JP2023501510A - 誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞に由来するエクソソームを含む腎臓疾患の予防又は治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、前処理物質で前処理した或いは前処理していない誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソームを有効成分として含む、腎臓疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。本発明のエクソソームは、既存の間葉幹細胞から分離されたエクソソームに比べてより改善された腎臓疾患の予防又は治療効果を示すので、これを関連の研究開発及び製品化に有用に使用可能である。【選択図】 図４Ａ
Description
本発明は、前処理物質で前処理した或いは前処理していない誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞に由来するエクソソームを有効成分として含む、腎臓疾患の予防又は治療用組成物に関する。
間葉幹細胞は、多分化能を有する間質細胞であって、造骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞などを含む様々な細胞へと分化可能な細胞のことをいう。間葉幹細胞は、軟骨や骨組織、靭帯、骨髄基質などの様々な結合組織へと分化可能なことから、関節炎や外傷、火傷などによる軟部組織の欠損を治療するなど、様々な疾患への治療用途として研究されている。
最近では、間葉幹細胞自体を用いず、間葉幹細胞が分泌するエクソソームを用いた様々な疾患に対する治療効果に対する研究が活発に行われつつある。このようなエクソソームを商業的に利用するためには、多量かつ良質のエクソソームが必要である。しかしながら、間葉幹細胞から得られるエクソソームの量は僅かであり、間葉幹細胞の機能及び増殖能力も継代の反復につれて減少するため、間葉幹細胞と同等である或いはそれよりも優れた機能性を有しながらも、増殖能力に優れた細胞を確立する技術開発の必要性がでてきた。
一方、腎臓は左右に１個ずつ合計２個があり、各腎臓は、約１００万個のネフロン（ｎｅｐｈｒｏｎ）という基本構造からなり、１個のネフロンは、糸球体と呼ばれる微細な毛細血管の塊と腎細尿管とから構成され、濾過及び吸収の機能を担当する。
腎臓が排泄、調節、代謝及び内分泌的機能を正常に行えず、全般的に低下又は異常が起きた状態を腎臓疾患というが、腎臓疾患は、進行状態によって、急性腎不全症と慢性腎不全症とに分類されるか、発病の原因によって、血管複合体の沈着による糸球体腎炎、糖尿病又は高血圧などの合併症による糖尿病性腎症、抗生剤又は抗癌剤などの薬物投与による毒性腎症、細菌感染による尿路感染などに分類される。
腎臓疾患は、原因とされる腎臓疾患の種類に関係なく、慢性的に腎機能の障害が進んで糸球体の濾過率が５０％以下に減少すると、一般に、糸球体の濾過率が減少し続き、最終的に末期腎不全症に到達して血液学的異常、神経系合併症、胃腸関連合併症、免疫学的合併症、感染又は骨異栄養症などの合併症が発生し、ひどい場合には死に至る。
腎臓疾患は、世界的に毎年発病者が増加しており、その上、症状が発現しない或いはよく認知できず、初期に発見しても末期腎不全に至るケースが多い。韓国にも概ね４５万人の腎不全症患者がおり、初期腎不全症患者まで考慮すると、発病者はさに多いと予測される。腎不全症の治療において、長期的透析や腎臓移植（ｒｅｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）などの治療手段があるものの、慢性腎不全症の初期・中期の治療問題を解決することはできず、しかも治療費用が高いため、国と患者の家庭に深刻な経済的負担をもたらす。
したがって、より安全かつ効果的な腎臓疾患の治療に適する新しい治療用組成物の開発ニーズが高まっている状況である。
本発明者らは、間葉幹細胞のエクソソームを用いた腎臓疾患の治療剤を開発しようと鋭意研究努力した。その結果、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）由来の間葉幹細胞よりも未分化段階にある間葉幹細胞の前駆細胞を確立し、前処理物質で前処理した或いは前処理していない前記誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞に由来するエクソソームが、腎臓疾患において優れた予防又は治療効果を示すことを究明し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）由来間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）の前駆細胞から分離されたエクソソームを有効成分として含む、腎臓疾患（Ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソームを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前処理物質で前処理された、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）由来間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）の前駆細胞から分離されたエクソソームを有効成分として含む、腎臓疾患（Ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前処理物質で前処理された、誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソームを提供することである。
本発明者らは、間葉幹細胞のエクソソームを用いた腎臓疾患の治療剤を開発しようと鋭意研究努力した。その結果、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）由来の間葉幹細胞よりも未分化段階にある間葉幹細胞の前駆細胞を確立し、前処理物質で前処理した或いは前処理していない前記誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞に由来するエクソソームが、腎臓疾患において優れた予防又は治療効果を示すことを究明した。
本発明は、誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソーム及びこれを有効成分として含む、腎臓疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物、及び前処理物質で前処理された、誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソーム及びこれを有効成分として含む、腎臓疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の一態様は、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）由来間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）の前駆細胞から分離されたエクソソームを有効成分として含む、腎臓疾患（Ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
本明細書において、用語「幹細胞」とは、未分化された細胞であって、自己複製能力を有しながら２つ以上の異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞をいう。本発明の幹細胞は、自己又は同種由来幹細胞であってよい。
本明細書において、用語「誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）」とは、体細胞のように既に分化された細胞に逆分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を誘導して初期の未分化された状態に戻り、全分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有するようになった細胞のことを意味する。
前記逆分化は、特定の遺伝子（例えば、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋ１ｆ４、Ｏｃｔ－４など）を導入して発現させるか、或いは前記特定の遺伝子が導入された細胞で作られた逆分化誘導タンパク質を注入して誘導できる。
前記全分化能は、生体を構成する３つの胚葉（ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）、すなわち内胚葉（ｅｎｄｏｄｅｒｍ）、中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍ）及び外胚葉（ｅｃｔｏｄｅｒｍ）起源の組織又は器官へと分化可能な能力のことを意味する。
本明細書において、用語「間葉幹細胞」とは、多分化能を有する細胞であり、造骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞などを含む様々な細胞に分化可能な幹細胞をいう。前記間葉幹細胞は、骨髄由来間葉幹細胞が最も頻繁に用いられるが、骨髄の他にも臍帯又は臍帯血、脂肪組織、羊水、奥歯の歯蕾（ｔｏｏｔｈ ｂｕｄ）に由来してよい。間葉幹細胞は、間質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）という用語とも呼ばれる。
前記間葉幹細胞の前駆細胞は、一般の間葉幹細胞ではなく、［本発明者らが開発した］誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）に由来する間葉幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）である。
前記「誘導万能幹細胞」は、分化された細胞から人為的な逆分化過程を通じて多能成分化能を有するように誘導された細胞のことを指し、逆分化幹細胞とも呼ばれる。
前記人為的な逆分化過程は、レトロウイルス、レンチウイルス及びセンダイウイルスを用いたウイルス媒介又は非ウイルス性ベクターの利用、タンパク質及び細胞抽出物などを用いる非ウイルス媒介逆分化因子の導入により行われるか、或いは幹細胞抽出物、化合物などによる逆分化過程を含む。
前記誘導万能幹細胞は、胚性幹細胞とほぼ同じ特性を有し、具体的には、類似の細胞形態を示し、遺伝子及びタンパク質の発現パターンが類似しており、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で全分化能を有し、テラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）を形成し、マウスの胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）に挿入させたときにキメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）マウスを形成し、遺伝子のジャームライン転移（ｇｅｒｍＬｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）が可能である。
本発明の誘導万能幹細胞は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ウサギなどのあらゆる哺乳動物由来の誘導万能幹細胞を含むが、好ましくは、ヒト由来の誘導万能幹細胞である。
また、本発明の前記誘導万能幹細胞が逆分化される前の体細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、羊水又は胎盤などに由来する体細胞であってよいが、これに限定されない。
具体的に、前記体細胞は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｓｅ ｃｅｌｌ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、表皮細胞（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、筋細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、メラノサイト（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）、神経細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ）、膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、星状膠細胞（ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）などを含むが、これに限定されるものではない。
本発明の一具現例において、前記本発明の間葉幹細胞の前駆細胞は、同等な数の間葉幹細胞に比べ、ＡＮＫＲＤ１１、ＣＰＥ、ＮＫＡＩＮ４、ＬＣＰ１、ＣＣＤＣ３、ＭＡＭＤＣ２、ＣＬＳＴＮ２、ＳＦＴＡ１Ｐ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＰＤＥ１Ｃ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＳＵＬＴ１Ｃ４、ＴＲＩＭ５８、ＤＥＮＮＤ２Ａ、ＣＡＤＭ４、ＡＩＦ１Ｌ、ＮＴＭ、ＳＨＩＳＡ２、ＲＡＳＳＦ４、及びＡＣＫＲ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子をより高いレベルで発現させる。
また、本発明の他の具現例において、前記本発明の間葉幹細胞の前駆細胞は、同等な数の間葉幹細胞に比べ、ＤＨＲＳ３、ＢＭＰＥＲ、ＩＦＩ６、ＰＲＳＳ１２、ＲＤＨ１０、及びＫＣＮＥ４からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子をより低いレベルで発現させる。
前記間葉幹細胞の前駆細胞及び同等な数の間葉幹細胞は、同種組織由来である。さらに具体的には、前記間葉幹細胞の前駆細胞は、誘導万能幹細胞に由来する間葉幹細胞の前駆細胞である。
本発明の一実施例において、前記間葉幹細胞の前駆細胞は、臍帯組織由来の誘導万能幹細胞に由来する間葉幹細胞の前駆細胞であり、これと比較される同等な数の間葉幹細胞は、臍帯組織由来の間葉幹細胞である。
本発明者らは、前記誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞を、ＢｘＣ（ｂｒｅｘｏｇｅｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と命名した。本明細書において、前記「誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）」は、「誘導万能幹細胞由来間葉前駆細胞」とも表現される。
本発明の同一組織由来（例えば、臍帯組織）の誘導万能幹細胞の間葉幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）は、同一組織由来（例えば、臍帯組織）の間葉幹細胞（ＭＳＣ）と比べて、染色体核型に異常がなく、増殖能力に優れている。具体的に、本発明のＢｘＣは、継代を９回以上繰り返す場合に、同一組織由来の間葉幹細胞（ＭＳＣ）と比べて１０倍以上の増殖能の差を示し、継代を１２回以上繰り返しても増殖能の減少が観察されない。また、ＢｘＣは、ＭＳＣに比べて、細胞増殖能に関連するマーカーであるＫｉ６７の発現量も２倍以上高く見られる。
前記誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）は、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、エンドセリン－１（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１）、ＶＥＧＦ－Ａ、トロンボスポンジン－２（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ－２）、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ｂｅｔａ－ＮＧＦ、及びＨＢ－ＥＧＦなどの機能性タンパク質を、同等な数の間葉幹細胞と比べて多量分泌する。
本明細書において、前記エンドスタチンは、自然に生成されるＸＶＩＩＩ型コラーゲンに由来する２０ｋＤａ Ｃ末端断片であり、抗新生血管製剤として報告されている。
本明細書において、前記エンドセリン－１は、プレプロエンドセリン－１（ＰＰＥＴ１）とも知られており、ＥＤＮ１遺伝子によりエンコードされるタンパク質であり、血管内皮細胞から生産される。エンドセリン－１は強力な血管収縮剤として知られている。
本明細書において、前記ＶＥＧＦ－Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ）は、ＶＥＧＦＡ遺伝子がエンコードするタンパク質であり、血管内皮細胞のＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２との相互作用によって血管の成長を誘導するものと知られている。
本明細書において、前記トロンボスポンジン－２は、ＴＨＢＳ２遺伝子によりエンコードされるタンパク質であり、細胞－細胞の相互作用又は細胞－基質の相互作用を媒介するものと知られている。トロンボスポンジン－２の癌に対する働きは論争の余地があるが、間葉幹細胞の細胞表面の特性を調節することが報告されており、細胞の付着及び移動に関与すると知られている。
本明細書において、前記ＰＩＧＦ（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は、ＰＧＦ遺伝子によりエンコードされるタンパク質であり、ＶＥＧＦサブファミリーのメンバーとして胚発生期において血管新生に主な働きをするタンパク質として知られている。
本明細書において、前記ＰＤＧＦ－ＡＡ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は、細胞の成長及び分裂を調節する成長因子であり、血管の生成及び成長、間葉幹細胞の増殖、化学走性、及び移動において重要な役割を担うと知られている。
本明細書において、ＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は、神経親和性因子及びニューロペプチドであり、主に神経の成長、保持、増殖及び生存に関与する。ＮＧＦは、ａｌｐｈａ－、ｂｅｔａ－、及びｇａｍｍａ－ＮＧＦが約２：１：２の割合で発現する３つのタンパク質の複合体であり、ここで、ｇａｍｍａ－ＮＧＦはセリンプロテアーゼとして働き、ｂｅｔａ－ＮＧＦのＮ末端を切断してＮＧＦを活性化させると知られている。
本明細書において、前記ＨＢ－ＥＧＦ（ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＧＦ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は、ＨＢＥＧＦ遺伝子によりエンコードされるＥＧＦファミリータンパク質のメンバーである。ＨＢ－ＥＧＦは心臓の発達及び血管分布に重要な役割を担うと知られており、表皮創傷の治癒において上皮化過程に必須なタンパク質として知られている。
本明細書において、用語「エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」とは、細胞が細胞外に分泌させるか、細胞内に存在する脂質－二重層からなる膜構造を有する小胞（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）であり、大部分の真核生物の体液に存在する。エクソソームの直径は、３０～１０００ｎｍ程度であり、多重小胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ）が細胞膜と融合するときに細胞から放出されるか、細胞膜から直接放出される。エクソソームが、凝固、細胞－細胞間のコミュニケーション及び細胞性免疫を仲裁する機能的役目を果たすために、細胞内の生体分子であるタンパク質、生体活性脂質及びＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を輸送する役割を担っていることはよく知られている。
前記エクソソームは、微細小胞体（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）を包括する概念である。エクソソームのマーカータンパク質としては、ＣＤ６３、ＣＤ８１などが知られており、他には、ＥＧＦＲのような細胞表面の受容体、信号伝達関連分子、細胞付着関連タンパク質、ＭＳＣ関連抗原、熱衝撃タンパク質（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）、小胞形成に関連したＡｌｉｘなどのタンパク質が知られている。
本発明において、前記誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソームは、前述した誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）内に存在するか、ＢｘＣから分泌されたエクソソームを意味する。
本明細書において、用語「有効成分として含む」とは、誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソームが、腎臓疾患の予防又は治療活性を達成するに十分な量を含むことを意味する。
前記腎臓疾患は、腎臓線維症、糖尿病性腎症、高血圧性腎症、糸球体腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、ループス腎炎、多嚢胞性腎臓疾患、腎不全症、糸球体硬化症、移植後急性拒否反応及び／又は薬物による腎臓損傷でよいが、これに制限されるものではない。
前記薬物は抗癌剤でよく、例えば、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）でよいが、これに制限されない。
本発明における用語「予防」は、本発明の組成物の投与により腎臓疾患を抑制させるか、進行を遅らせる全ての行為を意味する。
本明細書における用語「治療」は、（ａ）腎臓疾患の進展の抑制；（ｂ）腎臓疾患の軽減；及び（ｃ）腎臓疾患の除去を意味する。
本発明に係る薬剤学的組成物は、有効成分の他に薬剤学的に許容される担体を含んでもよい。このとき、薬剤学的に許容される担体は、製剤の際に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、安息香酸ヒドロキシメチル、安息香酸ヒドロキシプロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。また、前記成分の他にも、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでよい。
本発明の薬剤学的組成物は、目的とする方法によって、経口投与又は非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内又は局所に適用）でき、投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物の形態、投与の経路及び時間によって異なるが、当業者によって適切に選択されてよい。
本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬剤学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の割合で疾患を治療することに十分な量を意味し、有効量は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時使用される薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られた要素によって決定されてよい。
本発明に係る薬剤学的組成物は、個別治療剤として投与されるか、他の治療剤と併用して投与されてよく、既存の治療剤とは順次に又は同時に投与されてよく、単回又は多回投与されてよい。前記要素を全て考慮し、副作用なしに、最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定されてよい。
具体的に、本発明の薬剤学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内における活性成分の吸収度、不活性率及び排泄速度、疾患の種類、併用される薬物によって異なってよい。
本発明の他の態様は、誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソームに関する。
本発明の前記誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）は、既存のエクソソームとしての特性を有するエクソソームである。本発明の実施例で立証しているように、前記誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソームは、腎臓細胞の再生に優れた効果を示すことが確認された（図２）。また、本発明のＢｘＣ－ｅは、腎不全（Ｋｉｄｎｅｙ ｆａｉｌｕｒｅ）が誘導された腎臓細胞において、炎症を抑制し、細胞の死滅を抑制する他、小胞体のストレスを抑制することも確認された（図４Ａ～図６Ｂ）。
本発明のさらに他の態様は、前記誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソームを個体に投与する段階を含む、腎臓疾患の治療方法に関する。
前記「個体」とは、疾病の治療が必要な対象を意味し、より具体的には、ヒト又は非ヒトの霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、イヌ、ネコ、ウマ及びウシなどの哺乳類を意味する。
本発明のさらに他の態様は、前記誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソームの腎臓疾患の治療用途に関する。
前記腎臓疾患の治療方法及び治療用途は、前述した本発明の誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソーム及びこれを含む薬剤学的組成物と構成成分が共通するので、それらに共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
本発明のさらに他の態様は、前処理物質で前処理された、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）由来間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）の前駆細胞から分離されたエクソソームを有効成分として含む、腎臓疾患（Ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
本明細書における用語「前処理」とは、誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞の培養過程において、前処理物質が添加された細胞培養培地を誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞に接触させる過程を意味する。
前記前処理は、前記誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞を、前処理物質を含む細胞培養培地で培養する方法により行われてよい。
前記細胞培養培地は、動物細胞の培養に通常用いられるいかなる培地も可能であり、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭとＦ１２との混合物、イーグルのＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）、α－ＭＥＭ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ＭＥＭ、１９９培地、ＣＭＲＬ １０６６、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ１２、Ｆ１０、Ｗａｙ－ｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ７５２／１、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ及びＭＣＤＢシリーズなどが用いられてよい。
前記培養は６～４８時間行われてよい。
具体的に、前記培養は、６～４２時間、６～３６時間、６～３０時間、６～２７時間、１２～４８時間、１２～４２時間、１２～３６時間、１２～３０時間、１２～２７時間、１８～４８時間、１８～４２時間、１８～３６時間、１８～３０時間、１８～２７時間、２１～４８時間、２１～４２時間、２１～３６時間、２１～３０時間、又は２１～２７時間行われてよい。
前記前処理物質はエクセンディン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）であってよい。
本発明のエクセンディン－４は、グルカゴン様ペプチド（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＧＬＰ）受容体のペプチドアゴニストである。エクセンディン－４は、インスリン分泌を促進するものと知られており、２型糖尿及びパーキンソン疾患の治療用途として臨床的に使用されてきた。
前記エクセンディン－４は、細胞培養培地内に１～１００ｎＭの濃度で含まれてよい。
具体的に、前記エクセンディン－４は、細胞培養培地内に１～９０ｎＭ、１～８０ｎＭ、１～７０ｎＭ、１～６０ｎＭ、１～５０ｎＭ、１～４０ｎＭ、１～３０ｎＭ、１０～９０ｎＭ、１０～８０ｎＭ、１０～７０ｎＭ、１０～６０ｎＭ、１０～５０ｎＭ、１０～４０ｎＭ、及び１０～３０ｎＭの濃度で含まれてよい。
前記前処理物質は、ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）であってよい。
本発明のラニフィブラノールは、ＰＰＡＲ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）であって、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ及びＰＰＡＲγと知られた３つのＰＰＡＲアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）をそれぞれ活性化させ、身体内で抗線維化、抗炎、そして有益な代謝変化を誘導するものと知られている小分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）である。ＰＰＡＲは、遺伝子の発現を調節する核ホルモン受容体ファミリーに属するリガンド－活性化された転写因子である。ＰＰＡＲは、細胞の分化、発達及び腫瘍形成の調節に必須の役割を担う。線維症を調節するＰＰＡＲを活性化させて結合組織の異常成長を減少させることが知られている。また、ラニフィブラノールは全身硬化症の治療剤、特発性肺線維症の治療剤などの用途に臨床的に用いられてきた。
前記ラニフィブラノールは、細胞培養の培地内に１～１００ｎＭの濃度で含まれてよい。
具体的に、前記ラニフィブラノールは、細胞培養の培地内に１～１０００μＭ、１～５００μＭ、１～１００μＭ、１～９０μＭ、１～８０μＭ、１～７０μＭ、１～６０μＭ、１～５０μＭ、１～４０μＭ、１～３０μＭ、１～２０μＭ、５～１０００μＭ、５～５００μＭ、５～１００μＭ、５～９０μＭ、５～８０μＭ、５～７０μＭ、５～６０μＭ、５～５０μＭ、５～４０μＭ、５～３０μＭ、５～２０μＭの濃度で含まれてよい。
本発明のさらに他の態様は、前処理物質で前処理された、誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソームに関する。
本発明の前記前処理物質で前処理された、誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）は、既存のエクソソームとしての特性を有するエクソソームである。本発明の実施例で立証しているように、本発明のＢｘＣ－Ｇ６３ｅは、腎不全が誘導された腎臓細胞において、炎症を抑制し、細胞の死滅を抑制する他、小胞体のストレスを抑制することも確認された（図４Ａ～図６Ｂ）。
本発明のさらに他の態様は、前記前処理物質で前処理された、誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソームを個体に投与する段階を含む、腎臓疾患の治療方法に関する。
前記「個体」とは、疾病の治療が必要な対象を意味し、より具体的には、ヒト又は非ヒトの霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、イヌ、ネコ、ウマ及びウシなどの哺乳類を意味する。
本発明のさらに他の態様は、前記前処理物質で前処理された、誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソームの腎臓疾患の治療用途に関する。
前記腎臓疾患の治療方法及び治療用途は、前述した本発明の前処理物質で前処理された、誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソーム及びこれを含む薬剤学的組成物と構成成分が共通するので、それらに共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
本発明は、前処理物質で前処理した或いは前処理していない誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソームを有効成分として含む、腎臓疾患の予防又は治療用組成物に関する。本発明のエクソソームは、既存の間葉幹細胞から分離されたエクソソームに比べてより改善された腎臓疾患の予防又は治療効果を示すので、これを関連の研究開発及び製品化に有用に用いることができる。
誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）由来間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）の前駆細胞から分離されたエクソソームを有効成分として含む、腎臓疾患（Ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防又は治療用薬剤学的組成物。
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
本明細書全体を通じて、特定物質の濃度を示すために使われる「％」は、別に断りのない限り、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、そして、液体／液体は（体積／体積）％である。
製造例：誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）由来間葉幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）の分離及び培養
まず、誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）を１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭで７日間培養した。次に、培養された誘導万能幹細胞で、ＦＡＣＳにより、細胞表面にＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現しないＳＳＥＡ－４（－）細胞を分離した。また、分離されたＳＳＥＡ－４（－）細胞を継代して前記と同一の培地で７日間さらに培養し、本発明の誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞を作製した。本発明者らは、前記誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞をＢｘＣ（ｂｒｅｘｏｇｅｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と命名した。
ＢｘＣと命名された誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞を、培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１００Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１１４０－０５０）］でさらに培養した。
実施例１：誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）由来エクソソームの分離
前記製造例で培養された誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞（以下、ＢｘＣ）の培養培地を回収して３００ｘｇで１０分間遠心分離し、残っている細胞と細胞残余物を除去した。上澄液を取って０．２２μｍフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機（ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｅｎｔｒｉｇｕｇｅ）を用いて１０，０００ｘｇ、４℃で７０分間遠心分離した。遠心分離された上澄液を再び取って超遠心分離機（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１００，０００ｘｇ、４℃で９０分間遠心分離し、上澄液を除去した。下層に残っているエクソソームをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎ）に希釈し、以下の実験で使用した。
実験例１：誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）由来エクソソームの特性の確認
前記実施例１で分離されたエクソソーム（以下、ＢｘＣ－ｅ）に対して、ナノ粒子トラッキングアッセイ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙ）（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いてエクソソームのサイズ分布を確認し、電子顕微鏡を用いてエクソソームの形態を確認した。
図１Ａ及び図１Ｂから確認できるように、本発明のＢｘＣに由来するエクソソームはエクソソームとしての特性を有することが分かる。
実験例２：誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞由来エクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）の腎臓細胞再生効果の確認
前記実施例１で分離されたエクソソームに対して、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）又はＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）処理により損傷された腎臓細胞に対する再生効果を確認した。
２－１．シスプラチン損傷
まず、９６ウェル培養皿（ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ）に、上皮細胞株（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるＨＫ－２（韓国細胞株銀行）、腎臓上皮細胞（ｋｉｄｎｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）であるＲＰＴＥＣ（Ｒｅｎａｌ Ｐｒｏｘｉｍａｌ Ｔｕｂｕｌｅ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌs）（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－２５５３）及び腎臓上皮細胞であるＧＥＣ（Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ）（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＣＢＲＩ １２８）をそれぞれ、ウェル当たり１×１０４ずつ接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。
細胞接種１６時間後、細胞の状態を確認し、無血清成長培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｅａ）と共にシスプラチン（Ｓｉｇｍａ Ｐ４３９４）２５μＭを２４時間処理した。２４時間後、上澄液を捨ててＤＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３００２８．０２）で洗浄した後、新しい無血清成長培地と共に、前記実施例１で分離されたエクソソームを、５０μｇ（低用量）又は１００μｇ（高用量）ずつ４８時間処理した。
最終に、１０μＬのＣＣＫ－８溶液（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８、Ｅｎｚｏ ＡＬＸ－８５０－０３９－ＫＩ０１）を入れて３７℃のＣＯ２インキュベーターで２時間インキュベーションした。色が変わることを確認し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
２－２．ＬＰＳ損傷
前記実験例２－１のシスプラチンの代わりにＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ Ｌ２８８０）２０μｇ／ｍＬを処理した以外は、前記実験例２－１と同じ方法で実験を行った。
図２Ａ～図２Ｃから確認できるように、本発明のＢｘＣに由来するエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）は、様々な腎臓細胞に対する再生効果に優れていることが分かった。
実施例２：前処理物質処理による誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞由来エクソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）の分離
２－１．エクセンディン－４処理による誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞由来エクソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）の分離
２０ｎＭのエクセンディン－４が含まれた培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１９９５－０６５）；１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１１４０－０５０）］で、前記製造例で製造された誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）由来間葉幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）を２４時間培養した。
培養を完了した後、エクセンディン－４が前処理されたＢｘＣを洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加した培養培地で、７２時間さらに培養した。エクソソームが除去されたＦＢＳを使用する理由は、一般に使用するＦＢＳにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれているため、細胞の分泌するエクソソームの他にＦＢＳ由来のエクソソームが混入することを防止するためである。
７２時間の培養後、前処理物質が処理されたＢｘＣ培養培地を回収して３００ｘｇで１０分間遠心分離し、残っている細胞と細胞残余物を除去した。上澄液を取り、０．２２μｍフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機（ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｅｎｔｒｉｇｕｇｅ）を用いて１０，０００ｘｇ、４℃で７０分間遠心分離した。遠心分離された上澄液を再び取って超遠心分離機（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｇｕｇｅ）を用いて１００，０００ｘｇ、４℃で９０分間遠心分離し、上澄液を除去した。下層に残っているエクソソームをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎｅ）に希釈し、以下の実験で使用した。
２－２．ラニフィブラノール処理による誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞由来エクソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）の分離
１０μＭのラニフィブラノールが含まれた培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１９９５－０６５）；１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１１４０－０５０）］で、前記製造例で製造された誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）由来間葉幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）を２４時間培養した。
培養を完了した後、ラニフィブラノールが前処理されたＢｘＣを洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加した培養培地で７２時間さらに培養した。
７２時間の培養後、前処理物質が処理されたＢｘＣ培養培地を回収して３００ｘｇで１０分間遠心分離し、残っている細胞と細胞残余物を除去した。上澄液を取り、０．２２μｍフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機（ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｅｎｔｒｉｇｕｇｅ）を用いて１０，０００ｘｇ、４℃で７０分間遠心分離した。遠心分離された上澄液を再び取って超遠心分離機（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｇｕｇｅ）を用いて１００，０００ｘｇ、４℃で９０分間遠心分離し、上澄液を除去した。下層に残っているエクソソームをＰＢＳに希釈し、以下の実験で使用した。
実験例３：前処理物質の処理による誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞由来エクソソームの特性の確認
前記実施例２で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）に対して、ナノ粒子トラッキングアッセイ（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いてエクソソームのサイズ分布を確認し、電子顕微鏡を用いてエクソソームの形態を確認した。
図３Ａ～図３Ｄから確認できるように、本発明のエクセンディン－４及びラニフィブラノール処理によるＢｘＣ由来のエクソソームがエクソソームとしての特性を有することが分かる。
実験例４：エクセンディン－４処理による誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞由来エクソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）の腎臓疾患治療活性の評価
前記実施例１で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）及び前記実施例２－１で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）に対して、下記のように実験した。
４－１．炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）抑制効果
６ウェル培養皿に、上皮細胞株であるＨＫ－２、腎臓上皮細胞であるＲＰＴＥＣ及び腎臓上皮細胞であるＧＥＣをそれぞれ、ウェル当たり１×１０５ずつ接種した。細胞接種１６時間後、細胞の状態を確認し、無血清成長培地と共にシスプラチン２５μＭ又はＬＰＳ ２０μｇ／ｍＬ、及び前記実施例１で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）又は前記実施例２で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）１００μｇを２４時間処理した。この際、陽性対照群としては、シスプラチン又はＬＰＳのみを処理して腎不全を誘導した群を使用した。
２４時間後、上澄液を捨ててＤＰＢＳで洗浄した後、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）を処理して全ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を抽出した。ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した後、ｑＲＴ－ＰＣＲによりＴＮＦα遺伝子の発現を測定した。
図４Ａ及び図４Ｂから確認できるように、本発明のエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）は、シスプラチン又はＬＰＳ処理により毒性が誘発された様々な腎臓細胞において炎症を顕著に抑制する効果を有することが分かる。
４－２．細胞死滅（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）抑制効果
６ウェル培養皿に、上皮細胞株であるＨＫ－２、腎臓上皮細胞であるＲＰＴＥＣ及び腎臓上皮細胞であるＧＥＣをそれぞれ、ウェル当たり１×１０５ずつ接種した。細胞接種１６時間後、細胞の状態を確認し、無血清成長培地と共にシスプラチン２５μＭ又はＬＰＳ ２０μｇ／ｍＬ、及び前記実施例１で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）又は前記実施例２で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）１００μｇを２４時間処理した。この際、陽性対照群としては，シスプラチン又はＬＰＳのみを処理して腎不全を誘導した群を使用した。
２４時間後、上澄液を捨ててＤＰＢＳで洗浄した後、トリゾールを処理して全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した後、ｑＲＴ－ＰＣＲによりカスパーゼ－３（ｃａｓｐａｓｅ－３）遺伝子の発現を測定した。
図５Ａ及び図５Ｂから確認できるように、本発明のエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）は、シスプラチン又はＬＰＳ処理により毒性が誘発された様々な腎臓細胞において細胞死滅を顕著に抑制する効果を有することが分かる。
４－３．小胞体ストレス（ＥＲ Ｓｔｒｅｓｓ）の抑制効果
６ウェル培養皿に、上皮細胞株であるＨＫ－２、腎臓上皮細胞であるＲＰＴＥＣ及び腎臓上皮細胞であるＧＥＣをそれぞれウェル当たり１×１０５ずつ接種した。細胞接種１６時間後、細胞の状態を確認し、無血清成長培地と共にシスプラチン２５μＭ又はＬＰＳ ２０μｇ／ｍＬ、及び前記実施例１で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）又は前記実施例２で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）１００μｇを２４時間処理した。この際、陽性対照群としては、シスプラチン又はＬＰＳのみを処理して腎不全を誘導した群を使用した。
２４時間後、上澄液を捨ててＤＰＢＳで洗浄した後、トリゾールを処理して全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した後、ｑＲＴ－ＰＣＲによりＣＨＯＰ遺伝子の発現を測定した。
図６Ａ及び６Ｂから確認できるように、本発明のエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）は、シスプラチン又はＬＰＳ処理により毒性が誘発された様々な腎臓細胞において腎臓細胞内の小胞体ストレスを顕著に抑制する効果を有することが分かる。
４－４．腎臓損傷の治療及び回復機能
シスプラチンにより腎不全（Ｋｉｄｎｅｙ ｆａｉｌｕｒｅ）が誘導されたマウス腎臓損傷モデルにおいて、エクセンディン－４前処理の誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離したエクソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）の腎臓損傷治療及び回復機能を確認した。
８週齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウスにシスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して腎臓損傷を誘発した。シスプラチンの注入後、エクセンディン－４前処理の誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離したエクソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）をＩＶ投与し、３日後に血液を分離してクレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを測定し、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅの腎臓損傷治療及び回復機能を確認した。
実験の結果、図７Ａ及び図７Ｂ、及び表１及び表２から確認できるように、本発明に係るエクセンディン－４前処理の誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離したエクソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）は、シスプラチンにより増加された腎臓の血中尿素窒素（ＢＵＮ）数値とクレアチニン数値を顕著に減少させ得ることが確認され、これにより、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅエクソソームが損傷された腎臓の機能を回復させることに顕著に優れた効果があることを確認した。
実験例５：ラニフィブラノール処理による誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞由来エクソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）の腎臓疾患治療活性の評価
５．１．細胞死滅（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の抑制効果
ウェル培養皿に、腎臓上皮細胞をウェル当たり１×１０５ずつ接種した。細胞接種１６時間後、細胞の状態を確認し、無血清成長培地と共にＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍＬ）及び前記実施例１で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）又はラニフィブラノール処理による誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞由来エクソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）１００μｇを２４時間処理した。この際、陽性対照群としては、ＴＧＦ－βのみを処理して腎不全を誘導した群を使用した。
２４時間後、上澄液を捨ててＤＰＢＳで洗浄した後、トリゾールを処理して全ＲＮＡを抽出した。その後、下記表３のプライマーを用いてＲＮＡにてｃＤＮＡを合成した後、ｑＲＴ－ＰＣＲによりカスパーゼ－３遺伝子の発現を測定した。
図８及び表４から確認できるように、本発明のエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）は、ＴＧＦ－β処理により線維化が誘発された腎臓細胞において細胞の死滅を顕著に抑制する効果があることが分かる。
５．２．線維化（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）抑制効果
５．２．１．コラーゲンＩ、ＣＴＧＦ、α－ＳＭＡ及びフィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）発現抑制
６ウェル培養皿に、腎臓上皮細胞をウェル当たり１×１０５ずつ接種した。細胞接種１６時間後、細胞の状態を確認し、無血清成長培地と共にＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び前記実施例１で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）又はラニフィブラノール処理による誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞由来エクソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）１００μｇを２４時間処理した。この際、陽性対照群としては、ＴＧＦ－βのみを処理して腎不全を誘導した群を使用した。
２４時間後、上澄液を捨ててＤＰＢＳで洗浄した後、トリゾールを処理して全ＲＮＡを抽出した。下記表５のプライマーを用いてＲＮＡにてｃＤＮＡを合成した後、ｑＲＴ－ＰＣＲによりコラーゲンＩ、ＣＴＧＦ、α－ＳＭＡ、フィブロネクチン遺伝子の発現を測定した。
図９Ａ～９Ｄ及び表６～表９から確認できるように、本発明のエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）は、ＴＧＦβ処理により腎不全が誘導された腎臓細胞において、腎臓細胞の線維化（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）と関連した遺伝子であるコラーゲンＩ、ＣＴＧＦ、α－ＳＭＡ及びフィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）の発現を顕著に減少させ得ることが確認された。
５．２．２．結節（Ｎｏｄｕｌｅ）形成抑制
６ウェル培養皿に、腎臓上皮細胞をウェル当たり１×１０５ずつ接種した。細胞の接種時に、無血清成長培地と共にＴＧＦ－β、及び前記実施例１で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）又はラニフィブラノール処理による誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞由来エクソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）１００μｇを２４時間処理した。この際、陽性対照群としては、ＴＧＦ－βのみを処理して腎不全を誘導した群を使用した。２４時間後、上澄液を除去してＤＰＢＳで洗浄した後、メタノールで ４℃で５分間固定した後、ピクロシリウスレッド溶液（Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れて処理し、酢酸溶液（Ａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（０．５％）で２回洗浄し、顕微鏡を用いて結節（ｎｏｄｕｌｅ）の形成程度を観察して比較し、また、０．１Ｎ ＫＯＨでピクロシリウスレッド染料（Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ ｄｙｅ）を溶かして５４０ｎｍで吸光度を測定し、陽性対照群と比較した。
図１０Ａ～図１０Ｅ及び表１０から確認できるように、本発明のエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）は、ＴＧＦβ処理により腎不全が誘導された腎臓細胞で形成される結節（ｎｏｄｕｌｅ）生成を顕著に減少させ得ることが確認された。
５．２．３．Ｓｍａｄ２リン酸化の防止
６ウェル培養皿に、腎臓上皮細胞をウェル当たり１×１０５ずつ接種した。細胞接種１６時間後、細胞の状態を確認し、無血清成長培地と共にＴＧＦ－β及び前記実施例１で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）又はラニフィブラノール処理による誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞由来エクソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）１００μｇを２４時間処理した。この際、陽性対照群としては、ＴＧＦ－βのみを処理して腎不全を誘導した群を使用した。
２４時間後、上澄液を捨て、ＤＰＢＳで洗浄した後、細胞を集めてＮＰ４０バッファーによりタンパク質を抽出した。タンパク質は、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を用いて全Ｓｍａｄ２タンパク質及びリン酸化タンパク質を分析した。それぞれの全タンパク質でリン酸化されたＳｍａｄ２タンパク質を定量し、ＴＧＦ－βが処理されない陰性対照群と比較した。
図１１から確認できるように、本発明のエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）は、ＴＧＦβ処理により腎不全が誘導された腎臓細胞においてＴＧＦ－βによるＳｍａｄ２タンパク質のリン酸化を抑制するが確認された。
５．２．４．ＥＭＴ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）経路の調節
６ウェル培養皿に、腎臓上皮細胞をウェル当たり１×１０５ずつ接種した。細胞接種１６時間後、細胞の状態を確認し、無血清成長培地と共にＴＧＦ－β、及び前記実施例１で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）又はラニフィブラノール処理による誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞由来エクソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）１００μｇを２４時間処理した。この際、陽性対照群としては、ＴＧＦ－βのみを処理して腎不全を誘導した群を使用した。
２４時間後、上澄液を捨て、ＤＰＢＳで洗浄した後、トリゾールを処理して全ＲＮＡを抽出した。その後、表１１のプライマーを用いてＲＮＡにてｃＤＮＡを合成した後、ｑＲＴ－ＰＣＲによりＥ－カドヘリン（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、Ｎ－カドヘリン（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）遺伝子の発現を測定した。
図１２Ａ～図１２Ｃ及び表１２～表１４から確認できるように、本発明のエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）は、ＴＧＦβ処理により腎不全が誘導された腎臓細胞において、線維化（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）関連の重要な機序であるＥＭＴ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）経路の調節効果に優れていることが確認された。
５．２．５．ｓｎａｉｌ１及びｓｌｕｇのｍＲＮＡ発現抑制
６ウェル培養皿に、腎臓上皮細胞をウェル当たり１×１０５ずつ接種した。細胞接種１６時間後、細胞の状態を確認し、無血清成長培地と共にＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び前記実施例１で分離されたエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）又はラニフィブラノール処理による誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞由来エクソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）１００μｇを２４時間処理した。この際、陽性対照群としては、ＴＧＦ－βのみを処理して腎不全を誘導した群を使用した。
２４時間後、上澄液を捨て、ＤＰＢＳで洗浄した後、トリゾールを処理して全ＲＮＡを抽出した。その後、表１５のプライマーを用いてＲＮＡにてｃＤＮＡを合成した後、ｑＲＴ－ＰＣＲによりＳｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ遺伝子の発現を測定した。
図１３Ａ及び図１３Ｂ並びに表１６～表１７から確認できるように、本発明のエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）は、ＴＧＦβ処理により腎不全が誘導された腎臓細胞において、線維化（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）関連の重要な機序であるＥＭＴ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）経路の下位シグナルであるｓｎａｉｌ１及びｓｌｕｇ ｍＲＮＡの発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を調節する効果に優れていることが確認された。
５．３腎臓損傷の治療及び回復機能
シスプラチンにより腎不全が誘導されたマウス腎臓損傷モデルにおいて、ラニフィブラノール前処理の誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離したエクソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）の腎臓損傷治療及び回復機能を確認した。
８週齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウスにシスプラチン（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して腎臓損傷を誘発した。シスプラチンの注入後に、ラニフィブラノール前処理の誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離したエクソソーム（ＢｘＣ－Ｖ６３ｅ）をＩＶ投与し、３日後に血液を分離してクレアチニン、ＢＵＮを測定し、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅの腎臓損傷治療及び回復機能を確認した。
実験の結果、図１４Ａ及び図１４Ｂ並びに表１８及び表１９から確認できるように、本発明に係るエクセンディン－４前処理の誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離したエクソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）は、シスプラチンにより増加された腎臓の血中尿素窒素（ＢＵＮ）数値とクレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）数値を顕著に減少させ得ることが確認され、これにより、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅエクソソームは、損傷された腎臓の機能を回復させる効果に優れていることが確認された。
以上の内容を総合すると、本発明のＢｘＣ－ｅ、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅは、腎不全が誘導された腎臓細胞において、炎症を抑制し、細胞死滅を抑制する他、小胞体ストレスも抑制させるので、腎臓疾患の予防又は治療効能に優れていることが分かる。
本発明は、前処理物質で前処理した或いは前処理していない誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞に由来するエクソソームを有効成分として含む、腎臓疾患の予防又は治療用組成物に関する。
８週齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウスにシスプラチン（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して腎臓損傷を誘発した。シスプラチンの注入後に、ラニフィブラノール前処理の誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離したエクソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）をＩＶ投与し、３日後に血液を分離してクレアチニン、ＢＵＮを測定し、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅの腎臓損傷治療及び回復機能を確認した。
Claims (12)
- 誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）由来間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）の前駆細胞から分離されたエクソソームを有効成分として含む、腎臓疾患（Ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防又は治療用薬剤学的組成物。
- 前記間葉幹細胞の前駆細胞は、同等な数の同種組織由来間葉幹細胞に比べ、ＡＮＫＲＤ１、ＣＰＥ、ＮＫＡＩＮ４、ＬＣＰ１、ＣＣＤＣ３、ＭＡＭＤＣ２、ＣＬＳＴＮ２、ＳＦＴＡ１Ｐ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＰＤＥ１Ｃ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＳＵＬＴ１Ｃ４、ＴＲＩＭ５８、ＤＥＮＮＤ２Ａ、ＣＡＤＭ４、ＡＩＦ１Ｌ、ＮＴＭ、ＳＨＩＳＡ２、ＲＡＳＳＦ４、及びＡＣＫＲ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子をより高いレベルで発現させる、請求項１に記載の腎臓疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物。
- 前記間葉幹細胞の前駆細胞は、同等な数の同種組織由来間葉幹細胞に比べ、ＤＨＲＳ３、ＢＭＰＥＲ、ＩＦＩ６、ＰＲＳＳ１２、ＲＤＨ１０、及びＫＣＮＥ４からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子をより低いレベルで発現させる、請求項１に記載の腎臓疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物。
- 前記腎臓疾患は、腎臓線維症、糖尿病性腎症、高血圧性腎症、糸球体腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、ループス腎炎、多嚢胞性腎臓疾患、腎不全症、糸球体硬化症、移植後の急性拒否反応及び薬物による腎臓損傷からなる群から選ばれる、請求項１に記載の腎臓疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物。
- 誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソーム。
- 前処理物質で前処理された、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）由来間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）の前駆細胞から分離されたエクソソームを有効成分として含む、腎臓疾患（Ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防又は治療用薬剤学的組成物。
- 前記前処理物質は、エクセンディン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）である、請求項６に記載の腎臓疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物。
- 前記前処理物質は、ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）である、請求項６に記載の腎臓疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物。
- 前記腎臓疾患は、腎臓線維症、糖尿病性腎症、高血圧性腎症、糸球体腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、ループス腎炎、多嚢胞性腎臓疾患、腎不全症、糸球体硬化症、移植後の急性拒否反応及び薬物による腎臓損傷からなる群から選ばれる、請求項６に記載の腎臓疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物。
- 前処理物質で前処理された誘導万能幹細胞由来間葉幹細胞の前駆細胞から分離されたエクソソーム。
- 前記前処理物質は、エクセンディン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）である、請求項１０に記載のエクソソーム。
- 前記前処理物質は、ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）である、請求項１０に記載のエクソソーム。
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