JP2023126188A

JP2023126188A - ビタミンｄ誘導体

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Publication number: JP2023126188A
Application number: JP2023028750A
Authority: JP
Inventors: 和夫長澤; Kazuo Nagasawa; 正行寺; Masayuki Tera; 海帆岩城; Kaiho Iwaki
Original assignee: Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Current assignee: Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Priority date: 2022-02-28
Filing date: 2023-02-27
Publication date: 2023-09-07

Abstract

【課題】簡便で、かつ候補化合物の実際のＶＤＲ結合親和性を反映できる、ＶＤＲ結合親和性評価に使用可能な化合物を提供する。【解決手段】下記式（Ｉ）で表される化合物を使用する：TIFF2023126188000080.tif5264（式中、Ｒ１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基等；Ｒ２は水素、エーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５の飽和若しくは不飽和の炭化水素基等；Ｒ３は水素又は水酸基；Ｌはリンカー；Ｍは標識分子）。【選択図】なし

Description

本発明は、ビタミンＤ誘導体、その合成中間体及びその合成方法、並びに該ビタミンＤ誘導体を使用して対象化合物のビタミンＤ受容体に対する結合親和性を評価する方法に関する。

ビタミンＤは骨形成作用、カルシウム濃度恒常性維持作用、筋肉増強作用、細胞分化誘導作用をはじめとする多様な生理活性を有しており、その誘導体の多くが医薬品として開発されてきた。これまでに、その生理活性に着目したビタミンＤ製剤の開発を目的として、３０００種類を超えるビタミンＤ誘導体が合成されてきた。その中で、慢性腎不全、二次性副甲状腺機能亢進症、骨粗しょう症、乾癬ビタミンＤなどの疾患に対し、アルファカルシドール、ファレカルシトリオール、ｐａｒｉｃａｌｃｉｔｏｌ、エルデカルシトール、カルシポトリオール、タカルシトール、マキサカルシトール等が臨床に用いられている（非特許文献１）。

１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３（活性型ビタミンＤ）およびその誘導体の多くは、細胞の核内に存在するビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）と結合することで、その生理活性を示すことが知られている。そのため、新規のビタミンＤ誘導体からの創薬開発には、ビタミンＤ誘導体候補化合物から、そのＶＤＲ結合親和性の評価によるスクリーニングを行う工程が有用である。従来は、同位体標識を有する活性型ビタミンＤを、候補化合物と共にＶＤＲに競合的に結合させ、非結合物質の標識を検出することで、候補化合物のＶＤＲ結合親和性を評価する方法がとられてきた（非特許文献２）。特許文献１には、同位体標識に代えて、活性型ビタミンＤの特定の位置に蛍光物質を結合させた低分子化合物（蛍光リガンド）を使用する方法が開示されている。この方法では、ＶＤＲ結合時と非結合時で蛍光物質の蛍光偏向度が変化する特性を用いて、非結合の該低分子化合物を定量することが可能である。

非特許文献３には、ＶＤＲのリガンド結合部位（ＬＢＤ）と分割型ルシフェラーゼを結合させた複合体を用いて、候補化合物のＶＤＲ結合親和性を評価する方法が開示されている。候補化合物(リガンド)と前記複合体が結合することにより、ＬＢＤに構造変化が生じて２つに分割したルシフェラーゼが結合し、一体化したルシフェラーゼが形成される。これとルシフェリンとの反応により生じる蛍光を測定することで、候補化合物のＶＤＲ結合親和性を評価することが可能である。

国際公開第２００３／０７０６９７号

岡野登志夫編「ビタミンＤと疾患改訂版」医薬ジャーナル社（2014/1/15） Peter F., et. al., Science, Vol. 4129 (183), pp. 1089-1091 (1974) 真野寛生ら、ビタミン第９１巻第３号、pp. 165-172 (2017)

特許文献１に記載の方法は、蛍光リガンドの蛍光偏向度を測定することを要する。蛍光偏向度の測定は、通常の分光蛍光光度計では不可能であり、特殊な装置を用いることを要する。また、蛍光偏向を生じさせるためには蛍光リガンドをＶＤＲから確実に遊離させる必要があるが、蛍光リガンドのＫｄが高いため、比較的多量の候補化合物を要する、という課題があった。

一方、非特許文献３に記載の方法は、分光蛍光光度計で測定可能ではあるが、ＶＤＲそのものではなく、ＬＢＤ及び分割型ルシフェラーゼの複合体と候補物質との結合親和性を測定する方法である。したがって、その測定値が実際のＶＤＲ結合親和性を反映できているか不明である。

本発明は、簡便で、かつ候補化合物の実際のＶＤＲ結合親和性を反映できる、ＶＤＲ結合親和性評価に使用可能な化合物を提供することを目的とする。

本発明は、以下を提供する。
［１］下記式（Ｉ）で表される化合物：

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^２は水素、エーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５のアルコキシ基である；Ｒ^３は水素又は水酸基である；Ｌはリンカーである；Ｍは標識分子である）。
［２］前記リンカーが炭素数２～１０の炭素鎖に相当する長さを有する、［１］に記載の化合物。
［３］下記式（ＩＩ）で表される化合物である、［１］又は［２］に記載の化合物：

（式中、Ｍは標識分子である）。
［４］下記式（ＩＩＩ）で表される化合物である、［１］又は［２］に記載の化合物：

（式中、Ｍは標識分子である）。
［５］下記式（ＩＶ）で表される化合物である、［１］又は［２］に記載の化合物：

（式中、Ｍは標識分子である）。
［６］ビタミンＤ受容体への結合親和性を有する、［１］～［５］のいずれかに記載の化合物。
［７］標識分子が、環境応答型蛍光分子である、［１］～［６］のいずれかに記載の化合物。
［８］標識分子が、下記式（Ｖ）～（ＩＸ）で表される化合物及びこれらの誘導体からなる群より選択される、少なくとも１つの化合物である、［７］に記載の化合物。

［９］標識分子が、波長３５０ｎｍの光照射で蛍光を発する蛍光分子である、［１］～［５］のいずれかに記載の化合物。
［１０］［１］に記載の化合物の中間化合物である、下記式（Ｘ）で表される化合物：

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^５はアジド基又はシアノ基である；Ｌはリンカーである）。
［１１］［１］に記載の化合物を合成する方法であって、下記工程（ａ）～（ｄ）を含む、方法：
（ａ）下記式（ＸＩ）で表される化合物を提供する工程：

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^４は－Ｏ－Ｐ（Ｐは保護基）である）；
（ｂ）上記式（ＸＩ）で表される化合物より、下記式（Ｘ）で表される化合物を取得する工程；

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^５はアジド基又はシアノ基である；Ｌはリンカーである）；
（ｃ）上記式（Ｘ）で表される化合物を下記式（ＸＩＩ）で表される化合物と反応させて下記式（ＸＩＩＩ）で表される化合物を取得する工程；及び

（式中、Ｒ^２は水素、エーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５のアルコキシ基である；Ｒ^６は－Ｏ－Ｐ（Ｐは保護基）である；Ｒ^７は水素又は－Ｏ－Ｐ（Ｐは保護基）である；Ｒ^８及びＲ^９は、それぞれ独立に炭素数２～８の飽和又は不飽和の炭化水素である）、

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^２は水素、エーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５のアルコキシ基である；Ｒ^５はアジド基又はシアノ基である；Ｒ^６は－Ｏ－Ｐ（Ｐは保護基）である；Ｒ^７は水素又は－Ｏ－Ｐ（Ｐは保護基）である；Ｌはリンカーである）
（ｄ）上記式（ＸＩＩＩ）で表される化合物に標識分子を結合させ、脱保護を行い、下記式（Ｉ）で表される化合物を得る工程：

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^２は水素、エーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５のアルコキシ基である；Ｒ^３は水素又は水酸基である；Ｌはリンカーである；Ｍは標識分子である）。
［１２］対象化合物のビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）に対する結合親和性を評価する方法であって、下記工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む、方法：
（ｉ）下記式（Ｉ）で表され、かつ、ＶＤＲに対する結合親和性を有する標識リガンドを提供する工程：

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^２は水素、エーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５のアルコキシ基である；Ｒ^３は水素又は水酸基である；Lはリンカーである；Ｍは標識分子である）；
（ｉｉ）ＶＤＲ、前記標識リガンド、及び対象化合物を反応させる工程；
（ｉｉｉ）前記標識分子の所定のシグナルを定量する工程。
［１３］前記リンカーが炭素数２～１０の炭素鎖に相当する長さを有する、［１２］に記載の方法。
［１４］前記標識リガンドが、下記式（ＩＩ）で表される化合物である、［１２］又は［１３］に記載の方法：

（式中、Ｍは標識分子である）。
［１５］前記標識リガンドが、下記式（ＩＩＩ）で表される化合物である、［１２］又は［１３］に記載の方法：

（式中、Ｍは標識分子である）。
［１６］標識分子が、環境応答型蛍光分子である、［１２］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］標識分子が、下記式（Ｖ）～（ＩＸ）で表される化合物及びこれらの誘導体からなる群より選択される、少なくとも１つの化合物である、［１６］に記載の方法。

［１８］標識分子が、波長３５０ｎｍの光照射で蛍光を発する蛍光分子である、［１２］～［１５］のいずれかに記載の化合物。
［１９］複数の候補化合物群からビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）結合親和性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
各候補化合物を対象化合物として、［１２］～［１８］のいずれかに記載の方法で対象化合物のＶＤＲ結合親和性を評価して、高いＶＤＲ結合親和性を有する化合物を選定することを含む、方法。
［２０］［１］～［１０］のいずれかに記載の化合物、及びビタミンＤ受容体を含む、対象化合物のＶＤＲ結合親和性を評価するためのキット。

本発明によれば、簡便で、かつ候補化合物の実際のＶＤＲ結合親和性を反映できる、ＶＤＲ結合親和性評価に使用可能な化合物を提供することが可能である。

活性型ビタミンＤ（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３）の構造と、従来の誘導体類の構造を示す概略図である。アセチニルアジドビタミンＤ誘導体の合成手順の例を示す概略図である。図２－１の続きである。アセチニルニトリルビタミンＤ誘導体の合成手順の例を示す概略図である。本発明の対象化合物のＶＤＲ結合親和性評価方法の原理を示す概略図である。各濃度のビタミンＤ受容体を添加した、蛍光リガンド（化合物１９）の蛍光スペクトルである。各濃度のビタミンＤ受容体を添加した、蛍光リガンド（化合物２３）の蛍光スペクトルである。各濃度の１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３と、一定量のビタミンＤ受容体を添加した、蛍光リガンド（化合物１９）の蛍光スペクトルである。各濃度の１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３と、一定量のビタミンＤ受容体を添加した、蛍光リガンド（化合物２３）の蛍光スペクトルである。各濃度のビタミンＤ受容体を添加した、蛍光リガンド（化合物１９）の励起波長２８０ｎｍでの蛍光スペクトルである。各濃度の１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３と、一定量のビタミンＤ受容体を添加した、蛍光リガンド（化合物１９）の励起波長２８０ｎｍでの蛍光スペクトルである。

本明細書に表される化学式は、特に記載がない限り、あらゆる幾何学異性体及び光学的異性体を含むものとする。また、本明細書に表される化合物は、特に記載がない限り、その化合物の塩及び溶媒和物を包含するものとする。本明細書において「含有量」又は「量」とは、特に記載のない限り、モル量を指すものとする。また「モル濃度（Ｍ）」は、特に記載のない限り、溶液単位体積当たりのモル量（モル／ｄｍ^３）を指すものとする。

１．化合物
本発明の第１の実施形態は、下記式（Ｉ）で表される化合物である。

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^２は水素、エーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５のアルコキシ基である；Ｒ^３は水素又は水酸基である；Ｌはリンカーである；Ｍは標識分子である）。

本実施形態の化合物は、ビタミンＤ_３のＡ環及びＣＤ環構造（図１を参照のこと）を有するビタミンＤ_３の誘導体である。図１に、活性型ビタミンＤ（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３）の構造と、既知の誘導体類の構造を示す。図１に示す通り、従来のビタミンＤ誘導体は、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３の１～３位、１６位、１９～２１位及び２２～２５位が修飾されて形成されるものが知られていた。本実施形態の化合物は、１１位に置換基が導入された点に特徴を有する。特に後述の環境応答型蛍光分子を標識分子として使用する場合に、１１位に標識分子が結合することで、ＶＤＲとの結合時と非結合時のその蛍光波長及び／又は蛍光強度に明確な差異が生じる。

本実施形態の化合物において、リンカー（Ｌ）は、炭素数２～１０、特に炭素数３～６、さらに炭素数４～５の炭素鎖に相当する長さを有するリンカーであることが好ましい。Ｌの構造は、特に限定されないが、例えば、炭素数２～１０の飽和又は不飽和の炭素鎖を有する構造とすることができる。炭素鎖の長さが上記範囲内であれば、前記炭素鎖はエーテル結合を有してもよく、また、分岐鎖を有してもよい。前記炭素鎖が不飽和結合を有する場合、例えば、１つ又は２つの二重結合及び／又は三重結合を有することができる。Ｌの構造は、例えば、左を標識分子側として、－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｃ≡Ｃ－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ_２－、－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ_２－等の構造とすることができる。Ｌを上記の長さとすることで、標識分子（Ｍ）を後述の環境依存型の蛍光標識を使用した場合に、ＶＤＲとの結合時と非結合時のその蛍光波長及び／又は蛍光強度に差異を生じさせることが可能となる。

本実施形態の化合物において、標識分子（Ｍ）は、低分子化合物の検出に通常使用される標識分子であれば特に限定されず、蛍光分子、キレート、ビオチン、ジゴキシゲニン、核酸等のいずれも使用できる。

本実施形態の化合物の一態様においては、Ｍとして、環境応答型蛍光分子を使用する。本明細書において「環境応答型蛍光分子」とは、周囲環境の極性変化によって、その蛍光波長及び／又は蛍光強度に変化が生じる特徴を有する蛍光分子を指す。前記の特徴を有する蛍光分子であれば、特に限定されないが、例えば、ダンシル、ベンゾフラザン等の蛍光分子を使用することができる。このような蛍光分子としては、好適には、下記式（Ｖ）～（ＩＸ）で表される化合物及びこれらの誘導体からなる群から選択される、少なくとも１つの環境応答型蛍光分子を使用することができる。

本実施形態の化合物の別の態様においては、Ｍとして、波長３５０ｎｍの光照射で蛍光を発する蛍光分子を使用する。ＶＤＲのＶＤ結合領域近傍にはトリプトファン残基があることが知られる。トリプトファン残基は、２８０ｎｍの励起光を照射することで３５０ｎｍ付近の蛍光を発することが知られる。そのため、標識分子として励起波長が２８０ｎｍに近い蛍光物質を使用すると、その検出時にトリプトファンの蛍光が干渉する可能性がある。本実施形態の化合物の標識分子として、トリプトファンの蛍光波長である３５０ｎｍ付近に励起波長を有する蛍光分子を用いた場合、前記化合物とＶＤＲが結合すると、前記蛍光分子とＶＤＲのトリプトファンが非常に近接した状態となる。ここに、２８０ｎｍの光を照射すると、トリプトファンから３５０ｎｍ付近の蛍光が発生し、この傾向が前記蛍光分子の励起光となり、さらに高波長（例えば５２０ｎｍ）の蛍光が生じる（蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ））。高波長の蛍光を検出することにより、ＶＤＲに結合する前記化合物の量をより正確に測定することが可能である。なお、本明細書において「蛍光を発する」とは、照射光（励起光）よりも長波長側にて検出可能な蛍光ピークを生じることを指す。ここでいう「検出可能な蛍光ピーク」とは、例えば、ノイズに埋もれることなく、使用した測定機器、解析ソフトの使用でピークとして明確に認識可能なピークを指す。

このような蛍光分子は、波長３５０ｎｍの光照射で蛍光を発する蛍光分子であれば特に限定されないが、例えば、下記式（Ｖ）、（ＸＩＶ）及び（ＸＶ）で表される化合物並びにこれらの誘導体が挙げられる。

本実施形態の化合物は、ＶＤＲ結合親和性を有することが好ましい。本明細書において「ＶＤＲ結合親和性を有する」化合物とは、活性型ビタミンＤ（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３）のＶＤＲ結合力を１００とした場合に、１以上の結合力を有する化合物を指す。本実施形態の化合物の、Ｌ、Ｍの部分を除く構造は、既知のＶＤＲ結合親和性を有する化合物、例えば、非特許文献1に記載のＶＤＲ結合親和性を有する化合物のうち、いずれかの化合物と同じ構造とすることができる。

本明細書において、「ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）」とは、カルシトリオール受容体とも称される、核内受容体の１つを指す。より具体的には、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ００２１６８．２）で表されるアミノ酸配列又は配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、活性型ビタミンＤ（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３）との結合親和性を有するポリペプチドを指す。

本実施形態の化合物は、例えば、下記式（ＩＩ）から（ＩＶ）のいずれかの構造を有することができる。

（式中、Ｍは標識分子である）。

（式中、Ｍは標識分子である）。

（式中、Ｍは標識分子である）。

２．化合物の合成方法
本発明の第２の実施形態は、第１の実施形態の化合物を合成する方法である。本実施形態の方法は、下記工程（ａ）～（ｄ）を含むことを特徴とする。
（ａ）下記式（ＸＩ）で表される化合物を提供する工程：

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^２は水素、エーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５のアルコキシ基である；Ｒ^５はアジド基又はシアノ基である；Ｒ^６は－Ｏ－Ｐ（Ｐは保護基）である；Ｒ^７は水素又は－Ｏ－Ｐ（Ｐは保護基）である；Ｌはリンカーである）
（ｄ）上記式（ＸＩＩＩ）で表される化合物に標識分子を結合させ、脱保護を行い、上記式（Ｉ）で表される化合物を得る工程。

ビタミンＤ誘導体の誘導体を合成するためにビタミンＤ_３の環状構造に官能基を導入する場合、その立体構造や反応活性等の影響で、通常は、非特許文献１、特許文献１に示される通り、１位、２位に導入される。一方、１１位の炭素は、官能基化を行うための足場となる水酸基等の官能基がなく化学的に不活性（安定）であることから、この位置の官能基化は１位、２位への官能基化と比較して困難であった。本発明者らは、Ａ環及びＣＤ環を備えたビタミンＤ_３骨格を有する化合物に直接官能基を導入するのではなく、Ａ環とＣＤ環とを別々に調製して、ＣＤ環の１１位相当位置のＣ－Ｈ結合を活性化した後にリンカーを導入し、これをＡ環と結合させることで、第１の実施形態の化合物のように１１位にリンカーが導入された化合物を合成した。本実施形態の方法における化合物の合成手順の例を図２及び図３に示す。

２－１工程（ａ）
本実施形態の方法の工程（ａ）は、上記式（ＸＩ）で表される化合物を提供する工程である。式中のＲ^１は、上記式（Ｉ）のＲ^１と共通の構造を有してもよい。Ｒ^４の保護基Ｐは、例えばトリメチルシリル基（ＴＭＳ）、トリエチルシリル基（ＴＥＳ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）、トリイソプロピルシリル基（ＴＩＰＳ）ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基（ＴＢＤＰＳ）、テトラヒドロピィラニル基（ＴＨＰ）、メトキシメチル基（ＭＯＭ）、エトキシエチル基本（ＥＥ）、ベンジルオキシメチル基（ＢＯＭ）等とすることができる。上記式（ＸＩ）で表される化合物は、R. Bouillon et al., J. Biol. Chem., Vol. 267, No. 5, pp. 3044-3051(1992)に記載の方法で調製することができる。

２－２工程（ｂ）
本実施形態の方法の工程（ｂ）は、上記式（ＸＩ）で表される化合物より、上記式（Ｘ）で表される化合物を取得する工程である。式（Ｘ）中のＲ^１は、上記式（ＸＩ）のＲ^１と共通の構造を有してもよい。また、リンカーＬは、上記式Ｌと共通の構造を有してもよい。上記式（ＸＩ）で表される化合物より上記式（Ｘ）で表される化合物を取得する詳細な手順は、１１位に相当する位置にリンカーを付加できれば特に限定されないが、例えば、図２（図２－１及び図２－２）に示す手順、すなわち、オレフィン構造を有する化合物１を開始物質として、化合物１０を得る手順とすることができる。あるいは、図３に示す手順、すなわち、オレフィン構造を有する化合物１から中間化合物６を経て、化合物１６を得る手順とすることができる。

図２に示す例では、まず、オレフィン化合物１に三臭化ピリジン及びトリエチルアミンを反応させ、オレフィンの不飽和結合に臭素（ハロゲン）が付加した化合物２を生成させる。化合物２にカリウムｔｅｒｔ－ブトキシドを反応させてハロゲン付加部分をアセチレン基に変換し、化合物３を生成する。次いで、アセチレン基の末端に（１）ジアゾ酢酸エチル、（２）リチウムアルミニウムヒドリド、（３）トシルクロリドをこの順に付加・精製してトシル体６を得る。次いで、トシル基に（４）アジ化ナトリウムを付加して、アジド化合物７を得る。化合物７を脱保護・酸化してケトン化合物９を生成した後、１位の水酸基に保護基を付加して化合物１０を得ることができる。

図３に示す例では、上記と同様に調製したトシル体６にシアン化ナトリウムを反応させ、トシル基をシアノ基に変換させて化合物１３を得る。化合物１３を脱保護、酸化してケトン体１５を生成した後、１位の水酸基に保護基を付加して化合物１６を得ることができる。

２－３工程（ｃ）
本実施形態の方法の工程（ｃ）は、上記式（Ｘ）で表される化合物を上記式（ＸＩＩ）で表される化合物と反応させて上記式（ＸＩＩＩ）で表される化合物を取得する工程である。上記式（ＸＩＩＩ）で表される化合物において、Ｒ^８及びＲ^９は、それぞれ独立して、例えば、フェニル基又は炭素数２～８のアルキル基とすることができる。特に、Ｒ^８及びＲ^９をいずれもフェニル基とする、すなわち、Ｒ^８、Ｒ^９及びホスフィンオキシド基を合わせて、ジフェニルホスフィンオキシド基とすることが好ましい。上記式（ＸＩＩ）で表される化合物において、Ｒ^２は、上記式（Ｉ）のＲ^２と共通の構造を有してもよい。Ｒ^６及びＲ^７において、保護基Ｐは、例えば、トリメチルシリル基（ＴＭＳ）、トリエチルシリル基（ＴＥＳ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）、トリイソプロピルシリル基（ＴＩＰＳ）ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基（ＴＢＤＰＳ）、テトラヒドロピィラニル基（ＴＨＰ）、メトキシメチル基（ＭＯＭ）、エトキシエチル基本（ＥＥ）、ベンジルオキシメチル基（ＢＯＭ）等とすることができる。

上記式（Ｘ）で表される化合物より上記式（ＸＩＩＩ）を取得する詳細な手順は、リンカーを有するＣＤ環構造にＡ環を付加できれば特に限定されないが、例えば、図２に示す手順、すなわち、図２中の化合物１０に化合物１１を反応させて、化合物１２を得る手順とすることができる。あるいは、図３に示す手順、すなわち図３中の化合物１６に化合物１１を反応させて化合物１７を得る手順とすることができる。

２－４工程（ｄ）
本実施形態の方法の工程（ｄ）は、上記式（ＸＩＩＩ）で表される化合物に標識分子を結合させて脱保護を行い、上記式（Ｉ）で表される化合物を得る工程である。ここで、結合させる標識分子（Ｍ）は、低分子化合物の検出に通常使用される標識分子であれば特に限定されず、蛍光分子、キレート、ビオチン、ジゴキシゲニン、核酸等のいずれも使用できる。本実施形態の方法において、Ｍは、環境応答型蛍光分子とすることが好ましく、さらに、上記式（Ｖ）～（ＩＸ）で表される化合物及びこれらの誘導体からなる群から選択される、少なくとも１つの環境応答型蛍光分子とすることがより好ましい。

３．中間化合物
本発明の第３の実施形態は、第１の実施形態の化合物の中間化合物であって、下記（Ｘ）で表される化合物である。

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^５はアジド基又はシアノ基である；Ｌはリンカーである）。

本実施形態の化合物は、第１の実施形態の化合物、具体的には上記式（Ｉ）で示される化合物を合成するために使用される。

４．対象化合物のＶＤＲ結合親和性評価方法
本発明の第４の実施形態は、対象化合物のＶＤＲに対する結合親和性を評価する方法であって、下記工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む、ことを特徴とする。
（ｉ）下記式（Ｉ）で表され、かつ、ＶＤＲに対する結合親和性を有する標識リガンドを提供する工程：

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^２は水素、エーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５のアルコキシ基である；Ｒ^３は水素又は水酸基である；Ｌはリンカーである；Ｍは標識分子である）；
（ｉｉ）ＶＤＲ、前記標識リガンド、及び対象化合物を反応させる工程；
（ｉｉｉ）前記標識分子の所定のシグナルを定量する工程。

本実施形態の方法は、標識分子が付加されたＶＤＲ結合性化合物（標識リガンド）と対象化合物とをＶＤＲ存在下で競合的に反応させることで、前記標識リガンドに生じるシグナルの変化に基づいて対象化合物のＶＤＲ結合親和性を評価することができる。

対象化合物としては、ＶＤＲ結合親和性を有すると予測される候補化合物であれば、いずれの化合物であってもよい。このような化合物は、例えば、ビタミンＤ_３と同じ環構造、すなわちＡ環及びＣＤ環を備え、かつ、新規の修飾を加えた化合物とすることができる。

図４に本実施形態の方法の原理を示す。候補物質の不存在下では、標識リガンドはＶＤＲと結合して複合体を形成する。ここに、一定量の対象化合物（図中では１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３）を共存させると、対象化合物がＶＤＲ結合性を有していれば、対象化合物と前記標識リガンドが競合して、少なくとも一部の標識リガンドが複合体から遊離する。複合体と遊離化合物とで、結合する標識分子の発するシグナルが変化することから、標識リガンドの遊離に伴うシグナル変化を定量することで、対象化合物のＶＤＲ結合親和性を評価することが可能となる。

４．１工程（ｉ）
本実施形態の方法の工程（ｉ）は、上記式（Ｉ）で表され、かつ、ＶＤＲに対する結合親和性を有する標識リガンドを提供する工程である。本実施形態の方法において、使用する標識リガンドのリンカー（Ｌ）は、炭素数２～１０、特に炭素数３～６、さらに炭素数４～５の炭素鎖に相当する長さを有するリンカーであることが好ましい。Ｌの構造は、特に限定されないが、例えば、炭素数２～１０の飽和又は不飽和の炭素鎖を有する構造とすることができる。炭素鎖の長さが上記範囲内であれば、前記炭素鎖はエーテル結合を有してもよく、また、分岐鎖を有してもよい。前記炭素鎖が不飽和結合を有する場合、例えば、１つ又は２つの二重結合及び／又は三重結合を有することができる。Ｌの構造は、例えば、左を標識分子側として、－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｃ≡Ｃ－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ_２－、－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ_２－等の構造とすることができる。

本実施形態の方法において、使用する標識リガンドの標識分子（Ｍ）は、低分子化合物の検出に通常使用される標識分子であれば特に限定されず、蛍光分子、キレート、ビオチン、ジゴキシゲニン、核酸等のいずれも使用できるが、特に、環境応答型蛍光分子を好適に使用できる。

本実施形態の方法の好適な態様は、１１位の炭素に、炭素数２～１０、より好適には炭素数３～６、さらに好適には４～５の炭素鎖に相当する長さを有するリンカーを介して、標識リガンドとして環境応答型蛍光分子が結合した構造を有する化合物を使用する。以下、このような標識リガンドを「蛍光リガンド」とも称する。当該蛍光リガンドは、ＶＤＲ結合時のＶＤＲ－蛍光分子間の距離に起因して、ＶＤＲ結合時とＶＤＲ非結合時とで、蛍光分子周囲の極性に変化が生じる。そのため、蛍光リガンドがＶＤＲから遊離する際に、その蛍光波長及び／又は蛍光強度に変化が生じる。その際の蛍光波長、蛍光強度の変化は、通常の分光蛍光光度計で容易に測定することが可能である。

蛍光リガンドにおいて、例えば、蛍光分子を１１位ではなく２位の炭素に結合させた場合、ＶＤＲ－蛍光分子間の距離が離れすぎているため、ＶＤＲ結合時とＶＤＲ非結合時との極性変化は微小となり、遊離時の蛍光波長及び蛍光強度の変化はほとんど見られない。そのため、蛍光リガンドの遊離の程度を測定するためには、蛍光偏向度を測定するか、遊離した蛍光リガンドとＶＤＲに残存する蛍光リガンドを分離して、いずれか又は両方の蛍光強度を測定する必要がある。

Ｍとしては、好適には、下記式（Ｖ）～（ＩＸ）で表される化合物及びこれらの誘導体から選択される少なくとも１つの環境応答型蛍光分子を使用することができる。

本実施形態において、「リガンド」とは、活性型ビタミンＤ（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３）のＶＤＲ結合力を１００とした場合に、１以上の結合力を有する化合物を指す。本実施形態における標識リガンドの、Ｌ、Ｍの部分を除く構造は、既知のＶＤＲ結合親和性を有する化合物、例えば、非特許文献1に記載のＶＤＲ結合親和性を有する化合物のうち、いずれかの化合物と同じ構造をとることができる。

標識リガンドは、例えば、下記式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の構造を有する化合物とすることができる。

（式中、Ｍは標識分子である）。

（式中、Ｍは標識分子である）。

本実施形態の方法で使用される標識リガンドは、「２．化合物の合成方法」の項に記載の方法で合成することができる。また、本実施形態の方法で使用される標識リガンドは、「３．中間化合物」の項に記載の化合物を中間物質として合成することができる。

本実施形態で使用される標識リガンドのその他の特徴は、特に矛盾のない限り、「１．化合物」の項に記載の特徴と同様である。

４．２工程（ｉｉ）
本実施形態の方法の工程（ｉｉ）は、ＶＤＲ、前記標識リガンド、及び対象化合物を反応させる工程である。工程（ｉｉ）において使用するＶＤＲは、生体試料から精製したポリペプチドであってもよく、また、公知の方法で調製されたリコンビナントポリペプチドであってもよい。市販のリコンビナントＶＤＲ、例えば、Thermo Fisher Vitamin D3 Receptor Recombinant Human Protein (製品番号 A15670)等を使用してもよい。

工程（ｉｉ）は、例えば、ＶＤＲと標識リガンドとが複合体を形成して存在する系に、ＶＤＲ結合性を有すると予測される対象化合物を添加する工程とすることができる。図４に示すように、前記複合体に対象化合物（図中では１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３）を添加することで、対象化合物とＶＤＲとで複合体を生じさせ、標識リガンド（図中では蛍光リガンド）を遊離させることができる。対象化合物のＶＤＲ結合親和性が高いほど、遊離する蛍光リガンドの量が多くなる。

工程（ｉｉ）において、ＶＤＲ、標識リガンド及び対象化合物の反応は、特に限定されないが、バッファー（緩衝液）中で行うことが好ましい。使用するバッファーとしては、Ｔｒｉｓ、リン酸、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ等の緩衝剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、塩化カリウム、塩化ナトリウム等の塩類を含むものをいずれも使用できる。使用するバッファーのｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ６～１１、特にｐＨ７～１０とすることが好ましい。反応をバッファーを使用する場合、ＶＤＲの濃度は、特に限定されないが、例えば、１０～２００ｎＭ、特に５０～１００ｎＭとすることができる。また、標識リガンドの濃度は、特に限定されないが、例えば、１００～１０００ｎＭ、特に２００～６００ｎＭとすることができる。

４．３工程（ｉｉｉ）
本実施形態の方法の工程（ｉｉｉ）は、前記標識分子の所定のシグナルを定量する工程である。図４に示すように、工程（ｉｉ）において、ＶＤＲ－標識リガンドの複合体に対象化合物（図中では１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３）の一定量を添加すると、対象化合物のＶＤＲ結合親和性の高さに応じて前記複合体から標識リガンドが遊離し、標識分子の発するシグナルに変化が生じる。この変化したシグナルを定量することで、添加した化合物のＶＤＲ結合親和性を評価することが可能である。本実施形態における「所定のシグナル」とは、標識リガンドの遊離に伴い生じるシグナルを指す。具体的に定量の対象となるシグナルは、その標識リガンドにおける標識分子の種類や炭素骨格の構造等によって異なる。

上記の通り、標識分子として環境応答型蛍光分子を使用した場合、標識リガンド（蛍光リガンド）の遊離により変化した蛍光波長及び／又は蛍光強度を測定することにより、対象化合物をＶＤＲ結合親和性を評価することが可能である。例えば、標識分子として上記式（Ｖ）で表されるダンシルを使用した場合、蛍光リガンドの遊離により、３４２ｎｍの励起光照射時の蛍光波長は約４８０ｎｍから約５１０ｎｍに変化し、更に全体の蛍光強度が低下する。そのため、極大蛍光波長の変化の度合い、及び／又は約５１０ｎｍの蛍光強度を測定することで、対象化合物のＶＤＲ結合親和性を評価することができる。また、例えば、標識分子として上記式（ＶＩ）で表されるニトロベンゾフラザンを使用した場合、蛍光リガンドの遊離により、４８７ｎｍの励起光照射時の５５１ｎｍの蛍光強度は低くなる。そのため、反応後の５５１ｎｍの蛍光強度を測定することで、対象化合物のＶＤＲ結合親和性を評価することができる。

標識分子として環境応答型蛍光分子以外を使用する場合は、遊離した標識リガンドを複合体から溶媒抽出、カラム分離、抗体結合等の公知の手段により分離して、分離後の遊離した標識リガンド、又は複合体に残留した標識リガンドを定量することにより、対象化合物のＶＤＲ結合親和性を評価することが可能である。あるいは、環境応答型でない蛍光分子を標識分子として使用する場合は、対象化合物を添加した後の遊離した標識リガンドを蛍光偏向度の測定により定量し、対象化合物のＶＤＲ結合親和性を評価してもよい。

５．スクリーニング方法
本発明の第５の実施形態は、各候補化合物を対象化合物として「４．対象化合物のＶＤＲ結合親和性評価方法」に記載の方法でＶＤＲ結合親和性を評価して、高いＶＤＲ結合親和性を有する化合物を選定することを含む、複数の候補化合物群からＶＤＲ結合親和性を有する化合物をスクリーニングする方法である。

本実施形態において、候補化合物は、ＶＤＲ結合親和性を有すると予測される候補化合物であれば、いずれの化合物であってもよい。このような化合物は、例えば、ビタミンＤ_３と同じ環構造、すなわちＡ環及びＣＤ環を備え、かつ、新規の修飾を加えた化合物とすることができる。

６．キット
本発明の第６の実施形態は、「１．化合物」の項に記載の化合物、及びビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）を含む、対象化合物のＶＤＲ結合親和性を評価するためのキットである。本実施形態のキットは、「４．対象化合物のＶＤＲ結合親和性評価方法」の項に記載の方法に使用することができる。また、本実施形態のキットは、「５．スクリーニング方法」の項に記載の方法に使用することができる。

本実施形態のキットは、上記式（Ｉ）で表される化合物であって、ＶＤＲ結合親和性を有する化合物、すなわち標識リガンドを含む。また、本実施形態のキットは、ＶＤＲを含む。ＶＤＲとしては、生体試料から精製したＶＤＲポリペプチド、公知の方法で調製されたリコンビナントＶＤＲポリペプチド及び市販のＶＤＲポリペプチドのいずれを使用してもよい。

本実施形態のキットは、ＶＤＲ結合親和性の評価対象となる対象化合物を希釈するための溶媒及び／又は緩衝液を備えていてもよい。また、対象化合物と、標識リガンド及びＶＤＲとを反応させるための容器を備えていてもよい。容器の材質、形状は特に限定されず、マイクロウェルプレート、キュベット、石英セル等をいずれも使用できるが、標識分子として蛍光標識を使用する場合は、遮光性のマイクロウェルプレート等を好適に使用できる。

本実施形態のキットは、さらに、キットの使用方法等を記載した説明書を備えていてもよい。

［実施例１］アセチニルアジドビタミンＤ誘導体の合成
アセチニルアジドビタミンＤ誘導体１２の合成手順は、図２に示す通りである。以下、各合成手順を説明する。
（１－１）（（（１Ｒ，３ａＲ，４Ｓ，７ａＲ）－６－（１，２－ジブロモエチル）－７ａ－メチル－１－（Ｒ）－６－メチル－６（（トリエチルシリル）オキシ）ヘプタン－２－イル）オクタヒドロ－１Ｈ－インデン－４－イル）オキシ）トリエチルシラン（２）の合成
オレフィン1は、R. Bouillon et al., J. Biol. Chem., Vol. 267, No. 5, pp. 3044-3051(1992)に記載の方法に準じて調製した。アルゴン雰囲気下、オレフィン１（１１７ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＣＨ_２Ｃｌ_２、１ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（Ｅｔ_３Ｎ、３６μＬ）、三臭化ピリジン（ｐｙＨＢｒ・Ｂｒ_２、８４ｍｇ）を０℃で加え、３０分攪拌した。室温に戻し、トリエチルアミン（３６μＬ）、再び０℃で三臭化ピリジン（８４ｍｇ）を加えた。反応液にトリエチルアミン（７２μＬ）、チオ硫酸ナトリウムを加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００／１）にて精製し、ジブロモ体２（１４１ｍｇ，収率９３％）を黄色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 4.26-4.23 (m, 1H), 4.13-4.09 (m, 1H), 3.86-3.69 (m, 2H), 2.63-2.54 (m, 1H), 1.94-1.80 (m, 2H), 1.69-1.52 (m, 3H), 1.41-1.06 (m, 16H), 1.00-0.90 (m, 24H), 0.61-0.46 (m, 12H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₃₂H₆₄Br₂O₂Si₂Na 719.26888, found 719.26995.

（１－２）トリエチル（（（１Ｒ，３ａＲ，４Ｓ，７ａＲ）－６－エチニル－７ａ－メチル－１－（（Ｒ）－６－メチル－６－（（トリエチルシリル）オキシ）ヘプタン－２－イル）オクタヒドロ－１Ｈ－インデン－４－イル）オキシ）シラン（３）の合成
アルゴン雰囲気下、ジブロモ体２（１４１ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２．０ｍＬ）に溶解し、カリウム－ｔｅｒｔ－ブトキシド（ｔ-ＢｕＯＫ、１１３ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で５分攪拌した。反応液に蒸留水（１ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００／１）にて精製し、アセチニル３（７４ｍｇ、収率７８％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 4.05 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 2.90 (td, J = 12.4, 2.7 Hz, 1H), 2.26 (dd, J = 12.6, 2.5 Hz, 1H), 2.01-1.95 (m, 1H), 1.88-1.79 (m, 1H), 1.61-1.48 (m, 1H), 1.41-1.22 (m, 4H), 1.19 (s, 6H), 1.03-0.91 (m, 24H), 0.61-0.53 (m, 12H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₁₆H₂₁D₃O₆SNa 370.1380, found 370.1413.

（１－３）エチル－４－（（３Ｒ，３ａＲ，５Ｒ，７Ｓ，７ａＲ）－３ａ－メチル－３－（（Ｒ）－６－メチル－６－（（トリエチルシリル）オキシ）ヘプタ－２－イル）－７－（（トリエチルシリル）オキシ）オクタヒドロ－１Ｈ－インデン－５－イル）ブト－３－イノエート（４）の合成
アルゴン雰囲気下、アセチニル３（７３．８ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（ＭｅＣＮ、０．３１ｍＬ）に溶解し、室温でヨウ化銅（ＣｕＩ、６．０ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）、ジアゾ酢酸エチル（２５μＬ，０．２４ｍｍｏｌ）を加え、室温で一日攪拌した。溶媒留去したのちに、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００／１）にて精製し、エステル４（７５ｍｇ，収率７６％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 4.28-4.14 (m, 3H), 4.03 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.25-3.21 (m, 2H), 2.90 (t, J = 12.4 Hz, 1H), 2.23 (dd, J = 12.4, 2.7 Hz, 1H), 2.00-1.92 (m, 1H), 1.86-1.77 (m, 1H), 1.61-1.04 (m, 22H), 1.02-0.82 (m, 24H), 0.55 (qd, J = 7.9, 1.5 Hz, 12H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₃₆H₆₈O₃Si₂Na 643.45538, found 643.45886.

（１－４）４－（（３Ｒ，３ａＲ，５Ｒ，７Ｓ，７ａＲ）－３ａ－メチル－３－（（Ｒ）－６－メチル－６－（（トリエチルシリル）オキシ）ヘプタン－２－イル）－７－（（トリエチルシリル）オキシ）オクタヒドロ－１Ｈ－インデン－５－イル）ブト－３－イル－ｌ－オール（５）の合成
アルゴン雰囲気下、エステル４（７５ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．１２ｍＬ）に溶解し、リチウムアルミニウムヒドリド（ＬｉＡｌＨ_４、１３ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）を０℃で加え、室温で１時間攪拌した。反応液にロッシェル塩（１ｍＬ）を加え、０℃で３０分攪拌した。酢酸エチルで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２０／１）にて精製し、アルコール５（５０ｍｇ，収率６８％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 4.02 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.69-3.64 (m, 2H), 2.86 (t, J = 12.4 Hz, 1H), 2.44 (td, J = 6.2, 2.0 Hz, 2H), 2.20 (dd, J = 12.4, 2.3 Hz, 1H), 1.93-1.02 (m, 23H), 0.98-0.90 (m, 24H), 0.60-0.52 (m, 12H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₁₄H₂₃D₃O₃SiNa 296.1737, found 296.1732.

（１－５）４－（（３Ｒ，３ａＲ，５Ｒ，７Ｓ，７ａＲ）－３ａ－メチル－３－（（Ｒ）－６－メチル－６－（（トリエチルシリル）オキシ）ヘプタン－２－イル）－７－（（トリエチルシリル）オキシ）オクタヒドロ－１Ｈ－インデン－５－イル）ブト－３－イン－ｌ－イル－４－メチルベンゼンスルホネート（６）の合成
アルゴン雰囲気下、アルコール５（２７ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．４６ｍＬ）に溶解し，トリエチルアミン（４５μＬ，０．３２ｍｍｏｌ）、トシルクロリド（ｐ-ＴｓＣｌ、３５ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．６ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）を加え、室温で７時間攪拌した。反応液に蒸留水（１ｍＬ）加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００／１）にて精製し、トシル体６（２９ｍｇ，収率８７％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 7.80 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.06 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 4.01 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 2.78 (t, J = 12.4 Hz, 1H), 2.55-2.49 (m, 2H), 2.45 (s, 3H), 2.13 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 1.86-1.77 (m, 2H), 1.58-1.47 (m, 2H), 1.40-1.21 (m, 11H), 1.18 (s, 6H), 0.96-0.78 (m, 24H), 0.55 (qd, J = 7.9, 2.1 Hz, 12H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₄₁H₇₂O₅S₁Si₂Na 755.45111, found 755.45367.

（１－６）（（（１Ｒ，３ａＲ，４Ｓ，６Ｒ，７ａＲ）－６－（４－アジドブト－１－イン－１－イル）－７ａ－メチル－１－（（Ｒ）－６－メチル－６－（（トリエチルシリル）オキシ）ヘプタン－２－イル）オクタヒドロ－１Ｈ－インデン－４－イル）オキシ）トリエチルシラン（７）の合成
アルゴン雰囲気下、トシル体６（７５ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．１３ｍＬ）に溶解し、室温アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３、２０ｍｇ，０．３０８ｍｍｏｌ）を加え、７０℃で２０時間攪拌した。反応液に蒸留水（１ｍＬ）加え、酢酸エチルで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００／１）にて精製し、アジド７（５９．５ｍｇ，収率９３％）を黄色液体として得た。
¹H-NMR (301 MHz, CHLOROFORM-D) δ 4.03 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 3.35 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.86 (t, J = 12.2 Hz, 1H), 2.48 (td, J = 6.9, 2.1 Hz, 2H), 2.23-2.19 (m, 1H), 1.94-1.76 (m, 2H), 1.59-1.16 (m, 18H), 0.98-0.90 (m, 24H), 0.60-0.52 (m, 12H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₃₄H₆₅N₃O₂Si₂Na 626.45155, found 626.45130.

（１－７）（１Ｒ，３ａＲ，４Ｓ，６Ｒ，７ａＲ）－６－（４－アジドブト－１－イン－１－イル）－１－（（Ｒ）－６－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン－２－イル）－７ａ－メチルオクタヒドロ－１Ｈ－インデン－４－オール（８)の合成
アルゴン雰囲気下、アジド７（５７ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４．７ｍＬ）に溶解し，フッ化水素・トリエチルアミン錯体（ＨＦ・Ｅｔ_３Ｎ、０．６ｍＬ）を加え、室温で三日攪拌した。反応液に炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）加え、酢酸エチルで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）にて精製し、ジオール８（３６ｍｇ，収率９５％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 4.10-4.07 (m, 1H), 3.34-3.29 (m, 2H), 2.87 (t, J = 12.4 Hz, 1H), 2.47-2.40 (m, 2H), 2.25-2.17 (m, 1H), 2.04 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 1.91-1.82 (m, 1H), 1.57-1.23 (m, 15H), 1.20 (d, J = 4.6 Hz, 6H), 1.13-0.96 (m, 1H), 0.92 (t, J = 3.2 Hz, 6H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₂₂H₃₇N₃O₂Na 398.27986, found 398.27835.

（１－８）（１Ｒ，３ａＲ，６Ｒ，７ａＲ）－６－（４－アジドブト－１－イン－１－イル）－１－（（Ｒ）－６－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン－２－イル）－７ａ－メチルオクタヒドロ－４Ｈ－インデン－４－オン（９）の合成
アルゴン雰囲気下、ジオール８（３４ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．８ｍＬ）に溶解し、モレキュラーシーブス（４５ｍｇ）、Ｎ－メチルモルホリン－Ｎ－オキシド（ＮＭＯ、２３ｍｇ，０．１９８ｍｍｏｌ）を０℃で加え、２０分攪拌した。室温でテトラプロピルアンモニウムペルルテナート（ＭＳ４Ａ、１．３ｍｇ，０．００４ｍｍｏｌ）を室温で加え、３時間攪拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）にて精製し、ケトン９（３０ｍｇ，収率７８％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 3.35-3.25 (m, 2H), 2.98-2.83 (m, 1H), 2.53-2.21 (m, 5H), 2.04 (dd, J = 10.8, 4.4 Hz, 1H), 1.95-1.77 (m, 1H), 1.74-1.63 (m, 1H), 1.55-1.23 (m, 7H), 1.18 (d, J = 16.0 Hz, 4H), 0.98 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 0.91 (t, J = 3.2 Hz, 1H), 0.61 (s, 2H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₂₂H₃₅N₃O₂Na 396.26229, found 396.26270.

（１－９）（１Ｒ，３ａＲ，６Ｒ，７ａＲ）－６－（４－アジドブト－１－イン－１－イル）－７ａ－メチル－１－（（Ｒ）－６－メチル－６－（（トリエチルシリル）オキシ）ヘプタン－２－イル）オクタヒドロ－４Ｈ－インデン－４－オン（１０）の合成
アルゴン雰囲気下、ケトン９（１９．９ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（０．２６ｍＬ）に溶解し、氷冷下、２．６－ルチジン（２，６－ｌｕｔｉｄｉｎｅ、４９．３μＬ，０．４３ｍｍｏｌ）、トリフルオロメタンスルホン酸トリエチルシリル（ＴＥＳＯＴｆ、４８．１μＬ，０．２１ｍｍｏｌ）を滴下し、４時間攪拌した。反応液に蒸留水（１ｍＬ）加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）にて精製し、シリル保護体１０（１２ｍｇ，収率４９％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 3.34 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.98-2.92 (m, 1H), 2.61 (s, 1H), 2.55-2.22 (m, 6H), 1.96-1.87 (m, 1H), 1.77-1.22 (m, 11H), 1.18 (s, 6H), 0.99-0.91 (m, 12H), 0.62-0.50 (m, 9H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₁₃H₂₀D₃NOSiNa 263.1635, found 263.1632

（１－１０）（（（１Ｒ，３Ｓ，Ｚ）－５－（２－（（１Ｒ，３ａＳ，６Ｓ，７ａＲ，Ｅ）－６－（４－アジドブト－１－イン－１－イル）－７ａ－メチル－１－（（Ｒ）－６－メチル－６－（（トリエチルシリル）オキシ）ヘプタン－２－イル）オクタヒドロ－４Ｈ－インデン－４－イリデン）エチリデン）－４－メチレンシクロヘキサン－１，３－ジニル）ビス（オキシ））ビス（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシラン）（１２）の合成
アルゴン雰囲気下、Ａ環部１１（５５ｍｇ，０．０９５ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ（０．１９ｍＬ）に溶解し、－７８℃でｎ－ブチルリチウム（ｎ-ＢｕＬｉ、２．６Ｍヘキサン溶液）（３３．６μＬ，０．０９ｍｍｏｌ）を加え、２０分攪拌した。シリル保護体１０（９．３ｍｇ，０．０１９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（０．１５ｍｌ）を滴下し、－７８℃で３時間攪拌した。反応液に蒸留水（１ｍＬ）加え、酢酸エチルで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００／１）にて精製し、アセチニルアジドビタミンＤ誘導体１２（１２ｍｇ，収率７８％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 6.23 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 6.03 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 5.22-5.17 (m, 1H), 4.89-4.84 (m, 1H), 4.37 (q, J = 3.4 Hz, 1H), 4.21-4.17 (m, 1H), 3.36 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.05 (dd, J = 13.5, 3.9 Hz, 1H), 2.58-2.43 (m, 4H), 2.27-2.17 (m, 2H), 1.99-1.74 (m, 5H), 1.58 (s, 3H), 1.48-1.25 (m, 9H), 1.15 (d, J = 25.6 Hz, 6H), 1.02-0.91 (m, 10H), 0.89-0.78 (m, 16H), 0.59-0.52 (m, 10H), 0.10-0.05 (m, 15H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₄₉H₈₉N₃O₃Si₃Na 874.61094, found 874.60868

［実施例２］アセチニルニトリルビタミンＤ誘導体の合成
アセチニルニトリルビタミンＤ誘導体１７の合成手順を図３に示す。以下、各合成手順を説明する。
（２－１）５－（（３Ｒ，３ａＲ，５Ｒ，７Ｓ，７ａＲ）－３ａ－メチル－３－（（Ｒ）－６－メチル－６（（トリエチルシリル）オキシ）ヘプタン－２－イル）－７－（（トリエチルシリル）オキシ）オクタヒドロ－１Ｈ－インデン－５－イル）ペント－４－インニトリル（１３）の合成
アルゴン雰囲気下、アルキン６（３３．３ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（１．４ｍＬ）に溶解し、シアン化ナトリウム（ＮａＣＮ、１７．２ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）を加え、７０℃で３０分攪拌した。反応液に炭酸水素ナトリウム水溶液（１．０ｍＬ）加え、酢酸エチルで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２００／１）にて精製し、ニトリル１３（０．５７ｇ，収率７２％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (301 MHz, CHLOROFORM-D) δ 4.08-4.02 (m, 1H), 2.85 (s, 1H), 2.53 (s, 4H), 2.20-2.16 (m, 1H), 1.88 (t, J = 13.9 Hz, 1H), 1.62 (d, J = 32.0 Hz, 4H), 1.44-1.07 (m, 16H), 1.04-0.90 (m, 24H), 0.56 (q, J = 7.8 Hz, 12H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₁₂H₁₉D₃O₂SiNa 252.1475, found 252.1503.

（２－２）５－（（３Ｒ，３ａＲ，５Ｒ，７Ｓ，７ａＲ）－７－ヒドロキシ－３－（（Ｒ）－６－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン－２－イル）－３ａ－メチルオクタヒドロ－１Ｈ－インデン－５－イル）ペント－４－インニトリル（１４）の合成
アルゴン雰囲気下、ニトリル１３（１３ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．１ｍＬ）に溶解し，フッ化水素・トリエチルアミン錯体（０．２ｍＬ）を加え、室温で三日攪拌した。反応液に炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）加え、酢酸エチルで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）にて精製し、ジオール１４（７．２ｍｇ，収率９５％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 4.12-4.03 (m, 1H), 2.87 (t, J = 12.4 Hz, 1H), 2.54 (d, J = 16.5 Hz, 4H), 2.24-2.16 (m, 1H), 2.04 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 1.92-1.82 (m, 1H), 1.57-1.16 (m, 19H), 1.13-0.97 (m, 1H), 0.92 (t, J = 3.2 Hz, 6H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₂₃H₃₇N₁O₂Na 382.27503, found 382.27220.

（２－３）５－（（３Ｒ，３ａＲ，５Ｒ，５Ｒ，７ａＲ）－３－（（Ｒ）－６－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン－２－イル）－３ａ－メチル－７－オクソオクタヒドロ－１Ｈ－インデン－５－イル）ペント－４－イネンニトリル（１８）の合成
アルゴン雰囲気下、ジオール１４（７．２ｍｇ，０．０２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．４ｍＬ）に溶解し、モレキュラーシーブス（１０ｍｇ）、Ｎ－メチルモルホリン－Ｎ－オキシド（５．２ｍｇ，０．０４４ｍｍｏｌ）を０℃で加え、２０分攪拌した。室温でテトラプロピルアンモニウムペルルテナート（０．３ｍｇ，０．００１ｍｍｏｌ）、を室温で加え、３時間攪拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）にて精製し、ケトン１５（６．４ｍｇ，収率８５％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 2.97-2.91 (m, 1H), 2.53-2.26 (m, 9H), 1.96-1.86 (m, 1H), 1.74-1.64 (m, 2H), 1.56-1.31 (m, 8H), 1.28-1.21 (m, 7H), 1.10-1.03 (m, 1H), 0.98 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.64 (d, J = 17.4 Hz, 3H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₂₃H₃₅N₁O₂Na 380.25655, found 380.25926.

（２－４）５－（（３Ｒ，３ａＲ，５Ｒ，５Ｒ，７ａＲ）－３ａ－メチル－３－（（Ｒ）－６－メチル－６－（（トリエチルシリル）オキシ）ヘプタン－２－イル）－７－オクソオクタヒドロ－１Ｈ－インデン－５－イル）ペント－４－インニトリル（１６）の合成
アルゴン雰囲気下、ケトン１５（１４ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（０．１９ｍＬ）に溶解し，氷冷下、２．６ルチジン（１１７μＬ，０．６２ｍｍｏｌ）、トリフルオロメタンスルホン酸トリエチルシリル（７０．７μＬ，０．３１ｍｍｏｌ）を滴下し、３時間攪拌した。反応液に蒸留水（１ｍＬ）加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）にて精製し、シリル保護体１６（１２ｍｇ，収率６９％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 2.98-2.92 (m, 1H), 2.54-2.22 (m, 9H), 1.97-1.87 (m, 1H), 1.75-1.22 (m, 9H), 1.18 (s, 6H), 0.98-0.88 (m, 14H), 0.62 (s, 3H), 0.59-0.48 (m, 6H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₂₉H₄₉NO₂SiNa 494.34302, found 494.33811.

（２－５）５－（（３Ｒ，３ａＲ，５Ｓ，７ａＳ，Ｅ）－７－（（Ｚ）－２－（（３Ｓ，５Ｒ）－３，５，－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－２－メチレンシクロヘキシルインデン）エチリデン）－３ａ－メチル－３－（（Ｒ）－６－メチル－６－（（トリエチルシリル）オキシ）ヘプタン－２－イル）オクタンヒドロ－１Ｈ－インデン－５－イル）ペント－４－イネンニトリル（１７）の合成
アルゴン雰囲気下、Ａ環部１１（１０ｇ，０．０２２ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ（０．２２ｍＬ）に溶解し、－７８℃でｎブチルリチウム（２．６Ｍヘキサン溶液）（１９．４μＬ，０．０５ｍｍｏｌ）を加え、２０分攪拌した。シリル保護体１９（３２．８ｍｇ，０．０５６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（０．１５ｍｌ）を滴下し、－７８℃で３時間攪拌した。反応液に蒸留水（０．５ｍＬ）加え、酢酸エチルで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００／１）にて精製し、アセチニルアジドビタミンＤ誘導体１７（１０．１ｍｇ，収率７８％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 6.23 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 6.04 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 5.18 (s, 1H), 4.84 (s, 1H), 4.37 (s, 1H), 4.19 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 3.04 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 2.55 (s, 4H), 2.46 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 2.25-2.20 (m, 2H), 2.04-1.68 (m, 5H), 1.57 (s, 6H), 1.48-1.25 (m, 6H), 1.18 (s, 6H), 1.02-0.79 (m, 12H), 0.59-0.50 (m, 9H), 0.07-0.05 (m, 18H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₅₀H₈₉NO₃Si₃Na 858.60479, found 858.60652.

［実施例３］アセチアジドビタミンＤ誘導体のダンシル標識体１９及びアセチルニトリルビタミンＤ誘導体のダンシル標識体２１の合成
（３－１）化合物１２へのダンシルの付加

アルゴン雰囲気下、アセチルアジドビタミンＤ１２（５．０ｍｇ，０．００６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５８μＬ）、蒸留水（４μＬ）に溶解し，トリメチルホスフィン（１．０ＭＴＨＦ溶液）（３０μＬ，０．０２９ｍｍｏｌ）を加え、１時間攪拌し、溶媒留去した。残渣をジクロロメタン（１１μＬ）に溶解し、０℃でトリエチルアミン（１μＬ，０．００７ｍｍｏｌ）、ダンシルクロリド（１．７ｍｇ，０．００６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応液に蒸留水（０．２ｍｌ）を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３０／１）精製し、ダンシル標識体１８（５．１ｍｇ，収率８３％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 8.56 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.31-8.26 (m, 2H), 7.60-7.52 (m, 2H), 7.18 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 6.03 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 5.19 (s, 1H), 4.95 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 4.86 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.37 (t, J = 3.4 Hz, 1H), 4.20-4.17 (m, 1H), 3.04-2.98 (m, 2H), 2.89-2.83 (m, 6H), 2.49-1.10 (m, 42H), 0.94 (t, J = 7.8 Hz, 12H), 0.88-0.83 (m, 18H), 0.59-0.50 (m, 9H)

（３－２）化合物１８の脱保護

アルゴン雰囲気下、化合物１８（５．１ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）をメタノール（０．１６ｍＬ）に溶解し、０℃でｐ－トルエンスルホン酸（３．２ｍｇ，０．０１７ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応液に炭酸水素ナトリウム（１ｍｌ）を加え、クロロホルムで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝２０／１）にて精製し、アセチルアジドビタミンＤのダンシル標識体１９（１．８ｍｇ，収率５２％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 8.50-8.60 (1H), 8.27 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.58-7.54 (m, 2H), 6.30-6.37 (1H), 5.96-6.07 (1H), 5.34 (s, 1H), 4.99 (s, 1H), 4.35-4.49 (1H), 4.17-4.31 (1H), 3.02 (s, 2H), 2.89 (s, 6H), 2.55-2.65 (1H), 2.29-1.22 (m, 34H), 0.95 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.52 (s, 3H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₄₃H₆₀N₂O₅SNa 739.41206, found 739.41090.

（３－３）化合物１７へのダンシルの付加

アルゴン雰囲気下、アセチルニトリルビタミンＤ１７（２．４ｍｇ，０．００３ｍｍｏｌ）をジエチルエーテル（０．１ｍＬ）に溶解し、０℃で水素化アルミニウムリチウム（０．３２ｍｇ，０．００８ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分攪拌した。反応液に硫酸ナトリウム１０水和物（１ｍｇ）加え、綿栓ろ過した。残渣をジクロロメタン（５０μＬ）に溶解し、０℃でトリエチルアミン（４．７μＬ，０．０３６ｍｍｏｌ）、ダンシルクロリド（８．３ｍｇ，０．０３１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応液に蒸留水（０．２ｍｌ）を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）精製し、ダンシル標識体２０（５．１ｍｇ，収率８３％）を無色液体として得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 5.87-5.76 (m, 1H), 5.20-5.02 (m, 2H), 4.23-4.19 (m, 1H), 1.97 (s, 1H), 1.91-1.78 (m, 1H), 1.65 (dd, J = 13.8, 4.8 Hz, 1H), 0.89 (s, 18H), 0.09-0.04 (m, 12H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₂₀H₃₇D₃O₃Si₂Na 394.2653, found 394.2677.

（３－４）化合物２８の脱保護

アルゴン雰囲気下、２０（５．１ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）をメタノール（０．１６ｍＬ）に溶解し、０℃でｐ－トルエンスルホン酸（３．２ｍｇ，０．０１７ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応液に炭酸水素ナトリウム（１ｍｌ）を加え、クロロホルムで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝２０／１）にて精製し、アセチルアジドビタミンＤのダンシル標識体２１（１．８ｍｇ，収率５２％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 8.54 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.28 (q, J = 7.9 Hz, 2H), 7.59-7.51 (m, 2H), 7.19 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.35 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 6.02 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 5.32 (s, 1H), 4.98 (s, 1H), 4.91 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.44 (s, 1H), 4.22 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 3.65 (s, 2H), 3.49 (s, 2H), 3.06-2.96 (m, 3H), 2.89 (s, 6H), 2.61-1.21 (m, 30H), 0.95 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.53 (d, J = 8.2 Hz, 3H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₂₀H₃₇D₃O₃Si₂Na 394.2653, found 394.2677.

［実施例４］アセチアジドビタミンＤ誘導体２３及びアセチルニトリルビタミンＤ誘導体のニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ）標識体２５の合成
（４－１）化合物１２へのＮＢＤの付加

アルゴン雰囲気下、アセチルアジドビタミンＤ１２（５．０ｍｇ，０．００６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５８μＬ）、蒸留水（４μＬ）に溶解し，トリメチルホスフィン（１．０ＭＴＨＦ溶液）（３０μＬ，０．０２９ｍｍｏｌ）を加え、１時間攪拌し、溶媒留去した。残渣をジクロロメタン（１１μＬ）に溶解し、０℃でトリエチルアミン（１μＬ，０．００７ｍｍｏｌ）、４－フルオロ－７－ニトロベンゾフラザン（１．７ｍｇ，０．００６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応液に蒸留水（０．２ｍｌ）を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３０／１）精製し、ＮＢＤ標識体２２（５．１ｍｇ，収率８３％）を無色液体として得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 5.92-5.82 (m, 1H), 5.30-5.24 (m, 1H), 5.10 (qt, J = 5.0, 1.4 Hz, 1H), 4.42-4.38 (m, 1H), 4.33-4.28 (m, 0H), 1.99 (s, 1H), 1.93-1.73 (m, 2H), 0.90 (s, 9H), 0.11 (s, 6H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₁₄H₂₃D₃O₂SiNa 280.1788, found 280.1804.

（４－２）化合物２２の脱保護

アルゴン雰囲気下、２２（５．１ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）をメタノール（０．１６ｍＬ）に溶解し、０℃でｐ－トルエンスルホン酸（３．２ｍｇ，０．０１７ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応液に炭酸水素ナトリウム（１ｍｌ）を加え、クロロホルムで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝２０／１）にて精製し、アセチルアジドビタミンＤのＮＢＤ標識体２３（１．８ｍｇ，収率５２％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 8.51 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 6.33 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 6.25 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.04 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 5.30 (s, 1H), 4.98 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.44 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.26 (s, 1H), 3.72 (d, J = 6.9 Hz, 0H), 3.64 (s, 4H), 3.13 (s, 2H), 3.05-3.01 (m, 1H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.59 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 2.34 (t, J = 6.9 Hz, 0H), 2.26-2.17 (m, 1H), 2.04-1.91 (m, 2H), 1.79-1.67 (m, 6H), 1.46-1.34 (m, 6H), 1.26 (d, J = 11.0 Hz, 2H), 1.22 (s, 4H), 1.13 (s, 1H), 0.94 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.88-0.84 (m, 2H), 0.54 (d, J = 7.8 Hz, 3H), 0.07 (s, 1H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₃₇H₅₀N₄O₆Na 669.3628, found 669.3666.

（４－３）化合物１７へのＮＢＤの付加

アルゴン雰囲気下、アセチルニトリルビタミンＤ１７（１１．２ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）をジエチルエーテル（０．１ｍＬ）に溶解し、０℃で水素化アルミニウムリチウム（１．５ｍｇ，０．０４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分攪拌した。反応液に硫酸ナトリウム１０水和物（１ｍｇ）加え、綿栓ろ過した。残渣をアセトニトリル（０．１ｍｌ）に溶解し、０ °Ｃでトリエチルアミン（１０．９μＬ，０．０７８ｍｍｏｌ）、４－フルオロ－７－ニトロベンゾフラザン（７．１ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応液に蒸留水（０．２ｍｌ）を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）精製し、ＮＢＤ標識体２４（５．２ｍｇ，収率４０％）を無色液体として得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 5.87-5.76 (m, 1H), 5.20-5.02 (m, 2H), 4.23-4.19 (m, 1H), 1.97 (s, 1H), 1.91-1.78 (m, 1H), 1.65 (dd, J = 13.8, 4.8 Hz, 1H), 0.89 (s, 18H), 0.09-0.04 (m, 12H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₂₀H₃₇D₃O₃Si₂Na 394.2653, found 394.2677.

（４－４）化合物２４の脱保護

アルゴン雰囲気下、化合物２４（５．１ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）をメタノール（０．１６ｍＬ）に溶解し、０℃でｐ－トルエンスルホン酸（３．２ｍｇ，０．０１７ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応液に炭酸水素ナトリウム（１ｍｌ）を加え、クロロホルムで抽出し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝２０／１）にて精製し、アセチルアジドビタミンＤのＮＢＤ標識体２５（１．８ｍｇ，収率５２％）を無色液体として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 8.51 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.34 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 6.24 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.06 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 5.33 (s, 1H), 4.99 (s, 1H), 4.45 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.26 (s, 1H), 3.68 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.07 (dd, J = 13.7, 4.1 Hz, 1H), 2.59 (d, J = 13.3 Hz, 2H), 2.44 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.34-2.25 (m, 2H), 2.09-1.89 (m, 6H), 1.83-1.04 (m, 19H), 0.94 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.55 (d, J = 16.9 Hz, 3H)
HRMS (ESI, M+Na) calcd. for C₂₀H₃₇D₃O₃Si₂Na 394.2653, found 394.2677.

［実施例５］蛍光リガンドに対するＶＤＲの用量反応曲線
（５－１）化合物１９に対する反応試験
１０μＭのリコンビナントヒトＶＤＲ（Thermo Fisher Vitamin D3 Receptor Recombinant Human Protein (製品番号 A15670)）に対し、２％ＤＴＴを含む反応バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、５００ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を加え、０～２０００ｎＭの所定の濃度のＶＤＲ溶液を調製した。２０００ｎＭの蛍光リガンド（化合物１９）３０μＬに反応バッファー２７０μＬを加えて蛍光リガンド溶液と調製した。各ＶＤＲ溶液、蛍光リガンド溶液を１５μＬずつ３８４ウェルマイクロプレート（７８１２０９、グライナー社）に分注混合した。マイクロウェルプレートを室温暗所にて１４０分間静置し、各ウェルの励起波長３４２ｎｍでの蛍光スペクトルを、ＳＰＡＲＫ（登録商標）マルチ検出モードマイクロプレートリーダー（テカン社）を用いて測定した。

図５に測定結果を示す。ＶＤＲと結合する蛍光リガンドの増加に伴い、最大発光波長が低波長側にシフトし、全体の蛍光強度が増大することが確認された。

（５－２）化合物２３に対する反応試験
１０μＭのリコンビナントヒトＶＤＲに対し、２％ＤＴＴを含む反応バッファーを加え、０～２００ｎＭの所定の濃度のＶＤＲ溶液を調製した。４０００ｎＭの蛍光リガンド（化合物２３）３０μＬに反応バッファー２７０μＬを加えて蛍光リガンド溶液を調製した。各ＶＤＲ溶液、蛍光リガンド溶液を１５μＬずつ３８４ウェルマイクロプレートに分注混合した。マイクロウェルプレートを室温暗所にて１４０分間静置し、各ウェルの励起波長４８７ｎｍでの蛍光スペクトルを、ＳＰＡＲＫ（登録商標）マルチ検出モードマイクロプレートリーダーを用いて測定した。

図６に測定結果を示す。ＶＤＲと結合する蛍光リガンドの増加に伴い、全体の蛍光強度が増大することが確認された。

［実施例６］蛍光リガンド及びビタミンＤ受容体に対する１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３の用量反応曲線
（６－１）化合物１９に対する反応試験
１０ｍＭの１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３（ＭＥＲＣＩＡＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）に対し、ＤＭＳＯを加えて所定の濃度とし、さらに２％ＤＴＴを含む反応バッファーを加え、ＤＭＳＯ終濃度を５％とした（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３濃度を０．０００１～２５００００ｎＭとした）。４０００ｎＭの蛍光リガンド（化合物１９）４０μＬと１５００ｎＭのヒトＶＤＲ３μＬ、反応バッファー１５６μＬを加えた。ＶＤＲ・蛍光リガンド溶液と１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３溶液をそれぞれ１０μＬずつ３８４ウェルマイクロプレートに分注混合した。マイクロウェルプレートを室温暗所にて１４０分間静置し、各ウェルの励起波長３５０ｎｍでの蛍光スペクトルをＳＰＡＲＫ（登録商標）マルチ検出モードマイクロプレートリーダーを用いて測定した。

図７に測定結果を示す。添加する１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３量を増加させることで蛍光強度が減少することが確認された。これにより、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３の添加により、ＶＤＲと結合する蛍光リガンド量の減少、すなわち蛍光リガンドの遊離が生じることが確認された。

（６－２）化合物２３に対する反応試験
１０ｍＭの１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３に対し、ＤＭＳＯを加えて所定の濃度とし、さらに２％ＤＴＴを含む反応バッファーを加え、ＤＭＳＯ終濃度を５％とした（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３０．０２～６．６ｎＭとした）。４０００ｎＭの蛍光リガンド（化合物１９）５μＬと１ｎＭのヒトＶＤＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）３μＬ、反応バッファー９２μＬを加えた。ＶＤＲ・蛍光リガンド溶液と１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３溶液をそれぞれ１０μＬずつ３８４ウェルマイクロプレートに分注混合した。マイクロウェルプレートを室温暗所にて１４０分間静置し、各ウェルの励起波長４７０ｎｍでの蛍光スペクトルをＳＰＡＲＫ（登録商標）マルチ検出モードマイクロプレートリーダーを用いて測定した。

図８に測定結果を示す。添加する１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３量を増加させることで蛍光強度が減少することが確認された。これにより、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３の添加により、ＶＤＲと結合する蛍光リガンド量の減少、すなわち蛍光リガンドの遊離が生じることが確認された。

［実施例７］ＶＤＲと化合物１９とのＦＲＥＴ試験
（７－１）ＶＤＲ量による化合物１９の蛍光スペクトルの変化
１０μＭのリコンビナントヒトＶＤＲ（Thermo Fisher Vitamin D3 Receptor Recombinant Human Protein (製品番号 A15670)）に対し、２％ＤＴＴを含む反応バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、５００ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を加え、０～４０００ｎＭの所定の濃度のＶＤＲ溶液を調製した。２０００ｎＭの蛍光リガンド（化合物１９）３０μＬに反応バッファー２７０μＬを加えて蛍光リガンド溶液と調製した。各ＶＤＲ溶液、蛍光リガンド溶液を１５μＬずつ３８４ウェルマイクロプレート（７８１２０９、グライナー社）に分注混合した。マイクロウェルプレートを室温暗所にて１４０分間静置し、各ウェルの励起波長２８０ｎｍでの蛍光スペクトルを、ＳＰＡＲＫ（登録商標）マルチ検出モードマイクロプレートリーダー（テカン社）を用いて測定した。

図９に測定結果を示す。トリプトファンの励起波長である２８０ｎｍの光照射で、ＶＤＲ濃度依存的にダンシルの蛍光波長に相当する５２０ｎｍ付近の蛍光強度が上昇していることが確認され、これによりＦＲＥＴが生じていることが確認できた。ダンシルの蛍光は疎水性環境下で低波長側にシフトすることが知られるが、図９においてダンシルの極大蛍光波長がＶＤＲ濃度依存的に低波長側にシフトしていることから、ダンシルがＶＤＲ近傍に局在していることが示唆された。

（７－２）１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３添加による競合試験
１０ｍＭの１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３（ＭＥＲＣＩＡＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）に対し、ＤＭＳＯを加えて所定の濃度とし、さらに２％ＤＴＴを含む反応バッファーを加え、ＤＭＳＯ終濃度を５％とした（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３濃度を０．０００１～２５００００ｎＭとした）。４０００ｎＭの蛍光リガンド（化合物１９）４０μＬと１５００ｎＭのヒトＶＤＲ３μＬ、反応バッファー１５６μＬを加えた。ＶＤＲ・蛍光リガンド溶液と１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３溶液をそれぞれ１０μＬずつ３８４ウェルマイクロプレートに分注混合した。マイクロウェルプレートを室温暗所にて１４０分間静置し、各ウェルの励起波長２８０ｎｍでの蛍光スペクトルをＳＰＡＲＫ（登録商標）マルチ検出モードマイクロプレートリーダーを用いて測定した。

図１０に測定結果を示す。励起波長２８０ｎｍより発せられる極大波長５００ｎｍ付近の蛍光は、添加する１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３量の増加により低下したことから、ＶＤＲと蛍光リガンドと結合により生じる蛍光であることが確認された。

Claims

下記式（Ｉ）で表される化合物：

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^２は水素、エーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５のアルコキシ基である；Ｒ^３は水素又は水酸基である；Ｌはリンカーである；Ｍは標識分子である）。
前記リンカーが炭素数２～１０の炭素鎖に相当する長さを有する、請求項１に記載の化合物。
下記式（ＩＩ）で表される化合物である、請求項１に記載の化合物：

（式中、Ｍは標識分子である）。
下記式（ＩＩＩ）で表される化合物である、請求項１に記載の化合物：

（式中、Ｍは標識分子である）。
下記式（ＩＶ）で表される化合物である、請求項１に記載の化合物：

（式中、Ｍは標識分子である）。
ビタミンＤ受容体への結合親和性を有する、請求項１に記載の化合物。
標識分子が、環境応答型蛍光分子である、請求項１に記載の化合物。
標識分子が、下記式（Ｖ）～（ＩＸ）で表される化合物及びこれらの誘導体からなる群より選択される、少なくとも１つの化合物である、請求項７に記載の化合物。
標識分子が、波長３５０ｎｍの光照射で蛍光を発する蛍光分子である、請求項１に記載の化合物。
請求項１に記載の化合物の中間化合物である、下記式（Ｘ）で表される化合物：

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^５はアジド基又はシアノ基である；Ｌはリンカーである）。
請求項１に記載の化合物を合成する方法であって、下記工程（ａ）～（ｄ）を含む、方法：
（ａ）下記式（ＸＩ）で表される化合物を提供する工程：

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^４は－Ｏ－Ｐ（Ｐは保護基）である）；
（ｂ）上記式（ＸＩ）で表される化合物より、下記式（Ｘ）で表される化合物を取得する工程；

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^５はアジド基又はシアノ基である；Ｌはリンカーである）；
（ｃ）上記式（Ｘ）で表される化合物を下記式（ＸＩＩ）で表される化合物と反応させて下記式（ＸＩＩＩ）で表される化合物を取得する工程；及び

（式中、Ｒ^２は水素、エーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５のアルコキシ基である；Ｒ^６は－Ｏ－Ｐ（Ｐは保護基）である；Ｒ^７は水素又は－Ｏ－Ｐ（Ｐは保護基）である；Ｒ^８及びＲ^９は、それぞれ独立に炭素数２～８の飽和又は不飽和の炭化水素である）、

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^２は水素、エーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５のアルコキシ基である；Ｒ^５はアジド基又はシアノ基である；Ｒ^６は－Ｏ－Ｐ（Ｐは保護基）である；Ｒ^７は水素又は－Ｏ－Ｐ（Ｐは保護基）である；Ｌはリンカーである）
（ｄ）上記式（ＸＩＩＩ）で表される化合物に標識分子を結合させ、脱保護を行い、下記式（Ｉ）で表される化合物を得る工程：

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^２は水素、エーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５のアルコキシ基である；Ｒ^３は水素又は水酸基である；Ｌはリンカーである；Ｍは標識分子である）。
対象化合物のビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）に対する結合親和性を評価する方法であって、下記工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む、方法：
（ｉ）下記式（Ｉ）で表され、かつ、ＶＤＲに対する結合親和性を有する標識リガンドを提供する工程：

（式中、Ｒ^１はエーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～１０のアルコキシ基である；Ｒ^２は水素、エーテル結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５の飽和若しくは不飽和の炭化水素基、又は不飽和結合を有してもよい置換若しくは非置換の炭素数１～５のアルコキシ基である；Ｒ^３は水素又は水酸基である；Lはリンカーである；Ｍは標識分子である）；
（ｉｉ）ＶＤＲ、前記標識リガンド、及び対象化合物を反応させる工程；
（ｉｉｉ）前記標識分子の所定のシグナルを定量する工程。
前記リンカーが炭素数２～１０の炭素鎖に相当する長さを有する、請求項１２に記載の方法。
前記標識リガンドが、下記式（ＩＩ）で表される化合物である、請求項１２に記載の方法：

（式中、Ｍは標識分子である）。
前記標識リガンドが、下記式（ＩＩＩ）で表される化合物である、請求項１２に記載の方法：

（式中、Ｍは標識分子である）。
標識分子が、環境応答型蛍光分子である、請求項１２に記載の方法。
標識分子が、下記式（Ｖ）～（ＩＸ）で表される化合物及びこれらの誘導体からなる群より選択される、少なくとも１つの化合物である、請求項１６に記載の方法。
標識分子が、波長３５０ｎｍの光照射で蛍光を発する蛍光分子である、請求項１２に記載の方法。
複数の候補化合物群からビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）結合親和性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
各候補化合物を対象化合物として、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の方法でＶＤＲ結合親和性を評価して、高いＶＤＲ結合親和性を有する化合物を選定することを含む、方法。
請求項１～１０のいずれか１項に記載の化合物、及びビタミンＤ受容体を含む、対象化合物のＶＤＲ結合親和性を評価するためのキット。