JP2014048549A - 浸液保持具、観察部位固定装置、及び、顕微鏡 - Google Patents

浸液保持具、観察部位固定装置、及び、顕微鏡 Download PDF

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Abstract

【課題】浸液を長時間保持する技術を提供することを課題とする。
【解決手段】液浸系対物レンズを備えた顕微鏡による観察に用いられる浸液保持具20は、マウス2に固定される固定部22と、浸液9を保持するための凹部が形成された浸液保持部21と、を含んでいる。浸液保持部21の凹部の底面は、カバーガラス23からなっている。固定部22には、試料であるマウス2の観察部位を臨む第1の貫通穴が形成されている。浸液保持具20では、浸液保持部21は、カバーガラス23が第1の貫通穴を覆うように、固定部22と接合または一体に形成されている。
【選択図】図2

Description

液浸系対物レンズを備えた顕微鏡で長時間にわたって実験動物を生きたまま観察するために用いられる浸液保持具及び観察部位固定装置、並びに、それらを備えた顕微鏡に関する。
二光子励起顕微鏡などの多光子励起顕微鏡により、マウスなどの実験動物を生きたまま観察することが可能となり、近年では、数時間以上の長時間にわたって実験動物を生きたまま観察するタイムラプス観察も行われている。このような観察は実験動物を眠らせた状態で行われるのが通常であるが、顕微鏡の視野と焦点深度はごく狭いことから、実験動物の同じ部位を継続して観察するためには、実験動物の呼吸や心拍などによって生じる観察部位の動きを抑える必要がある。
実験動物の観察部位の動きを抑える技術は、例えば、特許文献1に開示されている。特許文献1には、試料表面の動的な挙動を抑えるためのスタビライザを備えた顕微鏡観察システムが開示されている。特許文献1に開示される顕微鏡観察システムは、さらに、スタビライザを試料表面に吸着させるための吸着手段を備えていて、これにより、吸着部位近傍の試料表面の動的な挙動を抑えることができる。
特開2005−338631号公報
ところで、特許文献1には、乾燥系対物レンズにより試料を観察する顕微鏡観察システムが開示されているが、実験動物の観察では、液浸系対物レンズが用いられることも少なくない。
一般に、液浸系対物レンズを用いた観察は、液浸系対物レンズと試料(またはカバーガラス)との間に表面張力によって浸液が保持された状態で行われるが、表面張力によって保持し得る程度の量の浸液は、長時間にわたるタイムラプス観察では、観察期間中に蒸発してしまう。また、スライス標本とは異なり、生きている実験動物の表面形状は平らではないため、蒸発に備えて予め大量の液浸を供給しておくことも難しい。このため、生きている実験動物を長時間にわたってタイムラプス観察する場合には、観察期間中に、観察者が浸液を随時供給しなければならない。また、浸液を供給することによって浸液の温度変化が発生したり物理的に圧力が加えられたりするため、観察している部位が対物レンズの焦点深度から外れることも起こりうる。
以上のような実情を踏まえ、本発明は、浸液を長時間保持することができる浸液保持具、観察部位固定装置、及び、顕微鏡を提供することを目的とする。
本発明の第1の態様は、液浸系対物レンズを備えた顕微鏡による観察に用いられる浸液保持具であって、試料の観察部位を臨む第1の貫通穴が形成された、前記試料に固定される固定部と、底面が透明な平板からなる浸液を保持するための凹部が形成された浸液保持部と、を含み、前記透明な平板が前記第1の貫通穴を覆うように、前記液浸保持部が前記固定部と接合または一体に形成されている浸液保持具を提供する。
本発明の第2の態様は、第1の態様に記載の浸液保持具と、前記試料が置かれるステージに設置された、前記浸液保持具を支持する支持部と、を含む観察部位固定装置を提供する。
本発明の第3の態様は、第2の態様に記載の観察部位固定装置において、さらに、前記固定部と前記試料と前記透明な平板とにより囲まれた空間内の気体を吸引するための吸引部を含み、前記吸引部は、前記浸液保持具に形成された第2の貫通穴を介して前記空間内の気体を吸引する観察部位固定装置を提供する。
本発明の第4の態様は、第3の態様に記載の観察部位固定装置において、前記第2の貫通穴は、前記固定部の面であって前記透明な平板と接する面と同一の平面に形成された溝によって構成される観察部位固定装置を提供する。
本発明の第5の態様は、第3の態様に記載の試料固定装置において、前記第2の貫通穴は、前記固定部と前記浸液保持部とを接合するそれぞれの接合面に形成された溝によって構成される観察部位固定装置を提供する。
本発明の第6の態様は、第2の態様乃至第5の態様のいずれか1つに記載の観察部位固定装置において、前記支持部は、前記ステージに設置される支持部本体と、前記支持部本体から延出した前記浸液保持具を支持するアーム部と、前記アーム部を駆動して前記浸液保持具を前記ステージに対して相対的に移動させるための駆動部と、を備える観察部位固定装置を提供する。
本発明の第7の態様は、第2の態様乃至第6の態様のいずれか1つに記載の観察部位固定装置と、前記観察部位固定装置の浸液保持部に保持された浸液に浸される液浸系対物レンズと、前記試料が置かれるステージとを含む顕微鏡を提供する。
本発明によれば、浸液を長時間保持することができる浸液保持具、観察部位固定装置、及び、顕微鏡を提供することができる。
本発明の実施例1に係る顕微鏡の構成を示す図である。 本発明の実施例1に係る観察部位固定装置の構成を示す図である。 本発明の実施例1に係る浸液保持具の断面図である。 図3Aに示す浸液保持具の一部を拡大した断面図である。 本発明の実施例1に係る浸液保持具の変形例の断面図である。 図4Aに示す浸液保持具の変形例の一部を拡大した断面図である。 本発明の実施例1に係る浸液保持具の別の変形例の一部を拡大した断面図である。 本発明の実施例2に係る観察部位固定装置の構成を示す図である。 本発明の実施例2に係る浸液保持具の構成を示す図である。 図7Aに示す浸液保持具のBB断面における断面図である。 図7Aに示す浸液保持具を矢印Cに沿って見た図である。 本発明の実施例2に係る浸液保持具の変形例の構成を示す図である。 図8Aに示す浸液保持具のBB断面における断面図である。 図8Aに示す浸液保持具を矢印Cに沿って見た図である。 本発明の実施例3に係る観察部位固定装置の構成を示す図である。 浸液保持具の装着位置の一例を示す図である。 浸液保持具の装着位置の別の一例を示す図である。 浸液保持具の装着位置のさらに別の一例を示す図である。 本発明の実施例4に係る浸液保持具の構成を示す図である。
図1は、本実施例に係る顕微鏡の構成を示す図である。図1に示される顕微鏡1は、液浸系対物レンズ4を備えた二光子励起顕微鏡であり、試料である生きたマウス2を眠らせた状態で上方から観察する正立顕微鏡である。顕微鏡1は、マウス2の観察部位の経時的な変化を記録するタイムラプスユニットとして動作可能に構成されている。
顕微鏡1は、生きたマウス2の同じ部位を継続して観察するために、マウス2の観察部位を固定する観察部位固定装置10を備えている。観察部位固定装置10は、液浸系対物レンズ4を用いた長時間の観察を可能とするため、マウス2と液浸系対物レンズ4との間の空間を満たす浸液9を保持する役割を担っている。浸液9は、最も一般的には水であるが、使用される浸液は水に限られず、シリコーンオイルなどの他の浸液が用いられても良い。
顕微鏡1は、さらに、マウス2が置かれるステージ3と、液浸系対物レンズ4が装着されるZ方向に移動可能なノーズピース5と、マウス2に照射される励起光を出射するレーザ光源6と、マウス2からの蛍光が結像して得られる蛍光画像を目視するための接眼部7と、蛍光画像の画像データを生成するためにマウス2からの蛍光を検出して電気信号に変換するディテクタ8を備えている。なお、ステージ3は、液浸系対物レンズ4の光軸に直交するXY方向に移動可能に構成されていて、より好ましくは、さらに、液浸系対物レンズ4の光軸と平行なZ方向にも移動可能に構成されている。なお、顕微鏡1は、図示しないパーソナルコンピュータ(PC)に接続されても良く、PCによって顕微鏡1の各部の制御や画像データの生成などが行われてもよい。
図2は、本実施例に係る観察部位固定装置の構成を示す図である。図2を参照しながら、顕微鏡1に含まれる観察部位固定装置10の構成をさらに詳細に説明する。
観察部位固定装置10は、図2に示されるように、浸液9を保持する浸液保持具20と、浸液保持具20を支持する支持部30を備えている。なお、支持部30は、マウス2が置かれるステージ3に設置されている。
浸液保持具20は、さらに、浸液保持部21と固定部22を備えている。浸液保持部21は、浸液9を保持する役割を担っていて、全体として、対物レンズ側に凹面を向けた椀形状を呈している。浸液保持部21には、浸液9を保持するため、底面がカバーガラス23からなる凹部が形成されていて、その凹部には少なくとも1ccの浸液9を蓄えることが可能となっている。また、液浸系対物レンズ4の先端を浸液9に浸すことができるように、凹部の内径は液浸系対物レンズ4の先端部の外径よりも大きく形成されている。一方、固定部22は、マウス2の観察部位を固定する役割を担っていて、マウス2に直接接触して固定されるように構成されている。固定部22には、マウス2に固定された状態でマウス2の観察部位を臨む貫通穴(第1の貫通穴)が形成されていて、固定部22は、全体として、底面に貫通穴が設けられた凹面を試料側に向けた椀形状を呈している。マウス2との十分な大きさの接触面を確保してしっかりとマウス2の観察部位を固定するためには、凹面の面積は少なくとも1mm以上であることが望ましい。
そして、浸液保持部21は、カバーガラス23が貫通穴を覆うように、固定部22に接合されている。このため、レーザ光源6から出射された励起光L1は、液浸系対物レンズ4側からマウス2側に向かって透明な平板であるカバーガラス23を透過してマウス2に照射される。一方、励起光の照射によりマウス2から生じる蛍光L2は、マウス2側から液浸系対物レンズ4側に向かってカバーガラス23を透過して接眼部7またはディテクタ8に導かれる。
支持部30は、ステージ3に設置される支持部本体31と、支持部本体31から延出した浸液保持具20を支持するアーム部32を備えている。浸液保持具20が支持部30によりマウス2に押し付けられた状態で支持部30を介してステージ3に対して設置されることで、観察部位固定装置10はマウス2の観察部位を固定することができる。なお、アーム部32には、浸液保持具20が取り外し可能に装着されていて、実験動物の大きさや形状に合わせて異なる大きさまたは形状を有する任意の浸液保持具を装着することができる。
図3Aは、本実施例に係る浸液保持具の断面図である。図3Bは、図3Aに示す浸液保持具の一部を拡大した断面図である。図3A及び図3Bを参照しながら、観察部位固定装置10に含まれる浸液保持具20の構成をさらに詳細に説明する。
浸液保持部21は、より詳細には、図3Aに示されるように、凹部の底面を構成するカバーガラス23と、凹部の少なくとも側面を構成する浸液保持部本体24と、カバーガラス23と浸液保持部本体24との隙間を塞ぐためのOリング25と、Oリング25をカバーガラス23及び浸液保持部本体24に押さえつける押さえ部材26と、から構成されている。
浸液保持部本体24は、液浸系対物レンズ4の先端を内部に挿入し得るような環状部材であって、浸液保持部本体24に形成された凹部の底面の一部には、固定部22に形成されたマウス2の観察部位を臨む貫通穴29(第1の貫通穴)と略同径の貫通穴が形成されている。浸液保持具20では、浸液保持部本体24の凹部の底面上にカバーガラス23が配置されて、固定部22に形成された貫通穴29及び貫通穴29と略同径の浸液保持部本体24に形成された貫通穴を覆うことで、固定部22側の空間と浸液保持部本体24(浸液保持部21)側の空間とが分離される。なお、Oリング25及び押さえ部材26も、浸液保持部本体24と同様に環状部材である。カバーガラス23と浸液保持部本体24との隙間を塞ぐように配置されたOリング25は、浸液9が固定部22側の空間に漏れ出ることを防止するためのものである。図3Bに示すように、押さえ部材26に形成された雄ねじを浸液保持部本体24の内側面に形成された雌ねじに螺合させて、押さえ部材26がOリング25をカバーガラス23及び浸液保持部本体24に押しつけることで、浸液9が固定部22側の空間に漏れ出ることを確実に防止することができる。
以上のように構成された浸液保持具20は、カバーガラス23がマウス2の観察部位に接触するようにマウス2に固定される。浸液保持具20は、図1及び図2に示されるように、多くの浸液9を安定して浸液保持部21の凹部に保持することができるため、観察に必要な量の浸液9を長時間保持することができる。従って、浸液保持具20によれば、観察が長時間に及んだ場合であっても、観察期間中に浸液9を継ぎ足すことなく、液浸系対物レンズ4とカバーガラス23との間を浸液9で満たしておくことができる。
また、浸液保持具20を備えた観察部位固定装置10は、浸液保持具20がステージ3に設置された支持部30に支持されているため、浸液保持具20によってマウス2をステージ3上にしっかりと押さえつけることができる。このため、観察部位固定装置10によれば、長時間浸液9を保持できるとともに、観察期間中に生じるマウス2の呼吸や心拍などによる観察部位の動きを抑えることができる。
従って、観察部位固定装置10を備える顕微鏡1によれば、呼吸や心拍などによる観察部位の動きを抑えながら浸液9を長時間保持することができるため、マウス2の同じ部位を長時間継続して高い解像度で観察することができる。このため、数時間以上のわたる長時間のタイムラプス観察を、観察期間中に観察者が浸液9を継ぎ足すことなく行うことが可能であり、観察者の負担を大幅に軽減することができる。また、浸液を供給することによって浸液の温度変化が発生したり物理的に圧力が加えられたりすることで観察している部位が対物レンズの焦点深度から外れてしまう事態の発生を防止することができる。
なお、図3A及び図3Bでは、カバーガラス23が浸液保持部本体24の凹部の底面上に配置される例を示したが、図4A及び図4Bに示すように、浸液保持部本体44に接合される固定部42の接合面上に配置されても良い。カバーガラス23は、貫通穴29を覆うように配置され、且つ、浸液保持部に形成される凹部の底面を構成すればよい。また、図5に示すように、浸液保持部本体44と固定部42は、予め一体に形成されてもよい。これにより、浸液保持部本体44と固定部42の接合作業を省略することができる。
また、図3A及び図3Bに示される浸液保持具20と図4A及び図4Bに示される浸液保持具40では、浸液保持部本体と押さえ部材26が螺合することでカバーガラス23が固定されている。このような構成は、観察終了後、カバーガラス23を浸液保持具から容易に取り外して洗浄することができる点で好ましい。なお、カバーガラス23は、取り外し可能な任意の方法で固定されても良い。また、浸液保持具が使い捨て用に設計されている場合には、カバーガラス23は浸液保持部本体に接着剤により固定されても良い。
また、以上では、浸液保持具20の構成要素のうち励起光L1と蛍光L2が通過するカバーガラス23のみが透明な材料によって構成されている例を示したが、浸液保持具20を構成する他の構成要素も透明な材料によって構成されてもよい。これにより、浸液保持具20をマウス2に装着した状態であっても、観察部位を固定部22などを通して目視で確認することができる。このため、浸液保持具20の装着位置の微調整などの作業が容易になる。
図6は、本実施例に係る観察部位固定装置の構成を示す図である。本実施例に係る観察部位固定装置50は、浸液保持具20の代わりに浸液保持具60を備えている点、及び、負圧(つまり、大気圧より低い圧力状態)によってマウス2を浸液保持具60に固定するためのポンプ51及びチューブ52を備えている点が、実施例1に係る観察部位固定装置10と異なっている。また、図示しない本実施例に係る顕微鏡は、観察部位固定装置10の代わりに観察部位固定装置50を含む点が、実施例1に係る顕微鏡1と異なっている。その他の点は、顕微鏡1と同様である。
浸液保持具60は、浸液9を保持するための浸液保持部61とマウス2の観察部位を固定するための固定部62を備えていて、カバーガラス23が浸液保持部61に形成された凹部の底面を構成する点は、実施例1に係る浸液保持具20と同様である。
図7Aは、本実施例に係る浸液保持具の構成を示す図であり、図7A(a)に示す浸液保持具の上面図と図7(b)に示す浸液保持具の断面図とを併記したものである。図7Bは、図7Aに示す浸液保持具のBB断面における断面図である。図7Cは、図7Aに示す浸液保持具を矢印Cに沿って見た図である。図7Aから図7Cを参照しながら、試料固定装置50に含まれる浸液保持具60の構成について詳細に説明する。
図7A及び図7Bに示されるように、浸液保持具60は、カバーガラス23がOリング25及び押さえ部材26により浸液保持部本体64に固定されている点は、浸液保持具20と同様である。浸液保持具60は、浸液保持具60がマウス2に装着された状態でマウス2の観察部位を臨む貫通穴69(第1の貫通穴)に加えて、浸液保持具60がマウス2に装着された状態で固定部62とカバーガラス23とマウス2とにより囲まれる空間と浸液保持具60の外側面との間を貫通する貫通穴67(第2の貫通穴)が形成されている点が、浸液保持具20と異なっている。
貫通穴67は、図7Aから図7Cに示されるように、固定部62と浸液保持部本体64とを接合するそれぞれの接合面に形成された溝によって構成されている。貫通穴67は、図7A(a)において太い破線で示されているように、貫通穴69を中心に環状に形成された穴67aと、貫通穴69を中心に放射状に形成された穴67bと、穴67aと浸液保持具60の外側面との間を貫通する穴67cと、から構成されている。
チューブ52は、穴67cにつながっていて、ポンプ51は、貫通穴67及びチューブ52を介して、固定部62とカバーガラス23とマウス2とにより囲まれた空間内の気体を吸引する吸引部として機能する。これにより、上述した空間には負圧が発生して、マウス2がカバーガラス23及び固定部62に吸着されることで、浸液保持具60に観察部位が固定される。なお、ポンプ51の吸引力は、調整可能であることが望ましい。
従って、本実施例に係る観察部位固定装置50によれば、実施例1に係る観察部位固定装置10と同様に、長時間浸液9を保持することができるとともに、観察部位固定装置10に比べて、弱い押圧力でまたは押圧力を付与することなく観察期間中に生じるマウス2の呼吸や心拍などによる観察部位の動きを抑えることができる。このため、マウス2にかかる負担を軽減することができる。
なお、図7Aから図7Cでは、カバーガラス23が浸液保持部本体64の凹部の底面上に配置される例を示したが、図8Aから図8Cに示すように、カバーガラス23は浸液保持部本体74に接合される固定部72の接合面上に配置されても良い。この場合、貫通穴77は、固定部72の面であってカバーガラス23と接する面と同一の平面に形成された溝によって構成されていてもよい。そして、その貫通穴77(第2の貫通穴)は、図8A(a)において太い破線で示されているように、貫通穴67と同様に、貫通穴79(第1の貫通穴)を中心に環状に形成された穴77aと、貫通穴79を中心に放射状に形成された穴77bと、穴77aと浸液保持具70の外側面との間を貫通する穴77cと、から構成されていてもよい。貫通穴77は、ポンプ51が固定部とカバーガラス23とマウス2とにより囲まれた空間内の気体を吸引できれば、任意の場所に形成することができる。
図9は、本実施例に係る観察部位固定装置の構成を示す図である。本実施例に係る観察部位固定装置80は、支持部30の代わりに支持部90を備えている点が、実施例2に係る試料固定装置50と異なっている。また、図示しない本実施例に係る顕微鏡は、観察部位固定装置10の代わりに観察部位固定装置80を含む点が、実施例1に係る顕微鏡1と異なっている。その他の点は、顕微鏡1と同様である。
支持部90は、支持部本体31とアーム部32に加えて、3つの駆動部(駆動部93、駆動部94、駆動部95)を備えている点が、実施例2に係る支持部30と異なっている。駆動部93、駆動部94、駆動部95は、それぞれ直交する方向にアーム部32を駆動して、浸液保持具60をステージ3に対して相対的に移動させる機能を備えている。なお、3つの駆動部は、手動で操作されてもよく、または、電気的に操作されてもよい。
本実施例に係る試料固定装置80によれば、3つの駆動部を操作してマウス2に対する浸液保持具60の位置を変化させることで、例えば、図10A及び図10Bに示されるように、マウス2の任意の部位に浸液保持具60を装着して固定することができる。また、図10Cに示されるように、マウス2を仰向けにしてマウス2の腹部に浸液保持具60を装着して固定しても良い。そして、3つの駆動部による浸液保持具60に移動に合わせてステージ3も移動させることで液浸系対物レンズ4をカバーガラス23上に位置させることができる。なお、長時間浸液9を保持することができるとともに、弱い押圧力でまたは押圧力を付与することなく観察期間中に生じるマウス2の呼吸や心拍などによる観察部位の動きを抑えることができる点については、実施例2に係る観察部位固定装置50と同様である。
なお、実施例1では、押圧により試料に浸液保持具を固定する例を、実施例2及び実施例3では、吸着または押圧と吸着の併用により試料に浸液保持具を固定する例を示したが、他の方法によって試料に浸液保持具を固定してもよい。例えば、図11に示されるように、接着剤101により試料であるマウス2に浸液保持具100を固定してもよい。
上述した各実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。各実施例に係る浸液保持具、観察部位固定装置及び顕微鏡は、特許請求の範囲により規定される本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。
1・・・顕微鏡
2・・・マウス
3・・・ステージ
4・・・液浸系対物レンズ
5・・・ノーズピース
6・・・レーザ光源
7・・・接眼部
8・・・ディテクタ
9・・・浸液
10、50、80・・・観察部位固定装置
20、40、60、70、100・・・浸液保持具
21、61・・・浸液保持部
22、42、62、72・・・固定部
23・・・カバーガラス
24、44、64、74・・・浸液保持部本体
25・・・Oリング
26・・・押さえ部材
29、67、69、77、79・・・貫通穴
30、90・・・支持部
31・・・支持部本体
32・・・アーム部
51・・・ポンプ
52・・・チューブ
67a、67b、67c、77a、77b、77c・・・穴
93、94、95・・・駆動部
101・・・接着剤
L1・・・励起光
L2・・・蛍光

Claims (7)

  1. 液浸系対物レンズを備えた顕微鏡による観察に用いられる浸液保持具であって、
    試料の観察部位を臨む第1の貫通穴が形成された、前記試料に固定される固定部と、
    底面が透明な平板からなる浸液を保持するための凹部が形成された浸液保持部と、を含み、
    前記透明な平板が前記第1の貫通穴を覆うように、前記液浸保持部が前記固定部と接合または一体に形成されている
    ことを特徴とする浸液保持具。
  2. 請求項1に記載の浸液保持具と、
    前記試料が置かれるステージに設置された、前記浸液保持具を支持する支持部と、を含む
    ことを特徴とする観察部位固定装置。
  3. 請求項2に記載の観察部位固定装置において、さらに、
    前記固定部と前記試料と前記透明な平板とにより囲まれた空間内の気体を吸引するための吸引部を含み、
    前記吸引部は、前記浸液保持具に形成された第2の貫通穴を介して前記空間内の気体を吸引する
    ことを特徴とする観察部位固定装置。
  4. 請求項3に記載の観察部位固定装置において、
    前記第2の貫通穴は、前記固定部の面であって前記透明な平板と接する面と同一の平面に形成された溝によって構成される
    ことを特徴とする観察部位固定装置。
  5. 請求項3に記載の観察部位固定装置において、
    前記第2の貫通穴は、前記固定部と前記浸液保持部とを接合するそれぞれの接合面に形成された溝によって構成される
    ことを特徴とする観察部位固定装置。
  6. 請求項2乃至請求項5のいずれか1項に記載の観察部位固定装置において、
    前記支持部は、
    前記ステージに設置される支持部本体と、
    前記支持部本体から延出した前記浸液保持具を支持するアーム部と、
    前記アーム部を駆動して前記浸液保持具を前記ステージに対して相対的に移動させるための駆動部と、を備える
    ことを特徴とする観察部位固定装置。
  7. 請求項2乃至請求項6のいずれか1項に記載の観察部位固定装置と、
    前記観察部位固定装置の浸液保持部に保持された浸液に浸される液浸系対物レンズと、
    前記試料が置かれるステージと、を含む
    ことを特徴とする顕微鏡。
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