JP2023173360A

JP2023173360A - 生体老化レベルの評価方法

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Publication number: JP2023173360A
Application number: JP2022085555A
Authority: JP
Inventors: 将大藤村; Masahiro Fujimura; 悠一郎大形; Yuichiro Ogata; 貴亮山田; Takaaki Yamada; 克真宮地; Katsuma Miyachi; 靖司長谷川; Yasushi Hasegawa
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2022-05-25
Filing date: 2022-05-25
Publication date: 2023-12-07

Abstract

【課題】生体老化レベルを客観的かつ正確に評価できる指標を用いた新たな生体老化レベルの評価方法を提供すること。【解決手段】生体試料におけるＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌから選ばれる１種又は２種以上のタンパク質の発現量を指標とする、生体老化レベルの評価方法、ならびに評価用キット。【選択図】なし

Description

本発明は、生体試料における特定のタンパク質の発現量を指標として生体老化レベルを評価する方法に関する。

人の身体は老化によって、シミ、しわ、たるみ、乾燥、白髪などの外見的な変化が生じたり、骨、関節、筋肉が加齢によって衰えることで運動機能が低下する。また、老化に伴って生体防御機能を担う免疫担当細胞の機能が低下すること（非特許文献１）、認知機能や記憶力といった脳機能の低下を引き起こすことがわかっている（非特許文献２）。近年では、こうした個体の老化度を生化学的に評価できる指標（老化マーカー）の開発が進められるようになってきた。例えば、これまでに老化度の評価方法として、血液や尿等の生体試料中のベータガラクトシダーゼ活性を指標とする方法（特許文献１）、８－ハイドロキシデオキシグアノシンを指標とする方法（特許文献２）などが報告されているが、老化度と客観的に関連づけられる指標としていまだ十分満足できるものはなかった。また、近年では、生体の組織を構成する細胞は老化することで炎症性物質やマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）などの発現が高まり、周囲の老化を促進する可能性が示唆されている（非特許文献３）。生体内のこれらの老化関連因子を評価することができれば個人の老化状態を予測できると期待されるが、具体的にどのような因子が個人の表現型に関与するかは十分に明らかとなっていない。

特許第５０２１２７３号公報特許第２８５０１２８号公報

ＡｎｉｓＬａｒｂｉｅｔａｌ．，Ａｇｉｎｇｏｆｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍａｓａｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｆａｃｔｏｒｆｏｒｈｕｍａｎｌｏｎｇｅｖｉｔｙ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．，２３：６４（２００８）Ｐａｒｋｅｔａｌ．，Ｍｏｄｅｌｓｏｆｖｉｓｕｏｓｐａｔｉａｌａｎｄｖｅｒｂａｌｍｅｍｏｒｙａｃｒｏｓｓｔｈｅａｄｕｌｔｌｉｆｅｓｐａｎ．ＰｓｙｃｈｏｌＡｇｉｎｇ．，１７，２９９－３２０（２００２）ＢｙｕｎＨＯｅｔａｌ．，Ｆｒｏｍｃｅｌｌｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｔｏａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｄｉｓｅａｓｅｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆａｃｔｉｏｎｏｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．ＢＭＢＲｅｐ．５４９－５５８（２０１５）

従って、本発明は、生体老化レベルを客観的かつ正確に評価できる指標を用いた新たな生体老化レベルの評価方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌの発現量が、若齢群の検体よりも高齢群の検体のほうが有意に高く、加齢に伴う脳機能の低下、血液の老化、及び抗疲労性の低下と相関性があること、また、その相関性に基づき上記タンパク質の発現量を指標とすれば、生体老化レベルを客観的かつ正確に評価できるという知見を得、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）生体試料におけるＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌから選ばれる１種又は２種以上のタンパク質の発現量を指標とする、生体老化レベルの評価方法。
（２）前記生体試料が、被験体より採取した唾液又は血液である、（１）に記載の方法。
（３）前記生体老化が、脳機能の低下である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記生体老化が、血液の老化である、（１）又は（２）に記載の方法。
（５）前記生体老化が、抗疲労性の低下である、（１）又は（２）に記載の方法。
（６）Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌから選ばれる１種又は２種以上のタンパク質に対する抗体を含む、生体老化レベルの評価用キット。

本発明の方法によれば、生体老化レベルと相関する新規マーカーを指標とするため、生体老化レベルを客観的かつ正確に評価することができる。本発明の方法は、検体として被験者から採取した唾液や血液などの体液を用いることができるため、被験者の負担もなく、迅速かつ簡便である。本発明の方法によって得られた生体老化レベルの評価は、個人の健康状態の把握に役立ち、老化の改善や老化の予防を目的とした生活習慣の見直し、アンチエイジング志向の高まりから需要が伸びている抗老化のための医薬品やサプリメント等を積極的に取り入れる意識を高めることができる。

若齢群と高齢群における各脳機能（ＭＳＴ（短期記憶能力）、２－ｂａｃｋ課題（ワーキングメモリー能力）、ロンドン塔課題（プランニング能力））試験の結果（正答率）の比較を示す（＊：Ｐ＜０．０５）。唾液中のＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅの濃度と各脳機能（ＭＳＴ、２－ｂａｃｋ課題、ロンドン塔課題）試験の正答率との関係（散布図）を示す。図３Ａは、若齢群と高齢群における赤血球沈降速度の比較を示す（＊：Ｐ＜０．０５）。図３Ｂは、唾液中のＩＬ－１αの濃度と赤血球沈降速度との関係（散布図）を示す。図４Ａは、若齢群と高齢群における、自律神経強度（ＴＰ)の比較を示す（＊：Ｐ＜０．０５）。図４Ｂは、唾液中のＩＬ－１αの濃度とＴＰとの関係（散布図）を示す。

１．生体老化レベルを評価する方法
本発明の生体老化レベルを評価する方法は、生体試料におけるＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌから選ばれる１種又は２種以上のタンパク質の発現量を指標として用いる。

本発明において、「生体老化レベルの評価」とは、加齢に伴う生体機能の低下の程度の判定をいう。加齢に伴う生体機能の低下としては、脳機能（記憶力・認知機能）の低下、血液の老化、抗疲労性の低下（疲れやすい、疲れが蓄積しやすい、疲れが回復しにくい等）、筋力の低下、心肺機能の低下、免疫力の低下などが含まれるが、これらに限定はされない。

本発明において、生体試料は、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及び／又はＣＤ３０Ｌの発現量の変動を測定及び／又は比較できる試料であれば、その種類は特に限定されるものではないが、体液が好ましい。生体試料を採取する被験体としてはヒトであるが、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。

体液としては、例えば、唾液、血液（例えば、全血、白血球等の血球、血漿、血清等）、尿、喀痰、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、口腔（内頬）粘膜ぬぐい液、涙腺分泌液、関節液、膣液、精液、子宮頸分泌液、及び汗などが挙げられるが、検査の簡便性と低侵襲性の点から、唾液又は血液が好ましく、唾液がより好ましい。唾液には、安静時唾液及び刺激時唾液が包含される。

上記生体試料の採取は、通常の方法により行うことができる。例えば、生体試料が、唾液の場合は、安静時唾液は、吐唾法、ワッテ法等により採取することができ、刺激時唾液は、例えば、ガム法により採取することができる。唾液の採取方法は、当該技術分野において確立されており、当業者であれば、適宜選択することが可能である。

本発明において生体老化レベルの評価の指標として用いるＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ（ＣＸ３ＣＬ１）、ＩＬ－１α（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１ａｌｐｈａ）、ＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａｌｐｈａ）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ３０Ｌｉｇａｎｄ／ＴＮＦＳＦ８（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｌｉｇａｎｄｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒ８））は、いずれもサイトカインタンパク質として知られており、主に生体内の様々な炎症反応、炎症の病態形成に関与する。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上併用することより評価の精度を高めることができる。２種以上を併用する場合は、ＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅとＩＬ－１αの組み合わせが好ましく、ＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅとＩＬ－１αとＴＮＦ－α、ＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅとＩＬ－１αとＣＤ３０Ｌの組み合わせがより好ましく、ＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅとＩＬ－１αとＴＮＦ－αとＣＤ３０Ｌの組み合わせがさらに好ましい。

上記のタンパク質の配列情報は、例えばヒトの場合は、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ（ＧｅｎＢａｎｋｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ＿００２９８７．１）、ＩＬ－１α（ＧｅｎＢａｎｋｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ＿０００５６６）、ＴＮＦ－α（ＧｅｎＢａｎｋｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ＿０００５８５）、ＣＤ３０Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ＿００１２３９２１９）として登録されている。ヒトのＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌのアミノ酸配列は、配列表の配列番号１、２、３、４にそれぞれ示される。本発明においてこれらのタンパク質は、生体老化レベルの指標として用いることができる限り、配列番号１、２、３、及び４の各アミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよく、そのようなホモログタンパク質も、本発明にいうＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌに包含されるものとする。

本発明に係る生体老化レベルの評価方法は、生体試料におけるＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌの発現量が、老化が進むと増加するという知見に基づき、生体試料を採取した被験者の生体老化レベルを評価するものである。よって、評価にあたっては、生体老化レベルの評価に供する生体試料を用意し、該生体試料におけるＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌから選ばれる１種又は２種以上のタンパク質（以下、これらを「老化マーカータンパク質」という）の発現量を測定し、該発現量に基づいて老化レベルを評価する。生体試料における老化マーカータンパク質の発現量は、絶対値又は相対値（比較対照又は基準発現量との比率や差など）として算出され、必ずしも老化マーカータンパク質の絶対的な発現量を測定する必要はなく、対照の老化マーカータンパク質の発現量との相対的な関係が明らかになればよい。また、ここでいう「評価」は、医師による診断を包含せず、加齢により発症する特定の疾患に対して医師による診断が介入する場合であっても、診断の補助を意味し、具体的には、診断のためのデータを取得することをいう。

老化マーカータンパク質の発現量の測定は、例えば、老化マーカータンパク質に対する抗体又は抗体断片を用いて免疫学的に測定する方法を用いることができる。具体的には、ウエスタンブロッティング法、酵素免疫測定法(ＥＬIＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲIＡ）、蛍光抗体法、セルアレイ法、組織アレイ法等を挙げることができる。その他、抗体を用いず、同時に多くのタンパク質を定量できるハイスループットなタンパク質質量分析技術であるＬＣ－ＭＳ／ＭＳＭＲＭ等を用いることができる。これらの測定方法についても、常法のプロトコル、又は常法のプロトコルを適宜修正・変更したプロトコルによって実施することができる。

本発明において、生体老化レベルの評価は、例えば、上記の方法で測定した生体試料における老化マーカータンパク質の発現量と、予め定めた基準発現量とを比較することにより行うことができる。基準発現量としては、例えば、若齢群、高齢群、あるいは年齢群別に平均値をとって定めた老化マーカータンパク質の発現量を用いることができる。あるいは、老化マーカータンパク質の発現量と生体老化の指標（例えば、認知機能試験の正答率、赤血球沈降速度、自律神経強度（ＴＰ))との相関図を予め作成しておき、被験体の生体試料における当該老化マーカータンパク質の発現量をその相関図と比較してもよい。

発現量の比較は、有意差の有無に基づいて行うことが好ましい。例えば、生体試料における老化マーカータンパク質の発現量が、基準発現量と比べて、１０％、又は２０％、又は３０％、又は５０％、又は７０％、又は１００％高い、又は低い場合、有意に高い、又は、有意に低いとすることができる。生体試料における老化マーカータンパク質と高齢群又は若齢群の基準発現量とを比較し、該生体試料における老化マーカータンパク質の発現量が高齢群の基準発現量と同等又は若齢群の基準発現量よりも有意に高い場合には、該生体試料を採取した被験体の生体老化レベルが高いと評価でき、該生体試料における老化マーカータンパク質の発現量が若齢群の基準発現量と同等又は高齢群の基準発現量よりも有意に低い場合には、該生体試料を採取した被験体の生体老化レベルが低いと評価できる。

あるいは、別の方法として、２０代、３０代、４０代、５０代、６０代、７０代といったように年代別に「基準発現量（平均値）＋２ＳＤ」をカットオフ値として規定し、被験体より採取した生体試料中の老化マーカータンパク質の発現量が、該被験体の実年齢に相当する年代のカットオフ値より高い場合には、該被験体の生体老化レベルが高い、生体老化が進んでいると評価でき、カットオフ値より低い場合には、該被験体の生体老化レベルが低い、生体老化が進んでいないと評価することができる。

カットオフ値を用いる場合の生体老化レベルの評価方法は、具体的には、(ａ）被験体より採取した生体試料におけるＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌから選ばれる１種又は２種以上のタンパク質の発現量を測定する工程、(ｂ）工程(ａ)で測定したＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌから選ばれる１種又は２種以上のタンパク質の発現量を、予め設定されたカットオフ値と比較し、該発現量が該カットオフ値以上である場合は該被験体の生体老化レベルが高いと評価し、該発現量が該カットオフ値以下である場合は該被験体の生体老化レベルが低いと評価する工程を含む。

２．生体老化レベルの評価用キット
本発明に係る生体老化レベルの評価用キットは、前記のＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌから選ばれる１種又は２種以上の老化マーカータンパク質の発現量を測定するための試薬を含む。当該キットを構成する試薬としては、老化マーカータンパク質に対する抗体を用いることができる。

老化マーカータンパク質に対する抗体は、当該タンパク質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。また抗体は、上記のタンパク質に特異的に結合し得る限り断片であってもよい。抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、単鎖抗体(ｓｃＦｖ)等が挙げられる。抗体の作成は、上記タンパク質を抗原として、常法により作製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス等）から血液を採取し、この血液から公知の方法により血清を分離することによって得られる。また、モノクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物から抗体産生細胞（脾臓細胞、リンパ節細胞等）を取り出して骨髄腫細胞と細胞融合させ、得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から回収することによって得られる。また、市販品を用いることもできる。タンパク質の定量のために、これらの抗体を適宜標識してもよい。標識物質は、蛍光色素、放射性同位体、酵素等を使用することができる。

本発明のキットには、前記の測定方法において用いる抗体を少なくとも含んでいればよいが、必要に応じて、固定化担体、標識物質、標識の検出に用いられる基質化合物、陽性や陰性の標準試料、キットの使用方法を記載した指示書等を含めることもできる。なお、キット中の試薬は溶液でも凍結乾燥物でもよい。

以下に本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（実施例１）唾液中のタンパク質濃度の測定
被験者２０名（２０～３０代若齢群１０名、５０～６０代高齢群１０名）から唾液を採取した。唾液は、水道水で口を３回ゆすいだ後、自然に分泌される唾液を５分間採取した。採取した唾液を３，５００ｒｐｍにて１５分間遠心し、上清を回収した。回収した上清を１００℃で５分間加熱した後、３，５００ｒｐｍで１５分間遠心し、還元処理したものをサンプルとして用いた。還元処理前のサンプルのタンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）により測定し、サンプルのタンパク質濃度を調整した。ドットブロッター（ＳＣＩＥ－ＰＬＡＳ社製）を用いてメンブレン（ＭＥＲＣＫ社製）上にサンプルを吸引・吸着させ、ＰＢＳ（－）にて洗浄し、ＰＶＤＦＢｌｏｃｋｉｎｇＲｅａｇｅｎｔｆｏｒＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌ（登録商標）（ＴＯＹＯＢＯ社製）でブロッキングをした。ＰＢＳ（－）で洗浄した後、ＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌＳｏｌｕｔｉｏｎ１（ＴＯＹＯＢＯ社製）で希釈した一次抗体をメンブレンに添加し、４℃で１２時間反応させた。一次抗体には抗Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ社製）、抗ＩＬ－１ａ抗体（ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）、抗ＴＮＦ－α抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＣＤ３０Ｌ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。一次抗体反応後、ＰＢＳ（－）で洗浄し、ＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌＳｏｌｕｔｉｏｎ２（ＴＯＹＯＢＯ社製）で希釈した二次抗体をメンブレンに添加し、室温で１時間反応させた。二次抗体には、ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＦ（ａｂ’）２ＦｒａｇｍｅｎｔＲａｂｂｉｔＡｎｔｉ－ＲａｔＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた。二次抗体反応後、ＰＢＳ（－）で洗浄し、ＥＣＬ^ＴＭＰｒｉｍｅＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔｓ（ｃｙｔｉｖａ社製）で処理し、ＷＳＥ－６２００ＨＬｕｍｉｎｏＧｒａｐｈII（ＡＴＴＯ社製）を用いて発光強度を測定し、検量線の発光強度を比較することでタンパク量を定量した。各群（１０名）における平均タンパク質濃度（ｎｇ／ｍＬ)を表１に示した。

表１に示されるように、唾液中のＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌの濃度は、若齢群の検体よりも高齢群の検体のほうが有意に高かった。

（実施例２）脳機能の測定
被験者２０名（２０～３０代若齢群１０名、５０～６０代高齢群１０名）の脳機能として、短期記憶能力、ならびに前頭前野に関連するワーキングメモリー能力及びプランニング能力を測定した。短期記憶能力の測定にはＭｎｅｍｏｎｉｃＳｉｍｉｌａｒｉｔｙＴａｓｋ（ＭＳＴ）を用いた。ＭＳＴとは被験者に対して様々な画像を提示し、１０分後に先ほど見た画像を正確に憶えているかを測定する試験である。本試験では１０枚の画像を５秒ずつ提示し、１０分後の正答率を短期記憶能力として算出した。ワーキングメモリー能力の測定には２－ｂａｃｋ課題を用いた。２－ｂａｃｋ課題とは被験者に対して様々な画像を数枚提示し、提示し終えた時点から２枚前の画像を正確に憶えているかを測定する試験である。本試験では３～５枚の画像を提示し２枚前の画像を回答させるのを１０セット行い、正答率をワーキングメモリー能力として算出した。プランニング能力の測定にはロンドン塔課題を用いた。ロンドン塔課題とは被験者にそれぞれ高さの異なる３本の棒に「赤」、「青」、「緑」の３色の球が配置されているスタートの画像とゴールの画像を提示し、球を最低何回動かせばスタートの配置からゴールの配置になるかを回答させる試験である。本試験では１０セット行い、正答率をプランニング能力として算出した。

図１に、若齢群と高齢群における各脳機能（ＭＳＴ（短期記憶能力）、２－ｂａｃｋ課題（ワーキングメモリー能力）、ロンドン塔課題（プランニング能力））の試験結果（正答率（％））の比較を示す。また、図２に、実施例１で測定したＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅの濃度（ｎｇ／ｍＬ)と各脳機能試験の正答率（％）との関係（散布図）を示す。

図１に示されるように、若齢群に比べて高齢群は各脳機能試験の正答率が下がり、加齢によって脳機能が低下した。また、図２に示されるように、唾液中のＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅの濃度が高くなるにつれて各脳機能試験の正答率が下がり、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅの濃度と脳機能とは、負の相関関係（ＭＳＴ：相関係数ｒ＝－０．４８９４６７０８６、２－ｂａｃｋ課題：相関係数ｒ＝－０．４６５３５０９１８、ロンドン塔課題：相関係数ｒ＝－０．６５５６３５７９４）があることが認められた。

（実施例３）血液の状態（赤血球沈降速度）の測定
被験者２０名（２０～３０代若齢群１０名、５０～６０代高齢群１０名）から血液を採取し、外部機関にて血液検査を行った（名古屋臨床センター）。測定項目は赤血球沈降速度を設定した。赤血球沈降速度は、採取した血液に抗凝固剤を添加したものを細管に入れ、自然放置することで赤血球が沈降することを利用した検査方法であり、古くから炎症の診断に用いられてきた。赤血球の沈降速度は赤血球の凝集しやすさに比例するため、沈降速度から赤血球の状態を推定できる。一般に老化した赤血球は膜構造の不安定化により凝集しやすくなることが知られているため、沈降速度の速い検体では老化した赤血球が多く存在すると考えられる

図３Ａに、若齢群と高齢群における赤血球沈降速度（ｍｍ／時間）の比較を示す。また、図３Ｂに、実施例１で測定したＩＬ－１α濃度(ｎｇ／ｍＬ）と赤血球沈降速度（ｍｍ／時間）との関係（散布図）を示す。

図３Ａに示されるように、若齢群に比べて高齢群は赤血球沈降速度が上がり、加齢によって血液（赤血球）の老化が生じた。また、図３Ｂに示されるように、唾液中のＩＬ－１αの濃度が高くなるにつれて赤血球沈降速度が上がり、ＩＬ－１αの濃度と血液（赤血球）の老化とは、正の相関関係（相関係数ｒ＝０．６６６６９３９５）があることが認められた。

（実施例４）疲労度の測定
被験者２０名（２０～３０代若齢群１０名、５０～６０代高齢群１０名）の指尖脈波を計測し、疲労度を解析した。指尖脈波の計測及び解析にはＳＡ－３０００ｐｌｕｓ（東京医研）を用い、自律神経強度（ＴｏｔａｌＰｏｗｅｒ：ＴＰ）の解析を行った。一般に、自律神経強度と疲労度との間に相関関係があることが知られており、自律神経強度を測定することにより疲労度の客観的な測定が可能であるとされている。

図４Ａに、若齢群と高齢群におけるＴＰ(ｍＳ^２)の比較を示す。また、図４Ｂに、実施例１で測定したＩＬ－１α濃度(ｎｇ／ｍＬ）とＴＰ(ｍＳ^２)との関係（散布図）を示す。

図４Ａに示されるように、若齢群に比べて高齢群はＴＰが下がり、加齢によって疲労度が増し、抗疲労性が低下した。また、図４Ｂに示されるように、唾液中のＩＬ－１αの濃度が高くなるにつれてＴＰが下がり、ＩＬ－１αの濃度と抗疲労性とは、負の相関関係（相関係数ｒ＝－０．４４６７０４８１３）があることが認められた。

なお、上記実施例２～４の相関係数ｒは、唾液中のタンパク質の濃度をｘ（説明変数）、各試験で得られた測定値をｙ（目的変数）とし、下記の式１で算出される。

（実施例５）唾液中のタンパク質と老化レベル測定値との相関解析
実施例１で測定した唾液中のタンパク質（Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌ）の濃度を説明変数とし、実施例２（脳機能：ＭＳＴ、２－ｂａｃｋ課題、ロンドン塔課題）、実施例３（血液の状態：赤血球沈降速度）、実施例４（抗疲労性：ＴＰ）で得られた測定値を目的変数とし、それぞれ単回帰分析によって決定係数Ｒ^２を算出した。また、実施例１で測定した唾液中のタンパク質の濃度の複数の組み合わせを説明変数とし、実施例２（脳機能）、実施例３（血液の状態）、実施例４（抗疲労性）の各測定で得られた測定値を目的変数とし、それぞれ重回帰分析によって決定係数Ｒ^２を算出した。決定係数Ｒ^２は寄与率ともいい、説明変数が目的変数をどれくらい説明しているかを表す。決定係数Ｒ^２は、推定された回帰式の当てはまりの良さの度合いを示す指標であり、０から１までの値を取り、１に近いほど回帰式が測定されたデータに良く当てはまることを示す。また、説明変数と目的変数から得られた決定係数Ｒ^２が統計的に有意であるかどうかを判定するために該説明変数と該目的変数のｐ値を求めた。ｐ値は０．０５（＝５％）を有意水準として、ｐ値が０．０５より小さい場合に有意性があるとされる。本実施例では被験者が２０名であるため、決定係数Ｒ^２が０．１４３１４２でｐ値＜０．１、決定係数Ｒ^２が０．１９６９２６でｐ値＜０．０５、決定係数Ｒ^２が０．３１５２０９でｐ値＜０．０１の値となる。

表２に、唾液中のタンパク質と、脳機能、血液の状態、抗疲労性の老化レベルの測定値の相関解析により算出した決定係数Ｒ^２を示す。

表２に示されるように、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅと脳機能との単回帰分析により算出した決定係数Ｒ^２は０．２４、０．２２、０．４３で、ｐ値が有意水準以下であることから、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅと脳機能との有意な相関性が認められた。また、ＩＬ－１αと血液の状態との単回帰分析により算出した決定係数Ｒ^２は０．４４、ＩＬ－１αと抗疲労性との単回帰分析により算出した決定係数Ｒ^２は０．２０で、ｐ値が有意水準以下であることから、ＩＬ－１αは血液の状態及び抗疲労性との有意な相関性が認められた。また、ＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅとＩＬ－１αの組み合わせ、及び、ＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅとＩＬ－１αと、ＴＮＦ－α又はＣＤ３０Ｌとの組み合わせでは、さらに決定係数Ｒ^２が大きくなり、より強い相関が認められた。

以上より、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌから選ばれる１種又は２種以上のタンパク質の発現量により、脳機能、血液の状態、抗疲労性の老化レベルが十分に説明できることが明らかとなり、これらのタンパク質は生体老化レベルの新たな指標として有効であることがわかった。

本発明の方法によれば、生体老化レベルを客観的かつ正確に、しかも迅速に評価することができる。よって、本発明の方法によって得られた生体老化レベルの評価結果に基づき、被験者にカスタマイズした老化の改善や老化の予防のためのサプリメントを提供すること、また、老化の改善や老化の予防のためのケア方法に関するカウンセリングやアドバイスを行うことが可能となる。

Claims

生体試料におけるＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌから選ばれる１種又は２種以上のタンパク質の発現量を指標とする、生体老化レベルの評価方法。
前記生体試料が、被験体より採取した唾液又は血液である、請求項１に記載の方法。
前記生体老化が、脳機能の低下である、請求項１又は２に記載の方法。
前記生体老化が、血液の老化である、請求項１又は２に記載の方法。
前記生体老化が、抗疲労性の低下である、請求項１又は２に記載の方法。
Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－α、及びＣＤ３０Ｌから選ばれる１種又は２種以上のタンパク質に対する抗体を含む、生体老化レベルの評価用キット。