JP2023025223A - Klk1、klk4、又は、klk4及びklk8を阻害するペプチド - Google Patents
Klk1、klk4、又は、klk4及びklk8を阻害するペプチド Download PDFInfo
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Abstract
Description
domainから成る7kDaのタンパク質である。ヒト生体内では精巣や精嚢で発現しており、trypsin/acrosin inhibitorとして機能する(非特許文献8)。SPINK2自身がKLK1、KLK4、又は、KLK4及びKLK8二重阻害剤になりうることを示唆する知見はない。
(1)
配列番号23(図29)で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、KLK1の有するプロテアーゼ活性を特異的に阻害するSPINK2変異体ペプチド、
(2)
1乃至13番目のXaa(X1乃至X13)がCys及びPro以外のアミノ酸である、(1)記載のペプチド、
(3)
1番目のXaa(X1)がAsp又はGlyである、(1)又は(2)記載のペプチド、
(4)
2番目のXaa(X2)はAla、Asp又はSer、3番目のXaa(X3)はIle、Gln、Arg又はVal、4番目のXaa(X4)はAla、Asn又はTyr、5番目のXaa(X5)はLeu、Lys、Asn又はGln、6番目のXaa(X6)はIle、Arg、Tyr又はVal、7番目のXaa(X7)はAsp、Arg又はVal、8番目のXaa(X8)はAsp、Ile又はArg、9番目のXaa(X9)は
Phe、His又はTrp、10番目のXaa(X10)はTyr又はTrp、11番目のXaa(X11)はAla、Thr又はTyr、12番目のXaa(X12)はSer又はTyr、並びに、13番目のXaa(X13)はGlu、Lys又はGlnである、(1)乃至(3)のいずれか一つに記載のペプチド、
(5)
配列番号5乃至8(図11乃至14)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、(1)乃至(4)のいずれか一つに記載のペプチド、
(6)
配列番号23(図29)で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、KLK4の有するプロテアーゼ活性を特異的に阻害するSPINK2変異体ペプチド、
(7)
1乃至13番目のXaa(X1乃至X13)がCys及びPro以外のアミノ酸である、(6)記載のペプチド、
(8)
1番目のXaa(X1)がAsp又はGlyである、(6)又(7)記載のペプチド、(9)
2番目のXaa(X2)はGlu、Arg又はSer、3番目のXaa(X3)はHis、Lys、Leu又はGln、4番目のXaa(X4)はAla、Gln又はTyr、5番目のXaa(X5)はAla、Glu、Gln又はVal、6番目のXaa(X6)はGlu、Leu、Met又はTyr、7番目のXaa(X7)はAsp又はGly、8番目のXaa(X8)はAla又はVal、9番目のXaa(X9)はGln、10番目のXaa(X10)はLys又はArg、11番目のXaa(X11)はIle、Leu又はThr、12番目のXaa(X12)はPhe又はTyr、並びに、X13)はLys、Leu又はGlnである、(6)乃至(8)のいずれか一つに記載のペプチド、
(10)
配列番号9乃至12(図15乃至18)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、(6)乃至(9)のいずれか一つに記載のペプチド、
(11)
配列番号23(図29)で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、KLK4の有するプロテアーゼ活性及びKLK8の有するプロテアーゼ活性を特異的に阻害するSPINK2変異体ペプチド、
(12)
1乃至13番目のXaa(X1乃至X13)がCys及びPro以外のアミノ酸である、(11)記載のペプチド、
(13)
1番目のXaa(X1)がAsp又はGlyである、(11)又(12)記載のペプチド、
(14)
2番目のXaa(X2)はGly、Met、Gln、Arg、Ser又はThr、3番目のXaa(X3)はLys又はArg、4番目のXaa(X4)はPhe、His、Gln又はTyr、5番目のXaa(X5)はHis、Lys、Arg、Ser、Thr、Val又はTyr、6番目のXaa(X6)はIle、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Val又はTrp、7番目のXaa(X7)はAsp、Glu、Gly、His、Asn、Arg、Val又はTrp、8番目のXaa(X8)はGly又はTrp、9番目のXaa(X9)はAla、Phe、Asn、Ser又はThr、10番目のXaa(X10)はLys又はArg、11番目のXaa(X11)はIle、Met、Gln、Ser又はVal、12番目のXaa(X12)はPhe、Leu又はTyr、並びに、13番目のXaa(X13)はAla、Asp、Glu又はAsnである、(11)乃至(13)のいずれか一つに記載のペプチド、
(15)
配列番号13乃至22(図19乃至28)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、(11)乃至(14)のいずれか一つに記載のペプチド、
(16)
配列番号23(図29)で示されるアミノ酸配列のアミノ末端側に、1乃至3個のアミノ酸残基が付加してなるアミノ酸配列、又は、配列番号26(図32)で示されるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、(1)乃至(15)のいずれか一つに記載のペプチド、
(17)
配列番号23(図29)で示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側に、1乃至6個のアミノ酸からなるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、(1)乃至(16)のいずれか一つに記載のペプチド、
(18)
3つのジスルフィド結合を有し、ループ構造、αへリックス及びβシートを含むことで特徴付けられる立体構造を有する、(1)乃至(17)のいずれか一つに記載のペプチド、
(19)
(1)乃至(18)のいずれか一つに記載のペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(20)
(19)記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
(21)
(19)記載のポリヌクレオチド若しくは(20)記載のベクターを含むか又は(1)乃至(18)のいずれか一つに記載のペプチドを産生する細胞、
(22)
下記工程(i)及び(ii)を含む、SPINK2変異体ペプチドの製造方法:
(i)(21)記載の細胞を培養する工程;
(ii)該培養物からSPINK2変異体ペプチドを回収する工程、
(23)
(1)乃至(18)のいずれか一つに記載のペプチドを化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該ペプチドの製造方法、
(24)
(22)又は(23)記載の方法により得られるSPINK2変異体ペプチド、
(25)
(1)乃至(18)及び(24)のいずれか一つに記載のペプチドに他の部分が結合してなるコンジュゲート、
(26)
ペプチドである、(25)記載のコンジュゲート、
(27)
免疫グロブリンのFc領域又はその機能断片を含む、(25)又は(26)記載のコンジュゲート、
(28)
下記工程(i)及び(ii)を含む、(25)乃至(27)のいずれか一つに記載のSPINK2変異体ペプチドコンジュゲートの製造方法:
(i)該コンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む細胞を培養する工程:
(ii)該培養物からSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を回収する工程、
(29)
(25)乃至(27)のいずれか一つに記載のSPINK2変異体ペプチドコンジュゲ
ート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該コンジュゲートの製造方法、
(30)
(28)又は(29)記載の方法により得られるSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート、
(31)
(1)乃至(18)及び(24)のいずれか一つに記載のペプチドに結合する抗体又はその結合断片、
(32)
(1)乃至(18)及び(24)のいずれか一つに記載のペプチド、(19)記載のポリヌクレオチド、(20)記載のベクター、(21)記載の細胞、(25)乃至(27)及び(30)のいずれか一つに記載のコンジュゲート、及び/又は、(31)記載の抗体もしくはその結合断片を含む組成物、
(33)
(1)乃至(18)及び(24)のいずれか一つに記載のペプチド、(19)記載のポリヌクレオチド、(20)記載のベクター、(21)記載の細胞、及び/又は、(25)乃至(27)及び(30)のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む医薬組成物、
(34)
KLK1関連疾患、KLK4関連疾患及び/又はKLK8関連疾患の治療用又は予防用である、(33)記載の医薬組成物、
(35)
(1)乃至(18)及び(24)のいずれか一つに記載のペプチド、(19)記載のポリヌクレオチド、(20)記載のベクター、(21)記載の細胞、(25)乃至(27)及び(30)のいずれか一つに記載のコンジュゲート、及び/又は、(31)記載の抗体もしくはその結合断片を含む、検査用又は診断用組成物、及び、
(36)
(31)記載の抗体又はその結合断片を用いたアフィニティー精製工程を含む、(22)、(23)、(28)又は(29)に記載の製造方法、
等に関する。
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子又はその相補鎖を意味し、一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上からなり、DNA鎖とRNA鎖の会合体、一本の鎖上にリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドが混在するもの及びそのよう鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上の核酸分子も「遺伝子」の意味に含まれる。
又は結合作用をまとめて「X結合活性」という。)ペプチドを、「X結合ペプチド」と呼ぶことができる。さらに、標的分子Xを認識し、又は標的分子Xに結合し、かつ標的分子Xの有する1つ又は2つ以上の活性又は機能を阻害又は抑制する(以下、それらの阻害又は抑制作用をまとめて「X阻害活性」という。)ペプチドを、「X阻害ペプチド」と呼ぶことができる。
「KLK1阻害ペプチド」、「KLK4阻害ペプチド」及び「KLK4/KLK8阻害ペプチド」の範囲には、当該ペプチドの断片、他の部分(moiety)が当該ペプチド又はその断片に付加又は結合してなるコンジュゲートのうち、KLK1阻害(結合)活性、KLK4阻害(結合)活性、又は、KLK4/KLK8阻害(結合)活性を維持しているものがそれぞれ含まれる。すなわち、KLK1阻害(結合)活性、KLK4阻害(結合)活性、又は、KLK4阻害(結合)活性及びKLK8阻害(結合)活性を維持する当該ペプチドの断片、付加体及び修飾体(コンジュゲート)も「KLK1阻害ペプチド」、「KLK4阻害ペプチド」又は「KLK4/KLK8阻害ペプチド」にそれぞれ含まれる。
2-1.アミノ酸
「アミノ酸」は、アミノ基及びカルボキシル基を含む有機化合物であり、好適には蛋白質に、より好適には天然の蛋白質に、構成単位として含まれるα-アミノ酸を意味する。本発明において、より好適なアミノ酸は、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及びValであり、特に明記しない限り「アミノ酸」はこれらの計20アミノ酸を意味する。それらの計20アミノ酸を「天然アミノ酸」と呼ぶことができる。本発明のKLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、又は、KLK4/KLK8阻害ペプチドは、好適には天然アミノ酸を含有する。
(1)疎水性アミノ酸グループ:Met、Ala、Val、Leu、Ile
(2)中性親水性アミノ酸グループ:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
(3)酸性アミノ酸グループ:Asp、Glu
(4)塩基性アミノ酸グループ:His、Lys、Arg
(5)主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ:Gly、Pro
(6)芳香族アミノ酸グループ:Trp、Tyr、Phe
ただし、天然アミノ酸の分類はこれらに限定されるものではない。
(1)非極性アミノ酸グループ:アラニン(以下、「Ala」又は単に「A」と記す)、バリン(以下、「Val」又は単に「V」と記す)、ロイシン(以下、「Leu」又は単に「L」と記す)、イソロイシン(以下、「Ile」又は単に「I」と記す)、プロリン(以下、「Pro」又は単に「P」と記す)、フェニルアラニン(「Phe」又は単に「F」と記す)、トリプトファン(以下、「Trp」又は単に「W」と記す)、メチオニン(以下、「Met」又は単に「M」と記す)
(2)非荷電極性アミノ酸グループ:グリシン(以下、「Gly」又は単に「G」と記す)、セリン(以下、「Ser」又は単に「S」と記す)、スレオニン(以下、「Thr」又は単に「T」と記す)、システイン(以下、「Cys」又は単に「C」と記す)、チロシン(以下、「Tyr」又は単に「Y」と記す)、アスパラギン(以下、「Asn」又は単に「N」と記す)、グルタミン(以下、「Gln」又は単に「Q」と記す)
(3)酸性アミノ酸グループ:アスパラギン酸(以下、「Asp」又は単に「D」と記す)、グルタミン酸(以下、「Glu」又は単に「E」と記す)
(4)塩基性アミノ酸グループ:リジン(以下、「Lys」又は単に「K」と記す)、アルギニン(以下、「Arg」又は単に「R」と記す)、ヒスチジン(以下、「His」又は単に「H」と記す)
本発明において、アミノ酸は、天然アミノ酸以外のアミノ酸であってもよい。例えば、天然のペプチドや蛋白質において見出されるセレノシステイン、N-ホルミルメチオニン、ピロリジン、ピログルタミン酸、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、O-ホスホセリン、デスモシン、β-アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γアミノ酪酸、オパイン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、アクロメリン酸等をあげることができ、ノルロイシン、Ac-アミノ酸、Boc-アミノ酸、Fmoc-アミノ酸、Trt-アミノ酸、Z-アミノ酸等のN末端保護アミノ酸、アミノ酸t-ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、フルオレニルエステル等のC末端保護アミノ酸、ジアミン、ωアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、アミノ酸のTic誘導体、アミノフォスフォン酸を含むその他の天然界には見出されないアミノ酸等をあげることができるが、それらに限らず上記20の「天然アミノ酸」以外のアミノ酸を、本発明では便宜的に「非天然アミノ酸」と総称する。
本発明のペプチドは、KLK1阻害活性、KLK4阻害活性、又は、KLK4/KLK8阻害活性を有する。
在性の基質、外因性の基質、合成基質等、特に限定されるものではない。KLK1のヒトの内在性の基質としては、低分子キニノーゲンやカリスタチン、コラーゲン等を例示することができる。KLK4のヒトの内在性の基質としては、Pro-KLK3やフィブロネクチン、コラーゲン等を例示することが出来る。KLK8のヒトの内在性の基質としては、tPAやフィブロネクチン、コラーゲン等を例示することが出来る。コラーゲンを熱変性して得られるゼラチンも基質として用いることができる。合成基質としては、特に限定されないが、PFR-AMCやBoc-VPR-AMC等を例示することができる。本発明のKLK1阻害ペプチドのKLK1阻害活性(IC50又はKi)、KLK4阻害ペプチドのKLK4阻害活性、及び、KLK4/KLK8阻害活性は、それぞれ1μM以下、好適には100nM以下、より好適には10nM以下、より一層好適には1nM以下である。また、KLK4/KLK8阻害ペプチドは、KLK4阻害活性とKLK8阻害活性(いずれもIC50又はKi)の相対的な大小により分類することができ、好適には、(i)KLK4阻害活性がKLK8阻害活性の0.5倍未満、(ii)KLK4阻害活性がKLK8阻害活性の差の0.5倍以上2倍未満、(iii)KLK4阻害活性がKLK8阻害活性の2倍以上、の3群に分類され、治療等の用途に応じてそれらの群から所望のペプチドが選択され得る。例えば、KLK4関連疾患治療効果に比して相対的に強いKLK8関連疾患治療効果が望まれる場合、上記(i)に属するペプチドが治療のために好適に選択され得る。
る。
4/KLK8を認識して結合したKLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、又は、KLK4/KLK8阻害ペプチドを検出する方法が挙げられる。KLK1、KLK4、又は、KLK4/KLK8の固相化には、ビオチン-ストレプトアビジンの他、KLK1、KLK4、もしくは、KLK4/KLK8、又は、KLK1、KLK4、もしくは、KLK4/KLK8に融合したタグを認識する固相用抗体等を利用することができる。KLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、又は、KLK4/KLK8阻害ペプチドの検出には、標識されたストレプトアビジンの他、KLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、もしくは、KLK4/KLK8阻害ペプチド、又は、KLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、もしくは、KLK4/KLK8阻害ペプチドに融合したタグを認識する標識された検出用抗体等を利用することができる。標識には、ビオチンの他、HRP、アルカリフォスファターゼ、FITC等生化学的解析に実施可能な方法を利用することができる。酵素標識を利用した検出にはTMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)、BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)、p-NPP(p-nitrophenyl phosphate)、OPD(o-Phenylenediamine)、ABTS(3-Ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)、SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific)等の発色基質やQuantaBlu(登録商標)Fluorogenic Peroxidase Substrate(Thermo Fisher Scientific)等の蛍光基質、及び化学発光基質を用いることができる。検出シグナルの測定には、吸光プレートリーダー、蛍光プレートリーダー、発光プレートリーダー、RI液体シンチレーションカウンター等を利用することができる。
SA法における結合活性EC50をあげることができる。他の判定基準としては、例えば、解離定数(dissociation constant:以下、「KD」という)をあげることができる。本発明におけるKLK1阻害ペプチドのKLK1に対するKD値、KLK4阻害ペプチドのKLK4に対するKD値、又は、KLK4/KLK8阻害ペプチドのKLK4及びKLK8に対するKD値は1×10-5M以下、5×10-6M以下、2×10-6M以下又は1×10-6M以下、より好適には5×10-7M以下、2×10-7M以下又は1×10-7M以下、より一層好適には5×10-8M以下、2×10-8M以下又は1×10-8M以下、さらにより一層好適には5×10-9M以下、2×10-9M以下又は1×10-9M以下である。他の判定基準としては、例えば、免疫沈降法での解析結果をあげることができる。本発明における好適なKLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、又は、KLK4/KLK8阻害ペプチドをビーズに固相化し、それぞれKLK1、KLK4、又は、KLK4及びKLK8を添加した後にビーズを分離し、ビーズと共に沈殿したKLK1、KLK4、又は、KLK4及びKLK8を検出した場合、KLK1、KLK4、又は、KLK4及びKLK8のシグナルが検出される。
のアミノ酸配列(配列番号1:図7)の:
16番Ser~22番Glyのうち1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又は7つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており;
24番Pro~28番Asnのうち1つ、2つ、3つ、4つ又は5つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており;
15番Cys、23番Cys、31番Cys、42番Cys、45番Cys及び63番Cysは、天然型のジスルフィド結合を維持するためには野生型と同じくCysであることが好ましく、天然型のジスルフィド結合を消失させたり、非天然型のジスルフィド結合を生じさせたりするためには、それらのうち1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つを他のアミノ酸に置換してもよい。本発明のSPINK2変異体うち一部の好適なKLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、又は、KLK4/KLK8阻害ペプチドにおいては、天然型と同じ当該6箇所にCysが維持され、ジスルフィド結合が保持されている。かかるペプチドのうちより好適な一部の態様においては、15番Cys-45番Cys、23番Cys-42番Cys、及び、31番Cys-63番Cysが、それぞれジスルフィド結合を形成している。
1番Xaa(X1)はAsp又はGly;
16番Xaa(X2)はAla、Asp又はSer;
17番Xaa(X3)はIle、Gln、Arg又はVal;
18番Xaa(X4)はAla、Asn又はTyr;
19番Xaa(X5)はLeu、Lys、Asn又はGln;
20番Xaa(X6)はIle、Arg、Tyr又はVal;
21番Xaa(X7)はAsp、Arg又はVal;
22番Xaa(X8)はAsp、Ile又はArg;
24番Xaa(X9)はPhe、His又はTrp;
25番Xaa(X10)はTyr又はTrp;
26番Xaa(X11)はAla、Thr又はTyr;
27番Xaa(X12)はSer又はTyr;及び
28番Xaa(X13)はGlu、Lys又はGln
である。
1番Xaa(X1)はAsp又はGly;
16番Xaa(X2)はGlu、Arg又はSer;
17番Xaa(X3)はHis、Lys、Leu又はGln;
18番Xaa(X4)はAla、Gln又はTyr;
19番Xaa(X5)はAla、Glu、Gln又はVal;
20番Xaa(X6)はGlu、Leu、Met又はTyr;
21番Xaa(X7)はAsp又はGly;
22番Xaa(X8)はAla又はVal;
24番Xaa(X9)はGln;
25番Xaa(X10)はLys又はArg;
26番Xaa(X11)はIle;
27番Xaa(X12)はPhe又はTyr;及び
28番Xaa(X13はLys、Leu又はGln
である。
1番Xaa(X1)はAsp又はGly;
16番Xaa(X2)はGly、Met、Gln、Arg、Ser又はThr;
17番Xaa(X3)はLys又はArg、X4はPhe、His、Gln又はTyr;
18番Xaa(X4)はPhe、His、Gln又はTyr;
19番Xaa(X5)はHis、Lys、Arg、Ser、Thr、Val又はTyr;
20番Xaa(X6)はIle、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Val又はTrp;
21番Xaa(X7)はAsp、Glu、Gly、His、Asn、Arg、Val又はTrp;
22番Xaa(X8)はGly又はTrp;
24番Xaa(X9)はAla、Phe、Asn、Ser又はThr;
25番Xaa(X10)はLys又はArg;
26番Xaa(X11)はIle、Met、Gln、Ser又はVal;
27番Xaa(X12)はPhe、Ler又はTyr;及び
28番Xaa(X13)はAla、Asp、Glu又はAsn
である。
(a1)配列番号5乃至8(図11乃至14)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列;(a2)(a1)に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK1阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列;
(a3)(a1)に記載のアミノ酸配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK1阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列;及び、
(a4)(a1)に記載のアミノ酸配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK1阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、
(b1)配列番号9乃至12(図15乃至18)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列;
(b2)(b1)に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK4阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列;
(b3)(b1)に記載のアミノ酸配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK4阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列;及び、
(b4)(b1)に記載のアミノ酸配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK4阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、又は、
(c1)配列番号13乃至22(図19乃至28)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列;
(c2)(c1)に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK4/KLK8阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列;
(c3)(c1)に記載のアミノ酸配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK4/KLK8阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列;及び、
(c4)(c1)に記載のアミノ酸配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK4/KLK8阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、
本発明のKLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、又は、KLK4/KLK8阻害ペプチドに、そのフォールディング安定性、熱安定性、保存安定性、血中半減期、水溶性、生物活性、薬理活性、副次的作用等を改善する目的で、変異を導入することができる。例えば、ポリエチレングルコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、ビオチン、ペプチド又は蛋白質等の他の物質にコンジュゲートさせるため、Cysのような新たな反応性基を変異により導入することができる。
本発明のペプチドは、例えば、そのC末に、ビオチン、Strepタグ(登録商標)、StrepタグII(登録商標)、His6等のオリゴヒスチジン、ポリヒスチジン、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合蛋白質、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)、ジゴキシゲニンやジニトロフェノール等のハプテン、FLAG(登録商標)等のエピトープタグ、mycタグ、HAタグ等(以下まとめて「アフィ二ティー・タグ」と呼ぶ)を含むことができる。タグ付加体も、本発明のコンジュゲートに、その一部の態様として含まれ得る。本発明のコンジュゲートは、全体としてペプチド(ポリペプチド)であってもよい。
8阻害ペプチド(のアミノ酸配列)には、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸のいずれをも含むことができ、天然アミノ酸としてはL-アミノ酸及びD-アミノ酸のいずれをも含むことができる。
KLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、及び、KLK4/KLK8阻害ペプチドは、SPINK2のアミノ酸配列又は本発明のKLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、及び、KLK4/KLK8阻害ペプチドの有するアミノ酸配列(例えば、配列番号5乃至8:図11乃至14からなる群、配列番号9乃至12:図15乃至18からなる群、又は、配列番号13乃至22:図19乃至28からなる群から選択されるアミノ酸配列)、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列を含む核酸分子等を出発材料として、当業者に周知の方法により、同定することができる。好適な一例として、ヒトSPINK2変異体ライブラリーより、KLK1阻害活性、KLK4阻害活性、又は、KLK4/KLK8阻害活性を指標としてそれぞれ同定することができ、KLK1、KLK4、又は、KLK4/KLK8に対する結合活性もそれぞれ指標として組み合わせてもよい。
al.(1993年)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
90巻,10444-10448頁)。
水性領域、シグナル配列、活性ドメイン、細胞壁ドメイン等が含まれ、それらを操作する
ことにより、酵母の細胞表面上に所望の蛋白質をディスプレイすることができる。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるDNA群を酵母ディスプレイに適したベクターに導入し、当該ベクターで酵母細胞を形質転換すれば、形質転換酵母細胞表面上に、ランダム変異誘発された蛋白質群を提示するライブラリーを得ることができる(Ueda,M.& Tanaka,A.、Biotechnol.Adv.、18巻、121頁~、2000年刊:Ueda,M.& Tanaka,A.、J.Biosci.Bioeng.、90巻、125頁~、2000年刊等)。
れる融合遺伝子を該ファージミドに挿入して細菌に感染させ、該細胞を培養すれば、かかるペプチドを、該細菌上又はファージ様粒子上に発現もしくは提示(ディスプレイと同義)させるか、又は、該被覆蛋白質との融合蛋白質としてファージ粒子中もしくは該細菌の培養上清中に産生することができる。
ム変異を誘発して得られるmRNA群とピューロマイシン等のリンカー、及び、無細胞蛋白質合成系を利用することで、ランダム変異誘発された蛋白質群がリボゾーム上に提示されたライブラリーを得ることができる(Nemoto N,et al.(1997年)FEBS Lett. 414巻2号,405-408頁)。
(a1)配列番号5乃至8(図11乃至14)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(a2)(a1)に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK1阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(a3)(a1)に記載のヌクレオチド配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK1阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び、
(a4)(a1)に記載のヌクレオチド配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK1阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列:
(b1)配列番号5乃至8(図11乃至14)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(b2)(b1)に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK4阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(b3)(b1)に記載のヌクレオチド配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃
至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK4阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び、
(b4)(b1)に記載のヌクレオチド配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK4阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列:
(c1)配列番号13乃至22(図19乃至28)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(c2)(c1)に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK4/KLK8阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(c3)(c1)に記載のヌクレオチド配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK4/KLK8阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び、
(c4)(c1)に記載のヌクレオチド配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK4/KLK8阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
KLK4/KLK8阻害ペプチドは、分子内ジスルフィド結合を有する。分子内ジスルフィド結合を有するペプチドは、シグナル配列等を用いて、酸化性の酸化還元環境を有する細胞区間に送達させることが好ましい場合がある。酸化性環境は、大腸菌等のグラム陰性細菌の周辺質、グラム陽性細菌の細胞外環境、真核細胞の小胞体内腔等により提供することが可能であり、かかる環境下では、構造的なジスルフィド結合の形成が促進され得る。また、大腸菌等の宿主細胞の細胞質において分子内ジスルフィド結合を有するペプチドを作製することも可能であり、その場合ペプチドは、可溶性の折り畳まれた状態で直接的に獲得されるか、又は封入体の形態で回収され、次いでイン・ビトロで復元され得る。さらに、酸化性の細胞内環境を有する宿主細胞を選択し、その細胞質において分子内ジスルフィド結合を有するペプチドを作製することもできる。一方、KLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、又は、KLK4/KLK8阻害ペプチドが分子内ジスルフィド結合を有さない場合は、還元性の酸化還元環境を有する細胞区間、例えば、グラム陰性細菌の細胞質において作製され得る。
本発明はKLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、若しくは、KLK4/KLK8阻害ペプチド、又は、そのコンジュゲートを含む医薬組成物をも提供する。
ナメル質形成不全症、前立腺がん等をあげることができる。
る。例えば、他の医薬を投与した後にKLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、又は、KLK4/KLK8阻害ペプチドを有効成分として含む医薬組成物を投与するか、かかる医薬組成物を投与した後に、他の医薬を投与するか、又は、当該医薬組成物と他の医薬とを同時に投与してもよい。同時に投与する場合、KLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、又は、KLK4/KLK8阻害ペプチドと他の医薬とは、単一の製剤、及び、別々の製剤(複数の製剤)、のいずれに含有されてもよい。
本発明のKLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、若しくは、KLK4/KLK8阻害ペプチド、又はそのコンジュゲートを含む検査用又は診断用組成物(以下、まとめて「診断用組成物」という)を提供する。
成物、それらを含む医薬組成物を投与する個体の同定に有用である。
ImmunoSpot)法、ドットブロット法、オクタロニー法、CIE(Counterimmunoelectrophoresis)法、CLIA(Chemiluminescent immuno assay)、FCM(Flow Cytometry)等の検出方法が利用可能である。検出には抗体や本発明のペプチドもしくはそのコンジュゲート等を標識したものが利用される。標識法としてはビオチンのほか、HRP、アルカリフォスファターゼ、FITC等の発蛍光団、放射性同位元素等のラベル等生化学的解析に実施可能な標識法が利用できる。酵素標識を利用した検出にはTMB(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)、BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)、p-NPP(p-nitrophenyl phosphate)、OPD(o-Phenylenediamine)、ABTS(3-Ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)、SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific)等の発色基質やQuantaBlu(登録商標) Fluorogenic Peroxidase Substrate(Thermo Fisher Scientific)蛍光基質のほか、化学発光基質を用いることができる。本測定には、ヒト又は非ヒト動物由来の試料に加え、組換え蛋白質等の人工的な処理を加えた試料をも供することができる。生物個体由来の被検試料としては、例えば、血液、関節液、腹水、リンパ液、脳脊髄液、肺胞洗浄液、唾液、痰、組織ホモジネート上清、組織切片等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
ペプチド、KLK4阻害ペプチド、若しくは、KLK4/KLK8阻害ペプチドに免疫グロブリンのFc領域をコンジュゲートしたものをプロテインGを介して磁気ビーズに固相化し、そこに被検試料を添加する等、工程2としては、例えば、磁気ビーズを分離し、ビーズと共に沈殿した可溶性蛋白質をSDS-PAGEやWestern blot法で解析し、KLK1、KLK4、又は、KLK4及びKLK8を検出する等をあげることができる。本測定には、ヒト又は非ヒト動物由来の試料に加え、組換え蛋白質等の人工的な処理を加えた試料をも供することができる。生物個体由来の被検試料としては、例えば、血液、関節液、腹水、リンパ液、脳脊髄液、肺胞洗浄液、唾液、痰、組織ホモジネート上清、組織切片等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
当該方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。
本発明のKLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、若しくは、KLK4/KLK8阻害ペプチドペプチドは、KLK1、KLK4、又は、KLK4及びKLK8に特異的な結合活性を有する。したがって、本発明の好適なKLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、若しくは、KLK4/KLK8阻害ペプチド又はそのコンジュゲートを用いて、KLK1、KLK4、又は、KLK4及びKLK8と他のKLKが混在した試料中から、KLK1、KLK4、又は、KLK4及びKLK8を特異的に分離することができる。ペプチドからのKLK1、KLK4、又は、KLK4及びKLK8の遊離は、相対的に高いイオン強度、低いpH、中程度の変性条件、カオトロピック塩の存在下等で、非選択的に行うことができるが、KLK1、KLK4、又は、KLK4及びKLK8のプロテアーゼ活性を減弱させない範囲で行うことが好ましい。
KLK1、KLK4、KLK8の調製
(1-1)KLK1、KLK4、KLK8発現ベクターの構築
pro-KLK1(配列番号2:図8,UniProt;P06870)をコードするヌクレオチド配列、pro-KLK4(配列番号3:図9,UniProt;Q9Y5K2)をコードするヌクレオチド配列、pro-KLK8(配列番号4:図10、UniProt;O60259)をコードするヌクレオチド配列を鋳型として、KOD-plus-(TOYOBO)を用いたオーバーラップPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 30秒)×30サイクル)により各断片をそれぞれ増幅し、各遺伝子のC末端にHis tagを付加した哺乳細胞発現ベクターpCMA_pro-KLK1、pCMA_pro-KLK4、pCMA_pro-KLK8を構築した。
(1-1)で構築した発現ベクターは、PEI MAX 40000(Polysciences)を用いてExpi293F細胞(Thermo Fisher Scientific)にトランスフェクションし、培養3日後に培養上清を回収した。HisTrap excel(GE healthcare)を用いて培養上精から所望のHis tag融合タンパク質を回収し、Amicon Ultra NMWL 10,000(Merck Millipore)を用いてPBSにバッファー交換することで、pro-KLK1、pro-KLK4、pro-KLK8をそれぞれ精製した。
KLK活性化バッファー(50mM Tris-HCl,150mM NaCl,10mM CaCl2,pH7.5)で調製した200μg/mLのpro-KLK1に等量の2μg/mLのthermolysinを添加し、37℃で一定時間反応後、20mM
1,10-phenanthrolineを等量混合することで活性化KLK1を調製した。同様に、KLK活性化バッファーで調製した200μg/mLのpro-KLK4またはpro-KLK8に等量の8μg/mL Thermolysinを添加し、37°Cで一定時間反応させた後、20mM 1,10-phenanthrolineを等量混合することで活性化KLK4またはKLK8を調製した。
KLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、KLK4/KLK8阻害ペプチドの調製
(2-1)KLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、KLK4/KLK8阻害ペプチド発現ベクターの構築
SPINK2 scaffoldを骨格としたKLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド及びKLK4/KLK8阻害ペプチドの発現ベクターを構築した。各阻害ペプチドのアミノ酸配列(配列番号5乃至22:図11乃至28))をコードするヌクレオチド配列とヒトSPINK2(配列番号1:図7)をコードするヌクレオチド配列を鋳型として、下記プライマーおよびKOD-plus-(TOYOBO)を用いたPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 30秒)×30サイクル)により阻害ペプチド断片を増幅した。
プライマー1:5’-AAAAGAATTCTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3’(配列番号24:図30)
プライマー2:5’-AAAACTCGAGTTATGCGGCCGCAGACGCGCCGCACGGACC-3’(配列番号25:図31)
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のDNA断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)によりDNAを調製した。調製したDNA断片およびpET 32a(改変)を制限酵素EcoRI(NEB)およびXhoI(NEB)を用いて、37℃で1時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のDNA断片を切り出し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)により精製した。T4 DNA Ligase(NEB)を用いて、精製した断片を16℃で一晩反応させることでligation反応を実施した。Ligation溶液は、大腸菌JM109(TOYOBO)に添加し、氷上で30分間静置した後、42℃で45秒の熱処理、さらに氷上で5分間静置し、0.1mg/mLアンピシリンを含む2YTプレートに播種後、37℃で一晩静置培養することで、大腸菌を形質転換した。翌日、形質転換した大腸菌を、0.1mg/mLアンピシリンを含むTerrific Broth培地(Invitrogen)に植菌し、37℃で一晩培養後、QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit(Qiagen)を用いてプラスミドDNAを回収し、配列解析を実施することで「pET 32a(改変)_KLK1阻害ペプチド」「pET 32a(改変)_KLK4阻害ペプチド」「pET 32a(改変)_KLK4/KLK8阻害ペプチド」を構築した。
(2-1)で構築したベクターでそれぞれ大腸菌Origami B (DE3)(Novagen)を形質転換し、0.1mg/mLアンピシリンを含む2YT培地を用いて37℃で培養後、IPTG(最終濃度1mM)を添加し、16℃で一晩培養した。翌日、遠心分離(3,000g、20分、4℃)により集菌後、BugBuster Master Mix(Novagen)を用いてlysateを調製し、TALON Metal Affinity Resin(Clontech)を用いてHis tag融合目的蛋白質を精製した。次に、Thrombin Cleavage Capture Kit(Novagen)を用いてthioredoxin tagと所望の蛋白質とを切断し、TALONを用いて精製した。さらに、ゲルろ過クロマトグラフィー(Superdex75 10/300 GL)に供することで、N末にS tagおよびリンカー(配列番号26:図32)、C末に6残基(配列番号27:図33)を含むKLK1阻害ペプチド、KLK4阻害ペプチド、KLK4/KLK8阻害ペプチドを精製した。
各阻害ペプチドの評価
(3-1)ペプチド基質を用いた各阻害ペプチドのKLK1、KLK4、及び、KLK4/KLK8阻害活性評価
基質ペプチドを10mMになるようDMSOで溶解し、Assay buffer(50mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH8.0)で希釈して終濃度100μMで使用した。Assay bufferで希釈したKLK1、KLK4、又はKLK8と阻害ペプチドをそれぞれ25μLずつ混ぜ、37℃で20分反応させた後にAssay bufferで希釈した基質を50μL加えて、Enspire(PerkinElmer)で蛍光シグナル(excitation 380nm/emission 460nm)を測定した。各酵素と基質の組み合わせは以下の通り使用した。KLK1阻害活性評価では終濃度1nMのKLK1および終濃度100μMのPFR-AMC(BACHEM)を使用した。KLK4阻害活性評価では終濃度10nMのKLK4および終濃度100μMのBoc-VPR-AMC(R&D systems)を用いた。KLK8阻害活性評価では終濃度20nMのKLK8および終濃度100μMのBoc-VPR-AMC(R&D Systems)を用いた。なお、各阻害ペプチドは終濃度1.875~1,000nM、反応および測定にはプロテオセーブ(登録商標)SS96F黒プレート(住友ベークライト株式会社)を使用した。
50およびKi値を算出には、独立した3回の実験の平均値を使用した。
基質ペプチドの切断を指標に、他のプロテアーゼに対する特異性を評価した。(3-1)に記載の方法と同様、Assay bufferで希釈したプロテアーゼとサンプル(終濃度1μM)をそれぞれ25μLずつ混ぜ、37℃で20分反応させた後にAssay bufferで希釈した基質を50μL加えて、Enspire(PerkinElmer)で蛍光シグナル(excitation 380nm/emission 460nm)を測定した。尚、プロテアーゼ活性評価にはAssay buffer(50mM Tris,150mM NaCl,pH8.0)を用い、反応および測定にはプロテオセーブ(登録商標)SS96F黒プレート(住友ベークライト株式会社)を使用した。特異性評価に用いたプロテアーゼおよび基質の組み合わせは以下の通り。
tems;1458-HT)、終濃度50μM 基質ペプチドH2-Opt(株式会社ペプチド研究所)
KLK4阻害ペプチドの結合親和性
Single cycle kineticsによるKLK4阻害ペプチドの結合親和性を測定するため、BIAcore T 200(GE healthcare)を用いて表面プラズモン共鳴分析を実施した。一本鎖DNAが固定化されたSensor Chip CAP(GE healthcare)に、ストレプトアビジンコンジュゲートの相補鎖DNAをハイブリダイゼーションでキャプチャーさせた。次に、EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo Fisher Scientific)を用いてビオチン化したKLK4を流速10μL/minでキャプチャーさせることで、約5RUを固定化した。その後、HBS-EPで3倍段階希釈したKLK4阻害ペプチド(0.08~20nM)をアナライトとして流速10μL/minで添加した。BIAcore T 200 Evaluation software(version 2.0)を用いて解析し、simple one-to-one Langmuir binding modelを用いてkonおよびkoffを算出した。尚、平衡定数KDはkoff/konの比率として算出した。さらに、Biotin CAPture Kit(GE healthcare)付属のRegeneration bufferでSensor Chip CAPを再生し、ビオチン化KLK4を繰り返しキャプチャーさせることで、複数のKLK4阻害ペプチドを測定した。測定した3つのKLK4阻害ペプチドはいずれも1nMを下回るKD値を示しており、非常に強い結合力であることが明らかとなった(図5)。
KLK4/KLK4阻害ペプチド複合体のX線結晶構造解析
(5-1)KLK4/KLK4阻害ペプチド複合体の調製
(1-3)および(2-2)に記載した方法に従って、KLK4およびK41043(配列番号19:図25)で示されるアミノ酸配列を有するKLK4阻害ペプチドをそれぞれ調製した。50mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH8.0の条件下で両者を混合後、ゲルろ過クロマトグラフィー(Superdex 200 10/300 GL)により複合体を単離精製した。
(5-1)で調製した複合体溶液を30mg/mLまで濃縮し、終濃度16.7U/uLとなるようにEKMax(Invitrogen社)を添加後、リザーバー溶液(LiCl 0.2M,20%PEG3350)と1対1で混合し、蒸気拡散法により結晶化した。得られた単結晶をクライオ溶液(20%グリセロール、PBS、リザーバー溶液)に浸漬した後、液体窒素にて凍結した。凍結結晶をクライオ気流下でX線照射し、回折イメージを得た(photon factory NE3A:高エネルギー加速器研究機構)。imosflmを使用した解析により、最大分解能1.9Å(オングストローム)のスケーリングデータを取得した。KLK4単体(PDB ID:4K1E)、およびSPINK2単体(PDB ID:2JXD)を鋳型とした分子置換法により位相を決定し、構造精密化後、分解能2.0AでKLK4/該ペプチドの複合体結晶を決定した。当該KLK4阻害ペプチドはKLK4酵素活性中心を含む領域へ結合していることが認められた(図6)。
配列番号2:ヒトKLK1のアミノ酸配列(図8)
配列番号3:ヒトKLK4のアミノ酸配列(図9)
配列番号4:ヒトKLK8のアミノ酸配列(図10)
配列番号5:KLK1阻害ペプチドK10061のアミノ酸配列(図11)
配列番号6:KLK1阻害ペプチドK10062のアミノ酸配列(図12)
配列番号7:KLK1阻害ペプチドK10066のアミノ酸配列(図13)
配列番号8:KLK1阻害ペプチドK10071のアミノ酸配列(図14)
配列番号9:KLK4阻害ペプチドK40001のアミノ酸配列(図15)
配列番号10:KLK4阻害ペプチドK40003のアミノ酸配列(図16)
配列番号11:KLK4阻害ペプチドK40004のアミノ酸配列(図17)
配列番号12:KLK4阻害ペプチドK40005のアミノ酸配列(図18)
配列番号13:KLK4/KLK8阻害ペプチドK41021のアミノ酸配列(図19)配列番号14:KLK4/KLK8阻害ペプチドK41024のアミノ酸配列(図20)配列番号15:KLK4/KLK8阻害ペプチドK41025のアミノ酸配列(図21)配列番号16:KLK4/KLK8阻害ペプチドK41026のアミノ酸配列(図22)配列番号17:KLK4/KLK8阻害ペプチドK41041のアミノ酸配列(図23)配列番号18:KLK4/KLK8阻害ペプチドK41042のアミノ酸配列(図24)配列番号19:KLK4/KLK8阻害ペプチドK41043のアミノ酸配列(図25)配列番号20:KLK4/KLK8阻害ペプチドK41045のアミノ酸配列(図26)配列番号21:KLK4/KLK8阻害ペプチドK41046のアミノ酸配列(図27)配列番号22:KLK4/KLK8阻害ペプチドK41047のアミノ酸配列(図28)配列番号23:KLK1阻害結合ペプチド、KLK4阻害ペプチド又はKLK4/KLK8阻害ペプチドの一般式(図29)
配列番号24:プライマー1のヌクレオチド配列(図30)
配列番号25:プライマー2のヌクレオチド配列(図31)
配列番号26:Stag+リンカー1のアミノ酸配列(図32)
配列番号27:C末6マーのアミノ酸配列(図33)
配列番号28:ヒトIgG1 Fcのアミノ酸配列(図34)
Claims (21)
- 下記(i)で示されるアミノ酸配列を含む、SPINK2変異体ペプチド:
(i)配列番号9乃至12(図15乃至18)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列。 - KLK4の有するプロテアーゼ活性を特異的に阻害する、請求項1記載のペプチド。
- 該アミノ酸配列のアミノ末端側に、1乃至3個のアミノ酸残基が付加してなるアミノ酸配列、又は、配列番号26(図32)で示されるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載のペプチド。
- 該アミノ酸配列のカルボキシル末端側に、1乃至6個のアミノ酸からなるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、請求項1乃至3のいずれか一つに記載のペプチド。
- 3つのジスルフィド結合を有し、ループ構造、αへリックス及びβシートを含むことで特徴付けられる立体構造を有する、請求項1乃至4のいずれか一つに記載のペプチド。
- 請求項1乃至5のいずれか一つに記載のペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項6記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項6記載のポリヌクレオチド若しくは請求項7記載のベクターを含むか又は請求項1乃至5のいずれか一つに記載のペプチドを産生する細胞。
- 下記工程(i)及び(ii)を含む、SPINK2変異体ペプチドの製造方法:
(i)請求項8記載の細胞を培養する工程;
(ii)該培養物からSPINK2変異体ペプチドを回収する工程。 - 請求項1乃至5のいずれか一つに記載のペプチドを化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該ペプチドの製造方法。
- 請求項9又は10記載の方法により得られるSPINK2変異体ペプチド。
- 請求項1乃至5及び11のいずれか一つに記載のペプチドに他の部分が結合してなるコンジュゲート。
- ペプチドである、請求項12記載のコンジュゲート。
- 免疫グロブリンのFc領域又はその機能断片を含む、請求項12又は13記載のコンジュゲート。
- 下記工程(i)及び(ii)を含む、請求項13又は14記載のSPINK2変異体ペプチドコンジュゲートの製造方法:
(i)該コンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む細胞を培養する工程:
(ii)該培養物からSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を回収する工程。 - 請求項12乃至14のいずれか一つに記載のSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該コンジュゲートの製造方法。
- 請求項15又は16記載の方法により得られるSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート。
- 請求項1乃至5及び11のいずれか一つに記載のペプチド、請求項6記載のポリヌクレオチド、請求項7記載のベクター、請求項8記載の細胞、及び/又は、請求項12乃至14及び17のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む組成物。
- 請求項1乃至5及び11のいずれか一つに記載のペプチド、請求項6記載のポリヌクレオチド、請求項7記載のベクター、請求項8記載の細胞、及び/又は、請求項12乃至14及び17のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
- 請求項1乃至5及び11のいずれか一つに記載のペプチド、請求項6記載のポリヌクレオチド、請求項7記載のベクター、請求項8記載の細胞、及び/又は、請求項12乃至14及び17のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む、KLK4の検出用又は測定用組成物。
- 請求項1乃至5及び11のいずれか一つに記載のペプチドに結合する抗体又はその結合断片を用いたアフィニティー精製工程を含む、請求項9、10、15又は16に記載の製造方法。
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