JP2023172606A - 細胞死抑制剤、医薬、及びインビトロにおける細胞死を抑制する方法 - Google Patents

細胞死抑制剤、医薬、及びインビトロにおける細胞死を抑制する方法 Download PDF

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梶山　浩
Hiroshi Kajiyama
俊英 三村
Toshihide Mimura
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Abstract

【課題】ヒドロキシクロロキンによる細胞死及び長期培養による細胞死のいずれかの細胞死を抑制することができる細胞死抑制剤、ＨＣＱが用いられる疾患に使用するための医薬、及びインビトロにおける細胞死を抑制する方法の提供。【解決手段】ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤を含み、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）による細胞死及び長期培養による細胞死のいずれかの細胞死を抑制する細胞死抑制剤である。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞死抑制剤、ＨＣＱが用いられる疾患に使用するための医薬、及びインビトロにおける細胞死を抑制する方法に関する。
ヒドロキシクロロキン（以下、「ＨＣＱ」と称することがある。）は、全身性エリテマトーデス（以下、「ＳＬＥ」と称することがある。）の病態の安定化を目的に使われている免疫調整薬である。ＨＣＱは、腎機能保護作用、生命予後改善作用があることから、長年ＳＬＥの治療薬として全世界で使われてきた。日本国内でも、２０１５年７月にＳＬＥに対して保険承認となった。
一方、海外からの報告では、６年から１５年間の内服の間、７～８％の症例で非可逆的失明に至る網膜症が出現すると報告され、日本国内でも数例の報告がある。また、ＨＣＱ投与により糸球体上皮細胞内にファブリー（Ｆａｂｒｙ）病で認めるゼブラボディ（Ｚｅｂｒａ ｂｏｄｙ）様の封入体が形成され、蛋白尿が出現することが報告されている。
しかし、このＨＣＱの投与による網膜症や腎障害の機序の詳細は、まだ十分に解明されていない。
なお、これまでに、円板状エリテマトーデスの治療において、ヒドロキシクロロキンが用いられることがあるものの、この薬物には網膜毒性のリスクがあることから、それに代えて、ＪＡＫ経路を調節する化合物を円板状エリテマトーデスの治療に用いる技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、ドライアイおよび他の目に関連する疾患を治療するために、ヤヌスキナーゼを阻害する化合物を使用する技術が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
特表２０１４－５０７４８０号公報 特開２０２０－０５０６８２号公報
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ヒドロキシクロロキンによる細胞死及び長期培養による細胞死のいずれかの細胞死を抑制することができる細胞死抑制剤、ＨＣＱが用いられる疾患に使用するための医薬、及びインビトロにおける細胞死を抑制する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、ＨＣＱが、培養細胞に対して細胞死を起こすことを新たに見出した。また、ＪＡＫ阻害剤を用いることで、ＨＣＱによる細胞死及び長期培養による細胞死を、再現性良く、抑制できることを見出した。
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤を含み、
ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）による細胞死及び長期培養による細胞死のいずれかの細胞死を抑制することを特徴とする細胞死抑制剤である。
＜２＞ 個体に、前記＜１＞に記載の細胞死抑制剤を投与することを特徴とする細胞死抑制方法である。
＜３＞ ＨＣＱが用いられる疾患に使用するための医薬であって、
ＪＡＫ阻害剤を含み、ＨＣＱによる細胞死を抑制する細胞死抑制剤を含有することを特徴とする医薬である。
＜４＞ 個体に、前記＜３＞に記載の医薬を投与することを特徴とするＨＣＱが用いられる疾患の治療方法である。
＜５＞ インビトロにおける細胞死を抑制する方法であって、
ＪＡＫ阻害剤を細胞に添加することを含み、
前記細胞死が、ＨＣＱによる細胞死及び長期培養による細胞死のいずれかの細胞死であることを特徴とする方法である。
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ヒドロキシクロロキンによる細胞死及び長期培養による細胞死のいずれかの細胞死を抑制することができる細胞死抑制剤、ＨＣＱが用いられる疾患に使用するための医薬、及びインビトロにおける細胞死を抑制する方法を提供することができる。
図１は、試験例１の生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。 図２は、試験例２の生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。 図３は、試験例３の生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。 図４は、試験例４の生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。 図５は、試験例５の生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。 図６は、試験例６の生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。 図７Ａは、試験例７におけるウパダシチニブを添加した場合の生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。 図７Ｂは、試験例７におけるバリシチニブを添加した場合の生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
（細胞死抑制剤）
本発明の細胞死抑制剤は、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。本発明の細胞死抑制剤は、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）による細胞死及び長期培養による細胞死のいずれかの細胞死を抑制する。
本明細書において、「ＨＣＱによる細胞死」には、ＨＣＱを培養細胞に添加することにより起きる細胞死、ＨＣＱを個体に投与することにより起きる細胞死のいずれもが含まれる。
本明細書において、「長期培養による細胞死」とは、細胞を長期間、培養液の交換なしで培養することによる細胞死のことをいう。前記長期間とは、１４日間以上のことをいい、２８日間以上が好ましい。
＜ＪＡＫ阻害剤＞
前記ＪＡＫ阻害剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、バリシチニブ、ウパダシチニブ、トファシチニブ、ペフィシチニブ、フィルゴチニブなどが挙げられる。これらは、個体への投与の際は通常単独で用いられ、インビトロの使用の際は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記ＪＡＫ阻害剤の中でも、バリシチニブ、ウパダシチニブが好ましい。
前記ＪＡＫ阻害剤は、適宜調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
前記細胞死抑制剤における前記ＪＡＫ阻害剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記細胞死抑制剤は、前記ＪＡＫ阻害剤のみからなるものであってもよい。
＜その他の成分＞
前記細胞死抑制剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、剤型等に応じて適宜選択することができる。
前記細胞死抑制剤におけるその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜剤形＞
前記細胞死抑制剤の剤形としては、特に制限はなく、所望の投与方法などに応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。
前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。
＜使用＞
前記細胞死抑制剤は、インビボで用いることもできるし、インビトロで用いることもできる。
前記細胞死抑制剤の投与方法、投与量、投与時期、投与回数、投与間隔、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記細胞死抑制剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記細胞死抑制剤の剤形、投与対象である個体の年齢、体重、疾患の有無、投与対象の細胞の状態などに応じて、適宜選択することができる。例えば、個体に投与する場合は、経口投与、腹腔内投与、血液中への投与等の全身投与、局所投与のいずれかを選択することができる。また、細胞に投与する場合は、培地中に添加することにより、投与することができる。
前記細胞死抑制剤の投与量（使用量）としては、特に制限はなく、投与対象である個体の年齢、体重、疾患の有無、投与対象の細胞の状態などに応じて、適宜選択することができる。例えば、個体に対する投与量としては、有効成分であるＪＡＫ阻害剤の最大血中濃度として、０．１５μＭ～０．５μＭとすることが好ましく、０.１５μＭ～０．３５μＭとすることがより好ましい。また、培養細胞に対する投与量としては、有効成分であるＪＡＫ阻害剤の培地中の濃度として、０．００３μＭ～５０μＭとすることが好ましく、０．００３μＭ～０．３５μＭとすることがより好ましい。
前記細胞死抑制剤の投与時期、投与回数、投与間隔としても、特に制限はなく、投与対象である個体の年齢、体重、疾患の有無、投与対象の細胞の状態などに応じて、適宜選択することができる。
前記細胞死がＨＣＱによる細胞死である場合には、前記細胞死抑制剤は、前記ＨＣＱを使用する前に用いることが好ましい。前記ＨＣＱを複数回使用する場合には、最初のＨＣＱの使用前に細胞死抑制剤を使用してもよいし、各回のＨＣＱの使用前に細胞死抑制剤を使用してもよいし、任意の回のＨＣＱの使用前に細胞死抑制剤を使用してもよい。また、前記細胞死抑制剤の投与と、ＨＣＱの投与との間隔としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記細胞死抑制剤が対象とする個体（種）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられる。
前記細胞死抑制剤が対象とする細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した個体由来の細胞などが挙げられる。
前記細胞死抑制剤は、他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。
前記細胞死抑制剤によれば、ＨＣＱによる細胞死を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、個体に、前記細胞死抑制剤を投与することを特徴とする細胞死抑制方法にも関する。
また、前記細胞死抑制剤は、ＨＣＱの副作用を低減するための剤、細胞保護剤ということもできる。
（ＨＣＱが用いられる疾患に使用するための医薬）
本発明のＨＣＱが用いられる疾患に使用するための医薬（以下、「医薬」と称することがある。）は、ＪＡＫ阻害剤を含み、ＨＣＱによる細胞死を抑制する細胞死抑制剤を少なくとも含有し、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記医薬によれば、前記ＨＣＱが用いられる疾患における網膜症や腎障害を抑制し得る。
＜ＨＣＱが用いられる疾患＞
前記ＨＣＱが用いられる疾患としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、マラリアなどが挙げられる。
＜ＪＡＫ阻害剤を含み、ＨＣＱによる細胞死を抑制する細胞死抑制剤＞
前記ＪＡＫ阻害剤を含み、ＨＣＱによる細胞死を抑制する細胞死抑制剤は、上記した本発明の細胞死抑制剤と同様である。
前記医薬における前記細胞死抑制剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬は、前記細胞死抑制剤のみからなるものであってもよい。
＜その他の成分＞
前記医薬におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した細胞死抑制剤におけるその他の成分と同様のものが挙げられる。
前記医薬における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜剤形＞
前記医薬の剤形としては、特に制限はなく、所望の投与方法などに応じて適宜選択することができ、例えば、上記した細胞死抑制剤における剤形と同様のものが挙げられる。
＜使用＞
前記医薬の投与方法、投与量、投与時期、投与回数、投与間隔、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した細胞死抑制剤の「使用」の項目における個体に投与する場合と同様とすることができる。
前記医薬は、前記ＨＣＱを使用する前に用いることが好ましい。前記ＨＣＱを複数回使用する場合には、最初のＨＣＱの使用前に細胞死抑制剤を使用してもよいし、各回のＨＣＱの使用前に細胞死抑制剤を使用してもよいし、任意の回のＨＣＱの使用前に細胞死抑制剤を使用してもよい。また、前記医薬の投与と、ＨＣＱの投与との間隔としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記医薬が対象とする種（個体）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられる。
前記医薬は、他の医薬と組み合わせて使用してもよい。
前記医薬によれば、ＨＣＱによる細胞死を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、個体に、前記医薬を投与することを特徴とするＨＣＱが用いられる疾患の治療方法にも関する。
前記治療とは、前記ＨＣＱが用いられる疾患における、網膜症や腎障害等のＨＣＱの副作用を治したり、和らげたり、進行を防いだりすることをいう。
また、前記医薬は、ＨＣＱの副作用を低減するための医薬、細胞を保護するための医薬ということもできる。
（インビトロにおける細胞死を抑制する方法）
本発明のインビトロにおける細胞死を抑制する方法は、ＪＡＫ阻害剤を細胞に添加すること（以下、「添加工程」と称することがある。）を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。本発明のインビトロにおける細胞死を抑制する方法における細胞死は、ＨＣＱによる細胞死及び長期培養による細胞死のいずれかの細胞死である。
＜添加工程＞
前記添加工程は、ＪＡＫ阻害剤を細胞に添加する工程である。
前記ＪＡＫ阻害剤は、上記した細胞死抑制剤におけるＪＡＫ阻害剤と同様である。
前記ＪＡＫ阻害剤の添加量（投与量）としては、特に制限はなく、投与対象の細胞の状態などに応じて、適宜選択することができ、例えば、上記した細胞死抑制剤の「使用」の項目における培養細胞に対する投与量と同様とすることができる。
前記ＪＡＫ阻害剤の投与時期、投与回数、投与間隔としても、特に制限はなく、投与対象の細胞の状態などに応じて、適宜選択することができる。
前記細胞死がＨＣＱによる細胞死である場合には、前記ＪＡＫ阻害剤は、前記ＨＣＱを使用する前に用いることが好ましい。前記ＨＣＱを複数回使用する場合には、最初のＨＣＱの使用前にＪＡＫ阻害剤を使用してもよいし、各回のＨＣＱの使用前にＪＡＫ阻害剤を使用してもよいし、任意の回のＨＣＱの使用前にＪＡＫ阻害剤を使用してもよい。また、前記ＪＡＫ阻害剤の投与と、ＨＣＱの投与との間隔としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、哺乳動物由来の細胞が好ましい。前記哺乳動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられる。
前記ＪＡＫ阻害剤は、他の添加剤と組み合わせて使用してもよい。
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記インビトロにおける細胞死を抑制する方法によれば、ＨＣＱによる細胞死や長期培養による細胞死を効果的に抑制することができる。
前記インビトロにおける細胞死を抑制する方法は、ＨＣＱの副作用を低減するための方法、細胞を保護するための方法ということもできる。
以下に本発明の試験例を説明するが、本発明は、これらの試験例に何ら限定されるものではない。
（試験例１）
３～４×１０５ｃｅｌｌｓのヒト培養ポドサイト（「Ｓａｋａｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２９８（３） Ｆ５５７－５６７， ２０１０」を参照）を、インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムを添加した１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地２０ｍＬで、Ｉ型コラーゲンをコートした１７５ｃｍ２フラスコにて、３３℃、ＣＯ２濃度５．０％で培養を開始し、フラスコ面の８０～９０％を細胞が覆う程度の細胞密度まで培養した。
その後、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地を吸引除去し、等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、数回フラスコを揺らし、ＰＢＳを吸引除去した後、３ｍＬの０．０２％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃、ＣＯ２濃度５．０％で１０分間培養した。次いで、７ｍＬの１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地を加えてトリプシンを失活させ、１０ｍＬの細胞浮遊液を作製した。この細胞浮遊液を１５℃、１，６００ｒｐｍで７分間遠心処理し、得られた細胞ペレットを適量の１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁し、１０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度の細胞浮遊液を作製した。
Ｉ型コラーゲンをコートした９６ウェルプレートに、１００μＬ／ウェルの量で前記細胞浮遊液を注入し、３７℃、ＣＯ２濃度５．０％で培養を開始した。
培養開始４８時間後に、２０ｍｇ／ｍＬのヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）のストック溶液（溶媒はＰＢＳ）から、４ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．０６２５ｍｇ／ｍＬ、０．０１５６ｍｇ／ｍＬ、０．００３９１ｍｇ／ｍＬ、０．０００９ｍｇ／ｍＬの濃度のＨＣＱ溶液を、ＰＢＳを溶媒として作製し、各濃度のＨＣＱ溶液を１μＬ、９６ウェルプレートのウェルに播いた各細胞へ添加した。
ＨＣＱ添加後３日目に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（プロメガ社）を用いて生存細胞数を決定した。ルミネセンスは、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。
結果を図１に示す。図１の縦軸は相対蛍光単位（ＲＬＵ）を表し、横軸はＨＣＱの濃度を表す。具体的には、横軸は下記のとおりである。
・ Ｈ０ ・・・ ＨＣＱの濃度が、０μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１０×４－５ ・・・ ＨＣＱの濃度が、０．００９μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１０×４－４ ・・・ ＨＣＱの濃度が、０．０３９１μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１０×４－３ ・・・ ＨＣＱの濃度が、０．１５６μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１０×４－２ ・・・ ＨＣＱの濃度が、０．６２５μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１０×４－１ ・・・ ＨＣＱの濃度が、２．５μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１０×４０ ・・・ ＨＣＱの濃度が、１０μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１０×４１ ・・・ ＨＣＱの濃度が、４０μｇ／ｍＬ
図１に示したように、１０μｇ／ｍＬを超える濃度のＨＣＱは、細胞死を起こすことが確認された。
（試験例２）
３～４×１０５ｃｅｌｌｓのマウス培養ポドサイト（「Ｋａｊｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ， ２９（３） １５３－１６３， ２００９」を参照）を、１０～２０Ｕ／ｍＬのマウスＩＦＮ－γを添加した１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地２０ｍＬで、Ｉ型コラーゲンをコートした１７５ｃｍ２フラスコにて、３３℃、ＣＯ２濃度５．０％で培養を開始し、フラスコ面の８０～９０％を細胞が覆う程度の細胞密度まで培養した。
その後、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地を吸引除去し、等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、数回フラスコを揺らし、ＰＢＳを吸引除去した後、３ｍＬの０．０２％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃、ＣＯ２濃度５．０％で１０分間培養した。次いで、７ｍＬの１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地を加えてトリプシンを失活させ、１０ｍＬの細胞浮遊液を作製した。この細胞浮遊液を１５℃、１，６００ｒｐｍで７分間遠心処理し、得られた細胞ペレットを適量の１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁し、１０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度の細胞浮遊液を作製した。
Ｉ型コラーゲンをコートした９６ウェルプレートに、１００μＬ／ウェルの量で前記細胞浮遊液を注入し、３７℃、ＣＯ２濃度５．０％で培養を開始した。
培養開始４８時間後に、２０ｍｇ／ｍＬのヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）のストック溶液（溶媒はＰＢＳ）から、４ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．０６２５ｍｇ／ｍＬ、０．０１５６ｍｇ／ｍＬ、０．００３９１ｍｇ／ｍＬ、０．０００９ｍｇ／ｍＬの濃度のＨＣＱ溶液を、ＰＢＳを溶媒として作製し、各濃度のＨＣＱ溶液を１μＬ、９６ウェルプレートのウェルに播いた各細胞へ添加した。
ＨＣＱ添加後２日目に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（プロメガ社）を用いて生存細胞数を決定した。ルミネセンスは、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。
結果を図２に示す。図２の縦軸は相対蛍光単位（ＲＬＵ）を表し、横軸はＨＣＱの濃度を表す。具体的には、横軸は下記のとおりである。
・ Ｈ０ ・・・ ＨＣＱの濃度が、０μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１０×４－５ ・・・ ＨＣＱの濃度が、０．００９μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１０×４－４ ・・・ ＨＣＱの濃度が、０．０３９１μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１０×４－３ ・・・ ＨＣＱの濃度が、０．１５６μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１０×４－２ ・・・ ＨＣＱの濃度が、０．６２５μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１０×４－１ ・・・ ＨＣＱの濃度が、２．５μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１０×４０ ・・・ ＨＣＱの濃度が、１０μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１０×４１ ・・・ ＨＣＱの濃度が、４０μｇ／ｍＬ
図２に示したように、２．５μｇ／ｍＬを超える濃度のＨＣＱは、細胞死を起こすことが確認された。
（試験例３）
ヒト網膜色素上皮細胞株ＡＲＰＥ－１９を、培地（１０％ＦＣＳ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）＋Ｌ－グルタミン＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）で、何もプレコートしていないフラスコにて、３３℃、ＣＯ２濃度５．０％で培養を開始し、フラスコ面の８０～９０％を細胞が覆う程度の細胞密度まで培養した。
その後、前記培地を吸引除去し、等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、数回フラスコを揺らし、ＰＢＳを吸引除去した後、３ｍＬの０．０２％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃、ＣＯ２濃度５．０％で７分間培養した。次いで、７ｍＬの培地（１０％ＦＣＳ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）＋Ｌ－グルタミン＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）を加えてトリプシンを失活させ、１０ｍＬの細胞浮遊液を作製した。この細胞浮遊液を１５℃、１，６００ｒｐｍで７分間遠心処理し、得られた細胞ペレットを適量の培地（１０％ＦＣＳ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）＋Ｌ－グルタミン＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）で再懸濁し、１２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度の細胞浮遊液を作製した。
ウェルの底面に何もコートしていない、通常の９６ウェルプレートに、１００μＬ／ウェルの量で前記細胞浮遊液を注入し、３７℃、ＣＯ２濃度５．０％で培養を開始した。
培養開始４８時間後に、２０ｍｇ／ｍＬのヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）のストック溶液（溶媒はＰＢＳ）から、８ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．１２５ｍｇ／ｍＬ、０．０３１２５ｍｇ／ｍＬ、０．００７８１３ｍｇ／ｍＬ、０．００１９５ｍｇ／ｍＬの濃度のＨＣＱ溶液を、ＰＢＳを溶媒として作製し、各濃度のＨＣＱ溶液を１μＬ、９６ウェルプレートのウェルに播いた各細胞へ添加した。
ＨＣＱ添加後４日目に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（プロメガ社）を用いて生存細胞数を決定した。ルミネセンスは、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。
結果を図３に示す。図３の縦軸は相対蛍光単位（ＲＬＵ）を表し、横軸はＨＣＱの濃度を表す。具体的には、横軸は下記のとおりである。
・ ＰＢＳ ・・・ ＨＣＱの濃度が、０μｇ／ｍＬ
・ Ｈ０．０１９ ・・・ ＨＣＱの濃度が、０．０１９μｇ／ｍＬ
・ Ｈ０．０７８ ・・・ ＨＣＱの濃度が、０．０７８μｇ／ｍＬ
・ Ｈ０．３１２５ ・・・ ＨＣＱの濃度が、０．３１２５μｇ／ｍＬ
・ Ｈ１．２５ ・・・ ＨＣＱの濃度が、１．２５μｇ／ｍＬ
・ Ｈ５ ・・・ ＨＣＱの濃度が、５μｇ／ｍＬ
・ Ｈ２０ ・・・ ＨＣＱの濃度が、２０μｇ／ｍＬ
・ Ｈ８０ ・・・ ＨＣＱの濃度が、８０μｇ／ｍＬ
図３に示したように、５μｇ／ｍＬを超える濃度のＨＣＱは、細胞死を起こすことが確認された。
（試験例４）
３～４×１０５ｃｅｌｌｓのヒト培養ポドサイト（「Ｓａｋａｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２９８（３） Ｆ５５７－５６７， ２０１０」を参照）を、インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムを添加した１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地２０ｍＬで、Ｉ型コラーゲンをコートした１７５ｃｍ２フラスコにて、３３℃、ＣＯ２濃度５．０％で培養を開始し、フラスコ面の８０～９０％を細胞が覆う程度の細胞密度まで培養した。
その後、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地を吸引除去し、等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、数回フラスコを揺らし、ＰＢＳを吸引除去した後、３ｍＬの０．０２％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃、ＣＯ２濃度５．０％で１０分間培養した。次いで、７ｍＬの１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地を加えてトリプシンを失活させ、１０ｍＬの細胞浮遊液を作製した。この細胞浮遊液を１５℃、１，６００ｒｐｍで７分間遠心処理し、得られた細胞ペレットを適量の１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁し、１０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度の細胞浮遊液を作製した。
Ｉ型コラーゲンをコートした９６ウェルプレートに、１００μＬ／ウェルの量で前記細胞浮遊液を注入し、３７℃、ＣＯ２濃度５．０％で培養を開始した。
培養開始４８時間後に、バリシチニブ（ＢＡＲ）を、５０μＭ、１０μＭ、２μＭ、０．４μＭ、０．０８μＭ、０．０１６μＭ、０．００３２μＭの最終濃度になるように、各ウェルにＢＡＲを添加した。
ＢＡＲを添加した４８時間後に、ＨＣＱを２０μｇ／ｍＬの最終濃度となるように、一部のウェルに添加した。
ＨＣＱ添加後７日目に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（プロメガ社）を用いて生存細胞数を決定した。ルミネセンスは、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。
結果を図４に示す。図４の縦軸は相対蛍光単位（ＲＬＵ）を表し、横軸はＢＡＲ及びＨＣＱの濃度を表す。具体的には、横軸は下記のとおりである。
・ Ｈ２０－ＰＢＳ ・・・ ＨＣＱの濃度が２０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲのコントロールとしてＰＢＳを１μＬ／ｗｅｌｌ加えた（ＢＡＲは無し）。
・ Ｈ２０－Ｄｍ ・・・ ＨＣＱの濃度が２０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲのコントロールとしてＤＭＳＯを１μＬ／ｗｅｌｌ加えた（ＢＡＲは無し）。
・ Ｈ２０－Ｂ１０×５－５ ・・・ ＨＣＱの濃度が２０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲの濃度が０．００３２μＭ
・ Ｈ２０－Ｂ１０×５－４ ・・・ ＨＣＱの濃度が２０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲの濃度が０．０１６μＭ
・ Ｈ２０－Ｂ１０×５－３ ・・・ ＨＣＱの濃度が２０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲの濃度が０．０８μＭ
・ Ｈ２０－Ｂ１０×５－２ ・・・ ＨＣＱの濃度が２０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲの濃度が０．４μＭ
・ Ｈ２０－Ｂ１０×５－１ ・・・ ＨＣＱの濃度が２０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲの濃度が２μＭ
・ Ｈ２０－Ｂ１０×５０ ・・・ ＨＣＱの濃度が２０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲの濃度が１０μＭ
・ Ｈ２０－Ｂ１０×５１ ・・・ ＨＣＱの濃度が２０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲの濃度が５０μＭ
・ Ｈ０ ・・・ ＨＣＱのコントロールとしてＰＢＳを１μＬ／ｗｅｌｌ加えた（ＨＣＱは無し）。ＢＡＲのコントロールとしてＤＭＳＯを１μＬ／ｗｅｌｌ加えた（ＢＡＲは無し）。
図４に示したように、少なくとも２～５０μＭのＢＡＲにより、濃度依存的にＨＣＱによる細胞死が抑制された。また、より低濃度のＢＡＲでも、ＨＣＱによる細胞死が抑制される傾向が見られた。
（試験例５）
３～４×１０５ｃｅｌｌｓのマウス培養ポドサイト（「Ｋａｊｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ， ２９（３） １５３－１６３， ２００９」を参照）を、１０～２０Ｕ／ｍＬのマウスＩＦＮ－γを添加した１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地２０ｍＬで、Ｉ型コラーゲンをコートした１７５ｃｍ２フラスコにて、３３℃、ＣＯ２濃度５．０％で培養を開始し、フラスコ面の８０～９０％を細胞が覆う程度の細胞密度まで培養した。
その後、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地を吸引除去し、等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、数回フラスコを揺らし、ＰＢＳを吸引除去した後、３ｍＬの０．０２％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃、ＣＯ２濃度５．０％で１０分間培養した。次いで、７ｍＬの１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地を加えてトリプシンを失活させ、１０ｍＬの細胞浮遊液を作製した。この細胞浮遊液を１５℃、１，６００ｒｐｍで７分間遠心処理し、得られた細胞ペレットを適量の１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁し、１０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度の細胞浮遊液を作製した。
Ｉ型コラーゲンをコートした９６ウェルプレートに、１００μＬ／ウェルの量で前記細胞浮遊液を注入し、３７℃、ＣＯ２濃度５．０％で培養を開始した。
培養開始４８時間後に、バリシチニブ（ＢＡＲ）を、５０μＭ、１０μＭ、２μＭ、０．４μＭ、０．０８μＭ、０．０１６μＭ、０．００３２μＭの最終濃度になるように、各ウェルにＢＡＲを添加した。
ＢＡＲを添加した４８時間後に、ＨＣＱを１０μｇ／ｍＬの最終濃度となるように、一部のウェルに添加した。
ＨＣＱ添加後９日目に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（プロメガ社）を用いて生存細胞数を決定した。ルミネセンスは、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。
結果を図５に示す。図５の縦軸は相対蛍光単位（ＲＬＵ）を表し、横軸はＢＡＲ及びＨＣＱの濃度を表す。具体的には、横軸は下記のとおりである。
・ Ｈ１０－ＰＢＳ ・・・ ＨＣＱの濃度が１０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲのコントロールとしてＰＢＳを１μＬ／ｗｅｌｌ加えた（ＢＡＲは無し）。
・ Ｈ１０－Ｄｍ ・・・ ＨＣＱの濃度が１０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲのコントロールとしてＤＭＳＯを１μＬ／ｗｅｌｌ加えた（ＢＡＲは無し）。
・ Ｈ１０－Ｂ１０×５－５ ・・・ ＨＣＱの濃度が１０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲの濃度が０．００３２μＭ
・ Ｈ１０－Ｂ１０×５－４ ・・・ ＨＣＱの濃度が１０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲの濃度が０．０１６μＭ
・ Ｈ１０－Ｂ１０×５－３ ・・・ ＨＣＱの濃度が１０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲの濃度が０．０８μＭ
・ Ｈ１０－Ｂ１０×５－２ ・・・ ＨＣＱの濃度が１０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲの濃度が０．４μＭ
・ Ｈ１０－Ｂ１０×５－１ ・・・ ＨＣＱの濃度が１０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲの濃度が２μＭ
・ Ｈ１０－Ｂ１０×５０ ・・・ ＨＣＱの濃度が１０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲの濃度が１０μＭ
・ Ｈ１０－Ｂ１０×５１ ・・・ ＨＣＱの濃度が１０μｇ／ｍＬ、ＢＡＲの濃度が５０μＭ
・ Ｈ０ ・・・ ＨＣＱのコントロールとしてＰＢＳを１μＬ／ｗｅｌｌ加えた（ＨＣＱは無し）。ＢＡＲのコントロールとしてＤＭＳＯを１μＬ／ｗｅｌｌ加えた（ＢＡＲは無し）。
図５に示したように、少なくとも２～５０μＭのＢＡＲにより、濃度依存的にＨＣＱによる細胞死が抑制された。また、より低濃度のＢＡＲでも、ＨＣＱによる細胞死が抑制される傾向が見られた。
（試験例６）
ヒト網膜色素上皮細胞株ＡＲＰＥ－１９を、培地（１０％ＦＣＳ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）＋Ｌ－グルタミン＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）で、何もプレコートしていないフラスコにて、３３℃、ＣＯ２濃度５．０％で培養を開始し、フラスコ面の８０～９０％を細胞が覆う程度の細胞密度まで培養した。
その後、前記培地を吸引除去し、等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、数回フラスコを揺らし、ＰＢＳを吸引除去した後、３ｍＬの０．０２％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃、ＣＯ２濃度５．０％で７分間培養した。次いで、７ｍＬの培地（１０％ＦＣＳ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）＋Ｌ－グルタミン＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）を加えてトリプシンを失活させ、１０ｍＬの細胞浮遊液を作製した。この細胞浮遊液を１５℃、１，６００ｒｐｍで７分間遠心処理し、得られた細胞ペレットを適量の培地（１０％ＦＣＳ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）＋Ｌ－グルタミン＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）で再懸濁し、１２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度の細胞浮遊液を作製した。
ウェルの底面に何もコートしていない、通常の９６ウェルプレートに、１００μＬ／ウェルの量で前記細胞浮遊液を注入し、３７℃、ＣＯ２濃度５．０％で培養を開始した。
培養開始４８時間後に、ウパダシチニブ（ＵＰＡ）を、５０μＭ、１０μＭ、２μＭ、０．４μＭ、０．０８μＭ、０．０１６μＭ、０．００３２μＭの最終濃度になるように、各ウェルにＵＰＡを添加した。
ＵＰＡを添加した２４時間後に、ＨＣＱを８０μｇ／ｍＬの最終濃度となるように、一部のウェルに添加した。
ＨＣＱ添加後４日目に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（プロメガ社）を用いて生存細胞数を決定した。ルミネセンスは、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。
結果を図６に示す。図６の縦軸は相対蛍光単位（ＲＬＵ）を表し、横軸はＵＰＡ及びＨＣＱの濃度を表す。具体的には、横軸は下記のとおりである。
・ Ｈ８０－Ｄｍ ・・・ ＨＣＱの濃度が８０μｇ／ｍＬ、ＵＰＡのコントロールとしてＤＭＳＯを１μＬ／ｗｅｌｌ加えた（ＵＰＡは無し）。
・ Ｈ８０－Ｕｐ１０×５－５ ・・・ ＨＣＱの濃度が８０μｇ／ｍＬ、ＵＰＡの濃度が０．００３２μＭ
・ Ｈ８０－Ｕｐ１０×５－４ ・・・ ＨＣＱの濃度が８０μｇ／ｍＬ、ＵＰＡの濃度が０．０１６μＭ
・ Ｈ８０－Ｕｐ１０×５－３ ・・・ ＨＣＱの濃度が８０μｇ／ｍＬ、ＵＰＡの濃度が０．０８μＭ
・ Ｈ８０－Ｕｐ１０×５－２ ・・・ ＨＣＱの濃度が８０μｇ／ｍＬ、ＵＰＡの濃度が０．４μＭ
・ Ｈ８０－Ｕｐ１０×５－１ ・・・ ＨＣＱの濃度が８０μｇ／ｍＬ、ＵＰＡの濃度が２μＭ
・ Ｈ８０－Ｕｐ１０×５０ ・・・ ＨＣＱの濃度が８０μｇ／ｍＬ、ＵＰＡの濃度が１０μＭ
・ Ｈ８０－Ｕｐ１０×５１ ・・・ ＨＣＱの濃度が８０μｇ／ｍＬ、ＵＰＡの濃度が５０μＭ
・ Ｈ０ ・・・ ＨＣＱのコントロールとしてＰＢＳを１μＬ／ｗｅｌｌ加えた（ＨＣＱは無し）。ＵＰＡのコントロールとしてＤＭＳＯを１μＬ／ｗｅｌｌ加えた（ＵＰＡは無し）。
図６に示したように、０．０１６～１０μＭのＵＰＡにより、ＨＣＱによる細胞死が抑制された。
（試験例７）
マウス培養ポドサイト（「Ｋａｊｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ， ２９（３） １５３－１６３， ２００９」を参照）を、１０～２０Ｕ／ｍＬのマウスＩＦＮ－γを添加した１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地２０ｍＬで、Ｉ型コラーゲンをコートした１７５ｃｍ２フラスコにて、３３℃、ＣＯ２濃度５．０％で培養を開始し、フラスコ面の８０～９０％を細胞が覆う程度の細胞密度まで培養した。
その後、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地を吸引除去し、等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、数回フラスコを揺らし、ＰＢＳを吸引除去した後、３ｍＬの０．０２％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃、ＣＯ２濃度５．０％で１０分間培養した。次いで、７ｍＬの１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地を加えてトリプシンを失活させ、１０ｍＬの細胞浮遊液を作製した。この細胞浮遊液を１５℃、１，６００ｒｐｍで７分間遠心処理し、得られた細胞ペレットを適量の１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁し、１０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度の細胞浮遊液を作製した。
Ｉ型コラーゲンをコートした９６ウェルプレートに、１００μＬ／ウェルの量で前記細胞浮遊液を注入し、３７℃、ＣＯ２濃度５．０％で培養を開始した。
培養開始４８時間後に、最終濃度が１０μＭ、２．５μＭ、０．６２５μＭ、０．１５６μＭ、０．０３９μＭとなるように、ウェルにＢＡＲ又はＵＰＡを添加し、そのまま液替えなしで２８日間培養した。
ＢＡＲ又はＵＰＡを添加した２８日間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（プロメガ社）を用いて生存細胞数を決定した。ルミネセンスは、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。
結果を図７Ａ及び７Ｂに示す。図７ＡはＵＰＡを添加した場合の結果を示し、図７ＢはＢＡＲを添加した場合の結果を示す。図７Ａ及び７Ｂの縦軸は相対蛍光単位（ＲＬＵ）を表し、横軸はＵＰＡ又はＢＡＲの濃度を表す。具体的には、横軸は下記のとおりである。
・ ＰＢＳ＋Ｄｍ ・・・ ＰＢＳで希釈したＤＭＳＯのみ（ＵＰＡ又はＢＡＲは無し）
・ ０．０３９ ・・・ ＵＰＡ又はＢＡＲの濃度が０．０３９μＭ
・ ０．１５６ ・・・ ＵＰＡ又はＢＡＲの濃度が０．１５６μＭ
・ ０．６２５ ・・・ ＵＰＡ又はＢＡＲの濃度が０．６２５μＭ
・ ２．５ ・・・ ＵＰＡ又はＢＡＲの濃度が２．５μＭ
・ １０ ・・・ ＵＰＡ又はＢＡＲの濃度が１０μＭ
図７に示したように、長期培養の系では、次第に細胞死が起こるが、少なくとも２．５μＭのＵＰＡ、２．５～１０μＭのＢＡＲにより、長期培養による細胞死が抑制された。また、より低濃度のＵＰＡ、ＢＡＲでも、長期培養による細胞死が抑制される傾向が見られた。
ＨＣＱの網膜毒性はＨＣＱ平均血中濃度と正の相関が報告されており、血中濃度が０～７４１ｎｇ／ｍＬの群で１．２％と最小の網膜毒性出現率である一方、最近のメタアナリシスにより、臨床効果を得るための血中濃度として、７５０ｎｇ／ｍＬ以上の濃度が提唱されており、網膜毒性のリスクを念頭に置きつつ、一定の濃度でのＨＣＱの血中濃度維持がその効果発現には求められる。
上記したＪＡＫ阻害剤の細胞保護効果は、通常用量内服によって得られる最大血中濃度（１μＭ）よりもはるかに低い濃度（１６～４００ｎＭ）でもその傾向が認められており、ＪＡＫ阻害剤を必要最低限の用量で継続しつつＨＣＱを継続することで、ＨＣＱの毒性を最小限にしつつＨＣＱの臨床効果を得ることが可能になる。したがって、本発明によれば、ＨＣＱの副作用を回避することができ、ＨＣＱ内服中の症例の網膜症や腎障害の抑制につながる可能性がある。
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤を含み、
ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）による細胞死及び長期培養による細胞死のいずれかの細胞死を抑制することを特徴とする細胞死抑制剤である。
＜２＞ 前記細胞死が、ＨＣＱによる細胞死であり、前記細胞死抑制剤が、前記ＨＣＱを使用する前に用いられる前記＜１＞に記載の細胞死抑制剤である。
＜３＞ 前記ＪＡＫ阻害剤が、バリシチニブ、ウパダシチニブ、トファシチニブ、ペフィシチニブ、及びフィルゴチニブからなる群から選択される少なくとも１つである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の細胞死抑制剤である。
＜４＞ 個体に、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の細胞死抑制剤を投与することを特徴とする細胞死抑制方法である。
＜５＞ ＨＣＱが用いられる疾患に使用するための医薬であって、
ＪＡＫ阻害剤を含み、ＨＣＱによる細胞死を抑制する細胞死抑制剤を含有することを特徴とする医薬である。
＜６＞ 前記医薬が、前記ＨＣＱを使用する前に用いられる前記＜５＞に記載の医薬である。
＜７＞ 前記ＪＡＫ阻害剤が、バリシチニブ、ウパダシチニブ、トファシチニブ、ペフィシチニブ、及びフィルゴチニブからなる群から選択される少なくとも１つである前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の医薬である。
＜８＞ 個体に、前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の医薬を投与することを特徴とするＨＣＱが用いられる疾患の治療方法である。
＜９＞ インビトロにおける細胞死を抑制する方法であって、
ＪＡＫ阻害剤を細胞に添加することを含み、
前記細胞死が、ＨＣＱによる細胞死及び長期培養による細胞死のいずれかの細胞死であることを特徴とする方法である。
＜１０＞ 前記細胞死が、ＨＣＱによる細胞死であり、
前記ＪＡＫ阻害剤が、前記ＨＣＱを使用する前に用いられる前記＜９＞に記載の方法である。
＜１１＞ 前記ＪＡＫ阻害剤が、バリシチニブ、ウパダシチニブ、トファシチニブ、ペフィシチニブ、及びフィルゴチニブからなる群から選択される少なくとも１つである前記＜９＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。

Claims (9)

  1. ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤を含み、
    ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）による細胞死及び長期培養による細胞死のいずれかの細胞死を抑制することを特徴とする細胞死抑制剤。
  2. 前記細胞死が、ＨＣＱによる細胞死であり、
    前記細胞死抑制剤が、前記ＨＣＱを使用する前に用いられる請求項１に記載の細胞死抑制剤。
  3. 前記ＪＡＫ阻害剤が、バリシチニブ、ウパダシチニブ、トファシチニブ、ペフィシチニブ、及びフィルゴチニブからなる群から選択される少なくとも１つである請求項１から２のいずれかに記載の細胞死抑制剤。
  4. ＨＣＱが用いられる疾患に使用するための医薬であって、
    ＪＡＫ阻害剤を含み、ＨＣＱによる細胞死を抑制する細胞死抑制剤を含有することを特徴とする医薬。
  5. 前記医薬が、前記ＨＣＱを使用する前に用いられる請求項４に記載の医薬。
  6. 前記ＪＡＫ阻害剤が、バリシチニブ、ウパダシチニブ、トファシチニブ、ペフィシチニブ、及びフィルゴチニブからなる群から選択される少なくとも１つである請求項４から５のいずれかに記載の医薬。
  7. インビトロにおける細胞死を抑制する方法であって、
    ＪＡＫ阻害剤を細胞に添加することを含み、
    前記細胞死が、ＨＣＱによる細胞死及び長期培養による細胞死のいずれかの細胞死であることを特徴とする方法。
  8. 前記細胞死が、ＨＣＱによる細胞死であり、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、前記ＨＣＱを使用する前に用いられる請求項７に記載の方法。
  9. 前記ＪＡＫ阻害剤が、バリシチニブ、ウパダシチニブ、トファシチニブ、ペフィシチニブ、及びフィルゴチニブからなる群から選択される少なくとも１つである請求項７から８のいずれかに記載の方法。
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