JP2023503416A - Ｐｒａｍｅ ｔｃｒ受容体及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）を有するＰＲＡＭＥペプチドもしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態、に結合する能力を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。ＴＣＲをコードする核酸、当該核酸を含むベクター、及び当該ＴＣＲ、当該核酸配列、または当該ベクターを含む宿主細胞も本発明に含まれる。本明細書に記載のＴＣＲを得るための方法、医薬組成物または診断組成物、及び対象におけるがんの存在をインビトロで検出する方法もさらに含まれる。さらに、本発明は、改変リンパ球を得るためにＴＣＲ、核酸、及び／またはベクターを使用することにも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）を有するＰＲＡＭＥペプチドもしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態、に結合する能力を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。当該ＴＣＲをコードする核酸、当該核酸を含むベクター、及び当該ＴＣＲ、当該核酸配列、または当該ベクターを含む宿主細胞も本発明に含まれる。本明細書に記載のＴＣＲを得るための方法、ＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／または宿主細胞を含む医薬組成物または診断組成物、ならびにＴＣＲ、宿主細胞、及び／または医薬組成物を使用することを含む、対象におけるがんの存在をインビトロで検出する方法もさらに含まれる。さらに、本発明は、改変リンパ球を生成させるためにＴＣＲ、核酸、及び／またはベクターを使用することにも関する。
細胞介在性の免疫系の一部を形成するＴリンパ球（またはＴ細胞）は、病原体の除去において主要な役割を担っている。Ｔ細胞は胸腺で発生し、有核細胞上で発現する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子上に提示されたペプチド（抗原提示）を認識することを可能にするＴ細胞受容体分子をその表面上に発現する。病原体の抗原、すなわちＭＨＣ分子によって提示される外来抗原は強力なＴ細胞応答を誘発することになるが、その一方で、自己抗原特異的Ｔ細胞はそのようなＴ細胞が発生する間に胸腺で負の選択を受けることから、自己抗原は、通常、Ｔ細胞応答を引き起こすことはない。したがって、免疫系は、外来抗原を提示する有核細胞と自己抗原を提示する有核細胞とを区別すると共に、感染細胞を特異的に標的とし、Ｔ細胞の強力なサイトカイン放出機構及び細胞傷害性機構を介してそうした感染細胞を除去し得る。
免疫系の能力は将来のがん治療に有望なツールとして認識されている。過去１０年の間に、養子細胞移入（ＡＣＴ）を使用することによってＴ細胞の特有の特性を利用する研究が始まっている。ＡＣＴでは、ドナー由来のリンパ球をエクスビボで増殖させて投与することが行われる。ＡＣＴは患者の免疫能力を必要としない上、変異を有さないことから免疫原性が低く、典型的には自己Ｔ細胞応答の効果的な誘発に失敗する腫瘍抗原を移入リンパ球の特異性の標的とすることが可能であることから、ＡＣＴは、がん治療の魅力的な概念である。ＡＣＴは、さまざまな型のがんに有望な治療であることが示されているものの、各患者から腫瘍特異的Ｔ細胞を特別に単離し、特徴付けること（これは、困難かつ時間を要し得るというだけでなく、アビディティーの高いＴ細胞を得ることに失敗することも多いプロセスである）が必要であることが、ＡＣＴを臨床的治療として広く適用することの障害となっている（非特許文献１、非特許文献２）。
腫瘍抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を初代Ｔ細胞に遺伝的に導入することで、規定の抗原特異性を有する腫瘍反応性Ｔリンパ球を、免疫不全患者においてさえ、迅速に生成させることが可能になることから、ＡＣＴの現在の制限のいくつかを克服することができる。一方で、腫瘍抗原を特異的に認識し、所望の抗腫瘍効果をインビボで示す適切なＴＣＲ保有Ｔ細胞クローンを同定することは、依然として、進行中の研究の課題である。２０１２年に世界で新たに発生したがん症例数は約１４１０万に上っており、現在のところ世界のすべてのヒト死亡例の約１４．６％ががんによって引き起こされていることを考慮すると、新規かつ有効な治療選択肢が緊急に必要とされている。上記のニーズを満たすことが本発明の目的である。
ＰＲＡＭＥは、さまざまな腫瘍、好ましくは黒色腫に発現する腫瘍関連抗原である。さらに、ＰＲＡＭＥは、ぶどう膜黒色腫などでは転移の独立したバイオマーカーとして説明されており（非特許文献３）、ＤＬＢＣＬについては予後マーカーとして説明されている（非特許文献４）。ＰＲＡＭＥは、精巣を除いて正常組織では発現しない。この発現パターンは、他のがん精巣（ＣＴ）抗原（ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、及びＧＡＧＥなど）のものと同様である。しかしながら、こうした他のＣＴ抗原とは異なり、この遺伝子は急性白血病でも発現する。コードされるタンパク質は、レチノイン酸受容体のリプレッサーとして働き、この機能を介してがん細胞に増殖優位性を付与するものとみられる。選択的スプライシングの結果、複数の転写産物バリアントが生じる。トリプルネガティブ乳癌でのＰＲＡＭＥの過剰発現は、上皮間葉転換の誘導を介してがん細胞運動性を促進することも明らかとなっている（非特許文献５）。慢性リンパ球性白血病ではＰＲＡＭＥの欠失が報告されているが、このことは、この遺伝子がＢ細胞では発現しないことから、機能的には関連しておらず、この欠失は、免疫グロブリン軽鎖が生理学的に再構成された結果である。
Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；１３９（２）：１６７－１７２ Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２０（１１）：１２４０－１２４８ Ｆｉｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１６ Ｍａｒｃｈ；２２（５）：１２３４－１２４２ Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１４，１／２０１４ Ａｌ－Ｋｈａｄａｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１９；１７：９
本発明は、腫瘍関連抗原ＰＲＡＭＥを特異的に認識する能力を有する新規のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。具体的には、同定されたＴＣＲは、ＰＲＡＭＥアミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（本明細書ではＰＲＡＭＥＳＬＬペプチドとも称される）を特異的に認識する。本発明は、この特異的ＰＲＡＭＥペプチドに結合するこの単離されたＴ細胞受容体が、先行技術分野で知られるＰＲＡＭＥ ＴＣＲと比較して優れた特性を有するという驚くべき発見に少なくとも部分的には基づくものである。具体的には、ＰＲＡＭＥペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬに結合する能力を有する本発明のＴ細胞受容体は、高い機能的アビディティーならびに有利な腫瘍細胞認識特性及び腫瘍細胞死滅特性も与えるものである。腫瘍細胞とは対照的に、正常細胞及び無関係なペプチドは当該ＴＣＲによって認識されない。さらに、このＴ細胞受容体はＨＬＡ分子（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ））上に提示された当該ペプチドを認識し、特に、ＨＬＡサブアレルであるＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、及びＨＬＡ－Ａ＊０２：０４がコードするＨＬＡ分子上に提示された当該ペプチドを認識することで、ＰＲＡＭＥＳＬＬを提示する低頻度ＨＬＡ－Ａ＊０２アレルを発現するがん患者を治療することさえ可能にするものである。
第１の態様では、本発明は、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）を有するＰＲＡＭＥペプチドもしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態、に結合する能力を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関し、このＴＣＲは、（配列番号６）のアミノ酸配列、または配列番号６との同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列、を含むまたはからなる、ＴＣＲアルファ鎖可変領域のＣＤＲ３、及び／または（配列番号７）のアミノ酸配列、または配列番号７との同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列、を含むまたはからなる、ＴＣＲベータ鎖可変領域のＣＤＲ３、を含む。
別の態様では、本発明は、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）を有するＰＲＡＭＥペプチドもしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態、に結合する能力を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関し、このＴＣＲは、
ａ）（配列番号６）のアミノ酸配列、または配列番号６との同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列、を含むまたはからなる、ＴＣＲアルファ鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号２のアミノ酸配列を含むまたはからなる、ＴＣＲアルファ鎖可変領域のＣＤＲ１、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはからなる、ＴＣＲアルファ鎖可変領域のＣＤＲ２と、
ｂ）（配列番号７）のアミノ酸配列、または配列番号７との同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列、を含むまたはからなる、ＴＣＲベータ鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号３のアミノ酸配列を含むまたはからなる、ＴＣＲベータ鎖可変領域のＣＤＲ１、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはからなる、ＴＣＲベータ鎖領域のＣＤＲ２と、
を含む。
ＨＬＡ－Ａ２は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０４がコードする分子であることが想定される。
具体的には、配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）もしくは好ましくはその機能性部分、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態に当該ＴＣＲが結合すると、当該ＴＣＲが形質導入またはトランスフェクトされている細胞によってＩＦＮ－ガンマの分泌が誘導されることが想定される。
ＩＦＮ－ガンマイムノアッセイによって測定すると、最大相対ＩＦＮ－ガンマ分泌量の５０％を与える濃度（ＥＣ５０値）は、好ましくは１０－７Ｍ未満である。
本発明のＴＣＲは、
ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲアルファ鎖、及び／または
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲベータ鎖
を含むことも想定される。
本発明を踏まえると、本明細書で言及されるＴＣＲは、配列番号８のアミノ酸配列を含むもしくはからなるＴＣＲアルファ鎖可変領域、及び／または配列番号９のアミノ酸配列を含むもしくはからなるＴＣＲベータ鎖可変領域、を含み得る。
本発明のＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖定常領域及び／またはＴＣＲベータ鎖定常領域を含むことも想定される。
好ましくは、本発明のＴＣＲは、
ａ）配列番号１０、または配列番号１０との同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を含むまたはからなるＴＣＲアルファ鎖、及び／または
ｂ）配列番号１１、または配列番号１１との同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を含むまたはからなるＴＣＲベータ鎖
を含む。
本発明のＴＣＲは、互いに共有結合で連結されてＴＣＲヘテロ二量体またはＴＣＲ多量体を形成する、少なくとも１つのＴＣＲアルファ鎖（複数可）及び少なくとも１つのＴＣＲベータ鎖（複数可）を含むことも想定される。
本発明を踏まえると、本明細書で言及されるＴＣＲは、天然のＴＣＲ、ＴＣＲバリアント、ＴＣＲ断片、またはＴＣＲコンストラクトから選択され得ることが想定される。
いくつかの実施形態では、本発明のＴＣＲは、Ｆｃ受容体、Ｆｃドメイン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＭを含む）、サイトカイン（ＩＬ－２またはＩＬ－１５を含む）、毒素、抗体またはその抗原結合断片（抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤＳ抗体、抗ＣＤ１６抗体、もしくは抗ＣＤ５６抗体、またはその抗原結合断片を含む）、ＣＤ２４７（ＣＤ３－ゼータ）ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ１３７ドメイン、またはＣＤ１３４ドメイン、あるいはそれらの組み合わせ、から任意選択で選択される１つ以上の融合要素（複数可）を含むと共に、少なくとも１つのリンカーを任意選択でさらに含む。
本明細書で言及されるＴＣＲは、好ましくは、少なくとも１つのＴＣＲアルファ鎖（本明細書で定義されるもの）及び／または少なくとも１つのＴＣＲベータ鎖（本明細書で定義されるもの）、及び／またはリンパ球の表面上の抗原もしくはエピトープに対する抗体もしくは一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）、を含み、ＴＣＲアルファ鎖（複数可）とＴＣＲベータ鎖（複数可）とは互いに連結され、リンカーを任意選択で介して当該抗体またはｓｃＦｖと融合される。当該抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、またはＣＤ５６から選択され得る。
本発明のＴＣＲは、好ましくは、少なくとも１つの分子マーカーを含む。好ましくは、本発明のＴＣＲは可溶性である。
別の態様では、本発明は、本明細書で言及されるＴＣＲをコードする核酸に関する。
当該核酸は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２２の核酸配列を含み得る。
別の態様では、本発明は、本明細書で定義される核酸を含むベクターに関する。
別の態様では、本発明は、本明細書で定義されるＴＣＲ、本明細書で定義される核酸配列、または本明細書で定義されるベクター、を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、リンパ球から選択することができ、こうしたリンパ球には、限定されないが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ガンマ／デルタＴ細胞が含まれる。
別の態様では、本発明は、本明細書で定義されるＴＣＲを得るための方法に関し、この方法は、本明細書で定義される宿主細胞を当該ＴＣＲが発現する条件の下でインキュベートすること、及び当該ＴＣＲを精製すること、を含む。
別の態様では、本発明は、医薬組成物または診断組成物に関し、この医薬組成物または診断組成物は、本明細書で定義されるＴＣＲ、本明細書で定義される核酸、本明細書で定義されるベクター、及び／または本明細書で定義される宿主細胞、のうちの１つ以上と、任意選択の医薬品添加物（複数可）と、を含む。医薬組成物は、チェックポイント阻害剤をさらに含み得る。当該チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、及びＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、ＩＣＯＳ阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤、ならびにＣＥＡＣＡＭ１阻害剤からなる群から選択され得る。
別の態様では、本発明は、薬剤としての使用のための、本明細書で定義されるＴＣＲ、本明細書で定義される核酸、本明細書で定義されるベクター、及び／または本明細書で定義される宿主細胞に関する。好ましくは、この使用は、がんの検出、診断、予後予測、予防、及び／または治療におけるものである。これに関して、がんは、黒色腫、膀胱癌、結腸癌、及び乳腺腺癌、肉腫、前立腺癌、子宮癌、ぶどう膜癌（ｕｖｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、ぶどう膜黒色腫、頭頸部扁平上皮癌、滑膜癌、ユーイング肉腫、トリプルネガティブ乳癌、甲状腺癌、精巣癌、腎癌、膵癌、卵巣癌、食道癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、肝細胞癌、頭頸部癌、胃癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、胆管癌、乳癌、膀胱癌、骨髄性白血病、ならびに急性リンパ芽球性白血病からなる群から選択されることが想定され、好ましくは、がんは、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、乳癌、卵巣癌、または結腸直腸癌、肉腫または骨肉腫からなる群から選択される。
さらに、がんの予防及び／または治療における本明細書で定義されるＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／または宿主細胞の使用は、
（ａ）（ｉ）本明細書の他の箇所に記載のＴＣＲ、（ｉｉ）本明細書の他の箇所に記載の核酸、（ｉｉｉ）本明細書の他の箇所に記載のベクター、（ｉｖ）本明細書の他の箇所に記載の宿主細胞、及び（ｖ）本明細書の他の箇所に記載の医薬組成物、のうちの１つ以上を供給すること、ならびに
（ｂ）（ｉ）～（ｖ）のうちの少なくとも１つを、それを必要とする対象に投与すること、
を含むことが想定される。
好ましくは、がんの予防及び／または治療において使用するための、本明細書で定義されるＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／または宿主細胞は、
（ａ）対象の試料を供給することであって、当該試料がリンパ球を含む、当該供給すること、
（ｂ）（ｉ）本明細書の他の箇所に記載のＴＣＲ、（ｉｉ）本明細書の他の箇所に記載の核酸、（ｉｉｉ）本明細書の他の箇所に記載のベクター、（ｉｖ）本明細書の他の箇所に記載の宿主細胞、及び（ｖ）本明細書の他の箇所に記載の医薬組成物、のうちの１つ以上を供給すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）の（ｉ）～（ｖ）のうちの１つ以上を、ステップ（ｂ）のリンパ球に導入し、それによって改変リンパ球を得ること、
（ｄ）ステップ（ｃ）の改変リンパ球を、それを必要とする対象または患者に投与すること、
を含む。
別の態様では、本発明は、対象におけるがんの存在をインビトロで検出する方法に関し、この方法は、
（ａ）対象の試料を供給することであって、当該試料が１つ以上の細胞を含む、当該供給すること、
（ｂ）当該試料を、（ｉ）本明細書の他の箇所に記載のＴＣＲ、（ｉｉ）本明細書の他の箇所に記載の宿主細胞、及び／または（ｉｉｉ）本明細書の他の箇所に記載の医薬組成物と接触させ、それによって複合体を形成させること、ならびに
（ｃ）複合体を検出することであって、複合体の検出が、対象におけるがんの存在を示す、当該検出すること、
を含む。
さらに別の態様では、本発明は、改変リンパ球を生成させるために、本明細書で定義されるＴＣＲ、本明細書で定義される核酸、及び／または本明細書で定義されるベクターを使用することに関する。
ペプチド特異性を示す。特異的ＳＬＬ（ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ）または無関係のペプチド（ＧＬＳＮＴＨＶＬ）のいずれかをＴ２細胞に負荷した。次に、これらの細胞をＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と共培養した。２０時間後にＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳＡを使用して細胞培養上清中のＩＦＮ－ガンマのレベルを測定した。特異的ＳＬＬペプチドは、Ｔ２細胞上に負荷されると、陰性対照ＴＣＲを除くすべてのＴＣＲ形質導入エフェクター細胞によって認識されるが、無関係のペプチドは認識されない。 機能的アビディティーを示す。漸増量のＳＬＬペプチド（１０－５Ｍ～１０－１２Ｍ）を負荷したＴ２細胞を含む共培養物において、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞集団の機能的アビディティーを、最大相対ＩＦＮ－ガンマ放出量の５０％を与える濃度（ＥＣ５０値）として測定している。ＴＣＲ ０２７－００４を形質導入した細胞は、ＴＣＲ ３８２５を形質導入したＴ細胞と比較して高い機能的アビディティーを示す。 ＴＣＲ認識モチーフ（セリンスキャン）を示す。ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と、１０－５Ｍのペプチドを負荷したＴ２細胞とを、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を１：１としてインビトロで共培養したものである（１０．０００個エフェクター細胞／９６ウェル）。この実験については、１つのアミノ酸位置をアミノ酸セリンによって連続的に置換したことのみが異なるペプチドをＴ２細胞に負荷した。ＴＣＲ（０２７－００４ ＴＣＲ）を形質導入したＴ細胞（Ａ）は、ＴＣＲクローン３８２５形質導入Ｔ細胞（Ｂ）と比較して固定位置が少ない異なる認識モチーフを示す。 ＴＣＲ認識モチーフ（セリンスキャン）を示す。ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と、１０－５Ｍのペプチドを負荷したＴ２細胞とを、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を１：１としてインビトロで共培養したものである（１０．０００個エフェクター細胞／９６ウェル）。この実験については、１つのアミノ酸位置をアミノ酸セリンによって連続的に置換したことのみが異なるペプチドをＴ２細胞に負荷した。ＴＣＲ（０２７－００４ ＴＣＲ）を形質導入したＴ細胞（Ａ）は、ＴＣＲクローン３８２５形質導入Ｔ細胞（Ｂ）と比較して固定位置が少ない異なる認識モチーフを示す。 腫瘍細胞の認識を示す。両方のＴＣＲ形質導入Ｔ細胞集団（ＴＣＲ ０２７－００４またはＴＣＲ ３８２５のいずれかを形質導入したもの）がＰＲＡＭＥＳＬＬ陽性腫瘍細胞株を認識する。ＰＲＡＭＥＳＬＬ陽性細胞の認識は、３８２５ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と比較して０２７－００４ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の方が強い。ＰＲＡＭＥＳＬＬ陰性腫瘍細胞は、試験したＴＣＲのいずれによっても認識されない。 腫瘍細胞の死滅を示す。ＴＣＲ形質導入エフェクター細胞はすべて、ＰＲＡＭＥＳＬＬ陽性（ＰＲＡＭＥ陽性）腫瘍細胞を溶解し、ＰＲＡＭＥＳＬＬ陰性腫瘍細胞（ＰＲＡＭＥ陰性）の増殖には影響を与えない。ＴＣＲ ０２７－００４を形質導入したエフェクター細胞は、ＴＣＲ ３８２５を形質導入したＴ細胞と比較してＰＲＡＭＥＳＬＬ陽性細胞株を良好に死滅させる。 図５－１の続き。 図５－２の続き。 図５－３の続き。 図５－４の続き。 図５－５の続き。 正常細胞の認識を示す。ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞集団は、ＩＦＮ－ガンマが高レベルで分泌されるように非負荷正常細胞を認識することはない。一方で、特異的ＰＲＡＭＥＳＬＬペプチドが細胞に負荷された場合、そうした細胞はＴＣＲ ０２７－００４によって認識される。細胞株ＲＰＴＥＣ（内因性にＰＲＡＭＥ陽性の細胞株）との共培養時にのみ、負荷が行われていない場合でも、両方のエフェクター調製物において最小限のＩＦＮ－ガンマが産生される。 図６－１の続き。 ＨＬＡ－Ａ＊０２のアレル頻度を示す。米国／欧州系コーカサス人種集団のアレル頻度（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ．ｎｅｔ）。 ＴＣＲ ０２７－００４のＨＬＡ－Ａ＊０２精密タイピングを示す。ＴＣＲ ０２７－００４を形質導入したＴ細胞と、選択したＨＬＡ－Ａ２サブアレル陽性リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ；ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞）とを、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を１：２としてインビトロで共培養したものである（１０．０００個エフェクター細胞／９６ウェル）。すべての個々のＬＣＬにＳＬＬペプチド（１０－５Ｍ）を負荷することで、特有のＴＣＲサブアレル認識を決定している。非負荷標的細胞を陰性対照としている。２０時間の共培養の後に標準的なＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ－ガンマの分泌量を決定した。ＴＣＲ ０２７－００４は、試験した１０個のＨＬＡ－Ａ２サブアレル（Ａ＊０２：ｘｘ）のうちの３個によって提示されたＰＲＡＭＥペプチドを効率的に認識し、ＨＬＡ－Ａ＊０２サブアレルＡ＊０２：０２及びＡ＊０２：０４は、Ａ＊０２：０１と比較して同等のレベルで認識される。 ＴＣＲ ３８２５のＨＬＡ－Ａ＊０２精密タイピングを示す。ＴＣＲ ３８２５を形質導入したＴ細胞と、選択したＨＬＡ－Ａ＊０２サブアレル陽性リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ；ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞）とを、Ｅ：Ｔ比を１：２としてインビトロで共培養したものである（１０．０００個エフェクター細胞／９６ウェル）。すべての個々のＬＣＬにＳＬＬペプチド（１０－５Ｍ）を負荷することで、特有のＴＣＲサブアレル認識を決定している。非負荷標的細胞を陰性対照としている。２０時間の共培養の後に標準的なＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ－ガンマの分泌量を決定した。対照ＴＣＲ ３８２５は、試験した１０個のＨＬＡ－Ａ２サブアレル（Ａ＊０２：ｘｘ）のうちの１個によって提示されたＰＲＡＭＥペプチドを効率的に認識し、すなわち、ＨＬＡ－Ａ２サブアレルＡ＊０２：０１のみが認識される。 図８及び図９に示される結果のまとめを示す。 ＴＣＲを形質導入した後のエフェクター細胞の増殖を示す。形質導入を行った日、及び１３日間の増殖を経た後に血球計算盤を使用してエフェクター細胞の細胞数を決定した。各グラフは１人のドナーを表す。ＴＣＲ ＩｍＣｏｒｅＰｒｅｆＣｏｍｂｉ１では、エフェクター細胞の増殖が見られなかったことから、ＴＣＲ ＩｍＣｏｒｅＰｒｅｆＣｏｍｂｉ１を、さらなる実験に含めることは不可能であった。 図１１－１の続き。 ＴＣＲ Ｔ２３．８－２．１０２７－００４が、当該技術分野で最新のＴＣＲと異なる認識モチーフを有することを示す。ＰＲＡＭＥ－ＳＬＬ－ペプチド（一番右側）を負荷したＴ２細胞、または単一アミノ酸をスレオニンに置換したＳＬＬ－ペプチドバリアントを負荷したＴ２細胞とＴＣＲ形質導入エフェクター（エフェクター細胞）とを共培養した。読み出しとして、２０時間後に上清を回収し、ＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳＡによって分析した。各グラフは１つのＴＣＲを表す。Ｘ軸上の文字はアミノ酸置換の位置を示す。認識モチーフの「固定」位置はＸ軸上で箱によって強調されている。ＴＣＲ ４６ＳＬＬでは、元のＰＲＡＭＥ－ＳＬＬペプチドが負荷されたＴ２細胞の認識が見られず、ＴＣＲ ＩｍＣｏｒｅ＿Ｓｃａｆｆｏｌｄでは、ＰＲＡＭＥ－ＳＬＬが負荷されたＴ２細胞の認識の低下が見られる。誤解を避けるために記載すると、この説明内では本発明のＴＣＲはＴＣＲ ０２７－００４と略されているが、その正式名称はＴＣＲ Ｔ２３．８－２．１－０２７－００４であることに留意されたい。 図１２－１の続き。 図１２－２の続き。 当該技術分野で最新のＴＣＲを形質導入したエフェクターと比較してＴＣＲ Ｔ２３．８－２．１－０２７－００４形質導入エフェクターが高い機能的アビディティーを有することを示す。ＴＣＲ Ｔ２３．８－２．１－０２７－００４形質導入エフェクター（黒色）及び他のＴＣＲ形質導入エフェクター（灰色）を、漸増量のＰＲＡＭＥ－ＳＬＬ－ペプチドを負荷したＴ２細胞と共培養した。読み出しとして、２０時間後に上清を回収し、ＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳＡによって分析した。破線は、最大相対ＩＦＮ－ガンマ分泌量の５０％を与えるのに必要なペプチド濃度を示す。グラフは、光学密度値を表す非線形回帰曲線を示す。非線形回帰分析を使用することで、異なるＴＣＲ形質導入エフェクターのＥＣ５０値を計算した。各グラフは、当該技術分野で最新のＴＣＲの１つをＴＣＲ Ｔ２３．８－２．１－０２７－００４と比較したものを表す。 図１３－１の続き。 図１３－２の続き。 図１３－３の続き。 当該技術分野で最新のＴＣＲを形質導入したエフェクターと比較してＴ２３．８－２．１－０２７－００４形質導入エフェクターがＨＬＡ－Ａ＊０２：０１／ＰＲＡＭＥ二重陽性腫瘍細胞株を強く認識することを示す。６つの異なるＴＣＲを形質導入したエフェクター、ならびに非形質導入対照エフェクターをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１／ＰＲＡＭＥ二重陽性腫瘍細胞株であるＭｅｌＡ３７５、ＮＣＩ－Ｈ１６５０、及びＮＣＩ－Ｈ１７０３と共培養した。共培養物の上清を２０時間後に回収し、ＥＬＩＳＡによって分析してＩＦＮ－ガンマの分泌量を決定した。 当該技術分野で最新のＴＣＲを形質導入したエフェクターと比較してＴ２３．８－２．１－０２７－００４形質導入エフェクターがＰＲＡＭＥ陽性腫瘍細胞の溶解を効率的に媒介することを示す。ＮｕｃｌｉｇｈｔＲｅｄが形質導入された腫瘍細胞株ＭｅｌＡ３７５及びＮＣＩ－Ｈ１６５０（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性／ＰＲＡＭＥ陽性）を９６ウェル平底プレートに播種し、非形質導入エフェクター（灰色で表される）、Ｔ２３．８－２．１－０２７－００４－形質導入エフェクター（黒丸）、または他のＴＣＲが形質導入されたエフェクターと１４４時間共培養した。赤色蛍光の消失によって腫瘍細胞のアポトーシスを可視化した。非形質導入エフェクターを陰性対照とした。３連で得た赤色細胞数（１／ｍｍ２）の経時変化が示される。 図１５－１の続き。
本発明の発明者らは、腫瘍関連抗原ＰＲＡＭＥ（配列番号３３に示されるＰＲＡＭＥ全長）を発現する細胞及び特に、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）（本明細書ではＰＲＡＭＥＳＬＬとも称される）を発現する細胞を認識する能力を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）クローンを同定している。この配列は特異的な様式で認識される一方で、無関係のペプチドは認識され得ない（図１）。この特異性は、ＰＲＡＭＥ陽性がん細胞株のみが認識されることによって生じるものであり（図４及び図５）、ＰＲＡＭＥに陰性であり、ＰＲＡＭＥが負荷されていない正常細胞が当該ＴＣＲ受容体によって認識されることはない。しかしながら、正常細胞でも、ＰＲＡＭＥＳＬＬペプチドが負荷されると認識されることになる（図６）。この選択的認識は、当該Ｔ細胞受容体の認識モチーフによって得ることが可能なものであり、この認識モチーフに見られる固定位置の数はごく少数である（図３）。配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）のアミノ酸ＬＬＱ及び特にアミノ酸ＨＬＩが、この認識モチーフの一部となっている。これらのアミノ酸は、有利なエフェクター機能（ＰＲＡＭＥペプチドに対する複数の親和性が高度に蓄積して得られる強度（例えば、機能的アビディティー、図２）など）を示す。
要するに、本発明の発明者らが同定したＴ細胞受容体は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ＰＲＡＭＥ及び特にＰＲＡＭＥＳＬＬを発現する細胞を特異的に認識する能力を有する。当該ＴＣＲは、有利なエフェクター機能（サイトカイン産生及び標的細胞の細胞溶解など）を示す。それ故に、当該Ｔ細胞受容体は、高度に特異的かつ有効ながん治療のための有望なツールである。したがって、同定されたＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲは、がんの養子Ｔ細胞療法に適するものである。上に言及したことによって、Ｔ細胞をエクスビボで武装化し、ドナーに再導入することが可能であり、このようにすることで、そうしたＴ細胞がＰＲＡＭＥ発現がん細胞を効率的に認識し、そのようながん細胞を特異的に除去できるようになる（図４及び図５）。この関連では、異なるＨＬＡサブアレルが認識されることが、サブアレル型が異なる患者を試験コホートに含めて世界人口の中での頻度差異をカバー可能にする上で有利であり得る（図７）。本明細書に記載のＴＣＲ受容体は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ならびにＨＬＡ－Ａ＊０２：０２及びＨＬＡ－Ａ＊０２：０４がコードする分子を認識する（図８～１０）。したがって、ＰＲＡＭＥを発現する腫瘍を有するがん患者の大集団に対するがん治療が可能になり得る。さらに、本明細書で提供される新規のＴＣＲの抗原結合領域は、直接的な投与に容易に利用可能な、追加の機能性部分（薬物、標識、または他の免疫細胞を誘引する別の結合ドメインなど）を含む可溶性コンストラクトの設計に使用することができる。
当該技術分野の最新開発状況を踏まえて本発明のＴＣＲの効果をさらに証明するために、本発明者らは、当該ＴＣＲの認識モチーフ、腫瘍細胞認識、機能的アビディティー、及び死滅能力を、当該技術で知られるＴＣＲと比較した。ＷＯ２０１６１４２７８３から２つのＴＣＲ（４６ＳＬＬ及び５４ＳＬＬ）、ＷＯ２０１８２３４３１９から２つのＴＣＲ（ＩｍＣｏｒｅ＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ及びＩｍＣｏｒｅＰｒｅｆＣｏｍｂｉ１）、ならびにＷＯ２０１８１７２５３３に記載の２つの追加のＴＣＲ（Ｒ１１Ｐ３Ｄ３及びＲ１１Ｐ３Ｄ３＿ＫＥ）を選択した。表２は、これらの選択クローンの概要及びそれらのそれぞれの刊行物を示す。
ＴＣＲ ＩｍＣｏｒｅＰｒｅｆＣｏｍｂｉ１ではエフェクター細胞の増殖が見られず、それ故に、ＴＣＲ ＩｍＣｏｒｅＰｒｅｆＣｏｍｂｉ１を、その後の実験に含めることが不可能であったことは、図１１から明らかである。選択したＴＣＲをスレオニンスキャンで分析した（図１２）。このスレオニンスキャンによって、それぞれの認識モチーフを形成するアミノ酸の組成が異なることを証明することが可能であった。重要なことに、選択したＴＣＲはいずれも、同じ実験設定で本発明のＴＣＲ（Ｔ２３．８－２．１－０２７－００４）と比較して低いペプチド濃度で相対ＩＦＮ－ガンマ放出量のＥＣ５０値に到達することはなかった。図１３では、先行技術のＴＣＲで能力が最高のもののＥＣ５０値を本発明のＴＣＲに対してプロットしてある。ＥＣ５０値に到達したペプチド濃度は、ＴＣＲ ５４ＳＬＬでは３．５７×１０－８Ｍ、ＴＣＲ ＩｍＣｏｒｅ＿Ｓｃａｆｆｏｌｄでは１．３１×１０－７Ｍであったのに対して、本明細書に記載のＴＣＲ Ｔ２３．８－２．１－０２７－００４では１．１６×１０－８Ｍであった。他のＴＣＲについても、本発明のＴＣＲほどの良好な能力は発揮されず、それらのＴＣＲでＥＣ５０値に達したペプチド濃度は、８．２７×１０－８Ｍ（Ｒ１１Ｐ３Ｄ３）及び５．７３×１０－８Ｍ（Ｒ１１Ｐ３Ｄ３＿ＫＥ）であった。したがって、本発明のＴＣＲは、先行技術のＴＣＲと比較して高い機能的アビディティーを誘発するものである。
腫瘍細胞の認識についてさらに調べるために、３つのＰＲＡＭＥ発現腫瘍細胞株を、異なるＴＣＲを形質導入したエフェクター細胞と共培養し、それぞれのＩＦＮ－ガンマ放出量を、共培養から２０時間後に測定した（図１４及び表３）。本発明のＴＣＲを形質導入したエフェクター細胞では、腫瘍細胞株であるＭｅｌＡ３７５、ＮＣＩ－Ｈ１６５０、及びＮＣＩ－Ｈ１７０３との共培養後に見られたＩＦＮ－ガンマ放出量が最も多かった。
最終的に、ＰＲＡＭＥを発現する腫瘍細胞株（ＭｅｌＡ３７５＿ＮｕｃｌｉｇｈｔＲｅｄ及びＮＣＩ－Ｈ１６５０＿ＮｕｃｌｉｇｈｔＲｅｄ）を使用して腫瘍細胞の死滅について分析した。図１５及び表４に示されるように、本発明のＴＣＲが形質導入されたエフェクター細胞は、当該技術分野で最新の他のＴＣＲを形質導入したエフェクター細胞と比較して効率的に腫瘍細胞を溶解した。
上述のデータから、本発明のＴＣＲは、先行技術で開示されたＴＣＲと比較して高い機能的アビディティーを有しており、試験した腫瘍細胞株を最良に認識し、ＰＲＡＭＥ陽性腫瘍細胞をより効率的に溶解するものであると結論付けることができる。
可変領域
ＣＤＲ３ドメイン
第１の態様では、本発明は、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）を有するＰＲＡＭＥペプチドもしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態、に結合する能力を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関し、このＴＣＲは、（配列番号６）のアミノ酸配列を含むもしくはからなる、ＴＣＲアルファ鎖可変領域のＣＤＲ３、及び／または（配列番号７）のアミノ酸配列を含むもしくはからなる、ＴＣＲベータ鎖可変領域のＣＤＲ３、を含む。配列番号６との同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列を含むもしくはからなるＣＤＲ３アルファ、及び／または配列番号７との同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列を含むもしくはからなるＣＤＲ３ベータ、を含むＴＣＲ配列バリアントもさらに想定されるが、但し、添付の実施例において評価したＴＣＲの有利な能力をＴＣＲが保持していること、すなわち、本明細書で特定される抗原性標的に結合する能力をＴＣＲが有していることが条件である。
本明細書で使用される「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」という用語は、すべての文法形態において、天然のＴＣＲ、ならびにＴＣＲバリアント、ＴＣＲ断片、及びＴＣＲコンストラクトを含む。したがって、この用語は、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含むヘテロ二量体、ならびに多量体及び一本鎖コンストラクトを含み、これらは、任意選択で追加のドメイン及び／または部分を含む。
ＴＣＲは、その天然形態では、いくつかのタンパク質の複合体としてＴ細胞の表面上に存在する。Ｔ細胞受容体は、２つの（別々の）タンパク質鎖から構成され、これらのタンパク質鎖は、独立したＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子及びＴ細胞受容体ベータ（ＴＣＲβ）遺伝子から産生され、アルファ（α－）鎖及びベータ（β－）鎖と呼ばれる。ＴＣＲの各鎖は、Ｎ末端免疫グロブリン様（Ｉｇ）可変（Ｖ）ドメイン／領域を１つ、Ｉｇ定常様（Ｃ）ドメイン／領域を１つ、当該鎖を細胞膜中に固定する膜貫通／細胞膜貫通領域を１つ、及びＣ末端に位置する短い細胞質尾部を１つ有する。
抗原特異性は、アルファ鎖及びベータ鎖の可変領域によって付与される。ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖の可変ドメインは両方共、フレームワーク（ＦＲ）領域によって囲まれた３つの超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ１アルファ／ベータ、ＣＤＲ２アルファ／ベータ、及びＣＤＲ３アルファ／ベータ）を含む。ＣＤＲ３は、抗原認識及び特異性（すなわち、特異的抗原を認識し、それと相互作用する能力）の主要な決定部であり、一方、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、抗原性ペプチドを提示するＭＨＣ分子と主に相互作用する。
本明細書で提供されるＴＣＲは、本明細書の他の箇所に詳細に論じられるように、ＰＲＡＭＥ、具体的にはそのＭＨＣ結合形態中のＰＲＡＭＥを認識及び特異的に認識する能力を有する。抗原性ペプチドは、それがＭＨＣ分子と共に複合体を形成すると、その「ＭＨＣ結合形態」で存在すると言われる（これは、抗原提示細胞（樹状細胞など）もしくは腫瘍細胞の表面上に存在し得るか、または（例えば、ビーズもしくはプレートにコーティングされることによって）固定化され得る）。
天然のＴＣＲは、抗原提示細胞の表面で主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と結合した（その上に提示／ディスプレイされた）抗原性ペプチドを認識する。ＭＨＣ分子上に提示された抗原性ペプチドは、本明細書では「ペプチド：ＭＨＣ複合体」とも称される。ＭＨＣ分子には２つの異なるクラス（ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ）が存在し、これらは、異なる細胞コンパートメントに由来するペプチドを提示する。ＭＨＣクラスＩ分子は、ヒトの体を通じてすべての有核細胞の表面上に発現し、細胞内コンパートメント由来のペプチドまたはタンパク質断片を細胞傷害性Ｔ細胞にディスプレイする。ヒトでは、ＭＨＣはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれる。ＭＨＣクラスＩには３つの主要な型（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ）が存在する。ＴＣＲがその特異的ペプチド：ＭＨＣ複合体に結合すると、Ｔ細胞が活性化され、生物学的エフェクター機能を発揮する。
「に結合する」及び「認識する」という用語は、すべての文法形態において、本明細書で互換的に使用される。抗原性標的は、ＭＨＣクラスＩ分子、具体的にはＨＬＡ－Ａ分子、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２分子による結合を受けると本発明のＴＣＲによって認識されることが特に想定される。具体的には、抗原性標的は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２アレル、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０４アレルがコードするＨＬＡ－分子によって提示されると本発明のＴＣＲによって認識される。当該ＭＨＣ分子、すなわちＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２アレル、及びＨＬＡ－Ａ＊０２：０４アレルがコードするＭＨＣ分子は、細胞の表面上（例えば、腫瘍細胞の表面上）または（固相）担体上に提示され得る。本発明との関連では、ＰＲＡＭＥＳＬＬペプチドは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０４がコードする分子であるＨＬＡ－Ａ２による結合を受けると本発明のＴＣＲによって認識されることが特に想定される。本発明の好ましい実施形態では、当該ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、及びＨＬＡ－Ａ＊０２：０４がコードする分子による結合を受けるとＰＲＡＭＥＳＬＬペプチドを特異的に認識することができ、すなわち、これらのＨＬＡ－Ａ＊０２アレルがコードする分子の３つすべてと結合する能力を有する。このことは、本発明のＴＣＲが、ＨＬＡアレルであるＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、及びＨＬＡ－Ａ＊０２：０４がコードする分子のそれぞれに結合する能力を有することを意味する。しかしながら、すべてのＨＬＡ－Ａ２分子が一人の患者で同時に認識されることが想定されるわけではなく、これらのＨＬＡ－Ａ２分子は代替物として理解されよう。
ＣＤＲ１ドメイン及びＣＤＲ２ドメイン
上述のように、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２は主にＭＨＣ認識に関与すると考えられている。ＨＬＡ－Ａ＊０２拘束性抗原認識に関与することが知られるＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の「プール」は限られており、本発明のＣＤＲ３ドメインは、配列番号２～５に示されるＣＤＲ１ドメイン及びＣＤＲ２ドメインのいずれとも原理的には組み合わせることができると想定されるが、但し、ＴＣＲがその抗原性標的、好ましくはその抗原性標的のＨＬＡ－Ａ＊０２（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、及びＨＬＡ－Ａ＊０２：０４）結合形態中の当該抗原性標的を、実施例で評価したＴＣＲ ３８２５と同様の程度、同じ程度、またはさらに強い程度で認識する能力を保持することが条件である。ＣＤＲ１ドメイン及びＣＤＲ２ドメインの有用な例としては、配列番号２に示される配列を含むまたはからなるＣＤＲ１アルファ、配列番号４に示される配列を含むまたはからなるＣＤＲ２アルファ、配列番号３に示される配列を含むまたはからなるＣＤＲ１ベータ、及び配列番号５に示される配列を含むまたはからなるＣＤＲ２ベータが挙げられる。これらのＣＤＲ配列は表１にも示されている。
前述の内容によれば、本発明は、とりわけ、２つのポリペプチド鎖を含むＴＣＲを提供し、これらのポリペプチド鎖はそれぞれ、ＴＣＲの少なくとも１つの相補性決定領域（すなわち、具体的にはＣＤＲ３、ならびに好ましくはＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２）を含むヒト可変領域を含む。特定の有利な特性（添付の実施例に示されるもの）を有するＴＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列を含むもしくはからなるＣＤＲ１（ＣＤＲ１アルファ）、配列番号４のアミノ酸配列を含むもしくはからなるＣＤＲ２（ＣＤＲ２アルファ）、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むもしくはからなるＣＤＲ３（ＣＤＲ３アルファ）を含む第１のポリペプチド鎖、及び／または配列番号３のアミノ酸配列を含むもしくはからなるＣＤＲ１（ＣＤＲ１ベータ）、配列番号５のアミノ酸配列を含むもしくはからなるＣＤＲ２（ＣＤＲ２ベータ）、及び配列番号７のアミノ酸配列を含むもしくはからなるＣＤＲ３（ＣＤＲ３ベータ）を含む第２のポリペプチド鎖、を含む。
配列番号２との同一性が少なくとも約６０％、好ましくは配列番号２との同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列を含むもしくはからなるＣＤＲ１アルファ、及び／または配列番号３との同一性が少なくとも約６０％、好ましくは配列番号３との同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列を含むもしくはからなるＣＤＲ１ベータ、を含む、本発明のＴＣＲのＴＣＲ配列バリアントもさらに想定されるが、但し、添付の実施例において評価したＴＣＲの有利な能力をＴＣＲが保持していること、すなわち、本明細書で特定される抗原性標的に結合する能力をＴＣＲが有していることが条件である。配列番号４との同一性が少なくとも約７０％、好ましくは配列番号４との同一性少なくとも８５％であるアミノ酸配列を含むもしくはからなるＣＤＲ２アルファ、及び／または配列番号５との同一性が少なくとも約６５％、好ましくは配列番号５との同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列を含むもしくはからなるＣＤＲ２ベータ、を含む、本発明のＴＣＲのＴＣＲ配列バリアントもさらに想定されるが、但し、添付の実施例において評価したＴＣＲの有利な能力をＴＣＲが保持していること、すなわち、本明細書で特定される抗原性標的に結合する能力をＴＣＲが有していることが条件である。
完全な可変領域
本発明は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むもしくはからなるＴＣＲアルファ鎖可変領域、及び／または配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むもしくはからなるＴＣＲベータ鎖可変領域、を含むＴＣＲをさらに提供する。当該アルファ鎖配列及びベータ鎖配列もまた、表１に示されている。
配列番号８との同一性が少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列を含むアルファ鎖可変領域、及び／または配列番号９との同一性が少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列を含むもしくはからなるＴＣＲベータ鎖可変領域、を含むＴＣＲ配列バリアントも本明細書では想定されるが、但し、添付の実施例において評価したＴＣＲの有利な能力をＴＣＲが保持していること、すなわち、本明細書で特定される抗原性標的に結合する能力をＴＣＲが有していることが条件である。
定常領域
本発明のＴＣＲは、アルファ鎖定常領域及び／またはＴＣＲベータ鎖定常領域を含む。定常領域は、ヒト定常領域であるか、または別の種に由来するものであり得、定常領域が別の種に由来する場合は「キメラ」ＴＣＲが得られる。例えば、ヒトアルファ鎖及び／またはヒトベータ鎖を、そのマウス対応物によって置き換えること（「マウス化」）ができ、「マウス化」は、ＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖との選択的な対形成、ならびにＣＤ３共受容体との結び付きの安定性の向上を支援することによってヒトＴＣＲの表面発現を増強することが明らかになっている。アルファ鎖の適切な定常領域は、例えば、配列番号２６（ヒト）、配列番号２９（最小マウスされたもの）、及び配列番号３１（マウス）から選択され得る。ベータ鎖の適切な定常領域は、配列番号２７（ヒト）、配列番号２８（ヒト）、配列番号３０（最小マウスされたもの）、及び配列番号３２（マウス）から選択され得る。配列番号２７及び配列番号２８に示される２つのＴＣＲベータ定常領域は、少数のアミノ酸が異なるヒト配列である。それらは代替物として理解されよう。完全なヒト定常領域をそのマウス対応物によって置き換える代わりに、ヒト定常領域中のいくつかのアミノ酸に限ってマウス定常領域の対応アミノ酸に交換すること（「最小マウス化」）も可能である。このことについては、本明細書の「ＴＣＲ配列バリアント」セクションにてさらに説明される。本発明は、こうした目的に適した様式で定常領域と可変領域とを組み合わせ可能であることをさらに想定している。このシナリオでは、定常領域及び可変領域は、ヒトもしくはマウスに由来するか、または上記の最小マウス化のプロセスによって達成され得る。
アルファ鎖及びベータ鎖
本発明のＴＣＲの有用な例としては、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むもしくはからなるアルファ鎖、及び／または配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むもしくはからなるベータ鎖を含むものが挙げられる。
配列番号１０との同一性が少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列を含むアルファ鎖、及び／または配列番号１１との同一性が少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列を含むもしくはからなるＴＣＲベータ鎖、を含むＴＣＲ配列バリアントも本明細書では想定されるが、但し、添付の実施例において評価したＴＣＲの有利な能力をＴＣＲが保持していること、すなわち、本明細書で特定される抗原性標的に結合する能力をＴＣＲが有していることが条件である。
抗原性標的
本明細書で提供されるＴＣＲは、（ヒト）ＰＲＡＭＥ（配列番号１）（ＰＲＡＭＥＳＬＬとも呼ばれる）に有利に結合する能力を有する。したがって、当該ＴＣＲは、配列番号１に示されるＰＲＡＭＥペプチド（ＰＲＡＭＥＳＬＬとも呼ばれる）に特異的である。本発明との関連での「に特異的」という用語は、ＴＣＲが標的に特異的に結合することを意味する。ＰＲＡＭＥ（黒色腫に選択的に発現する抗原、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ７８３９５）は、ＭＡＰＥ（腫瘍に選択的に発現する黒色腫抗原）及びＯＩＰ４（ＯＰＡ相互作用タンパク質４）とも称されており、機能未知のがん精巣抗原（ＣＴＡ）として報告されている。ＰＲＡＭＥは、黒色腫及び白血病、ならびに慢性骨髄性白血病と関連するタンパク質をコードする遺伝子である。この遺伝子に関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）アノテーションは、レチノイン酸受容体結合を含む。ＰＲＡＭＥタンパク質は転写リプレッサーとして機能し、レチノイン酸受容体であるＲＡＲＡ、ＲＡＲＢ、及びＲＡＲＧを介してレチノイン酸のシグナル伝達を阻害する。これによって、細胞増殖停止、分化、及びアポトーシスがレチノイン酸によって誘導されることが妨げられる。
好ましくは、本発明のＴＣＲは、その抗原性標的に特異的に結合する。具体的には、本発明は、配列番号１に示されるＰＲＡＭＥアミノ酸配列（表１を参照のこと）内に含まれるペプチドと結合する能力を有するＴＣＲを提供する。「結合する能力を有する」という用語は、当該ＴＣＲが当該ペプチドに特異的に結合することを意味する。「特異的な結合（特異的に結合する）」という用語は、一般に、ＴＣＲが、その抗原結合部位を介して、無作為な無関係の非標的抗原と比較してその所期の抗原性標的に容易に結合することを示す。具体的には、「特異的に結合する」という用語は、ＴＣＲの、その抗原性標的に対する結合特異性が、非標的抗原に対する当該ＴＣＲの結合特異性と比較して、少なくとも約５倍、好ましくは１０倍、より好ましくは２５倍、さらにより好ましくは５０倍、最も好ましくは１００倍以上高いことを示す。配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＰＲＡＭＥペプチドは、本明細書では「抗原性標的」または「ＳＬＬペプチド」とも称される。したがって、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＰＲＡＭＥペプチドは、本発明のＴＣＲの標的エピトープであるか、または本発明のＴＣＲの標的エピトープを構成する。
「エピトープ」という用語は、一般に、結合ドメインが認識する抗原上の一部位（典型的には（ポリ）ペプチド）を指す。「結合ドメイン」という用語は、その広義では「抗原結合部位」を指し、すなわち、分子のうちで、抗原性標的上の特異的エピトープと結合／相互作用するドメインを特徴付ける。抗原性標的は、単一のエピトープを含み得るが、典型的には、少なくとも２つのエピトープを含み、抗原のサイズ、立体構造、及び型に応じて任意の数のエピトープを含み得る。「エピトープ」という用語は、一般に、直鎖状エピトープ及び構造的エピトープを包含する。直鎖状エピトープは、アミノ酸一次配列中に含まれる連続エピトープであり、典型的には、少なくとも２つ以上のアミノ酸を含む。構造的エピトープは、標的抗原、具体的には標的（ポリ）ペプチドのフォールディングによって寄り集まった非連続アミノ酸によって形成される。
本発明の発明者らは、本発明のＴＣＲによって認識される最小のアミノ酸配列が、ＰＲＡＭＥのアミノ酸配列（配列番号１）に対応するものであることを明らかにしている。具体的には、本発明のＴＣＲは、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）を含むもしくはからなるアミノ酸配列またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態（添付の実施例に示されるもの）を（特異的に）認識することが示されている。この選択的認識は、当該Ｔ細胞受容体の認識モチーフによって得ることが可能なものであり、この認識モチーフに見られる固定位置の数はごく少数である（図３）。配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）のアミノ酸ＬＬＱ及び特にアミノ酸ＨＬＩが、この認識モチーフの一部となっている。具体的には、本明細書に記載のＴＣＲは、前述のアミノ酸配列中に含まれる少なくとも１つのエピトープを認識することが想定される。さらに、本発明のＴＣＲは、当該技術分野で知られる他のＴＣＲの認識パターンとは著しく異なる認識モチーフを有する（図１２）。
本明細書に記載の天然のＴＣＲは、高い機能的アビディティーを伴ってその抗原性標的（すなわち、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０４がコードする分子の上に抗原提示細胞によって提示されるＰＲＡＭＥ）に結合することが想定される。「機能的アビディティー」という用語は、ＴＣＲ発現細胞（具体的には、本明細書に記載の天然のＴＣＲを発現するＴ細胞）が所与の濃度のリガンドにインビトロで反応する能力を指し、ＴＣＲ発現細胞のインビボでのエフェクター能力と相関するものであると考えられる。定義によれば、ＴＣＲ発現細胞は、その機能的アビディティーが高いと、インビトロ試験において非常に低い抗原用量に反応する一方で、そのような細胞は、その機能的アビディティーが低いと、アビディティーが高いＴＣＲ発現細胞のものと同様の免疫応答を開始するまでにより多くの量の抗原を必要とする。したがって、機能的アビディティーは、ＴＣＲ発現細胞の活性化閾値の定量的な決定要因であると考えることができる。機能的アビディティーは、そのような細胞を、異なる量の対応抗原にインビトロで曝露することによって決定される。機能的アビディティーが高いＴＣＲ発現細胞は、低用量の抗原に反応する。
例えば、ＴＣＲ発現細胞は、分子量が９５６ｇ／ｍｏｌであるＰＲＡＭＥペプチドを約１０－５～約１０－１１Ｍ（すなわち、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、または５ｎｇ／ｍＬ）の範囲の低いＰＲＡＭＥペプチド濃度で負荷した抗原陰性のＨＬＡ－Ａ２発現標的細胞との共培養時にインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）を少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬ以上（例えば、２００ｐｇ／ｍＬ以上、３００ｐｇ／ｍＬ以上、４００ｐｇ／ｍＬ以上、５００ｐｇ／ｍＬ以上、６００ｐｇ／ｍＬ以上、７００ｐｇ／ｍＬ以上、１０００ｐｇ／ｍＬ以上、５，０００ｐｇ／ｍＬ以上、７，０００ｐｇ／ｍＬ以上、１０，０００ｐｇ／ｍＬ以上、または２０，０００ｐｇ／ｍＬ以上）分泌するのであれば、「高い」機能的アビディティーを伴ってその抗原性標的に結合すると典型的には考えられることになる。したがって、本発明のＴＣＲは、最大相対ＩＦＮ－ガンマ分泌量の５０％を与える濃度（ＥＣ５０値）が、ＩＦＮ－ガンマイムノアッセイによって測定すると１０－７Ｍ未満である高アビディティーＴＣＲである。好ましくは、最大相対ＩＦＮ－ガンマ分泌量の５０％を与える濃度（ＥＣ５０値）は、ＩＦＮ－ガンマイムノアッセイによって測定すると１０－８Ｍ未満である（図２）。本発明のＴＣＲのアビディティーが高いことは、当該技術分野で開示されている他のＴＣＲとの比較を各ＴＣＲのＥＣ５０値の決定によって行うことによって、さらに証明されている（図１３）。
本発明は、ＴＣＲが形質導入またはトランスフェクトされた細胞によるＩＦＮ－ガンマの分泌が、配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）もしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態への結合によって誘導されることを含む。エフェクター細胞上に発現した本発明のＴＣＲが配列番号１のアミノ酸配列（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０４がコードする分子によって提示される）に結合することによって誘導されるＩＦＮ－ガンマの分泌量は、配列番号１のアミノ酸配列（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０４がコードする分子によって提示される）への結合の場合、無関係のペプチド（配列番号２５に示されるアミノ酸配列ＧＬＳＮＴＨＶＬ）（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０４がコードする分子によって提示される）への結合と比較して、１００倍超多く、好ましくは５００倍超多く、より好ましくは２０００倍超多くあり得る。ＩＦＮ－ガンマの分泌量は、例えば、１００ｐｇ／ｍｌ超（５００ｐｇ／ｍｌ超または２０００ｐｇ／ｍｌ超など）であり得る。
サイトカイン放出（ＩＦＮ－ガンマ分泌など）は、インビトロアッセイを使用して測定することができ、このインビトロアッセイでは、Ｋ５６２細胞（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ．２００６ Ｄｅｃ １５；１０８（１３）：４１０９－１７）が、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列または無関係のペプチドを発現するようにｉｖｔＲＮＡのトランスフェクトまたは形質導入に供され、調べるべきＴＣＲを発現するＣＤ８＋濃縮ＰＢＭＣ及び／または非ＣＤ８＋濃縮ＰＢＭＣと共にそれらの細胞がインキュベートされる。あるいは、配列番号１または無関係のペプチドのいずれかを外部からＴ２細胞に負荷した後、調べるべきＴＣＲを発現するＣＤ８＋濃縮ＰＢＭＣ及び／または非ＣＤ８＋濃縮ＰＢＭＣと共に当該Ｔ２細胞を共インキュベートするインビトロアッセイにおいてもサイトカイン放出（ＩＦＮ－ガンマ分泌など）を測定することができる。
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の単離されたＴＣＲ、本明細書に記載のポリペプチド、または本明細書に記載の多価ＴＣＲ複合体を指し、エフェクター細胞上に発現した本発明のＴＣＲが配列番号１のアミノ酸配列、または具体的には、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０４がコードする分子によって提示された配列番号１のアミノ酸配列に結合することによって誘導されるＩＦＮ－ガンマの分泌量は、所定の閾値を下回る。閾値は、特定のエフェクターと標的との比を少なくとも２：１にすることによって決定され得る。「エフェクター細胞」は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。典型的には、エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）である。特定の適切なエフェクター細胞には、本明細書に他の箇所に記載されるように、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ガンマ／デルタＴ細胞が含まれる。
ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０４がコードする分子によって提示された配列番号１のアミノ酸配列に対してエフェクター細胞上に発現した本発明のＴＣＲが結合したときのＩＦＮ－ガンマの分泌は、少なくとも１０－７Ｍ、好ましくは少なくとも１０－８Ｍ、より好ましくは１０－９ＭのＰＲＡＭＥＳＬＬペプチド濃度で誘導され得る。特定の実施形態では、例えばＴＣＲトランスジェニックＴ細胞とＴ２細胞との比が２：１の場合、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１がコードする分子によって提示された配列番号１のアミノ酸配列に対してエフェクター細胞上に発現した本発明のＴＣＲが結合することによって生じるＩＦＮ－ガンマの分泌は、少なくとも１０－７Ｍ、好ましくは少なくとも１０－８Ｍ、より好ましくは１０－９ＭのＰＲＡＭＥＳＬＬペプチド濃度で誘導され得る。本発明のＴＣＲの特異的結合を決定するための他の方法には、Ｇｅｒｔｎｅｒ－Ｄａｒｄｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８８（９）：４７０１－４７０８によって説明されている＜５１＞Ｃｒ放出アッセイ、Ｌｅｉｓｅｇａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１０．１６：２３３３－２３４３によって説明されているＣＤ１０７ａ／ｂ表面発現、及びＷｉｌｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１２；１８９：５９８－６０５によって説明されているペプチド：ＭＨＣ多量体結合分析が含まれる。
バリアント
上述のように、「ＴＣＲ」という用語はＴＣＲバリアントを包含し、こうしたＴＣＲバリアントには、ＴＣＲ配列バリアント、ＴＣＲ断片、及びＴＣＲコンストラクトが含まれる。すべてのＴＣＲバリアントが本発明のＴＣＲの機能性バリアントであることが想定される。本明細書で使用される「機能性バリアント」という用語は、親ＴＣＲ、その可変領域、またはその抗原結合領域との配列同一性または配列類似性が実質的または顕著なものであり、その生物学的活性、すなわち本発明の親ＴＣＲが抗原特異性を有する抗原性標的に対して、本明細書に開示され、添付の実施例で評価したＴＣＲと同様の程度、同じ程度、またはさらに強い程度で特異的に結合するその能力を共有するＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。本発明は、ＴＣＲ配列バリアントも包含する。
「ＴＣＲバリアント」という用語は、本明細書に開示のＴＣＲの「配列バリアント」を含み、この「配列バリアント」は、すなわち、上記の本発明のＴＣＲ（「親」ＴＣＲとも称される）のアミノ酸配列を実質的に含むが、「親」ＴＣＲアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変（すなわち、置換、欠失、または挿入）を含むバリアントであるが、但し、そうしたバリアントが、好ましくは、本発明の「親」ＴＣＲの抗原特異性を保持することが条件である。本発明のＴＣＲ配列バリアントは、典型的には、「親」ＴＣＲをコードする核酸への適切なヌクレオチド変更の導入、またはペプチド合成によって調製される。一般に、前述のアミノ酸改変は、ＴＣＲの可変領域または定常領域に導入されるか、またはそこに存在し得るものであり、結合の強度及び特異性、翻訳後プロセシング（例えば、グリコシル化）、熱力学的安定性、溶解性、表面発現、またはＴＣＲ構築のような特性の調節に役立ち得る。
上述のように、アミノ酸改変には、例えば、親ＴＣＲのアミノ酸配列に含まれる残基からの欠失及び／またはそこへの挿入及び／またはその置換が含まれる。本発明のＴＣＲの挿入バリアントの例としては、当該ＴＣＲと酵素または別の機能性ポリペプチドとの融合産物が挙げられる。本発明のＴＣＲの置換バリアントの例は、アルファ鎖及び／またはベータ鎖の可変領域またはＣＤＲ、フレームワーク領域、あるいは定常領域中にアミノ酸置換を含むものである。具体的には、本明細書では保存的アミノ酸置換が想定される。保存的アミノ酸置換は当該技術分野で知られており、そうした保存的アミノ酸置換には、ある特定の物理的及び／または化学的特性を有する１つのアミノ酸が、同じ化学的特性または物理的特性を有する別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換が含まれる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）に置換されるもの、非極性側鎖を有するアミノ酸が非極性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌなど）に置換されるもの、塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇなど）に置換されるもの、極性側鎖を有するアミノ酸が極性側鎖を有する別のアミノ酸（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）に置換されるものなどであり得、これらの置換は、例えば、関与残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／または両親媒性、の類似性に基づいて行われ得る。
一般に、ＴＣＲ配列バリアントは、本明細書に開示のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、アルファ鎖可変領域、ベータ鎖可変領域、アルファ鎖、及び／またはベータ鎖、あるいは本明細書に開示のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含むまたはからなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、アルファ鎖可変領域、ベータ鎖可変領域、アルファ鎖、及び／またはベータ鎖、のうちの少なくとも１つを含むことが想定されるが、但し、当該バリアントが示す結合特性が、添付の実施例で評価したＴＣＲと比較して同等であるか、同じであるか、または改善されることが条件である。
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、２つの（ヌクレオチドまたはアミノ酸）配列がアライメントにおいて同じ位置に同一残基を有する程度を示し、パーセントとして表されることが多い。好ましくは、同一性は、比較される配列の全長にわたって決定される。したがって、正確に同じ配列の２つのコピーの同一性は１００％であるが、高度保存度が低く、欠失、追加、または置換を有する配列の同一性の度合いは低くなり得る。標準的なパラメーターを使用する配列同一性の決定にはいくつかのアルゴリズムが利用可能であることを当業者なら認識するであろう。こうしたアルゴリズムは、例えば、Ｂｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）、及びＣｌｕｓｔａｌＷである。
したがって、配列番号１０または配列番号１１のアミノ酸配列は、例えば、「対象配列」または「参照配列」となり得、一方、それとは異なるＣＤＲ３のアミノ酸配列は「問い合わせ配列」となり得る。
「位置」という用語は、本開示に従って使用される場合、本明細書に示されるアミノ酸配列内のアミノ酸の位置、または本明細書に示される核酸配列内のヌクレオチドの位置を意味する。本明細書で使用される「対応する」という用語は、順序的に先に位置するヌクレオチド／アミノ酸の数によって位置が決定されることだけではなく、配列の周囲部分と関連付けて位置が判断されることも含む。したがって、本開示による所与のアミノ酸またはヌクレオチドの位置は、配列中の他の位置のアミノ酸もしくはヌクレオチドの欠失または配列中の他の位置へのアミノ酸もしくはヌクレオチドの追加に起因して変わり得る。したがって、位置が「対応位置」と称される場合、本開示によれば、ヌクレオチド／アミノ酸は、特定の数詞に関しては異なり得るが、依然として同様の隣接ヌクレオチド／アミノ酸を有し得ることが理解されよう。所与の配列中のアミノ酸残基（またはヌクレオチド）が、「親」アミノ酸／ヌクレオチド配列のアミノ酸配列中のある特定の位置に対応するかどうかを決定するために、手作業で、またはコンピュータープログラム（本明細書で例示されるものなど）を使用することによって、当該技術分野でよく知られる手段及び方法（例えば、配列アライメント）を当業者なら使用することができる。
対照として本明細書で使用されるＴＣＲバリアントはＴＣＲ受容体３８２５である。このバリアントは、ＰＲＡＭＥに対するＴＣＲ受容体を発現したＰＲＡＭＥ免疫化マウス（マウスＩＤ３８２５）に基づくものであり、配列番号２３に示されるＣＤＲ３アルファ配列（ＣＡＶＥＰＧＧＳＹＩＰＴＦ）、配列番号２４に示されるＣＤＲ３ベータ配列（ＣＡＳＳＰＧＬＳＹＥＱＹＦ）を有する。コドン最適化オリゴヌクレオチドを含むＴＣＲライブラリーを介して、このＴＣＲの組換え発現及び分析が可能であった（Ｗｅｉｓ，Ｍａｎｏｎ（２０１５）：Ｃｈａｒａｋｔｅｒｉｓｉｅｒｕｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｚｉｆｉｓｃｈｅｒ Ｔ－Ｚｅｌｌｅｎ ｎａｃｈ Ｉｎｄｕｋｔｉｏｎ ｉｎ ＴＣＲ－ｈｕｍａｎｉｓｉｅｒｔｅｎ Ｍａｕｓｅｎ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，ＬＭＵ Ｍｕｎｃｈｅｎ Ｔｉｅｒａｒｚｔｌｉｃｈｅ Ｆａｋｕｌｔａｔ：Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｆａｃｕｌｔｙ Ｌｕｄｗｉｇｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｕｎｉｃｈ）。
システイン改変
定常領域中にジスルフィド結合を追加することによってＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖との正しい対形成が促進されることが報告されている（Ｋｕｂａｌｌ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００７ Ｍａｒ．１５；１０９（６）：２３３１－８．）。したがって、本明細書では１つ以上のシステイン結合を定常領域中に追加することも想定される。
マウス化
上述のように、ＴＣＲのマウス化（すなわち、アルファ鎖及びベータ鎖中のヒト定常領域を、それらのマウス対応物によって交換すること）は、宿主細胞でのＴＣＲの細胞表面発現を改善するために一般に適用される手法である。特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、マウス化されたＴＣＲはＣＤ３共受容体とより効率的に結び付き、及び／または互いに選択的に対を形成し、エクスビボで操作されたヒトＴ細胞上で混合ＴＣＲを形成する傾向が低いことで、所望の抗原特異性を有するＴＣＲを発現する一方で、その「元の」ＴＣＲを依然として保持及び発現すると考えられている。
最近、マウス化ＴＣＲの発現改善に関与するアミノ酸が９つ同定されており（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ ａｎｄ Ｕｃｋｅｒｔ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０ Ｊｕｎ．１；１８４（１１）：６２２３－３１）、ＴＣＲアルファ鎖定常領域中及び／またはＴＣＲベータ鎖定常領域中のこれらのアミノ酸残基のうちの１つまたはすべてを、そのマウス対応残基に置き換えることが想定される。この手法は、「最小マウス化」とも称され、細胞表面発現を増強するという利点を与える一方で、同時に、アミノ酸配列中の「外来」アミノ酸残基の数を低減し、それによって免疫原性のリスクを低減するものである。
コンストラクト及び断片
本明細書で使用される「ＴＣＲ」という用語は、ＴＣＲコンストラクトをさらに含む。「コンストラクト」という用語は、本発明のＴＣＲの少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含むが、こうしたタンパク質またはポリペプチドは、天然のＴＣＲの基本構造（すなわち、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖に可変ドメインが組み込まれており、これらの鎖がヘテロ二量体を形成しているもの）を必ずしも共有するわけではない。ＴＣＲコンストラクト及びＴＣＲ断片は、典型的には、所定の遺伝子操作方法によって得られるものであり、追加の機能性タンパク質ドメインまたは機能性ポリペプチドドメインを含むように人工的に構築されることが多い。前述の内容によれば、本発明のＴＣＲコンストラクト及びＴＣＲ断片は、少なくとも１つのＣＤＲ３アルファ（本明細書の他の箇所に開示のもの）及び／または少なくとも１つのＣＤＲ３ベータ（本明細書の他の箇所に開示のもの）を含むことが想定される。本明細書では、少なくとも１つのＣＤＲ１アルファ、少なくとも１つのＣＤＲ２アルファ、少なくとも１つのＣＤＲ１ベータ、少なくとも１つのＣＤＲ２ベータ、少なくとも１つのアルファ鎖可変領域、少なくとも１つのベータ鎖可変領域、少なくとも１つのアルファ鎖、及び／または少なくとも１つのベータ鎖、あるいはそれらの組み合わせを、本明細書に例示される追加のタンパク質ドメインまたは部分と任意選択で組み合わせて含むコンストラクト及び断片がさらに想定される。本明細書で提供されるＴＣＲコンストラクト及びＴＣＲ断片は、上に説明され、添付の実施例で評価した本発明のＴＣＲと同じ抗原性標的に特異的に結合する能力を有することが想定される。
多量体
本発明のＴＣＲコンストラクトは、少なくとも１つのＴＣＲアルファ鎖可変領域またはＴＣＲアルファ鎖と、少なくとも１つのＴＣＲベータ鎖可変領域とが互いに共有結合で連結されてＴＣＲヘテロ二量体またはＴＣＲ多量体を形成したヘテロ二量体及び多量体を包含する。本発明で使用される「多量体」は、多様なサブユニットまたは機能性実体の分子を説明するものである一方で、ヘテロ二量体は、２つの機能性実体のみを含む。本発明による多価ＴＣＲコンストラクトは、その最も単純な形態では、２つまたは３つまたは４つまたはそれを超える数のＴＣＲが（好ましくは、リンカー分子を介して）互いに結び付いた（例えば、共有結合またはその他の様式で連結された）多量体を含む。この関連では、「共有結合で連結された」は、２つの分子（電子対を共有している）の間に化学結合が存在することを意味し、原子結合の間に安定なバランスが保たれていることを説明するものである。
球体、好ましくは均一なビーズ、より好ましくはポリスチレンビーズ、最も好ましくは生体適合性ポリスチレンビーズに対する適切なリンカー。そのようなＴＣＲコンストラクトは、本発明のＴＣＲと、所定の蛍光色素が組み込まれたビーズと、から構成されることもあり得る。適切なリンカー分子には、限定されないが、多価結合分子（アビジン、ストレプトアビジン、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ、及びｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ（これらはそれぞれ、ビオチンに対する結合部位を４つ有する）など）が含まれる。したがって、ビオチン化ＴＣＲは、複数のＴＣＲ結合部位を有する多量体を形成し得る。多量体中のＴＣＲの数は、多量体の調製に使用されるリンカー分子の量に対するＴＣＲの量に依存すると共に、いずれかの他のビオチン化分子の存在または不在にも依存することになる。多量体の例は、二量体ＴＣＲコンストラクト、三量体ＴＣＲコンストラクト、四量体ＴＣＲコンストラクト、もしくは五量体ＴＣＲコンストラクト、またはより高次の多量体ＴＣＲコンストラクトである。本発明の多量体は、追加の機能性実体（標識または薬物または（固相）担体など）も含み得る。
融合タンパク質
ＴＣＲヘテロ二量体またはＴＣＲ多量体は、少なくとも１つのＴＣＲアルファ鎖、少なくとも１つのＴＣＲアルファ鎖可変領域、もしくは少なくとも１つのＣＤＲ３アルファ及び／または少なくとも１つのＴＣＲベータ鎖、少なくとも１つのＴＣＲベータ鎖可変領域、もしくは少なくとも１つのＣＤＲ３ベータと、追加の１つ以上の融合要素（複数可）と、を含む融合タンパク質または融合ポリペプチドにも関する。ＴＣＲヘテロ二量体またはＴＣＲ多量体は、少なくとも１つのＴＣＲアルファ鎖（本明細書で定義されるもの）及び／または少なくとも１つのＴＣＲベータ鎖（本明細書で定義されるもの）、及び／またはリンパ球の表面上の抗原もしくはエピトープに対する抗体もしくは一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）であり得、また、ＴＣＲアルファ鎖（複数可）とＴＣＲベータ鎖（複数可）とは互いに連結され、リンカーを任意選択で介して当該抗体またはｓｃＦｖと融合される。有用な要素には、Ｆｃ受容体、Ｆｃドメイン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＭに由来するもの）、サイトカイン（ＩＬ－２またはＩＬ－１５など）、毒素、抗体またはその抗原結合断片（抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ１６抗体、もしくは抗ＣＤ５６抗体、またはその抗原結合断片など）、ＣＤ２４７（ＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ１３７ドメイン、ＣＤ１３４ドメイン、あるいはそれらの任意の組み合わせ、が含まれる。
融合要素として使用され得る抗体断片の例としては、全長抗体の断片（（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または「ｒ ＩｇＧ」（「半抗体」））、改変抗体断片（ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖまたはｂｉ（ｓ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、タンデム型ダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ）、タンデム型ｄｉ－ｓｃＦｖ、タンデム型ｔｒｉ－ｓｃＦｖ、ミニボディ、マルチボディ（トリアボディまたはテトラボディなど）、及び単一ドメイン抗体（ナノボディ、または可変ドメインを１つのみ含む単一可変ドメイン抗体（ＶＨＨ、ＶＨ、またはＶＬであり得る）など）など）が挙げられる。
本発明のＴＣＲコンストラクトを１つ以上の抗体または抗体断片と融合することで、一価のコンストラクト、二価のコンストラクト、及び多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）／多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）のコンストラクトを得ることができ、したがって、単一特異性コンストラクト（１つの標的抗原にのみ特異的に結合する）ならびに二重特異性コンストラクト及び多重特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）／多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）コンストラクト（異なる抗原結合部位を介して複数種類の標的抗原（例えば、２つ、３つ、またはそれを超える種類数）に特異的に結合する）を得ることができる。
本発明のＴＣＲコンストラクトのドメインまたは領域の１つ以上の間に任意選択でリンカーを導入することができ、すなわち、ＴＣＲアルファ鎖ＣＤＲ３、ＴＣＲアルファ鎖可変領域、及び／またはＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖ＣＤＲ３、ＴＣＲベータ鎖可変領域、及び／またはＴＣＲベータ鎖、及び／または１つ以上の融合要素（複数可）（本明細書に記載のもの）、の間に任意選択でリンカーを導入することができる。リンカーは当該技術分野で知られており、とりわけ、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１３ Ｏｃｔ．１５；６５（１０）：１３５７－１３６９によって概説されている。一般に、リンカーには、可動性のリンカー、切断可能なリンカー、及び剛性のリンカーが含まれ、こうしたリンカーは、コンストラクトの型及び所期の使用／用途に応じて選択されることになる。例えば、治療用途については、有害な免疫原性反応が生じるリスクを低減しつつドメイン間にある程度の可動性または相互作用を確保する上では、非免疫原性の可動性リンカーが好ましいことが多い。そのようなリンカーは、一般に、小さな非極性アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）または極性アミノ酸（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）から構成され、そのようなリンカーには、Ｇｌｙ残基及びＳｅｒ残基の区間からなる「ＧＳ」リンカーが含まれる。
本発明に従って想定される特に有用なＴＣＲコンストラクトは、少なくとも１つのＴＣＲアルファ鎖、少なくとも１つのＴＣＲアルファ鎖可変領域、または少なくとも１つのＣＤＲ３アルファ（本明細書で定義されるもの）、少なくとも１つのＴＣＲベータ鎖、少なくとも１つのＴＣＲベータ鎖可変領域、または少なくとも１つのＣＤＲ３ベータ（本明細書で定義されるもの）を含み、これらが任意選択で互いに連結され、リンパ球の表面上の抗原またはエピトープに対する少なくとも１つの抗体または抗体断片（一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）など）とリンカーを任意選択で介して融合されたものである。抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）によって認識される有用な抗原性標的には、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、及びＣＤ５６が含まれる。当該コンストラクトは、一般に、任意の構造を有し得るが、但し、「ＴＣＲ部分」（すなわち、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖またはその可変領域もしくはＣＤＲ３）が、本明細書で定義される抗原性標的を認識する能力を保持し、「抗体部分」が所望の表面抗原またはエピトープに結合し、それによってそれぞれのリンパ球が動員され、標的細胞がそうしたリンパ球の標的となることが条件である。そのようなコンストラクトは、抗原性標的（腫瘍細胞など）をディスプレイする抗原提示細胞と、リンパ球（細胞傷害性Ｔ細胞またはＮＫ細胞など）とを一緒に結び付ける「アダプター」として有利に働き得る。そのような融合タンパク質の一例は、異なる抗体に由来する２つの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が約５５キロダルトン（ｋＤａ）の単一ペプチド鎖に存在するのものからなる二重特異性Ｔ細胞誘導剤（ＢｉＴＥ（登録商標））の原理に従って操作されたコンストラクトである。したがって、本発明のＴＣＲコンストラクトは、所望の結合特異性（例えば、ＣＤ３またはＣＤ５６）を有するｓｃＦｖ（または他の結合ドメイン）と連結された少なくとも１つのＴＣＲ抗原結合ドメイン（本明細書に記載のもの）（例えば、ＴＣＲ可変アルファ鎖とＴＣＲ可変ベータ鎖とが互いに融合されたもの）を含み得る。ｓｃＦｖ（または他の結合ドメイン）は、ＣＤ３受容体を介すなどしてＴ細胞に結合するか、またはＮＫ細胞の活性化についてはＣＤ５６に結合し、もう一方のものは、腫瘍細胞上に特異的に発現した抗原性標的を介して腫瘍細胞に結合する。少なくとも１つのＴＣＲ抗原結合ドメイン（本明細書に記載のもの）、ｓｃＦｖ（または他の結合ドメイン）、及び追加のドメイン（例えば、体内の作用部位をコンストラクトの標的にするためのもの）（例えば、Ｆｃドメイン）を含むトリボディも本明細書では想定される。
単離された形態
本発明のＴＣＲは、「単離された」形態または「実質的に純粋な」形態で提供され得る。「単離された」または「実質的に純粋な」は、本明細書で使用される場合、ＴＣＲが、その産生環境の成分から同定、分離、及び／または回収されており、その結果、「単離された」ＴＣＲは、その治療用途または診断用途を妨害し得るその産生環境由来の他の混入成分を含まないか、または実質的に含まないことを意味する。混入成分には、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれ得る。したがって、「単離された」ＴＣＲは、ＴＣＲを得るための方法によって調製されることになり、この方法は、当該ＴＣＲが発現する条件の下で宿主細胞をインキュベートし、当該ＴＣＲを精製することによるものであり、したがって、こうした混入成分を除去または実質的に除去する精製ステップを少なくとも１つ含む。前述の定義は、「単離された」ポリヌクレオチド／核酸に等しく準用可能である。
可溶性形態
本発明のＴＣＲは可溶性形態で提供され得る。可溶性ＴＣＲは、診断ツールとして、さらには、（例えば、可溶性ＴＣＲによって認識される抗原性標的を発現するがん細胞）を特異的に治療剤またはエフェクター細胞の標的にする担体または「アダプター」として有用である。可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）は、典型的には、ＴＣＲアルファ鎖及び／またはＴＣＲベータ鎖あるいはその可変領域またはＣＤＲを含む断片またはコンストラクトであり、任意選択で、ジスルフィド結合を介して安定化されるか、または適切なリンカー分子（例えば、本発明のＴＣＲコンストラクトとの関連で上に記載されるもの）を介して共有結合で連結されることになる。ｓＴＣＲは、典型的には、例えば膜貫通領域を含まない。状況によっては、（望まれる場合は）分子の溶解性を増強し、及び／またはアルファ鎖及びベータ鎖のフォールディング及び対形成を正しく生じさせるためにポリペプチド配列にアミノ酸改変を施すことができ、具体的には、このアミノ酸改変は、前述の特徴が得られない組換え宿主でポリペプチド配列が産生される場合に施される。Ｅ．ｃｏｌｉを産生宿主細胞として使用する場合、例えば、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖のフォールディング及び対形成は、典型的には、インビトロで達成される。したがって、本発明によるＴＣＲは、例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように追加のシステイン残基を含み得る。
追加のシステイン架橋以外の他の有用な改変には、例えば、ロイシンジッパー及び／またはリボソームスキッピング配列（例えば、Ｗａｌｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１５），ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（４）：ｅ０１１９５５９に記載のピコルナウイルス由来の２Ａ配列）を追加して、ＴＣＲアルファ鎖及び／またはＴＣＲベータ鎖のフォールディング、発現、及び／または対形成を増加させることが含まれる。
改変
本発明のＴＣＲは、以下に記載の改変を１つ以上さらに含み得る。以下に記載の改変は、典型的には、共有結合改変であり、当該技術分野で知られる標準的な手法を使用して達成され得る。状況によっては、当該改変の導入を促進するためにＴＣＲ中のアミノ酸改変が必要になり得る。
分子マーカー
本発明のＴＣＲ、具体的には（可溶性）ＴＣＲは、少なくとも１つの分子マーカーで標識化され得る。当該技術分野では有用な分子マーカーが知られており、所定の方法を使用してそうした分子マーカーを、さまざまな長さのリンカーを任意選択で介してＴＣＲまたはＴＣＲバリアンとカップリングさせることができる。
一般に、異なるマーカーは、それが検出されるアッセイに応じてさまざまなクラスに分類され、その例としては、限定されないが、同位体マーカー（放射性同位体もしくは重同位体（放射性同位体もしくは放射性核種（例えば、＜３＞Ｈ、＜１４＞、＜１５＞Ｎ、＜３５＞Ｓ、＜８９＞Ｚｒ、＜９０＞Ｙ、＜９９＞Ｔｃ、＜１１１＞Ｉｎ、＜１２５＞Ｉ、＜１３１＞Ｉ）など）であり得る）、磁性マーカー（例えば、磁性粒子）、酸化還元活性部分、光学色素（限定されないが、発色団、リン光体、及びフルオロフォアを含む）（蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、化学発光基、及びフルオロフォア（「小分子」フルオロフォアもしくはタンパク質性フルオロフォアのいずれかであり得る）など）、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｂ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ビオチン化基、または二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）が挙げられる。ＴＣＲ、ＴＣＲバリアント、または特に可溶性ＴＣＲコンストラクト（少なくとも１つのＴＣＲアルファ鎖及び／またはＴＣＲベータ鎖（本明細書に記載のもの）を含むものなど）が診断用途を意図するものである場合、分子マーカーでの標識化が特に想定される。
機能性部分
本発明のＴＣＲ、具体的には可溶性ＴＣＲは、追加の機能性部分を付加することによって改変され得る。この改変の目的は、例えば、免疫原性を低減すること、流体力学的サイズ（溶液中でのサイズ）、溶解性、及び／または安定性を向上させること（例えば、タンパク質分解に対する保護を増強することによって行われる）、及び／または血清中半減期を延長することである。
本発明に従って使用するための機能性部分の例としては、ヒトの体内の他のタンパク質（血清アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、または胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）など）に結合するペプチドまたはタンパク質ドメイン、さまざまな長さのポリペプチド鎖（例えば、ＸＴＥＮ技術またはＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標））、非タンパク質性ポリマー（限定されないが、さまざまなポリオール（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、もしくはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーなど）、または糖質のポリマー（ヒドロキシエチルデンプン（例えば、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標））など）もしくはポリシアル酸（例えば、ＰｏｌｙＸｅｎ（登録商標）技術）を含む）が挙げられる。
他の有用な機能性部分には、患者の体内において本発明のＴＣＲを保有するエフェクター宿主細胞を除去するために使用され得る「自殺スイッチ」または「安全スイッチ」が含まれる。一つの例は、Ｇａｒｇｅｔｔ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１４；５：２３５によって説明された誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）「安全スイッチ」である。簡潔に記載すると、エフェクター宿主細胞は、よく知られる方法によってカスパーゼ９ドメイン（その二量体化は、小分子である二量体化薬（ＡＰ１９０３／ＣｌＰなど）に依存する）を発現するように改変され、その結果、改変エフェクター細胞においてアポトーシスが迅速に誘導されるようになる。この系は、例えば、ＥＰ２１７３８６９（Ａ２）に記載されている。他の「自殺スイッチ」、「安全スイッチ」の例も当該技術分野で知られており、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、ＣＤ２０を発現させ、その後に抗ＣＤ２０抗体を使用して枯渇を生じさせるもの、またはｍｙｃタグ（Ｋｉｅｂａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００８ Ｊａｎ．１５；１０５（２）：６２３－８）が知られている。本発明のＴＣＲは、誘導性のいわゆる「オンスイッチ」（例えば、ＷＯ２０１９１７５２０９Ａ１に記載のもの）を導入することによって改変されることもあり得、この場合、本発明のＴＣＲの改変されたアルファ鎖及びベータ鎖は、小さな二量体化薬との相互作用時にのみ二量体化するようになり、その結果、二量体化薬の存在下でのみ細胞表面上に発現する機能性ＴＣＲが得られる。
グリコシル化
本明細書では、グリコシル化パターンが変化したＴＣＲも想定される。当該技術分野で知られるように、グリコシル化パターンは、アミノ酸配列（例えば、以下に論じられる特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在もしくは不在）及び／またはタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物に依存し得る。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ－結合型またはＯ－結合型のいずれかである。Ｎ－結合型は、アスパラギン残基の側鎖への糖質部分の追加を指す。結合分子へのＮ－結合型グリコシル化部位の追加は、アスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）から選択される１つ以上のトリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変えることによって好都合に達成される。Ｏ－結合型グリコシル化部位は、１つ以上のセリン残基もしくはスレオニン残基を出発配列に追加するか、または１つ以上のセリン残基もしくはスレオニン残基による置換を出発配列に施すことによって導入され得る。
ＴＣＲのグリコシル化の別の手段は、グリコシドとタンパク質とを化学的または酵素的にカップリングさせることによるものである。使用するカップリング様式に応じて、糖（複数可）は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基（システインのものなど）、（ｄ）遊離ヒドロキシル基（セリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのものなど）、（ｅ）芳香族残基（フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのものなど）、または（ｆ）グルタミンのアミド基、に付加され得る。
同様に、脱グリコシル化（すなわち、結合分子上に存在する糖質部分の除去）は、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸にＴＣＲを曝露することによって化学的に達成されるか、またはエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼを用いることによって酵素的に達成され得る。
薬物複合体
薬物（小分子化合物など）をＴＣＲ、具体的には本発明の可溶性ＴＣＲに付加することも考えられる。結合は、共有結合または非共有結合相互作用（静電力を介するものなど）を介して達成され得る。当該技術分野ではさまざまなリンカーが知られており、そうしたリンカーを薬物複合体の形成に用いることができる。
タグ
本開示のＴＣＲ、具体的には可溶性ＴＣＲは、それぞれの分子の同定、追跡、精製、及び／または単離に役立つ追加のドメイン（タグ）が導入されるように改変され得る。そのようなタグの例としては、限定されないが、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ及びそのバリアント（例えばＳｔｒｅｐＩＩタグ）、Ｈｉｓタグ、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｔ７タグ、ＨＡ（ヘマグルチニン）タグ、またはＧＦＰタグとして知られるペプチドモチーフが挙げられる。
エピトープタグは、本開示のＴＣＲに組み込み得るタグの有用な例である。エピトープタグは、特異的抗体の結合を可能にし、それ故に、患者の体内の可溶性ＴＣＲもしくは宿主細胞または培養（宿主）細胞の結合及び移動の同定及び追跡を可能にする短いアミノ酸区間である。エピトープタグの検出、したがってタグ付きＴＣＲの検出は、いくつかの異なる手法を使用して達成され得る。そのような手法の例としては、免疫組織化学、免疫沈降、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット法（「ウエスタン」）、及び親和性クロマトグラフィーが挙げられる。エピトープタグは、例えば、そのアミノ酸長が６～１５、具体的には９～１１であり得る。本発明のＴＣＲにエピトープタグを複数含めることも可能である。
さらに、タグは、当該タグに特異的な結合分子（抗体）の存在下で細胞を培養することによって、本発明のＴＣＲを保有する宿主細胞の刺激及び増殖を行うために用いることもできる。
核酸
本発明は、本明細書に記載のＴＣＲをコードする核酸、または本明細書に記載のＴＣＲをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。こうした核酸はコドンが最適化されるものであり、このことは、選択され得る多くの代替核酸配列によって１つのタンパク質がコードされ得ることを意味する。コドン選択（コドン使用頻度の偏り）は生物ごとに異なり、異種発現系での組換えタンパク質の発現を困難にし得るものであり、結果的に発現量の低下及び不確かさを招く。このことは自己発現にも当てはまり得る。何故なら、野生型配列は、発現収量についてだけなく、分解、制御、及び他の特性についても必ずしも最適化されたものではないためである。したがって、本明細書ではコドン最適化を使用して効率的なタンパク質発現を得た。以下の表１は、それぞれのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
Figure 2023503416000001
Figure 2023503416000002
Figure 2023503416000003
具体的には、本発明のＴＣＲアルファ鎖またはＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲアルファ鎖可変領域またはＴＣＲベータ鎖可変領域、ならびにＴＣＲ ＣＤＲ３アルファ及びＴＣＲ ＣＤＲ３ベータ、ならびにＴＣＲバリアント、ＴＣＲコンストラクト、及びＴＣＲ断片、をコードするポリヌクレオチドが本明細書で提供され、配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２２に示される。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、ハイブリッド分子を含めて、直鎖状もしくは環状またはそれらが混ざった状態の一本鎖形態及び／または二本鎖形態をそれぞれがとるポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドの配列（例えば、修飾または非修飾のＲＮＡまたはＤＮＡ）を含む。したがって、本発明による核酸は、ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｃＤＮＡなど）、ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｉｖｔＲＮＡなど）、それらの組み合わせ、またはそれらの誘導体（ＰＮＡなど）を含む。
ポリヌクレオチドは、従来型のホスホジエステル結合または非従来型の結合（例えば、アミド結合（ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるものなど））を含み得る。本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾塩基（例えば、トリチル化塩基及び通常とは異なる塩基（イノシンなど）など）も含み得る。化学的修飾、酵素修飾、または代謝修飾を含めて、他の修飾も考えられるが、但し、本発明の結合分子がポリヌクレオチドから発現し得ることが条件である。ポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に定義される単離された形態で提供され得る。ポリヌクレオチドは制御配列（転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルを含む）など）、リボソーム結合部位、イントロン、または同様のものを含み得る。
具体的には、本発明は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２２に示される配列からなる群から選択される参照ポリヌクレオチド配列との同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である核酸を含むまたはからなるポリヌクレオチドを提供する。
上記のポリヌクレオチドは、追加のヌクレオチド配列または改変されたヌクレオチド配列を含むことも含まないこともあり得、こうしたヌクレオチド配列は、例えば、変更されたアミノ酸残基、コードするＴＣＲの分泌を導くシグナルペプチド、定常領域、または他の異種ポリペプチド（本明細書に記載のもの）をコードする。したがって、そのようなポリヌクレオチドは、本明細書に記載の結合分子の融合ポリペプチド、断片、バリアント、及び他の誘導体をコードし得る。
本発明の核酸配列は、所望の宿主細胞（例えば、ヒトリンパ球）での発現を最適化するため、または本発明の可溶性ＴＣＲの発現が特に想定される細菌細胞、酵母細胞、もしくは昆虫細胞での発現を生じさせるためにコドン最適化に供され得る。コドン最適化は、所与の種の高発現遺伝子に見られる頻度が一般に低い目的コドンを有する配列に対して、そのような種の高発現遺伝子に見られる頻度が一般に高いコドンによる交換を行うことを指し、そのようなコドンは、交換対象のコドンと同じアミノ酸をコードする。したがって、最適なコドンの選択は、宿主ゲノムのコドン使用頻度がどうであるか、ならびに望ましい配列モチーフ及び望ましくない配列モチーフがいくつ存在するかに依存する。
ベクター
本明細書では、本明細書に記載の核酸のうちの１つ以上を含むベクターがさらに提供される。「ベクター」は、（外来）遺伝物質を宿主細胞（例えば、そうした（外来）遺伝物質の複製及び／または発現が生じるもの）へと導入するための媒体として使用される核酸分子である。
「ベクター」という用語は、限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター（レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を含む）、ファージ、ファージミド、コスミド、ならびに人工染色体（ＢＡＣ及びＹＡＣを含む）を包含する。ベクターは、一般に、それ自体がヌクレオチド配列であり、このヌクレオチド配列は、挿入断片（導入遺伝子）と、ベクターの「骨格」として働くより長い配列と、を含むＤＮＡ配列であることが一般的である。操作されたベクターは、典型的には、宿主細胞中で自己複製するための起点（ポリヌクレオチドの安定発現が望まれる場合）、選択マーカー、及び制限酵素切断部位（例えば、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ））を含む。ベクターは、プロモーター、遺伝子マーカー、レポーター遺伝子、標的指向性配列、及び／またはタンパク質精製タグを追加で含み得る。当業者には知られていることであるが、適切なベクターは当業者に多く知られており、多くが市販されている。
標的指向性ベクター
標的指向性ベクターは、当該技術分野で知られる方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）によって説明されるものなど）によってポリヌクレオチドを宿主細胞の染色体に組み込むために使用され得る。簡潔に記載すると、適切な手段は、組み込み部位を特異的に配列の標的とするハイブリッドリコンビナーゼによる相同組換えまたはその使用を含む。標的指向性ベクターは、典型的には、相同組換えに使用する前は環状または直鎖状である。代替手段として、外来ポリヌクレオチドは、フュージョンＰＣＲによって連結されたＤＮＡ断片、または合成的に構築されたＤＮＡ断片であり得、その後、これらの断片は組換えによって宿主細胞に導入される。無作為な組み込みまたは非標的指向型の組み込みが生じる非相同組換えを使用することも可能である。
発現ベクター
本発明のベクターは、発現ベクターでもあり得る。「発現ベクター」または「発現コンストラクト」は、適切な宿主細胞における異種ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のＴＣＲをコードするもの）の転写及びそのｍＲＮＡの翻訳に使用され得る。このプロセスは、本明細書では本発明のＴＣＲの「発現」とも称される。
複製起点、選択マーカー、及び制限酵素切断部位に加えて、発現ベクターは、典型的には、発現すべき異種ポリヌクレオチドと機能可能なように連結された１つ以上の制御配列を含む。
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物または宿主細胞において、機能可能なように連結された（異種）ポリヌクレオチドコード配列を発現させるために必要な核酸配列を指し、したがって、この用語は、転写制御配列及び翻訳制御配列を含む。典型的には、原核生物における異種ポリヌクレオチド配列の発現に必要な制御配列は、プロモーター（複数可）、任意選択でオペレーター配列（複数可）、及びリボソーム結合部位（複数可）を含む。真核生物では、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー、及び任意選択でスプライスシグナルが典型的には必要である。さらに、培養培地への目的ポリペプチドの分泌を可能にするために、特定の開始シグナル及び分泌シグナルもベクターに導入され得る。
核酸は、別の核酸配列、具体的には同じポリヌクレオチド分子上の別の核酸配列との機能的関連性が与えられた場合、「機能可能なように連結されている」。例えば、プロモーターは、異種遺伝子のコード配列の発現に影響を与えることが可能な場合、当該コード配列と機能可能なように連結されている。プロモーターは、典型的には、目的ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に配置され、当該遺伝子の発現を制御する。
哺乳類宿主細胞のための制御配列の例としては、哺乳類細胞においてタンパク質を高レベルで発現させるウイルスエレメントが挙げられ、こうしたウイルスエレメントは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーター及び／またはエンハンサー（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーター及び／またはエンハンサー（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルスに由来するプロモーター及び／またはエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ならびにポリオーマに由来するプロモーター及び／またはエンハンサーなどである。既に述べたように、発現ベクターは、複製起点及び選択可能マーカーも含み得る。
前述のように、本発明のベクターは、１つ以上の選択マーカーをさらに含み得る。真核生物宿主での使用に適した選択マーカーには、限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｇｐｒｔ）遺伝子、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ａｐｒｔ）遺伝子が含まれる。他の遺伝子には、ｄｈｆｒ（メトトレキサート耐性）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸耐性）、ｎｅｏ（Ｇ－４１８耐性）、及びｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシン耐性）が含まれる。ベクターを増幅させて発現レベルを上昇させることが行われ得る。一般に、選択マーカー遺伝子は、発現すべきポリヌクレオチド配列と直接的に連結されるか、または同時形質転換によって同じ宿主細胞に導入され得る。
したがって、上記のことを踏まえると、本発明は、本明細書に記載のヌクレオチド配列の１つ以上がベクターに挿入されたもの（すなわち、それがベクターに含められたもの）をさらに提供する。具体的には、本発明は、本発明のＴＣＲ、またはそのアルファ鎖もしくはベータ鎖、またはアルファ可変ドメインもしくはベータ可変ドメイン、またはＣＤＲ３アルファもしくはＣＤＲ３ベータをコードするヌクレオチド配列がプロモーターに機能可能なように連結されたものを含む（複製可能）ベクターを提供する。
当業者なら適切な発現ベクターを容易に選択することができ、この選択は、例えば、ＴＣＲ発現を意図する宿主細胞に基づいて行われる。適切な発現ベクターの例はウイルスベクターであり、こうしたウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、ＭＰ７１ベクターまたはレトロウイルスＳＩＮベクター）、及びレンチウイルスベクターまたはレンチウイルスＳＩＮベクターなどである。本発明のＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、例えば、リンパ球に感染する能力を有し、こうしたリンパ球は、感染を受けた後に異種ＴＣＲを発現することが想定される。適切な発現ベクターの別の例は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾントランスポゼースＤＮＡプラスミド系（ＳＢ ＤＮＡプラスミド）である。本発明の核酸及び／または具体的には発現コンストラクトは、ＲＮＡを一過性にトランスフェクトすることによっても細胞に導入され得る。
天然のＴＣＲの発現に現在使用されているウイルスベクターは、典型的には、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列、またはブタテシオウイルス由来の２Ａペプチド配列のいずれかを用いて１つのベクターにおいてＴＣＲ－アルファ鎖遺伝子とＴＣＲ－ベータ鎖遺伝子とを結び付けるものであり、その結果、形質導入された細胞内でウイルスプロモーターの制御下で単一のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子から発現が生じる。
宿主細胞
本発明は、本明細書に記載のＴＣＲ、核酸、またはベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
本発明に従ってさまざまな宿主細胞が使用され得る。本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載のポリヌクレオチドもしくはベクターのレシピエントとなり得るか、または本明細書に記載のポリヌクレオチドもしくはベクターのレシピエントとなっており、及び／または本発明のＴＣＲを発現し、（任意選択でそれを分泌する）細胞を包含する。「細胞」または「細胞培養物」という用語は、別に明確に指定されない限り、ＴＣＲの源を示すために互換的に使用される。「宿主細胞」という用語は、宿主細胞株も含む。一般に、「宿主細胞」という用語は、原核細胞または真核細胞を含むと共に、限定されないが、細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、ならびに動物細胞（昆虫細胞及び哺乳類細胞（例えば、マウス細胞、ラット細胞、マカク細胞、またはヒト細胞）など）も含む。
したがって、上記のことを踏まえると、本発明は、とりわけ、本明細書に記載のＴＣＲまたはＴＣＲコンストラクトをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはベクター（例えば、発現ベクター）を含む宿主細胞を提供する。本発明のポリヌクレオチド及び／またはベクターは、当該技術分野で知られる所定の方法（例えば、トランスフェクト、形質転換、または同様のものによるもの）を使用して宿主細胞に導入され得る。
「トランスフェクト」は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞に意図的に導入するプロセスである。一例はＲＮＡトランスフェクトであり、すなわち、ＲＮＡ（インビトロで転写されるＲＮＡ（ｉｖｔＲＮＡ）など）を宿主細胞に導入するプロセスである。この用語は、真核細胞での非ウイルス性の方法に対して使用されることが最も多い。「形質導入」という用語は、核酸分子またはポリヌクレオチドをウイルス介在性に導入することを説明するために使用されることが多い。動物細胞のトランスフェクトでは、典型的には、物質の取り込みを可能にするために細胞膜に細孔または「穴」を一過性に開けることが行われる。トランスフェクトは、リン酸カルシウムを使用して実施するか、電気穿孔によって実施するか、細胞スクイージングによって実施するか、または陽イオン性脂質を物質と混合してリポソーム（細胞膜と融合し、そのカーゴを内側に放つ）を生成させることによって実施され得る。真核生物宿主のトランスフェクトを行うための手法の例としては、脂質小胞介在性の取り込み、熱ショック介在性の取り込み、リン酸カルシウム介在性のトランスフェクト（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈法）、マイクロインジェクション、及び電気穿孔が挙げられる。
「形質転換」という用語は、細菌、さらには、非動物真核細胞（植物細胞を含む）への核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）の非ウイルス性の導入を説明するために使用される。したがって、形質転換は、細菌細胞または非動物真核細胞の遺伝的改変であり、この遺伝的改変は、そうした細菌細胞または非動物真核細胞の環境から細胞膜（複数可）を介して外来性遺伝物質（核酸分子）が直接的に取り込まれ、その後にそれが組み込まれることによって生じる。形質転換は、人工的な手段によって引き起こされ得る。形質転換を生じさせるためには、細胞または細菌が形質転換受容性を有する状態でなくてはならず、この状態は、環境的条件（飢餓または細胞密度など）に対する時限応答として生じ得る。原核細胞の形質転換については、手法には、熱ショック介在性の取り込み、インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合、マイクロインジェクション、及び電気穿孔が含まれ得る。植物細胞の形質転換を行うための手法には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ介在性の導入（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによるものなど）、タングステン微粒子または金微粒子を高速で打ち込むもの、電気穿孔、マイクロインジェクション、及びポリエチレングリコール介在性の取り込みが含まれる。
したがって、上記のことを踏まえると、本発明は、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列及び／またはベクター（本明細書に記載のもの）を含む宿主細胞をさらに提供する。
本発明のＴＣＲの発現については、挿入されたポリヌクレオチド配列の発現を、望まれるように調節し、及び／または遺伝子産物（すなわち、ＲＮＡ及び／またはタンパク質）を、望まれるように修飾及びプロセシングする宿主細胞が選択され得る。遺伝子産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、ＴＣＲの機能に重要であり得る。遺伝子産物を翻訳後にプロセシング及び修飾するための機構は、宿主細胞によって特徴的かつ特異的なものである。産物の修飾及びプロセシングが正しく確実に生じるように適切な細胞株または宿主系が選択され得る。この目的のために、一次転写産物のプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化を適切に行うための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。
（ａ）本発明のＴＣＲ、具体的には可溶性形態の本発明のＴＣＲを発現させ、それを得るための宿主細胞（「産生宿主細胞」）、及び（ｂ）本発明のＴＣＲを発現し、かつエフェクター機能を有する宿主細胞（「エフェクター宿主細胞」）、を提供することが本明細書で想定される。そのような「エフェクター宿主細胞」は、治療用途に特に有用であり、それを必要とする対象に投与することが想定される。好ましい「エフェクター宿主細胞」には、リンパ球（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ガンマ／デルタＴ細胞など）が含まれる。
「産生宿主細胞」
細胞
本発明の可溶性ＴＣＲの発現に使用される「産生宿主細胞」は、好ましくは、多量の組換えタンパク質を発現する能力を有する。
前述の内容によれば、考えられる発現系（すなわち、上記の発現ベクターを含む宿主細胞）には、組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクター、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された微生物（細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など）、組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）、組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させた植物細胞系、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系が含まれる。哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要前初期プロモーター（ＭＩＥＰ）プロモーター）を含む組換え発現コンストラクトを保有する哺乳類発現系が好ましいことが多い。適切な哺乳類宿主細胞は、既知の細胞株（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＬＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）から選択され得るが、リンパ球（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ガンマ／デルタＴ細胞など）を使用することも考えられる。
「産生宿主細胞」として使用され得る哺乳類宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（ＤＨＦＲマイナスＣＨＯ細胞（ＤＧ４４細胞及びＤＵＸＢｌ１細胞など）を含む）、ＮＳＯ細胞、ＣＯＳ細胞（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩの派生細胞）、ＨＥＫ２９３（ヒト腎臓）細胞、及びＳＰ２（マウス骨髄腫）細胞が挙げられる。他の宿主細胞株の例としては、限定されないが、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、Ｐ３ｘ６３－Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ－ｌｃＩＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、及びＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）が挙げられる。宿主細胞株は、典型的には、商業サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、または既刊文献から利用可能である。
非哺乳類細胞（細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または植物細胞など）も容易に利用可能であり、上記の「産生宿主細胞」としても使用され得る。細菌宿主細胞の例としては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａなど）、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなど）、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａが挙げられる。他の宿主細胞には、酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなど）が含まれる。昆虫細胞には、限定されないが、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞が含まれる。
前述の内容によれば、本発明は、本明細書に記載のＴＣＲの産生及び取得を行うための方法も提供し、この方法は、（ａ）当該ＴＣＲが発現する条件の下で宿主細胞（すなわち、産生宿主細胞）をインキュベートするステップ、及び（ｂ）当該ＴＣＲを精製するステップ、を含む。
培養
発現ベクターを保有する宿主細胞は、本明細書で提供されるＴＣＲ、具体的には本明細書の他の箇所に記載のアルファ鎖及び／またはベータ鎖の産生に適した条件の下で増殖され、アルファ鎖及び／またはベータ鎖のタンパク質合成についてアッセイされる。二本鎖ＴＣＲの発現については、分子全体を発現させるための宿主細胞において、アルファ鎖及びベータ鎖の両方をコードするベクターが共発現され得る。
精製
本発明のＴＣＲが発現すると、当該技術分野で知られる任意の精製方法によって本発明のＴＣＲを精製することができ、こうした精製方法は、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー）、親和性クロマトグラフィー、具体的にはプロテインＡ親和性クロマトグラフィー、プロテインＧ親和性クロマトグラフィー、もしくはレクチン親和性クロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離法、溶解性の差異を利用するもの、疎水性相互作用クロマトグラフィー、または任意の他の標準的なタンパク質精製手法によるものである。当業者なら、回収すべきＴＣＲの個々の特徴に基づいて適切な精製方法を容易に選択できるであろう。
「エフェクター宿主細胞」
前述のように、本発明は、本発明のヌクレオチド配列、ベクター、またはＴＣＲを含む「エフェクター宿主細胞」も提供する。当該エフェクター宿主細胞は、本発明のＴＣＲをコードする核酸配列を含むように所定の方法を使用して改変され、本明細書に記載のＴＣＲを具体的には細胞表面上に発現することが想定される。本発明の目的では、「本発明のＴＣＲを発現する改変宿主細胞」は、一般に、本発明によるＴＣＲを発現するように処理または変更された（エフェクターまたは産生）宿主細胞を指し、この処理または変更は、例えば、添付の実施例に記載のＲＮＡトランスフェクトによって行われる。他の改変方法またはトランスフェクト方法または形質導入方法（本明細書の他の箇所に記載のものなど）も想定される。したがって、「改変宿主細胞」という用語は、「トランスフェクト」された宿主細胞、「形質導入」された宿主細胞、及び「遺伝子操作」された宿主細胞を含み、こうした宿主細胞は、好ましくは、本発明のＴＣＲを発現する。
好ましくは、そのような「（改変）エフェクター宿主細胞」（具体的には「（改変）エフェクターリンパ球」）は、ＴＣＲがその特異的抗原性標的に結合すると細胞内シグナル伝達を介してエフェクター機能を媒介する能力を有する。そのようなエフェクター機能には、例えば、パーフォリン（標的細胞膜に穴を創出する）の放出、グランザイム（細胞内で作用してアポトーシスを引き起こすプロテアーゼである）の放出、Ｆａｓリガンド（ＦＡＳを有する標的細胞においてアポトーシスを活性化する）の発現、及びサイトカイン、好ましくはＴｈ１／Ｔｃ１サイトカイン（ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αなど）の放出が含まれる。したがって、治療すべき対象における抗原性標的を認識し、それに結合する能力を有する本発明のＴＣＲを発現するように操作されたエフェクター宿主細胞は、上述のエフェクター機能を発揮し、それによって標的（例えば、がん）細胞を死滅させることが想定される。標的細胞の細胞溶解を評価することができ、この評価は、例えば、ＴＣＲがトランスフェクトされたレシピエントＴ細胞との共培養中の蛍光標識標的細胞の消失を検出するＣＴＬ蛍光死滅アッセイ（ＣＴＬ、ＵＳＡ）を用いて行われる。
上記のことを踏まえると、エフェクター宿主細胞は、好ましくは機能性ＴＣＲを発現し、この機能性ＴＣＲは、すなわち、典型的には、本明細書に記載のＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含むと共に、シグナル伝達サブユニット（ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、及びＣＤ３ゼータ）（ＣＤ３複合体）も含む。さらに、共受容体ＣＤ４または共受容体ＣＤ８の発現も望まれ得る。一般に、抗原結合、受容体活性化、及び下流シグナル伝達に関与する必要遺伝子（例えば、Ｌｃｋ、ＦＹＮ、ＣＤ４５、及び／またはＺａｐ７０）を保有するリンパ球、すなわちＴ細胞がエフェクター宿主細胞として特に適している。一方で、ＣＤ３シグナル伝達サブユニット及び／または前述の下流シグナル伝達分子を有さずに、「結合ドメイン」として本発明のＴＣＲを発現するエフェクター宿主細胞（すなわち、本明細書に記載の抗原性標的を認識する能力は有するが、ＣＤ３及び／または前述の下流シグナル伝達分子によって媒介される機能は発揮しないもの）も本明細書では想定される。そのようなエフェクター細胞は、本明細書に記載の抗原性標的を認識する能力を有し、任意選択で、ＣＤ３シグナル伝達及び／または前述の下流シグナル伝達分子のシグナル伝達と関連しない他の機能を発揮する能力を有することが想定される。例としては、本発明のＴＣＲを発現するＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞が挙げられ、こうしたＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞は、例えば、その抗原性標的を認識すると細胞傷害性顆粒を放出する能力を有する。
したがって、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ガンマ／デルタＴ細胞が有用なリンパ球エフェクター宿主細胞であると考えられる。本発明の組換えＴＣＲを発現するそのようなリンパ球は、本明細書では「改変エフェクターリンパ球」とも称される。一方で、一般に、所望のエフェクター機能を引き起こすＴＣＲシグナル伝達経路の任意の構成要素を、当該技術分野で知られる組換え遺伝子操作方法によって適切な宿主細胞に導入し得ることを当業者なら容易に認識するであろう。
エフェクター宿主細胞、具体的にはリンパ球（Ｔ細胞など）は、治療すべき対象から得られ、本発明のＴＣＲを発現するように形質転換または形質導入された自己宿主細胞であり得る。典型的には、ＴＣＲの組換え発現は、添付の実施例に記載のウイルスベクターを使用して達成されることになる。当該技術分野では患者から細胞を取得及び単離するための手法が知られている。
前述のように、本明細書で提供されるエフェクター宿主細胞は、治療用途向けであることが特に想定される。治療効力を向上させるためには、宿主細胞をさらに遺伝子改変することが望ましくあり得る。例えば、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞を「エフェクター宿主細胞」として使用する場合、適切な追加の改変には、内在性ＴＣＲ、ＣＴＬＡ－４、及び／またはＰＤ－１の発現の下方制御、及び／または共刺激分子（ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７など）の増幅が含まれる。前述の遺伝子改変を達成するための手段及び方法は当該技術分野で報告されている。
当該技術分野では宿主細胞の標的化ゲノム操作を行う方法が知られており、こうした方法には、ｓｉＲＮＡでの遺伝子ノックダウンに加えて、いわゆる「プログラム可能なヌクレアーゼ」を使用するものが含まれ、「プログラム可能なヌクレアーゼ」は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及び細菌の規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系に由来するＲＮＡガイド型の操作されたヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）（とりわけ、Ｋｉｍ ＆ Ｋｉｍ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５，３２１－３３４（２０１４）で概説されているもの）などである。例えば、「望ましくない」タンパク質（ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、または内在性ＴＣＲなど）をコードするＤＮＡ領域を切断し、それによってその発現を低減するために、プログラム可能なヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮなど）が利用され得る。Ｔ細胞が（エフェクター）宿主細胞として使用される場合、内在性ＴＣＲの下方制御は、内在性のＴＣＲアルファ／ベータ鎖と外来性のＴＣＲアルファ／ベータ鎖との望ましくない「誤った対形成」を低減するという利点を有する。
医薬組成物
本発明は、１つ以上の活性薬剤としての本明細書に記載のＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／または宿主細胞と、任意選択の１つ以上の医薬品添加物（複数可）と、を含む医薬組成物をさらに提供する。したがって、本明細書では、当該ＴＣＲ、核酸、ベクター、及び宿主細胞を医薬組成物または薬剤の製造に使用することも想定される。
「医薬組成物」という用語は、具体的には、ヒトへの投与に適した組成物を指す。しかしながら、非ヒト動物への投与に適した組成物もまた、一般にこの用語に包含される。
本発明によって想定される医薬組成物は、１つ以上のチェックポイント阻害剤をさらに含み得、こうしたチェックポイント阻害剤は、好ましくは、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、及びＰＤ－Ｌ１阻害剤からなる群から選択される。上述の阻害剤はすべて、免疫応答を下方制御する能力を有する免疫チェックポイント阻害剤である。細胞傷害性リンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）阻害剤は、制御性Ｔ細胞では構成的に発現するが、通常のＴ細胞ではその活性化後にのみ上方制御されるタンパク質受容体である。ＰＤ－１阻害剤及びＰＤ－Ｌ１阻害剤は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）がその受容体（プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１））と結び付くことを阻害するように働く。こうした細胞表面タンパク質の相互作用は免疫系の抑制に関与しており、感染後に生じることで、バイスタンダー宿主細胞の死滅を限定すると共に自己免疫疾患を防止する。したがって、当該チェックポイント阻害剤を、本発明による医薬組成物と組み合わせることが好ましい。
本発明によって包含される追加のチェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、及びＣＥＡＣＡＭ１である。ＬＡＧ３は、抗原活性化Ｔ細胞上の抑制性受容体である。ＩＣＯＳタンパク質は、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４細胞表面受容体ファミリーに属する。ＩＣＯＳタンパク質はホモ二量体を形成し、細胞間シグナル伝達、免疫応答、及び細胞増殖制御において重要な役割を担っている。ＴＩＭ３、すなわちＡ型肝炎ウイルス細胞受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリー及びＴＩＭタンパク質ファミリーに属するタンパク質をコードする。ＣＤ４陽性Ｔヘルパーリンパ球は、そのサイトカイン分泌パターンに基づいて１型（Ｔｈ１）及び２型（Ｔｈ２）に分類され得る。ＶＩＳＴＡ、すなわちＶ－Ｓｅｔ免疫調節受容体は、Ｔ細胞応答を阻害する免疫調節受容体をコードする。ＣＥＡＣＡＭ１遺伝子は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子ファミリーのメンバー（免疫グロブリンスーパーファミリーに属する）をコードする。こうしたチェックポイント阻害剤もまた、医薬組成物と組み合わせられ得る。
医薬組成物及びその構成要素（すなわち、活性薬剤及び任意選択の医薬品添加物）は、好ましくは医薬的に許容可能なものであり、すなわち、レシピエントにおいていずれの望ましくない局所作用または全身作用も生じさせることなく所望の治療効果を誘発する能力を有する。本発明の医薬的に許容可能な組成物は、例えば、滅菌され得る。具体的には、「医薬的に許容可能な」という用語は、動物、より具体的にはヒトでの使用が規制機関または他の一般に認知された薬局方によって承認されていることを意味し得る。
前述の活性薬剤（例えば、宿主細胞またはＴＣＲ）は、好ましくは、治療的に有効な量で医薬組成物中に存在する。「治療的に有効な量」は、所望の治療効果を誘発する活性薬剤の量を意味する。治療効力及び毒性は、（例えば、細胞培養または試験動物において）標準的な手順によって決定され得る（例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量））。治療作用と毒性作用との用量比は治療指数であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０比として表され得る。治療指数が大きい医薬組成物が好ましい。
用量
ＴＣＲポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の正確な用量は、既知の手法を使用して当業者によって確かめられることになる。適切な用量は、本発明の活性薬剤を十分な量で与え、好ましくは治療的に有効であり、すなわち、所望の治療効果を誘発する。
当該技術分野では知られていることであるが、治療目的（例えば、寛解維持であるか、急性の疾患再発であるか）、投与経路、投与時間、及び投与頻度、製剤投与の時間及び頻度、年齢、体重、総体的な健康、性別、食事、病状の重症度、併用薬物（複数可）、反応感度、ならびに治療に対する耐性／応答、に合うように調整することが必要であり得る。適切な用量範囲（例えば、本明細書に記載の可溶性ＴＣＲのためのもの）は、細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを使用して決定することができ、ＥＤ５０を含み得る。典型的には、用量は、投与経路に応じて０．１～１０００００マイクログラムの間で異なり得、総用量は最大で約２ｇとなり得る。本発明の活性薬剤の用量の例は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの範囲内のものである。特定の送達用量及び送達方法に関するガイダンスは文献中で与えられている。治療では、本発明の活性薬剤を、その治療的に有効な用量で単回投与または複数回投与することが必要になり得ることが認識されよう。例えば、医薬組成物によっては、特定の組成物の製剤、半減期、及びクリアランス速度に応じて、３～４日ごとに１回、１週間ごとに１回、もしくは２週間ごとに１回、または１ヶ月に１回投与され得る。上述のように、医薬組成物は、１つ以上の医薬品添加物及び／または追加の活性薬剤を任意選択で含み得る。
医薬品添加物
「医薬品添加物」という用語は、増量剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、吸着剤、付着防止剤、流動促進剤、保存剤、抗酸化剤、香味剤、着色剤、甘味剤、溶媒、共溶媒、緩衝剤、キレート剤、粘性付与剤、界面活性剤、希釈剤、保湿剤、担体、希釈剤、保存剤、乳化剤、安定化剤、及び浸透圧調整剤を含む。本発明の所望の医薬組成物の調製に適した医薬品添加物を選択することは当業者の技能範疇である。本発明の医薬組成物において使用するための担体の例としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、及び水が挙げられる。典型的には、適切な医薬品添加物の選択は、とりわけ、使用する活性薬剤、治療すべき疾患、及び医薬組成物の所望の製剤に依存することになる。
追加の活性薬剤
本発明は、上記の本発明の活性薬剤（例えば、宿主細胞またはＴＣＲコンストラクト）の１つ以上と、治療すべき疾患の治療及び／または予防に適した１つ以上の追加の活性薬剤と、を含む医薬組成物をさらに提供する。組み合わせに適した好ましい活性成分例としては、既知の抗がん剤（シスプラチン、マイタンシン誘導体、ラシェルマイシン（ｒａｃｈｅｌｍｙｃｉｎ）、カリケアミシン、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムフォトフリンＩＩ（ｓｏｒｆｉｍｅｒ ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ）、テモゾロミド、トポテカン、トリメトレートグルクロネート（ｔｒｉｍｅｔｒｅａｔｅ ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、アウリスタチンＥ、ビンクリスチン、及びドキソルビシンなど）、ならびにペプチド細胞毒素（リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮＡａｓｅ、及びＲＮＡａｓｅなど）、放射性核種（ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０及びビスマス２１３、アクチニウム２２５、ならびにアスタチン２１３など）、プロドラッグ（抗体指向化酵素プロドラッグなど）、免疫刺激剤（ＩＬ－２など）、ケモカイン（ＩＬ－８、血小板第４因子、黒色腫増殖刺激タンパク質など）、抗体またはその断片（抗ＣＤ３抗体またはその断片など）、補体活性化因子、異種タンパク質ドメイン、同種異系タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメイン、ならびにウイルス／細菌ペプチドが挙げられる。
投与
本発明による医薬組成物の投与にはさまざまな経路が適用可能である。典型的には、投与は、非経口的に達成されることになる。非経口送達の方法には、局所投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与、子宮内投与、腟内投与、舌下投与、または鼻腔内投与が含まれる。
製剤
本発明の医薬組成物は、とりわけ使用活性薬剤（例えば、可溶性ＴＣＲ）に応じて、さまざまな形態で製剤化することができ、例えば、固体形態、液体形態、気体形態、または凍結乾燥形態で製剤化することができ、とりわけ、軟膏、クリーム、経皮吸収パッチ、ゲル、粉末、錠剤、溶液、エアロゾル、顆粒、丸剤、懸濁液、エマルション、カプセル、シロップ、液体、エリキシル剤、抽出物、チンキ剤、もしくは流エキス剤の形態、または所望の投与方法に特に適した形態において製剤化され得る。薬剤を生産するためのプロセス自体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅｄ．Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，２０１２）の第２２版に示されており、そうしたプロセスには、例えば、通常の混合プロセス、溶解プロセス、造粒プロセス、糖衣錠調製プロセス、湿潤条件下での微粉化プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、封入プロセス、または凍結乾燥プロセスが含まれ得る。医薬組成物（例えば、本明細書に記載の宿主細胞または可溶性ＴＣＲを含むもの）は、典型的には、液体形態で提供され、好ましくは、医薬的に許容可能な緩衝剤を含むことになる。
本発明の医薬組成物は、その調製後に適切な容器に入れられ、指示条件の治療向けのラベルが付加され得る。そのようなラベルは、例えば、投与量、投与頻度、及び投与方法を含むことになろう。
治療
したがって、前述の内容を踏まえると、本発明は、がんの検出、診断、予後予測、予防、及び／または治療における薬剤としての使用のための、本明細書に記載のＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／または宿主細胞を提供する。
ＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／または宿主細胞は、一般に、疾患または障害の治療検出、診断、予後予測、予防、及び／または治療に用いられ得る。「治療」という用語は、すべてのその文法形態において、それを必要とする対象の治療的治療または予防的治療を含む。「治療的治療または予防的治療」は、臨床的及び／または病理学的徴候の完全な予防を目的とする予防的治療、あるいは臨床的及び／または病理学的徴候の軽快または寛解を目的とする治療的治療を含む。したがって、「治療」という用語は、疾患の軽快または予防も含む。
本発明の医薬組成物を使用すると治療されると想定されるそのような疾患は、好ましくは、黒色腫、膀胱癌、結腸癌、及び乳腺腺癌、肉腫、前立腺癌、子宮癌、ぶどう膜癌（ｕｖｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、ぶどう膜黒色腫、頭頸部扁平上皮癌、滑膜癌、ユーイング肉腫、トリプルネガティブ乳癌、甲状腺癌、精巣癌、腎癌、膵癌、卵巣癌、食道癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、肝細胞癌、頭頸部癌、胃癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、胆管癌、乳癌、膀胱癌、骨髄性白血病、ならびに急性リンパ芽球性白血病からなる群から選択されるがんであり、好ましくは、がんは、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、乳癌、卵巣癌、または結腸直腸癌、肉腫または骨肉腫からなる群から選択される。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」という用語は、治療が望まれる任意の対象、具体的には哺乳類対象を指すために本明細書で互換的に使用される。哺乳類対象には、一般に、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシ、及び同様のものが含まれる。一方で、本明細書で提供されるＴＣＲ、核酸、ベクター、宿主細胞、及び医薬組成物は、ヒト対象の治療、具体的にはＨＬＡ－Ａ２陽性のヒト対象の治療が特に想定されることが容易に理解されよう。
直接投与
治療については、本発明のＴＣＲ（具体的には、本発明の可溶性ＴＣＲ）、核酸、ベクター（ウイルスベクターなど）、または宿主細胞は、それを必要とする対象に直接的に投与され得る。したがって、本発明は、がんを検出、診断、予後予測、予防、及び／または治療する方法において使用するためのＴＣＲ、核酸、ベクター、または宿主細胞を提供する。当該方法は、（ａ）本発明の（ｉ）ＴＣＲ、（ｉｉ）核酸、（ｉｉｉ）ベクター、（ｉｖ）宿主細胞、及び／または（ｖ）医薬組成物、のうちの１つ以上を供給するステップ、ならびに（ｂ）（ｉ）～（ｖ）のうちの１つ以上を、それを必要とする対象に投与するステップ、を含み得る。任意選択で、方法は、がん治療（例えば、放射線照射、または１つ以上の抗がん剤の投与）のステップをさらに含み得る。
エクスビボでの治療
本発明による治療は、（ａ）対象の試料を供給するステップであって、当該試料がリンパ球を含む、当該供給するステップ、（ｂ）本発明の（ｉ）ＴＣＲ、（ｉｉ）核酸、（ｉｉ）ベクター、（ｉｖ）宿主細胞、及び／または（ｖ）医薬組成物、のうちの１つ以上を供給するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の（ｉ）～（ｖ）のうちの１つ以上を、ステップ（ａ）のリンパ球に導入し、それによって改変リンパ球を得るステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の改変リンパ球を、それを必要とする対象または患者に投与するステップ、も含み得る。
ステップ（ａ）で供給されるリンパ球は、前述の「エフェクター宿主細胞」であることが特に想定され、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び／またはＮＫＴ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞、から有利に選択され、当該技術分野で知られる所定の方法によって対象の試料、具体的には対象の血液試料から事前のステップで得ることができる。一方で、他のリンパ球（好ましくは、本発明のＴＣＲを発現する能力を有し、本明細書に記載の所望の生物学的エフェクター機能を発揮するもの）を使用することも考えられる。さらに、当該リンパ球は、典型的には、対象の免疫系との適合性が得られるように選択されることになり、すなわち当該リンパ球は、好ましくは、免疫原性応答を誘発することはない。例えば、「普遍的レシピエント細胞」、すなわち、所望の生物学的エフェクター機能を発揮し、インビトロで成長及び増殖し得る普遍的に適合性のリンパ球を使用することが考えられる。したがって、そのような細胞を使用すれば、ステップ（ａ）で対象自身のリンパ球の取得し、供給する必要がなくなることになる。
ステップ（ｃ）のエクスビボでの導入は、本明細書に記載の核酸もしくはベクターを電気穿孔によってリンパ球に導入することによって実施するか、またはエフェクター宿主細胞との関連で前述したウイルスベクター（レンチウイルスもしくはレトロウイルスベクターなど）をリンパ球に感染させることによって実施され得る。考えられる他の方法には、トランスフェクト試薬（リポソームなど）を使用するもの、またはＲＮＡを一過性にトランスフェクトするもの、が含まれる。抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を（例えば、（レトロ）ウイルスベクターによって）（初代）Ｔ細胞に導入すること、またはＲＮＡを一過性にトランスフェクトすることは、腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞を生成させる上で有望なツールとなっており、この腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞は、その後にドナーに再導入することができ、当該ドナーにおいて、当該抗原を発現する腫瘍細胞を特異的に標的とし、破壊する。本発明では、当該腫瘍関連抗原は、本明細書で定義されるＰＲＡＭＥであり、具体的には、そのＨＬＡ－Ａ＊０２結合形態のＰＲＡＭＥである。
本発明による治療は、（ａ）対象の試料を供給するステップであって、当該試料がリンパ球を含む、当該供給するステップも含み得、この治療は、（ｂ）（ｉ）ＴＣＲ、（ｉｉ）核酸、（ｉｉｉ）ベクター、（ｉｖ）宿主細胞、及び（ｖ）医薬組成物、のうちの１つ以上を供給するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の（ｉ）～（ｖ）のうちの１つ以上を、ステップのリンパ球に導入し、それによって改変リンパ球を得るステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の改変リンパ球を、それを必要とする対象または患者に投与するステップ、からなる。
したがって、上記のことを踏まえると、本発明の別の態様は、改変リンパ球を生成させるために、本明細書の他の箇所に記載のＴＣＲ、核酸配列、ベクター、及び／または宿主細胞を使用することである。（例えば、核酸及びベクターを）リンパ球に導入するための手段及び方法については、本明細書の他の箇所に記載されている。
診断組成物
本発明は、１つ以上の診断剤（複数可）と、本明細書に記載のＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／または宿主細胞と、を含む診断組成物も提供する。典型的には、当該診断剤は、その抗原性標的にそれが結合したことを検出するための手段（例えば、本発明のＴＣＲコンストラクトとの関連で記載した標識）を含むことになる。宿主細胞に関しては、例えば、抗原認識時に（細胞傷害性顆粒の代わりに）放出される色素または造影剤を含む改変宿主細胞を使用することが考えられる。
使用
本発明は、対象におけるがんの検出、診断、及び／または予後予測をインビボまたはインビトロで達成し得るために前述の診断剤を使用することを想定する。
したがって、本発明は、対象におけるがんのインビボでの検出、診断において使用するための診断組成物を提供し、当該組成物は、本発明のＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／または宿主細胞を診断剤として含む。方法は、典型的には、（ａ）当該診断剤を対象に投与すること、及び（ｂ）当該診断剤がその抗原性標的に結合したことを検出すること、を含むことになる。
さらに、本発明は、対象におけるがんをインビトロで検出、診断、及び／または予後予測する方法を提供する。したがって、本発明は、対象におけるがんの存在を検出する方法も提供し、この方法は、（ａ）対象の試料を供給するステップであって、当該試料が１つ以上の細胞を含む、当該供給するステップ、（ｂ）当該試料を、本発明のＴＣＲ、宿主細胞、及び／または医薬組成物と接触させ、それによって複合体を形成させるステップ、ならびに（ｃ）複合体を検出するステップ、を含む。当該複合体は、診断剤がその抗原性標的に結合したことを示すものとなることが想定され、当該抗原性標的を発現する（がん）細胞が存在することを表すものである。
両方の方法において、診断剤がその抗原性標的に結合したことは、当該技術分野で知られる所定の方法を使用することによって検出可能であり、とりわけ、特定の使用診断剤に依存することになる。本発明の診断剤とカップリングされ得る適切な標識については、標識化ＴＣＲコンストラクトに関するセクションに例示されている。
さらに、改変リンパ球を生成させるために本明細書に記載のＴＣＲ、核酸、またはベクターを使用することを含むことも、本発明によって想定される。本明細書の他の箇所に記載されるように、好ましいリンパ球には、限定されないが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ガンマ／デルタ－Ｔ細胞が含まれる。
本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、別に文脈上明確に示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されなくてはならない。したがって、例えば、「試薬」への言及は、そのような異なる試薬の１つ以上を含み、「方法」への言及は、本明細書に記載の方法向けに改変し得るか、またはその代わりとなり得る当業者に知られる同等のステップ及び方法への言及を含む。
別段の指定がない限り、一連の要素に前置される「少なくとも」という用語は、そうした一連の要素のそれぞれを指すことが理解されよう。当業者なら、所定の実験を行うだけで、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するであろう、または確かめることが可能であろう。そのような均等物は、本発明によって包含されることが意図される。
「及び／または」という用語は、本明細書でのその使用箇所を問わず、「及び」、「または」、ならびに「当該用語によって接続される要素のすべてまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。但し、この用語は名数も含み、例えば、「約２０」は２０を含む。
「未満」または「超」という用語は名数を含む。例えば、２０未満は、以下を意味する。同様に、超（ｍｏｒｅ ｔｈａｎ）または超（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ）は、それぞれ以上（ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｒ ｅｑｕａｌ ｔｏ）または以上（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ ｏｒ ｅｑｕａｌ ｔｏ）を意味する。
本明細書及び後述の特許請求の範囲を通じて、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という言葉ならびにその変形形態（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」など）は、記載される整数もしくはステップまたは整数群もしくはステップ群を含むが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数群もしくはステップ群を除外しないことを暗示することが理解されよう。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、その代わりとして「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語が使用される可能性があり、本明細書で使用される場合、場合によっては「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語が代わりに使用され得る。
本明細書で使用される場合、「からなる」は、請求要素に特定されないいずれの要素、ステップ、または成分も除外するものである。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、請求対象の基礎的な特徴及び新規の特徴に実質的に影響を与えない物質またはステップを除外しないものである。
本明細書での使用時のそれぞれにおいて、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」は、という用語はいずれも、その他の２つ用語のいずれとも交換可能である。
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、材料、試薬、及び物質に限定されるものではなく、それ故に変わり得るものであることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することを目的とするものにすぎず、本発明の範囲の限定は意図されておらず、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義される。
本明細書のテキストを通じて引用されるすべての刊行物及び特許（すべての特許、特許出願、科学的刊行物、製造者の規格書、説明書などを含む）は、それらの引用箇所を問わず、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。そのような開示に先行する権利が本発明に付与されないことを、先行発明であるという理由によって本明細書が承認していると解釈してはならない。参照によって組み込まれる材料が本明細書と矛盾するまたは不一致である限りにおいては、いずれのそのような材料にも本明細書が優先することになる。
下記の実施例を参照することで本発明及びその優位性についての理解が深まることになるが、これらの実施例の提供目的は例示にすぎない。これらの実施例は、いかなる様式においても本発明の範囲の限定を意図するものでない。
下記の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
Figure 2023503416000004
実施例１：ペプチド特異性
特異的ＳＬＬペプチド（ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ）または無関係のペプチド（ＧＬＳＮＴＨＶＬ）のいずれかを、その濃度を１０－５Ｍとして、３７℃でＴ２細胞に１．５時間負荷した。次に、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と上記の細胞とを、エフェクター：標的比を１：１として共培養した（１０．０００個エフェクター細胞／９６ウェルとした）。２０時間後に、標準的なＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳＡを使用して細胞培養上清中のＩＦＮ－ガンマのレベルを測定した。特異的ＳＬＬペプチドは、Ｔ２細胞上への負荷に、陰性対照ＴＣＲを除くすべてのＴＣＲ形質導入エフェクター細胞によって認識されるが、無関係のペプチドは認識されない（図１）。
実施例２：機能的アビディティー
この実験では、ＳＬＬペプチド特異的ＴＣＲの機能的アビディティーを測定することを目的とした。機能的アビディティーは、個々の非共有結合相互作用（トランスジェニックＴＣＲとｐＭＨＣ複合体との間の相互作用など）の親和性が複数積み重なった強度を指す。ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞集団の機能的アビディティーは、段階的（漸増）量のＳＬＬペプチドの負荷（１０－５Ｍ～１０－１２Ｍ、３７℃での負荷を１．５時間実施）を行ったＴ２細胞との共培養物（エフェクター：標的＝１：１、１０．０００個エフェクター細胞／９６ウェル）において最大相対ＩＦＮ－ガンマ放出量の５０％を与える濃度（ＥＣ５０値）として測定される。
共培養から２０時間後に標準的なＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳＡを読み出しとして行った（４０００ｐｇ超の値については、三次多項式を使用して外挿した）。
結果：
３８２５ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と比較して０２７－００４ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞では高い機能的アビディティーが見られ、このことは、非常に低い量の標的ペプチドに対する感度がより高いことを示している（図２）。
当該技術分野で開示されているＴＣＲが形質導入されたＴ細胞と比較して０２７－００４ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞では高い機能的アビディティーが見られ、このことは、非常に低い量の標的ペプチドに対する感度がより高いことを示している（図１３）。
実施例３：ＴＣＲ認識モチーフ（セリンスキャン及びスレオニンスキャン）
この実験は、ＳＬＬエピトープ配列中の残基のうちで、ＴＣＲによる直接的な認識に必須となる決定的な残基、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１がコードする分子への当該ペプチドの結合に必須となる決定的な残基を評価することを目的としている。当該エピトープ配列中の決定的アミノ酸の定義にはアミノ酸置換スキャンを使用した。決定的アミノ酸であるならば、そうした残基がアミノ酸セリンまたはアミノ酸スレオニンに交換されるとＴＣＲによる認識が消失することになる。これらの「固定」アミノ酸を使用することで、特有のＴＣＲ認識モチーフを定義することができる。セリン残基またはスレオニン残基を使用することで、ＰＲＡＭＥペプチド中の個々のアミノ酸が体系的に置き換えられる（セリンスキャン及びスレオニンスキャン）。
Ｅ：Ｔ比を１：１（１０．０００個エフェクター細胞／９６ウェル）としてＴＣＲ形質導入Ｔ細胞とＴ２細胞とをインビトロで共培養して、１０－５Ｍの異なるペプチドを別々に負荷した（３７℃で１．５時間）。
読み出し：共培養から２０時間後に標準的なＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳＡを行った（４０００ｐｇ超の値については、三次多項式を使用して外挿した）。
結果：
セリンスキャンにおいて、３８２５ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と比較して０２７－００４ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞では固定位置が少ない異なる認識モチーフが見られる（図３）。
スレオニンスキャンにおいて、当該技術分野で開示されている他のＴＣＲと比較して０２７－００４ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞では異なる認識モチーフが見られる（図１２）。
Figure 2023503416000005
Figure 2023503416000006
実施例４：腫瘍細胞の認識及び腫瘍細胞の死滅
腫瘍細胞の認識については、ＴＣＲ ０２７－００４またはＴＣＲ ３８２５のいずれかを形質導入したエフェクター細胞とＰＲＡＭＥＳＬＬ陽性腫瘍細胞またはＰＲＡＭＥＳＬＬ陰性腫瘍細胞とを、Ｅ：Ｔ比を１：１（１０．０００個エフェクター細胞／９６ウェル）として６％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２０時間共培養した。標準的なＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳＡを使用してエフェクター細胞のＩＦＮ－ガンマの分泌量を決定した（４０００ｐｇ超の値については、三次多項式を使用して外挿した）。
結果：
ＴＣＲ ０２７－００４形質導入エフェクター細胞は、３８２５ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と比較して腫瘍細胞（例えば、ＭｅｌＡ３７５）を良好に認識する（図４）。
ＴＣＲ ０２７－００４形質導入エフェクター細胞は、当該技術分野で知られるＴＣＲを形質導入したＴ細胞と比較して腫瘍細胞（ＭｅｌＡ３７５、ＮＣＩ－Ｈ１６５０、及びＮＣＩ－Ｈ１７０３）を良好に認識する（図１４）。
腫瘍細胞の死滅については、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄレンチウイルス形質導入腫瘍細胞を平底ウェルに播種し、１日後に共培養に供した。
ウェル当たり２０．０００個のエフェクター細胞を添加した後、腫瘍細胞（６４７Ｖの場合は細胞数２．５００、他の腫瘍細胞株についてはすべて、細胞数５．０００）を添加し、培養プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅＺＯＯＭ（登録商標）デバイスに移し、６％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で赤色蛍光細胞の増殖を１００時間にわたって監視し、その間、４時間ごとに写真を撮った。
ＴＣＲ形質導入エフェクター細胞はすべて、ＰＲＡＭＥＳＬＬ陽性腫瘍細胞（ＰＲＡＭＥ陽性）を溶解するが、ＰＲＡＭＥＳＬＬ陰性腫瘍細胞（ＰＲＡＭＥ陰性）の増殖には影響を与えない。
結果：
ＴＣＲ ０２７－００４形質導入エフェクター細胞は、３８２５ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と比較して腫瘍細胞（例えば、ＭｅｌＡ３７５）を良好に死滅させる（図５）。
ＴＣＲ ０２７－００４形質導入エフェクター細胞は、当該技術分野で知られるＴＣＲを形質導入したＴ細胞と比較して腫瘍細胞（ＭｅｌＡ３７５及びＮＣＩ－Ｈ１６５０）を良好に死滅させる（図１５）。
実施例５：正常細胞の認識
この一連の実験では、ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲ形質導入エフェクター細胞によって引き起こされ得るオンターゲット／オフ腫瘍毒性及びオフターゲット毒性の可能性を評価することを目的としている。この目的のために、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１発現初代細胞、及び必要不可欠な組織または器官に当たる人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来細胞株がＴＣＲ形質導入Ｔ細胞によって認識されるかを試験した。
個々の標的細胞型に応じて適切なＥ：Ｔ比でインビトロの共培養実験（４０．０００個エフェクター細胞／９６ウェル）を実施した。個々の標的の特性に沿って、共培養を開始する１～７日前に製造者の説明による細胞密度で細胞を播種し、平底ウェル中で単層培養した。
ニューロン上のＨＬＡ－Ａ２発現は、低用量のＩＦＮ－ガンマを培養培地に含めて誘導した。
オンターゲット／オフ腫瘍毒性と潜在的なオフターゲット毒性とを区別するために、試験したすべての正常細胞について、そのＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ発現を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって分析した。１０－５Ｍのペプチドを負荷した標的細胞を内部陽性対照（ＳＬＬペプチド）とした。
読み出し：共培養から２０時間後に標準的なＩＦＮ－ガンマ／ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡを行った。
結果：ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞集団は、ＩＦＮ－ガンマが高レベルで産生される様式で非負荷正常細胞を認識することはない。一方で、特異的ＳＬＬペプチドが細胞に負荷されると、そうした細胞は認識される。ＲＰＴＥＣとの共培養に限っては負荷を行っていなくても、両方の試料において最小限のＩＦＮ－ガンマ産生が生じる。この産生は、この細胞型での既知の内在性ＰＲＡＭＥ発現に起因するものである（図６）。
実施例６：ＨＬＡ－Ａ＊０２精密タイピング
この実験の目的は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１以外でＰＲＡＭＥＳＬＬエピトープを提示可能であり、個々のＳＬＬ特異的ＴＣＲによって認識され得る一般的なＨＬＡ－Ａ２サブアレル（ＨＬＡ－Ａ＊０２：ｘｘ；ｗｗｗ．ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇによるアレル命名）を決定することとした（ＨＬＡ拘束精密タイピング）。したがって、こうした認識されるＨＬＡ－Ａ２サブアレルを患者が発現するのであれば、そうした患者を試験コホートに加えることも可能となる（図７）。
ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と、選択したＨＬＡ－Ａ２サブアレル陽性リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ；ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞）とを、Ｅ：Ｔ比を１：２として６％ＣＯ２雰囲気下、３７℃、インビトロで２０時間共培養した（１０．０００個エフェクター細胞／９６ウェル）。エフェクター細胞として、一人のドナーのＴＣＲ形質導入ＰＢＬを使用した。すべての個々のＬＣＬに対して１０－５ＭのＳＬＬペプチドを３７℃で１．５時間負荷し、それらのＬＣＬをそれぞれのエフェクター細胞と共培養し、ＩＦＮ－ガンマ分泌について試験することで、形質導入Ｔ細胞の特有のＴＣＲサブアレル認識を決定している。非負荷標的細胞を陰性対照としている。
読み出し：共培養から２０時間後に標準的なＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳＡを行った。
結果：０２７－００４は、試験した１０個のＨＬＡ－Ａ２サブアレル（Ａ＊０２：ｘｘ）のうちの３個によって提示されたＰＲＡＭＥペプチドを効率的に認識し、ＨＬＡ－Ａ２サブアレルＡ＊０２：０２及びＡ＊０２：０４は、Ａ＊０２：０１と比較して等しいレベルで認識される。対照３８２５は、試験した１０個のＨＬＡ－Ａ２サブアレル（Ａ＊０２：ｘｘ）のうちの１個によって提示されたＰＲＡＭＥペプチドを効率的に認識し、すなわち、ＨＬＡ－Ａ２サブアレルＡ＊０２：０１が認識される（図８～１０）。
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ＷＯ２０１９／１７５２０９Ａ１

Claims (30)

  1. アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）を有するＰＲＡＭＥペプチドもしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態、に結合する能力を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、前記ＴＣＲが、
    ａ）（配列番号６）のアミノ酸配列、または配列番号６との同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列、を含むまたはからなる、前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号２のアミノ酸配列を含むまたはからなる、前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域のＣＤＲ１、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはからなる、前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域のＣＤＲ２と、
    ｂ）（配列番号７）のアミノ酸配列、または配列番号７との同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列、を含むまたはからなる、前記ＴＣＲベータ鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号３のアミノ酸配列を含むまたはからなる、前記ＴＣＲベータ鎖可変領域のＣＤＲ１、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはからなる、前記ＴＣＲベータ鎖可変領域のＣＤＲ２と、
    を含む、前記ＴＣＲ。
  2. 前記ＨＬＡ－Ａ２が、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０４がコードする分子である、請求項１に記載のＴＣＲ。
  3. 配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）もしくはその一部、またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態への結合が、前記ＴＣＲで形質導入またはトランスフェクトされた細胞によるＩＦＮ－ガンマ分泌を誘導する、請求項１または請求項２に記載のＴＣＲ。
  4. ＩＦＮ－ガンマイムノアッセイによって測定した場合、前記ＩＦＮ－ガンマ分泌の半最大有効濃度が１０－７Ｍ未満である、請求項１～３のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
  5. 前記ＴＣＲが、
    ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲアルファ鎖と、
    ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲベータ鎖と、
    を含む、先行請求項のいずれかに記載のＴＣＲ。
  6. ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはからなるＴＣＲアルファ鎖可変領域と、
    ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むまたはからなるＴＣＲベータ鎖可変領域と、
    を含む、先行請求項のいずれかに記載のＴＣＲ。
  7. ａ）配列番号１０、または配列番号１０との同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を含むまたはからなるＴＣＲアルファ鎖と、
    ｂ）配列番号１１、または配列番号１１との同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％であるアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を含むまたはからなるＴＣＲベータ鎖と、
    を含む、先行請求項のいずれかに記載のＴＣＲ。
  8. 互いに共有結合で連結されてＴＣＲヘテロ二量体またはＴＣＲ多量体を形成する、少なくとも１つのＴＣＲアルファ鎖（複数可）及び少なくとも１つのＴＣＲベータ鎖（複数可）を含む、先行請求項のいずれかに記載のＴＣＲ。
  9. 前記ＴＣＲが、天然のＴＣＲ、ＴＣＲバリアント、ＴＣＲ断片、またはＴＣＲコンストラクトから選択される、先行請求項のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
  10. Ｆｃ受容体、Ｆｃドメイン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＭを含む）、サイトカイン（ＩＬ－２またはＩＬ－１５を含む）、毒素、抗体またはその抗原結合断片（抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤＳ抗体、抗ＣＤ１６抗体、もしくは抗ＣＤ５６抗体、またはその抗原結合断片を含む）、ＣＤ２４７（ＣＤ３－ゼータ）ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ１３７ドメイン、ＣＤ１３４ドメイン、あるいはそれらの組み合わせ、から任意選択で選択される１つ以上の融合要素（複数可）をさらに含むと共に、少なくとも１つのリンカーを任意選択でさらに含む、先行請求項のいずれかに記載のＴＣＲ。
  11. 前記ＴＣＲが、
    ａ）請求項１～１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＴＣＲアルファ鎖、及び／または
    ｂ）請求項１～１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＴＣＲベータ鎖、及び／または
    ｃ）リンパ球の表面上の抗原もしくはエピトープに対して向けられた抗体もしくは一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）
    を含み、
    前記ＴＣＲアルファ鎖（複数可）と前記ＴＣＲベータ鎖（複数可）とが互いに連結され、リンカーを任意選択で介して前記抗体または前記ｓｃＦｖと融合される、先行請求項のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
  12. 前記抗原が、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、またはＣＤ５６から選択される、請求項１１に記載のＴＣＲ。
  13. 少なくとも１つの分子マーカーをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
  14. 可溶性である、先行請求項のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
  15. 先行請求項のいずれか１項に記載のＴＣＲをコードする核酸。
  16. 配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２２の核酸配列を含む、請求項１５に記載の核酸。
  17. 請求項１５または請求項１６に記載の核酸を含むベクター。
  18. 請求項１～１４のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１５もしくは請求項１６に記載の核酸配列、または請求項１７に記載のベクター、を含む宿主細胞。
  19. 限定されないが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ガンマ／デルタＴ細胞を含むリンパ球から選択される、請求項１８に記載の宿主細胞。
  20. 先行請求項のいずれかに記載のＴＣＲを得るための方法であって、
    ａ）前記ＴＣＲが発現する条件の下で請求項１８または請求項１９に記載の宿主細胞をインキュベートすること、
    ｂ）前記ＴＣＲを精製すること、
    を含む、前記方法。
  21. ａ）請求項１～１４のいずれか１項に記載のＴＣＲ、
    ｂ）請求項１５もしくは請求項１６に記載の核酸、
    ｃ）請求項１７に記載のベクター、及び／または
    ｄ）請求項１８もしくは請求項１９に記載の宿主細胞
    のうちの１つ以上と、
    任意選択で、医薬品添加物（複数可）と、
    を含む医薬組成物または診断組成物。
  22. チェックポイント阻害剤をさらに含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 前記チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、及びＰＤ－Ｌ１阻害剤からなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. 薬剤としての使用のための、請求項１～１４のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１５もしくは請求項１６に記載の核酸、請求項１７に記載のベクター、及び／または請求項１８もしくは請求項１９に記載の宿主細胞。
  25. がんの検出、診断、予後、予防、及び／または治療における使用のための、請求項１～１４のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１５もしくは請求項１６に記載の核酸、請求項１７に記載のベクター、及び／または請求項１８もしくは請求項１９に記載の宿主細胞。
  26. 前記がんが、好ましくは、黒色腫、膀胱癌、結腸癌、及び乳腺癌、肉腫、前立腺癌、子宮癌、ぶどう膜悪性腫瘍、ぶどう膜黒色腫、頭頸部扁平上皮癌、滑膜癌、ユーイング肉腫、トリプルネガティブ乳癌、甲状腺癌、精巣癌、腎癌、膵癌、卵巣癌、食道癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、肝細胞癌、頭頸部癌、胃癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、胆管癌、乳癌、膀胱癌、骨髄性白血病、ならびに急性リンパ芽球性白血病からなる群から選択され、好ましくは、前記がんが、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、乳癌、卵巣癌、または結腸直腸癌、肉腫または骨肉腫からなる群から選択される、請求項２５に記載の前記使用のためのＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／または宿主細胞。
  27. がんの予防及び／または治療が、
    ａ）（ｉ）請求項１～１４のいずれか１項に記載のＴＣＲ、
    （ｉｉ）請求項１５または請求項１６に記載の核酸、
    （ｉｉｉ）請求項１７に記載のベクター、
    （ｉｖ）請求項１８または請求項１９に記載の宿主細胞、及び
    （ｖ）請求項２１～２３のいずれか１項に記載の医薬組成物
    のうちの１つ以上を供給することと、
    ｂ）（ｉ）～（ｖ）のうちの少なくとも１つを、それを必要とする対象に投与することと、
    を含む、請求項２５に記載の前記使用のためのＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／または宿主細胞。
  28. がんの予防及び／または治療が、
    ａ）対象の試料を供給することであって、前記試料がリンパ球を含む、前記供給することと、
    ｂ）（ｉ）請求項１～１４のいずれか１項に記載のＴＣＲ、
    （ｉｉ）請求項１５または請求項１６に記載の核酸、
    （ｉｉｉ）請求項１７に記載のベクター、
    （ｉｖ）請求項１８または請求項１９に記載の宿主細胞、及び
    （ｖ）請求項２１～２３のいずれか１項に記載の医薬組成物
    のうちの１つ以上を供給することと、
    ｃ）ステップ（ｂ）の（ｉ）～（ｖ）のうちの１つ以上を、前記ステップ（ａ）のリンパ球に導入し、それによって改変リンパ球を得ることと、
    ｄ）前記ステップ（ｃ）の改変リンパ球を、それを必要とする対象または患者に投与することと、
    を含む、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の前記使用のためのＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／または宿主細胞。
  29. 対象におけるがんの存在をインビトロで検出する方法であって、
    （ａ）対象の試料を供給することであって、前記試料が１つ以上の細胞を含む、前記供給すること、
    （ｂ）前記試料を
    （ｉ）請求項１～１４のいずれか１項に記載のＴＣＲ、
    （ｉｉ）請求項１８もしくは請求項１９に記載の宿主細胞、及び／または
    （ｉｉｉ）請求項２１に記載の医薬組成物
    と接触させ、それによって複合体を形成させること、ならびに
    （ｃ）前記複合体を検出すること、
    を含み、
    前記複合体の検出が、前記対象における前記がんの存在を示す、前記方法。
  30. 改変リンパ球を生成させるための、請求項１～１４のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１５または１６に記載の核酸、及び／または請求項１７に記載のベクター、の使用。
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