JP2023134312A - 生体中や環境あるいは食品中に存在する微小物質の濃縮法 - Google Patents

Abstract

【課題】濃縮すべき微小物質（特にウイルス）以外の夾雑物を多く含む試料から、目的とする微小物質を簡便、迅速、かつ、効率よく濃縮できるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法を提供する。【解決手段】ＰＥＧ溶液に、塩基物質、キレート剤、還元剤、及び／又はタンパク質成分を添加することによって、大容量の種々の試料から微量な微小物質（特にウイルス）を高回収率で回収できる。回収された微小物質は、Ｄｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲでの検出に十分耐えうる純度を有している。【選択図】なし

Description

本発明は、生体中や環境あるいは食品中に存在する微小物質、特に、公衆衛生・医療検査分野さらには公共安全性や食品安全性を確保するための一般検査分野などにおけるウイルス（特に病原性ウイルス）を濃縮して検出するのに好適な濃縮方法ならびにそれに使用する試薬に関するものである。

研究や検査の対象となる生体中や環境あるいは食品中の微小物質としては、まずはウイルス（特に動植物に害をもたらす病原性ウイルス）が挙げられる。それに加えて、生体内の細胞や培養細胞由来のエクソームを含む細胞外小胞体（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＥＶｓ）や細胞やＥＶｓの構成物であるプラスミド、核酸（ＤＮＡ ａｎｄ／ｏｒ ＲＮＡ）やタンパク質も、研究や検査の対象となっており、一部では治療への応用も試みられている。

その内、医療検査分野におけるウイルス検査においては、近年世界中で大流行したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２や毎年のように多数の感染者を発生させるインフルエンザウイルス、世界中に蔓延しているヒト免疫不全ウイルス、さらには、高病原性インフルエンザウイルスやエボラウイルスなど警戒が必要なウイルスが多種多様存在している。さらには今後大規模な感染の危険性が指摘されているウイルスも数多く、日々の観測や警戒が必要になっている。

他方、食品安全性分野においては、ノロウイルスやサポウイルを筆頭に、ロタウイルス、アデノウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、Ａ型肝炎ウイルスなど、ヒトに下痢症を起こすウイルスなどが食品安全性上、特に監視が必要なウイルスとして挙げられる。

さらに、近年、混合試料や大容量の環境水などに存在する微量ウイルスを検知することで、流行地域からの高病原性ウイルス流入の早期発見や流行期が過ぎた後の再流行のモニタリングなどに生かすことの有用性が強調されるに至り、大容量の試料から高感度にモニタリング対象ウイルス（遺伝子）を検出できるシステムの開発が急務になってきている。

これらの生体中や環境あるいは食品中の微小物質の濃縮、精製には、超遠心法やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法が多用されているが、両法とも濃縮・精製には煩雑な操作が必要で操作時間も長い。さらに両法とも、大量調製には不向きな上、回収率や夾雑物の除去率においても問題を孕んでいる。

そこで、我々は、ＰＥＧにグリコーゲンなどの多糖類を最適濃度で添加し、さらには添加する塩濃度を最適化するなどで、水溶液に懸濁したウイルスを簡便・迅速かつ安定的、高回収率で回収できることを発明（以下、「改良ＰＥＧ沈殿法」という）し、特許出願を行った（特許文献１：特開２０２０－００５６３２号）

ところで、回収した濃縮物における検査対象がＲＮＡやＤＮＡなどの核酸である場合には、核酸を増幅して検出する方法が主流ではあるが、最近は、非増幅核酸検出法も開発され始めている。

他方、検査対象がタンパク質などの核酸以外の構成物である場合には、現在は汎用性の高い抗原抗体法で検出するのが主流ではあるが、質量分析法や電子顕微鏡などでの検出も試みられている。

核酸を増幅して検出する主な方法としては、検出対象がＤＮＡの場合は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法やＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの標的とするＤＮＡ領域を増幅して検出する方法が挙げられる。また、検出対象がＲＮＡの場合は、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅで標的とするＲＮＡをＤＮＡ（ｃＤＮＡ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）に転換してから上記のＤＮＡ増幅法で増幅して検出する方法や、ＲＮＡを鋳型として増幅して検出するＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などが挙げられる。

増幅した核酸を検出する場合は、以前は増幅した核酸を一旦取り出してから電気泳動などで検出する方法が多用されていたが、本法は操作が煩雑な上に、操作中に増幅産物の拡散によるコンタミネーションが生じる危険性も高かった。

しかしながら、蛍光標識したプローブやＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなどのインターカレーションダイを用いたＭｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ（融解曲線）でリアルタイムに目的産物を検出するｒｅａｌ ｔｉｍｅ（ＲＴ）－ＰＣＲ法やｒｅａｌ ｔｉｍｅ（ＲＴ）－ＬＡＭＰ法が開発されたことで、簡便・迅速、高感度、かつコンタミネーションの危険性も少なく、検出対象の核酸を増幅して検出することが可能となった。

それでも、通常の核酸増幅法では、試料中に共存する夾雑物由来の反応阻害を避けるために、逆転写酵素によるｃＤＮＡへの変換や核酸増幅の前に試料から核酸を抽出・精製する工程が必要となり、遺伝子増幅法の利便性を大いに損なっていた。

そこで、本件発明者は夾雑物を中和する成分を独自に見出し、それを反応液に添加することで、試料から核酸を抽出精製することなしに、直接増幅して検出する方法（Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ法）を見出した（特許文献２：特許３４１６９８１号、特許文献３：特許４７３５６４５号）。その後、本技術は、検便中の食中毒菌検出キットやノロウイルス検出キット、咽頭拭い液や唾液中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キットなどの各種検出キットに利用されている。

しかしながら、Ｄｉｒｅｃｔ（ＲＴ－）ＰＣＲ法では、試料を反応液に直接添加できるが、試料の投入可能量に限界があり、数μＬレベル以上を添加することが難しかった。さらにウイルスから核酸を抽出精製してから増幅する方法においても、核酸の回収に必要な液量や抽出精製後にも残存する試料由来の反応阻害物資などを考慮すると、添加可能な試料の量には限度があった。

そこで、今回、我々は、上記で示した改良ＰＥＧ沈殿法で生体試料（唾液や咽頭拭い液などの体液、糞便などの排出物）に存在する微量のウイルスを濃縮して、Ｄｉｒｅｃｔ（ＲＴ－）ＰＣＲ法で検出する方法の検討を開始した。

まずは、改良ＰＥＧ沈殿法を使用して唾液に添加した疑似コロナウイルス（ＮＡＴｔｒｏｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２：ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ）の検出を試みたが、蒸留水や緩衝液、環境からの拭取り液を対象とした場合に形成される遠心後の沈渣が形成されず、それに伴い、回収液からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲによる反応産物の大幅な減少が認められた。

従って、改良ＰＥＧ沈殿法においても、生体試料などの核酸以外の夾雑物を多量に含有している試料に対しては改善を加える必要がある。

特開２０２０－００５６３２号 特許３４１６９８１号 特許４７３５６４５号

生体中や環境あるいは食品中の微小物質の濃縮、精製には、超遠心法やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法が多用されているが、両法とも濃縮・精製には煩雑な操作が必要で操作時間も長い。さらに両法とも、大量調製には不向きな上、回収率や夾雑物の除去率においても問題を孕んでいる。

そこで、我々は、ＰＥＧにグリコーゲンなどの多糖類を最適濃度で添加し、さらには添加する塩濃度を最適化するなどで、水溶液に懸濁したウイルスを簡便・迅速かつ高回収率で安定的に回収できることを見出し、前述のとおり特許出願を行なっている（改良ＰＥＧ沈殿法）。

しかしながら、擬似コロナウイルスを添加した唾液などの生体試料を検体として使用した場合においては、改良ＰＥＧ沈殿法においても、ＰＥＧ沈渣からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲ法での蛍光プローブ検出において、不検出もしくはＴｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ）の大幅な遅れが認められたところから、ウイルス回収率や夾雑物除去率などの大幅低下が疑われた。

そこで、水溶液のみならず、濃縮すべき微小物質（特にウイルス）以外の夾雑物を多く含む生体試料などから微小物質を簡便、迅速、かつ効率よく濃縮できるＰＥＧ沈殿法の開発が必要となった。

さらに、近年、流行地域からの高病原性ウイルス流入の早期発見や流行期が過ぎた後の再流行のモニタリングの必要性が強調されるに至り、大容量の試料からもウイルスなどの微小物質を効率的に濃縮できるシステムの開発が急務になってきている。

しかしながら、Ｄｉｒｅｃｔ（ＲＴ－）ＰＣＲ法では、試料を反応液に直接添加できるが、試料の投入可能量に限界があり、数μＬレベル以上を添加することが難しかった。さらにウイルスから核酸を抽出精製してから増幅する方法においても、核酸の回収にはある程度の溶解液が必要となる。さらには、生体試料には多種、多様かつ多量の酵素反応阻害の要因となる夾雑物が存在するので、核酸の抽出精製でも除ききれなかった残渣物の影響を考慮すると、添加可能な試料量にもおのずと限度があった。

ＰＥＧ沈殿に有効な成分や条件をさらに付加することで、濃縮すべき微小物質（特にウイルス）以外の夾雑物を多く含む試料からも目的とする微小物質を簡便、迅速、かつ効率よく濃縮できるＰＥＧ沈殿法の開発を行う。特に特開２０２０－００５６３２号に記載した水溶液に懸濁したウイルスを簡便・迅速かつ高回収率で安定的に回収できる改良ＰＥＧ沈殿法をベースに検討することにした。

次に、生体試料からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを可能にした特許文献３（特許４７３５６４５号）に記載した検体前処理試薬成分が、夾雑物の不活化などに有効ではないかとの推論を元に改良ＰＥＧ沈殿法との掛け合わせでの検討を行った。

まずは、疑似コロナウイルスを添加した唾液検体に水酸化ナトリウムを加えて、塩基性化した後に改良ＰＥＧ沈殿法を行ったところ、終濃度で３８．２～３．８３ｍＭの水酸化ナトリウムを添加したＰＥＧ沈殿においては沈渣が認められたが、水酸化ナトリウム１．２１ｍＭ添加群や無添加群では沈渣は認められなかった。しかしながら、Ｄｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲにおいて、水酸化ナトリウムの１２．１および３．８３ｍＭ添加群では、ターゲットであるウイルスのみならず内部コントロール特異的なＰＣＲ産物も得られなかった。

上記の現象は、目的とする疑似ウイルスと共に、多くの夾雑物も共沈した結果ではないかとの推論の元、疑似コロナウイルスを添加した唾液検体に水酸化ナトリウムとともにキレート剤としてＥｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ（ＥＧＴＡ）を添加して改良ＰＥＧ沈殿を行った。結果、水酸化ナトリウム存在下、終濃度で１０．０ｍＭのＥＧＴＡを加えたＰＥＧ沈殿においては沈渣が認められなかったが、３．２７～０．１００ｍＭでは認められた。加えて、得られたＰＥＧ沈殿物からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲの結果、ＰＥＧ沈殿において水酸化ナトリウム存在下終濃度で１．００～０．１００ｍＭのＥＧＴＡを加えた群での反応産物の大幅な増加がターゲット特異的ＰＣＲ産物検出時のＣｔ値とＥｎｄ ＲＦＵ値から確認できた。また、キレート剤としてＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）を使用した場合にもＥＧＴＡ使用時と同様の結果が得られた。

次に、疑似コロナウイルスを添加した唾液検体に水酸化ナトリウム、ＥＧＴＡとともに還元剤としてＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）を添加して改良ＰＥＧ沈殿を行った。得られたＰＥＧ沈殿物からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲの結果、ＤＴＴを終濃度で０．００５－０．５ｍＭ添加した群では、未添加群に比べてターゲット特異的ＰＣＲ産物検出時のＥｎｄ ＲＦＵ値の増大が認められた。

ところが、疑似コロナウイルスを添加した蒸留水に、水酸化ナトリウムとＥＧＴＡを添加して改良ＰＥＧ沈殿法を実施したところ、得られたＰＥＧ沈殿物からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲでターゲット特異的ＰＣＲ産物が検出されなくなった。そこで、上記の改良ＰＥＧ沈殿法にタンパク質成分としてＢｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を添加したところ、Ｄｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲにおいてターゲット特異的ＰＣＲ産物が検出されるようになり、その効果は終濃度で０．１６７～０．０１６７％を添加した時に最も顕著であった。

４０コピーの疑似コロナウイルスを添加した大容量唾液検体（５０人分の混合検体２５０μＬ）に１２．１ｍＭの水酸化ナトリウム、１．００ｍＭのＥＧＴＡおよび０．１６７％のＢＳＡを添加したもの（ＰＥＧ液を加えた後の終濃度として）に１６％ＰＥＧ６，０００溶液にグリコーゲンと塩化ナトリウムを添加したＰＥＧ溶液を等量混和し、ＰＥＧ沈殿法を施行した。得られたＰＥＧ沈殿物からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行ったところ、混合唾液を試料として用いた場合においてもＢＳＡによるＲＴ－ＰＣＲの増強効果が認められた。

添加する大容量検体を咽頭拭い液や１０％糞便懸濁上清に代えて行って実施した場合にも、上記と同様に、Ｄｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲによって、２５０μＬ検体中の４０コピーの疑似コロナウイルスの検出が可能であった。

検出対象をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者由来のウイルスに代えて、大容量唾液検体（５０人分の混合検体２５０μＬ）に添加して［００３２］と同様の検討を行ったところ、実検体由来の１０コピー相当の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の検出が可能であった。

検出対象をノロウイルス感染者由来のウイルスに代えて、大容量唾液検体（５０人分の混合検体２５０μｌ）に添加して［００３４］と同様の検討を行ったところ、検出対象をノンエンベロープウイルスであるノロウイルスに代えても、１００コピー相当のノロウイルスＧＩおよびＧＩＩの検出が可能であった。

纏めると、今回発明した４要素（塩基物質、キレート剤、還元剤、タンパク質成分）、特に塩基物質、キレート剤は、ＰＥＧ沈殿法の適用範囲や性能を大きく向上させることができる物質である。今回発明した要素は、特に濃縮対象とする微小物質以外の夾雑物を多く含む、大容量の試料からの濃縮に特に有用である。
すなわち、本発明は、水溶液中の微小物質をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法で濃縮する際に、塩基物質及びキレート剤を個別もしくは混合状態で添加した後、遠心操作で微小物質を濃縮することを特徴とするＰＥＧ沈殿法である。さらには、還元剤もしくはタンパク質成分を添加してもよい。
また、本発明は、濃縮した検体を核酸の精製なしに反応液に添加して、微小物質中の核酸を増幅して検出することを特徴とするウイルス検出方法である。

微小物質としては、まずは、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスさらにはレトロウイルスが挙げられる。さらには、生体内の細胞や培養細胞由来のエクソームを含む細胞外小胞体（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＥＶｓ）や細胞やＥＶｓの構成物であるプラスミド、核酸（ＤＮＡ ａｎｄ／ｏｒ ＲＮＡ）やタンパク質も対象として挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

ＰＥＧ沈殿法での濃縮対象となる水溶液は、蒸留水、生理食塩水、緩衝液、生体試料、環境もしくは食品由来の溶液やそれら由来の乾燥物の再溶解液などが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。

材料となる生体材料としては、血液、リンパ液、髄液などの体液、汗や唾液などの分泌液、喉、鼻、口などからの拭い液や喀痰、尿、糞便などの排泄物やそれらをＰＢＳ（－）や生理食塩液などの各種緩衝液あるいは蒸留水などで希釈したものが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。

ＰＥＧ沈殿法で濃縮したものを検出する方法としては、検出対象が核酸である場合には、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法などの標的とするＤＮＡ領域を増幅して検出する方法、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅで標的とするＲＮＡをＤＮＡに転換してから上記のＤＮＡ増幅法で増幅して検出する方法、ＲＮＡを鋳型として増幅して検出するＴＭＡ法などが挙げられるがこれらに限定されるわけではない

検出対象がタンパク質などの核酸以外の構成物である場合には、抗原抗体法や質量分析法、電子顕微鏡などの高い分解能を有する顕微鏡を使用する方法などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

今回発明した４要素の内、塩基物質とは、アルカリ金属やアルカリ土類金属などの水酸化物、あるいはアンモニア、アミンなど水溶液のｐＨが７．０より大きく塩基性を示す物質の総称である。代表的なものとして、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、アンモニア、水酸化銅、水酸化鉄などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。水酸化ナトリウムの場合、終濃度で１．２１～３８．２ｍＭ、好ましくは３．８３～１２．１ｍＭを添加する。

また、キレート剤とは、金属イオンと錯体を形成し活性を低下させる物質であり、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＧＬＤＡ、ＨＥＤＴＡ、ＧＥＤＴＡ、ＴＴＨＡ、ＨＩＤＡ、ＤＨＥＧなどたくさんの種類のものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。上記のうち、アミノカルボン酸系キレート剤、すなわち、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡもしくはその塩の単独もしくはこれらの混合物が好ましい。アミノカルボン酸系キレート剤は、終濃度で０．１００～３．２７ｍＭ、好ましくは０．３１７～１．００ｍＭを添加する。

さらに、還元剤としては、ＤＴＴ、ＢＭＥ、ＴＣＥＰ、２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌなどのタンパク質ジスルフィド用還元剤が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。還元剤がＤＴＴである場合、終濃度で５ｍＭ以下、好ましくは０．００５～０．５ｍＭを添加する。

また、タンパク質成分としてはＢＳＡを使用したが、世の中には多種多様のタンパク質が存在し、特にどれかに限定されるわけではない。濃縮用の液に添加するＢＳＡは、終濃度で０．００１６７～１．６７％、好ましくは０．０１６７～０．１６７％である。

上記４要素の内、塩基物質とキレート剤が少なくとも含まれていればよいが、３要素若しくは４要素全てを組合せてもよい。これらは、個別もしくは混合状態で、検体やＰＥＧ液に予め添加しておくことも、使用時に別途添加することも可能であり、添加する要素や順序などが限定されるわけではない。

上記４要素と組み合わせるＰＥＧ溶液はＰＥＧにグリコーゲンなどの多糖類を最適濃度で添加し、さらには添加する塩濃度を最適化するなどした改良ＰＥＧ液が最適であるが、これらに拘らない。

実施例においては、各種試料中に存在するウイルスの濃縮を例示したが、ＰＥＧ沈殿法が各種試料に存在する多種多様の微小物質の濃縮に広く使用されていることから、本発明が試料中に存在するウイルス以外の微小物質の濃縮にも応用できることは十分に予測可能な範囲である。よって、本発明の応用範囲はウイルスに限定される必要はない。例えば、生体内の細胞や培養細胞由来のＥＶｓ、細胞やＥＶｓの構成物であるプラスミド、核酸（ＤＮＡ ａｎｄ／ｏｒ ＲＮＡ）やタンパク質などが近年研究や検査の対象として注目を集めており、一部では治療への応用も試みられているところから、これらを目的とした濃縮に際しても有効な手段を提供しうる。

また、実施例では、２５０μＬの各種試料中に存在するウイルスの濃縮を例示したが、さらに多量の試料の持ち込みも可能である。その際には、濃縮対象である微小物質に伴って持ち込まれる酵素反応などを阻害する物質の量も増大するが、その場合は、陰電荷膜吸着法、限外ろ過膜法、ｓｏｌｉｄ沈殿法などの他の濃縮法との併用やＰＥＧ２段階濃縮法、各種核酸抽出精製法などとの組み合わせも有効となる。これらは、海、湖、池、河川、上水、下水など環境水中に微量に存在するウイルスなどを検査対象とする場合に特に有用となる。

生体材料（血液、リンパ液、髄液などの体液、汗や唾液などの分泌液、喉、鼻、口などからの拭い液、喀痰、尿、糞便などの排泄物）やその希釈液、培養細胞やその培養液、環境や食品などの種々サンプル中に存在する微小物質［ウイルス、プラスミド、細胞外小胞体（ＥＶｓ）、さらにはそれらを構成する核酸（ＤＮＡ ａｎｄ／ｏｒ ＲＮＡ）やタンパク質など］を濃縮する際に使用されるＰＥＧ沈殿法をさらに有用にするための添加物として、塩基物質、キレート剤、還元剤、タンパク質成分を見出した。

ＰＥＧ沈殿を行う際にこれら４成分のうち、少なくとも塩基物質とキレート剤を混合もしくは単独で添加することで、ＰＥＧ沈殿法がより有効なものになりうる。特に、ＰＥＧ溶液にグリコーゲンなどの多糖類を最適濃度で添加し、さらには添加する塩濃度を最適化するなどした改良ＰＥＧ液と組み合わせることで、種々の大容量サンプルから効率的に目的とする微小物質を濃縮することが可能となった。

本方法で濃縮した微小物質中の核酸を（ＲＴ）－ＰＣＲ法などで増幅・検出することで、微量な核酸を簡便・迅速かつ高感度に増幅して検出することが可能となる。従って、コロナウイルス、インフルエンザウイルスやノロウイルスのような感染力が強く、人から人、もしくは人から環境を介して人へと、容易に人に感染し重篤な症状をもたらすウイルスを今回発明した方法で検出もしくはモニタリングすることで、公衆衛生の向上に寄与することができる。

今回発明した方法は、３桁マイクロリッターレベル量の試料からの濃縮に耐えうることから、混合検体からの微量核酸の検出やスクリーニングも可能となる。このことは、流行地域からの高病原性ウイルス流入の早期発見や流行期が過ぎた後の再流行のモニタリングなどに最適なシステムとなる。加えて、陰電荷膜吸着法、限外ろ過膜法、ｓｏｌｉｄ沈殿法などの他の濃縮法との併用やＰＥＧ２段階濃縮法、各種核酸抽出精製法などとの組み合わせにより、リッター単位の極めて大容量の試料からの濃縮も可能となるであろうことから、環境（特に環境水）中に存在する微量ウイルスの検出もしくはモニタリングなどにより、広域での公衆衛生の向上に寄与することも十分に可能である。

それに加えて、生体内の細胞や培養細胞由来のＥＶｓ、細胞やＥＶｓの構成物であるプラスミド、核酸（ＤＮＡ ａｎｄ／ｏｒ ＲＮＡ）やタンパク質などが近年研究や検査の対象として注目を集めており、一部では治療への応用も試みられているところから、これらを目的とした濃縮に際しても有効な手段を提供しうる。

生体試料中に添加した疑似コロナウイルス（ＮＡＴｔｒｏｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２：ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ）のＰＥＧ沈殿法での濃縮時における塩基物質添加の影響を検討した。即ち、７５０μＬの蒸留水もしくは５０人分の混合唾液（２５０μＬ）と蒸留水（５００μＬ）の混和物に４０コピーの擬似コロナウイルスを混入したものに、水酸化ナトリウムを３８．２～１．２１ｍＭ添加したもの（ＰＥＧ液を加えた後の終濃度として）をＰＥＧ沈殿用の材料とした。そこに、１６％ ＰＥＧ ６，０００溶液にグリコーゲンと塩化ナトリウムを添加したＰＥＧ溶液を等量添加し、室温で１０分間放置した後、０℃に設定した遠心機で２０，０００Ｇ １０分間の遠心を施した。遠心上清を吸引廃棄後、沈渣に自製の検体処理液を添加して、９０℃，５分間処理した。熱処理したサンプルに、逆転写酵素・ＰＣＲ酵素、ｄＮＴＰｓ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用プライマーと３’端を蛍光で標識したプローブおよび内部コントロール（ＩＣ）検出用のプライマー／プローブなどを添加した自製ＲＴ－ＰＣＲ反応液を加えて、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ（Ｄｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲ）を行った。結果は、濃縮後の沈渣形成の有無、濃縮液に添加したのと同量のウイルスを直接検体処理液に添加してＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った際の標識プローブ由来の蛍光立上りｃｙｃｌｅ値（Ｃｔ値）と４５ｃｙｃｌｅｓ ＰＣＲ後のＥｎｄ ＲＦＵ値との比較で評価した。結果を表１に示しているが、各群２重で行った結果の平均値をもとに算出している。結果、終濃度で３８．２～３．８３ｍＭの水酸化ナトリウムを添加したＰＥＧ沈殿においては沈渣が認められたが、水酸化ナトリウム１．２１ｍＭ添加群や無添加群では認められなかった。しかしながら、Ｄｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲにおいて、沈渣が認められた群からのターゲット特異的なＰＣＲ産物は認められず、かつ１２．１および３．８３ｍＭ添加群では、ターゲットのみならず内部コントロール特異的なＰＣＲ産物も得られなかった。本結果から、１２．１および３．８３ｍＭ添加群では、ターゲットであるウイルスのみならず共存する検体由来のＲＴ－ＰＣＲ阻害物質も濃縮してしまった結果と推測した。

生体試料中に添加した疑似コロナウイルスのＰＥＧ沈殿法での濃縮時におけるキレート剤添加の影響を検討した。即ち、７５０μＬの蒸留水もしくは５０人分の混合唾液（２５０μＬ）と蒸留水（５００μＬ）の混和物に４０コピーの擬似コロナウイルスを混入したものに、水酸化ナトリウムを１２．１ｍＭとＥＧＴＡを１０．０～０．１００ｍＭ添加したもの（ＰＥＧ液を加えた後の終濃度として）をＰＥＧ沈殿用の材料とした。そこに、１６％ ＰＥＧ ６，０００溶液にグリコーゲンと塩化ナトリウムを添加したＰＥＧ溶液を等量添加し、室温で１０分間放置した後、０℃に設定した遠心機で２０，０００Ｇ１０分間の遠心を施した。遠心上清を吸引廃棄後、沈渣に自製の検体処理液を添加して、９０℃，５分間処理した。熱処理したサンプルに、実施例１で使用した自製ＲＴ－ＰＣＲ反応液を加えて、Ｄｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った。結果は、濃縮後の沈渣形成の有無、濃縮液に添加したのと同量のウイルスを直接検体処理液に添加してＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った際の標識プローブ由来の蛍光立上りｃｙｃｌｅ値（Ｃｔ値）と４５ｃｙｃｌｅｓ ＰＣＲ後のＥｎｄ ＲＦＵ値との比較で評価した。結果を表２に示しているが、各群２重で行った結果の平均値をもとに算出している。結果、水酸化ナトリウム添加下において終濃度で１０．０ｍＭのＥＧＴＡを加えたＰＥＧ沈殿においては沈渣が認めらなかったが、３．２７～０．１００ｍＭでは認められた。加えて、得られたＰＥＧ沈殿物からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲの結果、ＰＥＧ沈殿において水酸化ナトリウム添加下において終濃度で１．００～０．１００ｍＭのＥＧＴＡを加えた群からのターゲット特異的産物検出時のＣｔ値とＥｎｄ ＲＦＵ値から増幅産物の増加が確認できた。

生体試料中に添加した疑似コロナウイルスのＰＥＧ沈殿法での濃縮時におけるＥＧＴＡ以外のキレート剤添加の影響を検討した。即ち、７５０μＬの蒸留水もしくは５０人分の混合唾液（２５０μＬ）と蒸留水（５００μＬ）の混和物に４０コピーの擬似コロナウイルスを混入したものに、水酸化ナトリウムを１２．１ｍＭとＥＤＴＡを１０．０～０．１００ｍＭ添加したもの（ＰＥＧ液を加えた後の終濃度として）をＰＥＧ沈殿用の材料とした。そこに、１６％ ＰＥＧ ６，０００溶液にグリコーゲンと塩化ナトリウムを添加したＰＥＧ溶液を等量添加し、室温で１０分間放置した後、０℃に設定した遠心機で２０，０００Ｇ １０分間の遠心を施した。遠心上清を吸引廃棄後、沈渣に自製の検体処理液を添加して、９０℃，５分間処理した。熱処理したサンプルに、実施例１で使用した自製ＲＴ－ＰＣＲ反応液を加えて、Ｄｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った。結果は、濃縮後の沈渣形成の有無、濃縮液に添加したのと同量のウイルスを直接検体処理液に添加してＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った際の標識プローブ由来の蛍光立上りｃｙｃｌｅ値（Ｃｔ値）と４５ｃｙｃｌｅｓ ＰＣＲ後のＥｎｄ ＲＦＵ値との比較で評価した。結果を表３に示しているが、各群２重で行った結果の平均値をもとに算出している。結果、水酸化ナトリウム添加下において終濃度で１．００ｍＭのＥＤＴＡを加えたＰＥＧ沈殿においては沈渣が認められ、得られたＰＥＧ沈殿物からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲのターゲット特異産物検出時のＣｔ値とＥｎｄ ＲＦＵ値から増幅産物の増加も確認できた。

生体試料中に添加した疑似コロナウイルスのＰＥＧ沈殿法での濃縮時における還元剤添加の影響を検討した。即ち、７５０μＬの蒸留水もしくは５０人分の混合唾液（２５０μＬ）と蒸留水（５００μＬ）の混和物に４０コピーの擬似コロナウイルスを混入したものに、１２．１ｍＭの水酸化ナトリウムと１．００ｍＭのＥＧＴＡおよび５．００～０．００５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加したもの（ＰＥＧ液を加えた後の終濃度として）をＰＥＧ沈殿用の材料とした。そこに、１６％ ＰＥＧ ６，０００溶液にグリコーゲンと塩化ナトリウムを添加したＰＥＧ溶液を等量添加し、室温で１０分間放置した後、０℃に設定した遠心機で２０，０００Ｇ １０分間の遠心を施した。遠心上清を吸引廃棄後、沈渣に自製の検体処理液を添加して、９０℃，５分間処理した。熱処理したサンプルに、実施例１で使用した自製ＲＴ－ＰＣＲ反応液を加えて、Ｄｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った。結果は、濃縮後の沈渣形成の有無、濃縮液に添加したのと同量のウイルスを直接検体処理液に添加してＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った際の標識プローブ由来の蛍光立上りｃｙｃｌｅ値（Ｃｔ値）と４５ｃｙｃｌｅｓ ＰＣＲ後のＥｎｄ ＲＦＵ値との比較で評価した。結果を表４に示しているが、各群２重で行った結果の平均値をもとに算出している。結果、得られたＰＥＧ沈殿物からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲの結果、ＰＥＧ沈殿における水酸化ナトリウムとＥＧＴＡ共存下においてＤＴＴを終濃度で０．５００～０．００５ｍＭ添加した群では、未添加群に比べてターゲット特異産物検出時のＥｎｄ ＲＦＵ値の増大が認められた。

蒸留水中に添加した疑似コロナウイルスのＰＥＧ沈殿法での濃縮時における各種添加剤の影響を検討した。即ち、７５０μＬの蒸留水に４０コピーの擬似コロナウイルスを混入したものに、１２．１ｍＭの水酸化ナトリウム、１．００ｍＭのＥＧＴＡおよび１．６７～０．００１６７％のＢＳＡを添加したもの（ＰＥＧ液を加えた後の終濃度として）をＰＥＧ沈殿用の材料とした。そこに、１６％ ＰＥＧ ６，０００溶液にグリコーゲンと塩化ナトリウムを添加したＰＥＧ溶液を等量添加し、室温で１０分間放置した後、０℃に設定した遠心機で２０，０００Ｇ １０分間の遠心を施した。遠心上清を吸引廃棄後、沈渣に自製の検体処理液を添加して、９０℃，５分間処理した。熱処理したサンプルに、実施例１で使用した自製ＲＴ－ＰＣＲ反応液を加えて、Ｄｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った。結果は、濃縮後の沈渣形成の有無、濃縮液に添加したのと同量のウイルスを直接検体処理液に添加してＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った際の標識プローブ由来の蛍光立上りｃｙｃｌｅ値（Ｃｔ値）と４５ｃｙｃｌｅｓ ＰＣＲ後のＥｎｄ ＲＦＵ値との比較で評価した。結果を表５に示しているが、各群２重で行った結果の平均値をもとに算出している。結果、得られたＰＥＧ沈殿物からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲの結果、蒸留水を試料として用いた場合、ＰＥＧ沈殿における水酸化ナトリウム、ＥＧＴＡのみの添加ではＲＴ－ＰＣＲ産物の産生は認められなかったが、ＢＳＡを共存させることで産生が認められ、特に終濃度で０．１６７～０．０１６７％の添加で効果が顕著であった。

混合唾液中に添加した疑似コロナウイルスのＰＥＧ沈殿法での濃縮時における各種添加剤の影響を検討した。即ち、７５０μＬの蒸留水もしくは５０人分の混合唾液（２５０μＬ）と蒸留水（５００μＬ）の混和物に４０コピーの擬似コロナウイルスを混入したものに、１２．１ｍＭの水酸化ナトリウム、１．００ｍＭのＥＧＴＡおよび０．１６７％のＢＳＡを添加したもの（ＰＥＧ液を加えた後の終濃度として）をＰＥＧ沈殿用の材料とした。そこに、１６％ ＰＥＧ ６，０００溶液にグリコーゲンと塩化ナトリウムを添加したＰＥＧ溶液を等量添加し、室温で１０分間放置した後、０℃に設定した遠心機で２０，０００Ｇ １０分間の遠心を施した。遠心上清を吸引廃棄後、沈渣に自製の検体処理液を添加して、９０℃，５分間処理した。熱処理したサンプルに、実施例１で使用した自製ＲＴ－ＰＣＲ反応液を加えて、Ｄｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った。結果は、濃縮後の沈渣形成の有無、濃縮液に添加したのと同量のウイルスを直接検体処理液に添加してＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った際の標識プローブ由来の蛍光立上りｃｙｃｌｅ値（Ｃｔ値）と４５ｃｙｃｌｅｓ ＰＣＲ後のＥｎｄ ＲＦＵ値との比較で評価した。結果を表６に示しているが、各群２重で行った結果の平均値をもとに算出している。得られたＰＥＧ沈殿物からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲの結果、唾液を試料として用いた場合でもＰＥＧ沈殿における水酸化ナトリウム、ＥＧＴＡ共存下におけるＢＳＡ添加の効果がＥｎｄ ＲＦＵ値の値から見てとれた。

咽頭拭い液および糞便検体中に添加した疑似コロナウイルスのＰＥＧ沈殿法での濃縮時における各種添加剤の影響を検討した。即ち、７５０μＬの蒸留水もしくは咽頭拭い液もしくは１０％糞便懸濁の遠心上清液（２５０μＬ）と蒸留水（５００μＬ）の混和物に４０コピーの擬似コロナウイルスを混入したものに、１２．１ｍＭの水酸化ナトリウム、１．００ｍＭのＥＧＴＡおよび０．１６７％のＢＳＡを添加したもの（ＰＥＧ液を加えた後の終濃度として）をＰＥＧ沈殿用の材料とした。そこに、１６％ ＰＥＧ ６，０００溶液にグリコーゲンと塩化ナトリウムを添加したＰＥＧ溶液を等量添加し、室温で１０分間放置した後、０℃に設定した遠心機で２０，０００Ｇ １０分間の遠心を施した。遠心上清を吸引廃棄後、沈渣に自製の検体処理液を添加して、９０℃，５分間処理した。熱処理したサンプルに、実施例１で使用した自製ＲＴ－ＰＣＲ反応液を加えて、Ｄｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った。結果は、濃縮後の沈渣形成の有無、濃縮液に添加したのと同量のウイルスを直接検体処理液に添加してＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った際の標識プローブ由来の蛍光立上りｃｙｃｌｅ値（Ｃｔ値）と４５ｃｙｃｌｅｓ ＰＣＲ後のＥｎｄ ＲＦＵ値との比較で評価した。結果を表７に示しているが、各群２重で行った結果の平均値をもとに算出している。得られたＰＥＧ沈殿物からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲの結果、咽頭拭い液や糞便懸濁上清液を試料として用いた場合でも、水酸化ナトリウム、ＥＧＴＡおよびＢＳＡを添加したＰＥＧ溶液を使用してＰＥＧ沈殿を行うことで、２５０μＬのこれら試料に混入した４０コピーの擬似コロナウイルスを検出できることを示している。

混合唾液中に添加したコロナウイルスのＰＥＧ沈殿法での濃縮時における各種添加剤の影響を検討した。即ち、５０人分の混合唾液（２５０μＬ）と蒸留水（５００μＬ）の混和物にＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染者唾液から希釈したウイルス（約１０コピー）を混入した検体に、１２．１ｍＭの水酸化ナトリウム、１．００ｍＭのＥＧＴＡおよび０．１６７％のＢＳＡを添加したもの（ＰＥＧ液を加えた後の終濃度として）をＰＥＧ沈殿用の材料とした。そこに、１６％ ＰＥＧ ６，０００溶液にグリコーゲンと塩化ナトリウムを添加したＰＥＧ溶液を等量添加し、室温で１０分間放置した後、０℃に設定した遠心機で２０，０００Ｇ １０分間の遠心を施した。遠心上清を吸引廃棄後、沈渣に自製の検体処理液を添加して、９０℃，５分間処理した。熱処理したサンプルに、実施例１で使用した自製ＲＴ－ＰＣＲ反応液を加えて、Ｄｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った。結果は、濃縮後の沈渣形成の有無、濃縮液に添加したのと同量のウイルスを直接検体処理液に添加してＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った際の標識プローブ由来の蛍光立上りｃｙｃｌｅ値（Ｃｔ値）と４５ｃｙｃｌｅｓ ＰＣＲ後のＥｎｄ ＲＦＵ値との比較で評価した。結果を表８に示しているが、得られたＰＥＧ沈殿物からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲの結果、実試料由来のエンベロープウイルスであるコロナウイルスを使用した場合でも、水酸化ナトリウム、ＥＧＴＡおよびＢＳＡを添加したＰＥＧ溶液を使用してＰＥＧ沈殿を行うことで、２５０μＬの試料に混入した約１０コピーのコロナウイルスを検出できることを示している。

混合唾液中に添加したノロウイルスのＰＥＧ沈殿法での濃縮時における各種添加剤の影響を検討した。即ち、７５０μＬの蒸留水もしくは５０人分の混合唾液（２５０μＬ）と蒸留水（５００μＬ）の混和物に、ノロウイルス感染者糞便懸濁液から希釈したウイルス（約１００コピー）を混和した検体に、１２．１ｍＭの水酸化ナトリウム、１．００ｍＭのＥＧＴＡおよび０．１６７％のＢＳＡを添加したもの（ＰＥＧ液を加えた後の終濃度として）をＰＥＧ沈殿用の材料とした。そこに、１６％ ＰＥＧ ６，０００溶液にグリコーゲンと塩化ナトリウムを添加したＰＥＧ溶液を等量添加し、室温で１０分間放置した後、０℃に設定した遠心機で２０，０００Ｇ １０分間の遠心を施した。遠心上清を吸引廃棄後、沈渣に自製の検体処理液を添加して、９０℃，５分間処理した。熱処理したサンプルに、逆転写酵素・ＰＣＲ酵素、ｄＮＴＰｓ、ノロウイルス検出用プライマーと３’端を蛍光で標識したプローブおよび内部コントロール（ＩＣ）検出用のプライマー／プローブなどを添加した自製ＲＴ－ＰＣＲ反応液を加えて、Ｄｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲを行った。結果は、濃縮後の沈渣形成の有無、濃縮液に添加したのと同量のウイルスを直接検体処理液に添加してリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行った際の標識プローブ由来の蛍光立上りｃｙｃｌｅ値（Ｃｔ値）と４５ｃｙｃｌｅｓ ＰＣＲ後のＥｎｄ ＲＦＵ値との比較で評価した。ノロウイルスＧＩ検出結果を表９、ノロウイルスＧＩＩ検出結果を表１０に示している。得られたＰＥＧ沈殿物からのＤｉｒｅｃｔ ＲＴ－ＰＣＲの結果、ウイルスをノンエンベロープウイルスであるノロウイルスに代えた場合でも、水酸化ナトリウム、ＥＧＴＡおよびＢＳＡを添加したＰＥＧ溶液を使用してＰＥＧ沈殿を行うことで、２５０μＬの試料に混入した１００コピー相当のノロウイルスを検出できることを示している。

Claims (14)

1. 水溶液中の微小物質をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法で濃縮する際に塩基物質及びキレート剤を個別もしくは混合状態で添加した後、遠心操作で微小物質を濃縮することを特徴とするＰＥＧ沈殿法。
2. 請求項１のＰＥＧ沈殿法において、塩基物質及びキレート剤とともに、さらに還元剤及び／又はタンパク質成分を添加することを特徴とする請求項１記載のＰＥＧ沈殿法。
3. 微小物質がウイルス、細胞外小胞体、プラスミド、核酸、タンパク質などであることを特徴とする請求項１記載のＰＥＧ沈殿法。
4. ウイルスがエンベロープウイルスもしくはノンエンベロープウイルスであることを特徴とする請求項３記載のＰＥＧ沈殿法。
5. 濃縮用の液に添加する塩基物質が水酸化ナトリウムであることを特徴とする請求項１乃至２記載のＰＥＧ沈殿法。
6. 濃縮用の液に添加する水酸化ナトリウムが、終濃度で１．２１～３８．２ｍＭである請求項５記載のＰＥＧ沈殿法。
7. 濃縮用の液に添加するキレート剤が、アミノカルボン酸系キレート剤であることを特徴とする請求項１乃至２記載のＰＥＧ沈殿法。
8. 濃縮用の液に添加するアミノカルボン酸系キレート剤が、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）もしくはその塩の単独もしくはこれらの混合物からなることを特徴とする請求項７記載のＰＥＧ沈殿法。
9. 濃縮用の液に添加するアミノカルボン酸系キレート剤が、終濃度で０．１００～３．２７ｍＭである請求項７及至８記載のＰＥＧ沈殿法。
10. 濃縮用の液に添加する還元剤が、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）であることを特徴とする請求項２記載のＰＥＧ沈殿法。
11. 濃縮用の液に添加するＤＴＴが、終濃度で５ｍＭ以下である請求項１０記載のＰＥＧ沈殿法。
12. 濃縮用の液に添加するタンパク質成分が牛血清アルブミン（ＢＳＡ）であることを特徴とする請求項２記載のＰＥＧ沈殿法。
13. 濃縮用の液に添加するＢＳＡが、終濃度で０．００１６７～１．６７％である請求項１２記載のＰＥＧ沈殿法。
14. 請求項１に記載した方法で濃縮した検体を核酸の精製なしに反応液に添加して、微小物質中の核酸を増幅して検出することを特徴とするウイルス検出方法。