CN206630597U - 一种微型化自适应光学双光子荧光成像系统 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种微型化自适应光学双光子荧光成像系统，该成像系统包括：激光光源装置；微型探头装置，其利用激发光激发活体样本内部的组织平面，以产生荧光信号；以及根据活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布，对各等晕区进行波前校正；波前检测装置，其检测平均波前畸变分布；去扫描构件，其用于在波前检测装置检测平均波前畸变分布之前，实时补偿微型探头装置产生的等晕区离轴效应；荧光成像装置，其采集微型探头装置输出的经由波前校正后的荧光信号，完成活体样本内部的组织平面的成像。本实用新型能够实现具有可在自由活动的动物中进行大视场、高时空分辨率、深层生物组织成像。

Description

一种微型化自适应光学双光子荧光成像系统

技术领域

本实用新型涉及双光子荧光成像技术领域，特别是涉及一种微型化自适应光学双光子荧光成像系统。

背景技术

在自由活动的动物中直接记录神经元活动是研究动物行为与神经功能之间的关系最直接有效的方法之一。在之前的很长一段时间里，这一任务都是通过电生理学途径(electrophysiological approach)来执行的。近些年来，光学成像特别是荧光显微技术在这项任务中起了越来越重要的作用。相比于电生理方法，光学成像最大的优势是其具有非侵入性以及更大的成像视野和更多的可观察目标。而与普通的单光子荧光成像技术相比，双光子显微镜具有更好的光学切片能力和更深的穿透深度。这使得双光子显微镜成为利用荧光成像对大脑神经元观察中最重要和最广泛使用的工具。同时，为了观测清醒动物在活动状态下的神经活动，研究者通常会将大型的台式双光子显微镜进行改造，加入一些模拟运动的装置例如跑步机或者转轮等等；但实验时必须将小鼠的头部固定在显微镜镜头之下，仅仅不限制躯干的活动，用这种方式来模拟真实的运动。随着研究的深入，科学家发现这种模拟暴露出许多的弊端。首先，人们认为这种模拟不能反映真实的活动状态。因为动物例如小鼠真实活动中所需要参与的很多过程，例如身体的扭动，周围环境的线索，重力的转换等等在头部固定式都不具备。其次，许多经典的行为学研究，例如恐惧，社交和探索等等无法在头部固定时实现。

所以，从2001年开始，人们就开始尝试制造微型的，可以安装在动物头部如大鼠或小鼠头部的，可以在其完全自由活动时进行荧光成像的微型双光子显微镜系统。从2001年美国Denk教授课题组尝试制作的25g小型双光子显微镜到2011年Kerr教授课题组制作的5g微型双光子显微镜。科学家进行了数次尝试，然而都没有达到很理想的效果。总体来讲，由于微型双光子显微镜将所有的光学镜片尺寸都进行了大大的缩减，使得整体的光学质量很难控制。再 加上微小的镜头之间的装配和耦合很难跟大型镜片一样好。更重要的是，小型的物镜由于镜片数量的限制，对由样本引入的畸变更加敏感。所有这些问题导致微型化双光子显微镜无法达到跟大型台式双光子显微镜一样的高分辨率成像。这极大的限制了微型化双光子显微镜的推广和应用。

另一方面，自适应光学在天文学，眼底检查以及显微成像领域，都被很好的利用，以纠正由系统和样板带来的畸变，进而提高像质。特别是在大型的台式双光子显微镜中，已有人尝试利用自适应光学来纠正像差，提高成像质量。然而，由于常规的自适应光学系统需要复杂的波前检测装置和波前矫正装置，整体体积巨大，是无法应用在微型化双光子显微镜当中的。所以，只有提出新的自适应光学方案，设计新的自适应光学系统，使用新的微型自适应光学器件，才能将自适应光学与微型双光子显微镜结合，进而提高微型化双光子显微镜的成像质量。

因此，希望有一种技术方案来克服或至少减轻现有技术的上述缺陷中的至少一个。

实用新型内容

本实用新型的目的在于提供一种微型化自适应光学双光子成像系统来克服或至少减轻现有技术的上述缺陷中的至少一个。

为实现上述目的，本实用新型提供一种微型化自适应光学双光子荧光成像系统，所述微型化自适应光学双光子荧光成像系统包括：激光光源装置，其用于输出激发光；微型探头装置，其用于接收所述激光光源装置输出的激发光，并利用所述激发光激发活体样本内部的组织平面，以产生荧光信号；以及用于在所述活体样本被释放的情形下，根据所述活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布，对各所述等晕区进行波前校正；波前检测装置，其信号输入端口可操作性地与所述微型探头装置的信号输出端口连接，用于在所述活体样本被固定的情形下，接收所述微型探头装置输出的荧光信号，并检测所述平均波前畸变分布；去扫描构件，其设置在所述微型探头装置与波前检测装置之间的光路上，用于在所述波前检测装置检测所述平均波前畸变分布之前，实时补偿所述微型探头装置产生的等晕区离轴效应；和荧光成像装置，其信号输入端口可操作性地与所述微型探头装置的信号输出端口连接，用于采集所述微型探头装置输出的经由波前校正后的荧光信号，完成所述活体样本内 部的组织平面的成像。

进一步地，所述微型探头装置包括：激光输入模块，用于接收所述激光光源装置输出的激发光；波前校正模块，用于在所述活体样本被释放的情形下，根据活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布对各所述等晕区进行波前校正；和扫描成像模块，用于接收波前校正后的激发光，该激发光以二维运动的方式对所述活体样本内部的组织平面进行扫描，以激发所述活体样本产生所述荧光信号。

进一步地，所述扫描成像模块包括：第一微机电双轴转镜，其用于通过转动改变激发光入射角角度的方式将由所述波前校正模块波前校正后的激发光对所述活体样本内部的组织平面进行二维扫描；目镜，其用于将来自所述第一微机电双轴转镜的激发光会聚到所述活体样本内部，以激发所述活体样本产生所述荧光信号；以及用于输出所述荧光信号；扫描镜，其布置在所述第一微机电双轴转镜和目镜之间的光路上，用于将所述第一微机电双轴转镜二维扫描所产生的角度变化的激发光转化成位置变化的激发光；和双色镜，其设在所述扫描镜和目镜之间，用于将激发光和荧光信号分开以及输出所述荧光信号。

进一步地，所述去扫描构件包括：第二微机电双轴转镜，其设置在所述微型探头装置的信号输出端口和波前检测装置之间的光路上；和第一透镜，其设置在所述第一微机电双轴转镜与所述微型探头装置的信号输出端口之间的光路上，用于接收所述微型探头装置输出的荧光信号，并将所述荧光信号转变成波前以及将该波前的共轭面投射到所述第二微机电双轴转镜上；所述第二微机电双轴转镜以能够实时补偿所述第一微机电双轴转镜扫描产生的等晕区离轴效应的方式与所述第一微机电双轴转镜相配合，再将实时补偿后的激发光传输给所述波前检测装置；所述第二微机电双轴转镜与所述第一微机电双轴转镜之间的配合关系需要满足：在时间上，同频率、同相位；在空间上，扫描角度要求为：所述第二微机电双轴转镜转动的角度与所述第一微机电双轴转镜转动的角度的比值为所述扫描镜的焦距与所述第一透镜的焦距的比值；扫描方向要求为：方向相反。

进一步地，所述波前检测装置包括：波前传感器，其用于接收所述第一透镜输出的波前；和第一中继机构，其设置在所述第二微机电双轴转镜与波前传感器之间的光路上，用于使所述第二微机电双轴转镜与波前传感器共轭，使所述波前传感器能够检测到所述平均波前畸变分布。

进一步地，所述波前校正模块包括：可变型反射镜，其用于接收所述激光输入模块输出的激发光，并根据所述平均波前畸变分布，改变和控制发射出的激发光的波前；和第二中继机构，其用于使所述可变型反射镜和扫描镜共轭，并将被所述可变型反射镜波前校正后的激发光投射到所述第一微机电双轴转镜的反射面。

进一步地，所述波前校正模块还包括设置在光路上的第二透镜、第一半波片、偏振分光立方体、第二半波片和四分之一波片，其中：所述激光输入模块输出的激发光先后经由所述第二透镜和第一半波片，再从所述偏振分光立方体的第一侧面进入所述偏振分光立方体，然后从所述偏振分光立方体的第二侧面输出，并依次通过所述第二半波片和四分之一波片后投射到所述可变型反射镜的反射面；所述可变型反射镜反射出的激发光再次先后通过所述四分之一波片和第二半波片，从所述偏振分光立方体的第二侧面进入所述偏振分光立方体，经由所述偏振分光立方体的激发光从所述偏振分光立方体的第三侧面投射到所述第二中继机构。

进一步地，所述荧光成像装置的信号输入端口通过柔性光线束与所述微型探头装置的信号输出端口连接。

本实用新型在固定活体样本的情形下，能够将荧光信号的波前从微型探头装置导出，并使用去扫描构件实时补偿微型探头装置产生的等晕区离轴效应，再利用波前检测装置检测所述活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布，然后在释放活体样本的前提条件下，微型探头装置根据检测到的平均波前畸变分布，对各等晕区进行波前校正并输出波前校正后的荧光信号，完成活体样本内部的组织平面的成像，因此可以实现具有可在自由活动的动物中进行大视场、高时空分辨率、深层生物组织成像。

附图说明

图1是本实用新型所提供的微型化自适应光学双光子成像系统的原理性示意图。

图2是图1的微型化自适应光学双光子成像系统中实现波前检测部分的一优选实施方式的结构示意图。

图3是图2中的去扫描构件与扫描成像模块的配合关系说明示意图。

图4是图1的微型化自适应光学双光子成像系统中实现荧光成像部分的 一优选实施方式的结构示意图。

图5是图1的激光光源装置的结构示意图。

具体实施方式

在附图中，使用相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面结合附图对本实用新型的实施例进行详细说明。

在本实用新型的描述中，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型保护范围的限制。

本实用新型的活体样本是有生命的小动物，例如：小老鼠等。鉴于活体样本的体积较小，因此，本实用新型属于微型器件，整体结构的体积在1～5cm³范围内。

现有技术中的微型探头装置内的扫描构件在成像/波前检测时，即激光扫描时对激发光产生了一定程度的偏折，这使得激发光的会聚位置偏离了整个光学系统的光轴，进而使得产生的荧光信号的等晕区也偏离了光轴，这种现象也称为“离轴效应”。现有技术中的波前检测几乎都是采用基于等晕区不变的波前传感方式，而这种方式在存在“离轴效应”的情形下，无法检测到活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布。

鉴于现有技术的问题，本实用新型欲通过微型探头装置与波前传感装置之间的光路上新增一套去扫描机构，并利用控制算法将该去扫描机构与微型探头内的扫描机构联动，将荧光信号的偏折反向离轴的等晕区实时地纠正到整个光学系统的光轴上，这样，即便是采用现有技术中的基于等晕区不变的波前传感方式，也能够准确地检测到活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布。

根据本实用新型要解决的技术问题，本实施例所提供的微型化自适应光学双光子荧光成像系统的使用方法包括：

步骤1，波前检测，其具体包括：

步骤11，固定活体样本，并在所述活体样本的预设位置固定安装微型探头装置。“预设位置”通常选取在活体样本头部(小老鼠的头部)的开窗位置。 该开窗位置能够显露出荧光标记后的大脑组织。

步骤12，通过去扫描构件实时补偿所述微型探头装置中的扫描构件产生的等晕区离轴效应。该步骤可以采用如下方法实现：

如图1和图3所示，去扫描构件4包括第二微机电双轴转镜41和第一透镜42，第二微机电双轴转镜41设置在微型探头装置2的信号输出端口和波前检测装置3之间的光路上。第一透镜42设置在第一微机电双轴转镜231与微型探头装置2的信号输出端口之间的光路上，用于接收所述微型探头装置2输出的荧光信号，并将所述荧光信号转变成波前以及将该波前的共轭面投射到第二微机电双轴转镜41上。微型探头装置2中的扫描构件包括第一微机电双轴转镜231、和扫描镜233，第一微机电双轴转镜231用于以转动改变角度的方式将由波前校正模块22波前校正后的激发光对所述活体样本内部的组织平面进行二维扫描。扫描镜233用于将第一微机电双轴转镜231二维扫描所产生的角度变化的激发光转化成位置变化的激发光。第二微机电双轴转镜41和第一微机电双轴转镜231同步扫描需要满足以下要求：

1.在时间上，频率相同，范围在100～300Hz；相位相同。

2.在空间上，扫描角度要求为：第二微机电双轴转镜41转动的角度和第一微机电双轴转镜231转动的角度的比值为扫描镜233的焦距和第一透镜42的焦距的比值。扫描方向要求为：方向相反。

通过上述方式，扫描构件扫描导致的等晕区“离轴效应”恰好被去扫描构件的同步偏转补偿，进而将微型探头装置输出的荧光信号的偏折反向离轴的等晕区实时地纠正到整个光学系统的轴上，从而为步骤13有效进行平均波前畸变分布检测提供了有利条件。

步骤13，通过波前检测装置检测所述活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布。

步骤2，荧光成像，其具体包括：

步骤21，释放所述活体样本，并利用柔性光纤束收集所述微型探头装置输出的荧光信号，柔性光纤束需要足够的长度，这样活体样本即便是头顶着所述微型探头装置，也能够自如活动，而不会受到约束，进而有利于反映活体样本真实的活动状态，有利于获取活体样本的深层脑部组织的真实图像数据。

步骤22，根据所述步骤13检测到的所述平均波前畸变分布，所述微型探头装置对各所述等晕区进行波前校正并输出波前校正后的荧光信号。

步骤23，通过荧光成像装置采集所述步骤22输出的所述荧光信号，完成所述活体样本内部的组织平面的成像。

反复操作步骤1和步骤2，也就是说，每次在上一次的基础上不断优化，直到收敛到一个最佳值，即残余波前误差最小，从而能够实现对整个深层生物组织进行大视场、高时空分辨率、逐点扫描荧光显微成像。

如图1所示，本实施例提供实现如上述微型化自适应光学双光子荧光成像方法的微型化自适应光学双光子荧光成像系统，该系统包括激光光源装置1、微型探头装置2、波前检测装置3、去扫描构件4和荧光成像装置5，其中：

如图5所示，激光光源装置1用于输出激发光。激光光源装置1由一台飞秒激光器11，飞秒激光器11的脉宽在80至250fs(飞秒)之间，重复频率范围为40至100MHz，最高功率在500mW以上。

微型探头装置2固定安装在活体样本的预设位置，即活体样本的头部开窗位置。微型探头装置2用于接收激光光源装置1输出的激发光，并利用所述激发光激发活体样本内部的组织平面，以产生荧光信号；以及用于在所述活体样本被释放的情形下，根据活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布，对各所述等晕区进行波前校正。

如图1所示，在一个实施例中，微型探头装置2包括激光输入模块21、波前校正模块22和扫描成像模块23，其中：

如图5所示，激光输入模块21用于接收激光光源装置1输出的激发光。激光输入模块21具体包括光强调制模块和光纤耦合模块215，其中，所述光强调制模块包括电动快门211、半波片212和电光/声光调制器213。光纤耦合模块215通过非球面透镜214将准直激光束耦合进光子晶体光纤中(hollow-core photon crystal fiber)。

如图1所示，波前校正模块22用于在所述活体样本被释放的情形下，根据活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布对各所述等晕区进行波前校正。

如图2所示，在一个实施例中，波前校正模块22包括可变型反射镜221和第二中继机构222，其中：可变型反射镜221用于接收激光输入模块21输出的激发光，并根据所述平均波前畸变分布，改变和控制发射出的激发光的波前。

第二中继机构222用于使可变型反射镜221和第一微机电双轴转镜231 共轭，并将被可变型反射镜221波前校正后的激发光投射到第一微机电双轴转镜231的反射面。也就是说，设定本实施例需要检测和校正图中示意出来的#1面的波前，通过第二中继机构222，可变型反射镜221和第一微机电双轴转镜231形成一个4f系统，那么，可变型反射镜221校正的#1面的共轭面为第一微机电双轴转镜231的发射面。

在进行波前校正的过程中，可变型反射镜221的控制电流和第一微机电双轴转镜231之间的配合关系可利用下式表示：

ΔS(N)＝-2*T(I_N)/λ

其中：ΔS(N)是共轭面#1上第N个子孔径上的平均波前畸变(与平面波前之间的相位差)；I_N为施加在可变型反射镜221的第N个独立变形单元上的电流；T(I)为可变型反射镜221的驱动函数，即当施加数值为I的电流时，某一独立变形单元上的空间位移量；λ为入射激光波长。

在一个实施例中，波前校正模块22还包括设置在光路上的第二透镜223、第一半波片224、偏振分光立方体225、第二半波片226和四分之一波片227，其中：激光输入模块21输出的激发光先后经由所述第二透镜223和第一半波片224，再从所述偏振分光立方体225的第一侧面进入所述偏振分光立方体225，然后从所述偏振分光立方体225的第二侧面输出，并依次通过所述第二半波片226和四分之一波片227后投射到可变型反射镜221的反射面。可变型反射镜221反射出的激发光再次先后通过四分之一波片227和第二半波片226，从偏振分光立方体225的第二侧面进入偏振分光立方体225，经由偏振分光立方体225的激发光从偏振分光立方体225的第三侧面投射到第二中继机构222，最后通过第二中继机构222投射到第一微机电双轴转镜231的反射面上。本实施例中，第二透镜223用于准直从光线发出的激光。第一半波片224用于改变激光偏振方向。偏振分光立方体225用于将入射光和反射光分开。第二半波片226和四分之一波片227共同用于使得入射光与发射光的偏振方向恰好垂直，这样才可以利用225将入射光和反射光分开。

扫描成像模块23用于接收波前校正后的激发光，该激发光以二维运动的方式对所述活体样本内部的组织平面进行扫描，以产生所述荧光信号。

在一个实施例中，扫描成像模块23包括第一微机电双轴转镜231、目镜232、扫描镜233和双色镜234，其中：

第一微机电双轴转镜231用于以转动改变角度的方式将由波前校正模块 22波前校正后的激发光对所述活体样本内部的组织平面进行二维扫描。第一微机电双轴转镜231每变换一次角度，波前校正模块22的波前校正更新一次，以补偿不同等晕区的不同波前畸变。第一微机电双轴转镜231采用的是微机电双轴转镜，其参数范围包括：镜面尺寸：0.8～1.0mm；扫描角度：±5～±7°；第一谐振频率：大于2000Hz。

目镜232用于将来自第一微机电双轴转镜231的激发光会聚到所述活体样本内部，以激发所述活体样本内部产生所述荧光信号，以及用于输出所述荧光信号。图2中示出的#2面为成像面，所述活体样本内部的组织平面的成像面，与#1面互为傅里叶变换。

扫描镜233布置在第一微机电双轴转镜231和目镜232之间的光路上，用于将第一微机电双轴转镜231二维扫描所产生的角度变化的激发光转化成位置变化的激发光。双色镜234设在扫描镜233和目镜232之间，用于将激发光和荧光信号分开。

如图1所示，波前检测装置3的信号输入端口可操作性地与微型探头装置2的信号输出端口连接，用于在所述活体样本被固定的情形下，接收微型探头装置2输出的荧光信号，并检测所述平均波前畸变分布。波前检测装置3在波前检测时，与微型探头装置2配合使用。在波前检测时，需要固定所述活体样本。

如图2所示，在一个实施例中，波前检测装置3包括波前传感器31和第一中继机构，其中：波前传感器31用于接收第一透镜42输出的波前。第一中继机构设置在第二微机电双轴转镜41与波前传感器31之间的光路上，用于使所述第二微机电双轴转镜41与波前传感器31共轭，使波前传感器31能够检测到所述平均波前畸变分布。第一中继机构由透镜33和透镜34组成，使得第二微机电双轴转镜41和波前传感器31形成一个4f系统，那么，#1面的共轭面为波前传感器31的检测面。#2面通过透镜33和第一透镜42形成的4f关系形成在反射镜35的反射面上。

也就是说，在不需要光纤6将荧光信号引入系统5的情况下，也可以利用探测器37来进行成像。这样便于在波前检测和不断优化波前矫正的过程中评价成像质量的改进。

如图1和图2所示，在一个实施例中，去扫描构件4设置在微型探头装置2与波前检测装置3之间的光路上，用于在波前检测装置3检测所述平均波 前畸变分布之前，实时补偿微型探头装置2产生的等晕区离轴效应。

具体地，去扫描构件4包括第二微机电双轴转镜41和第一透镜42，其中：

第二微机电双轴转镜41设置在微型探头装置2的信号输出端口和波前检测装置3之间的光路上。第二微机电双轴转镜41采用的是大口径微机电双轴转镜，其参数范围包括：镜面尺寸：3-5mm；扫描角度：±1～±3°；第一谐振频率：大于200Hz。

第一透镜42设置在第一微机电双轴转镜231与微型探头装置2的信号输出端口之间的光路上，用于接收所述微型探头装置2输出的荧光信号，并将所述荧光信号转变成波前以及将共轭面#1投射到第二微机电双轴转镜41上。

第二微机电双轴转镜41转动的角度与第一微机电双轴转镜231转动的角度的比值为扫描镜233的焦距与第一透镜42的焦距的比值，以实时补偿第一微机电双轴转镜231扫描产生的等晕区离轴效应，再实时补偿后的激发光传输给所述波前检测装置3。

结合图3，为了实现去扫描构件4实时补偿微型探头装置2产生的等晕区离轴效应，第二微机电双轴转镜41和第一微机电双轴转镜231同步扫描需要满足以下要求：

1.在时间上，频率相同，范围在100～300Hz；相位相同。

2.在空间上，扫描角度要求为：第二微机电双轴转镜41转动的角度和第一微机电双轴转镜231转动的角度的比值为扫描镜233的焦距和第一透镜42的焦距的比值，即图3中示意出来的β₁为第二微机电双轴转镜41转动的角度，α₁为第一微机电双轴转镜231转动的角度，F₁为扫描镜233的焦距，F₂为第一透镜42的焦距。扫描方向要求为：方向相反。

通过上述方式，扫描构件扫描导致的等晕区“离轴效应”恰好被去扫描构件的同步偏转补偿，进而将微型探头装置输出的荧光信号的偏折反向离轴的等晕区实时地纠正到整个光学系统的轴上，从而为波前检测装置3有效进行平均波前畸变分布检测提供了有利条件。

如图4所示，荧光成像装置5信号输入端口可操作性地与微型探头装置2的信号输出端口连接，用于采集微型探头装置2输出的经由波前校正后的荧光信号，完成所述活体样本内部的组织平面的成像。荧光成像装置5的组成为现 有技术在此不再展开描述。荧光成像装置5在荧光成像时，与微型探头装置2配合使用。荧光成像装置5的信号输入端口通过柔性光线束6与所述微型探头装置2的信号输出端口连接。在荧光成像时，需要释放所述活体样本，并利用柔性光纤束6收集所述微型探头装置输出的荧光信号，柔性光纤束需要足够的长度，这样活体样本即便是头顶着所述微型探头装置，也能够自如活动，而不会受到约束，进而有利于反映活体样本真实的活动状态，有利于获取活体样本的深层脑部组织的真实图像数据。

利用本实用新型进行波前检测的工作过程如下：

微型探头装置2和波前检测装置3组合，如图2所示。飞秒激光器11输出的飞秒激发光通过空心光子晶体光纤传至微型探头装置2中。首先，由第二透镜223进行准直，再通过第一半波片224调整偏振方向，并由偏振分光立方体225反射，分别第一次通过第二半波片226和四分之一波片227，到达可变型反射镜221的表面。由可变型反射镜221反射的准直光第二次经过第二半波片226和四分之一波片227并穿过偏振分光立方体225。然后，利用第二中继机构222，激发光光束被投射到第一微机电双轴转镜231表面。第一微机电双轴转镜231通过两路高压静电信号控制，可以在两个方向上进行激光扫描。通过扫描镜233的会聚作用和双色镜234的反射作用，扫描光束被聚焦于目镜232成像面，再通过目镜232聚焦到活体样本，从而进行二维的点扫描激发。激发出的荧光信号再以落射形式被目镜232收集，穿过双色镜234，从微型探头装置2射出，再被第一透镜42准直。准直后的光束照射到第二微机电双轴转镜41上，再被反射镜反射，并通过透镜33和透镜4组成的第一中继机构，投射到波前传感器31或者光电探测器37的接收器上。

在上述过程中，所有的后出瞳面具有成像共轭关系(#1)；所有的像面具有成像共轭关系(#2)。距离1与第一透镜42的工作距离相等；距离2与距离3的和与透镜3的工作距离相同，并等于距离4；距离5和距离6相同，等于透镜44的工作距离。在波前测量时，要求第一微机电双轴转镜231与第二微机电双轴转镜41进行同步扫描，即扫描频率，相位，波形相同。幅度的比值要求达到“去扫描”效果，即由于微型微机电双轴转镜扫描导致的等晕区离轴效应恰好被大口径微机电双轴转镜的同步偏转补偿，达到等晕区不变的效果。进而对较大的视场都可以做到准确的波前传感。

利用本实用新型进行荧光成像的工作过程如下：

微型探头装置2和荧光成像装置5组合，如图4所示。目镜232接收并发出的荧光信号被柔性光纤束6收集，进而由荧光成像装置5收集。本过程中，根据计算出的各等晕区在后出瞳面#2面上的平均波前畸变分布后，驱动微型探头装置2中的可变型反射镜221产生镜面变形，完成波前校正。反复以上两步的操作，即可实现对整个深层生物组织进行大视场、高时空分辨率、逐点扫描荧光显微成像。

最后需要指出的是：以上实施例仅用以说明本实用新型的技术方案，而非对其限制。本领域的普通技术人员应当理解：可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本实用新型各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种微型化自适应光学双光子荧光成像系统，其特征在于，包括：

激光光源装置(1)，其用于输出激发光；

微型探头装置(2)，其用于接收所述激光光源装置(1)输出的激发光，并利用所述激发光激发活体样本内部的组织平面，以产生荧光信号；以及用于在所述活体样本被释放的情形下，根据所述活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布，对各所述等晕区进行波前校正；

波前检测装置(3)，其信号输入端口可操作性地与所述微型探头装置(2)的信号输出端口连接，用于在所述活体样本被固定的情形下，接收所述微型探头装置(2)输出的荧光信号，并检测所述平均波前畸变分布；

去扫描构件(4)，其设置在所述微型探头装置(2)与波前检测装置(3)之间的光路上，用于在所述波前检测装置(3)检测所述平均波前畸变分布之前，实时补偿所述微型探头装置(2)产生的等晕区离轴效应；和

荧光成像装置(5)，其信号输入端口可操作性地与所述微型探头装置(2)的信号输出端口连接，用于采集所述微型探头装置(2)输出的经由波前校正后的荧光信号，完成所述活体样本内部的组织平面的成像。

2.如权利要求1所述的微型化自适应光学双光子荧光成像系统，其特征在于，所述微型探头装置(2)包括：

激光输入模块(21)，用于接收所述激光光源装置(1)输出的激发光；

波前校正模块(22)，用于在所述活体样本被释放的情形下，根据活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布对各所述等晕区进行波前校正；和

扫描成像模块(23)，用于接收波前校正后的激发光，该激发光以二维运动的方式对所述活体样本内部的组织平面进行扫描，以激发所述活体样本产生所述荧光信号。

3.如权利要求2所述的微型化自适应光学双光子荧光成像系统，其特征在于，所述扫描成像模块(23)包括：

第一微机电双轴转镜(231)，其用于通过转动改变激发光入射角角度的 方式将由所述波前校正模块(22)波前校正后的激发光对所述活体样本内部的组织平面进行二维扫描；

目镜(232)，其用于将来自所述第一微机电双轴转镜(231)的激发光会聚到所述活体样本内部，以激发所述活体样本产生所述荧光信号；以及用于输出所述荧光信号；

扫描镜(233)，其布置在所述第一微机电双轴转镜(231)和目镜(232)之间的光路上，用于将所述第一微机电双轴转镜(231)二维扫描所产生的角度变化的激发光转化成位置变化的激发光；和

双色镜(234)，其设在所述扫描镜(233)和目镜(232)之间，用于将激发光和荧光信号分开以及输出所述荧光信号。

4.如权利要求3所述的微型化自适应光学双光子荧光成像系统，其特征在于，所述去扫描构件(4)包括：

第二微机电双轴转镜(41)，其设置在所述微型探头装置(2)的信号输出端口和波前检测装置(3)之间的光路上；和

第一透镜(42)，其设置在所述第二微机电双轴转镜(41)与所述微型探头装置(2)的信号输出端口之间的光路上，用于接收所述微型探头装置(2)输出的荧光信号，并将所述荧光信号转变成波前以及将该波前的共轭面投射到所述第二微机电双轴转镜(41)上；

所述第二微机电双轴转镜(41)以能够实时补偿所述第一微机电双轴转镜(231)扫描产生的等晕区离轴效应的方式与所述第一微机电双轴转镜(231)相配合，再将实时补偿后的激发光传输给所述波前检测装置(3)；

所述第二微机电双轴转镜(41)与所述第一微机电双轴转镜(231)之间的配合关系需要满足：

在时间上，同频率、同相位；

在空间上，扫描角度要求为：所述第二微机电双轴转镜(41)转动的角度与所述第一微机电双轴转镜(231)转动的角度的比值为所述扫描镜(233)的焦距与所述第一透镜(42)的焦距的比值；扫描方向要求为：方向相反。

5.如权利要求4所述的微型化自适应光学双光子荧光成像系统，其特征在于，所述波前检测装置(3)包括：

波前传感器(31)，其用于接收所述第一透镜(42)输出的波前；和

第一中继机构，其设置在所述第二微机电双轴转镜(41)与波前传感器(31)之间的光路上，用于使所述第二微机电双轴转镜(41)与波前传感器(31)共轭，使所述波前传感器(31)能够检测到所述平均波前畸变分布。

6.如权利要求3至5中任一项所述的微型化自适应光学双光子荧光成像系统，其特征在于，所述波前校正模块(22)包括：

可变型反射镜(221)，其用于接收所述激光输入模块(21)输出的激发光，并根据所述平均波前畸变分布，改变和控制发射出的激发光的波前；和

第二中继机构(222)，其用于使所述可变型反射镜(221)和扫描镜(233)共轭，并将被所述可变型反射镜(221)波前校正后的激发光投射到所述第一微机电双轴转镜(231)的反射面。

7.如权利要求6所述的微型化自适应光学双光子荧光成像系统，其特征在于，所述波前校正模块(22)还包括设置在光路上的第二透镜(223)、第一半波片(224)、偏振分光立方体(225)、第二半波片(226)和四分之一波片(227)，其中：所述激光输入模块(21)输出的激发光先后经由所述第二透镜(223)和第一半波片(224)，再从所述偏振分光立方体(225)的第一侧面进入所述偏振分光立方体(225)，然后从所述偏振分光立方体(225)的第二侧面输出，并依次通过所述第二半波片(226)和四分之一波片(227)后投射到所述可变型反射镜(221)的反射面；所述可变型反射镜(221)反射出的激发光再次先后通过所述四分之一波片(227)和第二半波片(226)，从所述偏振分光立方体(225)的第二侧面进入所述偏振分光立方体(225)，经由所述偏振分光立方体(225)的激发光从所述偏振分光立方体(225)的第三侧面投射到所述第二中继机构(222)。

8.如权利要求7所述的微型化自适应光学双光子荧光成像系统，其特征在于，所述荧光成像装置(5)的信号输入端口通过柔性光线束(6)与所述微型探头装置(2)的信号输出端口连接。