JP2023182838A - Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、及び線維芽細胞活性化タンパク質と結合するタンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６、及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）と結合する多重特異性結合タンパク質に加えて、がん、自己免疫疾患、または線維症の治療のために有用な当該多重特異性結合タンパク質の医薬組成物及び治療方法を提供すること。【解決手段】本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体ならびに腫瘍関連抗原（ＦＡＰ）へ結合する、多重特異性結合タンパク質を提供する。かかるタンパク質は、２つ以上の種類のＮＫ活性化受容体に係合することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合をブロックし得る。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／６７２，２９９号の利益及び優先権を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、本明細書に参照することによってその全体が援用される。２０１９年５月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＤＦＹ＿０５６ＷＯ＿ＳＬ２５．ｔｘｔと命名され、１２１，６７０バイトのサイズである。

本発明は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）へ結合する、多重特異性結合タンパク質に関する。

がんは、この疾患を治療するために文献中で報告されているかなりの研究の努力及び科学の進歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。最も頻繁に診断されるがんのいくつかとしては、前立腺癌、乳癌、及び肺癌が挙げられる。前立腺癌は、男性において最も一般的ながんの形態である。乳癌は、依然として女性における死亡の最多の原因である。これらのがんのための現行の治療選択肢は、すべての患者にとって有効ではない、及び／またはかなりの有害な副作用を有し得る。他のタイプのがんも、既存の治療法の選択肢を使用して治療することは困難なままである。がん中のがん関連線維芽細胞は、しばしば悪性度を増進し、がん療法を阻害する。

がん免疫療法は、特異性が高く、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を容易にし得るので望ましい。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー等の融合タンパク質は、文献中で記載されるがん免疫療法であり、腫瘍細胞及びＴ細胞へ結合して腫瘍細胞の破壊を容易にするものである。ある特定の腫瘍関連抗原、免疫細胞、及び腫瘍微小環境中の他の細胞（例えばがん関連線維芽細胞）へ結合する抗体が、文献中で記載されている。例えばＷＯ２０１６／１３４３７１及びＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は先天性免疫系の構成要素であり、循環リンパ球のおよそ１５％を構成する。ＮＫ細胞は、事実上すべての組織に浸潤し、事前の感作を必要とせずに腫瘍細胞を有効に殺傷する能力によって元々特徴づけられた。活性化ＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞に類似する手段によって（すなわちパーフォリン及びグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒経由に加えて、死受容体経路経由で）、標的細胞を殺傷する。活性化ＮＫ細胞は、標的組織への他の白血球の動員を増進する炎症性サイトカイン（ＩＦＮ－γ及びケモカイン等）も分泌する。

ＮＫ細胞は、それらの表面上の様々な活性化受容体及び阻害性受容体を介してシグナルへ応答する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇する場合に、それらの活性はキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化を介して阻害される。代替的に、ＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇する場合に、それらは、活性化受容体（例えばＮＫＧ２Ｄ、自然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）、ＤＮＡＸアクセサリー分子１（ＤＮＡＭ１））経由で活性化される。ＮＫ細胞は、それらの表面上のＣＤ１６受容体を介していくつかの免疫グロブリンの定常領域によっても活性化される。ＮＫ細胞の活性化に対する全体的な感受性は、刺激性シグナル及び阻害性シグナルの合計に依存する。

線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）は、セリンプロテアーゼファミリーに属する、ホモ二量体の内在性膜ゼラチナーゼである。このタンパク質は、発生の間の線維芽細胞増殖または上皮間葉相互作用の制御、組織修復、及び上皮発癌に関与すると考えられる。すべてのヒト癌腫のうちの９０％超は活性化間質線維芽細胞上でのＦＡＰ発現を有する。間質線維芽細胞は、癌腫の発生、増殖、及び転移において重要な役割を果たす。ＦＡＰは、骨肉腫及び軟部組織肉腫の悪性細胞においても発現される。
本発明は、上で言及されたがんの治療を改善するための特定の利点を提供する。

国際公開第２０１６／１３４３７１号 国際公開第２０１５／０９５４１２号

本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体ならびに腫瘍関連抗原（ＦＡＰ）へ結合する、多重特異性結合タンパク質を提供する。かかるタンパク質は、２つ以上の種類のＮＫ活性化受容体に係合することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合をブロックし得る。ある特定の実施形態において、当該タンパク質は、ヒトにおけるＮＫ細胞をアゴナイズし得る。いくつかの実施形態において、当該タンパク質は、ヒト及び他の種（齧歯動物及びカニクイザル等）におけるＮＫ細胞をアゴナイズし得る。本発明の様々な態様及び実施形態は、以下でさらに詳細に記載される。

したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と；ＦＡＰと結合する第２の抗原結合部位と；ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体断片結晶化可能（Ｆｃ）ドメイン、その一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位とを組み込むタンパク質を提供する。

抗原結合部位は各々、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを組み込み得る（例えば抗体中でのようにアレンジされるか、または一緒に融合されてｓｃＦｖを形成する）か、または抗原結合部位の１つまたは複数が、単一ドメイン抗体（ラクダ抗体のようなＶ_ＨＨ抗体、または軟骨魚類中で見出されるもののようなＶ_ＮＡＲ抗体等）であり得る。

ある特定の態様において、本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体ならびにがん細胞上のＦＡＰへ結合する、多重特異性結合タンパク質を提供する。ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号１、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５、配列番号１６７、配列番号１７１、配列番号１７５、配列番号１７９、配列番号１８３、配列番号１８７、及び配列番号９３から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含み得る。

第１の抗原結合部位（それはいくつかの実施形態においてＮＫＧ２Ｄへ結合する）は、配列番号１に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有すること、及び／または配列番号１のＣＤＲ１（配列番号１０５または配列番号１５１）、ＣＤＲ２（配列番号１０６）、及びＣＤＲ３（配列番号１０７または配列番号１５２）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込むこと等によって、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込み得る。配列番号１に関連する重鎖可変ドメインは、様々な軽鎖可変ドメインとカップリングされてＮＫＧ２Ｄ結合部位を形成し得る。例えば、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込む第１の抗原結合部位は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、及び４０に関連する配列のうちの任意の１つから選択される軽鎖可変ドメインをさらに組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位は、配列番号１に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を備えた重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、及び４０から選択される配列のうちの任意の１つに少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を備えた軽鎖可変ドメインを組み込む。

代替的に、特定の実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号４１に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号４２に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４１に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号４１のＣＤＲ１（配列番号４３または配列番号１５３）、ＣＤＲ２（配列番号４４）、及びＣＤＲ３（配列番号４５または配列番号１５４）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号４２に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号４２のＣＤＲ１（配列番号４６）、ＣＤＲ２（配列番号４７）、及びＣＤＲ３（配列番号４８）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

ある特定の実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号４９に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号５０に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４９に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号４９のＣＤＲ１（配列番号５１または配列番号１５５）、ＣＤＲ２（配列番号５２）、及びＣＤＲ３（配列番号５３または配列番号１５６）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号５０に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号５０のＣＤＲ１（配列番号５４）、ＣＤＲ２（配列番号５５）、及びＣＤＲ３（配列番号５６）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

代替的に、第１の抗原結合部位は、配列番号５７に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の及び配列番号５８に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列をそれぞれ有すること等によって、配列番号５７に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号５８に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。別の実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号５９に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号６０に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号５９に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号５９のＣＤＲ１（配列番号１０８）、ＣＤＲ２（配列番号１０９）、及びＣＤＲ３（配列番号１１０）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号６０に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号６０のＣＤＲ１（配列番号１１１）、ＣＤＲ２（配列番号１１２）、及びＣＤＲ３（配列番号１１３）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号１０１に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の及び配列番号１０２に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列をそれぞれ有すること等によって、配列番号１０１に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１０２に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号１０３に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の及び配列番号１０４に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列をそれぞれ有すること等によって、配列番号１０３に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１０４に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。

第１の抗原結合部位（それはいくつかの実施形態においてＮＫＧ２Ｄへ結合する）は、配列番号６１に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号６２に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６１に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号６１のＣＤＲ１（配列番号６３または配列番号１５７）、ＣＤＲ２（配列番号６４）、及びＣＤＲ３（配列番号６５または配列番号１５８）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号６２に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号６２のＣＤＲ１（配列番号６６）、ＣＤＲ２（配列番号６７）、及びＣＤＲ３（配列番号６８）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号６９に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号７０に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６９に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号６９のＣＤＲ１（配列番号７１または配列番号１５９）、ＣＤＲ２（配列番号７２）、及びＣＤＲ３（配列番号７３または配列番号１６０）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７０に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号７０のＣＤＲ１（配列番号７４）、ＣＤＲ２（配列番号７５）、及びＣＤＲ３（配列番号７６）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号７７に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号７８に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号７７に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号７７のＣＤＲ１（配列番号７９または配列番号１６１）、ＣＤＲ２（配列番号８０）、及びＣＤＲ３（配列番号８１または配列番号１６２）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７８に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号７８のＣＤＲ１（配列番号８２）、ＣＤＲ２（配列番号８３）、及びＣＤＲ３（配列番号８４）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号８５に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号８５に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８５のＣＤＲ１（配列番号８７または配列番号１６３）、ＣＤＲ２（配列番号８８）、及びＣＤＲ３（配列番号８９または配列番号１６４）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）、及びＣＤＲ３（配列番号９２）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号１６７に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１６７に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１６７のＣＤＲ１（配列番号８７または配列番号１６８）、ＣＤＲ２（配列番号８８）、及びＣＤＲ３（配列番号１６９または配列番号１７０）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）、及びＣＤＲ３（配列番号９２）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号１７１に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１７１に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１７１のＣＤＲ１（配列番号８７または配列番号１７２）、ＣＤＲ２（配列番号８８）、及びＣＤＲ３（配列番号１７３または配列番号１７４）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）、及びＣＤＲ３（配列番号９２）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号１７５に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１７５に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１７５のＣＤＲ１（配列番号８７または配列番号１７６）、ＣＤＲ２（配列番号８８）、及びＣＤＲ３（配列番号１７７または配列番号１７８）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）、及びＣＤＲ３（配列番号９２）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号１７９に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１７９に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１７９のＣＤＲ１（配列番号８７または配列番号１８０）、ＣＤＲ２（配列番号８８）、及びＣＤＲ３（配列番号１８１または配列番号１８２）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）、及びＣＤＲ３（配列番号９２）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号１８３に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１８３に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１８３のＣＤＲ１（配列番号８７または配列番号１８４）、ＣＤＲ２（配列番号８８）、及びＣＤＲ３（配列番号１８５または配列番号１８６）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）、及びＣＤＲ３（配列番号９２）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号１８７に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１８７に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１８７のＣＤＲ１（配列番号８７または配列番号１８８）、ＣＤＲ２（配列番号８８）、及びＣＤＲ３（配列番号１８９または配列番号１９０）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）、及びＣＤＲ３（配列番号９２）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号９３に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号９４に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号９３に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号９３のＣＤＲ１（配列番号９５または配列番号１６５）、ＣＤＲ２（配列番号９６）、及びＣＤＲ３（配列番号９７または配列番号１６６）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９４に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号９４のＣＤＲ１（配列番号９８）、ＣＤＲ２（配列番号９９）、及びＣＤＲ３（配列番号１００）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

ある特定の実施形態において、第２の抗原結合部位はＦＡＰへ結合することができ、配列番号１１４に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８に関連する軽鎖可変ドメインを任意選択に組み込み得る。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１１４に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１１４のＣＤＲ１（配列番号１１５または配列番号１４７）、ＣＤＲ２（配列番号１１６または配列番号１４８）、及びＣＤＲ３（配列番号１１７）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１１８に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１１８のＣＤＲ１（配列番号１１９または配列番号１４９）、ＣＤＲ２（配列番号１２０）、及びＣＤＲ３（配列番号１２１）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

代替的に、ＦＡＰへ結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１３１に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１３５に関連する軽鎖可変ドメインを任意選択に組み込み得る。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１３１に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１３１のＣＤＲ１（配列番号１３２）、ＣＤＲ２（配列番号１３３）、及びＣＤＲ３（配列番号１３４）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１３５に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１３５のＣＤＲ１（配列番号１３６）、ＣＤＲ２（配列番号１３７）、及びＣＤＲ３（配列番号１３８）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

代替的に、ＦＡＰへ結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１３９に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１４３に関連する軽鎖可変ドメインを任意選択に組み込み得る。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１３９に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１３９のＣＤＲ１（配列番号１４０）、ＣＤＲ２（配列番号１４１）、及びＣＤＲ３（配列番号１４２）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１４３に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１４３のＣＤＲ１（配列番号１４４）、ＣＤＲ２（配列番号１４５）、及びＣＤＲ３（配列番号１４６）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

代替的に、ＦＡＰへ結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１２２に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１２６に関連する軽鎖可変ドメインを任意選択に組み込み得る。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１２２に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１２２のＣＤＲ１（配列番号１２３）、ＣＤＲ２（配列番号１２４）、及びＣＤＲ３（配列番号１２５）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１２６に少なくとも９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり得る、及び／または配列番号１２６のＣＤＲ１（配列番号１２７）、ＣＤＲ２（配列番号１２８）、及びＣＤＲ３（配列番号１２９）の配列に同一のアミノ酸配列を組み込む。

いくつかの実施形態において、第２の抗原結合部位は、第１の抗原結合部位中に存在する軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列に同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込む。

いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの一部を組み込み、抗体Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン及びＣＨ２ドメイン及び／またはヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸配列２３４～３３２に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態において、タンパク質は、腫瘍関連抗原へ結合する第４の抗原結合部位をさらに組み込み、それは、がんと関連する任意の抗原を含む。例えば、第４の抗原結合部位は、がん細胞上で発現される、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＣＤ２０、ＣＤ３３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、デルタ様カノニカルノッチリガンド（ＤＬＬ３）、ガングリオシドＧＤ２（ＧＤ２）、ＣＤ１２３、アノクタミン－１（Ａｎｏ１）、メソテリン、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（ＴＲＯＰ２）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、クローディン－１８．２、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、糖タンパク質非転移性悪性黒色腫タンパク質Ｂ（ＧＰＮＭＢ）、葉酸受容体α（ＦＲα）、妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰ－Ａ）、ＣＤ３７、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、Ｂ７ホモログ６（Ｂ７Ｈ６）、Ｃ－Ｃケモカイン受容体タイプ（ＣＣＲ４）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）４、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体２（ＲＯＲ２）、ＣＤ１３３、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、α鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３）／ＥＲＢＢ３、ヒト上皮増殖因子受容体４（ＨＥＲ４）／ＥＲＢＢ４、ムチン１（ＭＵＣ１）、チロシンタンパク質キナーゼＭＥＴ（ｃＭＥＴ）、シグナル伝達リンパ球活性化分子Ｆ７（ＳＬＡＭＦ７）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体２（ＴＲＡＩＬＲ２）、黒色腫関連抗原３（ＭＡＧＥ－Ａ３）、Ｂリンパ球抗原Ｂ７．１（Ｂ７．１）、Ｂリンパ球抗原Ｂ７．２（Ｂ７４．２）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、またはＣＤ２５抗原へ結合し得る。

本明細書において記載されるタンパク質のうちの任意の１つを含有する製剤；当該タンパク質を発現する１つまたは複数の核酸を含有する細胞、及び当該タンパク質を使用して、腫瘍細胞死を促進する方法も提供される。

本発明の別の態様は、患者におけるがんを治療する方法を提供する。方法は、治療有効量の本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質をそれを必要とする患者へ投与することを含む。ＦＡＰ標的化多重特異性結合タンパク質を使用して治療されるがんとしては、ＦＡＰを発現する任意のがん、例えば浸潤性乳管癌、膵管腺癌、胃癌、子宮癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、頭頸部癌、中皮腫、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、子宮内膜癌、神経内分泌癌、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、平滑筋肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、滑膜肉腫、神経鞘腫、黒色腫、及び神経膠腫が挙げられる。

ある特定の実施形態において、本発明は、患者における自己免疫疾患を治療する方法を提供する。方法は、治療有効量の本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質をそれを必要とする患者へ投与することを含む。ある特定の実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、グレーヴス病、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化症胆管炎、及び炎症性破壊性関節炎からなる群から選択される。

ある特定の実施形態において、本発明は、治療有効量の本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質をそれを必要とする患者へ投与することを含む、患者における線維症を治療する方法を提供する。ある特定の実施形態において、線維症は、特発性肺線維症、腎線維症、肝線維症、及び心筋線維化からなる群から選択される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
以下の：
（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と；
（ｂ）線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）と結合する第２の抗原結合部位と；
（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、
を含む、タンパク質。
（項目２）
前記第１の抗原結合部位が、ヒトにおけるＮＫＧ２Ｄへ結合する、項目１に記載のタンパク質。
（項目３）
前記第１の抗原結合部位が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、項目１または２に記載のタンパク質。
（項目４）
前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、項目３に記載のタンパク質。
（項目５）
前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、項目３または４に記載のタンパク質。
（項目６）
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、項目５に記載のタンパク質。
（項目７）
前記第１の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列に同一のアミノ酸配列を有する、項目５または６に記載のタンパク質。
（項目８）
前記第１の抗原結合部位が、配列番号１、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５、配列番号１６７、配列番号１７１、配列番号１７５、配列番号１７９、配列番号１８３、配列番号１８７、及び配列番号９３から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む、項目１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目９）
前記第１の抗原結合部位が、配列番号４１に少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号４２に少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、項目１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１０）
前記第１の抗原結合部位が、配列番号４９に少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号５０に少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、項目１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１１）
前記第１の抗原結合部位が、配列番号５７に少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号５８に少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、項目１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１２）
前記第１の抗原結合部位が、配列番号５９に少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号６０に少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、項目１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１３）
前記第１の抗原結合部位が、配列番号６１に少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号６２に少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、項目１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１４）
前記第１の抗原結合部位が、配列番号６９に少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号７０に少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、項目１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１５）
前記第１の抗原結合部位が、配列番号７７に少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号７８に少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、項目１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１６）
前記第１の抗原結合部位が、配列番号８５、配列番号１６７、配列番号１７１、配列番号１７５、配列番号１７９、配列番号１８３、または配列番号１８７に少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン、及び配列番号８６に少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、項目１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１７）
前記第１の抗原結合部位が、配列番号９３に少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号９４に少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、項目１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１８）
前記第１の抗原結合部位が、配列番号１０１に少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０２に少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、項目１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１９）
前記第１の抗原結合部位が、配列番号１０３に少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０４に少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、項目１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目２０）
前記第１の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、項目１または２に記載のタンパク質。
（項目２１）
前記単一ドメイン抗体が、Ｖ_ＨＨ断片またはＶ_ＮＡＲ断片である、項目２０に記載のタンパク質。
（項目２２）
前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、項目１～２または２０～２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目２３）
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、項目２２に記載のタンパク質。
（項目２４）
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１１４に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１１８に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１～２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目２５）
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１３１に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１３５に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１～２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目２６）
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１３９に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１４３に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１～２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目２７）
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１２２に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１２６に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１～２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目２８）
前記第２の抗原結合部位が、配列番号１１４及び１１８、１３１及び１３５、１３９及び１４３、ならびに１２２及び１２６からなる群から選択される、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列をそれぞれ含む、項目１～２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目２９）
前記第２の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、項目１～４または８～２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目３０）
前記第２の抗原結合部位が、Ｖ_ＨＨ断片またはＶ_ＮＡＲ断片である、項目２９に記載のタンパク質。
（項目３１）
前記タンパク質が、ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの一部を含み、前記抗体Ｆｃドメインが、ヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインを含む、項目１～３０のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目３２）
前記抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインを含む、項目３１に記載のタンパク質。
（項目３３）
前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目３１または３２に記載のタンパク質。
（項目３４）
前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃドメインに少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、Ｋ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で異なる、項目３３に記載のタンパク質。
（項目３５）
項目１～３４のいずれか１項に記載のタンパク質及び薬学的に許容される担体を含む、製剤。
（項目３６）
項目１～３４のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含む、細胞。
（項目３７）
腫瘍細胞死を促進する方法であって、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を有効量の項目１～３４のいずれか１項に記載のタンパク質へ曝露することを含む、前記方法。
（項目３８）
がんを治療する方法であって、有効量の項目１～３４のいずれか１項に記載のタンパク質または項目３５に記載の製剤を患者へ投与することを含む、前記方法。
（項目３９）
前記治療されるがんが、浸潤性乳管癌、膵管腺癌、胃癌、子宮癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、中皮腫、胃癌、膵臓癌、頭頸部癌、肝臓癌、子宮内膜癌、神経内分泌癌、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、平滑筋肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、滑膜肉腫、神経鞘腫、黒色腫、及び神経膠腫からなる群から選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
自己免疫疾患を治療する方法であって、有効量の項目１～３４のいずれか１項に記載のタンパク質または項目３５に記載の製剤を患者へ投与することを含む、前記方法。
（項目４１）
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、グレーヴス病、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化症胆管炎、及び炎症性破壊性関節炎からなる群から選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
線維症を治療する方法であって、有効量の項目１～３４のいずれか１項に記載のタンパク質または項目３５に記載の製剤を患者へ投与することを含む、前記方法。
（項目４３）
前記線維症が、特発性肺線維症、腎線維症、肝線維症、及び心臓線維症からなる群から選択される、項目４２に記載の方法。

ヘテロ二量体性の多重特異性結合タンパク質の図である。各々のアームは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたはＦＡＰについての結合ドメインのいずれかを表わし得る。多重特異性結合タンパク質は、ＣＤ１６へ結合するＦｃドメインまたはその一部をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及びＦＡＰ結合ドメインは、共通の軽鎖を共有し得る。 ヘテロ二量体性の多重特異性結合タンパク質図である。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたはＦＡＰへの結合ドメインのいずれかは、ｓｃＦｖフォーマット（右アーム）をとり得る。 ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒト組換えＮＫＧ２ＤへのＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）の結合親和性を示す線グラフである。 ＥＬＩＳＡアッセイにおけるカニクイザル組換えＮＫＧ２ＤへのＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）の結合親和性を示す線グラフである。 ＥＬＩＳＡアッセイにおけるマウス組換えＮＫＧ２ＤへのＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）の結合親和性を示す線グラフである。 平均蛍光強度（ＭＦＩ）のバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）としてフローサイトメトリーによって測定された、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）の結合を示す棒グラフである。 平均蛍光強度（ＭＦＩ）のバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）としてフローサイトメトリーによって測定された、マウスＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）の結合を示す棒グラフである。 ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドＵＬＢＰ－６との競合結合アッセイにおける、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ－ＦｃについてのＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）の結合親和性を示す線グラフである。 ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドＭＩＣＡとの競合結合アッセイにおける、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ－ＦｃについてのＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされた）の結合親和性を示す線グラフである。 ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドＲａｅ－１δとの競合結合アッセイにおける、組換えマウスＮＫＧ２Ｄ－ＦｃについてのＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）の結合親和性を示す線グラフである。 フローサイトメトリーによって測定され、ＴＮＦ－α陽性細胞のパーセンテージとして定量化された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）による、ヒトＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ３ζ融合タンパク質を発現する細胞の活性化を示す棒グラフである。 フローサイトメトリーによって測定され、ＴＮＦ－α陽性細胞のパーセンテージとして定量化された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）による、マウスＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ３ζ融合タンパク質を発現する細胞の活性化を示す棒グラフである。 フローサイトメトリーによって測定され、ＩＦＮ－γ^＋／ＣＤ１０７ａ^＋細胞のパーセンテージとして定量化された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）による、ヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。 フローサイトメトリーによって測定され、ＩＦＮ－γ^＋／ＣＤ１０７ａ^＋細胞のパーセンテージとして定量化された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）による、ヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。 フローサイトメトリーによって測定され、ＩＦＮ－γ^＋／ＣＤ１０７ａ^＋細胞のパーセンテージとして定量化された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）による、マウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。 フローサイトメトリーによって測定され、ＩＦＮ－γ^＋／ＣＤ１０７ａ^＋細胞のパーセンテージとして定量化された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）による、マウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。 Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｋｉｔ ａｓｓａｙを使用して測定された、ＴＨＰ－１腫瘍細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）の細胞傷害性効果を示す棒グラフである。 示差走査蛍光定量法によって測定された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとしてリストされる）の融解温度を示す棒グラフである。 フローサイトメトリーによって測定され、ＮＫ活性化マーカーについての陽性細胞のパーセンテージとして定量化された、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄの結合によるＮＫ細胞の相乗的活性化を示す棒グラフである。Ａは、プレートに結合させた、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体単独、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体単独、または抗ＣＤ１６抗体と抗ＮＫＧ２Ｄ抗体との組み合わせによる４時間の処理後のＣＤ１０７ａ^＋細胞のパーセンテージを示す。Ｂは、プレートに結合させた、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体単独、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体単独、または抗ＣＤ１６抗体と抗ＮＫＧ２Ｄ抗体との組み合わせによる４時間の処理後のＩＦＮ－γ^＋細胞のパーセンテージを示す。Ｃは、プレートに結合させた、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体単独、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体単独、または抗ＣＤ１６抗体と抗ＮＫＧ２Ｄ抗体との組み合わせによる４時間の処理後のＣＤ１０７ａ^＋／ＩＦＮ－γ^＋細胞のパーセンテージを示す。グラフは平均（ｎ＝２）±ＳＤを示す。データは、５名の異なる健康なドナーを使用した５つの独立した実験を代表するものである。 Ｔｒｉｏｍａｂ形態における多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 ＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態における多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））形態における多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 オルソゴナルＦａｂ界面（Ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ）形態における多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 ツー・イン・ワンＩｇ形態における多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 静電ステアリング（ＥＳ）形態における多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 制御されたＦａｂアーム交換（ｃＦＡＥ）形態における多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ボディ形態における多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 ＬｕＺ－Ｙ形態における多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 Ｃｏｖ－Ｘボディ形態における多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 κλ－ボディにおける多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。Ａは、κλ－ボディの１つ形態の例示の代表的な図であり；Ｂは、別のκλ－ボディの例示の代表的な図である。 １アーム単一鎖（ＯＡｓｃ）－Ｆａｂ形態における多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 ＤｕｅｔＭａｂ形態における多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態における多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 Ｆｉｔ－Ｉｇ形態における多重特異性結合タンパク質の代表的な図である。 ヒト細胞株のＬＬ８６（Ａ）、ＣＯＬＯ ８２９（Ｂ）及びＵ－８７ ＭＧ（Ｃ）上でのＦＡＰ発現を示すヒストグラムである。 ヒト細胞株のＬＬ８６（Ａ）、ＣＯＬＯ ８２９（Ｂ）及びＵ－８７ ＭＧ（Ｃ）上で発現されるＦＡＰについての、抗ＦＡＰモノクローナル抗体（ＦＡＰ－ｍＡｂ）及び抗ＦＡＰ多重特異性結合タンパク質（ＦＡＰ－多重特異性ＢＰ）の結合親和性を示す線グラフである。 多重特異性結合タンパク質（ＦＡＰ－多重特異性ＢＰ）、モノクローナル抗体（ＦＡＰ－ｍＡｂ）、またはアイソタイプ対照抗体により刺激された、２名の別個のドナー（ドナーＲＲ０１６１２、Ａ～Ｃ；及びドナー５５１０９、Ｄ）からの初代ヒトＮＫ細胞の、ＦＡＰを発現するＬＬ８６（Ａ）、ＣＯＬＯ８２９（Ｂ）、Ｕ－８７ ＭＧ（Ｃ）及びＣＯＬＯ８２９（Ｄ）細胞に対する細胞傷害性活性を示す線グラフである。 多重特異性結合タンパク質（ＦＡＰ－多重特異性ＢＰ）、モノクローナル抗体（ＦＡＰ－ｍＡｂ）、またはアイソタイプ対照抗体により刺激された、２名の別個のドナー（ドナーＲＲ０１６１２、Ａ～Ｃ；及びドナー５５１０９、Ｄ）からの初代ヒトＮＫ細胞の、ＦＡＰを発現するＬＬ８６（Ａ）、ＣＯＬＯ８２９（Ｂ）、Ｕ－８７ ＭＧ（Ｃ）及びＣＯＬＯ８２９（Ｄ）細胞に対する細胞傷害性活性を示す線グラフである。 多重特異性結合タンパク質（ＦＡＰ－多重特異性ＢＰ）、モノクローナル抗体（ＦＡＰ－ｍＡｂ）、またはアイソタイプ対照抗体により刺激された、２名の別個のドナー（ドナーＲＲ０１６１２、Ａ～Ｃ；及びドナー５５１０９、Ｄ）からの初代ヒトＮＫ細胞の、ＦＡＰを発現するＬＬ８６（Ａ）、ＣＯＬＯ８２９（Ｂ）、Ｕ－８７ ＭＧ（Ｃ）及びＣＯＬＯ８２９（Ｄ）細胞に対する細胞傷害性活性を示す線グラフである。 多重特異性結合タンパク質（ＦＡＰ－多重特異性ＢＰ）、モノクローナル抗体（ＦＡＰ－ｍＡｂ）、またはアイソタイプ対照抗体により刺激された、２名の別個のドナー（ドナーＲＲ０１６１２、Ａ～Ｃ；及びドナー５５１０９、Ｄ）からの初代ヒトＮＫ細胞の、ＦＡＰを発現するＬＬ８６（Ａ）、ＣＯＬＯ８２９（Ｂ）、Ｕ－８７ ＭＧ（Ｃ）及びＣＯＬＯ８２９（Ｄ）細胞に対する細胞傷害性活性を示す線グラフである。

本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体ならびにがん細胞上のＦＡＰと結合する、多重特異性結合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、腫瘍関連抗原と結合する追加の抗原結合部位をさらに含む。本発明は、がんの治療等の目的のための、かかる多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにかかる多重特異性結合タンパク質及び医薬組成物を使用する治療方法も提供する。本発明の様々な態様が下記の各セクション中で記載されるが、１つの特定のセクションにおいて記載される本発明の態様は、任意の特定のセクションへ限定されるものではない。

本発明の理解を容易にするために、多数の用語及び語句を以下で定義する。

「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」という用語は、本明細書において使用される時、文脈が不適切でなければ、「１つまたは複数の」を意味し、複数を包含する。

本明細書において使用される時、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）及び軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖及び軽鎖のＶ領域内の高度に多様性のある３つのストレッチは「超可変領域」と称され、それは「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された近接ストレッチの間に挟まれる。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリン中の超可変領域間で及びそれらに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間中で互いに相関して配置されて抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は結合される抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。ラクダ及び軟骨魚類等の特定の動物において、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」を提供する単一抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、インタクトな抗体中に、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合断片中に、またはｓｃＦｖ等の組換えポリペプチド中に（単一ポリペプチドにおいて重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインへ接続するためにペプチドリンカーを使用して）、存在し得る。

「腫瘍関連抗原」という用語は、本明細書において使用される時、がんと関連するタンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、または脂質が挙げられるがこれらに限定されない任意の抗原を意味する。かかる抗原は、悪性細胞上でまたは腫瘍微小環境中で（腫瘍関連血管、細胞外マトリックス、間葉系間質、または免疫浸潤物等上で）発現され得る。

本明細書において使用される時、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において記載される方法及び組成物によって治療される生物体を指す。かかる生物体としては、好ましくは哺乳動物（例えばマウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ及び同種のもの）が挙げられるがこれらに限定されず、より好ましくはヒトが挙げられる。

本明細書において使用される時、「有効量」という用語は、有益な効果または所望される結果となるのに十分な化合物（例えば本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１または複数回の投与、適用または投薬量で投与され得、特定の製剤または投与経路に限定されることは意図されない。本明細書において使用される時、「治療すること」という用語は、任意の効果、例えば病態、疾患、障害及び同種のものの改善をもたらす、軽減、低減、調節、改善もしくは消失、またはそれらの症状の改善を包含する。

本明細書において使用される時、「医薬組成物」という用語は、活性薬剤と、不活性担体または活性担体との組み合わせを指し、当該組み合わせは、組成物を、インビボまたはエクスビボの診断または治療の使用のために特に好適にする。

本明細書において使用される時、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝食塩溶液、水、エマルション（例えば油／水エマルションまたは水／油エマルション等）、及び様々なタイプの湿潤剤等の標準的な薬学的担体のうちの任意のものを指す。組成物は、安定化物質及び防腐物質も含み得る。担体、安定化物質及びアジュバントの例については、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９７５）を参照されたい。

本明細書において使用される時、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象への投与に際して、本発明の化合物またはその活性代謝物質もしくは残留物を提供することができる、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば酸または塩基）を指す。当業者に公知であるように、本発明の化合物の「塩」は、無機酸または有機酸及び無機塩基または有機塩基に由来し得る。例示的な酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、及び同種のものが挙げられるがこれらに限定されない。他の酸（シュウ酸等）は、それら自体は薬学的に許容されないが、本発明の化合物及びそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製において用いられ得る。

例示的な塩基としては、アルカリ金属（例えばナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）水酸化物、アンモニア、及び式ＮＷ_４ ^＋の化合物（式中、Ｗは、Ｃ_１－４アルキルである）、ならびに同種のものが挙げられるがこれらに限定されない。

例示的な塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホネート、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩（ｆｌｕｃｏｈｅｐｔａｎｏａｔｅ）、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホネート、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩、及び同種のものが挙げられるがこれらに限定されない。塩の他の例としては、Ｎａ^＋、ＮＨ_４ ^＋及びＮＷ_４ ^＋（式中、Ｗは、Ｃ_１－４アルキル基である）等の好適な陽イオン、ならびに同種のものと化合された本発明の化合物の陰イオンが挙げられる。

治療使用のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されるものであるものとして企図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸及び塩基の塩も、例えば薬学的に許容される化合物の調製または精製における用途が見出され得る。

本明細書を通して、組成物が、具体的な構成要素を有するか、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）か、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として記載される場合に、またはプロセス及び方法が具体的なステップを有するか、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）か、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として記載される場合に、追加で、列挙された構成要素から本質的になるかまたはそれらからなる本発明の組成物があること、及び列挙されたプロセシングステップから本質的になるかまたはそれらからなる本発明に従うプロセス及び方法があることが企図される。

一般的な事項として、パーセンテージを明記する組成物は、別段の定めのない限り、重量当たりである。さらに、変数に定義が伴わないならば、その時は変数の先の定義が優先する。

Ｉ．タンパク質
本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体ならびにがん細胞上のＦＡＰへ結合する、多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書において記載される医薬組成物及び治療方法において有用である。ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体への多重特異性結合タンパク質の結合は、ＦＡＰ抗原を発現する腫瘍細胞の破壊に向けたナチュラルキラー細胞の活性を促進する。ＦＡＰ発現細胞への多重特異性結合タンパク質の結合は、がん細胞をナチュラルキラー細胞と接近させ、それにより、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的及び間接的な破壊を容易にする。いくつかの例示的な多重特異性結合タンパク質のさらなる記載が、以下で提供される。

ある特定の他の実施形態において、本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体ならびに線維芽細胞上のＦＡＰへ結合する、多重特異性結合タンパク質を提供する。例えば、線維芽細胞は、自己免疫疾患または線維症を有する患者における活性化された間質線維芽細胞であり得る。ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体への多重特異性結合タンパク質の結合は、ＦＡＰ抗原を発現する線維芽細胞の破壊に向けたナチュラルキラー細胞の活性を促進する。ＦＡＰ発現細胞への多重特異性結合タンパク質の結合は、線維芽細胞をナチュラルキラー細胞と接近させ、それにより、ナチュラルキラー細胞による線維芽細胞の直接的及び間接的な破壊を容易にする。

多重特異性結合タンパク質の第１の構成要素は、ＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞（ＮＫ細胞、γδＴ細胞及びＣＤ８^＋αβＴ細胞が挙げられ得るがこれらに限定されない）へ結合する。ＮＫＧ２Ｄの結合に際して、多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄへ結合すること及びＮＫＧ２Ｄ受容体を活性化することから天然リガンド（ＵＬＢＰ６及びＭＩＣＡ等）をブロックし得る。

ある特定の実施形態において、多重特異性結合タンパク質の第２の構成要素は、ＦＡＰ発現細胞へ結合する。ＦＡＰ発現細胞は、例えば浸潤性乳管癌、膵管腺癌、胃癌、子宮癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、中皮腫、胃癌、膵臓癌、子宮内膜癌、神経内分泌癌、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、平滑筋肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、滑膜肉腫、神経鞘腫、黒色腫、及び神経膠腫中で見出され得るがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質は、腫瘍関連抗原（タンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、または脂質等であるがこれらに限定されない、がんと関連する任意の抗原が挙げられる）へ結合する追加の抗原結合部位をさらに組み込む。かかる抗原は、悪性細胞上でまたは腫瘍微小環境中で（腫瘍関連血管、細胞外マトリックス、間葉系間質、または免疫浸潤物等上で）発現され得る。例えば、追加の抗原結合部位は、がん細胞上で発現される、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＤＬＬ３、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ａｎｏ１、メソテリン、ＣＡＩＸ、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡ、クローディン－１８．２、ＲＯＲ１、５Ｔ４、ＧＰＮＭＢ、ＦＲα、ＰＡＰＰ－Ａ、ＣＤ３７、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ＦＬＴ３、ＧＰＣ３、Ｂ７Ｈ６、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ４、ＲＯＲ２、ＣＤ１３３、ＨＬＡ－Ｅ、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＤ２５抗原へ結合し得る。したがって、いくつかの実施形態において、がん細胞上で発現される腫瘍関連抗原への多重特異性結合タンパク質の結合は、細胞をナチュラルキラー細胞と接近させ、それにより、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的及び間接的な破壊に加えて、ナチュラルキラー細胞による骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）及び／または腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の破壊を容易にする。

多重特異性結合タンパク質についての第３の構成要素は、ＣＤ１６（ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞、及び濾胞樹状細胞を包含する白血球の表面上のＦｃ受容体）を発現する細胞へ結合する。

本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質は、様々なフォーマットをとり得る。例えば、１つのフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖、及び第２の免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体性の多重特異性抗体である（図１）。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメイン、第１の重鎖可変ドメイン、及び任意選択に第１のＣＨ１重鎖ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の軽鎖可変ドメイン及び第１の軽鎖定常ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と一緒に、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメイン、第２の重鎖可変ドメイン、及び任意選択に第２のＣＨ１重鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態において、第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン重鎖と一緒に、ＦＡＰと結合する抗原結合部位を形成する。第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインは一緒に、ＣＤ１６へ結合することが可能である（図１）。いくつかの実施形態において、第１の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン軽鎖に同一である。

別の例示的なフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖、及び免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体性の多重特異性抗体に関する（図２）。第１の免疫グロブリン重鎖は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（それらはペアになってＮＫＧ２Ｄと結合するかまたはＦＡＰと結合する）から構成される一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）へ、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれか経由で融合される第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメイン、第２の重鎖可変ドメイン、及び任意選択にＣＨ１重鎖ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖とペアになり、ＮＫＧ２Ｄへ結合するかまたはＦＡＰと結合する。第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインは一緒に、ＣＤ１６へ結合することが可能である（図２）。

１つまたは複数の追加の結合モチーフは、任意選択にリンカー配列経由で定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端へ融合され得る。ある特定の実施形態において、抗原結合部位は、一本鎖可変領域もしくはジスルフィド安定化可変領域（ｓｃＦｖ）であり得るか、または四価分子もしくは三価分子を形成し得る。

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質はＴｒｉｏｍａｂ形態であり、それはＩｇＧ様形状を維持する三機能二重特異性抗体である（例えば図２０中で表わされる多重特異性結合タンパク質）。このキメラ二重特異性抗体は２つの半分の抗体から構成され、各々は２つの親抗体を起源とする１つの軽鎖及び１つの重鎖を備える。Ｔｒｉｏｍａｂ形態は、１／２のラット抗体及び１／２のマウス抗体から構成されるヘテロ二量体であり得る。

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質はＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態であり、これはノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）技術を援用する（例えば図２１中で表わされる多重特異性結合タンパク質）。ＫｉＨ共通ＬＣ形態は、第１の標的へ結合するＦａｂ、第２の標的へ結合するＦａｂ、及びヘテロ二量体化突然変異によって安定化させたＦｃドメインを含む、ヘテロ二量体である。２つのＦａｂは各々重鎖及び軽鎖を含み、各々のＦａｂの重鎖は他のものとは異なり、各々それぞれの重鎖とペアになる軽鎖は両方のＦａｂに共通である。

ＫｉＨ技術は、ＣＨ３ドメインを操作して、各々の重鎖中で「ノブ」または「ホール」のいずれかを生成しヘテロ二量体化を増進することを伴う。１つのＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）中の「ノブ」の導入は、かさ高い残基による小さな残基の置換（例えばＥＵナンバリングにおいてＴ３６６Ｗ_ＣＨ３Ａ）を含む。「ノブ」を格納するために、相補的な「ホール」表面が、他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）上の、ノブに最も接近した付近の残基をより小さな１つにより置き換えること（例えばＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ_ＣＨ３Ｂ）によって導入される。「ホール」突然変異は、構造にガイドされたファージライブラリーのスクリーニングによって最適化された（Ａｔｗｅｌｌ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１）：２６－３５．）。ＫｉＨ ＦｃバリアントのＸ線結晶構造（Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２６（９）：１９４７－５７．；Ｍｉｍｏｔｏ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ；５８（１）：１３２－８．）により、ＣＨ３ドメインコア間の界面での立体化学的相補性によって駆動される疎水性相互作用によってヘテロ二量体化が熱力学的に優位になるが、ノブ－ノブ界面及びホール－ホール界面は、それぞれ立体障害及び好都合な相互作用の破壊に起因してホモ二量体化を優位としないということが実証された。

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））形態であり、それは２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメイン及び柔軟な天然に存在するリンカーを含む、四価ＩｇＧ様構造である（例えば図２２）。ＤＶＤ－Ｉｇ（商標）形態は、抗原１を標的化するＦａｂ可変ドメインのＮ末端に融合された抗原２を標的化する可変ドメインを含む、ホモ二量体である。図２２中で示される代表的な多重特異性結合タンパク質は、非修飾Ｆｃを含む。

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、オルソゴナルＦａｂ界面（Ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ）形態である（例えば図２３中で表わされる多重特異性結合タンパク質）。Ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ ＩｇＧアプローチにおいて（Ｌｅｗｉｓ Ｓ．Ｍ．，ｅｔ
ａｌ．（２０１４），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；３２（２）：１９１－８．）、構造に基づく領域デザインは、他方のＦａｂを変化させること無しに、１つのＦａｂのみにおいてＬＣとＨＣ_{ＶＨ－ＣＨ１}との界面で相補的変異を導入する。

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、ツー・イン・ワンＩｇ形態である（例えば図２４中で表わされる多重特異性結合タンパク質）。

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、静電ステアリング（ＥＳ）形態であり、それは標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂならびにＦｃドメインを含む、ヘテロ二量体である（例えば図２５中で表わされる多重特異性結合タンパク質）。ヘテロ二量体化は、Ｆｃドメイン中の静電ステアリング突然変異によって保証される。

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、制御されたＦａｂアーム交換（ｃＦＡＥ）形態である（例えば図２６中で表わされる多重特異性結合タンパク質）。ｃＦＡＥ形態は、標的１及び標的２へ結合する２つの異なるＦａｂを含む二重特異性ヘテロ二量体であり、ＬＣ－ＨＣペア（半分の分子）は別の分子からのＬＣ－ＨＣペアによりスワッピングされる。ヘテロ二量体化は、Ｆｃ中の突然変異によって保証される。

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、鎖交換操作されたドメイン（ＳＥＥＤ）ボディ形態である（例えば図２７中で表わされる多重特異性結合タンパク質）。ＳＥＥＤプラットフォームは、天然の抗体の治療適用を拡大するために非対称且つ二重特異性の抗体様分子を生成するようにデザインされた。このタンパク質操作プラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメイン内の免疫グロブリンクラスの構造的に関連する配列を交換すること（例えばＩｇＡ及びＩｇＧのＣＨ３ドメイン配列のセグメントを交替すること）に基づく。ＳＥＥＤデザインは、ヘテロ二量体の効率的な生成を可能にする一方で、ＳＥＥＤ ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を不利にする（Ｍｕｄａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．；２４（５）：４４７－５４．）。いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、ＬｕＺ－Ｙ形態である（例えば図２８中で表わされる多重特異性結合タンパク質）。ＬｕＺ－Ｙ形態は、Ｆｃドメインへ融合された標的１及び標的２へ結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含む、ヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃドメインのＣ末端へ融合されたロイシンジッパーモチーフの導入を介して保証される（Ｗｒａｎｉｋ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２８７：４３３３１－９．）。

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、Ｃｏｖ－Ｘ－ボディ形態である（例えば図２９中で表わされる多重特異性結合タンパク質）。二重特異性ＣｏｖＸ－ボディは、各々のＦａｂアームへ共有結合で連結されるファーマコフォアペプチドヘテロ二量体を有するスキャフォールド抗体を含み、ペプチドヘテロ二量体の１つの分子は第１の標的に結合し、ペプチドヘテロ二量体の他方の分子は第２の標的に結合し、２つの分子はアゼチジノンリンカーによって繋がれる。ファーマコフォアは機能活性を担うが、抗体スキャフォールドは長い半減期及びＩｇ様分布を付与する。ファーマコフォアは化学的に最適化され得るか、または他のファーマコフォアにより置き換えられて最適化されたもしくはユニークな二重特異性抗体を生成し得る（Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ Ｖ．Ｒ．ｅｔ
ａｌ．（２０１０）ＰＮＡＳ；１０７（５２）：２２６１１－２２６１６．）。

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、κλ－ボディ形態であり、それはヘテロ二量体化突然変異によって安定化させたＦｃドメインへ融合された２つの異なるＦａｂを含む、ヘテロ二量体である（例えば図３０中で表わされる多重特異性結合タンパク質）。標的１と結合する第１のＦａｂはκＬＣを含み、標的２と結合する第２のＦａｂはλＬＣを含む。図３０Ａはκλ－ボディの１つの形態の例示的な表示であり；図３０Ｂは別のκλ－ボディの例示的な表示である。

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、１アーム単一鎖（ＯＡｓｃ）－Ｆａｂ形態である（例えば図３１中で表わされる多重特異性結合タンパク質）。ＯＡｓｃ－Ｆａｂ形態は、Ｆｃドメインへ融合された標的１へ結合するＦａｂ及び標的２へ結合するｓｃＦａｂを含むヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃドメイン中の突然変異によって保証される。

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、ＤｕｅｔＭａｂ形態である（例えば図３２中で表わされる多重特異性結合タンパク質）。ＤｕｅｔＭａｂ形態は、標的１及び標的２へ結合する２つの異なるＦａｂならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化させたＦｃドメインを含む、ヘテロ二量体である。２つの異なるＦａｂは、正確なＬＣ及びＨＣのペアリングを保証する異なるＳ－Ｓ架橋を含む。

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態である（例えば図３３中で表わされる多重特異性結合タンパク質）。ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態は、標的１及び標的２へ結合する２つの異なるＦａｂならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化させたＦｃドメインを含む、ヘテロ二量体である。ＣＬドメインとＣＨ１ドメイン及びＶＨドメインとＶＬドメインがスイッチされ、例えばＣＨ１はＶＬと一列になって融合される一方で、ＣＬはＶＨと一列になって融合される。

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｉｔ－Ｉｇ形態である（例えば図３４中で表わされる多重特異性結合タンパク質）。Ｆｉｔ－Ｉｇ形態は、標的１へ結合するＦａｂのＨＣのＮ末端へ融合された標的２へ結合するＦａｂを含むホモ二量体である。図３４の代表的な多重特異性結合タンパク質は、非修飾Ｆｃドメインを含む。

表１は、組み合わせでＮＫＧ２Ｄへ結合し得る、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列をリストする。別段の指示のない限り、表１中で提供されるＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ下で決定される。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄへの結合親和性において変動し得るが、それにもかかわらず、それらはすべて、ヒトＮＫＧ２Ｄ及びＮＫ細胞を活性化する。

代替的に、配列番号１０１によって表わされる重鎖可変ドメインは、ＵＳ９，２７３，１３６中で例証されるように、配列番号１０２によって表わされる軽鎖可変ドメインとペアになって、ＮＫＧ２Ｄへ結合し得る抗原結合部位を形成し得る。
配列番号１０１
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＧＬＧＤＧＴＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号１０２
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮＷＹＱＱＬＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＤＤＬＬＰＳＧＶＳＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＦＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ

代替的に、配列番号１０３によって表わされる重鎖可変ドメインは、ＵＳ７，８７９，９８５中で例証されるように、配列番号１０４によって表わされる軽鎖可変ドメインとペアになって、ＮＫＧ２Ｄへ結合し得る抗原結合部位を形成し得る。
配列番号１０３
ＱＶＨＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＤＤＳＩＳＳＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＳＹＳＧＳＡＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＮＷＤＤＡＦＮＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号１０４
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ

ある特定の実施形態において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体ならびにがん細胞上の抗原ＦＡＰへ結合する、多重特異性結合タンパク質を提供する。表２は、組み合わせでＦＡＰへ結合し得る、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのいくつかの例示的配列をリストする。以下の表２中でリストされ、対応する特許及び出版物中で記載される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列のＣＤＲ配列は、参照することによって本明細書に援用される。別段の指示のない限り、表２中で提供されるＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ下で決定される。

代替的に、ＦＡＰへ結合し得る新規抗原結合部位は、配列番号１３０によって定義されたアミノ酸配列への結合についてのスクリーニングによって同定され得る。
配列番号１３０
ＭＫＴＷＶＫＩＶＦＧＶＡＴＳＡＶＬＡＬＬＶＭＣＩＶＬＲＰＳＲＶＨＮＳＥＥＮＴＭＲＡＬＴＬＫＤＩＬＮＧＴＦＳＹＫＴＦＦＰＮＷＩＳＧＱＥＹＬＨＱＳＡＤＮＮＩＶＬＹＮＩＥＴＧＱＳＹＴＩＬＳＮＲＴＭＫＳＶＮＡＳＮＹＧＬＳＰＤＲＱＦＶＹＬＥＳＤＹＳＫＬＷＲＹＳＹＴＡＴＹＹＩＹＤＬＳＮＧＥＦＶＲＧＮＥＬＰＲＰＩＱＹＬＣＷＳＰＶＧＳＫＬＡＹＶＹＱＮＮＩＹＬＫＱＲＰＧＤＰＰＦＱＩＴＦＮＧＲＥＮＫＩＦＮＧＩＰＤＷＶＹＥＥＥＭＬＡＴＫＹＡＬＷＷＳＰＮＧＫＦＬＡＹＡＥＦＮＤＴＤＩＰＶＩＡＹＳＹＹＧＤＥＱＹＰＲＴＩＮＩＰＹＰＫＡＧＡＫＮＰＶＶＲＩＦＩＩＤＴＴＹＰＡＹＶＧＰＱＥＶＰＶＰＡＭＩＡＳＳＤＹＹＦＳＷＬＴＷＶＴＤＥＲＶＣＬＱＷＬＫＲＶＱＮＶＳＶＬＳＩＣＤＦＲＥＤＷＱＴＷＤＣＰＫＴＱＥＨＩＥＥＳＲＴＧＷＡＧＧＦＦＶＳＴＰＶＦＳＹＤＡＩＳＹＹＫＩＦＳＤＫＤＧＹＫＨＩＨＹＩＫＤＴＶＥＮＡＩＱＩＴＳＧＫＷＥＡＩＮＩＦＲＶＴＱＤＳＬＦＹＳＳＮＥＦＥＥＹＰＧＲＲＮＩＹＲＩＳＩＧＳＹＰＰＳＫＫＣＶＴＣＨＬＲＫＥＲＣＱＹＹＴＡＳＦＳＤＹＡＫＹＹＡＬＶＣＹＧＰＧＩＰＩＳＴＬＨＤＧＲＴＤＱＥＩＫＩＬＥＥＮＫＥＬＥＮＡＬＫＮＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬＥＶＤＥＩＴＬＷＹＫＭＩＬＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰＬＬＩＱＶＹＧＧＰＣＳＱＳＶＲＳＶＦＡＶＮＷＩＳＹＬＡＳＫＥＧＭＶＩＡＬＶＤＧＲＧＴＡＦＱＧＤＫＬＬＹＡＶＹＲＫＬＧＶＹＥＶＥＤＱＩＴＡＶＲＫＦＩＥＭＧＦＩＤＥＫＲＩＡＩＷＧＷＳＹＧＧＹＶＳＳＬＡＬＡＳＧＴＧＬＦＫＣＧＩＡＶＡＰＶＳＳＷＥＹＹＡＳＶＹＴＥＲＦＭＧＬＰＴＫＤＤＮＬＥＨＹＫＮＳＴＶＭＡＲＡＥＹＦＲＮＶＤＹＬＬＩＨＧＴＡＤＤＮＶＨＦＱＮＳＡＱＩＡＫＡＬＶＮＡＱＶＤＦＱＡＭＷＹＳＤＱＮＨＧＬＳＧＬＳＴＮＨＬＹＴＨＭＴＨＦＬＫＱＣＦＳＬＳＤ

Ｆｃドメイン内で、ＣＤ１６の結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインによって媒介される。例えばヒトＩｇＧ１内で、ＣＤ１６との相互作用は、主として、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５～Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７～Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７～Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４～Ｓｅｒ２３９、及びＣＨ２ドメイン中の炭水化物残基Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン上に集中する（例えばＳｏｎｄｅｒｍａｎｎ Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ；４０６（６７９３）：２６７－２７３．を参照）。既知のドメインに基づいて、突然変異は、ファージディスプレイライブラリーもしくは酵母の表面にディスプレイされるｃＤＮＡライブラリー等の使用によって、ＣＤ１６への結合親和性を促進するかもしくは低減させるように選択され得るか、または相互作用の公知の三次元構造に基づいてデザインされ得る。

ヘテロ二量体性の抗体重鎖のアセンブリは、同じ細胞中で２つの異なる抗体重鎖配列の発現によって達成され得、これはヘテロ二量体のアセンブリに加えて、各々の抗体重鎖のホモ二量体のアセンブリを導き得る。ヘテロ二量体の選択的アセンブリの増進は、ＵＳ１３／４９４，８７０、ＵＳ１６／０２８，８５０、ＵＳ１１／５３３，７０９、ＵＳ１２／８７５，０１５、ＵＳ１３／２８９，９３４、ＵＳ１４／７７３，４１８、ＵＳ１２／８１１，２０７、ＵＳ１３／８６６，７５６、ＵＳ１４／６４７，４８０、及びＵＳ１４／８３０，３３６中で示されるように、各々の抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン中に異なる突然変異を組み込むことによって達成され得る。例えば、ヒトＩｇＧ１に基づいて、そして第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド内の別個のペアのアミノ酸置換（これらの２つの鎖が互いと選択的にヘテロ二量体化することを可能にする）を組み込んで、突然変異をＣＨ３ドメイン中で生じさせることができる。以下に示されるアミノ酸置換の位置はすべて、Ｋａｂａｔでのように、ＥＵインデックスに従ってナンバリングされる。

１つのシナリオにおいて、第１のポリペプチド中のアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）から選択されるより大きなアミノ酸により置き換え、第２のポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、元のアミノ酸（複数可）を、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）またはバリン（Ｖ）から選ばれるより小さなアミノ酸（複数可）により置き換えるものであり、その結果、より大きなアミノ酸置換（突起）がより小さなアミノ酸置換（空洞）の表面へとフィットする。例えば、１つのポリペプチドはＴ３６６Ｗ置換を組み込むことができ、他のものは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込むことができる。

本発明の抗体重鎖可変ドメインは、抗体定常領域（ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域等）に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列へ、ＣＨ１ドメイン有りまたは無しで、任意選択にカップリングされ得る。いくつかの実施形態において、定常領域のアミノ酸配列は、ヒト抗体定常領域（ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域等）に少なくとも９０％同一である。他のいくつかの実施形態において、定常領域のアミノ酸配列は、別の哺乳動物（ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマ等）からの抗体定常領域に少なくとも９０％同一である。１つまたは複数の突然変異は、ヒトＩｇＧ１定常領域に比較して、例えばＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及び／またはＫ４３９で、定常領域の中へ組み込まれ得る。例示的な置換としては、例えばＱ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅが挙げられる。

ある特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１の中へ組み込まれ得る突然変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、及び／またはＶ１７３でのものであり得る。ある特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκの中へ組み込まれ得る突然変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、及び／またはＴ１６４でのものであり得る。

代替的に、アミノ酸置換は、表３中で示される以下の置換のセットから選択され得る。

代替的に、アミノ酸置換は、表４中で示される以下の置換のセットから選択され得る。

代替的に、アミノ酸置換は、表５中で示される以下の置換のセットから選択され得る。

代替的に、各々のポリペプチド鎖中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、表６から選択され得る。

代替的に、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表７中の以下の置換のセットから選択され、そこで、第１のポリペプチドのカラム中で示される位置（複数可）は、任意の既知の負に荷電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドのカラム中で示される位置（複数可）は、任意の既知の正に荷電したアミノ酸によって置き換えられる。

代替的に、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表８中の以下の置換のセットから選択され、そこで、第１のポリペプチドのカラム中で示される位置（複数可）は、任意の既知の正に荷電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドのカラム中で示される位置（複数可）は、任意の既知の負に荷電したアミノ酸によって置き換えられる。

代替的に、アミノ酸置換は、表９中の以下のセットから選択され得る。

代替的にまたは加えて、ヘテロ多量体タンパク質の構造安定性は、第１のポリペプチド鎖または第２のポリペプチド鎖のいずれか上にＳ３５４Ｃを導入し、向かい合うポリペプチド鎖上にＹ３４９Ｃを導入して、それが２つのポリペプチドの界面内で人工的ジスルフィド架橋を形成することによって、増加し得る。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、位置Ｔ３６６で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８、及びＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８、及びＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、位置Ｔ３６６で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００、及びＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、及びＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、及びＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００、及びＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０、及びＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９、及びＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９、及びＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７、及びＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、及びＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７、及びＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７、及びＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、及びＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６、及びＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２、及びＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２、及びＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６、及びＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態において、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

上で記載される多重特異性結合タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列は、第１の発現ベクターの中へクローニングされ得、第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列は、第２の発現ベクターの中へクローニングされ得、免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列は、第３の発現ベクターの中へクローニングされ得、第１の発現ベクター、第２の発現ベクター、及び第３の発現ベクターは、安定的に宿主細胞の中へ一緒にトランスフェクションされて、多量体タンパク質を産生し得る。

多重特異性タンパク質の最も高い収率を達成するために、第１の発現ベクター、第２の発現ベクター、及び第３の発現ベクターの異なる比率が探索されて、宿主細胞の中へのトランスフェクションについての最適な比率が決定され得る。トランスフェクション後に、単一クローンは、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、顕微鏡検査、またはＣｌｏｎｅｐｉｘ等の当技術分野において公知の方法を使用して、細胞バンク生成のために単離され得る。

クローンは、バイオリアクターのスケールアップに好適な条件下で培養され、多重特異性タンパク質の発現を維持し得る。多重特異性結合タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、ホモジナイズ、凍結融解、親和性精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、及び混合モードクロマトグラフィーが含まれる、当技術分野において公知の方法を使用して、単離及び精製され得る。

ＩＩ．多重特異性結合タンパク質の特徴
本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位、ＣＤ１６結合部位、及びＦＡＰについての結合部位を含む。ある特定の実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ及び／またはＣＤ１６を発現する細胞（ＮＫ細胞等）、ならびにＦＡＰを発現する腫瘍細胞に同時に結合する。ＮＫ細胞への多重特異性結合タンパク質の結合は、がん細胞の破壊に向けたＮＫ細胞の活性を促進し得る。

ある特定の実施形態において、本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質は、同じＦＡＰ結合部位を有する対応するモノクローナル抗体の親和性に類似する親和性でＦＡＰへ結合する。ある特定の実施形態において、本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質は、腫瘍増殖を低減させること及びＦＡＰを発現する腫瘍細胞を殺傷することに、同じＦＡＰ結合部位を有する対応するモノクローナル抗体よりも有効であり得る。

ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合部位及びＦＡＰ結合部位を含む本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質は、ＦＡＰを発現する腫瘍細胞と共に共培養された場合に、初代ヒトＮＫ細胞を活性化する。ＮＫ細胞活性化は、ＣＤ１０７ａ発現、脱顆粒、及びＩＦＮ－γサイトカイン産生の増加を特徴とする。さらに、本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質は、同じＦＡＰ結合部位を有する対応するモノクローナル抗体に比較して、ＦＡＰを発現する腫瘍細胞の存在下におけるヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示し得る。

ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合部位及びＦＡＰについての結合部位を含む本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質は、ＦＡＰを発現する腫瘍細胞の存在下における静止したＩＬ－２活性化ヒトＮＫ細胞の活性化を促進し得る。

ある特定の実施形態において、本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質は、同じＦＡＰ結合部位を有する対応するモノクローナル抗体に比較して、ＦＡＰを発現する腫瘍細胞に対してより高い細胞傷害性活性を有し得る。

ＩＩＩ．治療適用
本発明は、本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質及び／または本明細書において記載される医薬組成物を使用して、がんを治療するための方法を提供する。当該方法を使用して、ＦＡＰを発現する様々ながんを治療することができる。治療される例示的ながんは、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、子宮内膜癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、頭頸部癌、卵巣癌、食道癌、腎癌、肝臓癌、精巣癌、ならびに口腔癌、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、黒色腫、皮膚の基底細胞癌及び有棘細胞癌、神経膠腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、ならびに中皮腫であり得る。

他のいくつかの実施形態において、治療される例示的ながんは、末端性黒子性黒色腫、光線角化症、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺癌、腺様嚢胞癌、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管癌、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管肉腫、肛門直腸癌、星状細胞系腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌（例えば皮膚）、Ｂ細胞リンパ腫、胆道癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、気管支腺癌、バーキットリンパ腫、カルチノイド、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫／脈絡叢癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、結合組織癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、嚢胞腺腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜癌／子宮内膜増殖症、子宮内膜間質部肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞癌、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、上衣癌、上皮細胞癌、食道癌、ユーイング肉腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性のナチュラルキラー細胞リンパ腫／Ｔ細胞リンパ腫、眼癌及び眼窩癌、女性生殖器癌、限局性結節性過形成、濾胞性リンパ腫、胆嚢癌、胃前庭部癌、胃癌、胃底部癌、ガストリノーマ、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、グルカゴノーマ、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、血液腫瘍、肝腺腫、肝腺腫症、肝細胞癌、肝胆道癌、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮内扁平上皮細胞新生物、肝内胆管癌、浸潤性扁平上皮細胞癌、空腸癌、関節癌、カポジ肉腫、腎臓癌、大細胞癌、大腸癌、平滑筋肉腫、悪性黒子型黒色腫、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、男性生殖器癌、悪性黒色腫、悪性中皮腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、髄芽細胞腫、髄様上皮腫、黒色腫、髄膜癌、中皮癌、中皮腫、転移性癌、口内癌、粘液性類表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、骨髄異形成新生物、骨髄増殖性新生物、鼻腔癌、神経系癌、神経芽細胞腫、神経上皮腺癌、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、結節型黒色腫、非上皮皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠細胞癌、口腔癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭状漿液性腺癌、耳下腺癌、骨盤癌、陰茎癌、末梢Ｔ細胞リンパ腫、咽頭癌、下垂体部腫瘍、形質細胞腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、偽肉腫、肺芽腫、直腸癌、腎癌、腎細胞癌、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、小リンパ球性リンパ腫、平滑筋癌、軟部組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎癌、脾辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、有棘細胞癌（例えば皮膚）、横紋筋癌、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、中皮下癌（ｓｕｂｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、甲状腺癌、舌癌、未分化癌腫、尿管癌、尿道癌、膀胱癌、子宮癌、子宮体癌、ブドウ膜黒色腫、膣癌、疣状癌、ＶＩＰ産生腫瘍、外陰癌、高分化癌、またはウィルムス腫瘍であり得る。

ある特定の実施形態において、本発明は、患者における自己免疫疾患を治療する方法を提供する。治療される例示的な自己免疫疾患としては、関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、炎症を伴う破壊性関節炎、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、若年型糖尿病、多発性硬化症、骨関節炎、乾癬性関節炎、乾癬、皮膚炎、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性筋炎／皮膚筋炎、中毒性表皮剥離症、全身性強皮症及び全身性硬化症、炎症性大腸疾患と関連する応答、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、脳膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー性病態、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤及び慢性的な炎症応答を伴う病態、アレルギー性脳脊髄炎、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅延性の過敏症と関連する免疫応答、結核、サーコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症が含まれる肉芽腫症、顆粒球減少症、血管炎（ＡＮＣＡが含まれる）、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）が含まれる免疫性溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠損症、血友病Ａ、自己免液性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、多臓器損傷症候群、重症筋無力症、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、ランバート・イートン筋無力症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、固形臓器移植拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、自己免疫性多内分泌症、ライター病、スティッフマン症候群、巨細胞性動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性ニューロパシーまたはＩｇＭ媒介性ニューロパシー、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性精巣炎及び自己免疫性卵巣炎が含まれる精巣及び卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、原発性硬化性胆管炎、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーヴス病、多腺性自己免疫症候群（または多腺性内分泌症候群）、１型糖尿病（インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも称される）、及びシーハン症候群が含まれる、自己免疫性内分泌疾患；自己免疫性肝炎、リンパ球様間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植）ｖｓ ＮＳＩＰ、ギラン・バレー症候群、大型血管炎（リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞性動脈炎（高安動脈炎）が含まれる）、中型血管炎（川崎病及び結節性多発動脈炎が含まれる）、強直性脊椎炎、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、急性進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変症、セリアック病（グルテン性腸症）、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、または冠動脈疾患が挙げられる。

ある特定の実施形態において、本発明は、患者における線維症を治療する方法を提供する。方法は、治療有効量の本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質をそれを必要とする患者へ投与することを含む。ＦＡＰを標的化する多重特異的結合タンパク質を使用して治療される線維症は、間質性肺炎、肝硬変、腎臓疾患、心疾患、眼疾患、硬皮症、ケロイド瘢痕及び肥厚性瘢痕、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄、術後瘢痕、化学療法薬使用、放射線療法、肉体的怪我、または熱傷と関連し得る。例えば、線維症は、特発性肺線維症、腎線維症、肝線維症、または心臓線維症であり得る。

ＩＶ．併用療法
本発明の別の態様は、併用療法を提供する。本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質は、がんを治療するための追加の治療剤と組み合わせて使用され得る。

がんの治療における併用療法の一部分として使用され得る例示的な治療剤としては、例えば放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、チマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミソール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、フォルメスタン、インターフェロン－α、インターフェロン－２α、インターフェロン－β、インターフェロン－γ、コロニー刺激因子－１、コロニー刺激因子－２、デニロイキン・ディフティトックス、インターロイキン－２、黄体形成ホルモン放出因子、ならびに同族受容体への差異的な結合及び増加または減少した血清半減期を提示し得る前述の薬剤の変形が挙げられる。

がんの治療における併用療法の一部分として使用され得る追加のクラスの薬剤は、免疫チェックポイント阻害物質である。例示的な免疫チェックポイント阻害物質としては、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７－Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７－Ｈ４、及び（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１つまたは複数を阻害する薬剤が挙げられる。ＣＴＬＡ４阻害物質イピリムマブは、黒色腫を治療するために米国食品医薬品局によって承認されている。

がんの治療における併用療法の一部分として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェックポイント標的を標的化するモノクローナル抗体剤（例えばハーセプチン）及び非細胞傷害剤（例えばチロシンキナーゼ阻害物質）である。

さらに他のカテゴリーの抗がん剤としては、例えば（ｉ）ＡＬＫ阻害物質、ＡＴＲ阻害物質、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基切除修復阻害物質、Ｂｃｒ－Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害物質、ブルトン型チロシンキナーゼ阻害物質、ＣＤＣ７阻害物質、ＣＨＫ１阻害物質、サイクリン依存性キナーゼ阻害物質、ＤＮＡ－ＰＫ阻害物質、ＤＮＡ－ＰＫ及びｍＴＯＲの両方の阻害物質、ＤＮＭＴ１阻害物質、ＤＮＭＴ１阻害物質プラス２－クロロ－デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害物質、ヘッジホッグシグナル経路阻害物質、ＩＤＯ阻害物質、ＪＡＫ阻害物質、ｍＴＯＲ阻害物質、ＭＥＫ阻害物質、ＭＥＬＫ阻害物質、ＭＴＨ１阻害物質、ＰＡＲＰ阻害物質、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害物質、ＰＡＲＰ１及びＤＨＯＤＨの両方の阻害物質、プロテアソーム阻害物質、トポイソメラーゼＩＩ阻害物質、チロシンキナーゼ阻害物質、ＶＥＧＦＲ阻害物質、ならびにＷＥＥ１阻害物質から選択される阻害物質；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、またはＩＣＯＳのアゴニスト；ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦから選択されるサイトカインが挙げられる。

本発明のタンパク質は、原発巣の外科的除去への補助としても使用され得る。

多重特異性結合タンパク質及び追加の治療剤の量、ならびに相対的な投与タイミングは、所望の併用療法効果を達成するために選択され得る。例えば、かかる投与を必要とする患者へ併用療法を施す場合に、併用における治療剤、または治療剤を含む医薬組成物（複数可）は、任意の順序（例えば順次に、並列して、一緒に、同時に、及び同種のもの等）で投与され得る。さらに例えば、多重特異性結合タンパク質は、追加の治療剤（複数可）がその予防的効果または治療的効果を発揮する間に投与され得、またはその逆もあり得る。

Ｖ．医薬組成物
本開示は、本明細書において記載されるタンパク質の治療有効量を含有する医薬組成物も特色とする。組成物は、様々な薬物送達系における使用のために製剤化され得る。１つまたは複数の生理学的に許容される賦形剤または担体も、適切な製剤化のために組成物中に含まれ得る。本開示における使用に好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７^ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８５）中で見出される。薬物送達のための方法の短い総説については、例えばＬａｎｇｅｒ Ｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ；２４９（４９７６）：１５２７－１５３３を参照されたい。

本開示の静脈注射薬送達製剤は、バッグ、ペンまたはシリンジ中に含有され得る。ある特定の実施形態において、バッグは、チューブ及び／または針を含むチャンネルへ接続され得る。ある特定の実施形態において、製剤は、凍結乾燥製剤または液体製剤であり得る。ある特定の実施形態において、製剤は冷凍乾燥（凍結乾燥）され、約１２～６０のバイアル中に含有され得る。ある特定の実施形態において、製剤は冷凍乾燥され、４５ｍｇの冷凍乾燥製剤は、１つのバイアル中に含有され得る。ある特定の実施形態において、約４０ｍｇ～約１００ｍｇの冷凍乾燥製剤は、１つのバイアル中に含有され得る。ある特定の実施形態において、１２、２７または４５のバイアルからの冷凍乾燥製剤を組み合わせて、静脈注射薬製剤中で治療用量のタンパク質を得る。ある特定の実施形態において、製剤は液体製剤であり、約２５０ｍｇ／バイアル～約１０００ｍｇ／バイアルとして保存され得る。ある特定の実施形態において、製剤は液体製剤であり、約６００ｍｇ／バイアルとして保存され得る。ある特定の実施形態において、製剤は液体製剤であり、約２５０ｍｇ／バイアルとして保存され得る。

本開示は、緩衝溶液中に治療有効量の多重特異性タンパク質を含む液体水性医薬製剤で存在し得る。

本明細書において開示される組成物は、従来の滅菌技法によって滅菌され得るか、またはフィルター滅菌され得る。もたらされた水溶液は、そのままの使用のために包装され得るか、または凍結乾燥され得、その場合は凍結乾燥調製物は、投与の前に滅菌水性担体と組み合わせられる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１の間、より好ましくは５～９または６～８の間、最も好ましくは７～８の間（７～７．５等）であるだろう。固体形態においてもたらされた組成物は複数の単回用量単位で包装され得、各々は固定量の前述の薬剤（複数可）を含有する。固体形態における組成物は、融通性のある量のための容器中でも包装され得る。

ある特定の実施形態において、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水、及び水酸化ナトリウムと組み合わせて、本開示の多重特異性タンパク質を含む、貯蔵寿命が延長した製剤を提供する。

ある特定の実施形態において、水性製剤は、ｐＨ緩衝溶液中で本開示のタンパク質を含んで調製される。本発明の緩衝液は、約４～約８、例えば、約４．５～約６．０、または約４．８～約５．５の範囲のｐＨを有し得るか、または約５．０～約５．２のｐＨを有し得る。上で列挙されたｐＨに対して中間的な範囲も、本開示の一部分であることが意図される。例えば、上で列挙された値のうちの任意のものの組み合わせを上限及び／または下限として使用する値の範囲が含まれることが意図される。この範囲内でｐＨを制御する緩衝液の例としては、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）緩衝液、コハク酸塩（例えばコハク酸ナトリウム）緩衝液、グルコン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸塩緩衝液、及び他の有機酸緩衝液が挙げられる。

ある特定の実施形態において、製剤は、約４～約８の範囲のｐＨを維持するためにクエン酸塩及びリン酸塩を含有する緩衝系を含む。ある特定の実施形態において、ｐＨ範囲は、約４．５～約６．０、または約４．８～約５．５、または約５．０～約５．２のｐＨ範囲であり得る。ある特定の実施形態において、緩衝系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、及び／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。ある特定の実施形態において、緩衝液系は、約１．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸（例えば１．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約０．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム（例えば０．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約１．５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば１．５３ｍｇ／ｍＬ）、約０．９ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば０．８６）、及び約６．２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム（例えば６．１６５ｍｇ／ｍＬ）を含む。ある特定の実施形態において、緩衝液系は、１～１．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸、０．２５～０．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、１．２５～１．７５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物、０．７～１．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物、及び６．０～６．４ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムを含む。ある特定の実施形態において、製剤のｐＨは、水酸化ナトリウムにより調整される。

等張化剤として作用し、且つ抗体を安定化させ得るポリオールも、本明細書において記載される製剤中に含まれ得る。ポリオールは、製剤の所望の等張性に応じて変動し得る量で製剤へ添加される。ある特定の実施形態において、水性製剤は等張であり得る。添加されるポリオールの量は、ポリオールの分子量に対しても変更され得る。例えば、単糖（例えばマンニトール）は、二糖（トレハロース等）に比較して、より少ない量で添加され得る。ある特定の実施形態において、等張化剤として製剤中で使用され得るポリオールは、マンニトールである。ある特定の実施形態において、マンニトール濃度は、約５～約２０ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態において、マンニトールの濃度は、約７．５～１５ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態において、マンニトールの濃度は、約１０～１４ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態において、マンニトールの濃度は、約１２ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態において、ポリオールソルビトールは、製剤中に含まれ得る。

デタージェントまたは界面活性物質も本発明の製剤へ添加され得る。例示的なデタージェントとしては、ポリソルベート（例えばポリソルベート２０及びポリソルベート８０など）またはポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）等の非イオン性デタージェントが挙げられる。添加されるデタージェントの量は、それが製剤化された抗体の凝集を低減させる、及び／または製剤中の微粒子の形成を最小限にする、及び／または吸着を低減させるようなものである。ある特定の実施形態において、製剤は、ポリソルベートである界面活性物質を含み得る。ある特定の実施形態において、製剤は、デタージェントのポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ ８０を含有し得る。Ｔｗｅｅｎ ８０は、ポリオキシエチレン（２０）モノオレイン酸ソルビタンを記載するために使用される用語である（例えばＦｉｅｄｌｅｒ Ｈ．Ｐ．，Ｌｅｘｉｋｏｎ ｄｅｒ Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ ｆｕｒ Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，Ｋｏｓｍｅｔｉｋ ｕｎｄ ａｎｄｒｅｎｚｅｎｄｅ Ｇｅｂｉｅｔｅ，４^ｔｈ Ｅｄ．，Ｅｄｉｔｉｏ Ｃａｎｔｏｒ，Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９９６））。ある特定の実施形態において、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬの間または約０．５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬの間のポリソルベート８０を含有し得る。ある特定の実施形態において、約０．１％のポリソルベート８０が、製剤中に添加され得る。

ある特定の実施形態において、本開示の多重特異性タンパク質産物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓により閉鎖され、アルミニウムクリンプシールクロージャによりシールされたＵＳＰ／Ｐｈ Ｅｕｒ Ｉ型５０Ｒバイアルのいずれか中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。栓は、ＵＳＰ及びＰｈ Ｅｕｒに準拠したエラストマーで作製され得る。ある特定の実施形態において、バイアルは、６０ｍＬの抽出可能な体積を可能にするために、６１．２ｍＬの多重特異性タンパク質産物溶液により充填され得る。ある特定の実施形態において、液体製剤は、０．９％の食塩溶液により希釈され得る。

ある特定の実施形態において、本開示の液体製剤は、安定化レベルで糖と組み合わせて１０ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液として調製され得る。ある特定の実施形態において、液体製剤は、水性担体中で調製され得る。ある特定の実施形態において、安定化物質は、静脈内投与のために所望されないかまたは好適でない粘度をもたらし得る量を超えない量で添加され得る。ある特定の実施形態において、糖は、二糖（例えばスクロース）であり得る。ある特定の実施形態において、液体製剤は、緩衝剤、界面活性物質、及び防腐物質のうちの１つまたは複数も含み得る。

ある特定の実施形態において、液体製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸及び／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態において、薬学的に許容される酸は、塩酸であり得る。ある特定の実施形態において、塩基は、水酸化ナトリウムであり得る。

凝集に加えて、脱アミド化は、発酵、収集／細胞の清澄化、精製、薬物物質／薬物製品の貯蔵、及びサンプル分析の間に起こり得る、ペプチド及びタンパク質の共通の産物変動である。生理学的条件下で、脱アミド化は、タンパク質のアスパラギン残基からのアンモニア（ＮＨ_３）の損失であり、１７ダルトンの質量の減少及びスクシンイミド中間体の形成をもたらす。後続するスクシンイミドの加水分解は、１８ダルトンの質量の増加及びアスパラギン酸またはイソアスパラギン酸の形成をもたらす。脱アミド化の速度に影響するパラメーターとしては、ｐＨ、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所的なポリペプチド立体配座、及び三次構造が挙げられる。ペプチド鎖中のＡｓｎへ隣接するアミノ酸残基も、脱アミド化速度に影響し得る（例えばＡｓｎ残基に続くＧｌｙ及びＳｅｒは、脱アミド化へのより高い感受性をもたらす）。

ある特定の実施形態において、本開示の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミド化を防止するためのｐＨ及び湿度の条件下で保存され得る。

本明細書において関心の水性担体は、薬学的に許容されるものであり（すなわちヒトへの投与のために安全で非毒性であり）且つ液体製剤の調製のために有用なものである。例示的な担体としては、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液、またはデキストロース溶液が挙げられる。

防腐物質は任意選択に本明細書の製剤へ添加されて、微生物作用を低減させ得る。防腐物質の添加は、例えば複数回使用（複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。

静脈内（ＩＶ）製剤は、入院患者が移植後にすべての薬物をＩＶ経路で受ける場合等の特定の事例において、好ましい投与経路であり得る。ある特定の実施形態において、液体製剤は、投与の前に０．９％の塩化ナトリウム溶液により希釈される。ある特定の実施形態において、注射用に希釈された薬物製品は、等張であり、静脈内点滴による投与に好適である。

ある特定の実施形態において、塩または緩衝液の構成要素は、約１０ｍＭ～約２００ｍＭの量で添加され得る。塩及び／または緩衝物質は、薬学的に許容されるものであり、「塩基形成」金属またはアミンと共に様々な既知の酸（無機及び有機）に由来する。ある特定の実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態において、緩衝液は、グリシン酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、またはクエン酸塩緩衝液であり得、その事例において、ナトリウムイオン、カリウムイオン、またはアンモニウムイオンが、カウンターイオンとして供され得る。

防腐物質は任意選択に本明細書の製剤へ添加されて、微生物作用を低減させ得る。防腐物質の添加は、例えば複数回使用（すなわち複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。

本明細書において関心の水性担体は、薬学的に許容されるものであり（すなわちヒトへの投与のために安全で非毒性であり）且つ液体製剤の調製のために有用なものである。例示的な担体としては、ＳＷＦＩ、ＢＷＦＩ、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液、またはデキストロース溶液が挙げられる。

本開示は、タンパク質及び凍結保護物質を含む凍結乾燥製剤中に存在し得る。凍結保護物質は、糖（例えば二糖）であり得る。ある特定の実施形態において、凍結保護物質は、スクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥製剤は、緩衝剤、界面活性物質、増量剤、及び／または防腐物質のうちの１つまたは複数も含み得る。

凍結乾燥薬物製品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なくとも１：２のタンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比であり得る。ある特定の実施形態において、タンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比は、１：２～１：５であり得る。

ある特定の実施形態において、凍結乾燥の前の凍結乾燥製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸及び／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態において、薬学的に許容される酸は、塩酸であり得る。ある特定の実施形態において、薬学的に許容される塩基は、水酸化ナトリウムであり得る。

凍結乾燥の前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは、６～８の間で調整され得る。ある特定の実施形態において、凍結乾燥薬物製品のためのｐＨ範囲は、７～８であり得る。

凍結乾燥製剤のある特定の実施形態において、塩または緩衝液の構成要素は１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加され得る。塩及び／または緩衝物質は、薬学的に許容されるものであり、「塩基形成」金属またはアミンと共に様々な既知の酸（無機及び有機）に由来する。ある特定の実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態において、緩衝液は、グリシン酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液であり得、その事例において、ナトリウムイオン、カリウムイオン、またはアンモニウムイオンが、カウンターイオンとして供され得る。

ある特定の実施形態において、「増量剤」が凍結乾燥製剤へ添加され得る。「増量剤」は、凍結乾燥混合物へ質量を加え、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば開口孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの産生を容易にする）化合物である。例示的な増量剤としては、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール、及びソルビトールが挙げられる。本発明の凍結乾燥製剤は、かかる増量剤を含有し得る。

防腐物質は任意選択に本明細書の凍結乾燥製剤へ添加されて、微生物作用を低減させ得る。防腐物質の添加は、例えば複数回使用（すなわち複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。

ある特定の実施形態において、凍結乾燥薬物製品は、水性希釈物質により構成され得る。本明細書において関心の水性希釈物質は、薬学的に許容されるものであり（例えばヒトへの投与のために安全で非毒性であり）且つ凍結乾燥後の再構成液体製剤の調製のために有用なものである。例示的な希釈物質としては、ＳＷＦＩ、ＢＷＦＩ、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液、またはデキストロース溶液が挙げられる。

ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥薬物製品は、ＳＷＦＩまたは注射用の０．９％の塩化ナトリウム（ＵＳＰ）のいずれかにより再構成される。再構成の間に、凍結乾燥粉末は溶液へと溶解する。

ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥タンパク質産物は、約４．５ｍＬの注射用水へ構成され、０．９％の生理食塩水（塩化ナトリウム溶液）により希釈される。

本発明の医薬組成物中の実際の投薬量レベルの活性成分は、患者への毒性無しに、特定の患者、組成物、及び投与モードについて所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変更され得る。

具体的な用量は、各々の患者に均一の用量、例えば５０～５０００ｍｇのタンパク質であり得る。代替的に、患者の用量は、患者のおおよその体重または表面積に対して調整され得る。適切な投薬量を決定する他の因子としては、治療または予防される疾患または病態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別及び医学的条件が挙げられ得る。治療のための適切な投薬量を決定するのに必要な計算のさらなる微調整は、特に本明細書において開示される投薬量情報及びアッセイに照らして、当業者によってルーチンに行われる。投薬量は、適切な用量－応答データと併用して使用される投薬量の決定のための公知のアッセイの使用を介しても決定され得る。個々の患者の投薬量は、疾患の進行をモニターしながら調整され得る。有効濃度に到達するかまたはそれを維持するように投薬量が調整される必要があるかどうか確かめるために、患者における標的可能なコンストラクトまたは複合体の血中レベルが測定され得る。薬理ゲノミクスを使用して、どの標的可能なコンストラクト及び／または複合体、ならびにそれらの投薬量が、所与の個体に有効である可能性が最も高いかを決定することができる（例えばＳｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ；３０８：４３－５３．；Ｓｔｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ；３０８：３３－４１．を参照）。

概して、体重に基づく投薬量は、約０．０１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重（約０．０１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、または約５０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重等）である。

用量は、１日１回以上、週１回以上、月１回以上、もしくは年１回以上、または場合によっては２～２０年ごとに１回与えられ得る。当業者であれば、体液または組織中の標的可能なコンストラクトまたは複合体の測定された滞留時間及び濃度に基づいて、投薬のための反復率をたやすく推測することができる。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜腔内、髄腔内、腔内、カテーテルを介する灌流による、または直接的病巣内注射によるものであり得る。これは、１日１回以上、週１回以上、月１回以上、または年１回以上投与され得る。

上の記載は、本発明の複数の態様及び実施形態を記載する。本特許出願は、これらの態様及び実施形態のすべての組み合わせ及び順列を具体的に企図する。

ここで概して記載される本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、これらは、単に本発明のある特定の態様及び実施形態の例証の目的のために含まれ、本発明を限定するとは意図されない。

実施例１ － ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄへ結合する
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは精製された組換えＮＫＧ２Ｄへ結合する
ヒト、マウス、またはカニクイザルのＮＫＧ２Ｄエクトドメインの核酸配列を、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインをコードする核酸配列と融合させ、発現させる予定の哺乳動物細胞の中へ導入した。精製後に、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ融合タンパク質をマイクロプレートのウェルへ吸着させた。非特異的結合を防止するためにウシ血清アルブミンによりウェルをブロッキングした後に、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを力価測定し、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ融合タンパク質により前吸着させたウェルへ添加した。一次抗体の結合を、ホースラディシュペルオキシダーゼへコンジュゲートさせ、ヒトκ軽鎖を特異的に認識してＦｃ交差反応性を回避する二次抗体を使用して、検出した。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ホースラディシュペルオキシダーゼのための基質）をウェルへ添加して結合シグナルを可視化し、その吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローン、アイソタイプ対照、または陽性対照（配列番号１０１～１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン、または抗マウスＮＫＧ２ＤクローンのＭＩ－６及びＣＸ－５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む）を、各々ウェルへ添加した。

アイソタイプ対照は、組換えＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質へ最少の結合を示したが、陽性対照は、組換え抗原へ最も強く結合した。すべてのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、クローン間で親和性が変動するが、ヒト、マウス及びカニクイザルの組換えＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質にわたって結合することが実証された。概して、各々の抗ＮＫＧ２Ｄのクローンは、ヒト（図３）及びカニクイザル（図４）の組換えＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃへ類似の親和性で結合したが、マウス（図５）の組換えＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃへより低い親和性で結合した。

ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄを発現する細胞へ結合する
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株を、ヒトまたはマウスのＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインキメラ抗原受容体を発現するように操作した。ＥＬ４細胞上で発現した細胞外ＮＫＧ２Ｄを染色するために、ＮＫＧ２Ｄ結合クローン、アイソタイプ対照または陽性対照を１００ｎＭの濃度で使用した。抗体結合を、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、バックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を、親ＥＬ４細胞に比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して計算した。

ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ヒト及びマウスのＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞へ結合したすべてのクローンによって産生された。陽性対照抗体（配列番号１０１～１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン、または抗マウスＮＫＧ２ＤクローンのＭＩ－６及びＣＸ－５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む）は、最も良好なＦＯＢ結合シグナルを提供した。各々のクローンについてのＮＫＧ２Ｄ結合親和性は、ヒトＮＫＧ２Ｄ（図６）及びマウスＮＫＧ２Ｄ（図７）を発現する細胞の間で類似していた。

実施例２ － ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合をブロックする
ＵＬＢＰ－６との競合
組換えヒトＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルへ吸着させ、ウェルをウシ血清アルブミンによりブロッキングして非特異的結合を低減させた。飽和濃度のＵＬＢＰ－６－Ｈｉｓ－ビオチンをウェルへ添加し、続いて、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンを添加した。２時間のインキュベーション後に、ウェルを洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃコーティングウェルへ結合されたままのＵＬＢＰ－６－Ｈｉｓ－ビオチンを、ホースラディシュペルオキシダーゼへコンジュゲートしたストレプトアビジン及びＴＭＢ基質によって検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを差し引いた後に、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインのＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質への特異的結合を、ウェル中のＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質への結合がブロックされたＵＬＢＰ－６－Ｈｉｓ－ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１～１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む）及び様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＵＬＢＰ－６のＮＫＧ２Ｄへの結合をブロックした一方で、アイソタイプ対照は、ＵＬＢＰ－６との競合をほとんど示さなかった（図８）。

ＵＬＢＰ－６配列は、配列番号１５０によって表わされる。
ＭＡＡＡＡＩＰＡＬＬＬＣＬＰＬＬＦＬＬＦＧＷＳＲＡＲＲＤＤＰＨＳＬＣＹＤＩＴＶＩＰＫＦＲＰＧＰＲＷＣＡＶＱＧＱＶＤＥＫＴＦＬＨＹＤＣＧＮＫＴＶＴＰＶＳＰＬＧＫＫＬＮＶＴＭＡＷＫＡＱＮＰＶＬＲＥＶＶＤＩＬＴＥＱＬＬＤＩＱＬＥＮＹＴＰＫＥＰＬＴＬＱＡＲＭＳＣＥＱＫＡＥＧＨＳＳＧＳＷＱＦＳＩＤＧＱＴＦＬＬＦＤＳＥＫＲＭＷＴＴＶＨＰＧＡＲＫＭＫＥＫＷＥＮＤＫＤＶＡＭＳＦＨＹＩＳＭＧＤＣＩＧＷＬＥＤＦＬＭＧＭＤＳＴＬＥＰＳＡＧＡＰＬＡＭＳＳＧＴＴＱＬＲＡＴＡＴＴＬＩＬＣＣＬＬＩＩＬＰＣＦＩＬＰＧＩ（配列番号１５０）

ＭＩＣＡとの競合
組換えヒトＭＩＣＡ－Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルへ吸着させ、ウェルをウシ血清アルブミンによりブロッキングして非特異的結合を低減させた。ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃビオチン、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインをウェルへ添加した。インキュベーション及び洗浄後に、ＭＩＣＡ－Ｆｃコーティングウェルへ結合されたままのＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ－ビオチンを、ストレプトアビジン－ＨＲＰ及びＴＭＢ基質によって検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを差し引いた後に、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインのＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質への特異的結合を、ＭＩＣＡ－Ｆｃコーティングウェルへの結合がブロックされたＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ－ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１～１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む）及び様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＭＩＣＡのＮＫＧ２Ｄへの結合をブロックした一方で、アイソタイプ対照は、ＭＩＣＡとの競合をほとんど示さなかった（図９）。

Ｒａｅ－１δとの競合
組換えマウスＲａｅ－１δ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）をマイクロプレートのウェルへ吸着させ、ウェルをウシ血清アルブミンによりブロッキングして非特異的結合を低減させた。マウスＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃビオチン、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインをウェルへ添加した。インキュベーション及び洗浄後に、Ｒａｅ－１δ－Ｆｃコーティングウェルへ結合されたままのＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ－ビオチンを、ストレプトアビジン－ＨＲＰ及びＴＭＢ基質によって検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを差し引いた後に、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインのＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質への特異的結合を、Ｒａｅ－１δ－Ｆｃコーティングウェルへの結合がブロックされたＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ－ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照（配列番号１０１～１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン、または抗マウスＮＫＧ２ＤクローンのＭＩ－６及びＣＸ－５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む）及び様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンは、Ｒａｅ－１δのマウスＮＫＧ２Ｄへの結合をブロックした一方で、アイソタイプ対照抗体は、Ｒａｅ－１δとの競合をほとんど示さなかった（図１０）。

実施例３ － ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンはＮＫＧ２Ｄを活性化する
ヒト及びマウスのＮＫＧ２Ｄの核酸配列をＣＤ３ζシグナリングドメインをコードする核酸配列へ融合して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトを得た。次いでＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲコンストラクトを、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用してレトロウイルスベクターの中へクローニングし、レトロウイルス産生のためにｅｘｐｉ２９３細胞の中へトランスフェクションした。ＥＬ４細胞を、ＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを含有するウイルスに８μｇ／ｍＬのポリブレンと一緒に感染させた。感染の２４時間後に、ＥＬ４細胞におけるＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーによって分析し、細胞表面上で高レベルのＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを発現するクローンを選択した。

ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＮＫＧ２Ｄを活性化するかどうかを決定するために、それらをマイクロプレートのウェルへ吸着させ、ＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ ＥＬ４細胞をブレフェルジン－Ａ及びモネンシンの存在下において抗体断片コーティングウェル上で４時間培養した。細胞内のＴＮＦ－α産生（ＮＫＧ２Ｄ活性化についての指標）を、フローサイトメトリーによってアッセイした。ＴＮＦ－α陽性細胞のパーセンテージを、陽性対照により処理した細胞に対して正規化した。すべてのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ヒトＮＫＧ２Ｄ（図１１）及びマウスＮＫＧ２Ｄ（図１２）の両方を活性化した。

実施例４ － ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫ細胞を活性化する
初代ヒトＮＫ細胞
密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞（ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋）を単離し、単離したＮＫ細胞の純度は典型的には＞９５％であった。次いで単離したＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含有している培地中で２４～４８時間培養し、その後に、それらを、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルへ移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン－Ａ、及びモネンシンを含有する培地中で培養した。培養に続いて、ＣＤ３、ＣＤ５６、及びＩＦＮ－γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用して、フローサイトメトリーによって、ＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞におけるＣＤ１０７ａ染色及びＩＦＮ－γ染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を査定した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ－γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の係合を介するより良好なＮＫ細胞の活性化を表す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び陽性対照（例えば配列番号１０１または配列番号１０３によって表わされる重鎖可変ドメイン、及び配列番号１０２または配列番号１０４によって表わされる軽鎖可変ドメイン）は、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージのＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ^＋及びＩＦＮ－γ^＋になることを示した（図１３及び図１４は２つの独立した実験からのデータを表わし、各々は、ＮＫ細胞の調製のために異なるドナーのＰＢＭＣを使用した）。

初代マウスＮＫ細胞
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから脾臓を得、７０μｍのセルストレーナーを介して破砕して単一細胞懸濁液を得た。細胞をペレットにし、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃Ａ１０４９２０１、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；１５５ｍＭの塩化アンモニウム、１０ｍＭの重炭酸カリウム、０．０１ｍＭのＥＤＴＡ）中で再懸濁して、赤血球を除去した。残存する細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－２と共に７２時間培養し、その後に、収集し、ＮＫ細胞単離のために調製した。次いでＮＫ細胞（ＣＤ３^－ＮＫ１．１^＋）を、磁気ビーズによるネガティブ涸渇技法を使用して脾臓細胞から単離し、それにより典型的には＞９０％の純度を有するＮＫ細胞集団を得た。精製したＮＫ細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ－１５を含有する培地中で４８時間培養し、その後に、それらをＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルへ移し、フルオロフォアをコンジュゲートする抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン－Ａ、及びモネンシンを含有する培地中で培養した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインコーティングウェル中での培養に続いて、ＣＤ３、ＮＫ１．１、及びＩＦＮ－γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用して、フローサイトメトリーによって、ＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３^－ＮＫ１．１^＋細胞におけるＣＤ１０７ａ染色及びＩＦＮ－γ染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を査定した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ－γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の係合を介するより良好なＮＫ細胞の活性化を表す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び陽性対照（抗マウスＮＫＧ２ＤクローンのＭＩ－６及びＣＸ－５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから選択される）は、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージのＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ^＋及びＩＦＮ－γ^＋になることを示した（図１５及び図１６は２つの独立した実験からのデータを表わし、各々は、ＮＫ細胞の調製のために異なるマウスを使用した）。

実施例５ － ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは標的腫瘍細胞に対する細胞傷害性を促進する
ヒト及びマウスの初代ＮＫ細胞活性化アッセイは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインとのインキュベーション後のＮＫ細胞上の細胞傷害性マーカーの増加を実証する。このことが腫瘍細胞溶解の増加へとつながるかどうかを検討するために、各々のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを単一特異性抗体へと発展させた細胞ベースのアッセイを利用した。Ｆｃ領域を１つの標的化アームとして使用する一方で、Ｆａｂ領域（ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン）を別の標的化アームとして作用させて、ＮＫ細胞を活性化した。ＴＨＰ－１細胞（ヒト起源であり、高レベルのＦｃ受容体を発現する）を腫瘍標的として使用し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用した。ＴＨＰ－１細胞をＢＡＴＤＡ試薬により標識し、１０^５／ｍＬで培養培地中に再懸濁した。次いで標識したＴＨＰ－１細胞を、ＮＫＧ２Ｄ抗体及び単離したマウスＮＫ細胞と３７℃で３時間マイクロタイタープレートのウェル中で組み合わせた。インキュベーション後に、２０μｌの培養液上清を除去し、２００μｌのユウロピウム溶液と混合し、暗所で振盪しながら１５分間インキュベーションした。蛍光を、時間分解蛍光モジュール（励起３３７ｎｍ、発光６２０ｎｍ）を装備したＰＨＥＲＡＳｔａｒ（登録商標）プレートリーダーによって経時的に測定し、比溶解（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ）をキットの指示に従って計算した。

陽性対照（ＮＫＧ２Ｄについての天然リガンドであるＵＬＢＰ－６）は、マウスＮＫ細胞によるＴＨＰ－１標的細胞の比溶解の増加を示した。ＮＫＧ２Ｄ抗体もＴＨＰ－１標的細胞の比溶解を増加させた一方で、アイソタイプ対照抗体は比溶解の低減を示した。点線は、抗体を添加していないマウスＮＫ細胞によるＴＨＰ－１細胞の比溶解を示す（図１７）。

実施例６ － ＮＫＧ２Ｄ抗体は高い熱安定性を有する
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの融解温度を、示差走査蛍光定量法を使用してアッセイした。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの推測された外挿の融解温度は、典型的なＩｇＧ１抗体に比べて高かった（図１８）。

実施例７ － ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６の架橋によるヒトＮＫ細胞の相乗的活性化
初代ヒトＮＫ細胞活性化アッセイ
末梢血中単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離を使用して、末梢ヒト血液バフィーコートから単離した。ＮＫ細胞を、ネガティブ選択磁気ビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ；カタログ番号１７９５５）を使用して、ＰＢＭＣから精製した。ＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによって決定されるように、＞９０％がＣＤ３^－ＣＤ５６^＋であった。次いで細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ、カタログ番号２００－０２）を含有する培地中で４８時間増幅させ、その後に、活性化アッセイにおいて使用した。抗体を、１００μｌの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、２μｇ／ｍｌ（抗ＣＤ１６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；カタログ番号３０２０１３）及び５μｇ／ｍＬ（抗ＮＫＧ２Ｄ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ；カタログ番号ＭＡＢ１３９）の濃度で、９６ウェルの平底プレートの上へ４℃で一晩コーティングし、続いて、ウェルを完全に洗浄して過剰な抗体を除去した。脱顆粒の査定のために、ＩＬ－２活性化ＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ２及び１μｇ／ｍＬのＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；カタログ番号３２８６１９）を補足した培養培地中で５×１０^５細胞／ｍｌで、再懸濁した。次いで１×１０^５細胞／ウェルを、抗体コーティングプレートの上へ添加した。タンパク質輸送阻害物質のブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；カタログ番号４２０６０１）及びモネンシン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；カタログ番号４２０７０１）を、１：１０００及び１：２７０の最終希釈でそれぞれ添加した。プレーティングした細胞を、５％のＣＯ_２中で３７℃で４時間インキュベーションした。ＩＦＮ－γの細胞内染色のために、ＮＫ細胞を、抗ＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；カタログ番号３００４５２）及び抗ＣＤ５６ ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；カタログ番号３１８３２８）により標識し、後続して、固定及び透過化を行い、抗ＩＦＮ－γ ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号５０６５０７）により標識した。ＮＫ細胞を、生存ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－細胞に対してゲーティングした後に、ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ－γの発現についてフローサイトメトリーによって分析した。

受容体の組み合わせの相対効力を調査するために、ＮＫＧ２ＤまたはＣＤ１６の架橋及びプレート結合刺激による両方の受容体の共架橋を行った。

図１９中で示されるように、ＩＬ－２活性化ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ及び細胞内ＩＦＮ－γの発現を、抗ＣＤ１６、抗ＮＫＧ２Ｄ、またはそれらの両方のモノクローナル抗体の組み合わせによる４時間のプレート結合刺激後に、分析した。ＣＤ１６とＮＫＧ２Ｄとの組み合わせ刺激は、ＣＤ１６またはＮＫＧ２Ｄの単独の個別刺激の相加効果（点線によって示される）よりも大きいパーセンテージのＣＤ１０７ａ^＋細胞（図１９Ａ）及びＩＦＮ－γ^＋細胞（図１９Ｂ）をもたらした。同様に、ＣＤ１６とＮＫＧ２Ｄとの組み合わせ刺激は、各々の受容体単独の個別の相加効果に比較して、より高いパーセンテージのＣＤ１０７ａ^＋ＩＦＮ－γ^＋二重陽性細胞をもたらした（図１９Ｃ）。棒グラフは平均（ｎ＝２）±ＳＤを示し、５名の異なる健康なドナーを使用した５つの独立した実験を代表するものである。

実施例８ － ヒト細胞株上でのＦＡＰの発現
ＦＡＰ発現を、３つのヒト細胞株：骨原性肉腫を有する患者からの正常な組織に由来したＬＬ８６線維芽細胞；ＣＯＬＯ８２９黒色腫癌細胞；及び神経膠芽細胞腫からのＵ－８７ ＭＧ上皮癌細胞上で確認した。ＦＡＰ発現を、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＦＡＰ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）により細胞を染色することによって、フローサイトメトリー分析を使用して、測定した。

図３５中で示されるように、抗体アイソタイプ対照に比較して、ＦＡＰ発現が、ＬＬ８６（図３５Ａ）、ＣＯＬＯ ８２９（図３５Ｂ）、及びＵ－８７ ＭＧ（図３５Ｃ）細胞上で検出された。

実施例９ － 抗ＦＡＰ多重特異性結合タンパク質及び抗ＦＡＰモノクローナル抗体のＦＡＰ発現細胞株への結合
ＦＡＰ発現ヒト細胞株（ＬＬ８６、ＣＯＬＯ ８２９及びＵ－８７ＭＧ）を使用して、配列番号１１８に同一の軽鎖可変ドメイン配列とペアになる配列番号１１４に同一の重鎖可変ドメイン配列（ＦＡＰ多重特異性ＢＰシブロツズマブ）；配列番号１３５に同一の軽鎖可変ドメイン配列とペアになる配列番号１３１に同一の重鎖可変ドメイン配列（ＦＡＰ多重特異性ＢＰ ４Ｇ８）；または配列番号１４３に同一の軽鎖可変ドメイン配列とペアになる配列番号１３９に同一の重鎖可変ドメイン配列（ＦＡＰ多重特異性ＢＰ ２９Ｂ１１）を含む、ＦＡＰ結合部位を有する多重特異性結合タンパク質の腫瘍抗原結合を査定した。同じＦＡＰ結合部位を有する多重特異性結合タンパク質または対応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を希釈し、細胞とインキュベーションした。結合を、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ヒト組換えＩｇＧ１染色対照に対して正規化した平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表現して、バックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）値を得た。

図３６Ａ～３６Ｃ中で示されるように、ＦＡＰ多重特異性ＢＰシブロツズマブ、ＦＡＰ多重特異性ＢＰ ４Ｇ８、ＦＡＰ多重特異性ＢＰ ２９Ｂ１１、及び同じＦＡＰ結合部位を有する対応するｍＡＢは、ＦＡＰ発現ヒトＬＬ８６細胞（図３６Ａ）、ＣＯＬＯ８２９細胞（図３６Ｂ）、及びＵ－８７ ＭＧ細胞（図３６Ｃ）へ結合する。全体的な結合シグナルは、対応するｍＡｂに比較して、多重特異性結合タンパク質でより高かった。

実施例１０ － 多重特異性結合タンパク質によるＦＡＰ発現標的細胞のＮＫ細胞媒介性溶解の促進
密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートからＰＢＭＣを単離した。単離したＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞の単離のために調製した。磁気ビーズを用いたネガティブ選択を使用してＮＫ細胞を単離した。ＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによって決定されるように、＞９０％がＣＤ３^－ＣＤ５６^＋であった。単離したＮＫ細胞をサイトカイン無しの培地中で一晩インキュベーションし、その後に、細胞傷害性アッセイにおいて使用した。

ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ：
ＦＡＰ発現ヒトがん細胞株を培養から収集した。細胞をＰＢＳにより洗浄し、１０^６細胞／ｍＬで増殖培地中で再懸濁して、製造者の指示に従ってＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、カタログ番号ＡＤ０１１６）により標識した。標識後に、細胞をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水により３×洗浄し、５×１０^４細胞／ｍＬで培養培地中で再懸濁し、１００μｌのＢＡＴＤＡ標識細胞を９６ウェルプレートの各々のウェルへ添加した。指定したウェルを標的細胞からの自然放出のために取っておき、他のすべてのウェルを１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘの添加によって標的細胞の最大溶解のために調製した。

抗ＦＡＰ多重特異性結合タンパク質、及び同じＦＡＰ結合部位を有する対応するｍＡｂを、培養培地中で希釈した。５０μｌの希釈した抗ＦＡＰ ｍＡｂまたは抗ＦＡＰ多重特異性結合タンパク質を、指定したウェルへ添加した。精製した初代ＮＫ細胞を培養から収集し、洗浄し、１×１０^５～２．０×１０^６細胞／ｍＬの濃度で培養培地中で再懸濁した。５０μｌの初代ＮＫ細胞懸濁物を９６ウェルプレートの指定したウェルへ添加して合計で２００μｌの培養体積にし、１０：１のエフェクター細胞対標的細胞の比を達成した。プレートを５％のＣＯ_２、３７℃で２～４時間インキュベーションし、その後に、アッセイを進めた。

共培養に続いて、細胞を５００×Ｇで５分間遠心分離によってペレットにした。２０μｌの培養液上清を清浄なマイクロプレートへ移し、２００μｌの室温のユウロピウム溶液を各々のウェルへ添加した。マイクロプレートを光から保護し、プレート振盪機上で２５０ｒｐｍで１５分間インキュベーションした。マイクロプレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘ機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により読み取った。％比溶解を以下のように計算した。
％比溶解＝［（実験的放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）］×１００％

図３７Ａは、ＦＡＰ多重特異性ＢＰシブロツズマブ、ＦＡＰ多重特異性ＢＰ ４Ｇ８、及びＦＡＰ－多重特異性ＢＰ ２９Ｂ１１が、ＦＡＰ発現ＬＬ８６細胞に対する、ドナーＲＲ０１６１２から単離した初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性活性を模倣したことを示す。

同様に、図３７Ｄは、ＦＡＰ多重特異性ＢＰシブロツズマブ、ＦＡＰ多重特異性ＢＰ ４Ｇ８、及びＦＡＰ－多重特異性ＢＰ ２９Ｂ１１が、ＦＡＰ発現ＬＬ８６細胞に対する、ドナー５５１０９から単離した初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性活性を模倣したことを示す。

図３７Ｂは、ＦＡＰ多重特異性ＢＰシブロツズマブ、ＦＡＰ多重特異性ＢＰ ４Ｇ８、及びＦＡＰ－多重特異性ＢＰ ２９Ｂ１１が、ＦＡＰ発現ＣＯＬＯ８２９細胞に対する、ドナーＲＲ０１６１２から単離した初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性活性を模倣したことを示す。

図３７Ｃは、ＦＡＰ多重特異性ＢＰシブロツズマブ、ＦＡＰ多重特異性ＢＰ ４Ｇ８、及びＦＡＰ－多重特異性ＢＰ ２９Ｂ１１が、ＦＡＰ発現Ｕ－８７ ＭＧ細胞に対する、ドナーＲＲ０１６１２から単離した初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性活性を模倣したことを示す。

すべての抗ＦＡＰ多重特異性結合タンパク質は、ヒトがん細胞に対する初代ＮＫ細胞の細胞傷害性を、同じＦＡＰ結合部位を有する対応するｍＡｂよりも有効に刺激した。

参照による援用
本明細書において参照される特許文書及び科学論文の各々の開示全体は、すべての目的のために参照することによって援用される。

均等物
本発明は、その趣旨または本質的特徴から逸脱せずに、他の具体的な形態で実施され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書において記載される本発明を限定するのではなく、すべての点で例証と見なされるべきである。よって、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、該特許請求の範囲の均等性の意味及び範囲内に入るすべての変化がその中に包含されることが意図される。

Claims (1)

1. 本明細書に記載の発明。