が適切に機能するために、別の隣接する部分に対する部分の効果的な配置を可能にするべきである。リンカーはまた、部分間の立体障害を防ぐのに十分な長さの単純なアミノ酸配列であり得る。加えて、リンカー配列は、例えば、リン酸化部位、ビオチン化部位、硫酸化部位、γ－カルボキシル化部位等を含むがこれらに限定されない、翻訳後修飾を提供し得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、生物学的に活性なペプチドを単一の望ましくない立体構造に保持しないように柔軟である。リンカーは、柔軟性を提供するために、グリシン、アラニン、及びセリン等の小さな側鎖を有するアミノ酸から主に構成され得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列の約８０又は９０パーセント以上は、グリシン、アラニン、又はセリン残基、特にグリシン及びセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ４Ｓリンカーペプチドは、融合タンパク質の末端プロセシングドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインを分離する。他の実施形態では、２Ａリンカー配列は、２つの別個のタンパク質が単一の翻訳から産生されることを可能にする。好適なリンカー配列は、経験的に容易に特定することができる。加えて、リンカー配列の好適なサイズ及び配列もまた、従来のコンピューターモデリング技法によって決定することができる。一実施形態では、リンカー配列は、自己切断ペプチドをコードする。一実施形態では、自己切断ペプチドは２Ａである。いくつかの他の実施形態では、リンカー配列は、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）を提供する。いくつかの実施形態では、任意の２つの連続するリンカー配列は異なる。
標的化された組み込みのための外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入する方法は、それ自体が知られている細胞への遺伝子移入の方法を使用して達成することができる。一実施形態では、構築物は、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター等のウイルスベクターの骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞（例えば、ｐＡｌ－１１、ｐＸＴｌ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）等に送達及び／又は発現するために使用される。いくつかの他の実施形態では、エピソームベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞に送達するために使用される。いくつかの実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を遺伝子操作のために使用して、相同組換えを介して挿入、欠失、又は置換を導入することができる。レンチウイルスとは異なり、ｒＡＡＶは宿主ゲノムに組み込まれない。加えて、エピソームｒＡＡＶベクターは、従来の標的化プラスミドのトランスフェクションと比較して、はるかに高い割合で相同性指向遺伝子標的化を媒介する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ６又はＡＡＶ２ベクターは、ｉＰＳＣのゲノムの標的部位に挿入、欠失又は置換を導入するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書の方法及び組成物を使用して得られたゲノム修飾されたｉＰＳＣ及びその派生細胞は、表２に列記される少なくとも１つの遺伝子型を含む。
ＩＶ．ゲノム操作されたｉＰＳＣを取得及び維持する方法
本発明は、１つ又は複数の所望の部位で１つ又は複数の標的化された編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得て維持する方法を提供し、標的化された編集は、拡大されたゲノム操作されたｉＰＳＣ又はｉＰＳＣ由来非多能性細胞において、それぞれの選択した編集部位で無傷及び機能的であり続ける。標的化された編集は、ｉＰＳＣ及びそれからの派生細胞のゲノムに、挿入、欠失、及び／又は置換、すなわち、選択した部位での標標的化された組み込み及び／又はイン／デルを導入する。患者由来の末梢血由来の一次エフェクター細胞を直接操作する場合と比較して、ここで提供されるようにｉＰＳＣを編集及び分化させることによりゲノム操作された派生細胞を得ることの多くの利点には、以下が含まれるが、これらに限定されない：設計されたエフェクター細胞の無制限のソース；特に複数の設計されたモダリティが含まれる場合、エフェクター細胞を繰り返し操作する必要がない；取得されたエフェクター細胞は、伸長したテロメアを有し、消耗が少ないために若返っている；主に本明細書で提供される操作されたｉＰＳＣでのクローン選択が可能であることに起因して、エフェクター細胞集団は、編集部位、コピー数、及び対立遺伝子変異、無作為変異、発現多様性がないという点で均一である。
特定の実施形態では、１つ又は複数の選択された部位での１つ又は複数の標的化された編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、運命維持培地（ＦＭＭ）として表３に示される細胞培養培地において、単一細胞として長期間維持、継代、及び拡大され、ｉＰＳＣは、選択された部位で標的化された編集及び機能修飾を保持する。培地の組成は、表３に示される最適範囲内の量で培地中に存在し得る。ＦＭＭで培養されたｉＰＳＣは、未分化で、基底又はナイーブなプロファイル、培養物を洗浄又は選択する必要なくゲノム安定性を維持し続けることが示されており、３つすべての体細胞系統、胚様体又は単層（胚様体の形成なし）を介したインビトロ分化、及び奇形腫形成によるインビボ分化を容易に生じさせる。例えば、国際公開第２０１５／１３４６５２号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2023505206000007
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の標的化された組み込み及び／又はイン／デルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤を含まないか、又は本質的に含まない培地中で維持、継代、拡大され、ｉＰＳＣは、選択された部位において無傷で機能的な標的化された編集を保持する。
本発明の別の態様は、ｉＰＳＣの標的化された編集を通じて、又は最初に標的化された編集によりゲノム操作された非多能性細胞を生成し、次に選択／単離されたゲノム操作された非多能性細胞を再プログラミングして、非多能性細胞と同じ標的化された編集を含むｉＰＳＣを得ることを通じて、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法を提供する。本発明の更なる態様は、標的化された組み込み及び／又は標的化されたイン／デルを細胞に導入することによって同時に再プログラミングを受けているゲノム操作された非多能性細胞を提供し、接触した非多能性細胞は再プログラミングに十分な条件下にあり、再プログラミングの条件は、非多能性細胞を１つ又は複数の再プログラミング因子及び小分子と接触させることを含む。同時のゲノム操作及び再プログラミングのための方法の様々な実施形態では、非多能性細胞を１つ又は複数の再プログラミング因子及び任意選択で小分子と接触させることにより再プログラミングを開始する前に、又は本質的に同時に、標的化された組み込み及び／又は標的化されたイン／デルを非多能性細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態では、非多能性細胞を同時にゲノム操作及び再プログラミングするために、標的化された組み込み及び／又はイン／デルはまた、非多能性細胞を１つ又は複数の再プログラミング因子及び小分子と接触させることによって再プログラミングの複数日のプロセスが開始された後に非多能性細胞に導入されてもよく、再プログラミング細胞がＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１８１、及びＣＤ３０を含むがこれらに限定されない１つ又は複数の内因性多能性遺伝子の安定した発現を示す前に、構築物を担持するベクターが導入される。
いくつかの実施形態では、再プログラミングは、非多能性細胞を少なくとも１つの再プログラミング因子、並びに任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤の組合せ（ＦＲＭ；表３）と接触させることによって開始される。いくつかの実施形態では、上述の任意の方法によるゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤の組合せを含む混合物（ＦＭＭ；表３）を使用して更に維持及び拡大される。
ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法のいくつかの実施形態では、方法は、ｉＰＳＣに１つ以上の標的化された組み込み及び／又はイン／デルを導入することによりｉＰＳＣをゲノム操作し、表２に列記される少なくとも１つの遺伝子型を有するゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることを含む。代替的に、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法は、（ａ）１つ又は複数の標的化された編集を非多能性細胞に導入して、選択した部位で標的化された組み込み及び／又はイン／デルを含むゲノム操作された非多能性細胞を得ることと、（ｂ）ゲノム操作された非多能性細胞を、１つ又は複数の再プログラミング因子、並びに任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及び／又はＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位で標的化された組み込み及び／又はイン／デルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることと、を含む。代替的に、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法は、（ａ）非多能性細胞を１つ又は複数のリプログラミング因子、及び任意にＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及び／又はＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて非多能性細胞のリプログラミングを開始することと、（ｂ）１つ又は複数の標的化組み込み及び／又はイン／デルを、ゲノム操作のためのリプログラミング非多能性細胞に導入することと、（ｃ）選択された部位で標的化組み込み及び／又はイン／デルを含む、クローンゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることと、を含む。
再プログラミング因子は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１８８０１及びＰＣＴ／ＵＳ１６／５７１３６に開示される（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、Ｌ１ＴＤ１、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。１つ又は複数の再プログラミング因子は、ポリペプチドの形態であり得る。再プログラミング因子はまた、ポリヌクレオチドの形態であり得るため、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、プラスミド、及びミニサークル等のベクターによって非多能性細胞に導入される。特定の実施形態では、少なくとも１つの再プログラミング因子をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、エピソームベクターによって導入される。様々な他の実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、センダイウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、様々な再プログラミング因子の化学量論考慮に入れたプラスミドの組合せによって導入される。例えば、国際公開第２０１９／０７５０５７号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、非多能性細胞は、同じ又は異なる選択された部位での標的化された組み込みのための複数のベクターによって、異なる外因性ポリヌクレオチド及び／又は異なるプロモーターを含む複数の構築物で移入される。これらの外因性ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子、又は標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又はｉＰＳＣ若しくはその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／又は生存率を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されないＲＮＡをコードする。これらの外因性ポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、及び組織又は細胞型特異的プロモーターからなる群から選択される１つ又は複数のプロモーターによって駆動され得る。したがって、ポリヌクレオチドは、プロモーターを活性化する条件下で、例えば、誘導剤の存在下で、又は特定の分化した細胞型において発現可能である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉＰＳＣ及び／又はｉＰＳＣから分化した細胞において発現される。一実施形態では、１つ又は複数の自殺遺伝子は、構成的プロモーター、例えば、ＣＡＧによって駆動されるカパーゼ－９によって駆動される。異なる外因性ポリヌクレオチド及び／又は異なるプロモーターを含むこれらの構築物は、同時に又は連続してのいずれかで非多能性細胞に移入することができる。複数の構築物の標的化された組み込みに供される非多能性細胞は、１つ又は複数の再プログラミング因子に同時に接触させて、ゲノム操作と同時に再プログラミングを開始でき、それにより、同じ細胞のプールにおいて複数の標的化された組み込みを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることができる。このように、この堅牢な方法により、同時再プログラミング及び操作戦略が、１つ又は複数の選択された標的部位に組み込まれた複数のモダリティを有するクローンゲノム操作されたｈｉＰＳＣを導くことを可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書の方法及び組成物を使用して得られたゲノム修飾されたｉＰＳＣ及びその派生細胞は、表２に列記される少なくとも１つの遺伝子型を含む。
Ｖ．ｉＰＳＣ分化プラットフォームを使用してゲノム操作されたｉＰＳＣ及びＣＡＲエンドドメインスクリーニングを分化させることにより遺伝子操作されたエフェクター細胞を取得する方法
本発明の更なる態様は、奇形腫形成によるゲノム操作されたｉＰＳＣのインビボでの分化の方法を提供し、ゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するインビボ分化細胞は、所望の部位で標的化された組み込み及び／又はイン／デルを含む無傷で機能的な標的化された編集を保持する。いくつかの実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからインビボで派生した分化細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、若しくはＲＵＮＸ１、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１つ又は複数の望ましい部位に組み込まれた１つ又は複数の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するインビボ分化細胞は、標的化モダリティをコードするポリヌクレオチド、又は幹細胞及び／又は前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能、自己複製、持続性、及び／又は生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の誘導性自殺遺伝子を含む奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するインビボ分化細胞は、免疫応答の制御及び媒介に関連する内因性遺伝子の１つ又は複数のイン／デルを更に含む。いくつかの実施形態では、イン／デルは、１つ又は複数の内因性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン／デルは、１つ又は複数の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン／デルは、１つ又は複数の内因性ＭＨＣクラスＩサプレッサー遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン／デルは、主要組織適合遺伝子複合体に関連する１つ又は複数の内因性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン／デルは、Ｂ２Ｍ、ＰＤ１、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＴＣＲ遺伝子を含むがこれらに限定されない１つ又は複数の内因性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位に１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドを含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍ（ベータ－２－ミクログロブリン）をコードする遺伝子における標的化された編集を更に含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供される１つ又は複数の遺伝子修飾を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを使用して、インビトロで造血細胞系統又は任意の他の特定の細胞型を導き、由来非多能性細胞は、選択された部位で標的化された編集を含む機能的遺伝子修飾を保持する。一実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞には、二次造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、二次ＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、造血多分化能前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、及びマクロファージが含まれるが、これらに限定されず、ゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するこれらの細胞は、所望の部位で標的化された編集を含む機能的な遺伝子修飾を保持する。
ｉＰＳＣ由来の造血細胞系統を得るための適用される分化方法及び組成物には、例えば、国際公開第２０１７／０７８８０７号に示されているものが含まれ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。提供されるように、造血細胞系統を生成するための方法及び組成物は、無血清、フィーダーフリー、及び／又は間質を含まない条件下で、またスケーラブルで単層のＥＢ形成を必要としない培養プラットフォームにおいて、ｈｉＰＳＣを含む、多能性幹細胞に由来する二次造血内皮（ＨＥ）を介する。提供された方法に従って分化され得る細胞は、多能性幹細胞から、特定の最終分化細胞及び分化転換細胞にコミットされた前駆細胞、並びに多能性中間体を経由せずに造血運命に直接移行した様々な系統の細胞にまで及ぶ。同様に、幹細胞を分化させることによって産生される細胞は、多分化能幹細胞又は前駆細胞から、最終分化細胞、及び介在するすべての造血細胞系統にまで及ぶ。
単層培養において造血系統の細胞を多能性幹細胞から分化及び拡大する方法は、多能性幹細胞をＢＭＰ経路活性化因子、及び任意選択でｂＦＧＦと接触させることを含む。提供されるように、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞は、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく得られ、拡大される。次いで、中胚葉細胞をＢＭＰ経路活性化因子、ｂＦＧＦ、及びＷＮＴ経路活性化因子と接触させて、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく、二次造血性内皮（ＨＥ）の可能性を有する拡大された中胚葉細胞を得る。その後のｂＦＧＦ、並びに任意選択でＲＯＣＫ阻害剤及び／又はＷＮＴ経路活性化因子との接触により、二次ＨＥの可能性を有する中胚葉細胞は、二次ＨＥ細胞に分化し、これも分化中に拡大される。
造血系統の細胞を得るために本明細書で提供される方法は、ＥＢ形成が中程度から最小の細胞拡大をもたらし、均質な拡大を必要とする多くの用途に重要である単層培養、及び集団内の細胞の均質な分化を可能にせず、困難で、効率が低いため、ＥＢを介した多能性幹細胞分化よりも優れている。
提供される単層分化プラットフォームは、造血幹細胞及びＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞等の分化した子孫の派生をもたらす、二次造血内皮への分化を容易にする。単層分化戦略は、増強された分化効率と大規模な拡大を組み合わせて、様々な治療用途のための多能性幹細胞由来造血細胞の治療上適切な数の送達を可能にする。更に、本明細書で提供される方法を使用する単層培養は、インビトロ分化、エクスビボ調節、並びにインビボ長期造血自己再生、再構成、及び生着の全範囲を可能にする機能的な造血系統細胞をもたらす。提供されるように、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞には、二次造血内皮、造血多分化能前駆細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに好中球が含まれるが、これらに限定されない。
多能性幹細胞の二次造血系統の細胞への分化を指向する方法であって、方法は、（ｉ）多能性幹細胞をＢＭＰ活性化因子及び任意選択でｂＦＧＦを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞から中胚葉細胞の分化及び拡大を開始することと、（ｉｉ）中胚葉細胞をＢＭＰ活性化因子、ｂＦＧＦ、及びＧＳＫ３阻害剤を含む組成物（組成物は、任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない）と接触させて、中胚葉細胞から二次ＨＥの可能性を有する中胚葉細胞の分化及び拡大を開始することと、（ｉｉｉ）二次ＨＥの可能性を有する中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤；ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＧＦ、ＥＰＯ、ＩＬ６、及びＩＬ１１からなる群から選択される１つ又は複数の成長因子及びサイトカイン、並びに任意選択でＷｎｔ経路活性化因子を含む組成物（組成物は、任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない）と接触させて、二次造血内皮の可能性を有する多能性幹細胞由来中胚葉細胞から二次造血内皮の分化及び拡大を開始することと、を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含む組成物（組成物はＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない）と接触させて、多能性幹細胞を播種及び拡大することを更に含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣ、又はナイーブｉＰＳＣ、又は１つ又は複数の遺伝子インプリントを含むｉＰＳＣであり、ｉＰＳＣに含まれる１つ又は複数の遺伝子インプリントは、それから分化した造血細胞に保持される。多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指向する方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化は、胚様体の生成を欠き、単層培養形態である。
上記の方法のいくつかの実施形態では、得られた多能性幹細胞由来の二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋である。いくつかの実施形態では、得られた二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＤ９３－である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ９３－である。
上記の方法のいくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ又は複数の成長因子及びサイトカイン；並びに任意選択でＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させて、二次造血内皮のプレＴ細胞前駆細胞への分化を開始することと、任意選択で、（ｉｉ）プレＴ細胞前駆細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ又は複数の成長因子及びサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子、及びＲＯＣＫ阻害剤のうちの１つ又は複数を含まない組成物と接触させて、プレＴ細胞前駆細胞のＴ細胞前駆細胞又はＴ細胞への分化を開始することとを更に含む。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。
多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指向するための上記の方法の更にいくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ又は複数の成長因子及びサイトカインを含む組成物と接触させて、二次造血内皮のプレＮＫ細胞前駆細胞への分化を開始することと、任意選択で、（ｉｉ）多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ又は複数の成長因子及びサイトカインを含む組成物（培地は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子、及びＲＯＣＫ阻害剤のうちの１つ又は複数を含まない）と接触させて、プレＮＫ細胞前駆細胞のＮＫ細胞前駆細胞又はＮＫ細胞への分化を開始することと、とを更に含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆細胞は、ＣＤ３－ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ７＋である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋であり、任意選択で、ＮＫｐ４６＋、ＣＤ５７＋、及びＣＤ１６＋によって更に定義される。
したがって、上記の分化方法を使用して、以下のｉＰＳＣ由来の造血細胞のうちの１つ又は複数の集団を得ることができる。（ｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、及びｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ又は複数の培養培地を使用したＣＤ３４＋ＨＥ細胞（ｉＣＤ３４）、（ｉｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、及びｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ又は複数の培養培地を使用した二次造血内皮（ｉＨＥ）、（ｉｉｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、及びｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ又は複数の培養培地を使用した二次ＨＳＣ、（ｉｖ）ｉＭＰＰ－Ａを使用した多分化能前駆細胞（ｉＭＰＰ）、（ｖ）ｉＴＣ－Ａ２及びｉＴＣ－Ｂ２から選択される１つ又は複数の培養培地を使用したＴ系統細胞前駆細胞（ｉｐｒｏ－Ｔ）、（ｖｉ）ｉＴＣ－Ｂ２を使用したＴ細胞（ｉＴＣ）、（ｖｉｉ）ｉＮＫ－Ａ２及びｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ又は複数の培養培地を使用したＮＫ系統細胞前駆細胞（ｉｐｒｏ－ＮＫ）、並びに／又は（ｖｉｉｉ）ＮＫ系統細胞（ｉＮＫ）、及びｉＮＫ－Ｂ２。いくつかの実施形態では、培地は以下である：
ａ．ｉＣＤ３４－Ｃは、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＧＦ、及びＥＰＯからなる群から選択される１つ又は複数の成長因子及びサイトカイン、並びに任意選択でＷｎｔ経路活性化因子を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない；
ｂ．ｉＭＰＰ－Ａは、ＢＭＰ活性化因子、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＩＬ１１からなる群から選択される１つ又は複数の成長因子及びサイトカインを含む；
ｃ．ｉＴＣ－Ａ２は、ＲＯＣＫ阻害剤；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ又は複数の成長因子及びサイトカイン、並びに任意選択で、ＢＭＰ活性化因子を含む；
ｄ．ｉＴＣ－Ｂ２は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ又は複数の成長因子及びサイトカインを含む；
ｅ．ｉＮＫ－Ａ２は、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ又は複数の成長因子及びサイトカインを含む；並びに
ｆ．ｉＮＫ－Ｂ２は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ又は複数の成長因子及びサイトカインを含む。
いくつかの実施形態では、上記の方法から得られるゲノム操作ｉＰＳＣ派生細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む１つ又は複数の所望の組み込み部位で組み込まれた１つ又は複数の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又は幹細胞及び／若しくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、及び／又は生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、チェックポイント遺伝子、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子、及びＭＨＣクラスＩ抑制遺伝子を含むがこれに限定されない、免疫応答の制御及び媒介に関連する１つ又は複数の内因性遺伝子に含まれる１つ又は複数のイン／デルを更に含む。一実施形態では、１つ又は複数の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子にイン／デルを更に含み、Ｂ２Ｍはノックアウトされている。
加えて、第１の運命のゲノム操作された造血細胞から第２の運命のゲノム操作された造血細胞を得るための適用される脱分化方法及び組成物は、例えば、国際公開第２０１１／１５９７２６号に示されるものを含み、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。その中で提供される方法及び組成物は、再プログラミング中に内因性Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を制限することによって、開始非多能性細胞を非多能性中間細胞に部分的に再プログラミングし、非多能性中間細胞を、中間細胞を所望の細胞型に分化させるための条件に供することを可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書の方法及び組成物を使用して得られたゲノム修飾されたｉＰＳＣ及びその派生細胞は、表２に列記される少なくとも１つの遺伝子型を含む。
ＶＩ．遺伝子操作されたｉＰＳＣから分化された外因性機能的モダリティを有する派生免疫細胞の治療的使用
本発明は、いくつかの実施形態では、開示される方法及び組成物を使用してゲノム操作されたｉＰＳＣから分化された機能的に増強された派生免疫細胞の単離された集団又は亜集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣ派生免疫細胞に保持可能な１つ又は複数の標的化遺伝子編集を含み、遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びその派生細胞は、細胞ベースの養子療法に好適である。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来ＣＤ３４細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来ＨＳＣ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来ｐｒｏＴ又はＴ系統細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来ｐｒｏＮＫ又はＮＫ系統細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来免疫制御細胞又は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来の遺伝子操作された免疫細胞は、改善された治療可能性のためにエクスビボで更に調節される。一実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ナイーブＴ細胞、幹細胞メモリＴ細胞、及び／又はセントラルメモリＴ細胞の数又は比率の増加を含む。一実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞の数又は比率の増加を含む。別の実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、適応ＮＫ細胞の数又は比率の増加を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作されたＣＤ３４細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ系統細胞、ＮＫ系統細胞、又は骨髄由来サプレッサー細胞の単離された集団又は亜集団は、同種異系である。いくつかの他の実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作されたＣＤ３４細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、又はＭＤＳＣの単離された集団又は亜集団は、自家性である。
いくつかの実施形態では、分化のためのｉＰＳＣは、エフェクター細胞において望ましい治療属性を伝えるために選択された遺伝子インプリントを含むが、但し、分化中の細胞発生生物学が破壊されず、該ｉＰＳＣに由来する分化したエフェクター細胞において遺伝子インプリントが保持され、機能的であることを条件とする。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞の遺伝子インプリントは、（ｉ）非多能性細胞をｉＰＳＣに再プログラミングする間若しくはその後に多能性細胞のゲノムにおけるゲノム挿入、欠失、若しくは置換により得られる１つ又は複数の遺伝子修飾されたモダリティ、又は（ｉｉ）ドナー特異的、疾患特異的、若しくは治療応答特異的である供給源特異的免疫細胞の１つ又は複数の保持可能な治療属性を含み、多能性細胞が供給源特異的免疫細胞から再プログラミングされ、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞にも含まれる供給源の治療属性を保持する。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変モダリティは、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、あるいは、ｉＰＳＣ又はその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節と調整、及び／又は生存率を促進するタンパク質の１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたｉＰＳＣ及びその派生細胞は、表２に列記された遺伝子型を含む。他のいくつかの実施形態では、表２に列記された遺伝子型を含む遺伝子改変ｉＰＳＣ及びその派生細胞は、（１）ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、又はＲＦＸＡＰ、及び染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の１つ又は複数の欠失又は発現低下、並びに（２）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、又は二重特異性又は多重特異性又はユニバーサルエンゲージャとのカップリングのための表面トリガー受容体の導入された又は増加した発現を含む追加の遺伝子改変モダリティを更に含む。
またいくつかの他の実施形態では、造血系統細胞は、以下のうちの少なくとも２つの組合せに関する供給源特異的免疫細胞の治療属性を含む。（ｉ）１つ又は複数の抗原標的化受容体の発現、（ｉｉ）修飾されたＨＬＡ、（ｉｉｉ）腫瘍微小環境に対する耐性、（ｉｖ）バイスタンダー免疫細胞の動員及び免疫調節、（ｖ）腫瘍外効果の低減による改善された標的特異性、及び（ｖｉ）改善されたホーミング、持続性、細胞傷害性、又は抗原エスケープ救済。
いくつかの実施形態では、表２に列記された遺伝子型を含むｉＰＳＣ派生造血細胞、及び該細胞は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、又はＩＬ２１を含む少なくとも１つのサイトカイン及び／若しくはその受容体、又はその任意の修飾されたタンパク質を発現し、少なくともＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、サイトカイン及びＣＡＲの操作された発現は、ＮＫ細胞特異的である。いくつかの他の実施形態では、サイトカイン及びＣＡＲの操作された発現は、Ｔ細胞特異的である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ派生造血エフェクター細胞は、抗原特異的である。いくつかの実施形態では、抗原特異的派生エフェクター細胞は、液性腫瘍を標的とする。いくつかの実施形態では、抗原特異的派生エフェクター細胞は、固形腫瘍を標的とする。いくつかの実施形態では、抗原特異的ｉＰＳＣ派生造血エフェクター細胞は、腫瘍抗原エスケープを救済することができる。
養子細胞療法に好適な対象に本発明の免疫細胞を導入することにより、様々な疾患を回復させることができる。いくつかの実施形態では、提供されるｉＰＳＣ派生造血細胞は、同種異系養子細胞療法のためのものである。加えて、本発明は、いくつかの実施形態では、養子細胞療法に好適な対象に組成物を導入することによって、上記の治療用組成物の治療的使用を提供し、対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、又は、ＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、若しくはＢＫポリオーマウイルスに関連する感染を有する。血液悪性腫瘍の例には、急性及び慢性白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群が含まれるが、これらに限定されない。固形癌の例には、脳、前立腺、乳房、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭、首、胃、子宮頸部、直腸、喉頭、及び食道の癌が含まれるが、これらに限定されない。様々な自己免疫障害の例には、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、心筋炎のいくつかの形態、多発性硬化症、類天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ様関節炎、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ウェゲナー病）が含まれるが、これらに限定されない。ウイルス感染の例には、ＨＩＶ－（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＳＶ－（単純ヘルペスウイルス）、ＫＳＨＶ－（カポシ肉腫関連ヘルペスウイルス）、ＲＳＶ－（呼吸器合胞体ウイルス）、ＥＢＶ－（エプスタイン－バーウイルス）、ＣＭＶ－（サイトメガロウイルス）、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）、アデノウイルス－、レンチウイルス－、ＢＫポリオーマウイルス関連障害）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される実施形態の由来造血系統細胞を使用する治療は、症状に応じて、又は再発生防止のために実施され得る。「治療すること」、「治療」等の用語は、本明細書では、一般に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、疾患を完全に又は部分的に予防するという点で予防的であり得、かつ／又は疾患及び／若しくは疾患に起因する有害作用の部分的又は完全な治癒に関して治療的であり得る。本明細書で使用される場合「治療」は、対象における疾患のあらゆる介入を網羅し、以下を含む：疾患にかかりやすいが、まだそれを有していると診断されていない対象において疾患が生じることを予防すること、疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること、又は疾患を緩和する、すなわち疾患を後退させること。治療薬又は組成物は、疾患又は傷害の発症前、発症中、又は発症後に投与することができる。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化又は低減する進行中の疾患の治療もまた、特に関心がある。特定の実施形態では、治療を必要とする対象は、細胞療法によって少なくとも１つの関連する症状を抑制し、回復させ、かつ／又は改善することができる疾患、状態、及び／又は傷害を有する。ある特定の実施形態は、細胞療法を必要とする対象が、骨髄又は幹細胞移植の候補、化学療法又は放射線療法を受けた対象、過剰増殖性障害又は癌、例えば、造血系の過剰増殖性障害若しくは癌を有するか又はそのリスクがある対象、腫瘍、例えば固形腫瘍を有するか又はそれを発達させるリスクがある対象、ウイルス感染又はウイルス感染に関連する疾患を有するか又はそのリスクがある対象を含むが、これらに限定されないことを企図する。
本明細書に開示される実施形態の由来造血系統細胞を含む治療に対する応答性を評価する場合、応答は、臨床的有益率、死亡までの生存、病理学的完全応答、病理学的応答の半定量的測定、臨床的完全寛解、臨床的部分寛解、臨床的安定疾患、無再発生存、無転移生存、無病生存、循環腫瘍細胞減少、循環マーカー応答、及びＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準）基準のうちの少なくとも１つを含む基準によって測定され得る。
開示される由来造血系統細胞を含む治療用組成物は、他の治療の前、治療中、及び／又は治療後に対象に投与され得る。したがって、組合せ療法の方法は、追加の治療薬の使用前、使用中、及び／又は使用後に、ｉＰＳＣ由来免疫細胞の投与又は調製を伴い得る。上記に提供されるように、１つ又は複数の追加の治療薬は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、小ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞構成要素若しくはその置換因子、目的の１つ又は複数のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤若しくは放射性部分、又は免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む。ｉＰＳＣ由来免疫細胞の投与は、追加の治療薬の投与から、時間、日、更には週単位の時間で分離することができる。加えて、又は代替的に、投与は、限定されないが、抗腫瘍剤、外科手術等の非薬物療法等の他の生物学的に活性な薬剤又はモダリティと組み合わせることができる。
組み合わせ細胞療法のいくつかの実施形態では、治療的組合せは、本明細書で提供されるｉＰＳＣ由来造血系統細胞と、抗体又は抗体断片である追加の治療薬とを含む。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はキメラ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体又は抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍又はウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来造血系統細胞を活性化して、それらの殺滅能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来造血系統細胞に対する追加の治療薬として、組合せ治療に好適な抗体としては、ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ）、ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ、パーツズマブ）、ＣＤ５２抗体（例えば、アレムツズマブ）、ＥＧＦＲ抗体（例えば、セルツキシマブ）、ＧＤ２抗体（例えば、ジヌツキシマブ）、ＰＤＬ１抗体（例えば、アベルマブ）、ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、ＣＤ１２３抗体（例えば、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、ＳＬＡＭＦ７抗体（例えば、エロツズマブ）、ＭＩＣＡ／Ｂ抗体（例えば、７Ｃ６、６Ｆ１１、１Ｃ２）、及びそれらのヒト化又はＦｃ改変されたバリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物及びバイオシミラーが挙げられるがそれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、１つ又は複数のチェックポイント阻害剤を含む。チェックポイントは、阻害されていない場合、免疫応答を抑制又は下方制御することができる細胞分子、多くの場合細胞表面分子である。チェックポイント阻害剤は、チェックポイント遺伝子発現又は遺伝子産物を低減するか、又はチェックポイント分子の活性を減少させることができるアンタゴニストである。本明細書で提供される、ＮＫ細胞又はＴ細胞を含む派生エフェクター細胞との併用療法に好適なチェックポイント阻害剤には、ＰＤ１（Ｐｄｃｄｌ、ＣＤ２７９）、ＰＤＬ－１（ＣＤ２７４）、ＴＩＭ３（Ｈａｖｃｒ２）、ＴＩＧＩＴ（ＷＵＣＡＭ及びＶｓｔｍ３）、ＬＡＧ３（Ｌａｇ３、ＣＤ２２３）、ＣＴＬＡ４（Ｃｔｌａ４、ＣＤ１５２）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、及び阻害性ＫＩＲ（例えば、２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３、３ＤＬ１、及び３ＤＬ２）のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
提供される派生エフェクター細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態は、チェックポイント分子を標的とする少なくとも１つの阻害剤を更に含む。提供される派生エフェクター細胞との併用療法のいくつかの他の実施形態は、２つ、３つ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、２つ、３つ以上の阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される併用療法のためのエフェクター細胞は、提供される派生ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される併用療法のためのエフェクター細胞は、派生Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、併用療法のための派生ＮＫ細胞又はＴ細胞は、本明細書に提供されるように機能的に増強される。いくつかの実施形態では、２つ、３つ以上のチェックポイント阻害剤は、派生エフェクター細胞の投与とともに、投与前、又は投与後に併用療法で投与され得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のチェックポイント阻害剤は、同時に、又は一度に１つ（連続的に）投与される。
いくつかの実施形態では、上記のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、サメ重鎖のみの抗体（ＶＮＡＲ）、Ｉｇ ＮＡＲ、キメラ抗体、組換え抗体、又はそれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ）´２、Ｆ（ａｂ）´３、Ｆｖ、単鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）、及び全抗体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられ、これらは、産生するのに費用対効果が高いか、使用がより容易であるか、又は全抗体よりも感度が高い可能性がある。いくつかの実施形態では、１つ、又は２つ、又は３つ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの誘導体又は機能的同等物のうちの少なくとも１つを含む。
派生エフェクター細胞と、１つ又は複数のチェック阻害剤とを含む併用療法は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、菌状息肉腫、パジェット細網症、セザリー症候群、肉芽腫性弛緩性皮膚、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、急性痘瘡状苔癬状ひこう疹、ＣＤ３０＋皮膚Ｔ細胞リンパ腫、続発性皮膚ＣＤ３０＋大細胞リンパ腫、非菌状息肉腫ＣＤ３０皮膚大Ｔ細胞リンパ腫、多形性Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、皮下Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンスリンパ腫（ＨＬ）、頭頸部腫瘍、扁平上皮癌、横紋筋肉腫、ルイス肺癌（ＬＬＣ）、非小細胞肺癌、食道扁平上皮癌、食道腺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、乳癌、胃癌、前立腺小細胞神経内分泌癌（ＳＣＮＣ）、肝臓癌、神経膠芽腫、肝臓癌、口腔扁平上皮癌、膵臓癌、甲状腺乳頭癌、肝内胆管細胞癌、肝細胞癌、骨癌、転移、及び鼻咽頭癌を含むがこれらに限定されない液性及び固形癌の治療に適用される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される派生エフェクター細胞以外に、治療的使用のための組合せは、化学療法剤又は放射性部分を含む１つ又は複数の追加の治療薬を含む。化学療法剤とは、細胞傷害性抗腫瘍剤、すなわち、腫瘍細胞を優先的に殺滅するか、急速に増殖する細胞の細胞周期を破壊するか、又は幹癌細胞を根絶することが見出され、腫瘍性細胞の成長を防止又は低減するために治療的に使用される化学剤を指す。化学療法剤はまた、抗腫瘍性又は細胞傷害性の薬物又は薬剤と称されることもあり、当技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有薬剤、インターフェロン、及びインターロイキンを含む。例示的な化学療法剤には、アルキル化剤（シクロホスファミド、メクロレタミン、メファリン、クロランブシル、ヘアメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン）、アニメタボライト（メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン）、エピポドフィロトキシン（エトポシド、エトポシドオルトキノン、及びテニポシド）、抗生物質（ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ビサントレン、アクチノマイシンＤ、プリカマイシン、ピューロマイシン、及びグラミシジンＤ）、パクリタキセル、コルヒチン、サイトカラシンＢ、エメチン、メイタンシン、及びアムサクリンが含まれるが、これらに限定されない。追加の薬剤には、アミングルテチミド、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、アルトレタミン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、アレムツザマブ、アルトレタミン、アナストロゾール、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、セツキシマブ、クラドリビン、クロフラビン、シタラビン、ダカルバジン、デニロイキンジフチトクス、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドロモスタノロン、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エチニルエストラジオール、エキセメスタン、フロクスウリジン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ（２ａ、２ｂ）、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、メクロレタミン、メゲストロール、メルファリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、ミトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペガデマーゼ、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロサン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トペテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビノレルビン、及びゾレドロネートが含まれる。他の好適な薬剤は、化学療法剤又は放射線療法剤として承認され、当技術分野で知られているものを含む、ヒトでの使用が承認されている薬剤である。そのような薬剤は、いくつかの標準的な医師及び腫瘍学者の参考文献のいずれか（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ´ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｙ．，１９９５）又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト（ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ｄｒｕｇｌｉｓｔｆｒａｒｎｅ．ｈｔｍ）を通じて参照でき、両方とも随時更新される。
サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドマイド等の免疫調節薬（ＩＭｉＤ）は、ＮＫ細胞及びＴ細胞の両方を刺激する。本明細書で提供されるように、ＩＭｉＤは、癌治療のためのｉＰＳＣ由来の治療用免疫細胞とともに使用され得る。
治療用組成物に含まれるｉＰＳＣ由来造血系統細胞の単離された集団以外に、患者への投与に好適な組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容される担体（添加剤）及び／若しくは希釈剤（例えば、薬学的に許容される培地、例えば、細胞培養培地）、又は他の薬学的に許容される構成要素を更に含み得る。薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は、部分的には、投与される特定の組成物によって、並びに治療用組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の治療用組成物の多種多様な好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．１９８５を参照されたく、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来のＴ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来のＮＫ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来のＣＤ３４＋ＨＥ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来のＨＳＣを含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来のＭＤＳＣを含む。本明細書に開示されるｉＰＳＣ由来造血系統細胞の集団を含む治療用組成物は、静脈内、腹腔内、経腸、又は気管投与法によって別個に、又は他の好適な化合物と組み合わせて投与して、所望の治療目標に影響を及ぼすことができる。
これらの薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は、治療用組成物のｐＨを約３～約１０の間に維持するのに十分な量で存在することができる。したがって、緩衝剤は、全組成物の重量対重量ベースで約５％ほどであり得る。限定されないが、塩化ナトリウム及び塩化カリウム等での電解質もまた、治療用組成物に含まれ得る。一態様では、治療用組成物のｐＨは、約４～約１０の範囲である。代替的に、治療用組成物のｐＨは、約５～約９、約６～約９、又は約６．５～約８の範囲である。別の実施形態では、治療用組成物は、該ｐＨ範囲のうちの１つのｐＨを有する緩衝液を含む。別の実施形態では、治療用組成物は、約７のｐＨを有する。代替的に、治療用組成物は、約６．８～約７．４の範囲のｐＨを有する。更に別の実施形態では、治療用組成物は、約７．４のｐＨを有する。
本発明はまた、部分的に、本発明の特定の組成物及び／又は培養物における薬学的に許容される細胞培養培地の使用を提供する。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。一般的に言えば、本発明の実施形態によるｉＰＳＣ由来免疫細胞の維持、成長、及び／又は健康を支持する任意の培地は、医薬細胞培養培地としての使用に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清及び／又はフィーダーフリー培地である。様々な実施形態では、無血清培地は動物質を含まず、任意選択でタンパク質を含まなくてもよい。任意選択で、培地は、生物学的製剤に許容される組換えタンパク質を含み得る。動物質を含まない培地とは、構成要素が動物以外の供給源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地で天然の動物性タンパク質に取って代わり、栄養素は、合成、植物、又は微生物源から得られる。対照的に、タンパク質を含まない培地は、実質的にタンパク質を含まないと定義される。当業者は、上記の培地の例が例示的であり、本発明での使用に好適な培地の配合を決して制限するものではなく、当業者に既知の利用可能な多くの好適な培地があることを理解するであろう。
単離された多能性幹細胞由来造血系統細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｏＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、ＨＳＣ、Ｂ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞、又は間葉系間質細胞を有し得る。いくつかの実施形態では、単離された多能性幹細胞由来造血系統細胞は、約９５％～約１００％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｏＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、又は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞療法を必要とする対象を治療するための、約９５％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｏＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、又は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の単離された集団を有する組成物等の、精製されたＴ細胞又はＮＫ細胞を有する治療用組成物を提供する。
一実施形態では、組合せ細胞療法は、治療用タンパク質又はペプチド、及びゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞の集団を含み、派生ＮＫ細胞は、本明細書に記載の１つ又は複数の小化合物処置で調節される。更にいくつかの追加の実施形態では、組合せ細胞療法は、ダラツムマブ、イサツキシマブ、又はＭＯＲ２０２、及び表２に列記された遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞又はＴ細胞の集団を含み、派生ＮＫ細胞又はＴ細胞は、提供されるエンドドメインを有する第１のＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、ｈｎＣＤ１６、第２のＣＡＲ並びに１つ又は複数の外因性のサイトカインを含む。
当業者が理解するように、本明細書の方法及び組成に基づいてｉＰＳＣに由来する自家及び同種異系の造血系統細胞の両方を、上述の細胞治療に使用することができる。自家移植の場合、由来造血系統細胞の単離された集団は、患者と完全又は部分的にＨＬＡ一致する。別の実施形態では、由来造血系統細胞は、対象とＨＬＡが一致せず、由来造血系統細胞は、ＨＬＡ Ｉ及びＨＬＡ ＩＩヌルを有するＮＫ細胞又はＴ細胞である。
いくつかの実施形態では、治療用組成物中の由来造血系統細胞の数は、用量当たり少なくとも０．１ｘ１０５細胞、少なくとも１ｘ１０５細胞、少なくとも５ｘ１０５細胞、少なくとも１ｘ１０６細胞、少なくとも５ｘ１０６細胞、少なくとも１ｘ１０７細胞、少なくとも５ｘ１０７細胞、少なくとも１ｘ１０８細胞、少なくとも５ｘ１０８細胞、少なくとも１ｘ１０９細胞、又は少なくとも５ｘ１０９細胞である。いくつかの実施形態では、治療用組成物中の由来造血系統細胞の数は、用量当たり約０．１ｘ１０５細胞～約１ｘ１０６細胞、用量当たり約０．５ｘ１０６細胞～約１ｘ１０７細胞、用量当たり約０．５ｘ１０７細胞～約１ｘ１０８細胞、用量当たり約０．５ｘ１０８細胞～約１ｘ１０９細胞、用量当たり約１ｘ１０９細胞～約５ｘ１０９細胞、用量当たり約０．５ｘ１０９細胞～約８ｘ１０９細胞、用量当たり約３ｘ１０９細胞～約３ｘ１０１０細胞、又はその間の任意の範囲である。一般に、６０ｋｇの患者の場合、１ｘ１０８細胞／用量は、１．６７ｘ１０６細胞／ｋｇに変換される。
一実施形態では、治療用組成物中の由来造血系統細胞の数は、血液の部分的又は単一の臍帯中の免疫細胞の数であるか、又は少なくとも０．１ｘ１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５ｘ１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１ｘ１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも５ｘ１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０ｘ１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．７５ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．２５ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．５ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．７５ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２．５ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも４ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも５ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１５ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２０ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２５ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３０ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、１ｘ１０８細胞／ｋｇ体重、５ｘ１０８細胞／ｋｇ体重、又は１ｘ１０９細胞／ｋｇ体重である。
一実施形態では、ある用量の由来造血系統細胞が対象に送達される。例示的な一実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、少なくとも２ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも３ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも４ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも５ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも６ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも７ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも８ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも９ｘ１０６細胞／ｋｇ、又は少なくとも１０ｘ１０６細胞／ｋｇ、又はそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在するすべての細胞用量を含む。
別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約２ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４ｘ１０６細胞／ｋｇ、約５ｘ１０６細胞／ｋｇ、約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、約９ｘ１０６細胞／ｋｇ、若しくは約１０ｘ１０６細胞／ｋｇ、又はそれ以上の細胞／ｋｇ（介在するすべての細胞用量を含む）である。
別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約２ｘ１０６細胞／ｋｇ～約１０ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３ｘ１０６細胞／ｋｇ～約１０ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４ｘ１０６細胞／ｋｇ～約１０ｘ１０６細胞／ｋｇ、約５ｘ１０６細胞／ｋｇ～約１０ｘ１０６細胞／ｋｇ、２ｘ１０６細胞／ｋｇ～約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、２ｘ１０６細胞／ｋｇ～約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、２ｘ１０６細胞／ｋｇ～約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、３ｘ１０６細胞／ｋｇ～約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、３ｘ１０６細胞／ｋｇ～約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、３ｘ１０６細胞／ｋｇ～約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、４ｘ１０６細胞／ｋｇ～約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、４ｘ１０６細胞／ｋｇ～約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、４ｘ１０６細胞／ｋｇ～約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、５ｘ１０６細胞／ｋｇ～約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、５ｘ１０６細胞／ｋｇ～約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、５ｘ１０６細胞／ｋｇ～約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、又は６ｘ１０６細胞／ｋｇ～約８ｘ１０６細胞／ｋｇ（介在するすべての細胞用量を含む）である。
いくつかの実施形態では、由来造血系統細胞の治療的使用は、単回投与治療である。いくつかの実施形態では、由来造血系統細胞の治療的使用は、複数回投与治療である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、毎日、３日ごと、７日ごと、１０日ごと、１５日ごと、２０日ごと、２５日ごと、３０日ごと、３５日ごと、４０日ごと、４５日ごと、若しくは５０日ごと、又はその間の任意の日数に１回の投与である。
本発明の由来造血系統細胞の集団を含む組成物は、無菌であり得、ヒト患者への投与に好適であり、投与の準備ができている（すなわち、更に処置することなく投与することができる）。投与の準備ができている細胞ベースの組成物は、組成物が、対象への移植又は投与の前に、任意の更なる処置又は操作を必要としないことを意味する。他の実施形態では、本発明は、１つ又は複数の薬剤を投与する前に拡大及び／又は調節される、由来造血系統細胞の単離された集団を提供する。組換えＴＣＲ又はＣＡＲを発現するように遺伝子操作された由来造血系統細胞の場合、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号に記載される方法を使用して、細胞を活性化及び拡大することができる。
ある特定の実施形態では、由来造血系統細胞の一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、又は表面に結合され得る。表面に結合される場合、薬剤は同じ表面（つまり、「シス」形成で）、又は別個の表面に（つまり、「トランス」形成で）結合され得る。代替的に、一方の薬剤を表面に結合させ、もう一方の薬剤を溶液中に存在させることもできる。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合され得、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、又は表面に結合される。ある特定の実施形態では、両方の薬剤は、溶液中にあり得る。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であり、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞、又は本発明の実施形態ではＴリンパ球を活性化及び拡大する際に使用することが企図されている人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について米国特許出願公開第２００４／０１０１５１９号及び同第２００６／００３４８１０号に開示される等の薬剤に結合する抗体若しくは他の結合剤等の表面に架橋され得る。
投与量、頻度、及びプロトコルのある程度の変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に発生する。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象に適切な用量、頻度、及びプロトコルを決定する。
実施例
以下の実施例は、例示ために提供され、限定のためではない。
実施例１－材料及び方法
様々なプロモーターの制御下で、異なるセーフハーバー遺伝子座組み込み戦略と組み合わせて自殺系を効果的に選択し、試験するために、単一細胞の継代及び高スループットの９６ウェルプレートベースのフローサイトメトリ選別を可能にする、出願人独自のｈｉＰＳＣプラットフォームを使用し、単一又は複数の遺伝子調節によるクローンｈｉＰＳＣの誘導を可能にする。
小分子培養におけるｈｉＰＳＣの維持：培養のコンフルエントが７５％～９０％に達すると、ｈｉＰＳＣを単一細胞として日常的に継代した。単一細胞の解離では、ｈｉＰＳＣをＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で１回洗浄し、アキュターゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で３７°Ｃで３～５分間処置した後、ピペッティングして単一細胞の解離を確実にした。次いで、単一細胞懸濁液を従来の培地と等量で混合し、２２５ｘｇで４分間遠心分離し、ＦＭＭに再懸濁し、マトリゲルでコーティングした表面にプレーティングした。継代は、典型的には、１：６～１：８で、３７°Ｃで２～４時間、マトリゲルで前もってコーティングした組織培養プレートに移し、２～３日ごとにＦＭＭを供給した。細胞培養は、３７℃及び５％ＣＯ２に設定された加湿インキュベーターで維持された。
ＺＦＮによるヒトのｉＰＳＣ操作、目的のモダリティの標的化された編集のためのＣＲＩＳＰＲ：例としてＲＯＳＡ２６標的化された挿入を使用して、ＺＦＮを介したゲノム編集では、ＡＡＶＳ１標的化された挿入のために、２．５ｕｇのＺＦＮ－Ｌ（ＦＴＶ８９３）、２．５ｕｇのＺＦＮ－Ｒ（ＦＴＶ８９４）、及び５ｕｇのドナー構築物の混合物を２００万個のｉＰＳＣにトランスフェクトした。ＣＲＩＳＰＲを介したゲノム編集では、ＲＯＳＡ２６標的化された挿入のために、５ｕｇのＲＯＳＡ２６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９（ＦＴＶ９２２）及び５ｕｇのドナー構築物の混合物を２００万個のｉＰＳＣにトランスフェクトした。トランスフェクションは、パラメーター１５００Ｖ、１０ｍｓ、３パルスを使用して、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行われた。トランスフェクション後の２日目又は３日目に、プラスミドに人工プロモータードライバーＧＦＰ及び／又はＲＦＰ発現カセットが含まれている場合、フローサイトメトリを使用してトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクション後の４日目に、ピューロマイシンを最初の７日間は０．１ｕｇ／ｍｌの濃度で、７日後は０．２ｕｇ／ｍｌの濃度で培地に添加して、標的化された細胞を選択した。ピューロマイシンの選択中、細胞は１０日目にマトリゲルでコーティングされた新しいウェルに継代された。ピューロマイシン選択の１６日目以降に、生存細胞をＧＦＰ＋ｉＰＳ細胞の割合についてフローサイトメトリで分析した。
ゲノム編集されたｉＰＳＣのバルク選別及びクローン選別：ＺＦＮ又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用したゲノム標的化された編集を伴うｉＰＳＣは、ピューロマイシン選択の２０日後に、ＧＦＰ＋ＳＳＥＡ４＋ＴＲＡ１８１＋ｉＰＳＣのバルク選別及びクローン選別された。単一細胞で解離した標的化されたｉＰＳＣプールを、最適な性能のために新しく作製された、ハンクス平衡塩溶液（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）、４％ウシ胎仔児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を含む冷却染色緩衝液に再懸濁した。ＳＳＥＡ４－ＰＥ、ＴＲＡ１８１－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む、コンジュゲートされた一次抗体を細胞溶液に添加し、氷上で１５分間インキュベートした。すべての抗体は、１００万個の細胞当たり１００μＬの染色緩衝液に７μＬで使用された。溶液を染色緩衝液で１回洗浄し、２２５ｇで４分間スピンダウンし、１０μＭのチアゾビブンを含む染色緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリ選別のために氷上で維持した。フローサイトメトリ選別は、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。バルク選別では、ＧＦＰ＋ＳＳＥＡ４＋ＴＲＡ１８１＋細胞をゲーティングし、７ｍｌのＦＭＭで満たされた１５ｍｌの標準チューブに選別した。クローン選別では、選別された細胞を、ウェル当たり３イベントの濃度で、１００μＭのノズルを使用して９６ウェルプレートに直接排出した。各ウェルには、５μｇ／ｍＬのフィブロネクチン及び１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を補充した２００μＬのＦＭＭを予め充填し、５ｘマトリゲルで前もって一晩コーティングした。５ｘマトリゲルプレコーティングには、１アリコートのマトリゲルを５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に添加し、次いで、適切な再懸濁を可能にするために４°Ｃで一晩インキュベートし、最後にウェル当たり５０μＬで９６ウェルプレートに添加した後、３７°Ｃで一晩インキュベートすることが含まれる。５ｘマトリゲルは、各ウェルに培地を添加する直前に吸引される。選別が完了したら、インキュベーションの前に、９６ウェルプレートを２２５ｇで１～２分間遠心分離した。プレートを７日間静置した。７日目に、１５０μＬの培地を各ウェルから除去し、１００μＬのＦＭＭと交換した。選別後１０日目に、ウェルに追加の１００μＬのＦＭＭを再供給した。コロニー形成は早くも２日目に検出され、ほとんどのコロニーは選別後７～１０日で拡大した。最初の継代では、ウェルをＰＢＳで洗浄し、３０μＬのアキュターゼで、３７℃で約１０分間解離させた。アキュターゼ処理の延長の必要性は、長期間培養でアイドリング状態にあったコロニーのコンパクトさを反映している。細胞が解離していることが認められた後、２００μＬのＦＭＭを各ウェルに添加し、数回ピペッティングしてコロニーを破壊する。解離したコロニーを、５ｘマトリゲルで前もってコーティングした９６ウェルプレートの別のウェルに移し、次いでインキュベーション前に２２５ｇで２分間遠心分離する。この１：１の継代は、拡大する前に初期のコロニーを広げるために行われる。その後の継代は、３～５分間のアキュターゼ処置、及びＦＭＭ中の１ｘマトリゲルで前もってコーティングされたより大きなウェルへの７５～９０％のコンフルエンシーでの１：４～１：８の拡大で日常的に行われた。各クローン細胞株は、ＧＦＰ蛍光レベル及びＴＲＡ１－８１発現レベルについて分析された。１００％に近いＧＦＰ＋及びＴＲＡ１８１＋のクローン株を、更なるＰＣＲスクリーニング及び分析のために選択した。フローサイトメトリ分析は、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ８ ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で行われ、Ｆｌｏｗｊｏ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を使用して分析された。
実施例２－小化合物で処置されたｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞のインビトロ及びインビボ機能プロファイリング
ＣＤ１９に特異的なキメラ抗原受容体を発現するｉＮＫ細胞を、分化後の増殖の最後の５日間、増殖培地にＩＬ１５又はＩＬ２を補充せずに、デキサメタゾン又はデキサメタゾンとＩＬ７で処置した。次に、フローサイトメトリ染色により、グランザイムＢレベルを対照の未処置ｉＮＫ細胞と比較した。図１Ａの幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）は、デキサメタゾン又はデキサメタゾンとＩＬ７で処置されたｉＮＫ細胞におけるグランザイムＢタンパク質レベルが、未処置の対照と比較して減少していることを示している。デキサメタゾンで処置された初代ＮＫ細胞を使用して、グランザイムＢ発現の低下によって反映される同様の機能抑制が観察された。図１Ｂに示すように、末梢血ＮＫ細胞は、グランザイムレベルを上方制御することが知られているＩＬ１５、あるいは１又は１０μＭのデキサメタゾンのいずれかで処置した。デキサメタゾンの追加の濃度レベルを試験し、効果が特に濃度に依存しないことが示している。グランザイムＢレベルはフローサイトメトリ染色によって決定され、幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）は図１Ｂに示され、グランザイムＢの発現が低下していることを示しており、したがって、処置された初代ＮＫ細胞の細胞機能が抑制されている。
ＣＤ１９－ＣＡＲを発現するｉＮＫ細胞を、デキサメタゾン、レナリドミド、ラパマイシン、又はデキサメタゾンとレナリドミドとの組合せで５日間処置し、凍結保存した。細胞を解凍し、Ｎａｌｍ６（ＣＤ１９＋）又はＮａｌｍ６ ＣＤ１９ノックアウト（１９ｋｏ）細胞に対する４時間の細胞毒性アッセイでエフェクターとして直ちに使用し、細胞毒性を評価した。ＥＣ５０は非線形回帰によって決定され、ここで、ＥＣ５０＝５０％の特異的細胞毒性を達成するために必要なＥ：Ｔ比であり、ＥＣ５０が低いほど細胞毒性が高いことを示す。図２Ａに示すように、ＣＡＲ発現ｉＮＫ細胞の小分子処置は、抗原特異的認識を改善し、デキサメタゾンは、抗原陽性と陰性標的との間の最良の識別を示している。インビトロでの非特異的相互作用が少ないことが、インビボでのエフェクター細胞のより良い生体内分布を促進し、それが細胞の有効性に有益であるかどうかはまだ分からない。
デキサメタゾン、レナリドミド、ラパマイシン、又はデキサメタゾンとレナリドミドとを組み合わせて５日間処置し、凍結保存、解凍し、細胞毒性アッセイを開始する前に一晩休止させたＣＤ１９－ＣＡＲを発現するｉＮＫ細胞を使用して、ｉＮＫ細胞の細胞毒性の追加評価を行った。同様に、ＥＣ５０は非線形回帰によって決定され、ここで、ＥＣ５０＝５０％の特異的細胞毒性を達成するために必要なＥ：Ｔ比であり、ＥＣ５０が低いほど細胞毒性が高いことを示す。図２Ｂに示すように、分化後のｉＮＫ細胞増殖中の小化合物処置は、時間の経過とともにより良い機能回復をもたらし、デキサメタゾンはラパマイシン処置よりも優れており、デキサメタゾン／レナリドミド併用処置は、凍結保存前に処置されなかった対照細胞よりも優れている。
ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ殺傷アッセイを実施するために、ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞を指定の化合物で処置し、凍結保存し、解凍し、Ｒａｊｉ Ｂ細胞リンパ腫株に対する２４時間の細胞毒性アッセイのエフェクターとして使用した。結果を図３Ａに示し、各時点で残っている標的細胞の正規化された数であり、標的単独＝１００であり、標的数が少ないほど細胞毒性が高くなる。曲線上の面積（ＡＯＣ）はまた、Ｒａｊｉ及びＲａｊｉ ＣＤ１９ノックアウト（ＣＤ１９ＫＯ）細胞に対する細胞毒性について計算した（図３Ｂ）。ＡＯＣが大きいほど、細胞毒性の増加に対応する。図３Ａ及び３Ｂに示されるように、デキサメタゾン単独、又はレナリドミドとの組合せは、ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞で最高の腫瘍殺傷性能を示し、次にレノリダミド処置及びＡＱＸ処置細胞が続く。２Ａ及び２Ｂの細胞毒性アッセイと一致して、デキサメタゾン処置の結果として、抗原陽性標的と陰性標的との間のより良好な識別がもたらされる（図３Ｂを参照）。比較すると、前処置なしで凍結保存及び解凍されたＣＡＲ－ｉＮＫ細胞は、腫瘍細胞の増殖を効果的に制御しない。
細胞のインビボ有効性に対する化合物処置の影響を評価するために、ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞を、凍結保存前の培養の最後の５日間、示された化合物で処置した。次に、凍結保存した対照細胞又は化合物で処置したＣＤ１９－ＣＡＲ ｉＮＫ細胞を凍結ストックから解凍し、１日前に１Ｅ５Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ細胞を移植したＮＳＧマウスの処置に使用した。腫瘍の進行は、７日目及び１４日目に生物発光イメージングによってモニタリングした。図４Ａに示すように、デキサメタゾン単独又はデキサメタゾンとレナリドミドの組合せを使用したｉＮＫ培養物の化合物処置は、インビボでの有効性を改善する。
凍結保存前の培養の最後の５日間デキサメタゾンで処置されたＣＤ１９－ＣＡＲ ｈｎＣＤ１６ｉＮＫ細胞は、１Ｅ５ Ｒａｊｉルシフェラーゼ細胞を１日前に移植されたＮＳＧマウスを使用してＢ細胞リンパ腫のインビボモデルで試験した。培養中及び凍結前にデキサメタゾンで処置した凍結保存ＣＤ１９－ＣＡＲ ｈｎＣＤ１６ ｉＮＫ細胞を解凍し、接種後１日においてリツキシマブ（０．３ｕｇ／マウス）と組み合わせて、接種後１、４、及び７日目のＲａｊｉルシフェラーゼ接種マウスに注入した。腫瘍の進行は、２、７日目及び１５日目に生物発光イメージングによってモニタリングした。図４Ｂに示すように、デキサメタゾンで処置されたリツキシマブとＣＤ１９－ＣＡＲ ｈｎＣＤ１６ ｉＮＫ細胞との組合せは、該ｉＮＫ細胞なしのリツキシマブ単独での処置よりも腫瘍増殖の改善された制御を提供した。
凍結保存前の培養の最後の５日間デキサメタゾンで処置されたＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ ｉＮＫ細胞は、ＭＩＣＡを発現するように操作されたＢ１６メラノーマ細胞を、１日前にＩＶ移植したＮＳＧマウスを使用した固形腫瘍転移のインビボモデルで試験した。培養中及び凍結前にデキサメタゾンで処置された凍結保存されたＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ ｉＮＫ細胞を解凍し、腫瘍移植マウスに注入した。腫瘍移植の１４日後、肺の腫瘍結節の数（図４Ｃ）及び脾臓に存在するｉＮＫ細胞の数（図４Ｄ）を定量化した。図４Ｃ及び４Ｄに示されるように、デキサメタゾンのみを使用したｉＮＫ培養物の化合物処置は、凍結保存前に処置されなかったｉＮＫ細胞と比較して、腫瘍増殖制御及びｉＮＫ持続性を改善した。
インビボでのｉＮＫ細胞の持続性を更に実証するために、インビトロで増殖した末梢血ＮＫ細胞、デキサメタゾンなしで培養されたｉＮＫ細胞、又はデキサメタゾンで培養されたｉＮＫ細胞を、腫瘍のない状態でＮＳＧマウスに約１．２Ｅ７細胞を週３回注射した（試験１、８、及び１５日目）。末梢血に注入された細胞の持続性は、８、１５、１６、２２、２９、３６、及び４３日目にフローサイトメトリによって評価した。図４Ｅに示すように、デキサメタゾンのみを使用したｉＮＫ培養物の化合物処置は、試験期間を通してｉＮＫ細胞の持続性を改善した。
ＲＮＡｓｅｑ（商標）を使用して差次的遺伝子解析を実施して、未処置の対照ｉＮＫ細胞と、分化後の増殖中にデキサメタゾン又はデキサメタゾン／レノリダミド組合せで処置したｉＮＫ細胞との間の遺伝子発現プロファイルを比較した。図５に示すように、デキサメタゾン又はデキサメタゾンとレノリダミドによるｉＮＫ細胞の処置は、特有の遺伝子発現プロファイルを促進する。デキサメタゾンで処置されたｉＮＫ細胞の場合、未処置のｉＮＫ細胞と比較して最も差次的に発現する遺伝子には、少なくともＳＰＯＣＫ２、ＰＴＧＤＳ、ＩＬ７Ｒ、ＬＣＮＬ１、ＲＡＳＧＲＰ２、ＳＭＡＰ２等の上方制御された遺伝子並びにＪＣＨＡＩＮ、ＫＬＦ３、ＫＬＲＢ１、ＩＧＦＢＰ４、及びＮＵＣＢ２等の下方制御された遺伝子が含まれる。これらの遺伝子に関する既知の情報を表４に簡単に説明する。
Figure 2023505206000008
 実施例３－小化合物で処置されたｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のインビトロ及びインビボ機能プロファイリング
ＣＤ１９に特異的なキメラ抗原受容体を発現するｉＴ細胞を、ｉＰＳＣからの分化後に４１ＢＢＬ及びＩＬ２１又はＣＤ１９ｌｏｗを発現するフィーダー細胞を使用して、増殖の最後の５日間デキサメタゾン（ＩＬ７との組合せあり又はなし）で処置した。デキサメタゾンで培養された対照ＣＡＲ－ｉＴ細胞又はＣＡＲ－ｉＴ細胞の培養物は、ＲＮＡｓｅｑによって評価され、示差的遺伝子セット濃縮分析を実行した。デキサメタゾンによるｉＴ細胞の処置は、独自の遺伝子発現プロファイルを促進する。図６に示すように、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ－７Ｒ及びＩＬ２ＲＡはデキサメタゾン処置によって高度に誘導されたが、ＣＸＣＲ６及びＣＳＦ２ＲＢはデキサメタゾン処置なしのｉＴ細胞で高度に発現されている。ＩＬ７を伴う（対照）又は伴わないデキサメタゾン処置は、ＣＡＲ－ｉＴ細胞の増殖倍率に有意差を有さなかった（図７Ａ）。次に、様々な細胞表面マーカをフローサイトメトリで評価した。デキサメタゾン処置中のＩＬ７の不在によって表現型は影響を受けず（図７Ｂ－７Ｃ）、更に、ＣＡＲ－ｉＴ細胞の増殖中にデキサメタゾンをＩＬ７に補充する必要がないことを示している。
ＣＡＲ－ｉＴ細胞は、凍結保存前の培養の最後の５日間、デキサメタゾン処置の有無にかかわらず増殖した。凍結保存対照又はデキサメタゾン処置ＣＤ１９－ＣＡＲ ｉＴ細胞を凍結ストックから解凍し、０日目において１Ｅ５ Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ細胞を３日前に静脈注射されたＮＳＧ雌マウス（各郡Ｎ＝５）に、３、６、及び９日目に静脈投与した。腫瘍の進行は、腫瘍注射後７、１４、及び２０日目に生物発光イメージングによってモニタリングした。デキサメタゾンで処置されたＣＡＲ－ｉＴ細胞（図８Ｂ）を、培養物中のデキサメタゾン処置なしの対照細胞（図８Ａ）とｉｖ／ｉｖインビボ有効性について比較した。示されているように、デキサメタゾン処置は、ｉＴインビボ有効性を改善した。図９Ａ～９Ｂは、デキサメタゾン処置を施したＣＡＲ－ｉＴ細胞が、インビボでの腫瘍制御及びクリアランスにおいて、初代ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも優れた性能を発揮することを示している。図９Ａ～９Ｂのデータを生成するために使用したマウスは、フローサイトメトリによってヒト及び腫瘍細胞を分析するために、腫瘍注射後２４、３１、３５日目に屠殺にされ、図１０Ａ～１０Ｂに示されるように、デキサメタゾンで処置されたＣＡＲ－ｉＴ細胞は、リンパ性白血病の全身性ゼノグラフィマウスモデルのマウス骨髄組織に存続し、初代ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して生存率が延長され（生存日数＞８０日、ｐ＞０．１）、ｉＰＳＣ由来のエフェクター細胞のインビボ有効性におけるデキサメタゾン処置の影響を更に確認する。
更なるサイトカイン離脱試験（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｓｔｕｄｙ）では、ＣＡＲ－ｉＴ細胞をデキサメタゾンのみ（サイトカインなし）、デキサメタゾンとサイトカインＩＬ７のみ（ＩＬ２又はＩＬ１５なし）、又はＩＬ２、ＩＬ７、及びＩＬ１５の様々なサイトカインの組合せで培養した（データは示していない）。７日間の培養後、細胞の増殖及び拡大を評価した。図１１Ａ～１１Ｂに示されるように、デキサメタゾンで処置されたＣＡＲ－ｉＴ細胞は、デキサメタゾン＋ＩＬ７で処置されたＣＡＲ－ｉＴ細胞のものと同様の細胞表現型を示した。図１１Ｃに示すように、サイトカインの非存在下でのデキサメタゾン治療は、ＩＬ２、ＩＬ７及びＩＬ１５の様々な組合せによるデキサメタゾン治療と比較して、はるかに低いＣＡＲ－ｉＴ細胞増殖を有していた。デキサメタゾン単独及びデキサメタゾン＋ＩＬ７で処置されたＣＡＲ－ｉＴ細胞を、０日目において、１Ｅ５ Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ細胞で３日前に静脈内注射されたＮＳＧ雌マウス（各群でＮ＝５）に、腫瘍移植後３、６、及び９日目に静脈内投与した。腫瘍の進行は、腫瘍注射後２、７、１４、２１、２８及び３５日目に生物発光イメージングによってモニタリングした。図１１Ｄに示すように、デキサメタゾンのみ（サイトカインなし）及びデキサメタゾン＋ＩＬ７で処置されたＣＡＲ－ｉＴ細胞を、培養物中のデキサメタゾン処置なしの対照細胞とｉｖ／ｉｖインビボ有効性について比較した。インビトロ増殖速度が低いにもかかわらず、デキサメタゾンで処置されたＣＡＲ－ｉＴ細胞は、少なくとも驚くべきことに、デキサメタゾン＋ＩＬ７で処置されたＣＡＲ－ｉＴ細胞と同様にインビボでの有効性を有し、処置されたＣＡＲ－ｉＴ細胞の両方が未処置の細胞（デキサメタゾン又はサイトカインなし）を超える改善した有効性を示した。
当業者は、本明細書に記載の方法、組成物、及び産生物が例示的な実施形態の代表であり、本発明の範囲に対する限定として意図されていないことを容易に理解するであろう。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示される本開示に対して様々な置換及び修正を行うことができることは当業者には容易に明らかであろう。
本明細書で言及されるすべての特許及び刊行物は、本開示が属する当業者のレベルを示している。すべての特許及び刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に例示的に記載されている本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素、制限がなくても実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各場合において、「含む」、「本質的にからなる」、及び「からなる」という用語のいずれかを、他の２つの用語のいずれかで置き換えることができる。使用されている用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定ではなく、そのような用語及び表現の使用において、示され説明された特色又はその一部の同等物を除外する意図はないが、特許請求される本開示の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。したがって、本開示は、好ましい実施形態及び任意選択の特色によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の修正及び変形は、当業者によって想到され得、そのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると考えられると理解されるべきである。

Claims (37)

  1. 免疫細胞又はその集団を製造する方法であって、前記免疫細胞に、デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、あるいはそれらの誘導体又は類似体のうちの少なくとも１つを含む、小化合物処置を行って、それにより、同じ小化合物処置なしの対応する免疫細胞と比較して、解凍後の細胞毒性が増強された免疫細胞を得る、免疫細胞又はその集団を製造する方法。
  2. 前記免疫細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化した派生エフェクター免疫細胞であり、前記エフェクター免疫細胞が、派生ＣＤ３４細胞、派生造血幹及び前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆細胞、派生ＮＫ細胞前駆細胞、派生Ｔ細胞、派生ＮＫＴ細胞、派生ＮＫ細胞、派生Ｂ細胞、あるいは対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ又は複数の機能的特徴を有する派生エフェクター細胞を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｉＰＳＣが、以下の編集、
    （ｉ）第１の標的特異性を有する第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、
    （ｉｉ）ＣＤ３８ノックアウト、
    （ｉｉｉ）天然の対応する細胞と比較した、ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損、
    （ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの発現の導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、
    （ｖ）ＣＤ１６又はそのバリアント、
    （ｖｉ）第２の標的特異性を有する第２のＣＡＲ、
    （ｖｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的又は完全なペプチドを含むシグナル伝達複合体、
    （ｖｉｉｉ）表２に列記される遺伝子型のうちの少なくとも１つ、
    （ｉｘ）天然の対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つにおける欠失又は低減された発現、あるいは
    （ｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及び二重若しくは多重特異性又はユニバーサルエンゲージャと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入された又は増加した発現、のうちの少なくとも１つを含み、前記ｉＰＳＣから分化した前記エフェクター免疫細胞が、前記ｉＰＳＣと同じ１つ又は複数の編集を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記第１のＣＡＲが、
    （ｉ）少なくとも１つの抗原認識領域、膜貫通ドメイン、及び少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインを含むエクトドメインであって、前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、Ｔ及び／又はＮＫ細胞の活性化又は機能に特異的なシグナル伝達タンパク質の細胞質ドメインに由来する、エクトドメイン、
    （ｉｉ）疾患、病原体、液性腫瘍、又は固形腫瘍に関連する抗原に特異的に結合する抗原認識ドメイン、あるいは
    （ｉｉｉ）以下のもの、
    （ａ）ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、及びＰＤＬ１のうちのいずれか１つ、又は
    （ｂ）ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、メラノーマ抗原ファミリＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、癌－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮成長因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、及びウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）のうちのいずれか１つに特異的な抗原認識ドメインを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記第１のＣＡＲが、
    （１）細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体の部分的又は完全なペプチドであって、前記外因性サイトカイン又はその受容体が、
    （ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及びそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つ、
    （ｂ）
    （ｉ）自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの共発現と、
    （ｉｉ）ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの融合タンパク質と、
    （ｉｉｉ）切断又は排除されたＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインを有するＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質と、
    （ｉｖ）ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインの融合タンパク質と、
    （ｖ）ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒβの融合タンパク質と、
    （ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが、天然であるか、若しくは改変されている、融合タンパク質と、
    （ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体と、とのうちの少なくとも１つを含む、細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体の部分的又は完全なペプチド、
    （２）抗体又はその断片、
    （３）エンゲージャ、あるいは
    （４）チェックポイント阻害剤、を共発現するバイシストロニック構築物に含まれる、請求項３に記載の方法。
  6. 前記免疫細胞の前記小化合物処置が、前記免疫細胞の凍結保存の前又は後である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記方法が、前記小化合物処置に供された前記免疫細胞を凍結保存することを更に含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記凍結保存が、前記処置の１つ又は複数の小化合物を含まないか、又は実質的に含まない、請求項７に記載の方法。
  9. 前記増強された解凍後細胞毒性が、凍結保存後に解凍された免疫細胞の増強されたインビボ有効性を含み、前記小化合物処置を有する前記解凍後免疫細胞が、同じ小化合物処置なしの解凍後の対応する免疫細胞と比較して、以下の特徴、
    （ｉ）腫瘍制御、腫瘍クリアランス、及び／又は腫瘍再発の低減における増強された能力、
    （ｉｉ）腫瘍浸透の改善、あるいは
    （ｉｉｉ）骨髄及び／又は腫瘍部位への移動能力の向上
    の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記小化合物処置が、
    （ｉ）デキサメタゾン、又はその誘導体若しくは類似体を含み、
    （ｉｉ）任意選択で、サイトカインＩＬ７を含まないか、又は本質的に含まず、ここで、前記処置中の前記免疫細胞が、Ｔ細胞であり、
    （ｉｉｉ）任意選択で、サイトカインＩＬ２及び／又はサイトカインＩＬ１５を含まないか、又は本質的に含まず、ここで、前記処置中の前記免疫細胞が、ＮＫ細胞であり、
    （ｉｖ）デキサメタゾンを含むが、サイトカインＩＬ７を含まず、
    （ｖ）サイトカインを含まないか、又は本質的に含まず、
    （ｖｉ）細胞培養中及び／又は凍結保存の前若しくは後であり、
    （ｖｉｉ）細胞をｉＰＳＣから分化させた後の免疫細胞増殖中であり、並びに／あるいは
    （ｖｉｉｉ）凍結保存の前に、約１～約１２日、又は約３～約６日続く、請求項１に記載の方法。
  11. 前記デキサメタゾンが約１０ｎＭ～約２０μＭの濃度範囲で存在する、請求項１０に記載の方法。
  12. 細胞又はその集団であって、
    （ｉ）前記細胞が、デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、及びそれらの誘導体若しくは類似体の少なくとも１つを含む小化合物処置を受けた免疫細胞であり、
    （ｉｉ）前記免疫細胞が、同じ小化合物処置なしの対応する免疫細胞と比較して、解凍後の細胞毒性が増強されている、細胞又はその集団。
  13. （ｉｉｉ）前記免疫細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化した派生エフェクター免疫細胞であり、
    （ｉｖ）前記エフェクター免疫細胞が、派生ＣＤ３４細胞、派生造血幹及び前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆細胞、派生ＮＫ細胞前駆細胞、派生Ｔ細胞、派生ＮＫＴ細胞、派生ＮＫ細胞、派生Ｂ細胞、あるいは対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ又は複数の機能的特徴を有する派生エフェクター細胞を含む、請求項１２に記載の細胞又はその集団。
  14. 前記ｉＰＳＣが、以下の編集、
    （ｉ）第１の標的特異性を有する第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、
    （ｉｉ）ＣＤ３８ノックアウト、
    （ｉｉｉ）その天然の対応する細胞と比較した、ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損、
    （ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの発現の導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、
    （ｖ）ＣＤ１６又はそのバリアント、
    （ｖｉ）第２の標的特異性を有する第２のＣＡＲ、
    （ｖｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的又は完全なペプチドを含むシグナル伝達複合体、
    （ｖｉｉｉ）表２に列記される遺伝子型のうちの少なくとも１つ、
    （ｉｘ）その天然の対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つにおける欠失又は低減された発現、あるいは
    （ｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及び二重若しくは多重特異性又はユニバーサルエンゲージャと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入された又は増加した発現、のうちの少なくとも１つを含み、前記ｉＰＳＣから分化した前記エフェクター免疫細胞が、前記ｉＰＳＣと同じ１つ又は複数の編集を含む、請求項１３に記載の細胞又はその集団。
  15. 前記第１及び第２のＣＡＲが独立して、
    （ｉ）少なくとも１つの抗原認識領域、膜貫通ドメイン、及び少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインを含むエクトドメインであって、前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、Ｔ及び／又はＮＫ細胞の活性化又は機能に特異的なシグナル伝達タンパク質の細胞質ドメインに由来する、エクトドメイン、
    （ｉｉ）疾患、病原体、液性腫瘍、又は固形腫瘍に関連する抗原に特異的に結合する抗原認識ドメイン、あるいは
    （ｉｉｉ）
    （ａ）ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、及びＰＤＬ１のうちのいずれか１つ、又は
    （ｂ）ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、メラノーマ抗原ファミリＡ １（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、癌－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮成長因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、及びウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）のうちのいずれか１つに特異的な抗原認識ドメインを含む、請求項１４に記載の細胞又はその集団。
  16. 前記第１のＣＡＲが、
    （１）細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体の部分的又は完全なペプチドであって、前記外因性サイトカイン又はその受容体が、
    （ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及びそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つ、
    （ｂ）
    （ｉ）自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの共発現と、
    （ｉｉ）ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの融合タンパク質と、
    （ｉｉｉ）切断又は排除されたＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインを有するＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質と、
    （ｉｖ）ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインの融合タンパク質と、
    （ｖ）ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒβの融合タンパク質と、
    （ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが、天然であるか、若しくは改変されている、融合タンパク質と、
    （ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体と、とのうちの少なくとも１つを含む、細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体の部分的又は完全なペプチド、
    （２）抗体又はその断片、あるいは
    （３）チェックポイント阻害剤、を共発現するバイシストロニック構築物に含まれる、請求項１４に記載の細胞又はその集団。
  17. 前記免疫細胞の前記小化合物処置が、前記免疫細胞の凍結保存の前である、請求項１２に記載の細胞又はその集団。
  18. 前記小化合物処置された免疫細胞が、
    （ｉ）凍結保存前の培地に含まれており、
    （ｉｉ）凍結保存培地に含まれており、
    （ｉｉｉ）凍結保存に存在し、又は
    （ｉｖ）凍結保存からの解凍後である、請求項１２に記載の細胞又はその集団。
  19. 前記凍結保存が、前記処置の１つ又は複数の小化合物を含まないか、又は実質的に含まない、請求項１２に記載の細胞又はその集団。
  20. 前記増強された解凍後細胞毒性が、凍結保存後に解凍された免疫細胞の増強されたインビボ有効性を含み、ここで、前記凍結保存前の前記小化合物処置を有する前記解凍後免疫細胞が、同じ小化合物処置なしの解凍後の対応する免疫細胞と比較して、以下の特徴、
    （ｉ）腫瘍制御、腫瘍クリアランス、及び／又は腫瘍再発の低減における増強された能力、
    （ｉｉ）腫瘍浸透の改善、又は
    （ｉｉｉ）骨髄及び／又は腫瘍部位への移動能力の向上
    の少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の細胞又はその集団。
  21. 前記小化合物処置が、
    （ｉ）デキサメタゾンを含み、
    （ｉｉ）任意選択で、サイトカインＩＬ７を含まないか、又は本質的に含まず、ここで、前記処置中の前記免疫細胞が、Ｔ細胞であり、
    （ｉｉｉ）任意選択で、サイトカインＩＬ２及び／又はサイトカインＩＬ１５を含まないか、又は本質的に含まず、ここで、前記処置中の前記免疫細胞が、ＮＫ細胞であり、
    （ｉｖ）デキサメタゾンを含むが、サイトカインＩＬ７を含まず、
    （ｖ）サイトカインを含まないか、又は本質的に含まず、
    （ｖｉ）細胞培養中及び／又は凍結保存の前若しくは後であり、
    （ｖｉｉ）細胞をｉＰＳＣから分化させた後の免疫細胞増殖中であり、並びに／あるいは
    （ｖｉｉｉ）凍結保存の前に、約１～約１２日、又は約３～約６日続く、請求項１２に記載の細胞又はその集団。
  22. 前記デキサメタゾンが約１０ｎＭ～約２０μＭの濃度範囲で存在する、請求項２１に記載の細胞又はその集団。
  23. 前記免疫細胞が、同じ小化合物処置なしの対応する免疫細胞と比較して、
    （ｉ）ＳＰＯＣＫ２、ＰＴＧＤＳ、ＩＬ７Ｒ、ＬＣＮＬ１、ＲＡＳＧＲＰ２、ＳＭＡＰ２、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ－７Ｒ、及びＩＬ２ＲＡの上方制御、又は
    （ｉｉ）ＪＣＨＡＩＮ、ＫＬＦ３、ＫＬＲＢ１、ＩＧＦＢＰ４、ＮＵＣＢ２、ＣＳＦ２ＲＢ、及びＣＸＣＲ６の下方制御のうちの少なくとも１つを含む１つ又は複数の差次的に発現される遺伝子を含む、請求項１２に記載の細胞又はその集団。
  24. 前記免疫細胞が培地に含まれ、前記培地が、
    （ｉ）デキサメタゾンを含み、
    （ｉｉ）レナリドミドを含み、
    （ｉｉｉ）ＡＱＸ－１１２５を含み、
    （ｉｖ）デキサメタゾン及びレナリドミドを含み、
    （ｖ）デキサメタゾンを含むが、サイトカインＩＬ７を含まず、任意選択で、前記免疫細胞がＴ細胞であり、
    （ｖｉ）デキサメタゾンを含むが、サイトカインＩＬ２又はサイトカインＩＬ１５を含まず、任意選択で、前記免疫細胞がＮＫ細胞であり、又は
    （ｖｉｉ）デキサメタゾンを含み、サイトカインを含まないか、若しくは本質的に含まない、請求項１２に記載の細胞又はその集団。
  25. 免疫細胞又はその集団を製造する方法であって、
    （ａ）遺伝子操作されたｉＰＳＣを分化させて前記免疫細胞を得ることであって、前記ｉＰＳＣが、以下の編集、
    （ｉ）第１の標的特異性を有する第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、
    （ｉｉ）ＣＤ３８ノックアウト、
    （ｉｉｉ）その天然の対応する細胞と比較した、ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損、
    （ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの発現の導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、
    （ｖ）ＣＤ１６又はそのバリアント、
    （ｖｉ）第２の標的特異性を有する第２のＣＡＲ、
    （ｖｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的又は完全なペプチドを含むシグナル伝達複合体、
    （ｖｉｉｉ）表２に列記される遺伝子型のうちの少なくとも１つ、
    （ｉｘ）その天然の対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つにおける欠失又は低減された発現、
    （ｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体又はその断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及び二重若しくは多重特異性又はユニバーサルエンゲージャと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入された又は増加した発現、のうちの少なくとも１つを含み、
    前記ｉＰＳＣから分化した前記免疫細胞が、前記ｉＰＳＣと同じ１つ又は複数の編集を含むことと、
    （ｂ）デキサメタゾン、レナリドミド、ＡＱＸ－１１２５、あるいはそれらの誘導体又は類似体の少なくとも１つを含む小化合物処置に前記免疫細胞を供することと、
    それにより、同じ小化合物処置なしの対応する免疫細胞と比較して、解凍後の細胞毒性が増強された免疫細胞を得ることと、を含む、免疫細胞又はその集団を製造する方法。
  26. （ｃ）ステップ（ｂ）からの前記処置された免疫細胞を凍結保存することを更に含む、請求項２５に記載の方法。
  27. クローンｉＰＳＣをゲノム操作して、前記第１のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをノックインすることを更に含み、任意選択で、
    （ｉ）ＣＤ３８をノックアウトすること、
    （ｉｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡをノックアウトすること、
    （ｉｉｉ）ＣＤ５８及びＣＤ５４の一方又は両方をノックアウトすること、及び／又は
    （ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ１６若しくはそのバリアント、第２のＣＡＲ、及び／又は細胞表面発現外因性サイトカイン若しくはその受容体の部分的若しくは完全なペプチドの発現を導入することを更に含む、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記ゲノム操作が、標的化された欠失、挿入、又はイン／デルを含み、前記ゲノム操作が、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同性組換え、又はこれらの方法の他の任意の機能的変異によって実施される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化した前記免疫細胞が、派生ＣＤ３４細胞、派生造血幹及び前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆細胞、派生ＮＫ細胞前駆細胞、派生Ｔ細胞、派生ＮＫＴ細胞、派生ＮＫ細胞、派生Ｂ細胞、あるいは対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ又は複数の機能的特徴を有する派生エフェクター細胞を含む、請求項２５に記載の方法。
  30. （ｄ）ステップ（ｃ）からの前記凍結保存された免疫細胞を解凍することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
  31. 請求項１２～２３のいずれか一項に記載の免疫細胞と、１つ又は複数の治療薬と、を含む、治療的使用のための組成物。
  32. 前記１つ又は複数の治療薬が、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、小ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞構成要素若しくはその置換因子、目的の１つ又は複数のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤若しくは放射性部分、又は免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む、請求項３１に記載の組成物。
  33. （ｉ）前記チェックポイント阻害剤が、
    （ａ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、若しくは阻害性ＫＩＲを含むチェックポイント分子に対する１つ又は複数のアンタゴニスト、
    （ｂ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの誘導体若しくは機能的同等物のうちの１つ又は複数、あるいは
    （ｃ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペンブロリズマブのうちの少なくとも１つ、を含むか、あるいは
    （ｉｉ）前記治療薬が、ベネトクラクス、アザシチジン、及びポマリドマイドのうちの１つ以上を含む、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記抗体が、
    （ａ）抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＧＤ２、抗ＰＤＬ１、及び／又は抗ＣＤ３８抗体；
    （ｂ）リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セルツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、及びそれらのヒト化若しくはＦｃ改変されたバリアント若しくは断片、並びにそれらの機能的同等物及びバイオシミラーのうちの１つ又は複数；あるいは
    （ｃ）ダラツムマブを含み、前記派生造血細胞が、ＣＤ３８ノックアウトを含む派生ＮＫ細胞又は派生Ｔ細胞、及び任意選択でＣＤ１６又はそのバリアントの発現を含む、請求項３２に記載の組成物。
  35. 養子細胞療法に好適な対象に前記組成物を導入することによる、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の組成物の治療的使用であって、前記対象が、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、癌、又はウイルス感染を有する、治療的使用。
  36. （ｉ）請求項２６～２９のいずれか一項に従って製造された凍結保存された免疫細胞の１つ又は複数のユニットを解凍することと、
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記解凍後免疫細胞を含む組成物を対象に投与することと、を含む、疾患を治療する方法。
  37. 前記免疫細胞が、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞、あるいは対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ又は複数の機能的特徴を有するｉＰＳＣ由来エフェクター細胞である、請求項３６に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022238962A1 (en) * 2021-05-12 2022-11-17 Crispr Therapeutics Ag Genetically engineered immune cells targeting cd70 for use in treating hematopoietic malignancies
US20230016422A1 (en) * 2021-06-23 2023-01-19 Crispr Therapeutics Ag Engineered cells with improved protection from natural killer cell killing
CA3223323A1 (en) * 2021-07-02 2023-01-05 Bahram Valamehr Protected effector cells and use thereof for allogeneic adoptive cell therapies
CA3236261A1 (en) * 2021-11-08 2023-05-11 Fate Therapeutics, Inc. Engineered effector cells and methods of enhancing ubiquitous targeting of solid tumors
TW202340453A (zh) * 2022-01-28 2023-10-16 中國大陸商杭州啟函生物科技有限公司 用於基於細胞的免疫療法的方法和組合物
WO2023196994A1 (en) * 2022-04-08 2023-10-12 Fate Therapeutics, Inc. Cells having solid tumor targeting backbone and use thereof
WO2024097911A1 (en) * 2022-11-02 2024-05-10 Fate Therapeutics, Inc. Off-the-shelf therapeutic cells with multiplex genomic engineering for targeting gprc5d
CN117305241B (zh) * 2023-11-28 2024-03-19 上海兴瑞一达生物科技有限公司 一种hiPSCs诱导分化为NK细胞的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017015427A1 (en) * 2015-07-21 2017-01-26 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
EP3405568A4 (en) * 2016-01-20 2019-12-04 Fate Therapeutics, Inc. COMPOUNDS AND METHODS FOR IMMUNOCELL MODULATION IN ADOPTIVE IMMUNOTHERAPIES
CA3013187C (en) * 2016-02-01 2023-02-28 Green Cross Lab Cell Corporation Medium composition for cryopreservation of cell and use thereof
IL310031A (en) * 2017-05-01 2024-03-01 Juno Therapeutics Inc A combination of cellular therapy and an immune modulatory compound
US20200179451A1 (en) * 2017-07-19 2020-06-11 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immune cell modulation in adoptive immunotherapies
WO2019112899A2 (en) * 2017-12-08 2019-06-13 Fate Therepeutics, Inc. IMMUNOTHERAPIES USING ENHANCED iPSC DERIVED EFFECTOR CELLS
EP3822342A4 (en) * 2018-07-13 2022-08-03 Kyoto University PROCESS FOR PRODUCTION OF GAMMA DELTA T LYMPHOCYTES

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