JP2023062347A - 画像校正色標及び画像校正方法 - Google Patents

Abstract

【課題】色標と病理標本との撮像環境の変化を抑制し、効率の良いデジタル画像の取得に寄与する画像校正色標を提供する。【解決手段】画像校正色標１は、顕微鏡にセット可能な透明部材１０と、透明部材１０上に設けられ、複数の色パッチを有するパッチ部２１と、透明部材１０上に設けられ、透明部材１０上に開口する少なくとも一つのウェルを有するウェル部２５とを備える。【選択図】図１

Description

本発明は、画像の色調校正に用いる色標に関する。この色標を用いた画像校正方法についても言及する。

病理診断医学は、病気の原因や発生機序の解明や病気の診断（病理診断）を目的とし、特に細胞、組織及び臓器の病理標本を、肉眼あるいは顕微鏡によって観察して診断を行なう医学の一分野である。
近年、病理診断医学において、デジタルカメラなどの撮像装置により、顕微鏡の視野範囲におけるスライドガラス上の病理標本の画像をデジタルカラー画像（以下、単に「デジタル画像」と称する。）として取得し、表示装置の表示画面に表示されたデジタル画像に基づいて病理医師が病理診断を行なうことも多い。

厚生労働省は、デジタル画像を用いた病理診断の検査において、診断の正確性を期すために、一人の病理医師の診断結果をそのまま採用するのではなく、複数の病理医師が診断を行うダブルチェックの必要性を求めている。
しかし、病理医師の数は全国的に十分とは言えず、一つの医療施設に２人以上の病理医師が常駐する病院数は、日本全体の病院の５％にも満たない（２０１５年度の厚生労働省データ）。そのため、現状においては、異なる医療施設に所属する複数の病理医師よりダブルチェックが行われることも少なくない。

このようなダブルチェックにおいて、最初に病理診断を行った病理医師は、ダブルチェックを行なう他の病理医師に対し、病理標本のデジタル画像を送信する。このとき、顕微鏡、撮像装置及び表示装置の各々の特性が、各病理医師の保有する装置間で異なっていると、病理標本のデジタル画像における画質や色再現の特性が均一に保てない。
このため、現状としては、ダブルチェックを行う病理医師に対して、病理標本自体が送付され、ダブルチェックとしての病理診断が行われている。

病理標本のデジタル画像を用いて好適にダブルチェックを行うことを可能とするために、画像の色調を校正するための色標が提案されている（例えば、非特許文献１）。
この色標は、デジタル画像の色の校正に用いられる。校正により、病理標本のデジタル画像から予測される三刺激値は、実際の測定で取得された三刺激値に対して、色差ΔＥ＊ａｂとして５から８の範囲内とできる。これにより、病理医師間における病理診断のダブルチェックを、病理標本のデジタル画像を用いて行なうことが可能となり、病理標本自体のやり取りを不要とできる。

Yuri Murakami, Hikaru Gunji, Fumikazu Kimura, Masahiro Yamaguchi, Yoshiko Yamashita, Akira Saito, Tokiya Abe, Michiie Sakamoto, Pinky A. Bautista, Yukako Yagi. "Color correction in whole slide digital pathology." 20th Color and Imaging Conference: Color Science and Engineering Systems, Technologies, and Applications, CIC 2012 - Los Angeles, CA, United States, 2012, Color and Imaging Conference Final Program and Proceedings:253-258.

非特許文献１における色標は、カラーフィルムを用いて作成されているため、サイズが１４．８（ｍｍ）×１４．８（ｍｍ）と大きい上、病理標本と同一のスライドガラス上に配置されているわけでなく、異なるスライドガラスに形成されている。このため、色標のデジタル画像を取得した後、色標が形成されたスライドガラスを外し、病理標本が取り付けられたスライドガラスを顕微鏡にセットする処理が必要となる。これにより、色標及び病理標本の各々の撮像における撮像環境（光源環境）が変化し、色標を用いた病理標本のデジタル画像における色の校正を正確に行いにくい。
また、非特許文献１における色標は、サイズが大きく、顕微鏡の一視野に色標の全体が入らないため、色標を構成する色標パッチを一つずつ別々に撮像する必要がある。また、色標の撮像と病理標本の撮像とで倍率を異ならせる必要もあり、煩雑である。

他の問題として、組織標本の染色のばらつきがある。ほとんどの病理標本においては、細胞核と結合し紫に染色されるヘマトキシリン（ヘマテイン）と、タンパク質等の細胞質に結合し赤あるいはピンク色に染色されるエオジンとの混合溶液により染色が行われているが、染色度合いや色合いに関する指標は決められておらず、染色濃度は施設ごとあるいは病理医ごとに異なるのが実情である。したがって、同一の組織標本を染色したとしても、そのばらつきによって診察の精度が影響を受ける可能性がある。

上記事情を踏まえ、本発明は、色標と病理標本との撮像環境の変化を抑制し、効率の良いデジタル画像の取得に寄与する画像校正色標を提供することを目的とする。

本発明の第一の態様は、画像校正色標である。
この画像校正色標は、顕微鏡にセット可能な透明部材と、透明部材上に設けられ、複数の色パッチを有するパッチ部と、透明部材上に設けられ、透明部材上に開口する少なくとも一つのウェルを有するウェル部とを備える。

本発明の第二の態様は、第一の態様に係る画像校正色標を用いた画像校正方法である。
この方法では、透明部材上に配置した標本のデジタル画像を取得し、パッチ部のデジタル画像を取得し、ウェル内にヘマトキシリン・エオジン染色が可能な染色材料を配置し、ウェル内にヘマトキシリン・エオジン染色液を入れて染色材料を染色した状態でウェル部のデジタル画像を取得する。
さらに、パッチ部のデジタル画像を用いて標本のデジタル画像の色を補正し、ウェル部のデジタル画像を用いて前記標本のデジタル画像のγ補正を行う。

本発明によれば、色標と病理標本との撮像環境の変化を抑制し、効率の良いデジタル画像の取得に寄与する画像校正色標を提供できる。

本発明の第一実施形態に係る画像校正色標を示す模式図である。 図１のＩ－Ｉ線における断面図である。 ウェル部の形成方法の一例を示す図である。 同画像校正色標の使用時の一形態を示す図である。 複数のウェルの透過率特性の一例を示すグラフである。 複数のウェルのＯＤ値の一例を示す表である。 同ＯＤ値に基づく検量線の一例を示すグラフである。

以下、本発明の一実施形態について、図１から図７を参照しながら説明する。図１は、本実施形態に係る画像校正色標１を示す模式平面図である。画像校正色標１は、透明部材１０と、透明部材１０上に形成された色標部２０とを備えている。
透明部材１０として、顕微鏡にセットして使用する公知のスライドガラスを好適に用いることができるが、顕微鏡にセットして使用することができれば、その材質はガラスに限定されない。

色標部２０は、複数の色パッチを含むパッチ部２１と、透明部材１０上に開口する深さの異なる複数のウェルを含むウェル部２５とを有する。
本実施形態においてパッチ部２１は、赤パッチＲ、緑パッチＧ、青パッチＢ、シアンパッチＣ、マゼンタパッチＭ、およびイエローパッチＹの６つの色パッチを有する。赤パッチＲ、緑パッチＧ、および青パッチＢは、ＲＧＢ表色系の３原色における色成分である。シアンパッチＣ、マゼンタパッチＭ、およびイエローパッチＹは、上記３原色のそれぞれに対する補色成分である。

赤パッチＲ、緑パッチＧ、青パッチＢは、ＸＹＺ表色系の刺激値Ｘ、刺激値Ｙ、刺激値Ｚそれぞれを求めるために必ず必要となる。シアンパッチＣ、マゼンタパッチＭ、およびイエローパッチＹは省略されてもよいが、設けることにより、刺激値Ｘ、刺激値Ｙ、刺激値Ｚの予測精度を向上できる。
他の態様として、上述の６色から任意の３色を選択したり、混合により生成した色パッチを組み合わせたりすることもできる。

図２は、図１のＩ－Ｉ線における断面図である。本実施形態において、ウェル部２５は、図２に示すように、それぞれ深さの異なる３つのウェル２５a、２５ｂ、および２５ｃを有する。各ウェル２５a、２５ｂ、２５ｃの底部には、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）が可能な染色材料２６が固定されている。
染色材料としては、各種の生体組織を例示でき、病理標本と同種の組織を固定したものなどが好適であるが、リン酸基を有する等により負に帯電して負電荷を有するものや、アスパラギン酸やグルタミン酸などの酸性アミノ酸基を有する等により正に帯電し正電荷を有するものなど、原理的にＨＥ染色が可能なものであれば、生体に由来しない有機材料や無機材料を用いることもできる。

パッチ部２１の各色パッチとウェル部２５の各ウェルとは、図１に示す画像校正色標１の平面視において、同形同大であり、６つの色パッチと３つのウェルが、二次元マトリクス状に整列配置されている。これにより、色標部２０全体としての平面視形状は、略正方形となっている。
色標部２０の寸法は、病理診断時における一般的な倍率の顕微鏡視野内に収まる大きさであることが好ましい。例えば、倍率４０倍の場合、視野径は約５００μｍであるため、色パッチやウェルの平面視形状が正方形である場合、一辺の長さは、２０μｍから５０μｍ程度とできる。

画像校正色標１は、透明部材１０上にパッチ部２１およびウェル部２５を形成することにより作製できる。パッチ部２１とウェル部２５とは、いずれが先に形成されてもよい。

パッチ部２１の各色パッチは、対応する色のカラーレジストをフォトリソグラフィによりパターニングすることで形成できる。したがって、設ける色パッチの数だけこの工程を繰り返すことにより、パッチ部２１を形成できる。
赤パッチＲ、緑パッチＧ、および青パッチＢの形成に使用するカラーレジストとしては、液晶ディスプレイのＡｄｏｂｅＲＧＢ規格に準拠したものが好適である。シアンパッチＣ、マゼンタパッチＭ、およびイエローパッチＹの形成に使用するカラーレジストとしては、多色カラーフィルタに用いられるものが好適である。
色パッチ間にブラックマトリクスを設けて色パッチの重なりを防いでもよい。例えば、色パッチをアライメント精度±３μｍ程度で形成する場合、幅５μｍのブラックマトリクスとして設けることにより、色パッチの混色や色抜け等を好適に防止できる。
色パッチの形成方法は、上述したパターニングには限られず、インクジェット法、印刷法、エッチング法、転写法、電着法等で形成されてもよい。

ウェル部を形成する手順の一例について、図３を参照して説明する。
前工程として透明部材１０を洗浄した後、図３の（ａ）に示すように、透明部材１０上にレジスト層１００を形成する。一般的にはドライフォトレジストを用いるが、直接描画タイプの感光性フィルムを用いることもできる。

次に、レジスト層１００をパターニングして、図３の（ｂ）に示すように、作製するウェルに対応する開口１００ａを形成する。

次に、図３の（ｃ）に示すように、開口１００ａからレーザＬを照射して透明部材１０の改質を行う。改質により、照射部位のエッチングレートが変化するため、開口１００ａごとに改質の程度を異ならせることにより、次工程で形成されるウェルの深さを異ならせることができる。
レーザのパルス幅はピコ秒からフェムト秒の範囲であることが好ましい。ナノ秒以上となると、１パルスあたりのエネルギー量の制御が困難となり、透明部材１０にマイクロクラックが発生して割れやすくなる。レーザパルスのエネルギーは、透明部材１０の材質等に応じて適宜設定でき、例えば、５μＪ以上１５０μＪ以下とできる。

次に、透明部材１０に対してエッチングを施す。例えば透明部材１０の材質がガラスである場合は、フッ化水素水によりエッチングを行う。透明部材１０は、上述したように、開口１００ａごとに改質の程度を異ならせているため、エッチングを終了すると、開口１００ａごとに穴の深さが異なるウェルが形成される。
エッチング後にレジスト層１００を除去すると、図３の（ｄ）に示すように、ウェル部２５が完成する。

最後に、図３の（ｅ）に示すように、各ウェルの底部に染色材料２６を取り付ける。例えば透明部材１０の材質がガラスである場合は、ウェルの底面をアミノ化してできた官能基によって固定することができる。固定方法はこれに限らず、接着等による固定でもよい。

画像校正色標１を用いた病理画像の構成方法について説明する。
準備作業として、図４に示すように、透明部材１０上に病理標本Ｓｐを載せる。さらに、ウェル部２５の各ウェルにＨＥ染色の染色液を入れる。染色液の量は、各ウェルが概ね満たされる程度とする。各ウェル染色液が入ると、ウェル内の染色材料２６は、染色液によって染色されるが、各ウェルは深さが異なっているため、各ウェルが染色液で概ね満たされていると、画像校正色標１の平面視において、それぞれ異なる色調となる。

まず、パッチ部２１およびウェル部２５を含む色標部２０の全体のデジタル画像と、病理標本Ｓｐのデジタル画像を取得する。可能であれば、色標部２０と病理標本Ｓｐとを同一視野内に収めて一つのデジタル画像を取得することが好ましいが、それぞれを撮像して２つのデジタル画像を取得してもよい。２つのデジタル画像を取得する場合は、照明や倍率等の条件をできるだけ揃えることが好ましい。また、２つのデジタル画像はいずれが先に取得されてもよく、パッチ部２１のデジタル画像とウェル部２５のデジタル画像が別々に取得されてもよい。

次に、色標部２０のデジタル画像を用いて、病理標本Ｓｐのデジタル画像の色調を補正する。
例えば、病理標本Ｓｐのデジタル画像の色成分Ｒ、色成分Ｇ、及び色成分Ｂの数値から、測色値としての刺激値Ｘ、刺激値Ｙ、刺激値Ｚそれぞれを、以下の（１）式により予測することを考える。（１）式において、変換行列Ｍは、標本デジタル画像の色成分Ｒ、色成分Ｇ及び色成分Ｂの数値から、刺激値Ｘ、刺激値Ｙ、刺激値Ｚそれぞれを求める行列である。

上記（１）式の変換行列Ｍ（３×４行列）を求める際、画像校正色標１に対して標準光源（例えば、ＣＩＥ(国際照明委員会)やＪＩＳ（日本工業規格）などで定められている標準の光Ｄ６５）を、校正色標の背面から照射した透過光を測定した刺激値Ｘ，刺激値Ｙ及び刺激値Ｚの各々と、撮像された色標デジタル画像の色成分Ｒ、色成分Ｇ及び色成分Ｂの各々の数値とを教師データとしている。教師データである刺激値Ｘ，刺激値Ｙ及び刺激値Ｚの各々と、色成分Ｒ、色成分Ｇ及び色成分Ｂの各々の数値とにより、重回帰分析などの手法を用いて、変換行列Ｍを求める。

このとき、他の色パッチの数値を（１）式に加えることもできる。例えば、病理標本の色がマゼンタ系であれば、（１）式に色パッチＭの数値を加えて変換行列Ｍを３×５行列とすることにより、精度を向上させることができる。

本実施形態において、パッチ部２１の赤パッチＲ、緑パッチＧ、および青パッチＢを形成するカラーレジストは、ＪＩＳ規格のＤ６５標準イルミナントを用いて計算されたＣＩＥ色度図のｘｙ座標系において、色成分Ｒの色度がｘ：０．６００以上、ｙ：０．３００～０．３６０、ピークの立ち上がり半値波長：５７０ｎｍ～６２０ｎｍであり、色成分Ｇの色度がｘ：０．１８０～０．２４０、ｙ：０．６００以上、ピーク波長：５００ｎｍ～５５０ｎｍであり、色成分Ｂの色度がｘ：０．１２０～０．１６０、ｙ：０．１００以下、ピーク波長：４３０ｎｍ～４８０ｎｍである。
また、マゼンタパッチＭは、ピーク波長が４００ｎｍ～５００ｎｍ、および６００ｎｍ～７００ｎｍの２つの波長領域にピークを持つマゼンタ系のカラーレジストを用いて形成されている。

次に、ウェル部２５の各ウェルの分光透過率から算出されるＯＤ（Optical Density：光学濃度）値を用いて、病理標本Ｓｐのデジタル画像のγ補正を行う。γ補正を行なうためには、少なくとも２階調分のＮＤ（Neutral Density）フィルタとしてのガンマ補正用パッチが必要となるが、上述したように、ウェル部２５の各ウェルのデジタル画像は、深さ（すなわち染色液の厚み）が異なるため階調が異なっており、複数階調分のＮＤ（Neutral Density）フィルタとして用いることができる。

複数のウェルを有するウェル部を用いたＯＤ値の取得の例を示す。
深さの比が１（ｔ／４）：２（ｔ／２）：４（ｔ）となる三つのウェルの底部に染色材料を配置し、ＨＥ染色液で満たした後に分光透過率を測定し、図５に示すような透過率特性のグラフを得た。透過率が最低となる波長５３５ｎｍにおける透過率に基づいてＯＤ値を算出したところ、図６に示す値であり、この値に基づいて図７に示すような検量線を取得できた。波長λにおけるＯＤ値（λ）は、以下の式により求めることができ、検量線は、プログラム等により測定装置に自動的に作成させることもできる。
ＯＤ値(λ)＝ｌｏｇ_１０（ＰＩ(λ)/ＰＴ(λ))
したがって、この３つのウェルのデジタル画像は、それぞれＯＤ＝０．６６、０．３３、０．１６のＮＤフィルタとして機能するガンマ補正用パッチとして画像校正に利用できる。

以上、本発明の一実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の構成の変更、組み合わせなども含まれる。以下にそのような変更のいくつかを例示するが、これらはすべてではなく、それ以外の変更も可能である。これらの変更が２以上適宜組み合わされてもよい。

・色標部は、モノトーンのγ補正パッチを含んでもよい。
・ウェル部のウェルは１つでもよい。この場合、ウェル部のデジタル画像を用いたγ補正はできなくなるが、ウェル部のデジタル画像をリファレンスとして用いることにより、補正の精度を向上できる。

・ウェル部内に染色材料が配置されていなくてもよい。この場合、使用者が病理標本の小片や病理標本でない同種組織の小片をウェル内に配置してウェル内を染色液でみたすことにより、概ね上述した内容と同様のγ補正を行うことができる。

・色標部において、パッチ部とウェル部が透明部材の異なる面に設けられてもよい。例えば、ウェル部を標本が設置される側である上面に形成し、パッチ部を反対側の下面に形成してもよい。このような構成であっても、透明部材を通してパッチ部の色彩を視認できるため、画像の校正が可能である。

・本発明に係る画像校正色標の適用範囲は、実施形態で説明した病理診断には限られない。例えば、ヒト以外の各種動物の標本、種、花びら、葉などの各種植物標本、石、鉱石、金属などの各種無機物標本の等の顕微観察に適用しても、色再現の精度向上に寄与できる。

１ 画像校正色標
１０ 透明部材
２０ 色標部
２１ パッチ部
２５ ウェル部
２５ａ、２５ｂ、２５ｃ ウェル

Claims (8)

1. 顕微鏡にセット可能な透明部材と、
   前記透明部材上に設けられ、複数の色パッチを有するパッチ部と、
   前記透明部材上に設けられ、前記透明部材上に開口する少なくとも一つのウェルを有するウェル部と、
   を備える、
   画像校正色標。
2. 前記ウェル部は、深さの異なる複数の前記ウェルを有する、
   請求項１に記載の画像校正色標。
3. 前記ウェル部は、深さの異なる２つの前記ウェルを有し、一方のウェルの深さが他方のウェルの深さの４０以上６０％以下である、
   請求項２に記載の画像校正色標。
4. 前記ウェル内に、ヘマトキシリン・エオジン染色が可能な染色材料が配置されている、
   請求項１から３のいずれか一項に記載の画像校正色標。
5. 前記染色材料が生体由来である、
   請求項４に記載の画像校正色標。
6. 前記透明部材はガラスからなり、
   前記染色材料は、ガラスをアミノ化してできた官能基によって前記ウェルの底部に固定されている、
   請求項４に記載の画像校正色標。
7. 前記パッチ部および前記ウェル部からなる色標部が、直径５００μｍの円内に配置できるように前記色パッチおよび前記ウェルの寸法及び配置が設定されている、
   請求項１に記載の画像校正色標。
8. 請求項１に記載の画像校正色標を用いた画像の校正方法であって、
   前記透明部材上に配置した標本のデジタル画像を取得し、
   前記パッチ部のデジタル画像を取得し、
   前記ウェル内にヘマトキシリン・エオジン染色が可能な染色材料を配置し、前記ウェル内にヘマトキシリン・エオジン染色液を入れて前記染色材料を染色した状態で前記ウェル部のデジタル画像を取得し、
   前記パッチ部のデジタル画像を用いて前記標本のデジタル画像の色調を補正し、
   前記ウェル部の分光透過率から算出される光学濃度値を用いて前記標本のデジタル画像のγ補正を行う、
   画像校正方法。

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