JP2023500327A - ミオイノシトールを使用して除核赤芽球細胞を生成する方法 - Google Patents

ミオイノシトールを使用して除核赤芽球細胞を生成する方法 Download PDF

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Abstract

除核赤芽球細胞集団を生成する方法が本明細書に提供される。本発明は、成熟中にミオイノシトールを含む培養培地中での赤芽球前駆細胞の培養が、細胞増殖の増加、除核率の増加、ひいては除核赤芽球細胞数の増加（例えば、赤芽球前駆細胞の成熟中に、ミオイノシトール（例えば、約０．５ｇ／Ｌ～約５４．０ｇ／Ｌのミオイノシトール）を含む培養培地の使用を含まない方法と比較して）、および／または赤芽球前駆細胞が成長および／または除核し続けることができる期間の延長をもたらすという発見に基づく。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６２／９３０，５０６号に対する優先権を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、概して、除核赤芽球細胞を生成する方法に関する。
赤血球は、失血を経験した患者に輸血される。加えて、赤血球を含む操作された除核赤芽球細胞は、それを必要とする患者に外因性タンパク質を運搬または提示する治療薬として開発中である。
本発明は、成熟中にミオイノシトールを含む培養培地中での赤芽球前駆細胞の培養が、細胞増殖の増加、除核率の増加、ひいては除核赤芽球細胞数の増加（例えば、赤芽球前駆細胞の成熟中に、ミオイノシトール（例えば、約０．５ｇ／Ｌ～約５４．０ｇ／Ｌのミオイノシトール）を含む培養培地の使用を含まない方法と比較して）、および／または赤芽球前駆細胞が成長および／または除核し続けることができる期間の延長をもたらすという発見に基づく。
この発見に照らして、除核赤芽球細胞集団を生成する方法であって、（ａ）赤芽球前駆細胞の第１の細胞培養物のある体積を、容器内に含まれる第２の培養培地中に配置して、第２の細胞培養物を提供することと、（ｂ）第２の細胞培養物を約２日～約１５日間培養する（例えば、灌流、回分、または流加培養する）ことと、（ｃ）ステップ（ｂ）の第２の細胞培養物のある体積を、容器内に含まれる第３の培養培地中に配置して、第３の細胞培養物を提供することであって、第３の培養培地が、約０．５ｇ／Ｌ～約５４．０ｇ／Ｌまたは約５０μＭ～約４４５ｍＭのミオイノシトール（またはミオイノシトール前駆体もしくはミオイノシトール分解産物）を含む、提供することと、（ｄ）ステップ（ｃ）の第３の細胞培養物を約５日～約２０日間培養する（例えば、灌流、回分、または流加培養する）ことと、を含み、ステップ（ｄ）の後に、第３の培養培地が除核赤芽球細胞集団を含む、方法が本明細書に提供される。本明細書に記載の除核赤芽球細胞集団を生成する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の初期細胞密度は、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬである。本明細書に記載の除核赤芽球細胞集団を生成する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の初期細胞密度は、約１×１０５～約１×１０７細胞／ｍＬである。
本明細書に記載の除核赤芽球細胞集団を生成する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の容器は灌流バイオリアクターであり、ステップ（ｂ）の培養は灌流培養であり、ステップ（ｃ）の容器は灌流バイオリアクターであり、ステップ（ｄ）の培養は灌流培養である。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップ（ａ）の前に、（ｉ）複数の赤芽球前駆細胞を、容器内に含まれる第１の培養培地中に配置して、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬの初期細胞密度を有する第１の細胞培養物を提供することと、（ｉｉ）第１の細胞培養物を約１日～約１５日間回分または流加培養することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、振盪フラスコである。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１５ｍＬ～約５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約５０ｍＬ～約１．５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１００ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪フラスコを０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪フラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、振盪管である。いくつかの実施形態では、振盪管は、約２ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約５０ｍＬ～約２００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、円錐容器である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、培養バッグである。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約２５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約５０揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約２５揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を回分培養することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を流加培養することを含む。いくつかの実施形態では、流加培養は、第１の培養培地の追加体積を経時的に第１の細胞培養物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地の追加体積は、経時的に第１の細胞培養物に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、第１の細胞培養培地の追加体積は、経時的に第１の細胞培養物に定期的に添加される。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＩＬ－３、およびＩＬ－６の各々を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約８μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１５０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１６０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１８０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の回分または流加培養は、約５日～約１２日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の回分または流加培養は、約５日～約９日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の初期細胞密度は、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の初期細胞密度は、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の灌流バイオリアクターは、５Ｌ～約５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の灌流バイオリアクターは、約５Ｌ～約２，５００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の灌流バイオリアクターは、約５Ｌ～約１００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、約５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、約１０ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、第２の培養液の追加体積を経時的に第２の培養液に添加することを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地の追加体積は、経時的に第２の細胞培養物に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、第２の培養培地の追加体積は、経時的に第２の細胞培養物に定期的に添加される。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびインスリンのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのうちの３つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンの各々を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭのデキサメタゾンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭのデキサメタゾンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭのデキサメタゾンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、約４日～約１０日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、約５日～約８日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の初期細胞密度は、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の初期細胞密度は、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の灌流バイオリアクターは、約５００ｍＬ～約１５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の灌流バイオリアクターは、５Ｌ～約５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の灌流バイオリアクターは、約５Ｌ～約２，５００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の灌流バイオリアクターは、約５Ｌ～約１００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、約５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、約１０ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、（ｉ）第３の培養培地の追加体積を第３の細胞培養物に第１の期間にわたって添加することと、（ｉｉ）第４の培養培地の追加体積を第３の培養培地に第２の期間にわたって添加することとを含み、第４の培養培地は、約０．５ｇ／Ｌ～約５２．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第３の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第１の期間にわたって連続的に添加される、および／または（ｉｉ）の第４の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第２の期間にわたって連続的に添加される。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第３の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第１の期間にわたって定期的に添加される、および／または（ｉｉ）の第４の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第２の期間にわたって定期的に添加される。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第１の期間は、約１日～約７日間である。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第１の期間は、約３日～約５日間である。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）の第２の期間は、約１日～約１０日間である。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）の第２の期間は、約３日～約７日間である。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．５ｇ／Ｌ～約２５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第３の液体培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第３の液体培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯの各々を含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む。
いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約０．５ｇ／Ｌ～約２５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯの各々を含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約２ｍｇ／ｍＬのホロトランスフェリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約１．５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯをさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、約８日～約１５日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、約９日～約１３日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の初期細胞密度は、約２．０×１０５細胞／ｍＬ～約８．０×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の初期細胞密度は、約４．０×１０５細胞／ｍＬ～約６．０×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）および（ｄ）の灌流培養は、接線濾過の使用を含む。いくつかの実施形態では、接線濾過は、交互接線濾過（ＡＴＦ）である。いくつかの実施形態では、接線濾過は、約１０ｎｍ～約６．０μｍの平均細孔径を有するフィルターの使用を含む。いくつかの実施形態では、フィルターは、約０．１μｍ～約３．０μｍの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）により、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬの細胞密度がもたらされる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）により、約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬの細胞密度がもたらされる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）により、約５×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬの細胞密度がもたらされる。
本明細書に記載の除核赤芽球細胞集団を生成する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の培養は回分または流加培養であり、ステップ（ｃ）の容器は灌流バイオリアクターであり、ステップ（ｄ）の培養は灌流培養である。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップ（ａ）の前に、（ｉ）複数の赤芽球前駆細胞を、容器内に含まれる第１の培養培地中に配置して、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬの初期細胞密度を有する第１の細胞培養物を提供することと、（ｉｉ）第１の細胞培養物を約１日～約１５日間回分または流加培養することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、振盪フラスコである。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１５ｍＬ～約５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約５０ｍＬ～約１．５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１００ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪フラスコを約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪フラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、振盪管である。いくつかの実施形態では、振盪管は、約２ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約５０ｍＬ～約２００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、円錐容器である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、培養バッグである。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約２５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約５０揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約２５揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を回分培養することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を流加培養することを含む。いくつかの実施形態では、流加培養は、第１の培養培地の追加体積を経時的に第１の細胞培養物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地の追加体積は、経時的に第１の細胞培養物に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、第１の細胞培養培地の追加体積は、経時的に第１の細胞培養物に定期的に添加される。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＩＬ－３、およびＩＬ－６の各々を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約８μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、およそ脂質（例えば、脂質混合物）を含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１５０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１６０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１８０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の回分または流加培養は、約５日～約１２日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の回分または流加培養は、約５日～約９日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の初期細胞密度は、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の初期細胞密度は、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の容器は、振盪フラスコである。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１５ｍＬ～約３Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約５０ｍＬ～約１．５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１００ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、振盪フラスコを０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、振盪フラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の容器は、振盪管である。いくつかの実施形態では、振盪管は、約２ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約５０ｍＬ～約２００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、円錐容器である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、振盪管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、振盪管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の容器は、培養バッグである。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約２５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約５０揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約２５揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の容器は、バイオリアクターである。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、１Ｌ～約１５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）のバイオリアクターは、５Ｌ～約５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）のバイオリアクターは、約５Ｌ～約２，５００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）のバイオリアクターは、約５Ｌ～約１００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を回分培養することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を流加培養することを含む。いくつかの実施形態では、流加培養は、第２の培養培地の追加体積を経時的に第２の細胞培養物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地の追加体積は、経時的に第２の細胞培養物に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、第２の細胞培養培地の追加体積は、経時的に第２の細胞培養物に定期的に添加される。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびインスリンのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのうちの３つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンの各々を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭのデキサメタゾンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭのデキサメタゾンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭのデキサメタゾンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、およそ脂質（例えば、脂質混合物）を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の回分または流加培養は、約４日～約１０日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の回分または流加培養は、約５日～約８日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の初期細胞密度は、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の初期細胞密度は、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の灌流バイオリアクターは、約５００ｍＬ～約１５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の灌流バイオリアクターは、５Ｌ～約５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の灌流バイオリアクターは、約５Ｌ～約２，５００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の灌流バイオリアクターは、約５Ｌ～約１００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、約５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、約１０ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、（ｉ）第３の培養培地の追加体積を第３の細胞培養物に第１の期間にわたって添加することと、（ｉｉ）第４の培養培地の追加体積を第３の培養培地に第２の期間にわたって添加することとを含み、第４の培養培地は、約０．５ｇ／Ｌ～約５２．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第３の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第１の期間にわたって連続的に添加される、および／または（ｉｉ）の第４の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第２の期間にわたって連続的に添加される。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第３の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第１の期間にわたって定期的に添加される、および／または（ｉｉ）の第４の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第２の期間にわたって定期的に添加される。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第１の期間は、約１日～約７日間である。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第１の期間は、約３日～約５日間である。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）の第２の期間は、約１日～約１０日間である。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）の第２の期間は、約３日～約７日間である。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．５ｇ／Ｌ～約２５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯの各々を含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第３の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第３の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む。
いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約０．５ｇ／Ｌ～約２５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯの各々を含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約１．５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯをさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、約８日～約１５日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、約９日～約１３日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の初期細胞密度は、約２．０×１０５細胞／ｍＬ～約８．０×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の初期細胞密度は、約４．０×１０５細胞／ｍＬ～約６．０×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、接線濾過の使用を含む。いくつかの実施形態では、接線濾過は、交互接線濾過（ＡＴＦ）である。いくつかの実施形態では、接線濾過は、約１０ｎｍ～約６．０μｍの平均細孔径を有するフィルターの使用を含む。いくつかの実施形態では、フィルターは、約０．１μｍ～約３．０μｍの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）により、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬの細胞密度がもたらされる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）により、約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬの細胞密度がもたらされる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）により、約５×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬの細胞密度がもたらされる。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の容器は灌流バイオリアクターであり、ステップ（ｂ）の培養は灌流培養であり、ステップ（ｄ）の培養は回分または流加培養である。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップ（ａ）の前に、
（ｉ）複数の赤芽球前駆細胞を、容器内に含まれる第１の培養培地中に配置して、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬの初期細胞密度を有する第１の細胞培養物を提供することと、（ｉｉ）第１の細胞培養物を約１日～約１５日間回分または流加培養することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、振盪フラスコである。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１５ｍＬ～約３Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約５０ｍＬ～約１．５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１００ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪フラスコを約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪フラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、振盪管である。いくつかの実施形態では、振盪管は、約２ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約５０ｍＬ～約２００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、円錐容器である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、培養バッグである。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約２５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約５０揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約２５揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を回分培養することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を流加培養することを含む。いくつかの実施形態では、流加培養は、第１の培養培地の追加体積を経時的に第１の細胞培養物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地の追加体積は、経時的に第１の細胞培養物に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、第１の細胞培養培地の追加体積は、経時的に第１の細胞培養物に定期的に添加される。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＩＬ－３、およびＩ１－６の各々を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約８μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１５０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１６０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１８０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の回分または流加培養は、約５日～約１２日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の回分または流加培養は、約５日～約９日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の初期細胞密度は、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の初期細胞密度は、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の灌流バイオリアクターは、約５００ｍＬ～約１５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の灌流バイオリアクターは、５Ｌ～約５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の灌流バイオリアクターは、約５Ｌ～約２，５００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の灌流バイオリアクターは、約５Ｌ～約１００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、約５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、約１０ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、第２の培養液の追加体積を経時的に第２の培養液に添加することを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地の追加体積は、経時的に第２の細胞培養物に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、第２の培養培地の追加体積は、経時的に第２の細胞培養物に定期的に添加される。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびインスリンのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのうちの３つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンの各々を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭのデキサメタゾンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭのデキサメタゾンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭのデキサメタゾンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、約４日～約１０日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、約５日～約８日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の初期細胞密度は、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の初期細胞密度は、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の容器は、振盪フラスコである。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１５ｍＬ～約３Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約５０ｍＬ～約１．５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１００ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、振盪フラスコを約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、振盪フラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の容器は、振盪管である。いくつかの実施形態では、振盪管は、約２ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約５０ｍＬ～約２００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、円錐容器である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、振盪管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、振盪管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の容器は、培養バッグである。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約２５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約２５揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の容器は、バイオリアクターである。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、１Ｌ～約１５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、５Ｌ～約５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、約５Ｌ～約２，５００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、約５Ｌ～約１００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物を回分培養することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物を流加培養することを含む。いくつかの実施形態では、流加培養は、第３の培養培地の追加体積を経時的に第３の細胞培養物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地の追加体積は、経時的に第３の細胞培養物に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、第３の細胞培養培地の追加体積は、経時的に第３の細胞培養物に定期的に添加される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の回分および流加培養は、（ｉ）第３の培養培地の追加体積を第３の細胞培養物に第１の期間にわたって添加することと、（ｉｉ）第４の培養培地の追加体積を第３の培養培地に第２の期間にわたって添加することとを含み、第４の培養培地は、約０．５ｇ／Ｌ～約５２．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第３の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第１の期間にわたって連続的に添加される、および／または（ｉｉ）の第４の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第２の期間にわたって連続的に添加される。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第３の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第１の期間にわたって定期的に添加される、および／または（ｉｉ）の第４の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第２の期間にわたって定期的に添加される。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第１の期間は、約１日～約７日間である。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第１の期間は、約３日～約５日間である。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）の第２の期間は、約１日～約１０日間である。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）の第２の期間は、約３日～約７日間である。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．５ｇ／Ｌ～約２５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯの各々を含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第３の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第３の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む。
いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約０．５ｇ／Ｌ～約２５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯの各々を含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約１．５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯをさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の回分または流加培養は、約８日～約１５日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の回分または流加培養は、約９日～約１３日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の初期細胞密度は、約２．０×１０５細胞／ｍＬ～約８．０×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の初期細胞密度は、約４．０×１０５細胞／ｍＬ～約６．０×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、接線濾過の使用を含む。いくつかの実施形態では、接線濾過は、交互接線濾過（ＡＴＦ）である。いくつかの実施形態では、接線濾過は、約１０ｎｍ～約６．０μＭの平均細孔径を有するフィルターの使用を含む。いくつかの実施形態では、フィルターは、約０．１μＭ～約３．０μＭの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）により、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬの細胞密度がもたらされる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）により、約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬの細胞密度がもたらされる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）により、約５×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬの細胞密度がもたらされる。
本明細書に記載の除核赤芽球細胞集団を生成する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の培養は回分または流加培養であり、ステップ（ｄ）の培養は回分または流加培養である。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップ（ａ）の前に、（ｉ）複数の赤芽球前駆細胞を、容器内に含まれる第１の培養培地中に配置して、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬの初期細胞密度を有する第１の細胞培養物を提供することと、（ｉｉ）第１の細胞培養物を約１日～約１５日間回分または流加培養することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、振盪フラスコである。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１５ｍＬ～約５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約５０ｍＬ～約１．５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１００ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪フラスコを約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪フラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、振盪管である。いくつかの実施形態では、振盪管は、約２ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約５０ｍＬ～約２００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、円錐容器である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、培養バッグである。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約２５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約５０揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約２５揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を回分培養することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を流加培養することを含む。いくつかの実施形態では、流加培養は、第１の培養培地の追加体積を経時的に第１の細胞培養物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地の追加体積は、経時的に第１の細胞培養物に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、第１の細胞培養培地の追加体積は、経時的に第１の細胞培養物に定期的に添加される。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＩＬ－３、およびＩ１－６の各々を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約８μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１５０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１６０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１８０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の回分または流加培養は、約５日～約１２日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の回分または流加培養は、約５日～約９日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の初期細胞密度は、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の初期細胞密度は、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の容器は、振盪フラスコである。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１５ｍＬ～約３Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約５０ｍＬ～約１．５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１００ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、振盪フラスコを０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、振盪フラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の容器は、振盪管である。いくつかの実施形態では、振盪管は、約２ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約５０ｍＬ～約２００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、円錐容器である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、振盪管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、振盪管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の容器は、培養バッグである。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約２５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約５０揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約２５揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の容器は、バイオリアクターである。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、１Ｌ～約１５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）のバイオリアクターは、５Ｌ～約５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）のバイオリアクターは、約５Ｌ～約２，５００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）のバイオリアクターは、約５Ｌ～約１００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を回分培養することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を流加培養することを含む。いくつかの実施形態では、流加培養は、第２の培養培地の追加体積を経時的に第２の細胞培養物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地の追加体積は、経時的に第２の細胞培養物に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、第２の細胞培養培地の追加体積は、経時的に第２の細胞培養物に定期的に添加される。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびインスリンのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのうちの３つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンの各々を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭのデキサメタゾンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭのデキサメタゾンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭのデキサメタゾンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。いくつかの実施形態では、第２の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の回分または流加培養は、約４日～約１０日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の回分または流加培養は、約５日～約８日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の初期細胞密度は、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の初期細胞密度は、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の容器は、振盪フラスコである。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１５ｍＬ～約３Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約５０ｍＬ～約１．５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約１００ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、振盪フラスコを約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、振盪フラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の容器は、振盪管である。いくつかの実施形態では、振盪管は、約２ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、約５０ｍＬ～約２００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、振盪管は、円錐容器である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、振盪管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、振盪管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の容器は、培養バッグである。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約２５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約５０揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、培養バッグを約１０揺動サイクル／分～約２５揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の容器は、バイオリアクターである。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、１Ｌ～約１５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、５Ｌ～約５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、約５Ｌ～約２，５００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、約５Ｌ～約１００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物を回分培養することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物を流加培養することを含む。いくつかの実施形態では、流加培養は、第３の培養培地の追加体積を経時的に第３の細胞培養物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地の追加体積は、経時的に第３の細胞培養物に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、第３の細胞培養培地の追加体積は、経時的に第３の細胞培養物に定期的に添加される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の回分および流加培養は、（ｉ）第３の培養培地の追加体積を第３の細胞培養物に第１の期間にわたって添加することと、（ｉｉ）第４の培養培地の追加体積を第３の培養培地に第２の期間にわたって添加することとを含み、第４の培養培地は、約０．５ｇ／Ｌ～約５２．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第３の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第１の期間にわたって連続的に添加される、および／または（ｉｉ）の第４の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第２の期間にわたって連続的に添加される。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第３の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第１の期間にわたって定期的に添加される、および／または（ｉｉ）の第４の培養培地の追加体積は、第３の細胞培養物に第２の期間にわたって定期的に添加される。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第１の期間は、約１日～約７日間である。いくつかの実施形態では、（ｉ）の第１の期間は、約３日～約５日間である。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）の第２の期間は、約１日～約１０日間である。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）の第２の期間は、約３日～約７日間である。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．５ｇ／Ｌ～約２５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯの各々を含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第３の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第３の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む。
いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約０．５ｇ／Ｌ～約２５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１．０ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯの各々を含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約１．５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯをさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の回分または流加培養は、約８日～約１５日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の回分または流加培養は、約９日～約１３日間行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の初期細胞密度は、約２．０×１０５細胞／ｍＬ～約８．０×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の初期細胞密度は、約４．０×１０５細胞／ｍＬ～約６．０×１０５細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）により、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬの細胞密度がもたらされる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）により、約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬの細胞密度がもたらされる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）により、約５×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬの細胞密度がもたらされる。
本明細書に記載の除核赤芽球細胞集団を生成する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、赤芽球前駆細胞は、ヒト赤芽球前駆細胞である。いくつかの実施形態では、赤芽球前駆細胞は、Ｏ陰性ヒトドナーから得られる。いくつかの実施形態では、赤芽球前駆細胞は、Ｏ陰性およびＫｅｌｌ陰性ヒトドナーから得られる。
本明細書に記載の除核赤芽球細胞集団を生成する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、除核赤芽球細胞集団は、ヒト除核赤芽球細胞集団である。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）の第３の細胞培養物から除核赤芽球細胞集団を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｆ）ステップ（ｅ）で単離された除核赤芽球細胞集団を製剤化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｇ）ステップ（ｆ）の製剤化された除核赤芽球細胞集団を、それを必要とする対象に投与することをさらに含む。
本明細書に記載の除核赤芽球細胞集団を生成する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、ステップ（ａ）の前に、第１の細胞培養物中の赤芽球前駆細胞に核酸を導入することをさらに含み、本方法により、操作された除核赤芽球細胞集団の生成がもたらされる。いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞集団は、操作されたヒト赤芽球細胞である。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の外因性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、操作されたヒト除核赤芽球細胞は、１つ以上の外因性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の外因性タンパク質を細胞にクリックコンジュゲートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞を低張的にロードすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、物理的操作を介して細胞をロードすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性タンパク質のうちの１つが、操作されたヒト除核赤芽球細胞のサイトゾル中に存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性タンパク質のうちの１つは、操作されたヒト除核赤芽球細胞の膜上に存在するタンパク質である。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性タンパク質のうちの１つがフェニルアラニンアンモニアリアーゼであり、フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、操作されたヒト除核赤芽球細胞のサイトゾル中に存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性タンパク質は、免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性タンパク質は、抗原提示分子を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）の第３の細胞培養物から操作された除核赤芽球細胞集団を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｆ）ステップ（ｅ）で単離された操作された除核赤芽球細胞集団を製剤化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｇ）ステップ（ｆ）の製剤化された操作された除核赤芽球細胞集団を、それを必要とする対象に投与することをさらに含む。
本明細書に記載の除核赤芽球細胞集団を生成する方法のうちのいずれかによって産生される除核赤芽球細胞集団も本明細書に提供される。（ｆ）ステップ（ｅ）で単離された除核赤芽球細胞集団を製剤化することをさらに含む、本明細書に記載の除核赤芽球細胞集団を生成する方法のうちのいずれかによって産生される製剤も本明細書に提供される。ステップ（ａ）の前に、第１の細胞培養物中の赤芽球前駆細胞に核酸を導入することさらにを含み、本方法により、操作された除核赤芽球細胞集団の産生がもたらされる、本明細書に記載の除核赤芽球細胞集団を生成する方法のうちのいずれかによって産生される除核赤芽球細胞集団も本明細書に提供される。ステップ（ａ）中および／またはステップ（ａ）の前に、第１の細胞培養物中の赤芽球前駆細胞に核酸を導入することをさらに含み、本方法により、操作された除核赤芽球細胞集団の産生がもたらされ、本方法が、（ｅ）ステップ（ｄ）の第３の細胞培養物から操作された除核赤芽球細胞集団を単離することをさらに含み、本方法が、（ｆ）ステップ（ｅ）で単離された操作された除核赤芽球細胞集団を製剤化することをさらに含む、本明細書に記載の除核赤芽球細胞集団を生成する方法のうちのいずれかによって産生される製剤も本明細書に提供される。
「集団」という用語は、所与の物品（例えば、本明細書に記載の例示的な除核赤芽球細胞のうちのいずれか）のうちの２つ以上を意味する。
「操作された除核赤芽球細胞」という用語は、１つ以上（例えば、２、３、４、５、または６つ）の外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な外因性タンパク質の任意の組み合わせ）を含む除核赤芽球細胞（例えば、ヒト除核赤芽球細胞）を意味する。例えば、操作された赤血球は、そのサイトゾル中に存在する１つ以上の外因性タンパク質を有し得る。いくつかの実施形態では、操作された赤血球は、その原形質膜上に存在する１つ以上の外因性タンパク質を有し得る。いくつかの実施形態では、操作された赤血球は、（ｉ）そのサイトゾル中に存在する１つ以上の外因性タンパク質、および（ｉｉ）その原形質膜上に存在する１つ以上の外因性タンパク質を有し得る。操作された除核赤芽球細胞の非限定的な例には、クリックコンジュゲートされた除核赤芽球細胞、低張的にロードされた除核赤芽球細胞、および物理的操作（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なタイプの物理的操作のうちのいずれか）によってロードされた除核赤芽球細胞が挙げられる。操作された除核赤芽球細胞の追加の非限定的な態様は、本明細書に記載される。
「クリックコンジュゲートされた除核赤芽球細胞」という用語は、化学反応により操作された除核赤芽球細胞の原形質膜上に存在する別のタンパク質（例えば、除核赤血球の内因性タンパク質または異なる外因性タンパク質）にコンジュゲートされた少なくとも１つの外因性タンパク質を有する操作された除核赤芽球細胞を意味する。
「低張的にロードされた除核赤芽球細胞」という用語は、除核赤芽球細胞または赤芽球前駆細胞を、１つ以上の外因性タンパク質を含む低イオン強度緩衝液（例えば、本明細書に記載の例示的な低イオン強度緩衝液のうちのいずれか）に曝露することによって少なくとも部分的に生成された操作された除核赤芽球細胞を意味する。低張的にロードされた除核赤芽球細胞を生成するために使用することができる方法の非限定的な例が本明細書に記載される。低張的にロードされた除核赤芽球細胞を生成するための追加の方法は、当該技術分野で既知である。
「物理的操作によってロードされた除核赤芽球細胞」という用語は、１つ以上の外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な外因性タンパク質のうちのいずれか）および／または１つ以上の外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な外因性タンパク質のうちのいずれか）をコードする核酸の赤芽球前駆細胞への導入をもたらす様式で赤芽球前駆細胞を物理的に操作することによって少なくとも部分的に生成された除核赤芽球細胞を意味する。１つ以上の外因性タンパク質をコードする核酸を赤芽球前駆細胞に導入するために使用することができる物理的操作の非限定的な例には、エレクトロポレーションおよび粒子媒介トランスフェクションが挙げられる。１つ以上の外因性タンパク質をコードする核酸を赤芽球前駆細胞に導入するために使用することができる物理的操作の追加の例は、当該技術分野で既知である。
「外因性タンパク質」という用語は、細胞内もしくは細胞上に導入されるか、またはタンパク質をコードする外因性核酸を細胞もしくは細胞の前駆体に導入することにより細胞によって発現されるタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、外因性タンパク質は、細胞または細胞の前駆体に導入された外因性核酸によってコードされるタンパク質であり、この核酸は任意選択的に細胞によって保持されない。いくつかの実施形態では、外因性タンパク質は、化学的または酵素的手段によって細胞の表面にコンジュゲートされたタンパク質である。外因性タンパク質の非限定的なクラスには、酵素、インターロイキン、サイトカイン受容体、Ｆｃ結合分子、Ｔ細胞活性化リガンド、Ｔ細胞受容体、免疫阻害分子、ＭＨＣ分子、ＡＰＣ結合分子、自己抗原、アレルゲン、毒素、標的剤、受容体リガンド（例えば、受容体作動薬または受容体拮抗薬）、および抗体または抗体断片が含まれる。操作された除核赤芽球細胞中に存在することができる外因性タンパク質の追加の例が本明細書に記載される（例えば、表Ａ～Ｄを参照されたい）。操作された除核赤芽球細胞中に存在することができる外因性タンパク質の追加の例は、当該技術分野で既知である。
「膜上に存在するタンパク質」という用語は、（１）除核赤芽球の膜に物理的に結合しているか、またはその膜中に少なくとも部分的に包埋されたタンパク質（例えば、膜貫通タンパク質、表在性膜タンパク質、脂質アンカータンパク質（例えば、ＧＰＩアンカー、Ｎ－ミリストイル化タンパク質、またはＳ－パルミトイル化タンパク質））、または（２）その同族受容体に安定的に結合したタンパク質を意味し、ここで、同族受容体が除核赤芽球細胞の膜に物理的に結合している（例えば、その同族受容体に結合したリガンドであって、その同族受容体が除核赤芽球細胞の膜に物理的に結合している）。哺乳類細胞の膜上にタンパク質が存在するかを決定するための非限定的な方法には、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学、細胞分画アッセイ、およびウェスタンブロッティングが含まれる。
「赤芽球前駆細胞」という用語は、除核赤芽球細胞に最終的に分化／発育することができる哺乳類細胞を意味する。いくつかの実施形態では、赤芽球前駆細胞は、臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＣ、ＨＳＰＣ）、脾臓コロニー形成（ＣＦＵ－Ｓ）細胞、一般的な骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）、芽球コロニー形成細胞、バースト形成単位－赤芽球／赤血球（ＢＦＵ－Ｅ）、巨核球－赤芽球前駆（ＭＥＰ）細胞、赤芽球コロニー形成単位、もしくはコロニー形成単位赤血球（ＣＦＵ－Ｅ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、赤芽球前駆細胞は、ヒト赤芽球前駆細胞である。いくつかの実施形態では、赤芽球前駆細胞は、Ｏ陰性ヒトドナーから得ることができる。いくつかの実施形態では、赤芽球前駆細胞は、Ｏ陰性およびＫｅｌｌ陰性ヒトドナーから得ることができる。
「対象」という用語は、任意の哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、対象または「治療を必要とする対象」は、霊長類（例えば、ヒト、サル（ｓｉｍｉａｎ）（例えば、サル（ｍｏｎｋｅｙ）（例えば、マーモセットもしくはヒヒ））、または類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、もしくはテナガザル）、齧歯類（例えば、マウス、テンジクネズミ、ハムスター、もしくはラット）、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、またはヤギとすることができる。いくつかの実施形態では、対象または「治療に好適な対象」は、非ヒト哺乳動物、特に、ヒト（例えば、マウス、ブタ、ラット、または非ヒト霊長類）における治療有効性を実証するためのモデルとして従来使用されている哺乳動物であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、医療専門家（例えば、医師、検査技師、医師助手、看護師、または臨床検査技師））によって治療が必要であると以前に診断または特定された可能性がある。
本明細書で使用される場合、「治療する」とは、対象（例えば、本明細書に記載の例示的な対象のうちのいずれか）における内科的疾患または状態の１つ以上の症状の数、重症度、頻度、および／または持続時間の減少を意味する。
「振盪フラスコ」という用語は、少なくとも１つのガス透過性表面（例えば、滅菌バリアの役割も果たし得る膜などのガス透過性要素を有する端部）および／または少なくとも１つのベントキャップを有する、液体培養培地の体積を保持することができる容器（例えば、滅菌容器）を意味し、その形状の少なくとも一部分は略円錐台形である。例えば、振盪フラスコは、Ｔフラスコ、三角フラスコ、または任意の当該技術分野で認識されているそれらの修正バージョンなどの細胞培養フラスコとすることができる。
「振盪管」という用語は、少なくとも１つのガス透過性表面（例えば、滅菌バリアの役割も果たし得る膜などのガス透過性要素を有する端部）および／または少なくとも１つのベントキャップを有し、かつ撹拌（例えば、回転撹拌）時に液体培養培地を容器内に保持することができる、液体培養培地を保持することができる容器（例えば、滅菌容器）を意味し、その形状の少なくとも一部分は略円筒形である。例えば、振盪管は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）管（例えば、５０ｍＬもしくは１５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）管）、または任意の当該技術分野で認識されているそれらの等価もしくは修正バージョンとすることができる。いくつかの実施形態では、振盪管は、マルチウェルプレート内のウェル（例えば、丸底ウェルまたは平底ウェル）とすることができる。
「流加培養」という用語は、第１の液体培養培地を細胞培養物から実質的にまたは有意に除去することなく、第２の液体培養培地を初期細胞培養物に増分的または連続的に添加することを含む培養方法を意味する。いくつかの事例では、第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地と実質的に同じ濃度で同じ成分を含む。他の事例では、第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地の濃縮形態である、および／または乾燥粉末として添加される。
「灌流培養」という用語は、液体培養培地の細胞培養物への添加（増分的または連続的）および液体培養培地の細胞培養物からの除去の両方を含む培養方法を意味する。除去および添加は、同時にもしくは順次、またはそれらの２つの組み合わせで行うことができる。さらに、除去および添加は連続的に行うことができる。
除去された液体培養培地の体積および添加された液体培養培地の体積は、いくつかの事例では、培養期間全体またはその一部にわたって、各２４時間（あるいは、約１時間～約２４時間の増分期間もしくは２４時間を超える増分期間）にわたってほぼ同じに保持することができる。当該技術分野で知られているように、液体培養培地の体積が除去される速度（体積／時間単位）および液体培養培地の体積が添加される速度（体積／時間単位）は変化し得る。液体培養培地の体積が除去される速度（体積／時間単位）および液体培養培地の体積が添加される速度（体積／時間単位）は、ほぼ同じであってもよく、または異なっていてもよい。
あるいは、除去された体積および添加された体積は、培養期間中、各２４時間（あるいは、１時間～約２４時間の増分期間もしくは２４時間を超える増分期間）にわたって変化（例えば、徐々に増加）し得る。例えば、培養期間にわたって各２４時間（あるいは、１時間～２４時間超の増分期間または２４時間を超える増分期間）以内に除去された液体培養培地の体積および添加された液体培養培地の体積は、培養期間にわたって増加し得る（例えば、徐々にまたは時差増分（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）により）。
液体培養培地の体積は、例えば、液体培養培地の体積を容器（例えば、バイオリアクター）から除去することができる機械的システムによって、細胞を沈殿させてピペット操作を使用して液体培養培地の体積を除去することによって、または遠心力の使用を少なくとも部分的に含み得る方法によって除去することができる。あるいは、または加えて、液体培養培地の体積は、赤芽球前駆細胞および除核赤芽球細胞を除く分子量カットオフを有する滅菌膜を通した液体培養培地の体積の浸出または重力流によって除去することができる。
液体培養培地の体積は、例えば、蠕動ポンプまたは灌流ポンプによって自動化様式で容器（例えば、バイオリアクター）に添加することができる。
「動物成分を含まない液体培養培地」という用語は、哺乳動物に由来するいかなる成分（例えば、タンパク質または血清）も含まない液体培養培地を意味する。
「無血清液体培養培地」という用語は、哺乳動物の血清を含まない液体培養培地を意味する。
「既知組成液体培養培地」という用語は、全ての化学成分が知られている液体培養培地を意味する。例えば、既知組成液体培養培地は、胎児血清、血清アルブミン、または血清アルブミンを含まず、これらの調製物が典型的にはアルブミンと脂質の複合混合物を含むためである。
「撹拌」という用語は、容器内での細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な細胞のうちのいずれかを含む細胞培養物）の移動を意味する。撹拌は、任意の当該技術分野で既知の方法、例えば、回転振盪機などの円運動または楕円運動で細胞培養物を含む容器を移動させる器具を使用して行うことができる。あるいは、または加えて、撹拌は、容器を傾けることによって、または細胞培養物を含む容器を転がすことによって行うことができる。いくつかの実施形態では、細胞培養物の撹拌は、細胞培養物を含むバイオリアクター内でのインペラの使用により起こり得る。
「ミオイノシトール分解産物」という用語は、哺乳類細胞中のミオイノシトールの異化によって産生される分子（例えば、産物または中間体）を意味する。ミオイノシトール分解産物の非限定的な例は、グルクロン酸およびホスファチジル－１Ｄ－ミオイノシトールである。
「ミオイノシトール前駆体」という用語は、哺乳類細胞におけるミオイノシトール生合成経路中の分子（例えば、基質または中間体）を意味する。ミオイノシトール前駆体の非限定的な例には、１Ｄ－ミオイノシトール－３－ホスフェートおよび１Ｄ－ミオイノシトール－１－ホスフェートが挙げられる。ミオイノシトール前駆体の追加の非限定的な例には、１－ホスファチジル－１Ｄ－ミオイノシトール－３，５－ビスホスフェート、１－ホスファチジル－１Ｄ－ミオイノシトール－５－ホスフェート、１－ホスファチジル－１Ｄ－ミオイノシトール－３，４，５－トリスホスフェート、１－ホスファチジル－１Ｄ－ミオイノシトール－３－ホスフェート、１－ホスファチジル－１Ｄ－ミオイノシトール－３，４－ビスホスフェート、１－ホスファチジル－１Ｄ－ミオイノシトール－４，５－ビスホスフェート、１－ホスファチジル－１Ｄ－ミオイノシトール－４－ホスフェート、ホスファチジル－１Ｄ－ミオイノシトール、ミオイノシトール－１，３－ビスホスフェート、１Ｄ－ミオイノシトール－４－ホスフェート、１Ｄ－ミオイノシトール－１，４－ビスホスフェート、１Ｄ－ミオイノシトール－１，４，５－トリスホスフェート、１Ｄ－ミオイノシトール－１，３，４，５－テトラキスホスフェート、１Ｄ－ミオイノシトール－１，３，４－トリスホスフェート、Ｄ－グルコース－６－ホスフェート、および１Ｄ－ミオイノシトール－３，４－ビスホスフェートが挙げられる。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、細胞培養は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかのうちの少なくとも一部において細胞培養物の撹拌を含まない。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明に使用するための方法および材料が本明細書に記載されており、当該技術分野で既知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施例は例証にすぎず、限定するようには意図されていない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。
本発明の他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態および図面から、かつ特許請求の範囲から明らかであろう。
ミオイノシトールを含む第３の培養培地またはミオイノシトールを含まない第３の培養培地を使用した際の赤芽球前駆細胞の培養物中の総細胞密度（「総細胞密度」）を示す。 ミオイノシトールを含む第３の培養培地またはミオイノシトールを含まない第３の培養培地を使用した際の赤芽球前駆細胞の培養物中の除核細胞密度を示す。
除核赤芽球細胞集団を生成する方法であって、（ａ）赤芽球前駆細胞の第１の細胞培養物のある体積を、容器内に含まれる第２の培養培地中に配置して、第２の細胞培養物を提供することと、（ｂ）第２の細胞培養物を約２日～約１５日間培養する（例えば、灌流、回分、または流加培養する）ことと、（ｃ）ステップ（ｂ）の第２の細胞培養物のある体積を、容器内に含まれる第３の培養培地中に配置して、第３の細胞培養物を提供することであって、第３の培養培地が、約０．５ｇ／Ｌ～約５４．０ｇ／Ｌまたは約５０μＭ～約４４５ｍＭのミオイノシトール（またはそのミオイノシトール前駆体もしくはそのミオイノシトール分解産物）を含む、提供することと、（ｄ）ステップ（ｃ）の第３の細胞培養物を約５日～約２０日間培養する（例えば、灌流、回分、または流加培養する）ことと、を含み、ステップ（ｄ）の後に、第３の培養培地が除核赤芽球細胞集団を含む、方法が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、成熟中にミオイノシトール（またはミオイノシトール前駆体もしくはミオイノシトール分解産物）を含むか、または０．５ｇ／Ｌ～約５４．０ｇ／Ｌまたは５０μＭ～約４４５ｍＭのミオイノシトール（またはミオイノシトール前駆体もしくはミオイノシトール分解産物）を含む培養培地の使用を含まない同様の方法と比較して、本明細書に記載の方法のうちのいずれかの終了時に、除核率または除核細胞パーセンテージの増加（例えば、少なくとも１％～約３００％増加（例えば、約１％～約２８０％増加、約１％～約２６０％増加、約１％～約２４０％増加、約１％～約２２０％増加、約１％～約２００％増加、約１％～約１８０％増加、約１％～約１６０％増加、約１％増加～約１４０％増加、約１％～約１２０％増加、約１％増加～約１００％増加、約１％増加～約８０％増加、約１％増加～約６０％増加、約１％増加～約４０％増加、約１％増加～約２０％増加、約１％増加～約１０％増加、約１％増加～約５％増加、約５％増加～約３００％増加、約５％～約２８０％増加、約５％～約２６０％増加、約５％～約２４０％増加、約５％～約２２０％増加、約５％～約２００％増加、約５％～約１８０％増加、約５％～約１６０％増加、約５％増加～約１４０％増加、約５％～約１２０％増加、約５％増加～約１００％増加、約５％増加～約８０％増加、約５％増加～約６０％増加、約５％増加～約４０％増加、約５％増加～約２０％増加、約５％増加～約１０％増加、約１０％増加～約３００％増加、約１０％～約２８０％増加、約１０％～約２６０％増加、約１０％～約２４０％増加、約１０％～約２２０％増加、約１０％～約２００％増加、約１０％～約１８０％増加、約１０％～約１６０％増加、約１０％増加～約１４０％増加、約１０％～約１２０％増加、約１０％増加～約１００％増加、約１０％増加～約８０％増加、約１０％増加～約６０％増加、約１０％増加～約４０％増加、約１０％増加～約２０％増加、約２０％増加～約３００％増加、約２０％～約２８０％増加、約２０％～約２６０％増加、約２０％～約２４０％増加、約２０％～約２２０％増加、約２０％～約２００％増加、約２０％～約１８０％増加、約２０％～約１６０％増加、約２０％増加～約１４０％増加、約２０％～約１２０％増加、約２０％増加～約１００％増加、約２０％増加～約８０％増加、約２０％増加～約６０％増加、約２０％増加～約４０％増加、約４０％増加～約３００％増加、約４０％～約２８０％増加、約４０％～約２６０％増加、約４０％～約２４０％増加、約４０％～約２２０％増加、約４０％～約２００％増加、約４０％～約１８０％増加、約４０％～約１６０％増加、約４０％増加～約１４０％増加、約４０％～約１２０％増加、約４０％増加～約１００％増加、約４０％増加～約８０％増加、約４０％増加～約６０％増加、約６０％増加～約３００％増加、約６０％～約２８０％増加、約６０％～約２６０％増加、約６０％～約２４０％増加、約６０％～約２２０％増加、約６０％～約２００％増加、約６０％～約１８０％増加、約６０％～約１６０％増加、約６０％増加～約１４０％増加、約６０％～約１２０％増加、約６０％増加～約１００％増加、約６０％増加～約８０％増加、約８０％増加～約３００％増加、約８０％～約２８０％増加、約８０％～約２６０％増加、約８０％～約２４０％増加、約８０％～約２２０％増加、約８０％～約２００％増加、約８０％～約１８０％増加、約８０％～約１６０％増加、約８０％増加～約１４０％増加、約８０％～約１２０％増加、約８０％増加～約１００％増加、約１００％増加～約３００％増加、約１００％～約２８０％増加、約１００％～約２６０％増加、約１００％～約２４０％増加、約１００％～約２２０％増加、約１００％～約２００％増加、約１００％～約１８０％増加、約１００％～約１６０％増加、約１００％増加～約１４０％増加、約１００％～約１２０％増加、約１２０％増加～約３００％増加、約１２０％～約２８０％増加、約１２０％～約２６０％増加、約１２０％～約２４０％増加、約１２０％～約２２０％増加、約１２０％～約２００％増加、約１２０％～約１８０％増加、約１２０％～約１６０％増加、約１２０％増加～約１４０％増加、約１４０％増加～約３００％増加、約１４０％～約２８０％増加、約１４０％～約２６０％増加、約１４０％～約２４０％増加、約１４０％～約２２０％増加、約１４０％～約２００％増加、約１４０％～約１８０％増加、約１４０％～約１６０％増加、約１６０％増加～約３００％増加、約１６０％～約２８０％増加、約１６０％～約２６０％増加、約１６０％～約２４０％増加、約１６０％～約２２０％増加、約１６０％～約２００％増加、約１６０％～約１８０％増加、約１８０％増加～約３００％増加、約１８０％～約２８０％増加、約１８０％～約２６０％増加、約１８０％～約２４０％増加、約１８０％～約２２０％増加、約１８０％～約２００％増加、約２００％増加～約３００％増加、約２００％～約２８０％増加、約２００％～約２６０％増加、約２００％～約２４０％増加、約２００％～約２２０％増加、約２２０％増加～約３００％増加、約２２０％～約２８０％増加、約２２０％～約２６０％増加、約２２０％～約２４０％増加、約２４０％増加～約３００％増加、約２４０％～約２８０％増加、約２４０％～約２６０％増加、約２６０％増加～約３００％増加、約２６０％～約２８０％増加、または約２８０％増加～約３００％増加））を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、成熟中にミオイノシトール（またはミオイノシトール前駆体もしくはミオイノシトール分解産物）を含むか、または約０．５ｇ／Ｌ～約５４．０ｇ／Ｌまたは約５０μＭ～４４５ｍＭのミオイノシトール（またはミオイノシトール前駆体もしくはミオイノシトール分解産物）を含む培養培地の使用を含まない同様の方法と比較して、本明細書に記載の方法のうちのいずれかの終了時に、除核赤芽球細胞（例えば、本明細書に記載の除核赤芽球細胞のうちのいずれか）の濃度、数、または収率の約１約％増加～約３００約％増加（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、分化または成熟中にミオイノシトール（またはミオイノシトール前駆体もしくはミオイノシトール分解産物）を含むか、または約０．５ｇ／Ｌ～約５４．０ｇ／Ｌまたは約５０μＭ～約４４５ｍＭのミオイノシトール（またはミオイノシトール前駆体もしくはミオイノシトール分解産物）を含む培養培地の使用を含まない同様の方法と比較して、本明細書に記載の方法のうちのいずれかの最中に、１赤芽球前駆細胞あたりの平均細胞分裂数の約１約％増加～約３００約％増加（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）を提供する。
これらの方法の非限定的な態様は、以下に記載される。当業者に理解され得るように、以下に列記される例示的な態様を任意の組み合わせで使用することができ、当該技術分野で既知の他の態様と組み合わせることもできる。
振盪フラスコ
本明細書に記載の方法のいくつかの態様は、振盪フラスコの使用を含む。いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約２ｍＬ～約５Ｌ、約２ｍＬ～約４．５Ｌ、約２ｍＬ～約４Ｌ、約２ｍＬ～約３．５Ｌ、約２ｍＬ～約３Ｌ、約２ｍＬ～約２．５Ｌ、約２ｍＬ～約２Ｌ、約２ｍＬ～約１．５Ｌ、約２ｍＬ～約１．０Ｌ、約２ｍＬ～約９５０ｍＬ、約２ｍＬ～約９００ｍＬ、約２ｍＬ～約８５０ｍＬ、約２ｍＬ～約８００ｍＬ、約２ｍＬ～約７５０ｍＬ、約２ｍＬ～約７００ｍＬ、約２ｍＬ～約６５０ｍＬ、約２ｍＬ～約６００ｍＬ、約２ｍＬ～約５５０ｍＬ、約２ｍＬ～約５００ｍＬ、約２ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２ｍＬ～約４００ｍＬ、約２ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２ｍＬ～約３００ｍＬ、約２ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２ｍＬ～約２００ｍＬ、約２ｍＬ～約１８０ｍＬ、約２ｍＬ～約１６０ｍＬ、約２ｍＬ～約１４０ｍＬ、約２ｍＬ～約１２０ｍＬ、約２ｍＬ～約１００ｍＬ、約２ｍＬ～約８０ｍＬ、約２ｍＬ～約６０ｍＬ、約２ｍＬ～約４０ｍＬ、約２ｍＬ～約２０ｍＬ、約２ｍＬ～約１０ｍＬ、約２ｍＬ～約５ｍＬ、約５ｍＬ～約５Ｌ、約５ｍＬ～約４．５Ｌ、約５ｍＬ～約４Ｌ、約５ｍＬ～約３．５Ｌ、約５ｍＬ～約３Ｌ、約５ｍＬ～約２．５Ｌ、約５ｍＬ～約２Ｌ、約５ｍＬ～約１．５Ｌ、約５ｍＬ～約１．０Ｌ、約５ｍＬ～約９５０ｍＬ、約５ｍＬ～約９００ｍＬ、約５ｍＬ～約８５０ｍＬ、約５ｍＬ～約８００ｍＬ、約５ｍＬ～約７５０ｍＬ、約５ｍＬ～約７００ｍＬ、約５ｍＬ～約６５０ｍＬ、約５ｍＬ～約６００ｍＬ、約５ｍＬ～約５５０ｍＬ、約５ｍＬ～約５００ｍＬ、約５ｍＬ～約４５０ｍＬ、約５ｍＬ～約４００ｍＬ、約５ｍＬ～約３５０ｍＬ、約５ｍＬ～約３００ｍＬ、約５ｍＬ～約２５０ｍＬ、約５ｍＬ～約２００ｍＬ、約５ｍＬ～約１８０ｍＬ、約５ｍＬ～約１６０ｍＬ、約５ｍＬ～約１４０ｍＬ、約５ｍＬ～約１２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１００ｍＬ、約５ｍＬ～約８０ｍＬ、約５ｍＬ～約６０ｍＬ、約５ｍＬ～約４０ｍＬ、約５ｍＬ～約２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１０ｍＬ、約１０ｍＬ～約５Ｌ、約１０ｍＬ～約４．５Ｌ、約１０ｍＬ～約４Ｌ、約１０ｍＬ～約３．５Ｌ、約１０ｍＬ～約３Ｌ、約１０ｍＬ～約２．５Ｌ、約１０ｍＬ～約２Ｌ、約１０ｍＬ～約１．５Ｌ、約１０ｍＬ～約１．０Ｌ、約１０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約９００ｍＬ、約１０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約７００ｍＬ、約１０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１０ｍＬ～約８０ｍＬ、約１０ｍＬ～約６０ｍＬ、約１０ｍＬ～約４０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約５Ｌ、約２０ｍＬ～約４．５Ｌ、約２０ｍＬ～約４Ｌ、約２０ｍＬ～約３．５Ｌ、約２０ｍＬ～約３Ｌ、約２０ｍＬ～約２．５Ｌ、約２０ｍＬ～約２Ｌ、約２０ｍＬ～約１．５Ｌ、約２０ｍＬ～約１．０Ｌ、約２０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約９００ｍＬ、約２０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約８００ｍＬ、約２０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約７００ｍＬ、約２０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約６００ｍＬ、約２０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約３００ｍＬ、約２０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１００ｍＬ、約２０ｍＬ～約８０ｍＬ、約２０ｍＬ～約６０ｍＬ、約２０ｍＬ～約４０ｍＬ、約４０ｍＬ～約５Ｌ、約４０ｍＬ～約４．５Ｌ、約４０ｍＬ～約４Ｌ、約４０ｍＬ～約３．５Ｌ、約４０ｍＬ～約３Ｌ、約４０ｍＬ～約２．５Ｌ、約４０ｍＬ～約２Ｌ、約４０ｍＬ～約１．５Ｌ、約４０ｍＬ～約１．０Ｌ、約４０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約９００ｍＬ、約４０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約８００ｍＬ、約４０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約７００ｍＬ、約４０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約６００ｍＬ、約４０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約５００ｍＬ、約４０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約３００ｍＬ、約４０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約２００ｍＬ、約４０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１００ｍＬ、約４０ｍＬ～約８０ｍＬ、約４０ｍＬ～約６０ｍＬ、約６０ｍＬ～約５Ｌ、約６０ｍＬ～約４．５Ｌ、約６０ｍＬ～約４Ｌ、約６０ｍＬ～約３．５Ｌ、約６０ｍＬ～約３Ｌ、約６０ｍＬ～約２．５Ｌ、約６０ｍＬ～約２Ｌ、約６０ｍＬ～約１．５Ｌ、約６０ｍＬ～約１．０Ｌ、約６０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約９００ｍＬ、約６０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約８００ｍＬ、約６０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約７００ｍＬ、約６０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約６００ｍＬ、約６０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約５００ｍＬ、約６０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約４００ｍＬ、約６０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約３００ｍＬ、約６０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約２００ｍＬ、約６０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１００ｍＬ、約６０ｍＬ～約８０ｍＬ、約８０ｍＬ～約５Ｌ、約８０ｍＬ～約４．５Ｌ、約８０ｍＬ～約４Ｌ、約８０ｍＬ～約３．５Ｌ、約８０ｍＬ～約３Ｌ、約８０ｍＬ～約２．５Ｌ、約８０ｍＬ～約２Ｌ、約８０ｍＬ～約１．５Ｌ、約８０ｍＬ～約１．０Ｌ、約８０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約９００ｍＬ、約８０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約８００ｍＬ、約８０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約７００ｍＬ、約８０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約６００ｍＬ、約８０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約５００ｍＬ、約８０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約４００ｍＬ、約８０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約３００ｍＬ、約８０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約２００ｍＬ、約８０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５Ｌ、約１００ｍＬ～約４．５Ｌ、約１００ｍＬ～約４Ｌ、約１００ｍＬ～約３．５Ｌ、約１００ｍＬ～約３Ｌ、約１００ｍＬ～約２．５Ｌ、約１００ｍＬ～約２Ｌ、約１００ｍＬ～約１．５Ｌ、約１００ｍＬ～約１．０Ｌ、約１００ｍＬ～約９５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約９００ｍＬ、約１００ｍＬ～約８５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約８００ｍＬ、約１００ｍＬ～約７５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約７００ｍＬ、約１００ｍＬ～約６５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約６００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約５００ｍＬ、約１００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約４００ｍＬ、約１００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約３００ｍＬ、約１００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約２００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約５Ｌ、約１２０ｍＬ～約４．５Ｌ、約１２０ｍＬ～約４Ｌ、約１２０ｍＬ～約３．５Ｌ、約１２０ｍＬ～約３Ｌ、約１２０ｍＬ～約２．５Ｌ、約１２０ｍＬ～約２Ｌ、約１２０ｍＬ～約１．５Ｌ、約１２０ｍＬ～約１．０Ｌ、約１２０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約９００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約７００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約５Ｌ、約１４０ｍＬ～約４．５Ｌ、約１４０ｍＬ～約４Ｌ、約１４０ｍＬ～約３．５Ｌ、約１４０ｍＬ～約３Ｌ、約１４０ｍＬ～約２．５Ｌ、約１４０ｍＬ～約２Ｌ、約１４０ｍＬ～約１．５Ｌ、約１４０ｍＬ～約１．０Ｌ、約１４０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約９００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約７００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約５Ｌ、約１６０ｍＬ～約４．５Ｌ、約１６０ｍＬ～約４Ｌ、約１６０ｍＬ～約３．５Ｌ、約１６０ｍＬ～約３Ｌ、約１６０ｍＬ～約２．５Ｌ、約１６０ｍＬ～約２Ｌ、約１６０ｍＬ～約１．５Ｌ、約１６０ｍＬ～約１．０Ｌ、約１６０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約９００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約７００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約５Ｌ、約１８０ｍＬ～約４．５Ｌ、約１８０ｍＬ～約４Ｌ、約１８０ｍＬ～約３．５Ｌ、約１８０ｍＬ～約３Ｌ、約１８０ｍＬ～約２．５Ｌ、約１８０ｍＬ～約２Ｌ、約１８０ｍＬ～約１．５Ｌ、約１８０ｍＬ～約１．０Ｌ、約１８０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約９００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約７００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５Ｌ、約２００ｍＬ～約４．５Ｌ、約２００ｍＬ～約４Ｌ、約２００ｍＬ～約３．５Ｌ、約２００ｍＬ～約３Ｌ、約２００ｍＬ～約２．５Ｌ、約２００ｍＬ～約２Ｌ、約２００ｍＬ～約１．５Ｌ、約２００ｍＬ～約１．０Ｌ、約２００ｍＬ～約９５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約９００ｍＬ、約２００ｍＬ～約８５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約８００ｍＬ、約２００ｍＬ～約７５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約７００ｍＬ、約２００ｍＬ～約６５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約６００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約５００ｍＬ、約２００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約４００ｍＬ、約２００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約３００ｍＬ、約２００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約５Ｌ、約２５０ｍＬ～約４．５Ｌ、約２５０ｍＬ～約４Ｌ、約２５０ｍＬ～約３．５Ｌ、約２５０ｍＬ～約３Ｌ、約２５０ｍＬ～約２．５Ｌ、約２５０ｍＬ～約２Ｌ、約２５０ｍＬ～約１．５Ｌ、約２５０ｍＬ～約１．０Ｌ、約２５０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約９００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約

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いくつかの実施形態では、振盪フラスコは、約０．１×ｇ～約５０×ｇ（例えば、約０．１×ｇ～約４０×ｇ、約０．１×ｇ～約３０×ｇ、約０．１×ｇ～約２０×ｇ、約０．１×ｇ～約１５×ｇ、約０．１×ｇ～約１０×ｇ、約０．１×ｇ～約９．５×ｇ、約０．１×ｇ～約９．０×ｇ、約０．１×ｇ～約８．５×ｇ、約０．１×ｇ～約８．０×ｇ、約０．１×ｇ～約７．５×ｇ、約０．１×ｇ～約７．０×ｇ、約０．１×ｇ～約６．５×ｇ、約０．１×ｇ～約６．０×ｇ、約０．１×ｇ～約５．５×ｇ、約０．１×ｇ～約５．０×ｇ、約０．１×ｇ～約４．５×ｇ、約０．１×ｇ～約４．１×ｇ、約０．１×ｇ～約４．０×ｇ、約０．１×ｇ～約３．５×ｇ、約０．１×ｇ～約３．０×ｇ、約０．１×ｇ～約２．５×ｇ、約０．１×ｇ～約２．０×ｇ、約０．１×ｇ～約１．７８×ｇ、約０．１×ｇ～約１．６×ｇ、約０．１×ｇ～約１．４×ｇ、約０．１×ｇ～約１．２×ｇ、約０．１×ｇ～約１．０×ｇ、約０．１×ｇ～約０．８×ｇ、約０．１×ｇ～約０．６×ｇ、約０．１×ｇ～約０．４×ｇ、約０．１×ｇ～約０．２３×ｇ、約０．２３×ｇ～約５０×ｇ、約０．２３×ｇ～約４０×ｇ、約０．２３×ｇ～約３０×ｇ、約０．２３×ｇ～約２０×ｇ、約０．２３×ｇ～約１５×ｇ、約０．２３×ｇ～約１０×ｇ、約０．２３×ｇ～約９．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約９．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約８．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約８．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約７．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約７．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約６．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約６．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約５．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約５．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約４．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約４．１×ｇ、約０．２３×ｇ～約４．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約３．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約３．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約２．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約２．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇ、約０．２３×ｇ～約１．６×ｇ、約０．２３×ｇ～約１．４×ｇ、約０．２３×ｇ～約１．２×ｇ、約０．２３×ｇ～約１．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約０．８×ｇ、約０．２３×ｇ～約０．６×ｇ、約０．２３×ｇ～約０．４×ｇ、約０．４×ｇ～約５０×ｇ、約０．４×ｇ～約４０×ｇ、約０．４×ｇ～約３０×ｇ、約０．４×ｇ～約２０×ｇ、約０．４×ｇ～約１５×ｇ、約０．４×ｇ～約１０×ｇ、約０．４×ｇ～約９．５×ｇ、約０．４×ｇ～約９．０×ｇ、約０．４×ｇ～約８．５×ｇ、約０．４×ｇ～約８．０×ｇ、約０．４×ｇ～約７．５×ｇ、約０．４×ｇ～約７．０×ｇ、約０．４×ｇ～約６．５×ｇ、約０．４×ｇ～約６．０×ｇ、約０．４×ｇ～約５．５×ｇ、約０．４×ｇ～約５．０×ｇ、約０．４×ｇ～約４．５×ｇ、約０．４×ｇ～約４．１×ｇ、約０．４×ｇ～約４．０×ｇ、約０．４×ｇ～約３．５×ｇ、約０．４×ｇ～約３．０×ｇ、約０．４×ｇ～約２．５×ｇ、約０．４×ｇ～約２．０×ｇ、約０．４×ｇ～約１．７８×ｇ、約０．４×ｇ～約１．６×ｇ、約０．４×ｇ～約１．４×ｇ、約０．４×ｇ～約１．２×ｇ、約０．４×ｇ～約１．０×ｇ、約０．４×ｇ～約０．８×ｇ、約０．４×ｇ～約０．６×ｇ、約０．６×ｇ～約５０×ｇ、約０．６×ｇ～約４０×ｇ、約０．６×ｇ～約３０×ｇ、約０．６×ｇ～約２０×ｇ、約０．６×ｇ～約１５×ｇ、約０．６×ｇ～約１０×ｇ、約０．６×ｇ～約９．５×ｇ、約０．６×ｇ～約９．０×ｇ、約０．６×ｇ～約８．５×ｇ、約０．６×ｇ～約８．０×ｇ、約０．６×ｇ～約７．５×ｇ、約０．６×ｇ～約７．０×ｇ、約０．６×ｇ～約６．５×ｇ、約０．６×ｇ～約６．０×ｇ、約０．６×ｇ～約５．５×ｇ、約０．６×ｇ～約５．０×ｇ、約０．６×ｇ～約４．５×ｇ、約０．６×ｇ～約４．１×ｇ、約０．６×ｇ～約４．０×ｇ、約０．６×ｇ～約３．５×ｇ、約０．６×ｇ～約３．０×ｇ、約０．６×ｇ～約２．５×ｇ、約０．６×ｇ～約２．０×ｇ、約０．６×ｇ～約１．７８×ｇ、約０．６×ｇ～約１．６×ｇ、約０．６×ｇ～約１．４×ｇ、約０．６×ｇ～約１．２×ｇ、約０．６×ｇ～約１．０×ｇ、約０．６×ｇ～約０．８×ｇ、約０．８×ｇ～約５０×ｇ、約０．８×ｇ～約４０×ｇ、約０．８×ｇ～約３０×ｇ、約０．８×ｇ～約２０×ｇ、約０．８×ｇ～約１５×ｇ、約０．８×ｇ～約１０×ｇ、約０．８×ｇ～約９．５×ｇ、約０．８×ｇ～約９．０×ｇ、約０．８×ｇ～約８．５×ｇ、約０．８×ｇ～約８．０×ｇ、約０．８×ｇ～約７．５×ｇ、約０．８×ｇ～約７．０×ｇ、約０．８×ｇ～約６．５×ｇ、約０．８×ｇ～約６．０×ｇ、約０．８×ｇ～約５．５×ｇ、約０．８×ｇ～約５．０×ｇ、約０．８×ｇ～約４．５×ｇ、約０．８×ｇ～約４．１×ｇ、約０．８×ｇ～約４．０×ｇ、約０．８×ｇ～約３．５×ｇ、約０．８×ｇ～約３．０×ｇ、約０．８×ｇ～約２．５×ｇ、約０．８×ｇ～約２．０×ｇ、約０．８×ｇ～約１．７８×ｇ、約０．８×ｇ～約１．６×ｇ、約０．８×ｇ～約１．４×ｇ、約０．８×ｇ～約１．２×ｇ、約０．８×ｇ～約１．０×ｇ、約１．０×ｇ～約５０×ｇ、約１．０×ｇ～約４０×ｇ、約１．０×ｇ～約３０×ｇ、約１．０×ｇ～約２０×ｇ、約１．０×ｇ～約１５×ｇ、約１．０×ｇ～約１０×ｇ、約１．０×ｇ～約９．５×ｇ、約１．０×ｇ～約９．０×ｇ、約１．０×ｇ～約８．５×ｇ、約１．０×ｇ～約８．０×ｇ、約１．０×ｇ～約７．５×ｇ、約１．０×ｇ～約７．０×ｇ、約１．０×ｇ～約６．５×ｇ、約１．０×ｇ～約６．０×ｇ、約１．０×ｇ～約５．５×ｇ、約１．０×ｇ～約５．０×ｇ、約１．０×ｇ～約４．５×ｇ、約１．０×ｇ～約４．１×ｇ、約１．０×ｇ～約４．０×ｇ、約１．０×ｇ～約３．５×ｇ、約１．０×ｇ～約３．０×ｇ、約１．０×ｇ～約２．５×ｇ、約１．０×ｇ～約２．０×ｇ、約１．０×ｇ～約１．７８×ｇ、約１．０×ｇ～約１．６×ｇ、約１．０×ｇ～約１．４×ｇ、約１．０×ｇ～約１．２×ｇ、約１．２×ｇ～約５０×ｇ、約１．２×ｇ～約４０×ｇ、約１．２×ｇ～約３０×ｇ、約１．２×ｇ～約２０×ｇ、約１．２×ｇ～約１５×ｇ、約１．２×ｇ～約１０×ｇ、約１．２×ｇ～約９．５×ｇ、約１．２×ｇ～約９．０×ｇ、約１．２×ｇ～約８．５×ｇ、約１．２×ｇ～約８．０×ｇ、約１．２×ｇ～約７．５×ｇ、約１．２×ｇ～約７．０×ｇ、約１．２×ｇ～約６．５×ｇ、約１．２×ｇ～約６．０×ｇ、約１．２×ｇ～約５．５×ｇ、約１．２×ｇ～約５．０×ｇ、約１．２×ｇ～約４．５×ｇ、約１．２×ｇ～約４．１×ｇ、約１．２×ｇ～約４．０×ｇ、約１．２×ｇ～約３．５×ｇ、約１．２×ｇ～約３．０×ｇ、約１．２×ｇ～約２．５×ｇ、約１．２×ｇ～約２．０×ｇ、約１．２×ｇ～約１．７８×ｇ、約１．２×ｇ～約１．６×ｇ、約１．２×ｇ～約１．４×ｇ、約１．４×ｇ～約５０×ｇ、約１．４×ｇ～約４０×ｇ、約１．４×ｇ～約３０×ｇ、約１．４×ｇ～約２０×ｇ、約１．４×ｇ～約１５×ｇ、約１．４×ｇ～約１０×ｇ、約１．４×ｇ～約９．５×ｇ、約１．４×ｇ～約９．０×ｇ、約１．４×ｇ～約８．５×ｇ、約１．４×ｇ～約８．０×ｇ、約１．４×ｇ～約７．５×ｇ、約１．４×ｇ～約７．０×ｇ、約１．４×ｇ～約６．５×ｇ、約１．４×ｇ～約６．０×ｇ、約１．４×ｇ～約５．５×ｇ、約１．４×ｇ～約５．０×ｇ、約１．４×ｇ～約４．５×ｇ、約１．４×ｇ～約４．１×ｇ、約１．４×ｇ～約４．０×ｇ、約１．４×ｇ～約３．５×ｇ、約１．４×ｇ～約３．０×ｇ、約１．４×ｇ～約２．５×ｇ、約１．４×ｇ～約２．０×ｇ、約１．４×ｇ～約１．７８×ｇ、約１．４×ｇ～約１．６×ｇ、約１．６×ｇ～約５０×ｇ、約１．６×ｇ～約４０×ｇ、約１．６×ｇ～約３０×ｇ、約１．６×ｇ～約２０×ｇ、約１．６×ｇ～約１５×ｇ、約１．６×ｇ～約１０×ｇ、約１．６×ｇ～約９．５×ｇ、約１．６×ｇ～約９．０×ｇ、約１．６×ｇ～約８．５×ｇ、約１．６×ｇ～約８．０×ｇ、約１．６×ｇ～約７．５×ｇ、約１．６×ｇ～約７．０×ｇ、約１．６×ｇ～約６．５×ｇ、約１．６×ｇ～約６．０×ｇ、約１．６×ｇ～約５．５×ｇ、約１．６×ｇ～約５．０×ｇ、約１．６×ｇ～約４．５×ｇ、約１．６×ｇ～約４．１×ｇ、約１．６×ｇ～約４．０×ｇ、約１．６×ｇ～約３．５×ｇ、約１．６×ｇ～約３．０×ｇ、約１．６×ｇ～約２．５×ｇ、約１．６×ｇ～約２．０×ｇ、約１．６×ｇ～約１．７８×ｇ、約１．７８×ｇ～約５０×ｇ、約１．７８×ｇ～約４０×ｇ、約１．７８×ｇ～約３０×ｇ、約１．７８×ｇ～約２０×ｇ、約１．７８×ｇ～約１５×ｇ、約１．７８×ｇ～約１０×ｇ、約１．７８×ｇ～約９．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約９．０×ｇ、約１．７８×ｇ～約８．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約８．０×ｇ、約１．７８×ｇ～約７．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約７．０×ｇ、約１．７８×ｇ～約６．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約６．０×ｇ、約１．７８×ｇ～約５．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約５．０×ｇ、約１．７８×ｇ～約４．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約４．１×ｇ、約１．７８×ｇ～約４．０×ｇ、約１．７８×ｇ～約３．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約３．０×ｇ、約１．７８×ｇ～約２．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約２．０×ｇ、約２．０×ｇ～約５０×ｇ、約２．０×ｇ～約４０×ｇ、約２．０×ｇ～約３０×ｇ、約２．０×ｇ～約２０×ｇ、約２．０×ｇ～約１５×ｇ、約２．０×ｇ～約１０×ｇ、約２．０×ｇ～約９．５×ｇ、約２．０×ｇ～約９．０×ｇ、約２．０×ｇ～約８．５×ｇ、約２．０×ｇ～約８．０×ｇ、約２．０×ｇ～約７．５×ｇ、約２．０×ｇ～約７．０×ｇ、約２．０×ｇ～約６．５×ｇ、約２．０×ｇ～約６．０×ｇ、約２．０×ｇ～約５．５×ｇ、約２．０×ｇ～約５．０×ｇ、約２．０×ｇ～約４．５×ｇ、約２．０×ｇ～約４．１×ｇ、約２．０×ｇ～約４．０×ｇ、約２．０×ｇ～約３．５×ｇ、約２．０×ｇ～約３．０×ｇ、約２．０×ｇ～約２．５×ｇ、約２．５×ｇ～約５０×ｇ、約２．５×ｇ～約４０×ｇ、約２．５×ｇ～約３０×ｇ、約２．５×ｇ～約２０×ｇ、約２．５×ｇ～約１５×ｇ、約２．５×ｇ～約１０×ｇ、約２．５×ｇ～約９．５×ｇ、約２．５×ｇ～約９．０×ｇ、約２．５×ｇ～約８．５×ｇ、約２．５×ｇ～約８．０×ｇ、約２．５×ｇ～約７．５×ｇ、約２．５×ｇ～約７．０×ｇ、約２．５×ｇ～約６．５×ｇ、約２．５×ｇ～約６．０×ｇ、約２．５×ｇ～約５．５×ｇ、約２．５×ｇ～約５．０×ｇ、約２．５×ｇ～約４．５×ｇ、約２．５×ｇ～約４．１×ｇ、約２．５×ｇ～約４．０×ｇ、約２．５×ｇ～約３．５×ｇ、約２．５×ｇ～約３．０×ｇ、約３．０×ｇ～約５０×ｇ、約３．０×ｇ～約４０×ｇ、約３．０×ｇ～約３０×ｇ、約３．０×ｇ～約２０×ｇ、約３．０×ｇ～約１５×ｇ、約３．０×ｇ～約１０×ｇ、約３．０×ｇ～約９．５×ｇ、約３．０×ｇ～約９．０×ｇ、約３．０×ｇ～約８．５×ｇ、約３．０×ｇ～約８．０×ｇ、約３．０×ｇ～約７．５×ｇ、約３．０×ｇ～約７．０×ｇ、約３．０×ｇ～約６．５×ｇ、約３．０×ｇ～約６．０×ｇ、約３．０×ｇ～約５．５×ｇ、約３．０×ｇ～約５．０×ｇ、約３．０×ｇ～約４．５×ｇ、約３．０×ｇ～約４．１×ｇ、約３．０×ｇ～約４．０×ｇ、約３．０×ｇ～約３．５×ｇ、約３．５×ｇ～約５０×ｇ、約３．５×ｇ～約４０×ｇ、約３．５×ｇ～約３０×ｇ、約３．５×ｇ～約２０×ｇ、約３．５×ｇ～約１５×ｇ、約３．５×ｇ～約１０×ｇ、約３．５×ｇ～約９．５×ｇ、約３．５×ｇ～約９．０×ｇ、約３．５×ｇ～約８．５×ｇ、約３．５×ｇ～約８．０×ｇ、約３．５×ｇ～約７．５×ｇ、約３．５×ｇ～約７．０×ｇ、約３．５×ｇ～約６．５×ｇ、約３．５×ｇ～約６．０×ｇ、約３．５×ｇ～約５．５×ｇ、約３．５×ｇ～約５．０×ｇ、約３．５×ｇ～約４．５×ｇ、約３．５×ｇ～約４．１×ｇ、約３．５×ｇ～約４．０×ｇ、約４．０×ｇ～約５０×ｇ、約４．０×ｇ～約４０×ｇ、約４．０×ｇ～約３０×ｇ、約４．０×ｇ～約２０×ｇ、約４．０×ｇ～約１５×ｇ、約４．０×ｇ～約１０×ｇ、約４．０×ｇ～約９．５×ｇ、約４．０×ｇ～約９．０×ｇ、約４．０×ｇ～約８．５×

ｇ、約４．０×ｇ～約８．０×ｇ、約４．０×ｇ～約７．５×ｇ、約４．０×ｇ～約７．０×ｇ、約４．０×ｇ～約６．５×ｇ、約４．０×ｇ～約６．０×ｇ、約４．０×ｇ～約５．５×ｇ、約４．０×ｇ～約５．０×ｇ、約４．０×ｇ～約４．５×ｇ、約４．０×ｇ～約４．１×ｇ、約４．１×ｇ～約５０×ｇ、約４．１×ｇ～約４０×ｇ、約４．１×ｇ～約３０×ｇ、約４．１×ｇ～約２０×ｇ、約４．１×ｇ～約１５×ｇ、約４．１×ｇ～約１０×ｇ、約４．１×ｇ～約９．５×ｇ、約４．１×ｇ～約９．０×ｇ、約４．１×ｇ～約８．５×ｇ、約４．１×ｇ～約８．０×ｇ、約４．１×ｇ～約７．５×ｇ、約４．１×ｇ～約７．０×ｇ、約４．１×ｇ～約６．５×ｇ、約４．１×ｇ～約６．０×ｇ、約４．１×ｇ～約５．５×ｇ、約４．１×ｇ～約５．０×ｇ、約４．１×ｇ～約４．５×ｇ、約４．５×ｇ～約５０×ｇ、約４．５×ｇ～約４０×ｇ、約４．５×ｇ～約３０×ｇ、約４．５×ｇ～約２０×ｇ、約４．５×ｇ～約１５×ｇ、約４．５×ｇ～約１０×ｇ、約４．５×ｇ～約９．５×ｇ、約４．５×ｇ～約９．０×ｇ、約４．５×ｇ～約８．５×ｇ、約４．５×ｇ～約８．０×ｇ、約４．５×ｇ～約７．５×ｇ、約４．５×ｇ～約７．０×ｇ、約４．５×ｇ～約６．５×ｇ、約４．５×ｇ～約６．０×ｇ、約４．５×ｇ～約５．５×ｇ、約４．５×ｇ～約５．０×ｇ、約５．０×ｇ～約５０×ｇ、約５．０×ｇ～約４０×ｇ、約５．０×ｇ～約３０×ｇ、約５．０×ｇ～約２０×ｇ、約５．０×ｇ～約１５×ｇ、約５．０×ｇ～約１０×ｇ、約５．０×ｇ～約９．５×ｇ、約５．０×ｇ～約９．０×ｇ、約５．０×ｇ～約８．５×ｇ、約５．０×ｇ～約８．０×ｇ、約５．０×ｇ～約７．５×ｇ、約５．０×ｇ～約７．０×ｇ、約５．０×ｇ～約６．５×ｇ、約５．０×ｇ～約６．０×ｇ、約５．０×ｇ～約５．５×ｇ、約５．５×ｇ～約５０×ｇ、約５．５×ｇ～約４０×ｇ、約５．５×ｇ～約３０×ｇ、約５．５×ｇ～約２０×ｇ、約５．５×ｇ～約１５×ｇ、約５．５×ｇ～約１０×ｇ、約５．５×ｇ～約９．５×ｇ、約５．５×ｇ～約９．０×ｇ、約５．５×ｇ～約８．５×ｇ、約５．５×ｇ～約８．０×ｇ、約５．５×ｇ～約７．５×ｇ、約５．５×ｇ～約７．０×ｇ、約５．５×ｇ～約６．５×ｇ、約５．５×ｇ～約６．０×ｇ、約６．０×ｇ～約５０×ｇ、約６．０×ｇ～約４０×ｇ、約６．０×ｇ～約３０×ｇ、約６．０×ｇ～約２０×ｇ、約６．０×ｇ～約１５×ｇ、約６．０×ｇ～約１０×ｇ、約６．０×ｇ～約９．５×ｇ、約６．０×ｇ～約９．０×ｇ、約６．０×ｇ～約８．５×ｇ、約６．０×ｇ～約８．０×ｇ、約６．０×ｇ～約７．５×ｇ、約６．０×ｇ～約７．０×ｇ、約６．０×ｇ～約６．５×ｇ、約６．５×ｇ～約５０×ｇ、約６．５×ｇ～約４０×ｇ、約６．５×ｇ～約３０×ｇ、約６．５×ｇ～約２０×ｇ、約６．５×ｇ～約１５×ｇ、約６．５×ｇ～約１０×ｇ、約６．５×ｇ～約９．５×ｇ、約６．５×ｇ～約９．０×ｇ、約６．５×ｇ～約８．５×ｇ、約６．５×ｇ～約８．０×ｇ、約６．５×ｇ～約７．５×ｇ、約６．５×ｇ～約７．０×ｇ、約７．０×ｇ～約５０×ｇ、約７．０×ｇ～約４０×ｇ、約７．０×ｇ～約３０×ｇ、約７．０×ｇ～約２０×ｇ、約７．０×ｇ～約１５×ｇ、約７．０×ｇ～約１０×ｇ、約７．０×ｇ～約９．５×ｇ、約７．０×ｇ～約９．０×ｇ、約７．０×ｇ～約８．５×ｇ、約７．０×ｇ～約８．０×ｇ、約７．０×ｇ～約７．５×ｇ、約７．５×ｇ～約５０×ｇ、約７．５×ｇ～約４０×ｇ、約７．５×ｇ～約３０×ｇ、約７．５×ｇ～約２０×ｇ、約７．５×ｇ～約１５×ｇ、約７．５×ｇ～約１０×ｇ、約７．５×ｇ～約９．５×ｇ、約７．５×ｇ～約９．０×ｇ、約７．５×ｇ～約８．５×ｇ、約７．５×ｇ～約８．０×ｇ、約８．０×ｇ～約５０×ｇ、約８．０×ｇ～約４０×ｇ、約８．０×ｇ～約３０×ｇ、約８．０×ｇ～約２０×ｇ、約８．０×ｇ～約１５×ｇ、約８．０×ｇ～約１０×ｇ、約８．０×ｇ～約９．５×ｇ、約８．０×ｇ～約９．０×ｇ、約８．０×ｇ～約８．５×ｇ、約８．５×ｇ～約５０×ｇ、約８．５×ｇ～約４０×ｇ、約８．５×ｇ～約３０×ｇ、約８．５×ｇ～約２０×ｇ、約８．５×ｇ～約１５×ｇ、約８．５×ｇ～約１０×ｇ、約８．５×ｇ～約９．５×ｇ、約８．５×ｇ～約９．０×ｇ、約９．０×ｇ～約５０×ｇ、約９．０×ｇ～約４０×ｇ、約９．０×ｇ～約３０×ｇ、約９．０×ｇ～約２０×ｇ、約９．０×ｇ～約１５×ｇ、約９．０×ｇ～約１０×ｇ、約９．０×ｇ～約９．５×ｇ、約９．５×ｇ～約５０×ｇ、約９．５×ｇ～約４０×ｇ、約９．５×ｇ～約３０×ｇ、約９．５×ｇ～約２０×ｇ、約９．５×ｇ～約１５×ｇ、約９．５×ｇ～約１０×ｇ、約１０×ｇ～約５０×ｇ、約１０×ｇ～約４０×ｇ、約１０×ｇ～約３０×ｇ、約１０×ｇ～約２０×ｇ、約１０×ｇ～約１５×ｇ、約１５×ｇ～約５０×ｇ、約１５×ｇ～約４０×ｇ、約１５×ｇ～約３０×ｇ、約１５×ｇ～約２０×ｇ、約２０×ｇ～約５０×ｇ、約２０×ｇ～約４０×ｇ、約２０×ｇ～約３０×ｇ、約３０×ｇ～約５０×ｇ、約３０×ｇ～約４０×ｇ、または約４０×ｇ～約５０×ｇ）の撹拌でインキュベートすることができる。
様々な振盪フラスコが市販されている。振盪フラスコの追加の非限定的な態様は、当該技術分野で既知である。
振盪管
本明細書に記載の方法のいくつかの態様は、振盪管の使用を含む。いくつかの実施形態では、振盪管は、約１ｍＬ～約５００ｍＬ、約１ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１ｍＬ～約４００ｍＬ、約１ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１ｍＬ～約３００ｍＬ、約１ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１ｍＬ～約２００ｍＬ、約１ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１ｍＬ～約１００ｍＬ、約１ｍＬ～約８０ｍＬ、約１ｍＬ～約６０ｍＬ、約１ｍＬ～約４０ｍＬ、約１ｍＬ～約２０ｍＬ、約１ｍＬ～約１０ｍＬ、約１ｍＬ～約５ｍＬ、約１ｍＬ～約２ｍＬ、約２ｍＬ～約５００ｍＬ、約２ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２ｍＬ～約４００ｍＬ、約２ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２ｍＬ～約３００ｍＬ、約２ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２ｍＬ～約２００ｍＬ、約２ｍＬ～約１８０ｍＬ、約２ｍＬ～約１６０ｍＬ、約２ｍＬ～約１４０ｍＬ、約２ｍＬ～約１２０ｍＬ、約２ｍＬ～約１００ｍＬ、約２ｍＬ～約８０ｍＬ、約２ｍＬ～約６０ｍＬ、約２ｍＬ～約４０ｍＬ、約２ｍＬ～約２０ｍＬ、約２ｍＬ～約１０ｍＬ、約２ｍＬ～約５ｍＬ、約５ｍＬ～約５００ｍＬ、約５ｍＬ～約４５０ｍＬ、約５ｍＬ～約４００ｍＬ、約５ｍＬ～約３５０ｍＬ、約５ｍＬ～約３００ｍＬ、約５ｍＬ～約２５０ｍＬ、約５ｍＬ～約２００ｍＬ、約５ｍＬ～約１８０ｍＬ、約５ｍＬ～約１６０ｍＬ、約５ｍＬ～約１４０ｍＬ、約５ｍＬ～約１２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１００ｍＬ、約５ｍＬ～約８０ｍＬ、約５ｍＬ～約６０ｍＬ、約５ｍＬ～約４０ｍＬ、約５ｍＬ～約２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１０ｍＬ、約１０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１０ｍＬ～約８０ｍＬ、約１０ｍＬ～約６０ｍＬ、約１０ｍＬ～約４０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約３００ｍＬ、約２０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１００ｍＬ、約２０ｍＬ～約８０ｍＬ、約２０ｍＬ～約６０ｍＬ、約２０ｍＬ～約４０ｍＬ、約４０ｍＬ～約５００ｍＬ、約４０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約３００ｍＬ、約４０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約２００ｍＬ、約４０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１００ｍＬ、約４０ｍＬ～約８０ｍＬ、約４０ｍＬ～約６０ｍＬ、約６０ｍＬ～約５００ｍＬ、約６０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約４００ｍＬ、約６０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約３００ｍＬ、約６０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約２００ｍＬ、約６０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１００ｍＬ、約６０ｍＬ～約８０ｍＬ、約８０ｍＬ～約５００ｍＬ、約８０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約４００ｍＬ、約８０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約３００ｍＬ、約８０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約２００ｍＬ、約８０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５００ｍＬ、約１００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約４００ｍＬ、約１００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約３００ｍＬ、約１００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約２００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５００ｍＬ、約２００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約４００ｍＬ、約２００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約３００ｍＬ、約２００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約３００ｍＬ～約５００ｍＬ、約３００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３００ｍＬ～約４００ｍＬ、約３００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４００ｍＬ～約５００ｍＬ、約４００ｍＬ～約４５０ｍＬ、または約４５０ｍＬ～約５００ｍＬの体積を有することができる。
いくつかの実施形態では、振盪管は、約０．１×ｇ～約５０×ｇ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の撹拌でインキュベートすることができる。
様々な振盪管が市販されている。振盪管の追加の非限定的な態様は、当該技術分野で既知である。
培養バッグ
本明細書に記載の方法のいくつかの態様は、培養バッグの使用を含む。いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５０ｍＬ～約５００Ｌ、約５０ｍＬ～約４００Ｌ、約５０ｍＬ～約３００Ｌ、約５０ｍＬ～約２００Ｌ、約５０ｍＬ～約１００Ｌ、約５０ｍＬ～約５０Ｌ、５０ｍＬ～約２５Ｌ、約５０ｍＬ～約２０Ｌ、約５０ｍＬ～約１５Ｌ、約５０ｍＬ～約１０Ｌ、約５０ｍＬ～約８Ｌ、約５０ｍＬ～約６Ｌ、約５０ｍＬ～約５Ｌ、約５０ｍＬ～約４Ｌ、約５０ｍＬ～約３Ｌ、約５０ｍＬ～約２．５Ｌ、約５０ｍＬ～約２．０Ｌ、約５０ｍＬ～約１．８Ｌ、約５０ｍＬ～約１．６Ｌ、約５０ｍＬ～約１．４Ｌ、約５０ｍＬ～約１．２Ｌ、約５０ｍＬ～約１．０Ｌ、約５０ｍＬ～約９００ｍＬ、約５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約５０ｍＬ～約７００ｍＬ、約５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約５０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約２００ｍＬ、約５０ｍＬ～約１５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約１００ｍＬ、約５０ｍＬ～約７５ｍＬ、約７５ｍＬ～約５００Ｌ、約７５ｍＬ～約４００Ｌ、約７５ｍＬ～約３００Ｌ、約７５ｍＬ～約２００Ｌ、約７５ｍＬ～約１００Ｌ、約７５ｍＬ～約５０Ｌ、７５ｍＬ～約２５Ｌ、約７５ｍＬ～約２０Ｌ、約７５ｍＬ～約１５Ｌ、約７５ｍＬ～約１０Ｌ、約７５ｍＬ～約８Ｌ、約７５ｍＬ～約６Ｌ、約７５ｍＬ～約５Ｌ、約７５ｍＬ～約４Ｌ、約７５ｍＬ～約３Ｌ、約７５ｍＬ～約２．５Ｌ、約７５ｍＬ～約２．０Ｌ、約７５ｍＬ～約１．８Ｌ、約７５ｍＬ～約１．６Ｌ、約７５ｍＬ～約１．４Ｌ、約７５ｍＬ～約１．２Ｌ、約７５ｍＬ～約１．０Ｌ、約７５ｍＬ～約９００ｍＬ、約７５ｍＬ～約８００ｍＬ、約７５ｍＬ～約７００ｍＬ、約７５ｍＬ～約６００ｍＬ、約７５ｍＬ～約５００ｍＬ、約７５ｍＬ～約４５０ｍＬ、約７５ｍＬ～約４００ｍＬ、約７５ｍＬ～約３５０ｍＬ、約７５ｍＬ～約３００ｍＬ、約７５ｍＬ～約２５０ｍＬ、約７５ｍＬ～約２００ｍＬ、約７５ｍＬ～約１５０ｍＬ、約７５ｍＬ～約１００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５００Ｌ、約１００ｍＬ～約４００Ｌ、約１００ｍＬ～約３００Ｌ、約１００ｍＬ～約２００Ｌ、約１００ｍＬ～約１００Ｌ、約１００ｍＬ～約５０Ｌ、１００ｍＬ～約２５Ｌ、約１００ｍＬ～約２０Ｌ、約１００ｍＬ～約１５Ｌ、約１００ｍＬ～約１０Ｌ、約１００ｍＬ～約８Ｌ、約１００ｍＬ～約６Ｌ、約１００ｍＬ～約５Ｌ、約１００ｍＬ～約４Ｌ、約１００ｍＬ～約３Ｌ、約１００ｍＬ～約２．５Ｌ、約１００ｍＬ～約２．０Ｌ、約１００ｍＬ～約１．８Ｌ、約１００ｍＬ～約１．６Ｌ、約１００ｍＬ～約１．４Ｌ、約１００ｍＬ～約１．２Ｌ、約１００ｍＬ～約１．０Ｌ、約１００ｍＬ～約９００ｍＬ、約１００ｍＬ～約８００ｍＬ、約１００ｍＬ～約７００ｍＬ、約１００ｍＬ～約６００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５００ｍＬ、約１００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約４００ｍＬ、約１００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約３００ｍＬ、約１００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約２００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約５００Ｌ、約１５０ｍＬ～約４００Ｌ、約１５０ｍＬ～約３００Ｌ、約１５０ｍＬ～約２００Ｌ、約１５０ｍＬ～約１００Ｌ、約１５０ｍＬ～約５０Ｌ、１５０ｍＬ～約２５Ｌ、約１５０ｍＬ～約２０Ｌ、約１５０ｍＬ～約１５Ｌ、約１５０ｍＬ～約１０Ｌ、約１５０ｍＬ～約８Ｌ、約１５０ｍＬ～約６Ｌ、約１５０ｍＬ～約５Ｌ、約１５０ｍＬ～約４Ｌ、約１５０ｍＬ～約３Ｌ、約１５０ｍＬ～約２．５Ｌ、約１５０ｍＬ～約２．０Ｌ、約１５０ｍＬ～約１．８Ｌ、約１５０ｍＬ～約１．６Ｌ、約１５０ｍＬ～約１．４Ｌ、約１５０ｍＬ～約１．２Ｌ、約１５０ｍＬ～約１．０Ｌ、約１５０ｍＬ～約９００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約７００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５００Ｌ、約２００ｍＬ～約４００Ｌ、約２００ｍＬ～約３００Ｌ、約２００ｍＬ～約２００Ｌ、約２００ｍＬ～約１００Ｌ、約２００ｍＬ～約５０Ｌ、２００ｍＬ～約２５Ｌ、約２００ｍＬ～約２０Ｌ、約２００ｍＬ～約１５Ｌ、約２００ｍＬ～約１０Ｌ、約２００ｍＬ～約８Ｌ、約２００ｍＬ～約６Ｌ、約２００ｍＬ～約５Ｌ、約２００ｍＬ～約４Ｌ、約２００ｍＬ～約３Ｌ、約２００ｍＬ～約２．５Ｌ、約２００ｍＬ～約２．０Ｌ、約２００ｍＬ～約１．８Ｌ、約２００ｍＬ～約１．６Ｌ、約２００ｍＬ～約１．４Ｌ、約２００ｍＬ～約１．２Ｌ、約２００ｍＬ～約１．０Ｌ、約２００ｍＬ～約９００ｍＬ、約２００ｍＬ～約８００ｍＬ、約２００ｍＬ～約７００ｍＬ、約２００ｍＬ～約６００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５００ｍＬ、約２００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約４００ｍＬ、約２００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約３００ｍＬ、約２００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約５００Ｌ、約２５０ｍＬ～約４００Ｌ、約２５０ｍＬ～約３００Ｌ、約２５０ｍＬ～約２００Ｌ、約２５０ｍＬ～約１００Ｌ、約２５０ｍＬ～約５０Ｌ、２５０ｍＬ～約２５Ｌ、約２５０ｍＬ～約２０Ｌ、約２５０ｍＬ～約１５Ｌ、約２５０ｍＬ～約１０Ｌ、約２５０ｍＬ～約８Ｌ、約２５０ｍＬ～約６Ｌ、約２５０ｍＬ～約５Ｌ、約２５０ｍＬ～約４Ｌ、約２５０ｍＬ～約３Ｌ、約２５０ｍＬ～約２．５Ｌ、約２５０ｍＬ～約２．０Ｌ、約２５０ｍＬ～約１．８Ｌ、約２５０ｍＬ～約１．６Ｌ、約２５０ｍＬ～約１．４Ｌ、約２５０ｍＬ～約１．２Ｌ、約２５０ｍＬ～約１．０Ｌ、約２５０ｍＬ～約９００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約７００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約３００ｍＬ～約５００Ｌ、約３００ｍＬ～約４００Ｌ、約３００ｍＬ～約３００Ｌ、約３００ｍＬ～約２００Ｌ、約３００ｍＬ～約１００Ｌ、約３００ｍＬ～約５０Ｌ、３００ｍＬ～約２５Ｌ、約３００ｍＬ～約２０Ｌ、約３００ｍＬ～約１５Ｌ、約３００ｍＬ～約１０Ｌ、約３００ｍＬ～約８Ｌ、約３００ｍＬ～約６Ｌ、約３００ｍＬ～約５Ｌ、約３００ｍＬ～約４Ｌ、約３００ｍＬ～約３Ｌ、約３００ｍＬ～約２．５Ｌ、約３００ｍＬ～約２．０Ｌ、約３００ｍＬ～約１．８Ｌ、約３００ｍＬ～約１．６Ｌ、約３００ｍＬ～約１．４Ｌ、約３００ｍＬ～約１．２Ｌ、約３００ｍＬ～約１．０Ｌ、約３００ｍＬ～約９００ｍＬ、約３００ｍＬ～約８００ｍＬ、約３００ｍＬ～約７００ｍＬ、約３００ｍＬ～約６００ｍＬ、約３００ｍＬ～約５００ｍＬ、約３００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３００ｍＬ～約４００ｍＬ、約３００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約５００Ｌ、約３５０ｍＬ～約４００Ｌ、約３５０ｍＬ～約３００Ｌ、約３５０ｍＬ～約２００Ｌ、約３５０ｍＬ～約１００Ｌ、約３５０ｍＬ～約５０Ｌ、３５０ｍＬ～約２５Ｌ、約３５０ｍＬ～約２０Ｌ、約３５０ｍＬ～約１５Ｌ、約３５０ｍＬ～約１０Ｌ、約３５０ｍＬ～約８Ｌ、約３５０ｍＬ～約６Ｌ、約３５０ｍＬ～約５Ｌ、約３５０ｍＬ～約４Ｌ、約３５０ｍＬ～約３Ｌ、約３５０ｍＬ～約２．５Ｌ、約３５０ｍＬ～約２．０Ｌ、約３５０ｍＬ～約１．８Ｌ、約３５０ｍＬ～約１．６Ｌ、約３５０ｍＬ～約１．４Ｌ、約３５０ｍＬ～約１．２Ｌ、約３５０ｍＬ～約１．０Ｌ、約３５０ｍＬ～約９００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約７００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４００ｍＬ～約５００Ｌ、約４００ｍＬ～約４００Ｌ、約４００ｍＬ～約３００Ｌ、約４００ｍＬ～約２００Ｌ、約４００ｍＬ～約１００Ｌ、約４００ｍＬ～約５０Ｌ、４００ｍＬ～約２５Ｌ、約４００ｍＬ～約２０Ｌ、約４００ｍＬ～約１５Ｌ、約４００ｍＬ～約１０Ｌ、約４００ｍＬ～約８Ｌ、約４００ｍＬ～約６Ｌ、約４００ｍＬ～約５Ｌ、約４００ｍＬ～約４Ｌ、約４００ｍＬ～約３Ｌ、約４００ｍＬ～約２．５Ｌ、約４００ｍＬ～約２．０Ｌ、約４００ｍＬ～約１．８Ｌ、約４００ｍＬ～約１．６Ｌ、約４００ｍＬ～約１．４Ｌ、約４００ｍＬ～約１．２Ｌ、約４００ｍＬ～約１．０Ｌ、約４００ｍＬ～約９００ｍＬ、約４００ｍＬ～約８００ｍＬ、約４００ｍＬ～約７００ｍＬ、約４００ｍＬ～約６００ｍＬ、約４００ｍＬ～約５００ｍＬ、約４００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約４５０ｍＬ～約５００Ｌ、約４５０ｍＬ～約４００Ｌ、約４５０ｍＬ～約３００Ｌ、約４５０ｍＬ～約２００Ｌ、約４５０ｍＬ～約１００Ｌ、約４５０ｍＬ～約５０Ｌ、４５０ｍＬ～約２５Ｌ、約４５０ｍＬ～約２０Ｌ、約４５０ｍＬ～約１５Ｌ、約４５０ｍＬ～約１０Ｌ、約４５０ｍＬ～約８Ｌ、約４５０ｍＬ～約６Ｌ、約４５０ｍＬ～約５Ｌ、約４５０ｍＬ～約４Ｌ、約４５０ｍＬ～約３Ｌ、約４５０ｍＬ～約２．５Ｌ、約４５０ｍＬ～約２．０Ｌ、約４５０ｍＬ～約１．８Ｌ、約４５０ｍＬ～約１．６Ｌ、約４５０ｍＬ～約１．４Ｌ、約４５０ｍＬ～約１．２Ｌ、約４５０ｍＬ～約１．０Ｌ、約４５０ｍＬ～約９００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約７００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約５００ｍＬ～約５００Ｌ、約５００ｍＬ～約４００Ｌ、約５００ｍＬ～約３００Ｌ、約５００ｍＬ～約２００Ｌ、約５００ｍＬ～約１００Ｌ、約５００ｍＬ～約５０Ｌ，５００ｍＬ～約２５Ｌ、約５００ｍＬ～約２０Ｌ、約５００ｍＬ～約１５Ｌ、約５００ｍＬ～約１０Ｌ、約５００ｍＬ～約８Ｌ、約５００ｍＬ～約６Ｌ、約５００ｍＬ～約５Ｌ、約５００ｍＬ～約４Ｌ、約５００ｍＬ～約３Ｌ、約５００ｍＬ～約２．５Ｌ、約５００ｍＬ～約２．０Ｌ、約５００ｍＬ～約１．８Ｌ、約５００ｍＬ～約１．６Ｌ、約５００ｍＬ～約１．４Ｌ、約５００ｍＬ～約１．２Ｌ、約５００ｍＬ～約１．０Ｌ、約５００ｍＬ～約９００ｍＬ、約５００ｍＬ～約８００ｍＬ、約５００ｍＬ～約７００ｍＬ、約５００ｍＬ～約６００ｍＬ、約６００ｍＬ～約５００Ｌ、約６００ｍＬ～約４００Ｌ、約６００ｍＬ～約３００Ｌ、約６００ｍＬ～約２００Ｌ、約６００ｍＬ～約１００Ｌ、約６００ｍＬ～約５０Ｌ、６００ｍＬ～約２５Ｌ、約６００ｍＬ～約２０Ｌ、約６００ｍＬ～約１５Ｌ、約６００ｍＬ～約１０Ｌ、約６００ｍＬ～約８Ｌ、約６００ｍＬ～約６Ｌ、約６００ｍＬ～約５Ｌ、約６００ｍＬ～約４Ｌ、約６００ｍＬ～約３Ｌ、約６００ｍＬ～約２．５Ｌ、約６００ｍＬ～約２．０Ｌ、約６００ｍＬ～約１．８Ｌ、約６００ｍＬ～約１．６Ｌ、約６００ｍＬ～約１．４Ｌ、約６００ｍＬ～約１．２Ｌ、約６００ｍＬ～約１．０Ｌ、約６００ｍＬ～約９００ｍＬ、約６００ｍＬ～約８００ｍＬ、約６００ｍＬ～約７００ｍＬ、約７００ｍＬ～約５００Ｌ、約７００ｍＬ～約４００Ｌ、約７００ｍＬ～約３００Ｌ、約７００ｍＬ～約２００Ｌ、約７００ｍＬ～約１００Ｌ、約７００ｍＬ～約５０Ｌ、７００ｍＬ～約２５Ｌ、約７００ｍＬ～約２０Ｌ、約７００ｍＬ～約１５Ｌ、約７００ｍＬ～約１０Ｌ、約７００ｍＬ～約８Ｌ、約７００ｍＬ～約６Ｌ、約７００ｍＬ～約５Ｌ、約７００ｍＬ～約４Ｌ、約７００ｍＬ～約３Ｌ、約７００ｍＬ～約２．５Ｌ、約７００ｍＬ～約２．０Ｌ、約７００ｍＬ～約１．８Ｌ、約７００ｍＬ～約１．６Ｌ、約７００ｍＬ～約１．４Ｌ、約７００ｍＬ～約１．２Ｌ、約７００ｍＬ～約１．０Ｌ、約７００ｍＬ～約９００ｍＬ、約７００ｍＬ～約８００ｍＬ、約８００ｍＬ～約５００Ｌ、約８００ｍＬ～約４００Ｌ、約８００ｍＬ～約３００Ｌ、約８００ｍＬ～約２００Ｌ、約８００ｍＬ～約１００Ｌ、約８００ｍＬ～約５０Ｌ、８００ｍＬ～約２５Ｌ、約８００ｍＬ～約２０Ｌ、約８００ｍＬ～約１５Ｌ、約８００ｍＬ～約１０Ｌ、約８００ｍＬ～約８Ｌ、約８００ｍＬ～約６Ｌ、約８００ｍＬ～約５Ｌ、約８００ｍＬ～約４Ｌ、約８００ｍＬ～

約３Ｌ、約８００ｍＬ～約２．５Ｌ、約８００ｍＬ～約２．０Ｌ、約８００ｍＬ～約１．８Ｌ、約８００ｍＬ～約１．６Ｌ、約８００ｍＬ～約１．４Ｌ、約８００ｍＬ～約１．２Ｌ、約８００ｍＬ～約１．０Ｌ、約８００ｍＬ～約９００ｍＬ、約９００ｍＬ～約５００Ｌ、約９００ｍＬ～約４００Ｌ、約９００ｍＬ～約３００Ｌ、約９００ｍＬ～約２００Ｌ、約９００ｍＬ～約１００Ｌ、約９００ｍＬ～約５０Ｌ、９００ｍＬ～約２５Ｌ、約９００ｍＬ～約２０Ｌ、約９００ｍＬ～約１５Ｌ、約９００ｍＬ～約１０Ｌ、約９００ｍＬ～約８Ｌ、約９００ｍＬ～約６Ｌ、約９００ｍＬ～約５Ｌ、約９００ｍＬ～約４Ｌ、約９００ｍＬ～約３Ｌ、約９００ｍＬ～約２．５Ｌ、約９００ｍＬ～約２．０Ｌ、約９００ｍＬ～約１．８Ｌ、約９００ｍＬ～約１．６Ｌ、約９００ｍＬ～約１．４Ｌ、約９００ｍＬ～約１．２Ｌ、約９００ｍＬ～約１．０Ｌ、約１．０Ｌ～約５００Ｌ、約１．０Ｌ～約４００Ｌ、約１．０Ｌ～約３００Ｌ、約１．０Ｌ～約２００Ｌ、約１．０Ｌ～約１００Ｌ、約１．０Ｌ～約５０Ｌ、１．０Ｌ～約２５Ｌ、約１．０Ｌ～約２０Ｌ、約１．０Ｌ～約１５Ｌ、約１．０Ｌ～約１０Ｌ、約１．０Ｌ～約８Ｌ、約１．０Ｌ～約６Ｌ、約１．０Ｌ～約５Ｌ、約１．０Ｌ～約４Ｌ、約１．０Ｌ～約３Ｌ、約１．０Ｌ～約２．５Ｌ、約１．０Ｌ～約２．０Ｌ、約１．０Ｌ～約１．８Ｌ、約１．０Ｌ～約１．６Ｌ、約１．０Ｌ～約１．４Ｌ、約１．０Ｌ～約１．２Ｌ、約１．２Ｌ～約５００Ｌ、約１．２Ｌ～約４００Ｌ、約１．２Ｌ～約３００Ｌ、約１．２Ｌ～約２００Ｌ、約１．２Ｌ～約１００Ｌ、約１．２Ｌ～約５０Ｌ、１．２Ｌ～約２５Ｌ、約１．２Ｌ～約２０Ｌ、約１．２Ｌ～約１５Ｌ、約１．２Ｌ～約１０Ｌ、約１．２Ｌ～約８Ｌ、約１．２Ｌ～約６Ｌ、約１．２Ｌ～約５Ｌ、約１．２Ｌ～約４Ｌ、約１．２Ｌ～約３Ｌ、約１．２Ｌ～約２．５Ｌ、約１．２Ｌ～約２．０Ｌ、約１．２Ｌ～約１．８Ｌ、約１．２Ｌ～約１．６Ｌ、約１．２Ｌ～約１．４Ｌ、約１．４Ｌ～約５００Ｌ、約１．４Ｌ～約４００Ｌ、約１．４Ｌ～約３００Ｌ、約１．４Ｌ～約２００Ｌ、約１．４Ｌ～約１００Ｌ、約１．４Ｌ～約５０Ｌ、１．４Ｌ～約２５Ｌ、約１．４Ｌ～約２０Ｌ、約１．４Ｌ～約１５Ｌ、約１．４Ｌ～約１０Ｌ、約１．４Ｌ～約８Ｌ、約１．４Ｌ～約６Ｌ、約１．４Ｌ～約５Ｌ、約１．４Ｌ～約４Ｌ、約１．４Ｌ～約３Ｌ、約１．４Ｌ～約２．５Ｌ、約１．４Ｌ～約２．０Ｌ、約１．４Ｌ～約１．８Ｌ、約１．４Ｌ～約１．６Ｌ、約１．６Ｌ～約５００Ｌ、約１．６Ｌ～約４００Ｌ、約１．６Ｌ～約３００Ｌ、約１．６Ｌ～約２００Ｌ、約１．６Ｌ～約１００Ｌ、約１．６Ｌ～約５０Ｌ、１．６Ｌ～約２５Ｌ、約１．６Ｌ～約２０Ｌ、約１．６Ｌ～約１５Ｌ、約１．６Ｌ～約１０Ｌ、約１．６Ｌ～約８Ｌ、約１．６Ｌ～約６Ｌ、約１．６Ｌ～約５Ｌ、約１．６Ｌ～約４Ｌ、約１．６Ｌ～約３Ｌ、約１．６Ｌ～約２．５Ｌ、約１．６Ｌ～約２．０Ｌ、約１．６Ｌ～約１．８Ｌ、約１．８Ｌ～約５００Ｌ、約１．８Ｌ～約４００Ｌ、約１．８Ｌ～約３００Ｌ、約１．８Ｌ～約２００Ｌ、約１．８Ｌ～約１００Ｌ、約１．８Ｌ～約５０Ｌ、１．８Ｌ～約２５Ｌ、約１．８Ｌ～約２０Ｌ、約１．８Ｌ～約１５Ｌ、約１．８Ｌ～約１０Ｌ、約１．８Ｌ～約８Ｌ、約１．８Ｌ～約６Ｌ、約１．８Ｌ～約５Ｌ、約１．８Ｌ～約４Ｌ、約１．８Ｌ～約３Ｌ、約１．８Ｌ～約２．５Ｌ、約１．８Ｌ～約２．０Ｌ、約２．０Ｌ～約５００Ｌ、約２．０Ｌ～約４００Ｌ、約２．０Ｌ～約３００Ｌ、約２．０Ｌ～約２００Ｌ、約２．０Ｌ～約１００Ｌ、約２．０Ｌ～約５０Ｌ、２．０Ｌ～約２５Ｌ、約２．０Ｌ～約２０Ｌ、約２．０Ｌ～約１５Ｌ、約２．０Ｌ～約１０Ｌ、約２．０Ｌ～約８Ｌ、約２．０Ｌ～約６Ｌ、約２．０Ｌ～約５Ｌ、約２．０Ｌ～約４Ｌ、約２．０Ｌ～約３Ｌ、約２．０Ｌ～約２．５Ｌ、約２．５Ｌ～約５００Ｌ、約２．５Ｌ～約４００Ｌ、約２．５Ｌ～約３００Ｌ、約２．５Ｌ～約２００Ｌ、約２．５Ｌ～約１００Ｌ、約２．５Ｌ～約５０Ｌ、２．５Ｌ～約２５Ｌ、約２．５Ｌ～約２０Ｌ、約２．５Ｌ～約１５Ｌ、約２．５Ｌ～約１０Ｌ、約２．５Ｌ～約８Ｌ、約２．５Ｌ～約６Ｌ、約２．５Ｌ～約５Ｌ、約２．５Ｌ～約４Ｌ、約２．５Ｌ～約３Ｌ、約３Ｌ～約５００Ｌ、約３Ｌ～約４００Ｌ、約３Ｌ～約３００Ｌ、約３Ｌ～約２００Ｌ、約３Ｌ～約１００Ｌ、約３Ｌ～約５０Ｌ、３Ｌ～約２５Ｌ、約３Ｌ～約２０Ｌ、約３Ｌ～約１５Ｌ、約３Ｌ～約１０Ｌ、約３Ｌ～約８Ｌ、約３Ｌ～約６Ｌ、約３Ｌ～約５Ｌ、約３Ｌ～約４Ｌ、約４Ｌ～約５００Ｌ、約４Ｌ～約４００Ｌ、約４Ｌ～約３００Ｌ、約４Ｌ～約２００Ｌ、約４Ｌ～約１００Ｌ、約４Ｌ～約５０Ｌ、４Ｌ～約２５Ｌ、約４Ｌ～約２０Ｌ、約４Ｌ～約１５Ｌ、約４Ｌ～約１０Ｌ、約４Ｌ～約８Ｌ、約４Ｌ～約６Ｌ、約４Ｌ～約５Ｌ、約５Ｌ～約５００Ｌ、約５Ｌ～約４００Ｌ、約５Ｌ～約３００Ｌ、約５Ｌ～約２００Ｌ、約５Ｌ～約１００Ｌ、約５Ｌ～約５０Ｌ、５Ｌ～約２５Ｌ、約５Ｌ～約２０Ｌ、約５Ｌ～約１５Ｌ、約５Ｌ～約１０Ｌ、約５Ｌ～約８Ｌ、約５Ｌ～約６Ｌ、約６Ｌ～約５００Ｌ、約６Ｌ～約４００Ｌ、約６Ｌ～約３００Ｌ、約６Ｌ～約２００Ｌ、約６Ｌ～約１００Ｌ、約６Ｌ～約５０Ｌ、６Ｌ～約２５Ｌ、約６Ｌ～約２０Ｌ、約６Ｌ～約１５Ｌ、約６Ｌ～約１０Ｌ、約６Ｌ～約８Ｌ、約８Ｌ～約５００Ｌ、約８Ｌ～約４００Ｌ、約８Ｌ～約３００Ｌ、約８Ｌ～約２００Ｌ、約８Ｌ～約１００Ｌ、約８Ｌ～約５０Ｌ、８Ｌ～約２５Ｌ、約８Ｌ～約２０Ｌ、約８Ｌ～約１５Ｌ、約８Ｌ～約１０Ｌ、約１０Ｌ～約５００Ｌ、約１０Ｌ～約４００Ｌ、約１０Ｌ～約３００Ｌ、約１０Ｌ～約２００Ｌ、約１０Ｌ～約１００Ｌ、約１０Ｌ～約５０Ｌ、１０Ｌ～約２５Ｌ、約１０Ｌ～約２０Ｌ、約１０Ｌ～約１５Ｌ、約１５Ｌ～約５００Ｌ、約１５Ｌ～約４００Ｌ、約１５Ｌ～約３００Ｌ、約１５Ｌ～約２００Ｌ、約１５Ｌ～約１００Ｌ、約１５Ｌ～約５０Ｌ、１５Ｌ～約２５Ｌ、約１５Ｌ～約２０Ｌ、約２０Ｌ～約５００Ｌ、約２０Ｌ～約４００Ｌ、約２０Ｌ～約３００Ｌ、約２０Ｌ～約２００Ｌ、約２０Ｌ～約１００Ｌ、約２０Ｌ～約５０Ｌ、２０Ｌ～約２５Ｌ、約２５Ｌ～約５００Ｌ、約２５Ｌ～約４００Ｌ、約２５Ｌ～約３００Ｌ、約２５Ｌ～約２００Ｌ、約２５Ｌ～約１００Ｌ、約２５Ｌ～約５０Ｌ、約５０Ｌ～約５００Ｌ、約５０Ｌ～約４００Ｌ、約５０Ｌ～約３００Ｌ、約５０Ｌ～約２００Ｌ、約５０Ｌ～約１００Ｌ、約１００Ｌ～約５００Ｌ、約１００Ｌ～約４００Ｌ、約１００Ｌ～約３００Ｌ、約１００Ｌ～約２００Ｌ、約２００Ｌ～約５００Ｌ、約２００Ｌ～約４００Ｌ、約２００Ｌ～約３００Ｌ、約３００Ｌ～約５００Ｌ、約３００Ｌ～約４００Ｌ、または約４００Ｌ～約５００Ｌの体積を有することができる。
いくつかの実施形態では、培養バッグは、約５揺動サイクル／分～約４０揺動サイクル／分、約５揺動サイクル／分～約３５揺動サイクル／分、約５揺動サイクル／分～約３０揺動サイクル／分、約５揺動サイクル／分～約２５揺動サイクル／分、約５揺動サイクル／分～約２０揺動サイクル／分、約５揺動サイクル／分～約１５揺動サイクル／分、約５揺動サイクル／分～約１０揺動サイクル／分、約１０揺動サイクル／分～約４０揺動サイクル／分、約１０揺動サイクル／分～約３５揺動サイクル／分、約１０揺動サイクル／分～約３０揺動サイクル／分、約１０揺動サイクル／分～約２５揺動サイクル／分、約１０揺動サイクル／分～約２０揺動サイクル／分、約１０揺動サイクル／分～約１５揺動サイクル／分、約１５揺動サイクル／分～約４０揺動サイクル／分、約１５揺動サイクル／分～約３５揺動サイクル／分、約１５揺動サイクル／分～約３０揺動サイクル／分、約１５揺動サイクル／分～約２５揺動サイクル／分、約１５揺動サイクル／分～約２０揺動サイクル／分、約２０揺動サイクル／分～約４０揺動サイクル／分、約２０揺動サイクル／分～約３５揺動サイクル／分、約２０揺動サイクル／分～約３０揺動サイクル／分、約２０揺動サイクル／分～約２５揺動サイクル／分、約２５揺動サイクル／分～約４０揺動サイクル／分、約２５揺動サイクル／分～約３５揺動サイクル／分、約２５揺動サイクル／分～約３０揺動サイクル／分、約３０揺動サイクル／分～約４０揺動サイクル／分、約３０揺動サイクル／分～約３５揺動サイクル／分、または約３５揺動サイクル／分～約４０揺動サイクル／分の揺動速度でインキュベートすることができる。
様々な培養バッグが市販されている。培養バッグの追加の非限定的な態様は、当該技術分野で既知である。
バイオリアクター
本明細書に記載の方法のいくつかの態様は、バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）の使用を含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）は、約５００ｍＬ～約１５，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約１２，５００Ｌ、約５００ｍＬ～約１０，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約８，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約６，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約８００Ｌ、約５００ｍＬ～約６００Ｌ、約５００ｍＬ～約４００Ｌ、約５００ｍＬ～約２００Ｌ、約５００ｍＬ～約１００Ｌ、約５００ｍＬ～約５０Ｌ、約５００ｍＬ～約２０Ｌ、約５００ｍＬ～約１０Ｌ、約５００ｍＬ～約５Ｌ、約５００ｍＬ～約１Ｌ、約５００ｍＬ～約７５０ｍＬ、約７５０ｍＬ～約１５，０００Ｌ、約７５０ｍＬ～約１２，５００Ｌ、約７５０ｍＬ～約１０，０００Ｌ、約７５０ｍＬ～約８，０００Ｌ、約７５０ｍＬ～約６，０００Ｌ、約７５０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約７５０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約７５０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約７５０ｍＬ～約８００Ｌ、約７５０ｍＬ～約６００Ｌ、約７５０ｍＬ～約４００Ｌ、約７５０ｍＬ～約２００Ｌ、約７５０ｍＬ～約１００Ｌ、約７５０ｍＬ～約５０Ｌ、約７５０ｍＬ～約２０Ｌ、約７５０ｍＬ～約１０Ｌ、約７５０ｍＬ～約５Ｌ、約７５０ｍＬ～約１Ｌ、約１Ｌ～約１５，０００Ｌ、約１Ｌ～約１２，５００Ｌ、約１Ｌ～約１０，０００Ｌ、約１Ｌ～約８，０００Ｌ、約１Ｌ～約６，０００Ｌ、約１Ｌ～約４，０００Ｌ、約１Ｌ～約２，０００Ｌ、約１Ｌ～約１，０００Ｌ、約１Ｌ～約８００Ｌ、約１Ｌ～約６００Ｌ、約１Ｌ～約４００Ｌ、約１Ｌ～約２００Ｌ、約１Ｌ～約１００Ｌ、約１Ｌ～約５０Ｌ、約１Ｌ～約２０Ｌ、約１Ｌ～約１０Ｌ、約１Ｌ～約５Ｌ、約５Ｌ～約１５，０００Ｌ、約５Ｌ～約１２，５００Ｌ、約５Ｌ～約１０，０００Ｌ、約５Ｌ～約８，０００Ｌ、約５Ｌ～約６，０００Ｌ、約５Ｌ～約４，０００Ｌ、約５Ｌ～約２，０００Ｌ、約５Ｌ～約１，０００Ｌ、約５Ｌ～約８００Ｌ、約５Ｌ～約６００Ｌ、約５Ｌ～約４００Ｌ、約５Ｌ～約２００Ｌ、約５Ｌ～約１００Ｌ、約５Ｌ～約５０Ｌ、約５Ｌ～約２０Ｌ、約５Ｌ～約１０Ｌ、約１０Ｌ～約１５，０００Ｌ、約１０Ｌ～約１２，５００Ｌ、約１０Ｌ～約１０，０００Ｌ、約１０Ｌ～約８，０００Ｌ、約１０Ｌ～約６，０００Ｌ、約１０Ｌ～約４，０００Ｌ、約１０Ｌ～約２，０００Ｌ、約１０Ｌ～約１，０００Ｌ、約１０Ｌ～約８００Ｌ、約１０Ｌ～約６００Ｌ、約１０Ｌ～約４００Ｌ、約１０Ｌ～約２００Ｌ、約１０Ｌ～約１００Ｌ、約１０Ｌ～約５０Ｌ、約１０Ｌ～約２０Ｌ、約２０Ｌ～約１５，０００Ｌ、約２０Ｌ～約１２，５００Ｌ、約２０Ｌ～約１０，０００Ｌ、約２０Ｌ～約８，０００Ｌ、約２０Ｌ～約６，０００Ｌ、約２０Ｌ～約４，０００Ｌ、約２０Ｌ～約２，０００Ｌ、約２０Ｌ～約１，０００Ｌ、約２０Ｌ～約８００Ｌ、約２０Ｌ～約６００Ｌ、約２０Ｌ～約４００Ｌ、約２０Ｌ～約２００Ｌ、約２０Ｌ～約１００Ｌ、約２０Ｌ～約５０Ｌ、約５０Ｌ～約１５，０００Ｌ、約５０Ｌ～約１２，５００Ｌ、約５０Ｌ～約１０，０００Ｌ、約５０Ｌ～約８，０００Ｌ、約５０Ｌ～約６，０００Ｌ、約５０Ｌ～約４，０００Ｌ、約５０Ｌ～約２，０００Ｌ、約５０Ｌ～約１，０００Ｌ、約５０Ｌ～約８００Ｌ、約５０Ｌ～約６００Ｌ、約５０Ｌ～約４００Ｌ、約５０Ｌ～約２００Ｌ、約５０Ｌ～約１００Ｌ、約１００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約１００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約１００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約１００Ｌ～約８，０００Ｌ、約１００Ｌ～約６，０００Ｌ、約１００Ｌ～約４，０００Ｌ、約１００Ｌ～約２，０００Ｌ、約１００Ｌ～約１，０００Ｌ、約１００Ｌ～約８００Ｌ、約１００Ｌ～約６００Ｌ、約１００Ｌ～約４００Ｌ、約１００Ｌ～約２００Ｌ、約２００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約２００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約２００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約２００Ｌ～約８，０００Ｌ、約２００Ｌ～約６，０００Ｌ、約２００Ｌ～約４，０００Ｌ、約２００Ｌ～約２，０００Ｌ、約２００Ｌ～約１，０００Ｌ、約２００Ｌ～約８００Ｌ、約２００Ｌ～約６００Ｌ、約２００Ｌ～約４００Ｌ、約４００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約４００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約４００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約４００Ｌ～約８，０００Ｌ、約４００Ｌ～約６，０００Ｌ、約４００Ｌ～約４，０００Ｌ、約４００Ｌ～約２，０００Ｌ、約４００Ｌ～約１，０００Ｌ、約４００Ｌ～約８００Ｌ、約４００Ｌ～約６００Ｌ、約６００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約６００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約６００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約６００Ｌ～約８，０００Ｌ、約６００Ｌ～約６，０００Ｌ、約６００Ｌ～約４，０００Ｌ、約６００Ｌ～約２，０００Ｌ、約６００Ｌ～約１，０００Ｌ、約６００Ｌ～約８００Ｌ、約８００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約８００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約８００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約８００Ｌ～約８，０００Ｌ、約８００Ｌ～約６，０００Ｌ、約８００Ｌ～約４，０００Ｌ、約８００Ｌ～約２，０００Ｌ、約８００Ｌ～約１，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約１，０００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約８，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約６，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約４，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約２，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約２，０００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約８，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約６，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約４，０００Ｌ、約４，０００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約４，０００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約４，０００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約４，０００Ｌ～約８，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約６，０００Ｌ、約６，０００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約６，０００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約６，０００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約６，０００Ｌ～約８，０００Ｌ、約８，０００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約８，０００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約８，０００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約１０，０００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約１０，０００Ｌ～約１２，５００Ｌ、または約１２，５００Ｌ～約１５，０００Ｌの体積を有することができる。
様々なバイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）が市販されている。バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）の追加の非限定的な態様は、当該技術分野で既知である。
第２の細胞培養物の提供（ステップＡ）
本明細書に記載の方法のうちのいずれかでは、ステップ（ａ）は、赤芽球前駆細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な赤芽球前駆細胞のうちのいずれか）の第１の細胞培養物のある体積を、容器（例えば、バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）、振盪フラスコ、振盪管、または培養バッグ）内に含まれる第２の培養培地（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な第２の培養培地のうちのいずれか）中に配置して、第２の細胞培養物（例えば、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０４細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０４細胞／ｍＬ、０．５×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０４細胞／ｍＬ、１×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、または約０．５×１０７細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬの初期細胞密度を有する）を提供することを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、約０．１ｍＬ～約５，０００Ｌ、約０．１ｍＬ～約４，５００Ｌ、約０．１ｍＬ～約４，０００Ｌ、約０．１ｍＬ～約３，５００Ｌ、約０．１ｍＬ～約３，０００Ｌ、約０．１ｍＬ～約２，５００Ｌ、約０．１ｍＬ～約２，０００Ｌ、約０．１ｍＬ～約１，５００Ｌ、約１ｍＬ～約１，０００Ｌ、約０．１ｍＬ～約８００ｍＬ、約０．１ｍＬ～約６００ｍＬ、約０．１ｍＬ～約５００ｍＬ、約０．１ｍＬ～約４５０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約４００ｍＬ、約０．１ｍＬ～約３５０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約３００ｍＬ、約０．１ｍＬ～約２５０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約２００ｍＬ、約０．１ｍＬ～約１５０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約１００ｍＬ、約０．１ｍＬ～約５０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約２０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約１０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約５ｍＬ、約５ｍＬ～約５，０００Ｌ、約５ｍＬ～約４，５００Ｌ、約５ｍＬ～約４，０００Ｌ、約５ｍＬ～約３，５００Ｌ、約５ｍＬ～約３，０００Ｌ、約５ｍＬ～約２，５００Ｌ、約５ｍＬ～約２，０００Ｌ、約５ｍＬ～約１，５００Ｌ、約５ｍＬ～約１，０００Ｌ、約５ｍＬ～約８００ｍＬ、約５ｍＬ～約６００ｍＬ、約５ｍＬ～約５００ｍＬ、約５ｍＬ～約４５０ｍＬ、約５ｍＬ～約４００ｍＬ、約５ｍＬ～約３５０ｍＬ、約５ｍＬ～約３００ｍＬ、約５ｍＬ～約２５０ｍＬ、約５ｍＬ～約２００ｍＬ、約５ｍＬ～約１５０ｍＬ、約５ｍＬ～約１００ｍＬ、約５ｍＬ～約５０ｍＬ、約５ｍＬ～約２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１０ｍＬ、約１０ｍＬ～約５，０００Ｌ、約１０ｍＬ～約４，５００Ｌ、約１０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約１０ｍＬ～約３，５００Ｌ、約１０ｍＬ～約３，０００Ｌ、約１０ｍＬ～約２，５００Ｌ、約１０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約１０ｍＬ～約１，５００Ｌ、約１０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約１０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１０ｍＬ～約５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約５，０００Ｌ、約２０ｍＬ～約４，５００Ｌ、約２０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約２０ｍＬ～約３，５００Ｌ、約２０ｍＬ～約３，０００Ｌ、約２０ｍＬ～約２，５００Ｌ、約２０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約２０ｍＬ～約１，５００Ｌ、約２０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約２０ｍＬ～約８００ｍＬ、約２０ｍＬ～約６００ｍＬ、約２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約３００ｍＬ、約２０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２０ｍＬ～約１５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１００ｍＬ、約２０ｍＬ～約５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約５，０００Ｌ、約５０ｍＬ～約４，５００Ｌ、約５０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約５０ｍＬ～約３，５００Ｌ、約５０ｍＬ～約３，０００Ｌ、約５０ｍＬ～約２，５００Ｌ、約５０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約５０ｍＬ～約１，５００Ｌ、約５０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約５０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約２００ｍＬ、約５０ｍＬ～約１５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５，０００Ｌ、約１００ｍＬ～約４，５００Ｌ、約１００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約１００ｍＬ～約３，５００Ｌ、約１００ｍＬ～約３，０００Ｌ、約１００ｍＬ～約２，５００Ｌ、約１００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約１００ｍＬ～約１，５００Ｌ、約１００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約１００ｍＬ～約８００ｍＬ、約１００ｍＬ～約６００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５００ｍＬ、約１００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約４００ｍＬ、約１００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約３００ｍＬ、約１００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約２００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約５，０００Ｌ、約１５０ｍＬ～約４，５００Ｌ、約１５０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約１５０ｍＬ～約３，５００Ｌ、約１５０ｍＬ～約３，０００Ｌ、約１５０ｍＬ～約２，５００Ｌ、約１５０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約１５０ｍＬ～約１，５００Ｌ、約１５０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約１５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５，０００Ｌ、約２００ｍＬ～約４，５００Ｌ、約２００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約２００ｍＬ～約３，５００Ｌ、約２００ｍＬ～約３，０００Ｌ、約２００ｍＬ～約２，５００Ｌ、約２００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約２００ｍＬ～約１，５００Ｌ、約２００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約２００ｍＬ～約８００ｍＬ、約２００ｍＬ～約６００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５００ｍＬ、約２００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約４００ｍＬ、約２００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約３００ｍＬ、約２００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約５，０００Ｌ、約２５０ｍＬ～約４，５００Ｌ、約２５０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約２５０ｍＬ～約３，５００Ｌ、約２５０ｍＬ～約３，０００Ｌ、約２５０ｍＬ～約２，５００Ｌ、約２５０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約２５０ｍＬ～約１，５００Ｌ、約２５０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約２５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約３００ｍＬ～約５，０００Ｌ、約３００ｍＬ～約４，５００Ｌ、約３００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約３００ｍＬ～約３，５００Ｌ、約３００ｍＬ～約３，０００Ｌ、約３００ｍＬ～約２，５００Ｌ、約３００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約３００ｍＬ～約１，５００Ｌ、約３００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約３００ｍＬ～約８００ｍＬ、約３００ｍＬ～約６００ｍＬ、約３００ｍＬ～約５００ｍＬ、約３００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３００ｍＬ～約４００ｍＬ、約３００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約５，０００Ｌ、約３５０ｍＬ～約４，５００Ｌ、約３５０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約３５０ｍＬ～約３，５００Ｌ、約３５０ｍＬ～約３，０００Ｌ、約３５０ｍＬ～約２，５００Ｌ、約３５０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約３５０ｍＬ～約１，５００Ｌ、約３５０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約３５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４００ｍＬ～約５，０００Ｌ、約４００ｍＬ～約４，５００Ｌ、約４００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約４００ｍＬ～約３，５００Ｌ、約４００ｍＬ～約３，０００Ｌ、約４００ｍＬ～約２，５００Ｌ、約４００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約４００ｍＬ～約１，５００Ｌ、約４００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約４００ｍＬ～約８００ｍＬ、約４００ｍＬ～約６００ｍＬ、約４００ｍＬ～約５００ｍＬ、約４００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約４５０ｍＬ～約５，０００Ｌ、約４５０ｍＬ～約４，５００Ｌ、約４５０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約４５０ｍＬ～約３，５００Ｌ、約４５０ｍＬ～約３，０００Ｌ、約４５０ｍＬ～約２，５００Ｌ、約４５０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約４５０ｍＬ～約１，５００Ｌ、約４５０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約４５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約５００ｍＬ～約５，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約４，５００Ｌ、約５００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約３，５００Ｌ、約５００ｍＬ～約３，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約２，５００Ｌ、約５００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約１，５００Ｌ、約５００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約８００ｍＬ、約５００ｍＬ～約６００ｍＬ、約６００ｍＬ～約５，０００Ｌ、約６００ｍＬ～約４，５００Ｌ、約６００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約６００ｍＬ～約３，５００Ｌ、約６００ｍＬ～約３，０００Ｌ、約６００ｍＬ～約２，５００Ｌ、約６００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約６００ｍＬ～約１，５００Ｌ、約６００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約６００ｍＬ～約８００ｍＬ、約８００ｍＬ～約５，０００Ｌ、約８００ｍＬ～約４，５００Ｌ、約８００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約８００ｍＬ～約３，５００Ｌ、約８００ｍＬ～約３，０００Ｌ、約８００ｍＬ～約２，５００Ｌ、約８００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約８００ｍＬ～約１，５００Ｌ、約８００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約５，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約４，５００Ｌ、約１，０００Ｌ～約４，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約３，５００Ｌ、約１，０００Ｌ～約３，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約２，５００Ｌ、約１，０００Ｌ～約２，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約１，５００Ｌ、約１，５００Ｌ～約５，０００Ｌ、約１，５００Ｌ～約４，５００Ｌ、約１，５００Ｌ～約４，０００Ｌ、約１，５００Ｌ～約３，５００Ｌ、約１，５００Ｌ～約３，０００Ｌ、約１，５００Ｌ～約２，５００Ｌ、約１，５００Ｌ～約２，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約５，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約４，５００Ｌ、約２，０００Ｌ～約４，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約３，５００Ｌ、約２，０００Ｌ～約３，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約２，５００Ｌ、約２，５００Ｌ～約５，０００Ｌ、約２，５００Ｌ～約４，５００Ｌ、約２，５００Ｌ～約４，０００Ｌ、約２，５００Ｌ～約３，５００Ｌ、約２，５００Ｌ～約３，０００Ｌ、約３，０００Ｌ～約５，０００Ｌ、約３，０００Ｌ～約４，５００Ｌ、約３，０００Ｌ～約４，０００Ｌ、約３，０００Ｌ～約３，５００Ｌ、約３，５００Ｌ～約５，０００Ｌ、約３，５００Ｌ～約４，５００Ｌ、約３，５００Ｌ～約４，０００Ｌ、約４，０００Ｌ～約５，０００Ｌ、約４，０００Ｌ～約４，５００Ｌ、約４，５００Ｌ～約５，０００Ｌの体積を配置することを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、約１０μＬ～約０．１ｍＬ、約１０μＬ～約８０μＬ、約１０μＬ～約６０μＬ、約１０μＬ～約４０μＬ、約１０μＬ～約２０μＬ、約２０μＬ～約０．１ｍＬ、約２０μＬ～約８０μＬ、約２０μＬ～約６０μＬ、約２０μＬ～約４０μＬ、約４０μＬ～約０．１ｍＬ、約４０μＬ～約８０μＬ、約４０μＬ～約６０μＬ、約６０μＬ～約０．１ｍＬ、約６０μＬ～約８０μＬ、または約６０μＬ～約０．１ｍＬの体積を配置することを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の容器は、バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的なバイオリアクターのうちのいずれか）である。ステップ（ａ）で使用することができるバイオリアクターの追加の例および態様は、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の容器は、振盪フラスコ（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振盪フラスコのうちのいずれか）である。ステップ（ａ）で使用することができる振盪フラスコの追加の例および態様は、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の容器は、振盪管（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な振盪管のうちのいずれか）である。ステップ（ａ）で使用することができる振盪管の追加の例および態様は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の容器は、培養バッグ（例えば、本明細書に記載の例示的な培養バッグのうちのいずれか）である。
いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ）（例えば、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのトランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ））、ＩＬ－３（例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＩＬ－３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＳＣＦ）、デキサメタゾン（例えば、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのデキサメタゾン）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＥＰＯまたはＥＰＯ模倣ペプチド）、およびインスリン（例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのインスリン）のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、または６つ）を含む。本明細書に記載の第２の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含む。本明細書に記載の第２の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。本明細書に記載の第２の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。本明細書に記載の第２の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、０．１％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ（例えば、約０．１％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約０．５％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約０．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約２．５％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ、約２．５％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、約２．５％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖ、約３．０％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ、約３．０％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、または約３．５％ｗ／ｖ～約４．０％ｗ／ｖ）のヒト血清アルブミンを含む。本明細書に記載の第２の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ（例えば、約０．１％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約０．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、または約２．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ）のＰｏｌｏｘａｍｅｒ－１８８（Ｐ１８８）を含む。
いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約

２４０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約３６０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３６０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約３６０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約３６０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約３６０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約３６０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約３６０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約３８０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３８０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約３８０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約３８０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約３８０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約３８０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約４２０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約４２０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約４２０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約４２０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約４４０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約４４０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約４４０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約４６０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約４６０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、または約４８０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリン（例えば、ヒトアポトランスフェリン、ヒトホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ）を含む。
いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、または約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３（例えば、ヒトＩＬ－３）を含む。
いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約

６００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約９５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦ（例えば、ヒト幹細胞因子）を含む。
いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１８０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１６０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１４０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１２０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭ、約０．１ｎＭ～約８０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約６０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約４０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約３０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約２０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約２ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１ｎＭ、約１ｎＭ～約２００ｎＭ、約１ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１ｎＭ～約１４０ｎＭ、約１ｎＭ～約１２０ｎＭ、約１ｎＭ～約１００ｎＭ、約１ｎＭ～約８０ｎＭ、約１ｎＭ～約６０ｎＭ、約１ｎＭ～約５０ｎＭ、約１ｎＭ～約４０ｎＭ、約１ｎＭ～約３０ｎＭ、約１ｎＭ～約２５ｎＭ、約１ｎＭ～約２０ｎＭ、約１ｎＭ～約１５ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約１ｎＭ～約５ｎＭ、約１ｎＭ～約２ｎＭ、約２ｎＭ～約２００ｎＭ、約２ｎＭ～約１８０ｎＭ、約２ｎＭ～約１６０ｎＭ、約２ｎＭ～約１４０ｎＭ、約２ｎＭ～約１２０ｎＭ、約２ｎＭ～約１００ｎＭ、約２ｎＭ～約８０ｎＭ、約２ｎＭ～約６０ｎＭ、約２ｎＭ～約５０ｎＭ、約２ｎＭ～約４０ｎＭ、約２ｎＭ～約３０ｎＭ、約２ｎＭ～約２５ｎＭ、約２ｎＭ～約２０ｎＭ、約２ｎＭ～約１５ｎＭ、約２ｎＭ～約１０ｎＭ、約２ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約２００ｎＭ、約５ｎＭ～約１８０ｎＭ、約５ｎＭ～約１６０ｎＭ、約５ｎＭ～約１４０ｎＭ、約５ｎＭ～約１２０ｎＭ、約５ｎＭ～約１００ｎＭ、約５ｎＭ～約８０ｎＭ、約５ｎＭ～約６０ｎＭ、約５ｎＭ～約５０ｎＭ、約５ｎＭ～約４０ｎＭ、約５ｎＭ～約３０ｎＭ、約５ｎＭ～約２５ｎＭ、約５ｎＭ～約２０ｎＭ、約５ｎＭ～約１５ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、約１０ｎＭ～約８０ｎＭ、約１０ｎＭ～約６０ｎＭ、約１０ｎＭ～約５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約４０ｎＭ、約１０ｎＭ～約３０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２５ｎＭ、約１０ｎＭ～約２０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１５ｎＭ、約１５ｎＭ～約２００ｎＭ、約１５ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１５ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１５ｎＭ～約１４０ｎＭ、約１５ｎＭ～約１２０ｎＭ、約１５ｎＭ～約１００ｎＭ、約１５ｎＭ～約８０ｎＭ、約１５ｎＭ～約６０ｎＭ、約１５ｎＭ～約５０ｎＭ、約１５ｎＭ～約４０ｎＭ、約１５ｎＭ～約３０ｎＭ、約１５ｎＭ～約２５ｎＭ、約１５ｎＭ～約２０ｎＭ、約２０ｎＭ～約２００ｎＭ、約２０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１００ｎＭ、約２０ｎＭ～約８０ｎＭ、約２０ｎＭ～約６０ｎＭ、約２０ｎＭ～約５０ｎＭ、約２０ｎＭ～約４０ｎＭ、約２０ｎＭ～約３０ｎＭ、約２０ｎＭ～約２５ｎＭ、約２５ｎＭ～約２００ｎＭ、約２５ｎＭ～約１８０ｎＭ、約２５ｎＭ～約１６０ｎＭ、約２５ｎＭ～約１４０ｎＭ、約２５ｎＭ～約１２０ｎＭ、約２５ｎＭ～約１００ｎＭ、約２５ｎＭ～約８０ｎＭ、約２５ｎＭ～約６０ｎＭ、約２５ｎＭ～約５０ｎＭ、約２５ｎＭ～約４０ｎＭ、約２５ｎＭ～約３０ｎＭ、約３０ｎＭ～約２００ｎＭ、約３０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約３０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約３０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約３０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約３０ｎＭ～約１００ｎＭ、約３０ｎＭ～約８０ｎＭ、約３０ｎＭ～約６０ｎＭ、約３０ｎＭ～約５０ｎＭ、約３０ｎＭ～約４０ｎＭ、約４０ｎＭ～約２００ｎＭ、約４０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約４０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約４０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約４０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約４０ｎＭ～約１００ｎＭ、約４０ｎＭ～約８０ｎＭ、約４０ｎＭ～約６０ｎＭ、約４０ｎＭ～約５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約２００ｎＭ、約５０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１００ｎＭ、約５０ｎＭ～約８０ｎＭ、約５０ｎＭ～約６０ｎＭ、約６０ｎＭ～約２００ｎＭ、約６０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約６０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約６０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約６０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約６０ｎＭ～約１００ｎＭ、約６０ｎＭ～約８０ｎＭ、約８０ｎＭ～約２００ｎＭ、約８０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約８０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約８０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約８０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約８０ｎＭ～約１００ｎＭ、約１００ｎＭ～約２００ｎＭ、約１００ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１００ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１００ｎＭ～約１４０ｎＭ、約１００ｎＭ～約１２０ｎＭ、約１２０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１２０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１２０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１２０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約１４０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１４０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１４０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１６０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１６０ｎＭ～約１８０ｎＭ、または約１８０ｎＭ～約２００ｎＭのデキサメタゾンを含む。
いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ

～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、４２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、４４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、または約４８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチドを含む。ＥＰＯ模倣ペプチドの非限定的な例には、例えば、ＥＰＯ模倣ペプチド（ＥＭＰ１、ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号１））または定義された化学リンカーまたはより大きいポリマーＰＥＧリンカーのいずれかを使用したそのペプチド二量体（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｌｌｉｆｆｅ，Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １５（９）：１２７４－１２７７，２０００に記載のものなど）、ＥＲＢ１－７（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９（１０）：１２７９－８６，１９９８に記載のものなど）、ＥＰＯ－Ｒ由来のペプチド（ＥＲＰ）（Ｎａｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９６（１３）：７５６９－７５７４，１９９９に記載のものなど）、ＥＭＰ２０（ＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫ（配列番号２））（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（１１）：３６９９－３７１０，１９９８に記載のもの）、ＡＧＥＭ４００（ヒドロキシエチルデンプン）、およびペゴルシヘマチド（ｐｅｇｏｌｓｉｈｅｍａｔｉｄｅ）（Ｇｕｐｔａ ａｎｄ Ｗｉｓｈ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２７（５）：３４５－３５０，２０１８に記載のものなど）が挙げられる。ＥＰＯ模倣ペプチドの追加の例は、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、第２の培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、または約４５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリン（例えば、ヒトインスリン）を含む。本明細書に記載の第２の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含む。本明細書に記載の第２の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の脂質（例えば、脂質混合物）を含む。本明細書に記載の第２の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。本明細書に記載の第２の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、０．１％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）のヒト血清アルブミンを含む。本明細書に記載の第２の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約０．１％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）のＰｏｌｏｘａｍｅｒ－１８８（Ｐ１８８）を含む。
いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、例えば、化学的に定義された液体培養培地、動物成分を含まない液体培養培地、または化学的に定義された動物成分を含まない液体培養培地、および／または無血清液体培養培地とすることができる。
ステップＡの前の任意選択的な培養ステップ
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、ステップ（ａ）の前に、（ｉ）複数の赤芽球前駆細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な赤芽球前駆細胞のうちのいずれか）を、容器（例えば、バイオリアクター、振盪管、または振盪フラスコ、例えば、本明細書に記載の例示的なバイオリアクター、振盪管、または振盪フラスコのうちのいずれか）内に含まれる第１の培養培地中に配置して、第１の細胞培養物（例えば、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ（例えば、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、０．１×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、１×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０５細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０５細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０５細胞／ｍＬ、約５×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約５×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約５×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約５×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０６細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０６細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０６細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約３×１０６細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約３×１０６細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、または約４×１０６細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬの初期細胞密度を有する）を提供することと、（ｉｉ）第１の細胞培養物を約１日～約１５日間（例えば、約１日～約１４日間、約１日～約１３日間、約１日～約１２日間、約１日～約１１日間、約１日～約１０日間、約１日～約９日間、約１日～約８日間、約１日～約７日間、約１日～約６日間、約１日～約５日間、約１日～約４日間、約１日～約３日間、約１日～約２日間、約２日～約１５日間、約２日～約１４日間、約２日～約１３日間、約２日～約１２日間、約２日～約１１日間、約２日～約１０日間、約２日～約９日間、約２日～約８日間、約２日～約７日間、約２日～約６日間、約２日～約５日間、約２日～約４日間、約２日～約３日間、約３日～約１５日間、約３日～約１４日間、約３日～約１３日間、約３日～約１２日間、約３日～約１１日間、約３日～約１０日間、約３日～約９日間、約３日～約８日間、約３日～約７日間、約３日～約６日間、約３日～約５日間、約３日～約４日間、約４日～約１５日間、約４日～約１４日間、約４日～約１３日間、約４日～約１２日間、約４日～約１１日間、約４日～約１０日間、約４日～約９日間、約４日～約８日間、約４日～約７日間、約４日～約６日間、約４日～約５日間、約５日～約１５日間、約５日～約１４日間、約５日～約１３日間、約５日～約１２日間、約５日～約１１日間、約５日～約１０日間、約５日～約９日間、約５日～約８日間、約５日～約７日間、約５日～約６日間、約６日～約１５日間、約６日～約１４日間、約６日～約１３日間、約６日～約１２日間、約６日～約１１日間、約６日～約１０日間、約６日～約９日間、約６日～約８日間、約６日～約７日間、約７日～約１５日間、約７日～約１４日間、約７日～約１３日間、約７日～約１２日間、約７日～約１１日間、約７日～約１０日間、約７日～約９日間、約７日～約８日間、約８日～約１５日間、約８日～約１４日間、約８日～約１３日間、約８日～約１２日間、約８日～約１１日間、約８日～約１０日間、約８日～約９日間、約９日～約１５日間、約９日～約１４日間、約９日～約１３日間、約９日～約１２日間、約９日～約１１日間、約９日～約１０日間、約１０日～約１５日間、約１０日～約１４日間、約１０日～約１３日間、約１０日～約１２日間、約１０日～約１１日間、約１１日～約１５日間、約１１日～約１４日間、約１１日～約１３日間、約１１日～約１２日間、約１２日～約１５日間、約１２日～約１４日間、約１２日～約１３日間、約１３日～約１５日間、約１３日～約１４日間、または約１４日～約１５日間）培養する（例えば、回分、流加、または灌流培養する）こととをさらに含むことができる。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）は、複数の赤芽球前駆細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な赤芽球前駆細胞のうちのいずれか）を、振盪フラスコ（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振盪フラスコのうちのいずれか）内に含まれる第１の培養培地内に配置することを含む。かかる実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪フラスコ内の第１の細胞培養物を０．１×ｇ～約５０×ｇ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）は、複数の赤芽球前駆細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な赤芽球前駆細胞のうちのいずれか）を、振盪管（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振盪管のうちのいずれか）内に含まれる第１の培養培地内に配置することを含む。かかる実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振盪管内の第１の細胞培養物を約０．１×ｇ～約５０×ｇ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）は、複数の赤芽球前駆細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な赤芽球前駆細胞のうちのいずれか）を、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の培養バッグ内に配置することを含む。かかる実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグ内の第１の細胞培養物を約１０揺動サイクル／分～約５０揺動サイクル／分（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の揺動速度でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を回分培養することを含む。
流加培養
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を流加培養することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の流加培養は、第１の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第１の培養培地のうちのいずれか）の追加体積を経時的に添加することを含む。いくつかの実施形態では、第１の培養培地の追加体積は、経時的に第１の細胞培養物に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、第１の培養培地の追加体積は、経時的に第１の細胞培養物に定期的に（例えば、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の直後の第１の細胞培養物の体積の約０．１倍～約１０倍（例えば、約０．１倍～約９．５倍、約０．１倍～約９．０倍、約０．１倍～約８．５倍、約０．１倍～約８．０倍、約０．１倍～約７．５倍、約０．１倍～約７．０倍、約０．１倍～約６．５倍、約０．１倍～約６．０倍、約０．１倍～約５．５倍、約０．１倍～約５．０倍、約０．１倍～約４．５倍、約０．１倍～約４．０倍、約０．１倍～約３．５倍、約０．１倍～約３．０倍、約０．１倍～約２．５倍、約０．１倍～約２．０倍、約０．１倍～約１．５倍、約０．１倍～約１．０倍、約０．１倍～約０．５倍、約０．１倍～約０．３倍、約０．１倍～約０．２倍、約０．２倍～約１０倍、約０．２倍～約９．５倍、約０．２倍～約９．０倍、約０．２倍～約８．５倍、約０．２倍～約８．０倍、約０．２倍～約７．５倍、約０．２倍～約７．０倍、約０．２倍～約６．５倍、約０．２倍～約６．０倍、約０．２倍～約５．５倍、約０．２倍～約５．０倍、約０．２倍～約４．５倍、約０．２倍～約４．０倍、約０．２倍～約３．５倍、約０．２倍～約３．０倍、約０．２倍～約２．５倍、約０．２倍～約２．０倍、約０．２倍～約１．５倍、約０．２倍～約１．０倍、約０．２倍～約０．５倍、約０．２倍～約０．３倍、約０．３倍～約１０倍、約０．３倍～約９．５倍、約０．３倍～約９．０倍、約０．３倍～約８．５倍、約０．３倍～約８．０倍、約０．３倍～約７．５倍、約０．３倍～約７．０倍、約０．３倍～約６．５倍、約０．３倍～約６．０倍、約０．３倍～約５．５倍、約０．３倍～約５．０倍、約０．３倍～約４．５倍、約０．３倍～約４．０倍、約０．３倍～約３．５倍、約０．３倍～約３．０倍、約０．３倍～約２．５倍、約０．３倍～約２．０倍、約０．３倍～約１．５倍、約０．３倍～約１．０倍、約０．３倍～約０．５倍、約０．５倍～約１０倍、約０．５倍～約９．５倍、約０．５倍～約９．０倍、約０．５倍～約８．５倍、約０．５倍～約８．０倍、約０．５倍～約７．５倍、約０．５倍～約７．０倍、約０．５倍～約６．５倍、約０．５倍～約６．０倍、約０．５倍～約５．５倍、約０．５倍～約５．０倍、約０．５倍～約４．５倍、約０．５倍～約４．０倍、約０．５倍～約３．５倍、約０．５倍～約３．０倍、約０．５倍～約２．５倍、約０．５倍～約２．０倍、約０．５倍～約１．５倍、約０．５倍～約１．０倍、約１．０倍～約１０倍、約１．０倍～約９．５倍、約１．０倍～約９．０倍、約１．０倍～約８．５倍、約１．０倍～約８．０倍、約１．０倍～約７．５倍、約１．０倍～約７．０倍、約１．０倍～約６．５倍、約１．０倍～約６．０倍、約１．０倍～約５．５倍、約１．０倍～約５．０倍、約１．０倍～約４．５倍、約１．０倍～約４．０倍、約１．０倍～約３．５倍、約１．０倍～約３．０倍、約１．０倍～約２．５倍、約１．０倍～約２．０倍、約１．０倍～約１．５倍、約１．５倍～約１０倍、約１．５倍～約９．５倍、約１．５倍～約９．０倍、約１．５倍～約８．５倍、約１．５倍～約８．０倍、約１．５倍～約７．５倍、約１．５倍～約７．０倍、約１．５倍～約６．５倍、約１．５倍～約６．０倍、約１．５倍～約５．５倍、約１．５倍～約５．０倍、約１．５倍～約４．５倍、約１．５倍～約４．０倍、約１．５倍～約３．５倍、約１．５倍～約３．０倍、約１．５倍～約２．５倍、約１．５倍～約２．０倍、約２．０倍～約１０倍、約２．０倍～約９．５倍、約２．０倍～約９．０倍、約２．０倍～約８．５倍、約２．０倍～約８．０倍、約２．０倍～約７．５倍、約２．０倍～約７．０倍、約２．０倍～約６．５倍、約２．０倍～約６．０倍、約２．０倍～約５．５倍、約２．０倍～約５．０倍、約２．０倍～約４．５倍、約２．０倍～約４．０倍、約２．０倍～約３．５倍、約２．０倍～約３．０倍、約２．０倍～約２．５倍、約２．５倍～約１０倍、約２．５倍～約９．５倍、約２．５倍～約９．０倍、約２．５倍～約８．５倍、約２．５倍～約８．０倍、約２．５倍～約７．５倍、約２．５倍～約７．０倍、約２．５倍～約６．５倍、約２．５倍～約６．０倍、約２．５倍～約５．５倍、約２．５倍～約５．０倍、約２．５倍～約４．５倍、約２．５倍～約４．０倍、約２．５倍～約３．５倍、約２．５倍～約３．０倍、約３．０倍～約１０倍、約３．０倍～約９．５倍、約３．０倍～約９．０倍、約３．０倍～約８．５倍、約３．０倍～約８．０倍、約３．０倍～約７．５倍、約３．０倍～約７．０倍、約３．０倍～約６．５倍、約３．０倍～約６．０倍、約３．０倍～約５．５倍、約３．０倍～約５．０倍、約３．０倍～約４．５倍、約３．０倍～約４．０倍、約３．０倍～約３．５倍、約３．５倍～約１０倍、約３．５倍～約９．５倍、約３．５倍～約９．０倍、約３．５倍～約８．５倍、約３．５倍～約８．０倍、約３．５倍～約７．５倍、約３．５倍～約７．０倍、約３．５倍～約６．５倍、約３．５倍～約６．０倍、約３．５倍～約５．５倍、約３．５倍～約５．０倍、約３．５倍～約４．５倍、約３．５倍～約４．０倍、約４．０倍～約１０倍、約４．０倍～約９．５倍、約４．０倍～約９．０倍、約４．０倍～約８．５倍、約４．０倍～約８．０倍、約４．０倍～約７．５倍、約４．０倍～約７．０倍、約４．０倍～約６．５倍、約４．０倍～約６．０倍、約４．０倍～約５．５倍、約４．０倍～約５．０倍、約４．０倍～約４．５倍、約４．５倍～約１０倍、約４．５倍～約９．５倍、約４．５倍～約９．０倍、約４．５倍～約８．５倍、約４．５倍～約８．０倍、約４．５倍～約７．５倍、約４．５倍～約７．０倍、約４．５倍～約６．５倍、約４．５倍～約６．０倍、約４．５倍～約５．５倍、約４．５倍～約５．０倍、約５．０倍～約１０倍、約５．０倍～約９．５倍、約５．０倍～約９．０倍、約５．０倍～約８．５倍、約５．０倍～約８．０倍、約５．０倍～約７．５倍、約５．０倍～約７．０倍、約５．０倍～約６．５倍、約５．０倍～約６．０倍、約５．０倍～約５．５倍、約５．５倍～約１０倍、約５．５倍～約９．５倍、約５．５倍～約９．０倍、約５．５倍～約８．５倍、約５．５倍～約８．０倍、約５．５倍～約７．５倍、約５．５倍～約７．０倍、約５．５倍～約６．５倍、約５．５倍～約６．０倍、約６．０倍～約１０倍、約６．０倍～約９．５倍、約６．０倍～約９．０倍、約６．０倍～約８．５倍、約６．０倍～約８．０倍、約６．０倍～約７．５倍、約６．０倍～約７．０倍、約６．０倍～約６．５倍、約６．５倍～約１０倍、約６．５倍～約９．５倍、約６．５倍～約９．０倍、約６．５倍～約８．５倍、約６．５倍～約８．０倍、約６．５倍～約７．５倍、約６．５倍～約７．０倍、約７．０倍～約１０倍、約７．０倍～約９．５倍、約７．０倍～約９．０倍、約７．０倍～約８．５倍、約７．０倍～約８．０倍、約７．０倍～約７．５倍、約７．５倍～約１０倍、約７．５倍～約９．５倍、約７．５倍～約９．０倍、約７．５倍～約８．５倍、約７．５倍～約８．０倍、約８．０倍～約１０倍、約８．０倍～約９．５倍、約８．０倍～約９．０倍、約８．０倍～約８．５倍、約８．５倍～約１０倍、約８．５倍～約９．５倍、約８．５倍～約９．０倍、約９．０倍～約１０倍、約９．０倍～約９．５倍、または約９．５倍～約１０倍が各２４時間増分で添加される。いくつかの実施形態では、第１の細胞培養物が特定の目標細胞密度、例えば、約１．０×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約２．０×１０６細胞／ｍＬ、約２．５×１０６細胞／ｍＬ、約３．０×１０６細胞／ｍＬ、約３．５×１０６細胞／ｍＬ、約４．０×１０６細胞／ｍＬ、約４．５×１０６細胞／ｍＬ、約５．０×１０６細胞／ｍＬ、約５．５×１０６細胞／ｍＬ、約６．０×１０６細胞／ｍＬ、約６．５×１０６細胞／ｍＬ、約７．０×１０６細胞／ｍＬ、約７．５×１０６細胞／ｍＬ、約８．０×１０６細胞／ｍＬ、約８．５×１０６細胞／ｍＬ、約９．０×１０６細胞／ｍＬ、約９．５×１０６細胞／ｍＬまたは約１．０×１０７細胞／ｍＬに達した時点で、第１の細胞培養物への第１の培養培地の追加体積の添加が開始する。
灌流培養
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を灌流培養することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載のバイオリアクターのうちのいずれか内の）第１の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３（例えば、約１０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約３０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約２５Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約２０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１５Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約３０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約２５Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約２０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約３０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約２５Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約３０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約１２０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１２０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１２０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１２０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約１４０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１４０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１４０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１６０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１６０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、および約１８０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３）のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の灌流培養は、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約１ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約０．５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約０．１ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約０．５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約５０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約５０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、または約５５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、灌流速度は、経時的に増加する。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の灌流培養は、約０．１容器体積／日（ＶＶＤ）～約３ＶＶＤ（例えば、約０．１ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約０．８ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約０．６ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約０．４ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約０．２ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約０．８ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約０．６ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約０．４ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約０．８ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約０．６ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約０．８ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約２．２ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約２．２ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約２．２ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約２．２ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約２．４ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約２．４ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約２．４ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約２．６ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約２．６ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、または約２．８ＶＶＤ～約３ＶＶＤ）の灌流速度を使用して行うことができる。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の灌流培養は、少なくとも部分的に、培養培地（例えば、第１の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第１の培養培地のうちのいずれか））の追加体積を経時的に第１の細胞培養物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、培養培地（例えば、第１の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第１の培養培地のうちのいずれか））の追加体積は、経時的に第１の細胞培養物に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、培養培地（例えば、第１の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第１の培養培地のうちのいずれか））の追加体積は、経時的に第１の細胞培養物に定期的に（例えば、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加される。培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第１の培養培地のうちのいずれか）の添加は、機械的に、例えば、蠕動ポンプもしくは灌流ポンプを使用して、または手動で（例えば、滅菌ピペット操作によって）行うことができる。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の灌流培養は、少なくとも部分的に、培養培地（例えば、実質的に無細胞の培養培地）のある体積を経時的に除去することを含む。いくつかの実施形態では、培養培地（例えば、実質的に無細胞の培養培地）は、経時的に、連続的に除去される。いくつかの実施形態では、培養培地は、経時的に、定期的に（例えば、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）除去される。培養培地（例えば、実質的に無細胞培養培地）の除去は、機械的に、例えば、接線流濾過（ＴＦＦ）もしくは交互流濾過（ＡＴＦ）を使用して、または手動で（例えば、滅菌ピペット操作によって）行うことができる。接線流濾過の追加の非限定的な態様は、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、灌流培養は、接線濾過（例えば、接線流濾過（ＴＦＦ）または交互接線濾過（ＡＴＦ））の使用を含む。いくつかの実施形態では、接線濾過（例えば、接線流濾過または交互接線濾過）は、約１０ｎｍ～約６．０μｍ、約１０ｎｍ～約５．５μｍ、約１０ｎｍ～約５．０μｍ、約１０ｎｍ～約４．５μｍ、約１０ｎｍ～約４．０μｍ、約１０ｎｍ～約３．５μｍ、約１０ｎｍ～約３．０μｍ、約１０ｎｍ～約２．５μｍ、約１０ｎｍ～約２．０μｍ、約１０ｎｍ～約１．５μｍ、約１０ｎｍ～約１．０μｍ、約１０ｎｍ～約０．５μｍ、約１０ｎｍ～約０．２μｍ、１０ｎｍ～約０．１μｍ、約１０ｎｍ～約５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６．０μｍ、約５０ｎｍ～約５．５μｍ、約５０ｎｍ～約５．０μｍ、約５０ｎｍ～約４．５μｍ、約５０ｎｍ～約４．０μｍ、約５０ｎｍ～約３．５μｍ、約５０ｎｍ～約３．０μｍ、約５０ｎｍ～約２．５μｍ、約５０ｎｍ～約２．０μｍ、約５０ｎｍ～約１．５μｍ、約５０ｎｍ～約１．０μｍ、約５０ｎｍ～約０．５μｍ、約５０ｎｍ～約０．２μｍ、約５０ｎｍ～約０．１μｍ、約０．１μｍ～約６．０μｍ、約０．１μｍ～約５．５μｍ、約０．１μｍ～約５．０μｍ、約０．１μｍ～約４．５μｍ、約０．１μｍ～約４．０μｍ、約０．１μｍ～約３．５μｍ、約０．１μｍ～約３．０μｍ、約０．１μｍ～約２．５μｍ、約０．１μｍ～約２．０μｍ、約０．１μｍ～約１．５μｍ、約０．１μｍ～約１．０μｍ、約０．１μｍ～約０．５μｍ、約０．１μｍ～約０．２μｍ、約０．２μｍ～約６．０μｍ、約０．２μｍ～約５．５μｍ、約０．２μｍ～約５．０μｍ、約０．２μｍ～約４．５μｍ、約０．２μｍ～約４．０μｍ、約０．２μｍ～約３．５μｍ、約０．２μｍ～約３．０μｍ、約０．２μｍ～約２．５μｍ、約０．２μｍ～約２．０μｍ、約０．２μｍ～約１．５μｍ、約０．２μｍ～約１．０μｍ、約０．２μｍ～約０．５μｍ、約０．５μｍ～約６．０μｍ、約０．５μｍ～約５．５μｍ、約０．５μｍ～約５．０μｍ、約０．５μｍ～約４．５μｍ、約０．５μｍ～約４．０μｍ、約０．５μｍ～約３．５μｍ、約０．５μｍ～約３．０μｍ、約０．５μｍ～約２．５μｍ、約０．５μｍ～約２．０μｍ、約０．５μｍ～約１．５μｍ、約０．５μｍ～約１．０μｍ、約１．０μｍ～約６．０μｍ、約１．０μｍ～約５．５μｍ、約１．０μｍ～約５．０μｍ、約１．０μｍ～約４．５μｍ、約１．０μｍ～約４．０μｍ、約１．０μｍ～約３．５μｍ、約１．０μｍ～約３．０μｍ、約１．０μｍ～約２．５μｍ、約１．０μｍ～約２．０μｍ、約１．０μｍ～約１．５μｍ、約１．５μｍ～約６．０μｍ、約１．５μｍ～約５．５μｍ、約１．５μｍ～約５．０μｍ、約１．５μｍ～約４．５μｍ、約１．５μｍ～約４．０μｍ、約１．５μｍ～約３．５μｍ、約１．５μｍ～約３．０μｍ、約１．５μｍ～約２．５μｍ、約１．５μｍ～約２．０μｍ、約２．０μｍ～約６．０μｍ、約２．０μｍ～約５．５μｍ、約２．０μｍ～約５．０μｍ、約２．０μｍ～約４．５μｍ、約２．０μｍ～約４．０μｍ、約２．０μｍ～約３．５μｍ、約２．０μｍ～約３．０μｍ、約２．０μｍ～約２．５μｍ、約２．５μｍ～約６．０μｍ、約２．５μｍ～約５．５μｍ、約２．５μｍ～約５．０μｍ、約２．５μｍ～約４．５μｍ、約２．５μｍ～約４．０μｍ、約２．５μｍ～約３．５μｍ、約２．５μｍ～約３．０μｍ、約３．０μｍ～約６．０μｍ、約３．０μｍ～約５．５μｍ、約３．０μｍ～約５．０μｍ、約３．０μｍ～約４．５μｍ、約３．０μｍ～約４．０μｍ、約３．０μｍ～約３．５μｍ、約３．５μｍ～約６．０μｍ、約３．５μｍ～約５．５μｍ、約３．５μｍ～約５．０μｍ、約３．５μｍ～約４．５μｍ、約３．５μｍ～約４．０μｍ、約４．０μｍ～約６．０μｍ、約４．０μｍ～約５．５μｍ、約４．０μｍ～約５．０μｍ、約４．０μｍ～約４．５μｍ、約４．５μｍ～約６．０μｍ、約４．５μｍ～約５．５μｍ、約４．５μｍ～約５．０μｍ、約５．０μｍ～約６．０μｍ、約５．０μｍ～約５．５μｍ、または約５．５μｍ～約６．０μｍの平均細孔径を有する１つ以上のフィルターの使用を含む。
いくつかの実施形態では、第１の細胞培養物の灌流は、第１の細胞培養物が特定の目標細胞密度、例えば、約１．０×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約２．０×１０６細胞／ｍＬ、約２．５×１０６細胞／ｍＬ、約３．０×１０６細胞／ｍＬ、約３．５×１０６細胞／ｍＬ、約４．０×１０６細胞／ｍＬ、約４．５×１０６細胞／ｍＬ、約５．０×１０６細胞／ｍＬ、約５．５×１０６細胞／ｍＬ、約６．０×１０６細胞／ｍＬ、約６．５×１０６細胞／ｍＬ、約７．０×１０６細胞／ｍＬ、約７．５×１０６細胞／ｍＬ、約８．０×１０６細胞／ｍＬ、約８．５×１０６細胞／ｍＬ、約９．０×１０６細胞／ｍＬ、約９．５×１０６細胞／ｍＬまたは約１．０×１０７細胞／ｍＬに達した時点で開始する。
いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド（例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＦｌｔ－３リガンド、）、ＳＣＦ（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＳＣＦ）、ＩＬ－３（例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＩＬ－３）、およびＩＬ－６（例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＩＬ－６）のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、または４つ）を含む。本明細書に記載の第１の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＳＣＧＭ培地を含む。本明細書に記載の第１の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、ＩＭＤＭを含む。第１の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ（例えば、約０．１ｍＭ～約９．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約９．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約８．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約８．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約７．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約７．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約６．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約６．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約５．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約４．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約４．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約３．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約３．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約２．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約２．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約０．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約７．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約６．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約６．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約４．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約４．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約３．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約３．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約２．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約２．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約１．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約１．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約８．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約７．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約７．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約６．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約６．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約５．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約４．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約４．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約３．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約３．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約２．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約１．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約７．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約６．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約６．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約４．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約４．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約３．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約３．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約２．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約２．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約８．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約７．５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約７．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約６．５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約６．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約５．５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約４．５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約４．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約３．５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約３．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約２．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約２．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約７．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～約６．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約６．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約４．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約４．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～約３．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約３．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約３．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約３．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約３．０ｍＭ～約８．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～約７．５ｍＭ、約３．０ｍＭ～約７．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～約６．５ｍＭ、約３．０ｍＭ～約６．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～約５．５ｍＭ、約３．０ｍＭ～約５ｍＭ、約３．０ｍＭ～約４．５ｍＭ、約３．０ｍＭ～約４．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～約３．５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約３．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約７．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～約６．５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約６．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約４．５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約４．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約４．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約４．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約４．０ｍＭ～約８．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～約７．５ｍＭ、約４．０ｍＭ～約７．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～約６．５ｍＭ、約４．０ｍＭ～約６．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～約５．５ｍＭ、約４．０ｍＭ～約５ｍＭ、約４．０ｍＭ～約４．５ｍＭ、約４．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約４．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約４．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約４．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約４．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約４．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約４．５ｍＭ～約７．０ｍＭ、約４．５ｍＭ～約６．５ｍＭ、約４．５ｍＭ～約６．０ｍＭ、約４．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約４．５ｍＭ～約５．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約５．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約５．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約５．０ｍＭ～約８．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～約７．５ｍＭ、約５．０ｍＭ～約７．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～約６．５ｍＭ、約５．０ｍＭ～約６．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～約５．５ｍＭ、約５．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約５．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約５．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約５．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約５．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約５．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約５．５ｍＭ～約７．０ｍＭ、約５．５ｍＭ～約６．５ｍＭ、約５．５ｍＭ～約６．０ｍＭ、約６．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約６．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約６．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約６．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約６．０ｍＭ～約８．０ｍＭ、約６．０ｍＭ～約７．５ｍＭ、約６．０ｍＭ～約７．０ｍＭ、約６．０ｍＭ～約６．５ｍＭ、約６．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約６．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約６．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約６．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約６．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約６．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約６．５ｍＭ～約７．０ｍＭ、約７．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約７．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約７．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約７．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約７．０ｍＭ～約８．０ｍＭ、約７．０ｍＭ～約７．５ｍＭ、約７．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約７．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約７．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約７．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約７．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約８．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約８．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約８．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約８．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約８．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約８．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約８．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約９．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約９．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、または約９．５ｍＭ～約１０ｍＭ）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の第１の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ（例えば、約１μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約７μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約６μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約７μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約６μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約７μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約６μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約７μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約６μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約７μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約６μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約７μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、１２μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、１３μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、１４μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１６μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１６μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１６μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、１７μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１７μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１７μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１８μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１８μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、または約１９μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ）のインスリン（例えば、ヒトインスリン）を含む。
本明細書に記載の第１の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。本明細書に記載の第１の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の培養培地は、トランスフェリン（例えば、アポトランスフェリング、ホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ）（例えば、約５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ～約１５０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１５０μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、または約３５０～約４００μｇ／ｍＬのトランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ）を含む。
いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、または約１９０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンド（例えば、組換えヒトＦｌｔ－３リガンド）を含む。
いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約６００

ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、または約９５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦ（例えば、組換えヒト幹細胞因子）を含む。
いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、または約１９０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３（例えば、組換えヒトＩＬ－３）を含む。
いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、または約１９０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６（例えば、組換えヒトＩＬ－６）を含む。
いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、例えば、化学的に定義された液体培養培地、動物成分を含まない液体培養培地、または化学的に定義された動物成分を含まない液体培養培地、および／または無血清液体培養培地とすることができる。
培養ステップＢ
灌流培養
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する例示的なバイオリアクターのうちのいずれか内の第２の細胞培養物のうちのいずれか）を約２日～約１５日間（例えば、約２日～約１４日間、約２日～約１３日間、約２日～約１２日間、約２日～約１１日間、約２日～約１０日間、約２日～約９日間、約２日～約８日間、約２日～約７日間、約２日～約６日間、約２日～約５日間、約２日～約４日間、約２日～約３日間、約３日～約１５日間、約３日～約１４日間、約３日～約１３日間、約３日～約１２日間、約３日～約１１日間、約３日～約１０日間、約３日～約９日間、約３日～約８日間、約３日～約７日間、約３日～約６日間、約３日～約５日間、約３日～約４日間、約４日～約１５日間、約４日～約１４日間、約４日～約１３日間、約４日～約１２日間、約４日～約１１日間、約４日～約１０日間、約４日～約９日間、約４日～約８日間、約４日～約７日間、約４日～約６日間、約４日～約５日間、約５日～約１５日間、約５日～約１４日間、約５日～約１３日間、約５日～約１２日間、約５日～約１１日間、約５日～約１０日間、約５日～約９日間、約５日～約８日間、約５日～約７日間、約５日～約６日間、約６日～約１５日間、約６日～約１４日間、約６日～約１３日間、約６日～約１２日間、約６日～約１１日間、約６日～約１０日間、約６日～約９日間、約６日～約８日間、約６日～約７日間、約７日～約１５日間、約７日～約１４日間、約７日～約１３日間、約７日～約１２日間、約７日～約１１日間、約７日～約１０日間、約７日～約９日間、約７日～約８日間、約８日～約１５日間、約８日～約１４日間、約８日～約１３日間、約８日～約１２日間、約８日～約１１日間、約８日～約１０日間、約８日～約９日間、約９日～約１５日間、約９日～約１４日間、約９日～約１３日間、約９日～約１２日間、約９日～約１１日間、約９日～約１０日間、約１０日～約１５日間、約１０日～約１４日間、約１０日～約１３日間、約１０日～約１２日間、約１０日～約１１日間、約１１日～約１５日間、約１１日～約１４日間、約１１日～約１３日間、約１１日～約１２日間、約１２日～約１５日間、約１２日～約１４日間、約１２日～約１３日間、約１３日～約１５日間、約１３日～約１４日間、または約１４日～約１５日間）灌流培養することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載されるバイオリアクターのうちのいずれか内の）第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の灌流速度を使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、灌流速度は、経時的に増加する。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、約０．１容器体積／日（ＶＶＤ）～約３ＶＶＤ（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の灌流速度を使用して行うことができる。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、少なくとも部分的に、培養培地（例えば、第２の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のうちのいずれか））の追加体積を経時的に第２の細胞培養物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、培養培地（例えば、第２の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のうちのいずれか））の追加体積は、経時的に第２の細胞培養物に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、培養培地（例えば、第２の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のうちのいずれか））の追加体積は、経時的に第２の細胞培養物に定期的に（例えば、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加される。培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のうちのいずれか）の添加は、機械的に、例えば、蠕動ポンプもしくは灌流ポンプを使用して、または手動で（例えば、滅菌ピペット操作によって）行うことができる。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養は、少なくとも部分的に、培養培地（例えば、実質的に無細胞の培養培地）のある体積を経時的に除去することを含む。いくつかの実施形態では、培養培地（例えば、実質的に無細胞の培養培地）は、経時的に、連続的に除去される。いくつかの実施形態では、培養培地は、経時的に、定期的に（例えば、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）除去される。培養培地（例えば、実質的に無細胞培養培地）の除去は、機械的に、例えば、接線流濾過（ＴＦＦ）もしくは交互流濾過（ＡＴＦ）を使用して、または手動で（例えば、滅菌ピペット操作によって）行うことができる。接線流濾過の追加の非限定的な態様は、本明細書に記載される。
これらの方法のいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン（例えば、ヒトアポトランスフェリン、ヒトホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ）（例えば、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのトランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ））、ＩＬ－３（例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＩＬ－３（例えば、組換えヒトＩＬ－３））、ＳＣＦ（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＳＣＦ（例えば、組換えヒトＳＣＦ））、デキサメタゾン（例えば、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのデキサメタゾン）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド）、およびインスリン（例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのインスリン）のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、または６つ）を含む。これらの方法のいくつかの例では、第２の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。これらの方法のいくつかの例では、第２の培養培地は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、灌流培養は、接線濾過（例えば、接線流濾過（ＴＦＦ）または交互接線濾過（ＡＴＦ））の使用を含む。いくつかの実施形態では、接線濾過（例えば、接線流濾過または交互接線濾過）は、約１０ｎｍ～約６．０μｍ（例えば、または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の平均細孔径を有する１つ以上のフィルターの使用を含む。
いくつかの実施形態では、第２の細胞培養物の灌流は、第１の細胞培養物が特定の目標細胞密度、例えば、約１．０×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約２．０×１０６細胞／ｍＬ、約２．５×１０６細胞／ｍＬ、約３．０×１０６細胞／ｍＬ、約３．５×１０６細胞／ｍＬ、約４．０×１０６細胞／ｍＬ、約４．５×１０６細胞／ｍＬ、約５．０×１０６細胞／ｍＬ、約５．５×１０６細胞／ｍＬ、約６．０×１０６細胞／ｍＬ、約６．５×１０６細胞／ｍＬ、約７．０×１０６細胞／ｍＬ、約７．５×１０６細胞／ｍＬ、約８．０×１０６細胞／ｍＬ、約８．５×１０６細胞／ｍＬ、約９．０×１０６細胞／ｍＬ、約９．５×１０６細胞／ｍＬまたは約１．０×１０７細胞／ｍＬに達した時点で開始する。
回分または流加培養
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振盪フラスコ、振盪管、培養バッグ、またはバイオリアクターのうちのいずれか内の第２の細胞培養物のうちのいずれか）を約２日～約１５日間（例えば、約２日～約１４日間、約２日～約１３日間、約２日～約１２日間、約２日～約１１日間、約２日～約１０日間、約２日～約９日間、約２日～約８日間、約２日～約７日間、約２日～約６日間、約２日～約５日間、約２日～約４日間、約２日～約３日間、約３日～約１５日間、約３日～約１４日間、約３日～約１３日間、約３日～約１２日間、約３日～約１１日間、約３日～約１０日間、約３日～約９日間、約３日～約８日間、約３日～約７日間、約３日～約６日間、約３日～約５日間、約３日～約４日間、約４日～約１５日間、約４日～約１４日間、約４日～約１３日間、約４日～約１２日間、約４日～約１１日間、約４日～約１０日間、約４日～約９日間、約４日～約８日間、約４日～約７日間、約４日～約６日間、約４日～約５日間、約５日～約１５日間、約５日～約１４日間、約５日～約１３日間、約５日～約１２日間、約５日～約１１日間、約５日～約１０日間、約５日～約９日間、約５日～約８日間、約５日～約７日間、約５日～約６日間、約６日～約１５日間、約６日～約１４日間、約６日～約１３日間、約６日～約１２日間、約６日～約１１日間、約６日～約１０日間、約６日～約９日間、約６日～約８日間、約６日～約７日間、約７日～約１５日間、約７日～約１４日間、約７日～約１３日間、約７日～約１２日間、約７日～約１１日間、約７日～約１０日間、約７日～約９日間、約７日～約８日間、約８日～約１５日間、約８日～約１４日間、約８日～約１３日間、約８日～約１２日間、約８日～約１１日間、約８日～約１０日間、約８日～約９日間、約９日～約１５日間、約９日～約１４日間、約９日～約１３日間、約９日～約１２日間、約９日～約１１日間、約９日～約１０日間、約１０日～約１５日間、約１０日～約１４日間、約１０日～約１３日間、約１０日～約１２日間、約１０日～約１１日間、約１１日～約１５日間、約１１日～約１４日間、約１１日～約１３日間、約１１日～約１２日間、約１２日～約１５日間、約１２日～約１４日間、約１２日～約１３日間、約１３日～約１５日間、約１３日～約１４日間、または約１４日～約１５日間）回分または流加培養することを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、バイオリアクター（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的なバイオリアクターのうちのいずれか）内に配置された第２の細胞培養物を回分または流加培養することを含む。かかる実施形態では、ステップ（ｂ）は、バイオリアクター内の第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）のＰ／Ｖ値でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、振盪フラスコ（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振盪フラスコのうちのいずれか）内に配置された第２の細胞培養物を回分または流加培養することを含む。かかる実施形態では、ステップ（ｂ）は、振盪フラスコ内の第２の細胞培養物を約０．１×ｇ～約５０×ｇ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、振盪管（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振盪管のうちのいずれか（例えば、円錐容器））内に配置された第２の細胞培養物を回分または流加培養することを含む。かかる実施形態では、ステップ（ｂ）は、振盪管内の第２の細胞培養物を約０．１×ｇ～約５０×ｇ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、培養バッグ（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的な培養バッグのうちのいずれか）内に配置された第２の細胞培養物を回分または流加培養することを含む。かかる実施形態では、ステップ（ｂ）は、培養バッグ内の第２の細胞培養物を１０揺動サイクル／分～約５０揺動サイクル／分（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の揺動速度でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を回分培養することを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を流加培養することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の流加培養は、第２の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のうちのいずれか）の追加体積を経時的に添加することを含む。いくつかの実施形態では、培養培地（例えば、第２の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のうちのいずれか））の追加体積は、経時的に第２の細胞培養物に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、培養培地（例えば、第２の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のうちのいずれか））の追加体積は、経時的に第２の細胞培養物に定期的に（例えば、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加される。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の直後の第２の細胞培養物の体積の約０．１倍～約１０倍（例えば、約０．１倍～約９．５倍、約０．１倍～約９．０倍、約０．１倍～約８．５倍、約０．１倍～約８．０倍、約０．１倍～約７．５倍、約０．１倍～約７．０倍、約０．１倍～約６．５倍、約０．１倍～約６．０倍、約０．１倍～約５．５倍、約０．１倍～約５．０倍、約０．１倍～約４．５倍、約０．１倍～約４．０倍、約０．１倍～約３．５倍、約０．１倍～約３．０倍、約０．１倍～約２．５倍、約０．１倍～約２．０倍、約０．１倍～約１．５倍、約０．１倍～約１．０倍、約０．１倍～約０．５倍、約０．１倍～約０．３倍、約０．１倍～約０．２倍、約０．２倍～約１０倍、約０．２倍～約９．５倍、約０．２倍～約９．０倍、約０．２倍～約８．５倍、約０．２倍～約８．０倍、約０．２倍～約７．５倍、約０．２倍～約７．０倍、約０．２倍～約６．５倍、約０．２倍～約６．０倍、約０．２倍～約５．５倍、約０．２倍～約５．０倍、約０．２倍～約４．５倍、約０．２倍～約４．０倍、約０．２倍～約３．５倍、約０．２倍～約３．０倍、約０．２倍～約２．５倍、約０．２倍～約２．０倍、約０．２倍～約１．５倍、約０．２倍～約１．０倍、約０．２倍～約０．５倍、約０．２倍～約０．３倍、約０．３倍～約１０倍、約０．３倍～約９．５倍、約０．３倍～約９．０倍、約０．３倍～約８．５倍、約０．３倍～約８．０倍、約０．３倍～約７．５倍、約０．３倍～約７．０倍、約０．３倍～約６．５倍、約０．３倍～約６．０倍、約０．３倍～約５．５倍、約０．３倍～約５．０倍、約０．３倍～約４．５倍、約０．３倍～約４．０倍、約０．３倍～約３．５倍、約０．３倍～約３．０倍、約０．３倍～約２．５倍、約０．３倍～約２．０倍、約０．３倍～約１．５倍、約０．３倍～約１．０倍、約０．３倍～約０．５倍、約０．５倍～約１０倍、約０．５倍～約９．５倍、約０．５倍～約９．０倍、約０．５倍～約８．５倍、約０．５倍～約８．０倍、約０．５倍～約７．５倍、約０．５倍～約７．０倍、約０．５倍～約６．５倍、約０．５倍～約６．０倍、約０．５倍～約５．５倍、約０．５倍～約５．０倍、約０．５倍～約４．５倍、約０．５倍～約４．０倍、約０．５倍～約３．５倍、約０．５倍～約３．０倍、約０．５倍～約２．５倍、約０．５倍～約２．０倍、約０．５倍～約１．５倍、約０．５倍～約１．０倍、約１．０倍～約１０倍、約１．０倍～約９．５倍、約１．０倍～約９．０倍、約１．０倍～約８．５倍、約１．０倍～約８．０倍、約１．０倍～約７．５倍、約１．０倍～約７．０倍、約１．０倍～約６．５倍、約１．０倍～約６．０倍、約１．０倍～約５．５倍、約１．０倍～約５．０倍、約１．０倍～約４．５倍、約１．０倍～約４．０倍、約１．０倍～約３．５倍、約１．０倍～約３．０倍、約１．０倍～約２．５倍、約１．０倍～約２．０倍、約１．０倍～約１．５倍、約１．５倍～約１０倍、約１．５倍～約９．５倍、約１．５倍～約９．０倍、約１．５倍～約８．５倍、約１．５倍～約８．０倍、約１．５倍～約７．５倍、約１．５倍～約７．０倍、約１．５倍～約６．５倍、約１．５倍～約６．０倍、約１．５倍～約５．５倍、約１．５倍～約５．０倍、約１．５倍～約４．５倍、約１．５倍～約４．０倍、約１．５倍～約３．５倍、約１．５倍～約３．０倍、約１．５倍～約２．５倍、約１．５倍～約２．０倍、約２．０倍～約１０倍、約２．０倍～約９．５倍、約２．０倍～約９．０倍、約２．０倍～約８．５倍、約２．０倍～約８．０倍、約２．０倍～約７．５倍、約２．０倍～約７．０倍、約２．０倍～約６．５倍、約２．０倍～約６．０倍、約２．０倍～約５．５倍、約２．０倍～約５．０倍、約２．０倍～約４．５倍、約２．０倍～約４．０倍、約２．０倍～約３．５倍、約２．０倍～約３．０倍、約２．０倍～約２．５倍、約２．５倍～約１０倍、約２．５倍～約９．５倍、約２．５倍～約９．０倍、約２．５倍～約８．５倍、約２．５倍～約８．０倍、約２．５倍～約７．５倍、約２．５倍～約７．０倍、約２．５倍～約６．５倍、約２．５倍～約６．０倍、約２．５倍～約５．５倍、約２．５倍～約５．０倍、約２．５倍～約４．５倍、約２．５倍～約４．０倍、約２．５倍～約３．５倍、約２．５倍～約３．０倍、約３．０倍～約１０倍、約３．０倍～約９．５倍、約３．０倍～約９．０倍、約３．０倍～約８．５倍、約３．０倍～約８．０倍、約３．０倍～約７．５倍、約３．０倍～約７．０倍、約３．０倍～約６．５倍、約３．０倍～約６．０倍、約３．０倍～約５．５倍、約３．０倍～約５．０倍、約３．０倍～約４．５倍、約３．０倍～約４．０倍、約３．０倍～約３．５倍、約３．５倍～約１０倍、約３．５倍～約９．５倍、約３．５倍～約９．０倍、約３．５倍～約８．５倍、約３．５倍～約８．０倍、約３．５倍～約７．５倍、約３．５倍～約７．０倍、約３．５倍～約６．５倍、約３．５倍～約６．０倍、約３．５倍～約５．５倍、約３．５倍～約５．０倍、約３．５倍～約４．５倍、約３．５倍～約４．０倍、約４．０倍～約１０倍、約４．０倍～約９．５倍、約４．０倍～約９．０倍、約４．０倍～約８．５倍、約４．０倍～約８．０倍、約４．０倍～約７．５倍、約４．０倍～約７．０倍、約４．０倍～約６．５倍、約４．０倍～約６．０倍、約４．０倍～約５．５倍、約４．０倍～約５．０倍、約４．０倍～約４．５倍、約４．５倍～約１０倍、約４．５倍～約９．５倍、約４．５倍～約９．０倍、約４．５倍～約８．５倍、約４．５倍～約８．０倍、約４．５倍～約７．５倍、約４．５倍～約７．０倍、約４．５倍～約６．５倍、約４．５倍～約６．０倍、約４．５倍～約５．５倍、約４．５倍～約５．０倍、約５．０倍～約１０倍、約５．０倍～約９．５倍、約５．０倍～約９．０倍、約５．０倍～約８．５倍、約５．０倍～約８．０倍、約５．０倍～約７．５倍、約５．０倍～約７．０倍、約５．０倍～約６．５倍、約５．０倍～約６．０倍、約５．０倍～約５．５倍、約５．５倍～約１０倍、約５．５倍～約９．５倍、約５．５倍～約９．０倍、約５．５倍～約８．５倍、約５．５倍～約８．０倍、約５．５倍～約７．５倍、約５．５倍～約７．０倍、約５．５倍～約６．５倍、約５．５倍～約６．０倍、約６．０倍～約１０倍、約６．０倍～約９．５倍、約６．０倍～約９．０倍、約６．０倍～約８．５倍、約６．０倍～約８．０倍、約６．０倍～約７．５倍、約６．０倍～約７．０倍、約６．０倍～約６．５倍、約６．５倍～約１０倍、約６．５倍～約９．５倍、約６．５倍～約９．０倍、約６．５倍～約８．５倍、約６．５倍～約８．０倍、約６．５倍～約７．５倍、約６．５倍～約７．０倍、約７．０倍～約１０倍、約７．０倍～約９．５倍、約７．０倍～約９．０倍、約７．０倍～約８．５倍、約７．０倍～約８．０倍、約７．０倍～約７．５倍、約７．５倍～約１０倍、約７．５倍～約９．５倍、約７．５倍～約９．０倍、約７．５倍～約８．５倍、約７．５倍～約８．０倍、約８．０倍～約１０倍、約８．０倍～約９．５倍、約８．０倍～約９．０倍、約８．０倍～約８．５倍、約８．５倍～約１０倍、約８．５倍～約９．５倍、約８．５倍～約９．０倍、約９．０倍～約１０倍、約９．０倍～約９．５倍、または約９．５倍～約１０倍）が各２４時間増分で添加される。いくつかの実施形態では、培養培地（例えば、第２の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のうちのいずれか）の追加体積の第２の細胞培養物への添加は、第１の細胞培養物が特定の目標細胞密度、例えば、約１．０×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約２．０×１０６細胞／ｍＬ、約２．５×１０６細胞／ｍＬ、約３．０×１０６細胞／ｍＬ、約３．５×１０６細胞／ｍＬ、約４．０×１０６細胞／ｍＬ、約４．５×１０６細胞／ｍＬ、約５．０×１０６細胞／ｍＬ、約５．５×１０６細胞／ｍＬ、約６．０×１０６細胞／ｍＬ、約６．５×１０６細胞／ｍＬ、約７．０×１０６細胞／ｍＬ、約７．５×１０６細胞／ｍＬ、約８．０×１０６細胞／ｍＬ、約８．５×１０６細胞／ｍＬ、約９．０×１０６細胞／ｍＬ、約９．５×１０６細胞／ｍＬ、または約１．０×１０７細胞／ｍＬに達した時点で開始する。
培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のうちのいずれか）の添加は、機械的に、例えば、蠕動ポンプを使用して、または手動で（例えば、滅菌ピペット操作によって）行うことができる。
これらの方法のいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン（例えば、ヒトアポトランスフェリン、ヒトホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ）（例えば、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのトランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ））、ＩＬ－３（例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＩＬ－３（例えば、組換えヒトＩＬ－３））、ＳＣＦ（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＳＣＦ（例えば、組換えヒトＳＣＦ））、デキサメタゾン（例えば、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのデキサメタゾン）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、本明細書に記載のＥＰＯ模倣ペプチドのうちのいずれか））、およびインスリン（例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのインスリン）のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、または６つ）を含む。これらの方法のいくつかの例では、第２の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。これらの方法のいくつかの例では、第２の培養培地は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
第３の細胞培養物の提供（ステップＣ）
本明細書に記載の方法は、ステップ（ｂ）の第２の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の細胞培養物のうちのいずれか）のある体積を、容器（例えば、バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）、振盪管、振盪フラスコ、または培養バッグ）内に含まれる第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のうちのいずれか）中に配置して、第３の細胞培養物（例えば、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約０．１×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約０．１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約０．１×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約０．１×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約０．１×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約０．１×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約０．１×１０６細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約０．１×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０６細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、または約０．５×１０７細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬの初期細胞密度を有する）を提供するステップ（ステップ（ｃ））を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）の第２の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の細胞培養物のうちのいずれか）のある体積を、バイオリアクター（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有するバイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）のうちのいずれか）内に含まれる第３の培養培地中に配置して、０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の初期細胞密度を有する第３の細胞培養物を提供することを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）の第２の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の細胞培養物のうちのいずれか）のある体積を、振盪フラスコ（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振盪フラスコのうちのいずれか）内に含まれる第３の培養培地中に配置して、０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の初期細胞密度を有する第３の細胞培養物を提供することを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）の第２の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の細胞培養物のうちのいずれか）のある体積を、振盪管（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振盪管のうちのいずれか（例えば、円錐容器））内に含まれる第３の培養培地中に配置して、０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の初期細胞密度を有する第３の細胞培養物を提供することを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）の第２の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の細胞培養物のうちのいずれか）のある体積を、培養バッグ（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的な培養バッグのうちのいずれか）内に含まれる第３の培養培地中に配置して、０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の初期細胞密度を有する第３の細胞培養物を提供することを含む。
いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．０１ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ（例えば、約０．０１ｇ／Ｌ～約７５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約７０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約６５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約５５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約４５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約１８ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約１６ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約１４ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約１２ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約９．５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約９．０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約８．５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約８．０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約７．５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約７．０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約６．５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約６．０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約５．５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約２．０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約１．０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約０．５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約０．１ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ～約０．０５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約７５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約７０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約６５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約５５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約４５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約１８ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約１６ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約１４ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約１２ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約９．５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約９．０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約８．５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約８．０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約７．５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約７．０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約６．５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約６．０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約５．５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約２．０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約１．０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約０．５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ～約０．１ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約７５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約７０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約６５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約５５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約４５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約１８ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約１６ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約１４ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約１２ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約９．５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約９．０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約８．５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約８．０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約７．５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約７．０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約６．５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約６．０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約５．５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約２．０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約１．０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ～約０．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約７５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約７０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約６５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約５５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約４５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約１８ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約１６ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約１４ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約１２ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約９．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約９．０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約８．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約８．０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約７．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約７．０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約６．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約６．０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約５．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約２．０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約１．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約７５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約７０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約６５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約５５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約４５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約１８ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約１６ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約１４ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約１２ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約９．５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約９．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約８．５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約８．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約７．５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約７．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約６．５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約６．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約５．５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約２．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約７５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約７０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約６５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約５５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約４５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約１８ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約１６ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約１４ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約１２ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約９．５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約９．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約８．５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約８．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約７．５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約７．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約６．５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約６．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約５．５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約２．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約７５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約７０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約６５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約５５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約４５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約１８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約１６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約１４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約１２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約９．５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約９．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約８．５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約８．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約７．５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約７．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約６．５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約６．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約５．５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約７５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約７０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約６５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約５５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約４５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約１８ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約１６ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約１４ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約１２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約９．５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約９．０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約８．５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約８．０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約７．５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約７．０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約６．５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約６．０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約５．５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約７５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約７０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約６５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約５５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約４５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約１８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約１６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約１４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約１２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約９．５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約９．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約８．５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約８．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約７．５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約７．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約６．５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約６．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約５．５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ～約７５ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ～約７０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ～約６５ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ～約５５ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ～約４５ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ、約３．５

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６０ｍＭ～約９５ｍＭ、約６０ｍＭ～約９０ｍＭ、約６０ｍＭ～約８５ｍＭ、約６０ｍＭ～約８０ｍＭ、約６０ｍＭ～約７５ｍＭ、約６０ｍＭ～約７０ｍＭ、約６０ｍＭ～約６５ｍＭ、約６５ｍＭ～約４４５ｍＭ、約６５ｍＭ～約４２５ｍＭ、約６５ｍＭ～約４００ｍＭ

、約６５ｍＭ～約３８０ｍＭ、約６５ｍＭ～約３６０ｍＭ、約６５ｍＭ～約３４０ｍＭ、約６５ｍＭ～約３２０ｍＭ、約６５ｍＭ～約３００ｍＭ、約６５ｍＭ～約２８０ｍＭ、約６５ｍＭ～約２６０ｍＭ、約６５ｍＭ～約２４０ｍＭ、約６５ｍＭ～約２２０ｍＭ、約６５ｍＭ～約２００ｍＭ、約６５ｍＭ～約１８０ｍＭ、約６５ｍＭ～約１６０ｍＭ、約６５ｍＭ～約１４０ｍＭ、約６５ｍＭ～約１２０ｍＭ、約６５ｍＭ～約１００ｍＭ、約６５ｍＭ～約９５ｍＭ、約６５ｍＭ～約９０ｍＭ、約６５ｍＭ～約８５ｍＭ、約６５ｍＭ～約８０ｍＭ、約６５ｍＭ～約７５ｍＭ、約６５ｍＭ～約７０ｍＭ、約７０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約７０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約７０ｍＭ～約４００ｍＭ、約７０ｍＭ～約３８０ｍＭ、約７０ｍＭ～約３６０ｍＭ、約７０ｍＭ～約３４０ｍＭ、約７０ｍＭ～約３２０ｍＭ、約７０ｍＭ～約３００ｍＭ、約７０ｍＭ～約２８０ｍＭ、約７０ｍＭ～約２６０ｍＭ、約７０ｍＭ～約２４０ｍＭ、約７０ｍＭ～約２２０ｍＭ、約７０ｍＭ～約２００ｍＭ、約７０ｍＭ～約１８０ｍＭ、約７０ｍＭ～約１６０ｍＭ、約７０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約７０ｍＭ～約１２０ｍＭ、約７０ｍＭ～約１００ｍＭ、約７０ｍＭ～約９５ｍＭ、約７０ｍＭ～約９０ｍＭ、約７０ｍＭ～約８５ｍＭ、約７０ｍＭ～約８０ｍＭ、約７０ｍＭ～約７５ｍＭ、約７５ｍＭ～約４４５ｍＭ、約７５ｍＭ～約４２５ｍＭ、約７５ｍＭ～約４００ｍＭ、約７５ｍＭ～約３８０ｍＭ、約７５ｍＭ～約３６０ｍＭ、約７５ｍＭ～約３４０ｍＭ、約７５ｍＭ～約３２０ｍＭ、約７５ｍＭ～約３００ｍＭ、約７５ｍＭ～約２８０ｍＭ、約７５ｍＭ～約２６０ｍＭ、約７５ｍＭ～約２４０ｍＭ、約７５ｍＭ～約２２０ｍＭ、約７５ｍＭ～約２００ｍＭ、約７５ｍＭ～約１８０ｍＭ、約７５ｍＭ～約１６０ｍＭ、約７５ｍＭ～約１４０ｍＭ、約７５ｍＭ～約１２０ｍＭ、約７５ｍＭ～約１００ｍＭ、約７５ｍＭ～約９５ｍＭ、約７５ｍＭ～約９０ｍＭ、約７５ｍＭ～約８５ｍＭ、約７５ｍＭ～約８０ｍＭ、約８０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約８０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約８０ｍＭ～約４００ｍＭ、約８０ｍＭ～約３８０ｍＭ、約８０ｍＭ～約３６０ｍＭ、約８０ｍＭ～約３４０ｍＭ、約８０ｍＭ～約３２０ｍＭ、約８０ｍＭ～約３００ｍＭ、約８０ｍＭ～約２８０ｍＭ、約８０ｍＭ～約２６０ｍＭ、約８０ｍＭ～約２４０ｍＭ、約８０ｍＭ～約２２０ｍＭ、約８０ｍＭ～約２００ｍＭ、約８０ｍＭ～約１８０ｍＭ、約８０ｍＭ～約１６０ｍＭ、約８０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約８０ｍＭ～約１２０ｍＭ、約８０ｍＭ～約１００ｍＭ、約８０ｍＭ～約９５ｍＭ、約８０ｍＭ～約９０ｍＭ、約８０ｍＭ～約８５ｍＭ、約８５ｍＭ～約４４５ｍＭ、約８５ｍＭ～約４２５ｍＭ、約８５ｍＭ～約４００ｍＭ、約８５ｍＭ～約３８０ｍＭ、約８５ｍＭ～約３６０ｍＭ、約８５ｍＭ～約３４０ｍＭ、約８５ｍＭ～約３２０ｍＭ、約８５ｍＭ～約３００ｍＭ、約８５ｍＭ～約２８０ｍＭ、約８５ｍＭ～約２６０ｍＭ、約８５ｍＭ～約２４０ｍＭ、約８５ｍＭ～約２２０ｍＭ、約８５ｍＭ～約２００ｍＭ、約８５ｍＭ～約１８０ｍＭ、約８５ｍＭ～約１６０ｍＭ、約８５ｍＭ～約１４０ｍＭ、約８５ｍＭ～約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ～約１００ｍＭ、約８５ｍＭ～約９５ｍＭ、約８５ｍＭ～約９０ｍＭ、約９０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約９０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約９０ｍＭ～約４００ｍＭ、約９０ｍＭ～約３８０ｍＭ、約９０ｍＭ～約３６０ｍＭ、約９０ｍＭ～約３４０ｍＭ、約９０ｍＭ～約３２０ｍＭ、約９０ｍＭ～約３００ｍＭ、約９０ｍＭ～約２８０ｍＭ、約９０ｍＭ～約２６０ｍＭ、約９０ｍＭ～約２４０ｍＭ、約９０ｍＭ～約２２０ｍＭ、約９０ｍＭ～約２００ｍＭ、約９０ｍＭ～約１８０ｍＭ、約９０ｍＭ～約１６０ｍＭ、約９０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約９０ｍＭ～約１２０ｍＭ、約９０ｍＭ～約１００ｍＭ、約９０ｍＭ～約９５ｍＭ、約９５ｍＭ～約４４５ｍＭ、約９５ｍＭ～約４２５ｍＭ、約９５ｍＭ～約４００ｍＭ、約９５ｍＭ～約３８０ｍＭ、約９５ｍＭ～約３６０ｍＭ、約９５ｍＭ～約３４０ｍＭ、約９５ｍＭ～約３２０ｍＭ、約９５ｍＭ～約３００ｍＭ、約９５ｍＭ～約２８０ｍＭ、約９５ｍＭ～約２６０ｍＭ、約９５ｍＭ～約２４０ｍＭ、約９５ｍＭ～約２２０ｍＭ、約９５ｍＭ～約２００ｍＭ、約９５ｍＭ～約１８０ｍＭ、約９５ｍＭ～約１６０ｍＭ、約９５ｍＭ～約１４０ｍＭ、約９５ｍＭ～約１２０ｍＭ、約９５ｍＭ～約１００ｍＭ、約１００ｍＭ～約４４５ｍＭ、約１００ｍＭ～約４２５ｍＭ、約１００ｍＭ～約４００ｍＭ、約１００ｍＭ～約３８０ｍＭ、約１００ｍＭ～約３６０ｍＭ、約１００ｍＭ～約３４０ｍＭ、約１００ｍＭ～約３２０ｍＭ、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ、約１００ｍＭ～約２８０ｍＭ、約１００ｍＭ～約２６０ｍＭ、約１００ｍＭ～約２４０ｍＭ、約１００ｍＭ～約２２０ｍＭ、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１８０ｍＭ、約１００ｍＭ～約１６０ｍＭ、約１００ｍＭ～約１４０ｍＭ、約１００ｍＭ～約１２０ｍＭ、約１２０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約１２０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約１２０ｍＭ～約４００ｍＭ、約１２０ｍＭ～約３８０ｍＭ、約１２０ｍＭ～約３６０ｍＭ、約１２０ｍＭ～約３４０ｍＭ、約１２０ｍＭ～約３２０ｍＭ、約１２０ｍＭ～約３００ｍＭ、約１２０ｍＭ～約２８０ｍＭ、約１２０ｍＭ～約２６０ｍＭ、約１２０ｍＭ～約２４０ｍＭ、約１２０ｍＭ～約２２０ｍＭ、約１２０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１２０ｍＭ～約１８０ｍＭ、約１２０ｍＭ～約１６０ｍＭ、約１２０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約１４０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約１４０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約１４０ｍＭ～約４００ｍＭ、約１４０ｍＭ～約３８０ｍＭ、約１４０ｍＭ～約３６０ｍＭ、約１４０ｍＭ～約３４０ｍＭ、約１４０ｍＭ～約３２０ｍＭ、約１４０ｍＭ～約３００ｍＭ、約１４０ｍＭ～約２８０ｍＭ、約１４０ｍＭ～約２６０ｍＭ、約１４０ｍＭ～約２４０ｍＭ、約１４０ｍＭ～約２２０ｍＭ、約１４０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１４０ｍＭ～約１８０ｍＭ、約１４０ｍＭ～約１６０ｍＭ、約１６０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約１６０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約１６０ｍＭ～約４００ｍＭ、約１６０ｍＭ～約３８０ｍＭ、約１６０ｍＭ～約３６０ｍＭ、約１６０ｍＭ～約３４０ｍＭ、約１６０ｍＭ～約３２０ｍＭ、約１６０ｍＭ～約３００ｍＭ、約１６０ｍＭ～約２８０ｍＭ、約１６０ｍＭ～約２６０ｍＭ、約１６０ｍＭ～約２４０ｍＭ、約１６０ｍＭ～約２２０ｍＭ、約１６０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１６０ｍＭ～約１８０ｍＭ、約１８０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約１８０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約１８０ｍＭ～約４００ｍＭ、約１８０ｍＭ～約３８０ｍＭ、約１８０ｍＭ～約３６０ｍＭ、約１８０ｍＭ～約３４０ｍＭ、約１８０ｍＭ～約３２０ｍＭ、約１８０ｍＭ～約３００ｍＭ、約１８０ｍＭ～約２８０ｍＭ、約１８０ｍＭ～約２６０ｍＭ、約１８０ｍＭ～約２４０ｍＭ、約１８０ｍＭ～約２２０ｍＭ、約１８０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２００ｍＭ～約４４５ｍＭ、約２００ｍＭ～約４２５ｍＭ、約２００ｍＭ～約４００ｍＭ、約２００ｍＭ～約３８０ｍＭ、約２００ｍＭ～約３６０ｍＭ、約２００ｍＭ～約３４０ｍＭ、約２００ｍＭ～約３２０ｍＭ、約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、約２００ｍＭ～約２８０ｍＭ、約２００ｍＭ～約２６０ｍＭ、約２００ｍＭ～約２４０ｍＭ、約２００ｍＭ～約２２０ｍＭ、約２２０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約２２０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約２２０ｍＭ～約４００ｍＭ、約２２０ｍＭ～約３８０ｍＭ、約２２０ｍＭ～約３６０ｍＭ、約２２０ｍＭ～約３４０ｍＭ、約２２０ｍＭ～約３２０ｍＭ、約２２０ｍＭ～約３００ｍＭ、約２２０ｍＭ～約２８０ｍＭ、約２２０ｍＭ～約２６０ｍＭ、約２２０ｍＭ～約２４０ｍＭ、約２４０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約２４０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約２４０ｍＭ～約４００ｍＭ、約２４０ｍＭ～約３８０ｍＭ、約２４０ｍＭ～約３６０ｍＭ、約２４０ｍＭ～約３４０ｍＭ、約２４０ｍＭ～約３２０ｍＭ、約２４０ｍＭ～約３００ｍＭ、約２４０ｍＭ～約２８０ｍＭ、約２４０ｍＭ～約２６０ｍＭ、約２６０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約２６０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約２６０ｍＭ～約４００ｍＭ、約２６０ｍＭ～約３８０ｍＭ、約２６０ｍＭ～約３６０ｍＭ、約２６０ｍＭ～約３４０ｍＭ、約２６０ｍＭ～約３２０ｍＭ、約２６０ｍＭ～約３００ｍＭ、約２６０ｍＭ～約２８０ｍＭ、約２８０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約２８０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約２８０ｍＭ～約４００ｍＭ、約２８０ｍＭ～約３８０ｍＭ、約２８０ｍＭ～約３６０ｍＭ、約２８０ｍＭ～約３４０ｍＭ、約２８０ｍＭ～約３２０ｍＭ、約２８０ｍＭ～約３００ｍＭ、約３００ｍＭ～約４４５ｍＭ、約３００ｍＭ～約４２５ｍＭ、約３００ｍＭ～約４００ｍＭ、約３００ｍＭ～約３８０ｍＭ、約３００ｍＭ～約３６０ｍＭ、約３００ｍＭ～約３４０ｍＭ、約３００ｍＭ～約３２０ｍＭ、約３２０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約３２０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約３２０ｍＭ～約４００ｍＭ、約３２０ｍＭ～約３８０ｍＭ、約３２０ｍＭ～約３６０ｍＭ、約３２０ｍＭ～約３４０ｍＭ、約３４０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約３４０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約３４０ｍＭ～約４００ｍＭ、約３４０ｍＭ～約３８０ｍＭ、約３４０ｍＭ～約３６０ｍＭ、約３６０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約３６０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約３６０ｍＭ～約４００ｍＭ、約３６０ｍＭ～約３８０ｍＭ、３８０ｍＭ～約４４５ｍＭ、約３８０ｍＭ～約４２５ｍＭ、約３８０ｍＭ～約４００ｍＭ、４００ｍＭ～約４４５ｍＭ、約４００ｍＭ～約４２５ｍＭ、もしくは約４２５ｍＭ～約４４５ｍＭ）のミオイノシトール（またはミオイノシトール前駆体（例えば、１Ｄ－ミオイノシトール３－ホスフェートおよび１Ｄ－ミオイノシトール１－ホスフェート）もしくはミオイノシトール分解産物）（例えば、グルクロン酸））と、任意選択的に、１つ以上（例えば、２、３、または４つ）のトランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ）（例えば、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのトランスフェリン（例えば、ヒトアポトランスフェリン、ヒトホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ））、インスリン（例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのインスリン（例えば、組換えヒトインスリン））、ＳＣＦ（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＳＣＦ（例えば、組換えヒトＳＣＦ））、およびＥＰＯまたはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なＥＰＯ模倣ペプチドのうちのいずれか））とを含む。本明細書に記載の第３の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第３の培養培地は、ＩＭＤＭを含む。本明細書に記載の第３の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．１％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ（例えば、約０．１％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約５．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約０．５

％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約５．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約５．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約５．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約８．０００％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約５．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約５．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約５．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約５．０ ％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約５．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約７．０００％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約８．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約８．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約８．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約８．０００％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約８．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約８．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約８．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約９．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約９．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、または約９．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ）の血清（例えば、ヒトＡＢ血清）を含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、０．１％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ（例えば、約０．１％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、または約４．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ）のヒト血漿を含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ（例えば、約１Ｕ／ｍＬ～約４Ｕ／ｍＬ、約１Ｕ／ｍＬ～約３Ｕ／ｍＬ、約１Ｕ／ｍＬ～約２Ｕ／ｍＬ、約２Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ、約２Ｕ／ｍＬ～約４Ｕ／ｍＬ、約２Ｕ／ｍＬ～約３Ｕ／ｍＬ、約３Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ、約３Ｕ／ｍＬ～約４Ｕ／ｍＬ、または約４Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ）のヘパリンを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．１％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ（例えば、約０．１％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約０．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、または約２．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ）のＰｏｌｏｘａｍｅｒ－１８８（Ｐ１８８）を含む。
本明細書に記載の第３の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭ（例えば、約１ｍＭ～約７ｍＭ、約１ｍＭ～約６ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、約１ｍＭ～約４ｍＭ、約１ｍＭ～約３ｍＭ、約１ｍＭ～約２ｍＭ、約２ｍＭ～約８ｍＭ、約２ｍＭ～約７ｍＭ、約２ｍＭ～約６ｍＭ、約２ｍＭ～約５ｍＭ、約２ｍＭ～約４ｍＭ、約２ｍＭ～約３ｍＭ、約３ｍＭ～約８ｍＭ、約３ｍＭ～約７ｍＭ、約３ｍＭ～約６ｍＭ、約３ｍＭ～約５ｍＭ、約３ｍＭ～約４ｍＭ、約４ｍＭ～約８ｍＭ、約４ｍＭ～約７ｍＭ、約４ｍＭ～約６ｍＭ、約４ｍＭ～約５ｍＭ、約５ｍＭ～約８ｍＭ、約５ｍＭ～約７ｍＭ、約５ｍＭ～約６ｍＭ、約６ｍＭ～約８ｍＭ、約６ｍＭ～約７ｍＭ、または約７ｍＭ～約８ｍＭ）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、１４０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、１６０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、１８０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、３５０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３５０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約３５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、または４５０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ）（例えば、ヒトアポトランスフェリン、ヒトホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ）を含む。
いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦ（例えば、組換えヒトＳＣＦ）を含む。
いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ

～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、４２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、４４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、または約４８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチドを含む。ＥＰＯ模倣ペプチドの非限定的な例は、本明細書に記載される。ＥＰＯ模倣ペプチドの追加の例は、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約０．１ μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１ μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２ μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約５ μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、または約４５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリン（例えば、ヒトインスリン）を含む。
いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、例えば、化学的に定義された液体培養培地、動物成分を含まない液体培養培地、または化学的に定義された動物成分を含まない液体培養培地、および／または無血清液体培養培地とすることができる。
培養ステップＤ
灌流培養
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的なバイオリアクター（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する灌流バイオリアクター）のうちのいずれか内の本明細書に記載の第３の細胞培養物のうちのいずれか））を約５日～約２０日間（例えば、約５日～約１９日間、約５日～約１８日間、約５日～約１７日間、約５日～約１６日間、約５日～約１５日間、約５日～約１４日間、約５日～約１３日間、約５日～約１２日間、約５日～約１１日間、約５日～約１０日間、約５日～約９日間、約５日～約８日間、約５日～約７日間、約５日～約６日間、約６日～約２０日間、約６日～約１９日間、約６日～約１８日間、約６日～約１７日間、約６日～約１６日間、約６日～約１５日間、約６日～約１４日間、約６日～約１３日間、約６日～約１２日間、約６日～約１１日間、約６日～約１０日間、約６日～約９日間、約６日～約８日間、約６日～約７日間、約７日～約２０日間、約７日～約１９日間、約７日～約１８日間、約７日～約１７日間、約７日～約１６日間、約７日～約１５日間、約７日～約１４日間、約７日～約１３日間、約７日～約１２日間、約７日～約１１日間、約７日～約１０日間、約７日～約９日間、約７日～約８日間、約８日～約２０日間、約８日～約１９日間、約８日～約１８日間、約８日～約１７日間、約８日～約１６日間、約８日～約１５日間、約８日～約１４日間、約８日～約１３日間、約８日～約１２日間、約８日～約１１日間、約８日～約１０日間、約８日～約９日間、約９日～約２０日間、約９日～約１９日間、約９日～約１８日間、約９日～約１７日間、約９日～約１６日間、約９日～約１５日間、約９日～約１４日間、約９日～約１３日間、約９日～約１２日間、約９日～約１１日間、約９日～約１０日間、約１０日～約２０日間、約１０日～約１９日間、約１０日～約１８日間、約１０日～約１７日間、約１０日～約１６日間、約１０日～約１５日間、約１０日～約１４日間、約１０日～約１３日間、約１０日～約１２日間、約１０日～約１１日間、約１１日～約２０日間、約１１日～約１９日間、約１１日～約１８日間、約１１日～約１７日間、約１１日～約１６日間、約１１日～約１５日間、約１１日～約１４日間、約１１日～約１３日間、約１１日～約１２日間、約１２日～約２０日間、約１２日～約１９日間、約１２日～約１８日間、約１２日～約１７日間、約１２日～約１６日間、約１２日～約１５日間、約１２日～約１４日間、約１２日～約１３日間、約１３日～約２０日間、約１３日～約１９日間、約１３日～約１８日間、約１３日～約１７日間、約１３日～約１６日間、約１３日～約１５日間、約１３日～約１４日間、約１４日～約２０日間、約１４日～約１９日間、約１４日～約１８日間、約１４日～約１７日間、約１４日～約１６日間、約１４日～約１５日間、約１５日～約２０日間、約１５日～約１９日間、約１５日～約１８日間、約１５日～約１７日間、約１５日～約１６日間、約１６日～約２０日間、約１６日～約１９日間、約１６日～約１８日間、約１６日～約１７日間、約１７日～約２０日間、約１７日～約１９日間、約１７日～約１８日間、約１８日～約２０日間、約１８日～約１９日間、または約１９日～約２０日間）灌流培養することを含み、ステップ（ｄ）の後に、第３の培養培地は、除核赤芽球細胞（例えば、本明細書に記載の例示的な除核赤芽球細胞のうちのいずれか）を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載のバイオリアクターのうちのいずれか内の）第３の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３（例えば、本明細書に記載の範囲の部分範囲のうちのいずれか）のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約１ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約０．５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約０．１ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約０．５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約５０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約５０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、または約５５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、灌流速度は、経時的に増加する。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、約０．１ＶＶＤ～約３ＶＶＤ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の灌流速度を使用して行うことができる。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、（ｉ）第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のうちのいずれか）の追加体積を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に第１の期間にわたって添加することと、（ｉｉ）第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のうちのいずれか）の追加体積を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に第２の期間にわたって添加することとを含む。
いくつかの実施形態では、（ｉ）の第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のうちのいずれか）の追加体積は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に第１の期間にわたって連続的に添加される、および／または（ｉｉ）の第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のうちのいずれか）の追加体積は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に第２の期間にわたって連続的に添加される。
いくつかの実施形態では、（ｉ）の第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のうちのいずれか）の追加体積は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に第１の期間にわたって定期的に（例えば、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加される、および／または（ｉｉ）（ｉｉ）の第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のうちのいずれか）の追加体積は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に第２の期間にわたって定期的に（例えば、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加される。
培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３または第４の培養培地のうちのいずれか）の添加は、機械的に、例えば、蠕動ポンプを使用して、または手動で（例えば、滅菌ピペット操作によって）行うことができる。
培養培地（例えば、実質的に無細胞培養培地）の除去は、機械的に、例えば、接線流濾過（ＴＦＦ）もしくは交互流濾過（ＡＴＦ）を使用して、または手動で（例えば、滅菌ピペット操作によって）行うことができる。接線流濾過の追加の非限定的な態様は、本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、（ｉ）の第１の期間は、約１日～約１２日間、約１日～約１１日間、約１日～約１０日間、約１日～約９日間、約１日～約８日間、約１日～約７日間、約１日～約６日間、約１日～約５日間、約１日～約４日間、約１日～約３日間、約１日～約２日間、約２日～約１２日間、約２日～約１１日間、約２日～約１０日間、約２日～約９日間、約２日～約８日間、約２日～約７日間、約２日～約６日間、約２日～約５日間、約２日～約４日間、約２日～約３日間、約３日～約１２日間、約３日～約１１日間、約３日～約１０日間、約３日～約９日間、約３日～約８日間、約３日～約７日間、約３日～約６日間、約３日～約５日間、約３日～約４日間、約４日～約１２日間、約４日～約１１日間、約４日～約１０日間、約４日～約９日間、約４日～約８日間、約４日～約７日間、約４日～約６日間、約４日～約５日間、約５日～約１２日間、約５日～約１１日間、約５日～約１０日間、約５日～約９日間、約５日～約８日間、約５日～約７日間、約５日～約６日間、約６日～約１２日間、約６日～約１１日間、約６日～約１０日間、約６日～約９日間、約６日～約８日間、約６日～約７日間、約７日～約１２日間、約７日～約１１日間、約７日～約１０日間、約７日～約９日間、約７日～約８日間、約８日～約１２日間、約８日～約１１日間、約８日～約１０日間、約８日～約９日間、約９日～約１２日間、約９日～約１１日間、約９日～約１０日間、約１０日～約１２日間、約１０日～約１１日間、または約１１日～約１２日間である。
いくつかの実施形態では、（ｉｉ）の第２の期間は、約１日～約１２日間、約１日～約１１日間、約１日～約１０日間、約１日～約９日間、約１日～約８日間、約１日～約７日間、約１日～約６日間、約１日～約５日間、約１日～約４日間、約１日～約３日間、約１日～約２日間、約２日～約１２日間、約２日～約１１日間、約２日～約１０日間、約２日～約９日間、約２日～約８日間、約２日～約７日間、約２日～約６日間、約２日～約５日間、約２日～約４日間、約２日～約３日間、約３日～約１２日間、約３日～約１１日間、約３日～約１０日間、約３日～約９日間、約３日～約８日間、約３日～約７日間、約３日～約６日間、約３日～約５日間、約３日～約４日間、約４日～約１２日間、約４日～約１１日間、約４日～約１０日間、約４日～約９日間、約４日～約８日間、約４日～約７日間、約４日～約６日間、約４日～約５日間、約５日～約１２日間、約５日～約１１日間、約５日～約１０日間、約５日～約９日間、約５日～約８日間、約５日～約７日間、約５日～約６日間、約６日～約１２日間、約６日～約１１日間、約６日～約１０日間、約６日～約９日間、約６日～約８日間、約６日～約７日間、約７日～約１２日間、約７日～約１１日間、約７日～約１０日間、約７日～約９日間、約７日～約８日間、約８日～約１２日間、約８日～約１１日間、約８日～約１０日間、約８日～約９日間、約９日～約１２日間、約９日～約１１日間、約９日～約１０日間、約１０日～約１２日間、約１０日～約１１日間、または約１１日～約１２日間である。
これらの方法のいくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約０．０１ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ（例えば、または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）または約５０μＭ～約４４５ｍＭ（例えば、または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）のミオイノシトール（またはミオイノシトール前駆体もしくはミオイノシトール分解産物）と、任意選択的に、トランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ）（例えば、約１００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのトランスフェリン（例えば、ヒトアポトランスフェリン、ヒトホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ））、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド）、インスリン（例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのインスリン）のうちの１つ以上（例えば、１、２、または３つ）とを含む。
本明細書に記載の第４の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第４の培養培地は、ＩＭＤＭを含む。本明細書に記載の第４の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約０．１％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ（例えば、約０．１％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約５．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約８．０００％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約５．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約８．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約８．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約８．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約８．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約８．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約８．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約８．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約９．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約９．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、または約９．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ）の血清（例えば、ヒトＡＢ血清）を含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、０．１％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ（例えば、約０．１％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、または約４．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ）のヒト血漿を含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ（例えば、約１Ｕ／ｍＬ～約４Ｕ／ｍＬ、約１Ｕ／ｍＬ～約３Ｕ／ｍＬ、約１Ｕ／ｍＬ～約２Ｕ／ｍＬ、約２Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ、約２Ｕ／ｍＬ～約４Ｕ／ｍＬ、約２Ｕ／ｍＬ～約３Ｕ／ｍＬ、約３Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ、約３Ｕ／ｍＬ～約４Ｕ／ｍＬ、または約４Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ）のヘパリンを含む。いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約０．１％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ（例えば、約０．１％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ

～約２．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約０．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、または約２．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ）のＰｏｌｏｘａｍｅｒ－１８８（Ｐ１８８）を含む。
いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭ（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約７００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約６００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約７００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約６００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約７００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約６００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約７００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約６００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ，５００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約７００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約６００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約７００μｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１．４ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１．４ｍｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．４ｍｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．４ｍｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．６ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１．６ｍｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、または約１．８ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ）（例えば、ヒトアポトランスフェリン、ヒトホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ）を含む。
いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ

～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、４２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、４４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、または約４８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチドを含む。ＥＰＯ模倣ペプチドの非限定的な例は、本明細書に記載される。ＥＰＯ模倣ペプチドの追加の例は、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約０．１ μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１ μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２ μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約５ μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ 約１５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、または約４５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリン（例えば、ヒトインスリン）を含む。
いくつかの実施形態では、灌流培養は、接線濾過（例えば、接線流濾過（ＴＦＦ）または交互接線濾過（ＡＴＦ））の使用を含む。いくつかの実施形態では、接線濾過（例えば、ＴＦＦまたはＡＴＦ）は、約１０ｎｍ～約６．０μＭ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の平均細孔径を有する１つ以上のフィルターの使用を含む。
いくつかの実施形態では、第４の培養培地は、例えば、化学的に定義された液体培養培地、動物成分を含まない液体培養培地、または化学的に定義された動物成分を含まない液体培養培地、および／または無血清液体培養培地とすることができる。
いくつかの実施形態では、第３の細胞培養物の灌流は、第１の細胞培養物が特定の目標細胞密度、例えば、約１．０×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約２．０×１０６細胞／ｍＬ、約２．５×１０６細胞／ｍＬ、約３．０×１０６細胞／ｍＬ、約３．５×１０６細胞／ｍＬ、約４．０×１０６細胞／ｍＬ、約４．５×１０６細胞／ｍＬ、約５．０×１０６細胞／ｍＬ、約５．５×１０６細胞／ｍＬ、約６．０×１０６細胞／ｍＬ、約６．５×１０６細胞／ｍＬ、約７．０×１０６細胞／ｍＬ、約７．５×１０６細胞／ｍＬ、約８．０×１０６細胞／ｍＬ、約８．５×１０６細胞／ｍＬ、約９．０×１０６細胞／ｍＬ、約９．５×１０６細胞／ｍＬまたは約１．０×１０７細胞／ｍＬに達した時点で開始する。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養は、約８日～約１５日間、約８日～約１４日間、約８日～約１３日間、約８日～約１２日間、約８日～約１１日間、約８日～約１０日間、約８日～約９日間、約９日～約１５日間、約９日～約１４日間、約９日～約１３日間、約９日～約１２日間、約９日～約１１日間、約９日～約１０日間、約１０日～約１５日間、約１０日～約１４日間、約１０日～約１３日間、約１０日～約１２日間、約１０日～約１１日間、約１１日～約１５日間、約１１日～約１４日間、約１１日～約１３日間、約１１日～約１２日間、約１２日～約１５日間、約１２日～約１４日間、約１２日～約１３日間、約１３日～約１５日間、約１３日～約１４日間、または約１４日～約１５日間行われる。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）により、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ、約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬの細胞密度がもたらされる。
回分または流加培養
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振盪フラスコ、振盪管、培養バッグ、またはバイオリアクターのうちのいずれか内の本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）を約５日～約２０日間（例えば、約５日～約１９日間、約５日～約１８日間、約５日～約１７日間、約５日～約１６日間、約５日～約１５日間、約５日～約１４日間、約５日～約１３日間、約５日～約１２日間、約５日～約１１日間、約５日～約１０日間、約５日～約９日間、約５日～約８日間、約５日～約７日間、約５日～約６日間、約６日～約２０日間、約６日～約１９日間、約６日～約１８日間、約６日～約１７日間、約６日～約１６日間、約６日～約１５日間、約６日～約１４日間、約６日～約１３日間、約６日～約１２日間、約６日～約１１日間、約６日～約１０日間、約６日～約９日間、約６日～約８日間、約６日～約７日間、約７日～約２０日間、約７日～約１９日間、約７日～約１８日間、約７日～約１７日間、約７日～約１６日間、約７日～約１５日間、約７日～約１４日間、約７日～約１３日間、約７日～約１２日間、約７日～約１１日間、約７日～約１０日間、約７日～約９日間、約７日～約８日間、約８日～約２０日間、約８日～約１９日間、約８日～約１８日間、約８日～約１７日間、約８日～約１６日間、約８日～約１５日間、約８日～約１４日間、約８日～約１３日間、約８日～約１２日間、約８日～約１１日間、約８日～約１０日間、約８日～約９日間、約９日～約２０日間、約９日～約１９日間、約９日～約１８日間、約９日～約１７日間、約９日～約１６日間、約９日～約１５日間、約９日～約１４日間、約９日～約１３日間、約９日～約１２日間、約９日～約１１日間、約９日～約１０日間、約１０日～約２０日間、約１０日～約１９日間、約１０日～約１８日間、約１０日～約１７日間、約１０日～約１６日間、約１０日～約１５日間、約１０日～約１４日間、約１０日～約１３日間、約１０日～約１２日間、約１０日～約１１日間、約１１日～約２０日間、約１１日～約１９日間、約１１日～約１８日間、約１１日～約１７日間、約１１日～約１６日間、約１１日～約１５日間、約１１日～約１４日間、約１１日～約１３日間、約１１日～約１２日間、約１２日～約２０日間、約１２日～約１９日間、約１２日～約１８日間、約１２日～約１７日間、約１２日～約１６日間、約１２日～約１５日間、約１２日～約１４日間、約１２日～約１３日間、約１３日～約２０日間、約１３日～約１９日間、約１３日～約１８日間、約１３日～約１７日間、約１３日～約１６日間、約１３日～約１５日間、約１３日～約１４日間、約１４日～約２０日間、約１４日～約１９日間、約１４日～約１８日間、約１４日～約１７日間、約１４日～約１６日間、約１４日～約１５日間、約１５日～約２０日間、約１５日～約１９日間、約１５日～約１８日間、約１５日～約１７日間、約１５日～約１６日間、約１６日～約２０日間、約１６日～約１９日間、約１６日～約１８日間、約１６日～約１７日間、約１７日～約２０日間、約１７日～約１９日間、約１７日～約１８日間、約１８日～約２０日間、約１８日～約１９日間、または約１９日～約２０日間）回分または流加培養することを含み、ステップ（ｄ）の後に、第３の培養培地は、除核赤芽球細胞（例えば、本明細書に記載の例示的な除核赤芽球細胞のうちのいずれか）を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、バイオリアクター（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的なバイオリアクターのうちのいずれか）内に配置された第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）を回分または流加培養することを含む。かかる実施形態では、ステップ（ｄ）は、バイオリアクター内の第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）のＰ／Ｖ値でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、振盪フラスコ（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振盪フラスコのうちのいずれか）内に配置された第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）を回分または流加培養することを含む。かかる実施形態では、ステップ（ｄ）は、振盪フラスコ内の第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）を約０．１×ｇ～約５０×ｇ（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、振盪管（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振盪管のうちのいずれか（例えば、円錐容器））内に配置された第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）を回分または流加培養することを含む。かかる実施形態では、ステップ（ｄ）は、振盪管内の第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）を約０．１×ｇ～約５０×ｇ（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、培養バッグ（例えば、本明細書に記載の例示的な体積のうちのいずれかを有する本明細書に記載の例示的な培養バッグのうちのいずれか）内に配置された第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）を回分または流加培養することを含む。かかる実施形態では、ステップ（ｄ）は、培養バッグ内の第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）を１０揺動サイクル／分～約５０揺動サイクル／分（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の揺動速度でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）を回分培養することを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）を流加培養することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の流加培養は、第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のうちのいずれか）および／または第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のうちのいずれか）の追加体積を経時的に第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に添加することを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のうちのいずれか）および／または第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のうちのいずれか）の追加体積は、経時的に第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に連続的に添加される。いくつかの実施形態では、第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）および／または第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のうちのいずれか）は、経時的に第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に定期的に（例えば、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の直後の第３の細胞培養物の体積の約０．１倍～約１０倍（例えば、約０．１倍～約９．５倍、約０．１倍～約９．０倍、約０．１倍～約８．５倍、約０．１倍～約８．０倍、約０．１倍～約７．５倍、約０．１倍～約７．０倍、約０．１倍～約６．５倍、約０．１倍～約６．０倍、約０．１倍～約５．５倍、約０．１倍～約５．０倍、約０．１倍～約４．５倍、約０．１倍～約４．０倍、約０．１倍～約３．５倍、約０．１倍～約３．０倍、約０．１倍～約２．５倍、約０．１倍～約２．０倍、約０．１倍～約１．５倍、約０．１倍～約１．０倍、約０．１倍～約０．５倍、約０．１倍～約０．３倍、約０．１倍～約０．２倍、約０．２倍～約１０倍、約０．２倍～約９．５倍、約０．２倍～約９．０倍、約０．２倍～約８．５倍、約０．２倍～約８．０倍、約０．２倍～約７．５倍、約０．２倍～約７．０倍、約０．２倍～約６．５倍、約０．２倍～約６．０倍、約０．２倍～約５．５倍、約０．２倍～約５．０倍、約０．２倍～約４．５倍、約０．２倍～約４．０倍、約０．２倍～約３．５倍、約０．２倍～約３．０倍、約０．２倍～約２．５倍、約０．２倍～約２．０倍、約０．２倍～約１．５倍、約０．２倍～約１．０倍、約０．２倍～約０．５倍、約０．２倍～約０．３倍、約０．３倍～約１０倍、約０．３倍～約９．５倍、約０．３倍～約９．０倍、約０．３倍～約８．５倍、約０．３倍～約８．０倍、約０．３倍～約７．５倍、約０．３倍～約７．０倍、約０．３倍～約６．５倍、約０．３倍～約６．０倍、約０．３倍～約５．５倍、約０．３倍～約５．０倍、約０．３倍～約４．５倍、約０．３倍～約４．０倍、約０．３倍～約３．５倍、約０．３倍～約３．０倍、約０．３倍～約２．５倍、約０．３倍～約２．０倍、約０．３倍～約１．５倍、約０．３倍～約１．０倍、約０．３倍～約０．５倍、約０．５倍～約１０倍、約０．５倍～約９．５倍、約０．５倍～約９．０倍、約０．５倍～約８．５倍、約０．５倍～約８．０倍、約０．５倍～約７．５倍、約０．５倍～約７．０倍、約０．５倍～約６．５倍、約０．５倍～約６．０倍、約０．５倍～約５．５倍、約０．５倍～約５．０倍、約０．５倍～約４．５倍、約０．５倍～約４．０倍、約０．５倍～約３．５倍、約０．５倍～約３．０倍、約０．５倍～約２．５倍、約０．５倍～約２．０倍、約０．５倍～約１．５倍、約０．５倍～約１．０倍、約１．０倍～約１０倍、約１．０倍～約９．５倍、約１．０倍～約９．０倍、約１．０倍～約８．５倍、約１．０倍～約８．０倍、約１．０倍～約７．５倍、約１．０倍～約７．０倍、約１．０倍～約６．５倍、約１．０倍～約６．０倍、約１．０倍～約５．５倍、約１．０倍～約５．０倍、約１．０倍～約４．５倍、約１．０倍～約４．０倍、約１．０倍～約３．５倍、約１．０倍～約３．０倍、約１．０倍～約２．５倍、約１．０倍～約２．０倍、約１．０倍～約１．５倍、約１．５倍～約１０倍、約１．５倍～約９．５倍、約１．５倍～約９．０倍、約１．５倍～約８．５倍、約１．５倍～約８．０倍、約１．５倍～約７．５倍、約１．５倍～約７．０倍、約１．５倍～約６．５倍、約１．５倍～約６．０倍、約１．５倍～約５．５倍、約１．５倍～約５．０倍、約１．５倍～約４．５倍、約１．５倍～約４．０倍、約１．５倍～約３．５倍、約１．５倍～約３．０倍、約１．５倍～約２．５倍、約１．５倍～約２．０倍、約２．０倍～約１０倍、約２．０倍～約９．５倍、約２．０倍～約９．０倍、約２．０倍～約８．５倍、約２．０倍～約８．０倍、約２．０倍～約７．５倍、約２．０倍～約７．０倍、約２．０倍～約６．５倍、約２．０倍～約６．０倍、約２．０倍～約５．５倍、約２．０倍～約５．０倍、約２．０倍～約４．５倍、約２．０倍～約４．０倍、約２．０倍～約３．５倍、約２．０倍～約３．０倍、約２．０倍～約２．５倍、約２．５倍～約１０倍、約２．５倍～約９．５倍、約２．５倍～約９．０倍、約２．５倍～約８．５倍、約２．５倍～約８．０倍、約２．５倍～約７．５倍、約２．５倍～約７．０倍、約２．５倍～約６．５倍、約２．５倍～約６．０倍、約２．５倍～約５．５倍、約２．５倍～約５．０倍、約２．５倍～約４．５倍、約２．５倍～約４．０倍、約２．５倍～約３．５倍、約２．５倍～約３．０倍、約３．０倍～約１０倍、約３．０倍～約９．５倍、約３．０倍～約９．０倍、約３．０倍～約８．５倍、約３．０倍～約８．０倍、約３．０倍～約７．５倍、約３．０倍～約７．０倍、約３．０倍～約６．５倍、約３．０倍～約６．０倍、約３．０倍～約５．５倍、約３．０倍～約５．０倍、約３．０倍～約４．５倍、約３．０倍～約４．０倍、約３．０倍～約３．５倍、約３．５倍～約１０倍、約３．５倍～約９．５倍、約３．５倍～約９．０倍、約３．５倍～約８．５倍、約３．５倍～約８．０倍、約３．５倍～約７．５倍、約３．５倍～約７．０倍、約３．５倍～約６．５倍、約３．５倍～約６．０倍、約３．５倍～約５．５倍、約３．５倍～約５．０倍、約３．５倍～約４．５倍、約３．５倍～約４．０倍、約４．０倍～約１０倍、約４．０倍～約９．５倍、約４．０倍～約９．０倍、約４．０倍～約８．５倍、約４．０倍～約８．０倍、約４．０倍～約７．５倍、約４．０倍～約７．０倍、約４．０倍～約６．５倍、約４．０倍～約６．０倍、約４．０倍～約５．５倍、約４．０倍～約５．０倍、約４．０倍～約４．５倍、約４．５倍～約１０倍、約４．５倍～約９．５倍、約４．５倍～約９．０倍、約４．５倍～約８．５倍、約４．５倍～約８．０倍、約４．５倍～約７．５倍、約４．５倍～約７．０倍、約４．５倍～約６．５倍、約４．５倍～約６．０倍、約４．５倍～約５．５倍、約４．５倍～約５．０倍、約５．０倍～約１０倍、約５．０倍～約９．５倍、約５．０倍～約９．０倍、約５．０倍～約８．５倍、約５．０倍～約８．０倍、約５．０倍～約７．５倍、約５．０倍～約７．０倍、約５．０倍～約６．５倍、約５．０倍～約６．０倍、約５．０倍～約５．５倍、約５．５倍～約１０倍、約５．５倍～約９．５倍、約５．５倍～約９．０倍、約５．５倍～約８．５倍、約５．５倍～約８．０倍、約５．５倍～約７．５倍、約５．５倍～約７．０倍、約５．５倍～約６．５倍、約５．５倍～約６．０倍、約６．０倍～約１０倍、約６．０倍～約９．５倍、約６．０倍～約９．０倍、約６．０倍～約８．５倍、約６．０倍～約８．０倍、約６．０倍～約７．５倍、約６．０倍～約７．０倍、約６．０倍～約６．５倍、約６．５倍～約１０倍、約６．５倍～約９．５倍、約６．５倍～約９．０倍、約６．５倍～約８．５倍、約６．５倍～約８．０倍、約６．５倍～約７．５倍、約６．５倍～約７．０倍、約７．０倍～約１０倍、約７．０倍～約９．５倍、約７．０倍～約９．０倍、約７．０倍～約８．５倍、約７．０倍～約８．０倍、約７．０倍～約７．５倍、約７．５倍～約１０倍、約７．５倍～約９．５倍、約７．５倍～約９．０倍、約７．５倍～約８．５倍、約７．５倍～約８．０倍、約８．０倍～約１０倍、約８．０倍～約９．５倍、約８．０倍～約９．０倍、約８．０倍～約８．５倍、約８．５倍～約１０倍、約８．５倍～約９．５倍、約８．５倍～約９．０倍、約９．０倍～約１０倍、約９．０倍～約９．５倍、または約９．５倍～約１０倍）が各２４時間増分で添加される。いくつかの実施形態では、第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のうちのいずれか）および／または第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のうちのいずれか）の追加体積の第３の細胞培養物への添加は、第３の細胞培養物が特定の目標細胞密度、例えば、約１．０×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約２．０×１０６細胞／ｍＬ、約２．５×１０６細胞／ｍＬ、約３．０×１０６細胞／ｍＬ、約３．５×１０６細胞／ｍＬ、約４．０×１０６細胞／ｍＬ、約４．５×１０６細胞／ｍＬ、約５．０×１０６細胞／ｍＬ、約５．５×１０６細胞／ｍＬ、約６．０×１０６細胞／ｍＬ、約６．５×１０６細胞／ｍＬ、約７．０×１０６細胞／ｍＬ、約７．５×１０６細胞／ｍＬ、約８．０×１０６細胞／ｍＬ、約８．５×１０６細胞／ｍＬ、約９．０×１０６細胞／ｍＬ、約９．５×１０６細胞／ｍＬ、または約１．０×１０７細胞／ｍＬに達した時点で開始する。
いくつかの実施形態では、第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のうちのいずれか）は、１つ以上（例えば、２、３、または４つ）のトランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ）（例えば、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのトランスフェリン（例えば、ヒトアポトランスフェリン、ヒトホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ））、インスリン（例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのインスリン（例えば、組換えヒトインスリン））、ＳＣＦ（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＳＣＦ（例えば、組換えヒトＳＣＦ））、およびＥＰＯまたはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なＥＰＯ模倣ペプチドのうちのいずれか）を含む。本明細書に記載の第３の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約０．１％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の血清（例えば、ヒトＡＢ血清）を含む。本明細書に記載の第３の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約約１ｍＭ～約８ｍＭ（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の流加培養は、（ｉ）第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のうちのいずれか）の追加体積を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に第１の期間にわたって添加することと、（ｉｉ）第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のうちのいずれか）の追加体積を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に第２の期間にわたって添加することとを含む。
いくつかの実施形態では、（ｉ）の第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のうちのいずれか）の追加体積は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に第１の期間にわたって連続的に添加される、および／または（ｉｉ）の第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のうちのいずれか）の追加体積は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に第２の期間にわたって連続的に添加される。
いくつかの実施形態では、（ｉ）の第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のうちのいずれか）の追加体積は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に第１の期間にわたって定期的に（例えば、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加される、および／または（ｉｉ）（ｉｉ）の第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のうちのいずれか）の追加体積は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のうちのいずれか）に第２の期間にわたって定期的に（例えば、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加される。
培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のうちのいずれかおよび／または本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のうちのいずれか）の添加は、機械的に、例えば、蠕動ポンプを使用して、または手動で（例えば、滅菌ピペット操作によって）行うことができる。
いくつかの実施形態では、（ｉ）の第１の期間は、約１日～約１２日間、約１日～約１１日間、約１日～約１０日間、約１日～約９日間、約１日～約８日間、約１日～約７日間、約１日～約６日間、約１日～約５日間、約１日～約４日間、約１日～約３日間、約１日～約２日間、約２日～約１２日間、約２日～約１１日間、約２日～約１０日間、約２日～約９日間、約２日～約８日間、約２日～約７日間、約２日～約６日間、約２日～約５日間、約２日～約４日間、約２日～約３日間、約３日～約１２日間、約３日～約１１日間、約３日～約１０日間、約３日～約９日間、約３日～約８日間、約３日～約７日間、約３日～約６日間、約３日～約５日間、約３日～約４日間、約４日～約１２日間、約４日～約１１日間、約４日～約１０日間、約４日～約９日間、約４日～約８日間、約４日～約７日間、約４日～約６日間、約４日～約５日間、約５日～約１２日間、約５日～約１１日間、約５日～約１０日間、約５日～約９日間、約５日～約８日間、約５日～約７日間、約５日～約６日間、約６日～約１２日間、約６日～約１１日間、約６日～約１０日間、約６日～約９日間、約６日～約８日間、約６日～約７日間、約７日～約１２日間、約７日～約１１日間、約７日～約１０日間、約７日～約９日間、約７日～約８日間、約８日～約１２日間、約８日～約１１日間、約８日～約１０日間、約８日～約９日間、約９日～約１２日間、約９日～約１１日間、約９日～約１０日間、約１０日～約１２日間、約１０日～約１１日間、または約１１日～約１２日間である。
いくつかの実施形態では、（ｉｉ）の第２の期間は、約１日～約１２日間、約１日～約１１日間、約１日～約１０日間、約１日～約９日間、約１日～約８日間、約１日～約７日間、約１日～約６日間、約１日～約５日間、約１日～約４日間、約１日～約３日間、約１日～約２日間、約２日～約１２日間、約２日～約１１日間、約２日～約１０日間、約２日～約９日間、約２日～約８日間、約２日～約７日間、約２日～約６日間、約２日～約５日間、約２日～約４日間、約２日～約３日間、約３日～約１２日間、約３日～約１１日間、約３日～約１０日間、約３日～約９日間、約３日～約８日間、約３日～約７日間、約３日～約６日間、約３日～約５日間、約３日～約４日間、約４日～約１２日間、約４日～約１１日間、約４日～約１０日間、約４日～約９日間、約４日～約８日間、約４日～約７日間、約４日～約６日間、約４日～約５日間、約５日～約１２日間、約５日～約１１日間、約５日～約１０日間、約５日～約９日間、約５日～約８日間、約５日～約７日間、約５日～約６日間、約６日～約１２日間、約６日～約１１日間、約６日～約１０日間、約６日～約９日間、約６日～約８日間、約６日～約７日間、約７日～約１２日間、約７日～約１１日間、約７日～約１０日間、約７日～約９日間、約７日～約８日間、約８日～約１２日間、約８日～約１１日間、約８日～約１０日間、約８日～約９日間、約９日～約１２日間、約９日～約１１日間、約９日～約１０日間、約１０日～約１２日間、約１０日～約１１日間、または約１１日～約１２日間である。
これらの方法のいくつかの実施形態では、第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のうちのいずれか）は、トランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ）（例えば、約１００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのトランスフェリン（例えば、ヒトアポトランスフェリン、ヒトホロトランスフェリン、またはそれらの組み合わせ））、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、本明細書に記載の例示的なＥＰＯ模倣ペプチドのうちのいずれか）（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド）、インスリン（例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれかのインスリン）のうちの１つ以上（例えば、１、２、または３つ）を含む。本明細書に記載の第４の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約０．１％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の血清（例えば、ヒトＡＢ血清）を含む。本明細書に記載の第４の培養培地のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第４の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭ（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の回分または流加培養は、約８日～約１５日間、約８日～約１４日間、約８日～約１３日間、約８日～約１２日間、約８日～約１１日間、約８日～約１０日間、約８日～約９日間、約９日～約１５日間、約９日～約１４日間、約９日～約１３日間、約９日～約１２日間、約９日～約１１日間、約９日～約１０日間、約１０日～約１５日間、約１０日～約１４日間、約１０日～約１３日間、約１０日～約１２日間、約１０日～約１１日間、約１１日～約１５日間、約１１日～約１４日間、約１１日～約１３日間、約１１日～約１２日間、約１２日～約１５日間、約１２日～約１４日間、約１２日～約１３日間、約１３日～約１５日間、約１３日～約１４日間、または約１４日～約１５日間行われる。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）により、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ（または約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ、約５×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ、約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約８×１０６除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約１×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約２×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約４×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬ、約６×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ、約８×１０７除核赤芽球細胞／ｍＬ～約１×１０８除核赤芽球細胞／ｍＬの細胞密度がもたらされる。
除核赤芽球細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の除核赤芽球細胞（例えば、ヒト除核赤芽球細胞）は、１つ以上のマイナー血液型抗原、例えば、Ｌｅ（ａ－ｂ－）（Ｌｅｗｉｓ抗原式）、Ｆｙ（ａ－ｂ－）（Ｄｕｆｆｙ式）、Ｊｋ（ａ－ｂ－）（Ｋｉｄｄ式）、Ｍ－Ｎ－（ＭＮＳ式）、Ｋ－ｋ－（Ｋｅｌｌ式）、Ｌｕ（ａ－ｂ－）（Ｌｕｔｈｅｒａｎ式）、およびＨ抗原陰性（Ｂｏｍｂａｙ表現型）、またはそれらの任意の組み合わせに対して陰性である（すなわち、それらを含まない）。いくつかの実施形態では、除核赤芽球細胞は、Ｏ型および／またはＲｈ－でもある。マイナー血液型は、例えば、Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｄｏｎｏｒｓ ｆｒｏｍ ａ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｃａｒｅ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｉｎ ｎｏｒｔｈ Ｉｎｄｉａ，”Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｓ．４８（１）：５１－５４，２０１３、およびＭｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ａｎａｅｓｔｈ． ５８（５）：５２４－５２８，２０１４に記載されており、それらの記述は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の除核赤芽球細胞（例えば、ヒト除核赤芽球細胞）は、外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の外因性タンパク質のうちのいずれか）を含まない単離された未培養の除核赤芽球細胞と実質的に同じ浸透圧膜脆弱性を呈する。いくつかの実施形態では、除核赤芽球細胞は、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％のＮａＣｌで５０％未満の細胞溶解の浸透圧脆弱性を有する。浸透圧脆弱性は、いくつかの例では、ＷＯ２０１５／０７３５８７（その記述は参照により本明細書に組み込まれる）の実施例５９に記載の方法を使用して決定される。
いくつかの実施形態では、除核赤芽球細胞（例えば、ヒト除核赤芽球細胞）は、野生型の未処理の除核赤芽球細胞とほぼ同じ直径または体積を有する。いくつかの実施形態では、除核赤芽球細胞（例えば、ヒト除核赤芽球細胞）集団は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ミクロン、または約４．０～約１２．０ミクロン、約４．０～約１１．５ミクロン、約４．０～約１１．０ミクロン、約４．０～約１０．５ミクロン、約４．０～約１０ミクロン、約４．０～約９．５ミクロン、約４．０～約９．０ミクロン、約４．０～約８．５ミクロン、約４．０～約８．０ミクロン、約４．０～約７．５ミクロン、約４．０～約７．０ミクロン、約４．０～約６．５ミクロン、約４．０～約６．０ミクロン、約４．０～約５．５ミクロン、約４．０～約５．０ミクロン、約４．０～約４．５ミクロン、約４．５～約１２．０ミクロン、約４．５～約１１．５ミクロン、約４．５～約１１．０ミクロン、約４．５～約１０．５ミクロン、約４．５～約１０．０ミクロン、約４．５～約９．５ミクロン、約４．５～約９．０ミクロン、約４．５～約８．５ミクロン、約４．５～約８．０ミクロン、約４．５～約７．５ミクロン、約４．５～約７．０ミクロン、約４．５～約６．５ミクロン、約４．５～約６．０ミクロン、約４．５～約５．５ミクロン、約４．５～約５．０ミクロン、約５．０～約１２．０ミクロン、約５．０～約１１．５ミクロン、約５．０～約１１．０ミクロン、約５．０～約１０．５ミクロン、約５．０～約１０．０ミクロン、約５．０～約９．５ミクロン、約５．０～約９．０ミクロン、約５．０～約８．５ミクロン、約５．０～約８．０ミクロン、約５．０～約７．５ミクロン、約５．０～約７．０ミクロン、約５．０～約６．５ミクロン、約５．０～約６．０ミクロン、約５．０～約５．５ミクロン、約５．５～約１２．０ミクロン、約５．５～約１１．５ミクロン、約５．５～約１１．０ミクロン、約５．５～約１０．５ミクロン、約５．５～約１０．０ミクロン、約５．５～約９．５ミクロン、約５．５～約９．０ミクロン、約５．５～約８．５ミクロン、約５．５～約８．０ミクロン、約５．５～約７．５ミクロン、約５．５～約７．０ミクロン、約５．５～約６．５ミクロン、約５．５～約６．０ミクロン、約６．０～約１２．０ミクロン、約６．０～約１１．５ミクロン、約６．０～約１１．０ミクロン、約６．０～約１０．５ミクロン、約６．０～約１０．０ミクロン、約６．０～約９．５ミクロン、約６．０～約９．０ミクロン、約６．０～約８．５ミクロン、約６．０～約８．０ミクロン、約６．０～約７．５ミクロン、約６．０～約７．０ミクロン、約６．０～約６．５ミクロン、約６．５～約１２．０ミクロン、約６．５～約１１．５ミクロン、約６．５～約１１．０ミクロン、約６．５～約１０．５ミクロン、約６．５～約１０．０ミクロン、約６．５～約９．５ミクロン、約６．５～約９．０ミクロン、約６．５～約８．５ミクロン、約６．５～約８．０ミクロン、約６．５～約７．５ミクロン、約６．５～約７．０ミクロン、約７．０～約１２．０ミクロン、約７．０～約１１．５ミクロン、約７．０～約１１．０ミクロン、約７．０～約１０．５ミクロン、約７．０～約１０．０ミクロン、約７．０～約９．５ミクロン、約７．０～約９．０ミクロン、約７．０～約８．５ミクロン、約７．０～約８．０ミクロン、約７．０～約７．５ミクロン、約７．５～約１２．０ミクロン、約７．５～約１１．５ミクロン、約７．５～約１１．０ミクロン、約７．５～約１０．５ミクロン、約７．５～約１０．０ミクロン、約７．５～約９．５ミクロン、約７．５～約９．０ミクロン、約７．５～約８．５ミクロン、約７．５～約８．０ミクロン、約８．０～約１２．０ミクロン、約８．０～約１１．５ミクロン、約８．０～約１１．０ミクロン、約８．０～約１０．５ミクロン、約８．０～約１０．０ミクロン、約８．０～約９．５ミクロン、約８．０～約９．０ミクロン、約８．０～約８．５ミクロン、約８．５～約１２．０ミクロン、約８．５～約１１．５ミクロン、約８．５～約１１．０ミクロン、約８．５～約１０．５ミクロン、約８．５～約１０．０ミクロン、約８．５～約９．５ミクロン、約８．５～約９．０ミクロン、約９．０～約１２．０ミクロン、約９．０～約１１．５ミクロン、約９．０～約１１．０ミクロン、約９．０～約１０．５ミクロン、約９．０～約１０．０ミクロン、約９．０～約９．５ミクロン、約９．５～約１２．０ミクロン、約９．５～約１１．５ミクロン、約９．５～約１１．０ミクロン、約９．５～約１０．５ミクロン、約９．５～約１０．０ミクロン、約１０．０～約１２．０ミクロン、約１０．０～約１１．５ミクロン、約１０．０～約１１．０ミクロン、約１０．０～約１０．５ミクロン、約１０．５～約１２．０ミクロン、約１０．５～約１１．５ミクロン、約１０．５～約１１．０ミクロン、約１１．０～約１２．０ミクロン、約１１．０～約１１．５ミクロン、もしくは約１１．５～約１２．０ミクロンの平均直径を有し、任意選択的に、集団の標準偏差は、１、２、または３ミクロン未満である。除核赤芽球細胞直径は、例えば、Ａｄｖｉａ １２０血液学システム、Ｖｉ－ｃｅｌｌ（商標）細胞生存率分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、またはＭｏｘｉ Ｚ細胞計数器（Ｏｒｆｌｏ）を使用して測定することができる。
いくつかの実施形態では、除核赤芽球細胞の平均赤血球体積の体積は、約１０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約１０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約１０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約１０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約１０ｆＬ～約１００ｆＬ、約１０ｆＬ～約９５ｆＬ、約１０ｆＬ～約９０ｆＬ、約１０ｆＬ～約８５ｆＬ、約１０ｆＬ～約８０ｆＬ、約１０ｆＬ～約７５ｆＬ、約１０ｆＬ～約７０ｆＬ、約１０ｆＬ～約６５ｆＬ、約１０ｆＬ～約６０ｆＬ、約１０ｆＬ～約５５ｆＬ、約１０ｆＬ～約５０ｆＬ、約１０ｆＬ～約４５ｆＬ、約１０ｆＬ～約４０ｆＬ、約１０ｆＬ～約３５ｆＬ、約１０ｆＬ～約３０ｆＬ、約１０ｆＬ～約２５ｆＬ、約１０ｆＬ～約２０ｆＬ、約１０ｆＬ～約１５ｆＬ、約１５ｆＬ～約１７５ｆＬ、約１５ｆＬ～約１６０ｆＬ、約１５ｆＬ～約１４０ｆＬ、約１５ｆＬ～約１２０ｆＬ、約１５ｆＬ～約１００ｆＬ、約１５ｆＬ～約９５ｆＬ、約１５ｆＬ～約９０ｆＬ、約１５ｆＬ～約８５ｆＬ、約１５ｆＬ～約８０ｆＬ、約１５ｆＬ～約７５ｆＬ、約１５ｆＬ～約７０ｆＬ、約１５ｆＬ～約６５ｆＬ、約１５ｆＬ～約６０ｆＬ、約１５ｆＬ～約５５ｆＬ、約１５ｆＬ～約５０ｆＬ、約１５ｆＬ～約４５ｆＬ、約１５ｆＬ～約４０ｆＬ、約１５ｆＬ～約３５ｆＬ、約１５ｆＬ～約３０ｆＬ、約１５ｆＬ～約２５ｆＬ、約１５ｆＬ～約２０ｆＬ、約２０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約２０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約２０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約２０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約２０ｆＬ～約１００ｆＬ、約２０ｆＬ～約９５ｆＬ、約２０ｆＬ～約９０ｆＬ、約２０ｆＬ～約８５ｆＬ、約２０ｆＬ～約８０ｆＬ、約２０ｆＬ～約７５ｆＬ、約２０ｆＬ～約７０ｆＬ、約２０ｆＬ～約６５ｆＬ、約２０ｆＬ～約６０ｆＬ、約２０ｆＬ～約５５ｆＬ、約２０ｆＬ～約５０ｆＬ、約２０ｆＬ～約４５ｆＬ、約２０ｆＬ～約４０ｆＬ、約２０ｆＬ～約３５ｆＬ、約２０ｆＬ～約３０ｆＬ、約２０ｆＬ～約２５ｆＬ、約２５ｆＬ～約１７５ｆＬ、約２５ｆＬ～約１６０ｆＬ、約２５ｆＬ～約１４０ｆＬ、約２５ｆＬ～約１２０ｆＬ、約２５ｆＬ～約１００ｆＬ、約２５ｆＬ～約９５ｆＬ、約２５ｆＬ～約９０ｆＬ、約２５ｆＬ～約８５ｆＬ、約２５ｆＬ～約８０ｆＬ、約２５ｆＬ～約７５ｆＬ、約２５ｆＬ～約７０ｆＬ、約２５ｆＬ～約６５ｆＬ、約２５ｆＬ～約６０ｆＬ、約２５ｆＬ～約５５ｆＬ、約２５ｆＬ～約５０ｆＬ、約２５ｆＬ～約４５ｆＬ、約２５ｆＬ～約４０ｆＬ、約２５ｆＬ～約３５ｆＬ、約２５ｆＬ～約３０ｆＬ、約３０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約３０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約３０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約３０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約３０ｆＬ～約１００ｆＬ、約３０ｆＬ～約９５ｆＬ、約３０ｆＬ～約９０ｆＬ、約３０ｆＬ～約８５ｆＬ、約３０ｆＬ～約８０ｆＬ、約３０ｆＬ～約７５ｆＬ、約３０ｆＬ～約７０ｆＬ、約３０ｆＬ～約６５ｆＬ、約３０ｆＬ～約６０ｆＬ、約３０ｆＬ～約５５ｆＬ、約３０ｆＬ～約５０ｆＬ、約３０ｆＬ～約４５ｆＬ、約３０ｆＬ～約４０ｆＬ、約３０ｆＬ～約３５ｆＬ、約３５ｆＬ～約１７５ｆＬ、約３５ｆＬ～約１６０ｆＬ、約３５ｆＬ～約１４０ｆＬ、約３５ｆＬ～約１２０ｆＬ、約３５ｆＬ～約１００ｆＬ、約３５ｆＬ～約９５ｆＬ、約３５ｆＬ～約９０ｆＬ、約３５ｆＬ～約８５ｆＬ、約３５ｆＬ～約８０ｆＬ、約３５ｆＬ～約７５ｆＬ、約３５ｆＬ～約７０ｆＬ、約３５ｆＬ～約６５ｆＬ、約３５ｆＬ～約６０ｆＬ、約３５ｆＬ～約５５ｆＬ、約３５ｆＬ～約５０ｆＬ、約３５ｆＬ～約４５ｆＬ、約３５ｆＬ～約４０ｆＬ、約４０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約４０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約４０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約４０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約４０ｆＬ～約１００ｆＬ、約４０ｆＬ～約９５ｆＬ、約４０ｆＬ～約９０ｆＬ、約４０ｆＬ～約８５ｆＬ、約４０ｆＬ～約８０ｆＬ、約４０ｆＬ～約７５ｆＬ、約４０ｆＬ～約７０ｆＬ、約４０ｆＬ～約６５ｆＬ、約４０ｆＬ～約６０ｆＬ、約４０ｆＬ～約５５ｆＬ、約４０ｆＬ～約５０ｆＬ、約４０ｆＬ～約４５ｆＬ、約４５ｆＬ～約１７５ｆＬ、約４５ｆＬ～約１６０ｆＬ、約４５ｆＬ～約１４０ｆＬ、約４５ｆＬ～約１２０ｆＬ、約４５ｆＬ～約１００ｆＬ、約４５ｆＬ～約９５ｆＬ、約４５ｆＬ～約９０ｆＬ、約４５ｆＬ～約８５ｆＬ、約４５ｆＬ～約８０ｆＬ、約４５ｆＬ～約７５ｆＬ、約４５ｆＬ～約７０ｆＬ、約４５ｆＬ～約６５ｆＬ、約４５ｆＬ～約６０ｆＬ、約４５ｆＬ～約５５ｆＬ、約４５ｆＬ～約５０ｆＬ、約５０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約５０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約５０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約５０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約５０ｆＬ～約１００ｆＬ、約５０ｆＬ～約９５ｆＬ、約５０ｆＬ～約９０ｆＬ、約５０ｆＬ～約８５ｆＬ、約５０ｆＬ～約８０ｆＬ、約５０ｆＬ～約７５ｆＬ、約５０ｆＬ～約７０ｆＬ、約５０ｆＬ～約６５ｆＬ、約５０ｆＬ～約６０ｆＬ、約５０ｆＬ～約５５ｆＬ、約６０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約６０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約６０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約６０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約６０ｆＬ～約１００ｆＬ、約６０ｆＬ～約９５ｆＬ、約６０ｆＬ～約９０ｆＬ、約６０ｆＬ～約８５ｆＬ、約６０ｆＬ～約８０ｆＬ、約６０ｆＬ～約７５ｆＬ、約６０ｆＬ～約７０ｆＬ、約６０ｆＬ～約６５ｆＬ、約７０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約７０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約７０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約７０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約７０ｆＬ～約１００ｆＬ、約７０ｆＬ～約９５ｆＬ、約７０ｆＬ～約９０ｆＬ、約７０ｆＬ～約８５ｆＬ、約７０ｆＬ～約８０ｆＬ、約７０ｆＬ～約７５ｆＬ、約８０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約８０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約８０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約８０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約８０ｆＬ～約１００ｆＬ、約８０ｆＬ～約９５ｆＬ、約８０ｆＬ～約９０ｆＬ、約８０ｆＬ～約８５ｆＬ、約１００ｆＬ～約１７５ｆＬ、約１００ｆＬ～約１６０ｆＬ、約１００ｆＬ～約１４０ｆＬ、約１００ｆＬ～約１２０ｆＬ、約１２０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約１２０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約１２０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約１４０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約１４０ｆＬ～約１６０ｆＬ、または約１６０ｆＬ～約１７５ｆＬであり、任意選択的に、集団の標準偏差は、５０、４０、３０、２０、１０、５、または２ｆＬ未満である。平均赤血球体積は、例えば、血液学的分析機器、例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器、Ｍｏｘｉ Ｚ細胞計数器（Ｏｒｆｌｏ）、またはＳｙｓｍｅｘ血液分析器を使用して測定することができる。
いくつかの実施形態では、除核赤芽球細胞は、ヒト（例えば、ヒトドナー赤芽球前駆細胞に由来する）除核赤芽球細胞である。
いくつかの実施形態では、除核赤芽球細胞は、操作されたヒト除核赤芽球細胞である。いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞は、単一の外因性タンパク質（例えば、サイトゾル中に存在する外因性タンパク質または操作された除核赤芽球細胞の膜上に存在する外因性タンパク質）（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な外因性タンパク質のうちのいずれか）を含む。
他の実施形態では、操作された除核赤芽球細胞は、２つ以上の外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載の例示的な外因性タンパク質のうちのいずれか）を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の外因性タンパク質のうちの少なくとも１つ（例えば、酵素、例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）は、操作された除核赤芽球細胞のサイトゾル中に存在することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の外因性タンパク質のうちの少なくとも１つ（例えば、Ｆｃ結合分子、サイトカイン受容体、Ｔ細胞活性化リガンド、Ｔ細胞受容体、免疫阻害分子、ＭＨＣ分子、ＡＰＣ結合分子、自己抗原、アレルゲン、毒素、標的剤、受容体リガンド、（例えば、受容体作動薬または受容体拮抗薬）、または抗体もしくは抗体断片）は、操作された除核赤芽球細胞の膜上に存在する。
本明細書に記載の操作された赤芽球細胞のうちのいずれかに含まれ得る１つ以上の外因性タンパク質の非限定的な例は、外因性タンパク質を含む操作された赤芽球細胞を使用して治療することができる対応する疾患または状態とともに以下の表Ａ～Ｄに列記される。本明細書に記載の赤芽球細胞のうちのいずれかに含まれ得る外因性タンパク質の追加の例は、当該技術分野で既知である。
Figure 2023500327000002
Figure 2023500327000003
Figure 2023500327000004
Figure 2023500327000005
いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞の膜上に存在する外因性タンパク質は、クリック化学反応の産物とすることができる（例えば、外因性タンパク質は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して、細胞の膜上に存在するタンパク質（例えば、第２の外因性タンパク質または内因性タンパク質）にコンジュゲートされ得る）。いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞の膜上に存在する外因性タンパク質は、ソルターゼ酵素を使用したコンジュゲーション反応の産物とすることができる（例えば、外因性タンパク質は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して、細胞の膜上に存在するタンパク質（例えば、第２の外因性タンパク質または内因性タンパク質）にコンジュゲーションされ得る）。ソルターゼ酵素を使用したコンジュゲーション反応の非限定的な例は、米国 特許第１０，２６０，０３８号および米国特許公開第２０１６／００８２０４６Ａ１号で見つけることができ、これらはいずれも参照により組み込まれる。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、
１つ以上の外因性タンパク質を細胞（例えば、本明細書に記載の細胞、例えば、除核赤芽球細胞、操作された除核赤芽球細胞、または本明細書に記載の赤芽球前駆細胞のうちのいずれか）に（例えば、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して）クリックコジュゲートすることをさらに含む。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、細胞（例えば、本明細書に記載の細胞、例えば、除核赤芽球細胞、操作された除核赤芽球細胞、または本明細書に記載の赤芽球前駆細胞のうちのいずれか）を（例えば、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して）低張的にロードすることをさらに含む。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、細胞（例えば、本明細書に記載の細胞、例えば、除核赤芽球細胞、操作された除核赤芽球細胞、または本明細書に記載の赤芽球前駆細胞のうちのいずれか）を、物理的操作を介して（例えば、本明細書に記載される任意の方法を使用して）ロードすることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞の膜上に存在する外因性タンパク質は、脂質アンカータンパク質、例えば、ＧＰＩアンカー、Ｎ－ミリストイル化タンパク質、またはＳ－パルミトイル化タンパク質とすることができる。いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞の膜上に存在する外因性タンパク質は、膜貫通タンパク質（例えば、１回もしくは複数回膜貫通タンパク質）または表在性膜タンパク質とすることができる。いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞の膜上に存在する外因性タンパク質は、膜貫通ドメインを含む融合タンパク質（例えば、ＳＭＩＭ１またはグリコフォリンＡ（ＧＰＡ）の膜貫通ドメインを含む融合タンパク質）とすることができる。いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞の膜上に存在する外因性タンパク質は、細胞外空間内に突出するアミノ酸を有しない。いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞の膜上に存在する外因性タンパク質は、操作された除核赤芽球細胞のサイトゾル内に突出するアミノ酸を有しない。いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞の膜上に存在する外因性タンパク質は、細胞外空間内に突出するアミノ酸および操作された除核赤芽球細胞のサイトゾル内に突出するアミノ酸を有する。
本明細書に記載の方法は、ステップ（ａ）の前に、１つ以上の組み換え型タンパク質をコードする核酸を、赤芽球前駆細胞（例えば、本明細書に記載の例示的な赤芽球前駆細胞のうちのいずれか）に導入することをさらに含むことができる。操作された除核赤芽球細胞は、１つ以上の外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の外因性タンパク質のうちのいずれか）をコードする１つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ発現ベクターまたはｍＲＮＡ）を、赤芽球前駆細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の赤芽球前駆細胞のうちのいずれか）に導入することによって産生することができる。ＤＮＡ発現ベクターを赤芽球前駆細胞に導入するための例示的な方法には、リポソーム媒介導入、形質転換、遺伝子銃、トランスフェクション、および形質導入、例えば、ウイルス媒介遺伝子導入（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびレトロウイルスベースのベクターを含むウイルスベクターを使用して行われる）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡ発現ベクターを赤芽球前駆細胞に導入するための追加の例示的な方法は、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、および細胞マイクロインジェクションの使用を含む。
赤芽球前駆細胞は、任意選択的に、操作された除核赤芽球細胞への分化を可能にする好適な条件下で、１つ以上の外因性タンパク質をコードする１つ以上の核酸の導入前に培養することができる。いくつかの実施形態では、結果として生じた操作された除核赤芽球細胞は、成熟赤血球に関連するタンパク質、例えば、ヘモグロビン（例えば、成人ヘモグロビンおよび／または胎児ヘモグロビン）、グリコフォリンＡ、および外因性タンパク質を含み、これらは、標準方法（例えば、ウェスタンブロッティングまたはＦＡＣＳ分析）によって検証および定量することができる。
いくつかの実施形態では、除核赤芽球細胞または赤芽球前駆細胞は、外因性タンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされて、操作された除核赤芽球細胞を生成することができる。メッセンジャーＲＮＡは、外因性タンパク質をコードする配列を含むｃＤＮＡプラスミド構築物のインビトロ転写から得ることができる。例えば、外因性タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、特定のＲＮＡポリメラーゼと互換性のあるプロモーター配列を含むクローニングベクターに挿入され得る。例えば、クローニングベクターＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ｐＢＫ－ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）は、それぞれ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと互換性のあるＴ３プロモーター配列およびＴ７プロモーター配列を含む。センスｍＲＮＡのインビトロ転写の場合、プラスミドは、外因性タンパク質をコードする配列の末端に対応する終止コドンの下流の制限部位で直線化される。ｍＲＮＡは、例えば、ＲＮＡＭａｘｘ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）などの市販のキットを使用して、線状ＤＮＡ鋳型から転写される。いくつかの事例では、５’－ｍ７ＧｐｐｐＧキャップｍＲＮＡを生成することが望ましい場合がある。したがって、線状化ｃＤＮＡ鋳型の転写は、例えば、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．，ＵＳＡ）製のｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｃａｐｐｅｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して行われ得る。転写は、３７℃で３０分～４時間にわたって２０～１００μＬの反応体積中で行われ得る。転写されたｍＲＮＡは、ＤＮａｓｅ Ｉで短時間処理して線状化ＤＮＡ鋳型を除去することにより反応混合物から精製され、その後、塩化リチウム、酢酸ナトリウム、または酢酸アンモニウムの存在下で７０％エタノール中に沈殿する。転写されたｍＲＮＡの完全性は、アガロース－ホルムアルデヒドゲルまたは市販のＮｏｖｅｘプレキャストＴＢＥゲル（Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）を用いた電気泳動を使用して評価され得る。
外因性タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡは、例えば、リポフェクションおよびエレクトロポレーション（ｖａｎ Ｔａｎｄｅｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９８：４９－５６，２００１）を含む様々なアプローチを使用して、除核赤芽球細胞または赤芽球前駆細胞に導入され得る。リポフェクションの場合、例えば、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）中５μｇのインビトロ転写ｍＲＮＡがカチオン性脂質ＤＭＲＩＥ－Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１：４の比率で５～１５分間インキュベートされる。
あるいは、例えば、ＤＯＴＡＰ、様々な形態のポリエチレンイミン、およびポリＬ－リシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ Ｍｏ．，ＵＳＡ）、ならびにＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ、例えば、Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：３８８２－３８９１，２００１を参照されたい）を含む様々な他のカチオン性脂質またはカチオン性ポリマーを使用して、ｍＲＮＡを赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞にトランスフェクトすることができる。結果として得られたｍＲＮＡ／脂質複合体が細胞（１～２×１０６細胞／ｍＬ）と３７℃で２時間インキュベートされ、洗浄され、培養に戻される。エレクトロポレーションの場合、例えば，５００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）中約５～２０×１０６細胞が約２０μｇのインビトロ転写ｍＲＮＡと混合され、例えば、Ｅａｓｙｊｅｃｔ Ｐｌｕｓ装置（ＥｑｕｉＢｉｏ、Ｋｅｎｔ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して、０．４ｃｍキュベット中でエレクトロポレーションされる。いくつかの事例では、特定のｍＲＮＡを赤芽球前駆細胞にトランスフェクトするのに有用な条件を決定するために、様々な電圧、静電容量、およびエレクトロポレーション体積を試験する必要があり得る。一般に、ｍＲＮＡを細胞に効率的にトランスフェクトするために必要なエレクトロポレーションパラメータは、ＤＮＡのエレクトロポレーションに必要なものよりも細胞に対する有害性が低いように見える（ｖａｎ Ｔａｎｄｅｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９８：４９－５６，２００１）。
あるいは、ｍＲＮＡは、ペプチド媒介ＲＮＡ送達戦略（例えば、Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：３８８２－３８９１，２００１を参照されたい）を使用して、赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞にトランスフェクトされ得る。例えば、カチオン性脂質ポリエチレンイミン２ｋＤａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）がメリチンペプチド（Ａｌｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）と組み合わせられて、特に有糸分裂後初代細胞におけるｍＲＮＡトランスフェクションの効率が増加し得る。メリチンペプチドは、例えば、ヘテロ二官能性クロスリンカーであるスクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネートなどのジスルフィドクロスリンカーを使用してＰＥＩにコンジュゲートされ得る。インビトロ転写ｍＲＮＡがメリチン－ＰＥＩと５～１５分間プレインキュベートされて、ＲＮＡ／ペプチド／脂質複合体を形成する。次いで、この複合体が５％ＣＯ２加湿環境下で無血清培養培地中の細胞に３７℃で２～４時間にわたって添加され、その後、除去され、トランスフェクト細胞がさらに培養される。
いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞は、１つ以上の外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載のいずれかの外因性タンパク質またはそれらの任意の組み合わせ）をコードする核酸（例えば、本明細書に記載の例示的な核酸のうちのいずれか）を赤芽球前駆細胞に導入することによって生成される。いくつかの実施形態では、外因性タンパク質がＤＮＡによってコードされ、それが赤芽球前駆細胞に導入される。いくつかの実施形態では、外因性タンパク質がＲＮＡによってコードされ、それが赤芽球前駆細胞に導入される。
１つ以上の外因性タンパク質をコードする核酸は、例えば、一過性のまたは安定したトランスフェクションおよび遺伝子療法アプローチを含む、様々なＤＮＡ技法を使用して、除核赤芽球細胞への最終分化前に赤芽球前駆細胞に導入され得る。
ウイルス遺伝子導入を使用して、１つ以上の外因性タンパク質をコードする核酸を細胞にトランスフェクトすることができる。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ１）などのレンチウイルス、および泡沫状ウイルスなどのスプマウイルスを含むいくつかのウイルスが遺伝子導入ビヒクルとして使用され得る（例えば、Ｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＨＥＰ １７８：１７７－２０２，２００７を参照されたい）。例えば、レトロウイルスは、ヒト細胞を含む哺乳類細胞を効率的に形質導入し、染色体に組み込み、安定した遺伝子導入をもたらす。
１つ以上の外因性タンパク質をコードする核酸を赤芽球前駆細胞にトランスフェクトすることができる。例えば、トランスフェクションは、ステップ（ｂ）の後に行うことができる。いくつかの実施形態では、トランスフェクションは、第２の培養培地中で行うことができる。好適なベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ベクターである（Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９１：２６６４－２６７１，１９９８）。発がん性レトロウイルスであるＭＭＬＶに基づくベクターは、現在、遺伝子療法臨床試験で使用されている（Ｈａｓｓｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃｉ．１７：８７－９２，２００２）。例えば、外因性タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を、標準の分子生物学技法を使用してＭＭＬＶベクター骨格内に生成することができる。この構築物は、例えば、ＰＡ３１７細胞などのパッケージング細胞株にトランスフェクトされ、ウイルス上清は、例えば、ＰＧ１３細胞などの産生細胞をトランスフェクトするために使用される。ＰＧ１３ウイルス上清は、赤芽球前駆細胞とインキュベートされる。外因性タンパク質の発現は、ＦＡＣＳ分析（蛍光活性化細胞分類）を使用して、例えば、それが操作されたヒト除核赤芽球細胞の膜上に存在する場合、外因性タンパク質に対して指向された蛍光標識抗体を用いて監視され得る。外因性タンパク質が操作されたヒト除核赤芽球細胞のサイトゾル中に存在するように類似の方法が使用され得る。
任意選択的に、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光追跡分子をコードする核酸は、ウイルスベースのアプローチを使用して赤芽球前駆細胞にトランスフェクトすることができる（Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５：６７０－６７８，２００７）。増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（例えば、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ）をコードするＤＮＡを含む異所性レトロウイルスベクターは、例えば、Ｐｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ細胞株（Ｏｒｂｉｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）により流通している）などのパッケージング細胞を使用してパッケージングされる。パッケージング細胞株は、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖなどの適切なウイルスパッケージングに必要なウイルスタンパク質を安定的に発現する。ウイルス粒子が脱落したＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ細胞由来の上清を使用して、赤芽球前駆細胞を形質導入する。いくつかの事例では、形質導入は、例えば、組換えフィブロネクチンの断片などの特別にコーティングされた表面上で行われて、レトロウイルス媒介遺伝子導入（例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ，Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の効率を改善することができる。細胞は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎでコーティングされたプレート中でレトロウイルスＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ上清および好適な補因子とインキュベートされる。形質導入は、翌日に繰り返され得る。この事例では、ＥＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓを発現する赤芽球前駆細胞のパーセンテージがＦＡＣＳによって評価され得る。形質導入効率を評価するために使用され得る他のレポーター遺伝子には、例えば、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、およびルシフェラーゼ、ならびに低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）およびヒト細胞表面ＣＤ２４抗原が含まれる（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １３：６０５－６１３，１９９９）。
非ウイルスベクターを使用して、１つ以上の外因性タンパク質をコードする核酸を赤芽球前駆細胞に導入して、操作された除核赤芽球細胞を生成することができる。化学的方法および物理的方法を含むいくつかの送達方法を使用して、非ウイルスベクターを赤芽球前駆細胞に導入することができる。
外因性タンパク質をコードする非ウイルスベクターは、カチオン性脂質およびポリマーなどの合成高分子を使用して赤芽球前駆細胞に導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０，２００５）。カチオン性リポソームは、例えば、電荷相互作用によりＤＮＡと複合体を形成する。この正に荷電したＤＮＡ／脂質複合体は、陰性細胞表面に結合し、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる。このアプローチは、例えば、造血細胞をトランスフェクトするために使用され得る（例えば、Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９３１－９３８，１９９９を参照されたい）。赤芽球前駆細胞の場合、プラスミドＤＮＡ（例えば、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）などの無血清培地中）を市販のトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）などのカチオン性リポソーム（無血清培地中）と混合し、少なくとも２０分間インキュベートさせて、複合体を形成する。このＤＮＡ／リポソーム複合体を赤芽球前駆細胞に添加し、５～２４時間インキュベートさせ、その後、外因性タンパク質の導入遺伝子発現をアッセイすることができる。あるいは、他の市販のリポソームトランスフェクション剤を使用してもよい（例えば、インビボＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ（商標）、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）。
任意選択的に、例えば、ポリエチルエニミン（ＰＥＩ）などのカチオン性ポリマーを使用して、赤芽球前駆細胞、例えば、造血細胞および臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞を効率的にトランスフェクトすることができる（例えば、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７２５：３７７－３８４，２００５を参照されたい）。ヒトＣＤ３４＋細胞がヒト臍帯血から単離され、２００ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子および２０％熱不活性化血清を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地中で培養される。外因性タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡが、０．８Ｋ～７５０Ｋのサイズの分岐状または直鎖状ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ；Ｆｅｒｍｅｔａｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ，Ｍｄ．，ＵＳＡ）とインキュベートされる。ＰＥＩが、４．２ｍｇ／ｍＬの蒸留水で原液として調製され、ＨＣｌを使用してｐＨ５．０にわずかに酸性化される。ＤＮＡが、１μｇのＤＮＡが３ｎｍｏｌのリン酸を含み、かつ１μＬのＰＥＩ原液が１０ｎｍｏｌのアミン窒素を含むという計算に基づいて様々な窒素／リン酸比で、室温で３０分間にわたってＰＥＩと合わせられ得る。単離されたＣＤ３４＋細胞にＤＮＡ／カチオン性複合体が播種され、２８０×ｇで５分間遠心分離され、外因性タンパク質の発現が評価されるまで４時間以上にわたって培養培地中でインキュベートされる。
プラスミドベクターは、粒子媒介トランスフェクション、「遺伝子銃」、微粒子銃、または粒子衝突技術などの物理的方法を使用して好適な赤芽球前駆細胞に導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０，２００５）。この事例では、外因性タンパク質をコードするＤＮＡが金粒子上に吸収され、粒子銃によって細胞に投与される。このアプローチは、例えば、赤芽球前駆細胞、例えば、臍帯血由来の造血幹細胞をトランスフェクトするために使用され得る（例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：６９２－６９９，１９９８を参照されたい）。したがって、臍帯血は、単離され、リン酸緩衝生理食塩水中で３倍に希釈される。ＣＤ３４＋細胞は、二次抗体および磁気分離系（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭｉｎｉＭａｃ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）でコーティングされた磁気マイクロビーズと組み合わせて抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を使用して精製される。ＣＤ３４＋濃縮細胞は、本明細書に記載されるように培養され得る。トランスフェクションの場合、外因性タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡは、塩化カルシウムおよびスペルミジンでの処理により、粒子、例えば、金ビーズ上に沈殿する。ＤＮＡでコーティングされたビーズをエタノールで洗浄した後、ビーズは、例えば、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）を使用して培養された細胞中に送達され得る。例えば、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子を使用して、トランスフェクションの効率を評価することができる。
任意選択的に、エレクトロポレーション法を使用して、プラスミドベクターを赤芽球前駆細胞に導入することができる。エレクトロポレーションは、細胞膜内に一過性の細孔を作製し、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む様々な分子を細胞中に導入することを可能にする。したがって、ＣＤ３４＋細胞は、本明細書に記載されるように単離され、培養される。エレクトロポレーションの直前に、細胞が室温で１０分間にわたる２５０×ｇでの遠心分離により単離され、例えば、１．０％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ １０などのエレクトロポレーション緩衝液中で、０．２～１０×１０６生存細胞／ｍＬで再懸濁される。プラスミドＤＮＡ（１～５０μｇ）を５００μＬの細胞懸濁液とともに適切なエレクトロポレーションキュベットに添加する。
エレクトロポレーションは、例えば、２００Ｖ～２８０Ｖの範囲の電圧および２５～７０ミリ秒の範囲のパルス長を有するＥＣＭ ６００エレクトロポレーター（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）を使用して行われ得る。いくつかの代替のエレクトロポレーション機器が市販されており、この目的のために使用され得る（例えば、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｅｌｌｊｅｃｔ Ｄｕｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．））。あるいは、単離されたＣＤ３４＋細胞の効率的なエレクトロポレーションは、以下のパラメータ：４ｍｍのキュベット、１６００μΕ、５５０ Ｖ／ｃｍ、および１×１０５細胞／ｍＬで１０μｇ ＤＮＡ／５００μＬ細胞を使用して行われ得る（Ｏｌｄａｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌｏｎｉｃａ ４９：６２５－６３２，２００２）。
赤芽球前駆細胞をトランスフェクトするためにエレクトロポレーションの一形態であるヌクレオフェクションを使用することもできる。この事例では、トランスフェクションは、ＤＮＡ（または他の試薬）を核に直接輸送し、それ故に、細胞質での起こり得る分解のリスクを低下させることを可能にする細胞型特異的溶液中で電気パラメータを使用して行われる。例えば、ヒトＣＤ３４ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キット（Ａｍａｘａ Ｉｎｃ．製）を使用して、赤芽球前駆細胞をトランスフェクトすることができる。この事例では、ヒトＣＤ３４ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液中１～５×１０６細胞が１～５μｇのＤＮＡと混合され、製造業者によって決定された事前にプログラムされた設定を使用してＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）機器内でトランスフェクトされる。
赤芽球前駆細胞は、ゲノム内に組み込まれない限り哺乳類細胞において自己複製することができない従来の発現ベクターで非ウイルス的にトランスフェクトされ得る。あるいは、赤芽球前駆細胞は、染色体に組み込まれることなく遺伝単位を自律的に複製するため宿主核内に存続することができるエピソームベクターでトランスフェクトされ得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０，２００５）。これらのベクターは、例えば、ＥＢＶ、ヒトポリオーマウイルスＢＫ、ウシ乳頭腫ウイルス－１（ＢＰＶ－１）、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ）、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などの潜伏感染時に細胞内で通常染色体外的に複製するウイルスに由来する遺伝要素を利用する。哺乳類人工染色体も非ウイルス遺伝子導入に使用され得る（Ｖａｎｄｅｒｂｙｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３３：１４７０－１４７６，２００５）。
１つ以上の外因性タンパク質をコードする外因性核酸は、当該技術分野で既知の標準分子生物学法、例えば、制限消化、重複伸長ＰＣＲ、およびギブソンアセンブリによって発現ベクターに構築され得る。
外因性核酸は、外因性タンパク質が細胞表面上に発現されるように、内因性または天然の膜タンパク質をコードする遺伝子に融合された細胞、例えば、除核赤芽球細胞の表面上に通常存在しない外因性タンパク質をコードする遺伝子を含み得る。例えば、外因性タンパク質をコードする外因性遺伝子は、１型膜タンパク質のリーダー配列に続くＮ末端で、２型膜タンパク質のＣ末端で、またはＧＰＩ結合膜タンパク質のＧＰＩ結合部位の上流でクローニングされ得る。
標準クローニング法を使用して、２つの融合遺伝子間に可動性アミノ酸リンカーを導入することができる。例えば、可動性リンカーは、全長抗体から一本鎖抗体断片を生成する際に一般に使用される［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］３（配列番号３）（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｌｏ ２００４）、またはＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ（配列番号４）ポリペプチド、例えば、一本鎖Ａｒｃリプレッサーを生成するために使用されるもの（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ，ＰＮＡＳ １９９８）などのポリグリシンポリセリンリンカーである。いくつかの実施形態では、可動性リンカーは、可動性リンカーを有しない等価構築物よりも高い可動性および立体自由度を外因性タンパク質に提供する。この付加された可動性は、標的、例えば、抗体もしくはタンパク質への結合、または活性部位が基質（例えば、標的）に到達可能でなければならないタンパク質の酵素反応を必要とする用途に有用である。
いくつかの実施形態では、提供される方法は、赤芽球前駆細胞を核酸と接触させ、本明細書に記載のものなどの核酸の細胞への送達に有効な条件下でエレクトロポレーションにより核酸を導入することによって、大型核酸（特に、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）を赤芽球前駆細胞に送達することを含む。好適なエレクトロポレーターには、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲおよびＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＮＥＯＮ、ＢＴＸ ＧＥＭＩＮＩシステム、およびＭＡＸＣＹＴＥエレクトロポレーターが含まれるが、これらに限定されない。これらの方法は、ウイルス送達またはウイルスベクターの使用を必要としない。好適な核酸には、ｍＲＮＡなどのＲＮＡが含まれる。好適な核酸には、転位性因子、安定したエピソーム、プラスミドＤＮＡ、または直鎖状ＤＮＡを含むＤＮＡも含まれる。
細胞株、例えば、Ｋ５６２赤白血病細胞のエレクトロポレーションの条件は、例えば、Ｖａｎ Ｔｅｎｄｅｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９８（ｌ）：４９－５６，２００１の文献に記載されている。本明細書に記載の方法に好適なエレクトロポレーション条件には、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎｅｏｎトランスフェクション系：約５００～約２０００Ｖ、約８００～約１８００Ｖ、または約８５０～約１７００Ｖの範囲のパルス電圧、約５～約５０ミリ秒または約１０～約４０ミリ秒の範囲のパルス幅、および１～２パルス、１～３パルス、１～４パルス、または１～５パルスの範囲のパルス数が含まれる。
赤芽球前駆細胞のエレクトロポレーションに特に好適な条件には、例えば、４日間にわたって、ａ）パルス電圧１３００～１４００、パルス幅１０～２０ミリ秒、パルス数１～３、ｂ）パルス電圧１４００、パルス幅１０ミリ秒、パルス数３、ｃ）パルス電圧１４００、パルス幅２０ミリ秒、パルス数１、およびｄ）パルス電圧１３００、パルス幅１０ミリ秒、パルス数３が含まれる。
赤芽球前駆細胞のエレクトロポレーションに特に好適な条件には、例えば、８～９日間にわたって、ａ）パルス電圧１４００～１６００、パルス幅２０、パルス数１、ｂ）パルス電圧１１００～１３００、パルス幅３０、パルス数１、ｃ）パルス電圧１０００～１２００、パルス幅４０、パルス数１、ｄ）パルス電圧１１００～１４００、パルス幅２０、パルス数２、ｅ）パルス電圧９５０～１１５０、パルス幅３０、パルス数２、ｆ）パルス電圧１３００～１６００、パルス幅１０、パルス数３が含まれる。これらの条件により、一般に、少なくとも約６０％以上（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは少なくとも約９７％、またはそれ以上）のトランスフェクション効率、および少なくとも約７０％以上（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは少なくとも約９７％、またはそれ以上）の細胞生存率がもたらされる。
分化条件下での培養中の赤芽球前駆細胞のエレクトロポレーションに特に好適な条件には、例えば、１２～１３日間にわたって、ａ）パルス電圧１５００～１７００、パルス幅２０、パルス数１、およびｂ）パルス電圧１５００～１６００、パルス幅１０、パルス数３が含まれる。これらの条件により、一般に、少なくとも約５０％以上（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは少なくとも約９７％、またはそれ以上）のトランスフェクション効率、および少なくとも約７０％以上（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは少なくとも約９７％、またはそれ以上）の細胞生存率がもたらされる。
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎｅｏｎシステムを参照して本明細書に開示される条件は、当業者によって容易に調整されて、日常的な実験のみで異なるエレクトロポレーターおよび／または異なるエレクトロポレーション設定に適合することができ、本明細書に記載の特定のエレクトロポレーターは開示される方法に限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエレクトロポレーション条件を使用して、培養された赤芽球前駆細胞に１回目のエレクトロポレーションが行われ、その後、所望の期間にわたって（任意選択的に、分化条件下で）培養され、その後、２回目の再エレクトロポレーションが行われる。いくつかの実施形態では、培養された赤芽球前駆細胞に１回目のエレクトロポレーションが行われ、その後、所望の期間にわたって（任意選択的に、分化条件下で）培養され、その後、２回目、３回目、４回目、５回目、または６回目の再エレクトロポレーションが行われる。任意選択的に、例えば、第１のエレクトロポレーションと第２のエレクトロポレーションとの間の培養期間、第２のエレクトロポレーションと第３のエレクトロポレーションとの間の培養期間は変化し得る。例えば、エレクトロポレーション間の期間は、所望通りに調整され得、例えば、その期間は、３０分間、１時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４８時間、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、または２１日であり得る。例えば、赤芽球前駆細胞は、１日目および２日目、１日目および３日目、１日目および４日目、１日目および５日目、１日目および６日目、１日目および７日目、１日目および８日目、１日目および９日目、１日目および１０、１日目および１１日目、１日目および１２日目、１日目および１３日目、１日目および１４日目、１日目および１５日目、または１日目および１６日目にエレクトロポレーションされ得る。別の例では、細胞は、２日目および３日目、２日目および４日目、２日目および５日目、２日目および６日目、２日目および７日目、２日目および８日目、２日目および９日目、２日目および１０日目、２日目および１１日目、２日目および１２日目、２日目および１３日目、２日目および１４日目、２日目および１５日目、または２日目および１６日目にエレクトロポレーションされ得る。さらに別の例では、赤芽球前駆細胞は、３日目および４日目、３日目および５日目、３日目および６日目、３日目および７日目、３日目および８日目、３日目および９日目、３日目および１０日目、３日目および１１日目、３日目および１２日目、３日目および１３日目、３日目および１４日目、３日目および１５日目、または３日目および１６日目にエレクトロポレーションされ得る。さらに別の例では、細胞は、４日目および５日目、４日目および６日目、４日目および７日目、４日目および８日目、４日目および９日目、４日目および１０日目、４日目および１１日目、４日目および１２日目、４日目および１３日目、４日目および１４日目、４日目および１５日目、または４日目および１６日目にエレクトロポレーションされ得る。さらに別の例では、細胞は、５日目および６日目、５日目および７日目、５日目および８日目、５日目および９日目、５日目および１０日目、５日目および１１日目、５日目および１２日目、５日目および１３日目、５日目および１４日目、５日目および１５日目、または５日目および１６日目にエレクトロポレーションされ得る。さらに別の例では、赤芽球前駆細胞は、６日目および７日目、６日目および８日目、６日目および９日目、６日目および１０日目、６日目および１１日目、６日目および１２日目、６日目および１３日目、６日目および１４日目、６日目および１５日目、または６日目および１６日目にエレクトロポレーションされ得る。さらに別の例では、赤芽球前駆細胞は、７日目および８日目、７日目および９日目、７日目および１０日目、７日目および１１日目、７日目および１２日目、７日目および１３日目、７日目および１４日目、７日目および１５日目、または７日目および１６日目にエレクトロポレーションされ得る。さらに別の例では、赤芽球前駆細胞は、８日目および９日目、８日目および１０日目、８日目および１１日目、８日目および１２日目、８日目および１３日目、８日目および１４日目、８日目および１５日目、または８日目および１６日目にエレクトロポレーションされ得る。さらに別の例では、赤芽球前駆細胞は、９日目および１０日目、９日目および１１日目、９日目および１２日目、９日目および１３日目、９日目および１４日目、９日目および１５日目、または９日目および１６日目にエレクトロポレーションされ得る。さらに別の例では、赤芽球前駆細胞は、１０日目および１１日目、１０日目および１２日目、１０日目および１３日目、１０日目および１４日目、１０日目および１５日目、または１０日目および１６日目にエレクトロポレーションされ得る。さらに別の例では、赤芽球前駆細胞は、１１日目および１２日目、１１日目および１３日目、１１日目および１４日目、１１日目および１５日目、または１１日目および１６日目にエレクトロポレーションされ得る。さらに別の例では、赤芽球前駆細胞は、１２日目および１３日目、１２日目および１４日目、１２日目および１５日目、または１２日目および１６日目にエレクトロポレーションされ得る。さらに別の例では、赤芽球前駆細胞は、１３日目および１４日目、１３日目および１５日目、または１３日目および１６日目にエレクトロポレーションされ得る。さらに別の例では、赤芽球前駆細胞は、１４日目および１５日目、または１４日目および１６日目にエレクトロポレーションされ得る。任意選択的に、赤芽球前駆細胞は、３回以上、例えば、３回、４回、５回、または６回エレクトロポレーションされ得、間隔は、細胞の分化プロセスの任意の時点で所望通りに選択され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエレクトロポレーション条件を使用して、培養された赤芽球前駆細胞は、分化の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６日目にエレクトロポレーションされる。
いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞は、クリックコンジュゲートされた操作された除核赤芽球細胞とすることができる。触媒結合形成ポリペプチドドメインは、例えば、サイトゾル中または膜上に存在する赤芽球前駆細胞上またはその中で発現され得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓから単離されたタンパク質であるＳｐｙ０１２８に由来するものを含む、トランスペプチダーゼ、ソルターゼ、およびイソペプチダーゼを含む多くの触媒結合形成ポリペプチドが存在する。Ｓｐｙ０１２８の自己触媒イソペプチド結合形成サブユニット（ＣｎａＢ２ドメイン）の分割により、相互に特異性を有する触媒活性を保持する２つの別個のポリペプチドがもたらされることが実証されている。この系中のポリペプチドは、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと呼ばれる。混合時に、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、ＳｐｙＴａｇ上のＡｓｐｌ１７とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ上のＬｙｓ３１との間のイソペプチド結合形成を受ける（Ｚａｋｅｒｉ ａｎｄ Ｈｏｗａｒｔｈ，ＪＡＣＳ １３２：４５２６，２０１０）。この反応は、細胞環境と互換性があり、タンパク質／ペプチドコンジュゲーションに高度に特異的である（Ｚａｋｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：Ｅ６９０－Ｅ６９７，２０１２）。ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、エラストン様タンパク質における翻訳後トポロジー修飾を指示することが示されている。例えば、Ｎ末端にＳｐｙＴａｇを配置し、Ｃ末端にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを配置することにより、環状エラストン様タンパク質の形成が誘導される（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１３）。
分子ＡがＳｐｙＴａｇに融合され、かつ分子ＢがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合される系が、分子ＡがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合され、かつ分子ＢがＳｐｙＴａｇに融合される系と機能的に同等であるように、成分ＳｐｙＴａｇと成分ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを交換することができる。本開示の目的のために、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが使用される場合、相補的分子がその場所で置換され得ることを理解されたい。
ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ系などの触媒結合形成ポリペプチドを使用して、外因性タンパク質を、細胞、例えば、赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞の表面に結合することができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチド配列は、赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞の細胞外表面上に発現され得る。ＳｐｙＴａｇポリペプチドは、例えば、１型または３型膜貫通タンパク質、例えば、グリコフォリンＡのＮ末端に融合することができる、２型膜貫通タンパク質、例えば、ＫｅｌｌのＣ末端に融合することができる、複数回膜貫通タンパク質、例えば、バンド３の細胞外末端または細胞外ループにインフレームで挿入することができる、ＧＰＩ－アクセプターポリペプチド、例えば、ＣＤ５５またはＣＤ５９に融合することができる、脂質鎖アンカーポリペプチドに融合することができる、または表在性膜タンパク質に融合することができる。外因性タンパク質は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合することができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合をコードする核酸は、ＳｐｙＴａｇ融合を発現する同じ赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞から発現および分泌され得る。あるいは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合をコードする核酸配列は、外因的に、例えば、細菌、真菌、昆虫、哺乳類、または無細胞産生系で生産することができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチドとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドとの反応時に、外因性タンパク質を赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞の表面に結合させる共有結合が形成される。
一実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドは、赤芽球細胞中のＧａｔａｌプロモーターの制御下でグリコフォリンＡのＮ末端への融合として発現され得る。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド配列に融合された外因性タンパク質は、同じ赤芽球細胞中のＧａｔａｌプロモーターの制御下で発現することができる。両方の融合ポリペプチドの発現時に、ＳｐｙＴａｇポリペプチドとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドとの間にイソペプチド結合が形成され、これにより、赤芽球細胞表面と外因性タンパク質との間に共有結合が形成される。
別の実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドは、赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞中のＧａｔａｌプロモーターの制御下でグリコフォリンＡのＮ末端への融合として発現され得る。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド配列に融合された外因性タンパク質は、好適な哺乳類細胞発現系、例えば、ＨＥＫ２９３細胞中で発現することができる。赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞上でのＳｐｙＴａｇ融合ポリペプチドの発現時に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合ポリペプチドが細胞と接触することができる。好適な反応条件下で、ＳｐｙＴａｇポリペプチドとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドとの間にイソペプチド結合が形成され、これにより、赤芽球前駆細胞表面または除核赤芽球細胞表面と外因性タンパク質との間に共有結合が形成される。
ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ系などの触媒結合形成ポリペプチドを使用して、外因性タンパク質を赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞の細胞内空間に固定することができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチド配列は、導入遺伝子の直接発現、内因性細胞内タンパク質、例えば、ヘモグロビンなどへの融合、内因性細胞表面タンパク質、例えば、バンド３、グリコフォリンＡ、Ｋｅｌｌなどの細胞内ドメインへの融合、または細胞骨格の構成成分への融合を含む多くの方法によって、赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞の細胞内空間内で発現することができる。ＳｐｙＴａｇ配列は、ポリペプチド末端に限定されず、ポリペプチドの翻訳および局在化が乱されないように内因性ポリペプチドの内部配列内に組み込まれ得る。外因性タンパク質は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合することができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合をコードする核酸配列は、ＳｐｙＴａｇ融合を発現する同じ赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞内で発現され得る。ＳｐｙＴａｇポリペプチドとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドとの反応時に、外因性タンパク質を赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞の細胞内空間内に固定する役割を果たす共有結合が形成される。
一実施形態では、赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞は、細胞内でヘモグロビンベータに融合されたＳｐｙＴａｇを含む。赤芽球前駆細胞は、翻訳時に細胞内ベータグロビンがＣ末端でＳｐｙＴａｇに融合されるように、ヘモグロビンプロモーター、ベータグロビン遺伝子、およびＳｐｙＴａｇ配列を含む遺伝子配列で遺伝子修飾され得る。加えて、赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞は、翻訳時に外因性ポリペプチドがそのＮ末端でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合されるように、外因性ポリペプチドの発現を駆動するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒをコードするＧａｔａｌプロモーター主導遺伝子を発現する。両方の融合タンパク質の発現時に、ＳｐｙＴａｇ結合ベータグロビンは、イソペプチド結合を介して細胞内空間内のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合外因性ポリペプチドに連結され、これにより、外因性ポリペプチドがベータグロビンに固定され、成熟中に保持されることが可能になる。
別の実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドは、赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞内の外因性タンパク質への融合として発現することができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドは、同じ赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞内のグリコフォリンＡのＣ末端（細胞内）への融合として発現することができる。両方の融合ポリペプチドの発現時に、ＳｐｙＴａｇポリペプチドとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドとの間にイソペプチド結合が形成され、これにより、膜アンカー内因性赤芽球ポリペプチドと外因性タンパク質との間に共有結合が形成される。
他の分子融合がポリペプチド間に形成され得、直接または間接的コンジュゲーションを含み得る。ポリペプチドは、互いに直接コンジュゲートされ得るか、またはリンカーを介して間接的にコンジュゲートされ得る。リンカーは、ペプチド、ポリマー、アプタマー、または核酸であり得る。ポリマーは、例えば、天然、合成、直鎖状、または分岐状であり得る。外因性タンパク質は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む異種融合タンパク質を含むことができ、この融合タンパク質は、一方の末端または両方の末端に、互いに直接結合しているか、または介在リンカー配列および／もしくはさらなる配列を用いて結合したポリペプチドを含む。リンカーへのコンジュゲーションは、共有結合またはイオン結合を介し得る。
いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞は、低張的にロードされたヒト除核赤芽球細胞である。低張ロード／溶解の場合、赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞が低イオン強度緩衝液に曝露され、それらの破裂が引き起こされる。外因性タンパク質は細胞内に分布している。除核赤芽球細胞または赤芽球前駆細胞は、単離された除核赤芽球細胞のペレットに５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）の３０～５０倍体積過剰量を添加することによって低張性に溶解し得る。結果として生じた溶解細胞膜は、遠心分離によって単離される。溶解細胞膜のペレットは、再懸濁され、例えば、３０分間にわたって、低イオン強度緩衝液中で外因性タンパク質の存在下でインキュベートされる。あるいは、溶解細胞膜は、除核赤芽球細胞または赤芽球前駆細胞を効率的にロードするために決定された最良の条件に応じて、短くて１分間または長くて数日間にわたって外因性タンパク質とインキュベートされ得る。１つ以上の外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な外因性タンパク質のうちのいずれか）をコードする核酸の低張ロードの場合、核酸は、低張トリス－ＨＣｌ溶液（ＰＨ７．０）中に懸濁され、赤芽球前駆細胞に注入され得る。トリス－ＨＣｌの濃度は、除核赤芽球細胞を効率的にロードするために決定された最良の条件に応じて、約２０ｍｍｏｌ／ｌ～約１５０ｍｍｏｌ／ｌとすることができる。
あるいは、低張溶液に対する制御された透析を使用して、赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞に外因性タンパク質がロードされて、細胞を膨張させ、細胞膜中に細孔を作製することができる（例えば、米国特許第４，３２７，７１０号、同第５，７５３，２２１号、同第６，４９５，３５１号、および同第１０，０４６，００９号を参照されたい）。例えば、細胞ペレットは、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルコース（ｐＨ７．４）中に再懸濁され、１０ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４、１０ｍＭのＮａＨＣＯ３、２０ｍＭのグルコース、および４ｍＭのＭｇＣｌ２を含む低イオン強度緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析される。３０～６０分後、細胞は、さらに３０～６０分間、外因性タンパク質を含む１６ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４溶液（ｐＨ ７．４）に対してさらに透析される。これらの手順は全て、４℃の温度で有利に行われ得る。いくつかの事例では、透析アプローチによって大量の赤芽球前駆細胞または除核赤芽球細胞をロードすることが有益であり得、この目的のために設計された特定の装置が使用され得る（例えば、米国特許第４，３２７，７１０号、同第６，１３９，８３６号、および同第６，４９５，３５１号を参照されたい）。
除核赤芽球細胞の単離および製剤化
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、（ｅ）操作された除核赤芽球細胞集団をステップ（ｄ）の第３の細胞培養物から単離することをさらに含むことができる。操作された除核赤芽球細胞は、遠心分離（例えば、密度勾配遠心分離）、ＦＡＣＳ、およびＭＡＣＳなどであるが、これらに限定されない当該技術分野で既知の方法を使用して単離することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、（ｆ）ステップ（ｅ）で単離された操作された除核赤芽球細胞集団を製剤化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞集団の製剤化は、単離された操作された除核赤芽球細胞集団を１つ以上の薬学的に許容される緩衝剤または賦形剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）と混合することを含むことができる。
いくつかの実施形態では、操作された除核赤芽球細胞集団は、細胞の保管、輸送、および／または対象への投与に好適な組成物（例えば、医薬組成物）に製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、ステップ（ｆ）で製剤化された操作された除核赤芽球細胞集団を、それを必要とする対象（例えば、操作された除核赤芽球細胞中に存在する１つ以上の外因性タンパク質を必要とすると以前に特定または診断された対象、または輸血および／もしくは赤血球の増加を必要とすると特定された対象）に投与することをさらに含む。これらの方法のいくつかの実施形態では、対象は、投与された操作された除核赤芽球細胞中に存在する外因性タンパク質のうちの１つ以上を必要とすると以前に特定または診断されている。これらの方法のいくつかの実施形態では、製剤化された操作された除核赤芽球細胞集団は、静脈内投与により対象に投与される。
組成物
本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって産生される除核赤芽球細胞集団も本明細書に提供される。本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって産生される除核赤芽球細胞集団のうちのいずれかを含む組成物も本明細書に提供される。本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって生産される製剤（例えば、医薬組成物）も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、製剤は、対象（例えば、本明細書に記載の対象のうちのいずれか）への静脈内投与に好適である。本明細書に記載の組成物または製剤のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物または本製剤は、本明細書に記載の除核赤芽球細胞のうちのいずれかの剤形である。
キット
本明細書に提供される組成物、製剤、または除核赤芽球細胞集団のうちのいずれかを含むキットも本明細書に提供される。本明細書に記載の組成物、製剤、または除核赤芽球細胞集団のうちのいずれかを含む１つ以上の滅菌容器（例えば、滅菌円錐管、滅菌ペトリ皿、滅菌バイアル（例えば、ホウケイ酸ガラスバイアル）、および滅菌プラスチック袋（ジ－２－エチルヘキシルフタレート（ＤＥＨＰ）可塑化ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）バッグ、またはｎ－ブチリル－トリ（ｎ－ヘキシル）－シトレート（ＢＴＨＣ）可塑化ＰＶＣバッグ）を含むキットも本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるキットのうちのいずれかは、本明細書に記載の組成物、製剤、または除核赤芽球細胞集団のうちのいずれかを、それを必要とする対象に投与するための指示をさらに含むことができる。
本明細書に記載のキットのいくつかの実施形態は、本明細書に記載の組成物、製剤、および除核赤芽球細胞集団のうちのいずれかの好適な単一剤形を含む。例えば、本明細書に記載の組成物または製剤のうちのいずれかの単一剤形は、例えば、約０．５ｍＬ～約２Ｌ、約０．５ｍＬ～約１８００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１５００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１２００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１０００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約８００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約６００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約５００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約４５０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約４００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約３５０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約３００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約２５０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約２００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１８０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１６０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１４０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１２０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約８０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約６０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約４０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約５ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１．０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約２Ｌ、約１．０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約８０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約６０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約４０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約２０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約５ｍＬ、約５ｍＬ～約２Ｌ、約５ｍＬ～約１８００ｍＬ、約５ｍＬ～約１５００ｍＬ、約５ｍＬ～約１２００ｍＬ、約５ｍＬ～約１０００ｍＬ、約５ｍＬ～約８００ｍＬ、約５ｍＬ～約６００ｍＬ、約５ｍＬ～約１８００ｍＬ、約５ｍＬ～約５００ｍＬ、約５ｍＬ～約４５０ｍＬ、約５ｍＬ～約４００ｍＬ、約５ｍＬ～約３５０ｍＬ、約５ｍＬ～約３００ｍＬ、約５ｍＬ～約２５０ｍＬ、約５ｍＬ～約２００ｍＬ、約５ｍＬ～約１８０ｍＬ、約５ｍＬ～約１６０ｍＬ、約５ｍＬ～約１４０ｍＬ、約５ｍＬ～約１２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１００ｍＬ、約５ｍＬ～約８０ｍＬ、約５ｍＬ～約６０ｍＬ、約５ｍＬ～約４０ｍＬ、約５ｍＬ～約２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２Ｌ、約１０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１０ｍＬ～約８０ｍＬ、約１０ｍＬ～約６０ｍＬ、約１０ｍＬ～約４０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約２Ｌ、約２０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約２０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約２０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約２０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約２０ｍＬ～約８００ｍＬ、約２０ｍＬ～約６００ｍＬ、約２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約３００ｍＬ、約２０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１００ｍＬ、約２０ｍＬ～約８０ｍＬ、約２０ｍＬ～約６０ｍＬ、約２０ｍＬ～約４０ｍＬ、約４０ｍＬ～約２Ｌ、約４０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約４０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約４０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約４０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約４０ｍＬ～約８００ｍＬ、約４０ｍＬ～約６００ｍＬ、約４０ｍＬ～約５００ｍＬ、約４０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約３００ｍＬ、約４０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約２００ｍＬ、約４０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１００ｍＬ、約４０ｍＬ～約８０ｍＬ、約４０ｍＬ～約６０ｍＬ、約６０ｍＬ～約２Ｌ、約６０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約６０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約６０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約６０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約６０ｍＬ～約８００ｍＬ、約６０ｍＬ～約６００ｍＬ、約６０ｍＬ～約５００ｍＬ、約６０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約４００ｍＬ、約６０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約３００ｍＬ、約６０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約２００ｍＬ、約６０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１００ｍＬ、約６０ｍＬ～約８０ｍＬ、約８０ｍＬ～約２Ｌ、約８０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約８０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約８０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約８０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約８０ｍＬ～約８００ｍＬ、約８０ｍＬ～約６００ｍＬ、約８０ｍＬ～約５００ｍＬ、約８０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約４００ｍＬ、約８０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約３００ｍＬ、約８０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約２００ｍＬ、約８０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１００ｍＬ～約２Ｌ、約１００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１００ｍＬ～約８００ｍＬ、約１００ｍＬ～約６００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５００ｍＬ、約１００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約４００ｍＬ、約１００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約３００ｍＬ、約１００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約２００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約２Ｌ、約１２０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約２Ｌ、約１４０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約２Ｌ、約１８０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２００ｍＬ～約２Ｌ、約２００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約２００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約２００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約２００ｍＬ～約１０００ｍＬ、約２００ｍＬ～約８００ｍＬ、約２００ｍＬ～約６００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５００ｍＬ、約２００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約４００ｍＬ、約２００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約３００ｍＬ、約２００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約２Ｌ、約２５０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約３００ｍＬ～約２Ｌ、約３００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約３００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約３００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約３００ｍＬ～約１０００ｍＬ、約３００ｍＬ～約８００ｍＬ、約３００ｍＬ～約６００ｍＬ、約３００ｍＬ～約５００ｍＬ、約３００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３００ｍＬ～約４００ｍＬ、約３００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約２Ｌ、約３５０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４００ｍＬ～約２Ｌ、約４００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約４００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約４００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約４００ｍＬ～約１０００ｍＬ、約４００ｍＬ～約８００ｍＬ、約４００ｍＬ～約６００ｍＬ、約４００ｍＬ～約５００ｍＬ、約４００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約４５０ｍＬ～約２Ｌ、約４５０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約５００ｍＬ～約２Ｌ、約５００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約５００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約５００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約５００ｍＬ～約１０００ｍＬ、約５００ｍＬ～約８００ｍＬ、約５００ｍＬ～約６００ｍＬ、約６００ｍＬ～約２Ｌ、約６００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約６００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約６００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約６００ｍＬ～約１０００ｍＬ、約６００ｍＬ～約８００ｍＬ、約８００ｍＬ～約２Ｌ、約８００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約８００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約８００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約８００ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１０００ｍＬ～約２Ｌ、約１０００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１０００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１０００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約１２００ｍＬ～約２Ｌ、約１２００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１２００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１５００ｍＬ～約２Ｌ、約１５００ｍＬ～約１８００ｍＬ、または約１８００ｍＬ～約２Ｌの体積を有することができる。
対象を治療する方法
治療を必要とする対象を治療する方法であって、本明細書に記載の組成物、製剤、または除核赤芽球細胞集団のうちのいずれかの治療有効量を投与することを含む、方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内投与により行われる。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、対象に１つ以上の追加の治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療薬は、本明細書に提供される組成物のうちのいずれかと実質的に同じ時点で対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療薬は、対象に本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを投与する前または投与した後に対象に投与することができる。
本発明は、以下の実施例にさらに説明されており、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：赤芽球細胞増殖および除核に対するミオイノシトールの効果
赤芽球前駆細胞培養物に対するミオイノシトールの効果を試験した。ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）を三段階プロセスで培養して、除核赤芽球細胞を生成した。第１段階で、ＣＤ３４＋ ＨＳＣを、組換えヒトインスリン、組換えヒトトランスフェリン、組換えヒトＳＣＦ、組換えＩＬ－３、組換えＦｌｔ－３リガンド、および組換えヒトＩＬ－３を補充したＩＭＤＭを含む第１の培養培地中のＴフラスコ中で増殖させた。その後、細胞に、フェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。形質導入後、細胞を、組換えヒトエリスロポエチン、組換えヒトＳＣＦ、組換えヒトＩＬ３、組換えヒトインスリン、デキサメタゾン、および組換えヒトトランスフェリンを補充したＩＭＤＭを含有する第２の培養培地を含む５０Ｌのバイオリアクター培養容器中で培養した。本プロセスの第３段階（成熟期）では、細胞のアリコートを、組換えヒトＥＰＯ、組換えヒトＳＣＦ、組換えヒトインスリン、組換えトランスフェリン、ヒトＡＢ血清、およびヒト血漿を補充したＩＭＤＭを含む第３の培養培地を含む２４ウェルプレートに播種した。第１、第２、および第３の培養培地は、０．００７２ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む基礎培地（すなわち、ＩＭＤＭ）を含んだ。基礎培地中に存在するミオイノシトールの量に加えて、第３の培養培地は、追加の１ｇ／Ｌのミオイノシトールを補充したものであるか、または対照としてミオイノシトールを補充しないものであるかのいずれかであった。定期的なサンプリングおよび細胞計数を、蛍光活性化細胞分類ベースの細胞計数器を使用して、第３段階中に行った。
図１および図２に示されるように、ミオイノシトールが第３の細胞培養培地に添加された場合、ミオイノシトールは赤芽球細胞の総細胞密度（図１）および除核赤芽球細胞密度（図２）の両方を有意に増加させることが見出された。これらのデータは、ミオイノシトールが、成熟期の赤芽球細胞の増殖および分裂能力を改善し、除核赤芽球細胞の収率を改善したことを示す。
他の実施形態
本発明がその発明を実施するための形態と併せて説明されているが、前述の記述が、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例証するよう意図されており、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (50)

  1. 除核赤芽球細胞集団を生成する方法であって、
    （ａ）赤芽球前駆細胞の第１の細胞培養物のある体積を、容器内に含まれる第２の培養培地中に配置して、第２の細胞培養物を提供することと、
    （ｂ）前記第２の細胞培養物を約２日～約１５日間培養することと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）の前記第２の細胞培養物のある体積を、容器内に含まれる第３の培養培地中に配置して、第３の細胞培養物を提供することであって、前記第３の培養培地が約０．５ｇ／Ｌ～約５４．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む、提供することと、
    （ｄ）ステップ（ｃ）の前記第３の細胞培養物を約５日～約２０日間培養することと、を含み、
    ステップ（ｄ）の後に、前記第３の培養培地が除核赤芽球細胞集団を含む、方法。
  2. ステップ（ａ）の前記容器が灌流バイオリアクターであり、ステップ（ｂ）の前記培養が灌流培養であり、ステップ（ｃ）の前記容器が灌流バイオリアクターであり、ステップ（ｄ）の前記培養が灌流培養である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記方法が、ステップ（ａ）の前に、
    （ｉ）複数の赤芽球前駆細胞を、容器内に含まれる第１の培養培地中に配置して、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬの初期細胞密度を有する前記第１の細胞培養物を提供することと、および
    （ｉｉ）前記第１の細胞培養物を約１日～約１５日間回分または流加培養することと、をさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. ステップ（ｉｉ）の前記回分または流加培養が約５日～約１２日間行われる、請求項３に記載の方法。
  5. ステップ（ｂ）の前記灌流培養が約４日～約１０日間行われる、請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. ステップ（ｄ）の前記灌流培養が、
    （ｉ）前記第３の培養培地の追加体積を前記第３の細胞培養物に第１の期間にわたって添加することと、
    （ｉｉ）第４の培養培地の追加体積を前記第３の細胞培養物に第２の期間にわたって添加することと、を含み、前記第４の培養培地が約０．５ｇ／Ｌ～約５２．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. （ｉ）の前記第１の期間が約１日～約７日間であり、（ｉｉ）の前記第２の期間が約１日～約１０日間である、請求項６に記載の方法。
  8. ステップ（ｄ）の前記灌流培養が約８日～約１５日間行われる、請求項２～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. ステップ（ｂ）の前記培養が回分または流加培養であり、ステップ（ｃ）の前記容器が灌流バイオリアクターであり、ステップ（ｄ）の前記培養が灌流培養である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記方法が、ステップ（ａ）の前に、
    （ｉ）複数の赤芽球前駆細胞を、容器内に含まれる第１の培養培地中に配置して、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬの初期細胞密度を有する前記第１の細胞培養物を提供することと、および
    （ｉｉ）前記第１の細胞培養物を約１日～約１５日間回分または流加培養することと、をさらに含む、請求項９に記載の方法。
  11. ステップ（ｉｉ）の前記回分または流加培養が約５日～約１２日間行われる、請求項１０に記載の方法。
  12. ステップ（ｂ）の前記回分または流加培養が約４日～約１０日間行われる、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. ステップ（ｄ）の前記灌流培養が、
    （ｉ）前記第３の培養培地の追加体積を前記第３の細胞培養物に第１の期間にわたって添加することと、
    （ｉｉ）第４の培養培地の追加体積を前記第３の細胞培養物に第２の期間にわたって添加することと、を含み、前記第４の培養培地が約０．５ｇ／Ｌ～約５２．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. （ｉ）の前記第１の期間が約１日～約７日間であり、（ｉｉ）の前記第２の期間が約１日～約１０日間である、請求項１３に記載の方法。
  15. ステップ（ｄ）の前記灌流培養が約８日～約１５日間行われる、請求項９～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. ステップ（ａ）の前記容器が灌流バイオリアクターであり、ステップ（ｂ）の前記培養が灌流培養であり、ステップ（ｄ）の前記培養が回分または流加培養である、請求項１に記載の方法。
  17. 前記方法が、ステップ（ａ）の前に、
    （ｉ）複数の赤芽球前駆細胞を、容器内に含まれる第１の培養培地中に配置して、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬの初期細胞密度を有する前記第１の細胞培養物を提供することと、および
    （ｉｉ）前記第１の細胞培養物を約１日～約１５日間回分または流加培養することと、をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  18. ステップ（ｉｉ）の前記回分または流加培養が約５日～約１２日間行われる、請求項１７に記載の方法。
  19. ステップ（ｂ）の前記灌流培養が約４日～約１０日間行われる、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. ステップ（ｄ）の前記回分および流加培養が、
    （ｉ）前記第３の培養培地の追加体積を前記第３の細胞培養物に第１の期間にわたって添加することと、
    （ｉｉ）第４の培養培地の追加体積を前記第３の細胞培養物に第２の期間にわたって添加することと、を含み、前記第４の培養培地が約０．５ｇ／Ｌ～約５２．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. （ｉ）の前記第１の期間が約１日～約７日間であり、（ｉｉ）の前記第２の期間が約１日～約１０日間である、請求項２０に記載の方法。
  22. ステップ（ｄ）の前記回分または流加培養が約８日～約１５日間行われる、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. ステップ（ｂ）の前記培養が回分または流加培養であり、ステップ（ｄ）の前記培養が回分または流加培養である、請求項１に記載の方法。
  24. 前記方法が、ステップ（ａ）の前に、
    （ｉ）複数の赤芽球前駆細胞を、容器内に含まれる第１の培養培地中に配置して、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬの初期細胞密度を有する前記第１の細胞培養物を提供することと、および
    （ｉｉ）前記第１の細胞培養物を約１日～約１５日間回分または流加培養することと、をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記第１の培養培地が、Ｆｌｔ－３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のうちの１つ以上を含む、請求項３～８、１０～１５、１７～２２、および２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. ステップ（ｉｉ）の前記回分または流加培養が約５日～約１２日間行われる、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記第２の培養培地が、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびインスリンのうちの１つ以上を含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. ステップ（ｂ）の前記回分または流加培養が約４日～約１０日間行われる、請求項２３、２４、または２６に記載の方法。
  29. ステップ（ｄ）の前記回分および流加培養が、
    （ｉ）前記第３の培養培地の追加体積を前記第３の細胞培養物に第１の期間にわたって添加することと、
    （ｉｉ）第４の培養培地の追加体積を前記第３の細胞培養物に第２の期間にわたって添加することと、を含み、前記第４の培養培地が約０．５ｇ／Ｌ～約５２．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む、請求項２３、２４、２６、または２８に記載の方法。
  30. （ｉ）の前記第１の期間が約１日～約７日間であり、（ｉｉ）の前記第２の期間が約１日～約１０日間である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記第３の培養培地が約０．５ｇ／Ｌ～約２５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記第３の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの１つ以上をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記第４の培養培地が約０．５ｇ／Ｌ～約２５．０ｇ／Ｌのミオイノシトールを含む、請求項６～８、１３～１５、および２０～２２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記第４の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの１つ以上をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  35. ステップ（ｄ）の前記回分または流加培養が約８日～約１５日間行われる、請求項２３、２４、２６、および２８～３０のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記赤芽球前駆細胞がヒト赤芽球前駆細胞である、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記除核赤芽球細胞集団がヒト除核赤芽球細胞集団である、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記方法が、
    （ｅ）ステップ（ｄ）の前記第３の細胞培養物から前記除核赤芽球集団を単離することをさらに含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記方法が、
    （ｆ）ステップ（ｅ）で単離された前記除核赤芽球細胞集団を製剤化することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記方法が、
    （ｇ）ステップ（ｆ）の前記製剤化された除核赤芽球細胞集団を、それを必要とする対象に投与することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記方法が、ステップ（ａ）の前に、前記第１の細胞培養物中の前記赤芽球前駆細胞に核酸を導入することをさらに含み、
    前記方法により、操作された除核赤芽球細胞集団の産生がもたらされる、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記操作された除核赤芽球細胞集団が操作されたヒト除核赤芽球細胞である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記核酸が１つ以上の外因性ポリペプチドをコードする、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 前記操作されたヒト除核赤芽球細胞が１つ以上の外因性タンパク質を含む、請求項４１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記方法が、１つ以上の外因性タンパク質を前記細胞にクリックコンジュゲートすることをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記方法が、前記細胞を低張的にロードすることをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記方法が、物理的操作を介して前記細胞をロードすることをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  48. 前記１つ以上の外因性タンパク質のうちの１つが、前記操作されたヒト除核赤芽球細胞のサイトゾル中に存在する、請求項４４～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記１つ以上の外因性タンパク質のうちの１つが、前記操作されたヒト除核赤芽球細胞の膜上に存在するタンパク質である、請求項４４～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法によって産生される、除核赤芽球細胞集団。

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