JP2023504149A - Ｃｄ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体 - Google Patents

Abstract

本発明はＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体、これを発現する免疫細胞などに関し、本発明に係るＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体は、ＣＤ３００ｃ抗原またはＣＤ３００ｃ受容体を発現するがん細胞を特異的に認識して直接的にがんの成長、転移などを効果的に抑制するだけでなく、ＣＤ３００ｃ抑制を通じて体内でＴ細胞などを活性化することによって副作用は減少させることができるだけでなく、がんの治療効果は増加することによって多様ながんの免疫治療剤として効果的に使われ得ると期待される。

Description

本発明はＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体、これを発現する免疫細胞、およびその用途などに関する。

がんは現代人の死亡原因の中で最も大きな比重を占めている疾患のうち一つであって、多様な原因によって発生した遺伝子の突然変異によって正常細胞が変化して発生した病気であり、正常な細胞の分化、増殖、成長形態などに従わない腫瘍のうち悪性のもの指称する。がんとは、「制御されていない細胞成長」と特徴づけられ、このような異常な細胞成長によって腫瘍（ｔｕｍｏｒ）と呼ばれる細胞塊が形成されて周囲の組織に浸透され、酷い場合には身体の他の器官に転移したりもする。がんは手術、放射線および薬物療法などで治療をしても、多くの場合に根本的な治癒には至らず、患者に苦痛を与え、最終的には死に至らせる難治性慢性疾患である。特に、最近では老年人口の増加、環境の悪化などによって世界のがん発生率は毎年５％以上増加している趨勢であり、ＷＨＯ報告書によると、今後２５年内にがんの発生人口は３千万人に増加し、このうち２千万人の人口はがんで死亡するものと推定されている。

がんの薬物治療、すなわち、抗がん剤は一般的に細胞毒性を有している化合物であって、がん細胞を攻撃して死滅させる方式でがんを治療するが、がん細胞だけでなく正常細胞にも損傷を与えるため高い副作用が出ている。したがって、副作用を減少させるために標的抗がん剤が開発された。しかし、このような標的抗がん剤の場合には副作用は低くすることができたものの、高い確率で耐性ができるという限界点を露呈した。したがって、最近では体内の免疫体系を利用して毒性および耐性による問題点を減少させる免疫抗がん剤に対する関心が急増している趨勢である。このような免疫抗がん剤の一例として、がん細胞表面のＰＤ－Ｌ１に特異的に結合してＴ細胞のＰＤ－１との結合を抑制してＴ細胞を活性化させ、がん細胞を攻撃するようにさせる免疫チェックポイント阻害剤が開発されたことがある。しかし、このような免疫チェックポイント阻害剤の場合にも効果を示すがんの種類が多様でないため、多様ながんにおいて同一に治療効果を示す新しい免疫チェックポイント阻害剤の開発が切に要望されているのが実情である（大韓民国公開特許１０－２０１６－００１６７２５）。

一方、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）はＴ細胞に抗原特異性を伝達するように設計された人工受容体であり、これらはＴ細胞を活性化させて特異的免疫性を提供するように選択された抗原特異的構成要素、膜貫通構成要素、細胞内構成要素などで構成される。最近では、このようなキメラ抗原受容体をコードする遺伝子を導入した細胞を利用してがん免疫療法、すなわち、患者からＴ細胞を採取して、このようなＴ細胞にキメラ抗原受容体をコードする遺伝子を導入して増幅し、再び患者に移入する療法を通じてがんを治療する方法に関する研究が活発に進行されているのが実情である。

本発明は前記のような従来技術上の問題点を解決するために案出されたもので、ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体、これを発現する免疫細胞、およびこれを利用したがん予防または治療用組成物などを提供することをその目的とする。

しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は以下の記載から当業界で通常の知識を有する者に明確に理解され得るであろう。

本発明はＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を提供する。

本発明の一具体例において、前記キメラ抗原受容体は好ましくは、ＣＤ３００ｃ抗原に特異的に結合する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）等を含むか、ＣＤ３００ｃ抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）を含むことによって、ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に認識し結合することができる。前記ＣＤ３００ｃ抗原は受容体に結合するために、ＣＤ３００ｃ抗原の配列全体を含んでもよくき、ＣＤ３００ｃ抗原の配列のうち細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ；ＥＣＤ）のみを含んでもよい。前記ＣＤ３００ｃ抗原の細胞外ドメイン配列は配列番号１４で表示されるアミノ酸配列を含むことができ、好ましくは前記配列番号１４と９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。また、前記抗体、単一ドメイン抗体、単鎖可変領域フラグメントなどはＣＤ３００ｃ抗原と結合するために、配列番号４、６、８、１０、または１２で表示されるアミノ酸配列を含むことができ、好ましくは前記配列番号４、６、８、１０、または１２と９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。アミノ酸配列に対する「配列相同性の％」は最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域でアミノ酸配列の一部は配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べてさらに追加または削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。しかし、ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合できる配列であればこれに制限されない。

本発明の他の具体例において、前記キメラ抗原受容体は好ましくはシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＳリンカー、膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）、細胞質内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ）等を追加で含むことができ、一般的に知られているキメラ抗原受容体の構成要素であれば、これに制限されない。

本発明のさらに他の具体例において、好ましくは前記シグナルペプチドはＣＤ８αシグナルペプチド配列を含むことができ、前記膜貫通領域はＣＤ８ヒンジ（ｈｉｎｇｅ ｏｆ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８）、ＣＤ２８膜貫通ドメイン（ＣＤ２８ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）等の配列を含むことができ、前記細胞質内領域はＣＤ２８細胞内ドメイン（ＣＤ２８ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）、ＣＤ３ζ細胞内ドメイン（ＣＤ３ζｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）等の配列を含むことができる。

本発明のさらに他の具体例において、前記キメラ抗原受容体はＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体を特異的に認識および／または結合することによって、ＣＤ３００ｃ抗原を表面に発現しているがんの治療用途で使われ得る。

また、本発明は前記キメラ抗原受容体を発現する組換えベクターを提供する。

また、本発明は前記組換えベクターで形質転換された免疫細胞を提供する。

本発明の一具体例において、前記免疫細胞は好ましくは単核球、大食細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＮＫ ｃｅｌｌ）、樹枝状細胞などであるが、がんの治療用途で使われている免疫細胞であれば制限がない。

また、本発明は前記免疫細胞を有効性分として含む、ＣＤ３００ｃ抗原またはＣＤ３００ｃ受容体を発現するがんの予防または治療用薬学的組成物を提供する。

本発明の一具体例において、前記がんは大腸がん、直腸がん、結腸がん、甲状腺がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、脳がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、すい臓がん、前立腺がん、皮膚がん、舌がん、乳ガン、子宮がん、胃がん、骨がん、血液がんなどであるが、ＣＤ３００ｃ抗原またはＣＤ３００ｃ受容体を表面に発現しているがんの種類であれば、これに制限されない。

本発明の他の具体例において、前記薬学的組成物は他の既存の抗がん剤を追加で含むことができ、前記抗がん剤は好ましくは毒素ルビシン、シスプラチン、ゲムシタビン、オキサリプラチン、５－ＦＵ、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、ネシツムマブ、がん抗原、抗がんウイルスなどであるが、現在抗がん剤として使われている物質であればこれに制限されない。前記がん抗原はがん腫に特異的ながんワクチン（ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ）であって、好ましくは膀胱がん特異的ながん抗原としてＮＹ－ＥＳＯ－１、乳ガン特異的ながん抗原としてＨＥＲ２、大腸がん特異的ながん抗原としてＣＥＡ、肺がん特異的ながん抗原としてＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２等であり得るが、がんワクチンとして知られているがん抗原の種類であれば、これに制限されない。抗がんウイルスの一例としてイムリジック、Ｐｅｘａ－Ｖｅｃなどがあるが、知られている抗がんウイルスであれば、これに制限されない。前記抗がん剤を追加で含むのは、好ましくは併用投与であるか、本願発明の免疫細胞内に含まれている形態であり得、またはＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体に結合された形態であってもよく、抗がん剤の伝達体内に共に含まれている形態であってもよい。しかし、これに制限されはしない。

本発明のさらに他の具体例において、前記薬学的組成物はがんまたはがん幹細胞の増殖、生存、転移、再発、抗がん剤耐性などを抑制することを特徴とするが、本発明の薬学的組成物によって発生する効果であれば、これに制限されない。

また、本発明はＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を有効性分として含む組成物を個体に投与する段階を含むがん治療方法を提供する。

また、本発明はＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を有効性分として含む組成物のがん予防または治療用途を提供する。

また、本発明はＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞のがん治療に利用される薬剤を生産するための用途を提供する。

本発明に係るＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体は、多様ながんの表面で発現するＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に高い結合力を有して結合されることによって、Ｔ細胞を活性化させるとともにがん細胞の増殖を抑制することによって多様ながんの免疫治療剤として効果的に使われ得る。また、本発明に係るＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を利用することによって、免疫細胞自らの治療効果を有することができるだけでなく、キメラ抗原受容体を通じてＣＤ３００ｃ蛋白質の生成を抑制することによってＴ細胞を活性化させるとともに、がん細胞の増殖を抑制することによって 効果的にがん細胞の成長、発達、転移などを抑制できることを確認した。そして、細胞死滅に抵抗する能力を示すがん細胞に本発明に係るＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を処理する場合、がん細胞のこのような能力を顕著に弱化させてがん再発防止にも優れた効能を見せるものと期待される。

本発明の一実施例に係るＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体製作のための遺伝子配置を簡略に示した図面である。 本発明の一実施例に係るＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体製作のためのベクターマップを示した図面である。 本発明の一実施例に係るＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞株をウエスタンブロッティングで確認した結果を示した図面である。 本発明の一実施例に係るＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞株の抗がん効果を確認した結果を示した図面である。

本発明のＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞は、がん細胞表面のＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合することによって、ＣＤ３００ｃのメカニズムを効果的に抑制することによってがん細胞の成長およびがんの発達を効果的に抑制できるため、ＣＤ３００ｃ抗原またはＣＤ３００ｃ受容体を表面に発現している多様ながんの治療に効果的に使われ得る。

本明細書において、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、免疫学的に特定の抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を意味し、ポリクローナル抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、単クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）およびこれの機能的なフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）をすべて含む。また、前記用語はキメラ性抗体（例えば、ヒト化ミュリン抗体）および異種結合抗体（例えば、両特異性抗体）のような遺伝工学によって生産された形態を含むことができる。このうち単クローン抗体は単一抗原性部位（エピトープ、ｅｐｉｔｏｐｅ）に対して単一結合特異性および親和度を示す抗体であって、異なるエピトープに対して特異性を示す抗体を含むポリクローナル抗体とは異なって、単クローン抗体は抗原上の単一エピトープに対してのみ結合特異性および親和度を示すため、治療剤としての品質管理が容易である。特に、本発明の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体はＣＤ３００ｃを発現するがん細胞に特異的に結合してそれ自体としても抗がん活性を示すだけでなく、免疫細胞を刺激することによってがん細胞依存性抗がん活性を最大化させることができる。前記抗体は構成のうち重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）および／または軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）の可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含み、前記可変領域は１次構造として抗体分子の抗原結合部位を形成する部分を含み、本発明の抗体は前記可変領域を含む一部のフラグメントで構成され得、好ましくは前記可変領域はＣＤ３００ｃに対する可溶性受容体で代替され得るが、本発明の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と同一の効果を示すのであればこれに制限されない。

本明細書において、「単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」はＣＤ３００ｃ抗原に対する特異抗体であって、ＣＤＲが単一ドメインポリペプチドの一部である抗体であり、一般的に二つの重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）と抗原結合部位のみを利用して製作された抗体であり得るが、軽鎖が自然的にない抗体、従来の４－鎖抗体から由来した単一ドメイン抗体、操作された抗体および抗体から由来したもの以外の単一ドメインスキャフォールドをすべて含むことができる。

本明細書において、「単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）」とは、抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を１５個内外のアミノ酸が連結されたペプチド配列からなるリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）で連結した蛋白質であり、軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域、または重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域の順のいずれも可能であり、元の抗体と同一あるいは類似する抗原特異性を有する。連結部位は主にグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）とセリン（ｓｅｒｉｎｅ）からなる親水性の柔軟なペプチド鎖（ＧＳ ｌｉｎｋｅｒ）であり、「（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_３」の１５個のアミノ酸配列またはこれと類似する配列が主に使用される。前記抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）は免疫学的に特定の抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を意味し、ポリクローナル抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、単クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）およびこれの機能的なフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）をすべて含む。また、前記用語はキメラ性抗体（例えば、ヒト化ミュリン抗体）および異種結合抗体（例えば、両特異性抗体）のような遺伝工学によって生産された形態を含むことができる。このうち単クローン抗体は単一抗原性部位（エピトープ、ｅｐｉｔｏｐｅ）に対して単一結合特異性および親和度を示す抗体であり、異なるエピトープに対して特異性を示す抗体を含むポリクローナル抗体とは異なって、単クローン抗体は抗原上の単一エピトープに対してのみ結合特異性および親和度を示すため、治療剤としての品質管理が容易である。特に、本発明の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体はＣＤ３００ｃを発現するがん細胞に特異的に結合してそれ自体としても抗がん活性を示すだけでなく、免疫細胞を刺激することによってがん細胞依存性抗がん活性を最大化させることができる。前記抗体は構成のうち重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）および／または軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）の可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含み、前記可変領域は１次構造として抗体分子の抗原結合部位を形成する部分を含み、本発明の抗体は前記可変領域を含む一部のフラグメントで構成され得る。

本明細書において、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、本発明に係る薬学的組成物の投与によってがんなどの疾患を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。

本明細書において、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本発明に係る薬学的組成物の投与によってがんなどの症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。

本明細書において、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」とは、本発明の薬学的組成物が投与され得る対象を指し、その対象には制限がない。

本明細書において、「薬学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とは、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲料の形態であることを特徴とすることができ、前記薬学的組成物はヒトを対象とすることを特徴とすることができる。前記薬学的組成物はこれらに限定されるものではないが、それぞれ常法により散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、座剤および滅菌注射溶液の形態で剤形化して使われ得る。本発明の薬学的組成物は薬剤的に許容可能な坦体を含むことができる。薬剤学的に許容される坦体は、経口投与時には結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使うことができ、注射剤の場合には緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して使うことができ、局所投与用の場合には基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使うことができる。本発明の薬学的組成物の剤形は前述したような薬剤学的に許容される坦体と混合して多様に製造され得る。例えば、経口投与時には錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウェハーなどの形態で製造することができるし、注射剤の場合には単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放性製剤などに剤形することができる。

一方、製剤化に適合な坦体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使われ得る。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる

本発明に係る薬学的組成物の投与経路はこれらに限定されるものではなく、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髓内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投与が好ましい。本願で使われた用語「非経口」とは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学的組成物はまた、直腸投与のための座剤の形態で投与され得る。

本発明の薬学的組成物は使われた特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健常、性別、規定食、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症を含んだ多様な要因により多様に変わり得、前記薬学的組成物の投与量は患者の状態、体重、病気の程度、薬物の形態、投与経路および期間により異なるが、当業者によって適切に選択され得、１日０．０００１～５００ｍｇ／ｋｇまたは０．００１～５００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与は一日に一度投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量はいかなる場合であれ、本発明の範囲を限定するものではない。本発明に係る薬学的組成物は丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化され得る。

以下、本発明の理解を助けるために下記の実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。

＜実施例＞
実施例１：ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体発現ベクターの製造
ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を製造するために、ｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）に、合成された蛋白質が細胞膜を通過して正確な位置に移動するようにする配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤ８αシグナルペプチド（ＣＤ８αｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＤＮＡ配列は配列番号１）、ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合する各配列番号４、６、８、１０、１２のアミノ酸配列を含むＣＫ１、ＣＬ６、ＣＬ７、ＣＬ１０、ＳＬ１８それぞれの単鎖可変領域フラグメント（ａｎｔｉ－ＣＤ３００ｃ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ａＣＤ３００ｃ ｓｃＦｖ、ＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号３、５、７、９、１１）または配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤ３００ｃ ＥＣＤ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）抗原（ＤＮＡ配列は配列番号１３）、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＧＳリンカー（ＤＮＡ配列は配列番号１５）、そして膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）として配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ（ｈｉｎｇｅ ｏｆ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８、ＤＮＡ配列は配列番号１７）、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤ２８膜貫通ドメイン（ＣＤ２８ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ、ＤＮＡ配列は配列番号１９）、そして大食細胞活性化信号伝達のための細胞質内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ）として配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤ２８細胞内ドメイン（ＣＤ２８ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、ＤＮＡ配列は配列番号２１）、および配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤ３ζ細胞内ドメイン（ＣＤ３ζｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、ＤＮＡ配列は配列番号２３）を順に挿入して、ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体発現ベクター（ｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏ／ａＣＤ３００ｃ ｓｃＦｖまたはｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏ／ＣＤ３００ｃ ＥＣＤ－ＣＡＲ）を製造した。製造した各ベクターの遺伝子および蛋白質配列の組み合わせは表１に表した。そして遺伝子の配列の模式図は図１に示し、製作されたベクターマップの例示は図２に示した。

実施例２． ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体発現用組換えレンチウイルスの製造
ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体発現用組換えレンチウイルスの製造に必要なＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＡＴＣＣ）を、次のように準備した。細胞の培養に使った完全培地は、新鮮なＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に熱処理したＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を１０％の濃度となるように添加し、１ＸのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した後に、上下に転倒させて均一に混合した後に３７℃で予熱して使った。そしてＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は冷凍保管された細胞ｓｔｏｃｋを使用前に迅速に３７℃恒温水槽に転移して、２～３分の間急速解凍した後に、３０ｍＬの完全培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ_２培養器で培養した。そして細胞飽和度が８０％以上となった時、継代培養しながら維持した。レンチウイルスの形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のためには、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を１－２ Ｘ １０^６ｃｅｌｌｓの濃度で１０ｍＬの完全培地に接種し、１６時間の間培養した後に、レンチウイルスの形質感染を実施した。

ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体発現用レンチウイルスの形質感染は、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ^ＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ）キットを利用した。実施例１と同一の方法で製造された７μｇのｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏ／ａＣＤ３００Ｃ ｓｃＦｖまたはｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏ／ＣＤ３００ｃ ＥＣＤ－ＣＡＲ発現ベクターにｓｔｅｒｉｌｅ ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加して６００μＬとなるように合わせた後に、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ^ＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ内のＬｅｎｔｉ－Ｘ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｈｏｔｓ ｔｕｂｅに入れて混合してｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｏｌｕｔｉｏｎを製造した。そして常温で１０分間反応させたｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｏｌｕｔｉｏｎを予め準備されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一滴ずつ添加した後、左右に振りながら混合した。そして培養器で４時間の間培養した後に、新しい完全培地を６ｍＬを追加で添加した後に、４８時間の間培養した。培養後には上清液を回収し遠心分離で細胞残余物を除去した後に０．４５μｍフィルタで濾過し、使用前まで－８０℃に保管した。

獲得されたレンチウイルス上清液のうち２０μＬをＬｅｎｔｉ－Ｘ^ＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ内のＧｏＳｔｉｘ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓａｍｐｌｅ ｗｅｌｌ（Ｓ）に添加し、Ｃｈａｓｅ溶液３滴をｓａｍｐｌｅ ｗｅｌｌに落とした後に常温で１０分の間反応させた後、バンドの有無で５Ｘ１０^５ＩＦＵ／ｍＬ以上の有効容量の組換えレンチウイルスを獲得したことを確認した。

その結果、ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現する組換えレンチウイルスが製造されたことを確認した。製造したレンチウイルスが配列番号４、６、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列をそれぞれ含むキメラ抗原受容体を発現することを確認した。

実施例３：ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞の製造
ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を製造するために、実施例２と同一の方法で製造された組換えレンチウイルスをＪｕｒｋａｔ細胞株に形質感染させた。より詳しくは、０．１～１０ＭＯＩの組換えレンチウイルスを８μｇ／ｍＬのｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ｍｅｒｋ）が添加された完全培地に接種し、上下に転倒させて均一に混合した。そして混合物を６－ウェルプレートに準備されたＪｕｒｋａｔ細胞株に１ｍＬずつ添加した後に、１，８００ｒｍｐで４５～９０分の間遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ_２培養器で２４時間の間培養した。そして２４時間後に、５Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で継代培養した。

そして形質感染されたＪｕｒｋａｔ細胞株でＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体が正常に発現するかを確認するために、培養されたＪｕｒｋａｔ細胞の総蛋白質をＰＲＯ－ＰＲＥＰ溶液（ｉＮｔＲＯＮ）を利用して収得した。そして収得された蛋白質の濃度はｍｉｃｒｏＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使って測定した後に、同一の量の蛋白質を利用してウエスタンブロッティングを実施した。より詳しくは、同一の量の蛋白質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に電気泳動した後に、電気泳動された蛋白質をｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移動させた。そして蛋白質が結合されたｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅを５％ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ（ＢＤ）溶液を利用してブロッキングさせて非特異的抗体反応を遮断し、１次抗体として抗－ＣＤ３抗体および抗－ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を１：１，０００の濃度となるようにそれぞれ５％ｓｋｉｍ ｍｉｌｋを利用して希釈し、これをｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅに処理し反応させた後に、結合されなかった抗体は除去した。そして２次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）－接合２次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１：２，０００の濃度で希釈して処理した。そしてＥＣＬ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を処理して発色反応を誘導した後に、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔイメージ分析装置ｉＢｒｉｇｈｔ１５００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って蛋白質の量を定量した。ウエスタンブロッティング結果は図３に示した。

図３に示された通り、抗－ＣＤ３抗体が結合されたＣＤ３ζ細胞内ドメインを確認することができたし、これを通じてＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞株が製造されたことを確認した。

そして追加的に、ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体の発現の程度を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を利用して確認した。より詳しくは、Ｊｕｒｋａｔ細胞株にＰＥ－融合抗－ＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を処理し、３０分の間４℃で培養して反応させた後に、フローサイトメーターを利用して確認した。

フローサイトメトリー分析結果、ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞株が製造されたことを確認した。

実施例４：ＣＤ３００ｃのがん細胞発現確認
ＣＤ３００ｃが多様ながん細胞で発現しているかを評価するために、多様なヒト由来固形がん細胞株を培養してｍＲＮＡおよび蛋白質水準でＣＤ３００ｃの発現を評価した。より詳しくは、ヒト肺がん細胞株であるＡ５４９、ヒト乳ガン細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１、マウス大腸がん細胞株であるＣＴ２６を培養し、それぞれの細胞を４％ホルムアルデヒドで固定させた後に、５％Ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍを利用してブロッキングした。そして１μｇの抗－ＣＤ３００ｃ抗体を処理し反応させた後に、ＦＩＴＣ－ｌａｂｅｌｅｄ抗－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ抗体を利用して染色した。そして蛍光標識された細胞をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を利用して確認した。

その結果、大腸がん、肺がん、乳ガンなどの多様ながん細胞の細胞表面にはＣＤ３００ｃ抗原を有していることを確認した。

実施例５：ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞の抗がん効果
ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞の抗がん効果を確認するために、Ａ５４９細胞株を利用してがん細胞死滅効果を確認した。より詳しくは、Ａ５４９細胞株を９６－ウェルプレートに１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で接種した。そして実施例３に記載された方法と同一の方法で製造されたＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞をがん細胞に２０：１の濃度となるように処理し共培養した。対照群としてレンチウイルスで形質感染されていないＪｕｒｋａｔ細胞を使った。２４時間の間共培養した後に、各ウェルから共培養したＪｕｒｋａｔ細胞株を除去し、ＣＣＫ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を利用して１時間の間反応させた後に、ＯＤ_{４５０ｎｍ}で吸光度を測定してがん細胞の死滅程度を確認した。その結果は図４に示した。

図４に示された通り、ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞株はＡ５４９細胞株に対して抗がん効果を示し、レンチウイルスで形質感染されていないＪｕｒｋａｔ細胞株より高い抗がん効果を示すことを確認した。

前記結果を通じて、ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞株を利用すると、免疫細胞株を利用したがん治療効果を増加させて効果的にがんを治療できることを確認することができた。また、ＣＤ３００ｃ抗原を表面に発現するがん細胞に対してのみ特異的に反応するため、副作用を減少させるとともに治療効果は最大化できるということを確認することができた。

前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形態に容易に変形できることが理解できるであろう。したがって、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり限定的ではないものと理解されるべきである。

産業上利用の可能性

本発明のＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体はＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するため、ＣＤ３００ｃ抗原を分泌するすべてのがんの治療に使われ得るだけでなく、ＣＤ３００ｃの抑制を通じて体内でＴ細胞などを活性化することによって副作用は減少させ得るだけでなく、がんの治療効果は増加することによって多様ながんの免疫治療に効果的に使うことができる。

Claims (16)

1. ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体であって、
   前記キメラ抗原受容体はＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合する抗体、単一ドメイン抗体、単鎖可変領域フラグメント、および抗原からなる群から選択されたいずれか一つ以上を含むことを特徴とする、キメラ抗原受容体。
2. 前記キメラ抗原受容体は、配列番号４、６、８、１０、１２または１４で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
3. 前記キメラ抗原受容体は、シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＳリンカー、膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）、および細胞質内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ）を追加で含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
4. 前記シグナルペプチドはＣＤ８αシグナルペプチドであることを特徴とする、請求項３に記載のキメラ抗原受容体。
5. 前記膜貫通ドメインはＣＤ８ヒンジ（ｈｉｎｇｅ ｏｆ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８）およびＣＤ２８膜貫通ドメイン（ＣＤ２８ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）であることを特徴とする、請求項３に記載のキメラ抗原受容体。
6. 前記細胞質内ドメインはＣＤ２８細胞内ドメイン（ＣＤ２８ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）およびＣＤ３ζ細胞内ドメイン（ＣＤ３ζｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）であることを特徴とする、請求項３に記載のキメラ抗原受容体。
7. 前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ３００ｃ抗原またはＣＤ３００ｃ受容体を発現するがんの治療用途で使われることを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
8. 請求項１～請求項７のいずれか一項に記載されたキメラ抗原受容体を発現する、組換えベクター。
9. 請求項８に記載された組換えベクターで形質転換された、免疫細胞。
10. 前記免疫細胞は、単核球、大食細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＮＫ ｃｅｌｌ）および樹枝状細胞からなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項９に記載の免疫細胞。
11. 請求項９に記載された免疫細胞を有効性分として含む、ＣＤ３００ｃ抗原またはＣＤ３００ｃ受容体を発現するがんの予防または治療用薬学的組成物。
12. 前記がんは、大腸がん、直腸がん、結腸がん、甲状腺がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、脳がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、すい臓がん、前立腺がん、皮膚がん、舌がん、乳ガン、子宮がん、胃がん、骨がんおよび血液がんからなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１１に記載の薬学的組成物。
13. 前記薬学的組成物は他の抗がん剤を追加で含むことを特徴とする、請求項１１に記載の薬学的組成物。
14. 前記薬学的組成物はがんの増殖、生存、転移、再発または抗がん剤耐性を抑制することを特徴とする、請求項１１に記載の薬学的組成物。
15. 請求項９に記載された免疫細胞を有効性分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、がんの予防または治療方法。
16. 請求項９に記載された免疫細胞を有効性分として含む組成物のがん予防または治療用途。
    
    

Images