JP2023088809A - 覚醒小動物の長時間の生体結像のための装置 - Google Patents
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Abstract
Description
動物の長時間の生体結像のための装置及び方法に関する。主に、齧歯目(例えば、マウス
、ラット、モルモットなど)、ウサギ目(例えば、ウサギ、ナキウサギなど)、小型霊長
類(例えば、マーモセットなど)などの小型実験用動物、特に覚醒状態にある生体の長時
間の結像に用いられ、覚醒又は麻酔後の小型実験用動物の体内の血流、様々なタイプの細
胞、イオンの動的変化過程を研究する。
、生体研究では、二光子顕微鏡を使用して動物生体組織に対して動的観察を行うことが重
要な研究手段である。二光子顕微鏡は、レーザー共焦点顕微鏡と二光子励起技術の利点を
兼ねて備えており、短波長よりも細胞への光毒性が小さく、透過能力が強く、且つ焦点面
の蛍光分子のみが励起されることが可能である長波長励起を利用するため、二光子顕微鏡
は、通常の蛍光顕微鏡よりも、厚い標本、生細胞又は生体標本の観察に適する。二光子顕
微鏡を利用することで、標本に対する多色、長時間、多時刻の観察を実現することができ
る。従来の方法は、局所組織を採取して相応な培養液に入れて観察するか、又は小動物に
麻酔をかけた後、小動物の固定装置を利用して局所を固定した後、二光子顕微鏡で観察す
る。しかし、実際には、小動物の実際の生理学的状態及び変化は、覚醒、自由に動く状態
のみにおいて、より正確に観察し記録することができる。既存の研究装置の制限により、
覚醒、自由に動く状態での小動物の観察は、二光子顕微鏡結像の課題となる。一般的な動
物固定装置の殆どは、麻酔状態にある小動物の結像に用いられる。既存の固定装置では、
小動物は通常、歯科用セメントを介して結像プラットフォームに接着され、小動物は自由
に動くことができず、肢体は底板の上に摩擦するしかできなく、前後に動くことができな
く、小動物はもがいて運動する過程において、接着箇所に反力がかかり、接着箇所の緩み
を招き且つ大きな振動を引き起こしやすく、結像焦点面の不安定をもたらす。そのため、
通常は、動物に麻酔をかけて、動物に静止状態を保持させる必要がある。既存の方法は、
覚醒、自由に動く状態にある小動物に対する長時間の動的観察を実現することが困難であ
る。
装置及び方法を提供する。この装置及び方法は、結像過程の安定性を確保することができ
るとともに、小動物が覚醒、自由に動く状態において、長時間の安定的な結像を確保する
ことができ、様々なサイズの動物に応じて柔軟に調整して適合することができ、通常の生
理学的状態において結像と信号記録を実現することができる。
振ステージに固定されるベースと、ベースに設けられる固定柱と、前記固定柱を介してベ
ースに取り付けられる結像プラットフォームとを含み、前記ベースに可動クローラがさら
に設けられる。小動物がその上に自由に動いたり、走ったり、又は与えられた刺激に応じ
て相応な運動をしたりするように、前記可動クローラは柔軟に転動することができること
を特徴とする。
され、ローラはベアリングを介して平行に角溝内に取り付けられ、クローラは全てのロー
ラに穿設される。
規則な孔であり、中央の比較的に大きい結像孔と外縁の二つの刺激及び信号記録孔からな
る。
円の円心と固定孔の円心は重ね合わせており、前記固定孔と弧状孔はいずれも可動クロー
ラを取り付けるために用いられる。
開孔に対応して設けられ、前記負圧チューブに負圧ポンプが接続され、負圧ポンプをオン
にすると、前記開孔の近くは負圧状態になる。
水布又はスポンジであり、前記洗浄バーは、結像プラットフォームの表面の液体を吸収す
るために用いられる。
音声プレイヤーが設けられ、前記ビデオプレイヤーは、小動物に視覚刺激を与えて、視覚
刺激を受けた小動物の生体結像を観察するために用いられる。前記音声プレイヤーは、音
声を再生し、小動物に聴覚刺激与えて、聴覚刺激を受けた小動物の生体結像を観察するた
めに用いられる。
カバーが設けられ、前記カバーに複数の通気孔が設けられ、前記凹溝は、刺激臭のある食
品を配置するために用いられ、小動物に味覚刺激を与えて、味覚刺激を受けた小動物の生
体結像を観察する。
ームの底部によりも近く、前記電気ヒータ線は、開孔領域を加熱するために用いられ、結
像領域に対する温度の影響を観察することが便利である。
ング内に電球が設けられ、前記電球はリード線を介して外部電源に接続され、前記リード
線は結像固定プラットフォームを貫通し、前記照明リングは透明材質であり、前記照明リ
ングは開孔の形状に適合しており、前記照明装置は、開孔内に光線を提供し、開孔内の明
るい視野を確保するために用いられる。
、前記通風路は孔内側に連通され、前記通風路にファンが接続される。
することができ、前記電極シートの外側に電源が接続され、前記電極シートは小動物に電
流刺激を与えて、電気刺激を受けた小動物の生体結像を観察することができる。
対する圧力を測定するために用いられる。対象となる小動物の興奮度が高いほど、落ち着
かなくなり、前後に動き易く、それによって圧力センサに影響を与える。圧力センサによ
って測定されたデータから小動物の興奮度を判断する。圧力センサによって測定されたデ
ータの極値が大きいほど、小動物の興奮度が高いことを表し、極値が小さいほど、小動物
の興奮度が比較的に低いことを表す。
、前記音波エミッタは、超音波、音波和低周波音を発射することができる。ここの音波と
は、周波数が20Hz~20kHzの間の音波を意味し、超音波とは、周波数が20kH
zよりも大きい音波を意味し、低周波音とは、周波数が20Hzよりも小さい音波を意味
する。異なる周波数の音波を発射し、音波の振幅などのパラメータを調節することによっ
て、覚醒小動物の結像状況を記録して、関連情報とデータを取得する。
を含む。
プラットフォームに固定し、小動物の残りの肢体を可動クローラに位置させる。
下に位置させる。
領域の刺激に対する反応状況を観察することができる。
どに柔軟に適合することができる。
に固定された状態でも、残りの部分は自由に前後に転がることができ、小動物の前後移動
を実現し、接着部分に非常に大きな反力をかかることもなく、結像プラットフォームの振
動を引き起こさず、結像焦点面の安定に影響を与えない。覚醒状態にある小動物に対して
安定した結像を行うことができ、特に、同期投薬刺激又は電気生理学的信号の記録を行う
ことができ、小動物の実際の生理学的状態及び変化をより正確に観察及び記録することが
できる。なお、麻酔状態にある小動物にも適用する。
がなく、依然として前後に自由に動くことができる。
て記録を行うことができる。
によって圧力センサに影響を与える。圧力センサによって測定されたデータから小動物の
興奮度を判断する。
。
板6、結像固定プラットフォーム2、柱5、可動クローラ7などを含む。覚醒状態にある
小動物の自由の動きを考慮して、本発明の装置は可動クローラ7を備えるとともに、柱5
の取付位置と高さを柔軟に調整可能であり、様々なサイズの小動物を確実に固定すること
を実現することができ、覚醒状態での安定した長時間の結像記録を実現することができる
。
間隔をおいてM6ネジ穴が配置されており、ネジ穴の全体サイズは、顕微鏡載物プラット
フォーム又は顕微鏡防振ステージに適合し、底板を顕微鏡載物プラットフォーム又は顕微
鏡防振ステージに固定するために用いられることができるとともに、結像プラットフォー
ムの柱5を固定するために用いられることもできる。さらに好ましくは、柱5は三組が設
けられてもよく、それぞれは1cm、2cm、3cmであり、様々な柱組の組み合わせに
よって、1cmから6cm、又は間隔が1cmである様々な高さ組み合わせを実現するこ
とができ、それによって様々なサイズの小動物に適用することができる。
それによって、覚醒状態にある小動物の自由の動きを実現する。前記可動クローラ7は、
クローラと少なくとも二つのローラ8を含み、ローラ8は、ベアリングを介して平行に
角形孔内に取り付けられ、クローラは全てのローラに穿設される。
、このプラットフォームに不規則な開孔4が設けられ、中央の比較的に大きい結像開孔4
-1と外縁の二つの刺激及び信号記録孔4-2からなり、そのうち、結像開孔4-1は、
結像して、細胞、カルシウム信号、血流などの動的情報を記録するために用いられるとと
もに、二つの刺激及び信号記録孔4-2において同期電気刺激、投薬、同期電気信号記録
などの実験を実現することができ、様々な実験需要をよく満たすことができる。
となく固定することができる。
部結像を具体的な実施例として説明する。
1)遺伝子組換え蛍光マウスの頭皮を眼科用ハサミで切り、結像領域と刺激投薬領域の
頭蓋骨を露出させて、過酸化水素又は塩化鉄溶液で頭蓋骨の表面を処理し、筋膜を除去す
る。歯科用セメント(グラスアイオノマーセメント(glass ionomer ce
ment))で頭蓋骨を結像固定プラットフォーム2に固定し、結像領域と刺激及び信号
記録領域をプラットフォームにおける結像開孔4-1と刺激及び信号記録孔4-2に位置
合わせさせる。
5選択して、底板6におけるネジ穴に固定して、バタフライ型ネジ1で結像固定プラット
フォーム2及びマウスを共に柱5に固定する。
なドリルで頭蓋骨の表面の歯科用セメントを取り除き、頭蓋骨を薄くように磨く。次に、
小さなドリルで結像開孔4-1に沿って一回りの小さな穴を開け、血管を避ける必要があ
る。頭蓋骨を冷やしてそのクズを洗い流すために、研磨する間に絶え間なく綿で生理学的
食塩水を浸し、頭蓋骨の表面を被せる。
、刺激及び信号記録孔4-2側でドリルで孔を開ける。
に引き剥がす。低融点寒天溶液を調製して、手の甲で寒天溶液の温度をテストして、火傷
するほど熱くなければ寒天を開孔に塗布し、速やかに一枚のカバーガラスを被せる。
位置させて、ネジで底板と顕微鏡プラットフォームを固定し、結像動物の準備作業を完了
する。
して結像することが好ましい。レンズは25倍の二光子専用レンズ(型番XLPLN25
XWMP2)を選択する。結像領域に純水を滴下して、関心のある領域を見付けて、実験
需要に応じて、光路と撮影パラメータを調節し、生体結像を行う。同期投薬刺激又は記録
電気生理学的信号の記録を行う必要がある場合、刺激及び信号記録孔4-2において実施
するとともに、生体結像を行ってもよい。
図1~図6に示すように、実施例1との違いは、前記底板6は、矩形のアルミニウム材
であり、前後側に25mmの間隔をおいてM6ネジ穴が配置されており、ネジ穴の全体サ
イズは、顕微鏡載物プラットフォーム又は顕微鏡防振ステージに適合する。底板を顕微鏡
載物プラットフォーム又は顕微鏡防振ステージに固定するためにも用いられることができ
るとともに、結像プラットフォームの柱5を固定するために用いられることもできる。さ
らに好ましくは、柱5は三組が設けられてもよく、それぞれは1cm、2cm、3cmで
あり、様々な柱組の組み合わせによって、1cmから6cm、又は間隔が1cmである様
々な高さ組み合わせを実現することができ、それによって様々なサイズの小動物に適用す
ることができる。
する仮想円の円心と固定孔15の円心は重ね合わせており、前記固定孔8と弧状孔9はい
ずれも可動クローラ7を取り付けるために用いられる。前記可動クローラ7は、クローラ
と少なくとも二つの回動ローラを含み、前記回動ローラはそれぞれ相応な固定孔8、弧状
孔9に接続され、クローラは全ての回動ローラに穿設される。設けられる固定孔8と弧状
孔9によって、可動クローラの傾斜角度を調節して、小動物に登坂運動又は下り坂運動を
実現させ、小動物を運動状態にさせて、接着部分に対する反力を減少させて、それによっ
て結像プラットフォームが振動して結像焦点面の安定に影響を与えることを避ける。
、このプラットフォームに不規則な開孔4が設けられ、中央の比較的に大きい結像開孔4
-1と外縁の二つの刺激及び信号記録孔4-2からなる。そのうち、結像開孔4-1は、
結像して、細胞、カルシウム信号、血流などの動的情報を記録するために用いられるとと
もに、二つの刺激及び信号記録孔4-2において同期電気刺激、投薬、同期電気信号記録
などの実験を実現することができ、様々な実験需要をよく満たすことができる。
ズルは開孔4に対応して設けられる。前記負圧チューブ10は筐体12に接続され、前記
筐体12内にフィルター層14が設けられ、前記筐体12の他方端は接続チューブを介し
て負圧ポンプ13に接続される。前記フィルター層14は、埃塵やクズが負圧ポンプ13
内に侵入することを防ぐことができ、負圧ポンプの安全な使用環境を確保される。負圧ポ
ンプをオンにすると、前記開孔4は負圧環境にあり、ドリルによって頭蓋骨の表面の歯科
用セメントを除去し、頭蓋骨を薄くなるように研磨する過程、及び小さなドリルによって
、結像開孔4-1に沿って小孔を開ける過程において、負圧チューブ10は研磨する時に
生成された埃塵やクズを吸収することができ、結像固定プラットフォーム2の表面のクリ
ーン環境が確保され、孔を開ける過程において生成された物質が生体結像に妨害すること
を避ける。前記結像プラットフォーム2の周辺側に洗浄バー11が設けられ、前記洗浄バ
ー11の材質は吸水布又はスポンジであり、前記洗浄バー11は液体を吸収するために用
いられ、結像領域に水を滴下し又は投薬する過程において、滴下した液体が比較的に多い
時、洗浄バー11は、結像固定プラットフォーム2までに流れ込んだ液体を吸収すること
ができる。
音声プレイヤーが設けられる。前記ベースにおける結像プラットフォームに近い一方端に
凹溝が設けられ、前記凹溝にカバーが設けられ、前記カバーに複数の通気孔が設けられる
。前記凹溝は、小動物の興味食品を配置するために用いられ、食品の臭いは通気孔を介し
て外部に放出される。小動物に対して結像観察を行う時、ビデオプレイヤー及び/又は音
声プレイヤーによってマウスに対して視覚、聴覚及び味覚の刺激を与えて、結像領域の刺
激に対する反応状況を観察することができる。
加熱することで、結像領域に対する温度の影響を観察することを容易にし、小動物の長時
間の結像観察を満たす。
グ16を含み、前記照明リング16に電球17が設けられ、前記電球17はLED電球で
あり、前記電球17は照明リング16内に均等的に配置される。前記電球17はリード線
18を介して外部電源に接続され、前記リード線18は結像固定プラットフォームを貫通
し、前記照明リング16は透明材質であり、前記照明リング16は開孔4の形状に適合し
、前記照明装置は開孔内に光線を提供するために用いられ、開孔内の明るい視野を確保す
る。
貫通し、前記通風路は開孔の内側に連通され、前記通風路にファンが接続され、前記ファ
ンは、風力刺激を受けた場合の生体結像を観察するための風力を提供し、小動物の生体結
像の観察需要を満たす。前記通風路は、開孔内の換気及び乾燥するためにも用いられる。
前記刺激及び信号記録孔4-2の内側の底部に電極シートが設けられ、前記電極シートは
小動物の頭蓋骨に接触することができ、前記電極シートの外側に電源が接続され、前記電
源は電流を提供するために用いられる。電極シートによって小動物に電流刺激を与えるこ
とにより、電気刺激を受けた小動物の生体結像を観察し、操作過程が便利である。
データプロセッサは、圧力センサによって収集されたデータを処理するために用いられる
。前記圧力センサは、結像固定プラットフォームの柱に対する圧力を測定するために用い
られる。対象となる小動物の興奮度が高いほど、落ち着かなくなり、前後に動き易く、そ
れによって圧力センサに影響を与える。圧力センサによって測定されたデータから小動物
の興奮度を判断する。圧力センサによって測定されたデータ値が高いほど、結像固定プラ
ットフォームに対する離脱力が大きく、小動物がより興奮していることを表す。データ値
が小さいほど、小動物が比較的に穏やかな状態にあることを表す。小動物が興奮状態にあ
る時、圧力センサによって測定されたデータが予め設定した閾値を超えた場合、小動物に
対する刺激を停止し、歯科用セメントの亀裂、小動物の結像固定プラットフォーム2から
の離脱現象を避け、実験を円滑に進行することを確保することができる。
、前記音波エミッタは、超音波、音波及び低周波音を発射することができる。ここの音波
とは、周波数が20Hz~20kHzの間の音波を意味し、超音波とは、周波数が20k
Hzよりも大きい音波を意味し、低周波音とは、周波数が20Hzよりも小さい音波を意
味する。異なる周波数の音波を発射し、音波の振幅などのパラメータを調節することによ
って、覚醒小動物の結像状況を記録して、関連情報とデータを取得する。
となく固定することができる。
ためのものではなく、当業者にとって、本発明は様々な変更と変化を行うことが可能であ
り、本発明の精神と趣旨を逸脱しない限り、なされた全ての修正、同等置換、改良などは
いずれも本発明の保護範囲に含まれるものとする。
M6ネジ穴に適合する;2、結像固定プラットフォーム、薄く、弾性力が良く、変形しに
くく、厚さが0.5mm以下であることが要求される;3、結像固定プラットフォーム固
定孔、直径が6mmである;4、結像プラットフォーム開孔;4-1、結像孔;4-2、
刺激及び信号記録孔;5、柱、合計で3組がある、高さがそれぞれ1cm、2cm、3c
mであり、様々な実験需要と標本に応じて組み合わせることにより、結像固定プラットフ
ォームの高さを調整することができ、各組は左右それぞれ一つがある;5-1、ネジ穴部
分、仕様M6;5-2、ねじ山部分、M6ネジ穴に適合する;6、ベース;6-1、ベー
スネジ穴アレイ、間隔仕様25mm、下は顕微鏡プラットフォームに固定され、上は柱を
固定するために用いられ、底板中央は四角形を取り抜き、クローラを固定するために用い
られる;7、可動クローラ、小動物が動く時に柔軟に転がることができる;8、ローラ、
複数あり、ベアリングを介してベース6の角形開孔に取り付けられ、クローラが転がるす
るように支持する;9、弧状孔;10、負圧チューブ;11、洗浄バー;12、筐体;1
3、負圧ポンプ;14、フィルター層;15、固定孔;16、照明リング;17、電球;
18、リード線。
Claims (10)
- 覚醒小動物の長時間の生体結像のための装置であって、
顕微鏡プラットフォーム又は防振ステージに固定されるベースと、
ベースに設けられる固定柱と、
前記固定柱を介してベースに取り付けられる結像プラットフォームとを含み、
前記ベースに可動クローラがさらに設けられる、ことを特徴とする覚醒小動物の長時間
の生体結像のための装置。
- 前記可動クローラは、クローラと少なくとも二つのローラを含み、ベースに角溝が開設
され、ローラはベアリングを介して平行に角溝内に取り付けられ、クローラは全てのロー
ラに穿設される、ことを特徴とする請求項1に記載の覚醒小動物の長時間の生体結像のた
めの装置。
- 前記固定柱の高さ及びベースにおける位置はいずれも調整可能である、ことを特徴とす
る請求項1に記載の覚醒小動物の長時間の生体結像のための装置。
- 前記結像プラットフォームに小動物を固定するための開孔が開設される、ことを特徴と
する請求項1に記載の覚醒小動物の長時間の生体結像のための装置。
- 前記ベースの両側はいずれにも固定孔と弧状孔が設けられ、前記弧状孔が位置する仮想
円の円心と固定孔の円心は重ね合わせており、前記固定孔と弧状孔はいずれも可動クロー
ラを取り付けるために用いられる、ことを特徴とする請求項1に記載の覚醒小動物の長時
間の生体結像のための装置。
- 前記結像プラットフォームに負圧チューブが設けられ、前記負圧チューブのノズルは、
開孔に対応して設けられる、ことを特徴とする請求項4に記載の覚醒小動物の長時間の生
体結像のための装置。
- 前記結像プラットフォームの周辺側に洗浄バーが設けられる、ことを特徴とする請求項
1に記載の覚醒小動物の長時間の生体結像のための装置。
- 前記ベースにおける結像プラットフォームに近い一方端に、ビデオプレイヤー及び/又
は音声プレイヤーが設けられる、ことを特徴とする請求項1に記載の覚醒小動物の長時間
の生体結像のための装置。
- 前記ベースにおける結像プラットフォームに近い一方端に凹溝が設けられ、前記凹溝に
カバーが設けられ、前記カバーに複数の通気孔が設けられる、ことを特徴とする請求項1
に記載の覚醒小動物の長時間の生体結像のための装置。
- 請求項1~9の何れか1項に記載の装置を利用して覚醒小動物の長時間の生体結像を行
う方法であって、
動物のサイズに応じて、ベースにおける固定柱の位置と高さを調節して、小動物を結像
プラットフォームに固定し、小動物の残りの肢体を可動クローラに位置させるステップと
、
実験用動物に対して手術を行い、結像領域を露出させるステップと、
ベースを顕微鏡プラットフォーム又は防振ステージに固定し、結像対象領域を顕微鏡の
下に位置させるステップと、
実験需要に応じて、特定領域に対して生体結像を行い、実験中に刺激を与えれば、特定
領域の刺激に対する反応状況を観察することができるステップとを含む、ことを特徴とす
る方法。
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