JP2023501002A - 生化学反応方法及び天然変性領域を含む試薬 - Google Patents
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Abstract
本発明は、水性インビトロ反応系などで生化学反応を行う方法に関する。この方法は、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含む巨大分子、特にポリペプチドを含む。本発明はまた、１つ以上の機能的ＩＤＲを含むか又はこれからなるタグ付きアミノ酸配列を含む巨大分子又はポリペプチドを含む、ＩＤＲ－ポリペプチドを含むＩＤＲ－巨大分子に関する。そのような機能的ＩＤＲは、生化学反応の効率を高めることができる。本発明は、任意のそのような巨大分子及びポリペプチドを含むキットに関する。本発明はさらに、多価金属イオンとの組み合わせを含む、任意のそのような巨大分子及びポリペプチドを使用して溶液中の液体－液体脱混合を刺激又は増強し、それによって生化学反応の効率を高めることができる試薬を提供するための方法に関する。
Description
本発明は、水性インビトロ反応系などで生化学反応を行う方法に関する。この方法は、１つ以上の機能的天然変性領域（intrinsically disordered regions）（ＩＤＲ）を含む巨大分子、特にポリペプチドを含む。本発明はまた、１つ以上の機能的ＩＤＲを含むか又はこれからなるタグ付きアミノ酸配列を含む巨大分子又はポリペプチドを含む、ＩＤＲ－ポリペプチドを含むＩＤＲ－巨大分子に関する。そのような機能的ＩＤＲは、生化学反応の効率を高めることができる。本発明は、任意のそのような巨大分子及びポリペプチドを含むキットに関する。本発明はさらに、多価金属イオンとの組み合わせを含む、任意のそのような巨大分子及びポリペプチドを使用して溶液中の液体－液体脱混合を刺激又は増強し、それによって生化学反応の効率を高めることができる試薬を提供するための方法に関する。
生化学反応、特にインビトロ生化学反応の実施は、生物科学において根本的に重要である。多くの生化学反応は、研究室の外で、例えばポイントオブケア又は現場で行う必要があり得る。これらの状況では、実験室環境によってもたらされる正確な方法で生化学反応を制御することは不可能であり得る。これらの状況で行われる生化学反応の効率を改善することは価値があるであろう。実際、インビトロ及びインビボ生化学反応を含む正確な設定に関係なく、生化学反応の効率を高めることが望ましい場合がある。本発明は、これらの問題に対処する。
多くの生化学反応は、実施効率を高めるのを助けるために補助因子の使用を必要とする。そのような補助因子の１つの特定の例は、巨大分子クラウディング剤である。クラウディング剤は、多くの生化学反応の実施に不可欠である。注目すべき例は、核酸を増幅するためのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）系である。クラウディング剤の使用は、ＲＰＡ実施効率を高めるのに不可欠であると考えられてきた。しかしながら、クラウディング剤には欠点があり得る。したがって、ＲＰＡを含む生化学反応の実施効率を高めるための代替手段、及び添加された／外因性のクラウディング剤の必要性を排除する代替手段が有用であろう。さらに、生化学反応の実施効率を高める際に、クラウディング剤の機能的効果を加えるか、又はこれと相乗作用する試薬が有用であろう。本発明はまた、これらの問題に対処する。
本発明は、水性インビトロ反応系において生化学反応を行う方法であって、生化学反応が、少なくとも１つの反応巨大分子、任意に少なくとも１つの反応ポリペプチドの機能に依存し、方法が、反応を行うために適した条件下で、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子をインビトロ反応系に導入することを含み、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子が、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含み、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子をインビトロ反応系へ導入すると、生化学反応の効率が、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子によって高められ、好ましくは、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子が、少なくとも１種類のＩＤＲ－ポリペプチドである、方法を提供する。
上記の方法では、生化学反応は、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子、任意に少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドの機能に依存してもよく、インビトロ反応系に導入されると、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子又は少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドは、生化学反応においてその反応機能を果たし、反応の効率を高める。
本明細書に記載の方法のいずれかは、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを系内に維持して、液体－液体脱混合及びＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによる系内の複数の相分離した水性区画の形成を引き起こし、それによって系内の生化学反応の効率を高めることをさらに含み得る。
本明細書に記載の方法のいずれかは、反応の実施に必要な分子を複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させるために、又は複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドとの反応の実施に必要な分子の共局在化をさらに刺激又は増強するために、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを系内に維持し、それによって系内の生化学反応の効率を高め得ることをさらに含み得る。
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、複数の相分離した水性区画は、複数の検出可能な相分離した水性粒子であり得る。
さらなる態様では、本発明は、水性インビトロ反応系において生化学反応を行う方法であって、生化学反応が、少なくとも１つの反応巨大分子、任意に少なくとも１つの反応ポリペプチドの機能に依存し、方法が、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）（ＩＤＲ－ポリペプチド）を含むか又はこれからなるアミノ酸配列でタグ付けされた少なくとも１つのポリペプチドを、反応を行うために適した条件下でインビトロ反応系に導入することと、ＩＤＲ－ポリペプチドによって系内で液体－液体脱混合及び複数の相分離した水性区画、好ましくは検出可能な相分離した水性粒子の形成を引き起こし、反応の実施に必要な分子を区画内でＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させ、それによって系内の生化学反応の効率を高めるために、系内でＩＤＲ－ポリペプチドを維持することとを含む、方法を提供する。
任意に、この追加の態様による方法では、生化学反応は、少なくとも１つの反応ポリペプチドの機能に依存し、反応ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドであり、系に導入すると、少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドは、生化学反応においてその反応機能を果たし、系における反応の効率を高める。
この追加の態様による方法のいずれかでは、反応を行うのに適した条件は、ＩＤＲ－ポリペプチドに多価金属イオンを提供し、それによって液体－液体脱混合及びＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる複数の相分離した水性区画の形成をさらに刺激又は増強し、それによって系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、任意に、多価金属イオンが約２２ｍＭ以上の濃度で提供され、好ましくは多価金属イオンが約２２ｍＭ～５０ｍＭの濃度で提供される。多価金属イオンは、二価金属イオンであってもよく、任意にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、より好ましくはＭｇ２＋であってもよい。
この追加の態様による方法のいずれかでは、反応を行うのに適した条件は、インビトロ反応系においてＩＤＲ－ポリペプチドにＡＴＰを提供し、それによって、ＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる液体－液体脱混合及び複数の相分離した水性区画の形成をさらにシミュレート又は増強し、それによって、系における生化学反応の効率をさらに高めることを含んでよく、ＡＴＰは、１ｍＭ～３．５ｍＭ、任意に１ｍＭ～２ｍＭ、好ましくは１ｍＭの濃度で系内に提供される。
この追加の態様による方法のいずれかでは、反応を行うのに適した条件は、多価金属イオンをＩＤＲ－ポリペプチドに提供し、それによって、反応の実施に必要な分子をさらに刺激又は増強して、複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させ、それによって、系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、任意に、多価金属イオンが約２２ｍＭ以上の濃度で提供され、好ましくは多価金属イオンが約２２ｍＭ～５０ｍＭの濃度で提供される。多価金属イオンは、二価金属イオンであってもよく、任意にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、より好ましくはＭｇ２＋であってもよい。
この追加の態様による方法のいずれかでは、反応を行うのに適した条件は、インビトロ反応系においてＩＤＲ－ポリペプチドにＡＴＰを提供し、それによって、反応の実施に必要な分子をさらに刺激又は増強して、複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させ、それによって、系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、ＡＴＰは、１ｍＭ～３．５ｍＭ、任意に１ｍＭ～２ｍＭ、好ましくは１ｍＭの濃度で系内に提供される。
この追加の態様による方法のいずれかでは、系における反応の効率は、少なくとも１つのポリペプチドが１つ以上の機能的ＩＤＲを含むか又はこれからなるアミノ酸配列でタグ付けされていないことを除いて、同じ反応条件下で少なくとも１つのポリペプチドの導入後の系における反応の効率と比較して、ＩＤＲ－ポリペプチドによって高められ得る。
本発明はまた、水性インビトロ反応系において生化学反応を行う方法を提供し、生化学反応が、少なくとも１つの反応巨大分子、任意に少なくとも１つの反応ポリペプチドの機能に依存し、方法が、
ｉ．少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子を含む分子を、反応を行うために適した条件下で系に導入することであって、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子が１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含み、好ましくは、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子が少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドである、導入することと、
ｉｉ．ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを系内に維持して、系内で液体－液体脱混合を引き起こすことであって、液体－液体脱混合がＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされ、系内の複数の相分離した水性区画を形成する、維持することと、
ｉｉｉ．反応の実施に必要な分子が区画内でＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドと共局在するように、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを系内に維持することと、
ｉｖ．生化学反応を区画内で進行させることであって、系における生化学反応の効率が、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子の存在によって高められることと、を含む。
ｉ．少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子を含む分子を、反応を行うために適した条件下で系に導入することであって、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子が１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含み、好ましくは、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子が少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドである、導入することと、
ｉｉ．ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを系内に維持して、系内で液体－液体脱混合を引き起こすことであって、液体－液体脱混合がＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされ、系内の複数の相分離した水性区画を形成する、維持することと、
ｉｉｉ．反応の実施に必要な分子が区画内でＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドと共局在するように、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを系内に維持することと、
ｉｖ．生化学反応を区画内で進行させることであって、系における生化学反応の効率が、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子の存在によって高められることと、を含む。
上記の方法では、生化学反応は、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子、任意に少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドの機能に依存してもよく、インビトロ反応系に導入されると、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子又は少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドは、生化学反応においてその反応機能を果たし、反応の効率を高める。複数の相分離した水性区画は、複数の検出可能な相分離した水性粒子であり得る。
さらなる態様では、本発明は、水性インビトロ反応系において生化学反応を行う方法を提供し、生化学反応が、少なくとも１つの反応巨大分子、任意に少なくとも１つの反応ポリペプチドの機能に依存し、方法が、
ｉ．１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）（ＩＤＲ－ポリペプチド）を含むか又はこれからなるアミノ酸配列でタグ付けされた少なくとも１つのポリペプチドを含む分子を、反応を行うために適した条件下で系に導入することと、
ｉｉ．ＩＤＲ－ポリペプチドを系内に維持して、系内で液体－液体脱混合及び複数の相分離した水性区画、好ましくは検出可能な相分離した水性粒子の形成を引き起こすことであって、液体－液体脱混合がＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる、維持することと、
ｉｉｉ．反応の実施に必要な分子が区画内でＩＤＲ－ポリペプチドと共局在するように、ＩＤＲ－ポリペプチドを系内に維持することと、
ｉｖ．生化学反応を区画内で進行させることであって、系における生化学反応の効率が、少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドの存在によって高められることと、を含む。
ｉ．１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）（ＩＤＲ－ポリペプチド）を含むか又はこれからなるアミノ酸配列でタグ付けされた少なくとも１つのポリペプチドを含む分子を、反応を行うために適した条件下で系に導入することと、
ｉｉ．ＩＤＲ－ポリペプチドを系内に維持して、系内で液体－液体脱混合及び複数の相分離した水性区画、好ましくは検出可能な相分離した水性粒子の形成を引き起こすことであって、液体－液体脱混合がＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる、維持することと、
ｉｉｉ．反応の実施に必要な分子が区画内でＩＤＲ－ポリペプチドと共局在するように、ＩＤＲ－ポリペプチドを系内に維持することと、
ｉｖ．生化学反応を区画内で進行させることであって、系における生化学反応の効率が、少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドの存在によって高められることと、を含む。
任意に、このさらなる態様による方法では、生化学反応は、少なくとも１つの反応ポリペプチドの機能に依存し、反応ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドであり、系に導入すると、少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドは、生化学反応においてその反応機能を果たし、系における反応の効率を高める。
このさらなる態様による方法のいずれかでは、反応を行うのに適した条件は、ＩＤＲ－ポリペプチドに多価金属イオンを提供し、それによって液体－液体脱混合及びＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる複数の相分離した水性区画の形成をさらに刺激又は増強し、それによって系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、任意に、多価金属イオンが約２２ｍＭ以上の濃度で提供され、好ましくは多価金属イオンが約２２ｍＭ～５０ｍＭの濃度で提供される。多価金属イオンは、二価金属イオンであってもよく、任意にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、より好ましくはＭｇ２＋であってもよい。
このさらなる態様による方法のいずれかでは、反応を行うのに適した条件は、インビトロ反応系においてＩＤＲ－ポリペプチドにＡＴＰを提供し、それによって、ＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる液体－液体脱混合及び複数の相分離した水性区画の形成をさらに刺激又は増強し、それによって、系における生化学反応の効率をさらに高めることを含んでよく、ＡＴＰは、１ｍＭ～３．５ｍＭ、任意に１ｍＭ～２ｍＭ、好ましくは１ｍＭの濃度で系内に提供される。
このさらなる態様による方法のいずれかでは、反応を行うのに適した条件は、多価金属イオンをＩＤＲ－ポリペプチドに提供し、それによって、反応の実施に必要な分子をさらに刺激又は増強して、複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させ、それによって、系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、任意に、多価金属イオンが約２２ｍＭ以上の濃度で提供され、好ましくは多価金属イオンが約２２ｍＭ～５０ｍＭの濃度で提供される。多価金属イオンは、二価金属イオンであってもよく、任意にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、より好ましくはＭｇ２＋であってもよい。
このさらなる態様による方法のいずれかでは、反応を行うのに適した条件は、インビトロ反応系においてＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドにＡＴＰを提供し、それによって、反応の実施に必要な分子をさらに刺激又は増強して、複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させ、それによって、系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、ＡＴＰは、１ｍＭ～３．５ｍＭ、任意に１ｍＭ～２ｍＭ、好ましくは１ｍＭの濃度で系内に提供される。
このさらなる態様による方法のいずれかでは、反応を行うのに適した条件は、多価金属イオンをＩＤＲ－ポリペプチドに提供し、それによって、反応の実施に必要な分子をさらに刺激又は増強して、複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させ、それによって、系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、任意に、多価金属イオンが約２２ｍＭ以上の濃度で提供され、好ましくは多価金属イオンが約２２ｍＭ～５０ｍＭの濃度で提供される。多価金属イオンは、二価金属イオンであってもよく、任意にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、より好ましくはＭｇ２＋であってもよい。
このさらなる態様による方法のいずれかでは、系における反応の効率は、少なくとも１つのポリペプチドが１つ以上の機能的ＩＤＲを含むか又はこれからなるアミノ酸配列でタグ付けされていないことを除いて、同じ反応条件下で少なくとも１つのポリペプチドの導入後の系における反応の効率と比較して、ＩＤＲ－ポリペプチドによって高められ得る。
上記の方法のいずれかでは、方法は、インビトロ反応系において核酸分子を合成するための生化学反応であってよく、
（ａ）少なくとも１つの核酸プライマーを提供することと、
（ｂ）少なくとも１つの標的鎖を含む標的核酸分子を提供し、少なくとも１つの核酸プライマーを標的鎖と接触させ、それによって二本鎖構造を形成することと、
（ｃ）ＩＤＲ－巨大分子をＩＤＲ－ポリペプチドとして提供することであって、ＩＤＲ－ポリペプチドがポリメラーゼ又は１つ以上のポリペプチド補助因子である、提供することと、
（ｄ）反応を進行させ、それによって、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いて、任意に１つ以上のポリペプチド補助因子の存在下で、少なくとも１つの核酸プライマーの３’末端を伸長させて、二本鎖核酸を生成させることであって、第１の鎖は標的鎖の配列を含み、第２の鎖はそれに相補的である配列を含む、進行させることと、を含む。
（ａ）少なくとも１つの核酸プライマーを提供することと、
（ｂ）少なくとも１つの標的鎖を含む標的核酸分子を提供し、少なくとも１つの核酸プライマーを標的鎖と接触させ、それによって二本鎖構造を形成することと、
（ｃ）ＩＤＲ－巨大分子をＩＤＲ－ポリペプチドとして提供することであって、ＩＤＲ－ポリペプチドがポリメラーゼ又は１つ以上のポリペプチド補助因子である、提供することと、
（ｄ）反応を進行させ、それによって、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いて、任意に１つ以上のポリペプチド補助因子の存在下で、少なくとも１つの核酸プライマーの３’末端を伸長させて、二本鎖核酸を生成させることであって、第１の鎖は標的鎖の配列を含み、第２の鎖はそれに相補的である配列を含む、進行させることと、を含む。
あるいは、上記の方法のいずれかにおいて、方法は、インビトロ反応系において一本鎖標的核酸分子又は二本鎖標的核酸分子を増幅するための生化学的であってよく、好ましくは標的核酸分子がＤＮＡ分子である。
方法は、インビトロ反応系において二本鎖標的核酸分子を増幅するための生化学反応であってもよく、
（ａ）第１及び第２の核酸プライマーを提供することと、
（ｂ）第１の鎖及び第２の鎖を含む二本鎖標的核酸分子を提供し、第１及び第２の核酸プライマーを標的核酸分子と接触させ、それによって第１の鎖を有する第１の二本鎖構造及び第２の鎖を有する第２の二本鎖構造を形成することと、
（ｃ）ＩＤＲ－巨大分子をＩＤＲ－ポリペプチドとして提供することであって、ＩＤＲ－ポリペプチドがポリメラーゼ又は１つ以上のタンパク質補助因子である、提供することと、
（ｄ）反応を進行させ、それによって、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いて、任意に１つ以上のタンパク質補助因子の存在下で、第１及び第２の核酸プライマーの３’末端を伸長させて、第１及び第２の二本鎖核酸を生成させることと、
（ｅ）所望の増幅度に達するまで工程（ｂ）～（ｄ）を繰り返すことと、を含む。
（ａ）第１及び第２の核酸プライマーを提供することと、
（ｂ）第１の鎖及び第２の鎖を含む二本鎖標的核酸分子を提供し、第１及び第２の核酸プライマーを標的核酸分子と接触させ、それによって第１の鎖を有する第１の二本鎖構造及び第２の鎖を有する第２の二本鎖構造を形成することと、
（ｃ）ＩＤＲ－巨大分子をＩＤＲ－ポリペプチドとして提供することであって、ＩＤＲ－ポリペプチドがポリメラーゼ又は１つ以上のタンパク質補助因子である、提供することと、
（ｄ）反応を進行させ、それによって、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いて、任意に１つ以上のタンパク質補助因子の存在下で、第１及び第２の核酸プライマーの３’末端を伸長させて、第１及び第２の二本鎖核酸を生成させることと、
（ｅ）所望の増幅度に達するまで工程（ｂ）～（ｄ）を繰り返すことと、を含む。
インビトロ反応系において二本鎖標的核酸分子を増幅するための上記の方法では、方法は、インビトロ反応系において二本鎖標的核酸分子を増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロセスであってよく、
（ａ）リコンビナーゼ剤、任意にリコンビナーゼ負荷タンパク質、一本鎖安定化剤、ポリメラーゼ、第１及び第２の核酸プライマー、第１の鎖及び第２の鎖を含む二本鎖標的核酸、並びに任意にエキソヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩを提供することと、
（ｂ）リコンビナーゼ剤を第１及び第２の核酸プライマー並びに任意にリコンビナーゼ負荷タンパク質と接触させて、それらの３’末端に一本鎖領域を含む第１及び第２の核タンパク質プライマーを形成することと、
（ｃ）第１及び第２の核タンパク質プライマーを標的核酸分子と接触させ、それによって、第１の鎖を有する第１の二本鎖構造及び第２の鎖を有する第２の二本鎖構造を形成することと、
（ｄ）反応を進行させ、それによって、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いて第１及び第２の核タンパク質プライマーの３’末端を伸長させて、第１及び第２の二本鎖核酸並びに第１及び第２の置換された核酸鎖を生成させることであって、一本鎖安定化剤が、第１及び第２の置換された鎖を安定化させる、進行させることと、
（ｅ）所望の増幅度に達するまで工程（ｂ）～（ｄ）を繰り返すことによって反応を継続することと、を含み、
リコンビナーゼ剤、及び／又はリコンビナーゼ負荷タンパク質、及び／又は一本鎖安定化剤、及び／又はポリメラーゼが、ＩＤＲ－ポリペプチドとして提供される。
（ａ）リコンビナーゼ剤、任意にリコンビナーゼ負荷タンパク質、一本鎖安定化剤、ポリメラーゼ、第１及び第２の核酸プライマー、第１の鎖及び第２の鎖を含む二本鎖標的核酸、並びに任意にエキソヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩを提供することと、
（ｂ）リコンビナーゼ剤を第１及び第２の核酸プライマー並びに任意にリコンビナーゼ負荷タンパク質と接触させて、それらの３’末端に一本鎖領域を含む第１及び第２の核タンパク質プライマーを形成することと、
（ｃ）第１及び第２の核タンパク質プライマーを標的核酸分子と接触させ、それによって、第１の鎖を有する第１の二本鎖構造及び第２の鎖を有する第２の二本鎖構造を形成することと、
（ｄ）反応を進行させ、それによって、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いて第１及び第２の核タンパク質プライマーの３’末端を伸長させて、第１及び第２の二本鎖核酸並びに第１及び第２の置換された核酸鎖を生成させることであって、一本鎖安定化剤が、第１及び第２の置換された鎖を安定化させる、進行させることと、
（ｅ）所望の増幅度に達するまで工程（ｂ）～（ｄ）を繰り返すことによって反応を継続することと、を含み、
リコンビナーゼ剤、及び／又はリコンビナーゼ負荷タンパク質、及び／又は一本鎖安定化剤、及び／又はポリメラーゼが、ＩＤＲ－ポリペプチドとして提供される。
インビトロ反応系において二本鎖標的核酸分子を増幅する上記RPAプロセスでは、リコンビナーゼ剤は、ＵｖｓＸ、Ｔ４ ＵｖｓＸ、Ｔ６ ＵｖｓＸ、ＲＢ１８ ＵｖｓＸ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ファージｗＶ７ ＵｖｓＸ、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ファージＣＢ８ ＵｖｓＸ、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ファージＳｈｆｌ２ ＵｖｓＸ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ファージＡＲ１ ＵｖｓＸ、ファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿Ｇ４５０７ ＵｖｓＸ、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ファージＳＨＦＭＬ－１１ ＵｖｓＸ、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＤａｌＣａ ＵｖｓＸ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲａｄＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲａｄＢ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒａｄ５１又はそれらの任意の機能的類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、好ましくはリコンビナーゼ剤が、ＵｖｓＸ、より好ましくはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＤａｌＣａ ＵｖｓＸであってよい。
インビトロ反応系において二本鎖標的核酸分子を増幅する上記RPAプロセスのいずれか１つでは、方法はリコンビナーゼ負荷タンパク質を含むことができ、リコンビナーゼ負荷タンパク質が、ＵｖｓＹ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＯ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＲ又はその任意の機能的類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、好ましくは、リコンビナーゼ負荷タンパク質がＵｖｓＹ、より好ましくはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ファージＳＴＯ ＵｖｓＹである。
インビトロ反応系において二本鎖標的核酸分子を増幅する上記RPAプロセスのいずれか１つでは、ポリメラーゼは、ｐｏｌ－α、ｐｏｌ－β、ｐｏｌ－δ、ｐｏｌ－ε又はそれらの任意の機能的類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される真核生物ポリメラーゼであり得る。ポリメラーゼは、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＩラージ断片、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｐｏｌ Ｉラージ断片（Ｂｓｕポリメラーゼ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（ソーポリメラーゼ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗ断片、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＶ、又はそれらの任意の機能的類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される原核生物ポリメラーゼであり、好ましくは、ポリメラーゼが黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（ソーポリメラーゼ）又はバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｐｏｌ Ｉラージ断片（Ｂｓｕポリメラーゼ）であってよい。ポリメラーゼは、バクテリオファージＴ４ ｇｐ４３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｈｉ－２９ ＤＮＡポリメラーゼ、又はそれらの任意の機能的類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるバクテリオファージポリメラーゼであり得る。
インビトロ反応系において二本鎖標的核酸分子を増幅する上記のRPAプロセスのいずれか１つでは、一本鎖安定化剤は、Ｇｐ３２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢタンパク質、ファージＴ４ Ｇｐ３２タンパク質、ファージＲｂ６９ Ｇｐ３２、ファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＮＢＧ１ Ｇｐ３２、又はそれらの任意の機能的類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてよく、好ましくは一本鎖安定化剤が、Ｇｐ３２又はファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＮＢＧ１ Ｇｐ３２である。
インビトロ反応系において二本鎖標的核酸分子を増幅する上記RPAプロセスのいずれか１つでは、リコンビナーゼ剤のみがＩＤＲ－ポリペプチドとして提供されてもよく、又はリコンビナーゼ負荷タンパク質のみがＩＤＲ－ポリペプチドとして提供されてもよく、又は一本鎖安定化剤のみがＩＤＲ－ポリペプチドとして提供されてもよく、又はポリメラーゼのみがＩＤＲ－ポリペプチドとして提供されてもよく、又はエキソヌクレアーゼのみがＩＤＲ－ポリペプチドとして提供されてもよい。
インビトロ反応系で二本鎖標的核酸分子を増幅する上記RPAプロセスのいずれか１つでは、ＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、ＩＤＲ－ポリペプチドが遺伝子操作された融合タンパク質であるように、１つ以上のＩＤＲを含むアミノ酸配列又はこれからなるアミノ酸配列としてＩＤＲ－ポリペプチドにタグ付けされてよく、１つ以上の機能的ＩＤＲが、ＩＤＲ－ポリペプチドのＣ末端、ＩＤＲ－ポリペプチドのＮ末端、又はＩＤＲ－ポリペプチドのＣ末端とＩＤＲ－ポリペプチドのＮ末端の両方、又はポリペプチドの長さに沿った任意のアミノ酸位置に位置する。
上記の方法のいずれか１つでは、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲは、アルゴリズムＭｅｔａＤｉｓｏｒｄｅｒによって分析した場合に０．５を超えるスコアを示すアミノ酸の配列として特徴付けられ得る。
上記の方法のいずれか１つでは、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、トリペプチド配列ＲＧＧの１つ以上のリピートを含むアミノ酸配列を含むか又はこれからなり得る。任意のそのような方法では、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲは、ジペプチド配列ＦＧの１つ以上のリピートをさらに含むアミノ酸配列を含むか又はこれからなり得る。任意のそのような方法では、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲは、チロシン又はフェニルアラニンからなる少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基をさらに含むアミノ酸配列を含むか又はこれからなり得る。
上記の方法のいずれか１つでは、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲは、
ｉ．（ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ）ｎ（配列番号１９）、（式中、ｎは、１～と１０の正の整数であり、任意に、ｎ＝１、２、又は３である）、又は
ｉｉ．（ＹＳＰＴＳＰＳ）ｎ（配列番号１２４）、（式中、ｎは、１～１０の正の整数であり、任意に、ｎ＝１、２、又は３である）、又は
ｉｉｉ．（ＦＳＰＴＳＰＴ）ｎ（配列番号１２５）、（式中、ｎは、１～１０の正の整数であり、任意に、ｎ＝１、２、又は３である）、又は
ｉｖ．（ＹＳＰＴＳＰ－Ａ／Ｎ／Ｇ）ｎ（配列番号１２６）、（式中、ｎは１～１０の正の整数であり、任意に、ｎ＝１、２、又は３である）、又は
ｖ．（ＹＳＰＧＳＰＡ）ｎ（配列番号１２７）、（式中、ｎは１～１０の正の整数であり、任意に、ｎ＝１、２、又は３である）のアミノ酸配列を含むか又はこれからなってよい。
ｉ．（ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ）ｎ（配列番号１９）、（式中、ｎは、１～と１０の正の整数であり、任意に、ｎ＝１、２、又は３である）、又は
ｉｉ．（ＹＳＰＴＳＰＳ）ｎ（配列番号１２４）、（式中、ｎは、１～１０の正の整数であり、任意に、ｎ＝１、２、又は３である）、又は
ｉｉｉ．（ＦＳＰＴＳＰＴ）ｎ（配列番号１２５）、（式中、ｎは、１～１０の正の整数であり、任意に、ｎ＝１、２、又は３である）、又は
ｉｖ．（ＹＳＰＴＳＰ－Ａ／Ｎ／Ｇ）ｎ（配列番号１２６）、（式中、ｎは１～１０の正の整数であり、任意に、ｎ＝１、２、又は３である）、又は
ｖ．（ＹＳＰＧＳＰＡ）ｎ（配列番号１２７）、（式中、ｎは１～１０の正の整数であり、任意に、ｎ＝１、２、又は３である）のアミノ酸配列を含むか又はこれからなってよい。
上記の方法のいずれか１つでは、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲは、グルタミンリッチなアミノ酸配列を含むか又はこれからなってよく、任意に、アミノ酸配列は、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０個の連続するグルタミン残基を含む。任意のそのような方法では、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲは、トリペプチド配列ＱＱＱの１つ以上のリピートを含むアミノ酸配列を含むか又はこれからなり得る。任意のこのような方法では、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲは、（ＱＱＱＰＱＹ）ｎ（配列番号１２８）のアミノ酸配列を含むか又はこれからなり、式中、ｎは１～１０の正の整数であり、任意にｎ＝１、２、又は３である。
上記の方法のいずれか１つでは、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲは、配列番号１の少なくとも５個の連続するアミノ酸の配列を含むか又はこれからなり得る。
上記の方法のいずれか１つでは、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲは、配列番号９の少なくとも５個の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含むか又はこれからなり得る。
上記の方法のいずれか１つでは、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲは、１つ以上の芳香族チロシン残基及び多価金属イオン、好ましくは二価金属イオンとの芳香族カチオン－π相互作用に関与することができる１つ以上のフェニルアラニン残基を含むアミノ酸配列を含み得る。
上記の方法のいずれか１つでは、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲは、多価金属イオン、好ましくは二価金属イオンとのグアニジン－金属相互作用に関与することができる１つ以上のアルギニン残基を含むアミノ酸配列を含み得る。
上記の方法のいずれか１つでは、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなる、又は配列番号１～４３の機能的バリアントアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなる、例えば配列番号１～４３のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列でタグ付けされた巨大分子又はポリペプチドを含むか又はこれからなり得る。
インビトロ反応系において二本鎖標的核酸分子を増幅する上記RPAプロセスのいずれか１つでは、ＩＤＲ－ポリペプチドは、Ｇｐ３２であり、配列番号６５～８８のいずれか１つのアミノ酸配列を有する一本鎖安定化剤であり得るか、又はＩＤＲ－ポリペプチドが、その機能的バリアント、例えば配列番号６５～８８のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＩＤＲ－ポリペプチドである。
インビトロ反応系で二本鎖標的核酸分子を増幅する上記RPAプロセスのいずれか１つでは、ＩＤＲ－ポリペプチドは、ＵｖｓＸであり、配列番号４４～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ剤であり得るか、又はＩＤＲ－ポリペプチドがその機能的バリアント、例えば配列番号４４～５９のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＩＤＲ－ポリペプチドである。
インビトロ反応系で二本鎖標的核酸分子を増幅する上記RPAプロセスのいずれか１つでは、ＩＤＲ－ポリペプチドは、ＵｖｓＹであり、配列番号６０～６４のいずれか１つのアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ負荷タンパク質であり得るか、又はＩＤＲ－ポリペプチドがその機能的バリアント、例えば配列番号６０～６４のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＩＤＲ－ポリペプチドである。
上記の方法のいずれか１つでは、方法は、インビトロ反応系でＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドに多価金属イオンを提供し、それによってインビトロ反応系での液体－液体脱混合をさらに刺激又は増強し、それによって系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、多価金属イオンは、系内の複数の相分離した水性区画の形成をさらに刺激又は増強し、それによって系内の生化学反応の効率をさらに高め、好ましくは多価金属イオンは、複数の検出可能な相分離した水性粒子の形成をさらに刺激又は増強し、任意に、多価金属イオンが約２２ｍＭ以上の濃度で提供され、好ましくは多価金属イオンが約２２ｍＭ～５０ｍＭの濃度で提供される。任意のそのような方法では、多価金属イオンは、二価金属イオン、任意にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、より好ましくはＭｇ２＋であり得る。
上記の方法のいずれか１つでは、反応を行うのに適した条件は、インビトロ反応系でＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドにＡＴＰを提供し、それによって、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる液体－液体脱混合及び複数の相分離した水性区画の形成をさらに刺激又は増強し、それによって、系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、ＡＴＰは、１ｍＭ～３．５ｍＭ、任意に１ｍＭ～２ｍＭ、好ましくは１ｍＭの濃度で系内に提供される。
上記の方法のいずれか１つでは、反応を行うのに適した条件は、多価金属イオンをＩＤＲ－ポリペプチドに提供し、それによって、反応の実施に必要な分子をさらに刺激又は増強して、複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させ、それによって、系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、任意に、多価金属イオンが約２２ｍＭ以上の濃度で提供され、好ましくは多価金属イオンが約２２ｍＭ～５０ｍＭの濃度で提供される。多価金属イオンは、二価金属イオンであってもよく、任意にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、より好ましくはＭｇ２＋であってもよい。
上記の方法のいずれか１つでは、反応を行うのに適した条件は、インビトロ反応系においてＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドにＡＴＰを提供し、それによって、反応の実施に必要な分子をさらに刺激又は増強して、複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させ、それによって、系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、ＡＴＰは、１ｍＭ～３．５ｍＭ、任意に１ｍＭ～２ｍＭ、好ましくは１ｍＭの濃度で系内に提供される。
上記の方法のいずれか１つでは、生化学反応は、表面を含む固相反応系で行われてもよい。任意のそのような方法では、生化学反応は、上記のインビトロ反応系で一本鎖標的核酸分子又は二本鎖標的核酸分子を増幅する方法であってよく、少なくとも１つの核酸プライマー及び／又はＩＤＲ－巨大分子及び／又は１つ以上のポリペプチド補助因子が表面に結合している。
インビトロ反応系で二本鎖標的核酸分子を増幅する上記RPAプロセスのいずれか１つでは、反応は、表面を含む固相反応系において行われてよく、リコンビナーゼ剤及び／又はリコンビナーゼ負荷タンパク質及び／又は一本鎖安定化剤及び／又はポリメラーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼ及び／又は第１の核酸プライマー及び／又は第２の核酸プライマーが表面に結合しており、好ましくは、（ｉ）第１の核酸プライマー又は第２の核酸プライマーが表面に結合している、又は（ｉｉ）第１及び第２の核酸プライマーの両方が表面に結合している。
表面を含む固相反応系で実施される上記の方法のいずれかでは、表面は平面であってもよく、又はマイクロビーズであってもよく、好ましくは表面はシリコン、ガラス、ゲルベースの材料及び／又はポリスチレンなどのポリマー材料を含み、より好ましくは表面はポリスチレンなどのポリマー材料を含むマイクロビーズである。任意のそのような方法では、表面は基質に結合されてもよく、好ましくは表面は平面であり、及び／又は基質はガラスを含む。表面、例えば平坦な表面及び／又は基質は、フローセルとして提供されてもよい。
本発明は、培養された宿主細胞内の生化学反応の効率を高めるために、培養された宿主細胞に上記のＩＤＲ－巨大分子のいずれかの少なくとも１つ又は上記のＩＤＲ－ポリペプチドのいずれかの少なくとも１つを導入することによって、又は培養された宿主細胞内で上記のＩＤＲ－ポリペプチドのいずれかの少なくとも１つを発現させることによって、培養中の細胞内で生化学反応を行うための方法を提供する。
インビトロ生化学反応を行うための上記の方法のいずれかは、培養された宿主細胞内での生化学反応の効率を高めるために、培養された宿主細胞に少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子又は少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドを導入することによって、又は培養された宿主細胞で少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドを発現させることによってなど、培養中の細胞内で行われる生化学反応を含み得る。
生化学反応は、培養された宿主細胞内で核酸分子の操作をもたらす、又は培養された宿主細胞内での核酸分子の変化、例えば核酸分子の構造の変化、例えば核酸分子のヌクレオチド配列の変化をもたらす任意の反応であり得る。生化学反応は、培養された宿主細胞において核酸分子の合成をもたらす任意の反応であり得る。生化学反応は、核酸分子からポリペプチドの発現をもたらす任意の反応であり得る。生化学反応は、培養された宿主細胞内の核酸配列の編集をもたらす任意の反応であってもよく、例えば、ＩＤＲ－ポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドを含むＣａｓポリペプチドなどのＣＲＩＳＰＲポリペプチドである。生化学反応は、培養された宿主細胞内の核酸の切断をもたらす任意の反応であり得る。生化学反応は、培養された宿主細胞内の核酸の相同組換えをもたらす任意の反応であり得る。生化学反応は、培養された宿主細胞内で１つ以上の目的の生物学的産物を産生するための、又は培養された宿主細胞から分泌されるか、そうでなければ培養された宿主細胞から培地中に放出される１つ以上の目的の生物学的産物を産生するための培養された宿主細胞内の代謝反応であり得る。
上記の方法のいずれか１つでは、生化学反応の効率を高めることは、同じ条件下で反応を行うことによって得られる反応の効率と比較して、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子又は少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドを使用する反応の効率を高めることを含み得るが、関連する少なくとも１つの巨大分子又は少なくとも１つのポリペプチドが、１つ以上の機能的天然変性領域ポリペプチド配列を含まないか、又はこれでタグ付けされておらず、任意に、反応は外因的に添加されたクラウディング剤の非存在下で行われる。
上記のRPAプロセスのいずれか１つでは、ＲＰＡ生化学反応の効率又は性能を増加又は増強することは、同じ条件下で反応を行うことによって得られる増幅産物の量と比較して、少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドを使用するＲＰＡ反応で得られる増幅産物の量を増加させることを含み得るが、関連する少なくとも１つのポリペプチドは、１つ以上の機能的天然変性領域ポリペプチド配列でタグ付けされておらず、任意に、反応は、外因的に添加されたクラウディング剤の非存在下で行われる。
少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドをインビトロ反応系に導入することを含む上記の方法のいずれか１つでは、系における反応の効率は、少なくとも１つの巨大分子又はポリペプチドが１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含まないことを除いて、同じ反応条件下で少なくとも１つの巨大分子又はポリペプチドの導入後の系における反応の効率と比較して、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって高められる。
少なくとも１つの機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含むか又はこれからなるアミノ酸配列でタグ付けされた少なくとも１つのポリペプチド（ＩＤＲ－ポリペプチド）をインビトロ反応系に導入することを含む上記の方法のいずれか１つでは、系における反応の効率は、少なくとも１つのポリペプチドが１つ以上の機能的ＩＤＲを含むか又はこれからなるアミノ酸配列でタグ付けされていないことを除いて、同じ反応条件下で少なくとも１つのポリペプチドの導入後の系における反応の効率と比較して、ＩＤＲ－ポリペプチドによって高められる。
本発明はまた、巨大分子及びタグアミノ酸配列を含む天然起源でないＩＤＲ－巨大分子を提供し、タグアミノ酸配列は、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含むか又はこれからなり、ＩＤＲ－巨大分子は、水性インビトロ反応系において液体－液体脱混合を引き起こすことができる。任意のそのようなＩＤＲ－巨大分子は、液体－液体脱混合及び系内の複数の相分離した水性区画、好ましくは複数の検出可能な相分離した水性粒子の形成を引き起こすことができ得る。インビトロ反応系における任意のそのような天然起源でないＩＤＲ－巨大分子によって引き起こされる任意のそのような液体－液体脱混合は、それによって生化学反応の効率を高め得る。
上記のＩＤＲ－巨大分子のいずれか１つは、巨大分子又はポリペプチド及びタグアミノ酸配列を含む、天然起源でない人工の又は遺伝子操作されたＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドであり得る。ＩＤＲ－ポリペプチドの場合、タグアミノ酸配列は、ポリペプチドのＣ末端、ポリペプチドのＮ末端、又はポリペプチドのＣ末端とポリペプチドのＮ末端の両方、又はポリペプチドの長さに沿った任意のアミノ酸位置に位置し得る。
上記のＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドのいずれか１つでは、タグアミノ酸配列の１つ以上の機能的ＩＤＲは、上記の方法のいずれか１つに記載の機能的ＩＤＲである。
上記のＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドのいずれか１つでは、タグ配列は、多価金属カチオン、好ましくは二価金属カチオン、より好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋イオン、さらにより好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、さらにより好ましくはＭｇ２＋との芳香族カチオン－π相互作用に関与することができるアミノ酸残基を含む。
上記のＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドのいずれか１つでは、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなる、又は配列番号１～４３の機能的バリアントアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなる、例えば配列番号１～４３のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列でタグ付けされた巨大分子又はポリペプチドを含むか又はこれからなる。
上記のＩＤＲ－ポリペプチドのいずれか１つでは、１つ以上の機能的ＩＤＲを含むか又はこれからなる配列がタグ付けされているポリペプチドは、酵素、例えばヘリカーゼ、ジャイレース、リコンビナーゼ、例えばＲＰＡリコンビナーゼ剤、ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ、リガーゼ、グリコリアーゼ（ｇｌｙｃｏｌｙａｓｅ）、メチラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＣＲＩＳＰＲ酵素などの遺伝子編集酵素、例えばＣａｓ９酵素；補助因子、例えばＲＰＡリコンビナーゼ負荷タンパク質及びＲＰＡ一本鎖安定化剤として、であり得る。１つ以上の機能的ＩＤＲを含む配列又はこれからなる配列がタグ付けされるポリペプチドは、リガーゼ、任意にＲＢ６９リガーゼ、例えばＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２（配列番号１１２）であり得る。１つ以上の機能的ＩＤＲを含む配列又はこれからなる配列がタグ付けされるポリペプチドは、ＲＰＡ一本鎖安定化剤、好ましくはＧｐ３２であってよく、任意に、ＩＤＲ－ポリペプチドが、配列番号６５～８８及び配列番号１２０のいずれか１つのアミノ酸配列を有するか、又はＩＤＲ－ポリペプチドが、その機能的バリアント、例えば、配列番号６５～８８及び配列番号１２０のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＩＤＲ－ポリペプチドであり得る。１つ以上の機能的ＩＤＲを含む配列又はこれからなる配列がタグ付けされるポリペプチドは、ＲＰＡリコンビナーゼ剤、好ましくはＵｖｓＸであってよく、任意に、ＩＤＲ－ポリペプチドが、配列番号４４～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するか、又はＩＤＲ－ポリペプチドがその機能的バリアント、例えば、配列番号４４～５９のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＩＤＲ－ポリペプチドである。１つ以上の機能的ＩＤＲを含む配列又はこれからなる配列がタグ付けされるポリペプチドは、ＲＰＡリコンビナーゼ負荷タンパク質、好ましくはＵｖｓＹであってよく、任意に、ＩＤＲ－ポリペプチドが、配列番号６０～６４のいずれか１つのアミノ酸配列を有するか、又はＩＤＲ－ポリペプチドがその機能的バリアント、例えば、配列番号６０～６４のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＩＤＲ－ポリペプチドである。
本発明はまた、上記のＩＤＲ－ポリペプチドのいずれかをコードする第１の核酸配列を含む単離された核酸分子を提供し、任意に、プロモーターをコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列が第２の核酸配列に作動可能に連結されている。本発明はまた、任意のそのような核酸分子を含む組換えポリヌクレオチド発現ベクターを提供する。本発明はまた、任意のそのような核酸分子又は任意のそのような組換えポリヌクレオチド発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、増殖培地及び任意のそのような宿主細胞の集団を含む細胞培養物を提供する。
本発明はまた、上記の天然起源でないＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドのいずれかを含むキットを提供する。任意のそのようなキットは、ＲＰＡリコンビナーゼ剤、及び／又はＲＰＡリコンビナーゼ負荷タンパク質、及び／又はポリメラーゼ、及び／又は第１及び第２の核酸プライマー、及び／又はエキソヌクレアーゼ、及び／又は緩衝液、及び／又は多価金属イオン源、好ましくは二価金属カチオンを含む追加のＲＰＡ成分をさらに含み得る。任意のそのようなキットでは、すべての成分は凍結乾燥形態で提供され得る。
本発明はまた、溶液中の液体－液体脱混合を刺激又は増強する方法であって、方法が、上記のＩＤＲ－巨大分子のいずれか又は上記のＩＤＲ－ポリペプチドのいずれかを含む溶液を提供することと、溶液中のＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを多価金属イオンと接触させることとを含み、その後、溶液中の液体－液体脱混合が刺激又は増強される方法を提供する。本発明はまた、水性インビトロ反応系においてＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる液体－液体脱混合を刺激又は増強するさらなる方法であって、上記のＩＤＲ－巨大分子のいずれか１つ又は上記のＩＤＲ－ポリペプチドのいずれか１つを系に提供することと、系に多価金属イオンを提供することと、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドが多価金属イオンと接触することを可能にすることとを含み、その後、溶液中のＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる液体－液体脱混合が刺激又は増強される方法を提供する。任意のそのような方法では、液体－液体脱混合は、溶液中に複数の相分離した水性区画、好ましくは複数の検出可能な相分離した水性粒子の形成をもたらし得る。任意のそのような方法では、多価金属イオンは、二価金属イオン、任意にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、より好ましくはＭｇ２＋であり得る。任意のそのようなさらなる方法では、多価金属イオンは、１つ以上の機能的ＩＤＲアミノ酸配列中のアミノ酸残基との芳香族カチオン－π相互作用に関与し、それによって液体－液体脱混合を促進し得る。
任意のそのようなさらなる方法では、反応を行うのに適した条件は、インビトロ反応系でＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドにＡＴＰを提供し、それによって、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる液体－液体脱混合及び複数の相分離した水性区画の形成をさらに刺激又は増強し、それによって、系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、ＡＴＰは、１ｍＭ～３．５ｍＭ、任意に１ｍＭ～２ｍＭ、好ましくは１ｍＭの濃度で系内に提供される。
任意のそのようなさらなる方法では、反応を行うのに適した条件は、多価金属イオンをＩＤＲ－ポリペプチドに提供し、それによって、反応の実施に必要な分子をさらに刺激又は増強して、複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させ、それによって、系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、任意に、多価金属イオンが約２２ｍＭ以上の濃度で提供され、好ましくは多価金属イオンが約２２ｍＭ～５０ｍＭの濃度で提供される。多価金属イオンは、二価金属イオンであってもよく、任意にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、より好ましくはＭｇ２＋であってもよい。
任意のそのようなさらなる方法では、反応を行うのに適した条件は、インビトロ反応系においてＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドにＡＴＰを提供し、それによって、反応の実施に必要な分子をさらに刺激又は増強して、複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させ、それによって、系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、ＡＴＰは、１ｍＭ～３．５ｍＭ、任意に１ｍＭ～２ｍＭ、好ましくは１ｍＭの濃度で系内に提供される。
本発明はまた、溶液中の液体－液体脱混合を刺激又は増強する際の多価金属イオンの使用を提供し、上記脱混合は、上記ＩＤＲ－巨大分子のいずれか１つ又は上記ＩＤＲ－ポリペプチドのいずれか１つによって媒介される。本発明はまた、系に導入されたＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる水性インビトロ反応系での液体－液体脱混合を刺激又は増強する際の多価金属イオンの使用を提供し、上記ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、上記のＩＤＲ－巨大分子のいずれか１つ又は上記のＩＤＲ－ポリペプチドのいずれか１つである。任意のそのような使用では、上記液体－液体脱混合は、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる複数の相分離した水性区画、好ましくは溶液中の複数の検出可能な相分離した水性粒子の形成をもたらし得る。任意のそのような使用では、多価金属イオンは、二価金属イオン、任意にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、より好ましくはＭｇ２＋であり得る。任意のそのような使用では、多価金属イオンは、１つ以上の機能的ＩＤＲアミノ酸配列中のアミノ酸残基との芳香族カチオン－π相互作用に関与し、それによって液体－液体脱混合を促進し得る。
任意のそのような使用では、反応を行うのに適した条件は、インビトロ反応系でＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドにＡＴＰを提供し、それによって、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる液体－液体脱混合及び複数の相分離した水性区画の形成をさらに刺激又は増強し、それによって、系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、ＡＴＰは、１ｍＭ～３．５ｍＭ、任意に１ｍＭ～２ｍＭ、好ましくは１ｍＭの濃度で系内に提供される。
任意のそのような使用では、反応を行うのに適した条件は、多価金属イオンをＩＤＲ－ポリペプチドに提供し、それによって、反応の実施に必要な分子をさらに刺激又は増強して、複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させ、それによって、系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、任意に、多価金属イオンが約２２ｍＭ以上の濃度で提供され、好ましくは多価金属イオンが約２２ｍＭ～５０ｍＭの濃度で提供される。多価金属イオンは、二価金属イオンであってもよく、任意にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、より好ましくはＭｇ２＋であってもよい。
任意のそのような使用では、反応を行うのに適した条件は、インビトロ反応系においてＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドにＡＴＰを提供し、それによって、反応の実施に必要な分子をさらに刺激又は増強して、複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させ、それによって、系内の生化学反応の効率をさらに高めることをさらに含んでよく、ＡＴＰは、１ｍＭ～３．５ｍＭ、任意に１ｍＭ～２ｍＭ、好ましくは１ｍＭの濃度で系内に提供される。
本発明はまた、治療での使用のための、薬物として使用するための、医薬品として使用するための、診断方法で使用するための、又は診断剤として使用のための、上述の天然起源でないＩＤＲ－巨大分子のいずれか１つ又は上述のＩＤＲ－ポリペプチドのいずれか１つを提供する。
本発明はまた、上記の天然起源でないＩＤＲ－巨大分子のいずれか１つ又は上記ＩＤＲ－ポリペプチドのいずれか１つを作製する方法であって、巨大分子、任意にポリペプチドを提供することと、１つ以上の機能的天然変性領域ポリペプチド配列で巨大分子又はポリペプチドをタグ付けすることとを含む方法を提供する。上記タグ付けは、本明細書に記載及び定義された任意の手段によって実行され得る。上記１つ以上の機能的天然変性領域ポリペプチド配列は、本明細書に記載及び定義されるものと同じもののいずれかであり得る。上記巨大分子又はポリペプチドは、本明細書に記載及び定義される任意の巨大分子又はポリペプチドを含む、任意の適切な巨大分子又はポリペプチドであり得る。
上記のＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドのいずれか１つは、生化学反応の効率を高め得る。生化学反応の効率を高めることは、同じ条件下で反応を行うことによって得られる反応の効率と比較して、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを使用する反応の効率を高めることを含み得るが、関連する巨大分子又は関連するポリペプチドは、１つ以上の機能的天然変性領域ポリペプチド配列を含まないか、又はこれでタグ付けされておらず、任意に、反応は外因的に添加されたクラウディング剤の非存在下で行われる。
上記ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドのいずれか１つは、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）反応における生化学反応の効率を高め得る。ＲＰＡ生化学反応の効率又は性能を増加させることは、同じ条件下で反応を行うことによって得られる増幅産物の量と比較して、ＩＤＲ－ポリペプチドを使用するＲＰＡ反応で得られる増幅産物の量を増加させることを含み得るが、関連ポリペプチドは、１つ以上の機能的天然変性領域ポリペプチド配列を含まないか、又はこれでタグ付けされておらず、任意に、ＲＰＡ反応は、外因的に添加されたクラウディング剤の非存在下で行われる。
本発明はまた、１つ以上の標的ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
（ｉ）１つ以上の標的ポリヌクレオチド分子を増幅し、それによって、１つ以上の標的ポリヌクレオチド分子の複数のコピーを含む集団を得るための上記方法を行う工程と、
（ｉｉ）標的ポリヌクレオチド分子の複数のコピーを含む集団に対して１つ以上の核酸配列決定反応を行う工程であって、
好ましくは、方法が、表面を含む固相反応系で実施される、行う工程と、を含む方法を提供する。
（ｉ）１つ以上の標的ポリヌクレオチド分子を増幅し、それによって、１つ以上の標的ポリヌクレオチド分子の複数のコピーを含む集団を得るための上記方法を行う工程と、
（ｉｉ）標的ポリヌクレオチド分子の複数のコピーを含む集団に対して１つ以上の核酸配列決定反応を行う工程であって、
好ましくは、方法が、表面を含む固相反応系で実施される、行う工程と、を含む方法を提供する。
本発明はまた、１つ以上の標的ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列を決定するための方法における上記ＩＤＲ－巨大分子のいずれか１つ又は上記ＩＤＲ－ポリペプチドのいずれか１つの使用を提供し、好ましくは方法は上記の通りである。
本発明はまた、配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなる、又は配列番号１～４３のいずれか１つの機能的バリアントアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなる、例えば配列番号１～４３のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するポリペプチド又は単離されたポリペプチドを提供する。任意のそのようなポリペプチドは、本明細書にさらに記載されるＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドを形成するために、巨大分子又はポリペプチドに結合／タグ付けすることができる。タグ付けされた巨大分子又はポリペプチドは、水性反応系における生化学反応の実施に必要な巨大分子又はポリペプチドであり得る。生化学反応を行うための条件下で水性反応系内に維持される場合、任意のそのようなＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列又はその任意の機能的バリアントによって引き起こされる液体－液体脱混合、及び系内の複数の相分離した水性区画、好ましくは複数の検出可能な相分離した水性粒子の形成を引き起こし、それによって系内の生化学反応の効率を高めることができる。生化学反応を行うための条件下で水性反応系内に維持される場合、任意のそのようなＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、反応の実施に必要な分子を複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させ、それによって系内の生化学反応の効率を高める。
水性反応系は、水性インビトロ反応系であり得る。
本発明はまた、配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなる、又は配列番号１～４３の機能的バリアントアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなる、例えば配列番号１～４３のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を提供する。
本発明はまた、ＩＤＲ部分が巨大分子又はポリペプチドに結合／タグ付けされているＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドを製造する際の、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含むか又はこれからなるポリペプチドであるＩＤＲ部分の使用を提供し、タグ付けされた巨大分子又はポリペプチドが、水性反応系における生化学反応の実施に必要な巨大分子又はポリペプチドであり、生化学反応を実施するための条件下で水性反応系内に維持される場合、ＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドが、ＩＤＲ部分によって引き起こされる液体－液体脱混合を引き起こし、系内で複数の相分離した水性区画、好ましくは複数の検出可能な相分離した水性粒子の形成を引き起こし、それによって、系内の生化学反応の効率を高める。生化学反応を行うための条件下で水性反応系内に維持される場合、任意のそのようなＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、反応の実施に必要な分子を複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドと共局在させ、それによって系内の生化学反応の効率を高める。
好ましくは、ＩＤＲ部分は、ポリペプチドに結合／タグ付けされ、それによって、好ましくは組換え遺伝子融合タンパク質として産生されるＩＤＲ－タグ付きポリペプチドを産生する。
好ましくは、ＩＤＲ部分は、配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなるポリペプチド、又は配列番号１～４３のいずれか１つの機能的バリアントアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなる、例えば配列番号１～４３のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するポリペプチドである。
上記のＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドのいずれも、天然起源でない、人工の、又は遺伝子操作された巨大分子又はポリペプチドとして定義され得る。
上記のＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドのいずれかは、本明細書に記載及び定義されるＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドのいずれか１つ以上の特徴的な特性をさらに有し得る。
水性反応系は、水性インビトロ反応系であり得る。
本発明はさらに、上記の使用のいずれかに従って得られるＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドを提供する。
本発明はまた、ＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドを製造するための方法であって、巨大分子又はポリペプチドを提供することと、そこにＩＤＲ部分を結合／タグ付けすることとを含み、ＩＤＲ部分が、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含むか又はこれからなるポリペプチドである、方法を提供し、タグ付けされた巨大分子又はポリペプチドが、水性反応系における生化学反応の実施に必要な巨大分子又はポリペプチドであり、生化学反応を行うための条件下で水性反応系内に維持されると、ＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドが、ＩＤＲ部分によって引き起こされる液体－液体脱混合を引き起こし、系内で複数の相分離した水性区画、好ましくは複数の検出可能な相分離した水性粒子の形成を引き起こし、それによって、系内の生化学反応の効率を高める、方法を提供する。生化学反応を行うための条件下で水性反応系内に維持される場合、任意のそのようなＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、反応の実施に必要な分子を複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドと共局在させ、それによって系内の生化学反応の効率を高める。
好ましくは、本方法は、ポリペプチドを提供し、それにＩＤＲ部分を結合／タグ付けして、好ましくは組換え遺伝子融合タンパク質として産生されるＩＤＲ－タグ付きポリペプチドを産生することを含む。
好ましくは、ＩＤＲ部分は、配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなるポリペプチド、又は配列番号１～４３のいずれか１つの機能的バリアントアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなる、例えば配列番号１～４３のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するポリペプチドである。
上記のＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドのいずれも、天然起源でない、人工の、又は遺伝子操作された巨大分子又はポリペプチドとして定義され得る。
上記のＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドのいずれかは、本明細書に記載及び定義されるＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドのいずれか１つ以上の特徴的な特性をさらに有し得る。
水性反応系は、水性インビトロ反応系であり得る。
本発明はさらに、上記方法のいずれかによって得られるＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドを提供する。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅は、核酸分子を増幅するための技術である。この系は、とりわけ、リコンビナーゼ酵素、好ましくはリコンビナーゼ負荷タンパク質を利用する。これらのタンパク質成分は、増幅プライマーと複合体を形成する。増幅される標的核酸分子への結合後、複合体は標的核酸分子を「スキャン」し、標的とプライマー配列との間の相補性領域を「検索」する。相補的領域が見出されると、複合体はプライマーの標的配列への結合を促進する。次いで、ポリメラーゼ酵素がプライマーを伸長させて標的配列のコピーを生成することができる。リコンビナーゼ複合体の使用は、ＰＣＲなどの他の核酸増幅方法との重要な違いを提供する。ＲＰＡでは、リコンビナーゼ複合体がプライマー結合の問題に対して完全に酵素ベースの解決策を提供するので、熱サイクルによって駆動される融解及びアニーリング工程は必要ない。したがって、ＲＰＡは等温技術である。極端な熱サイクルの必要性がないことは、ＲＰＡがＰＣＲなどの技術よりも多くの明らかな利点を有することを意味する。
ＲＰＡ法における十分に文書化された要件は、当技術分野で「巨大分子クラウディング剤」とも呼ばれる「クラウディング剤」の存在である。これらの薬剤は、当技術分野において周知であり、当技術分野において理解されている意味を有する。クラウディング剤は、本明細書でより詳細に論じられる。ＲＰＡ法で最も一般的に使用されるクラウディング剤の１つはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるが、他のクラウディング剤を使用することもできる。本発明の前には、クラウディング剤の使用は、ＲＰＡ法における必須要件であると考えられていた。
本発明者らは、驚くべきことに、ＲＰＡ法におけるクラウディング剤に対してこれまで認められてきた重要な要件を回避することが可能であることを発見した。本発明は、この発見に基づいている。
本発明者らは、驚くべきことに、１つ以上の機能的「天然変性領域」（ＩＤＲ）を含むか又はこれからなるアミノ酸配列で、ＲＰＡ法で必要とされるタンパク質成分などの巨大分子を「タグ付け」することによって、ＩＤＲアミノ酸配列タグが、クラウディング剤の完全な非存在下で効率的なＲＰＡを促進することができることを発見した。このように、ＲＰＡ系では、クラウディング剤に依存することなく効率的な増幅を達成することができ、したがってＲＰＡ反応の複雑さを低減することができる。
本発明者らはまた、驚くべきことに、クラウディング剤の非存在下でのＩＤＲ－タグ付き巨大分子成分を含むＲＰＡ法における増幅の効率が、生化学反応系における相分離をもたらす液体－液体脱混合を促進するＩＤＲアミノ酸タグ配列の機能的能力と相関し得ることを発見した。相分離は、本明細書でさらに説明するように、顕微鏡観察を含む標準的な方法による検出に適した、相分離した水性区画、特に球状様水性球状フォーカス又は相分離した水性粒子の生化学反応環境における形成によって評価することができる。
さらに、本発明者らはまた、驚くべきことに、ＩＤＲ－タグ付き巨大分子成分及びクラウディング剤の提供が、ＲＰＡ法における増幅の効率に関して相加的及びさらには相乗効果を提供し得ることを発見した。
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、クラウディング剤の非存在下でのＩＤＲアミノ酸－タグ付き巨大分子成分を含むＲＰＡ法における増幅の効率が、生化学反応環境に導入された多価金属カチオンの濃度と相関し得ることを発見した。したがって、多価金属カチオンは、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる液体－液体脱混合をさらに刺激又は増強し、それによって反応効率をさらに高めることができる。
本発明者らはまた、驚くべきことに、本明細書にさらに記載されるように、特定の濃度のＡＴＰが、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる液体－液体脱混合をさらに刺激又は増強し、それによって反応効率をさらに高めることができることを発見した。
これらの驚くべき発見に基づいて、本発明は、本明細書にさらに記載されるように、ＲＰＡ反応を含む酵素ベースのインビトロ生化学反応の効率を高める方法及び試薬を提供する。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列及びＩＤＲ試薬は、ポリペプチドなどの生化学反応の任意の適切な巨大分子成分に適用される有用な試薬として広範な適用性を有し、それによって、特にＩＤＲアミノ酸配列が多価金属カチオンと一緒に使用される場合、巨大分子クラウディング剤に依存することなく、生化学反応環境における液体－液体脱混合及び相分離の促進を促進する。本発明は、巨大分子クラウディング剤に依存することなく、生化学反応環境におけるＩＤＲアミノ酸配列媒介相分離を促進する際の、二価金属カチオンなどの多価金属カチオン又はその任意の機能的等価物均等物の使用をさらに包含する。
したがって、本発明は、本明細書に記載及び定義されるＩＤＲベースの方法、巨大分子、ポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞及び使用を提供する。
本発明の要素を以下に順に説明する。
生化学反応
上記で説明したように、本発明者らは、驚くべきことに、以前にＲＰＡ及び他の反応の必須成分であると考えられていたクラウディング剤の必要性を回避することが可能であることを発見した。本明細書に詳細に記載されるように、これは、ＲＰＡ反応に必要なタンパク質成分に、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含むアミノ酸配列を結合／繋ぎ止め／タグ付けすることによって達成され得る。本発明者らはまた、驚くべきことに、リガーゼ酵素に結合した機能的天然変性領域がリガーゼ反応の効率を高めることができることを示した。本発明者らは、ＩＤＲアミノ酸配列によって誘導される相分離の程度が、クラウディング剤の非存在下での反応、例えば増幅の効率と相関し得る、かつ多価金属カチオンで増強され得ることを示した。これらの驚くべき観察に基づいて、生化学反応の巨大分子又はタンパク質成分に関連するそのようなＩＤＲアミノ酸配列は、インビトロ又はインビボ生化学反応環境、特に添加／外因性クラウディング剤の非存在下での反応の効率を改善することがもっともらしいと予想される。
上記で説明したように、本発明者らは、驚くべきことに、以前にＲＰＡ及び他の反応の必須成分であると考えられていたクラウディング剤の必要性を回避することが可能であることを発見した。本明細書に詳細に記載されるように、これは、ＲＰＡ反応に必要なタンパク質成分に、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含むアミノ酸配列を結合／繋ぎ止め／タグ付けすることによって達成され得る。本発明者らはまた、驚くべきことに、リガーゼ酵素に結合した機能的天然変性領域がリガーゼ反応の効率を高めることができることを示した。本発明者らは、ＩＤＲアミノ酸配列によって誘導される相分離の程度が、クラウディング剤の非存在下での反応、例えば増幅の効率と相関し得る、かつ多価金属カチオンで増強され得ることを示した。これらの驚くべき観察に基づいて、生化学反応の巨大分子又はタンパク質成分に関連するそのようなＩＤＲアミノ酸配列は、インビトロ又はインビボ生化学反応環境、特に添加／外因性クラウディング剤の非存在下での反応の効率を改善することがもっともらしいと予想される。
したがって、本発明は、インビトロ又はインビボ生化学反応の任意の適切な巨大分子又はポリペプチド成分に適用される、本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれかの使用を包含し、したがって、生化学反応環境における液体－液体脱混合を促進し、生化学反応の効率を高めることができるＩＤＲ試薬を提供する。生化学反応環境におけるそのような液体－液体脱混合は、生化学反応環境の相分離をもたらし得る。生化学反応環境におけるそのような液体－液体脱混合は、本明細書にさらに記載されるように、生化学反応環境における検出可能な相分離した水性粒子を含む、相分離した水性区画の形成をもたらす、引き起こす、又は促進する相分離をもたらし得る。本明細書にさらに記載及び定義されるそのようなＩＤＲ試薬又はＩＤＲベースの試薬は、ＩＤＲ－巨大分子若しくはＩＤＲ－タグ付き巨大分子、又はＩＤＲ－ポリペプチド若しくはＩＤＲ－タグ付きポリペプチドのいずれか１つ以上を記載するために交換可能に言及され得る。
方法（ｍｅｔｈｏｄ）、方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）及び使用のいずれか１つでは、又は本明細書に記載及び定義される、天然起源でないＩＤＲ－巨大分子、ＩＤＲ融合巨大分子若しくはそれをコードする単離された核酸分子、組換えポリヌクレオチド発現ベクター若しくは宿主細胞のいずれか１つでは、生化学反応の効率又は性能を高めるか又は増強することは、同じ条件下で反応を行うことによって得られる効率と比較して、本明細書に記載されるＩＤＲベースの巨大分子又はポリペプチドのいずれか１つ以上を使用して反応の効率を高めることを含み得るが、関連する巨大分子又はポリペプチドは、１つ以上の機能的天然変性領域ポリペプチド配列を含まないか、又はそれでタグ付けされておらず、任意に、反応は外因的に添加されたクラウディング剤の非存在下で行われる。
生化学反応の効率又は性能を高める又は増強することは、一般に受け入れられている概念に従って理解されるべきである。例えば、ＲＰＡ反応又は任意の他の核酸増幅反応における反応効率は、比較的少ない出発標的核酸を使用してアンプリコンの等価の総集団を提供すること、又は同じ量の出発標的核酸を使用して比較的速い検出時間又は比較的速い増幅速度を提供することとして理解され得る。
ＲＰＡ生化学反応の効率又は性能を高める又は増強することは、同じ条件下で反応を行うことによって得られる増幅産物の量と比較して、本明細書に記載のＩＤＲベースの巨大分子又はポリペプチドのいずれか１つ以上を使用するＲＰＡ反応で得られる増幅産物の量を、増加させることを含み得るが、関連する巨大分子又はポリペプチドは、１つ以上の機能的天然変性領域ポリペプチド配列を含まないか、又はそれでタグ付けされておらず、任意に、反応は外因的に添加されたクラウディング剤の非存在下で行われる。
インビトロ反応系などの反応系における生化学反応の効率を高めることは、一定期間にわたる反応の速度、一定期間にわたって消費された基質の量、一定期間にわたって生成された生成物の量など、指定された期間にわたる系における反応の任意の測定可能なパラメータを増加させることを含み得る。
インビトロ反応系などの反応系における生化学反応の効率を高めることは、検出可能な相分離した区画、例えば検出可能な相分離した水性粒子内の反応のパラメータを増加させることを含み得る。これは、例えば、反応のパラメータを測定し、検出可能な相分離した水性粒子の形成及び／又は検出可能な相分離した水性粒子への反応分子の検出可能な共局在化と増加を相関させることによって間接的に推測することができる。
所与の巨大分子又はタンパク質と共に使用され、所望のインビトロ生化学反応環境に含まれる場合、任意のＩＤＲアミノ酸配列が所望の生化学反応環境において液体－液体脱混合及び相分離を促進する必要な様式で機能することができるかどうかを立証するために使用することができる簡単なバイオインフォマティクス方法及び相分離アッセイが、本明細書に記載される。さらに、任意の所与の補助因子、特に多価、例えば二価の金属カチオンの適合性は、これらのアッセイにおいて非常に簡単な方法で立証され得る。
したがって、本発明は、任意の所与の所望のインビトロ又はインビボ生化学反応環境に有用に適用され得る本明細書に記載及び定義されるＩＤＲ試薬を提供する。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれも、本明細書に記載される任意の反応などのインビトロ又はインビボ生化学反応の実施に必要な任意の巨大分子又はタンパク質成分と共に使用することができる。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれも、核酸合成反応の実施に必要な任意の巨大分子又はタンパク質成分と共に使用することができる。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれも、ポリメラーゼを使用してプライマー核酸分子を伸長することによって新たな核酸分子を合成する核酸合成反応の実施に必要な任意の巨大分子又はタンパク質成分と共に使用することができる。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれも、核酸増幅反応の実施に必要な任意の巨大分子又はタンパク質成分と共に使用することができる。核酸増幅反応は、熱サイクルを伴う反応であり得る。核酸増幅反応は、等温増幅反応であってもよい。核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼスパイラル反応（ＰＳＲ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製（３ ＳＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、分岐増幅法（ＲＡＭ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）又はニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）であり得る。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれも、遺伝子編集反応の実施に必要な任意の巨大分子又はタンパク質成分と共に使用することができる。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれも、ＣＲＩＳＰＲ反応の実施に必要な任意の巨大分子又はタンパク質成分と共に使用することができる。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれかは、プライム編集遺伝子編集反応の実施に必要な任意の巨大分子又はタンパク質成分と共に使用することができ、Ｃａｓ酵素、例えばＣａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ酵素は、少なくとも逆転写酵素との複合体において提供され、任意にさらにプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）との複合体において提供され、プライム編集複合体の任意の成分は、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）ポリペプチド配列でタグ付けされて提供することができ、例えばＣＲＩＳＰＲ酵素は１つ以上の機能的ＩＤＲポリペプチド配列でタグ付けされているか、又は逆転写酵素は１つ以上の機能的ＩＤＲポリペプチド配列でタグ付けされている。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれも、連結反応の実施に必要な任意の巨大分子又はタンパク質成分と共に使用することができる。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれも、エキソヌクレアーゼ反応の実施に必要な任意の巨大分子又はタンパク質成分と共に使用することができる。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれも、エンドヌクレアーゼ反応、転写反応、ＤＮＡメチル化反応、ＤＮＡグリコシル化反応、抗体－抗原反応、薬物－標的反応の実施に必要な任意の巨大分子又はタンパク質成分と共に使用することができる。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれも、タンパク質：タンパク質相互作用を含む反応の実施に必要な任意の巨大分子又はタンパク質成分と共に使用することができる。
本明細書で使用されるインビトロ生化学反応を行うための方法は、反応容器内の溶液中で直接行われる生化学反応、例えば本明細書にさらに記載されるＲＰＡ反応を包含することが意図される。
本明細書で使用されるインビトロ生化学反応を行うための方法はまた、培養された宿主細胞内で生化学反応の効率を高めるために、培養された宿主細胞内で本明細書に記載のＩＤＲ試薬を発現させることなどによって、培養中の細胞内で行われる生化学反応を含む。
本明細書で使用されるインビトロ生化学反応を行うための方法は、培養された宿主細胞内の生化学反応の効率を高めるために、培養された宿主細胞に本明細書に記載のＩＤＲ試薬を導入するか、又は培養された宿主細胞で本明細書に記載のＩＤＲ試薬を発現させることによって培養中の宿主細胞内で行われる生化学反応を含み、生化学反応は、培養された宿主細胞内の核酸分子の操作をもたらす、又は核酸分子のヌクレオチド配列の変化などの核酸分子の構造の変化などの培養された宿主細胞内の核酸分子の変化をもたらす任意の反応である。
本明細書で使用されるインビトロ生化学反応を行うための方法は、培養された宿主細胞内の生化学反応の効率を高めるために、培養された宿主細胞に本明細書に記載のＩＤＲ試薬を導入するか、又は培養された宿主細胞に本明細書に記載のＩＤＲ試薬を発現させることによって培養中の細胞内で実行される生化学反応を含み、生化学反応は、培養された宿主細胞内で核酸分子の合成をもたらす任意の反応である。
本明細書で使用されるインビトロ生化学反応を行うための方法は、培養された宿主細胞内の生化学反応の効率を高めるために、培養された宿主細胞に本明細書に記載のＩＤＲ試薬を導入するか、又は培養された宿主細胞で本明細書に記載のＩＤＲ試薬を発現させることによって培養中の細胞内で行われる生化学反応を含み、生化学反応は、核酸分子からポリペプチドの発現をもたらす任意の反応である。
本明細書で使用されるインビトロ生化学反応を行うための方法は、培養された宿主細胞内の生化学反応の効率を高めるために、培養された宿主細胞に本明細書に記載のＩＤＲ試薬を導入するか、又は培養された宿主細胞で本明細書に記載のＩＤＲ試薬を発現させることによって培養中の細胞内で行われる生化学反応を含み、生化学反応は、培養された宿主細胞内の核酸配列の編集（例えば、ＩＤＲ－ポリペプチドがＣａｓ９ポリペプチドを含むＣａｓポリペプチドなどのＣＲＩＳＰＲポリペプチドであるか、又はＩＤＲ－ポリペプチドがＣＲＩＳＰＲポリペプチドと複合体を形成しているポリペプチドであり、例えばＩＤＲ－ポリペプチドが逆転写酵素である）、培養された宿主細胞内の核酸の切断、及び培養された宿主細胞内の核酸の相同組換えをもたらす任意の反応である。
本明細書で使用されるインビトロ生化学反応を行うための方法は、培養された宿主細胞内の生化学反応の効率を高めるために、培養された宿主細胞に本明細書に記載のＩＤＲ試薬を導入するか、又は培養された宿主細胞に本明細書に記載のＩＤＲ試薬を発現させることによって培養中の細胞内で行われる生化学反応を含み、生化学反応は、培養された宿主細胞内で１つ以上の目的の生物学的産物を産生するための、又は培養された宿主細胞から分泌されるか、そうでなければ培養された宿主細胞から培地に放出される１つ以上の目的の生物学的産物を産生するための培養された宿主細胞内の代謝反応である。
本発明はまた、例えば、組織培養物又は体外で開発された任意の他の適切な複雑な生物学的系の細胞中で本明細書で定義されるＩＤＲ試薬を発現させることによって、エクスビボで行われる生化学反応を包含することを意図する。したがって、本明細書に記載のＩＤＲ試薬のいずれかを使用して本明細書で使用される水性インビトロ反応系で生化学反応を行うための方法への任意の言及は、代替的に、本明細書に記載のＩＤＲ試薬のいずれかを使用して水性エクスビボ反応系で生化学反応を行うための方法として定義され得る。
本発明はまた、インビボで生化学反応の効率を高めるための方法、試薬及び方法を提供する。したがって、本明細書に記載のＩＤＲ試薬のいずれかを使用して本明細書で使用される水性インビトロ反応系で生化学反応を行うための方法への任意の言及は、代替的に、本明細書に記載のＩＤＲ試薬のいずれかを使用して水性インビボ反応系で生化学反応を行うための方法として定義され得る。
本発明は、治療での使用のため、治療薬として使用するため、薬物として使用するため、医薬品として使用するため、又は診断剤として使用するための、本明細書に記載又は定義される任意の天然起源でないＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを提供する。
本発明は、治療によるヒト又は動物の身体の治療方法に使用するための、本明細書に記載又は定義される任意の天然起源でないＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを提供する。
本発明は、ヒト又は動物の身体で実施される診断方法で使用するための、本明細書に記載又は定義される任意の天然起源でないＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを提供する。
本発明は、治療によってヒト又は動物の身体を治療するための薬物の製造に使用するための、本明細書に記載又は定義される任意の天然起源でないＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを提供する。
本発明は、ヒト又は動物の身体に実施される診断方法のための診断剤の製造に使用するための、本明細書に記載又は定義される任意の天然起源でないＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを提供する。
本発明は、治療的有効量の本明細書に記載又は定義される任意の天然起源でないＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを、それを必要とするヒト又は動物に投与することを含む、ヒト又は動物の治療方法を提供する。
生化学反応の効率を高めるための上記方法、試薬及び方法のいずれか１つでは、天然起源でないＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、液体－液体脱混合を促進することができる。上記液体－液体脱混合は、溶液中の検出可能な相分離した水性粒子を含む、溶液中の相分離した水性区画の形成を促進することができ得る。それによって、上記液体－液体脱混合又は上記検出可能な相分離区画若しくは粒子の形成は、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって引き起こされる生化学反応の効率を高める。
本明細書で使用されるインビトロ生化学反応を行うための方法は、本明細書に記載のＩＤＲ試薬を溶液に導入するか、培養された宿主細胞にＩＤＲ試薬を導入又は発現させて、溶液中又は培養された宿主細胞中の液体－液体脱混合を促進することによって、反応容器内又は培養された宿主細胞内で溶液中でインビトロで行われる任意の生化学反応を含む。任意のそのような生化学反応では、本明細書に記載及び定義されるように、溶液中又は培養された宿主細胞中の液体－液体脱混合は、溶液中又は培養された宿主細胞中の相分離を促進する。
任意のそのような生化学反応は、溶液中若しくは培養された宿主細胞中の液体－液体脱混合の促進及び／又は溶液中若しくは培養された宿主細胞中の相分離の促進において、本明細書に記載及び定義される任意のＩＤＲアミノ酸配列の有効性を評価するために行われ得る。
任意のそのような生化学反応は、溶液中若しくは培養された宿主細胞中のＩＤＲアミノ酸配列によって媒介される液体－液体脱混合の刺激若しくは増強、及び／又は溶液中若しくは培養された宿主細胞中のＩＤＲアミノ酸配列によって媒介される相分離の刺激若しくは増強において、好ましくは試験薬剤がＩＤＲアミノ酸配列と相互作用する、薬物、ポリペプチド又は任意の他の分子などの試験薬剤の有効性を評価するために行われ得る。
任意のそのような生化学反応は、溶液中若しくは培養された宿主細胞中のＩＤＲアミノ酸配列によって媒介される液体－液体脱混合の阻害及び／又は溶液中若しくは培養された宿主細胞中のＩＤＲアミノ酸配列によって媒介される相分離の阻害における、好ましくは試験薬剤がＩＤＲアミノ酸配列と相互作用する、薬物、ポリペプチド又は任意の他の分子などの試験薬剤の有効性を評価するために行われ得る。
インビトロ、インビボ又はエクスビボ生化学反応を行うための本明細書に記載される方法のいずれも、ヒトをクローニングするための方法を除外し得る。
インビトロ、インビボ又はエクスビボの生化学反応を行うための本明細書中に記載される方法のいずれかは、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性を改変するための方法を排除し得る。
インビトロ、インビボ又はエクスビボ生化学反応を行うための本明細書に記載される方法のいずれも、ヒト胚の使用又は全能性ヒト細胞の使用を含む方法を排除し得る。
本明細書に記載される任意の宿主細胞は、ヒト胚、又は全能性ヒト細胞、又はヒト生殖系列細胞を排除し得る。
いくつかの態様ではインビボ使用を包含するが、本発明はいくつかの態様ではインビボ使用の排除を包含する。したがって、水性反応系において生化学反応を行うための本明細書に記載の方法、使用又は方法などのいずれかは、インビボ水性反応系を排除し得る。
いくつかの態様ではエクスビボ使用を包含するが、本発明はいくつかの態様ではエクスビボ使用の排除を包含する。したがって、水性反応系において生化学反応を行うための本明細書に記載の方法、使用又は方法などのいずれかは、エクスビボ水性反応系を排除し得る。
本明細書に記載の方法、方法、使用又はＩＤＲ試薬のいずれかでは、系内の反応の効率は、同じ反応条件下で少なくとも１つの巨大分子又はポリペプチドの導入後の系内の反応の効率と比較して、少なくとも１つの巨大分子又はポリペプチドが１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含まないことを除いて、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって高められ得る。
少なくとも１つの巨大分子又は少なくとも１つのポリペプチドが、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）（ＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチド）を含むか又はこれからなるアミノ酸配列でタグ付けされている、本明細書に記載の方法、方法、使用又はＩＤＲ試薬のいずれかでは、系における反応の効率は、同じ反応条件下で少なくとも１つの巨大分子又はポリペプチドの導入後の系における反応の効率と比較して、少なくとも１つの巨大分子又はポリペプチドが、１つ以上の機能的ＩＤＲを含むか又はこれからなるアミノ酸配列でタグ付けされていないことを除いて、ＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドによって高められ得る。
したがって、ＩＤＲ－巨大分子若しくはＩＤＲ－ポリペプチド、又はＩＤＲ－タグ付き巨大分子若しくはＩＤＲ－タグ付きポリペプチドが系内の反応の効率を高めることができるかどうかは、１つ以上の機能的ＩＤＲの有無にかかわらず、巨大分子又はポリペプチドの反応効率を比較することによって非常に簡単に立証することができる。当業者は、関連する機能的能力を立証するために単純な比較試験を実行することができる。例示的な試験アッセイを本明細書中にさらに記載する。
同様に、ＩＤＲ－巨大分子若しくはＩＤＲ－ポリペプチド、又はＩＤＲ－タグ付き巨大分子若しくはＩＤＲ－タグ付きポリペプチドが、反応の実施に必要な分子を、複数の相分離した水性区画内で、ＩＤＲ－巨大分子若しくはＩＤＲ－ポリペプチド、又はＩＤＲ－タグ付き巨大分子若しくはＩＤＲ－タグ付きポリペプチドと共局在させることができるかどうか、又は複数の相分離した水性区画内での反応の実施に必要な分子の共局在化をさらに刺激又は増強し、それによって系内の生化学反応の効率を高めることができるかどうかは、１つ以上の機能的ＩＤＲの有無にかかわらず共局在化を比較することによって非常に簡単に立証することもできる。ふたたび、当業者は、関連する機能的能力を立証するために単純な比較試験を実行することができる。例示的な試験アッセイを本明細書中にさらに記載する。
同様に、多価金属イオンをＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドに、又はＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドに提供し、それによって液体－液体脱混合及び複数の相分離した水性区画の形成をさらに刺激又は増強し、それによって系内の生化学反応の効率をさらに高めるかどうかは、多価金属イオンを提供するか又は提供しないかにかかわらず液体－液体脱混合を比較することによって非常に簡単に立証することもできる。ふたたび、当業者は、関連する機能的能力を立証するために単純な比較試験を実行することができる。例示的な試験アッセイを本明細書中にさらに記載する。
同様に、ＡＴＰをＩＤＲ－巨大分子若しくはＩＤＲ－ポリペプチド、又はＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドに提供することで、液体－液体脱混合及び複数の相分離した水性区画の形成をさらに刺激又は増強してよく、それによって系における生化学反応の効率をさらに高めるかどうかは、ＡＴＰを提供するかしないかにかかわらず液体－液体脱混合を比較することによって非常に簡単に立証することができる。ＩＤＲ－巨大分子若しくはＩＤＲ－ポリペプチド、又はＩＤＲ－タグ付き巨大分子若しくはＩＤＲ－タグ付きポリペプチドにＡＴＰを提供し、複数の相分離した水性区画内での反応の実施に必要な分子の共局在化をさらに刺激又は増強し、それによって系内の生化学反応の効率を高めるかどうかは、ＡＴＰを提供するか提供しないかにかかわらず共局在化を比較することによって非常に簡単に立証することもできる。ふたたび、当業者は、関連する機能的能力を立証するために単純な比較試験を実行することができる。例示的な試験アッセイを本明細書中にさらに記載する。
相分離した水性粒子の形成を引き起こす能力を参照して、液体－液体脱混合を引き起こす能力を立証するためのアッセイを本明細書中に記載する（例えば、本明細書に記載されるような「相分離アッセイ法」を参照のこと）。同じアッセイを使用して、相分離した水性区画（粒子）内での反応の実施のために必要な分子の共局在化を引き起こす能力を立証することができる。本明細書では、ＲＰＡ法の効率を高める能力を参照して、反応の効率を高める能力を立証するためのアッセイを記載する（例えば、本明細書中に記載されるような「ＲＰＡアッセイ法」を参照のこと）。そのようなアッセイを使用して、反応の効率を高めるために１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）からなるか又はこれを含むアミノ酸配列の能力を評価することができ、及び／又は二価金属イオンが反応の効率をさらに高める能力を評価することができ、及び／又はＡＴＰが反応の効率をさらに高める能力を評価することができる。
本明細書中に記載されるような単純なアッセイを使用して、当業者は、５％以上の反応効率の向上を決定することができ、反応効率の向上は、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上又は１００％以上であり得る。
クラウディング剤
クラウディング剤は、典型的には、タンパク質又は合成ブロックポリマーなどの高分子量の巨大分子である。クラウディング剤は、本質的に生化学的に不活性であると考えられ、すなわち、特定の相互作用又は触媒作用に寄与しない。
クラウディング剤は、典型的には、タンパク質又は合成ブロックポリマーなどの高分子量の巨大分子である。クラウディング剤は、本質的に生化学的に不活性であると考えられ、すなわち、特定の相互作用又は触媒作用に寄与しない。
クラウディング剤は、インビトロ系であれインビボ系であれ、溶液中の体積の物理的占有の影響を介して、生物学的／生化学的系に影響を及ぼし、したがって立体障害及び利用可能な開放溶媒空間の減少を引き起こすと広く仮定されている。この排除された体積機構により、クラウディング剤は他の巨大分子の有効濃度を増加させるようであり、解離定数の変化に特に影響を及ぼし、特定の組織化複合体に集まる複数のタンパク質などの相互作用巨大分子の会合を促進する。込み合い効果の大きさは、特に、関与する分子の分子量に依存し、一般に、より大きな分子ではるかに強くなる。したがって、一般に、巨大分子の込み合いは、大きな分子が他の大きな分子の特性に及ぼす影響である。
さらに、クラウディング剤は、反応物がそれ自体をミクロンサイズの相分離粒子に分離する好ましい相を有する生物学的／生化学的な系の形成を促進することができると広く記載されている。この効果は、大部分が体積で占められているバルク溶媒中に容易に拡散することができないために比較的「閉じ込められる」ようになる巨大分子複合体の解離定数に対する体積排除の効果から実質的に生じる。追加的及び／又は代替的に、ポリエチレングリコールのようなブロック鎖ポリマーなどのいくつかのクラウディング剤は、バルク水の構造に全体的な変化を及ぼし、典型的には水密度を低下させることをもたらす共変性特性を示し得る。バルク溶媒特性のこのような変化はまた、表面が水と相互作用しなければならない他の巨大分子及びそれらの集合体に複雑な効果を及ぼし得る。これはまた、これらの他の巨大分子の別の相への分離を促進し、生物学的成分が著しく濃縮され、付随して、主にバルク溶媒相を占めるクラウディング剤が枯渇し得る。
いずれのシナリオにおいても、単純な体積占有又は溶媒修飾のいずれかによって、巨大分子の相が異なる凝縮物への縮合を刺激する際の個々の又はクラウディング剤の組み合わせの効果は、凝縮物成分の観点から「引力的」機構ではなく「反発的な」機構によって作用するように見える。換言すれば、凝縮物が高度に濃縮された成分の観点から、クラウディング剤は、拡散によって容易に浸透することができないバルク相環境を作り出すように作用し、及び／又はそのバルク溶媒特性は、分散するための正味のエンタルピー的欠点を呈するように変更される。このようにして、本明細書では、典型的には１％ ｗ／ｖを超える高濃度のクラウディング剤の効果が、クラウディング剤の非存在下ではそうであるように凝縮物成分が容易に分散することができないためにこの現象が生じる場合に限り、「妨害的」又は「反発的」機構を介して機能することによって相分離を刺激する際に言及される。しかしながら、同時に、その一般的に不活性な特性を考慮すると、例えば、クラウディング剤は特定の分子側鎖と直接に著しく相互作用しないか、又は直接的な様式で効果を発揮しないため、クラウディング剤は系内の他の特定の分子に対して直接的な弱体化作用をほとんど又は全く有さない。
標準的なＲＰＡ反応では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、組換え／ＤＮＡ合成に大きな影響を及ぼし得る。ＰＥＧは、例えば、ＲｅｃＡがＧｐ３２と組み合わされるときに生じる複数の侵入／伸長サイクルの数に影響を及ぼし得る。ＰＥＧは、いくつかの異なる方法で構成された増幅反応を刺激することができる。ＰＥＧ及び他の同様のクラウディング剤は、Ｇｐ３２及びリコンビナーゼの協同性に影響を及ぼしてよく、ポリメラーゼの処理能力に影響を及ぼしてよく、溶液中のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度及び挙動に影響を及ぼし得る。ポリエチレングリコールの鎖長は、結果に影響を及ぼし得る。ＰＥＧはまた、リコンビナーゼ負荷フィラメントの安定性を高めてよく、向上した持続性はＲＰＡの有効性高め得る。
インビトロ生化学反応環境においてその効果を発揮するために、添加されたクラウディング剤は、典型的には、立体排除／閉じ込め効果が生じると予測される濃度で存在し、典型的には、反応物の体積又は重量で約１％を超えて存在する。
標準的なＲＰＡ反応では、クラウディング剤は、反応物の体積又は重量で約１％～１２％の濃度で存在する。
「巨大分子クラウディング剤」又はより単純に「クラウディング剤」という用語は、非常によく認識され、当技術分野で理解されている用語である。これは、これらの用語が広く使用されている文献から明らかである。例えば、Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ，Ｉ．，Ｍ．ら（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｏｗｄｉｎｇ Ｃａｎ Ｄｏ ｔｏ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ，２０１４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．、１５、ｐｐ ２３０９０－２３１４０）は、３２０を超える論文を網羅することを主張し、当分野における現在の知識の最も包括的な要約の１つを表すことが提案されている総説を提供している。用語「クラウディング剤」は、その遍在的な使用を強調する本文全体にわたって広く使用されている（Ｍｉｘｅｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｏｗｄｉｎｇ：Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，Ｂｉｓｗａｓ，Ｓ．ら、２０１８，ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ，３（４）、ｐｐ４３１６－４３３０及びＣｏｍｍｏｎ Ｃｒｏｗｄｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ Ｈａｖｅ Ｏｎｌｙ ａ Ｓｍａｌｌ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｐｈｉｌｌｉｐ Ｙ．ら、２００９，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，９７ ｐｐ８７５－８８５ ８７５も参照のこと）。
化合物又は巨大分子は、当技術分野で公知の手段によってクラウディング剤として同定することができる。例えば、クラウディング剤は、その実験的に決定され計算された流体力学的半径によってそのようなものとして同定することができる（上記のＫｕｚｎｅｔｓｏｖａら）。クラウディング剤は、ゾル－ゲルガラス封入分析によってそのようなものとして同定することができる（上記のＫｕｚｎｅｔｓｏｖａら）。
以下の化合物は、公知のクラウディング剤の例である。合成ブロックポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ２０５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ４６００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００、ＰＥＧ３５０００、ＰＥＧ化合物分子量１５，０００～２０，０００（Ｃａｒｂｏｗａｘ ２０Ｍとしても知られる）、デキストラン、デキストラン６、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストラン６７０、デキストランスルファート１０、デキストランスルファート５００、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｆｉｃｏｌｌ７０、Ｆｉｃｏｌｌ４００、ポリ（４－スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＳＳ）、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）、リボヌクレアーゼＡ、リゾチーム、β－ラクトグロブリン、ヘモグロビン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。
本発明の方法、プロセス及び使用のいずれか１つ（本発明のＲＰＡ法、方法及び使用のいずれか１つを含む）では、方法、プロセス及び使用は、クラウディング剤の非存在下で実施され得る。
本発明の方法、プロセス及び使用のいずれか１つ（本発明のＲＰＡ法、方法及び使用のいずれか１つを含む）では、方法、プロセス及び使用は、クラウディング剤の存在下で実施され得る。
本発明の方法、プロセス及び使用のいずれか１つ（本発明のＲＰＡ法、方法及び使用のいずれか１つを含む）では、方法、プロセス及び使用は、クラウディング剤の存在下で行われてもよく、クラウディング剤は、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって提供される生化学反応の効率の向上の増進を提供する濃度で提供される。
本発明の方法、プロセス及び使用のいずれか１つ（本発明のＲＰＡ法、方法及び使用を含む）では、方法、プロセス及び使用は、クラウディング剤の存在下で行われてもよく、クラウディング剤は、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって提供される生化学反応の効率に付加的な効果を提供する濃度で提供される。
本発明の方法、プロセス及び使用のいずれか１つ（本発明のＲＰＡ法、方法及び使用のいずれか１つを含む）では、方法、プロセス及び使用は、クラウディング剤の存在下で行われてもよく、クラウディング剤は、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって提供される生化学反応の効率に相乗効果を提供する濃度で提供される。
本発明の方法、プロセス及び使用のいずれか１つ（本発明のＲＰＡ法、方法及び使用のいずれか１つを含む）では、方法、プロセス及び使用は、クラウディング剤の存在下で行われてもよく、生化学反応系へのＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの導入は、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの生化学反応系への導入の非存在下で生化学反応の効率において同じ向上を達成するために必要とされるであろうクラウディング剤の濃度を低下させる。
クラウディング剤の存在下で行われ得る上記の方法、プロセス及び使用のいずれか１つでは、クラウディング剤は、その通常の生物学的効果（立体排除／閉じ込め効果）が生じる濃度より低い濃度で存在し得る。
クラウディング剤の存在下で行われ得る上記の方法、プロセス及び使用のいずれか１つでは、クラウディング剤は、反応物の体積又は重量で約３％、反応物の体積又は重量で約２％、反応物の体積又は重量で約１％、反応物の体積又は重量で約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％の濃度で存在し得る。
ＲＰＡ反応方法を含む本発明の方法、プロセス及び使用のいずれか１つで使用される場合、任意の適切なクラウディング剤が使用され得る。好適なクラウディング剤の例を本明細書で提供する。
天然変性領域（ＩＤＲ）を含む巨大分子又はポリペプチド
本発明の方法、プロセス及び試薬は、本明細書に記載されるように、「ＩＤＲ－タグ付き巨大分子」を含む「ＩＤＲ－巨大分子」を含む。本発明の方法、プロセス及び試薬は、本明細書に記載されるように、「ＩＤＲ－タグ付きポリペプチド」を含む「ＩＤＲ－ポリペプチド」を含む。任意のそのようなＩＤＲ－巨大分子、ＩＤＲ－タグ付き巨大分子、ＩＤＲ－ポリペプチド又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、本明細書ではＩＤＲ試薬又はＩＤＲベースの試薬と互換的に呼ばれ得る。
本発明の方法、プロセス及び試薬は、本明細書に記載されるように、「ＩＤＲ－タグ付き巨大分子」を含む「ＩＤＲ－巨大分子」を含む。本発明の方法、プロセス及び試薬は、本明細書に記載されるように、「ＩＤＲ－タグ付きポリペプチド」を含む「ＩＤＲ－ポリペプチド」を含む。任意のそのようなＩＤＲ－巨大分子、ＩＤＲ－タグ付き巨大分子、ＩＤＲ－ポリペプチド又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、本明細書ではＩＤＲ試薬又はＩＤＲベースの試薬と互換的に呼ばれ得る。
本明細書で使用されるＩＤＲ－巨大分子若しくはＩＤＲ－ポリペプチド又はＩＤＲ－タグ付き巨大分子若しくはＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含む任意の巨大分子又はポリペプチド若しくはタンパク質である。
本明細書で使用されるＩＤＲ－巨大分子若しくはＩＤＲ－ポリペプチド又はＩＤＲ－タグ付き巨大分子若しくはＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）からなるか又はこれを含むアミノ酸配列を含む任意の巨大分子又はポリペプチド若しくはタンパク質である。
したがって、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、本明細書で言及されるように、結果として、１つ以上の機能的天然変性領域からなるアミノ酸配列を含む巨大分子又はポリペプチドを指す場合があり、又は１つ以上の機能的天然変性領域を含むアミノ酸配列を含む巨大分子又はポリペプチドを指す場合がある。
さらに、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含むＩＤＲ－巨大分子は、本明細書で言及されるように、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）からなるか又はこれを含むアミノ酸配列でタグ付けされた目的の巨大分子であり得る。そのようなＩＤＲ－タグ付き巨大分子も、本明細書に記載のＩＤＲ試薬である。１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含むＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、本明細書で言及されるように、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）からなるか又はこれを含むアミノ酸配列でタグ付けされた目的のポリペプチドであり得る。そのようなＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、本明細書に記載のＩＤＲ試薬でもある。
ＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、本明細書で使用されるように、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）からなるか又はこれを含むアミノ酸配列で「タグ付け」されている任意の巨大分子又はポリペプチド若しくはタンパク質である。
したがって、ＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、本明細書で言及されるように、結果として、１つ以上の機能的天然変性領域からなるアミノ酸配列でタグ付けされた巨大分子又はポリペプチドを指す場合があり、又は１つ以上の機能的天然変性領域を含むアミノ酸配列でタグ付けされた巨大分子又はポリペプチドを指す場合がある。
１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）からなる又はこれを含むタグ付きアミノ酸配列は、タグ付き位置でタグ付けされている巨大分子又はポリペプチド若しくはタンパク質中に天然に又は通常は見られない。したがって、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）からなる又はこれを含むタグ付きアミノ酸配列は、それがタグ付けされている巨大分子又はポリペプチド若しくはタンパク質と比較して外因性アミノ酸配列であると見なすことができる。したがって、タグ付けされた巨大分子又はポリペプチド若しくはタンパク質は、天然起源でない、人工の又は遺伝子操作された巨大分子、ポリペプチド又はタンパク質であると見なすことができる。
アミノ酸配列がポリペプチド及び他の巨大分子に「タグ付け」され得る機構は、本明細書でさらに説明される。
本明細書に開示される特定のＩＤＲアミノ酸タグ配列のいずれか１つ以上、又はこのいずれか１つ以上の機能的バリアント、類似体、ホモログ若しくは誘導体を含む、任意の１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を巨大分子又はポリペプチド若しくはタンパク質にタグ付けすることができる。
本発明で使用するためには、天然変性領域ポリペプチド配列及びそのドメインの両方が、「機能的」でなければならない。「機能的」という用語は、任意のＩＤＲアミノ酸配列が、本明細書でさらに概説される機能特性の１つを有さなければならないことを意味する。
「天然変性領域」という用語は、当技術分野で一般的に使用される技術的に理解されている用語である。包括的な総説については、Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｅら、２０１４，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１４、ｐｐ ６５８９－６６３１を参照のこと。
本発明は、とりわけ、水性インビトロ反応系において生化学反応を行う方法であって、生化学反応が、少なくとも１つの反応巨大分子、任意に少なくとも１つの反応ポリペプチドの機能に依存し、方法が、反応を行うために適した条件下で、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子をインビトロ反応系に導入することを含み、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子が、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含み、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子をインビトロ反応系へ導入すると、生化学反応の効率が、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子によって高められる、方法を提供する。生化学反応の効率は、ＩＤＲ－巨大分子の１つ以上の機能的ＩＤＲによって高められる。任意のそのような方法では、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子は少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドであり得る。任意のそのような方法では、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含むＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、生化学反応がその機能に依存する「反応巨大分子」又は「反応ポリペプチド」でなくてもよい。したがって、任意のそのような方法において、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、生化学反応自体に固有の生化学的役割を有さない場合がある。それにもかかわらず、反応系へのその導入は、生化学反応の効率の向上をもたらす。
インビトロ反応系で生化学反応を行う方法は、生化学反応が少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子の機能に依存する方法であってよく、インビトロ反応系へのその導入時に、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子が生化学反応でその反応機能を実施し、反応の効率を高める。任意のそのような方法では、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子は少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドであり得る。任意のそのような方法では、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、生化学反応自体において固有の生化学的役割を有する。したがって、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含む少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、生化学反応がその機能に依存する「反応巨大分子」又は「反応ポリペプチド」である。
少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、１つ以上の機能的天然変性領域を含むか又はこれからなるアミノ酸配列を含む。ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、生化学反応を行うのに適した条件下で生化学反応系に導入される。１つ以上の機能的天然変性領域が存在するため、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは反応の効率を高める。
反応の効率を高めることにより、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドが、１つ以上の機能的天然変性領域を含むか又はこれからなるアミノ酸配列なしで提供された場合に観察されるであろう反応の効率と比較して、反応の効率が改善されることを意味する。そのような改善は、ＩＤＲアミノ酸配列を含む及び含まない反応巨大分子又はポリペプチドの比較試験によって容易に立証することができる。
本発明の方法のいずれか１つでは、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的天然変性領域は、反応系における液体－液体脱混合を促進／引き起こし、相分離をもたらす。反応系において相分離をもたらす液体－液体脱混合を促進する機能的能力は、例えば、本明細書に記載の相分離アッセイを行うことによって容易に立証することができる。そのような液体－液体脱混合は相分離を促進し、これは、本明細書でさらに詳述するように、例えば顕微鏡観察下で検出可能な粒子などの反応系内の相分離区画の形成をもたらし得る。
ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、触媒活性を有していてもよく、又は有していなくてもよい。例えば、ＩＤＲ－ポリペプチドは、本明細書にさらに記載されるように、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応で使用されるポリメラーゼ酵素などの触媒活性を有し得る。ＩＤＲ－ポリペプチドは、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応で使用される一本鎖安定化剤、例えば本明細書にさらに記載されるＧｐ３２などの触媒活性を有さなくてもよい。
本明細書でさらに論じるように、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドが触媒活性を有するか否かにかかわらず、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、生化学反応系にＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドが存在しない場合、生化学反応が進行できないか、又は効率が低下して進行するように、生化学反応に必要とされるか、又は生化学反応に影響を及ぼす機能を有し得る。あるいは、本明細書でさらに論じるように、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、生化学反応自体に必要とされるか、又は生化学反応自体に影響を及ぼす機能を有さなくてもよい。それにもかかわらず、ＩＤＲアミノ酸配列のために、生化学反応系へのＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの導入は、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの非存在下、又はＩＤＲアミノ酸配列を有しない同じ巨大分子又はポリペプチドの存在下で、観察される効率と比較して、生化学反応の効率の向上をもたらす。
ＩＤＲポリペプチドの構造特性
アミノ酸配列中のＩＤＲの存在は、構造分析によって容易に決定され得る。ポリペプチド及びタンパク質内のＩＤＲの存在を予測するために、多数のバイオインフォマティクスベースのプラットフォームが利用可能である。これらには、ＥＬＭ、ＭｉｎｉＭｏｔｉｆ、ＳＬｉＭＰｒｉｎｔｓ、ｐｈｙｌｏ－ＨＭＭ、ＤｉｌｉＭｏｔ、ＳＬｉＭＦｉｎｄｅｒ、Ｐｈｏｓｐｈｏ．ＥＬＭ、ＰｈｏｓｐｈｏＳｉｔｅ、ＰＨＯＳＩＤＡ、ＳｃａｎＳｉｔｅ、ＮｅｔＰｈｏｒｅｓｔ、ＮｅｔｗｏｒＫＩＮ、ＰｈｏｓｐｈｏＮＥＴ、ＩＤＥＡＬ、ＭｏＲＦｐｒｅｄ、ＡＮＣＨＯＲ、Ｐｆａｍ、ＦＦＰｒｅｄ、ＤｉｓＰｒｏｔ、Ｄ２Ｐ２、及びＭｅｔａＤｉｓｏｒｄｅｒが含まれる。これらの方法のいずれも、ＩＤＲアミノ酸配列を同定するために使用され得る。必要であれば、そのようなＩＤＲアミノ酸配列は、本明細書中でさらに記載されるように、それらの機能特性を評価するために試験され得る。
アミノ酸配列中のＩＤＲの存在は、構造分析によって容易に決定され得る。ポリペプチド及びタンパク質内のＩＤＲの存在を予測するために、多数のバイオインフォマティクスベースのプラットフォームが利用可能である。これらには、ＥＬＭ、ＭｉｎｉＭｏｔｉｆ、ＳＬｉＭＰｒｉｎｔｓ、ｐｈｙｌｏ－ＨＭＭ、ＤｉｌｉＭｏｔ、ＳＬｉＭＦｉｎｄｅｒ、Ｐｈｏｓｐｈｏ．ＥＬＭ、ＰｈｏｓｐｈｏＳｉｔｅ、ＰＨＯＳＩＤＡ、ＳｃａｎＳｉｔｅ、ＮｅｔＰｈｏｒｅｓｔ、ＮｅｔｗｏｒＫＩＮ、ＰｈｏｓｐｈｏＮＥＴ、ＩＤＥＡＬ、ＭｏＲＦｐｒｅｄ、ＡＮＣＨＯＲ、Ｐｆａｍ、ＦＦＰｒｅｄ、ＤｉｓＰｒｏｔ、Ｄ２Ｐ２、及びＭｅｔａＤｉｓｏｒｄｅｒが含まれる。これらの方法のいずれも、ＩＤＲアミノ酸配列を同定するために使用され得る。必要であれば、そのようなＩＤＲアミノ酸配列は、本明細書中でさらに記載されるように、それらの機能特性を評価するために試験され得る。
ＩＤＲアミノ酸配列同定のための好ましい生物情報学ベースのプラットフォームは、ＭｅｔａＤｉｓｏｒｄｅｒソフトウェアプログラム（ＭｅｔａＤｉｓｏｒｄｅｒ：タンパク質の天然変性を予測するためのメタサーバー、Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ，Ｌ．Ｐ．ら、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１２，１３（１）：１１１）である。
ＭｅｔａＤｉｓｏｒｄｅｒプログラムは、オンライン（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓｉｌｉｃｏ．ｐｌ／ｍｅｔａｄｉｓｏｒｄｅｒ／）で自由に入手可能である。このプログラムを使用して、目的のアミノ酸配列をインターネットブラウザウィンドウに単に貼り付けて、プログラムが開始される。オンライン文書が説明するように、ソフトウェアパッケージにおいて０．５を超えるスコアを有する任意のアミノ酸領域は、天然変性領域を含むと考えられる。
ＭｅｔａＤｉｓｏｒｄｅｒソフトウェアプラットフォームを使用して、本発明者らは、１つ以上の天然変性領域を含むいくつかのアミノ酸配列を同定した。これらをTable 1に示す。
したがって、方法、プロセス及び使用のいずれか１つにおいて、又は天然起源でないＩＤＲ－巨大分子、ＩＤＲ融合巨大分子若しくはそれをコードする単離された核酸分子、組換えポリヌクレオチド発現ベクター若しくは宿主細胞のいずれか１つにおいて、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲは、アルゴリズムＭｅｔａＤｉｓｏｒｄｅｒによって分析した場合に０．５を超えるスコアを有するアミノ酸の配列として特徴付けることができる。アミノ酸の配列は、アルゴリズムＭｅｔａＤｉｓｏｒｄｅｒアコーディオンによってＫｏｚｌｏｗｓｋｉ，Ｌ．Ｐ．ら、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１２，１３（１）：１１１の方法で分析した場合に０．５を超えるスコアを示すアミノ酸の配列であり得る。
本発明は、配列番号１～４３（Table 1）のいずれか１つのアミノ酸配列及びそのバリアントを含むか又はからなる好ましいＩＤＲアミノ酸配列を提供し、関連する。すべての場合において、配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列のバリアントは、本明細書にさらに記載されるように、ＩＤＲ機能特性を保持する機能的バリアントである。
さらに、本明細書にさらに記載されるように、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドは、配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなる、又は配列番号１～４３の機能的バリアントアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなるアミノ酸配列でタグ付けされた巨大分子又はポリペプチドを含むか又はこれからなり得る。
機能的バリアントは、本明細書に記載のＩＤＲアミノ酸配列（Table 1）と比較して少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。機能的バリアントは、本明細書に記載のＩＤＲアミノ酸配列（Table 1）と比較して少なくとも８１％の配列同一性、又は８２％の配列同一性、又は８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し得る。
本発明の目的のために、例えば配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列と配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列の機能的バリアントとの間の同一性パーセントを決定するために、２つのそれぞれのアミノ酸配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、第２の配列との最適なアラインメントのために第１の配列にギャップを導入することができる）。次いで、ヌクレオチド位置のヌクレオチド残基を比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチド残基によって占められている場合、ヌクレオチドはその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／参照配列中の位置の総数×１００）。
典型的には、配列比較は、参照配列の全長にわたって行われる。例えば、当業者が、所与の（「バリアント」）配列が配列番号２と８０％同一であるかどうかを決定したい場合、配列番号２は参照配列であろう。例えば、バリアント配列が配列番号２（参照配列の一例）と少なくとも８０％同一であるかどうかを評価するために、当業者は配列番号２の長さにわたってアラインメントを行い、試験配列中のいくつの位置が配列番号２の位置と同一であったかを同定するであろう。位置の少なくとも８０％が同一である場合、試験配列は配列番号２と少なくとも８０％同一である。配列が配列番号２より短い場合、ギャップ又は欠落した位置は、非同一の位置であると見なされるべきである。
当業者は、２つの配列間の相同性又は同一性を決定するために利用可能な異なるコンピュータプログラムを知っている。例えば、配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つのアミノ酸又は核酸配列間の同一性パーセントは、例えば、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ ２５０マトリックスのいずれか、並びに１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ重み及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重みを使用して、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能）においてＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）アルゴリズムを使用して決定することができる。
配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列の機能的バリアントは、それぞれ配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列と比較して少ないアミノ酸数を有することによって異なる（すなわち、機能的バリアントはより短い）か、又はそれぞれ配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列と比較して多いアミノ酸数を有することによって異なる（すなわち、機能的バリアントはより長い）アミノ酸配列であり得る。したがって、機能的バリアントは、参照アミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸欠失及び／又は１つ以上の挿入を含み得る。バリアントが参照配列と異なる機能的バリアントアミノ酸配列中のアミノ酸の数は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上又は２０以上であり得る。
配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列の機能的バリアントは、例えば、Table 1に列挙された配列に示されるアミノ酸残基の保存的アミノ酸置換を含み得る。保存的置換は、例えば、一般に受け入れられているアミノ酸のグループ分けを記載する以下の表に従って行うことができる。したがって、機能的バリアントは、参照アミノ酸配列と比較して保存的アミノ酸置換を含み得る。参照配列と比較して保存的アミノ酸置換である機能的バリアントアミノ酸配列中のアミノ酸の数は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上又は２０以上であり得る。
所与のバリアントがＩＤＲ機能特性を保持するかどうかは、例えば本明細書にさらに記載の方法によって容易に立証することができる。
Table 1
Table 1
同様の置換が、塩基性の場合は塩基性、酸性の場合は酸性、極性の場合は極性などのアミノ酸の場合に行われ得る。非相同置換もまた、すなわち、あるクラスの残基から別のクラスの残基まで、又は代替的に、オルニチン、ジアミノ酪酸オルニチン、ノルロイシンオルニチン、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の包含を伴って起こり得る。
本明細書に開示される特定のＩＤＲアミノ酸配列（Table 1参照）は、４つのグループに大別することができる。いくつかのＩＤＲ配列は、２つ以上のグループに分類することができる。ＲＧＧ／ＲＧグループは、ＦＧ／ＹＧリッチであるＩＤＲ配列を含む。このグループは、ｆｉｂ、ｈｎｒｐｎＡ１、ＤＤＸ、ＨＲＰ１及びＳｕｐを含む。Ｐｏｌｙ Ｑグループは、Ｑ／ＮリッチであるＩＤＲ配列を含む。このグループは、ＰＣＦ１１、Ｅｎｔ－１、ＨＲＰ１、Ｓｕｐ、Ｈｉｓ４、Ｈｉｓ８及びＨｉｓ１０を含む。Ｐｏｌｙ Ｐグループは、Ｐリッチである配列を含む。このグループは、Ｈｉｓ４、Ｈｉｓ９及びＨｉｓ１０を含む。Ｐｏｌｙ Ｈグループは、Ｈリッチである配列を含む。このグループは、Ｈｉｓ１－１１を含む。ＩＤＲアミノ酸配列のいくつかの重要な特徴は、それらがカチオン－π相互作用及びπ－π相互作用を示し、アミド架橋及び塩架橋を形成することができることである。好ましいＩＤＲアミノ酸配列の重要な特徴及び重要な分子間／分子内相互作用を以下のTable 2～Table 20に示す。
Table 2
Table 3
Table 4
Table 5
Table 6
Table 7
Table 8
Table 9
Table 10
Table 11
Table 12
Table 13
Table 14
Table 15
Table 16
Table 17
Table 18
Table 19
Table 20
Table 2
Table 3
Table 4
Table 5
Table 6
Table 7
Table 8
Table 9
Table 10
Table 11
Table 12
Table 13
Table 14
Table 15
Table 16
Table 17
Table 18
Table 19
Table 20
ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの機能特性
本明細書に記載のＩＤＲ－タグ付き巨大分子若しくはポリペプチド、又はＩＤＲ－巨大分子若しくはＩＤＲ－ポリペプチドは、本発明の方法で使用される１つ以上の機能的ＩＤＲからなるか又はこれを含むアミノ酸配列を有しなければならない。そのようなＩＤＲアミノ酸配列又はドメインが機能的であるか否かは、本明細書に記載される方法などの日常的な方法によって立証することができる。
本明細書に記載のＩＤＲ－タグ付き巨大分子若しくはポリペプチド、又はＩＤＲ－巨大分子若しくはＩＤＲ－ポリペプチドは、本発明の方法で使用される１つ以上の機能的ＩＤＲからなるか又はこれを含むアミノ酸配列を有しなければならない。そのようなＩＤＲアミノ酸配列又はドメインが機能的であるか否かは、本明細書に記載される方法などの日常的な方法によって立証することができる。
粒子形成
本発明者らは、驚くべきことに、ＩＤＲ－タグ付きポリペプチド又はＩＤＲ－ポリペプチドが適切な溶液中で粒子を形成することができることを発見した。これは、ＩＤＲアミノ酸配列によって媒介される溶液混合物内の流体の相分離をもたらす液体－液体脱混合によって起こると考えられる。
本発明者らは、驚くべきことに、ＩＤＲ－タグ付きポリペプチド又はＩＤＲ－ポリペプチドが適切な溶液中で粒子を形成することができることを発見した。これは、ＩＤＲアミノ酸配列によって媒介される溶液混合物内の流体の相分離をもたらす液体－液体脱混合によって起こると考えられる。
ＩＤＲアミノ酸配列によって媒介される粒子の形成は、以下の例にさらに記載される。粒子は回転楕円形の外観を示し、「小球」、「球状フォーカス」又は「粒子」と記載することができる。
本明細書で言及される「粒子」、「小球」又は「球状フォーカス」という用語は、同義語であることを意図しており、互換的に使用することができる。粒子の観察及び検出を可能にする条件及び方法は、以下の例を含む本明細書に記載されている。
本明細書に記載の例では、ＩＤＲ－タグ付きポリペプチド及び二価金属カチオンの溶液のみを含む単純な系で粒子形成が起こることが観察された。粒子形成はまた、ＲＰＡタンパク質成分の１つ（Ｇｐ３２）がＩＤＲ－タグ付きであったＲＰＡに必要な成分を含む混合物を含むより複雑な混合物中で起こることが見出された。これらの状況では、反応成分は粒子と強く共局在することがわかり、例えば、粒子は、それに結合した蛍光標識プローブによって検出されるようにオリゴヌクレオチド中で高密度であり、他のすべてのＲＰＡ反応タンパク質成分を含むことがわかった。
粒子の検出及びモニタリングは、任意の適切な方法、並びに以下の例に記載の方法を使用して行うことができる。例示的な方法としては、顕微鏡法、光散乱法、フローサイトメトリー法及びマイクロ流体法が挙げられる。
粒子は、顕微鏡法、例えば微分干渉コントラスト又は蛍光顕微鏡法を使用して検出して、粒子を高倍率で直接観察することができる。コンピュータの助けを借りて、顕微鏡画像を自動的に取得及び分析することができる。さらに、顕微鏡法は、粒子を含有する混合物の少なくとも一部の継続的又は頻繁なモニタリングを可能にすることができる。
粒子は、フローサイトメトリーを使用して検出することができる。フローサイトメトリーでは、１つ以上の光ビーム、例えば単一波長のそれぞれは、流体の流体力学的に集束された流れに向けられる。ビームを通過する懸濁粒子は光を散乱し、粒子内に見出されるか又は粒子に結合した蛍光化学物質が励起され得る。散乱光及び／又は蛍光は、装置内の検出器によって分析され、そこから粒径及び蛍光に関する情報を決定することができる。最新のフローサイトメーターは、「リアルタイム」で毎秒数千個の粒子を分析することができ、特定の特性を有する粒子を能動的に分離及び単離することができる。
粒子は、例えば、米国特許出願公開第２００９／００７９９６３号明細書及び米国特許出願公開第２０１０／０１７９０６８号明細書並びに国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１１２５９４号明細書に開示されているような、サイトメトリー法、デバイス及びシステムを使用して検出することができる。
粒子は、マイクロ流体法、デバイス、及びシステムを使用して検出することができる。例えば、ラブオンチップデバイス又はシステムなどを使用して粒子を検出することができる（例えば、米国特許出願公開第２００９／０３２６９０３号明細書及び米国特許出願公開第２００９／０２９７７３３号明細書を参照のこと）。
粒子は、約０．５～２０μｍのサイズ、例えば、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、及び２０μｍ（例えば、約１～１０μｍのサイズ）から選択されるほぼ任意の２つのサイズの間であり得る。
粒子の濃度は、約１０～５０００粒子／ｎｌであってよく、例えば、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、及び５０００粒子／ｎｌから選択される任意の２つの数の粒子の間で検出され得る（例えば、約１００～５００粒子／ｎｌ）。粒子の濃度は、ナノリットル当たり約２００～４００粒子であり得る。
そのような相分離粒子は、サイズが約０．５μｍより小さくてもよい。サイズが約０．５μｍより小さいものを含む相分離粒子は、溶液の濁度の変化によって検出することができる。溶液の濁度の変化は、標準的な手段によって測定することができ、典型的にはホルマジン濁度単位（ＦＴＵ）又はホルマジン比濁法単位（ＦＮＵ）に従って定量することができる。他の方法としては、多角度光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）を含むサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。
ＩＤＲ機能の実験的決定
本明細書に記載のＩＤＲ－巨大分子若しくはＩＤＲ－ポリペプチド、又はＩＤＲ－タグ付き巨大分子若しくはＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、機能的天然変性領域（ＩＤＲ）アミノ酸配列及び／又はそのドメインを有すると決定することができ、したがって、例えば以下に記載される相分離アッセイ法又はＲＰＡアッセイ法を使用することによって、本発明の方法及び試薬に使用することができる。
本明細書に記載のＩＤＲ－巨大分子若しくはＩＤＲ－ポリペプチド、又はＩＤＲ－タグ付き巨大分子若しくはＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、機能的天然変性領域（ＩＤＲ）アミノ酸配列及び／又はそのドメインを有すると決定することができ、したがって、例えば以下に記載される相分離アッセイ法又はＲＰＡアッセイ法を使用することによって、本発明の方法及び試薬に使用することができる。
したがって、ＩＤＲ－巨大分子、ＩＤＲ－ポリペプチド又はＩＤＲ－タグ付き巨大分子若しくはＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、１つ以上の機能的天然変性領域からなるアミノ酸配列を含むか、又はそれでタグ付けされた巨大分子又はポリペプチドであるか、又は、１つ若しくはそれを超える機能的天然変性領域を含むアミノ酸配列でタグ付けされた巨大分子若しくはポリペプチドである。すべての場合において、機能的天然変性領域は、下記に記載される相分離アッセイ法及び／又は下記に記載されるようなＲＰＡアッセイ法において機能的であると決定され得るものである。
相分離アッセイ法
相分離アッセイ法は、
１．ＩＤＲ－ポリペプチド融合タンパク質を作製するために１つ以上の天然変性領域アミノ酸配列をポリペプチドにタグ付けすること、好ましくは、Ｇｐ３２－ＩＤＲ融合タンパク質を作製するために組換えファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２タンパク質にタグ付けすること、及び精製ＩＤＲ－ポリペプチド融合タンパク質を提供することと、
２．ＩＤＲ－ポリペプチド融合タンパク質をある体積の水に１０００ｎｇ／μｌの最終濃度まで添加することであって、混合物の最終体積は５０μｌであり、好ましくは二価金属カチオンを２ｍＭ以上の最終濃度まで添加し、より好ましくは二価金属カチオンはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋である、添加することと、
３．混合物をボルテックスし、続いて混合物をパルス遠心分離することと、
４．混合物の上清の１０μｌの試料を血球計スライドに移すことと、
５．顕微鏡下で倍率４００倍で血球計スライドを見ることと、
６．混合物中の粒子の形成を観察することと、
７．混合物中に粒子が存在しない場合、工程１～６を繰り返し、混合物中の粒子の形成が観察されるまで二価金属カチオンの濃度を漸増的に増加させることと、
８．２１８μｍ×１７５μｍの拡大領域に形成される粒子の数を倍率４００倍でカウントすることと、
９．（ｉ）拡大領域内で１０個以上の粒子をカウントした場合、好ましくは拡大領域内で５０個以上の粒子をカウントした場合、より好ましくは拡大領域内で１００個以上の粒子をカウントした場合に、１つ以上の天然変性領域（ＩＤＲ）からなるか又はこれを含むアミノ酸配列が機能的であることを立証することと、又は
（ｉｉ）二価金属カチオンの濃度が１００ｍＭ以上に増大し、拡大領域内に形成する粒子が観察されない場合、又は拡大領域内で１０個未満の粒子がカウントされる場合、１つ以上の天然変性領域（ＩＤＲ）からなるか、又はこれを含むアミノ酸配列が非機能的であることを立証することと、
を含む方法である。
相分離アッセイ法は、
１．ＩＤＲ－ポリペプチド融合タンパク質を作製するために１つ以上の天然変性領域アミノ酸配列をポリペプチドにタグ付けすること、好ましくは、Ｇｐ３２－ＩＤＲ融合タンパク質を作製するために組換えファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２タンパク質にタグ付けすること、及び精製ＩＤＲ－ポリペプチド融合タンパク質を提供することと、
２．ＩＤＲ－ポリペプチド融合タンパク質をある体積の水に１０００ｎｇ／μｌの最終濃度まで添加することであって、混合物の最終体積は５０μｌであり、好ましくは二価金属カチオンを２ｍＭ以上の最終濃度まで添加し、より好ましくは二価金属カチオンはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋である、添加することと、
３．混合物をボルテックスし、続いて混合物をパルス遠心分離することと、
４．混合物の上清の１０μｌの試料を血球計スライドに移すことと、
５．顕微鏡下で倍率４００倍で血球計スライドを見ることと、
６．混合物中の粒子の形成を観察することと、
７．混合物中に粒子が存在しない場合、工程１～６を繰り返し、混合物中の粒子の形成が観察されるまで二価金属カチオンの濃度を漸増的に増加させることと、
８．２１８μｍ×１７５μｍの拡大領域に形成される粒子の数を倍率４００倍でカウントすることと、
９．（ｉ）拡大領域内で１０個以上の粒子をカウントした場合、好ましくは拡大領域内で５０個以上の粒子をカウントした場合、より好ましくは拡大領域内で１００個以上の粒子をカウントした場合に、１つ以上の天然変性領域（ＩＤＲ）からなるか又はこれを含むアミノ酸配列が機能的であることを立証することと、又は
（ｉｉ）二価金属カチオンの濃度が１００ｍＭ以上に増大し、拡大領域内に形成する粒子が観察されない場合、又は拡大領域内で１０個未満の粒子がカウントされる場合、１つ以上の天然変性領域（ＩＤＲ）からなるか、又はこれを含むアミノ酸配列が非機能的であることを立証することと、
を含む方法である。
上記の方法では、粒子形成に対する二価金属カチオンの提供の効果を調べることが望ましい場合、工程２は、任意の所望の最終濃度まで二価金属カチオンを添加することを含み得る。したがって、異なる濃度の二価金属カチオンの効果を調べることができる。
上記の方法では、粒子形成に対するＡＴＰの提供の効果を調べることが望ましい場合、工程２は、ＡＴＰを任意の所望の最終濃度に添加することを含み得る。したがって、異なる濃度のＡＴＰの効果を調べることができる。ＡＴＰは、例えば１ｍＭ～３．５ｍＭ、例えば１ｍＭ～２ｍＭの濃度で提供され得る。
工程２は、検出可能な核酸分子を添加することを含んでよく、工程８は、検出手段によって粒子の数をカウントすることを含む。例えば、工程２は、ＦＡＭ（フルオレセイン）で標識された配列番号１０４に設定された核酸配列を有するプローブを添加することを含んでよく、工程８は、蛍光によって粒子を検出することを含み得る。検出可能な核酸分子は、０．５μＭなどの任意の適切な最終濃度に添加することができる。
したがって、上記のアッセイを使用して、反応効率、液体－液体脱混合を引き起こす能力、及び分子を複数の相分離した水性区画（粒子）内に共局在させる能力を調べることができる。
上記方法において、二価金属カチオンがＭｇ２＋である場合、カチオン源はＭｇＯＡｃであることが好ましい。二価金属カチオンがＣａ２＋である場合、カチオン源はＣａＣｌ２であることが好ましい。二価金属カチオンがＭｎ２＋である場合、カチオン源はＭｎＣｌ２であることが好ましい。
ＲＰＡアッセイ法
ＲＰＡアッセイ法は、
１．Ｇｐ３２－ＩＤＲ融合タンパク質を作製するために、１つ以上の天然変性領域ポリペプチド配列をＧｐ３２タンパク質、好ましくは組換えファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２タンパク質にタグ付けし、精製されたＧｐ３２－ＩＤＲ融合タンパク質を提供することと、
２．以下を含む反応混合物を生成することと、
ａ．トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、２５ｍＭ、
ｂ．ＫＯＡｃ、７．５ｍＭ、
ｃ．ＤＴＴ、１ｍＭ、
ｄ．ＡＴＰ、２．５ｍＭ、
ｅ．ホスホクレアチン、２０ｍＭ、
ｆ．クレアチンキナーゼ、１μＭ、
ｇ．ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ、
ｈ．精製Ｇｐ３２－ＩＤＲ融合タンパク質、２０μＭ、
ｉ．精製ＵｖｓＸ、４．８μＭ
ｊ．精製ＵｖｓＹ、８．６μＭ
ｋ．黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ１（ＳＡＵ）、０．１３５μＭ
ｌ．エキソヌクレアーゼＩＩＩ、０．２７μＭ
ｍ．フォワードプライマー、０．４μＭ
ｎ．リバースプライマー、０．４μＭ
ｏ．プローブ、０．１２μＭ
３．反応混合物に３３ｍＭ ＭｇＯＡｃ及び鋳型核酸の１０コピーを添加することによってリコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応を開始することと、
４．ベアリングボールを使用して磁気混合しながら蛍光光度計で３９℃で反応混合物をインキュベートすることと、
５．（ｉ）増幅産物の２倍以上の増加が、鋳型依存的様式でベースラインと比較して蛍光の測定可能な増加によって１５分以内に検出可能である場合、１つ以上の天然変性領域ポリペプチド配列が機能的であることを立証することと、又は
（ｉｉ）１５分後に蛍光によって増幅産物が検出されない場合、１つ以上の天然変性領域ポリペプチド配列が非機能的であることを立証することと、
を含む、方法である。
ＲＰＡアッセイ法は、
１．Ｇｐ３２－ＩＤＲ融合タンパク質を作製するために、１つ以上の天然変性領域ポリペプチド配列をＧｐ３２タンパク質、好ましくは組換えファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２タンパク質にタグ付けし、精製されたＧｐ３２－ＩＤＲ融合タンパク質を提供することと、
２．以下を含む反応混合物を生成することと、
ａ．トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、２５ｍＭ、
ｂ．ＫＯＡｃ、７．５ｍＭ、
ｃ．ＤＴＴ、１ｍＭ、
ｄ．ＡＴＰ、２．５ｍＭ、
ｅ．ホスホクレアチン、２０ｍＭ、
ｆ．クレアチンキナーゼ、１μＭ、
ｇ．ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ、
ｈ．精製Ｇｐ３２－ＩＤＲ融合タンパク質、２０μＭ、
ｉ．精製ＵｖｓＸ、４．８μＭ
ｊ．精製ＵｖｓＹ、８．６μＭ
ｋ．黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ１（ＳＡＵ）、０．１３５μＭ
ｌ．エキソヌクレアーゼＩＩＩ、０．２７μＭ
ｍ．フォワードプライマー、０．４μＭ
ｎ．リバースプライマー、０．４μＭ
ｏ．プローブ、０．１２μＭ
３．反応混合物に３３ｍＭ ＭｇＯＡｃ及び鋳型核酸の１０コピーを添加することによってリコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応を開始することと、
４．ベアリングボールを使用して磁気混合しながら蛍光光度計で３９℃で反応混合物をインキュベートすることと、
５．（ｉ）増幅産物の２倍以上の増加が、鋳型依存的様式でベースラインと比較して蛍光の測定可能な増加によって１５分以内に検出可能である場合、１つ以上の天然変性領域ポリペプチド配列が機能的であることを立証することと、又は
（ｉｉ）１５分後に蛍光によって増幅産物が検出されない場合、１つ以上の天然変性領域ポリペプチド配列が非機能的であることを立証することと、
を含む、方法である。
上記方法において、フォワードプライマー配列は、ＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号９８）であり、リバースプライマー配列は、ＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡ（配列番号９９）であり、プローブ配列は、ＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＡＧ［ＦＡＭ］ ［ＴＨＦ］［ＢＨＱ－１］ＡＴＡＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡ（配列番号１００）であり、式中、ＦＡＭはフルオレセインであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＢＨＱはブラックホールクエンチャーであり、鋳型は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ゲノムＤＮＡである。
あるいは、上記ＲＰＡアッセイ法の工程５は、増幅産物の５倍以上の増加が、鋳型依存的様式でベースラインと比較して蛍光の測定可能な増加によって１５分以内に検出可能である場合、又は１０倍以上の増加が検出可能である場合、又は２０倍以上の増加、又は３０倍以上の増加、又は４０倍以上の増加、又は５０倍以上の増加、又は１００倍以上の増加、又は１５０倍以上の増加、又は２００倍以上の増加、又は２５０倍以上の増加、又は３００倍以上の増加、又は３５０倍以上の増加、又は４００倍以上の増加、又は４５０倍以上の増加、又は５００倍以上、１０００倍以上、２０００倍以上、３０００倍以上、４０００倍以上、５０００倍以上の増加が検出可能である場合、１つ以上の天然変性領域ポリペプチド配列が機能的であることを立証することを含み得る。ベースラインを超える増幅産物の増加とは、Ｇｐ３２タンパク質が１つ以上の天然変性領域ポリペプチド配列でタグ付けされていないことを除いて、同じ条件下で反応を行うことによって得られた増幅産物の量と比較した増幅産物の増加を意味する。
上記の方法では、反応効率に対する二価金属カチオンの提供の効果を調べることが望ましい場合、工程３は、任意の所望の最終濃度まで二価金属カチオンを添加することを含み得る。したがって、異なる濃度の二価金属カチオンの効果を調べることができる。
上記の方法では、反応効率に対するＡＴＰを提供する効果を調べることが望ましい場合、工程２は、ＡＴＰを任意の所望の最終濃度に添加することを含み得る。したがって、異なる濃度のＡＴＰの効果を調べることができる。ＡＴＰは、例えば１ｍＭ～３．５ｍＭ、例えば１ｍＭ～２ｍＭの濃度で提供され得る。
巨大分子及びポリペプチドへのＩＤＲアミノ酸配列のタグ付け
本発明の方法、方法及び試薬は、とりわけ、ＩＤＲ－タグ付き巨大分子及びＩＤＲ－タグ付きポリペプチドを含み、ＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、１つ以上の天然変性領域（ＩＤＲ）（本明細書ではＩＤＲ部分と呼ばれ得る）からなるか又はこれを含むアミノ酸配列でタグ付けされた目的の巨大分子又はポリペプチドである。
本発明の方法、方法及び試薬は、とりわけ、ＩＤＲ－タグ付き巨大分子及びＩＤＲ－タグ付きポリペプチドを含み、ＩＤＲ－タグ付き巨大分子又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドは、１つ以上の天然変性領域（ＩＤＲ）（本明細書ではＩＤＲ部分と呼ばれ得る）からなるか又はこれを含むアミノ酸配列でタグ付けされた目的の巨大分子又はポリペプチドである。
「タグ」又は「タグ付け」という用語は、その最も広い意味で理解されるべきである。これらの用語は、ＩＤＲ部分、すなわち、１つ以上の機能的ＩＤＲからなるか又はこれを含むアミノ酸配列が、任意の適切な方法で目的の巨大分子又はポリペプチドに結合しているか、繋ぎ止められているか、結合しているか、そうでなければ会合していることを意味すると理解されるべきである。
ＩＤＲ部分を目的のポリペプチドにタグ付けする最も好ましい手段は、組換え遺伝子融合タンパク質を作製することによるものであり、目的のポリペプチドは、転写及び翻訳されたときに発現されたタンパク質がＩＤＲ部分と共に目的のポリペプチドを含むようにヌクレオチドレベルで遺伝子操作される。
所望であれば、目的のポリペプチドとＩＤＲ部分との間にリンカーを配置してもよい。例えば、柔軟で、強固で、かつ切断可能なリンカーは当技術分野で周知であり、融合タンパク質の製造に広く使用されている（例えば：Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．２０１３，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，１５，６５（１０）、ｐｐ１３５７－１３６９を参照のこと）。
遺伝子操作のための標準的な方法は、タンパク質発現及び精製のための方法と同様に、当技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）を参照のこと）。
ＩＤＲ部分を目的の巨大分子又はポリペプチドにタグ付けすることができる他の手段は、１つ以上の共有結合又は親和性相互作用によるものである。
ＩＤＲ部分は、目的のポリペプチドのＮ末端、目的のポリペプチドのＣ末端などの任意の適切な配向でポリペプチドにタグ付けすることができ、又は目的のポリペプチドは、そのＮ末端及びＣ末端の両方に、又はポリペプチドの長さに沿った任意のアミノ酸位置にＩＤＲ部分を含み得る。
ペプチド／オリゴペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、この技術分野で非常に知られている方法を使用することによって、他のペプチド／オリゴペプチド／ポリペプチド／タンパク質を含む他の巨大分子に結合される／繋ぎ止められてコンジュゲートされ得る。
そのような方法の１つは、「クリックケミストリー」である。「クリックケミストリー」という用語は、典型的には、銅触媒の存在下で１，５－二置換１，２，３トリアゾールをもたらすアジドとアルキンとの反応を説明するために使用される。クリックケミストリーは、ペプチド／オリゴペプチド／ポリペプチド／タンパク質を、他のペプチド／オリゴペプチド／ポリペプチド／タンパク質、並びに例えば炭水化物、核酸、ポリマー、薬物、アプタマー、ヒドロゲルなどを含む広範囲の他の巨大分子にコンジュゲートさせることを可能にする。この方法は、「ＣｕＡＡＣ」（Ｃｕ触媒アルキンアジド環化付加）（例えば、「クリック」反応：ペプチドコンジュゲートの合成のための汎用ツールボックス、Ｔａｎｇ，Ｗ．ら、２０１４，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，４３、ｐｐ７０１３－７０３９を参照のこと）とも呼ばれる。
ペプチド／オリゴペプチド／ポリペプチド／タンパク質を、アミンと反応するマレイミド、スルフヒドリル反応性基又はスクシンイミジルエステル（しばしばＮＨＳエステルと呼ばれる）を含有する架橋剤などの他の巨大分子にコンジュゲートするために、多くの他のリンカー／架橋剤化学が利用可能である。例えば、スクシンイミドは、タンパク質又はペプチドとプラスチック材料との間に共有結合を形成するために使用することができる。
ポリペプチドと非ポリペプチド分子との間のコンジュゲートを作製するために一般的に用いられる標準的な化学物質、例えば抗体－薬物コンジュゲートを作製するための化学物質を使用することができる。このような技術の多くは、この技術分野において周知である。
親和性に基づく相互作用も使用することができる。例えば、１つ以上の機能的天然変性領域からなるか又はこれを含むアミノ酸配列は、ストレプトアビジン－ビオチン、受容体－リガンド相互作用などの親和性に基づく相互作用によって、目的の巨大分子又はポリペプチドに結合され／繋ぎ止められ得る。
ＩＤＲアミノ酸配列機能のための多価金属カチオン
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドがインビトロ生化学反応で使用される場合、インビトロ生化学反応緩衝液は、好ましくは多価金属カチオン、好ましくは二価金属カチオンを含有する。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドがインビトロ生化学反応で使用される場合、インビトロ生化学反応緩衝液は、好ましくは多価金属カチオン、好ましくは二価金属カチオンを含有する。
反応緩衝液中の多価／二価金属カチオンの存在は、ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって媒介される／引き起こされるインビトロ生化学反応環境における相分離をもたらす液体－液体脱混合を促進及び増強するのに役立つ。
ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって媒介される／引き起こされるインビトロ生化学反応環境において相分離を増強する二価金属カチオンの機能的能力は、本明細書に開示及び定義される技術などによって容易に立証することができる。特に、そのような機能的能力は、本明細書にさらに記載及び定義されるように、例えば本明細書に記載のアッセイによって決定されるように、ＩＤＲ依存的な方法でインビトロ生化学反応環境において球状フォーカス又は粒子の形成を誘導する多価／二価金属カチオンの能力によって立証することができる。
相分離をもたらすＩＤＲ依存性液体－液体脱混合の促進／増強における二価金属カチオンの使用が好ましい。しかしながら、任意の多価又は任意の二価金属カチオンの機能的等価物が想定される。本明細書に記載の多価／二価金属カチオンの機能的等価物は、例えば本明細書に記載のアッセイによって決定されるように、インビトロ生化学反応環境での相分離をもたらすＩＤＲ依存性液体－液体脱混合の促進において二価金属カチオンの代わりになり得る任意の薬剤である。
任意の適切な多価／二価金属カチオンを、単剤又は薬剤の組み合わせとして、任意にキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）又はニトロ酢酸（ＮＴＡ）の存在下で使用することができる。
二価金属カチオンは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋又はＣｕ２＋であり得る。これらのカチオンは、いずれも単剤で用いてもよく、又は、カチオンの組み合わせを用いてもよい。好ましくは、それらは単剤として使用される。好ましい二価金属カチオンは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋及びＣａ２＋である。
インビトロ生化学反応環境におけるＩＤＲ媒介相分離の促進において最適な結果を達成する特定の多価／二価金属カチオン、並びに使用される多価／二価金属カチオンの特定の濃度は、目的の巨大分子又はポリペプチドをタグ付けするために使用される特定の天然変性領域アミノ酸配列に依存し得る。最適な多価／二価金属カチオン及び最適な濃度は、日常的な試験を用いて経験的に立証することができる。本明細書にさらに記載される相分離アッセイは、この目的のために使用され得る。
多価／二価金属カチオンの好ましい濃度範囲は、約３００μＭ～約１００ｍＭ、約３００μＭ～約５０ｍＭ、約４００μＭ～約５０ｍＭ、約４００μＭ～約２０ｍＭ、約４００μＭ～約３０ｍＭ、約５００μＭ～約１０ｍＭ、約５００μＭ～約２５ｍＭ及び約１ｍＭ～約３５ｍＭである。
インビトロ生化学反応緩衝液は、Ｍｇ２＋イオンを含有し得る。好ましい濃度範囲は、約３００μＭ～約１００ｍＭ、より好ましくは約４００μＭ～約５０ｍＭ、さらにより好ましくは約５００μＭ～約４０ｍＭ、さらにより好ましくは約２５ｍＭ～約３５ｍＭ、例えば３３ｍＭである。好ましくは、緩衝液は、示された濃度でＭｇＯＡｃを含有する。
インビトロ生化学反応緩衝液は、Ｃａ２＋イオンを含有し得る。好ましい濃度範囲は、約３００μＭ～約１００ｍＭ、より好ましくは約４００μＭ～約５０ｍＭ、さらにより好ましくは約１ｍＭ～約４０ｍＭ、さらにより好ましくは約２５ｍＭ～約３５ｍＭ、例えば３３ｍＭである。好ましくは、緩衝液は、示された濃度でＣａＣｌ２を含有する。
インビトロ生化学反応緩衝液緩衝液は、Ｍｎ２＋イオンを含有し得る。好ましい濃度範囲は、約３００μＭ～約５０ｍＭ、より好ましくは約４００μＭ～約５０ｍＭ、さらにより好ましくは約５００μＭ～約４０ｍＭ、さらにより好ましくは約２５ｍＭ～約３５ｍＭ、例えば３３ｍＭである。好ましくは、緩衝液は、示された濃度でＭｎＣｌ２を含有する。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）は、核酸の等温増幅のための方法である。一般に、ＲＰＡの第１の工程では、リコンビナーゼ剤を第１及び第２の核酸プライマー並びにリコンビナーゼ負荷タンパク質と接触させて、第１及び第２の核タンパク質プライマーを形成する。一般に、第２の工程では、第１及び第２の核タンパク質プライマーを二本鎖鋳型核酸と接触させて、鋳型核酸の第１の鎖の第１の部分に第１の二本鎖構造を形成し、鋳型核酸の第２の鎖の第２の部分に第２の二本鎖構造を形成して、第１の核酸プライマー及び第２の核酸プライマーの３’末端が所与の核酸分子上で互いに向かって配向されるようにする。一般に、第３の工程では、第１及び第２の核タンパク質プライマーの３’末端がポリメラーゼによって伸長されて、第１及び第２の二本鎖核酸、並びに核酸の第１及び第２の置換一本鎖が生成される。一本鎖安定化剤は、核酸の第１及び第２の置換された一本鎖を安定化するために使用される。一般に、第２及び第３の工程は、所望の増幅度に達するまで繰り返すことができる。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）は、核酸の等温増幅のための方法である。一般に、ＲＰＡの第１の工程では、リコンビナーゼ剤を第１及び第２の核酸プライマー並びにリコンビナーゼ負荷タンパク質と接触させて、第１及び第２の核タンパク質プライマーを形成する。一般に、第２の工程では、第１及び第２の核タンパク質プライマーを二本鎖鋳型核酸と接触させて、鋳型核酸の第１の鎖の第１の部分に第１の二本鎖構造を形成し、鋳型核酸の第２の鎖の第２の部分に第２の二本鎖構造を形成して、第１の核酸プライマー及び第２の核酸プライマーの３’末端が所与の核酸分子上で互いに向かって配向されるようにする。一般に、第３の工程では、第１及び第２の核タンパク質プライマーの３’末端がポリメラーゼによって伸長されて、第１及び第２の二本鎖核酸、並びに核酸の第１及び第２の置換一本鎖が生成される。一本鎖安定化剤は、核酸の第１及び第２の置換された一本鎖を安定化するために使用される。一般に、第２及び第３の工程は、所望の増幅度に達するまで繰り返すことができる。
ＲＰＡ法は、例えば米国特許第７，２７０，９８１号明細書、米国特許第７，３９９，５９０号明細書、米国特許第７，６６６，５９８号明細書、米国特許第７，４３５，５６１号及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／１４１９４０号明細書に広く開示されている。さらに、包括的な最近の総説については、Ｒｅｖｉｅｗ：ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ａ ｄｅｃａｄｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｌｉ，Ｊ．ら、２０１９，Ａｎａｌｙｓｔ，１４４，ｐｐ３１－６７）を参照のこと。
リコンビナーゼ剤
本発明の方法を含むＲＰＡ法は、リコンビナーゼ剤を使用する。
本発明の方法を含むＲＰＡ法は、リコンビナーゼ剤を使用する。
本発明の１つ以上のＩＤＲ－ポリペプチドのいずれも、任意のリコンビナーゼ剤に結合され／繋ぎ止められ／タグ付けされ得る。
リコンビナーゼ剤は、一本鎖核酸、典型的にはＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をコーティングして核タンパク質フィラメントを形成することができる分子、典型的には酵素である。次いで、そのようなフィラメントは、配列相同性／相補性の領域について二本鎖核酸分子、典型的にはＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を「スキャン」することができる。相補的配列が位置する場合、（リコンビナーゼ剤を含む）核タンパク質フィラメント鎖は、二本鎖核酸分子に侵入して、Ｄループとして知られる短いハイブリッド及び置換鎖バブルを形成する。
任意の適切なリコンビナーゼ剤を本明細書に記載のＲＰＡ法で使用することができ、本明細書に記載のＩＤＲアミノ酸配列のいずれかでタグ付けすることができる。
リコンビナーゼ剤は、原核生物、真核生物又はウイルス生物に由来し得る。
リコンビナーゼ剤は、ＲｅｃＡ、ＵｖｓＸ、ＲａｄＡ、ＲａｄＢ、Ｒａｄ５１、又はこれらのタンパク質のいずれかの任意の機能的バリアント、類似体、ホモログ若しくは誘導体であり得る。
これらのタンパク質の任意の組み合わせが、使用され得る。
適切なリコンビナーゼ剤には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４ ＵｖｓＸタンパク質、又は任意の門からの任意の相同タンパク質若しくはタンパク質複合体が含まれる。
真核生物ＲｅｃＡホモログは、一般に、同定されるこのグループの最初のメンバーの後にＲａｄ５１と命名される。他の非相同リコンビナーゼ剤、例えばＲｅｃＴ又はＲｅｃＯを、ＲｅｃＡの代わりに利用してもよい。
例示的なリコンビナーゼ剤には、ＲｅｃＡ及びＵｖｓＸ、並びにそれらの断片又は変異体及びそれらの組み合わせが含まれる。ＲｅｃＡ及びＵｖｓＸタンパク質は、任意の種から得ることができる。利用可能なＲｅｃＡ及びＵｖｓＳタンパク質及び核酸配列、並びに分子生物学技術を使用して、ＲｅｃＡ及びＵｖｓＸ断片又は変異タンパク質を産生することもできる。例示的なＵｖｓＸタンパク質には、Ｔ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）ファージ１３３、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）ファージ６５、シアノファージＰ－ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ－ＰＭ２、Ｒｂ１４、Ｒｂ３２、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）ファージ２５、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）ファージｎｔ－１、ｐｈｉ－１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８１、ＲＢ４９、ファージＲｂ３、及びファージＬＺ２などのミオウイルス科ファージに由来するものが含まれる。さらなる例示的なリコンビナーゼ剤には、古細菌ＲＡＤＡ及びＲＡＤＢタンパク質並びに真核生物（例えば、植物、哺乳動物及び真菌）Ｒａｄ５１タンパク質（例えば、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＤＭＣ１、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３及びｒｅｃＡ）が含まれる。
リコンビナーゼ剤は、好ましくは、ＵｖｓＸ、Ｔ４ ＵｖｓＸ、Ｔ６ ＵｖｓＸ、ＲＢ１８ ＵｖｓＸ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ファージｗＶ７ ＵｖｓＸ、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ファージＣＢ８ ＵｖｓＸ、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ファージＳｈｆｌ２ ＵｖｓＸ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ファージＡＲ１ ＵｖｓＸ、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿Ｇ４５０７ ＵｖｓＸ、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ファージＳＨＦＭＬ－１１ ＵｖｓＸ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＤａｌＣａ ＵｖｓＸ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲａｄＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲａｄＢ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒａｄ５１、又はそれらの任意の機能的バリアント、類似体、ホモログ若しくは誘導体、又はそれらの任意の組み合わせである。特に好ましいリコンビナーゼ剤は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＤａｌＣａ ＵｖｓＸである。
リコンビナーゼ剤はまた、その活性を改善するために酸性残基のＣ末端欠失を含み得る。
上記のリコンビナーゼ剤の任意の機能的バリアント、類似体、ホモログ又は誘導体は、それ自体もリコンビナーゼ剤として機能してもよく、これらの機能的バリアント、類似体、ホモログ又は誘導体は、本明細書に記載及び定義される方法で使用されるリコンビナーゼ剤としても企図される。
例えば、ＲｅｃＡからの小さなペプチドは、ＲｅｃＡの組換え特性のいくつかの態様を保持することが示されている。このペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＡの残基１９３～２１２を含み、一本鎖オリゴヌクレオチドの対合を媒介することができる。
リコンビナーゼ剤（例えば、ＵｖｓＸ）は、変異リコンビナーゼ剤又はハイブリッドリコンビナーゼ剤であり得る。ＵｖｓＸの変異型は、米国特許第８，０７１，３０８号明細書に記載されている。変異体ＵｖｓＸは、Ｒｂ６９ ＵｖｓＸアミノ酸配列に少なくとも１つの変異を含むＲｂ６９ ＵｖｓＸであってよく、変異は、（ａ）位置６４でヒスチジンではないアミノ酸、位置６４でセリン、Ｃ末端での１つ以上のグルタミン酸残基の付加、Ｃ末端での１つ以上のアスパラギン酸残基の付加、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
変異体ＵｖｓＸは、Ｔ６ ＵｖｓＸアミノ酸配列に少なくとも１つの変異を有するＴ６ ＵｖｓＸであってよく、変異は、（ａ）位置６６のヒスチジンではないアミノ酸、（ｂ）位置６６のセリン、（ｃ）Ｃ末端における１つ以上のグルタミン酸残基の付加、（ｄ）Ｃ末端における１つ以上のアスパラギン酸残基の付加、及び（ｅ）それらの組み合わせからなる群から選択される。ハイブリッドリコンビナーゼ剤が使用される場合、ハイブリッドタンパク質は、例えば、異なるＵｖｓＸ種に由来するアミノ酸配列を含む少なくとも１つの領域を含むＵｖｓＸタンパク質であり得る。領域は、例えば、ＵｖｓＸのＤＮＡ結合ループ－２領域であり得る。
所望であれば、リコンビナーゼ剤は、温度感受性（本明細書では「ｔｓ」と呼ばれる）リコンビナーゼ剤であってもよい。ｔｓリコンビナーゼ剤を使用する場合、ＲＰＡ反応は、ある温度（許容温度）で開始し、別の温度（非許容温度）で終了することができる。許容温度の組み合わせは、例えば、２５℃／３０℃、３０℃／３７℃、３７℃／４２℃などであり得る。ｔｓタンパク質は可逆的であり得る。可逆的なｔｓタンパク質の活性は、非許容温度から許容温度に移行すると回復する。
任意のリコンビナーゼ剤濃度を使用することができるが、好ましいリコンビナーゼ濃度は、例えば、０．２～１２μＭ、６～１２μＭ、４～１２μＭ及び４～６μＭ、好ましくは約５μＭ、より好ましくは約４．８μＭの範囲であり得る。
リコンビナーゼ剤は、一般に、ＡＴＰ、ＡＴＰγＳ、又は他のヌクレオシド三リン酸若しくはそれらの類似体の存在を必要とする。リコンビナーゼ剤は、Ｄループ刺激合成のラウンドの直後に標的部位の再生が起こり得る反応環境で使用されることが好ましい。リコンビナーゼ分解を伴う完了した組換えイベントは、一方の末端から他方の末端への振動片側合成によって引き起こされるｓｓＤＮＡの増幅の失速又は非常に非効率的な線形増幅を回避する。
天然変性領域を含むアミノ酸タグ配列でタグ付けされた例示的なＵｖｓＸリコンビナーゼ剤を下記のTable 21に示す。
Table 21
Table 21
リコンビナーゼ負荷タンパク質
本発明の方法を含むＲＰＡ法は、リコンビナーゼ負荷タンパク質をさらに含み得る／使用し得る。
本発明の方法を含むＲＰＡ法は、リコンビナーゼ負荷タンパク質をさらに含み得る／使用し得る。
任意の適切なリコンビナーゼ負荷タンパク質が、本明細書中に記載されるＲＰＡ法において使用される場合がある。
本発明の１つ以上のＩＤＲ－ポリペプチドのいずれかは、任意のリコンビナーゼ負荷タンパク質に結合され／繋ぎ止められ／タグ付けされ得る。
リコンビナーゼ負荷タンパク質は、原核生物、ウイルス生物又は真核生物に由来し得る。例示的なリコンビナーゼ負荷タンパク質としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＯ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＲ、ＵｖｓＹ、及びそれらの変異体若しくは断片、又はそれらの組み合わせが挙げられる。例示的なＵｖｓＹタンパク質には、Ｔ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）ファージ１３３、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）ファージ６５、シアノファージＰ－ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ－ＰＭ２、Ｒｂ１４、Ｒｂ３２、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）ファージ２５、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）ファージｎｔ－１、ｐｈｉ－１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３、及びファージＬＺ２などのミオウイルス科ファージに由来するものが含まれる。
好ましいリコンビナーゼ負荷タンパク質は、ＵｖｓＹ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＯ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＲ、又はこれらのタンパク質のいずれかの任意の機能的バリアント、類似体、ホモログ若しくは誘導体である。特に好ましいＵｖｓＹリコンビナーゼ負荷タンパク質は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ファージＳＴＯ ＵｖｓＹである。
これらのタンパク質のいずれかの任意の組み合わせを使用してもよい。
これらのタンパク質の好ましい濃度は、０．１～２４μＭ、６～２４μＭ、４～２４μＭ及び４～１２μＭ、好ましくは約１０μＭ、より好ましくは約８．６μＭである。リコンビナーゼ負荷タンパク質は、リコンビナーゼ剤のマイクロモル濃度の約０．５～約２倍で存在し得る。
天然変性領域を含むアミノ酸タグ配列でタグ付けされた例示的なＵｖｓＹリコンビナーゼ負荷タンパク質を以下のTable 22に示す。
Table 22
Table 22
一本鎖安定化剤
本発明の方法を含むＲＰＡ法は、一本鎖安定化剤を使用する。
本発明の方法を含むＲＰＡ法は、一本鎖安定化剤を使用する。
任意の適切な一本鎖安定化剤（一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）が、本明細書中に記載されるＲＰＡ法において使用される場合がある。
本発明の１つ以上のＩＤＲ－ポリペプチドのいずれも、任意の一本鎖安定化剤に結合され／繋ぎ止められ／タグ付けされ得る。
一本鎖安定化剤は、ＲＰＡ反応中に起こる様々な交換反応中に核酸を安定化するために使用される。特に、リコンビナーゼ／ｓｓＤＮＡ核タンパク質フィラメントを安定化するために、一本鎖安定化剤が使用される。
一本鎖安定化剤は、任意の種、例えば原核生物種、ウイルス種又は真核生物種から誘導される又は得ることができる。
一本鎖安定化剤には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、並びにＴ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）ファージ１３３、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）ファージ６５、シアノファージＰ－ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ－ＰＭ２、Ｒｂ１４、Ｒｂ３２、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）ファージ２５、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）ファージｎｔ－１、ｐｈｉ－１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８１、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３、及びファージＬＺ２などのミオウイルス科ファージに由来するものが含まれる。一本鎖安定化剤のさらなる例としては、Ａ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ Ａｌｉｄｅ＿２０４７、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＢｔｈａＢ＿３３９５１、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｐｏｌｌｅｎｓ ＨＭＰＲＥＦ ９１４４＿０１２４、及び真核生物一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質複製タンパク質Ａが挙げられる。
好ましい一本鎖安定化剤は、Ｇｐ３２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢタンパク質、ファージＴ４ Ｇｐ３２タンパク質、ファージＲｂ６９ Ｇｐ３２、ファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＮＢＧ１ Ｇｐ３２、若しくはそれらの誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特に好ましい一本鎖安定化剤は、Ｇｐ３２であり、特にファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＮＢＧ１ Ｇｐ３２である。
これらのタンパク質のいずれかの任意の組み合わせを使用してもよい。
一本鎖安定化剤の１つの好ましい濃度は、約５～３０μＭ、例えば約８．６μＭ、好ましくは約１５～２５μＭ、より好ましくは約２０μＭである。
天然変性領域を含むアミノ酸タグ配列でタグ付けされた例示的なＧｐ３２一本鎖安定化剤を以下のTable 23に示す。
Table 23
Table 23
ポリメラーゼ
本発明のものを含むＲＰＡ法は、ポリメラーゼを使用する。
本発明のものを含むＲＰＡ法は、ポリメラーゼを使用する。
本明細書に記載の方法では、任意の適切なポリメラーゼを使用することができる。
本発明の１つ以上のＩＤＲ－ポリペプチドのいずれかは、任意の適切なポリメラーゼに結合され／繋ぎ止められ／タグ付けされ得る。
ＤＮＡの合成又は増幅には、ＤＮＡポリメラーゼが好ましく用いられる。
ＲＰＡ反応の１つの利点は、使用できるポリメラーゼのタイプにおける制限がないことである。例えば、真核生物、原核生物及びバクテリオファージポリメラーゼを使用することができる。
ＤＮＡポリメラーゼは、真核生物ポリメラーゼであり得る。使用され得る真核生物ポリメラーゼの例としては、ｐｏｌ－α、ｐｏｌ－β、ｐｏｌ－δ、ｐｏｌ－ε又はその任意の機能的バリアント、類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
ＤＮＡポリメラーゼは、原核生物ポリメラーゼであり得る。使用され得る原核生物ポリメラーゼの例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡ、ポリメラーゼＩクレノウ断片、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＶ、バチルス・ステアロテノフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＩ大断片、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｐｏｌ Ｉ大断片（Ｂｓｕポリメラーゼ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｓａｕ）又はそれらの任意の機能的バリアント、類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
ＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージポリメラーゼであり得る。本明細書に記載の方法で使用され得るバクテリオファージポリメラーゼの例には、Ｐｈｉ－２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４ ｇｐ４３ ＤＮＡポリメラーゼ、又はその任意の機能的バリアント、類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。
ＤＮＡポリメラーゼは、典型的には鎖置換特性を含む。
ＤＮＡポリメラーゼは、侵入鎖の遊離３’－ヒドロキシルを使用して、新しいヌクレオチドの取り込みによるＤＮＡ合成を触媒することができる。いくつかのポリメラーゼは、侵入鎖の３’－ヒドロキシルを使用して合成を触媒し、同時に合成が起こるにつれて他方の鎖を置換することができる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩを使用して、侵入したＤループを伸長させることができる。さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＳＯＳ病変標的変異で通常使用される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼＶを使用することができる。これらのポリメラーゼはすべて、β二量体クランプ並びに一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）及び他の成分との相互作用及び協働によって高度にプロセッシブにすることができる。原核生物、ウイルス及び真核生物由来の他のポリメラーゼもまた、侵入鎖を伸長するために使用することができる。
多くのＤＮＡポリメラーゼは３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、一部は５’－３’エキソヌクレアーゼ活性も有し、これはポリメラーゼが置換ではなく前進するにつれて一方のＤＮＡ鎖の消化を徐々にもたらすため、ＲＰＡ反応では望ましくない。
３’－５’エキソヌクレアーゼには、潜在的な利点及び明らかな欠点がある。一方では、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性は、複製反応の忠実度を高め、誤取り込み点でのポリメラーゼの失速も防ぐことができる。高忠実度増幅は、多くのＤＮＡ用途に望ましい。３’－５’エキソヌクレアーゼ活性はまた、誤取り込みによる失速が効果的な増幅を阻害し得るより大きなＤＮＡ断片の増幅のために適切であり得る。
３’－５’エキソヌクレアーゼ活性のこれらの明らかな利点にもかかわらず、いくつかの欠点がある。遊離オリゴヌクレオチドは、３’－５’エキソヌクレアーゼを有するポリメラーゼが使用される場合、末端依存性分解を受け得る。
反応ノイズは、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを利用することによって低減することができる。これは、誤プライミングが、ポリメラーゼの３’－５’エキソヌクレアーゼ活性によって短縮されたオリゴヌクレオチドに起因し得ることを示唆している。その結果、３’－５’エキソヌクレアーゼ編集活性、ピロリン酸化、又は任意の他の同様の編集活性がノイズ源となり得る。これは、飽和量の比較的協同的なＧｐ３２タンパク質をクレノウ断片などのいくつかのポリメラーゼと共に使用することによって大幅に抑制することができる。それにもかかわらず、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、本明細書に記載の方法で使用するためのポリメラーゼが提供され得る。
ＤＮＡポリメラーゼは、１０，０００単位／ｍｌ～１０単位／ｍｌ、例えば５０００単位／ｍｌ～５００単位／ｍｌの濃度で存在し得る。
補助剤
本発明のものを含むＲＰＡ反応は、補助剤をさらに利用し得る。
本発明のものを含むＲＰＡ反応は、補助剤をさらに利用し得る。
本発明の１つ以上のＩＤＲ－ポリペプチドのいずれも、任意の補助剤に結合され／繋ぎ止められ／タグ付けされ得る。
これらの補助剤には、一本鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リゾルベース及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。そのような薬剤は、核酸に対してそれぞれ巻き戻し、弛緩及び分離活性を有し得る。
補助剤はまた、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ、ＲｅｃＧ、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＴ、ＤｎａＢ、ＤｎａＣ、ＤｎａＧ、ＤｎａＸクランプローダ、ポリメラーゼコア複合体、ＤＮＡリガーゼ及びスライディングクランプ並びにそれらの任意の組み合わせを含み得る。スライディングクランプは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β－二量体スライディングクランプ、真核生物ＰＣＮＡスライディングクランプ、又はＴ４スライディングクランプｇｐ４５及びそれらの組み合わせであり得る。補助剤としては、さらに、β－Ｃｌａｍｐ、ＤｎａＸ Ｃｌａｍｐ Ｌｏａｄｅｒ、及びＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｏｒｅ ＣｏｍｐｌｅｘからなるＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素複合体が挙げられ得る。これらの後者の補助剤は、先行するＲＰＡ及び後行するＲＰＡの実施を可能にする。
ＲＰＡ反応は、ＤＮＡ合成の開始後にリコンビナーゼ剤／ｄｓＤＮＡ複合体の効率的な分解を促進することができる１つ以上の追加の酵素を用いて実施することができる。これらの酵素には、３’から５’への分解を刺激することができるもの及び５’から３’への分解を支持することができるものが含まれる。
そのような追加の酵素には、ＲｅｃＡを３’から５’方向に置換することができ、リコンビナーゼ剤／ｄｓＤＮＡ複合体の３’から５’への分解を刺激することができるいくつかのポリメラーゼが含まれる。これらのＤＮＡポリメラーゼには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰｏｌＶ及び他の種の相同ポリメラーゼが含まれる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰｏｌＶ又はその任意の機能的バリアント、類似体、ホモログ若しくは誘導体を含めることにより、増幅効率を改善することができる。
他の酵素には、ｄｓＤＮＡからのＲｅｃＡの分解を促進するために使用することができるヘリカーゼと呼ばれる酵素のクラスが含まれる。これらは、５’から３’及び３’から５’方向の両方で分解を促進する。中間体からのＲｅｃＡの分解を刺激するための理想的なヘリカーゼ複合体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質ＲｕｖＡ及びＲｕｖＢからなる。ＲｕｖＡＢ複合体は分枝移動を促進し、ＲｅｃＡタンパク質を解離させ、ＲｅｃＡをリサイクルすることを可能にする。ＲｕｖＡＢのＲＰＡ混合物への組み込みは、鎖交換及び置換後のｄｓＤＮＡからのＲｅｃＡの解離を促進することができ、同じ部位からの複製鋳型の新たな合成を可能にする。さらに、ＲｕｖＡＢ複合体は、ＲｕｖＣと協調して作用し、最終的にホリデイジャンクションを切断及び分解することができる。ＲｕｖＣをＲＰＡ反応混合物に添加することにより、侵入部位に形成されたホリデイジャンクションなどの複雑な構造を分解することができる。
さらに他の酵素には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＧタンパク質が含まれる。ＲｅｃＧは、分岐構造の分解を刺激することができる。
ＲＰＡ反応混合物に有用な他の酵素は、ＡＴＰ及び一本鎖安定化剤の存在下で、ＲｅｃＡ核タンパク質フィラメントの連続的な生成を可能にするものである。したがって、ＲｅｃＯ及びＲｅｃＲ、並びに任意にＲｅｃＦタンパク質を使用することができる。
エキソヌクレアーゼ酵素は、ＲＰＡ反応混合物に含まれることが多い。これらは、切断可能なプローブの効率的な操作のために含まれる。一般的に使用されるエキソヌクレアーゼ酵素の一例は、エキソヌクレアーゼＩＩＩである。本発明のＩＤＲポリペプチドのいずれも、任意のエキソヌクレアーゼに結合され／繋ぎ止められ／タグ付けされ得る。
プライマー
ＲＰＡ法は、ポリメラーゼを使用して鋳型核酸分子のコピーを生成する。したがって、本発明の方法を含むＲＰＡ法は、ポリメラーゼによる伸長を開始するためにプライマーを使用する。
ＲＰＡ法は、ポリメラーゼを使用して鋳型核酸分子のコピーを生成する。したがって、本発明の方法を含むＲＰＡ法は、ポリメラーゼによる伸長を開始するためにプライマーを使用する。
ほとんどの核酸ポリメラーゼは、組み込みが、新しい合成部位に隣接する短いストレッチの二本鎖核酸の末端糖上の遊離３’－ヒドロキシル部分を必要とすることが必要である。この二本鎖核酸のストレッチは、典型的には、ポリメラーゼ合成反応の開始部位として働くプライマーと呼ばれる相補的配列を典型的に有する短いオリゴヌクレオチドによって鋳型上に形成される。場合によっては、合成反応を刺激するために、スルフィドリルなどの３’修飾を利用することができる。鋳型と塩基対合し、ポリメラーゼによって伸長されるプライマー核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。典型的には、インビトロ反応のために、プライマーは、短い、しばしば化学合成される一本鎖ＤＮＡ（又は修飾ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）として供給され、通常、オリゴヌクレオチドプライマーと呼ばれる。プライマーは、特定の配列であることが多いが、ランダムプライマーも使用することができる。プライマーは、その特異的な塩基対合能によって相補的配列を標的とする。オリゴヌクレオチドプライマーと標的核酸との間のハイブリッドの形成は、典型的には、自発的アニーリングを可能にする塩、ｐＨ及び温度の条件下での溶液中での２つのインキュベーションによって形成される。
ＲＰＡにおいて使用されるプライマーは、リコンビナーゼ剤の存在下で標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーションのための一本鎖領域を有し得る。一本鎖領域は、例えば、約１０塩基、約１５塩基、約２０塩基、約２５塩基、約３０塩基、約４０塩基及び約５０塩基であり得る。さらにより長い領域、例えば、約７５塩基、約１００塩基、約１５０塩基又はそれを超えるものが、理論的には使用され得る。一本鎖領域の選択は、例えば、ヒトゲノムはより長いプライマーを必要とし得るが、プラスミドははるかに短いプライマーを必要とし得るように、出発核酸の複雑さに依存する。
好ましいプライマー長は、約３０～約５０塩基である。例えば、３０塩基～４５塩基、３０塩基～４０塩基、３０塩基～３５塩基、３５塩基～４０塩基、４０塩基～４５塩基及び４５塩基～５０塩基である。上に表記されたプライマー長が示されている一方で、３０塩基未満の最適プライマー長を有するリコンビナーゼ及び／又は一本鎖結合タンパク質も可能であり、想定される。
ＲＰＡで使用されるプライマーは、好ましくはＤＮＡであるが、ＰＮＡ及びＲＮＡもプライマーとしての使用に適している。実際、天然のＤＮＡ複製では、ＤＮＡポリメラーゼはＲＮＡプライマーからの伸長によってゲノムＤＮＡを伸長させることに留意されたい。
プライマーは、標準的な技術に従って合成され得る。修飾塩基及び／又はリンカー骨格の化学が望ましい場合があり、場合によっては機能的であり得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、様々な目的に役立つ基、例えば、蛍光基、クエンチャー、保護（ブロッキング）基（可逆的又は非可逆的）、磁気タグ、タンパク質などで５’又は３’のいずれかの末端で修飾され得る。場合によっては、一本鎖オリゴヌクレオチドを鎖侵入に使用してもよく、他の場合では部分的に一本鎖核酸のみを使用してもよく、侵入核酸の５’ストレッチの配列は、オリゴヌクレオチドに既にハイブリダイズしている。
プライマーは、標的核酸と相同でない５’領域を含み得る。プライマーが標的核酸に完全に相補的でなくても、増幅が達成され得ることに留意されたい。プライマーは、それらの５’末端に追加の配列を有することによって非相補的であり得る。これらの追加の配列は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位のための配列又は配列決定プライマーに相補的である配列であり得る。制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、増幅された配列のその後の切断に有用であり得る。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の外側で核酸を切断する制限エンドヌクレアーゼの使用も考えられる。配列決定プライマーに相補的である配列は、市販のプライマー又は市販の配列決定装置を使用して、増幅産物の迅速なＤＮＡ配列決定を可能にし得る。
インビトロＤＮＡ合成反応で使用するためのオリゴヌクレオチドを設計するためのソフトウェアは、特にＰＣＲで使用するために十分に立証されている。ＲＰＡ法の考慮事項は同様であり、オリゴヌクレオチドの融解温度の最適化、オリゴヌクレオチド内のヘアピン形成の回避、及び所与の反応に存在する他のオリゴヌクレオチドとの相補性に対する選択が含まれる。したがって、望ましくない副反応を避けるためにオリゴヌクレオチドプライマー対を設計することが重要である。
オリゴヌクレオチド配列設計の最適化に加えて、プライマーダイマー形成を低減又は排除するためのさらなるアプローチがある。本明細書の他の箇所で述べられるように、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを利用することによって、反応ノイズを低減することができる。これは、誤プライミングが、ポリメラーゼの３’－５’エキソヌクレアーゼ活性によって短縮されたオリゴヌクレオチドに起因し得ることを示唆している。その結果、３’－５’エキソヌクレアーゼ編集活性、ピロリン酸化、又は任意の他の同様の編集活性がノイズ源となり得る。エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼの使用及びピロホスファターゼによるピロリン酸の除去に加えて、最終及び／又は最後から２番目の結合に非加水分解性骨格を有する合成オリゴヌクレオチドの使用は、反応ノイズを低減するのに有益であり得る。代替の骨格は、ホスホロチオアート、モルホリノ、ロックド核酸又はペプチド核酸などの利用可能なかなりの範囲の化学から選択することができる。
ＲＰＡ反応に使用するための試薬
本発明のものを含む、ＲＰＡ法で使用するための試薬を以下に概説する。
本発明のものを含む、ＲＰＡ法で使用するための試薬を以下に概説する。
ｄＮＴＰｓ
ｄＮＴＰ、例えばｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、並びにそれらの誘導体及び類似体を、ＲＰＡ反応に添加することができる。リーディング鎖及びラギング鎖では、ＲＮＡプライマーの合成のために、ＲＰＡ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰも含まれ得る。さらに、ｄｄＮＴＰ（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＧＴＰ並びにそれらの誘導体及び類似体）を使用して、断片ラダーを生成することができる。
ｄＮＴＰ、例えばｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、並びにそれらの誘導体及び類似体を、ＲＰＡ反応に添加することができる。リーディング鎖及びラギング鎖では、ＲＮＡプライマーの合成のために、ＲＰＡ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰも含まれ得る。さらに、ｄｄＮＴＰ（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＧＴＰ並びにそれらの誘導体及び類似体）を使用して、断片ラダーを生成することができる。
ｄＮＴＰは、各ＮＴＰ種の１ｍＭ～２００ｍＭの濃度で使用され得る。
ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物を、ｄＮＴＰの濃度の１／１００～１／１０００のｄｄＮＴＰ濃度（１ｍＭ～２００ｍＭ）で使用してもよい。
ＲＰＡは、ＡＴＰ、加水分解性ＡＴＰ類似体、又は別のヌクレオシド三リン酸の存在下で実施され得る。ＡＴＰ類似体は、例えば、ｄＡＴＰ、ｄｄＡＴＰ、又はＵＴＰなどの別のヌクレオシド三リン酸類似体であり得る。
還元剤
ＲＰＡ反応に使用され得る還元剤としては、ＤＴＴが挙げられる。ＤＴＴ濃度は、１ｍＭ～１０ｍＭ、好ましくは１ｍＭであり得る。
ＲＰＡ反応に使用され得る還元剤としては、ＤＴＴが挙げられる。ＤＴＴ濃度は、１ｍＭ～１０ｍＭ、好ましくは１ｍＭであり得る。
ＡＴＰ
ＡＴＰ又はＡＴＰ類似体は、ＲＰＡ反応に使用され得る。
ＡＴＰ又はＡＴＰ類似体は、ＲＰＡ反応に使用され得る。
ＡＴＰ又はＡＴＰ類似体は、ＡＴＰ、ＡＴＰ－γ－Ｓ、ＡＴＰ－β－Ｓ、ｄｄＡＴＰ又はそれらの組み合わせのいずれかであり得る。好ましいＡＴＰ又はＡＴＰ類似体濃度は、１ｍＭ～１０ｍＭ、好ましくは２．５ｍＭである。
ＡＴＰ再生のための系
ＲＰＡ反応の他の成分は、ＡＴＰ再生のための系（すなわち、ＡＤＰをＡＴＰに変換する系）を含み得る。そのような系は、例えば、ホスホクレアチン及びクレアチンキナーゼであり得る。
ＲＰＡ反応の他の成分は、ＡＴＰ再生のための系（すなわち、ＡＤＰをＡＴＰに変換する系）を含み得る。そのような系は、例えば、ホスホクレアチン及びクレアチンキナーゼであり得る。
リコンビナーゼは核酸に結合したときに極めて高いＡＴＰ加水分解速度を有するので、ＡＴＰ再生系は持続的な組換え反応を可能にする。特に、ＵｖｓＸタンパク質は、ＲｅｃＡよりも１０～２０倍高い加水分解速度を有し、モノマーあたり毎分２００分子のＡＴＰを消費することができる。多数の系が利用可能である。クレアチンキナーゼ／ホスホクレアチン系が好ましい。ＵｖｓＸが使用される場合、産生されたＡＭＰはＡＴＰに変換され得る。ニワトリのミオキナーゼをさらに使用してもよく、これはＡＭＰの分子及びＡＴＰの１つを２分子のＡＤＰに変換する。次いで、クレアチンキナーゼ／ホスホクレアチン系を使用してＡＤＰをＡＴＰに変換することができる。ＡＴＰの再生不良は、反応速度を低下させ得る。
本明細書に記載のＲＰＡ法では、ホスホクレアチンは、好ましくは１５～２５ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭの濃度で使用される。クレアチンキナーゼは、好ましくは約０．２５～５．０μＭ、より好ましくは１μＭの濃度で使用される。
多価金属カチオン
ＲＰＡ反応における緩衝液は、多価金属カチオンを含むことが好ましい。緩衝液は、多価金属カチオンの機能的等価物を含み得る。
ＲＰＡ反応における緩衝液は、多価金属カチオンを含むことが好ましい。緩衝液は、多価金属カチオンの機能的等価物を含み得る。
ＲＰＡ反応における緩衝液は、二価金属カチオンを含むことがより好ましい。緩衝液は、二価金属カチオンの機能的等価物を含み得る。
任意の適切な多価若しくは二価金属カチオン又はその機能的等価物を、単剤又は薬剤の組み合わせとして使用することができる。
ＲＰＡ反応におけるＩＤＲ媒介相分離の促進／増強において最適な結果を達成する特定の多価若しくは二価金属カチオン又はその機能的等価物、及び使用される多価／二価金属カチオンの特定の濃度は、使用される特定のＩＤＲポリペプチドに依存し得る。最適な多価／二価金属カチオン又はその機能的等価物、及びその最適な濃度は、ＲＰＡ反応自体及び／又は本明細書にさらに記載される相分離アッセイを含む日常的な試験を使用して経験的に立証することができる。
二価金属カチオンは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋又はＣｕ２＋であり得る。これらのカチオンは、いずれも単剤で用いてもよく、又は、カチオンの組み合わせを用いてもよい。好ましくは、それらは単剤として使用される。好ましい二価金属カチオンは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋及びＣａ２＋である。特に好ましい二価金属カチオンは、Ｍｇ２＋である。
好ましい濃度範囲は、３０～４０ｍＭ、より好ましくは３３～３９ｍＭである。
緩衝液は、好ましくは示された濃度でＭｇ２＋イオンを含有し得る。より好ましくは、緩衝液は、示された濃度でＭｇＯＡｃを含有する。
緩衝液は、好ましくは示された濃度でＣａ２＋イオンを含有し得る。より好ましくは、緩衝液は、示された濃度でＣａＣｌ２を含有する。
緩衝液は、好ましくは示された濃度でＭｎ２＋イオンを含有し得る。より好ましくは、緩衝液は、表示濃度のＭｎＣｌ２を含有する。
緩衝液
ＲＰＡ反応における緩衝液は、トリス－ＨＣｌ緩衝液、トリス－酢酸塩緩衝液、又はそれらの組み合わせであり得る。緩衝液は、約１０ｍＭ～約１００ｍＭの濃度で存在し得る。好ましい緩衝液は、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、最も好ましくは２５ｍＭの濃度で使用されるトリス－ＨＣｌ緩衝液である。緩衝化したｐＨは、６．５～９．０の間、好ましくはｐＨ８．３であり得る。
ＲＰＡ反応における緩衝液は、トリス－ＨＣｌ緩衝液、トリス－酢酸塩緩衝液、又はそれらの組み合わせであり得る。緩衝液は、約１０ｍＭ～約１００ｍＭの濃度で存在し得る。好ましい緩衝液は、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、最も好ましくは２５ｍＭの濃度で使用されるトリス－ＨＣｌ緩衝液である。緩衝化したｐＨは、６．５～９．０の間、好ましくはｐＨ８．３であり得る。
緩衝液は、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ～約４０ｍＭの酢酸カリウムを含有し得る。
反応成分
ＲＰＡ反応のための反応成分の好ましいが限定されないセットは以下の通りである。
トリスＨＣｌ ｐＨ８．３ ２５ｍＭ
ＫＯＡｃ ７．５ｍＭ
ＤＴＴ １ｍＭ
ＡＴＰ ２．５ｍＭ
ホスホクレアチン ２０ｍＭ
クレアチンキナーゼ １μＭ
ｄＮＴＰｓ １ｍＭ
Ｇｐ３２ ２０μＭ
ＵｖｓＸ ４．８μＭ
ＵｖｓＹ ８．６μＭ
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｓａｕ）０．１３５μＭ
又はＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｂｓｕ）
エキソヌクレアーゼＩＩＩ ０．２７μＭ
ＭｇＯＡｃ ３３ｍＭ
フォワードプライマー ０．４μＭ
リバースプライマー ０．４μＭ
エキソプローブ ０．１２μＭ
ＲＰＡ反応のための反応成分の好ましいが限定されないセットは以下の通りである。
トリスＨＣｌ ｐＨ８．３ ２５ｍＭ
ＫＯＡｃ ７．５ｍＭ
ＤＴＴ １ｍＭ
ＡＴＰ ２．５ｍＭ
ホスホクレアチン ２０ｍＭ
クレアチンキナーゼ １μＭ
ｄＮＴＰｓ １ｍＭ
Ｇｐ３２ ２０μＭ
ＵｖｓＸ ４．８μＭ
ＵｖｓＹ ８．６μＭ
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｓａｕ）０．１３５μＭ
又はＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｂｓｕ）
エキソヌクレアーゼＩＩＩ ０．２７μＭ
ＭｇＯＡｃ ３３ｍＭ
フォワードプライマー ０．４μＭ
リバースプライマー ０．４μＭ
エキソプローブ ０．１２μＭ
ＲＰＡ反応条件
本発明の反応物を含むＲＰＡ反応物は、任意の適切な長さの時間インキュベートすることができる。
本発明の反応物を含むＲＰＡ反応物は、任意の適切な長さの時間インキュベートすることができる。
ＲＰＡ反応物のいずれも、５分～１６時間又はそれ以上、例えば１５分～３時間又は３０分～２時間インキュベートすることができる。
インキュベーションは、所望の増幅度が達成されるまで行われ得る。所望の増幅度は、１０倍、１００倍、１０００倍、１万倍、１０万倍又は１００万倍の増幅であり得る。
ＲＰＡの１つの利点は、ＰＣＲなどの熱サイクルを必要とする技術と比較して、反応を低温で行うことができることである。ＲＰＡのさらなる利点は、温度が重要ではなく、正確な制御が好ましいが、絶対的に必要ではないことである。例えば、現場環境では、室温又は体温に近い温度（３５℃～３８℃）で、例えば試料を身体の隙間に置くことによって、ＲＰＡ反応をインキュベートすれば十分である。また、ＲＰＡ反応は、鋳型核酸の温度誘導融解を伴わずに行ってもよい。
したがって、ＲＰＡ反応のいずれも、任意の適切な温度で行うことができる。
ＲＰＡ反応は、４５℃未満で行われてもよい。ＲＰＡ反応は、４０℃未満で行われてもよい。ＲＰＡ反応は、３５℃未満で行われてもよい。ＲＰＡ反応は、３０℃未満で行われてもよい。
ＲＰＡ反応は、２０℃～５０℃、２０℃～４０℃、例えば２０℃～３０℃で行うことができる。
ＲＰＡ反応成分の凍結乾燥
ＲＰＡ反応の１つの利点は、クラウディング剤（使用される場合）及び緩衝液を除いて、使用前に試薬を凍結乾燥する（すなわち、凍結乾燥される）ことができることである。凍結乾燥試薬は、活性を維持するために冷蔵を必要としないという利点を提供する。例えば、ＲＰＡ試薬のチューブを室温で保存することができる。この利点は、冷蔵へのアクセスが制限される現場条件において特に有用である。
ＲＰＡ反応の１つの利点は、クラウディング剤（使用される場合）及び緩衝液を除いて、使用前に試薬を凍結乾燥する（すなわち、凍結乾燥される）ことができることである。凍結乾燥試薬は、活性を維持するために冷蔵を必要としないという利点を提供する。例えば、ＲＰＡ試薬のチューブを室温で保存することができる。この利点は、冷蔵へのアクセスが制限される現場条件において特に有用である。
ＲＰＡ試薬は、チューブの底部、又はビーズ若しくは任意の他の適切なタイプの固体支持体上で凍結乾燥させることができる。ＲＰＡ反応を行うために、凍結乾燥試薬は、凍結乾燥試薬の組成に応じて、緩衝化した溶液中及びクラウディング剤（使用される場合）、又は単に緩衝液若しくは水で再構成される。次いで、標的核酸、又は標的核酸を含むと疑われる試料を添加する。再構成液は、試料核酸を含んでいてもよい。再構成された反応物を一定期間インキュベートし、増幅された核酸（存在する場合）を検出する。
本明細書中に記載されるＲＰＡ法のいずれか１つでは、使用前に凍結乾燥され得る試薬としては、リコンビナーゼ剤、リコンビナーゼ負荷タンパク質、一本鎖安定化剤、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ又はｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、還元剤、ＡＴＰ又はＡＴＰ類似体、プライマー及びプローブが、少なくとも挙げられる。
凍結乾燥混合物は、凍結乾燥性能及び貯蔵寿命を改善するために、例えば再構成反応において２０ｍＭ～２００ｍＭ、最適には４０ｍＭ～８０ｍＭのトレハロース糖などの安定化剤を含んでよい。必要に応じて、凍結乾燥された試薬は、使用前に１日、１週間、１ヶ月又は１年以上保存されてもよい。
ＲＰＡ試薬などの生化学反応試薬は、クラウディング剤と共に凍結乾燥されてもよい。しかしながら、凍結乾燥混合物中のクラウディング剤の省略を正当化し得る複雑な相互に関連する問題が存在し得る。例えば、ユーザは、凍結乾燥クラウディング剤の効果的な再水和において困難を経験することがあり、又はユーザは、より大きな凍結乾燥ペレットの必要性を含む他の有害な影響を経験することがある。したがって、とりわけ、ペレットサイズの縮小、より短いサイクル時間、及びより容易な再水和を含む凍結乾燥材料からクラウディング剤の一部又は全部を除外することができるという利点があり得る。しかしながら、これは、使用される場合には、生化学反応混合物を再水和して使用のために調製した後に、使用前に新鮮なクラウディング剤を添加する必要があるという結果として生じる欠点を有する。これは、ポイントオブケア使用又は現場使用などの特定の状況で問題となる可能性がある。本発明のＩＤＲベースの試薬の利点は、凍結乾燥設定ではクラウディング剤と同じ欠点を示すことが予想されず、したがって他の生化学反応成分で容易に凍結乾燥することができ、したがって使用前に新鮮な追加の試薬を添加する必要がなくなることである。
ＲＰＡ反応生成物の検出
ＲＰＡ反応生成物の検出は、任意の適切な方法を使用して実施され得る。
ＲＰＡ反応生成物の検出は、任意の適切な方法を使用して実施され得る。
例えば、検出は、アガロース又はＰＡＧＥゲルでの電気泳動とそれに続く臭化エチジウム染色を用いて行われ得る。
ＲＰＡ反応のモニタリングは、例えば、ＲＰＡの画分の除去、反応、組み込まれていない画分の単離、及び組み込まれていないプライマーの検出を含み得る。組み込まれていないプライマーのサイズは、５０ｂｐ未満、４０ｂｐ未満、３０ｂｐ未満又は２５ｂｐ未満であってよく、増幅産物のサイズは、１Ｋｂ超、２Ｋｂ超、５Ｋｂ超又は１０Ｋｂ超であり得るので、組み込まれたプライマーと組み込まれていないプライマーとの間に大きなサイズ差がある。組み込まれていないプライマーの単離は、例えば、スピンカラムなどのサイズ排除クロマトグラフィーを使用して迅速に行われ得る。プライマーが標識されている場合、スピンカラム及び測定（例えば、蛍光又は放射能）を含むモニター手順を１分未満で行うことができる。
伸長したプライマーを伸長していないプライマーから分離するための別の代替法は、ＰＡＧＥの使用を含む。例えば、伸長したプライマーは、ゲル電気泳動によって５分未満で伸長していないプライマーから分離され得る。
伸長したプライマーを分離するためのさらに別の代替法は、固定化されたオリゴヌクレオチドの使用を含む。例えば、増幅されたＤＮＡ配列内に固有に見られる配列に相同なオリゴヌクレオチドを使用して、プライマー伸長によって生成された核酸を特異的に捕捉することができる。これらの捕捉オリゴヌクレオチドは、チップ又は他の基質上に固定化することができる。捕捉オリゴヌクレオチドによる伸長オリゴヌクレオチドの捕捉は、ＲｅｃＡタンパク質媒介法によって、又は必要に応じて従来の溶液ハイブリダイゼーションによって行うことができる。
蛍光プローブの使用は、最も一般的に使用され、ＲＰＡ増幅産物の検出に好ましく、リアルタイム検出を提供するという利点を有する。
これらのプローブは、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン（ＦＡＭ））及びクエンチャー（例えば、ブラックホールクエンチャー）で、フルオロフォアに近接して標識される。プローブは、ポリメラーゼによるプローブからの伸長を防止するために３’末端にブロッキング基を有する。プローブが切断され、クエンチャーとフルオロフォアが分離されると、蛍光シグナルが検出され、リアルタイム検出が可能になる。プローブは脱塩基部位、典型的にはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）又はｄＲ基を含有し、切断は脱塩基部位で、典型的には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＴＨＦで切断）又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｆｐｇ（グリコリアーゼ／リアーゼ）（ｄＲ基で切断）によって起こる。
ＲＰＡ反応成分を含むキット
本発明はまた、ＲＰＡ反応を行うためのキットを提供する。
本発明はまた、ＲＰＡ反応を行うためのキットを提供する。
キットは、上記の濃度のいずれか１つのＲＰＡにおいて本明細書に記載される試薬のいずれかを含み得る。
キットは、本明細書に記載及び定義されるＩＤＲ－タグ付き巨大分子及び／又はＩＤＲ－タグ付きポリペプチドのいずれかを含み得る。好ましくは、キットは、ＲＰＡリコンビナーゼ剤、及び／又はＲＰＡリコンビナーゼ負荷タンパク質、及び／又はポリメラーゼ、及び／又は第１及び第２の核酸プライマー、及び／又はエキソヌクレアーゼ、及び／又は緩衝液、及び／又は多価金属イオン、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋などの二価金属カチオン源から選択される追加のＲＰＡ成分をさらに含む。
キットの試薬は凍結乾燥されてもよく、その場合、試薬は、再構成されたときに適切な試薬濃度が達成されるような任意の適切な量で提供されてもよい。
ポリメラーゼ
上記のように、本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれかは、核酸合成反応の実施に必要な任意のタンパク質成分にタグ付けされ得る。
上記のように、本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれかは、核酸合成反応の実施に必要な任意のタンパク質成分にタグ付けされ得る。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列のいずれかは、プライマー核酸分子を伸長することによって新しい核酸分子を合成するためにポリメラーゼが使用される核酸合成反応の実施に必要な任意のタンパク質成分にタグ付けされ得る。
したがって、任意の適切なポリメラーゼは、本明細書に記載及び定義されるＩＤＲアミノ酸配列でタグ付けされ得る。ポリメラーゼは、プライマー核酸分子を伸長することによって新たな核酸分子を合成するために使用される任意の反応に適合し、使用され得るものであり得る。
ポリメラーゼは、任意の核酸増幅反応に適合し、任意の核酸増幅反応に使用され得るものであり得る。核酸増幅反応は、熱サイクルを伴う反応であり得る。核酸増幅反応は、等温増幅反応であってもよい。核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼスパイラル反応（ＰＳＲ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製（３ ＳＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、分岐増幅法（ＲＡＭ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）又はニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）であり得る。
配列タグ
ＲＰＡ反応に関与するものを含む、本明細書に記載の生化学反応に関与するＩＤＲ－巨大分子のいずれか又はＩＤＲ－ポリペプチドのいずれかは、１つ以上の配列タグを含み得る。使用される場合、任意のそのような配列タグは、本明細書に記載されるように、融合タンパク質としてポリペプチドに結合することが好ましい。配列タグ及び配列タグをポリペプチドに付加する手段は、当技術分野で周知である。
ＲＰＡ反応に関与するものを含む、本明細書に記載の生化学反応に関与するＩＤＲ－巨大分子のいずれか又はＩＤＲ－ポリペプチドのいずれかは、１つ以上の配列タグを含み得る。使用される場合、任意のそのような配列タグは、本明細書に記載されるように、融合タンパク質としてポリペプチドに結合することが好ましい。配列タグ及び配列タグをポリペプチドに付加する手段は、当技術分野で周知である。
配列タグは、短いアミノ酸配列又はタンパク質を含むより大きなポリペプチドであり得る。
配列タグは、ポリペプチドのＣ末端、ポリペプチドタグのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端及びＮ末端の両方、又は任意の組み合わせでポリペプチドの長さに沿った任意のアミノ酸位置に結合され得る。
適切なアミノ酸配列タグの非限定的な例としては、６－ヒスチジン（６Ｘ－Ｈｉｓ、ＨＨＨＨＨＨ、配列番号８９）、ｃ－ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号９０）、ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号９１）、タンパク質Ｃ（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ、配列番号９２）、Ｔａｇ－１００（ＥＥＴＡＲＦＱＰＧＹＲＳ、配列番号９３）、Ｖ５エピトープ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ、配列番号９４）、ＶＳＶ－Ｇ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ、配列番号９５）、Ｘｐｒｅｓｓ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ、配列番号９６）、及びヘマグルチニン（ＹＰＹ－ＤＶＰＤＹＡ、配列番号９７）が挙げられる。
適切なタンパク質タグの非限定的な例としては、β－ガラクトシダーゼ、チオレドキシン、Ｈｉｓ－パッチチオレドキシン、ＩｇＧ結合ドメイン、インテインキチン結合ドメイン、Ｔ７遺伝子１０、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられる。
配列タグ及びタンパク質タグは、例えば精製及び／又は同定目的のために、交換可能に使用することができることが当業者によって理解されるであろう。
固相生化学反応
本発明による方法で行われる生化学反応は、固相又は可逆的固相技術を用いて行われ得る。本明細書に記載のプロセス、使用及び方法を実施するのに適した固相反応系は、表面を含み得る。任意の適切な表面を使用することができる。
本発明による方法で行われる生化学反応は、固相又は可逆的固相技術を用いて行われ得る。本明細書に記載のプロセス、使用及び方法を実施するのに適した固相反応系は、表面を含み得る。任意の適切な表面を使用することができる。
本明細書に記載のデータは、クラウディング剤の非存在下で固相技術を使用して、本発明によるＩＤＲベースの試薬を用いて生化学反応が実施され得ることを実証している。１つの特定の例は、プライマーが固体表面に結合している核酸のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅である。固相法を使用した実施に適した任意の適切な生化学反応は、本明細書に記載及び定義されるＩＤＲベースの試薬のいずれかを含む本発明による方法を使用したそのような方法を使用して実施することができる。
様々なこのような固相技術は、当技術分野で公知であり、使用され得る。
核酸増幅プライマー、ペプチド、ハプテン、ホルモン、薬物などを含むポリヌクレオチドなどの巨大分子を表面に固定化することができる。
本明細書に記載及び定義されるＩＤＲベースの試薬を含む、生化学反応の任意の適切な巨大分子成分を表面に固定化することができる。
ポリヌクレオチドなどの巨大分子、例えば増幅反応に使用するためのプライマーは、直接的又は間接的に表面に固定化され得る。例えば、それらは化学結合によって表面に直接結合されてもよい。それらは、中間面を介して表面に間接的に結合されてもよい。
表面は、例えば、ガラスなどの平面、ゲルベースの材料、又はビーズ若しくは官能性量子ドットなどの微粒子の表面であり得る。表面を含む材料は、それ自体が基質に結合されてもよい。基質は、ガラス、プラスチック又はポリマー材料などの任意の適切な材料を含んでもよい。
本発明の方法による生化学反応に関与する巨大分子は、例えばポリアクリルアミド又はヒドロゲルなどのゲルベースの材料に固定化されてもよく、ゲルベースの材料自体は、ガラス又はプラスチック又はポリマー材料などの支持基質に結合している。
例えば、予め形成されたポリヌクレオチドは、核酸マイクロアレイを作製するために一般的に用いられる方法によって表面に固定化することができる。例えば、ポリヌクレオチドを合成し、次いで表面、典型的には平面上にスポット又は印刷することができる。ポリヌクレオチドは、接触印刷技術を使用して表面上に堆積させることができる。例えば、固体又は中空の先端又はピンを、予め形成されたポリヌクレオチドを含む溶液に浸漬し、表面と接触させることができる。あるいは、ポリヌクレオチドをマイクロスタンプに吸着させ、次いで物理的接触によって表面に転写することができる。非接触印刷技術には、インクジェット及びバブルジェット印刷で使用される方法と同様の方法を使用して、予め形成されたポリヌクレオチドを含むナノリットル以下のサイズの微小液滴を印刷チップから吐出することができる熱印刷又は圧電印刷が含まれる。
ポリヌクレオチドは、核酸マイクロアレイを作製するために使用されるいわゆる「オンチップ」法を使用するなどして、表面上で直接合成され得る。ポリヌクレオチドを作製するためのオンチップ技術には、保護されたヌクレオチドを選択的に活性化し、その後の新たな保護されたヌクレオチドの取り込みを可能にするために、フォトリソグラフィマスクを介して誘導されたＵＶ光の使用を含むフォトリソグラフィが含まれる。ＵＶ媒介脱保護及び予め決定されたヌクレオチドのカップリングのサイクルは、所望の配列を有するポリヌクレオチドのインサイツ生成を可能にする。フォトリソグラフィマスクを使用する代わりに、インクジェット印刷技術を使用した核酸塩基の連続堆積、並びにカップリング、酸化及び脱保護のサイクルを使用して、所望の配列（総説については、Ｋｏｓｕｒｉ ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，１１，４９９－５０７を参照のこと）を有するオリゴヌクレオチドを生成することによって、ポリヌクレオチドを表面上に作製することができる。
ポリヌクレオチド、ペプチド、ハプテン、ホルモン、薬物などを含む巨大分子の結合ための表面は、任意の適切な材料で作製することができる。典型的には、表面は、シリコン、ガラス、又はポリスチレンなどの任意の適切なポリマー材料を含むことができる。表面は、ゲル表面、例えばポリアクリルアミド表面又はヒドロゲル表面を含み得る。次いで、ゲル表面は、固体支持体又は基質に結合又は結合されてもよく、支持体又は基質は、シリコン、ガラス又は任意の適切なポリマー材料などの任意の適切な材料を含んでもよい。表面は、ポリスチレン材料に結合されたヒドロゲル材料を含み得る。
表面は、しばしばミクロスフェア若しくはマイクロビーズ、又は単にビーズと呼ばれる微粒子の表面であり得る。
表面は、マイクロビーズの形態のポリスチレン材料に結合されたヒドロゲル材料を含み得る。
マイクロビーズなどの表面へのポリヌクレオチドなどの巨大分子の固定化には、様々な表面結合方法及び化学が利用可能である。表面は、結合を容易にするために官能化又は誘導体化され得る。このような官能化は当技術分野で公知である。例えば、表面は、ポリヒスチジンタグ（ｈｅｘａヒスチジンタグ、６ｘＨｉｓ－タグ、Ｈｉｓ６タグ又はＨｉｓタグ（登録商標））、Ｎｉ－ＮＴＡ、ストレプトアビジン、ビオチン、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ又はＬＮＡなど）、カルボキシル基、第四級アミン基、チオール基、アジド基、アルキン基、ＤＩＢＯ、脂質、ＦＬＡＧタグ（ＦＬＡＧオクタペプチド）、ポリヌクレオチド結合タンパク質、ペプチド、タンパク質、抗体又は抗体断片で官能化され得る。表面は、固定化されるべき巨大分子又は固定化されるべき巨大分子に結合した別の部分に特異的に結合する分子又は基で官能化されてもよい。表面への巨大分子の共有結合固定化が一般的に用いられる。純粋に例として、カルボキシラート修飾ポリスチレンラテックス表面は、例えばアミン末端タンパク質、ＤＮＡ又は他の分子の、例えばＥＤＡＣ媒介カップリングによる共有結合に適している。他の技術も利用可能である。巨大分子は、典型的には化学的に結合するであろうが、親和性相互作用などの間接的手段によって表面に結合することもできる。例えば、固定化される巨大分子は、ビオチンで官能化され、アビジン又はストレプトアビジンでコーティングされた表面に結合されてもよく、又はその逆であってもよい。
本明細書に記載及び定義されるプロセス、使用及び方法のいずれにおいても、巨大分子は、１つ以上の共有結合を介して表面に結合され得る。１つ以上の共有結合は、表面上の官能基と巨大分子上の官能基との間に形成され得る。巨大分子上の官能基は、例えば、アミン基、チオール基、チオホスファート基又はチオアミド基であり得る。表面上の官能基は、例えばブロモアセチル基であってもよく、任意に、ブロモアセチル基は、Ｎ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して誘導されたポリアクリルアミド表面上に提供される。
本明細書に記載及び定義されるプロセス、使用及び方法のいずれにおいても、巨大分子は、リンカーを介して直接的又は間接的に表面に結合され得る。自然界で生体適合性である任意の適切なリンカーを使用することができる。
リンカーは、直鎖リンカー又は分岐リンカーであり得る。
リンカーは、炭化水素鎖を含み得る。炭化水素鎖は、２～約２０００個以上の炭素原子を含み得る。炭化水素鎖は、アルキレン基、例えばＣ２～約２０００個以上のアルキレン基を含み得る。炭化水素鎖は、一般式－（ＣＨ２）ｎ－（式中、ｎは２～約２０００以上である）を有してもよい。炭化水素鎖は、任意に１つ以上のエステル基（すなわち、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）又は１つ以上のアミド基（すなわち、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－）によって中断されていてもよい。
任意のリンカーは、ポリアクリルアミド、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリ－２－メチル－２－オキサゾリン（ＰＭＯＸＡ）、双性イオンポリマー、例えばポリ（カルボキシベタインメタクリラート）（ＰＣＢＭＡ）、ポリ［Ｎ－（３－スルホプロピル）－Ｎ－メタクリロキシエチル－Ｎ，Ｎジメチルアンモニウムベタイン］（ＰＳＢＭＡ）、グリコポリマー及びポリペプチドを含む群から選択され得る。
リンカーは、一般式－［（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＰＯ２
－－Ｏ］ｍ－（式中、ｎは１～約６００以上であり、ｍは１～２００以上であり得る）を有するオリゴエチレングリコール－リン酸単位を含み得る。
上述のリンカーのいずれかは、リンカーの一端で本明細書に記載の巨大分子に結合し、リンカーの他端で第１の官能基に結合してもよく、第１の官能基は表面に共有結合を提供してもよい。第１の官能基は、例えば、本明細書にさらに記載されるアミン基、チオール基、チオホスファート基又はチオアミド基であり得る。表面は、第１の官能基との共有結合を提供するために、さらなる官能基で官能化されてもよい。さらなる官能基は、例えば、本明細書中にさらに記載されるような２－ブロモアセトアミド基であり得る。任意に、Ｎ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して誘導されたポリアクリルアミド表面にブロモアセチル基が提供される。表面上のさらなる官能基は、ブロモアセチル基であってもよく、任意に、ブロモアセチル基は、Ｎ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して誘導されるポリアクリルアミド表面上に提供され、第１の官能基は、例えば、必要に応じて、アミン基、チオール基、チオホスファート基又はチオアミド基であってもよい。ポリヌクレオチドが結合される表面は、ゲルを含み得る。表面は、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面を含んでもよく、好ましくは、ポリアクリルアミド表面は、ガラスなどの固体支持体に結合される。
可逆的な固定化を容易にする微粒子及びビーズを使用することができる。固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）法又は改変された方法は当技術分野で公知であり、使用され得る（例えば、ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ Ｍ．Ｍ．ら（１９９５）Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３（２２）：４７４２－４７４３を参照のこと）。
表面は、例えば常磁性ビーズの形態で提供され得る。常磁性ビーズは、磁場の影響下で凝集する可能性がある。例えば、常磁性表面は、適切な結合条件で核酸を含む巨大分子の結合部分として作用する化学基、例えばカルボキシル基を提供され得る。巨大分子は、適切な溶出条件でそのような表面から溶出することができる。微粒子及びビーズの表面は、ＵＶ感受性ポリカーボネートを提供され得る。核酸は、例えば、適切な固定化緩衝液の存在下で活性化表面に結合することができる。
微粒子及びビーズは、反応溶液内で自由に移動させ、次いで、例えば表面にエッチングされたマイクロウェル又はピット内にビーズを保持することによって可逆的に固定化することができる。ビーズは、例えばビーズに結合した固有の核酸「バーコード」の使用によって、又は色分けの使用によって、アレイの一部として局在化することができる。
表面は、誘電体上のエレクトロウェッティング（ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ－ｏｎ－ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ）系（ＥＷＯＤ）の一部であってもよい。ＥＷＯＤ系は、微小液滴（例えば、Ｃｈｏｕ，Ｗ－Ｌ．ら（２０１５）Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ，６：１２４９－１２７１を参照されたい）の形態の非常に小さな液体体積のマイクロ流体操作を容易にする誘電コーティングされた表面を提供する。液滴体積は、エレクトロウェッティング技術によってオンチップでプログラム可能に作成、移動、分配、及び結合することができる。したがって、エレクトロウェッティング系は、巨大分子を表面に可逆的に固定化し、及び／又は表面に固定化された巨大分子を操作するための代替手段を提供する。
したがって、本明細書に記載又は定義される本発明による方法又は使用のいずれか１つでは、生化学反応は、表面を含む固相反応系で行われ得る。
生化学反応が表面を含む固相反応系で行われる、本明細書に記載又は定義される本発明による方法又は使用のいずれか１つでは、反応の実施に必要な任意の巨大分子が表面に結合していてもよい。例えば、生化学反応が一本鎖標的核酸分子又は二本鎖標的核酸分子を本明細書に記載のインビトロ反応系で増幅する方法である１つのそのような方法では、少なくとも１つの核酸プライマー及び／又は反応巨大分子、及び／又はＩＤＲ－巨大分子及び／又は１つ以上のポリペプチド補助因子が表面に結合していてもよい。
生化学反応が表面を含む固相反応系で行われる、本明細書に記載又は定義される本発明による方法又は使用のいずれか１つでは、反応の実施に必要なＩＤＲ－巨大分子は、表面に結合していてもよい。
本明細書に記載又は定義される本発明による方法又は使用のいずれか１つでは、生化学反応は、インビトロ反応系において二本鎖標的核酸分子を増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅プロセスであり、反応は、表面を含む固相反応系で行われ、リコンビナーゼ剤及び／又はリコンビナーゼ負荷タンパク質及び／又は一本鎖安定化剤及び／又はポリメラーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼ及び／又は第１の核酸プライマー及び／又は第２の核酸プライマーは、表面に結合され得る。１つのそのような方法又は使用において、第１の核酸プライマー又は第２の核酸プライマーは、表面に結合され得る。あるいは、他のそのような方法又は使用では、第１の核酸プライマー及び第２の核酸プライマーの両方が表面に結合され得る。
生化学反応が固相反応系で行われる、本明細書に記載又は定義される本発明による方法又は使用のいずれか１つでは、巨大分子が結合している表面はマイクロビーズであってよく、好ましくはマイクロビーズは、シリコン、ガラス、ゲル、又はポリスチレンなどのポリマー材料、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
生化学反応が表面及び／又は基質を含む固相反応系で行われる、本明細書に記載の方法又は使用のいずれか１つでは、表面及び／又は基質はフローセルとして提供され得る。行われる生化学反応に適合する任意の適切なフローセルを使用してもよい。適切なフローセルは、生化学反応を行うために使用される試薬が流れることができる複数の流体チャネルを含むことができる。生化学反応を行うために使用される任意の１つ以上の巨大分子は、流体チャネルを裏打ちする表面に結合され得る。適切なフローセルを使用して、一本鎖又は二本鎖標的核酸分子の増幅のための生化学反応を行うことができる。本明細書中に記載されるプロセス、使用及び方法を使用して行われる配列決定反応はまた、好適なフローセルを使用して行われ得る。
例
以下の例は、本発明を説明するために提供されるが、本発明を限定するものではない。
以下の例は、本発明を説明するために提供されるが、本発明を限定するものではない。
例１．ヒトＯｔｘ１由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２を使用したリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）遺伝子ｈｌｙのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅。
実験の目的及び概要
この実験は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１の天然変性領域（ＩＤＲ）に見出されるヒスチジンリッチアミノ酸ドメイン配列を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１の天然変性領域（ＩＤＲ）に見出されるヒスチジンリッチアミノ酸ドメイン配列を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために行われた。
この例は、クラウディング剤の非存在下でヒスチジンリッチ天然変性領域（ＩＤＲ）ドメイン（Ｏｔｘ１）でＣ末端にタグ付けされたＧｐ３２を使用して、ある範囲の鋳型濃度にわたってリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）遺伝子ｈｌｙのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＩＳ２と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８２として示す（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＩＳ２と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８２として示す（表２３）。
次いで、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ゲノムＤＮＡに由来するＤＮＡ鋳型の示されたコピーを使用して、組換えファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２融合タンパク質をＰＥＧ非含有増幅で、すなわち、クラウディング剤の非存在下で試験した。図１に示すように、試験鋳型をコピー数で滴定した。
２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＭフォワードプライマー、０．４μＭリバースプライマー、０．１２μＭプローブ、２０μＭ Ｇｐ３２融合物、４．８μＭ ＵｖｓＸ、８．６μＭ ＵｖｓＹ、０．１３５μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．２７μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩを混合することによって反応を設定した。所与の濃度及び３３ｍＭ ＭｇＯＡｃを含む鋳型の添加によって反応を開始した。
関連するプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー：ＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号９８）。
リバースプライマー：ＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡ（配列番号９９）。
プローブ：ＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＡＧ［ＦＡＭ］ ［ＴＨＦ］［ＢＨＱ－１］ＡＴＡＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡ（配列番号１００）、式中、ＦＡＭはフルオレセインであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＢＨＱはブラックホールクエンチャーである。
次いで、反応物を３９℃でインキュベートし、ベアリングボールを使用して磁気混合しながら蛍光光度計に入れた。
結果及び結論
図１に示すように、試験鋳型は、ＲＰＡ反応の開始から７分以内に高感度で容易に検出された。アンプリコンは、わずか１０コピーの標的で検出された。
図１に示すように、試験鋳型は、ＲＰＡ反応の開始から７分以内に高感度で容易に検出された。アンプリコンは、わずか１０コピーの標的で検出された。
したがって、このＧｐ３２ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質を使用すると、ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下での増幅が効率的に起こることが見出された。
例２．ヒトＭａｆＡ由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２を使用したリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）遺伝子ｈｌｙのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅。
実験の目的及び概要
この実験は、ヒト転写因子ＭａｆＡの天然変性領域（ＩＤＲ）に見出されるヒスチジンリッチのドメイン配列を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、ヒト転写因子ＭａｆＡの天然変性領域（ＩＤＲ）に見出されるヒスチジンリッチのドメイン配列を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために行われた。
この例は、クラウディング剤の非存在下でヒスチジンリッチ天然変性領域（ＩＤＲ）ドメイン（ＭａｆＡ）でＣ末端にタグ付けされたＧｐ３２を使用して、ある範囲の鋳型濃度にわたってリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）遺伝子ｈｌｙのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＳＧＨＨＧＡＨＨＧＡＨＨＰＡＡＡＡＡＹＥＡＦＲＧＰＧＦＡＧＧＧＧＡＤＤＭＧＡＧＨＨＨＧＡＨＨＡＡＨＨＨＨＡＡＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＡＧＨＧＧＧＡＧＨＨ（配列番号２７）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＩＳ５と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８５として示す（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＳＧＨＨＧＡＨＨＧＡＨＨＰＡＡＡＡＡＹＥＡＦＲＧＰＧＦＡＧＧＧＧＡＤＤＭＧＡＧＨＨＨＧＡＨＨＡＡＨＨＨＨＡＡＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＡＧＨＧＧＧＡＧＨＨ（配列番号２７）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＩＳ５と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８５として示す（表２３）。
次いで、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ゲノムＤＮＡに由来するＤＮＡ鋳型の示されたコピーを使用して、組換えファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２融合タンパク質をＰＥＧ非含有増幅で、すなわち、クラウディング剤の非存在下で試験した。図２に示すように、試験鋳型をコピー数で滴定した。
２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＭフォワードプライマー、０．４μＭリバースプライマー、０．１２μＭプローブ、２０μＭ Ｇｐ３２融合物、４．８μＭ ＵｖｓＸ、８．６μＭ ＵｖｓＹ、０．１３５μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．２７μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩを混合することによって反応を設定した。所与の濃度及び３３ｍＭ ＭｇＯＡｃを含む鋳型の添加によって反応を開始した。
関連するプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー：ＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号９８）。
リバースプライマー：ＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡ（配列番号９９）。
プローブ：ＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＡＧ［ＦＡＭ］ ［ＴＨＦ］［ＢＨＱ－１］ＡＴＡＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡ（配列番号１００）、式中、ＦＡＭはフルオレセインであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＢＨＱはブラックホールクエンチャーである。
次いで、反応物を３９℃でインキュベートし、ベアリングボールを使用して磁気混合しながら蛍光光度計に入れた。
結果及び結論
図２に示すように、試験鋳型は、ＲＰＡ反応の開始から１０分以内に高感度で容易に検出された。アンプリコンは、わずか１０コピーの標的で検出された。
図２に示すように、試験鋳型は、ＲＰＡ反応の開始から１０分以内に高感度で容易に検出された。アンプリコンは、わずか１０コピーの標的で検出された。
したがって、このＧｐ３２ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質を使用すると、ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下での増幅が効率的に起こることが見出された。
例３．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２を使用したリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）遺伝子ｈｌｙのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅。
実験の目的及び概要
この実験は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために行われた。
この例は、クラウディング剤の非存在下で酵母Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含む配列でＣ末端にタグ付けされたＧｐ３２を使用して、ある範囲の鋳型濃度にわたってリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）遺伝子ｈｌｙのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＲＰ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号７９として示す（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＲＰ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号７９として示す（表２３）。
次いで、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ゲノムＤＮＡに由来するＤＮＡ鋳型の示されたコピーを使用して、組換えファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２融合タンパク質をＰＥＧ非含有増幅で、すなわち、クラウディング剤の非存在下で試験した。図３に示すように、試験鋳型をコピー数で滴定した。
２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＭフォワードプライマー、０．４μＭリバースプライマー、０．１２μＭプローブ、２０μＭ Ｇｐ３２融合物、４．８μＭ ＵｖｓＸ、８．６μＭ ＵｖｓＹ、０．１３５μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．２７μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩを混合することによって反応を設定した。所与の濃度及び３３ｍＭ ＭｇＯＡｃを含む鋳型の添加によって反応を開始した。
関連するプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー：ＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号９８）。
リバースプライマー：ＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡ（配列番号９９）。
プローブ：ＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＡＧ［ＦＡＭ］ ［ＴＨＦ］［ＢＨＱ－１］ＡＴＡＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡ（配列番号１００）、式中、ＦＡＭはフルオレセインであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＢＨＱはブラックホールクエンチャーである。
次いで、反応物を３９℃でインキュベートし、ベアリングボールを使用して磁気混合しながら蛍光光度計に入れた。
結果及び結論
図３に示すように、試験鋳型は、ＲＰＡ反応の開始から７分以内に高感度で容易に検出された。アンプリコンは、わずか１０コピーの標的で検出された。
図３に示すように、試験鋳型は、ＲＰＡ反応の開始から７分以内に高感度で容易に検出された。アンプリコンは、わずか１０コピーの標的で検出された。
したがって、このＧｐ３２ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質を使用すると、ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下での増幅が効率的に起こることが見出された。
例４．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｕｐ２由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２を使用したリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）遺伝子ｈｌｙのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅。
実験の目的及び概要
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｕｐ２タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）ドメインを含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために、この実験を行った。
実験の目的及び概要
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｕｐ２タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）ドメインを含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために、この実験を行った。
この例は、クラウディング剤の非存在下における酵母Ｓｕｐ２タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）ドメインを含む配列でＣ末端にタグ付けされたＧｐ３２を使用した、ある範囲の鋳型濃度にわたるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）遺伝子ｈｌｙのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ（配列番号１９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲドメインタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－Ｓｕｐ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号７２として示す（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ（配列番号１９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲドメインタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－Ｓｕｐ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号７２として示す（表２３）。
次いで、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ゲノムＤＮＡに由来するＤＮＡ鋳型の示されたコピーを使用して、組換えファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２融合タンパク質をＰＥＧ非含有増幅で、すなわち、クラウディング剤の非存在下で試験した。図Ｃに示すように、試験鋳型をコピー数で滴定した。
２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＭフォワードプライマー、０．４μＭリバースプライマー、０．１２μＭプローブ、２０μＭ Ｇｐ３２融合物、４．８μＭ ＵｖｓＸ、８．６μＭ ＵｖｓＹ、０．１３５μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．２７μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩを混合することによって反応を設定した。所与の濃度及び３３ｍＭ ＭｇＯＡｃを含む鋳型の添加によって反応を開始した。
関連するプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー：ＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号９８）。
リバースプライマー：ＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡ（配列番号９９）。
プローブ：ＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＡＧ［ＦＡＭ］ ［ＴＨＦ］［ＢＨＱ－１］ＡＴＡＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡ（配列番号１００）、式中、ＦＡＭはフルオレセインであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＢＨＱはブラックホールクエンチャーである。
次いで、反応物を３９℃でインキュベートし、ベアリングボールを使用して磁気混合しながら蛍光光度計に入れた。
結果及び結論
図４に示すように、試験鋳型は、ＲＰＡ反応の開始から７分以内に高感度で容易に検出された。アンプリコンは、わずか１０コピーの標的で検出された。
図４に示すように、試験鋳型は、ＲＰＡ反応の開始から７分以内に高感度で容易に検出された。アンプリコンは、わずか１０コピーの標的で検出された。
したがって、このＧｐ３２ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質を使用すると、ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下での増幅が効率的に起こることが見出された。
例５．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｕｐ２由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２を使用したヒトａｐｏＢ遺伝子のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅。
実験の目的及び概要
この実験は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｕｐ２タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）ドメインアミノ酸配列を含むタグを含む多くのＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために行われた。ＩＤＲドメインリピート単位の可変数を評価し、融合タンパク質の濃度の範囲を調べた。
実験の目的及び概要
この実験は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｕｐ２タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）ドメインアミノ酸配列を含むタグを含む多くのＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために行われた。ＩＤＲドメインリピート単位の可変数を評価し、融合タンパク質の濃度の範囲を調べた。
この例は、クラウディング剤の非存在下における酵母Ｓｕｐ２タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）ドメインを含む配列でＣ末端にタグ付けされたＧｐ３２を使用したヒトアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）遺伝子のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ（配列番号１９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。単一のＹＮＰＱＧＧＹＱＱ単位が結合しているか、又は２回、３回又は４回のリピートが結合していた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲドメインタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－Ｓｕｐ２（２回のリピート、配列番号２０）、Ｇｐ３２－Ｓｕｐ３（３回リピート、配列番号２１）及びＧｐ３２－Ｓｕｐ４（４回リピート、配列番号２２）と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７３、配列番号７４及び配列番号７５として示されている（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ（配列番号１９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。単一のＹＮＰＱＧＧＹＱＱ単位が結合しているか、又は２回、３回又は４回のリピートが結合していた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲドメインタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－Ｓｕｐ２（２回のリピート、配列番号２０）、Ｇｐ３２－Ｓｕｐ３（３回リピート、配列番号２１）及びＧｐ３２－Ｓｕｐ４（４回リピート、配列番号２２）と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７３、配列番号７４及び配列番号７５として示されている（表２３）。
次いで、組換えファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２融合タンパク質を、Ｇｐ３２－Ｓｕｐ１と共に、ＰＥＧ非含有増幅において、すなわち、クラウディング剤の非存在下で、ヒトゲノムＤＮＡに由来するＤＮＡ鋳型を用いて試験した。
２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＭフォワードプライマー、０．４μＭリバースプライマー、０．１２μＭプローブ、図５Ａ～図５Ｄに示される濃度のＧｐ３２融合タンパク質、４．８μＭ ＵｖｓＸ、８．６μＭ ＵｖｓＹ、０．１３５μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．２７μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩを混合することによって反応を設定した。鋳型の添加及び３３ｍＭ ＭｇＯＡｃによって反応を開始した。それぞれの場合に使用された試験鋳型コピー数は１万であった。
関連するプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー：ＧＣＡＧＣＴＧＴＡＴＡＧＣＡＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧ（配列番号１０１）。
リバースプライマー：ＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＧ（配列番号１０２）。
プローブ：ＣＡＣＴＧＡＴＧＣＴ ＴＴＴＣＣＴＡＧＡＣＡＣＧＡＧＡＴＧＡ［ＦＡＭ－ｄＴ］Ｇ［ＴＨＦ］Ｃ［ＢＨＱ１－ｄＴ］ＴＧＴＧＧＡＧＣＣＴＴＴＧＴ（配列番号１０３）、式中、ＦＡＭはフルオレセインであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＢＨＱはブラックホールクエンチャーである。
次いで、反応物を３９℃でインキュベートし、ベアリングボールを使用して磁気混合しながら蛍光光度計に入れた。
結果及び結論
結果を図５に示す。図５Ａは、単一のＩＤＲドメインタグ単位を使用した結果を示す。図５Ｂ～図５Ｄは、それぞれ２回、３回及び４回のＩＤＲドメインタグ単位リピートを使用した結果を示す。試験鋳型は、ＲＰＡ反応の開始の約１０分後に検出された。
結果を図５に示す。図５Ａは、単一のＩＤＲドメインタグ単位を使用した結果を示す。図５Ｂ～図５Ｄは、それぞれ２回、３回及び４回のＩＤＲドメインタグ単位リピートを使用した結果を示す。試験鋳型は、ＲＰＡ反応の開始の約１０分後に検出された。
ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下での増幅が、これらのＧｐ３２－ＩＤＲタグ付き融合タンパク質を使用して効率的に起こることが見出された。単一のＩＤＲドメインタグユニット及び２つのＩＤＲドメインタグ単位で最良の性能が見られた。３つのＩＤＲドメインタグ単位も良好な性能を与えた。
例６．ヒトＭａｆＡ由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２を使用したリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）遺伝子ｈｌｙのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅－マグネシウムイオン濃度の比較。
実験の目的
この実験は、ヒト転写因子ＭａｆＡの天然変性領域（ＩＤＲ）に見出されるヒスチジンリッチのドメイン配列を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために行われた。実験は、ある範囲のマグネシウム濃度にわたって性能を評価した。
実験の目的
この実験は、ヒト転写因子ＭａｆＡの天然変性領域（ＩＤＲ）に見出されるヒスチジンリッチのドメイン配列を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために行われた。実験は、ある範囲のマグネシウム濃度にわたって性能を評価した。
この例は、クラウディング剤の非存在下でヒスチジンリッチ天然変性領域（ＩＤＲ）ドメイン（ＭａｆＡ）でＣ末端にタグ付けされたＧｐ３２を使用して、マグネシウム濃度の範囲にわたるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）遺伝子ｈｌｙのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＳＧＨＨＧＡＨＨＧＡＨＨＰＡＡＡＡＡＹＥＡＦＲＧＰＧＦＡＧＧＧＧＡＤＤＭＧＡＧＨＨＨＧＡＨＨＡＡＨＨＨＨＡＡＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＡＧＨＧＧＧＡＧＨＨ（配列番号２７）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＩＳ５と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８５として示す（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＳＧＨＨＧＡＨＨＧＡＨＨＰＡＡＡＡＡＹＥＡＦＲＧＰＧＦＡＧＧＧＧＡＤＤＭＧＡＧＨＨＨＧＡＨＨＡＡＨＨＨＨＡＡＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＡＧＨＧＧＧＡＧＨＨ（配列番号２７）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＩＳ５と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８５として示す（表２３）。
次いで、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ゲノムＤＮＡに由来するＤＮＡ鋳型の示されたコピーを使用して、組換えファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２融合タンパク質をＰＥＧ非含有増幅で、すなわち、クラウディング剤の非存在下で試験した。試験鋳型を反応あたり１万コピーで提供し、マグネシウムイオン濃度を５．６ｍＭから４４．８ｍＭまで変化させた。
２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＭフォワードプライマー、０．４μＭリバースプライマー、０．１２μＭプローブ、２０μＭ Ｇｐ３２融合物、４．８μＭ ＵｖｓＸ、８．６μＭ ＵｖｓＹ、０．１３５μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．２７μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩを混合することによって反応を設定した。反応は、鋳型の添加及び５．６ｍＭ～４４．８ｍＭのＭｇＯＡｃの指示濃度によって開始された。
関連するプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー：ＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号９８）。
リバースプライマー：ＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡ（配列番号９９）。
プローブ：ＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＡＧ［ＦＡＭ］ ［ＴＨＦ］［ＢＨＱ－１］ＡＴＡＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡ（配列番号１００）、式中、ＦＡＭはフルオレセインであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＢＨＱはブラックホールクエンチャーである。
次いで、反応物を３９℃でインキュベートし、ベアリングボールを使用して磁気混合しながら蛍光光度計に入れた。
結果及び結論
ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下での増幅が、このＧｐ３２ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質を使用して効率的に起こることが見出された。
ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下での増幅が、このＧｐ３２ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質を使用して効率的に起こることが見出された。
図６に示すように、２８ｍＭ以上のマグネシウムが存在する場合、このＧｐ３２ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質を使用して良好な増幅が起こることが見出された。この実験における最適濃度は３３．６ｍＭであるように見え、４４．８ｍＭまでさらに増加すると、検出まで同様の時間が得られた。
例７．ヒトＡｐｏＢ遺伝子断片のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅に対するホスホクレアチンレベルの影響。
実験の目的及び概要
この実験は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１の天然変性領域（ＩＤＲ）に見られるヒスチジンリッチのドメイン配列を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能に対するホスホクレアチンレベルの変動の影響を評価するために行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１の天然変性領域（ＩＤＲ）に見られるヒスチジンリッチのドメイン配列を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能に対するホスホクレアチンレベルの変動の影響を評価するために行われた。
この例は、クラウディング剤の非存在下でヒスチジンリッチ天然変性領域（ＩＤＲ）ドメイン（Ｏｔｘ１）でＣ末端にタグ付けされたＧｐ３２を使用したヒトアポリポタンパク質（ａｐｏＢ）遺伝子の断片のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＩＳ２と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８２として示す（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＩＳ２と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８２として示す（表２３）。
次いで、組換えファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２融合タンパク質を、ＰＥＧ非含有増幅において、すなわちクラウディング剤の非存在下で試験した。ヒトａｐｏＢアッセイを使用してホスホクレアチン滴定を行った。試験鋳型は１０４コピーの濃度で提供された。
２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、図に示すホスホクレアチンのレベル、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＭフォワードプライマー、０．４μＭリバースプライマー、０．１２μＭプローブ、２０μＭ Ｇｐ３２融合物、４．８μＭ ＵｖｓＸ、８．６μＭ ＵｖｓＹ、０．１３５μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．２７μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩを混合することによって反応を設定した。反応ごとに１０４コピーの鋳型を添加し、３３ｍＭ ＭｇＯＡｃを用いて反応を開始した。
フォワードプライマー：ＧＣＡＧＣＴＧＴＡＴＡＧＣＡＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧ（配列番号１０１）。
リバースプライマー：ＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＧ（配列番号１０２）。
プローブ：ＣＡＣＴＧＡＴＧＣＴ ＴＴＴＣＣＴＡＧＡＣＡＣＧＡＧＡＴＧＡ［ＦＡＭ－ｄＴ］Ｇ［ＴＨＦ］Ｃ［ＢＨＱ１－ｄＴ］ＴＧＴＧＧＡＧＣＣＴＴＴＧＴ（配列番号１０３）、式中、ＦＡＭはフルオレセインであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＢＨＱはブラックホールクエンチャーである。
次いで、反応物を３９℃でインキュベートし、ベアリングボールを使用して磁気混合しながら蛍光光度計に入れた。
結果及び結論
ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下で増幅が、このＧｐ３２ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質を使用して起こることが見出された。図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃに示すように、ＰＥＧベースのＲＰＡ（５０ｍＭ）で使用される標準的なホスホクレアチン濃度では、２０分以内に増幅活性はほとんど見られなかった。ホスホクレアチンを２０ｍＭに減少させると最適な性能が得られたが、１５～２５ｍＭの間で良好な性能も観察され、３０～３５ｍＭで２０分以内のより低いレベルの増幅も観察された。
ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下で増幅が、このＧｐ３２ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質を使用して起こることが見出された。図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃに示すように、ＰＥＧベースのＲＰＡ（５０ｍＭ）で使用される標準的なホスホクレアチン濃度では、２０分以内に増幅活性はほとんど見られなかった。ホスホクレアチンを２０ｍＭに減少させると最適な性能が得られたが、１５～２５ｍＭの間で良好な性能も観察され、３０～３５ｍＭで２０分以内のより低いレベルの増幅も観察された。
例８．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２を使用したリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）遺伝子ｈｌｙのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅－塩濃度の比較。
実験の目的及び概要
この実験は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために行われた。この実験では、酢酸カリウムを使用して、ある範囲の塩濃度にわたって性能を評価した。
実験の目的及び概要
この実験は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために行われた。この実験では、酢酸カリウムを使用して、ある範囲の塩濃度にわたって性能を評価した。
この例は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）遺伝子ｈｌｙのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を、クラウディング剤の非存在下でサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）でＣ末端にタグ付けされたＧｐ３２を使用して、ある範囲の塩濃度にわたって最適化することができることを実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＲＰ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号７９として示す（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＲＰ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号７９として示す（表２３）。
次いで、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ゲノムＤＮＡに由来する１００コピーのＤＮＡ鋳型を使用して、組換えファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２融合タンパク質をＰＥＧ非含有増幅で、すなわちクラウディング剤の非存在下で試験した。酢酸カリウム濃度を１０ｍＭから１００ｍＭまで変化させた。
２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＭフォワードプライマー、０．４μＭリバースプライマー、０．１２μＭプローブ、２０μＭ Ｇｐ３２融合物、４．８μＭ ＵｖｓＸ、８．６μＭ ＵｖｓＹ、０．１３５μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．２７μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩを混合することによって反応を設定した。鋳型及び３３ｍＭ ＭｇＯＡｃの添加によって反応を開始した。
関連するプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー：ＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号９８）。
リバースプライマー：ＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡ（配列番号９９）。
プローブ：ＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＡＧ［ＦＡＭ］ ［ＴＨＦ］［ＢＨＱ－１］ＡＴＡＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡ（配列番号１００）、式中、ＦＡＭはフルオレセインであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＢＨＱはブラックホールクエンチャーである。
次いで、反応物を３９℃でインキュベートし、ベアリングボールを使用して磁気混合しながら蛍光光度計に入れた。
結果及び結論
ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下での増幅が、このＧｐ３２ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質を使用して効率的に起こることが見出された。
ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下での増幅が、このＧｐ３２ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質を使用して効率的に起こることが見出された。
また、このＧｐ３２ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質を用いたクラウディング剤の非存在下での増幅は、酢酸カリウムが代表例である塩濃度の範囲にわたって最適化され得ることも見出された。
図８に示すように、１０ｍＭ以上の酢酸カリウムが存在する場合、このＧｐ３２ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質を使用すると良好な増幅が起こることが見出された。この実験における最適な濃度範囲は、１０～４０ｍＭの間であるようであった。４０ｍＭを超える濃度では、より低い効率の増幅が観察された。
例９．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｕｐ２由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２を使用したヒトＡｐｏＢ遺伝子断片のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅－クラウディング剤との相乗効果。
実験の目的及び概要
この実験は、ファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合した酵母ＳＵＰ２遺伝子の天然変性領域に見られるヒスチジンリッチ配列、具体的にはＳｕｐ１配列ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ（配列番号１９）を含有するＧｐ３２融合タンパク質調製物の反応効率に対する低濃度のクラウディング剤、この場合はＰＥＧの効果を評価するために行われた。この融合タンパク質の性能を、ヒトアポリポタンパク質（ａｐｏＢ）遺伝子の断片のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅においてＳｕｐ１ ＩＤＲタグを欠くＧｐ３２タンパク質と比較した。
実験の目的及び概要
この実験は、ファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合した酵母ＳＵＰ２遺伝子の天然変性領域に見られるヒスチジンリッチ配列、具体的にはＳｕｐ１配列ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ（配列番号１９）を含有するＧｐ３２融合タンパク質調製物の反応効率に対する低濃度のクラウディング剤、この場合はＰＥＧの効果を評価するために行われた。この融合タンパク質の性能を、ヒトアポリポタンパク質（ａｐｏＢ）遺伝子の断片のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅においてＳｕｐ１ ＩＤＲタグを欠くＧｐ３２タンパク質と比較した。
低濃度のクロウイング剤は、Ｓｕｐ１ ＩＤＲ－タグ付きＧｐ３２の反応効率を高めることができ、相乗効果が観察され得る条件を達成することができることが見出された。
材料及び方法
Ｇｐ３２－Ｓｕｐ１
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ（配列番号１９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲドメインタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－Ｓｕｐ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号７２として示す（表２３）。
Ｇｐ３２－Ｓｕｐ１
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ（配列番号１９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲドメインタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－Ｓｕｐ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号７２として示す（表２３）。
Ｇｐ３２（７Ｈｉｓ）
ファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２を、試験対象のタンパク質のまさにＣ末端に配置されたヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２（７Ｈｉｓ）と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号６５として示す（表２３）。
ファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２を、試験対象のタンパク質のまさにＣ末端に配置されたヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２（７Ｈｉｓ）と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号６５として示す（表２３）。
組換えファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２融合タンパク質を、ヒトアポリポタンパク質（ａｐｏＢ）遺伝子の断片を含むＤＮＡ鋳型を使用して、クラウディング剤の存在下又は非存在下のいずれかで、ＲＰＡ反応で試験した。
２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、５０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＭフォワードプライマー、０．４μＭリバースプライマー、０．１２μＭプローブ、２０μＭ Ｇｐ３２融合タンパク質、４．８μＭ ＵｖｓＸ、８．６μＭ ＵｖｓＹ、０．１３５μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．２７μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩを混合することによって反応を設定した。鋳型の添加及び３３ｍＭ ＭｇＯＡｃによって反応を開始した。それぞれの場合に使用された試験鋳型コピー数は１万であった。関連する図に示される最終濃度までＰＥＧを添加した。使用したＰＥＧの種は、ＰＥＧ分子量３５，０００であった。
関連するプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー：ＧＣＡＧＣＴＧＴＡＴＡＧＣＡＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧ（配列番号１０１）。
リバースプライマー：ＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＧ（配列番号１０２）。
プローブ：ＣＡＣＴＧＡＴＧＣＴ ＴＴＴＣＣＴＡＧＡＣＡＣＧＡＧＡＴＧＡ［ＦＡＭ－ｄＴ］Ｇ［ＴＨＦ］Ｃ［ＢＨＱ１－ｄＴ］ＴＧＴＧＧＡＧＣＣＴＴＴＧＴ（配列番号１０３）、式中、ＦＡＭはフルオレセインであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＢＨＱはブラックホールクエンチャーである。
次いで、反応物を３９℃でインキュベートし、ベアリングボールを使用して磁気混合しながら蛍光光度計に入れた。
結果及び結論
結果を図９に示す。図９は、Ｇｐ３２－Ｓｕｐ１ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質をクラウディング剤ＰＥＧの非存在下で試験した場合、試験鋳型が効率的に検出されたことを示す。
結果を図９に示す。図９は、Ｇｐ３２－Ｓｕｐ１ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質をクラウディング剤ＰＥＧの非存在下で試験した場合、試験鋳型が効率的に検出されたことを示す。
Ｓｕｐ１ ＩＤＲタグを含まないＧｐ３２－７Ｈｉｓ融合タンパク質を、０．５％～２％の間のクラウディング剤ＰＥＧの存在下で試験した場合、少量であるが検出可能な量の増幅産物が観察された。
Ｇｐ３２－Ｓｕｐ１ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質を、クラウディング剤ＰＥＧの存在下で試験した場合、試験鋳型が効率的に検出された。この場合、（ｉ）ＰＥＧの非存在下でのＧｐ３２－Ｓｕｐ１ ＩＤＲ－タグ付き融合タンパク質及び（ｉｉ）ＰＥＧの非存在下でのＳｕｐ１ ＩＤＲタグなしのＧｐ３２－７Ｈｉｓ融合タンパク質で観察された量を比較した場合、増幅産物の量が合計量を超える相乗効果を観察することができた（例えば、図９を参照し、Ｓｕｐ１ １％ ＰＥＧをＳｕｐ１ ０％ ＰＥＧ＋正常ＧＰ３２ １％ ＰＥＧと比較する）。
これらの結果は、反応のＩＤＲ－タグ付き巨大分子成分を低濃度のクラウディング剤と組み合わせると、生化学反応の実施効率に対する増強された効果が観察され得ること、及び反応のＩＤＲ－タグ付き巨大分子成分を低濃度のクラウディング剤と組み合わせると、反応効率に対する相乗効果を促進する条件が達成され得ることを実証する。
例１０．多価金属カチオンの存在下でのＩＤＲタグによる相分離の促進。
実験の目的及び概要
この実験は、水性インビトロ生化学系において、天然変性領域（ＩＤＲ）ドメインアミノ酸配列を含むタグをそれぞれ有するいくつかのＧｐ３２融合タンパク質によって駆動される／引き起こされる相分離の促進における多価金属カチオンの影響を評価するために行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、水性インビトロ生化学系において、天然変性領域（ＩＤＲ）ドメインアミノ酸配列を含むタグをそれぞれ有するいくつかのＧｐ３２融合タンパク質によって駆動される／引き起こされる相分離の促進における多価金属カチオンの影響を評価するために行われた。
例は、ＩＤＲドメインアミノ酸配列を含むタグが驚くべきことに相分離を促進することができ、より驚くべきことに、この効果が多価金属カチオンの存在によって増強されることを実証する。
材料及び方法
Ｇｐ３２－ＨＩＳ２融合タンパク質
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－ＨＩＳ２融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号８２として提供される（表２３）。
Ｇｐ３２－ＨＩＳ２融合タンパク質
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－ＨＩＳ２融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号８２として提供される（表２３）。
Ｇｐ３２－ＨＲＰ１融合タンパク質
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－ＨＲＰ１融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号７９として提供される（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－ＨＲＰ１融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号７９として提供される（表２３）。
Ｇｐ３２－Ｓｕｐ１融合タンパク質
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ（配列番号１９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲドメインタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－Ｓｕｐ１融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号７２（表２３）として提供される。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ（配列番号１９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲドメインタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－Ｓｕｐ１融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号７２（表２３）として提供される。
Ｇｐ３２－Ｆｉｂ融合タンパク質
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＰＧＦＳＰＲＧＧＧＦＧＧＲＧＧＦＧＤＲＧＧＲＧＧＲＧＧＦＧＧＧＲＧＲＧＧＧＦＲＧＲＧＲ（配列番号１）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲドメインタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－Ｆｉｂ融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号６９として提供される（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＰＧＦＳＰＲＧＧＧＦＧＧＲＧＧＦＧＤＲＧＧＲＧＧＲＧＧＦＧＧＧＲＧＲＧＧＧＦＲＧＲＧＲ（配列番号１）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲドメインタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－Ｆｉｂ融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号６９として提供される（表２３）。
相分離アッセイ
以下に概説する方法は、試験したすべての融合タンパク質に適用される。使用した融合タンパク質溶液の体積は、精製後のタンパク質濃度に依存した。
以下に概説する方法は、試験したすべての融合タンパク質に適用される。使用した融合タンパク質溶液の体積は、精製後のタンパク質濃度に依存した。
それぞれの場合において、１０００ｎｇ／μｌの最終濃度のタグ付け融合タンパク質と、酢酸塩又は塩化物の形態のいずれかの金属イオンとを、以下に示され、本明細書に提示される関連する図に示される標的濃度で含む５０μｌの溶液を作製した。
Ｇｐ３２－ＨＩＳ２融合物については、精製後のタンパク質濃度は４８ｍｇ／ｍｌであった。１．０４μｌのこの融合タンパク質を各５０μｌの反応に使用して、溶液中１０００ｎｇ／μｌの最終濃度を達成した。Ｇｐ３２－ＨＲＰ１融合物については、精製後のタンパク質濃度は３９ｍｇ／ｍｌであった。１．２８μｌのこの融合タンパク質を各５０μｌの反応に使用して、溶液中１０００ｎｇ／μｌの最終濃度を達成した。Ｇｐ３２－Ｓｕｐ１融合物については、精製後のタンパク質濃度は３６ｍｇ／ｍｌであった。１．４μｌのこの融合タンパク質を各５０μｌの反応に使用して、溶液中１０００ｎｇ／μｌの最終濃度を達成した。Ｇｐ３２－Ｆｉｂ融合物について、精製後のタンパク質濃度は２０．２ｍｇ／ｍｌであった。２．４８μｌのこの融合タンパク質を各５０μｌの反応に使用して、溶液中１０００ｎｇ／μｌの最終濃度を達成した。
これらの実験では、検出可能な相分離増進が起こるために必要な二価金属カチオン濃度を、代表的な二価金属カチオン：マグネシウム（ＭｇＯＡｃ）、マンガン（ＭｇＣｌ２）及びカルシウム（ＣａＣｌ２）で試験した。マンガン及びカルシウムの酢酸塩形態は、単に溶液中でのそれらの不安定性が知られているために使用されなかった。マンガンは酢酸塩溶液中で経時的に酸化し、酢酸カルシウムは溶液中の一部の細菌の増殖を支持するようであるが、塩化カルシウムは支持しない。
水、ＩＤＲ－タグ付きタンパク質及び二価金属カチオンを含む混合物の構成後、混合物をボルテックスし、スピンダウンし、混合物の１０μｌの試料をＤＨＣ－Ｂ０１ Ｃ－Ｃｈｉｐ血球計スライドに移した。次いで、スライドを顕微鏡下で倍率４００倍で画像化した。検出相分離は、倍率を介して視覚的に同定し、血球計を使用してカウントすることができる球状様球状フォーカス／粒子の形成によって評価した。次いで、単位体積当たりの球状フォーカスカウントを行うことができる。球状フォーカスカウントは、２１８μｍ×１７５μｍの拡大領域に形成された球状フォーカスの数を倍率４００倍でカウントすることによって行った。これは、拡大画像を２０個の正方形セグメント（画像の４×５）に分割し、これらのセグメントのうちの１つで球状フォーカスをカウントし、次いでこの数に２０を掛けることによって行った。
結果及び結論
このアッセイにおける最小の検出可能な相分離濃度（ＭＰＳＣ）のすぐ下とＭＰＳＣのすぐ上との間で起こる移行が、行われたすべての反応において非常に突然起こることが観察された。ＭＰＳＣのすぐ下では、検出可能な相分離した水性粒子は全く観察されず、溶液は視覚的に検出可能な粒子（球状フォーカス）が空であることが見出された。ＭＰＳＣを超えると、移行が非常に明白であり、数百の視覚的に検出可能な粒子（球状フォーカス）が突然形成された。
このアッセイにおける最小の検出可能な相分離濃度（ＭＰＳＣ）のすぐ下とＭＰＳＣのすぐ上との間で起こる移行が、行われたすべての反応において非常に突然起こることが観察された。ＭＰＳＣのすぐ下では、検出可能な相分離した水性粒子は全く観察されず、溶液は視覚的に検出可能な粒子（球状フォーカス）が空であることが見出された。ＭＰＳＣを超えると、移行が非常に明白であり、数百の視覚的に検出可能な粒子（球状フォーカス）が突然形成された。
球状フォーカスのサイズは変化し、ＩＤＲタグ及び使用した二価金属カチオンと相互に関連していることが見出された。球状フォーカスの特定のサイズは重要ではないと判断された。
球状フォーカスは、形状が広く球形の粒子状構造として存在していた。任意の所与のＩＤＲタグ及び任意の所与の二価金属イオンの組み合わせについて、球状フォーカスの集団の平均直径は、標準的な方法を使用して容易に決定することができる。
個々の融合タンパク質を使用した結果を以下に概説する。
Ｇｐ３２－ＨＩＳ２融合タンパク質
これらの条件で検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するのに必要なマグネシウムの最小濃度は１０ｍＭであると決定され、約６００個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
これらの条件で検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するのに必要なマグネシウムの最小濃度は１０ｍＭであると決定され、約６００個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
これらの条件で検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するのに必要なカルシウムイオンの最小濃度は１２ｍＭであると決定され、約５００個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
これらの条件で検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するのに必要なマンガンイオンの最小濃度は２ｍＭであると決定され、約１８０個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
代表的な拡大画像を図１０Ａに示す。
Ｇｐ３２－ＨＲＰ１融合タンパク質
これらの条件において、検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するために必要なマグネシウムイオンの最小濃度は、１６ｍＭであると決定された。この濃度で、約５８０個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
これらの条件において、検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するために必要なマグネシウムイオンの最小濃度は、１６ｍＭであると決定された。この濃度で、約５８０個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
これらの条件で検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するのに必要なカルシウムイオンの最小濃度は、２４ｍＭであると決定された。この濃度で、約２４０個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
これらの条件で検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するのに必要なマンガンイオンの最小濃度は６ｍＭであると決定された。この濃度で、約２６０個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
代表的な拡大画像を図１０Ｂに示す。
Ｇｐ３２－Ｓｕｐ１融合タンパク質
これらの条件において、検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するために必要なマグネシウムイオンの最小濃度は、２４ｍＭであると決定された。この濃度で、約２８０個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
これらの条件において、検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するために必要なマグネシウムイオンの最小濃度は、２４ｍＭであると決定された。この濃度で、約２８０個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
これらの条件で検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するのに必要なカルシウムイオンの最小濃度は、３２ｍＭであると決定された。この濃度で、約４６０個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
これらの条件で検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するのに必要なマンガンイオンの最小濃度は４ｍＭであると決定された。この濃度で、約２２０個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
代表的な拡大画像を図１０Ｃに示す。
Ｇｐ３２－Ｆｉｂ融合タンパク質
これらの条件で検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するのに必要なマグネシウムイオンの最小濃度は、５００μＭであると決定された。この濃度で、約３４０個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
これらの条件で検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するのに必要なマグネシウムイオンの最小濃度は、５００μＭであると決定された。この濃度で、約３４０個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
これらの条件で検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するのに必要なカルシウムイオンの最小濃度は、１ｍＭであると決定された。この濃度で、約５００個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
これらの条件で検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するのに必要なマンガンイオンの最小濃度は、５００μＭであると決定された。この濃度で、約３６０個の粒子（球状フォーカス）が視野内でカウントされた。
代表的な拡大画像を図１０Ｄに示す。
これらのアッセイを使用して、タンパク質にタグ付けされたときのインビトロ生化学環境における検出可能な相分離した水性粒子の形成を増強するＩＤＲ又はＩＤＲドメインの機能的能力は、１０個以上の粒子（球状フォーカス）が２１８μｍ×１７５μｍの拡大領域において倍率４００倍で形成されたときに立証され得ることが決定された。タンパク質にタグ付けされた場合にインビトロ生化学環境において相分離を誘導するＩＤＲ又はＩＤＲドメインの機能的能力は、好ましくは５０個以上の粒子（球状フォーカス）が２１８μｍ×１７５μｍの拡大領域内で倍率４００倍で形成された場合、より好ましくは１００個以上の粒子（球状フォーカス）が形成された場合に立証され得る。
本明細書で使用される「球状フォーカス」という用語は、「小球」、「粒子」又は「球状粒子」と同義であり、これらの用語は互換的に使用することができる。
例１１．多価金属カチオンの存在下でのＩＤＲタグによる球状フォーカスの形成。
実験の目的及び概要
この実験は、インビトロ生化学反応系において、多価金属カチオンが、それぞれが天然変性領域（ＩＤＲ）ドメインアミノ酸配列を含むタグを有するいくつかのＧｐ３２融合タンパク質によって駆動される／引き起こされる相分離の促進に及ぼす影響を評価するために行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、インビトロ生化学反応系において、多価金属カチオンが、それぞれが天然変性領域（ＩＤＲ）ドメインアミノ酸配列を含むタグを有するいくつかのＧｐ３２融合タンパク質によって駆動される／引き起こされる相分離の促進に及ぼす影響を評価するために行われた。
例は、ＩＤＲドメインアミノ酸配列を含むタグが相分離を促進／増強することができ、この効果が様々な多価金属カチオンの存在下で起こることを実証する。
材料及び方法
Ｇｐ３２－Ｆｉｂ融合タンパク質
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＰＧＦＳＰＲＧＧＧＦＧＧＲＧＧＦＧＤＲＧＧＲＧＧＲＧＧＦＧＧＧＲＧＲＧＧＧＦＲＧＲＧＲ（配列番号１）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲドメインタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－Ｆｉｂ融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号６９として提供される（表２３）。
Ｇｐ３２－Ｆｉｂ融合タンパク質
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＰＧＦＳＰＲＧＧＧＦＧＧＲＧＧＦＧＤＲＧＧＲＧＧＲＧＧＦＧＧＧＲＧＲＧＧＧＦＲＧＲＧＲ（配列番号１）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲドメインタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－Ｆｉｂ融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号６９として提供される（表２３）。
Ｇｐ３２－Ｓｕｐ１融合タンパク質
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ（配列番号１９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲドメインタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－Ｓｕｐ１融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号７２（表２３）として提供される。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ（配列番号１９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲドメインタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－Ｓｕｐ１融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号７２（表２３）として提供される。
Ｇｐ３２－ＨＩＳ２融合タンパク質
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－ＨＩＳ２融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号８２として提供される（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－ＨＩＳ２融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号８２として提供される（表２３）。
Ｇｐ３２－ＨＲＰ１融合タンパク質
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－ＨＲＰ１融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号７９として提供される（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－ＨＲＰ１融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号７９として提供される（表２３）。
Ｇｐ３２－ＨＩＳ５融合タンパク質
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＳＧＨＨＧＡＨＨＧＡＨＨＰＡＡＡＡＡＹＥＡＦＲＧＰＧＦＡＧＧＧＧＡＤＤＭＧＡＧＨＨＨＧＡＨＨＡＡＨＨＨＨＡＡＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＡＧＨＧＧＧＡＧＨＨ（配列番号２７）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－ＨＩＳ５融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号８５として示されている。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＳＧＨＨＧＡＨＨＧＡＨＨＰＡＡＡＡＡＹＥＡＦＲＧＰＧＦＡＧＧＧＧＡＤＤＭＧＡＧＨＨＨＧＡＨＨＡＡＨＨＨＨＡＡＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＡＧＨＧＧＧＡＧＨＨ（配列番号２７）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｇｐ３２－ＨＩＳ５融合タンパク質の完全なアミノ酸配列は、配列番号８５として示されている。
相分離アッセイ
以下に概説する方法は、試験したすべての融合タンパク質に適用される。使用した融合タンパク質溶液の体積は、精製後のタンパク質濃度に依存した。
以下に概説する方法は、試験したすべての融合タンパク質に適用される。使用した融合タンパク質溶液の体積は、精製後のタンパク質濃度に依存した。
それぞれの場合において、１０００ｎｇ／μｌ（２９．４μＭ）の最終濃度のタグ付き融合タンパク質及び二価金属カチオンを含む５０μｌの溶液を作製した。試験した金属イオンは、Ｍｇ２＋（ＭｇＯＡｃ）、Ｍｎ２＋（ＭｎＣｌ２）及びＣａ２＋（ＣａＣｌ２）であり、いずれの場合もこれらを２０ｍＭの最終濃度で使用した。
水、ＩＤＲ－タグ付きタンパク質及び多価金属カチオンを含む混合物の構成後、混合物をボルテックスし、スピンダウンし、混合物の１０μｌの試料をＤＨＣ－Ｂ０１ Ｃ－Ｃｈｉｐ血球計スライドに移した。次いで、スライドを、明視野顕微鏡を使用して倍率４００倍で画像化した。相分離を、倍率によって視覚的に同定することができ、血球計を使用してカウントすることができる球状様の球状フォーカス（粒子）の形成によって評価した。
結果及び結論
代表的な拡大画像を図１１Ａ～図１１Ｅに示す。
代表的な拡大画像を図１１Ａ～図１１Ｅに示す。
試験したＩＤＲ－タグ付きＧｐ３２融合タンパク質のそれぞれについて、検出可能な球状様相分離粒子（球状フォーカス）の形成によって決定されるような検出可能な相分離が観察された。いずれの場合も、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋及びＣａ２＋二価金属イオンの存在下で効果が観察された。
したがって、多価金属イオンが相分離を誘導／増強する能力は、全く異なるアミノ酸配列を有する広範囲の異なるＩＤＲタグに適用可能な一般的特性であると思われる。
例１２．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２による球状フォーカスの形成。
実験の目的及び概要
この実験は、クラウディング剤の非存在下での例示的なインビトロ生化学反応環境において球状フォーカスを形成する際の、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の能力を評価するために行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、クラウディング剤の非存在下での例示的なインビトロ生化学反応環境において球状フォーカスを形成する際の、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の能力を評価するために行われた。
例は、ＩＤＲドメインアミノ酸配列を含むタグが、例示的なインビトロ生化学反応環境及びクラウディング剤の非存在下で、検出可能な相分離した水性粒子の形成によって決定されるように、相分離を促進／増強することができたことを実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＲＰ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号７９として示す（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＲＰ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号７９として示す（表２３）。
ＩＤＲドメイン配列タグの効果を試験するために、例示的なインビトロ生化学反応環境を作製した。この場合、環境は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応を特徴とする環境であった。
以下のプロトコルに従って反応を設定した。以下の成分：２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２μＭフォワードプライマー、０．２μＭリバースプライマー、０．５１６μＭプローブ、２２．６μＭ Ｇｐ３２－ＨＲＰ融合物、８．４μＭ ＵｖｓＸ、１５．３μＭ ＵｖｓＹ、０．１３５μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（大サブユニット）、及び０．２７μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて反応混合物を作製した。Ｇｐ３２、ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、ポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼＩＩＩをプレミックスとして調製した後、プライマー、緩衝液、ヌクレオチド及びクレアチンキナーゼの混合物に一段階で添加した。総体積は４４μｌであった。合わせたら、６μｌの２８０ｍＭ ＭｇＯＡｃを混合物に添加して、３３ｍＭの最終濃度を達成した。次いで、１０μｌの反応混合物を、３９℃に設定した加熱ステージに置いたＣチップ血球計スライドに移した後、顕微鏡下で観察し、明視野光条件下及び蛍光条件下で画像を撮影した。
関連するプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー：ＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号９８）。
リバースプライマー：ＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡ（配列番号９９）。
プローブ：ＦＡＭ（フルオレセイン）で標識したＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧ（配列番号１０４）。
結果及び結論
図１２に示すように、Ｇｐ３２に結合したＨＲＰタグは、（蛍光標識プローブによって検出されるように）オリゴヌクレオチド中で高密度であると見られた多くの検出可能な相分離した水性粒子（球状フォーカス）の形成を促進した。
図１２に示すように、Ｇｐ３２に結合したＨＲＰタグは、（蛍光標識プローブによって検出されるように）オリゴヌクレオチド中で高密度であると見られた多くの検出可能な相分離した水性粒子（球状フォーカス）の形成を促進した。
Ｇｐ３２タンパク質をヘプタヒスチジン配列のみでタグ化し、ＨＲＰ ＩＤＲタグでタグ付けしなかったことを除いて、同一の材料及び条件で別個の実験を行った。これらの実験では、球状フォーカスは形成されず（データは示さず）、球状フォーカスの形成がＩＤＲタグによって特異的に駆動されたこと、及びその結果、ヘプタヒスチジン配列が本明細書に記載の機能的ＩＤＲではないことを示している。
結果は、インビトロ生化学反応環境、この場合はリコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応を特徴とする反応混合物環境、及びクラウディング剤の非存在下で、ＩＤＲドメインタグ、この場合は上記のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＲＰ１アミノ酸配列タグによって表されるＩＤＲドメインタグが、検出可能な相分離を促進する機能的能力を実証する。
例１３．ヒトＯｔｘ１由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２による球状フォーカスの形成。
実験の目的及び概要
この実験は、クラウディング剤の非存在下での例示的なインビトロ生化学反応環境において球状フォーカスを形成する際の、ヒトＯｔｘ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の能力を評価するために行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、クラウディング剤の非存在下での例示的なインビトロ生化学反応環境において球状フォーカスを形成する際の、ヒトＯｔｘ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の能力を評価するために行われた。
例は、ＩＤＲドメインアミノ酸配列を含むタグが、例示的なインビトロ生化学反応環境及びクラウディング剤の非存在下で検出可能な相分離を促進することができたことを実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＩＳ２と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８２として示す（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＩＳ２と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８２として示す（表２３）。
ＩＤＲドメイン配列タグの効果を試験するために、例示的なインビトロ生化学反応環境を作製した。この場合、環境は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応を特徴とする環境であった。
以下のプロトコルに従って反応を設定した。以下の成分：２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２μＭフォワードプライマー、０．２μＭリバースプライマー、０．５１６μＭプローブ、２２．６μＭ Ｇｐ３２－ＨＩＳ２融合物、８．４μＭ ＵｖｓＸ、１５．３μＭ ＵｖｓＹ、０．１３５μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（大サブユニット）、及び０．２７μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて反応混合物を作製した。Ｇｐ３２－Ｈｉｓ２、ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、ポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼＩＩＩをプレミックスとして調製した後、プライマー、緩衝液、ヌクレオチド及びクレアチンキナーゼの混合物に一段階で添加した。総体積は４４μｌであった。合わせたら、６μｌの２８０ｍＭ ＭｇＯＡｃを混合物に添加して、３３ｍＭの最終濃度を達成した。次いで、１０μｌの反応混合物を、３９℃に設定した加熱ステージに置いたＣチップ血球計スライドに移した後、顕微鏡下で観察し、明視野光条件下及び蛍光条件下で画像を撮影した。
関連するプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー：ＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号９８）。
リバースプライマー：ＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡ（配列番号９９）。
プローブ：ＦＡＭ（フルオレセイン）で標識したＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧ（配列番号１０４）。
結果及び結論
図１３に示すように、Ｇｐ３２に結合したＨＩＳ２ ＩＤＲタグは、（蛍光標識プローブによって検出されるように）オリゴヌクレオチド中で高密度であると見られた多くの検出可能な相分離した水性粒子（球状フォーカス）の形成を促進した。本明細書中にさらに記載されるように、ＨＲＰ ＩＤＲタグがＧｐ３２に結合したときに形成されるものと比較して、小球のサイズがより小さく見えることに留意されたい。
図１３に示すように、Ｇｐ３２に結合したＨＩＳ２ ＩＤＲタグは、（蛍光標識プローブによって検出されるように）オリゴヌクレオチド中で高密度であると見られた多くの検出可能な相分離した水性粒子（球状フォーカス）の形成を促進した。本明細書中にさらに記載されるように、ＨＲＰ ＩＤＲタグがＧｐ３２に結合したときに形成されるものと比較して、小球のサイズがより小さく見えることに留意されたい。
結果は、インビトロ生化学反応環境、この場合はリコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応を特徴とする反応混合物環境、及びクラウディング剤の非存在下で、ＩＤＲドメインタグ、この場合は上記のＨＩＳ２アミノ酸配列タグによって表されるＩＤＲドメインタグが、検出可能な相分離を促進する機能的能力を実証する。
例１４．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２による球状フォーカスの形成に対する多価金属カチオンの効果。
実験の目的及び概要
この実験を、クラウディング剤の非存在下での例示的なインビトロ生化学反応環境において球状フォーカスを形成する際の、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の能力に対する多価金属カチオンの効果を評価するために行った。
実験の目的及び概要
この実験を、クラウディング剤の非存在下での例示的なインビトロ生化学反応環境において球状フォーカスを形成する際の、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の能力に対する多価金属カチオンの効果を評価するために行った。
例は、ＩＤＲドメインアミノ酸配列を含むタグが、検出可能な相分離した水性粒子の形成によって決定されるように、クラウディング剤の非存在下で相分離を促進／増強することができ、多価金属カチオンの存在下で相分離が増強され、相分離を促進するための最適化された濃度を決定することができることを実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＲＰ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号７９として示す（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＲＰ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号７９として示す（表２３）。
様々な濃度の二価金属カチオンの存在下でＩＤＲドメイン配列タグの効果を試験するために、例示的なインビトロ生化学反応環境を作製した。この場合、環境は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応を特徴とする環境であった。
以下のプロトコルに従って反応を設定した。以下の成分：２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２６μＭフォワードプライマー、０．２６μＭリバースプライマー、０．４μＭプローブ、２２．６μＭ Ｇｐ３２－ＨＲＰ融合物、８．４μＭ ＵｖｓＸ及び１５．３μＭ ＵｖｓＹを用いて反応混合物を作製した。Ｇｐ３２、ＵｖｓＸ及びＵｖｓＹをプレミックスとして調製した後、プライマー、緩衝液、ヌクレオチド及びクレアチンキナーゼの混合物に一段階で添加した。ＭｇＯＡｃを混合物に添加して、関連する図に示す最終濃度を達成した。次いで、１０μｌの反応混合物を、３９℃に設定した加熱ステージに置いたＣチップ血球計スライドに移した後、顕微鏡下で観察し、明視野光条件下及び蛍光条件下で画像を撮影した。
関連するプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー：ＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号９８）。
リバースプライマー：ＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡ（配列番号９９）。
プローブ：ＦＡＭ（フルオレセイン）で標識したＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧ（配列番号１０４）。
結果及び結論
図１４Ａ及び図１４Ｂに示すように、Ｇｐ３２に結合したＨＲＰ ＩＤＲタグは、（蛍光標識プローブによって検出されるように）オリゴヌクレオチド中で高密度であると見られた多くの検出可能な相分離した水性粒子（球状フォーカス）の形成を促進した。
図１４Ａ及び図１４Ｂに示すように、Ｇｐ３２に結合したＨＲＰ ＩＤＲタグは、（蛍光標識プローブによって検出されるように）オリゴヌクレオチド中で高密度であると見られた多くの検出可能な相分離した水性粒子（球状フォーカス）の形成を促進した。
球状フォーカスは、２２．４ｍＭ ＭｇＯＡｃで明確に見えた。球状フォーカスの最適な形成は、３３ｍＭ ＭｇＯＡｃで生じた。３３ｍＭを超える濃度で、小球のいくらかの凝集塊が観察され始めた。
注目すべきことに、３３ｍＭ ＭｇＯＡｃは、本明細書中に記載されるように、クラウディング剤の非存在下でＩＤＲ－タグ付きＧｐ３２を使用するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）反応において最適な増幅効率が観察されるマグネシウムの濃度である。したがって、球状フォーカスのＩＤＲタグ媒介形成の効率は、驚くべきことに、クラウディング剤の非存在下でのインビトロ系における例示的な生化学反応、この場合、試験生化学系の一例としてＩＤＲ－タグ付きタンパク質を使用したＲＰＡ反応における増幅の効率と相関する。
結果は、クラウディング剤の非存在下での生化学反応の効率を駆動／増加させる際のＩＤＲドメイン配列タグの性能が相分離の効率と相関することができ、これが次に、天然変性領域又はドメインの機能に影響を及ぼす系に含まれる多価金属カチオン又はその機能的等価物の濃度によって強化されるように見えるという驚くべき結論を裏付けている。
例１５．ヒトＯｔｘ１由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２による球状フォーカスの形成に対する多価金属カチオンの効果。
実験の目的及び概要
この実験を、クラウディング剤の非存在下での例示的なインビトロ生化学反応環境において粒子／球状フォーカスを形成する際の、ヒトＯｔｘ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを有するＧｐ３２融合タンパク質の能力に対する多価金属カチオンの効果を評価するために行った。
実験の目的及び概要
この実験を、クラウディング剤の非存在下での例示的なインビトロ生化学反応環境において粒子／球状フォーカスを形成する際の、ヒトＯｔｘ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを有するＧｐ３２融合タンパク質の能力に対する多価金属カチオンの効果を評価するために行った。
例は、ＩＤＲドメインアミノ酸配列を含むタグが、例示的なインビトロ生化学反応環境及びクラウディング剤の非存在下で検出可能な相分離を促進することができ、検出可能な相分離が多価金属カチオンの存在によって増強され、検出可能な相分離を促進するための最適化された濃度を決定することができることを実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＩＳ２と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８２として示す（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＩＳ２と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８２として示す（表２３）。
様々な濃度の二価金属カチオンの存在下でＩＤＲドメイン配列タグの効果を試験するために、例示的なインビトロ生化学反応環境を作製した。この場合、環境は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応を特徴とする環境であった。
以下のプロトコルに従って反応を設定した。以下の成分：２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２６μＭフォワードプライマー、０．２６μＭリバースプライマー、０．４μＭプローブ、２０μＭ Ｇｐ３２－ＨＩＳ２融合物、８．４μＭ ＵｖｓＸ及び８．６μＭ ＵｖｓＹを用いて反応混合物を作製した。Ｇｐ３２、ＵｖｓＸ及びＵｖｓＹをプレミックスとして調製した後、プライマー、緩衝液、ヌクレオチド及びクレアチンキナーゼの混合物に一段階で添加した。ＭｇＯＡｃを混合物に添加して、関連する図に示す最終濃度を達成した。次いで、１０μｌの反応混合物を、３９℃に設定した加熱ステージに置いたＣチップ血球計スライドに移した後、顕微鏡下で観察し、明視野光条件下及び蛍光条件下で画像を撮影した。
関連するプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー：ＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号９８）。
リバースプライマー：ＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡ（配列番号９９）。
プローブ：ＦＡＭ（フルオレセイン）で標識したＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧ（配列番号１０４）。
結果及び結論
図１５Ａ及び図１５Ｂに示されるように、Ｇｐ３２に結合したＨＩＳ２タグは、（蛍光標識プローブによって検出されるように）オリゴヌクレオチドにおいて高密度であると見られた多くの球状フォーカスの形成を促進した。
図１５Ａ及び図１５Ｂに示されるように、Ｇｐ３２に結合したＨＩＳ２タグは、（蛍光標識プローブによって検出されるように）オリゴヌクレオチドにおいて高密度であると見られた多くの球状フォーカスの形成を促進した。
球状フォーカスは、２２．４ｍＭ ＭｇＯＡｃで明確に見えた。球状フォーカスの最適な形成は、３３～３９ｍＭ ＭｇＯＡｃの間で生じた。３９ｍＭを超える濃度で、小球のいくらかの凝集塊が観察され始めた。
注目すべきことに、３３ｍＭ～３９ｍＭのＭｇＯＡｃは、本明細書中に記載されるように、クラウディング剤の非存在下でＩＤＲ－タグ付きＧｐ３２を使用するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）反応において最適な増幅効率が観察されるマグネシウムの濃度である。したがって、球状フォーカスのＩＤＲタグ媒介形成の効率は、驚くべきことに、クラウディング剤の非存在下でのインビトロ系における例示的な生化学反応、この場合、試験生化学系の一例としてＩＤＲ－タグ付きタンパク質を使用したＲＰＡ反応における増幅の効率と相関する。
結果は、クラウディング剤の非存在下での生化学反応の効率を駆動／増加させる際のＩＤＲドメイン配列タグの性能が相分離の効率と相関することができ、これが次に、天然変性領域又はドメインの機能に影響を及ぼす系に含まれる多価金属カチオン又はその機能的等価物の濃度によって強化されるように見えるという驚くべき結論を裏付けている。
例１６．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２による球状フォーカスの形成に対するマグネシウム濃度の効果。
実験の目的及び概要
この実験は、クラウディング剤の非存在下での例示的なインビトロ生化学反応環境において球状フォーカスを形成する際の、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の能力に対するマグネシウムイオンの効果を評価するために行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、クラウディング剤の非存在下での例示的なインビトロ生化学反応環境において球状フォーカスを形成する際の、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の能力に対するマグネシウムイオンの効果を評価するために行われた。
例は、ＩＤＲドメインアミノ酸配列を含むタグが、検出可能な相分離した水性粒子の形成によって決定されるように、例示的なインビトロ生化学反応環境及びクラウディング剤の非存在下で相分離を促進／増強することができたこと、相分離がマグネシウムイオンの存在に依存すること、及び反応混合物のすべてのタンパク質成分が、バルク相ではなく相分離粒子と会合していることが見出されたことを実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＲＰ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号７９として示す（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＲＰ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号７９として示す（表２３）。
マグネシウムイオンの存在下又は非存在下のいずれかでＩＤＲドメイン配列タグの効果を試験するために、例示的なインビトロ生化学反応環境を作製した。
以下のプロトコルに従って反応を設定した。以下の成分：２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、０．４μＭフォワードプライマー、０．４μＭリバースプライマー、０．４μＭプローブ、２０．２６μＭ Ｇｐ３２－ＨＲＰ融合物、５μＭ ＵｖｓＸ、８．６７μＭ ＵｖｓＹ、０．１２７μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（大サブユニット）及び０ｍＭ又は３３．６ｍＭのいずれかのＭｇＯＡｃを含む１ｍｌの反応混合物を作製した。
関連するプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー：ＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号９８）。
リバースプライマー：ＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡ（配列番号９９）。
プローブ：ＦＡＭ（フルオレセイン）で標識したＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧ（配列番号１０４）。
完成した混合物の写真を撮影した。
混合物を２，０００ｒｃｆで１分間回転させた。上清をＭｇＯＡｃ混合物から除去した。３３．６ｍＭ ＭｇＯＡｃとの混合物には、相分離した小球／粒子で構成されていると考えられる小さなペレットが残っていた。ＭｇＯＡｃを含まない混合物では、同様のペレットは見られなかった。１０μｌの１％ ＳＤＳ溶液を可溶化のためにペレットに添加した。ペレットの体積は４．５μｌと推定され、推定総体積は１４．５μｌであった。各試料１μｌをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
結果及び結論
図１６Ａに示すように、１ｍｌのＲＰＡ混合物に酢酸マグネシウムを添加すると、混合物が不透明になった。これは、酢酸マグネシウムの非存在下では観察されなかった。この不透明な効果は、同等のより小さな反応で見られるのと同じ効果であり、顕微鏡法によって２～３ミクロンの範囲、典型的にはナノリットル当たり約２００～４００粒子であると推定される典型的な直径を有する球状フォーカス／相分離粒子が形成されることが観察された場合であった。遠心分離に供した場合、これらの不透明な混合物は清澄化され、ペレット又は下相がチューブの底部に形成されるのが見られ、これは、一緒になって単一の体積にされた粒子の塊であると仮定された（図１６Ｂ）。このペレット画分の推定体積は約４μｌであり、これは、３μｍの平均粒径（したがって、約１３フェムトリットルの体積）及びナノリットル当たり約４００個の粒子の存在量を仮定して形成されると予想される粒子の予測総体積であり、血球計／顕微鏡視野計算に基づいて４０万個粒子／マイクロリットルであり、混合物１マイクロリットル当たり約５ｎｌの粒子、したがって混合物ｍｌ当たり約５マイクロリットルの推定体積を生成する。
図１６Ａに示すように、１ｍｌのＲＰＡ混合物に酢酸マグネシウムを添加すると、混合物が不透明になった。これは、酢酸マグネシウムの非存在下では観察されなかった。この不透明な効果は、同等のより小さな反応で見られるのと同じ効果であり、顕微鏡法によって２～３ミクロンの範囲、典型的にはナノリットル当たり約２００～４００粒子であると推定される典型的な直径を有する球状フォーカス／相分離粒子が形成されることが観察された場合であった。遠心分離に供した場合、これらの不透明な混合物は清澄化され、ペレット又は下相がチューブの底部に形成されるのが見られ、これは、一緒になって単一の体積にされた粒子の塊であると仮定された（図１６Ｂ）。このペレット画分の推定体積は約４μｌであり、これは、３μｍの平均粒径（したがって、約１３フェムトリットルの体積）及びナノリットル当たり約４００個の粒子の存在量を仮定して形成されると予想される粒子の予測総体積であり、血球計／顕微鏡視野計算に基づいて４０万個粒子／マイクロリットルであり、混合物１マイクロリットル当たり約５ｎｌの粒子、したがって混合物ｍｌ当たり約５マイクロリットルの推定体積を生成する。
酢酸マグネシウムの添加前後の１マイクロリットルのバルク混合物（又は清澄相）の分析は、添加前に様々なタンパク質が清澄な液体で予想されるように同定され得ることを示し、Ｇｐ３２は質量で最も突出したタンパク質である。凝縮及び清澄の後、微量のタンパク質のみが上清中に見出すことができるが、ペレットはＲＰＡ混合物に添加されたすべてのタンパク質が非常に豊富である（図１６Ｃ）。推定により、およそ２００倍の濃度の反応物が達成され、総タンパク質がおよそ２００μｇ／μｌの濃度であったと仮定することができる。
結果は、ＲＰＡ反応混合物のすべてのタンパク質成分、すなわちクレアチンキナーゼ、Ｇｐ３２－ＨＲＰ融合物、ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ及びポリメラーゼが、バルク相ではなく相分離粒子に会合することを実証している。
例１７．生化学反応の効率を高めることにおける天然変性領域を含むアミノ酸配列の本質的な性質の実証。
実験の目的及び概要
この実験は、クラウディング剤の存在下又は非存在下のいずれかでの例示的なインビトロ生化学反応環境において、天然変性領域（ＩＤＲ）を含むアミノ酸配列を含むタグを欠くＧｐ３２タンパク質の性能を評価するために行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、クラウディング剤の存在下又は非存在下のいずれかでの例示的なインビトロ生化学反応環境において、天然変性領域（ＩＤＲ）を含むアミノ酸配列を含むタグを欠くＧｐ３２タンパク質の性能を評価するために行われた。
この例は、ＩＤＲドメインアミノ酸配列を含むタグの非存在下では、Ｇｐ３２は、クラウディング剤の非存在下ではリコンビナーゼポリメラーゼ増幅を効率的に、かつ分析期間内にこのアッセイ系で検出が行われた時点まで媒介することができなかったことを実証する。例１～５などの上記の他の例と比較すると、これらのデータは、ＩＤＲドメインアミノ酸配列を含むタグが、クラウディング剤の非存在下での生化学反応の効率を高めるのに必須であることを立証する。
材料及び方法
ファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２タンパク質を、外因性ＩＤＲタグ又はヒスチジンタグのいずれの形態も欠くその天然形態で精製した。ヘパリン樹脂を用いてタンパク質を精製し、ＮａＣｌ工程勾配で溶出した。４００ｍＭ ＮａＣｌ画分からの天然Ｇｐ３２タンパク質を試験に供した。
ファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２タンパク質を、外因性ＩＤＲタグ又はヒスチジンタグのいずれの形態も欠くその天然形態で精製した。ヘパリン樹脂を用いてタンパク質を精製し、ＮａＣｌ工程勾配で溶出した。４００ｍＭ ＮａＣｌ画分からの天然Ｇｐ３２タンパク質を試験に供した。
クラウディング剤の存在下又は非存在下のいずれかでネイティブＧｐ３２タンパク質の効果を試験するために、例示的なインビトロ生化学反応環境を作製した。
以下のプロトコルに従って反応を設定した。
以下の成分：２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＭフォワードプライマー、０．４μＭリバースプライマー、０．１２μＭプローブ、２０μＭ天然Ｇｐ３２タンパク質、４．８μＭ ＵｖｓＸ、８．６μＭ ＵｖｓＹ、０．１３５μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（大サブユニット）及び０．２７μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩを含むＰＥＧ非含有反応混合物を作製した。
ＰＥＧベースの反応混合物を、以下の成分：５０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、１００ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、５０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＭフォワードプライマー、０．４μＭリバースプライマー、０．１２μＭプローブ、２０μＭ天然Ｇｐ３２タンパク質、４．８μＭ ＵｖｓＸ、８．６μＭ ＵｖｓＹ、０．２７μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（大サブユニット）、０．２７μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩ及び関連する図に示す最終濃度のＰＥＧを用いて作製した。使用したＰＥＧの種は、ＰＥＧ分子量３５，０００であった。
すべての反応において、関連するプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー：ＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号９８）。
リバースプライマー：ＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡ（配列番号９９）。
プローブ：ＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＡＧ［ＦＡＭ］ ［ＴＨＦ］［ＢＨＱ－１］ＡＴＡＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡ（配列番号１００）、式中、ＦＡＭはフルオレセインであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＢＨＱはブラックホールクエンチャーである。
すべての反応を、３３ｍＭ ＭｇＯＡｃ及び１００コピーのリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ鋳型の添加によって開始した。次いで、反応物を３９℃でインキュベートし、ベアリングボールを使用して磁気混合しながら蛍光光度計に入れた。
結果及び結論
図１７に示すように、５．５％ ＰＥＧの存在下で天然Ｇｐ３２タンパク質による迅速な増幅が観察された。しかし、ＰＥＧの非存在下での天然Ｇｐ３２タンパク質では増幅は観察されなかった。
図１７に示すように、５．５％ ＰＥＧの存在下で天然Ｇｐ３２タンパク質による迅速な増幅が観察された。しかし、ＰＥＧの非存在下での天然Ｇｐ３２タンパク質では増幅は観察されなかった。
上記の他の例、例えば例１～５では、Ｇｐ３２タンパク質が天然変性領域（ＩＤＲ）を含むアミノ酸配列でタグ付けされた場合にのみ、ＰＥＧの非存在下でＧｐ３２媒介増幅が観察された。
したがって、本明細書に記載される他の例に提示されるデータと合わせて、これらのデータは、インビトロ生化学反応の機能に不可欠なタンパク質成分に適用される天然変性領域（ＩＤＲ）を含むアミノ酸配列を含むタグが、反応におけるクラウディング剤の必要性を回避することができ、ＩＤＲタグ配列の非存在下で観察される効率と比較して生化学反応の効率を高めることを立証する。
例１８．ヒトＯｔｘ１由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２を使用した固体表面でのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅。
実験の目的及び概要
この実験は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１の天然変性領域（ＩＤＲ）に見出されるヒスチジンリッチアミノ酸ドメイン配列を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１の天然変性領域（ＩＤＲ）に見出されるヒスチジンリッチアミノ酸ドメイン配列を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の性能を評価するために行われた。
この例は、リアルタイム及び終点アッセイの両方において、クラウディング剤の非存在下でヒスチジンリッチ天然変性領域（ＩＤＲ）ドメイン（Ｏｔｘ１）でＣ末端にタグ付けされたＧｐ３２を使用した固体表面上の人工核酸鋳型のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＩＳ２と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８２として示す（表２３）。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＧｐ３２－ＨＩＳ２と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８２として示す（表２３）。
次いで、組換えファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２融合タンパク質を、ＰＥＧ非含有増幅において、すなわちクラウディング剤の非存在下で、固体表面上で試験した。試験は、異なる割合でビーズの表面に結合した２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施した。増幅は、切断可能なクエンチされた蛍光プローブを使用してリアルタイムで、又はアニーリングされた蛍光プローブの終点検出によって、蛍光によって検出された。リアルタイム及び終点ＲＰＡ反応の両方において、ビーズは同じであった。ビーズは、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂａｎｇｓｌａｂｓ．ｃｏｍ／）から供給され、カルボキシル化されたポリスチレンコアを有し、その上にヒドロゲルが成長し、オリゴヌクレオチドが共有結合していた。
リアルタイムＲＰＡ反応
２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、１２０ｎＭプローブ、２０μＭ Ｇｐ３２融合物、４．９μＭ ＵｖｓＸ、７．６μＭ ＵｖｓＹ、０．１４６μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ及び０．３４μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩを混合することによって反応を設定した。反応混合物はまた、８０万個のビーズ／μｌを含み、各ビーズは、ＰＡ３０フォワードプライマーとＰＢ３０リバースプライマーの混合物からなるビーズあたり約７５万個のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。
２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、１２０ｎＭプローブ、２０μＭ Ｇｐ３２融合物、４．９μＭ ＵｖｓＸ、７．６μＭ ＵｖｓＹ、０．１４６μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ及び０．３４μＭエキソヌクレアーゼＩＩＩを混合することによって反応を設定した。反応混合物はまた、８０万個のビーズ／μｌを含み、各ビーズは、ＰＡ３０フォワードプライマーとＰＢ３０リバースプライマーの混合物からなるビーズあたり約７５万個のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。
反応は、３３．６ｍＭ ＭｇＯＡｃ及びＴＦ１Ｌと呼ばれる人工ＤＮＡ鋳型を、反応混合物１μｌ当たり８０万鋳型コピーの最終濃度で添加することによって開始した。
関連するプライマー、プローブ及び鋳型を以下に示す。
ＰＡ３０フォワードプライマー：ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧ（配列番号１０５）。
ＰＢ３０リバースプライマー：ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧ（配列番号１０６）。
プローブ：ＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＴＡＣＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡ［ｄＴ－ＦＡＭ］Ｇ［ＴＨＦ］Ｇ［ｄＴ－クエンチャー］ＡＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＣＣ（配列番号１０７）、式中、ＦＡＭはフルオレセインであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、クエンチャーはブラックホールクエンチャーである。
ＴＦ１Ｌ鋳型配列：ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＧＧＧＴＴＡＡＡＡＧＧＴＴＴＣＧＡＡＣＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＧＧＣＧＧＴＡＴＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＣＡＴＧＴＣＴＡＡＡＴＴＧＴＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＣＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧＧＧＡＴＡＧＧ（配列番号１０８）。
次いで、反応物をＴ８蛍光光度計において３９℃で３０分間インキュベートし、ＦＡＭチャネルにおける蛍光を記録した。
図１８Ａは、デュアルプライマービーズを使用したリアルタイム増幅のために設定された反応混合物を描いた模式図である。図１８Ｂは、リアルタイム反応における増幅産物を描いた模式図である。
終点ＲＰＡ反応
２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、２０μＭ Ｇｐ３２融合物、４．９μＭ ＵｖｓＸ、７．６μＭ ＵｖｓＹ及び０．１４６μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼを混合することによって反応を設定した。反応混合物はまた、８０万個のビーズ／μｌを含み、各ビーズは、ＰＡ３０フォワードプライマーとＰＢ３０リバースプライマーの混合物からなるビーズあたり約７５万個のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。
２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、２０μＭ Ｇｐ３２融合物、４．９μＭ ＵｖｓＸ、７．６μＭ ＵｖｓＹ及び０．１４６μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼを混合することによって反応を設定した。反応混合物はまた、８０万個のビーズ／μｌを含み、各ビーズは、ＰＡ３０フォワードプライマーとＰＢ３０リバースプライマーの混合物からなるビーズあたり約７５万個のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。
反応は、３３．６ｍＭ ＭｇＯＡｃ及びＴＦ１Ｌと呼ばれる人工ＤＮＡ鋳型を、反応混合物１μｌ当たり８０万鋳型コピーの最終濃度で添加することによって開始した。
関連するプライマー及び鋳型を以下に示す。
ＰＡ３０フォワードプライマー：ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧ（配列番号１０５）。
ＰＢ３０リバースプライマー：ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧ（配列番号１０６）。
ＴＦ１Ｌ鋳型配列：ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＧＧＧＴＴＡＡＡＡＧＧＴＴＴＣＧＡＡＣＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＧＧＣＧＧＴＡＴＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＣＡＴＧＴＣＴＡＡＡＴＴＧＴＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＣＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧＧＧＡＴＡＧＧ（配列番号１０８）。
次いで、反応物を３９℃で３０分間インキュベートし、次いで、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を１％最終濃度まで添加し、６５℃に１０分間加熱してタンパク質を変性させることによって停止させた。
ＳＤＳを、水で１０倍に希釈し、ボルテックスし、約１８，０００ｇで１５分間遠心分離し、次いで上清を除去することによって除去した。ビーズをＴＥ ｐＨ８．０、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００緩衝液に再懸濁して、約８０万ビーズ／μｌを得た。
２つの蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（ＲＯＸがカルボキシローダミンであり、ＦＡＭがフルオレセインであるＰＢ３０’プローブ（ＲＯＸ－５’－ＣＴＧＡＧＡＣＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧＧＧＡＴＡＧＧ；配列番号１０９）及びＴＦ１Ｌプローブ（ＦＡＭ－５’－ＧＧＴＴＴＣＧＡＡＣＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧ；配列番号１１０））を、ＴＥ ｐＨ８．０、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中で、両方のプローブを１μＭ及び８万ビーズ／μｌの最終濃度で、ビーズにハイブリダイズさせた。９５℃まで２分間加熱した後、２５℃まで０．１℃／秒で冷却してハイブリダイゼーションを行った。陽性対照は、既にＴＦ１Ｌアンプリコンが結合しているビーズを使用して実行した。次いで、ビーズを洗浄して、ハイブリダイゼーション混合物をＴＥ ｐＨ８．０、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００緩衝液で６倍希釈し、約１８，０００ｇで１５分間遠心分離することによって未ハイブリダイズのプローブを除去し、次いで可能な限り多くの上清を除去した。ビーズをＴＥ ｐＨ８．０、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００緩衝液に再懸濁した。次いで、反応物をＴ８蛍光光度計（ＦＡＭレベルを１７％に設定、ＲＯＸレベルを８％に設定）において３９℃で５分間インキュベートし、ＦＡＭ及びＲＯＸチャネルにおける蛍光を記録した。
図１８Ｃは、終点反応における増幅特性評価を描いた模式図である。
結果
リアルタイムＲＰＡ反応
図１８Ｄは、特異的エキソヌクレアーゼ切断プローブを用いたＴＦ１Ｌアンプリコンのリアルタイム蛍光検出を示す。図中に特定されるＰＡ３０プライマーのパーセンテージは、ＰＡ３０オリゴヌクレオチドであるビーズ結合オリゴヌクレオチドのパーセンテージを示し、ビーズ結合オリゴヌクレオチドの残りはＰＢ３０オリゴヌクレオチドである。増幅は、すべてのＰＡ３０及びＰＢ３０オリゴヌクレオチドプライマーがビーズに結合している場合、並びにＰＡ３０及びＰＢ３０オリゴヌクレオチドプライマーが液相にある場合、又はＰＢ３０がビーズに結合しておりＰＡ３０が液相にある場合に検出される。ビーズ上にＰＢ３０のみが存在する場合、及びＰＡ３０が存在しない場合、増幅は検出されなかった。
リアルタイムＲＰＡ反応
図１８Ｄは、特異的エキソヌクレアーゼ切断プローブを用いたＴＦ１Ｌアンプリコンのリアルタイム蛍光検出を示す。図中に特定されるＰＡ３０プライマーのパーセンテージは、ＰＡ３０オリゴヌクレオチドであるビーズ結合オリゴヌクレオチドのパーセンテージを示し、ビーズ結合オリゴヌクレオチドの残りはＰＢ３０オリゴヌクレオチドである。増幅は、すべてのＰＡ３０及びＰＢ３０オリゴヌクレオチドプライマーがビーズに結合している場合、並びにＰＡ３０及びＰＢ３０オリゴヌクレオチドプライマーが液相にある場合、又はＰＢ３０がビーズに結合しておりＰＡ３０が液相にある場合に検出される。ビーズ上にＰＢ３０のみが存在する場合、及びＰＡ３０が存在しない場合、増幅は検出されなかった。
終点ＲＰＡ反応
ＴＦ１Ｌアンプリコンの終点蛍光検出を、ＰＢ３０オリゴヌクレオチドプライマー（ＲＯＸ標識、図１８Ｅ）及びＴＦ１Ｌアンプリコン（ＦＡＭ標識、図１８Ｆ）に特異的なプローブを使用して観察した。図中に指定されるパーセンテージは、ＰＡ３０オリゴヌクレオチドであるビーズ結合オリゴヌクレオチドのパーセンテージを示し、ビーズ結合オリゴヌクレオチドの残りはＰＢ３０オリゴヌクレオチドである。以下の表は、各ビーズタイプの蛍光レベル、ＴＦ１Ｌプローブ蛍光対ＰＢ３０’プローブ蛍光の比、及び不完全な洗浄によって引き起こされるバックグラウンド蛍光を説明するためにＴＦ１Ｌアンプリコンが直接結合した未増幅対照ビーズに対して正規化された同じ比を示す。
ＴＦ１Ｌアンプリコンの終点蛍光検出を、ＰＢ３０オリゴヌクレオチドプライマー（ＲＯＸ標識、図１８Ｅ）及びＴＦ１Ｌアンプリコン（ＦＡＭ標識、図１８Ｆ）に特異的なプローブを使用して観察した。図中に指定されるパーセンテージは、ＰＡ３０オリゴヌクレオチドであるビーズ結合オリゴヌクレオチドのパーセンテージを示し、ビーズ結合オリゴヌクレオチドの残りはＰＢ３０オリゴヌクレオチドである。以下の表は、各ビーズタイプの蛍光レベル、ＴＦ１Ｌプローブ蛍光対ＰＢ３０’プローブ蛍光の比、及び不完全な洗浄によって引き起こされるバックグラウンド蛍光を説明するためにＴＦ１Ｌアンプリコンが直接結合した未増幅対照ビーズに対して正規化された同じ比を示す。
結論
リアルタイム及び終点アッセイの両方において、Ｇｐ３２－ＨＩＳ２融合タンパク質を使用して、ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下での核酸増幅が効率的に起こることが見出された。
リアルタイム及び終点アッセイの両方において、Ｇｐ３２－ＨＩＳ２融合タンパク質を使用して、ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下での核酸増幅が効率的に起こることが見出された。
例１９．天然変性領域を含むアミノ酸配列の同定。
ファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２、Ｔ４ ＵｖｓＹ及びＴ４ ＵｖｓＸのアミノ酸配列を、ＭｅｔａＤｉｓｏｒｄｅｒソフトウェアプログラム（ＭｅｔａＤｉｓｏｒｄｅｒ：タンパク質の天然変性を予測するためのメタサーバー。Ｋｏｚｌｏｗｓｈｉ，Ｌ．Ｐ．ら、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１２，１３（１）：１１１）によって調べた。
ファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２、Ｔ４ ＵｖｓＹ及びＴ４ ＵｖｓＸのアミノ酸配列を、ＭｅｔａＤｉｓｏｒｄｅｒソフトウェアプログラム（ＭｅｔａＤｉｓｏｒｄｅｒ：タンパク質の天然変性を予測するためのメタサーバー。Ｋｏｚｌｏｗｓｈｉ，Ｌ．Ｐ．ら、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１２，１３（１）：１１１）によって調べた。
図１９Ａ、図１９Ｂ及び図１９Ｃにそれぞれ示すように、ファージｖＢ ＥｃｏＭ ＮＢＧ１ Ｇｐ３２、Ｔ４ ＵｖｓＹ及びＴ４ ＵｖｓＸの全長アミノ酸配列は、アルゴリズムによって分析した場合に０．５を超えるスコアを有するアミノ酸配列ストレッチを含み、したがって天然変性領域配列を含む。
この例は、天然変性領域配列又はそのドメインが、標準的な分析方法を用いて容易に同定され得ることを実証する。
例２０．ヒトＯｔｘ１由来のＩＤＲタグを有するＲＢ６９リガーゼとＲＢ６９リガーゼの相分離促進活性の比較
実験の目的及び概要
この実験は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１（Ｈｉｓ２タグ）の天然変性領域（ＩＤＲ）に見出されるヒスチジンリッチアミノ酸ドメイン配列を含むタグを含むリガーゼ酵素融合タンパク質調製物の相分離促進活性を評価するめに行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１（Ｈｉｓ２タグ）の天然変性領域（ＩＤＲ）に見出されるヒスチジンリッチアミノ酸ドメイン配列を含むタグを含むリガーゼ酵素融合タンパク質調製物の相分離促進活性を評価するめに行われた。
実験は、クラウディング剤の非存在下でのＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２による相分離した水性粒子（球状フォーカス）の形成がＭｇ２＋濃度によって増強されたが、ＲＢ６９リガーゼによる球状フォーカスの形成は、Ｍｇ２＋濃度とほとんど又は全く相関しなかったことを実証した。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４、表１）であった。これをＲＢ６９ ＤＮＡリガーゼのＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質及びＩＤＲ非含有タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジン及びＩＤＲ非含有タンパク質のＣ末端のポリヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。融合タンパク質をＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２と命名し、ＩＤＲ非含有タンパク質をＲＢ６９リガーゼと命名した。タンパク質の完全なアミノ酸配列を、下記のTable 24にそれぞれ配列番号１１１及び配列番号１１２として示されている。
Table 24
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４、表１）であった。これをＲＢ６９ ＤＮＡリガーゼのＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質及びＩＤＲ非含有タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジン及びＩＤＲ非含有タンパク質のＣ末端のポリヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。融合タンパク質をＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２と命名し、ＩＤＲ非含有タンパク質をＲＢ６９リガーゼと命名した。タンパク質の完全なアミノ酸配列を、下記のTable 24にそれぞれ配列番号１１１及び配列番号１１２として示されている。
Table 24
実験で使用したプローブオリゴは、ＦＡＭ（フルオレセイン）で標識したＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧ（配列番号１０４）であった。
１ｍｇ／ｍｌの最終濃度のリガーゼ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．４μＭのＦＡＭ－オリゴ及び関連する図に示される標的濃度のＭｇＣｌ２を含む５０μｌ溶液を作製した。次いで、１０μｌの反応混合物をＣチップ血球計スライドに移し、明視野光条件下及び蛍光条件下で画像を撮影した。
結果及び結論
図２０に示すように、ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２は、Ｍｇ２＋の存在下で（蛍光標識によって検出されるように）オリゴヌクレオチドプローブにおいて高密度であると見られた多くの相分離した水性粒子（球状フォーカス）の形成を増強した。タグなしＲＢ６９リガーゼは、２０ｍＭ Ｍｇ２＋でさえ、球状フォーカス形成の増強にほとんど効果がなかった。
図２０に示すように、ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２は、Ｍｇ２＋の存在下で（蛍光標識によって検出されるように）オリゴヌクレオチドプローブにおいて高密度であると見られた多くの相分離した水性粒子（球状フォーカス）の形成を増強した。タグなしＲＢ６９リガーゼは、２０ｍＭ Ｍｇ２＋でさえ、球状フォーカス形成の増強にほとんど効果がなかった。
例２１．ヒトＯｔｘ１由来のＩＤＲタグを有するＲＢ６９リガーゼのリガーゼ活性性能の評価。
実験の目的及び概要
この実験は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１（Ｈｉｓ２タグ）の天然変性領域（ＩＤＲ）に見られるヒスチジンリッチアミノ酸ドメイン配列を含むタグを含むリガーゼ酵素融合タンパク質調製物のリガーゼ活性性能を評価するめに行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１（Ｈｉｓ２タグ）の天然変性領域（ＩＤＲ）に見られるヒスチジンリッチアミノ酸ドメイン配列を含むタグを含むリガーゼ酵素融合タンパク質調製物のリガーゼ活性性能を評価するめに行われた。
この実験は、ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２の濃度を増加させると、二重連結産物が増加することを実証した。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４、表１）であった。これをＲＢ６９ ＤＮＡリガーゼのＣ末端に結合させた。組換えＩＤＲ融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２と命名した。タンパク質の完全なアミノ酸配列を上記の表２４に示す。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４、表１）であった。これをＲＢ６９ ＤＮＡリガーゼのＣ末端に結合させた。組換えＩＤＲ融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２と命名した。タンパク質の完全なアミノ酸配列を上記の表２４に示す。
連結鋳型は、ｐＵＣ１９ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）から増幅された１７０ｂｐ断片（Ｌｉｇ１７０）であった。２５μｌのＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２μＭのＬｉｇ１７０＿ＦＷプライマー、０．２μＭのＬｉｇ１７０＿ＲＶプライマー、１ｐｇのｐＵＣ１９を混合することによって、５０μｌの増幅反応を設定した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で５分間の最終伸長を行った。増幅産物を２％アガロースゲルで泳動した。標的ＤＮＡのバンドを切除し、Ｍｏｎａｒｃｈ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって精製した。ＤＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって５’末端でさらにリン酸化した。１ｘ反応緩衝液Ａ、１ｍＭ ＡＴＰ、１Ｕ Ｔ４ ＰＮＫ及び前の工程からのＤＮＡを混合することによって、５０μｌのリン酸化反応を設定した。リン酸化反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。５’－リン酸化二本鎖ＤＮＡをＭｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ＆ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって精製し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量した。
関連するプライマー及び鋳型配列を以下に示す。
Ｌｉｇ１７０＿ＦＷプライマー：５’－ＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡ－３’（配列番号１１３）。
Ｌｉｇ１７０＿ＲＶプライマー：５’－ＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣ－３’（配列番号１１４）。
Ｌｉｇ１７０鋳型：５’－ＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴ
ＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴ－３’（配列番号１１５）。
ＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴ－３’（配列番号１１５）。
Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターは、１．５μＭのＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ５及び１．５μＭのＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ７ｒｃ＿ＩＤＸ０１の２つのオリゴをアニーリングすることによって調製した。アニーリングプロセスは、オリゴ混合物を９５℃に加熱し、０．１℃／分の速度で１４℃に冷却した。
ＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ５：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’（配列番号１１６）。
ＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ７ｒｃ＿ＩＤＸ０１：５’－ＰＯ４－ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’（配列番号１１７）。
ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２は３５ｍｇ／ｍｌであり、作業用ストックとして１ｍｇ／ｍｌに希釈した。１ｎｇ／μｌの最終濃度でＴ４ ＰＮＫ処理Ｌｉｇ１７０、１８７．５ｎＭ Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター、５％ ＰＥＧ３５０００、１ｘ Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及び最終濃度０．１／０．２／０．３／０．４ｍｇ／ｍｌのＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２を含む２０μｌ溶液を作製した。連結反応を１６℃で２０分間及び６５℃で１５分間行った。アガロースゲルで可視化するために、各反応条件に対して８つの並行反応を設定し、２％アガロースゲルに充填する前に合わせた。ゲル画像をＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって分析し、バンドの光学密度をＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）によってプロットした。
結果及び結論
図２１に示すように、ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２の濃度が増加すると、二重連結産物が増加した。０．４ｍｇ／ｍｌのＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２を２０μｌの反応物（図中０．８μｇ）に使用した場合、９３．５％の鋳型をＩｌｌｕｍｉｎａアダプターによって両末端で連結することができた。
図２１に示すように、ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２の濃度が増加すると、二重連結産物が増加した。０．４ｍｇ／ｍｌのＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２を２０μｌの反応物（図中０．８μｇ）に使用した場合、９３．５％の鋳型をＩｌｌｕｍｉｎａアダプターによって両末端で連結することができた。
例２２．ヒトＯｔｘ１由来のＩＤＲタグを有するＲＢ６９リガーゼとＲＢ６９リガーゼのリガーゼ活性性能の比較。
実験の目的及び概要
この実験は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１（Ｈｉｓ２タグ）の天然変性領域（ＩＤＲ）に見られるヒスチジンリッチアミノ酸ドメイン配列を含むタグを含むリガーゼ酵素融合タンパク質調製物の活性性能を評価するめに行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１（Ｈｉｓ２タグ）の天然変性領域（ＩＤＲ）に見られるヒスチジンリッチアミノ酸ドメイン配列を含むタグを含むリガーゼ酵素融合タンパク質調製物の活性性能を評価するめに行われた。
実験は、Ｈｉｓ２タグが、タグなしＲＢ６９リガーゼの効率と比較して、ＲＢ６９リガーゼのＴＡ連結効率を有意に増加させ得ることを実証した。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４、表１）であった。これをＲＢ６９ ＤＮＡリガーゼのＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質及びＩＤＲ非含有タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジン及びＩＤＲ非含有タンパク質のＣ末端のポリヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。融合タンパク質をＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２と命名し、ＩＤＲ非含有タンパク質をＲＢ６９リガーゼと命名した。タンパク質の完全なアミノ酸配列を上記の表２４に示す。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４、表１）であった。これをＲＢ６９ ＤＮＡリガーゼのＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質及びＩＤＲ非含有タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジン及びＩＤＲ非含有タンパク質のＣ末端のポリヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。融合タンパク質をＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２と命名し、ＩＤＲ非含有タンパク質をＲＢ６９リガーゼと命名した。タンパク質の完全なアミノ酸配列を上記の表２４に示す。
連結鋳型は、ｐＵＣ１９ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）から増幅された１７０ｂｐ断片（Ｌｉｇ１７０）であった。２５μｌのＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２μＭのＬｉｇ１７０＿ＦＷプライマー、０．２μＭのＬｉｇ１７０＿ＲＶプライマー、１ｐｇのｐＵＣ１９を混合することによって、５０μｌの増幅反応を設定した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で５分間の最終伸長を行った。増幅産物を２％アガロースゲルで泳動した。標的ＤＮＡのバンドを切除し、Ｍｏｎａｒｃｈ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって精製した。ＤＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって５’末端でさらにリン酸化した。１ｘ反応緩衝液Ａ、１ｍＭ ＡＴＰ、１Ｕ Ｔ４ ＰＮＫ及び前の工程からのＤＮＡを混合することによって、５０μｌのリン酸化反応を設定した。リン酸化反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。５’－リン酸化二本鎖ＤＮＡをＭｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ＆ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって精製し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量した。
関連するプライマー及び鋳型配列を以下に示す。
Ｌｉｇ１７０＿ＦＷプライマー：５’－ＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡ－３’（配列番号１１３）。
Ｌｉｇ１７０＿ＲＶプライマー：５’－ＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣ－３’（配列番号１１４）。
Ｌｉｇ１７０鋳型：５’－ＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴ
ＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴ－３’（配列番号１１５）。
ＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴ－３’（配列番号１１５）。
Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターは、１．５μＭのＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ５及び１．５μＭのＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ７ｒｃ＿ＩＤＸ０１の２つのオリゴをアニーリングすることによって調製した。アニーリングプロセスは、オリゴ混合物を９５℃に加熱し、０．１℃／分の速度で１４℃に冷却した。
ＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ５：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’（配列番号１１６）。
ＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ７ｒｃ＿ＩＤＸ０１：５’－ＰＯ４－ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’（配列番号１１７）。
ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２は３５ｍｇ／ｍｌであり、ＲＢ６９リガーゼは２７．７５ｍｇ／ｍｌであった。それらを作業用ストックとして１ｍｇ／ｍｌに希釈した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼをＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量し、作業用ストックとして１ｍｇ／ｍｌに希釈した。１ｎｇ／ｕｌの最終濃度でＴ４ ＰＮＫ処理Ｌｉｇ１７０、１８７．５ｎＭ Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター、５％ ＰＥＧ３５０００、１ｘ Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及び最終濃度０．０７５ｍｇ／ｍｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ／ＲＢ６９リガーゼ／ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２を含む２０μｌ溶液を作製した。連結反応を１６℃で２０分間及び６５℃で１５分間行った。ＤＮＡを、製造元の指示に従って、ＰＣＲビーズ用の０．８ｘ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって精製した。精製したＤＮＡを２５μｌのＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２μＭのＩＬＭＮ＿Ｐ５プライマー、０．２μＭのＩＬＭＮ＿Ｐ７プライマーと混合した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１０サイクル、続いて７２℃で５分間の最終伸長を行った。増幅産物をＰＣＲビーズ用の１ｘ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰによって精製した。精製したＤＮＡをＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキットによって定量し、ＤＮＡの量をＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）によってプロットした。
ＩＬＭＮ＿Ｐ５：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１１８）
ＩＬＭＮ＿Ｐ７：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧ－３’（配列番号１１９）
結果及び結論
図２２に示すように、二重連結産物のみを増幅することができた。ＲＢ６９リガーゼ及びＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２の両方が、有意に増加した連結効率を示した。特に、ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２は、連結効率の最大３．１倍の増進を有することができた。
図２２に示すように、二重連結産物のみを増幅することができた。ＲＢ６９リガーゼ及びＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２の両方が、有意に増加した連結効率を示した。特に、ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２は、連結効率の最大３．１倍の増進を有することができた。
例２３．ヒトＯｔｘ１由来のＩＤＲタグを有するＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩリガーゼとＲＢ６９リガーゼのリガーゼ活性性能の比較
実験の目的及び概要
この実験は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１（Ｈｉｓ２タグ）の天然変性領域（ＩＤＲ）に見られるヒスチジンリッチアミノ酸ドメイン配列を含むタグを含有するリガーゼ酵素融合タンパク質調製物と比較して、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘの活性性能を評価するために行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１（Ｈｉｓ２タグ）の天然変性領域（ＩＤＲ）に見られるヒスチジンリッチアミノ酸ドメイン配列を含むタグを含有するリガーゼ酵素融合タンパク質調製物と比較して、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘの活性性能を評価するために行われた。
実験は、ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２が、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと比較して有意に増強された連結効率を有することを実証した。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをＲＢ６９ ＤＮＡリガーゼのＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２と命名した。タンパク質の完全なアミノ酸配列を上記の表２４に示す。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをＲＢ６９ ＤＮＡリガーゼのＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２と命名した。タンパク質の完全なアミノ酸配列を上記の表２４に示す。
連結鋳型は、ｐＵＣ１９ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）から増幅された１７０ｂｐ断片（Ｌｉｇ１７０）であった。２５μｌのＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２μＭのＬｉｇ１７０＿ＦＷプライマー、０．２μＭのＬｉｇ１７０＿ＲＶプライマー、１ｐｇのｐＵＣ１９を混合することによって、５０μｌの増幅反応を設定した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で５分間の最終伸長を行った。増幅産物を２％アガロースゲルで泳動した。標的ＤＮＡのバンドを切除し、Ｍｏｎａｒｃｈ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって精製した。ＤＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって５’末端でさらにリン酸化した。１ｘ反応緩衝液Ａ、１ｍＭ ＡＴＰ、１Ｕ Ｔ４ ＰＮＫ及び前の工程からのＤＮＡを混合することによって、５０μｌのリン酸化反応を設定した。リン酸化反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。５’－リン酸化二本鎖ＤＮＡをＭｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ＆ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって精製し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量した。
関連するプライマー及び鋳型配列を以下に示す。
Ｌｉｇ１７０＿ＦＷプライマー：５’－ＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡ－３’（配列番号１１３）。
Ｌｉｇ１７０＿ＲＶプライマー：５’－ＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣ－３’（配列番号１１４）。
Ｌｉｇ１７０鋳型：５’－ＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴ
ＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴ－３’（配列番号１１５）。
ＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴ－３’（配列番号１１５）。
Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターは、１．５μＭのＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ５及び１．５μＭのＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ７ｒｃ＿ＩＤＸ０１の２つのオリゴをアニーリングすることによって調製した。アニーリングプロセスは、オリゴ混合物を９５℃に加熱し、０．１℃／分の速度で１４℃に冷却した。
ＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ５：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’（配列番号１１６）。
ＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ７ｒｃ＿ＩＤＸ０１：５’－ＰＯ４－ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’（配列番号１１７）。
ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２は３５ｍｇ／ｍｌであり、作業用ストックとして１ｍｇ／ｍｌに希釈した。
１０ｎｇのＴ４ ＰＮＫ処理Ｌｉｇ１７０、１８７．５ｎＭのＩｌｌｕｍｉｎａアダプター、３０μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及び１μｌのＮＥＢＮｅｘｔ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒを含む９３．５μｌの溶液を作製した。連結反応を２０℃で１５分間行った。６．５μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加することによって連結反応を終了させ、ＤＮＡを、製造業者の指示に従ってＰＣＲビーズ用０．８ｘ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって精製した。１０ｎｇのＴ４ ＰＮＫ処理Ｌｉｇ１７０、１８７．５ｎＭのＩｌｌｕｍｉｎａアダプター、５％／７％ ＰＥＧ３５０００、１ｘ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及びＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２を０．２／０．３／０．４ｍｇ／ｍｌの最終濃度で含む９３．５μｌ溶液を作製した。連結反応を１６℃で２０分間行った。４．５μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ及び２ｕｌプロテアーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加することによって連結反応を終了させ、４０℃で３０分間インキュベートした。ＤＮＡを、製造元の指示に従って、ＰＣＲビーズ用の０．８ｘ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって精製した。精製したＤＮＡを２５μｌのＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２μＭのＩＬＭＮ＿Ｐ５プライマー、０．２μＭのＩＬＭＮ＿Ｐ７プライマーと混合した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１０サイクル、続いて７２℃で５分間の最終伸長を行った。増幅産物をＰＣＲビーズ用の１ｘ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰによって精製した。精製したＤＮＡをＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキットによって定量し、ＤＮＡの量をＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）によってプロットした。ＤＮＡも２％アガロースゲルによって分析した。
ＩＬＭＮ＿Ｐ５：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１１８）。
ＩＬＭＮ＿Ｐ７：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧ－３’（配列番号１１９）。
結果及び結論
二重連結産物のみを増幅することができた。図２３に示されるように、ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２は、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと比較して、連結効率の最大２．８倍の増進を有することができた。
二重連結産物のみを増幅することができた。図２３に示されるように、ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２は、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと比較して、連結効率の最大２．８倍の増進を有することができた。
例２４．ヒトＯｔｘ１由来のＩＤＲタグを有するＲＢ６９リガーゼの相分離性能に対するＡＴＰの効果の分析。
実験の目的及び概要
この実験の目的は、リガーゼ酵素融合タンパク質調製物が相分離を引き起こす能力に対するＡＴＰの効果を分析することであった。リガーゼ酵素融合タンパク質は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１（Ｈｉｓ２タグ）の天然変性領域（ＩＤＲ）に見られるヒスチジンリッチアミノ酸ドメイン配列を含むタグを有する。
実験の目的及び概要
この実験の目的は、リガーゼ酵素融合タンパク質調製物が相分離を引き起こす能力に対するＡＴＰの効果を分析することであった。リガーゼ酵素融合タンパク質は、ヒトホメオボックスタンパク質Ｏｔｘ１（Ｈｉｓ２タグ）の天然変性領域（ＩＤＲ）に見られるヒスチジンリッチアミノ酸ドメイン配列を含むタグを有する。
実験は、ＡＴＰがＨｉｓ２タグによって媒介される相分離を有意に増強することを実証した。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをＲＢ６９ ＤＮＡリガーゼのＣ末端に結合させた。組換えＩＤＲ融合タンパク質及びＩＤＲ非含有タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジン及びＩＤＲ非含有タンパク質のＣ末端のポリヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。融合タンパク質をＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２と命名し、ＩＤＲ非含有タンパク質をＲＢ６９リガーゼと命名した。タンパク質の完全なアミノ酸配列を上記の表２４に示す。ＦＡＭ－オリゴは、ＦＡＭ（フルオレセイン）で標識されたＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧ（配列番号１０４）である。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＡＧＨＨＨＨＨＰＨＡＨＨＰＬＳＱＳＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＱＧＹＧＧＳＧ（配列番号２４）であった。これをＲＢ６９ ＤＮＡリガーゼのＣ末端に結合させた。組換えＩＤＲ融合タンパク質及びＩＤＲ非含有タンパク質を、試験中の融合タンパク質のＩＤＲドメインタグに天然に存在するヒスチジン及びＩＤＲ非含有タンパク質のＣ末端のポリヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。融合タンパク質をＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２と命名し、ＩＤＲ非含有タンパク質をＲＢ６９リガーゼと命名した。タンパク質の完全なアミノ酸配列を上記の表２４に示す。ＦＡＭ－オリゴは、ＦＡＭ（フルオレセイン）で標識されたＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧ（配列番号１０４）である。
１ｍｇ／ｍｌの最終濃度でのリガーゼ、０．４μＭ ＦＡＭ－オリゴ及び０／２０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０／１ｍＭ ＡＴＰを含む５０μｌ溶液を作製した。次いで、１０μｌの反応混合物をＣチップ血球計スライドに移し、明視野光条件下及び蛍光条件下で画像を撮影した。
結果及び結論
図２４に示すように、ＩＤＲ非含有ＲＢ６９リガーゼを用いた場合、相分離した水性粒子（球状フォーカス）はほとんど観察されなかった。ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２は、１ｍＭ ＡＴＰの存在下で多くの球状フォーカスの形成を有意に促進した。２０ｍＭ Ｍｇ２＋の添加後、球状フォーカスのより明るい蛍光が観察され、球状フォーカス形成のさらなる増進及び／又はより多くのＤＮＡが球状フォーカスに共局在することを示した。
図２４に示すように、ＩＤＲ非含有ＲＢ６９リガーゼを用いた場合、相分離した水性粒子（球状フォーカス）はほとんど観察されなかった。ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２は、１ｍＭ ＡＴＰの存在下で多くの球状フォーカスの形成を有意に促進した。２０ｍＭ Ｍｇ２＋の添加後、球状フォーカスのより明るい蛍光が観察され、球状フォーカス形成のさらなる増進及び／又はより多くのＤＮＡが球状フォーカスに共局在することを示した。
例２５．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１由来のＩＤＲタグを有するＧｐ３２を使用した固体表面でのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅。
実験の目的及び概要
この実験は、固体表面上での増幅におけるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の能力を評価するために行われた。
実験の目的及び概要
この実験は、固体表面上での増幅におけるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）を含むタグを含むＧｐ３２融合タンパク質調製物の能力を評価するために行われた。
この例は、リアルタイム及び終点アッセイの両方において、クラウディング剤の非存在下で、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈｒｐ１タンパク質の天然変性領域（ＩＤＲ）でＣ末端にタグ付けＧｐ３２を使用した、固体表面上の人工核酸鋳型のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を実証する。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをＴ４ファージＧｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＴ４－Ｇｐ３２－ＨＲＰ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を以下の配列番号１２０として示す。
ＭＦＫＲＫＳＴＡＥＬＡＡＱＭＡＫＬＮＧＮＫＧＦＳＳＥＤＫＧＥＷＫＬＫＬＤＮＡＧＮＧＱＡＶＩＲＦＬＰＳＫＮＤＥＱＡＰＦＡＩＬＶＮＨＧＦＫＫＮＧＫＷＹＩＥＴＣＳＳＴＨＧＤＹＤＳＣＰＶＣＱＹＩＳＫＮＤＬＹＮＴＤＮＫＥＹＳＬＶＫＲＫＴＳＹＷＡＮＩＬＶＶＫＤＰＡＡＰＥＮＥＧＫＶＦＫＹＲＦＧＫＫＩＷＤＫＩＮＡＭＩＡＶＤＶＥＭＧＥＴＰＶＤＶＴＣＰＷＥＧＡＮＦＶＬＫＶＫＱＶＳＧＦＳＮＹＤＥＳＫＦＬＮＱＳＡＩＰＮＩＤＤＥＳＦＱＫＥＬＦＥＱＭＶＤＬＳＥＭＴＳＫＤＫＦＫＳＦＥＥＬＮＴＫＦＧＱＶＭＧＴＡＶＭＧＧＡＡＡＴＡＡＫＫＡＤＫＶＡＤＤＬＤＡＦＮＶＤＤＦＮＴＫＴＥＤＤＦＭＳＳＳＳＧＳＳＳＳＡＤＤＴＤＬＤＤＬＬＮＤＬＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱＨＨＨＨＨＨＨ
（配列番号１２０）
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをＴ４ファージＧｐ３２のＣ末端に結合させた。組換え融合タンパク質を、試験中の融合タンパク質のまさにＣ末端に配置された、すなわち融合タンパク質のＣ末端のＩＤＲタグの後に配置された追加のヘプタヒスチジンタグに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。融合タンパク質をＴ４－Ｇｐ３２－ＨＲＰ１と命名した。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を以下の配列番号１２０として示す。
ＭＦＫＲＫＳＴＡＥＬＡＡＱＭＡＫＬＮＧＮＫＧＦＳＳＥＤＫＧＥＷＫＬＫＬＤＮＡＧＮＧＱＡＶＩＲＦＬＰＳＫＮＤＥＱＡＰＦＡＩＬＶＮＨＧＦＫＫＮＧＫＷＹＩＥＴＣＳＳＴＨＧＤＹＤＳＣＰＶＣＱＹＩＳＫＮＤＬＹＮＴＤＮＫＥＹＳＬＶＫＲＫＴＳＹＷＡＮＩＬＶＶＫＤＰＡＡＰＥＮＥＧＫＶＦＫＹＲＦＧＫＫＩＷＤＫＩＮＡＭＩＡＶＤＶＥＭＧＥＴＰＶＤＶＴＣＰＷＥＧＡＮＦＶＬＫＶＫＱＶＳＧＦＳＮＹＤＥＳＫＦＬＮＱＳＡＩＰＮＩＤＤＥＳＦＱＫＥＬＦＥＱＭＶＤＬＳＥＭＴＳＫＤＫＦＫＳＦＥＥＬＮＴＫＦＧＱＶＭＧＴＡＶＭＧＧＡＡＡＴＡＡＫＫＡＤＫＶＡＤＤＬＤＡＦＮＶＤＤＦＮＴＫＴＥＤＤＦＭＳＳＳＳＧＳＳＳＳＡＤＤＴＤＬＤＤＬＬＮＤＬＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱＨＨＨＨＨＨＨ
（配列番号１２０）
次いで、組換えＴ４ファージＧｐ３２融合タンパク質を、ＰＥＧ非含有増幅において、すなわちクラウディング剤の非存在下で、固体表面上で試験した。試験は、ビーズの表面に結合した２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行った。増幅は、終点反応を用いてアンプリコンに見出されるニッカーゼ部位に蛍光ヌクレオチドを組み込むことによって検出した。ビーズは、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂａｎｇｓｌａｂｓ．ｃｏｍ／）から供給され、カルボキシル化されたポリスチレンコアを有し、オリゴヌクレオチドが共有結合したコポリマーがグラフトされていた。フォトリソグラフィ、ソフトリソグラフィ、エッチングなどの標準的な微細加工技術を使用して個別の領域にパターニングされたガラス基質上にビーズを堆積させた。得られた領域は、疎水性又は親水性などの特性を有し、分析される試料を引き付けるか又ははじくことができる。Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ－Ｌａｂｓ ＦｌｅｘＷｅｌｌ（商標）取り外し可能インキュベーションチャンバーを使用して、パターン化ガラスの単一のピースを、それぞれが表面上に１２２５万個のビーズを規則的な配列で含有すると推定される６．５ｍｍ×６．５ｍｍの８つの反応チャンバーに分割した。すべての鋳型がビーズ上のプライマーにハイブリッド形成された場合、反応チャンバーがビーズあたり０、５、１０、２０、４０又は８０コピーの鋳型を有するように、異なる量の増幅鋳型を異なる反応チャンバーに添加し、ハイブリッド形成は１００％未満の効率であると仮定した。一本鎖ＤＮＡ鋳型（ＵＰ１－ＵＰ２’＿ＴＦ１Ｌ鋳型配列：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡＡＡＡＡＧＧＴＴＴＣＧＡＡＣＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＧＧＣＧＧＴＡＴＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＣＡＴＧＴＣＴＡＡＡＴＴＧＴＣＧＡＴＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ（配列番号１２１）を５０μｌの緩衝液（１０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１００ｍＭ ＮａＣｌ）の反応チャンバーに加え、ＦｌｅｘＷｅｌｌ（登録商標）ＳｅａｌＳｔｒｉｐｓ（登録商標）で覆い、５０℃で１時間加熱し、鋳型をビーズ上の相補的オリゴヌクレオチドにアニーリングさせた。次いで、過剰な緩衝液を除去し、ビーズをＴＴＭ緩衝液（１０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で２回、次いで反応緩衝液（２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ）で２回洗浄して、アニーリングしていない鋳型を除去した。
２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１．７μＭクレアチンキナーゼ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、６．６μＭ Ｇｐ３２融合物、２．７μＭ ＵｖｓＸ、２．７μＭ ＵｖｓＹ、０．２２μＭ 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ及び２３ｍＭ ＭｇＯＡｃを混合することによって反応を設定した。反応混合物はまた、２９万個のビーズ／ｍｍ２を含み、０．５９μｌの反応混合物／ｍｍ２の各ビーズは、以下の配列を有するＵＰ１フォワードプライマーとＵＰ２－１８リバースプライマーの混合物からなるビーズあたり約６０万個のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。
ＵＰ１フォワードプライマー：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ（配列番号１２２）。
ＵＰ２－１８リバースプライマー：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡ（配列番号１２３）。
次いで、反応物を４３℃で６０分間インキュベートし、次いでＳＴＴＭ緩衝液（１０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度１％まで）で２回洗浄（添加／除去）して停止させ、タンパク質を変性させた。次いで、ＴＴＭ緩衝液（１０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を添加／除去することによってビーズを２回洗浄してＳＤＳを除去した。
次いで、ビーズを、２．５ＵニッカーゼＮｔ．ＢｂｖＣＩを含む２５μｌの１ｘ ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮＥＢ－５０ｍＭ ＫＯＡｃ、２０ｍＭ トリス－酢酸塩、１０ｍＭ ＭｇＯＡｃ、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ７．９）で覆った。ＵＰ１－ＵＰ２’＿ＴＦ１Ｌ鋳型は、ＤＮＡの一方の鎖にニックを導入するＮｔ．ＢｂｖＣＩ（ＣＣ／ＴＣＡＧＣ）の認識部位の単一コピーを含む。ビーズを３７℃に４５分間加熱して、アンプリコンが確実にニックを入れられるようにした。ニッカーゼを変性させるために、ＳＴＴＭ緩衝液（１０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度１％まで）で２回洗浄（添加／除去）することによってニッキングを停止した。次いで、ＴＴＭ緩衝液（１０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を添加／除去することによってビーズを２回洗浄してＳＤＳを除去し、反応緩衝液（２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ）で２回洗浄した。
プロトコルの最後の工程は、蛍光標識ｄＵＴＰをアンプリコンに組み込むことであった。これは、ビーズを０．１１μＭ黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、１６０ｐＭアミノアリル－ｄＵＴＰ－ＸＸ－ＡＴＴＯ－５９４（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び２３ｍＭ ＭｇＯＡｃを含む反応緩衝液（２５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．３、７．５ｍＭ ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ）に浸し、４５分間４３℃に加熱することによって行った。伸長をＳＴＴＭ緩衝液（１０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度１％まで）で２回洗浄（添加／除去）することによって停止させて、ニッカーゼを変性させた。次いで、ＴＴＭ緩衝液（１０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を添加／除去することによってビーズを２回洗浄してＳＤＳを除去した。次いで、Ｆｌｅｘｗｅｌｌを除去し、ガラスカバースリップ及び少量のＴＴＭ緩衝液をガラスウェハ上に置いた。蛍光顕微鏡を使用して、同じ場所の明視野及び蛍光写真を撮影してウェハを検査した。
結果
アンプリコンのＮｔ．Ｂｂｖ ＣＩニッキング部位へのＡＴＴＯ－５９４標識ｄＵＴＰの組み込みを使用して、ＵＰ１－ＵＰ２’－ＴＦ１Ｌアンプリコンの終点蛍光検出を観察した。図２５は、鋳型を添加しなかった場合、ビーズは暗色のままであったが、鋳型が増加するにつれて、ビーズの割合が増加し、蛍光のレベルが増加したことを示す。
アンプリコンのＮｔ．Ｂｂｖ ＣＩニッキング部位へのＡＴＴＯ－５９４標識ｄＵＴＰの組み込みを使用して、ＵＰ１－ＵＰ２’－ＴＦ１Ｌアンプリコンの終点蛍光検出を観察した。図２５は、鋳型を添加しなかった場合、ビーズは暗色のままであったが、鋳型が増加するにつれて、ビーズの割合が増加し、蛍光のレベルが増加したことを示す。
結論
表面上のＴ４ Ｇｐ３２－Ｈｒｐ１融合タンパク質を使用すると、ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下での核酸増幅が効率的に起こることが見出された。
表面上のＴ４ Ｇｐ３２－Ｈｒｐ１融合タンパク質を使用すると、ＰＥＧなどのクラウディング剤の非存在下での核酸増幅が効率的に起こることが見出された。
例２６．Ｃａｓ１２ａタンパク質の性能に対する関連する相分離を伴うＧｐ３２－ＨＲＰ１ ｓｓＤＮＡ結合タンパク質の効果の分析。
実験の目的及び概要
この実験の目的は、ガイドＲＮＡと会合したＣａｓ１２ａヌクレアーゼタンパク質の活性に対する相分離を促進する条件下でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３５Ｋの存在下でＩＤＲ－タグ付きＧｐ３２ ｓｓＤＮＡ結合タンパク質の効果を分析して、蛍光読み出しによってモニターされる二本鎖ＤＮＡ標的に結合して切断することであった。使用されるＧｐ３２ ｓｓＤＮＡ結合タンパク質は、酵母ＨＲＰタンパク質（Ｇｐ３２－ＨＲＰ１）の天然変性領域（ＩＤＲ）に見られるアミノ酸ドメイン配列を含むタグを有する。このタグ及びＰＥＧの存在下では、相分離は、低濃度のタンパク質であっても他の因子が実質的に存在しない状態で起こる。
実験の目的及び概要
この実験の目的は、ガイドＲＮＡと会合したＣａｓ１２ａヌクレアーゼタンパク質の活性に対する相分離を促進する条件下でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３５Ｋの存在下でＩＤＲ－タグ付きＧｐ３２ ｓｓＤＮＡ結合タンパク質の効果を分析して、蛍光読み出しによってモニターされる二本鎖ＤＮＡ標的に結合して切断することであった。使用されるＧｐ３２ ｓｓＤＮＡ結合タンパク質は、酵母ＨＲＰタンパク質（Ｇｐ３２－ＨＲＰ１）の天然変性領域（ＩＤＲ）に見られるアミノ酸ドメイン配列を含むタグを有する。このタグ及びＰＥＧの存在下では、相分離は、低濃度のタンパク質であっても他の因子が実質的に存在しない状態で起こる。
この場合のＣａｓ１２ａに対する二重鎖核酸標的は、切断されると、アニーリングされたハイブリッドから本質的に直ちに融解して測定可能な蛍光増加をもたらすべき６－ＦＡＭ標識を含有するヌクレオチド断片を生成する６－ＦＡＭ／ＢＨＱ１対合を有する。この鋳型を、引っ掛かるためのさらなる一本鎖領域によってＧｐ３２－ＨＲＰ１と相互作用するようにさらに操作した。
実験は、ＰＥＧ３５Ｋの存在下でＧｐ３２－ＨＲＰ１ ｓｓＤＮＡ結合タンパク質を使用すると、相分離した水性粒子（小球又は球状フォーカス）の形成がもたらされ、同時に、Ｃａｓ１２ａがインビトロ系においてそのＤＮＡ標的を切断する速度が有意に増強されることを実証している。
材料及び方法
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをＴ４ Ｇｐ３２ ｓｓＤＮＡ結合タンパク質のＣ末端に結合させた。組換えＩＤＲ融合タンパク質を、ＩＤＲタグのＣ末端に付加された７個の追加のヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して、精製した。融合タンパク質をＴ４ ＧＰ３２－ＨＲＰ１と命名した。タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号１２０として示す。
使用したＩＤＲドメインタグの具体的なアミノ酸配列は、ＧＧＮＮＧＧＮＮＭＮＲＲＧＧＮＦＧＮＱＧＤＦＮＱＭＹＱＮＰＭＭＧＧＹＮＰＭＭＮＰＱＡＭＴＤＹＹＱＫＭＱＥＹＹＱＱＭＱ（配列番号９）であった。これをＴ４ Ｇｐ３２ ｓｓＤＮＡ結合タンパク質のＣ末端に結合させた。組換えＩＤＲ融合タンパク質を、ＩＤＲタグのＣ末端に付加された７個の追加のヒスチジンに依存する標準的な１段階固定化金属（ニッケル）親和性クロマトグラフィーを使用して、精製した。融合タンパク質をＴ４ ＧＰ３２－ＨＲＰ１と命名した。タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号１２０として示す。
ガイドＲＮＡ配列は、５’－ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＧＵＵＧＵＡＧＡＵＡＡＡＧＵＧＣＵＣＡＵＣＡＵＵＧＧＡＡＡＡＣＧ－３’（配列番号１３４）である。
二本鎖／一本鎖ＤＮＡ標的は、５’末端がＦＡＭ（フルオレセイン）で標識されたトップオリゴ５’－ＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＧＴＴＣＴＡＴＧＴＡＴＣＡＡＡＧＣＧＧＣＣＡＴＴＴＧＣＧＧ－３’（配列番号１３５）及び３’末端がＢＨＱ－１（クエンチャー）で標識されたボトムオリゴ５’－ＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣ－３’（配列番号１３６）をアニーリングすることによって調製した。アニーリングプロセスは、１μＭオリゴ混合物を９５℃に加熱し、０．１℃／分の速度で１４℃に冷却した。これは、供給されたガイドＲＮＡを有するｃａｓ１２ａヌクレアーゼの二重鎖標的部位を提供するだけでなく、約３個のタンパク質モノマーの予想される結合でＧｐ３２－ＨＲＰ１と相互作用し得る追加の２４個の一本鎖残基も提供する。このようにして、アニーリングされた標的の多くは、相分離したＧｐ３２－ＨＲＰ１小球が生じた場合に、その中に位置するように強制されるだろうことが予想された。さらに、アニーリング時には近接しているはずであるが、切断後に分散する（得られたハイブリッドはわずか数ヌクレオチド長であるため）いずれかの鎖上のフルオロフォア及びクエンチャーの存在は、切断速度を評価するための便利な機構を提供する。予想されるように、Ｃａｓ１２ａ依存的様式では、蛍光は一般に低レベルから変化し、経時的に増加する。
ＥｎＧｅｎ Ｌｂａ Ｃａｓ１２ａタンパク質は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。
Ｃａｓ１２ａタンパク質、ＰＥＧ３５Ｋ又はＴ４ ＧＰ３２ ＨＲＰ１タンパク質を含むか又は含まない溶液を構成した。溶液は、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ酢酸トリスｐＨ８．３、２０ｍＭ酢酸Ｍｇ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、３３．３ｎＭガイドＲＮＡ、５０ｎＭ ｄｓＤＮＡ、５％ ＰＥＧ３５Ｋで構成された。反応に含めると、以下の成分が以下の濃度：３３．３ｎＭ Ｃａｓ１２ａタンパク質、３３３ｎｇ／μｌ Ｔ４ ＧＰ３２ ＨＲＰ１タンパク質で存在した。反応速度挙動を評価するために、３０μｌの反応溶液を０．２ｍｌチューブに移し、４２℃の実行温度を使用して、Ａｘｘｉｎ Ｔ１６蛍光リーダを使用してアッセイした。独立して、２０μｌの反応溶液を４２℃で約１分間加温し、次いでＣチップ血球計スライドに移し、明視野光条件下及び蛍光条件下で画像を撮影した。したがって、これらの画像は、反応の最初の数分以内の系の顕微鏡状態のスナップショットを表した。
結果及び結論
図２６Ａに示すように、Ｃａｓ１２ａタンパク質を含まないが、Ｇｐ３２－ＨＲＰ１及びＰＥＧの存在下では、相分離した水性粒子（球状フォーカス）が観察されたが、標識されているが、大きくクエンチされた標的ＤＮＡがＧｐ３２－ＨＲＰ１及びＰＥＧの存在下で存在した場合（反応を顕微鏡で分析した初期時点で）、弱い蛍光のみを示した。当然のことながら、おそらくフルオロフォア／クエンチャープローブの不完全なアニーリング及び結果としてのバックグラウンドに起因して、いくらかの蛍光が観察されるにもかかわらず、蛍光プロットの平坦な特徴（図２６Ｂ）に示されるように、経時的な蛍光変化の最小変化によって支持されるように、Ｃａｓ１２ａタンパク質が存在しなければ、切断は予想されない。
図２６Ａに示すように、Ｃａｓ１２ａタンパク質を含まないが、Ｇｐ３２－ＨＲＰ１及びＰＥＧの存在下では、相分離した水性粒子（球状フォーカス）が観察されたが、標識されているが、大きくクエンチされた標的ＤＮＡがＧｐ３２－ＨＲＰ１及びＰＥＧの存在下で存在した場合（反応を顕微鏡で分析した初期時点で）、弱い蛍光のみを示した。当然のことながら、おそらくフルオロフォア／クエンチャープローブの不完全なアニーリング及び結果としてのバックグラウンドに起因して、いくらかの蛍光が観察されるにもかかわらず、蛍光プロットの平坦な特徴（図２６Ｂ）に示されるように、経時的な蛍光変化の最小変化によって支持されるように、Ｃａｓ１２ａタンパク質が存在しなければ、切断は予想されない。
Ｃａｓ１２ａタンパク質が存在したが、Ｔ４ Ｇｐ３２ ＨＲＰ１の非存在下では、球状フォーカスは観察されず、これは、小球形成を可能にするためのＴ４ Ｇｐ３２ ＨＲＰ１の予想通りの必要性を示している。動力学的分析は、最大１０分まで評価したときに、標的切断が経時的に着実に増加したことを示した。顕微鏡的には、全体的な蛍光は、Ｃａｓ１２ａを差し引いた試料よりもわずかに高く見え、数分以内にいくつかのアニーリングされたプローブが速度論的研究と一致して処理されたことを示している。
しかしながら、際立って顕著なコントラストでは、Ｃａｓ１２ａ及びＴ４ Ｇｐ３２－ＨＲＰ１（及びＰＥＧ）の存在下では、多くの球状フォーカスが観察され、一般的にはるかに強い蛍光が顕微鏡画像全体にわたって観察され、これは、小球形成のためのＴ４ Ｇｐ３２－ＨＲＰ１の必要性の両方を示唆しているが、これに加えて、より多くの処理をもたらす（いったん処理されると、小さな放出された産物は必ずしももはや小球に局在するとは予想されないことに留意されたい）。動態グラフは、これらの条件下でも顕著かつ驚くほど異なっており、１分前後又はその前（試料をリーダに入れた直後）のピークまでの非常に急速な蛍光蓄積、次いで分析時間の残りの間のプラトーを示した。Ｔ４ Ｇｐ３２－ＨＲＰ１の存在下で観察されたＤＮＡ切断速度のこの有意な増進は、相分離粒子が特異的切断を著しく促進したという考えと一致しており、これはおそらく球状フォーカス内部のＣａｓ１２ａタンパク質及びそのｄｓＤＮＡ標的の共局在化によって引き起こされ、反応速度の大幅な増加を可能にする。本明細書で実証された増幅系と同様に、これは、単一の系成分のみが相分離を促進するように作用する場合でも、他の仲間がその相に引き寄せられ、局所的な高濃度及び大規模に加速された動態をもたらす可能性があることを示している。
開示されたＩＤＲベースの方法、方法、巨大分子、ポリペプチド及び使用の異なる用途は、当技術分野における特定のニーズに合わせて調整され得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことも理解されたい。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「巨大分子」、「ポリペプチド」、「ポリヌクレオチド」、「細胞」、「宿主細胞」などの実体への言及は、２つ以上のそのような実体を含む。
「約（ａｂｏｕｔ）」及び「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」などの用語は、内容が明らかに他のことを指示しない限り、関連する図を包含するものとして理解されるべきであり、図の値の＋／－１０％、又は図の値の＋／－５％である。
数値の範囲が下の値と上の値との「間」にあると提示される場合、その範囲は上の値と下の値とを含むと解釈されるべきである。例えば、２２ｍＭ～５０ｍＭ、又は約２２ｍＭ～約５０ｍＭの範囲は、２２ｍＭ及び５０ｍＭの値又は約２２ｍＭ及び約５０ｍＭの値を含むと解釈されるべきである。
本明細書で引用されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表４ ＜２２３＞ｆｉｂ－２（ｃｌｉｐｐｅｒ１）－ｆｉｂ１のＣ末端の７アミノ酸欠失
配列表５ ＜２２３＞ｆｉｂ－３（ｃｌｉｐｐｅｒ２）－ｆｉｂ１のＣ末端の１６アミノ酸欠失
配列表６ ＜２２３＞ｆｉｂ－４（ｃｌｉｐｐｅｒ３）－ｆｉｂ１のＣ末端の２８アミノ酸欠失
配列表１５ ＜２２３＞ｍｉｍｉｃ１－ＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣ末端を模倣するＹＤＰＴＳＰＳモチーフの７つのリピート
配列表１６ ＜２２３＞ｍｉｍｉｃ２－ＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣ末端を模倣するＹＳＰＴＤＰＳモチーフの７つのリピート
配列表１９ ＜２２３＞Ｓｕｐ１－ＹＮＰＱＧＧＹＱＱの１つのリピート
配列表２０ ＜２２３＞Ｓｕｐ２－ＹＮＰＱＧＧＹＱＱの２つのリピート
配列表２１ ＜２２３＞Ｓｕｐ３－ＹＮＰＱＧＧＹＱＱの３つのリピート
配列表２２ ＜２２３＞Ｓｕｐ４－ＹＮＰＱＧＧＹＱＱの４つのリピート
配列表５６ ＜２２３＞超陽性
配列表５７ ＜２２３＞超陰性
配列表６５ ＜２２３＞ファージｖＢからのＧｐ３２（７Ｈｉｓ）
配列表８９ ＜２２３＞６－ヒスチジン
配列表９０ ＜２２３＞ｃ－ｍｙｃエピトープ
配列表９１ ＜２２３＞ＦＬＡＧオクタペプチド
配列表９２ ＜２２３＞タンパク質Ｃ
配列表９４ ＜２２３＞Ｖ５エピトープ
配列表９７ ＜２２３＞ヘマグルチニン
配列表９８ ＜２２３＞実施例１－フォワードプライマー
配列表９９ ＜２２３＞実施例１－リバースプライマー
配列表１００ ＜２２３＞実施例１－プローブ
配列表１００ ＜２２３＞ＦＡＭ－フルオレセイン
配列表１００ ＜２２３＞ＴＨＦ－テトラヒドロフラン
配列表１００ ＜２２３＞ＢＨＱ－ブラックホールクエンチャー
配列表１０１ ＜２２３＞実施例５－フォワードプライマー
配列表１０２ ＜２２３＞実施例５－リバースプライマー
配列表１０３ ＜２２３＞実施例５－プローブ
配列表１０３ ＜２２３＞ＦＡＭ－フルオレセイン
配列表１０３ ＜２２３＞ＴＨＦ－テトラヒドロフラン
配列表１０３ ＜２２３＞ＢＨＱ－ブラックホールクエンチャー
配列表１０４ ＜２２３＞実施例１２－プローブ
配列表１０５ ＜２２３＞実施例１８－ＰＡ３０フォワードプライマー
配列表１０６ ＜２２３＞実施例１８－ＰＢ３０リバースプライマー
配列表１０７ ＜２２３＞実施例１８－プローブ
配列表１０７ ＜２２３＞ＦＡＭ－フルオレセイン
配列表１０７ ＜２２３＞ＴＨＦ－テトラヒドロフラン
配列表１０７ ＜２２３＞Ｑｕｅｎｃｈｅｒ－ブラックホールクエンチャー
配列表１０８ ＜２２３＞実施例１８－ＴＦ１Ｌ鋳型配列
配列表１０９ ＜２２３＞実施例１８－ＰＢ３０’プローブ
配列表１１０ ＜２２３＞実施例１８－ＴＦ１Ｌプローブ
配列表１１１ ＜２２３＞実施例２０－ＲＢ６９リガーゼ
配列表１１２ ＜２２３＞実施例２０－ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２
配列表１１３ ＜２２３＞実施例２１－Ｌｉｇ１７０フォワードプライマー
配列表１１４ ＜２２３＞実施例２１－Ｌｉｇ１７０リバースプライマー
配列表１１５ ＜２２３＞実施例２１－Ｌｉｇ１７０鋳型
配列表１１６ ＜２２３＞実施例２１－ＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ５
配列表１１７ ＜２２３＞実施例２１－ＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ７ｒｃ＿ＩＤＸ０１
配列表１１８ ＜２２３＞実施例２２－ＩＬＭＮ＿Ｐ５
配列表１１９ ＜２２３＞実施例２２－ＩＬＭＮ＿Ｐ７
配列表１２０ ＜２２３＞実施例２４－Ｔ４－Ｇｐ３２－ＨＲＰ１
配列表１２１ ＜２２３＞実施例２４－ＵＰ１－ＵＰ２’＿ＴＦ１Ｌ鋳型配列
配列表１２２ ＜２２３＞実施例２４－ＵＰ１フォワードプライマー
配列表１２３ ＜２２３＞実施例２４－ＵＰ２－１８リバースプライマー
配列表１２４ ＜２２３＞機能的ＩＤＲに含まれるアミノ酸配列
配列表１２５ ＜２２３＞機能的ＩＤＲに含まれるアミノ酸配列
配列表１２６ ＜２２３＞機能的ＩＤＲに含まれるアミノ酸配列
配列表１２６ ＜２２３＞ＸａａはＡ，Ｎ又はＧである
配列表１２７ ＜２２３＞機能的ＩＤＲに含まれるアミノ酸配列
配列表１２８ ＜２２３＞機能的ＩＤＲに含まれるアミノ酸配列
配列表１２９ ＜２２３＞ＹＤＰＴＳＰＳモチーフ
配列表１３０ ＜２２３＞ＹＳＰＴＤＰＳモチーフ
配列表１３１ ＜２２３＞ＭＥＡＦＳＳＡＫＴＥＤＤＦＭＳＳＳＳＳＤＤＳＤＬＤＤＬＬＡＧＬの自己設計二重配列
配列表１３２ ＜２２３＞ＥＩＶＥＡＥＶＤＥＬＩＮＳＫＶＥＫＦＫＳＰＥＳＫＳＫＳＡＡＤＬＥＴＤＬＥＱＬＳＤＭＥＥＦＮの自己設計二重配列
配列表１３３ ＜２２３＞ＤＤＶＡＳＥＦの自己設計リンカー
配列表１３４ ＜２２３＞実施例２６―ガイドＲＮＡ配列
配列表１３５ ＜２２３＞実施例２６―トップオリゴ
配列表１３６ ＜２２３＞実施例２６―ボトムオリゴ
配列表１３７ ＜２２３＞ヘマグルチニンＣ末端
配列表５ ＜２２３＞ｆｉｂ－３（ｃｌｉｐｐｅｒ２）－ｆｉｂ１のＣ末端の１６アミノ酸欠失
配列表６ ＜２２３＞ｆｉｂ－４（ｃｌｉｐｐｅｒ３）－ｆｉｂ１のＣ末端の２８アミノ酸欠失
配列表１５ ＜２２３＞ｍｉｍｉｃ１－ＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣ末端を模倣するＹＤＰＴＳＰＳモチーフの７つのリピート
配列表１６ ＜２２３＞ｍｉｍｉｃ２－ＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣ末端を模倣するＹＳＰＴＤＰＳモチーフの７つのリピート
配列表１９ ＜２２３＞Ｓｕｐ１－ＹＮＰＱＧＧＹＱＱの１つのリピート
配列表２０ ＜２２３＞Ｓｕｐ２－ＹＮＰＱＧＧＹＱＱの２つのリピート
配列表２１ ＜２２３＞Ｓｕｐ３－ＹＮＰＱＧＧＹＱＱの３つのリピート
配列表２２ ＜２２３＞Ｓｕｐ４－ＹＮＰＱＧＧＹＱＱの４つのリピート
配列表５６ ＜２２３＞超陽性
配列表５７ ＜２２３＞超陰性
配列表６５ ＜２２３＞ファージｖＢからのＧｐ３２（７Ｈｉｓ）
配列表８９ ＜２２３＞６－ヒスチジン
配列表９０ ＜２２３＞ｃ－ｍｙｃエピトープ
配列表９１ ＜２２３＞ＦＬＡＧオクタペプチド
配列表９２ ＜２２３＞タンパク質Ｃ
配列表９４ ＜２２３＞Ｖ５エピトープ
配列表９７ ＜２２３＞ヘマグルチニン
配列表９８ ＜２２３＞実施例１－フォワードプライマー
配列表９９ ＜２２３＞実施例１－リバースプライマー
配列表１００ ＜２２３＞実施例１－プローブ
配列表１００ ＜２２３＞ＦＡＭ－フルオレセイン
配列表１００ ＜２２３＞ＴＨＦ－テトラヒドロフラン
配列表１００ ＜２２３＞ＢＨＱ－ブラックホールクエンチャー
配列表１０１ ＜２２３＞実施例５－フォワードプライマー
配列表１０２ ＜２２３＞実施例５－リバースプライマー
配列表１０３ ＜２２３＞実施例５－プローブ
配列表１０３ ＜２２３＞ＦＡＭ－フルオレセイン
配列表１０３ ＜２２３＞ＴＨＦ－テトラヒドロフラン
配列表１０３ ＜２２３＞ＢＨＱ－ブラックホールクエンチャー
配列表１０４ ＜２２３＞実施例１２－プローブ
配列表１０５ ＜２２３＞実施例１８－ＰＡ３０フォワードプライマー
配列表１０６ ＜２２３＞実施例１８－ＰＢ３０リバースプライマー
配列表１０７ ＜２２３＞実施例１８－プローブ
配列表１０７ ＜２２３＞ＦＡＭ－フルオレセイン
配列表１０７ ＜２２３＞ＴＨＦ－テトラヒドロフラン
配列表１０７ ＜２２３＞Ｑｕｅｎｃｈｅｒ－ブラックホールクエンチャー
配列表１０８ ＜２２３＞実施例１８－ＴＦ１Ｌ鋳型配列
配列表１０９ ＜２２３＞実施例１８－ＰＢ３０’プローブ
配列表１１０ ＜２２３＞実施例１８－ＴＦ１Ｌプローブ
配列表１１１ ＜２２３＞実施例２０－ＲＢ６９リガーゼ
配列表１１２ ＜２２３＞実施例２０－ＲＢ６９リガーゼ－Ｈｉｓ２
配列表１１３ ＜２２３＞実施例２１－Ｌｉｇ１７０フォワードプライマー
配列表１１４ ＜２２３＞実施例２１－Ｌｉｇ１７０リバースプライマー
配列表１１５ ＜２２３＞実施例２１－Ｌｉｇ１７０鋳型
配列表１１６ ＜２２３＞実施例２１－ＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ５
配列表１１７ ＜２２３＞実施例２１－ＩＬＭＮ＿ＡＤ＿Ｐ７ｒｃ＿ＩＤＸ０１
配列表１１８ ＜２２３＞実施例２２－ＩＬＭＮ＿Ｐ５
配列表１１９ ＜２２３＞実施例２２－ＩＬＭＮ＿Ｐ７
配列表１２０ ＜２２３＞実施例２４－Ｔ４－Ｇｐ３２－ＨＲＰ１
配列表１２１ ＜２２３＞実施例２４－ＵＰ１－ＵＰ２’＿ＴＦ１Ｌ鋳型配列
配列表１２２ ＜２２３＞実施例２４－ＵＰ１フォワードプライマー
配列表１２３ ＜２２３＞実施例２４－ＵＰ２－１８リバースプライマー
配列表１２４ ＜２２３＞機能的ＩＤＲに含まれるアミノ酸配列
配列表１２５ ＜２２３＞機能的ＩＤＲに含まれるアミノ酸配列
配列表１２６ ＜２２３＞機能的ＩＤＲに含まれるアミノ酸配列
配列表１２６ ＜２２３＞ＸａａはＡ，Ｎ又はＧである
配列表１２７ ＜２２３＞機能的ＩＤＲに含まれるアミノ酸配列
配列表１２８ ＜２２３＞機能的ＩＤＲに含まれるアミノ酸配列
配列表１２９ ＜２２３＞ＹＤＰＴＳＰＳモチーフ
配列表１３０ ＜２２３＞ＹＳＰＴＤＰＳモチーフ
配列表１３１ ＜２２３＞ＭＥＡＦＳＳＡＫＴＥＤＤＦＭＳＳＳＳＳＤＤＳＤＬＤＤＬＬＡＧＬの自己設計二重配列
配列表１３２ ＜２２３＞ＥＩＶＥＡＥＶＤＥＬＩＮＳＫＶＥＫＦＫＳＰＥＳＫＳＫＳＡＡＤＬＥＴＤＬＥＱＬＳＤＭＥＥＦＮの自己設計二重配列
配列表１３３ ＜２２３＞ＤＤＶＡＳＥＦの自己設計リンカー
配列表１３４ ＜２２３＞実施例２６―ガイドＲＮＡ配列
配列表１３５ ＜２２３＞実施例２６―トップオリゴ
配列表１３６ ＜２２３＞実施例２６―ボトムオリゴ
配列表１３７ ＜２２３＞ヘマグルチニンＣ末端
Claims (68)
- 水性インビトロ反応系において生化学反応を行う方法であって、前記生化学反応は、少なくとも１つの反応巨大分子に依存し、任意に少なくとも１つの反応ポリペプチドの機能に依存し、以下を含む方法：
前記反応を行うために適した条件下で、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子を前記インビトロ反応系に導入すること、
ただし、前記少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子は、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含み、
また、前記少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子を前記インビトロ反応系へ導入すると、前記生化学反応の効率は、前記少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子によって高められ、
前記少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子は、好ましくは少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドである。 - 生化学反応が、少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子の機能に依存し、任意に少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドの機能に依存し、系に導入されると、前記少なくとも１つのＩＤＲ－巨大分子又は前記少なくとも１つのＩＤＲ－ポリペプチドが、前記生化学反応においてその反応機能を果たし、前記系における前記反応の効率を高める、請求項１に記載の方法。
- ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを系内に維持して、液体－液体脱混合及び前記ＩＤＲ－巨大分子又は前記ＩＤＲ－ポリペプチドによる前記系内の複数の相分離した水性区画の形成を引き起こし、それによって前記系内の生化学反応の効率を高めることをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
- 反応の実施に必要な分子を複数の相分離した水性区画内でＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドと共局在させるために、前記ＩＤＲ－巨大分子又は前記ＩＤＲ－ポリペプチドを系内に維持し、それによって前記系内の生化学反応の効率を高めることをさらに含む、請求項３に記載の方法。
- 複数の相分離した水性区画が、複数の検出可能な相分離した水性粒子である、請求項３又は請求項４に記載の方法。
- インビトロ反応系において核酸分子を合成するための生化学反応であり、以下を含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法：
（ａ）少なくとも１つの核酸プライマーを提供すること、
（ｂ）少なくとも１つの標的鎖を含む標的核酸分子を提供し、前記少なくとも１つの核酸プライマーを前記標的鎖と接触させ、それによって二本鎖構造を形成すること、
（ｃ）ＩＤＲ－巨大分子をＩＤＲ－ポリペプチドとして提供すること、ただし、前記ＩＤＲ－ポリペプチドは、ポリメラーゼ又は１つ以上のポリペプチド補助因子である、
（ｄ）前記反応を進行させ、それによって、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いて、任意に１つ以上のポリペプチド補助因子の存在下で、前記少なくとも１つの核酸プライマーの３’末端を伸長させて、二本鎖核酸を生成させること、ただし、第１の鎖は前記標的鎖の配列を含み、第２の鎖はそれに相補的である配列を含む、
。 - インビトロ反応系において一本鎖標的核酸分子又は二本鎖標的核酸分子を増幅するための生化学反応であり、好ましくは前記標的核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項６に記載の方法。
- インビトロ反応系において二本鎖標的核酸分子を増幅するための生化学反応であり、以下を含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法：
（ａ）第１及び第２の核酸プライマーを提供すること、
（ｂ）第１の鎖及び第２の鎖を含む二本鎖標的核酸分子を提供し、前記第１及び第２の核酸プライマーを前記標的核酸分子と接触させ、それによって前記第１の鎖を有する第１の二本鎖構造及び前記第２の鎖を有する第２の二本鎖構造を形成すること、
（ｃ）ＩＤＲ－巨大分子をＩＤＲ－ポリペプチドとして提供すること、ただし、前記ＩＤＲ－ポリペプチドは、ポリメラーゼ又は１つ以上のタンパク質補助因子である、
（ｄ）前記反応を進行させ、それによって、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いて、任意に前記１つ以上のタンパク質補助因子の存在下で、前記第１及び第２の核酸プライマーの３’末端を伸長させて、第１及び第２の二本鎖核酸を生成させること、
（ｅ）所望の増幅度に達するまで工程（ｂ）～（ｄ）を繰り返すこと。 - インビトロ反応系において二本鎖標的核酸分子を増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であり、以下を含む請求項８に記載の方法：
（ａ）リコンビナーゼ剤、任意にリコンビナーゼ負荷タンパク質、一本鎖安定化剤、ポリメラーゼ、第１及び第２の核酸プライマー、第１の鎖及び第２の鎖を含む二本鎖標的核酸、並びに任意にエキソヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩを提供すること、
（ｂ）前記リコンビナーゼ剤を前記第１及び第２の核酸プライマー並びに任意に前記リコンビナーゼ負荷タンパク質と接触させて、それらの３’末端に一本鎖領域を含む第１及び第２の核タンパク質プライマーを形成すること、
（ｃ）前記第１及び第２の核タンパク質プライマーを前記標的核酸分子と接触させ、それによって、前記第１の鎖を有する第１の二本鎖構造及び前記第２の鎖を有する第２の二本鎖構造を形成すること、
（ｄ）前記反応を進行させ、それによって、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いて前記第１及び第２の核タンパク質プライマーの３’末端を伸長させて、第１及び第２の二本鎖核酸並びに第１及び第２の置換された核酸鎖を生成させること、ただし、前記一本鎖安定化剤は、前記第１及び第２の置換された鎖を安定化させる、
（ｅ）所望の増幅度に達するまで工程（ｂ）～（ｄ）を繰り返すことによって反応を継続すること、
ただし、前記リコンビナーゼ剤、及び／又は前記リコンビナーゼ負荷タンパク質、及び／又は前記一本鎖安定化剤、及び／又は前記ポリメラーゼは、ＩＤＲ－ポリペプチドとして提供される。 - リコンビナーゼ剤が、ＵｖｓＸ、Ｔ４ ＵｖｓＸ、Ｔ６ ＵｖｓＸ、ＲＢ１８ ＵｖｓＸ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ファージｗＶ７ ＵｖｓＸ、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ファージＣＢ８ ＵｖｓＸ、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ファージＳｈｆｌ２ ＵｖｓＸ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ファージＡＲ１ ＵｖｓＸ、ファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿Ｇ４５０７ ＵｖｓＸ、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ファージＳＨＦＭＬ－１１ ＵｖｓＸ、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＤａｌＣａ ＵｖｓＸ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲａｄＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲａｄＢ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒａｄ ５１又はそれらの任意の機能的類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、好ましくは前記リコンビナーゼ剤が、ＵｖｓＸ、より好ましくはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＤａｌＣａ ＵｖｓＸである、請求項９に記載の方法。
- リコンビナーゼ負荷タンパク質を含み、前記リコンビナーゼ負荷タンパク質が、ＵｖｓＹ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＯ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＲ又はその任意の機能的類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、好ましくは、前記リコンビナーゼ負荷タンパク質がＵｖｓＹ、より好ましくはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ファージＳＴＯ ＵｖｓＹである、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
- ポリメラーゼが、ｐｏｌ－α、ｐｏｌ－β、ｐｏｌ－δ、ｐｏｌ－ε又はそれらの任意の機能的類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される真核生物ポリメラーゼである、請求項６～１１のいずれかに記載の方法。
- ポリメラーゼが、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＩラージ断片、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｐｏｌ Ｉラージ断片（Ｂｓｕポリメラーゼ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（ソーポリメラーゼ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗ断片、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＶ、又はそれらの任意の機能的類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される原核生物ポリメラーゼであり、好ましくは、前記ポリメラーゼが黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（ソーポリメラーゼ）又はバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｐｏｌ Ｉラージ断片（Ｂｓｕポリメラーゼ）である、請求項６～１１のいずれかに記載の方法。
- ポリメラーゼが、バクテリオファージＴ４ ｇｐ４３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｈｉ－２９ ＤＮＡポリメラーゼ、又はそれらの任意の機能的類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるバクテリオファージポリメラーゼである、請求項６～１１のいずれかに記載の方法。
- 一本鎖安定化剤が、Ｇｐ３２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢタンパク質、ファージＴ４ Ｇｐ３２タンパク質、ファージＲｂ６９ Ｇｐ３２、ファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＮＢＧ１ Ｇｐ３２、又はそれらの任意の機能的類似体、ホモログ若しくは誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、好ましくは前記一本鎖安定化剤が、Ｇｐ３２又はファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＮＢＧ１ Ｇｐ３２である、請求項９～１４のいずれかに記載の方法。
- リコンビナーゼ剤のみがＩＤＲ－ポリペプチドとして提供されるか、又はリコンビナーゼ負荷タンパク質のみが前記ＩＤＲ－ポリペプチドとして提供されるか、又は一本鎖安定化剤のみが前記ＩＤＲ－ポリペプチドとして提供されるか、又は前記ポリメラーゼのみが前記ＩＤＲ－ポリペプチドとして提供されるか、又はエキソヌクレアーゼのみが前記ＩＤＲ－ポリペプチドとして提供される、請求項９～１５のいずれかに記載の方法。
- ＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、前記ＩＤＲ－ポリペプチドが遺伝子操作された融合タンパク質であるように、前記１つ以上のＩＤＲを含むアミノ酸配列又はこれからなるアミノ酸配列として前記ＩＤＲ－ポリペプチドにタグ付けされ、前記１つ以上の機能的ＩＤＲが、前記ＩＤＲ－ポリペプチドのＣ末端、前記ＩＤＲ－ポリペプチドのＮ末端、又は前記ＩＤＲ－ポリペプチドのＣ末端と前記ＩＤＲ－ポリペプチドのＮ末端の両方、又は前記ポリペプチドの長さに沿った任意のアミノ酸位置に位置する、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、アルゴリズムＭｅｔａＤｉｓｏｒｄｅｒによって分析した場合に０．５を超えるスコアを示すアミノ酸の配列として特徴付けられる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、前記トリペプチド配列ＲＧＧの１つ以上のリピートを含むアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、ジペプチド配列ＦＧの１つ以上のリピートをさらに含むアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる、請求項１９に記載の方法。
- ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、チロシン又はフェニルアラニンからなる少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基をさらに含むアミノ酸配列を含むか又はこれからなる、請求項１９又は請求項２０に記載の方法。
- ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、
ｉ．（ＹＮＰＱＧＧＹＱＱ）ｎ、（式中、ｎは１～１０の正の整数であり、任意にｎ＝１、２、又は３である）、又は
ｉｉ．（ＹＳＰＴＳＰＳ）ｎ、（式中、ｎは１～１０の正の整数であり、任意にｎ＝１、２、又は３である）、又は
ｉｉｉ．（ＦＳＰＴＳＰＴ）ｎ、（式中、ｎは１～１０の正の整数であり、任意にｎ＝１、２、又は３である）、又は
ｉｖ．（ＹＳＰＴＳＰ－Ａ／Ｎ／Ｇ）ｎ、式中、ｎは１～１０の正の整数であり、任意にｎ＝１、２、又は３である）、又は
ｖ．（ＹＳＰＧＳＰＡ）ｎ、（式中、ｎは１～１０の正の整数であり、任意にｎ＝１、２、又は３である）
の前記アミノ酸配列を含むか又はこれからなる、先行請求項のいずれかに記載の方法。 - ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、グルタミンリッチなアミノ酸配列を含むか又はこれからなり、任意に前記アミノ酸配列が、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０個の連続するグルタミン残基を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、トリペプチド配列ＱＱＱの１つ以上のリピートを含むアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる、請求項２３に記載の方法。
- ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、（ＱＱＱＰＱＹ）ｎのアミノ酸配列を含むか又はこれからなり、式中、ｎは１～１０の正の整数であり、任意にｎ＝１、２、又は３である、請求項２３又は請求項２４に記載の方法。
- ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、配列番号１の少なくとも５個の連続するアミノ酸の配列を含むか又はこれからなる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、配列番号９の少なくとも５個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、１つ以上の芳香族チロシン残基及び多価金属イオン、好ましくは二価金属イオンとの芳香族カチオン－π相互作用に関与することができる１つ以上のフェニルアラニン残基を含有するアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの１つ以上の機能的ＩＤＲが、多価金属イオン、好ましくは二価金属イオンとのグアニジン－金属相互作用に関与することができる１つ以上のアルギニン残基を含むアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- ＩＤＲ－ポリペプチドが、配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなる、又は配列番号１～４３の機能的バリアントアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなる、例えば配列番号１～４３のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列で、タグ付けされたポリペプチドを含むか若しくはそれからなる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- ＩＤＲ－ポリペプチドが、Ｇｐ３２であり、配列番号６５～８８のいずれか１つの前記アミノ酸配列を有する一本鎖安定化剤であるか、又は前記ＩＤＲ－ポリペプチドが、その機能的バリアント、例えば配列番号６５～８８のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＩＤＲ－ポリペプチドである、請求項９～３０のいずれかに記載の方法。
- ＩＤＲ－ポリペプチドが、ＵｖｓＸであり、配列番号４４～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ剤であるか、又は前記ＩＤＲ－ポリペプチドがその機能的バリアント、例えば配列番号４４～５９のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＩＤＲ－ポリペプチドである、請求項９～３０のいずれかに記載の方法。
- ＩＤＲ－ポリペプチドが、ＵｖｓＹであり、配列番号６０～６４のいずれか１つのアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ負荷タンパク質であるか、又は前記ＩＤＲ－ポリペプチドが、その機能的バリアント、例えば配列番号６０～６４のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＩＤＲ－ポリペプチドである、請求項９～３０のいずれかに記載の方法。
- インビトロ反応系においてＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドに多価金属イオンを提供し、それによって前記インビトロ反応系における前記液体－液体脱混合を刺激又は増強し、それによって生化学反応の効率を高めることをさらに含み、好ましくは前記液体－液体脱混合が前記インビトロ反応系における検出可能な相分離粒子の形成を促進し、それによって前記生化学反応の前記効率を高め、任意に、前記多価金属イオンが約２２ｍＭ以上の濃度で提供され、好ましくは前記多価金属イオンが約２２ｍＭ～５０ｍＭの濃度で提供される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- 多価金属イオンが、二価金属イオン、任意にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、より好ましくはＭｇ２＋である、請求項３４に記載の方法。
- 生化学反応が、表面を含む固相反応系で行われる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- 生化学反応が、請求項３又は請求項４に記載のインビトロ反応系において一本鎖標的核酸分子又は二本鎖標的核酸分子を増幅する方法であり、少なくとも１つの核酸プライマー及び／又はＩＤＲ－巨大分子及び／又は前記１つ以上のポリペプチド補助因子が前記表面に結合している、請求項３６に記載の方法。
- 生化学反応が、インビトロ反応系において二本鎖標的核酸分子を増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であり、前記反応が、表面を含む固相反応系において行われ、前記リコンビナーゼ剤及び／又は前記リコンビナーゼ負荷タンパク質及び／又は前記一本鎖安定化剤及び／又は前記ポリメラーゼ及び／又は前記エキソヌクレアーゼ及び／又は前記第１の核酸プライマー及び／又は前記第２の核酸プライマーが前記表面に結合しており、好ましくは、（ｉ）前記第１の核酸プライマー又は前記第２の核酸プライマーが前記表面に結合している、又は（ｉｉ）第１及び第２の核酸プライマーの両方が表面に結合している、請求項９～３４のいずれかに記載の方法。
- 表面が平面であるか又はマイクロビーズであり、好ましくは、前記表面がシリコン、ガラス、ゲルベースの材料及び／又はポリスチレンなどのポリマー材料を含み、より好ましくは、前記表面がポリスチレンなどのポリマー材料を含むマイクロビーズである、請求項３６～３８のいずれかに記載の方法。
- 表面が基質に結合され、好ましくは前記表面が平面であり、及び／又は前記基質がガラスを含み、任意に前記表面及び／又は前記基質がフローセルとして提供される、請求項３９に記載の方法。
- 巨大分子及びタグアミノ酸配列を含む天然起源でないＩＤＲ－巨大分子であって、前記タグ配列が、１つ以上の機能的天然変性領域（ＩＤＲ）を含むか又はこれからなり、前記ＩＤＲ－巨大分子が溶液中での液体－液体脱混合を促進することができる、ＩＤＲ－巨大分子。
- 液体－液体脱混合が、インビトロ反応系における検出可能な相分離粒子の形成を促進する、請求項４１に記載のＩＤＲ－巨大分子。
- 液体－液体脱混合及び相分離した水性区画の形成が、それによって系内の生化学反応の効率を高めるか、又は検出可能な相分離した水性粒子の形成が、それによって前記系内の生化学反応の前記効率を高める、請求項４１又は請求項４２に記載のＩＤＲ－巨大分子。
- ポリペプチド及びタグアミノ酸配列を含む天然起源でない、人工の又は遺伝子操作されたＩＤＲ－ポリペプチドである、請求項４１～４３のいずれかに記載のＩＤＲ－巨大分子。
- タグアミノ酸配列が、ポリペプチドのＣ末端、前記ポリペプチドのＮ末端、又は前記ポリペプチドのＣ末端と前記ポリペプチドのＮ末端の両方、又は前記ポリペプチドの長さに沿った任意のアミノ酸位置に位置する、請求項４４に記載のＩＤＲ－ポリペプチド。
- タグアミノ酸配列の１つ以上の機能的ＩＤＲが、請求項１４～２８のいずれか一項に記載の機能的ＩＤＲである、請求項４５に記載のＩＤＲ－ポリペプチド。
- タグ配列が、多価金属カチオン、好ましくは二価金属カチオン、より好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋イオン、さらにより好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、さらにより好ましくはＭｇ２＋との芳香族カチオン－π相互作用に関与することができるアミノ酸残基を含む、請求項４１～４６のいずれかに記載のＩＤＲ－巨大分子又はポリペプチド。
- １つ以上の機能的ＩＤＲを含むか又はこれからなる配列がタグ付けされているポリペプチドが、酵素、例えばヘリカーゼ、ジャイレース、リコンビナーゼ、例えばＲＰＡリコンビナーゼ剤、ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ、リガーゼ、グリコリアーゼ（ｇｌｙｃｏｌｙａｓｅ）、メチラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＣＲＩＳＰＲ酵素などの遺伝子編集酵素、例えばＣａｓ９酵素；補助因子、例えばＲＰＡリコンビナーゼ負荷タンパク質及びＲＰＡ一本鎖安定化剤として、である請求項４４～４７のいずれかに記載のＩＤＲ－ポリペプチド。
- １つ以上の機能的ＩＤＲを含むか又はこれからなる配列がタグ付けされたポリペプチドが、ＲＰＡ一本鎖安定化剤、好ましくはＧｐ３２であり、任意に、ＩＤＲ－ポリペプチドが、配列番号６５～８８のいずれか１つのアミノ酸配列を有するか、又は前記ＩＤＲ－ポリペプチドがその機能的バリアント、例えば、配列番号６５～８８のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＩＤＲ－ポリペプチドである、請求項４８に記載のＩＤＲ－ポリペプチド。
- １つ以上の機能的ＩＤＲを含むか又はからなる配列がタグ付けされたポリペプチドが、ＲＰＡリコンビナーゼ剤、好ましくはＵｖｓＸであり、任意に、ＩＤＲ－ポリペプチドが、配列番号４４～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するか、又は前記ＩＤＲ－ポリペプチドがその機能的バリアント、例えば、配列番号４４～５９のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＩＤＲ－ポリペプチドである、請求項４８に記載のＩＤＲ－ポリペプチド。
- １つ以上の機能的ＩＤＲを含むか又はからなる配列がタグ付けされたポリペプチドが、ＲＰＡリコンビナーゼ負荷タンパク質、好ましくはＵｖｓＹであり、任意に、ＩＤＲ－ポリペプチドが、配列番号６０～６４のいずれか１つのアミノ酸配列を有するか、又は前記ＩＤＲ－ポリペプチドがその機能的バリアント、例えば、配列番号６０～６４のいずれか１つと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＩＤＲ－ポリペプチドである、請求項４８に記載のＩＤＲ－ポリペプチド。
- 請求項４１～５１のいずれか一項に記載のＩＤＲ－ポリペプチドをコードする第１の核酸配列を含み、任意に、プロモーターをコードする第２の核酸配列を含み、前記第１の核酸配列が前記第２の核酸配列に作動可能に連結されている、単離された核酸分子。
- 請求項５２に記載の核酸分子を含む組換えポリヌクレオチド発現ベクター。
- 請求項５２に記載の核酸分子又は請求項５３に記載の組換えポリヌクレオチド発現ベクターを含む宿主細胞。
- 増殖培地及び宿主細胞の集団を含む細胞培養物であって、前記集団が請求項５４に記載の宿主細胞を含む、細胞培養物。
- 請求項４１～５１のいずれか一項に記載の天然起源でないＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを含むキット。
- ＲＰＡリコンビナーゼ剤、及び／又はＲＰＡリコンビナーゼ負荷タンパク質、及び／又はポリメラーゼ、及び／又は第１及び第２の核酸プライマー、及び／又はエキソヌクレアーゼ、及び／又は緩衝液、及び／又は多価金属イオン源、好ましくは二価金属カチオンを含む追加のＲＰＡ成分をさらに含む、請求項５６に記載のキット。
- すべての成分が凍結乾燥形態で提供される、請求項５６又は請求項５７に記載のキット。
- 溶液中の液体－液体脱混合を刺激又は増強する方法であって、前記方法が、請求項４１～５１のいずれか一項に記載のＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを含む溶液を提供することと、前記溶液中で前記ＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドを多価金属イオンと接触させることとを含み、前記溶液中の液体－液体脱混合が刺激又は増強される、方法。
- 液体－液体脱混合が、溶液中で検出可能な相分離粒子の形成をもたらす、請求項５９に記載の方法。
- 前記多価金属イオンが、二価金属イオン、任意にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、より好ましくはＭｇ２＋である、請求項５９又は請求項６０に記載の方法。
- 溶液中で液体－液体脱混合を刺激又は増強する際の多価金属イオンの使用であって、前記脱混合が、請求項４１～５１のいずれかに記載のＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドによって媒介される、使用。
- 液体－液体脱混合が、溶液中で検出可能な相分離粒子の形成をもたらす、請求項６２に記載の使用。
- 前記多価金属イオンが、二価金属イオン、任意にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣａ２＋、より好ましくはＭｇ２＋である、請求項６２又は請求項６３に記載の使用。
- 多価金属イオンが、１つ以上の機能的ＩＤＲアミノ酸配列中のアミノ酸残基との芳香族カチオン－π相互作用に関与し、それによって液体－液体脱混合を促進する、請求項６２～６４のいずれかに記載の使用。
- 治療での使用のための、又は診断剤としての使用のための、請求項４１～４８のいずれかに記載の天然起源でないＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチド。
- １つ以上の標的ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列を決定するための、以下を含む方法：
（ｉ）請求項１～４０のいずれかに記載の方法を行い、１つ以上の標的ポリヌクレオチド分子を増幅し、それによって、前記１つ以上の標的ポリヌクレオチド分子の複数のコピーを含む集団を得る工程、
（ｉｉ）前記標的ポリヌクレオチド分子の前記複数のコピーを含む前記集団に対して１つ又は２つ以上の核酸配列決定反応を行う工程、
好ましくは、前記方法は、表面を含む固相反応系において行われる。 - １つ以上の標的ポリヌクレオチド分子、好ましくはＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を決定する方法における、請求項４１～５１のいずれかに記載のＩＤＲ－巨大分子又はＩＤＲ－ポリペプチドの使用、ただし、該方法は、好ましくは請求項６７に記載の方法である。
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