JP2023019886A

JP2023019886A - 検出キット及び検出方法

Info

Publication number: JP2023019886A
Application number: JP2021124946A
Authority: JP
Inventors: 真佐也宮崎; Masaya Miyazaki
Original assignee: NISHIKAWA KEISOKU KK
Current assignee: NISHIKAWA KEISOKU KK
Priority date: 2021-07-30
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2023-02-09

Abstract

【課題】捕捉用抗体によって検出対象を効率よく捕捉することができる検出キット及び検出方法を提供する。【解決手段】検出キット１０は、抗体のＦｃ領域に結合する抗体結合ドメインを外側表面に有する脂質二重膜と、抗体結合ドメインにＦｃ領域を介して保持される、検出対象に結合する捕捉用抗体と、脂質二重膜を表面に担持する微粒子４と、を備える。【選択図】図１

Description

本発明は、検出キット及び検出方法に関する。

ＥＬＩＳＡ（ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔＡｓｓａｙ）とは、特異的な抗原抗体反応及び酵素反応を利用して、検体中の検出対象の有無、さらにはその存在量を求める実験手法である。ＥＬＩＳＡには、直接法、間接法及びサンドイッチ法がある。

サンドイッチ法では、検出対象を捕捉する捕捉用抗体と、捕捉用抗体に捕捉された検出対象を検出する検出用抗体を使用する。検出用抗体には酵素で標識した抗体が使用されるが、標識されていない検出用抗体を使用する場合には、検出用抗体に結合する二次抗体として、標識された抗体が用いられる。サンドイッチ法は、直接法及び間接法と比べて感度が高く、検出対象の捕捉と検出に２種類の抗体を使うため、特異性が高い。

捕捉用抗体は、固相に固定されて使用される。捕捉用抗体は、静電相互作用、疎水的相互作用及び水素結合等を介して固相に保持される。特許文献１には、抗体を含む溶液に二糖類及び糖アルコール類を添加して抗原を固定化した担体を用いることで、検出感度を上昇させて測定対象を検出する免疫測定方法が開示されている。

捕捉用抗体が固定化される固相として、反応効率を高めることを意図して微粒子が使用される。例えば、特許文献２には、抗体が固定されている微粒子と抗原物質とを相互作用させる検出方法が開示されている。

特開２０２１－９２５１７号公報特開２００８－１９６９２７号公報

捕捉用抗体を微粒子に固定した場合、捕捉用抗体における抗原との結合部位の配向が不均一になる。抗原との結合部位が露出していないと、その捕捉用抗体は抗原の捕捉に寄与できず、感度が低下するおそれがある。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、捕捉用抗体によって検出対象を効率よく捕捉することができる検出キット及び検出方法を提供することを目的とする。

本発明の第１の観点に係る検出キットは、
抗体のＦｃ領域に結合する抗体結合ドメインを外側表面に有する脂質二重膜と、
前記抗体結合ドメインにＦｃ領域を介して保持される、検出対象に結合する捕捉用抗体と、
前記脂質二重膜を表面に担持する微粒子と、
を備える。

前記脂質二重膜は、
粒子形成能を有するタンパク質を含み、ナノ粒子として前記微粒子に担持される、
こととしてもよい。

前記粒子形成能を有するタンパク質は、
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質である、
こととしてもよい。

前記抗体結合ドメインは、
ＰｒｏｔｅｉｎＡのＦｃ領域結合Ｚドメイン２量体である、
こととしてもよい。

上記本発明の第１の観点に係る検出キットは、
前記捕捉用抗体とは抗原認識部位が異なる前記検出対象に結合する検出用抗体をさらに備える、
こととしてもよい。

前記検出用抗体は、
酵素で標識された抗体であって、
上記本発明の第１の観点に係る検出キットは、
前記酵素の発色基質をさらに備える、
こととしてもよい。

前記検出対象は、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、
こととしてもよい。

本発明の第２の観点に係る検出方法は、
検出対象に結合する検出用抗体と検体とを混合する混合ステップと、
抗体のＦｃ領域に結合する抗体結合ドメインを外側表面に有する脂質二重膜における前記抗体結合ドメインにＦｃ領域を介して保持された、前記検出用抗体とは抗原認識部位が異なる前記検出対象に結合する捕捉用抗体を、前記混合ステップで得られた混合物に暴露する暴露ステップと、
前記捕捉用抗体に結合した前記検体に含まれる前記検出対象を、前記検出用抗体によって検出する検出ステップと、
を含み、
前記脂質二重膜は、微粒子の表面に担持されている。

前記検体は、
物を拭き取ることで採取される、
こととしてもよい。

本発明によれば、捕捉用抗体によって検出対象を効率よく捕捉することができる。

本発明の実施の形態に係る検出キットの構成を示す図である。実施例１に係る検出対象であるスパイクタンパク質の濃度に対する吸光度を示す図である。実施例２に係る比較実験における吸光度を示す図である。実施例３に係る比較実験における吸光度を示す図である。実施例４に係る平板から回収した検体における吸光度を示す図である。実施例４に係るドアノブの取っ手から回収した検体における吸光度を示す図である。

本発明に係る実施の形態について図面を参照しながら説明する。なお、本発明は下記の実施の形態によって限定されるものではない。

（実施の形態）
本実施の形態に係る検出キットは、抗体のＦｃ領域に結合する抗体結合ドメインを外側表面に有する脂質二重膜と、検出対象に結合する捕捉用抗体と、脂質二重膜を表面に担持する微粒子と、を備える。

抗体結合ドメインは、Ｆｃ領域に結合するものであれば任意のものが使用できる。抗体結合ドメインは、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＡの抗体結合ドメイン、ＰｒｏｔｅｉｎＧの抗体結合ドメイン及びＰｒｏｔｅｉｎＬの抗体結合ドメイン等である。好ましくは、抗体結合ドメインは、ＰｒｏｔｅｉｎＡのＩｇＧ－Ｆｃ結合ドメインである。好適には、抗体結合ドメインは、ＰｒｏｔｅｉｎＡのＦｃ領域結合Ｚドメイン２量体である。

脂質二重膜とは、細胞膜の基本構造となるリン脂質の膜である。脂質二重膜では、リン脂質が疎水性部分を内側に向け、親水性部分を外側に向けた状態で、二重の層を形成している。脂質膜を形成する脂質としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。

リン脂質としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジラウロイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン；ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール及びジラウロイルホスファチジルグリセロール等のホスファチジルグリセロール；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン及びジラウロイルホスファチジルエタノールアミン等のホスファチジルエタノールアミン；ジオレオイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン及びジラウロイルホスファチジルセリン等のホスファチジルセリン；ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、並びにこれらの水素添加物等が挙げられる。

糖脂質としては、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド及びジガラクトシルジグリセリド等のグリセロ糖脂質；並びにガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド及びガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質等が挙げられる。

ステロールとしては、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸及びラノステロール等の動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール及びカンペステロール等の植物由来のステロール；並びにチモステロール及びエルゴステロール等の微生物由来のステロールが挙げられる。

飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸及びステアリン酸等の炭素数１２～２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。

脂質二重膜には、タンパク質を膜タンパク質として埋め込むことができる。例えば、膜タンパク質の一部に抗体結合ドメインを組み込むことで、抗体結合ドメインを外側表面に有する脂質二重膜が得られる。

好ましくは、脂質二重膜は、粒子形成能を有するタンパク質を含み、ナノ粒子を形成する。この場合、脂質二重膜はナノ粒子として微粒子に担持されてもよい。ナノ粒子は、粒子形成能を有するタンパク質を含むことで形成されたナノサイズで中空の粒子である。粒子形成能を有するタンパク質としては、例えば、種々のウイルスから得られるサブウイルス粒子を利用することができる。好ましくは、粒子形成能を有するタンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＶｉｒｕｓ；ＨＢＶ）表面抗原タンパク質である。中でもタンパク質としてＨＢＶの表面抗原Ｌタンパク質が好適である。ＨＢＶのＬタンパク質は（３８９アミノ酸）、Ｎ末端側よりＰｒｅ－Ｓ１領域（１０８アミノ酸）、Ｐｒｅ－Ｓ２領域（５５アミノ酸）及びＳ領域（２２６アミノ酸）から構成される。

粒子形成能を有するタンパク質を含むナノ粒子は、真核細胞で当該タンパク質を発現させることにより得られるものであってもよい。真核細胞で粒子形成能を有するタンパク質を発現させると、当該タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現し、蓄積され、粒子として放出される。真核細胞としては、酵母及び昆虫細胞等が使用できる。出芽酵母内でＨＢＶのＬタンパク質を過剰発現させて得られるナノ粒子はバイオナノカプセル（ＢＮＣ）として知られ、３回膜貫通型のＬタンパク質約１１０分子が酵母小胞体膜由来リポソームに埋め込まれたプロテオリポソームである。

上記の脂質二重膜で形成されるナノ粒子は、抗体のＦｃ領域に結合する抗体結合ドメインを外側表面に有する。抗体結合ドメインを外側表面に有するナノ粒子は、例えば、一部が抗体結合ドメインに置換されたＨＢＶのＬタンパク質を真核細胞で過剰発現させることで得られる。具体的には、Ｐｒｅ－Ｓ１領域及びＰｒｅ－Ｓ２領域の一部（Ｎ末端から５１～１５９番目）を、ＰｒｏｔｅｉｎＡのＦｃ領域結合Ｚドメイン（２量体（１２７アミノ酸））に置換したＺＺ－タンパク質を出芽酵母内で発現させることで、抗体結合ドメインを外側表面に有するナノ粒子が得られる。このような抗体結合ドメインを外側表面に有するナノ粒子は市販されており、例えば、バイオナノカプセル－ＺＺ（ＢＮＣ－ＺＺ、ビークル社製）等が使用できる。なお、当該ナノ粒子を破砕して得られる脂質二重膜を微粒子の表面に担持させてもよい。

ナノ粒子の粒子径は、ナノサイズ（１～１０００ｎｍ）であれば特に限定されないが、例えば１～５００ｎｍ、１０～３００ｎｍ、１２～２００ｎｍ、１５～１００ｎｍ又は２０～８０ｎｍである。好ましくは、ナノ粒子の粒径は３０ｎｍである。ナノ粒子の平均粒子径は、例えば動的散乱法では４０～５０ｎｍであってもよく、電子顕微鏡による測定で１５～２５ｎｍであってもよい。

捕捉用抗体は、検出対象に結合する抗体であれば特に限定されない。捕捉用抗体は、検出対象の特定の領域内にエピトープを有し、当該エピトープを認識して検出対象又は当該特定の領域を含むその断片に結合する。捕捉用抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。捕捉用抗体として、検出対象に応じて市販の抗体を用いてもよい。捕捉用抗体は、公知の方法に従って、例えば、検出対象を抗原として動物に免疫して作製してもよい。

捕捉用抗体は、抗体結合ドメインにＦｃ領域を介して保持される。脂質二重膜で形成されるナノ粒子の場合、当該ナノ粒子の表面に抗体結合ドメインにＦｃ領域を介して保持される。捕捉用抗体を抗体結合ドメインに保持させるには、例えば、抗体結合ドメインを外側表面に有する脂質二重膜、例えば脂質二重膜で形成されるナノ粒子を含む懸濁液に捕捉用抗体を加え、室温で静置すればよい。

検出対象は、抗体で認識できるものであれば特に限定されないが、好ましくはタンパク質を有するものである。検出対象は、例えば、原虫、原生動物、細菌及びウイルス等の病原体である。検出対象としては、大腸菌、サルモネラ菌、コレラ菌、百日咳菌、結核菌、黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、ヘリコバクターピロリ、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ヘルペスウイルス、コロナウイルス、ＨＩＶ及びエボラ出血熱ウイルス等が挙げられる。好適には、検出対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であって、捕捉用抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に特異的に結合する抗体である。

微粒子は、脂質二重膜又はナノ粒子より粒子径が大きい粒子、特には、マイクロサイズの粒子である。微粒子の粒子径は、例えば、１０～５００μｍ、１２～３００μｍ、１５～２００μｍ、１８～１００μｍ又は２０～６０μｍである。好ましくは、微粒子の粒子径は２０～３０μｍである。なお、上記のナノ粒子及び微粒子の粒子径は、ふるい分け法、沈降法、顕微鏡法、光散乱法、レーザー回折・散乱法、電気的抵抗試験、透過型電子顕微鏡による観察、及び走査型電子顕微鏡による観察等で測定できる。粒子径は公知の粒度分布計で測定してもよい。粒子径は、測定方法に応じて、ストーク相当径、円相当径、球相当径で表すことができる。また、粒子径は、複数の粒子を測定対象として、平均で表した平均粒子径、体積平均粒子径及び面積平均粒子径等であってもよい。

微粒子は、表面にタンパク質を保持できるものであれば特に限定されない。微粒子は、公知のポリマーで形成されたものが使用でき、例えば、ポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。微粒子の表面には公知の方法で脂質二重膜を担持させればよい。例えば、微粒子と脂質二重膜とを共存させることで物理吸着により微粒子の表面に脂質二重膜を担持させることができる。また、微粒子の表面のアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基及びエポキシ基等の官能基を介した共有結合により脂質二重膜を微粒子に担持させてもよい。

脂質二重膜に対する微粒子の量は、検出感度を考慮して適宜設定される。脂質二重膜で形成されるナノ粒子及び微粒子として、それぞれＢＮＣ－ＺＺ及び粒子径が２５μｍのラテックス微粒子を採用する場合、ナノ粒子と微粒子の質量比は、１：３００～１５０００、１：５００～１００００、１：１０００～５０００又は１：２０００～４０００であって、好ましくは１：３０００である。

続いて、本実施の形態に係る検出キットを使用した検出方法について説明する。検出方法は、混合ステップと、暴露ステップと、検出ステップと、を含む。混合ステップでは、検出対象に結合する検出用抗体と検体とを混合する。より具体的には、検体は抗体を含む溶液と混合される。検体は公知の方法で採取される。例えば検出対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の場合、検体はスワブ（綿棒）等で採取した鼻腔ぬぐい液である。なお、検体はヒト等の動物由来の検体に限らず、物、例えば検出対象が付着しているおそれがあるドアノブ、レバー、洋式便器の便座、携帯端末及び医療機器等を構成する基材等の表面を拭き取ることで採取されてもよい。基材の種類は、特に限定されず、金属、天然樹脂、合成樹脂、ガラス及びゴム等の任意である。

検出用抗体は、蛍光物質、酵素又はビオチン等で標識された抗体である。蛍光物質としては、ＦＩＴＣ（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＩｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）色素及びＣｙ色素等の蛍光色素、並びにＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）及びＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）等の蛍光タンパク質が挙げられる。酵素は発色基質の発色を触媒する酵素であれば任意で、例えば、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）及びＡＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）等である。ＨＲＰの発色基質はＤＡＢ及びＴＭＢ等で、ＡＰの発色基質は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ及びｐＰＮＰＰ等である。

検出用抗体と捕捉用抗体とは、抗原認識部位が異なる。検出用抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。

暴露ステップでは、上記脂質二重膜における抗体結合ドメインにＦｃ領域を介して保持された捕捉用抗体を、混合ステップで得られた混合物に暴露する。脂質二重膜は微粒子の表面に担持されているため、微粒子に混合物を接触させることで、捕捉用抗体を混合物に暴露することができる。

暴露ステップの後に、洗浄ステップによって、捕捉用抗体に補足された検出対象以外の物質を除去してもよい。洗浄ステップでは、例えばバッファー又はＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）等で微粒子をすすげばよい。必要に応じて、洗浄ステップを複数回行ってもよい。また、洗浄後の微粒子は、遠心分離法を利用して沈殿として回収することもできる。

検出ステップでは、捕捉用抗体に結合した検体に含まれる検出対象を、検出用抗体によって検出する。例えば、検出用抗体として酵素で標識された抗体を使用する場合、検出ステップでは、当該酵素と当該酵素の発色基質とを反応させればよい。続いて、吸光度を測定して呈色反応を測定することで、検出対象の有無を判定又は検出対象の量を測定することができる。なお、予めいくつかの濃度の測定対象について測定し、検量線を作成することで、検出対象の量を定量することができる。また、発色基質の呈色反応で検出する場合、検出ステップでは、遠心分離法を利用して微粒子を沈殿として除去しておき、上澄み液について吸光度を測定してもよい。

ここで、図１を参照して、本実施の形態に係る検出キットの一態様である検出キット１０を例示する。検出キット１０は、シリンジ１と、フィルター２と、ピストン３と、を備える。検出キット１０では、脂質二重膜で形成された上記ナノ粒子を使用するものとする。シリンジ１は中空で、下側の先端と上側の末端とは開口している。捕捉用抗体を保持するナノ粒子を担持する微粒子４がシリンジ１の内部に配置される。

フィルター２はシリンジ１の先端に接続される。フィルター２の内部には微粒子４の粒径より目の細かい濾過器が配置されている。フィルター２によって微粒子４はシリンジ１の内部に保持される。試薬、試料及びバッファー等はシリンジ１の末端開口部から微粒子４に供給することができる。

ピストン３は、シリンジ１の末端開口部から挿入される。ピストン３をシリンジ１の先端方向に押し込むことで、シリンジ１の内部に押圧がかかる。必要に応じて、ピストン３による押圧によって、微粒子４に保持されていない、例えば未反応の残余物等をシリンジ１の先端開口部から排出することができる。

検出キット１０を使用する場合、暴露ステップの前に、シリンジ１、フィルター２及び捕捉用抗体を保持するナノ粒子を担持する微粒子４は、検出対象のシリンジ１の壁面への非特異的な吸着及び捕捉用抗体への非特異的な結合等を抑制するために、公知の方法でブロッキングされてもよい。

暴露ステップでは、微粒子４に混合物を注いで反応させる。反応後、ピストン３による押圧で液体をシリンジ１から排出させる。ＰＢＳ等で微粒子４を洗浄し、液体をシリンジ１から排出した後、発色基質を微粒子４に注ぐ。静置して反応させた後、発色基質を含む液体を排出して回収する。回収した液体の吸光度を測定することで検出対象の有無等を判定できる。

本実施の形態に係る検出方法によれば、捕捉用抗体を保持する脂質二重膜が比表面積の大きい微粒子の表面に担持されているため、捕捉用抗体と検出対象との反応効率を高めことができる。さらに、脂質二重膜の外側表面の抗体結合ドメインにＦｃ領域を介して捕捉用抗体が保持されているため、捕捉用抗体における検出対象との結合部位であるＦａｂ領域で効率よく検出対象を捕捉できる。この結果、高い感度が得られる。

なお、本実施の形態に係る検出キットは、検出用抗体をさらに備えてもよい。検出用抗体が酵素で標識された抗体である場合、検出キットは酵素の発色基質をさらに備えてもよい。また、検出キットは、バッファー及びブロッキングバッファー等の試薬をさらに備えてもよい。

本実施の形態に係る検出キット１０は、捕捉用抗体を保持するナノ粒子（脂質二重膜）を担持する微粒子４がシリンジ１の内部に配置された状態で提供されてもよいし、ナノ粒子（脂質二重膜）、捕捉用抗体及び微粒子４等が、シリンジ１とは独立した状態で提供されて、検出キット１０の使用前に、シリンジ１の内部で、微粒子４にナノ粒子を担持させ、続いてナノ粒子に捕捉用抗体を保持させるようにしてもよい。

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

［実施例１］
（シリンジとフィルターのブロッキング）
先端にフィルター（ジーエルサイエンス社製、ＧＬクロマトディスク、４Ａ、０．４５μｍ、水系未滅菌）を接続した状態のシリンジ（ＮＯＲＭ－ＪＥＣＴ、ＬｕｅｒＬｏｃｋＳｔｅｒｉｌｅＳｙｒｉｎｇｅｓ、３ｍＬ）にブロッキングバッファー（ブロッキング試薬Ｎ１０２（２×、日油社製）とブロックエース（５％、ケー・エー・シー社製とを混合）２ｍＬを注いだ。シリンジにピストンを挿入しフィルター側を上にしてフィルターを外し、ピストンを押してシリンジ内の空気を抜いた。フィルターをシリンジの先端に取り付け、強く振ってシリンジ先端部をブロッキングバッファーで満たした。フィルター側を下にして室温で６０分以上、静置した。使用する直前に、ブロッキングバッファーを捨てて１ｍＬのＰＢＳでシリンジとフィルターとを３回洗浄した。

（検出キットの作製）
１検体に使用する検出キットを次のように作製した。よく振り混ぜたビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＰｏｌｙｂｅａｄＰｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅＭｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（２．５％（ｗ／ｖ）Ｓｏｌｉｄｓ－Ｌａｔｅｘ）、粒子径：２５．０μｍ）原液１２μＬをチューブに加えた。チューブを遠心分離し（約１９００×ｇ、１０秒程度、以下同様）、上澄みを除去した。ビーズをエタノールで３回洗浄した。なお、１回の洗浄で、エタノール（５０μＬ）をチューブに加え、ビーズをすすぎ、遠心分離し（約１９００×ｇ、１０秒程度）、上澄みを除去した。続いて超純水及びＰＢＳを用いて、同様の洗浄を各々３回行った。

ＢＮＣ－ＺＺ（ビークル社製）のＰＢＳ溶液（１μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を、ビーズを含む上記チューブに注ぎ、ビーズを液中に分散して、室温で３０分間、静置した。遠心分離後、上澄みを除去し、ＰＢＳでの洗浄を３回行った。ブロッキングバッファー（１００μＬ）をチューブに加え、ビーズを液中に分散して、室温で６０分間以上、静置した。遠心分離後、上澄みを除去し、ＰＢＳでの洗浄を３回行った。

捕捉用抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＳｐｉｋｅＳ１ＳｕｂｕｎｉｔＡｎｔｉｂｏｄｙ（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＭｏｕｓｅＩｇＧ_１Ｃｌｏｎｅ＃１０３５２０６）のＰＢＳ溶液（５μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を上記チューブに加え、ビーズを液中に分散して、室温で３０分間、静置した。遠心分離後、上澄みを除去し、ＰＢＳでの洗浄を３回行った。次に、ブロッキングバッファー（１００μＬ）をチューブに加え、ビーズを液中に分散して、室温で６０分間以上、静置した。遠心分離後、上澄みを除去し、ＰＢＳで３回洗浄した。

ＰＢＳ（５０μＬ）をチューブに加え、ビーズを液中によく分散した。ブロッキング済みのフィルターを装着したシリンジの先端部にビーズ分散液５０μＬを直接加え、ピストンによる押圧でＰＢＳのみをシリンジから排出した。フィルターをシリンジから外し、乾燥を防ぐためにＰＢＳ１０μＬをビーズに注いでから再度接続し、フィルターの出口側をパラフィルムで塞いだ。

（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の検出）
スパイクタンパク質（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＳｐｉｋｅＨｉｓ－ｔａｇ）のブロッキングバッファー溶液（１５００ｎｇ／ｍＬ）と、ＨＲＰで標識した検出用抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２ＳｐｉｋｅＲＢＤＬｌａｍａｂｏｄｙ（商標）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＨｕｍａｎＩｇＧ_１Ｃｌｏｎｅ＃ＶＨＨ７２）のブロッキングバッファー溶液（１５０ｎｇ／ｍＬ）とを、体積比１：１で混合し、室温で３０分間、静置した（溶液１）。なお、検出用抗体のＨＲＰでの標識には、ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ－ＮＨ_２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製、ＬＫ１１）を用いた。ブロッキングバッファーで溶液１を希釈して所定のスパイクタンパク質濃度の溶液を調製した。

呈色試薬（ＳｅｒａｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＫＰＬ、ＴＭＢＭｉｃｒｏｗｅｌｌＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅＳｙｓｔｅｍ（２－ＣｏｍｐｏｎｅｎｔＳｙｓｔｅｍ））のＡ液及びＢ液（各６０μＬ）を混合した。

上記の作製済みの検出キットのビーズに各スパイクタンパク質濃度の溶液１００μＬを加え、室温で１５分間、静置した。反応後、ピストンによる押圧で溶液をシリンジから排出した。ＰＢＳでビーズを３回洗浄し、混合した呈色試薬（１２０μＬ）を加え、室温で５分間以上、静置した。続いて、反応した呈色試薬を排出して回収した。呈色試薬の吸光度（６２０ｎｍ）を測定した。

（結果）
図２にスパイクタンパク質の濃度に対する吸光度を示す。本実施例に係る検出キットで測定された吸光度は、スパイクタンパク質の濃度とよく相関していた。

［実施例２］
本実施例では、本発明に係る検出方法とＢＮＣ－ＺＺを使用しない場合とで検出感度を比較した。特に指示がない限り、材料は実施例１と同じである。

実施例１と同様にＢＮＣ－ＺＺを介して捕捉用抗体を担持させたビーズ分散液５０μＬをシリンジに加えずに、０．２ｍＬチューブに加え、遠心分離し、上澄みを除去した。上記の溶液１をブロッキングバッファーで希釈して１５０ｎｇ／ｍＬのスパイクタンパク質溶液を調製した。チューブ内でビーズとスパイクタンパク質溶液（１００μＬ）を混合し、ビーズを液中に分散して、室温で１５分間、静置した。チューブを遠心分離し、上澄みを除去し、ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズに混合した呈色試薬（１２０μＬ）を注ぎ、ビーズを液中に分散して、室温で５分間以上、静置した。遠心分離し、上澄みの吸光度を測定した。

ＢＮＣ－ＺＺを使用しない場合は、洗浄後のビーズとＢＮＣ－ＺＺとの混合及びブロッキングを行わずに捕捉用抗体を担持させたビーズ分散液を用いる点を除いて同様に行った。

（結果）
ＢＮＣ－ＺＺを使用した場合と使用しなかった場合の吸光度を図３に示す。ＢＮＣ－ＺＺを使用しないとほとんど検出できない試料であっても、ＢＮＣ－ＺＺを使用することで検出できた。

［実施例３］
本実施例では、スパイクタンパク質を捕捉用抗体と反応させる前に検出用抗体と混合する本発明に係る検出方法（前標識）の検出感度を、スパイクタンパク質と捕捉用抗体との反応後に検出用抗体を加える後標識（サンドイッチ法）と比較した。特に指示がない限り、材料は実施例１と同じである。

前標識については、実施例２におけるＢＮＣ－ＺＺを使用した場合と同様とした。後標識では、実施例１と同様にＢＮＣ－ＺＺを介して捕捉用抗体を担持させたビーズ分散液５０μＬをシリンジに加えずに、０．２ｍＬチューブに加え、遠心分離し、上澄みを除去した。１５０ｎｇ／ｍＬのスパイクタンパク質のブロッキングバッファー溶液（１００μＬ）をチューブ内でビーズと混合し、ビーズを液中に分散して、室温で３０分間以上、静置した。遠心分離し、上澄みを除去し、ＰＢＳで３回洗浄した。

１５０ｎｇ／ｍＬの標識抗体のブロッキングバッファー溶液（１００μＬ）をチューブ内でビーズと混合し、ビーズを液中に分散して、室温で３０分間以上、静置した。遠心分離し、上澄みを除去し、ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズに混合した呈色試薬（１２０μＬ）を注ぎ、ビーズを液中に分散して、室温で５分間以上、静置した。遠心分離し、上澄みの吸光度を測定した。

（結果）
図４に示すように、前標識は、後標識と同様に、スパイクタンパク質を検出できることが示された。なお、試料に含まれるスパイクタンパク質の質量は両者で同じである。

［実施例４］
５ｃｍ角の平板の表面にスパイクタンパク質１５０ｎｇを塗布し乾固させた。平板の表面において、緩衝液（ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ－ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ）－Ｔ等）で湿潤させた綿棒を隙間無く縦横に往復させ、それぞれ一回ずつ拭った。綿棒を実施例１と同じＨＲＰで標識した検出用抗体のブロッキングバッファー溶液に浸漬させて検体を溶液に回収した。実施例１で使用した検査キットを用いて、検体について実施例１と同様に測定した。対照として、１５０ｎｇのスパイクタンパク質を含むブロッキングバッファー溶液と、ＨＲＰで標識した検出用抗体のブロッキングバッファー溶液とを混合した試料を用いた。

平板をドアノブの取っ手、レバーの取っ手又は洋式便器の便座上の部分（５ｃｍ角程度）に代えて得られた検体について実施例１と同様に測定した。

（結果）
平板から回収した検体及びドアノブの取っ手から回収した検体の結果をそれぞれ図５及び図６に示す。両方の検体は対照とほぼ同等の吸光度を示した。レバーの取っ手及び洋式便器の便座でも図５と同様の結果が得られた。

上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

本発明は、病原体の検出に好適である。

１シリンジ
２フィルター
３ピストン
４微粒子
１０検出キット

Claims

抗体のＦｃ領域に結合する抗体結合ドメインを外側表面に有する脂質二重膜と、
前記抗体結合ドメインにＦｃ領域を介して保持される、検出対象に結合する捕捉用抗体と、
前記脂質二重膜を表面に担持する微粒子と、
を備える、検出キット。
前記脂質二重膜は、
粒子形成能を有するタンパク質を含み、ナノ粒子として前記微粒子に担持される、
請求項１に記載の検出キット。
前記粒子形成能を有するタンパク質は、
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質である、
請求項２に記載の検出キット。
前記抗体結合ドメインは、
ＰｒｏｔｅｉｎＡのＦｃ領域結合Ｚドメイン２量体である、
請求項１から３のいずれか一項に記載の検出キット。
前記捕捉用抗体とは抗原認識部位が異なる前記検出対象に結合する検出用抗体をさらに備える、
請求項１から４のいずれか一項に記載の検出キット。
前記検出用抗体は、
酵素で標識された抗体であって、
前記酵素の発色基質をさらに備える、
請求項５に記載の検出キット。
前記検出対象は、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、
請求項１から６のいずれか一項に記載の検出キット。
検出対象に結合する検出用抗体と検体とを混合する混合ステップと、
抗体のＦｃ領域に結合する抗体結合ドメインを外側表面に有する脂質二重膜における前記抗体結合ドメインにＦｃ領域を介して保持された、前記検出用抗体とは抗原認識部位が異なる前記検出対象に結合する捕捉用抗体を、前記混合ステップで得られた混合物に暴露する暴露ステップと、
前記捕捉用抗体に結合した前記検体に含まれる前記検出対象を、前記検出用抗体によって検出する検出ステップと、
を含み、
前記脂質二重膜は、微粒子の表面に担持されている、
検出方法。
前記検体は、
物を拭き取ることで採取される、
請求項８に記載の検出方法。