JP2023105775A - 二酸化炭素がシェワネラ・プトレファシエンスの腐敗作用を抑制する効果を測定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)菌液活性化:凍結保存されたシェワネラ・プトレファシエンス種を取り出して解凍し、そしてトリプトン大豆ブロス(trypticase soy broth,TSB)培地に加え、シェーカーで振盪しながら10~14時間培養し、一次培養液を得、
(2)細菌懸濁液の調製:一次培養液を液体培地に接種し、再度シェーカーで振盪しながら4~8h培養し、細菌濃度が106~108CFU/mLの細菌懸濁液を作成し、
(3)試料の準備及び処理:水産物食材を用意し、処理した後、複数の質量が80~120gのシート状食材にカットし、そして0~4℃の水で洗浄して水切りし、試料を作成し、
(4)細菌接種処理:複数の試料をエタノール溶液に20~40s浸漬した後、取り出し、無菌蒸留水で2~4回洗浄し、さらに紫外線で15~25min殺菌し、複数の殺菌試料を得、細菌懸濁液を細菌濃度103~105CFU/mLに希釈し、そして希釈後の細菌懸濁液を用いて殺菌試料に対して細菌接種処理を行い、複数の細菌接種処理試料を得、
(5)袋への包装:複数の細菌接種処理試料をそれぞれガス置換包装袋に入れ、
(6)ガス置換包装:袋式ガス置換包装機を起動し、真空ポンプを起動し、ガス置換包装モードで包装し、包装時の鮮度保持ガス中のCO2の体積百分率が0~100%であり、残部がN2であり、
(7)冷蔵庫での冷蔵:包装した後の細菌接種処理試料を冷蔵庫に置き、4.0±0.5℃条件下で保存し、
(8)性能測定:包装した細菌接種処理試料をサンプルとし、それぞれ0~18日間保存した後に、ランダムに3つのサンプルを選択して並行群とし、並行群を検出し、異なるCO2濃度の鮮度保持ガス条件下でのシェワネラ・プトレファシエンスの腐敗作用に対する抑制効果を測定する。
(1)サンプル5.00gを取り、45mL滅菌生理食塩水に入れて均一に混合し、均一希釈液を作成する。(2)1mL滅菌ピペットにて均一希釈液1mLを吸い取り、壁に沿って9mL滅菌生理食塩水を注入して10倍希釈し、一次サンプル希釈液を作成する。(3)一次サンプル希釈液を均一希釈液としてステップ(2)を繰り返し、二次サンプル希釈液を作成する。上記のように、三次サンプル希釈液から十次サンプル希釈液を作成する。(4)一次サンプル希釈液から十次サンプル希釈液の中から3つのサンプル希釈液をランダムに選択し、それぞれ1mL吸い取って滅菌シャーレに入れるとともに、それぞれ1mL滅菌生理食塩水を吸い取って2つの滅菌シャーレに入れ、開口のままでクリーンベンチ内に置き、ブランク対照とする。(5)15~20mLのプレートカウント寒天培地を45±0.5℃に冷却し、前記滅菌シャーレを注入し、回転して均一に混合する。寒天が凝固した後、プレートを温度が30±1℃の生化学的インキュベータに逆さまに置いて72±3時間培養する。(6)プレートカウント法によりシャーレ内のコロニー総数を測定し、滅菌生理食塩水をブランクとして対照実験を行う。培養終了後に、コロニー総数が30~300のシャーレを選択してカウントする。
1mLサンプルを取って48マイクロウェルプレートに入れ、4.0±0.5℃の条件下で24時間静置培養した後、上清液を取り除き、残りの部分を滅菌リン酸緩衝液で2回洗浄して浮遊菌を除去する。前記滅菌リン酸緩衝液の濃度は0.01M、pH値=7.0である。洗浄後の材料を50±1℃で30min乾燥させ、そして濃度0.2%のクリスタルバイオレット染色液で15min染色して染色材料を得る。染色材料を水で洗浄して付着していないクリスタルバイオレット染色液を除去し、その後、50±1℃で30min乾燥させ、そして質量濃度95%のエタノール溶液に5min浸漬することでバイオフィルムに付着したクリスタルバイオレットをエタノール溶液に溶解する。クリスタルバイオレットが溶解されたエタノール溶液に対して600nmでの吸光度を測定し、吸光度の変化によりバイオフィルムの成長状況を示す。
アデノシン三リン酸キットによりサンプルのシェワネラ・プトレファシエンスアデノシン三リン酸濃度を測定する。
2gサンプルを20mL冷蔵Tris-bufferAと均一に混合する。前記冷蔵Tris-bufferA中のKCl濃度は0.05M、Tris-maleate濃度は20mM、pH値は7.0である。そして、回転速度10000×g及び温度4℃の条件下で15min遠心分離して上清液を除去し、残りの材料に対して上記のように1回繰り返し、沈殿物を得る。沈殿物を20mL冷蔵Tris-bufferBと均一に混合する。前記冷蔵Tris-bufferB中のKCl濃度は0.6M、Tris-maleate濃度は20mM、pH値は7.0である。そして、4℃の条件下で3時間浸出し、浸出物を10000×gの条件下で15min遠心分離し、遠心分離して得られた上清液は筋原線維タンパク質抽出液である。総スルフヒドリル基含有量キットを用いて筋原線維タンパク質抽出液におけるスルフヒドリル基含有量を測定する。
筋原線維タンパク質抽出液を得た後、それを凍結乾燥し、凍結乾燥筋原線維タンパク質溶液を得る。蛍光分光光度計を用いてエミッション走査モードで凍結乾燥筋原線維タンパク質溶液を走査する。励起波長を295nm、発光波長を300~410 nmに設定して異なる群の凍結乾燥筋原線維タンパク質溶液の内因性蛍光強度(intrinsic fluorescence intensity,IFI)を測定して三次構造を表す。
サンプルをサイズが3mm×3mm×1.5mmの切断サンプルにカットし、切断サンプルに質量濃度2.5%のグルタルアルデヒド溶液を加え、4℃の条件下で24時間固定し、浸出した後、液体部分を除去し、浸出後の切断サンプルを得る。0.1mol/LのpH値7.3のリン酸緩衝液で浸出後切断サンプルを毎回15minで3回すすぎ、洗浄サンプルを得る。前記リン酸緩衝液の濃度は0.1M、pH値は7.3である。そして、体積百分率がそれぞれ30%、50%、70%、80%、90%、95%及び100%のエタノール溶液を用いて順に洗浄サンプルを勾配溶出し、さらに、酢酸イソアミルで洗浄サンプル表面を洗浄してエタノールを置換し、処理サンプルを得る。処理サンプルを凍結乾燥し、イオンスパッタ装置において1min金属スパッタした後、20kV加速電圧で走査型電子顕微鏡により観察する。処理サンプルをサイズ1mm×1mm×1mmの二次切断サンプルにカットし、質量濃度2.5%のグルタルアルデヒド溶液で固定した後、リン酸塩緩衝液及び体積百分率がそれぞれ70%、80%、95%、100%のエタノール溶液を用いて順に浸漬溶出する。固定ステップ及びそれぞれの浸漬溶出ステップの時間は10minである。さらに、エポキシ樹脂で包埋し、最後に、透過型電子顕微鏡により観察する。
サンプルをサイズ15mm×15mm×15mmの切断サンプルにカットし、TPAモードで測定する。測定の設定パラメータは以下の通りである。測定前のプローブ下降速度が2.00mm/s、測定速度が1.00mm/s、測定後のプローブ戻り速度が5.00mm/s、圧縮比が40%、トリガー力が5.0g、プローブタイプがp/5、データ採取速度が200.00points/sである。各群のサンプルについて3回の並行実験を行い、平均値を硬度値として求める。
凍結保存されたシェワネラ・プトレファシエンス種を取り出して解凍した後、トリプトン大豆ブロス培地に加え、シェーカーで振盪しながら12時間培養し、一次培養液を得る。凍結保存の温度は≦-80℃、解凍温度は30±2℃、トリプトン大豆ブロス培地の使用量は5~10mLである。
(1)サンプル5.00gを取り、45mL滅菌生理食塩水に入れて均一に混合し、均一希釈液を作成する。(2)1mL滅菌ピペットにて均一希釈液1mLを吸い取り、壁に沿って9mL滅菌生理食塩水を注入して10倍希釈し、一次サンプル希釈液を作成する。(3)一次サンプル希釈液を均一希釈液としてステップ(2)を繰り返し、二次サンプル希釈液を作成する。上記のように、三次サンプル希釈液から十次サンプル希釈液を作成する。(4)一次サンプル希釈液から十次サンプル希釈液の中から3つのサンプル希釈液をランダムに選択し、それぞれ1mL吸い取って滅菌シャーレに入れるとともに、それぞれ1mL滅菌生理食塩水を吸い取って2つの滅菌シャーレに入れ、開口のままでクリーンベンチ内に置き、ブランク対照とする。(5)15~20mLのプレートカウント寒天培地を45±0.5℃に冷却し、前記滅菌シャーレを注入し、回転して均一に混合する。寒天が凝固した後、プレートを温度が30±1℃の生化学的インキュベータに逆さまに置いて72±3時間培養する。(6)プレートカウント法によりシャーレ内のコロニー総数を測定し、滅菌生理食塩水をブランクとして対照実験を行う。培養終了後に、コロニー総数が30~300のシャーレを選択してカウントする。
1mLサンプルを取って48マイクロウェルプレートに入れ、4.0±0.5℃の条件下で24時間静置培養した後、上清液を取り除き、残りの部分を滅菌リン酸緩衝液で2回洗浄して浮遊菌を除去する。前記滅菌リン酸緩衝液の濃度は0.01M、pH値=7.0である。洗浄後の材料を50±1℃で30min乾燥させ、そして濃度0.2%のクリスタルバイオレット染色液で15min染色して染色材料を得る。染色材料を水で洗浄して付着していないクリスタルバイオレット染色液を除去し、その後、50±1℃で30min乾燥させ、そして質量濃度95%のエタノール溶液に5min浸漬することでバイオフィルムに付着したクリスタルバイオレットをエタノール溶液に溶解する。クリスタルバイオレットが溶解されたエタノール溶液に対して600nmでの吸光度を測定し、吸光度の変化によりバイオフィルムの成長状況を示す。
アデノシン三リン酸キットによりサンプルのシェワネラ・プトレファシエンスアデノシン三リン酸濃度を測定する。
2gサンプルを20mL冷蔵Tris-bufferAと均一に混合する。前記冷蔵Tris-bufferA中のKCl濃度は0.05M、Tris-maleate濃度は20mM、pH値は7.0である。そして、回転速度10000×g及び温度4℃の条件下で15min遠心分離して上清液を除去し、残りの材料に対して上記のように1回繰り返し、沈殿物を得る。沈殿物を20mL冷蔵Tris-bufferBと均一に混合する。前記冷蔵Tris-bufferB中のKCl濃度は0.6M、Tris-maleate濃度は20mM、pH値は7.0である。そして、4℃の条件下で3時間浸出し、浸出物を10000×gの条件下で15min遠心分離し、遠心分離して得られた上清液は筋原線維タンパク質抽出液である。総スルフヒドリル基含有量キットを用いて筋原線維タンパク質抽出液におけるスルフヒドリル基含有量を測定する。
筋原線維タンパク質抽出液を得た後、それを凍結乾燥し、凍結乾燥筋原線維タンパク質溶液を得る。蛍光分光光度計を用いてエミッション走査モードで凍結乾燥筋原線維タンパク質溶液を走査する。励起波長を295nm、発光波長を300~410 nmに設定して異なる群の凍結乾燥筋原線維タンパク質溶液の内因性蛍光強度(intrinsic fluorescence intensity,IFI)を測定して三次構造を表す。
サンプルをサイズが3mm×3mm×1.5mmの切断サンプルにカットし、切断サンプルに質量濃度2.5%のグルタルアルデヒド溶液を加え、4℃の条件下で24時間固定し、浸出した後、液体部分を除去し、浸出後の切断サンプルを得る。0.1mol/LのpH値7.3のリン酸緩衝液で浸出後切断サンプルを毎回15minで3回すすぎ、洗浄サンプルを得る。前記リン酸緩衝液の濃度は0.1M、pH値は7.3である。そして、体積百分率がそれぞれ30%、50%、70%、80%、90%、95%及び100%のエタノール溶液を用いて順に洗浄サンプルを勾配溶出し、さらに、酢酸イソアミルで洗浄サンプル表面を洗浄してエタノールを置換し、処理サンプルを得る。処理サンプルを凍結乾燥し、イオンスパッタ装置において1min金属スパッタした後、20kV加速電圧で走査型電子顕微鏡により観察する。処理サンプルをサイズ1mm×1mm×1mmの二次切断サンプルにカットし、質量濃度2.5%のグルタルアルデヒド溶液で固定した後、リン酸塩緩衝液及び体積百分率がそれぞれ70%、80%、95%、100%のエタノール溶液を用いて順に浸漬溶出する。固定ステップ及びそれぞれの浸漬溶出ステップの時間は10minである。さらに、エポキシ樹脂で包埋し、最後に、透過型電子顕微鏡により観察する。
サンプルをサイズ15mm×15mm×15mmの切断サンプルにカットし、TPAモードで測定する。測定の設定パラメータは以下の通りである。測定前のプローブ下降速度が2.00mm/s、測定速度が1.00mm/s、測定後のプローブ戻り速度が5.00mm/s、圧縮比が40%、トリガー力が5.0g、プローブタイプがp/5、データ採取速度が200.00points/sである。各群のサンプルについて3回の並行実験を行い、平均値を硬度値として求める。
以下の相違点以外、方法は実施例1と同様である。
(1)シェーカーで振盪しながら10時間培養する。
(2)液体培地に接種し、さらにシェーカーで振盪しながら4時間培養し、細菌濃度が108CFU/mLの細菌懸濁液を作成する。接種量は0.5%(質量百分率)である。
(3)複数の質量80gのシート状食材にカットする。
(4)エタノール溶液に20s浸漬し、無菌蒸留水で4回洗浄し、紫外線で15min殺菌する。細菌懸濁液を細菌濃度103CFU/mLに希釈する。エタノール溶液の質量濃度が70%、エタノール溶液の使用量は、質量比でエタノール溶液:試料=2:1である。希釈後の細菌懸濁液が殺菌試料質量の5%となるように、殺菌試料の細菌含有量を≦105CFU/mLにする。
(5)それぞれのガス置換包装袋内の鮮度保持ガス体積と細菌接種処理試料の質量との比を2mL/g、真空引き時間を5s、充気時間を3s、ヒートシール口温度を150℃、鮮度保持ガス源圧力を4kg/cm2、パワーガス源圧力を7kg/cm2に設定する。
以下の相違点以外、方法は実施例1と同様である。
(1)シェーカーで振盪しながら14時間培養する。
(2)液体培地に接種し、さらにシェーカーで振盪しながら8時間培養し、細菌濃度が106CFU/mLの細菌懸濁液を作成する。接種量は1.5%(質量百分率)である。
(3)複数の質量120gのシート状食材にカットする。
(4)エタノール溶液に40s浸漬し、無菌蒸留水で2回洗浄し、紫外線で25min殺菌する。細菌懸濁液を細菌濃度105CFU/mLに希釈する。エタノール溶液の質量濃度が80%、エタノール溶液の使用量は、質量比でエタノール溶液:試料=4:1である。希釈後の細菌懸濁液は殺菌試料質量の15%であり、殺菌試料の細菌含有量は≦105CFU/mLである。
(5)それぞれのガス置換包装袋内の鮮度保持ガス体積と細菌接種処理試料の質量との比を4mL/g、真空引き時間を15s、充気時間を5s、ヒートシール口温度を125℃、鮮度保持ガス源圧力を6kg/cm2、パワーガス源圧力を8kg/cm2に設定する。
Claims (7)
- 以下のステップを含むシェワネラ・プトレファシエンスの腐敗作用に対する二酸化炭素の抑制を測定する方法であって、
(1)菌液活性化:凍結保存されたシェワネラ・プトレファシエンス種を取り出して解凍し、そしてトリプトン大豆ブロス(trypticase soy broth,TSB)培地に加え、シェーカーで振盪しながら10~14時間培養し、一次培養液を得、
(2)細菌懸濁液の調製:一次培養液を液体培地に接種し、再度シェーカーで振盪しながら4~8h培養し、細菌濃度が106~108CFU/mLの細菌懸濁液を作成し、
(3)試料の準備及び処理:水産物食材を用意し、処理した後、複数の質量が80~120gのシート状食材にカットし、そして0~4℃の水で洗浄して水切りし、試料を作成し、
(4)細菌接種処理:複数の試料をエタノール溶液に20~40s浸漬した後、取り出し、無菌蒸留水で2~4回洗浄し、さらに紫外線で15~25min殺菌し、複数の殺菌試料を得、細菌懸濁液を細菌濃度103~105CFU/mLに希釈し、そして希釈後の細菌懸濁液を用いて殺菌試料に対して細菌接種処理を行い、複数の細菌接種処理試料を得、
(5)袋への包装:複数の細菌接種処理試料をそれぞれガス置換包装袋に入れ、
(6)ガス置換包装:袋式ガス置換包装機を起動し、真空ポンプを起動し、ガス置換包装モードで包装し、包装時の鮮度保持ガス中のCO2の体積百分率が0~100%であり、残部がN2であり、
(7)冷蔵庫での冷蔵:包装した後の細菌接種処理試料を冷蔵庫に置き、4.0±0.5℃条件下で保存し、
(8)性能測定:それぞれ0~18日間保存した後に、ランダムに3つのサンプルを選択して並行群とし、並行群を検出し、異なるCO2濃度の鮮度保持ガス条件下でのシェワネラ・プトレファシエンスの腐敗作用に対する抑制効果を測定することを特徴とする、方法。 - ステップ(1)において、トリプトン大豆ブロス培地の使用量は5~10mLであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ステップ(2)において、接種量は、質量百分率で0.5~1.5%であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ステップ(4)において、エタノール溶液の質量濃度は70~80%であり、エタノール溶液と試料の質量比は(2~4):1であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ステップ(4)において、細菌接種処理では、希釈後の細菌懸濁液が殺菌試料の質量の5~15%となるように、殺菌試料の細菌含有量を≦105CFU/mLにすることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ステップ(6)において、包装する際に、それぞれのガス置換包装袋内の鮮度保持ガス体積と細菌接種処理試料の質量との比を2~4mL/g、真空引き時間を5~15s、充気時間を3~5s、ヒートシール口温度を125~150℃、鮮度保持ガス源圧力を4~6kg/cm2、パワーガス源圧力を7~8kg/cm2に設定し、袋式ガス置換包装機の動作が安定した後、細菌接種処理試料が入ったガス置換包装袋の袋口をガス置換及びヒートシール口に置き、ガス置換包装を行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ステップ(8)において、検出項目は、コロニー総数、バイオフィルム、アデノシン三リン酸含有量、スルフヒドリル基含有量、筋原線維タンパク質の三次構造、筋原線維タンパク質の超微細構造及び硬度値であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
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APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 66, no. 8, JPN6023009051, 2000, pages 3528 - 3534, ISSN: 0005007574 * |
INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY, vol. 19, JPN6023009052, 1993, pages 283 - 294, ISSN: 0005007575 * |
INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY, vol. 26, JPN6023009053, 1995, pages 305 - 317, ISSN: 0005007576 * |
LWT - FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, vol. 140, 110741, JPN6023009049, 2021, pages 1 - 10, ISSN: 0005007572 * |
食品科学, vol. 31, no. 20, JPN6023009050, 2010, pages 355 - 359, ISSN: 0005007573 * |
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