JP2022548644A - タンパク質発現のためのシステムおよび方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、エンハンサータンパク質と併せた標的タンパク質の発現のためのシステムを提供する。エンハンサータンパク質は、核細胞質間輸送を遮断するウイルスタンパク質であり得る。標的タンパク質およびエンハンサータンパク質の核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞も提供される。一態様では、本開示は、１種または複数種のベクターを含む真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムを提供する。ベクター（複数または単数）は、標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを有する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９０１，０４３号、および２０２０年２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／９７０，６２８号の利益を主張するものであり、これら仮出願のそれぞれの内容全体は、あらゆる目的のため、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の組み込み
本明細書に添付して電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名：ＥＸＣＩ＿００１＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０２０年９月１５日、ファイルサイズ：８４．８ｋｂ）。
背景
培養で成長させた真核細胞におけるタンパク質の組換え発現は、科学研究および医学において応用が利く。組換えにより産生されたタンパク質（抗体、酵素、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、分泌タンパク質、イオンチャネル、ウイルスタンパク質および増殖因子等）は、新薬を開発（例えば、小分子発見）するために、治療薬（例えば、抗体および他の生物学的薬物）として、および分析的方法のための重大な資源として、製薬業界内で使用されている。製薬業界内でのこれらの使用に加えて、組換えにより産生された哺乳動物タンパク質は、食品業界においてますます使用されている（例えば、いわゆるクリーンミート（ｃｌｅａｎ ｍｅａｔ）産生のために）。多くの組換えタンパク質について、機能的な形態での組換えタンパク質の発現の達成は、依然として困難である。
組換えタンパク質の産生において有用な組成物および方法の必要は、依然として満たされていない。
概要
本発明者らは、標的タンパク質と、ある特定のエンハンサータンパク質との同時発現が、組換えにより産生されるタンパク質を改善することを認識した。様々な実施形態では、開示されている組成物および方法は、先行技術を上回る、次の利点のうち１種または複数種を示す：（１）開示されている組成物および方法は、細胞株（例えば、真核細胞株）内の標的タンパク質のタンパク質発現（収量）を増加させる；（２）開示されている組成物および方法は、標的タンパク質の発現の調節を制御する；（３）開示されている組成物および方法は、改善された特性（例えば、減少された、ミスフォールディング、変更された活性、不正確な翻訳後修飾および／または毒性）を示す標的タンパク質を発現させる；（４）開示されている組成物および方法は、組換えタンパク質の正確なフォールディングおよび／または高収量を増加させる；（５）開示されている組成物および方法は、下流活性化経路（例えば、ＧＰＣＲシグナル伝達）の性能を改善する；ならびに／または（６）エンハンサータンパク質の同時発現は、標的タンパク質の機能性および／もしくは細胞の下流代謝に影響を与えない。一部の実施形態は、これらの利点のうちいずれも示さないか、いくつかを示すかまたは全てを示すため、本発明は、これらの列挙されている利点によって限定されない。
一態様では、本開示は、１種または複数種のベクターを含む真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムを提供する。ベクター（複数または単数）は、標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを有する。エンハンサータンパク質は、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、ならびに／またはエンハンサータンパク質は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択される。第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている。
別の態様では、本開示は、標的タンパク質の発現のための真核細胞であって、エンハンサータンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。エンハンサータンパク質は、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、ならびに／またはエンハンサータンパク質は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択される。外因性ポリヌクレオチドは、プロモーター（必要に応じて、ネイティブプロモーターまたは外因性プロモーター）に作動可能に連結されている。さらに別の態様では、本開示は、標的タンパク質の組換え発現のための方法であって、プロモーターに作動可能に連結された、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、この真核細胞に導入するステップを含む方法を提供する。さらに別の態様では、本開示は、標的タンパク質の組換え発現のための方法であって、本開示のベクターシステムを真核細胞に導入するステップを含む方法を提供する。さらに別の態様では、本開示は、真核細胞への本開示のベクターシステム（またはベクター）の導入によって産生された細胞を提供する。さらに別の態様では、本開示は、真核細胞への本開示のベクターシステム（またはベクター）の導入によって発現されたタンパク質を提供する。さらに別の態様では、本開示は、真核細胞において標的タンパク質を発現させるための方法であって、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド）を真核細胞に導入するステップを含む方法を提供する。本方法は、エンハンサータンパク質の同時発現を利用して、標的タンパク質の発現レベル、溶解度および／または活性を増強する。エンハンサータンパク質は、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、ならびに／またはエンハンサータンパク質は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、標的タンパク質に対する抗体を生成するための方法であって、本開示のシステムまたは方法を使用して産生された細胞または標的タンパク質で対象を免疫化するステップを含む方法を提供する。さらに別の態様では、本開示は、細胞選別による抗体発見のための方法であって、本開示のシステムまたは方法を使用して産生された標識された細胞または標識された標的タンパク質、および組換え細胞の集団を含む溶液を用意するステップであって、組換え細胞が、抗体またはその抗原結合性断片をそれぞれ含むポリペプチドのライブラリーを発現する、ステップと、標識された細胞または標識された標的タンパク質に結合された組換え細胞を検出することにより、溶液から１つまたは複数の組換え細胞を選別するステップとを含む方法を提供する。さらなる態様では、本開示は、ファージディスプレイライブラリーをパニングするための方法であって、ファージディスプレイライブラリーを、本開示のシステムまたは方法を使用して産生された細胞または標的タンパク質と混合するステップと、細胞または標的タンパク質に結合するファージディスプレイライブラリーのメンバーを精製および／または富化するステップとを含む方法を提供する。
次の詳細な開示によって、さらなる態様および実施形態が提供される。本発明は、本概要によって限定されるものではない。
図１は、真核細胞における遺伝子発現を調節する、６種の例示的な様式を描写する。
図２Ａ～図２Ｙは、非限定的な例示的構築物の概略図である：ＥＧ１、図２Ａ；ＥＧ２、図２Ｂ；ＥＧ３およびＥＧ４、図２Ｃ；ＥＧ５、図２Ｄ；ＥＧ６、図２Ｅ；ＥＧ７、図２Ｆ；ＥＧ８、図２Ｇ；ＥＧ９、図２Ｈ；ＥＧ１０およびＥＧ１１、図２Ｉ；ＥＧ１２およびＥＧ４、図２Ｊ；ＥＧ１０、図２Ｋ；ＥＧ１３、図２Ｌ；ＥＧ１４、図２Ｍ；ＥＧ１５、図２Ｎ；ＥＧ１６、図２Ｏ；ＥＧ１７、図２Ｐ；ＥＧ１８、図２Ｑ；ＥＧ１９、図２Ｒ；ＥＧ２０、図２Ｓ；ＥＧ２１、図２Ｔ；ＥＧ２２、図２Ｕ；ＥＧ２３、図２Ｖ；ＥＧ２４、図２Ｗ；ならびにＥＧ２５、図２Ｘ。 図２Ａ～図２Ｙは、非限定的な例示的構築物の概略図である：ＥＧ１、図２Ａ；ＥＧ２、図２Ｂ；ＥＧ３およびＥＧ４、図２Ｃ；ＥＧ５、図２Ｄ；ＥＧ６、図２Ｅ；ＥＧ７、図２Ｆ；ＥＧ８、図２Ｇ；ＥＧ９、図２Ｈ；ＥＧ１０およびＥＧ１１、図２Ｉ；ＥＧ１２およびＥＧ４、図２Ｊ；ＥＧ１０、図２Ｋ；ＥＧ１３、図２Ｌ；ＥＧ１４、図２Ｍ；ＥＧ１５、図２Ｎ；ＥＧ１６、図２Ｏ；ＥＧ１７、図２Ｐ；ＥＧ１８、図２Ｑ；ＥＧ１９、図２Ｒ；ＥＧ２０、図２Ｓ；ＥＧ２１、図２Ｔ；ＥＧ２２、図２Ｕ；ＥＧ２３、図２Ｖ；ＥＧ２４、図２Ｗ；ならびにＥＧ２５、図２Ｘ。 図２Ａ～図２Ｙは、非限定的な例示的構築物の概略図である：ＥＧ１、図２Ａ；ＥＧ２、図２Ｂ；ＥＧ３およびＥＧ４、図２Ｃ；ＥＧ５、図２Ｄ；ＥＧ６、図２Ｅ；ＥＧ７、図２Ｆ；ＥＧ８、図２Ｇ；ＥＧ９、図２Ｈ；ＥＧ１０およびＥＧ１１、図２Ｉ；ＥＧ１２およびＥＧ４、図２Ｊ；ＥＧ１０、図２Ｋ；ＥＧ１３、図２Ｌ；ＥＧ１４、図２Ｍ；ＥＧ１５、図２Ｎ；ＥＧ１６、図２Ｏ；ＥＧ１７、図２Ｐ；ＥＧ１８、図２Ｑ；ＥＧ１９、図２Ｒ；ＥＧ２０、図２Ｓ；ＥＧ２１、図２Ｔ；ＥＧ２２、図２Ｕ；ＥＧ２３、図２Ｖ；ＥＧ２４、図２Ｗ；ならびにＥＧ２５、図２Ｘ。
図３Ａ～図３Ｄは、対照ベクターＥＧ１と比較した、構築物ＥＧ２（ＣＭＶ－ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｌ）を使用して発現されたＧＦＰを発現する細胞の光学および蛍光顕微鏡の画像を示す。図３Ａ：ＥＧ１を含む細胞の光学顕微鏡。図３Ｂ：ＥＧ１を含む細胞の蛍光顕微鏡。図３Ｃ：ＥＧ２を含む細胞の光学顕微鏡。図３Ｄ：ＥＧ２を含む細胞の蛍光顕微鏡。ＥＧ２構築物からの蛍光ＧＦＰタンパク質の発現は、システムの実現可能性を実証する。ＥＧ１を含む細胞（図３Ｂ）と比較した、ＥＧ２を含む細胞（図３Ｄ）における有害な過剰発現の低下は、Ｌ－タンパク質の導入によるＧＦＰ発現の改善された調節を実証する。図３Ａ～図３Ｄにおけるバーは、４００ミクロンを表す。
図４Ａ～図４Ｄは、対照ベクターＥＧ１と比較した、構築物ＥＧ３およびＥＧ４（それぞれＴ７－ＩＲＥＳ－Ｌ－ＧＦＰおよびＣＭＶ－Ｔ７）を使用して発現されたＧＦＰを発現する細胞の光学および蛍光顕微鏡の画像を示す。図４Ａ：ＥＧ１を含む細胞の光学顕微鏡。図４Ｂ：ＥＧ１を含む細胞の蛍光顕微鏡。図４Ｃ：ＥＧ３＋ＥＧ４を含む細胞の光学顕微鏡。図４Ｄ：ＥＧ３＋ＥＧ４を含む細胞の蛍光顕微鏡。ＥＧ３＋ＥＧ４構築物からの蛍光ＧＦＰタンパク質の発現は、システムの実現可能性を実証する。ＥＧ１を含む細胞（図４Ｂ）と比較した、ＥＧ３＋ＥＧ４を含む細胞（図４Ｄ）における発現の低下は、Ｌ－タンパク質の導入によるＧＦＰ発現の改善された調節を実証する。図４Ａ～図４Ｄにおけるバーは、４００ミクロンを表す。
図５Ａ～図５Ｄは、構築物ＥＧ１０（ＣＭＶ－［ＤＲＤ１－ＧＦＰ］）（図５Ａ）またはＥＧ８（ＣＭＶ－［ＤＲＤ１－ＧＦＰ］－ＩＲＥＳ－Ｌ）（図５Ｃ）からＤＲＤ１－ＧＦＰ融合体を発現する細胞の蛍光顕微鏡の画像を示す。構築物ＥＧ１０を使用したＤＲＤ１－ＧＦＰは、発現されるが、受容体を外膜中に輸送することができず、封入体の形成を生じる（図５Ｂ、矢印）。構築物ＥＧ８を使用したＤＲＤ１－ＧＦＰは、発現され、膜中に確実に輸送され、高品質での外膜におけるＧＰＣＲの高収量をもたらす（図５Ｄ）。
図６Ａ～図６Ｂは、構築物ＥＧ１０（ＣＭＶ－［ＤＲＤ１－ＧＦＰ］）（図６Ａ）またはＥＧ１２およびＥＧ４（それぞれＴ７－ＩＲＥＳ－Ｌ－ＤＲＤ１－ＧＦＰおよびＣＭＶ－Ｔ７）（図６Ｂ）から発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞の蛍光顕微鏡の画像を示す。ＥＧ１０を使用して発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰは、発現されるが、受容体を外膜中に正確に輸送することができず、封入体の形成を生じる（図６Ａ、矢印）。ＥＧ４と組み合わせたＥＧ１２を使用して発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰは、発現され、膜中に確実に輸送され、高品質での外膜におけるＧＰＣＲの高収量をもたらす（図６Ｂ）。
図７は、抗ＣＦＴＲウエスタンブロットの結果を示す。ＰＣＲ産物またはベクターとして送達されたＬ－タンパク質およびＣＦＴＲの同時発現（破線の左）は、収量の減少を生じるが、Ｌ－タンパク質の同時発現なしのＣＦＴＲの対照発現（破線の右）と比較して、より均質な試料を生じる。
図８Ａ～図８Ｂは、ＮＡＤａｓｅの精製および活性検査の結果を示す。図８Ａは、ＦＬＡＧタグを使用して親和性精製されたＮＡＤａｓｅのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す（標準、ＳｅｅＢｌｕｅ２ ｐｌｕｓ；レーン２、溶解物／ロード；レーン３、フロースルー；レーン４、カラム溶出画分１；レーン５、カラム溶出画分２；レーン６、カラム溶出画分３；レーン７、カラム溶出画分４；８、樹脂）。図８Ｂは、異なる濃度の精製されたＮＡＤａｓｅを使用した、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって解析されたＮＡＤ＋変換活性のグラフを示す。
図９Ａ～図９Ｂは、ＩＴＫのＨｉｓタグ精製の結果を示す。図９Ａは、Ｈｉｓタグを使用して親和性精製されたＩＴＫのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。レーン：レーン１、ＳｅｅＢｌｕｅ２ ｐｌｕｓ着色済み；レーン２、５００ｎｇ ＧＦＰ；レーン３、２μｇ ＩＴＫ；レーン４、５μｇ ＩＴＫ；レーン５、１０μｇ ＩＴＫ。図９Ｂは、図９ＡのＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のウエスタンブロット解析を示し、矢印は、ＩＴＫの単量体および二量体を指す。
図１０は、構築物ＥＧ１０（ＣＭＶ－［ＤＲＤ１－ＧＦＰ］）（図１０Ａ）またはＥＧ１０およびＥＧ１１（図１０Ｂ）から発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞の蛍光顕微鏡の画像を示す。矢印は、受容体を外膜中に正確に輸送することができない、ＥＧ１０から発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰによって形成された封入体を指す。
図１１は、ドーパミンの存在または非存在下でＨＥＫ２９３細胞においてＥ５構築物（ＣＭＶ－ＤＲＤ１－Ｓｔｒｐ）またはＥ６構築物（ＣＭＶ－ＤＲＤ１－Ｓｔｒｐ－ＩＲＥＳ－Ｌ）のいずれかを発現する細胞におけるｃＡＭＰレベルを指し示す、ｃＡＭＰ－Ｇｌｏ（商標）アッセイに起因する発光を示すグラフを示す。より高い発光シグナルは、ＤＲＤ１－Ｓｔｒｅｐのより高い機能活性を指し示す。
図１２は、ＣＭＶプロモーターを使用して発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質（図１２Ａ）、ＣＭＶプロモーターを使用してＬタンパク質と組み合わせて発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質（図１２Ｂ）、ＥＦ１－αプロモーターを使用してＬタンパク質と組み合わせて発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質（図１２Ｃ）、およびＳＶ４０プロモーターを使用してＬタンパク質と組み合わせて発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質（図１２Ｄ）を発現する細胞の蛍光顕微鏡の画像を示す。下部パネルは、上部パネルに示すいくつかの細胞の拡大図を示す。
図１３は、ＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質（図１３Ａ）、ＥＭＣＶ由来のＬタンパク質と組み合わせて発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質（図１３Ｂ）、タイラーウイルス由来のＬタンパク質と組み合わせて発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質（図１３Ｃ）、ポリオウイルスの２Ａプロテアーゼと組み合わせて発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質（図１３Ｄ）、および水疱性口内炎ウイルスのＭタンパク質と組み合わせて発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質（図１３Ｅ）を発現するＨＥＫ２９３細胞の蛍光顕微鏡の画像を示す。下部パネルは、上部パネルに示すいくつかの細胞の拡大図を示す。
図１４は、ＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質（図１４Ａ）、およびタイラーウイルス由来のＬタンパク質と組み合わせて発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質（図１４Ｂ）を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の蛍光顕微鏡の画像を示す。矢印は、受容体を外膜中に正確に輸送することができない、ＥＧ１０から発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰによって形成された封入体を指す。
図１５は、ＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質（図１５Ａ）、およびＥＭＣＶ由来のＬタンパク質と組み合わせて発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質（図１５Ｂ）を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の蛍光顕微鏡の画像を示す。図１５Ａにおいて、矢印は、受容体を外膜中に正確に輸送することができない、ＥＧ１０から発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰによって形成された封入体を指す。図１５Ｂにおいて、矢印は、正確に局在化され、膜に取り込まれたＤＲＤ１－ＧＦＰを指す。
図１６は、ニッケル負荷親和性樹脂（図１６Ａ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（図１６Ｂ）を使用して精製された、ＨＥＫ２９３細胞において発現されたＩＴＫタンパク質、およびニッケル負荷親和性樹脂（図１６Ｃ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（図１６Ｄ）を使用して精製された、ＨＥＫ２９３細胞において発現されたＩＴＫ－Ｌ融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の画像を示す。Ｐ１は、二量体形態のＩＴＫを指し、一方、Ｐ２は、単量体形態のＩＴＫを指す。 図１６は、ニッケル負荷親和性樹脂（図１６Ａ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（図１６Ｂ）を使用して精製された、ＨＥＫ２９３細胞において発現されたＩＴＫタンパク質、およびニッケル負荷親和性樹脂（図１６Ｃ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（図１６Ｄ）を使用して精製された、ＨＥＫ２９３細胞において発現されたＩＴＫ－Ｌ融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の画像を示す。Ｐ１は、二量体形態のＩＴＫを指し、一方、Ｐ２は、単量体形態のＩＴＫを指す。
図１７Ａは、精製されたＩＴＫタンパク質、およびＨＥＫ２９３細胞においてＬタンパク質と組み合わせて発現された精製されたＩＴＫタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す。図１７Ｂは、ＳＤＳ ＰＡＧＥ画像に指し示す通りの、Ｐ１およびＰ２ ＩＴＫ精製タンパク質試料の発光測定のグラフを示す。 図１７Ａは、精製されたＩＴＫタンパク質、およびＨＥＫ２９３細胞においてＬタンパク質と組み合わせて発現された精製されたＩＴＫタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す。図１７Ｂは、ＳＤＳ ＰＡＧＥ画像に指し示す通りの、Ｐ１およびＰ２ ＩＴＫ精製タンパク質試料の発光測定のグラフを示す。
図１８は、ニッケル負荷親和性樹脂（図１８Ａ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（図１８Ｂ）を使用して精製された、ＣＨＯ細胞において発現されたＩＴＫタンパク質、およびニッケル負荷親和性樹脂（図１８Ｃ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（図１８Ｄ）を使用して精製された、ＣＨＯ細胞においてＬタンパク質と組み合わせて発現されたＩＴＫタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の画像を示す。Ｐ１は、二量体形態のＩＴＫを指し、一方、Ｐ２は、単量体形態のＩＴＫを指す。 図１８は、ニッケル負荷親和性樹脂（図１８Ａ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（図１８Ｂ）を使用して精製された、ＣＨＯ細胞において発現されたＩＴＫタンパク質、およびニッケル負荷親和性樹脂（図１８Ｃ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（図１８Ｄ）を使用して精製された、ＣＨＯ細胞においてＬタンパク質と組み合わせて発現されたＩＴＫタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の画像を示す。Ｐ１は、二量体形態のＩＴＫを指し、一方、Ｐ２は、単量体形態のＩＴＫを指す。 図１８は、ニッケル負荷親和性樹脂（図１８Ａ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（図１８Ｂ）を使用して精製された、ＣＨＯ細胞において発現されたＩＴＫタンパク質、およびニッケル負荷親和性樹脂（図１８Ｃ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（図１８Ｄ）を使用して精製された、ＣＨＯ細胞においてＬタンパク質と組み合わせて発現されたＩＴＫタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の画像を示す。Ｐ１は、二量体形態のＩＴＫを指し、一方、Ｐ２は、単量体形態のＩＴＫを指す。 図１８は、ニッケル負荷親和性樹脂（図１８Ａ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（図１８Ｂ）を使用して精製された、ＣＨＯ細胞において発現されたＩＴＫタンパク質、およびニッケル負荷親和性樹脂（図１８Ｃ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（図１８Ｄ）を使用して精製された、ＣＨＯ細胞においてＬタンパク質と組み合わせて発現されたＩＴＫタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の画像を示す。Ｐ１は、二量体形態のＩＴＫを指し、一方、Ｐ２は、単量体形態のＩＴＫを指す。
図１９は、ＣＨＯ細胞においてＬタンパク質と組み合わせて発現され、サイズ排除クロマトグラフィー実験を使用して精製された、Ｐ１およびＰ２ ＩＴＫタンパク質試料の発光測定のグラフを示す。
図２０Ａは、エンハンサーＬタンパク質の非存在（左）または存在（右）下で発現された、精製されたＣ１－阻害剤のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の画像を示す。図２０Ｂは、指し示す通り、エンハンサーＬタンパク質の存在または非存在下で発現された、精製されたＣ１－阻害剤タンパク質試料中に存在する機能活性があるＣ１－阻害剤の濃度を描写するグラフを示す。製造業者のプロトコールの通りに陽性対照（１００％活性）としてＣ１－阻害剤含有健康ヒト血漿を使用して、市販のＱｕｉｄｅｌ ＭｉｃｒｏＶｕｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ１－Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｐｌｕｓ酵素イムノアッセイを使用してデータを得た。
図２１は、ＰＳＧ１のイオン交換クロマトグラフィーを示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによってＰＳＧ１の存在を確認する（図２１Ｂ、赤色の矢印）前に、タンパク質含有画分（図２１Ａ、赤色のボックス）をプールし濃縮した。 図２１は、ＰＳＧ１のイオン交換クロマトグラフィーを示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによってＰＳＧ１の存在を確認する（図２１Ｂ、赤色の矢印）前に、タンパク質含有画分（図２１Ａ、赤色のボックス）をプールし濃縮した。
詳細な説明
本開示において、エンハンサータンパク質と標的タンパク質の同時発現において有用な、ベクターシステム、ベクターまたは真核細胞が提供される。一部の実施形態では、１種または複数種のベクターを含む真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムが提供される。一部の実施形態では、ベクター（複数または単数）は、標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを有する。エンハンサータンパク質は、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、ならびに／またはエンハンサータンパク質は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択される。第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている。
理論に制約されることなく、本開示の組成物および方法は、細胞の調節機構が、組換え標的タンパク質の発現に応答して活性化することを防止し、これにより、標的タンパク質の収量および／または機能性が改善されると思われる。本開示の方法およびシステムは、（１）転写開始の阻害、（２）転写終結およびポリアデニル化の阻害、（３）ｍＲＮＡプロセシングおよびスプライシングの阻害、（４）ｍＲＮＡ搬出の阻害、（５）翻訳開始の阻害、ならびに（６）ストレス応答を含むがこれらに限定されない、１種または複数種の細胞機構を阻害または干渉することができる（図１）。
図２Ａ～図２Ｙおよび表１に様々な実施形態が描写されている。一部の実施形態では、第１のベクターは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、第２のベクターは、エンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、単一のベクターは、標的タンパク質およびエンハンサータンパク質をコードする１種または複数種のポリヌクレオチドを含む。ベクターは、標的タンパク質およびエンハンサータンパク質の両方をコードする単一のポリヌクレオチドを含むことができる。代替では、２種以上のエンハンサータンパク質および／または２種以上の標的タンパク質が、ベクター（単数または複数）によってコードされる。
ポリヌクレオチド
本開示は、１種または複数種の標的タンパク質および１種または複数種のエンハンサータンパク質の発現のための組換えポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチド（または核酸もしくは核酸分子）は、１種または複数種の目的の遺伝子を含むことができ、本開示の組成物および方法を使用して細胞（例えば、真核細胞）に送達される。本開示のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド分子を含むことができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、天然の供給源から単離される；ＰＣＲ増幅もしくは化学合成等の技法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製される；例えば、組換えＤＮＡ技術により、ｉｎ ｖｉｖｏで調製される；またはいずれか適切な方法によって調製されるもしくは得られる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、いずれかの形状（直鎖状、環状等）またはトポロジー（一本鎖、二本鎖、直鎖状、環状、スーパーコイル、ねじれ、ニック入り等）のものである。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびポリペプチド－核酸コンジュゲート等の核酸誘導体；少なくとも１個の化学修飾された糖残基、骨格、ヌクレオチド間連結、塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシドまたはヌクレオチドアナログもしくは誘導体を有する核酸；ならびに化学修飾された５’または３’末端を有する核酸；ならびにかかる修飾のうち２個またはそれよりも多くを有する核酸を含むこともできる。ポリヌクレオチドにおける全ての連結が、同一である必要はない。
ポリヌクレオチドの例は、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において有用なオリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されない）、アプタマー、核酸、人工染色体、クローニングベクターおよび構築物、発現ベクターおよび構築物、遺伝子療法ベクターおよび構築物、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｔＲＮＡ、ならびにｔｍＲＮＡその他を限定することなく含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プラスミドである。
ポリヌクレオチドは、タンパク質のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を産生するために転写および翻訳（例えば、ＤＮＡ→ＲＮＡ→タンパク質）または翻訳（ＲＮＡ→タンパク質）され得る核酸配列を含む場合、前記タンパク質を「コードする」と言われる。ｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、真核細胞内）転写および／または翻訳は、内因性または外因性酵素によって行われる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの転写は、真核細胞の内因性ポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）によって行われる。一部の実施形態では、外因性ＲＮＡポリメラーゼは、同じまたは異なるベクターにおいて提供される。一部の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＨ８ ＲＮＡポリメラーゼから選択される。
本開示に係る例示的ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードする「第１のポリヌクレオチド」；エンハンサータンパク質をコードする「第２のポリヌクレオチド」；ならびに１種もしくは複数の標的タンパク質、１種もしくは複数のエンハンサータンパク質および／または１種もしくは複数の分離エレメントをコードする「コードポリヌクレオチド」を含む。
標的タンパク質
本開示に係るポリヌクレオチドは、１種または複数種の標的タンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。標的タンパク質をコードする核酸配列は、目的の遺伝子（「ＧＯＩ」）と称される。標的タンパク質は、発現が望まれるいずれかのタンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質は、膜タンパク質である。一部の実施形態では、参照発現システムにおいて発現されると、タンパク質の発現は、細胞毒性を引き起こすことができる。一部の実施形態では、タンパク質は、伝統的発現システムにおいて低収量発現であるタンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質の発現または品質は、開示されている方法に従った、例えば、１種または複数種のエンハンサータンパク質と併せた、発現によって著しく改善される。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＡＡＶカプシドタンパク質である。ＡＡＶカプシド標的タンパク質は、ネイティブＡＡＶカプシドタンパク質、またはネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列に１個もしくは複数の突然変異を含む突然変異体ＡＡＶカプシドタンパク質であり得る。
本組成物および方法の使用による発現のための標的タンパク質は、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、イミグルセラーゼ、タリグルセラーゼアルファ、ベラグルセラーゼアルファ、アルグルセラーゼ、セベリパーゼアルファ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、エロスルファーゼアルファ、ガルスルファーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、第ＶＩＩＩ因子、Ｃ３阻害剤、ハーラー症およびハンター症補正因子（Ｈｕｒｌｅｒ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ ｃｏｒｒｅｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）等、酵素補充に関係するタンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、標的タンパク質は、バイオシミラーである。一部の実施形態では、標的タンパク質は、分泌タンパク質、例えば、Ｃ１－Ｉｎｈであり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、抗体である。一部の実施形態では、本組成物および方法は、酵素産生のために使用される。かかる酵素は、臨床検査キットまたは他の診断アッセイの産生において有用であり得る。一部の実施形態では、本組成物および方法は、治療タンパク質の産生に使用される。一部の実施形態では、タンパク質は、ヒトタンパク質であり、発現のための宿主細胞は、ヒト細胞である。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、アバレリックス、アバタセプト、アブシキシマブ、アダリムマブ、アフリベルセプト、アガルシダーゼベータ、アルビグルチド、アルデスロイキン、アレファセプト、アレムツズマブ、アルグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、アリロクマブ、アリスキレン、アルファ－１－プロテイナーゼ阻害剤、アルテプラーゼ、アナキンラ、アンセスチム、アニストレプラーゼ、炭疽免疫グロブリンヒト、抗血友病因子、アンチトロンビンアルファ、アンチトロンビンＩＩＩヒト、抗胸腺細胞グロブリン、抗胸腺細胞グロブリン（ウマ）、抗胸腺細胞グロブリン（ウサギ）、アプロチニン、アルシツモマブ、アスホターゼアルファ、アスパラギナーゼ、アスパラギナーゼＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、アテゾリズマブ、自家培養軟骨細胞、バシリキシマブ、ベカプレルミン、ベラタセプト、ベリムマブ、ベラクタント、ベバシズマブ、ビバリルジン、ブリナツモマブ、Ａ型ボツリヌス毒素、Ｂ型ボツリヌス毒素、ブレンツキシマブベドチン、ブロダルマブ、ブセレリン、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（ヒト）、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カナキヌマブ、カナキヌマブ、カプロマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、コリオゴナドトロピンアルファ、絨毛性ゴナドトロピン（ヒト）、絨毛性ゴナドトロピン、凝固第ＩＸ因子、凝固第ＶＩＩａ因子、凝固第Ｘ因子ヒト、凝固第ＸＩＩＩ因子Ａサブユニット、コラゲナーゼ、コネスタットアルファ、コルチコトロピン、コシントロピン、ダクリズマブ、ダプトマイシン、ダラツムマブ、ダルベポエチンアルファ、デフィブロチド、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、デシルジン、ジヌツキシマブ、ドルナーゼアルファ、ドロトレコギンアルファ、デュラグルチド、エクリズマブ、エファリズマブ、エフモロクトコグ（Ｅｆｍｏｒｏｃｔｏｃｏｇ）アルファ、エロスルファーゼアルファ、エロツズマブ、エンフビルチド、エポエチンアルファ、エポエチンゼータ、エプチフィバチド、エタネルセプト、エボロクマブ、エキセナチド、第ＩＸ因子複合体（ヒト）、濃縮フィブリノゲン（ヒト）、フィブリノリジン別名プラスミン、フィルグラスチム、フィルグラスチム－ｓｎｄｚ、フォリトロピンアルファ、フォリトロピンベータ、ガルスルファーゼ、胃内因子、ゲムツズマブオゾガマイシン、グラチラマー酢酸塩、グルカゴン組換え、グルカルピダーゼ、ゴリムマブ、グラミシジンＤ、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎免疫グロブリン、ヒトカルシトニン、ヒトＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉトキソイド免疫グロブリン、ヒト狂犬病ウイルス免疫グロブリン、ヒトＲｈｏ（Ｄ）免疫グロブリン、ヒト血清アルブミン、ヒト水痘帯状疱疹免疫グロブリン、ヒアルロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、イダルシズマブ、イデュルスルファーゼ、イミグルセラーゼ、免疫グロブリンヒト、インフリキシマブ、インスリンアスパルト、ウシインスリン、インスリンデグルデク、インスリンデテミル、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリンリスプロ、ブタインスリン、レギュラーインスリン、レギュラーインスリン、インスリン、ブタ、インスリン、イソフェン、インターフェロンアルファ－２ａ、組換え、インターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンアルファコン（ａｌｆａｃｏｎ）－１、インターフェロンアルファ－ｎ１、インターフェロンアルファ－ｎ９、インターフェロンベータ－１ａ、インターフェロンベータ－１ｂ、インターフェロンガンマ－１ｂ、静脈内免疫グロブリン、イピリムマブ、イキセキズマブ、ラロニダーゼ、レノグラスチム、レピルジン、リュープロリド、リラグルチド、ルシナクタント、ルトロピンアルファ、ルトロピンアルファ、メカセルミン、メノトロピン、メポリズマブ、エポエチンベータ、メトレレプチン、ムロモナブ、ナタリズマブ、アルファインターフェロン、ネシツムマブ、ネシリチド、ニボルマブ、オビルトキサキシマブ（Ｏｂｉｌｔｏｘａｘｉｍａｂ）、オビヌツズマブ、オクリプラスミン、オファツムマブ、オマリズマブ、オプレルベキン、ＯｓｐＡリポタンパク質、オキシトシン、パリフェルミン、パリビズマブ、パンクレリパーゼ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、ボラクタントアルファ、プラムリンチド、プレオタクト（Ｐｒｅｏｔａｃｔ）、プロテインＳヒト、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラスブリカーゼ、ラキシバクマブ、レテプラーゼ、リロナセプト、リツキシマブ、ロミプロスチム、サクロシダーゼ、サケカルシトニン、サルグラモスチム、サツモマブペンデチド（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ Ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、セベリパーゼアルファ、セクレチン、セクキヌマブ、セルモレリン、血清アルブミン、ヨウ素化血清アルブミン、シルツキシマブ、シモクトコグアルファ、シプロイセル－Ｔ、ソマトトロピン組換え、ソマトロピン組換え、ストレプトキナーゼ、スロデキシド、スソクトコグ（Ｓｕｓｏｃｔｏｃｏｇ）アルファ、タリグルセラーゼアルファ、テデュグルチド、テイコプラニン、テネクテプラーゼ、テリパラチド、テサモレリン、トロンボモジュリンアルファ、サイマルファシン、サイログロブリン、サイロトロピンアルファ、サイロトロピンアルファ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツベルクリン精製タンパク質誘導体、ツロクトコグアルファ、ウロフォリトロピン、ウロキナーゼ、ウステキヌマブ、バソプレシン、ベドリズマブ、およびベラグルセラーゼアルファからなる群から選択される。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、限定しないが、可溶性タンパク質、分泌タンパク質または膜タンパク質である。一部の実施形態では、標的タンパク質は、限定しないが、ドーパミン受容体１（ＤＲＤ１）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－Ｉｎｈ）、ＩＬ２誘導性Ｔ細胞キナーゼ（ＩＴＫ）またはＮＡＤａｓｅである。一部の実施形態では、ＮＡＤａｓｅは、ＳＡＲＭ１である。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１は、成熟タンパク質を表す欠失バリアントである。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、膜タンパク質である。例示的な膜タンパク質は、イオンチャネル、ギャップジャンクション、イオンチャネル型受容体、輸送体、複合膜タンパク質、例えば、細胞表面受容体（例えば、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、チロシンキナーゼ受容体、インテグリンその他）、シグナル伝達に応答して膜とサイトゾルとの間を往復するタンパク質（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｃ、Ｒａｆ、Ｇαサブユニット、アレスチン、Ｓｒｃおよび他のエフェクタータンパク質）その他を含む。一部の実施形態では、膜タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体である。一部の実施形態では、標的タンパク質は、７（回）膜貫通ドメイン受容体、７ＴＭ受容体、ヘプタヘリカル（ｈｅｐｔａｈｅｌｉｃａｌ）受容体、セルペンチン受容体またはＧタンパク質連結受容体（ＧＰＬＲ）である。一部の実施形態では、標的タンパク質は、クラスＡ ＧＰＣＲ、クラスＢ ＧＰＣＲ、クラスＣ ＧＰＣＲ、クラスＤ ＧＰＣＲ、クラスＥ ＧＰＣＲまたはクラスＦ ＧＰＣＲである。一部の実施形態では、標的タンパク質は、クラス１ ＧＰＣＲ、クラス２ ＧＰＣＲ、クラス３ ＧＰＣＲ、クラス４ ＧＰＣＲ、クラス５ ＧＰＣＲまたはクラス６ ＧＰＣＲである。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ロドプシン様ＧＰＣＲ、セクレチン受容体ファミリーＧＰＣＲ、代謝型グルタミン酸／フェロモンＧＰＣＲ、真菌接合フェロモン受容体、サイクリックＡＭＰ受容体またはフリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）／スムーズンドＧＰＣＲである。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、ヌクレオシダーゼ、ＮＡＤ＋ヌクレオシダーゼ、ヒドロラーゼ、グリコシラーゼ、Ｎ－グリコシル化合物を加水分解するグリコシラーゼ、ＮＡＤ＋グリコヒドロラーゼ（ｇｌｙｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、ＮＡＤａｓｅ、ＤＰＮａｓｅ、ＤＰＮヒドロラーゼ、ＮＡＤヒドロラーゼ、ジホスホピリジンヌクレオシダーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドヌクレオシダーゼ、ＮＡＤグリコヒドロラーゼ、ＮＡＤヌクレオシダーゼまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドグリコヒドロラーゼである。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ニコチン酸およびニコチンアミド代謝ならびにカルシウムシグナル伝達経路に関与する酵素である。
一部の実施形態では、本開示は、真核細胞への本開示のベクターシステム（またはベクター）の導入によって発現されたタンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本開示のポリヌクレオチドを含む真核細胞によって産生された標的タンパク質を提供する。
エンハンサータンパク質
本開示は、標的タンパク質およびエンハンサータンパク質の同時発現に関する。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、収量、品質、フォールディング、翻訳後修飾、活性、局在化および下流活性を含むがこれらに限定されない、標的タンパク質発現の１種もしくは複数の側面を改善することができる、またはミスフォールディング、変更された活性、不正確な翻訳後修飾および／もしくは毒性のうち１種もしくは複数を低下させることができる。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、核膜孔遮断ウイルスタンパク質である。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、核膜孔を遮断し、これにより、核細胞質間輸送（「ＮＣＴ」）を阻害することができるネイティブまたは合成ペプチドである。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、ウイルスタンパク質である。一部の態様では、ウイルスタンパク質は、ＮＣＴ阻害剤である。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択される。
エンハンサータンパク質は、本明細書に開示されているタンパク質のいずれかの機能的バリアントである。本明細書で使用される場合、用語「機能的バリアント」は、本来のタンパク質と相同である、および／またはこの本来のタンパク質と実質的な配列類似性を共有し（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を超える配列同一性）、本来のタンパク質の１種または複数種の機能的特徴を共有する、タンパク質を指す。例えば、ＮＣＴ阻害剤であるエンハンサータンパク質の機能的バリアントは、ＮＣＴを阻害する能力を保持する。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、ピコルナウイルス由来のリーダー（Ｌ）タンパク質またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、Ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓ、ＨｅｐａｔｏｖｉｒｕｓまたはＡｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ属由来のリーダータンパク質である。例えば、エンハンサータンパク質は、ウシ鼻炎Ａウイルス、ウシ鼻炎Ｂウイルス、ウマ鼻炎Ａウイルス、口蹄疫ウイルス、ヘパトウイルスＡ、ヘパトウイルスＢ、Ｍａｒｍｏｔａ ｈｉｍａｌａｙａｎａヘパトウイルス、フォピウイルス（Ｐｈｏｐｉｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルスＡ、カルジオウイルスＢ、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）、ビリュイスク（Ｖｉｌｙｕｉｓｋ）ヒト脳脊髄炎ウイルス（ＶＨＥＶ）、タイラー様ラットウイルス（ＴＲＶ）またはサフォルド（Ｓａｆｆｏｌｄ）ウイルス（ＳＡＦ－Ｖ）に由来することができる。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、タイラーウイルスのＬタンパク質またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、Ｌタンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を共有する。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、配列番号１を含む、これからなるまたはこれから本質的になることができる。エンハンサータンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を共有することができる。
一部の実施形態では、Ｌタンパク質は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＬタンパク質またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、Ｌタンパク質は、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を共有することができる。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、配列番号２を含む、これからなるまたはこれから本質的になることができる。エンハンサータンパク質は、配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を共有することができる。
一部の実施形態では、Ｌタンパク質は、ポリオウイルスのＬタンパク質、ＨＲＶ１６のＬタンパク質、メンゴウイルスのＬタンパク質およびサフォルドウイルス２のＬタンパク質、またはそれらの機能的バリアントからなる群から選択される。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼまたはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、エンテロウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス（Ａｐｈｔｏｖｉｒｕｓ）またはカルジオウイルス由来の２Ａプロテアーゼである。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼまたはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、ピコルナイン（Ｐｉｃｏｒｎａｉｎ）３Ｃプロテアーゼである。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、エンテロウイルス、ライノウイルス、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の３Ｃプロテアーゼである。例えば、一部の非限定的な実施形態では、エンハンサータンパク質は、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、口蹄疫ウイルスまたはヘパトウイルスＡ由来の３Ｃプロテアーゼである。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、核内移行複合体形成を破壊する、および／または核内へのＳＴＡＴ１輸送を破壊する、ウイルスタンパク質である。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、エボラウイルスＶＰ４０タンパク質またはＶＰ３５タンパク質である。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、インポーチンタンパク質カリオフェリン－α（ＫＰＮＡ）に結合するウイルスタンパク質である。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、ＫＰＮＡへのＳＴＡＴ１の結合を阻害するウイルスタンパク質である。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、核膜孔複合体と相互作用するウイルスカプシドタンパク質である。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、ＨＳＶ ＯＲＦ５７タンパク質である。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、サイトラブドウイルス（Ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ジコラウイルス（Ｄｉｃｈｏｒｈａｖｉｒｕｓ）、エフェメロウイルス、リッサウイルス、ノビラブドウイルス、ヌクレオラブドウイルス（Ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ペラブドウイルス（Ｐｅｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、シグマウイルス、スピビウイルス（Ｓｐｒｉｖｉｖｉｒｕｓ）、チブロウイルス（Ｔｉｂｒｏｖｉｒｕｓ）、ツパウイルス（Ｔｕｐａｖｉｒｕｓ）、バリコサウイルス（Ｖａｒｉｃｏｓａｖｉｒｕｓ）またはベシクロウイルス由来のＭタンパク質である。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、表１に収載されているタンパク質またはその機能的バリアントから選択される。エンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、表１に収載されているアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列をコードすることができる。エンハンサータンパク質のアミノ酸配列は、表１に収載されているアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であり得る。エンハンサータンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であり得る。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、表１に収載されているアミノ酸配列のうち１種を含む、これからなるまたはこれから本質的になるアミノ酸配列を有することができる。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１のアミノ酸配列を含む、これからなるまたはこれから本質的になるアミノ酸配列を有することができる。
Figure 2022548644000002
Figure 2022548644000003
Figure 2022548644000004
融合タンパク質
一部の実施形態では、標的タンパク質およびエンハンサータンパク質は、単一の融合タンパク質に含まれる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、連結エレメントを含むことができる。一部の実施形態では、連結エレメントは、酵素による切断のための切断部位を含むことができる。他の実施形態では、融合タンパク質または連結エレメントは、切断部位を含まず、発現された融合タンパク質は、標的タンパク質およびエンハンサータンパク質の両方を含む。
タンパク質修飾
標的タンパク質、エンハンサータンパク質および／もしくは融合タンパク質、またはこのようなものをコードするポリヌクレオチドは、１種または複数種のマーカー、標識またはタグを含むように修飾されてよい。例えば、一部の実施形態では、本開示のタンパク質は、その検出を可能にするであろういずれかの標識、例えば、放射標識、蛍光剤、ビオチン、ペプチドタグ、酵素断片その他で標識されてよい。タンパク質は、親和性タグ、例えば、Ｈｉｓ－タグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴ－タグ、Ｓｔｒｅｐ－タグ、ビオチン－タグ、免疫グロブリン結合ドメイン、例えば、ＩｇＧ結合ドメイン、カルモジュリン結合ペプチドその他を含むことができる。一部の実施形態では、ＦＬＡＧタグは、アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２１）を含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、選択可能マーカー、例えば、抗生物質抵抗性マーカーを含む。
ポリメラーゼ
標的タンパク質（複数可）およびエンハンサータンパク質（複数可）をコードするポリヌクレオチドの転写のため、内因性または外因性ポリメラーゼを使用することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（複数可）の転写は、細胞（例えば、真核細胞）によって含まれる天然のポリメラーゼによって行われる。ウイルスポリメラーゼをその代わりにまたはその上使用することができる。一部の実施形態では、ウイルスプロモーターが、１種または複数種のウイルスポリメラーゼと組み合わせて使用される。一部の実施形態では、真核生物プロモーターが、１種または複数種の真核生物ポリメラーゼと組み合わせて使用される。例示的ウイルスポリメラーゼは、Ｔ７、Ｔ５、ＥＭＣＶ、ＨＩＶ、インフルエンザ、ＳＰ６、ＣＭＶ、Ｔ３、Ｔ１、ＳＰ０１、ＳＰ２、Ｐｈｉ１５その他を含むがこれらに限定されない。ウイルスポリメラーゼは、ＲＮＡプライミングまたはキャッピングポリメラーゼである。一部の実施形態では、ＩＲＥＳエレメントが、ウイルスポリメラーゼと併せて使用される。
本開示に係るベクター（単数または複数）は、ポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ウイルスポリメラーゼである。ポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、標的タンパク質コードポリヌクレオチドおよび／またはエンハンサータンパク質コードポリヌクレオチドを含むベクターによって含まれてよい。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、標的タンパク質またはエンハンサータンパク質コードポリヌクレオチドを含まないベクターによって含まれてよい。
一部の実施形態では、本明細書に開示されているシステム、方法または細胞によって含まれる１種または複数種のベクターのうち少なくとも１種は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。
ベクター
一部の態様では、本開示は、１種または複数種の標的タンパク質および１種または複数種のエンハンサータンパク質の発現のための核酸配列を含むベクターに関する。一部の実施形態では、ベクター（複数または単数）は、標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを有する。一部の実施形態では、ベクター（複数または単数）は、本明細書に開示されている発現カセットのうちいずれか１種、例えば、５’逆位末端配列（ＩＴＲ）、１種もしくは複数の標的タンパク質および１種もしくは複数のエンハンサータンパク質の発現のための本明細書に開示されている核酸配列のうちいずれか１種、ならびに３’ＩＴＲ、ならびに／またはＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットを含む。
本開示に係る使用のためのベクターは、当技術分野で公知のいずれかのベクターを含むことができる。ある特定の実施形態では、ベクターは、目的のタンパク質もしくはポリペプチドまたはその断片の発現が可能ないずれかの組換えベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、複製コンピテントアデノウイルスベクター、複製欠損アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたは非ウイルスプラスミドである。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体である。一部の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターを含むウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、プラスミド、バクテリオファージＰ１由来ベクター（ＰＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）または哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）である。
本明細書に開示されている細胞、システムおよび方法は、１種のベクターを含むことができる。一部の実施形態では、細胞、システムおよび方法は、標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを含む単一のベクターを含むことができる。
本明細書に開示されている細胞、システムおよび方法は、２種のベクターを含むことができる。一部の実施形態では、細胞、システムおよび方法は、第１のプロモーターに作動可能に連結された第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、第２のプロモーターに作動可能に連結された第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含むことができる。
本明細書に開示されている細胞、システムおよび方法は、３種以上のベクターを含むことができ、ベクターは、標的タンパク質（複数可）およびエンハンサータンパク質（複数可）を種々の組合せまたは構成でコードすることができる。
一部の実施形態では、本開示のベクター（単数または複数）を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドを含む細胞が提供される。一部の実施形態では、本開示の標的タンパク質（複数可）およびエンハンサータンパク質（複数可）を発現する細胞が提供される。
プロモーター
本開示に係るベクターは、１種または複数種のプロモーターを含むことができる。用語「プロモーター」は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与する、転写開始部の上流または下流に配置された領域または配列を指す。本開示に係るポリヌクレオチド（複数可）またはベクター（複数可）は、１種または複数種のプロモーターを含むことができる。プロモーターは、当技術分野で公知のいずれかのプロモーターであり得る。プロモーターは、フォワードプロモーターまたはリバースプロモーターであり得る。一部の実施形態では、プロモーターは、哺乳動物プロモーターである。一部の実施形態では、１種または複数種のプロモーターは、ネイティブプロモーターである。一部の実施形態では、１種または複数種のプロモーターは、非ネイティブプロモーターである。一部の実施形態では、１種または複数種のプロモーターは、非哺乳動物プロモーターである。開示されている組成物および方法における使用のためのＲＮＡプロモーターの非限定的な例は、Ｕ１、ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１アルファ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトユビキチン、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、Ｕ６、Ｈ１、ｔＲＮＡＬｙｓ、ｔＲＮＡＳｅｒおよびｔＲＮＡＡｒｇ、ＣＡＧ、ＰＧＫ、ＴＲＥ、ＵＡＳ、ＵｂＣ、ＳＶ４０、Ｔ７、Ｓｐ６、ｌａｃ、ａｒａＢａｄ、ｔｒｐならびにＰｔａｃプロモーターを含む。
用語「作動可能に連結された」は、本明細書で使用される場合、物理的な配置ではなく、作動可能な能力によって連結された、核酸配列中のエレメントまたは構造を指す。エレメントまたは構造は、所望の操作の達成が可能である、またはこれによって特徴付けられる。当業者によって、核酸配列中のエレメントまたは構造が、作動可能に連結されるために、タンデムなまたは隣接した順序である必要はないことが認識される。
一部の実施形態では、プロモーターは、構成的に１種もしくは複数の標的タンパク質および／または１種もしくは複数のエンハンサータンパク質の発現を駆動する；すなわち、プロモーターは、構成的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、限定されるものではなく、当技術分野で公知のいずれかの誘導性プロモーターであり得る。一部の実施形態では、誘導性プロモーターの発現は、１種または複数種の環境または化学的刺激の存在によって促進される。例えば、一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、テトラサイクリンおよびその誘導体（ドキシサイクリン等）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）およびその誘導体等の化学分子；または熱もしくは光等の環境刺激の存在下で発現を駆動する。
一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、テトラサイクリン制御転写活性化システム、クメートリプレッサーシステム、ｌａｃリプレッサーシステム、アラビノース調節ｐＢａｄプロモーターシステム、アルコール調節ＡｌｃＡプロモーターシステム、ステロイド調節ＬｅｘＡプロモーターシステム、熱ショック誘導性Ｈｓｐ７０もしくはＨｓｐ９０プロモーターシステム、または青色光誘導性ｐＲプロモーターシステムに基づく。よって、一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、テトラサイクリン応答エレメント等、テトラサイクリントランス活性化因子に結合する核酸配列を含む。一部の実施形態では、誘導性プロモーターの発現は、テトラサイクリンおよびその誘導体の存在下でオンになり（Ｔｅｔ－Ｏｎシステム）、一方、他の実施形態では、誘導性プロモーターの発現は、テトラサイクリンおよびその誘導体の存在下でオフになる（Ｔｅｔ－Ｏｆｆシステム）。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、クメートリプレッサーシステムに基づく。よって、一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、クメートオペレーター配列等、ＣｙｍＲリプレッサーに結合する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、誘導性プロモーターの発現は、転写因子の二量体化によって駆動される。一部の実施形態では、転写因子は、青色光の存在下で二量体化して、Ｃ１２０プロモーターまたはその調節エレメントからの発現を駆動する、細菌ＥＬ２２２である。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、Ｃ１２０プロモーターまたは調節エレメントに由来する核酸配列を含む。
本開示に係るベクターは、１種または複数種のウイルスポリメラーゼによる１種または複数種のポリヌクレオチドの転写を可能にする、１種または複数種のウイルスプロモーターを含むことができる。一部の実施形態では、例えば、ベクターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる第１のポリヌクレオチド（すなわち、標的タンパク質コードポリヌクレオチド）または第２のポリヌクレオチド（すなわち、エンハンサータンパク質コードポリヌクレオチド）のいずれか一方または両方の転写のために構成されたＴ７プロモーターを含むことができる。
発現カセット
本開示に係るベクター（単数または複数）は、１種または複数種の発現カセットを含むことができる。語句「発現カセット」は、本明細書で使用される場合、当該核酸分子によってコードされる別の核酸またはタンパク質の産生に必要とされる最小エレメントを含む核酸分子の定義されたセグメントを指す。一部の実施形態では、ベクターは、発現カセットを含むことができ、発現カセットは、標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを含む。一部の実施形態では、発現カセットは、第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと、第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターとを含む。一部の実施形態では、発現カセットは、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結された共有されたプロモーターを含む。
一部の実施形態では、発現カセットは、分離エレメント（例えば、リボソームスキッピング部位または２Ａエレメント）をコードするポリヌクレオチドによって連結された、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含むコードポリヌクレオチドを含み、コードポリヌクレオチドは、共有されたプロモーターに作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、発現カセットは、コードポリヌクレオチドを含み、コードポリヌクレオチドは、分離エレメント（例えば、リボソームスキッピング部位または２Ａエレメント）によって連結されたエンハンサータンパク質および標的タンパク質をコードし、コードポリヌクレオチドは、共有されたプロモーターに作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、発現カセットは、分離エレメント（例えば、リボソームスキッピング部位または２Ａエレメント）によって連結された、標的タンパク質およびエンハンサータンパク質の両方をコードする単一のメッセンジャーＲＮＡの転写のために構成されており、メッセンジャーＲＮＡの翻訳は、別個のポリペプチドとしての標的タンパク質およびエンハンサータンパク質（例えば、Ｌタンパク質）の発現をもたらす。
一部の実施形態では、発現カセットは、コードポリヌクレオチドを含み、コードポリヌクレオチドは、ポリペプチドリンカーありまたはなしで、融合タンパク質としてのエンハンサータンパク質および標的タンパク質をコードし、必要に応じて、ポリペプチドリンカーは、切断可能リンカーである。
一部の実施形態では、発現カセットは、５’逆位末端配列（ＩＴＲ）、１種または複数種の標的タンパク質および１種または複数種のエンハンサータンパク質の発現のための本明細書に開示されている核酸配列のうちいずれか１種、ならびに３’ＩＴＲを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットである。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、コザック配列、ポリアデニル化配列および／またはスタッファー配列を含む。
分離エレメント
一部の実施形態では、本開示に係る標的タンパク質（複数可）およびエンハンサータンパク質（複数可）は、同じベクターにコードされる、または別々のベクターにコードされる。一部の実施形態では、１種または複数種の標的タンパク質および１種または複数種のエンハンサータンパク質のための核酸配列が、同じベクターによって含まれる場合、ベクターは、タンパク質の別々の発現のための分離エレメントを含むことができる。様々な実施形態では、ベクターは、バイシストロニックベクターまたはポリシストロニックベクターである。分離エレメントは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａエレメントであり得る。一部の実施形態では、ベクターは、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含むことができる。例示的２Ａ自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２ＡおよびＴ２Ａを含む。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドもしくは第２のポリヌクレオチドまたはその両方は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結される。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドもしくは第２のポリヌクレオチドまたはその両方は、２Ａエレメントに作動可能に連結される。
組換えＡＡＶ粒子
本開示は、本明細書に開示されている発現カセットのうちいずれか１種を含む組換えウイルスベクターを提供する。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、複製コンピテントアデノウイルスベクター、複製欠損アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはバキュロウイルスベクターである。
本開示は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを産生するための方法であって、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プロデューサー細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）を、本明細書に開示されているＡＡＶ発現カセットのうちいずれか１種、または本明細書に開示されているＡＡＶ発現カセットのうちいずれか１種を含むベクター（例えば、プラスミドまたはバクミド）と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書に開示されているベクター（例えば、プラスミドまたはバクミド）は、例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む、ＡＡＶの産生において使用される１種または複数種の遺伝的エレメントをさらに含む、ならびに／またはヘルパーウイルスタンパク質配列をコードする。
一部の実施形態では、本方法は、ＡＡＶプロデューサー細胞を、例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む、ならびに／またはヘルパーウイルスタンパク質配列をコードする、１種または複数種の追加的なプラスミドと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、ＡＡＶが産生されるような条件下で、ＡＡＶプロデューサー細胞を維持するステップをさらに含む。
本開示は、本明細書に開示されている方法のうちいずれか１種を使用して産生されたｒＡＡＶベクターを提供する。産生されたｒＡＡＶベクターは、いずれかの血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶまたはウシＡＡＶのものであり得る。一部の実施形態では、産生された組換えＡＡＶベクターは、ネイティブＡＡＶカプシドと比較して、１つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、置換および／または欠失）を含むことができる。一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である。一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。
本開示は、本明細書に開示されている発現カセットのうちいずれか１種、ベクターのうちいずれか１種（組換えＡＡＶベクターのうちいずれか１種等）またはＡＡＶプロデューサー細胞のうちいずれか１種を含む、医薬組成物等の組成物をさらに提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、１種または複数種の薬学的に許容される担体を含む。
本開示は、本明細書に開示されている発現カセットのうちいずれか１種、ベクターのうちいずれか１種（組換えＡＡＶベクターのうちいずれか１種等）またはＡＡＶプロデューサー細胞のうちいずれか１種を含む、ワクチン組成物をさらに提供し、標的タンパク質は、対象における発現後に、対象における病原体に対する免疫応答を誘発することができる、または他の治療的な性質のものである、タンパク質である。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、病原体に由来する。病原体は、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物であり得る。一部の実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、チクングニアウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、インフルエンザウイルス（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エボラウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎およびＥ型肝炎）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ－２）およびヒトパピローマウイルスからなる群から選択される。一部の実施形態では、病原性寄生生物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａである。一部の実施形態では、病原性細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａおよびＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａからなる群から選択される。一部の実施形態では、ワクチン組成物は、１種または複数種のアジュバントを含む。
トランスフェクション、形質導入、形質転換
用語「トランスフェクション」、「形質導入」および「形質転換」は、核酸を細胞（例えば、真核細胞）に導入するプロセスを指す。本明細書に記載されているポリヌクレオチドまたはベクターは、当技術分野で公知のいずれかの方法を使用して、細胞（例えば、真核細胞）に導入することができる。ポリヌクレオチドまたはベクターは、当技術分野で周知であり、一部には、特定の宿主細胞に基づき選択される、種々の方法によって細胞に導入することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、化学的、物理学的、生物学的またはウイルス的手段を使用して、細胞に導入することができる。細胞にポリヌクレオチドまたはベクターを導入する方法は、リン酸カルシウム、デンドリマー、カチオン性ポリマー、リポフェクション、ヒュージーン（ｆｕｇｅｎｅ）、ペプチドデンドリマー、電気穿孔、細胞圧搾（ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インパレフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、水力学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、微粒子銃、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）およびウイルス形質導入の使用を含むがこれらに限定されない。
標的タンパク質およびエンハンサータンパク質をコードする標的化ＤＮＡおよび／または核酸を含むベクターは、種々の方法（例えば、注射、形質転換、トランスフェクション、直接的取込み、微粒子銃発射、リポソーム）によって細胞に導入することができる。標的タンパク質およびエンハンサータンパク質は、発現ベクターを使用して、細胞において安定にまたは一過性に発現させることができる。真核細胞における発現技法は、当業者にとって周知である（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ｃｈａｐｔｅｒ １２ ”Ｖｅｃｔｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ” ＆ Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ”Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”を参照）。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、必要に応じて、レンチウイルストランスフェクション、哺乳動物細胞へのバキュロウイルス遺伝子移入（ＢａｃＭａｍ）、レトロウイルストランスフェクション、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９および／またはトランスポゾンの使用により、安定した細胞株を産生するための標準方法を使用して、ゲノムへの挿入によって宿主細胞に導入することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、一過性トランスフェクションのために宿主細胞に導入することができる。一部の実施形態では、一過性トランスフェクションは、ウイルスベクター、ヘルパー脂質、例えば、ＰＥＩ、リポフェクタミンおよび／またはフェクタミン（Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２９３の使用によりもたらすことができる。遺伝的エレメントは、例えばベクターにおけるＤＮＡとして、または例えばＰＣＲ由来のＲＮＡとしてコードされ得る。遺伝的エレメントは、異なるベクターにおいて分離させても、または同じベクターにおいて組み合わせてもよい。
細胞、細胞株、宿主細胞
本開示の別の態様は、１種または複数種の標的タンパク質および１種または複数種のエンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む細胞に関する。ポリヌクレオチド、ベクター、標的タンパク質およびエンハンサータンパク質は、本明細書に記載されているもののうちいずれかであり得る。本開示は、１種または複数種のエンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む細胞または細胞株をさらに提供する；これらの細胞または細胞株は、「スーパープロデューサー細胞」または「スーパープロデューサー細胞株」と本明細書で称し得る。一部の実施形態では、スーパープロデューサー細胞は、１種または複数種の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび／またはベクターをさらに含む。いずれか１つの理論に制約されることなく、本明細書に開示されている１種または複数種のエンハンサータンパク質を発現する細胞は、１種または複数種の標的タンパク質の発現のための宿主細胞として機能することができると考えられる。
一部の実施形態では、細胞は、いずれかの真核細胞または細胞株である。開示されているポリヌクレオチド、ベクター、システムおよび方法は、いずれかの真核細胞株において使用することができる。真核細胞株は、ヒトおよび動物細胞株等、哺乳動物細胞株を含むことができる。真核細胞株は、昆虫、植物または真菌細胞株を含むこともできる。かかる細胞またはかかる細胞から生成される細胞株の非限定的な例は、Ｂｃ ＨＲＯＣ２７７、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳＯ、５Ｐ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ、例えば、Ｓｆ９）等の昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ等の真菌細胞を含む。
一部の実施形態では、標的タンパク質（複数可）およびエンハンサータンパク質（複数可）を発現するための細胞または細胞株は、ヒト細胞または細胞株である。ある特定の態様では、ヒト細胞株の選択は、例えば、標的タンパク質におけるグリコシル化、リン酸化、ジスルフィド結合等の翻訳後修飾（「ＰＴＭ」）に有益である。一部の実施形態では、ヒト細胞または細胞株は、ヒト標的タンパク質の発現に使用される。
一部の実施形態では、細胞株は、安定した細胞株である。一部の実施形態では、細胞は、本明細書に開示されているポリヌクレオチドおよび／またはベクターのうちいずれか１種または複数種を一過性にトランスフェクトされる。
一部の実施形態では、本開示は、標的タンパク質の発現のための真核細胞を提供し、細胞は、エンハンサータンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドは、一過性に形質導入される、および／または細胞のゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドは、安定に組み込まれる。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択される。外因性ポリヌクレオチドは、プロモーター（必要に応じて、ネイティブプロモーターまたは外因性プロモーター）に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結される。
タンパク質発現の方法
本開示は、真核細胞において標的タンパク質を発現させるための方法を提供する。本方法は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド）を真核細胞に導入するステップを含むことができる。本方法は、エンハンサータンパク質の同時発現を利用して、標的タンパク質の発現レベル、溶解度および／または活性を増強する。
一部の実施形態では、本開示の方法に従って１種または複数種のエンハンサーと組み合わせて発現された標的タンパク質の発現レベルは、１種または複数種のエンハンサーの非存在下で発現された標的タンパク質の発現レベルよりも高い。一部の実施形態では、本開示の方法に従って１種または複数種のエンハンサーと組み合わせて発現された標的タンパク質の発現レベルは、１種または複数種のエンハンサーの非存在下で発現された標的タンパク質の発現レベルと比較して、少なくとも約１．１倍（例えば、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍または約１０倍）高い。
一部の実施形態では、本開示の方法に従って１種または複数種のエンハンサーと組み合わせて発現された標的タンパク質の活性は、１種または複数種のエンハンサーの非存在下で発現された標的タンパク質の活性よりも高い。一部の実施形態では、本開示の方法に従って１種または複数種のエンハンサーと組み合わせて発現された標的タンパク質の活性は、１種または複数種のエンハンサーの非存在下で発現された標的タンパク質の活性と比較して、少なくとも約１．１倍（例えば、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍または約１０倍）高い。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択される。
一部の態様では、本開示は、１種または複数種の標的タンパク質および１種または複数種のエンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞の使用により標的タンパク質を産生する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、１種または複数種のベクターを含む真核細胞において実行される。一部の実施形態では、本方法は、前述のセクションに記載されているポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞を使用して実行される。一部の実施形態では、ベクター（複数または単数）は、標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを有することができる。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている。
標的タンパク質の組換え発現のための方法であって、プロモーターに作動可能に連結された、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、真核細胞に導入するステップを含む方法がさらに提供される。一部の実施形態では、標的タンパク質発現の方法は、本開示のベクターシステムを真核細胞に導入するステップを含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、膜タンパク質である。一部の実施形態では、細胞膜への膜タンパク質の局在化は、膜タンパク質がエンハンサータンパク質なしで発現された場合に観察される局在化と比較して増加される。一部の実施形態では、本開示の方法に従って１種または複数種のエンハンサーと組み合わせて発現された膜会合性膜タンパク質のレベルは、１種または複数種のエンハンサーの非存在下で発現された膜会合性膜タンパク質のレベルと比較して、少なくとも約１．１倍（例えば、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍または約１０倍）高い。
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法を使用した、本明細書に開示されている１種または複数種のエンハンサータンパク質の発現は、１種または複数種のエンハンサータンパク質を発現しない野生型細胞と比較して、特異的な細胞周期ステージにあるエンハンサー発現宿主細胞の数が変更されるような、宿主細胞の細胞周期における効果に関連する、これと相関する、またはこれをもたらすことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法を使用した、本明細書に開示されている１種または複数種のエンハンサータンパク質の発現は、細胞周期の特異的なステージでの宿主細胞の停止に関連する、これと相関する、またはこれをもたらすことができる。一部の実施形態では、特異的な細胞ステージは、Ｇ１、ＳまたはＧ２期等、細胞周期の増殖期である。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法を使用した、本明細書に開示されている１種または複数種のエンハンサータンパク質の発現は、細胞におけるクローナルドリフトの低下または排除に関連する、これと相関する、またはこれをもたらすことができる。
一部の実施形態では、本方法は、真核細胞に、プロモーターに作動可能に連結されたエンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入するステップを含むことができる。一部の実施形態では、本方法は、１種もしくは複数のＤＮＡ分子による真核細胞のトランスフェクション、単一のウイルスベクターによる真核細胞の形質導入、および／または２種もしくはそれよりも多いウイルスベクターによる真核細胞の形質導入を含むことができる。
下流適用
一部の実施形態では、本組成物、システムおよび方法の使用により産生された標的タンパク質およびかかるタンパク質を発現する細胞は、下流適用のために単離、精製および／または使用される。例示的適用は、小分子スクリーニング、構造決定（例えば、Ｘ線結晶学、クライオ電子顕微鏡その他）、活性アッセイ、治療薬、酵素補充療法、スクリーニングアッセイ、診断アッセイ、臨床検査キット、薬物発見、抗体発見その他を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本組成物および方法は、抗体スクリーニングアッセイのための、抗体の産生または抗原の産生に使用される。一部の実施形態では、標的タンパク質を発現する細胞は、例えば、全細胞システムにおいて細胞相互作用、抗体結合または小分子影響をスクリーニングするためのアッセイシステムとして使用することができる。
一部の実施形態では、本開示は、抗体発見のためのシステムおよび方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、標的タンパク質に対する抗体を生成するための方法であって、本開示のシステムまたは方法を使用して産生された細胞または標的タンパク質で対象を免疫化するステップを含む方法を提供する。様々な実施形態では、免疫化される対象は、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、ラマ、ラクダまたはヒトである。対象から単離された細胞は、単離された細胞として、または必要に応じて単離された細胞からハイブリドーマを生成した後に、選択のさらなるラウンドに付すことができる。遺伝子クローニングおよび／または配列決定を使用して、単離された細胞またはハイブリドーマから重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列（複数可）を単離することができる。遺伝子クローニングおよび／または配列決定は、単一の細胞または細胞の集団に適用することができる。一部の実施形態では、本開示の組成物および方法は、対象の免疫化と、続く対象からの血清の収集によるポリクローナル抗体の生成に使用される。
本開示は、細胞選別による抗体発見のための方法であって、本開示のシステムまたは方法を使用して産生された標識された細胞または標的タンパク質、および組換え細胞の集団を含む溶液を用意するステップであって、組換え細胞が、抗体またはその抗原結合性断片をそれぞれ含むポリペプチドのライブラリーを発現する、ステップと、標識された細胞または標識された標的タンパク質に結合された組換え細胞を検出することにより、溶液から１つまたは複数の組換え細胞を選別するステップとを含む方法をさらに提供する。他の変形形態では、細胞選別は、免疫化された対象に由来する細胞において行われる。対象は、本開示の方法に従って産生された細胞または標的タンパク質で、または別の適した免疫原を使用して、免疫化することができる。一部の実施形態では、組換え細胞は、ナイーブ抗体ライブラリー、必要に応じて、ヒトナイーブ抗体ライブラリーを含む。様々な抗体ライブラリー生成方法が、当技術分野で公知であり、本開示の方法と組み合わせることができる。本明細書で使用される場合、用語「選別」または「細胞選別」は、蛍光活性化細胞選別、磁気支援細胞選別、ならびに標識された細胞および標識されていない細胞の集団において標識された細胞を選択にする他の手段を指す。
本開示は、ファージディスプレイライブラリーをパニングするための方法であって、ファージディスプレイライブラリーを、本開示のシステムまたは方法を使用して産生された細胞または標的タンパク質と混合するステップと、細胞または標的タンパク質に結合するファージディスプレイライブラリーのメンバーを精製および／または富化するステップとを含む方法をさらに提供する。一部の実施形態では、ファージディスプレイライブラリーは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）または他の型の抗体／抗体断片（Ｆａｂ等）の集団を発現する。
さらなる実施形態では、本開示は、いずれかの型のタンパク質結合剤についてスクリーニングするための方法を提供する。本開示の細胞および標的タンパク質を使用して、薬物および巨大分子（タンパク質、核酸およびタンパク質：核酸複合体）を含む様々な型の分子のライブラリーをスクリーニングして、標的タンパク質の結合パートナーを同定することができる。他の実施形態では、本開示のシステムおよび方法は、単一のウェル、いくつかの配列のプールまたは遺伝子配列のライブラリーにおける標的タンパク質のライブラリーの発現に使用される。
高収量でのおよび／または細胞の表面に存在する、そのネイティブなまたは疾患に関連した形態で抗原を発現する能力は、抗体、抗体断片および他の分子の、先行技術方法よりも信頼のおける発見および／または生成を可能にする。かかる抗体、抗体断片および他の分子は、治療薬および／もしくは研究ツールとして、または他の適用に有用であり得る。
一部の実施形態では、本開示のシステムおよび方法は、標的分子（例えば、糖タンパク質）における特定のグリコシル化パターンに結合するおよび／またはこれに特異的である抗体の発見における使用に適している。一部の実施形態では、抗体ライブラリーは、ネイティブにグリコシル化されたタンパク質に対して選別され、不適切にグリコシル化されたまたは脱グリコシル化された同族タンパク質に対して対抗（ｃｏｕｎｔｅｒ）選別される。同様に記述すると、脱グリコシル化酵素を使用することにより、抗体は、グリコシル化パターンに対して特異的に選別され得る。さらなる実施形態では、本開示の細胞および／または標的タンパク質は、新規抗体または他の巨大分子の結合および／または機能活性の確認に使用される。
一部の実施形態では、本開示のシステムおよび方法は、本明細書に開示されているまたは当技術分野で公知のいずれかの宿主細胞におけるいずれかの標的タンパク質の生合成における使用に適している。例えば、本開示のシステムおよび方法は、哺乳動物細胞における、または細菌、酵母および他の微生物における発酵を使用した、いずれかの標的タンパク質の生合成における使用に適している。一部の実施形態では、本開示のシステムおよび方法は、宿主細胞への特異的代謝経路の導入による、非タンパク質分子の生合成における使用に適している。例えば、非タンパク質分子は、オピオイド分子または別の代謝物である。
例示的利点
本組成物、システムおよび方法は、多数の利点を有することができる。例えば、実施例１１において実証される通り、ヒト細胞株において過剰発現されるとアポトーシスを通常もたらし、したがって検出不能な収量を産生する、ヒトＮＡＤａｓｅは、エンハンサータンパク質がこの標的タンパク質と共に同時発現されると、確実に発現されて、２０ｍｇ／Ｌを超える収量を産生することができる。その上、この例示的方法により発現されたＮＡＤａｓｅは、機能的であり（リン酸放出アッセイによって実証される通り）、低いバッチ間変形形態を示す。
同様に、一部の実施形態では、本方法、システムおよび細胞は、発現することが困難なタンパク質の信頼のおける発現に使用される。一部の実施形態では、本開示は、低いバッチ間変形形態を有するタンパク質の産生に関する。本開示に従って産生されたタンパク質は、次の改善のうち１種または複数種を示すことができる：精製タグ融合体を用いない精製；改善された機能活性；信頼のおける産生；一貫した活性；および治療適用に対する適合性。
本開示の細胞は、標的タンパク質発現の観点から次の利点のうち１種または複数種を有することができる：膜におけるより高い濃度の標的膜タンパク質；より遅い／減少された標的タンパク質分解；溶解物における改善されたシグナル対ノイズ比；下流細胞代謝に影響を与えることのない標的タンパク質および／またはエンハンサータンパク質発現；膜結合膜タンパク質の脱感作に対する増加された安定性；ならびにより高い標的タンパク質収量。実施例１は、細胞の下流代謝に影響を与えることのないエンハンサータンパク質の発現の例示的な例を提供する。実施例１において例証されているＧＰＣＲは、その天然の基質と相互作用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定され得る活性化を産生することができた。
本システムおよび方法は、一部の実施形態では、次の利点のうち１種または複数種を有することができる：いずれかの真核細胞型に対する適合性；標的タンパク質発現最適化に対する減少された必要；および発現することが困難なタンパク質の信頼のおける発現。
システム
本開示の一態様は、１種または複数種のベクターを含む真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムを提供する。ベクター（複数または単数）は、標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを有することができる。エンハンサータンパク質は、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤であり得る。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択することができる。第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結され得る。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である。一部の実施形態では、ＮＣＴ阻害剤は、ウイルスタンパク質である。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択されるＮＣＴ阻害剤である。
ＮＣＴ阻害剤は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質またはその機能的バリアントであり得る。一部の実施形態では、ＮＣＴ阻害剤は、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼまたはその機能的バリアントであり得る。一部の実施形態では、ＮＣＴ阻害剤は、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼまたはその機能的バリアントであり得る。一部の実施形態では、ＮＣＴ阻害剤は、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質またはその機能的バリアントであり得る。一部の実施形態では、ＮＣＴ阻害剤は、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質またはその機能的バリアントであり得る。一部の実施形態では、ＮＣＴ阻害剤は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質またはその機能的バリアントであり得る。一部の実施形態では、ＮＣＴ阻害剤は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、ＮＣＴ阻害剤は、ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質またはその機能的バリアントである。
一部の実施形態では、エンハンサータンパク質は、タイラーウイルスのＬタンパク質またはその機能的バリアントであるＬタンパク質である。一部の実施形態では、Ｌタンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を共有することができる。
一部の実施形態では、Ｌタンパク質は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＬタンパク質またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、Ｌタンパク質は、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を共有することができる。
一部の実施形態では、Ｌタンパク質は、ポリオウイルスのＬタンパク質、ＨＲＶ１６のＬタンパク質、メンゴウイルスのＬタンパク質およびサフォルドウイルス２のＬタンパク質、またはそれらの機能的バリアントからなる群から選択される。
本システムは、発現カセットを含む単一のベクターを含むことができ、発現カセットは、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、発現カセットは、第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと、第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターとを含む。一部の実施形態では、発現カセットは、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結された共有されたプロモーターを含む。
一部の実施形態では、発現カセットは、リボソームスキッピング部位をコードするポリヌクレオチドによって連結された、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含むコードポリヌクレオチドを含み、コードポリヌクレオチドは、共有されたプロモーターに作動可能に連結される。
一部の実施形態では、発現カセットは、コードポリヌクレオチドを含み、エンハンサータンパク質および標的タンパク質をコードするコードポリヌクレオチドは、リボソームスキッピング部位によって連結され、コードポリヌクレオチドは、共有されたプロモーターに作動可能に連結される。
一部の実施形態では、発現カセットは、リボソームスキッピング部位によって連結された、標的タンパク質およびエンハンサータンパク質の両方をコードする単一のメッセンジャーＲＮＡの転写のために構成されており；メッセンジャーＲＮＡの翻訳は、別個のポリペプチドとしての標的タンパク質およびエンハンサータンパク質（例えば、Ｌタンパク質）の発現をもたらす。
本システムは、１種のベクターを含むことができる。一部の実施形態では、本システムは、標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを含む単一のベクターを含むことができる。
本システムは、２種のベクターを含むことができる。一部の実施形態では、本システムは、第１のプロモーターに作動可能に連結された第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、第２のプロモーターに作動可能に連結された第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含むことができる。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドもしくは第２のポリヌクレオチドまたはその両方は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結される。
一部の実施形態では、本システムによって含まれる１種または複数種のベクターのうち少なくとも１種は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドのいずれか一方または両方の転写のために構成されたＴ７プロモーターを含むことができる。
一部の実施形態では、本システムによって含まれる１種または複数種のベクターのうち少なくとも１種は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。
本明細書で引用されているあらゆる論文、刊行物および特許は、あたかも個々の論文、刊行物または特許のそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれていると特にかつ個々に指し示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれており、刊行物が引用されているものに関連して方法および／または材料を開示および記載するように、参照により本明細書に組み込まれる。しかし、本明細書に引用されているいずれかの参考文献、記事、刊行物、特許、特許公開および特許出願の言及は、有効な先行技術を構成すること、または世界のいずれかの国における共通の一般知識の一部を形成することの承認またはいずれかの形態の示唆ではなく、そうであると受け取るべきではない。
文脈がそれ以外のことを指し示さない限り、本明細書に記載されている様々な特色をいずれかの組合せで使用することができることが特に意図される。
他に規定がなければ、本明細書で使用されているあらゆる技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。
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 材料と方法
ＤＮＡ分子の構築
全てのアセンブリを、高コピー数複製起点を制御するプロモーター（ＣｏｌＥ１）と、それに続くターミネーター（ｒｒｎＢ Ｔ１およびＴ２ターミネーター）を含む、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて増やすことができるプラスミド骨格へと作製した。これに続いて、第２のターミネーター（ファージラムダ由来の転写ターミネーター）によってベクターの残りから隔離された、抗生物質抵抗性遺伝子を制御するプロモーターがある。骨格のエレメントを含む遺伝子をホスホラミダイト化学によって合成した。
プラスミドの構築に使用される構造遺伝子をホスホラミダイト化学によって合成し、増幅し、表２に収載されているプライマーを使用したＮＥＢ ＨＩ－ＦＩまたはギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）アセンブリ等の等温アセンブリ反応を使用して、上に記載されているベクターへとクローニングした。これらの実施例において用いられる例示的構築物によって含まれる選択アミノ酸配列を表３に提示する。
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細胞系 － 培養およびトランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞を使用して、ヒト真核細胞における本システム、方法および組成物の適用を説明した。ＨＥＫ２９３接着細胞（ＣＬＳ）を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）および５０，０００Ｕ Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地高グルコース（Ｇｉｂｃｏ）において培養した。製造業者の使用説明書に従って２９３フェクチン（ｆｅｃｔｉｎ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して一過性にトランスフェクトする前に、ＨＥＫ２９３細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で８０％集密度となるまで成長させた。０．５％トリプシン溶液を５分間３７℃で使用して細胞を剥離し、擦過することにより、タンパク質発現細胞を４８時間後に収集した。細胞をペレットにし（５，０００×ｇ、１５分間、４℃）、上清を廃棄した。さらなる使用まで、細胞ペレットを－８０℃で貯蔵した。
懸濁ＨＥＫ２９３細胞を使用して、ヒト真核細胞における本システム、方法および組成物の適用を説明した。懸濁適応ＨＥＫ２９３細胞（ＣＬＳ）を、補充したＥｘｐｉ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ）において培養した。トランスフェクション１日前に、１．７５×１０６個の細胞／ｍｌで細胞を播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートし、その後、製造業者の使用説明書に従ってＥｘｐｉ２９３発現システムキット（Ｇｉｂｃｏ）を使用して一過性にトランスフェクトした。４８時間～９６時間後に遠心分離（５，０００×ｇ、１５分間、４℃）によってタンパク質発現細胞を収集した。可溶性または膜タンパク質の場合、上清を廃棄し、さらなる使用まで、細胞ペレットを－８０℃で貯蔵した。分泌タンパク質の場合、さらなる精製のために上清を直ちに使用した。
ＣＨＯ－Ｋ１細胞を使用して、真核動物細胞における本システム、方法および組成物の適用を説明する。ＣＨＯ－Ｋ１接着細胞（ＣＬＳ）を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２ ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Ｇｉｂｃｏ）において培養した。製造業者の使用説明書に従ってリポフェクタミンＬＴＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して一過性にトランスフェクトする前に、ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で８０％集密度となるまで成長させた。０．５％トリプシン溶液を５分間３７℃で使用して細胞を剥離し、擦過することにより、タンパク質発現細胞を４８時間後に収集した。細胞をペレットにし（５，０００×ｇ、１５分間、４℃）、上清を廃棄した。さらなる使用まで、細胞ペレットを－８０℃で貯蔵した。
ＳＦ９細胞を使用して、真核昆虫細胞における本システム、方法および組成物の適用を説明した。ＳＦ９懸濁細胞（ＣＬＳ）を、Ｓｆ９－９００ ＩＩＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）において培養した。製造業者の使用説明書に従ってＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ ＩＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した一過性トランスフェクションのために６ウェルプレートに播種する前に、ＳＦ９細胞を２６℃および１３０ｒｐｍで成長させた。剥離しペレットにする（５，０００×ｇ、１５分間、４℃）ことにより、タンパク質発現細胞を４８時間後に収集し、上清を廃棄した。さらなる使用まで、細胞ペレットを－８０℃で貯蔵した。
（実施例１）
ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ発現
ＣＭＶプロモーターシステム
発現の際のウイルス核膜孔遮断タンパク質の導入の影響を実証するために、ＨＥＫ２９３細胞に、ＥＧ１、ＥＧ２のいずれかをトランスフェクトした、またはＥＧ３およびＥＧ４構築物をコトランスフェクトした（構築物の詳細については表２および図２を参照）。ウイルス孔遮断タンパク質の発現は、タンパク質発現の制御された調節をもたらした。結果的に、得られたＧＦＰシグナルは減少した。孔遮断タンパク質と協調した目的の遺伝子の制御された調節の理由は、ウイルスタンパク質の作用機序である。理論に制約されることなく、タンパク質調節の可能な機構は、孔遮断タンパク質を発現することにより、ｍＲＮＡの核外搬出が阻害され得、その結果、標的タンパク質の翻訳が下方調節されることになることである。安定化の後に、孔遮断タンパク質が分解され、ｍＲＮＡ輸送が再開するであろう。これにより再び、標的タンパク質およびエンハンサータンパク質、例えば、孔遮断タンパク質の両方の発現が生じる。この厳格に制御されたフィードバックは、標的タンパク質の安定化および永続的な発現を確実にし、タンパク質発現の停止をもたらす真核細胞の通常の調節を防止する。
図３Ａ～図３Ｄは、本開示に係る例示的エンハンサータンパク質としてのＥＣＭＶ由来のＬタンパク質の非存在および存在下でのＧＦＰ発現における効果を示す。上に記載されている通りにＥＧ１またはＥＧ２のいずれかを一過性にトランスフェクトする前に、ＨＥＫ２９３細胞を、２４ウェルプレートにおいて０．０５×１０６個の細胞／ウェルで播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡を使用して２４時間および４８時間後にモニターした。画像は、ＣＣＤカメラ（Ａｍｓｃｏｐｅ）を使用して撮り、ＩＳＣａｐｔｕｒｅ（Ａｍｓｃｏｐｅ）で解析した。本実施例は、本開示に係る標的タンパク質ポリヌクレオチドおよびエンハンサータンパク質ポリヌクレオチドを含む例示的システムにおける標的タンパク質発現の改善された調節を実証する。
Ｔ７ポリメラーゼシステム
ＥＧ２は、真核生物宿主の天然ポリメラーゼを使用するが、Ｔ７等の他のウイルスポリメラーゼを使用して、核外で転写を開始することができる。ウイルスポリメラーゼは、標準真核生物プロモーターの制御下にあり、対応するｍＲＮＡは、核外搬出に依存するであろう。サイトゾルにおいて、ウイルスポリメラーゼが翻訳され、次いで、標的タンパク質ポリヌクレオチドおよびエンハンサータンパク質ポリヌクレオチドの転写を開始する。一部の実施形態では、エンハンサータンパク質の発現の結果として、ウイルスポリメラーゼの核輸送が減少するであろう。システムの安定化は、エンハンサータンパク質の分解を生じ、ウイルスポリメラーゼのｍＲＮＡ輸送が再開するであろう。理論に制約されることなく、このフィードバックは、組換えタンパク質を過剰発現しながら、細胞の通常の調節を防止することができる。一部の状況では、ウイルスポリメラーゼの使用は、真核生物ポリメラーゼを使用したシステムと比較して、細胞間基盤でのより高い発現レベルの利点をもたらす。
図４Ａ～図４Ｄは、Ｔ７を有するベクターと共にコトランスフェクトされた場合の、Ｔ７プロモーターからのＥＣＭＶ由来のＬタンパク質と協調したＧＦＰの成功した発現を示す。上に記載されている通りにＥＧ１またはＥＧ３およびＥＧ４のいずれかを一過性にトランスフェクトする前に、ＨＥＫ２９３細胞を、２４ウェルプレートにおいて０．０５×１０６個の細胞／ウェルで播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡を使用して２４時間および４８時間後にモニターした。画像は、ＣＣＤカメラ（Ａｍｓｃｏｐｅ）を使用して撮り、ＩＳＣａｐｔｕｒｅ（Ａｍｓｃｏｐｅ）で解析した。本実施例は、標的タンパク質としてのＧＦＰおよびエンハンサータンパク質としてのＥＣＭＶのＬタンパク質と協調した、例示的ウイルスポリメラーゼとしてのＴ７の成功した使用を実証する。上の例と同様に、Ｌタンパク質の導入は、発現のより厳格な調節、したがって、過剰発現の全体的な低下を生じた。
（実施例２）
ドーパミン受容体１（ＤＲＤ１）の産生
高密度の活性膜受容体を得るために、ＤＲＤ１を使用して、エンハンサータンパク質としての孔遮断タンパク質と組み合わせた標的タンパク質としての膜タンパク質の同時発現に対する開示されているシステムおよび方法の適用を説明した。ＤＲＤ１は、Ｇタンパク質共役受容体であり、アカデミック標準を使用しては、発現することが困難であることが公知である。細胞の外膜への正確な転位を可視化するために、本システムにおいてＤＲＤ１－ＧＦＰ融合体（ＥＧ８）を使用した。アカデミックおよび産業的設定におけるＧＰＣＲに伴う問題を説明するために、アカデミック標準（ＥＧ１０）を対照として使用した。
改善された膜タンパク質発現および膜局在化
ＤＲＤ１－ＧＦＰ融合体を、ＨＥＫ２９３細胞において発現させた。上に記載されている通りにＥＧ１０またはＥＧ８のいずれかを一過性にトランスフェクトする前に、ＨＥＫ２９３細胞を、２４ウェルプレートにおいて０．０５×１０６個の細胞／ウェルで播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＤＲＤ１－ＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡を使用して２４時間および４８時間後にモニターした。画像は、ＣＣＤカメラ（Ａｍｓｃｏｐｅ）を使用して撮り、ＩＳＣａｐｔｕｒｅ（Ａｍｓｃｏｐｅ）で解析した。
図５Ａ～図５Ｄは、ＥＧ１０が、発現された受容体を正確に転位させることができないことを実証する。理論に制約されることなく、ＥＧ１０構築物を有するヒト細胞におけるヒトＤＲＤ１受容体の過剰発現の結果として、細胞は、発現された標的タンパク質の分解または制御を開始すると思われる。この形態の調節は、封入体としての変性されたタンパク質の形成をもたらす（図５Ｂ、赤色の矢印）。この様式での細胞による膜タンパク質の発現の制御は、不活性なかつミスフォールディングされたタンパク質、および結果的に、使用不能で不十分な品質の発現されたタンパク質をもたらすことができる。対照的に、膜への正確な挿入および封入体の非存在によって分かる通り、標的膜タンパク質と例示的エンハンサータンパク質の同時発現は、正確に転位されたＤＲＤ１－ＧＦＰをもたらした（図５Ｃ～図５Ｄ）。本実施例は、例示的な標的膜タンパク質（ＤＲＤ１）と併せた例示的エンハンサータンパク質（ＥＣＭＶのＬタンパク質）の同時発現が、膜タンパク質の改善された発現および局在化をもたらしたことを実証する。理論に制約されることなく、本システムは、標的タンパク質発現の厳格な調節を生じ、これにより、発現された膜タンパク質の分解をもたらすであろう細胞の正常な調節を迂回すると思われる。よって、本システムは、ＧＰＣＲの高収量発現および精製に適する。
異なる構築物からの標的タンパク質およびエンハンサータンパク質の発現
エンハンサータンパク質が、別々のＤＮＡ分子によってコードされ得ることを説明するために、ＤＲＤ１－ＧＦＰ（ＥＧ１０）構築物を、ＥＣＭＶ由来のＬタンパク質（ＥＧ１１）と共に、別々のベクターにおける別々のプロモーターの制御下で同時発現させた。上に記載されている通りにＥＧ１０およびＥＧ１１を一過性にトランスフェクトする前に、ＨＥＫ２９３細胞を、２４ウェルプレートにおいて０．０５×１０６個の細胞／ウェルで播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＤＲＤ１－ＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡を使用して４８時間後にモニターした。画像を撮り、Ｅｃｈｏ Ｒｅｖｏｌｖｅ顕微鏡システムによって解析した。
図１０Ａおよび図１０Ｂは、２種の別々のベクターからのＬ－タンパク質とＤＲＤ１－ＧＦＰの同時発現は、正確な膜会合を確実にすることを実証する。ＤＲＤ１－ＧＦＰの発現は、封入体の形成を生じるが（図１０Ａ、赤色の矢印）、正確な膜会合は、Ｌ－タンパク質の同時発現によって達成することができる。図１０Ｂは、Ｌ－タンパク質が、別々のベクターおよびプロモーターから発現される場合であっても、Ｌ－タンパク質の調節効果が、ＤＲＤ１の正確な膜会合の回復に十分であることを実証する。
これらの結果は、本明細書に開示されている方法を使用して、本明細書に開示されているエンハンサータンパク質および標的タンパク質を別々の構築物から発現させて、発現された標的タンパク質の収量および／または機能性における改善を達成することができることを実証する。さらに、これらの結果は、当技術分野で現在公知のまたは使用されているいずれかの構築物またはベクターからのいずれかの標的タンパク質の発現が、同じ構築物または異なる構築物からの本明細書に開示されているエンハンサータンパク質のうち１種または複数種の発現と組み合わせると、発現された標的タンパク質の収量および／または機能性を改善することができることを示唆する。これは、本明細書に開示されている方法および組成物の多用途性を劇的に増強する。
膜タンパク質の機能活性
ＤＲＤ１等の正確に転位されたＧＰＣＲの説明に加えて、ＤＲＤ１－Ｓｔｒｅｐ融合体を使用して活性検査を行った。より小型のｓｔｒｅｐ－タグは、サイトゾル配置されたＧタンパク質との相互作用がインタクトであり、機能アッセイを行うことができることを確実にする。ドーパミンの結合後に、ＤＲＤ１は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質を、そのＧαサブユニットおよびそのＧβγ複合体へと放出する。静止状態では、Ｇαは、ＧＤＰに結合するが、活性化後に、ＧＴＰからＧＤＰに交換する。Ｇα－ＧＴＰ複合体は、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）と相互作用し、ＡＣ活性の活性化をもたらし、結果的にｃＡＭＰレベルを増加させる。細胞内ｃＡＭＰレベルの変化は、標準ｃＡＭＰアッセイによって測定することができる。アカデミックおよび産業標準（ＥＧ５）を、ＥＣＭＶのＬタンパク質との同時発現における同じ標的タンパク質と比較した。
ＤＲＤ１－Ｓｔｒｅｐ融合体を、ＨＥＫ２９３細胞において発現させた。上に記載されている通りにＥＧ５またはＥＧ６のいずれかを一過性にトランスフェクトされる前に、ＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェル白色透明底プレートにおいて５，０００個の細胞／ウェルで播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。タンパク質を４８時間発現させ、製造業者の使用説明書に従ってｃＡＭＰ－Ｇｌｏ（商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＤＲＤ１活性を解析した。４８時間後に、細胞を滅菌ＰＢＳ ｐＨ７．２で洗浄し、細胞を、２０μｌの１ｍＭドーパミン基質溶液（＋ドーパミン；オン）またはＰＢＳ ｐＨ７．２（－ドーパミン；オフ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞をＰＢＳ ｐＨ７．２で洗浄し、続いて、２０μｌ溶解緩衝液を添加した。溶解を１５分間室温（ＲＴ）で振盪しつつ行った。その後、４０μｌ検出溶液を添加し、細胞を２０分間ＲＴで振盪しつつインキュベートした。解析前に、１５分間ＲＴでインキュベートした８０μｌ Ｋｉｎａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用して反応を停止した。プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＬＸ）を使用して発光を測定し、標準解析プログラムを使用してデータを解析した。
図１１は、ＥＭＣＶ由来のＬタンパク質と協調してＤＲＤ１－Ｓｔｒｅｐを発現する利点を実証する。ドーパミンが、ＤＲＤ１を発現する細胞に添加されると、対応する発光シグナルは、内部ｃＡＭＰ放出の結果として下落する。図１１は、ドーパミンの非存在下におけるオフ状態およびドーパミンの存在下におけるオン状態の間の差によって指し示される通り、ＤＲＤ１とＥＭＣＶ由来のＬタンパク質を同時発現させることにより、強い活性化シグナルが生じることを示す。アッセイの重要な側面は、活性化因子、ドーパミンの非存在下におけるＤＲＤ１の偽活性化またはｃＡＭＰ放出を除外することである。アッセイが、「リーキー」シグナルを産生する場合、薬物発見スクリーニングに対するその有用性は低い。図１１は、ＤＲＤ１とＥＭＣＶ由来のＬタンパク質を同時発現させることにより、単なるオフシグナルを非トランスフェクト細胞と比較する場合に、「リーキー」活性化、したがって、偽陰性読み取り値が、大幅に低下されることを示す。したがって、本明細書に開示されている方法を使用したエンハンサータンパク質の同時発現は、標的ＤＲＤ１タンパク質の活性化のより厳格な調節をもたらす。したがって、本明細書に開示されている方法は、薬物発見スクリーニングにおいて適用性を有する。
（実施例３）
ウイルスポリメラーゼと組み合わせたウイルスプロモーターを使用したＤＲＤ１－ＧＦＰの発現
本実施例について、Ｔ７プロモーターを使用して、例示的な、発現することが困難な標的膜タンパク質としてＤＲＤ１－ＧＦＰを発現させて、Ｔ７等のウイルスポリメラーゼを使用して、核外で転写を開始することができることを実証した。実施例１と同様に、ウイルスポリメラーゼは、標準真核生物プロモーターの制御下に置かれ、対応するｍＲＮＡは、核外搬出に頼った。
図６Ａ～図６Ｂは、Ｔ７を有するベクターとコトランスフェクトされた場合の、Ｔ７プロモーターからのＥＣＭＶ由来のＬタンパク質と協調したＤＲＤ１－ＧＦＰの成功した発現を実証する。ＥＧ１０またはＥＧ１２およびＥＧ４のいずれかを一過性にトランスフェクトする前に、ＨＥＫ２９３細胞を、２４ウェルプレートにおいて０．０５×１０６個の細胞／ウェルで播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＤＲＤ１－ＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡を使用して２４時間および４８時間後にモニターした。画像は、ＣＣＤカメラ（Ａｍｓｃｏｐｅ）を使用して撮り、ＩＳＣａｐｔｕｒｅ（Ａｍｓｃｏｐｅ）で解析した。本実施例は、標的タンパク質としてのＤＲＤ１－ＧＦＰおよびエンハンサータンパク質としてのＥＣＭＶのＬタンパク質と協調した、ウイルスポリメラーゼとしてのＴ７の成功した使用を実証する。
（実施例４）
異なる哺乳動物プロモーターを使用したＤＲＤ１－ＧＦＰの発現
本開示に係るシステム、方法および組成物は、多種多様な哺乳動物プロモーターと適合性である。異なるプロモーターからの標的タンパク質およびエンハンサータンパク質の同時発現の適合性を実証するために、例示的な標的タンパク質としてＤＲＤ１－ＧＦＰを使用した。実施例２に記載されている通り、ＤＲＤ１－ＧＦＰの正確な発現および転位は、蛍光顕微鏡によって容易に検出することができる。実験において使用された構築物は、ＣＭＶプロモーター（ＥＧ８）、ＥＦ１－αプロモーター（ＥＧ２２）またはＳＶ４０プロモーター（ＥＧ２３）のいずれかからＤＲＤ１を発現するように、また、次のエレメント － ＤＲＤ１－ＧＦＰをコードする核酸配列、ＩＲＥＳをコードする核酸配列、およびＬタンパク質配列をコードする核酸配列を有するように操作した。アカデミック標準システム（ＥＧ１０）を使用して、正確な膜会合および不正確な膜会合の間の差を説明した。
異なる哺乳動物プロモーターの制御下のＤＲＤ１－ＧＦＰ融合体を、ＨＥＫ２９３細胞において発現させた。上に記載されている通りにＥＧ８、ＥＧ１０、ＥＧ２２またはＥＧ２３のいずれかを一過性にトランスフェクトされる前に、ＨＥＫ２９３細胞を、２４ウェルプレートにおいて０．０５×１０６個の細胞／ウェルで播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＤＲＤ１－ＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡を使用して４８時間後にモニターした。画像を撮り、Ｅｃｈｏ Ｒｅｖｏｌｖｅ顕微鏡システムによって解析した。
図１２は、異なるプロモーターを使用して、エンハンサータンパク質の発現と組み合わせて標的タンパク質発現を駆動することができることを実証する。対照構築物からのＤＲＤ１－ＧＦＰの発現は、ＤＲＤ１が、細胞の外膜に局在化することができないが、むしろ、封入体に局在化することを示すが（明るい緑色のスポット、図１２Ａ）、ＣＭＶ、ＥＦ１αおよびＳＶ４０（図１２Ｂ～図１２Ｄ）プロモーターから発現されたＬ－タンパク質エンハンサーと組み合わせて発現されたＤＲＤ１－ＧＦＰは全て、封入体の非存在によって判断される通り、膜と正確に会合する。予想通り、異なるプロモーターは、異なる発現レベルをもたらし、したがって、膜におけるＤＲＤ１－ＧＦＰの量（蛍光の総量）は変動する。
（実施例５）
異なるウイルス孔遮断タンパク質を使用したＤＲＤ１－ＧＦＰの発現
例示的な標的融合タンパク質であるＤＲＤ１－ＧＦＰを、ＨＥＫ２９３細胞において異なるエンハンサータンパク質と組み合わせて発現させた。本実験において使用された構築物は、ＤＲＤ１－ＧＦＰと、ＥＣＭＶのリーダータンパク質（ＥＧ８）、タイラーウイルスのリーダータンパク質（ＥＧ１９）、ポリオウイルスの２Ａプロテアーゼ（ＥＧ２１）および水疱性口内炎ウイルスのＭタンパク質（ＥＧ２０）から選択されるエンハンサータンパク質のうち１種とをコードした。実施例２に記載されている通り、ＤＲＤ１－ＧＦＰの正確な発現および転位は、蛍光顕微鏡によって容易に検出することができる。アカデミック標準システム（ＥＧ１０）を使用して、正確な膜会合および不正確な膜会合の間の差を説明した。上に記載されている通りにＥＧ８、ＥＧ１０、ＥＧ１９、ＥＧ２０またはＥＧ２１のいずれかで一過性にトランスフェクトされる前に、ＨＥＫ２９３細胞を、２４ウェルプレートにおいて０．０５×１０６個の細胞／ウェルで播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＤＲＤ１－ＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡を使用して４８時間後にモニターした。画像を撮り、Ｅｃｈｏ Ｒｅｖｏｌｖｅ顕微鏡システムによって解析した。
図１３は、ＥＣＭＶのリーダータンパク質（図１３Ｂ）、タイラーウイルスのリーダータンパク質（図１３Ｃ）、ポリオウイルスの２Ａプロテアーゼ（図１３Ｄ）および水疱性口内炎ウイルスのＭタンパク質（図１３Ｅ）が全て、エンハンサータンパク質のいずれも持たないＤＲＤ１－ＧＦＰ（図１３Ａ）とは対照的に、ＤＲＤ１－ＧＦＰの正確な膜取込みを確実にするのに十分であることを実証する。
これらの結果は、宿主細胞において標的タンパク質と共に発現される場合、いくつかの異なるウイルス孔遮断タンパク質が、標的タンパク質の収量、局在化および／または機能性を改善する能力を共有することを示す。理論に制約されずに、これらのエンハンサータンパク質のいずれか１種からの発現に起因する核膜孔の遮断は、発現された標的タンパク質の分解をもたらしたであろう細胞の正常な調節を迂回し得ると考えられる。よって、ウイルス孔遮断タンパク質が、標的タンパク質発現、局在化および活性を増強する、この共通機構は、本明細書に開示されている方法が、当技術分野で公知の、将来発見されるまたは本明細書に開示されているいずれかの孔遮断タンパク質により実施されることを可能にする。
（実施例６）
ＣＨＯ細胞におけるＤＲＤ１－ＧＦＰの発現
実施例２の実験を、ＨＥＫ２９３の代わりにＣＨＯ－Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を使用して反復した。ＤＲＤ１－ＧＦＰを、エンハンサータンパク質もコードするＥＧ１９構築物からまたは対照ＥＧ１０構築物から発現させた。
ＤＲＤ１－ＧＦＰ融合タンパク質を、ＣＨＯ－Ｋ１細胞において発現させた。製造業者の使用説明書に従ってリポフェクタミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してＥＧ１０またはＥＧ１９のいずれかを一過性にトランスフェクトする前に、ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、２４ウェルプレートにおいて０．０５×１０６個の細胞／ウェルで播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＤＲＤ１－ＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡を使用して４８時間後にモニターした。画像を撮り、Ｅｃｈｏ Ｒｅｖｏｌｖｅ顕微鏡システムによって解析した。
図１４は、ＥＧ１０が、発現された受容体を正確に転位させることができないことを実証する。興味深いことに、ＣＨＯ細胞におけるヒトＤＲＤ１受容体の過剰発現の結果は、ＨＥＫ細胞と比較して、より重度であると思われる。ＥＧ１０構築物により、細胞は、発現された標的タンパク質の分解または制御を開始し、封入体としての変性されたタンパク質の形成をもたらす（図１４Ａ、赤色の矢印）。この様式での細胞による膜タンパク質の発現の制御は、不活性なかつミスフォールディングされたタンパク質、および結果的に、使用不能で不十分な品質の発現されたタンパク質をもたらすことができる。対照的に、標的膜タンパク質と例示的エンハンサータンパク質の同時発現は、膜への正確な挿入および封入体の非存在によって分かる通り、正確に転位されたＤＲＤ１－ＧＦＰをもたらした（図１４Ｂ）。本実施例は、例示的な標的膜タンパク質（ＤＲＤ１）と併せた例示的エンハンサータンパク質（タイラーウイルスのＬタンパク質）の同時発現が、膜タンパク質の改善された発現および局在化をもたらすことを実証する。その上、本実施例は、開示されている方法の実施において、様々な真核細胞型（例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞）を使用することができることを実証する。
（実施例７）
Ｓｆ９細胞におけるＤＲＤ１－ＧＦＰの発現の産生
実施例２の実験を、ＨＥＫ２９３の代わりにＳｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞を使用して反復した。ＤＲＤ１－ＧＦＰを、ＥＧ８構築物または産業的およびアカデミック標準構築物、ＥＧ１０から発現させた。
ＤＲＤ１－ＧＦＰ融合体を、Ｓｆ９細胞において発現させた。製造業者の使用説明書に従ってＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ試薬ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してＥＧ１０またはＥＧ８のいずれかを一過性にトランスフェクトする前に、Ｓｆ９細胞を、６ウェルプレートにおいて０．４×１０６個の細胞／ウェルで播種し、１５分間ＲＴでインキュベートした。蛍光顕微鏡を使用して、７２時間後にＤＲＤ１－ＧＦＰ発現をモニターした。画像を撮り、Ｅｃｈｏ Ｒｅｖｏｌｖｅ顕微鏡システムによって解析した。
図１５は、ＥＧ１０が、発現された受容体を正確に転位させることができないのみならず、発現された受容体が、細胞にとって高度に毒性であることを実証する。最高蛍光シグナルは、発現された遺伝子の毒性の結果として死んだ細胞において観察された（図１５Ａ、赤色の矢印）。対照的に、開示されている方法を使用したＤＲＤ１－ＧＦＰの発現は、ＤＲＤ１－ＧＦＰの発現によって引き起こされる細胞毒性を防止し、膜に取り込まれた受容体が観察される（図１５Ｂ、赤色の矢印）。興味深いことに、Ｓｆ９細胞におけるヒトＤＲＤ１受容体の過剰発現の結果は、ＨＥＫ細胞と比較してより重度であると思われる。標準システムＥＧ１０のように調節されていない発現は、高い細胞死およびその結果としての使用不能なタンパク質を引き起こす。毒性効果は、全体的な細胞健康および膜結合受容体によって明らかな通り、ＥＧ８からＤＲＤ１－ＧＦＰおよびＬタンパク質を発現する場合に、劇的により軽度である。本実施例は、例示的な標的膜タンパク質（ＤＲＤ１）と併せた例示的エンハンサータンパク質（ＥＭＣＶのＬ－タンパク質）の同時発現が、毒性効果の明らかに改善された制御と共に、膜タンパク質の改善された発現および局在化をもたらしたことを実証する。その上、本実施例は、開示されている方法が、様々な真核細胞型と適合性であることを実証する。
（実施例８）
ＩＬ２誘導性Ｔ細胞キナーゼ（ＩＴＫ）の産生
例示的な標的タンパク質としてＩＴＫを使用して、典型的には発現することが困難である可溶性タンパク質を発現させることに対する開示されているシステムの適用を例証した。ＩＴＫは、キナーゼのＴＥＣファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞における分化において役割を果たすものと思われる。また、ＩＴＫを使用して、バッチ間の酵素活性の一貫性および本明細書に開示されている方法のスケーラビリティを実証した。３×１０ｍｌ、１００ｍｌおよび１０００ｍｌの成長培地においてＩＴＫを発現させた。その上、ＩＴＫ－Ｌ－ｈｉｓタンパク質融合構築物（ＥＧ９）を使用して、調節を制御する能力を失うことなく、エンハンサータンパク質を、組換えにより発現された標的タンパク質に融合させることができることを実証した。ＥＧ１７から、ならびに比較としてアカデミックおよび産業的標準（ＥＧ１８）から、ＩＴＫ－ｈｉｓ融合体を発現させた。
ＨＥＫ２９３細胞においてＩＴＫ－ｈｉｓおよびＩＴＫ－Ｌ－ｈｉｓ融合体を発現させた。上に記載されている通りにＥＧ９、ＥＧ１７またはＥＧ１８のいずれかを一過性にトランスフェクトする前に、ＨＥＫ２９３細胞を、１０ｍｌ、１００ｍｌまたは１０００ｍｌ Ｅｘｐｉ２９３培地において２×１０６個の細胞／ｍｌで播種し、３７℃、１２０ｒｐｍおよび５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞を４８時間後に収集し（５，０００×ｇ、１５分間、４℃）、さらなる使用まで、細胞ペレットを－８０℃で貯蔵した。
ＩＴＫを精製するために、細胞を、溶解緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、７．５；２０ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ；５０μＭ ＤＴＴ；および２ｍＭ ＭｎＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤、ＤＮＡｓｅ）に再懸濁し、超音波処理（２分間、１０秒間オン、１０秒間オフ、４０％振幅）によって溶解し、粗細胞抽出物を清澄化した（５，０００×ｇ、２０分間、４℃）。蠕動ポンプを使用して清澄化した溶解物をロードする前に、５ｍｌ Ｈｉｓ－樹脂カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｉｓＴｒａｐ）を洗浄緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、７．５；２０ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ；５０μＭ ＤＴＴ；および２ｍＭ ＭｎＣｌ２）で平衡化した。ロード後に、ＡＫＴＡ（商標）システム（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（旧ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））において精製を行った。２５ＣＶにわたり連続勾配０～１００％溶出緩衝液（洗浄緩衝液＋３００ｍＭイミダゾール）で溶出する前に、カラムを５ＣＶの洗浄緩衝液で洗浄した。タンパク質含有画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（６～１２％ＢＯＬＴ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって解析し、タンパク質含有画分をプールし、濃縮した。
タンパク質を、ＳＥＣ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、７．５；２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によってさらに精製し、画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（６～１２％ＢＯＬＴ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって解析した。タンパク質含有画分をその出現に従ってプールし、製造業者の使用説明書に従ってＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と組み合わせたＩＴＫキナーゼ酵素システムを使用して活性について解析した。簡潔に説明すると、２００ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇおよび０ｎｇの総酵素濃度で、アッセイにおいてＥＧ１７およびＥＧ１８から発現された全長ＩＴＫを使用した。基質ＰｏｌｙＥ４Ｙ１を０．２μｇ／μｌの濃度で使用し、ＡＴＰを２５μＭで反応物に添加した。９６ウェルプレートにおいて、５μｌ反応緩衝液（キットに同梱されている）を、１０μｌの酵素希釈物および１０μｌのＡＴＰ／ＰｏｌｙＥ４Ｙ１ミックスと組み合わせた。プレートを６０分間ＲＴでインキュベートした。２５μｌ ＡＤＰ－Ｇｌｏ試薬を添加し、プレートを４０分間ＲＴで再度インキュベートした。５０μｌキナーゼ検出試薬を添加し、さらに３０分間ＲＴでインキュベートすることにより、反応を停止した。反応を、１秒間の積分時間で発光によって読み取った。
図１６は、ＩＴＫタンパク質、およびエンハンサータンパク質Ｌと融合されたＩＴＫタンパク質のための精製プロセスを示す。ＳＥＣを使用した精製において、２種のピーク（Ｐ１およびＰ２）は、単量体（Ｐ２）および二量体（Ｐ１）種としてウエスタンブロットによって同定され得る標的タンパク質として同定することができる（データ図示せず）。理論に制約されずに、ＩＴＫは、活性形態を達成するために二量体を形成する必要があると思われる。ＩＴＫは、過剰発現されると細胞にとって毒性がある公知キナーゼである。したがって、ＩＴＫの活性が高くなるにつれて、より多くの発現が、宿主細胞によって下方調節されるまたは単量体不活性形態にされるであろう。
図１７Ａは、同定された種の精製の最終ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。Ｐ１種のみが活性であり、したがって、ＩＴＫと組み合わせたエンハンサータンパク質の発現が、活性ＩＴＫ種の発現の莫大な増加を生じることに留意されたい。図１７Ｂは、一次読み取り値として発光を使用することにより、活性の差を実証する。ＥＧ１７から発現されたＰ１のみが、高い活性を実証し、したがって、このキナーゼに対する薬物スクリーニングのための唯一の使用可能なタンパク質である。両方のシステムが、同様の量の目的のタンパク質を発現すると思われるものの、本明細書に開示されている方法を使用して発現されたＩＴＫは、エンハンサータンパク質の非存在下で発現されたＩＴＫタンパク質よりも大きい活性を示す。本実施例は、本明細書に開示されている方法を使用して、本方法を用いなければ毒性があるまたは宿主細胞によって不活性にされる活性タンパク質を産生することができることを実証する。さらに、開示されている方法を使用して、本方法を用いなければ毒性がある活性タンパク質を産生することができるだけではなく、これらのタンパク質は次いで、新規治療薬を発見するための小分子スクリーニング等の薬物スクリーニングにおいて使用することができる。
（実施例９）
ＣＨＯ－Ｋ１細胞におけるＩＬ２誘導性Ｔ細胞キナーゼ（ＩＴＫ）の産生
実施例８の実験を、ＨＥＫ２９３の代わりにＣＨＯ細胞を使用して反復した。ＥＧ１７または対照構築物ＥＧ１８からＩＴＫ－ｈｉｓを発現させた。
ＣＨＯ－Ｋ１細胞においてＩＴＫ－ｈｉｓ融合体を発現させた。製造業者の使用説明書に従ってリポフェクタミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してＥＧ１７またはＥＧ１８のいずれかを一過性にトランスフェクトする前に、ＣＨＯ－Ｋ１細胞の各構築物の総計８枚の１５０ｍｍプレートを、５×１０６個の細胞／ディッシュ当たりで播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞を擦過することにより４８時間後に収集し、スピンダウンして、上清を除去した（５，０００×ｇ、１５分間、４Ｃ）。さらなる使用まで、細胞ペレットを－８０℃で貯蔵した。ＩＴＫを精製するために、細胞を、溶解緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、７．５；２０ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ；５０μＭ ＤＴＴ；および２ｍＭ ＭｎＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤、ＤＮＡｓｅ）に再懸濁し、超音波処理（２分間、１０秒間オン、１０秒間オフ、４０％振幅）によって溶解し、粗細胞抽出物を清澄化した（５，０００×ｇ、２０分間、４℃）。蠕動ポンプを使用して清澄化した溶解物をロードする前に、５ｍｌ Ｈｉｓ－樹脂カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｉｓＴｒａｐ）を、洗浄緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、７．５；２０ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ；５０μＭ ＤＴＴ；および２ｍＭ ＭｎＣｌ２）で平衡化した。ロード後に、ＡＥＫＴＡシステムにおいて精製を行った。２０ＣＶにわたり連続勾配０～７５％溶出緩衝液（洗浄緩衝液＋３００ｍＭイミダゾール）で溶出する前に、カラムを５ＣＶの洗浄緩衝液で洗浄した。５ＣＶの１００％溶出緩衝液によって溶出を完了した。
タンパク質含有画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（６～１２％ＳｕｒｅＰＡＧＥ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）によって解析し、タンパク質含有画分をプールし、濃縮した。タンパク質を、ＳＥＣ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、７．５；２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によってさらに純化し、画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（６～１２％ＳｕｒｅＰＡＧＥ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）によって解析した。タンパク質含有画分をその出現に従ってプールし、製造業者の使用説明書に従ってＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）と組み合わせたＩＴＫキナーゼ酵素システムを使用して活性について解析した。
Ｓｆ９昆虫細胞において発現されたΔＩＴＫを標準として使用した。２００ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇおよび０ｎｇの総酵素濃度で、アッセイにおいてＥＧ１７およびＥＧ１８から発現されたΔＩＴＫと共に全長ＩＴＫを使用した。０．２μｇ／μｌの濃度で基質ＰｏｌｙＥ４Ｙ１を使用し、２５μＭでＡＴＰを反応物に添加した。９６ウェルプレートにおいて、５μｌ反応緩衝液（キットに同梱されている）を、１０μｌの酵素希釈物および１０μｌのＡＴＰ／ＰｏｌｙＥ４Ｙ１ミックスと組み合わせた。プレートを６０分間ＲＴでインキュベートした。２５μｌ ＡＤＰ－Ｇｌｏ試薬を添加し、プレートを４０分間ＲＴで再度インキュベートした。５０μｌキナーゼ検出試薬を添加し、さらに３０分間ＲＴでインキュベートすることにより、反応を停止した。反応を、１秒間の積分時間で発光によって読み取った。
図１８は、エンハンサータンパク質Ｌありおよびなしで発現されたＩＴＫの精製プロセスを示す。上で言及されている通り、ＳＥＣを使用した精製において、２種のピーク（Ｐ１およびＰ２）を標的タンパク質として同定することができる。理論に制約されずに、ＩＴＫは、活性形態を達成するために二量体を形成する必要があると思われる。ＩＴＫは、過剰発現されると細胞にとって毒性がある公知キナーゼである。したがって、ＩＴＫの活性が高くなるにつれて、より多くの発現が、宿主細胞によって下方調節されるまたは単量体不活性形態にされるであろう。
図１９は、一次読み取り値として発光を使用することにより、活性の差を実証する。ＥＧ１７から発現されたＰ１のみが、提供されるΔＩＴＫ陽性対照に対して適合性の活性を実証する。両方のシステムが、同様の量の目的のタンパク質を発現すると思われるものの、提示されるシステムのみが、宿主細胞の調節を制御することにより、活性タンパク質を産生することを達成する。本実施例は、本明細書に開示されている方法を使用して、本方法を用いなければ毒性があるまたは宿主細胞によって不活性にされる活性タンパク質を産生することができることを実証する。
（実施例１０）
Ｓｆ９細胞におけるＩＬ２誘導性Ｔ細胞キナーゼ（ＩＴＫ）の産生
実施例８を、ＨＥＫ２９３の代わりにＳｆ９細胞を使用して反復する。ＥＧ１７構築物または産業的およびアカデミック標準ＥＧ１８構築物からＩＴＫ－ｈｉｓを発現する。Ｓｆ９細胞における発現は、実施例７に記載されている通りに行われ、Ｈｉｓタグ付けされたＩＴＫタンパク質のタンパク質精製は、実施例８および９に記載されている通りに為される。
（実施例１１）
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の発現
エンハンサータンパク質としての孔遮断タンパク質と組み合わせた標的タンパク質としての膜タンパク質の同時発現が、高密度の活性イオンチャネルを生じたことを実証するための追加的な例として、ＣＦＴＲを使用した。ＣＦＴＲは、上皮細胞膜を越えて塩素イオンを伝導する、ＡＢＣ輸送体クラスの膜貫通輸送体である。ＣＦＴＲは、アカデミック標準（ＥＧ２４）を使用した場合に、不均一な形で発現することが公知である。不均一性は、ＡＢＣ輸送体の精製または解析における困難を増加させる。均一性の改善を実証するために、ＣＦＴＲを、例示的システム（ＥＧ２５）の骨格へとクローニングしたか、またはＰＣＲ産物として使用した。比較として、アカデミック標準（ＥＧ２４）を対照として並行して使用した。
ＣＦＴＲ構築物をＨＥＫ２９３細胞において発現させた。上に記載されている通りにＥＧ２５、ＥＧ２５挿入のＰＣＲ産物またはＥＧ２４のいずれかを一過性にトランスフェクトする前に、ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルプレートにおいて０．３×１０６個の細胞／ウェルで播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＣＦＴＲ発現を、顕微鏡を使用して２４時間および４８時間後にモニターした。４８時間後に細胞を収集し、ＲＩＰＡ（放射性免疫沈降アッセイ）緩衝液（ＣｅｌｌＧｅｎｅ）を使用して溶解した。溶解物を清澄化し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（６～１２％ＢＯＬＴ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と、続いて抗ＣＦＴＲ（Ａｂｃａｍ、２次抗体 － 抗マウス－ＨＲＰ）を使用したウエスタンブロット（ニトロセルロース膜、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって解析した。
図７は、Ｌ－タンパク質とＣＦＴＲの同時発現の影響を実証する。アカデミック標準は、ウエスタンブロットにおいて幅広いバンドを産生したものの、ＥＧ２５構築物に基づく転写および翻訳は、定義されたバンドをもたらし、ＡＢＣ輸送体の高度に均質な発現を実証する。その上、本実施例は、発現システムが、ベクターまたはＰＣＲ産物として細胞内へと送達され得ることを実証する。
（実施例１２）
ＮＡＤａｓｅの発現
例示的な標的タンパク質としてＮＡＤａｓｅを使用して、発現することが困難な毒性可溶性タンパク質に対する開示されているシステムの適用を例証した。ＮＡＤａｓｅは、ＮＡＤ＋からＡＤＰ－リボースおよびニコチンアミドへの反応を触媒する酵素タンパク質である。ＮＡＤａｓｅの過剰発現は通常、細胞が、その天然エネルギー源ＮＡＤ＋から取り除かれるという事実により、増加した細胞死を生じる。本システムが、高収量の活性ＮＡＤａｓｅを産生することができることを実証するために、ＮＡＤａｓｅ－Ｆｌａｇ融合体を例示的システム（ＥＧ１３）の骨格へとクローニングした。
ＮＡＤａｓｅ－ｆｌａｇ構築物をＨＥＫ２９３細胞において発現させた。上に記載されている通りにＥＧ１３のいずれかを一過性にトランスフェクトする前に、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｔ２２５フラスコにおいて５×１０６個の細胞で播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＮＡＤａｓｅ－ｆｌａｇ発現を、顕微鏡を使用して２４時間および４８時間後にモニターした。０．５％トリプシン溶液を５分間３７℃で使用して細胞を剥離し、擦過することにより、細胞を４８時間後に収集した。細胞をペレットにし（５，０００×ｇ、１５分間、４℃）、上清を廃棄した。さらなる使用まで、細胞ペレットを－８０℃で貯蔵した。ＮＡＤａｓｅ－ｆｌａｇを精製するために、細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＰＯ４ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０、プロテアーゼ阻害剤、ＤＮＡｓｅ）に再懸濁し、超音波処理（２分間、１０秒間オン、１０秒間オフ、４０％振幅）によって溶解し、粗細胞抽出物を清澄化した（１００，０００×ｇ、４５分間、４℃）。清澄化した溶解物に添加する前に、抗ＦＬＡＧ Ｍ２親和性ゲル（Ｓｉｇｍａ）を洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＰＯ４ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で平衡化した。溶解物を樹脂と共に２時間４℃で振盪しつつインキュベートした。樹脂を沈め、５ＣＶの洗浄緩衝液で洗浄し、スピンカラムを使用して、４×１ＣＶの溶出緩衝液（洗浄緩衝液＋０．２ｍｇ／ｍｌ ３×Ｆｌａｇ－ペプチド（Ｓｉｇｍａ））でタンパク質を溶出させた。精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（６～１２％ＢＯＬＴ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって解析し（図８Ａ）、タンパク質含有画分をプールした。Ａ２８０（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してタンパク質濃度を測定した。タンパク質収量は、２６ｍｇ／Ｌ発現培地であると決定された。ＨＰＬＣによりＮＡＤ＋からＡＤＰ－リボースへの変換率を解析することにより、ＮＡＤａｓｅの活性を検査した（図８Ｂ）。
（実施例１３）
分泌タンパク質、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－Ｉｎｈ）の産生
例示的な標的タンパク質としてＣ１－Ｉｎｈを使用して、正確な翻訳後修飾を有する分泌タンパク質を発現させることに対する開示されている方法の適用を例証した。Ｃ１－Ｉｎｈは、セルピンスーパーファミリーに属するプロテアーゼ阻害剤である。分泌タンパク質として、Ｃ１－Ｉｎｈは、高度にグリコシル化されており、したがって、組換え発現にとって困難な標的であることを立証する。別々の構築物から発現されたＥＭＣＶ由来のＬタンパク質の存在または非存在下で、Ｃ１－Ｉｎｈ－ｍｙｃ－ｆｌａｇ融合タンパク質を発現させた。本実施例において、別々の構築物からＣＭＶプロモーターの制御下で、ＥＭＣＶ由来のＬタンパク質を同時発現させた。
Ｃ１－Ｉｎｈ－Ｍｙｃ－Ｆｌａｇ融合体をＨＥＫ２９３細胞において発現させた。当技術分野で公知のおよび／または本明細書に開示されている方法を使用した懸濁細胞のトランスフェクションによって、Ｃ１－Ｉｎｈをコードするベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ；ＣＡＴ＃：ＲＣ２０３７６７）を単独で、またはＥＧ１１と組み合わせて一過性にトランスフェクトする前に、ＨＥＫ２９３細胞を、１００ｍｌ振盪フラスコにおいて１．７５×１０６個／ｍｌの細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２および１２０ｒｐｍで一晩インキュベートした。発現された組換えＣ１－Ｉｎｈタンパク質を含有する上清を７２時間後に収集し、遠心分離とそれに続く濾過（２２ｕｍ、ニトロセルロース）によって上清を清澄化した。上清に添加する前に、Ｃ１－Ｉｎｈを精製するために、抗Ｆｌａｇ樹脂（抗ＦＬＡＧ Ｍ２親和性ゲル、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した。上清を樹脂と共に２時間４℃で振盪しつつインキュベートした。樹脂を沈め、５ＣＶの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄し、４ＣＶの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ ３×Ｆｌａｇペプチドでタンパク質を溶出させた。精製を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳｕｒｅＰＡＧＥ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）によって解析し、タンパク質含有画分をプールした。製造業者の使用説明書に従ってＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によってタンパク質濃度を解析し、製造業者の使用説明書に従ってイムノアッセイ（ＭｉｃｒｏＶｕｅ Ｃ１－Ｉｎｉｈｉｂｉｔｏｒ Ｐｌｕｓ ＥＩＡ、Ｑｕｉｄｅｌ）を使用して、正規化されたＣ１－Ｉｎｈを活性について検査した。
図２０Ａは、エンハンサータンパク質の非存在（左）および存在（右）下におけるＣ１－阻害剤の精製を示す。産生されるＣ１－阻害剤の総量は、エンハンサータンパク質の存在下で＞３０％増加される。図２０Ｂは、精製された試料内の活性Ｃ１－阻害剤の総量の改善を実証する。活性Ｃ１－阻害剤について検査する前に、活性アッセイのため、タンパク質濃度を正規化した。活性Ｃ１－阻害剤の量は、ＧＯＩと同時にエンハンサータンパク質を同時発現させることにより＞１０％増加され得る。これらの結果は、本明細書に開示されている方法が、Ｃ１－阻害剤等の分泌標的タンパク質のより高い収量および改善された活性をもたらすことを実証する。
（実施例１４）
分泌タンパク質、妊娠特異的糖タンパク質１（ＰＳＧ１）の産生
例示的な標的タンパク質としてＰＳＧ１を使用して、正確な翻訳後修飾を有する分泌タンパク質を発現させることに対する開示されている方法の適用を例証した。ＰＳＧ１は、癌胎児性抗原スーパーファミリー内のヒトＰＳＧファミリーの高度にグリコシル化された分泌タンパク質である。ＰＳＧ１は、妊娠中に母体血中に見出される最も豊富な胎児タンパク質の１つである。ＰＳＧ１は、マクロファージ、単球およびトロホブラストにおけるＴＧＦ－ベータの上方調節により、免疫調節薬として機能することが示された。加えて、ＰＳＧ１は、ヒト単球における抗炎症性サイトカインＩＬ－１０およびＩＬ－６の分泌を誘導することが示された。これらの機能は、ＰＳＧ１を魅力的な医薬品標的にした。ＰＳＧ１を発現する際の困難は、非ヒト細胞を使用した際に再形成することが不可能である正しいグリコシル化パターンである。本実施例において、ＥＭＣＶ由来のＬタンパク質を、ＣＭＶプロモーターの制御下でＰＳＧ１と共に同時発現させた。
ＰＳＧ１をＨＥＫ２９３細胞において発現させた。ＥＭＣＶ由来のＬタンパク質と協調してＰＳＧ１をコードするベクターを一過性にトランスフェクトする前に、ＨＥＫ２９３細胞を、１００ｍｌ振盪フラスコにおいて１．７５×１０６個／ｍｌの細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２および１２０ｒｐｍで一晩インキュベートした。発現された組換えＰＳＧ１タンパク質を含有する上清を７２時間後に収集し、遠心分離とそれに続く濾過（２２ｕｍ、ニトロセルロース）によって上清を清澄化した。蠕動ポンプを使用して上清をカラムにロードする前に、ＰＳＧ１を精製するために、ＨｉＴｒａｐ（商標）ＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ ＩＥＸカラム（Ｃｙｔｉｖａ（旧ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を洗浄緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６）で平衡化した。ロード後に、ＡＫＴＡ（商標）システム（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（旧ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））において精製を行った。多段階勾配１０％、２０％、３０％、５０％および１００％溶出緩衝液（洗浄緩衝液＋２００ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出する前に、カラムを５ＣＶの洗浄緩衝液で洗浄した。タンパク質含有画分をプールし、濃縮し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（６～１２％ＢＯＬＴ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および抗ＰＳＧ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２次抗体 － 抗ウサギ－ＨＲＰ）を使用したウエスタンブロット（ニトロセルロース膜、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって解析した。
図２１は、ＰＳＧ１のイオン交換クロマトグラフィーを示す（左）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによってＰＳＧ１の存在および同一性を確認する（図２１Ｂ、赤色の矢印）前に、タンパク質含有画分（図２１Ａ、赤色のボックス）をプールし、濃縮した。
さらなる番号付き実施形態
本発明のさらなる実施形態は、下の番号付き実施形態において提供される：
実施形態１． １種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
ａ．前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと
を含み、
ｉ．前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、および／または
ｉｉ．前記エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択され、
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
実施形態２． 前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、実施形態１に記載のシステム。
実施形態３． 前記ＮＣＴ阻害剤が、ウイルスタンパク質である、実施形態２に記載のシステム。
実施形態４． 前記ＮＣＴ阻害剤が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択される、実施形態１～３のいずれか一項に記載のシステム。
実施形態５． 前記ＮＣＴ阻害剤が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質またはその機能的バリアントである、実施形態４に記載のシステム。
実施形態６． 前記ＮＣＴ阻害剤が、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼまたはその機能的バリアントである、実施形態４に記載のシステム。
実施形態７． 前記ＮＣＴ阻害剤が、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼまたはその機能的バリアントである、実施形態４に記載のシステム。
実施形態８． 前記ＮＣＴ阻害剤が、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質またはその機能的バリアントである、実施形態４に記載のシステム。
実施形態９． 前記ＮＣＴ阻害剤が、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質またはその機能的バリアントである、実施形態４に記載のシステム。
実施形態１０． 前記ＮＣＴ阻害剤が、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質またはその機能的バリアントである、実施形態４に記載のシステム。
実施形態１１． 前記ＮＣＴ阻害剤が、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質またはその機能的バリアントである、実施形態４に記載のシステム。
実施形態１２． 前記ＮＣＴ阻害剤が、ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質またはその機能的バリアントである、実施形態４に記載のシステム。
実施形態１３． 前記Ｌタンパク質が、タイラーウイルスのＬタンパク質またはその機能的バリアントである、実施形態５に記載のシステム。
実施形態１４． 前記Ｌタンパク質が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を共有する、実施形態５に記載のシステム。
実施形態１５． 前記Ｌタンパク質が、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＬタンパク質またはその機能的バリアントである、実施形態５に記載のシステム。
実施形態１６． 前記Ｌタンパク質が、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を共有する、実施形態５に記載のシステム。
実施形態１７． 前記Ｌタンパク質が、ポリオウイルスのＬタンパク質、ＨＲＶ１６のＬタンパク質、メンゴウイルスのＬタンパク質およびサフォルドウイルス２のＬタンパク質、またはそれらの機能的バリアントからなる群から選択される、実施形態５に記載のシステム。
実施形態１８． 前記システムが、発現カセットを含む単一のベクターを含み、前記発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
実施形態１９． 前記発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと、前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターとを含む、実施形態１８に記載のシステム。
実施形態２０． 前記発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結された共有されたプロモーターを含む、実施形態１８に記載のシステム。
実施形態２１． 前記発現カセットが、リボソームスキッピング部位をコードするポリヌクレオチドによって連結された前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドを含むコードポリヌクレオチドを含み、前記コードポリヌクレオチドが、前記共有されたプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態２０に記載のシステム。
実施形態２２． 前記発現カセットが、コードポリヌクレオチドを含み、前記コードポリヌクレオチドが、リボソームスキッピング部位によって連結された前記エンハンサータンパク質および前記標的タンパク質をコードし、前記コードポリヌクレオチドが、前記共有されたプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態２０に記載のシステム。
実施形態２３． 前記発現カセットが、リボソームスキッピング部位によって連結された、前記標的タンパク質および前記エンハンサータンパク質の両方をコードする単一のメッセンジャーＲＮＡの転写のために構成されており、前記メッセンジャーＲＮＡの翻訳が、別個のポリペプチドとしての前記標的タンパク質および前記Ｌタンパク質の発現をもたらす、実施形態１８～２２のいずれか一項に記載のシステム。
実施形態２４． １種のベクターを含む、実施形態１～２３のいずれか一項に記載のシステム。
実施形態２５． ａ．第１のプロモーターに作動可能に連結された前記第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、
ｂ．第２のプロモーターに作動可能に連結された前記第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターと
を含む、実施形態１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
実施形態２６． ２種のベクターを含む、実施形態１～１７または実施形態２５のいずれか一項に記載のシステム。
実施形態２７． 前記第１のポリヌクレオチドもしくは前記第２のポリヌクレオチドのいずれか一方またはその両方が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されている、実施形態１～２６のいずれか一項に記載のシステム。
実施形態２８． 前記１種または複数種のベクターのうち少なくとも１種が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドのいずれか一方または両方の転写のために構成されたＴ７プロモーターを含む、実施形態１～２７のいずれか一項に記載のシステム。
実施形態２９． 前記１種または複数種のベクターのうち少なくとも１種が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１～２８のいずれか一項に記載のシステム。
実施形態３０． ａ．標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと
を含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのベクターであって、
ｉ．前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、および／または
ｉｉ．前記エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択され、
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、少なくとも１種のプロモーターに作動可能に連結されている、ベクター。
実施形態３１． 発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと、前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターとを含む、実施形態３０に記載のベクター。
実施形態３２． 前記発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結された共有されたプロモーターを含む、実施形態３０に記載のベクター。
実施形態３３． エンハンサータンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、標的タンパク質の発現のための真核細胞であって、
ａ．前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、および／または
ｂ．前記エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択され、
前記外因性ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結されている、真核細胞。
実施形態３４． 前記ポリヌクレオチドが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されている、実施形態３３に記載の真核細胞。
実施形態３５． 前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、実施形態３３または実施形態３４に記載の真核細胞。
実施形態３６． 標的タンパク質の組換え発現のための方法であって、プロモーターに作動可能に連結された、前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、実施形態３３～３５のいずれか一項に記載の細胞に導入するステップを含む方法。
実施形態３７． 標的タンパク質の組換え発現のための方法であって、実施形態１～２９のいずれか一項に記載のシステムまたは実施形態３０～３２のいずれか一項に記載のベクターを真核細胞に導入するステップを含む方法。
実施形態３８． 前記標的タンパク質が、膜タンパク質である、実施形態３６または実施形態３７に記載の方法。
実施形態３９． 前記膜タンパク質が、前記エンハンサータンパク質なしで発現された場合に観察される局在化と比較して、細胞膜への前記膜タンパク質の局在化が増加される、実施形態３８に記載の方法。
実施形態４０． 実施形態１～２９のいずれか一項に記載のシステムまたは実施形態３０～３２のいずれか一項に記載のベクターの導入によって産生された真核細胞。
実施形態４１． 真核細胞への実施形態１～２９のいずれか一項に記載のシステムまたは実施形態３０～３２のいずれか一項に記載のベクターの導入によって発現された標的タンパク質。
実施形態４２． 真核細胞において標的タンパク質を発現させるための方法であって、プロモーターに作動可能に連結された、前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記真核細胞に導入するステップを含み、
前記方法が、エンハンサータンパク質の共発現を利用して、前記標的タンパク質の発現レベル、溶解度および／または活性を増強し、
（ａ）前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、および／または
（ｂ）前記エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択される、方法。
実施形態４３． エンハンサータンパク質の前記共発現が、プロモーターに作動可能に連結された、前記エンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記真核細胞に導入するステップを含む、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４４． 前記導入するステップ（単数または複数）が、１種もしくは複数のＤＮＡ分子による前記真核細胞のトランスフェクション、単一のウイルスベクターによる前記真核細胞の形質導入、および／または２種のウイルスベクターによる前記真核細胞の形質導入を含む、実施形態４２または実施形態４３に記載の方法。
実施形態４５． 前記標的タンパク質が、可溶性タンパク質である、実施形態１～２９のいずれか一項に記載のシステム、実施形態３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、実施形態３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、実施形態３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、実施形態４０に記載の真核細胞、ならびに実施形態４１に記載の標的タンパク質。
実施形態４６． 前記標的タンパク質が、分泌タンパク質である、実施形態１～２９のいずれか一項に記載のシステム、実施形態３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、実施形態３３～３５のいずれか一項に記載の細胞、または実施形態３６～４４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４７． 前記標的タンパク質が、膜タンパク質である、実施形態１～２９のいずれか一項に記載のシステム、実施形態３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、実施形態３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、実施形態３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、実施形態４０に記載の真核細胞、ならびに実施形態４１に記載の標的タンパク質。
実施形態４８． 前記標的タンパク質が、ドーパミン受容体１（ＤＲＤ１）であり、必要に応じて、前記ＤＲＤ１が、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～２９のいずれか一項に記載のシステム、実施形態３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、実施形態３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、実施形態３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、実施形態４０に記載の真核細胞、ならびに実施形態４１に記載の標的タンパク質。
実施形態４９． 前記標的タンパク質が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）であり、必要に応じて、前記ＣＦＴＲが、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～２９のいずれか一項に記載のシステム、実施形態３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、実施形態３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、実施形態３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、実施形態４０に記載の真核細胞、ならびに実施形態４１に記載の標的タンパク質。
実施形態５０． 前記標的タンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－Ｉｎｈ）であり、必要に応じて、前記Ｃ１－Ｉｎｈが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～２９のいずれか一項に記載のシステム、実施形態３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、実施形態３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、実施形態３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、実施形態４０に記載の真核細胞、ならびに実施形態４１に記載の標的タンパク質。
実施形態５１． 前記標的タンパク質が、ＩＴＫであり、必要に応じて、前記ＩＴＫが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～２９のいずれか一項に記載のシステム、実施形態３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、実施形態３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、実施形態３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、実施形態４０に記載の真核細胞、ならびに実施形態４１に記載の標的タンパク質。
実施形態５２． 前記標的タンパク質が、ＮＡＤａｓｅであり、必要に応じて、前記ＮＡＤａｓｅが、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～２９のいずれか一項に記載のシステム、実施形態３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、実施形態３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、実施形態３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、実施形態４０に記載の真核細胞、ならびに実施形態４１に記載の標的タンパク質。
実施形態５３． 標的タンパク質に対する抗体を生成するための方法であって、実施形態３３～３５のいずれか一項に記載の細胞、実施形態４０に記載の細胞、または実施形態４１に記載の標的タンパク質で対象を免疫化するステップを含む方法。
実施形態５４． 前記標的タンパク質に特異的な免疫グロブリンタンパク質を発現する１つまたは複数の免疫細胞を単離するステップをさらに含む、実施形態５３に記載の方法。
実施形態５５． 前記１つまたは複数の免疫細胞から１つまたは複数のハイブリドーマを生成するステップを含む、実施形態５３または実施形態５４に記載の方法。
実施形態５６． 前記１つまたは複数の免疫細胞から１つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子をクローニングするステップを含む、実施形態５３～５５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態５７． 細胞選別による抗体発見のための方法であって、
ａ．前記細胞または標的タンパク質が標識されている、実施形態３３～３５のいずれか一項に記載の細胞、実施形態４０に記載の真核細胞、または実施形態４１に記載の標的タンパク質と、
ｂ．組換え細胞が、抗体またはその抗原結合性断片をそれぞれ含むポリペプチドのライブラリーを発現する、組換え細胞の集団と
を含む溶液を用意するステップと、
前記標識された細胞または前記標識された標的タンパク質に結合された組換え細胞について選別することにより、前記溶液から１つまたは複数の組換え細胞を単離するステップと
を含む方法。
実施形態５８． ファージディスプレイライブラリーをパニングするための方法であって、
ａ．ファージディスプレイライブラリーを、実施形態３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、実施形態４０に記載の真核細胞、または実施形態４１に記載の標的タンパク質と混合するステップと、
ｂ．前記細胞または標的タンパク質に結合する前記ファージディスプレイライブラリーのメンバーを精製および／または富化するステップと
を含む方法。
実施形態５９． ヒト細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞である、実施形態３３～３５および４０のいずれか一項に記載の真核細胞。
実施形態６０． 真核細胞株である、実施形態３３～３５、４０および５９のいずれか一項に記載の真核細胞。
実施形態６１． Ｂｃ ＨＲＯＣ２７７、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳＯ、５Ｐ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ、ｐｅｒＣ６細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、Ｐｉｃｈｉａ細胞またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞である、実施形態３３～３５、４０、５９および６０のいずれか一項に記載の真核細胞。
実施形態６２． 前記真核細胞株が、安定した細胞株である、実施形態６０に記載の真核細胞。
実施形態６３． 前記１種または複数種のベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、複製コンピテントアデノウイルスベクター、複製欠損アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたは非ウイルスプラスミドからなる群から選択される、実施形態１～２９および４５～５２のいずれか一項に記載のシステム。
実施形態６４． 前記１種または複数種のベクターのうち少なくとも１種が、ＡＡＶベクターである、実施形態６３に記載のシステム。
実施形態６５． アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、複製コンピテントアデノウイルスベクター、複製欠損アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたは非ウイルスプラスミドである、実施形態３０～３２のいずれか一項に記載のベクター。
実施形態６６． ＡＡＶベクターである、実施形態６５に記載のベクター。
実施形態６７． 前記ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質が、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＭタンパク質である、実施形態４に記載のシステム。
実施形態６８． 前記Ｍタンパク質が、配列番号９と少なくとも９０％の同一性を共有する、実施形態６７に記載のシステム。
実施形態６９． １種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
ａ．前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＬタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、前記Ｌタンパク質が、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を共有する、第２のポリヌクレオチドと
を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
実施形態７０． １種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
ａ．前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．タイラーウイルスのＬタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、前記Ｌタンパク質が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を共有する、第２のポリヌクレオチドと
を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
実施形態７１． １種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
ａ．前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、前記ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼが、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を共有する、第２のポリヌクレオチドと
を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
実施形態７２． １種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
ａ．前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＭタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、前記Ｍタンパク質が、配列番号９と少なくとも９０％の同一性を共有する、第２のポリヌクレオチドと
を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
実施形態７３． 前記標的タンパク質が、ドーパミン受容体１（ＤＲＤ１）であり、必要に応じて、前記ＤＲＤ１が、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。
実施形態７４． 前記標的タンパク質が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）であり、必要に応じて、前記ＣＦＴＲが、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。
実施形態７５． 前記標的タンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－Ｉｎｈ）であり、必要に応じて、前記Ｃ１－Ｉｎｈが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。
実施形態７６． 前記標的タンパク質が、ＩＴＫであり、必要に応じて、前記ＩＴＫが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。
実施形態７７． 前記標的タンパク質が、ＮＡＤａｓｅであり、必要に応じて、前記ＮＡＤａｓｅが、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。

Claims (77)

  1. １種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
    ａ）前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
    ｂ）エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと
    を含み、
    ｉ）前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、および／または
    ｉｉ）前記エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択され、
    前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
  2. 前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記ＮＣＴ阻害剤が、ウイルスタンパク質である、請求項２に記載のシステム。
  4. 前記ＮＣＴ阻害剤が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
  5. 前記ＮＣＴ阻害剤が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質またはその機能的バリアントである、請求項４に記載のシステム。
  6. 前記ＮＣＴ阻害剤が、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼまたはその機能的バリアントである、請求項４に記載のシステム。
  7. 前記ＮＣＴ阻害剤が、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼまたはその機能的バリアントである、請求項４に記載のシステム。
  8. 前記ＮＣＴ阻害剤が、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質またはその機能的バリアントである、請求項４に記載のシステム。
  9. 前記ＮＣＴ阻害剤が、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質またはその機能的バリアントである、請求項４に記載のシステム。
  10. 前記ＮＣＴ阻害剤が、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質またはその機能的バリアントである、請求項４に記載のシステム。
  11. 前記ＮＣＴ阻害剤が、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質またはその機能的バリアントである、請求項４に記載のシステム。
  12. 前記ＮＣＴ阻害剤が、ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質またはその機能的バリアントである、請求項４に記載のシステム。
  13. 前記Ｌタンパク質が、タイラーウイルスのＬタンパク質またはその機能的バリアントである、請求項５に記載のシステム。
  14. 前記Ｌタンパク質が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項５に記載のシステム。
  15. 前記Ｌタンパク質が、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＬタンパク質またはその機能的バリアントである、請求項５に記載のシステム。
  16. 前記Ｌタンパク質が、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項５に記載のシステム。
  17. 前記Ｌタンパク質が、ポリオウイルスのＬタンパク質、ＨＲＶ１６のＬタンパク質、メンゴウイルスのＬタンパク質およびサフォルドウイルス２のＬタンパク質、またはそれらの機能的バリアントからなる群から選択される、請求項５に記載のシステム。
  18. 前記システムが、発現カセットを含む単一のベクターを含み、前記発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
  19. 前記発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと、前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターとを含む、請求項１８に記載のシステム。
  20. 前記発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結された共有されたプロモーターを含む、請求項１８に記載のシステム。
  21. 前記発現カセットが、リボソームスキッピング部位をコードするポリヌクレオチドによって連結された前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドを含むコードポリヌクレオチドを含み、前記コードポリヌクレオチドが、前記共有されたプロモーターに作動可能に連結されている、請求項２０に記載のシステム。
  22. 前記発現カセットが、コードポリヌクレオチドを含み、前記コードポリヌクレオチドが、リボソームスキッピング部位によって連結された前記エンハンサータンパク質および前記標的タンパク質をコードし、前記コードポリヌクレオチドが、前記共有されたプロモーターに作動可能に連結されている、請求項２０に記載のシステム。
  23. 前記発現カセットが、リボソームスキッピング部位によって連結された、前記標的タンパク質および前記エンハンサータンパク質の両方をコードする単一のメッセンジャーＲＮＡの転写のために構成されており、前記メッセンジャーＲＮＡの翻訳が、別個のポリペプチドとしての前記標的タンパク質および前記Ｌタンパク質の発現をもたらす、請求項１８～２２のいずれか一項に記載のシステム。
  24. １種のベクターを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のシステム。
  25. ａ）第１のプロモーターに作動可能に連結された前記第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、
    ｂ）第２のプロモーターに作動可能に連結された前記第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターと
    を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
  26. ２種のベクターを含む、請求項１～１７または請求項２５のいずれか一項に記載のシステム。
  27. 前記第１のポリヌクレオチドもしくは前記第２のポリヌクレオチドのいずれか一方またはその両方が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されている、請求項１～２６のいずれか一項に記載のシステム。
  28. 前記１種または複数種のベクターのうち少なくとも１種が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドのいずれか一方または両方の転写のために構成されたＴ７プロモーターを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のシステム。
  29. 前記１種または複数種のベクターのうち少なくとも１種が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のシステム。
  30. ａ）標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
    ｂ）エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと
    を含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのベクターであって、
    ｉ）前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、および／または
    ｉｉ）前記エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択され、
    前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、少なくとも１種のプロモーターに作動可能に連結されている、ベクター。
  31. 発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと、前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターとを含む、請求項３０に記載のベクター。
  32. 前記発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結された共有されたプロモーターを含む、請求項３０に記載のベクター。
  33. エンハンサータンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、標的タンパク質の発現のための真核細胞であって、
    ａ）前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、および／または
    ｂ）前記エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択され、
    前記外因性ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結されている、真核細胞。
  34. 前記ポリヌクレオチドが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されている、請求項３３に記載の真核細胞。
  35. 前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項３３または請求項３４に記載の真核細胞。
  36. 標的タンパク質の組換え発現のための方法であって、プロモーターに作動可能に連結された、前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の細胞に導入するステップを含む方法。
  37. 標的タンパク質の組換え発現のための方法であって、請求項１～２９のいずれか一項に記載のシステムまたは請求項３０～３２のいずれか一項に記載のベクターを真核細胞に導入するステップを含む方法。
  38. 前記標的タンパク質が、膜タンパク質である、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
  39. 前記膜タンパク質が、前記エンハンサータンパク質なしで発現された場合に観察される局在化と比較して、細胞膜への前記膜タンパク質の局在化が増加される、請求項３８に記載の方法。
  40. 請求項１～２９のいずれか一項に記載のシステムまたは請求項３０～３２のいずれか一項に記載のベクターの導入によって産生された真核細胞。
  41. 真核細胞への請求項１～２９のいずれか一項に記載のシステムまたは請求項３０～３２のいずれか一項に記載のベクターの導入によって発現された標的タンパク質。
  42. 真核細胞において標的タンパク質を発現させるための方法であって、プロモーターに作動可能に連結された、前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記真核細胞に導入するステップを含み、
    前記方法が、エンハンサータンパク質の共発現を利用して、前記標的タンパク質の発現レベル、溶解度および／または活性を増強し、
    ａ）前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、および／または
    ｂ）前記エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択される、方法。
  43. エンハンサータンパク質の前記共発現が、プロモーターに作動可能に連結された、前記エンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記真核細胞に導入するステップを含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記導入するステップ（単数または複数）が、１種もしくは複数のＤＮＡ分子による前記真核細胞のトランスフェクション、単一のウイルスベクターによる前記真核細胞の形質導入、および／または２種のウイルスベクターによる前記真核細胞の形質導入を含む、請求項４２または請求項４３に記載の方法。
  45. 前記標的タンパク質が、可溶性タンパク質である、請求項１～２９のいずれか一項に記載のシステム、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、請求項３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、請求項４０に記載の真核細胞、ならびに請求項４１に記載の標的タンパク質。
  46. 前記標的タンパク質が、分泌タンパク質である、請求項１～２９のいずれか一項に記載のシステム、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の細胞、または請求項３６～４４のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記標的タンパク質が、膜タンパク質である、請求項１～２９のいずれか一項に記載のシステム、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、請求項３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、請求項４０に記載の真核細胞、ならびに請求項４１に記載の標的タンパク質。
  48. 前記標的タンパク質が、ドーパミン受容体１（ＤＲＤ１）であり、必要に応じて、前記ＤＲＤ１が、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のシステム、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、請求項３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、請求項４０に記載の真核細胞、ならびに請求項４１に記載の標的タンパク質。
  49. 前記標的タンパク質が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）であり、必要に応じて、前記ＣＦＴＲが、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のシステム、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、請求項３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、請求項４０に記載の真核細胞、ならびに請求項４１に記載の標的タンパク質。
  50. 前記標的タンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－Ｉｎｈ）であり、必要に応じて、前記Ｃ１－Ｉｎｈが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のシステム、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、請求項３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、請求項４０に記載の真核細胞、ならびに請求項４１に記載の標的タンパク質。
  51. 前記標的タンパク質が、ＩＴＫであり、必要に応じて、前記ＩＴＫが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のシステム、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、請求項３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、請求項４０に記載の真核細胞、ならびに請求項４１に記載の標的タンパク質。
  52. 前記標的タンパク質が、ＮＡＤａｓｅであり、必要に応じて、前記ＮＡＤａｓｅが、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のシステム、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、請求項３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、請求項４０に記載の真核細胞、ならびに請求項４１に記載の標的タンパク質。
  53. 標的タンパク質に対する抗体を生成するための方法であって、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の細胞、請求項４０に記載の細胞、または請求項４１に記載の標的タンパク質で対象を免疫化するステップを含む方法。
  54. 前記標的タンパク質に特異的な免疫グロブリンタンパク質を発現する１つまたは複数の免疫細胞を単離するステップをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記１つまたは複数の免疫細胞から１つまたは複数のハイブリドーマを生成するステップを含む、請求項５３または請求項５４に記載の方法。
  56. 前記１つまたは複数の免疫細胞から１つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子をクローニングするステップを含む、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 細胞選別による抗体発見のための方法であって、
    ａ）前記細胞または標的タンパク質が標識されている、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の細胞、請求項４０に記載の真核細胞、または請求項４１に記載の標的タンパク質と、
    ｂ）組換え細胞が、抗体またはその抗原結合性断片をそれぞれ含むポリペプチドのライブラリーを発現する、組換え細胞の集団と
    を含む溶液を用意するステップと、
    前記標識された細胞または前記標識された標的タンパク質に結合された組換え細胞について選別することにより、前記溶液から１つまたは複数の組換え細胞を単離するステップと
    を含む方法。
  58. ファージディスプレイライブラリーをパニングするための方法であって、
    ａ）ファージディスプレイライブラリーを、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、請求項４０に記載の真核細胞、または請求項４１に記載の標的タンパク質と混合するステップと、
    ｂ）前記細胞または標的タンパク質に結合する前記ファージディスプレイライブラリーのメンバーを精製および／または富化するステップと
    を含む方法。
  59. ヒト細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞である、請求項３３～３５および４０のいずれか一項に記載の真核細胞。
  60. 真核細胞株である、請求項３３～３５、４０および５９のいずれか一項に記載の真核細胞。
  61. Ｂｃ ＨＲＯＣ２７７、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳＯ、５Ｐ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ、ｐｅｒＣ６細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、Ｐｉｃｈｉａ細胞またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞である、請求項３３～３５、４０、５９および６０のいずれか一項に記載の真核細胞。
  62. 前記真核細胞株が、安定した細胞株である、請求項６０に記載の真核細胞。
  63. 前記１種または複数種のベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、複製コンピテントアデノウイルスベクター、複製欠損アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたは非ウイルスプラスミドからなる群から選択される、請求項１～２９および４５～５２のいずれか一項に記載のシステム。
  64. 前記１種または複数種のベクターのうち少なくとも１種が、ＡＡＶベクターである、請求項６３に記載のシステム。
  65. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、複製コンピテントアデノウイルスベクター、複製欠損アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたは非ウイルスプラスミドである、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のベクター。
  66. ＡＡＶベクターである、請求項６５に記載のベクター。
  67. 前記ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質が、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＭタンパク質である、請求項４に記載のシステム。
  68. 前記Ｍタンパク質が、配列番号９と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項６７に記載のシステム。
  69. １種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
    ａ）前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
    ｂ）脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＬタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、前記Ｌタンパク質が、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を共有する、第２のポリヌクレオチドと
    を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
  70. １種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
    ａ）前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
    ｂ）タイラーウイルスのＬタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、前記Ｌタンパク質が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を共有する、第２のポリヌクレオチドと
    を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
  71. １種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
    ａ）前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
    ｂ）ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、前記ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼが、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を共有する、第２のポリヌクレオチドと
    を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
  72. １種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
    ａ）前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
    ｂ）水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＭタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、前記Ｍタンパク質が、配列番号９と少なくとも９０％の同一性を共有する、第２のポリヌクレオチドと
    を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
  73. 前記標的タンパク質が、ドーパミン受容体１（ＤＲＤ１）であり、必要に応じて、前記ＤＲＤ１が、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。
  74. 前記標的タンパク質が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）であり、必要に応じて、前記ＣＦＴＲが、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。
  75. 前記標的タンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－Ｉｎｈ）であり、必要に応じて、前記Ｃ１－Ｉｎｈが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。
  76. 前記標的タンパク質が、ＩＴＫであり、必要に応じて、前記ＩＴＫが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。
  77. 前記標的タンパク質が、ＮＡＤａｓｅであり、必要に応じて、前記ＮＡＤａｓｅが、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。
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