CN114761565A - 用于蛋白质表达的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种用于表达靶蛋白与增强子蛋白组合的系统。增强子蛋白可以是阻断核质转运的病毒蛋白。还提供了包含靶蛋白和增强子蛋白核酸序列的多核苷酸、载体和细胞。

Description

用于蛋白质表达的系统和方法

相关应用程序的交叉引用

本申请要求于2019年9月16日提交的美国临时专利申请序列号62/901,043和2020年2月5日提交的美国临时专利申请序列号62/970,628的权益，各专利申请的内容出于所有目的，通过引用将其全文并入本文。

序列表的并入

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背景技术

在培养中生长的真核细胞中蛋白质的重组表达在科学研究和医学中具有多种应用。重组产生的蛋白质(如抗体、酶、G蛋白偶联受体(GPCR)、分泌蛋白、离子通道、病毒蛋白和生长因子)用于制药工业开发新药(例如,发现小分子),作为治疗剂(例如、抗体和其他生物药物)，并作为分析方法的关键资产。除了在制药工业中的用途外，重组生产的哺乳动物蛋白质也越来越多地用于食品工业(例如，用于所谓的清洁肉类生产)。对于许多重组蛋白质来说，实现以功能形式的重组蛋白质表达仍然具有挑战性。

对可用于生产重组蛋白质的组合物和方法的需求仍未得到满足。

发明内容

本发明人已经认识到，某些增强子蛋白与靶蛋白的共表达改善重组产生的蛋白质。在多种实施方案中，所公开的组合物和方法表现出优于现有技术的一个或多个以下优点：(1)它们增加细胞系(例如，真核细胞系)内靶蛋白的蛋白质表达(产量)；(2)它们控制靶蛋白表达的调节；(3)它们表达表现出改善特性的靶蛋白(例如，降低的错误折叠、改变的活性、不正确的翻译后修饰和/或毒性)；(4)它们增加重组蛋白的正确折叠和/或高产量；(5)它们改善下游激活通路的性能(例如，GPCR信号传导)；和/或(6)增强子蛋白的共表达不影响靶蛋白的功能和/或细胞的下游代谢。本发明不受这些列举的优点的限制，因为一些实施方案没有表现出这些优点、表现出这些优点的一些或全部。

在一个方面，本公开提供了一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的系统，其包含一个或多个载体。多个载体(或一个载体)具有编码靶蛋白的第一多核苷酸和编码增强子蛋白的第二多核苷酸。增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂，和/或增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白。第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

在另一个方面，本公开提供了用于表达靶蛋白的真核细胞，其中所述细胞包含编码增强子蛋白的外源多核苷酸。增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂，和/或增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、冠状病毒ORF6蛋白、埃博拉病毒VP24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白。外源多核苷酸可操作地连接至启动子(任选地天然启动子或外源启动子)。在又一方面，本公开提供了一种用于重组表达靶蛋白的方法，所述方法包括将编码靶蛋白的多核苷酸引入该真核细胞中，该多核苷酸与启动子可操作地连接。在又一方面，本公开提供了一种用于重组表达靶蛋白的方法，所述方法包括将本公开的载体系统引入真核细胞中。在又一方面，本公开提供了通过将本公开的载体系统(或载体)引入真核细胞中产生的细胞。在又一方面，本公开提供了通过将本公开的载体系统(或载体)引入真核细胞中表达的蛋白质。在又一方面，本公开提供了一种在真核细胞中表达靶蛋白的方法，所述方法包括将编码靶蛋白的多核苷酸(所述多核苷酸与启动子可操作地连接)引入真核细胞中。该方法利用增强子蛋白的共表达来增强靶蛋白的表达水平、溶解度和/或活性。增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂，和/或增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、冠状病毒ORF6蛋白、埃博拉病毒VP24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白。

在另一个方面，本公开提供了产生针对靶蛋白的抗体的方法，所述方法包括用使用本公开的系统或方法产生的细胞或靶蛋白免疫受试者。在又一方面，本公开提供了一种通过细胞分选发现抗体的方法，所述方法包括提供溶液以及重组细胞群，其中所述溶液包含使用本公开的系统或方法产生的标记细胞或标记靶蛋白，所述重组细胞表达多肽文库，每个多肽文库包含抗体或其抗原结合片段；通过检测与标记细胞或标记靶蛋白结合的重组细胞，从溶液中分选一个或多个重组细胞。在另一方面，本公开提供了一种淘选噬菌体展示文库的方法，所述方法包括将噬菌体展示文库与使用本公开的系统或方法产生的细胞或靶蛋白混合；以及纯化和/或富集结合细胞或靶蛋白的噬菌体展示文库的成员。

进一步的方面和实施方案由随后的详细公开提供。本发明不受此概述的限制。

附图说明

图1描绘了在真核细胞中调节基因表达的六种说明性方法。

图2A-2Y是非限制性说明性构建体的示意图：EG1,图2A；EG2,图2B；EG3和EG4,图2C；EG5,图2D；EG6,图2E；EG7,图2F；EG8,图2G；EG9,图2H；EG10和EG11,图2I；EG12和EG4,图2J；EG10,图2K；EG13,图2L；EG14,图2M；EG15,图2N；EG16,图2O；EG17,图2P；EG18,图2Q；EG19,图2R；EG20,图2S；EG21,图2T；EG22,图2U；EG23,图2V；EG24,图2W；以及EG25,图2X。

图3A-3D显示了与对照载体EG1相比，使用构建体EG2(CMV-GFP-IRES-L)表达的表达GFP的细胞的光学和荧光显微镜图像。图3A：包含EG1的细胞的光学显微镜。图3B：包含EG1的细胞的荧光显微镜。图3C：包含EG2的细胞的光学显微镜。图3D：包含EG2的细胞的荧光显微镜。来自EG2构建体的荧光GFP蛋白的表达证明了该系统的可行性。与包含EG1的细胞(图3B)相比，包含EG2的细胞(图3D)中有害过表达的降低证明了通过引入L-蛋白改善了对GFP表达的调节。图3A-3D中的条代表400微米。

图4A-4D显示了与对照载体EG1相比，使用构建体EG3和EG4(分别为T7-IRES-L-GFP和CMV-T7)表达的表达GFP的细胞的光学和荧光显微镜图像。图4A：包含EG1的细胞的光学显微镜。图4B：包含EG1的细胞的荧光显微镜。图4C：包含EG3+EG4的细胞的光学显微镜。图4D：包含EG3+EG4的细胞的荧光显微镜。来自EG3+EG4构建体的荧光GFP蛋白的表达证明了该系统的可行性。与包含EG1的细胞(图4B)相比，包含EG3+EG4的细胞(图4D)中表达的降低证明了通过引入L-蛋白改善了对GFP表达的调节。图4A-4D中的条代表400微米。

图5A-5D显示来自构建体EG10(CMV-[DRD1-GFP])(图5A)或EG8(CMV-[DRD1-GFP]-IRES-L)(图5C)的表达DRD1-GFP融合物的细胞的荧光显微镜图像。使用构建体EG10表达了DRD1-GFP，但不能将受体转运到外膜，导致包涵体的形成(图5B，箭头)。使用构建体EG8表达了DRD1-GFP，并且可靠地转运到膜中，从而在外膜上产生高产量的高质量GPCR(图5D)。

图6A-6B显示来自构建体EG10(CMV-[DRD1-GFP])(图6A)或EG12和EG4(分别为T7-IRES-L-DRD1-GFP和CMV-T7)(图6B)表达的表达DRD1-GFP融合蛋白的细胞的荧光显微镜图像。使用EG10表达的DRD1-GFP被表达了，但不能正确地将受体转运到外膜，导致包涵体的形成(图6A，箭头)。使用EG12与EG4的组合表达的DRD1-GFP被表达了，并且可靠地转运到膜中，从而在外膜上产生高产量的高质量GPCR(图6B)。

图7显示来自抗CFTR蛋白印迹的结果。作为PCR产物或载体递送的L蛋白和CFTR共表达(虚线左侧)导致产量下降，但与没有共表达L蛋白的CFTR的对照表达相比，样品更加均一(虚线右侧)。

图8A-8B显示来自NADase的纯化和活性测试的结果。图8A显示了使用FLAG标签纯化的NADase亲和力的SDS-PAGE。(标准，SeeBlue2 plus；泳道2，裂解物/上样；泳道3，流过；泳道4，柱洗脱级分1；泳道5，柱洗脱级分2；泳道6，柱洗脱级分3；泳道7，柱洗脱级分4；8,树脂)。图8B显示了使用不同浓度的纯化NADase通过高效液相色谱法(HPLC)分析的NAD+转化活性的图。

图9A-9B显示了ITK的His-标签纯化的结果。图9A显示了使用His标签亲和力纯化的ITK的SDS-PAGE。泳道：泳道1，SeeBlue2+预染；泳道2，500ng GFP；泳道3，2μg ITK；泳道4，5μg ITK；泳道5，10μg ITK。图9B显示图9A的SDS-PAGE后的蛋白印迹分析，其中箭头指向ITK的单体和二聚体。

图10显示来自构建体EG10(CMV-[DRD1-GFP])(图10A)或EG10和EG11(图10B)表达的表达DRD1-GFP融合蛋白的细胞的荧光显微镜图像。箭头指向由EG10表达的DRD1-GFP形成的包涵体，其不能正确地将受体转运到外膜。

图11显示图，该图显示来自cAMP-Glo^TM测定法的发光结果，其表明在存在或不存在多巴胺的情况下，在HEK293细胞中表达E5构建体(CMV-DRD1-Strp)或E6构建体(CMV-DRD1-Strp-IRES-L)的细胞中的cAMP水平。较高的发光信号表明DRD1-Strep的功能活性较高。

图12显示了来自细胞的荧光显微镜的图像，所述细胞表达使用CMV启动子表达的DRD1-GFP融合蛋白(图12A)、使用CMV启动子表达的DRD1-GFP融合蛋白与L蛋白的组合(图12B)、使用EF1-α启动子表达的DRD1-GFP融合蛋白与L蛋白的组合(图12C)、以及使用SV40启动子表达的DRD1-GFP融合蛋白与L蛋白的组合(图12D)。底部小图显示了顶部小图中显示的一些细胞的放大视图。

图13显示了来自HEK293细胞的荧光显微镜的图像，所述HEK293细胞表达DRD1-GFP融合蛋白(图13A)、表达的DRD1-GFP融合蛋白与来自EMCV的L蛋白的组合(图13B)、表达的DRD1-GFP融合蛋白与来自Theiler氏病毒的L蛋白的组合(图13C)、表达的DRD1-GFP融合蛋白与脊髓灰质炎病毒的2A蛋白酶的组合(图13D)、以及表达的DRD1-GFP融合蛋白与水疱性口炎病毒的M蛋白的组合(图13E)。底部小图显示了顶部小图中显示的一些细胞的放大视图。

图14显示了来自CHO-K1细胞的荧光显微镜的图像，所述CHO-K1细胞表达DRD1-GFP融合蛋白(图14A)、表达的DRD1-GFP融合蛋白与来自Theiler氏病毒的L蛋白的组合(图14B)。箭头指向由EG10表达的DRD1-GFP形成的包涵体，其不能正确地将受体转运到外膜。

图15显示了来自CHO-K1细胞的荧光显微镜的图像，所述CHO-K1细胞表达DRD1-GFP融合蛋白(图15A)、以及表达的DRD1-GFP融合蛋白与来自EMCV的L蛋白的组合(图15B)。在图15A中，箭头指向由EG10表达的DRD1-GFP形成的包涵体，它不能正确地将受体转运到外膜中。在图15B中，箭头指向正确地定位和膜并入的DRD1-GFP。

图16显示了使用带镍亲和树脂(图16A)或尺寸排阻色谱法(图16B)纯化的HEK293细胞中表达的ITK蛋白的SDS-PAGE分析图像，以及使用带镍亲和树脂(图16C)或尺寸排阻色谱法(图16D)纯化的HEK293细胞中表达的ITK-L融合蛋白的SDS-PAGE分析图像。P1是指ITK的二聚体形式，而P2是指ITK的单体形式。

图17A显示在HEK293细胞中纯化的ITK蛋白，和纯化的表达的ITK蛋白与L蛋白组合的SDS-PAGE分析结果。图17B显示了P1和P2 ITK纯化的蛋白质样品的发光测量图，如SDSPAGE图像所示。

图18显示了使用带镍亲和树脂(图18A)或尺寸排阻色谱法(图18B)纯化的CHO细胞中表达的ITK蛋白的SDS-PAGE分析图像，以及使用带镍亲和树脂(图18C)或尺寸排阻色谱法(图18D)纯化的CHO细胞中表达的ITK蛋白与L蛋白组合的SDS-PAGE分析图像。P1是指ITK的二聚体形式，而P2是指ITK的单体形式。

图19显示了在CHO细胞中表达的P1和P2 ITK蛋白样品与L蛋白组合的发光测量图，其使用尺寸排阻色谱实验纯化。

图20A显示纯化的C1-抑制剂的SDS-PAGE分析图像，所述C1-抑制剂在不存在(左)或存在(右)增强子L蛋白的情况下表达。图20B显示了图，该图描绘在纯化的C1-抑制剂蛋白样品中存在的功能活性C1-抑制剂的浓度，如所示，所述C1-抑制剂蛋白在存在或不存在增强子L蛋白的情况下表达。使用商业的Quidel MicroVue Complement C1-Inhibitor PlusEnzyme Immunoassay，根据制造商的方案获得数据，使用含有C1-抑制剂的健康人血浆作为阳性对照(100％活性)。

图21显示了PSG1的离子交换色谱图。合并并浓缩含有蛋白质的级分(图21A，红色框)，然后通过SDS-PAGE和蛋白印迹确认PSG1的存在(图21B，红色箭头)。

具体实施方式

根据本公开，提供了可用于增强子蛋白与靶蛋白共表达的载体系统、载体或真核细胞。在一些实施方案中，提供了一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的系统，其包含一个或多个载体。在一些实施方案中，多个载体(或一个载体)具有编码靶蛋白的第一多核苷酸和编码增强子蛋白的第二多核苷酸。增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂，和/或增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白。第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

不受理论束缚，据信本公开的组合物和方法防止细胞的调节机制响应重组靶蛋白的表达而激活，并且其改善了靶蛋白的产量和/或功能。本公开的方法和系统可以抑制或干扰一种或多种细胞机制，包括但不限于：(1)抑制转录起始，(2)抑制转录终止和多聚腺苷酸化；(3)抑制mRNA加工和剪接，(4)抑制mRNA输出；(5)抑制翻译起始；以及(6)应激反应(图1)。

各种实施方案描述于图2A-2Y和表1。在一些实施方案中，第一载体包含编码靶蛋白的多核苷酸，第二载体包含编码增强子蛋白的多核苷酸。在其他实施方案中，单个载体包含编码靶蛋白和增强子蛋白的一个或多个多核苷酸。载体可以包含编码靶蛋白和增强子蛋白的单个多核苷酸。或者，一个或多个载体编码多于一个的增强子蛋白和/或多于一个的靶蛋白。

多核苷酸

本公开涉及用于表达一个或多个靶蛋白和一个或多个增强子蛋白的重组多核苷酸。使用本公开的组合物和方法，多核苷酸(或核酸或核酸分子)可包含一个或多个感兴趣基因并被递送至细胞(例如，真核细胞)。本公开的多核苷酸可以包括DNA、RNA和DNA-RNA杂合分子。在一些实施方案中，多核苷酸分离自天然来源；使用PCR扩增或化学合成等技术在体外制备；例如,通过重组DNA技术在体内制备；或通过任何适当的方法制备或获得。在一些实施方案中，多核苷酸具有任何形状(线性、环状等)或拓扑结构(单链、双链、线性、环状、超螺旋、扭转、切口等)。多核苷酸还可以包括核酸衍生物，例如肽核酸(PNAS)和多肽-核酸缀合物；具有至少一个化学修饰的糖残基、骨架、核苷酸间键、碱基、核苷酸、核苷或核苷酸类似物或衍生物的核酸；以及具有化学修饰的5'或3'末端的核酸；和具有两个或更多个这样的修饰的核酸。并非多核苷酸中的所有键都需要相同。

多核苷酸的示例包括但不限于寡核苷酸(包括但不限于反义寡核苷酸、核酶和可用于RNA干扰(RNAi)的寡核苷酸)、适体、核酸、人工染色体、克隆载体和构建体、表达载体和构建体、基因治疗载体和构建体、rRNA、tRNA、mRNA、mtRNA和tmRNA等。在一些实施方案中，多核苷酸是体外转录(IVT)的mRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是质粒。

当多核苷酸包含能够被转录和翻译(例如，DNA→RNA→蛋白质)或能够被翻译(RNA→蛋白质)的核酸序列以产生对应于所述蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列时，称该多核苷酸“编码”蛋白质。体内(例如，在真核细胞内)转录和/或翻译由内源或外源酶进行。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸的转录由真核细胞的内源聚合酶II(polII)进行。在一些实施方案中，在相同或不同载体上提供外源RNA聚合酶。在一些实施方案中，RNA聚合酶选自T3RNA聚合酶、T5 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶和H8 RNA聚合酶。

根据本公开的示例性多核苷酸包含编码靶蛋白的“第一多核苷酸”；编码增强子蛋白的“第二多核苷酸”；以及编码一个或多个靶蛋白、一个或多个增强子蛋白和/或一个或多个分离元件的“编码多核苷酸”。

靶蛋白

根据本公开的多核苷酸可以包含编码一个或多个靶蛋白的核酸序列。编码靶蛋白的核酸序列称为感兴趣基因(“GOI”)。靶蛋白是期望表达的任何蛋白。在一些实施方案中，蛋白质是膜蛋白。在一些实施方案中，当在参考表达系统中表达时，蛋白质的表达可能引起细胞毒性。在一些实施方案中，蛋白质是在传统表达系统中具有低产量表达的蛋白质。在一些实施方案中，根据所公开的方法，例如，与一个或多个增强子蛋白结合进行表达，蛋白质的表达或质量显著改善。在一些实施方案中，靶蛋白是AAV衣壳蛋白。AAV衣壳靶蛋白可以是天然AAV衣壳蛋白，或在天然AAV衣壳蛋白序列中包含一个或多个突变的突变AAV衣壳蛋白。

通过使用本公开的组合物和方法进行表达的靶蛋白可以包括与酶替代相关的蛋白，例如阿加糖苷酶β(Agalsidase beta)、阿加糖苷酶α(Agalsidase alfa)、伊米苷酶(Imiglucerase)、塔利葡糖酶α(Taligulcerase alfa)、维拉苷酶α(Velaglucerase alfa)、阿糖脑苷酶(Alglucerase)、Sebelipase alpha、拉罗尼酶(Laronidase)、艾度硫酸酯酶(Idursulfase)、Elosulfase alpha、加硫酶(Galsulfase)、阿糖苷酶α(Alglucosidasealpha)、因子VIII、C3抑制剂、Hurler和Hunter校正因子。在一些实施方案中，靶蛋白是生物仿制药。在一些实施方案中，靶蛋白可以是分泌蛋白，例如,C1-Inh。在一些实施方案中，靶蛋白是抗体。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用于酶生产。此类酶可用于生产临床测试试剂盒或其他诊断测定法。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用于生产治疗性蛋白。在一些实施方案中，蛋白质是人蛋白并且用于表达的宿主细胞是人细胞。

在一些实施方案中，靶蛋白选自阿巴瑞克、阿巴西普、阿昔单抗、阿达木单抗、阿柏西普、阿加糖苷酶β、阿必鲁肽、阿地白介素、阿法西普、阿仑单抗、阿糖脑苷酶、阿糖苷酶α、阿利罗单抗(Alirocumab)、阿利吉仑、α-1-蛋白酶抑制剂,阿替普酶,阿那白滞素、安塞司亭(Ancestim)、阿尼替普酶、人炭疽免疫球蛋白、抗血友病因子、抗凝血酶α、人抗凝血酶III、抗胸腺细胞球蛋白、抗胸腺细胞球蛋白(马)、抗胸腺细胞球蛋白(兔)、抑肽酶、阿西莫单抗、Asfotase Alfa、天冬酰胺酶、菊花欧文菌天冬酰胺酶、阿特珠单抗(Atezolizumab)、自体培养软骨细胞、巴利昔单抗、贝卡普勒明、贝拉西普、贝利木单抗、贝拉克坦(Beractant)、贝伐单抗、比伐卢定、博纳吐单抗(Blinatumomab)、A型肉毒杆菌毒素、B型肉毒杆菌毒素、本妥昔单抗(Brentuximab vedotin)、布罗达单抗(Brodalumab)、布舍瑞林(Buserelin)、C1酯酶抑制剂(人)、C1酯酶抑制剂、卡那单抗(Canakinumab)、卡那单抗、卡罗单抗(Capromab)、赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)、西妥昔单抗(Cetuximab)、绒毛膜促性腺激素α、绒毛膜促性腺激素(人)、绒毛膜促性腺激素、凝血因子IX、凝血因子VIIa、人凝血因子X、凝血因子XIIIA亚基、胶原酶、Conestat alfa、促肾上腺皮质激素、Cosyntropin、达珠单抗、达托霉素、达雷木单抗、达依波汀α(Darbepoetin alfa)、去纤维肽(Defibrotide)、地尼白介素(Denileukin diftitox)、地诺单抗(Denosumab)、地西芦丁(Desirudin)、恩杂鲁单抗(Dinutuximab)、链道霉α(Dornase alfa)、Drotrecogin alfa、度拉糖肽(Dulaglutide)、依库丽单抗(Eculizumab)、依法珠单抗(Efalizumab)、Efmoroctocog alfa、Elosulfasealfa、埃洛珠单抗(Elotuzumab)、恩夫伟地(Enfuvirtide)、依波汀α(Epoetin alfa)、依波汀ζ(Epoetin zeta)、依替巴肽(Eptifibatide)、依那西普(Etanercept)、依洛尤单抗(Evolocumab)、艾赛那肽(Exenatide)、因子IX复合物(人)、纤维蛋白原浓缩物(人)、纤溶素又名纤溶酶、非格司亭(Filgrastim)、非格司亭-sndz(Filgrastim-sndz)、促卵泡素α、促卵泡素β、加硫酶(Galsulfase)、胃内因子、吉妥珠单抗奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)、醋酸格拉替雷、重组胰高血糖素、Glucarpidase、戈利木单抗(Golimumab)、短杆菌肽D(Gramicidin D)、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎免疫球蛋白、人降钙素、人破伤风梭菌类毒素免疫球蛋白、人狂犬病病毒免疫球蛋白、人Rho(D)免疫球蛋白、人血清白蛋白、人水痘-带状疱疹免疫球蛋白、透明质酸酶、透明质酸酶、替依莫单抗(Ibritumomab)、替依莫单抗替西坦(Ibritumomab tiuxetan)、依达珠单抗(Idarucizumab)、艾杜硫酶(Idursulfase)、伊米苷酶(Imiglucerase)、人免疫球蛋白、英夫利昔单抗(Infliximab)、门冬胰岛素、牛胰岛素、德谷胰岛素、地特胰岛素、甘精胰岛素、赖谷胰岛素、赖脯胰岛素、猪胰岛素、普通胰岛素、普通胰岛素、胰岛素(猪)、低精蛋白胰岛素、重组干扰素alfa-2a、干扰素alfa-2b、干扰素alfacon-1、干扰素alfa-n1、干扰素alfa-n9、干扰素beta-1a、干扰素beta-1b、干扰素gamma-1b、静脉注射免疫球蛋白、易普利姆玛(Ipilimumab)、伊克珠单抗(Ixekizumab)、拉罗苷酶(Laronidase)、来诺格司亭(Lenograstim)、来匹卢定(Lepirudin)、亮丙瑞林(Leuprolide)、利拉鲁肽(Liraglutide)、Lucinactant、黄体刺激素α(Lutropin alfa)、黄体刺激素α、美卡舍明(Mecasermin)、促生育素(Menotropins)、美泊利单抗(Mepolizumab)、红细胞生成素β(Epoetin beta)、美曲普汀(Metreleptin)、莫罗莫纳布(Muromonab)、那他珠单抗(Natalizumab)、干扰素α(alpha interferon)、耐西妥珠单抗(Necitumumab)、奈西利肽(Nesiritide)、纳武单抗(Nivolumab)、奥比妥昔单抗(Obiltoxaximab)、奥宾尤妥珠单抗(Obinutuzumab)、Ocriplasmin、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、奥普瑞白介素(Oprelvekin)、OspA脂蛋白、催产素、帕利弗明(Palifermin)、帕丽珠单抗(Palivizumab)、胰脂肪酶、帕尼单抗(Panitumumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、猪肺磷脂注射液α(Poractant alfa)、普兰林肽(Pramlintide)、Preotact、人蛋白S、雷莫露单抗(Ramucirumab)、兰尼单抗(Ranibizumab)、拉布利酶(Rasburicase)、雷西巴单抗(Raxibacumab)、瑞替普酶(Reteplase)、利纳希普(Rilonacept)、利妥昔单抗(Rituximab)、罗米斯亭(Romiplostim)、Sacrosidase、鲑鱼降钙素、沙格司亭(Sargramostim)、沙妥莫单抗喷地肽(Satumomab Pendetide)、Sebelipasealfa、分泌素、苏金单抗(Secukinumab)、舍莫瑞林(Sermorelin)、血清白蛋白、碘化血清白蛋白、司妥昔单抗(Siltuximab)、西莫科克α(Simoctocog Alfa)、Sipuleucel-T、重组生长激素(Somatotropin Recombinant)、重组生长激素(Somatropin recombinant)、链激酶、舒洛地特(Sulodexide)、Susoctocog alfa、塔利苷酶α(Taliglucerase alfa)、替度鲁肽(Teduglutide)、替考拉宁(Teicoplanin)、替耐普酶(Tenecteplase)、特立帕肽(Teriparatide)、替沙莫林(Tesamorelin)、血栓调节蛋白α、胸腺法新(Thymalfasin)、甲状腺球蛋白、甲状腺刺激激素α、甲状腺刺激激素α、Thyrotropin Alfa、托珠单抗(Tocilizumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、曲妥单抗(Trastuzumab)、结核菌素纯化蛋白衍生物、Turoctocog alfa、尿促卵泡素、尿激酶、伏特克单抗(Ustekinumab)、加压素、维多珠单抗(Vedolizumab)和维拉苷酶α。

在一些实施方案中，靶蛋白是但不限于可溶性蛋白、分泌蛋白或膜蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白是但不限于多巴胺受体1(DRD1)、囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)、C1酯酶抑制剂(C1-Inh)、IL2诱导型T细胞激酶(ITK)或NADase。在一些实施方案中，NADase是SARM1。在一些实施方案中，SARM1是代表成熟蛋白的缺失变体。

在一些实施方案中，靶蛋白是膜蛋白。示例性的膜蛋白包括离子通道、间隙连接、离子型受体、转运蛋白、整合膜蛋白，例如细胞表面受体(例如,G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸激酶受体、整联蛋白等)、响应信号传导在细胞膜和胞质之间穿梭的蛋白(例如Ras、Rac、Raf、Gα亚基、捕获蛋白、Src和其他效应蛋白)等。在一些实施方案中，膜蛋白是G蛋白偶联受体。在一些实施方案中，靶蛋白是七-(穿过)-跨膜结构域受体、7TM受体、七螺旋受体、蛇形受体或G蛋白连接受体(GPLR)。在一些实施方案中，靶蛋白是A类GPCR、B类GPCR、C类GPCR、D类GPCR、E类GPCR或F类GPCR。在一些实施方案中，靶蛋白是1类GPCR、2类GPCR、3类GPCR、4类GPCR、5类GPCR或6类GPCR。在一些实施方案中，靶蛋白是视紫红质样GPCR、分泌素受体家族GPCR、代谢型谷氨酸/信息素GPCR、真菌交配信息素受体、环状AMP受体或卷曲/平滑GPCR。

在一些实施方案中，靶蛋白是核苷酶、NAD+核苷酶、水解酶、糖基化酶、水解N-糖基化合物的糖基化酶、NAD+糖基水解酶、NADase、DPNase、DPN水解酶、NAD水解酶、二磷酸吡啶核苷酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸核苷酶、NAD糖水解酶、NAD核苷酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸糖水解酶。在一些实施方案中，靶蛋白是参与烟酸盐和烟酰胺代谢和钙信号传导通路的酶。

在一些实施方案中，本公开提供了通过将本公开的载体系统(或载体)引入真核细胞中而表达的蛋白。在一些实施方案中，本公开提供了由包含本公开的多核苷酸的真核细胞产生的靶蛋白。

增强子蛋白

本公开涉及靶蛋白和增强子蛋白的共表达。在一些实施方案中，增强子蛋白可以改善靶蛋白表达的一个或多个方面，包括但不限于产量、质量、折叠、翻译后修饰、活性、定位和下游活性，或可以减少错误折叠、改变的活性、不正确的翻译后修饰和/或毒性中的一种或多种。

在一些实施方案中，增强子蛋白是核孔阻断病毒蛋白。在一些实施方案中，增强子蛋白是能够阻断核孔从而抑制核质转运蛋白(“NCT”)的天然或合成肽。在一些实施方案中，增强子蛋白是病毒蛋白。在一些方面，病毒蛋白是NCT抑制剂。

在一些实施方案中，增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、冠状病毒ORF6蛋白、埃博拉病毒VP24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白。

增强子蛋白是本文公开的任何蛋白的功能变体。如本文所用，术语“功能变体”是指与原始蛋白同源的蛋白和/或与原始蛋白共有基本的序列相似性的蛋白(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性)，并且具有原始蛋白的一种或多种功能特征。例如，作为NCT抑制剂的增强子蛋白的功能变体保留了抑制NCT的能力。

在一些实施方案中，增强子蛋白是来自小核糖核酸病毒的前导(L)蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，增强子蛋白是来自心病毒、肝病毒或口疮病毒属的前导蛋白。例如，增强子蛋白可以来自牛鼻炎A病毒、牛鼻炎B病毒、马鼻炎A病毒、口蹄疫病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、喜马拉雅旱獭肝病毒、霍比病毒(Phopivirus)、心病毒A、心病毒B、Theiler氏鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)、Vilyuisk人脑脊髓炎病毒(VHEV)、Theiler样大鼠病毒(TRV)或Saffold病毒(SAF-V)。

在一些实施方案中，增强子蛋白是Theiler氏病毒的L蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，L蛋白与SEQ ID NO：1共有至少90％的同一性。在一些实施方案中，增强子蛋白可包含SEQ ID NO:1、由其组成、或基本上由其组成。增强子蛋白可以与SEQ ID NO:1共有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性。

在一些实施方案中，L蛋白是脑心肌炎病毒(EMCV)的L蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，L蛋白可以与SEQ ID NO：2共有至少90％的同一性。在一些实施方案中，增强子蛋白可包含SEQ ID NO:2、由其组成、或基本上由其组成。增强子蛋白可以与SEQ ID NO:2共有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性。

在一些实施方案中，L蛋白选自脊髓灰质炎病毒的L蛋白、HRV16的L蛋白、孟戈病毒的L蛋白和Saffold病毒2的L蛋白或其功能变体。

在一些实施方案中，增强子蛋白是小核糖核酸病毒2A蛋白酶或其功能变体。在一些实施方案中，增强子蛋白是来自肠病毒、鼻病毒、口疮病毒或心病毒的2A蛋白酶。

在一些实施方案中，增强子蛋白是鼻病毒3C蛋白酶或其功能变体。在一些实施方案中，增强子蛋白是Picornain 3C蛋白酶。在一些实施方案中，增强子蛋白是来自肠病毒、鼻病毒、口疮病毒或心病毒的3C蛋白酶。例如，在一些非限制性实施方案中，增强子蛋白是来自脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒或甲肝病毒的3C蛋白酶。

在一些实施方案中，增强子蛋白是冠状病毒ORF6蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，增强子蛋白是破坏核输入复合物形成和/或破坏STAT1转运入细胞核的病毒蛋白。

在一些实施方案中，增强子蛋白是埃博拉病毒VP24蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，增强子蛋白是埃博拉病毒VP40蛋白或VP35蛋白。在一些实施方案中，增强子蛋白是与输入蛋白核胞浆转运蛋白-α(KPNA)结合的病毒蛋白。在一些实施方案中，增强子蛋白是抑制STAT1与KPNA结合的病毒蛋白。

在一些实施方案中，增强子蛋白是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，增强子蛋白是与核孔复合物相互作用的病毒衣壳蛋白。

在一些实施方案中，增强子蛋白是单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，增强子蛋白是HSV ORF57蛋白。

在一些实施方案中，增强子蛋白是弹状病毒基质(M)蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，增强子蛋白是来自细胞杆状病毒(Cytorhabdovirus)、双链弧菌病毒(Dichorhavirus)、短叶病毒(Ephemerovirus)、狂犬病病毒(Lyssavirus)、弹状病毒(Novirhabdovirus)、核型弹状病毒(Nucleorhabdovirus)、似杆状病毒(Perhabdovirus)、西格玛病毒(Sigmavirus)、螺旋病毒(Sprivivirus)、蒂布罗病毒(Tibrovirus)、图帕病毒(Tupavirus)、水痘病毒(Varicosavirus)或水疱病毒(Vesiculovirus)的M蛋白。

在一些实施方案中，增强子蛋白选自表1中列出的蛋白或其功能变体。编码增强子蛋白的多核苷酸可以编码与表1中列出的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。增强子蛋白的氨基酸序列可以与表1中列出的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同。增强子蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，增强子蛋白可具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含表1所列氨基酸序列之一、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，增强子蛋白可具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

表1：示例性增强子蛋白

融合蛋白

在一些实施方案中，靶蛋白和增强子蛋白包含在单个融合蛋白中。在一些实施方案中，融合蛋白可以包含连接元件。在一些实施方案中，连接元件可以包含用于酶促切割的切割位点。在其他实施方案中，融合蛋白或连接元件不包含切割位点并且表达的融合蛋白包含靶蛋白和增强子蛋白。

蛋白质修饰

可以修饰靶蛋白、增强子蛋白和/或融合蛋白或编码它们的多核苷酸，以包含一个或多个标志物、标记或标签。例如，在一些实施方案中，本公开的蛋白质可以用任何允许其检测的标记进行标记，例如，放射性标记、荧光剂、生物素、肽标签、酶片段等。蛋白质可以包含亲和标签，例如，His-标签、FLAG标签、GST-标签、Strep-标签、生物素-标签、免疫球蛋白结合结构域，例如，IgG结合结构域、钙调蛋白结合肽等。在一些实施方案中，FLAG标签包含氨基酸序列DYKDDDDK(SEQ ID NO:21)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含选择标志物，例如，抗生素抗性标志物。

聚合酶

对于编码靶蛋白和增强子蛋白的多核苷酸的转录，可以使用内源或外源聚合酶。在一些实施方案中，多核苷酸的转录由细胞(例如，真核细胞)所包含的天然聚合酶进行。可替代地或另外地使用病毒聚合酶。在一些实施方案中，病毒启动子与一种或多种病毒聚合酶组合使用。在一些实施方案中，真核启动子与一种或多种真核聚合酶组合使用。示例性病毒聚合酶包括但不限于T7、T5、EMCV、HIV、流感、SP6、CMV、T3、T1、SP01、SP2、Phi15等。病毒聚合酶是RNA引发或加帽聚合酶。在一些实施方案中，IRES元件与病毒聚合酶结合使用。

根据本公开的一个或多个载体可以包含编码聚合酶的多核苷酸序列。在一些实施方案中，聚合酶是病毒聚合酶。编码聚合酶的多核苷酸序列可以被载体包含，所述载体包含靶蛋白编码多核苷酸和/或增强子蛋白编码多核苷酸。在一些实施方案中，聚合酶可以被载体包含，所述载体不包含靶蛋白或增强子蛋白编码多核苷酸。

在一些实施方案中，本文公开的系统、方法或细胞所包含的一个或多个载体中的至少一个可以包含编码T7 RNA聚合酶的多核苷酸序列。

载体

在一些方面，本公开涉及包含用于表达一个或多个靶蛋白和一个或多个增强子蛋白的核酸序列的载体。在一些实施方案中，多个载体(或一个载体)具有编码靶蛋白的第一多核苷酸和编码增强子蛋白的第二多核苷酸。在一些实施方案中，多个载体(或一个载体)包含本文公开的任何一种表达盒，例如，包含5'反向末端重复(ITR)的腺相关病毒(AAV)表达盒、任何一种本文公开的用于表达一个或多个靶蛋白和一个或多个增强子蛋白的核酸序列、和3'ITR、和/或编码AAV衣壳蛋白的核酸序列。

根据本公开使用的载体可以包括本领域已知的任何载体。在某些实施方案中，载体是能够表达感兴趣的蛋白或多肽或其片段的任何重组载体，例如腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、具有复制能力的腺病毒载体、复制缺陷型腺病毒载体、疱疹病毒载体、杆状病毒载体或非病毒质粒。在一些实施方案中，载体是病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、fosmid、噬菌体或人工染色体。在一些实施方案中，载体是病毒载体，包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体。在一些实施方案中，载体是细菌人工染色体(BAC)、质粒、噬菌体P1衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)。

本文公开的细胞、系统和方法可以包含一个载体。在一些实施方案中，细胞、系统和方法可以包含单个载体，所述载体包含编码靶蛋白的第一多核苷酸和编码增强子蛋白的第二多核苷酸。

本文公开的细胞、系统和方法可以包含两个载体。在一些实施方案中，细胞、系统和方法可以包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含可操作地连接到第一启动子的第一多核苷酸；所述第二载体包含可操作地连接到第二启动子的第二多核苷酸。

本文公开的细胞、系统和方法可包含多于两个的载体，其中所述载体可以多种组合或构型编码多个靶蛋白和多个增强子蛋白。

在一些实施方案中，提供了包含本公开的一个或多个载体的细胞。在一些实施方案中，提供了包含本公开的多核苷酸的细胞。在一些实施方案中，提供了表达本公开的一个或多个靶蛋白和一个或多个增强子蛋白的细胞。

启动子

根据本公开的载体可以包含一个或多个启动子。术语“启动子”是指位于转录起始上游或下游的区域或序列，所述转录起始参与RNA聚合酶和其他蛋白的识别和结合以启动转录。根据本公开的多核苷酸或载体可以包含一个或多个启动子。启动子可以是本领域已知的任何启动子。启动子可以是正向启动子或反向启动子。在一些实施方案中，启动子是哺乳动物启动子。在一些实施方案中，一个或多个启动子是天然启动子。在一些实施方案中，一个或多个启动子是非天然启动子。在一些实施方案中，一个或多个启动子是非哺乳动物启动子。用于所公开的组合物和方法的RNA启动子的非限制性示例包括U1、人延伸因子-1α(EF-1α)、巨细胞病毒(CMV)、人泛素、脾病灶形成病毒(SFFV)、U6、H1、tRNA^Lys、tRNA^Ser和tRNA^Arg、CAG、PGK、TRE、UAS、UbC、SV40、T7、Sp6、lac、araBad、trp和Ptac启动子。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指核酸序列中通过可操作能力而非物理位置连接的元件或结构。元件或结构能够完成期望的操作、或特征在于完成期望的操作。本领域普通技术人员认识到，核酸序列中的元件或结构不必以串联或相邻顺序可操作地连接。

在一些实施方案中，启动子组成型地驱动一个或多个靶蛋白和/或一个或多个增强子蛋白的表达；即，启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。诱导型启动子不受限制，可以是本领域已知的任何诱导型启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子的表达通过一个或多个环境或化学刺激的存在来促进。例如，在一些实施方案中，诱导型启动子在化学分子或环境刺激的存在下驱动表达，所述化学分子例如四环素及其衍生物(例如强力霉素)、cumate及其衍生物；所述环境刺激例如热或光。

在一些实施方案中，诱导型启动子是基于四环素控制的转录激活系统、cumate阻遏系统、lac阻遏系统、阿拉伯糖调节的pBad启动子系统、醇调节的AlcA启动子系统、类固醇调节的LexA启动子系统、热休克诱导型Hsp70或Hsp90启动子系统、或蓝光诱导型pR启动子系统。因此，在一些实施方案中，诱导型启动子包含与四环素反式激活因子如四环素反应元件结合的核酸序列。在一些实施方案中，诱导型启动子的表达在四环素及其衍生物的存在下被开启(Tet-On系统)，而在其他实施方案中，诱导型启动子的表达在四环素及其衍生物的存在下被关闭(Tet-Off系统)。在一些实施方案中，诱导型启动子基于cumate阻遏系统。因此，在一些实施方案中，诱导型启动子包含与CymR阻遏物结合的核酸序列，例如cumate操纵子序列。

在一些实施方案中，诱导型启动子的表达由转录因子的二聚化驱动。在一些实施方案中，转录是细菌EL222，其在蓝光存在下二聚化以由C120启动子或其调节元件驱动表达。在一些实施方案中，诱导型启动子包含源自C120启动子或调节元件的核酸序列。

根据本公开的载体可以包含一个或多个病毒启动子，其能够通过一个或多个病毒聚合酶转录一个或多个多核苷酸。在一些实施方案中，例如，载体可以包含T7启动子，其被配置用于通过T7 RNA聚合酶转录第一多核苷酸(即，靶蛋白编码多核苷酸)或第二多核苷酸(即，增强子蛋白编码多核苷酸)中的任一或两者。

表达盒

根据本公开的一个或多个载体可以包含一个或多个表达盒。如本文所用的短语“表达盒”是指核酸分子的限定片段，其包含产生另一核酸或由该核酸分子编码的蛋白所需的最少元件。在一些实施方案中，载体可以包含表达盒，所述表达盒包含编码靶蛋白的第一多核苷酸和编码增强子蛋白的第二多核苷酸。在一些实施方案中，表达盒包含与第一多核苷酸可操作地连接的第一启动子；和与第二多核苷酸可操作地连接的第二启动子。在一些实施方案中，表达盒包含与第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接的共有启动子。

在一些实施方案中，表达盒包含编码多核苷酸，所述编码多核苷酸包含通过编码分隔元件的多核苷酸(例如，核糖体跳跃位点或2A元件)连接的第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述编码多核苷酸与共有启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，表达盒包含编码多核苷酸，所述编码多核苷酸编码通过分隔元件(例如，核糖体跳跃位点或2A元件)连接的增强子蛋白和靶蛋白，所述编码多核苷酸与共有启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，表达盒被配置用于转录单个信使RNA，所述单个信使RNA编码通过分隔元件(例如，核糖体跳跃位点或2A元件)连接的靶蛋白和增强子蛋白；其中信使RNA的翻译导致靶蛋白和增强子蛋白(例如，L蛋白)作为不同的多肽表达。

在一些实施方案中，表达盒包含编码多核苷酸，所述编码多核苷酸编码作为融合蛋白的增强子蛋白和靶蛋白，其中具有或不具有多肽接头，任选地其中多肽接头是可切割接头。

在一些实施方案中，表达盒是包含5'反向末端重复(ITR)的腺相关病毒(AAV)表达盒、任何一种本文公开的用于表达一个或多个靶蛋白和一个或多个增强子蛋白的核酸序列、和3'ITR。在一些实施方案中，AAV表达盒包含Kozak序列、多聚腺苷酸化序列和/或填充序列。

分隔元件

在一些实施方案中，根据本公开的一个或多个靶蛋白和一个或多个增强子蛋白在相同的载体上编码或在单独的载体上编码。在一些实施方案中，如果用于一个或多个靶蛋白和一个或多个增强子蛋白的核酸序列包含在同一载体中，则该载体可以包含用于分开所表达蛋白的分隔元件。在各种实施方案中，载体是双顺反子载体或多顺反子载体。分隔元件可以是内部核糖体进入位点(IRES)或2A元件。在一些实施方案中，载体可以包含编码2A自切割肽的核酸。示例性的2A自切割肽包括P2A、E2A、F2A和T2A。

在一些实施方案中，第一多核苷酸或第二多核苷酸或两者可操作地连接至内部核糖体进入位点(IRES)。

在一些实施方案中，第一多核苷酸或第二多核苷酸或两者可操作地连接至2A元件。

重组AAV颗粒

本公开提供了包含本文公开的任何一种表达盒的重组病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、具有复制能力的腺病毒载体、复制缺陷型腺病毒载体、疱疹病毒载体或杆状病毒载体。

本公开提供了用于生产重组AAV(rAAV)载体的方法，所述方法包括使腺相关病毒(AAV)生产细胞(例如，HEK293细胞)与本文公开的任何一种AAV表达盒接触，或与包含本文公开的任何一种AAV表达盒的载体(例如，质粒或杆粒)接触。在一些实施方案中，本文公开的载体(例如，质粒或杆粒)进一步包含一个或多个在AAV生产期间使用的遗传元件，包括，例如，AAV rep和cap基因，和/或编码辅助病毒蛋白序列。

在一些实施方案中，所述方法包括使AAV生产细胞与一个或多个另外的质粒接触，所述质粒包含例如，AAV rep和cap基因，和/或编码辅助病毒蛋白序列。在一些实施方案中，所述方法还包括将AAV生产细胞维持在AAV产生的条件下。

本公开提供了使用本文公开的任何一种方法生产的rAAV载体。生产的rAAV载体可以是任何血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽AAV或牛AAV。在一些实施方案中，与天然AAV衣壳相比，产生的重组AAV载体可以包含一个或多个氨基酸修饰(例如，取代和/或缺失)。在一些实施方案中，重组AAV载体是单链AAV(ssAAV)。在一些实施方案中，重组AAV载体是自身互补AAV(scAAV)。

本公开进一步提供了组合物，例如药物组合物，其包含本文公开的任何一种表达盒、任何一种载体(例如，任何一种重组AAV载体)或任何一种AAV生产细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体。

本发明还提供了一种疫苗组合物，其包含本文公开的任何一种表达盒、任何一种载体(例如任何一种重组AAV载体)或任何一种AAV生产细胞，其中靶蛋白是在受试者中表达后，能够在受试者中引发针对病原体的免疫反应、或具有其他治疗性质的蛋白质。

在一些实施方案中，靶蛋白来源于病原体。病原体可以是病毒、细菌、真菌或寄生虫。在一些实施方案中，病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV-1、MERS-CoV、基孔肯雅病毒、非洲猪瘟病毒、登革热病毒、寨卡病毒、流感病毒(例如，A、B、C)、人免疫缺陷病毒(HIV)、埃博拉病毒、肝炎病毒(例如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎)、1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、2型单纯疱疹病毒(HSV-2)和人乳头瘤病毒。在一些实施方案中，病原寄生虫是恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)。在一些实施方案中，病原细菌选自：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、立克次氏次体(Rickettsia rickettsia)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和霍乱弧菌(Vibriocholera)。在一些实施方案中，疫苗组合物包含一种或多种佐剂。

转染、转导、转化

术语“转染”、“转导”和“转化”是指将核酸引入细胞(例如，真核细胞)的过程。可以使用本领域已知的任何方法将本文所述的多核苷酸或载体引入细胞(例如，真核细胞)中。可以通过多种方法将多核苷酸或载体引入细胞，这些方法在本领域中是众所周知的并且部分地基于特定的宿主细胞进行选择。例如，可以使用化学、物理、生物或病毒方法将多核苷酸引入细胞中。将多核苷酸或载体引入细胞的方法包括但不限于使用磷酸钙、树枝状大分子、阳离子聚合物、脂质转染、fugene、肽树枝状大分子、电穿孔、细胞挤压、声穿孔、光转染、原生质体融合、穿刺(impalefection)、流体动力学递送、基因枪、磁转染、粒子轰击、核转染和病毒转导。

可以通过多种方法将包含靶向DNA和/或编码靶蛋白和增强子蛋白的核酸的载体引入细胞中(例如、注射、转化、转染、直接摄取、弹丸轰击、脂质体)。使用表达载体可以在细胞中稳定或瞬时表达靶蛋白和增强子蛋白。在真核细胞中表达的技术为本领域技术人员所熟知。(参见Current Protocols in Human Genetics:Chapter 12“Vector Therapy”&Chapter 13“Delivery Systems for Gene Therapy”)。

在一些实施方案中，可以使用标准方法通过插入基因组将多核苷酸或载体引入宿主细胞，以产生稳定的细胞系，任选地通过使用慢病毒转染、杆状病毒基因转移到哺乳动物细胞(BacMam)、逆转录病毒转染、CRISPR/Cas9、和/或转座子。在一些实施方案中，可以将多核苷酸或载体引入宿主细胞中用于瞬时转染。在一些实施方案中，可以通过使用病毒载体、辅助脂质，例如，PEI、Lipofectamine和/或Fectamine 293实现瞬时转染。遗传元件可以作为例如载体上的DNA编码或作为来自例如PCR的RNA编码。遗传元件可以分开在不同的载体中、或组合在同一载体上。

细胞、细胞系、宿主细胞

本公开的另一方面涉及包含编码一个或多个靶蛋白和一个或多个增强子蛋白的多核苷酸和/或载体的细胞。多核苷酸、载体、靶蛋白和增强子蛋白可以是本文所述的那些中的任何。本公开进一步提供了包含编码一个或多个增强子蛋白的多核苷酸和/或载体的细胞或细胞系；这些细胞或细胞系在本文中可称为“超级生产细胞”或“超级生产细胞系”。在一些实施方案中，超级生产细胞还包含编码一个或多个靶蛋白的多核苷酸和/或载体。不受任何一种理论的束缚，认为表达一个或多个本文公开的增强子蛋白的细胞能够用作表达一个或多个靶蛋白的宿主细胞。

在一些实施方案中，细胞是任何真核细胞或细胞系。所公开的多核苷酸、载体、系统和方法可用于任何真核细胞系。真核细胞系可以包括哺乳动物细胞系，例如人和动物细胞系。真核细胞系还可以包括昆虫、植物或真菌细胞系。此类细胞或由此类细胞产生的细胞系的非限制性示例包括Bc HROC277、COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NSO、5P2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)、和perC6细胞以及昆虫细胞，如草地贪夜蛾(Spodoptera fugiperda，SF，例如,Sf9)或真菌细胞，如酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces)。

在一些实施方案中，用于表达靶蛋白和增强子蛋白的细胞或细胞系是人细胞或细胞系。在某些方面，人细胞系的选择是有益的，例如，对于靶蛋白中的翻译后修饰(“PTM”)是有益的，例如糖基化、磷酸化、二硫键。在一些实施方案中，人细胞或细胞系用于表达人靶蛋白。

在一些实施方案中，细胞系是稳定的细胞系。在一些实施方案中，用本文公开的任何一个或多个多核苷酸和/或载体瞬时转染细胞。

在一些实施方案中，本公开提供了用于表达靶蛋白的真核细胞，其中所述细胞包含编码增强子蛋白的外源多核苷酸。在一些实施方案中，编码增强子蛋白的外源多核苷酸被瞬时转导和/或不整合到细胞基因组中。在一些实施方案中，编码增强子蛋白的外源多核苷酸是稳定整合的。在一些实施方案中，增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂。在一些实施方案中，增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、冠状病毒ORF6蛋白、埃博拉病毒VP24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白。外源多核苷酸可操作地连接至启动子(任选地天然启动子或外源启动子)。在一些实施方案中，多核苷酸可操作地连接至内部核糖体进入位点(IRES)。

蛋白质表达的方法

本公开提供了一种在真核细胞中表达靶蛋白的方法。所述方法可以包括将编码靶蛋白的多核苷酸(可操作地连接到启动子的多核苷酸)引入真核细胞。该方法利用增强子蛋白的共表达来增强靶蛋白的表达水平、溶解度和/或活性。

在一些实施方案中，根据本公开的方法与一个或多个增强子组合表达的靶蛋白的表达水平高于在不存在一个或多个增强子的情况下表达的靶蛋白的表达水平。在一些实施方案中，与不存在一个或多个增强子的情况下表达的靶蛋白的表达水平相比，根据本公开的方法与一个或多个增强子组合表达的靶蛋白的表达水平高至少约1.1倍(例如，约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍)。

在一些实施方案中，根据本公开的方法与一个或多个增强子组合表达的靶蛋白的活性高于在不存在一个或多个增强子的情况下表达的靶蛋白的活性。在一些实施方案中，与不存在一个或多个增强子的情况下表达的靶蛋白的活性相比，根据本公开的方法与一个或多个增强子组合表达的靶蛋白的活性高至少约1.1倍(例如，约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍)。

在一些实施方案中，增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂。在一些实施方案中，增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、冠状病毒ORF6蛋白、埃博拉病毒VP24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白。

在一些方面，本公开涉及通过使用包含编码一个或多个靶蛋白和一个或多个增强子蛋白的多核苷酸的细胞来生产靶蛋白的方法。在一些实施方案中，所述方法在包含一个或多个载体的真核细胞中进行。在一些实施方案中，所述方法使用前述部分中描述的多核苷酸、载体和细胞进行。在一些实施方案中，多个载体(或一个载体)可以具有编码靶蛋白的第一多核苷酸和编码增强子蛋白的第二多核苷酸。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

还提供了一种重组表达靶蛋白的方法，所述方法包括将编码靶蛋白的多核苷酸引入真核细胞中，该多核苷酸与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，靶蛋白表达方法包括将本公开的载体系统引入真核细胞。在一些实施方案中，靶蛋白是膜蛋白。在一些实施方案中，与在没有增强子蛋白的情况下表达膜蛋白时观察到的定位相比，膜蛋白在细胞膜上的定位增加。在一些实施方案中，与不存在一个或多个增强子的情况下表达的膜相关靶蛋白的水平相比，根据本公开的方法与一个或多个增强子组合表达的膜相关靶蛋白的水平高至少约1.1倍(例如，约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍)。

在一些实施方案中，使用本文公开的方法表达本文公开的一个或多个增强子蛋白可能与宿主细胞的细胞周期相关、有关系或导致对宿主细胞的细胞周期的影响，使得与不表达一个或多个增强子蛋白的野生型细胞相比，在特定细胞周期阶段表达增强子的宿主细胞的数量改变了。在一些实施方案中，使用本文公开的方法表达本文公开的一个或多个增强子蛋白可能与宿主细胞在特定细胞周期阶段的停滞相关、有关系或导致宿主细胞在特定细胞周期阶段的停滞。在一些实施方案中，特定细胞阶段是细胞周期的生长期，例如G1、S或G2期。在一些实施方案中，使用本文公开的方法表达本文公开的一个或多个增强子蛋白可能与细胞中克隆漂移的降低或消除相关、有关系或导致细胞中克隆漂移的降低或消除。

在一些实施方案中，所述方法可以包括将编码增强子蛋白的多核苷酸与启动子可操作地连接地引入真核细胞中。在一些实施方案中，所述方法可以包括用一个或多个DNA分子转染真核细胞、用单个病毒载体转导真核细胞和/或用两个或更多个病毒载体转导真核细胞。

下游应用

在一些实施方案中，通过使用本发明的组合物、系统和方法产生的靶蛋白和表达此类蛋白的细胞被分离、纯化和/或用于下游应用。示例性的应用包括但不限于小分子筛选、结构确定(例如、X射线晶体学、低温电子显微镜等)、活性测定法、治疗、酶替代疗法、筛选测定法、诊断测定法、临床测试试剂盒、药物发现、抗体发现等。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用于产生抗体或产生用于抗体筛选测定法的抗原。在一些实施方案中，表达靶蛋白的细胞可以用作测定系统来筛选，例如，细胞相互作用、抗体结合或小分子对整个细胞系统的影响。

在一些实施方案中，本公开提供了用于抗体发现的系统和方法。在一些实施方案中，本公开提供了产生针对靶蛋白的抗体的方法，所述方法包括用使用本公开的系统或方法产生的细胞或靶蛋白免疫受试者。在各种实施方案中，免疫的受试者是小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物、lama、骆驼或人。从受试者分离的细胞可以作为分离细胞进行更多轮的选择，或者任选在从分离的细胞产生杂交瘤之后。基因克隆和/或测序可用于从分离的细胞或杂交瘤中分离编码重链和轻链的多核苷酸序列。基因克隆和/或测序可应用于单个细胞或细胞群。在一些实施方案中，本公开的组合物和方法用于通过免疫受试者然后从所述受试者收获血清来产生多克隆抗体。

本公开进一步提供了通过细胞分选发现抗体的方法，所述方法包括提供溶液，所述溶液包含使用本公开的系统或方法产生的标记细胞或靶蛋白，以及重组细胞群，其中所述重组细胞表达多肽文库，每个多肽文库包含抗体或其抗原结合片段；通过检测与标记细胞或标记靶蛋白结合的重组细胞，从溶液中分选一个或多个重组细胞。在其他变型中，对源自免疫受试者的细胞进行细胞分选。可以用根据本公开的方法产生的细胞或靶蛋白、或使用其他合适的免疫原免疫受试者。在一些实施方案中，重组细胞包含初始

抗体文库，任选地人初始

抗体文库。各种抗体文库生成方法是本领域已知的并且可以与本公开的方法组合。如本文所用，术语“分选”或“细胞分选”是指荧光激活细胞分选、磁辅助细胞分选和在标记和未标记细胞群中选择标记细胞的其他方法。

本公开还提供了一种淘选噬菌体展示文库的方法，所述方法包括将噬菌体展示文库与使用本公开的系统或方法产生的细胞或靶蛋白混合；以及纯化和/或富集结合细胞或靶蛋白的噬菌体展示文库的成员。在一些实施方案中，噬菌体展示文库表达单链可变片段(scFvs)或其他类型的抗体/抗体片段(Fabs等)的群。

在进一步的实施方案中，本公开提供了用于筛选任何类型的蛋白结合剂的方法。本公开的细胞和靶蛋白可用于筛选各种类型分子的文库，包括药物和大分子(蛋白、核酸、和蛋白：核酸复合物)，以鉴定靶蛋白的结合配偶体。在其他实施方案中，本公开的系统和方法用于在单个孔中、在一些序列的池中或在基因序列文库中表达靶蛋白的文库。

与现有技术的方法相比，以高产量表达天然或疾病相关形式的抗原和/或在细胞表面上呈递的能力能够更可靠地发现和/或产生抗体、抗体片段和其他分子。此类抗体、抗体片段和其他分子可用作治疗剂和/或研究工具，或用于其他应用。

在一些实施方案中，本公开的系统和方法适用于发现与靶分子(例如糖蛋白)上的特定糖基化模式结合和/或对其具有特异性的抗体。在一些实施方案中，针对天然糖基化蛋白分选抗体文库，并且针对不正确的糖基化或去糖基化的同源蛋白反分选抗体文库。类似地，通过使用去糖基化酶，可以针对糖基化模式特异性地分选抗体。在进一步的实施方案中，本公开的细胞和/或靶蛋白用于确认新的抗体或其他大分子的结合和/或功能活性。

在一些实施方案中，本公开的系统和方法适用于在本文公开的或本领域已知的任何宿主细胞中生物合成任何靶蛋白。例如，本公开的系统和方法适用于在哺乳动物细胞中、或使用在细菌、酵母和其他微生物中的发酵生物合成任何靶蛋白。在一些实施方案中，本公开的系统和方法适用于通过将特定代谢通路引入宿主细胞中来生物合成非蛋白分子。例如，非蛋白分子是阿片样物质分子或其他代谢物。

示例性优点

本发明的组合物、系统和方法可以具有许多优点。例如，如实施例11中所证明的，当人NADase在人细胞系中过表达时，通常导致细胞凋亡并因此产生不可检测的产量，而该靶蛋白与增强子蛋白共表达时，可以可靠地表达并产生大于20mg/L的产量。此外，通过这种示例性方法表达的NADase是功能性的(如通过磷酸盐释放测定法所证明)，并且显示出低的批次间差异。

类似地，在一些实施方案中，本公开的方法、系统和细胞用于可靠表达难以表达的蛋白。在一些实施方案中，本公开涉及以低的批次间差异生产蛋白质。根据本公开产生的蛋白质可以表现出以下一种或多种改善：无需纯化标签融合进行纯化；改善的功能活性；可靠的生产；一致的活性；和治疗应用的适用性。

本公开的细胞在靶蛋白表达方面可以具有以下一种或多种优点：靶膜蛋白在膜中更高的浓度；较慢/降低的靶蛋白降解；在全细胞测定法中改善的信噪比；靶蛋白和/或增强子蛋白表达而不影响下游细胞代谢；对膜结合膜蛋白脱敏的稳定性增加；和更高的靶蛋白产量。实施例1提供了在不影响细胞下游代谢的情况下表达增强子蛋白的示例性实施例。实施例1中例举的GPCR能够与其天然底物相互作用并产生体外可测量的活化。

在一些实施方案中，本公开的系统和方法可以具有一种或多种以下优点：对任何真核细胞类型的适用性；减少对靶蛋白表达优化的需求；可靠地表达难以表达的蛋白。

系统

本公开的一个方面提供了一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的系统，其包含一个或多个载体。多个载体(或一个载体)可以具有编码靶蛋白的第一多核苷酸和编码增强子蛋白的第二多核苷酸。增强子蛋白可以是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂。在一些实施方案中，增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白。第一多核苷酸和第二多核苷酸可以可操作地连接至一个或多个启动子。

在一些实施方案中，增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂。在一些实施方案中，NCT抑制剂是病毒蛋白。

在一些实施方案中，增强子蛋白是NCT抑制剂，并且选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、冠状病毒ORF6蛋白、埃博拉病毒VP24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白。

NCT抑制剂可以是小核糖核酸病毒前导(L)蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，NCT抑制剂可以是小核糖核酸病毒2A蛋白酶或其功能变体。在一些实施方案中，NCT抑制剂可以是鼻病毒3C蛋白酶或其功能变体。在一些实施方案中，NCT抑制剂可以是冠状病毒ORF6蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，NCT抑制剂可以是埃博拉病毒VP24蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，NCT抑制剂可以是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，NCT抑制剂是单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，NCT抑制剂是弹状病毒基质(M)蛋白或其功能变体。

在一些实施方案中，增强子蛋白是L蛋白，其是Theiler氏病毒的L蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，L蛋白可以与SEQ ID NO：1共有至少90％的同一性。

在一些实施方案中，L蛋白是脑心肌炎病毒(EMCV)的L蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，L蛋白可以与SEQ ID NO：2共有至少90％的同一性。

在一些实施方案中，L蛋白选自脊髓灰质炎病毒的L蛋白、HRV16的L蛋白、孟戈病毒的L蛋白和Saffold病毒2的L蛋白或其功能变体。

所述系统可以包括包含表达盒的单个载体，所述表达盒包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。在一些实施方案中，表达盒包含与第一多核苷酸可操作地连接的第一启动子；和与第二多核苷酸可操作地连接的第二启动子。在一些实施方案中，表达盒包含与第一多核苷酸和第二多核苷酸二者可操作地连接的共有启动子。

在一些实施方案中，表达盒包含编码多核苷酸，所述编码多核苷酸包含通过编码核糖体跳跃位点的多核苷酸连接的第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述编码多核苷酸与共有启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，表达盒包含编码多核苷酸，所述编码多核苷酸编码通过核糖体跳跃位点连接的增强子蛋白和靶蛋白，所述编码多核苷酸与共有启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，表达盒被配置用于转录单个信使RNA，所述单个信使RNA编码通过核糖体跳跃位点连接的靶蛋白和增强子蛋白；其中信使RNA的翻译导致靶蛋白和增强子蛋白(例如，L蛋白)作为不同的多肽表达。

所述系统可以包含一个载体。在一些实施方案中，所述系统可以包含单个载体，所述载体包含编码靶蛋白的第一多核苷酸和编码增强子蛋白的第二多核苷酸。

所述系统可以包括两个载体。在一些实施方案中，所述系统可以包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含可操作地连接到第一启动子的第一多核苷酸；所述第二载体包含可操作地连接到第二启动子的第二多核苷酸。

在一些实施方案中，第一多核苷酸或第二多核苷酸或两者可操作地连接至内部核糖体进入位点(IRES)。

在一些实施方案中，系统包含的一个或多个载体中的至少一个可以包含T7启动子，其被配置用于通过T7 RNA聚合酶转录第一多核苷酸或第二多核苷酸任一者或两者。

在一些实施方案中，系统所包含的一个或多个载体中的至少一个可以包含编码T7RNA聚合酶的多核苷酸序列。

本说明书中引用的所有论文、出版物和专利都通过引用并入本文，就如同具体地且单独地指明每篇单独的论文、出版物或专利都通过引用并入，并且通过引用并入本文以与这些出版物引用的内容结合来公开和描述方法和/或材料。然而，本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请的提及不是也不应被视为承认或以任何形式地暗示它们构成有效的现有技术或构成世界上任何一个国家的公知常识的一部分。

除非上下文另有说明，否则本文所描述的各种特征可以以任何组合使用。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

实施例

表4：实施例的目录

材料和方法

DNA分子的构建

所有的组装都被制成能够在大肠杆菌中繁殖的质粒骨架，包含控制高拷贝数复制起点的启动子(ColE1)，随后是终止子(rrnB T1和T2终止子)。随后是控制抗生素抗性基因的启动子，该基因通过第二终止子(来自λ噬菌体的转录终止子)从载体的其余部分中分离。通过亚磷酰胺化学合成包含骨架元件的基因。

通过亚磷酰胺化学合成用于构建质粒的结构基因，使用表2中列出的引物、使用等温组装反应如NEB HI-FI或Gibson组装，扩增并克隆到上述载体中。表3中提供了这些实施例中使用的示例性构建体所包含的选定氨基酸序列。

表2：构建体设计

表3：一些构建体包含的示例性氨基酸序列

细胞系——培养和转染

HEK293细胞用于说明本系统、方法和组合物在人真核细胞中的应用。在补充有10％胎牛血清(Gibco)和50,000U青链霉素(Gibco)的Dulbecco改良Eagle培养基高葡萄糖(Gibco)中培养HEK293贴壁细胞(CLS)。HEK293细胞在37℃和5％CO₂条件下生长至80％融合，然后根据制造商的说明使用293fectin(ThermoFisher)瞬时转染。48小时后通过在37℃下使用0.5％胰蛋白酶溶液5分钟分离并剥离细胞来收获表达蛋白的细胞。使细胞沉淀(5,000xg，15分钟，4℃)并弃去上清液。将细胞沉淀储存在-80℃直到进一步使用。

悬浮HEK293细胞用于说明本系统、方法和组合物在人真核细胞中的应用。在补充的Expi293表达培养基(Gibco)中培养悬浮适应的HEK293细胞(CLS)。转染前1天，细胞以1.75x10⁶个细胞/ml接种，并在37℃和5％CO₂下过夜孵育，然后根据制造商的说明使用Expi293表达系统试剂盒(Gibco)进行瞬时转染。48h-96h后通过离心(5,000xg,15min,4℃)收获表达蛋白的细胞。在可溶性或膜蛋白的情况下，弃去上清液，将细胞沉淀储存在-80℃直至进一步使用。在分泌蛋白的情况下，上清液立即用于进一步纯化。

CHO-K1细胞用于说明本系统、方法和组合物在真核动物细胞中的应用。在补充有10％胎牛血清(Gibco)的DMEM/F-12GlutaMAX培养基(Gibco)中培养CHO-K1贴壁细胞(CLS)。使CHO-K1细胞在37℃和5％CO₂下生长至80％融合，然后根据制造商的说明，使用Lipofectamine LTX(ThermoFisher)瞬时转染。48小时后通过在37℃下使用0.5％胰蛋白酶溶液5分钟分离并剥离细胞来收获表达蛋白的细胞。使细胞沉淀(5,000xg，15分钟，4℃)并弃去上清液。将细胞沉淀储存在-80℃直到进一步使用。

SF9细胞用于说明本系统、方法和组合物在真核昆虫细胞中的应用。在Sf9-900III培养基(Gibco)中培养SF9悬浮细胞(CLS)。SF9细胞在26℃和130rpm下生长，接种到6孔板中然后根据制造商的说明使用Cellfectin II(ThermoFisher)进行瞬时转染。48小时后通过分离和沉淀(5,000x g，15分钟，4℃)收获表达蛋白的细胞并弃去上清液。将细胞沉淀储存在-80℃直到进一步使用。

实施例1：HEK293细胞中的GFP表达

CMV启动子系统

为了证明在表达过程中引入病毒核孔阻断蛋白的影响，用EG1、EG2转染HEK293细胞或用EG3和EG4构建体共转染HEK293细胞(构建体的细节参见表2和图2)。病毒孔阻断蛋白质的表达导致蛋白质表达的受控调节。因此，获得的GFP信号降低。与孔阻断蛋白串联的感兴趣基因的受控调节的原因是病毒蛋白的作用模式。不受理论束缚，蛋白质调节的一种可能机制是通过表达孔阻断蛋白，可以抑制mRNA的核输出，因此靶蛋白的翻译将被下调。稳定后，孔阻断蛋白将被降解，mRNA转运将恢复。这再次导致靶蛋白和增强子蛋白(例如，孔阻断蛋白)的表达。这种严格的控制反馈确保了靶蛋白的稳定和永久表达，并防止了导致蛋白表达关闭的真核细胞的正常调节。

图3A-3D显示在不存在和存在来自ECMV的L-蛋白作为根据本公开的示例性增强子蛋白的情况下对GFP表达的影响。HEK293细胞以0.05x10⁶细胞/孔接种在24孔板中，并在37℃和5％CO₂下过夜孵育，然后使用如上所述的EG1或EG2瞬时转染。在24小时和48小时后使用荧光显微镜监测GFP表达。使用CCD相机(Amscope)拍摄图像并使用ISCapture(Amscope)进行分析。该实施例证明了在根据本公开的包含靶蛋白多核苷酸和增强子蛋白多核苷酸的示例性系统中靶蛋白表达的调节改善了。

T7聚合酶系统

虽然EG2使用真核宿主的天然聚合酶，但其他病毒聚合酶(如T7)可用于在细胞核外启动转录。病毒聚合酶在标准真核启动子的控制下，相应的mRNA将依赖于核输出。病毒聚合酶在胞质中被翻译，然后启动靶蛋白多核苷酸和增强子蛋白多核苷酸的转录。在一些实施方案中，由于增强子蛋白的表达，病毒聚合酶的核转运将减少。系统的稳定将导致增强子蛋白的降解，病毒聚合酶的mRNA转运将恢复。不受理论的束缚，这种反馈可以当过表达重组蛋白时防止细胞的通常调节。在某些情况下，与使用真核聚合酶的系统相比，使用病毒聚合酶提供了在细胞与细胞基础上的更高表达水平的优势。

图4A-4D显示当与携带T7的载体共转染时，成功表达了与来自T7启动子的ECMV的L蛋白串联的GFP。HEK293细胞以0.05x10⁶细胞/孔接种在24孔板中，并在37℃和5％CO₂下过夜孵育，然后使用如上所述的EG1或EG3和EG4瞬时转染。在24小时和48小时后使用荧光显微镜监测GFP表达。使用CCD相机(Amscope)拍摄图像并使用ISCapture(Amscope)进行分析。该实施例证明了在作为靶蛋白的GFP与作为增强子蛋白的ECMV的L蛋白串联中，T7成功地用作示例性病毒聚合酶。与上述实施例类似，L蛋白的引入导致表达的更严格调节，因此导致了过度表达的总体减少。

实施例2：多巴胺受体1(DRD1)的生产

DRD1用于说明所公开的系统和方法在共表达作为靶蛋白的膜蛋白与作为增强子蛋白的孔阻断蛋白中的应用，以产生高密度的活性膜受体。DRD1是一种G蛋白偶联受体，已知难以使用理论标准表达。为了可视化正确易位到细胞外膜中，在本系统中使用了DRD1-GFP融合物(EG8)。为了说明GPCR在理论和工业环境中的问题，使用理论标准(EG10)作为对照。

改善的膜蛋白表达和膜定位

在HEK293细胞中表达DRD1-GFP融合物。HEK293细胞以0.05x10⁶细胞/孔接种在24孔板中，并在37℃和5％CO₂下过夜孵育，然后使用如上所述的EG10或EG8瞬时转染。在24小时和48小时后使用荧光显微镜监测DRD1-GFP表达。使用CCD相机(Amscope)拍摄图像并使用ISCapture(Amscope)进行分析。

图5A-5D证明EG10不能正确地易位表达的受体。不受理论束缚，据信由于使用EG10构建体使人DRD1受体在人细胞中过表达，细胞开始降解或控制所表达的靶蛋白。这种形式的调节导致形成作为包涵体的变性蛋白质(图5B，红色箭头)。细胞以这种方式控制膜蛋白的表达可导致蛋白质失活和错误折叠，从而导致无法使用、质量差的表达蛋白。相比之下，靶膜蛋白与示例性增强子蛋白的共表达导致DRD1-GFP的正确易位，这可以通过正确插入膜以及不存在包涵体看出(图5C-5D)。该实施例证明了示例性增强子蛋白(ECMV的L蛋白)与示例性靶膜蛋白(DRD1)的共表达导致膜蛋白的表达和定位得到改善。不受理论束缚，认为本系统产生对靶蛋白表达的严格调节，从而绕过会导致表达的膜蛋白降解的正常的细胞调节。因此，本系统适用于GPCR的高产量表达和纯化。

来自不同构建体的靶蛋白和增强子蛋白的表达

为了说明增强子蛋白可以由单独的DNA分子编码，DRD1-GFP(EG10)构建体与来自ECMV(EG11)的L蛋白在单独载体上的单独启动子的控制下共表达。HEK293细胞以0.05x10⁶细胞/孔接种在24孔板中,并在37℃和5％CO₂下过夜孵育,然后使用如上所述的EG10和EG11瞬时转染。48小时后使用荧光显微镜监测DRD1-GFP表达。通过Echo Revolve显微镜系统拍摄和分析图像。

图10A和B证明来自两个单独载体的L蛋白与DRD1-GFP的共表达确保了正确的膜结合。而DRD1-GFP的表达导致包涵体的形成(图10A，红色箭头)，可以通过与L蛋白的共表达来实现正确的膜结合。图10B证明即使从单独的载体和启动子表达L蛋白时，L蛋白的调节作用也足以恢复DRD1的正确膜结合。

这些结果证明本文公开的增强子蛋白和靶蛋白可以从单独的构建体表达，以使用本文公开的方法实现所表达的靶蛋白的产量和/或功能性的改善。此外，这些结果表明，来自本领域目前已知或使用的任何构建体或载体的任何靶蛋白的表达，与来自相同构建体或不同构建体的本文公开的一个或多个增强子蛋白的表达组合，可以改善表达的靶蛋白的产量和/或功能性。这显著增强了本文公开的方法和组合物的多功能性。

膜蛋白的功能活性

除了说明正确易位的GPCR(如DRD1)外，还使用DRD1-Strep融合物进行了活性测试。较小的strep标签确保与位于胞质的G蛋白的相互作用是完整的，并且可以进行功能测定法。在与多巴胺结合后，DRD1将异源三聚体G蛋白释放到其Gα亚基及其Gβγ复合物。在静止状态下，Gα与GDP结合，但在激活后将GDP转换为GTP。Gα-GTP复合物与腺苷酸环化酶(AC)相互作用，导致AC活性的激活，从而增加cAMP水平。可以通过标准cAMP测定法测量细胞内cAMP水平的变化。将理论和工业标准(EG5)与在和ECMV的L蛋白共表达中的相同靶蛋白进行比较。

在HEK293细胞中表达DRD1-Strep融合物。HEK293细胞以5,000细胞/孔接种在96孔白色透明底板中，并在37℃和5％CO₂下过夜孵育，然后使用如上所述的EG5或EG6瞬时转染。蛋白表达48小时，并使用cAMP-Glo^TM测定法(Promega)根据制造商的说明分析DRD1活性。48小时后，用无菌PBS pH 7.2洗涤细胞，并将细胞与20μl 1mM多巴胺底物溶液(+多巴胺；ON)或PBS pH 7.2(-多巴胺；OFF)在37℃孵育2小时。孵育后，用PBS pH 7.2洗涤细胞，然后加入20μl裂解缓冲液。裂解在室温(RT)下振荡进行15分钟。随后，加入40μl检测溶液，并将细胞在室温下振荡孵育20分钟。使用80μl Kinase-

试剂在室温下孵育15分钟停止反应，然后进行分析。使用读板器(BioTek Synergy^TM LX)测量发光，并使用标准分析程序分析数据。

图11证明与来自EMCV的L蛋白串联表达DRD1-Strep的优点。当将多巴胺添加到表达DRD1的细胞中时，由于内部cAMP释放，相应的发光信号会下降。图11显示，通过与来自EMCV的L蛋白共表达DRD1，存在强的激活信号，如不存在多巴胺的OFF状态和存在多巴胺的ON状态之间的差异所示。该测定法的一个重要方面是排除了在没有激活剂多巴胺的情况下的DRD1的伪激活或cAMP释放。如果测定法产生“泄漏”信号，则它在药物发现筛选中的可用性很低。图11显示，通过将DRD1与来自EMCV的L蛋白共表达，与仅仅是未转染的细胞的OFF信号比较时，大大降低了“泄漏”激活以及由此产生的假阴性读取。因此，使用本文公开的方法共表达增强子蛋白导致对靶DRD1蛋白激活的更严格的调节。因此，本文公开的方法在药物发现筛选中具有适用性。

实施例3：使用病毒启动子与病毒聚合酶组合表达DRD1-GFP

在本实施例中，使用T7启动子表达DRD1-GFP，一种示例性的难表达靶膜蛋白，以证明T7等病毒聚合酶可用于启动细胞核外的转录。如实施例1，病毒聚合酶在标准真核启动子的控制下，相应的mRNA依赖于核输出。

图6A-6B证明了当与携带T7的载体共转染时，成功表达了与来自T7启动子的ECMV的L蛋白串联的DRD1-GFP。HEK293细胞以0.05x10⁶细胞/孔接种在24孔板中，并在37℃和5％CO₂下过夜孵育，然后使用EG10或EG12或EG4瞬时转染。在24小时和48小时后使用荧光显微镜监测DRD1-GFP表达。使用CCD相机(Amscope)拍摄图像并使用ISCapture(Amscope)进行分析。该实施例证明了在作为靶蛋白的DRD1-GFP与作为增强子蛋白的ECMV的L蛋白串联中，T7成功地用作病毒聚合酶。

实施例4：使用不同的哺乳动物启动子表达DRD1-GFP

根据本公开的系统、方法和组合物与多种哺乳动物启动子相容。为了证明来自不同启动子的靶蛋白和增强子蛋白的共表达的相容性，DRD1-GFP被用作示例性靶蛋白。如实施例2所述，通过荧光显微镜可以很容易地检测DRD1-GFP的正确表达和易位。工程化实验中使用的构建体，以从CMV启动子(EG8)、EF1-α启动子(EG22)或SV40启动子(EG23)表达DRD1，并且所述构建体具有以下元件-编码DRD1-GFP的核酸序列、编码IRES的核酸序列和编码L蛋白序列的核酸序列。使用理论标准体系(EG10)来说明正确和不正确的膜结合之间的差异。

在HEK293细胞中表达在不同哺乳动物启动子控制下的DRD1-GFP融合物。HEK293细胞以0.05x10⁶细胞/孔接种在24孔板中，并在37℃和5％CO₂下过夜孵育，然后使用如上所述的EG8、EG10、EG22或EG23瞬时转染。48小时后使用荧光显微镜监测DRD1-GFP表达。通过EchoRevolve显微镜系统拍摄和分析图像。

图12证明了不同的启动子可用于驱动与增强子蛋白表达相结合的靶蛋白的表达。来自对照构建体的DRD1-GFP的表达显示DRD1未能定位于细胞的外膜，而是定位于包涵体(亮绿色点，图12A)，然而，通过不存在包涵体所判断的，从CMV、EF1α和SV40(图12B-D)启动子表达的DRD1-GFP与L蛋白增强子的组合表达全部正确地与膜结合。正如预期的那样，不同的启动子导致不同的表达水平，因此膜中DRD1-GFP的量(荧光总量)不同。

实施例5：使用不同的病毒孔阻断蛋白表达DRD1-GFP

在HEK293细胞中表达示例性靶融合蛋白DRD1-GFP与不同增强子蛋白的组合。本实验中使用的构建体编码DRD1-GFP和一种选自以下的增强子蛋白：ECMV前导蛋白(EG8)、Theiler氏病毒的前导蛋白(EG19)、脊髓灰质炎病毒的2A蛋白酶(EG21)和水疱性口炎病毒的M蛋白(EG20)。如实施例2所述，通过荧光显微镜可以很容易地检测DRD1-GFP的正确表达和易位。使用理论标准体系(EG10)来说明正确和不正确的膜结合之间的差异。HEK293细胞以0.05x10⁶细胞/孔接种在24孔板中，并在37℃和5％CO₂下过夜孵育，然后使用如上所述的EG8、EG10、EG19、EG20或EG21瞬时转染。48小时后使用荧光显微镜监测DRD1-GFP表达。通过Echo Revolve显微镜系统拍摄和分析图像。

图13证明与没有任何增强子蛋白的DRD1-GFP相比(图13A)，ECMV的前导蛋白(图13B)、Theiler氏病毒的前导蛋白(图13C)、脊髓灰质炎病毒的2A蛋白酶(图13D)和水疱性口炎病毒的M蛋白(图13E)都足以确保DRD1-GFP的正确膜并入。

这些结果表明，当在宿主细胞中与靶蛋白一起表达时，几种不同的病毒孔阻断蛋白共有改善靶蛋白产量、定位和/或功能性的能力。不受理论束缚，认为由这些增强子蛋白中的任何一种的表达导致的核孔阻断可能绕过会导致所表达的靶蛋白降解的正常细胞调节。因此，病毒孔阻断蛋白增强靶蛋白表达、定位和活性的这种共同机制允许用本领域已知的、将来发现的或本文公开的任何孔阻断蛋白实践本文公开的方法。

实施例6：DRD1-GFP在CHO细胞中的表达

使用CHO-K1(中国仓鼠卵巢)细胞代替HEK293重复实施例2的实验。从EG19构建体(也编码增强子蛋白)或对照EG10构建体表达DRD1-GFP。

在CHO-K1细胞中表达DRD1-GFP融合蛋白。CHO-K1细胞以0.05x10⁶细胞/孔接种在24孔板中，并在37℃和5％CO₂下过夜孵育，然后使用Lipofectamine 3000(Thermofisher)、根据制造商的说明、使用EG10或EG19瞬时转染。48小时后使用荧光显微镜监测DRD1-GFP表达。通过Echo Revolve显微镜系统拍摄和分析图像。

图14证明EG10不能正确地易位表达的受体。有趣的是，与HEK细胞相比，CHO细胞中人DRD1受体过表达的结果似乎更严重。使用EG10构建体，细胞开始降解或控制表达的靶蛋白，从而导致变性的蛋白质作为包涵体形成(图14A，红色箭头)。细胞以这种方式控制膜蛋白的表达可导致蛋白质失活和错误折叠，从而导致无法使用、质量差的表达的蛋白质。相比之下，靶膜蛋白与示例性增强子蛋白的共表达导致DRD1-GFP的正确易位，这可以通过正确插入膜以及不存在包涵体看出(图14B)。该实施例证明了示例性增强子蛋白(Theiler氏病毒的L蛋白)与示例性靶膜蛋白(DRD1)的共表达导致膜蛋白的表达和定位得到改善。此外，该实施例证明，各种真核细胞类型(例如，HEK293或CHO细胞)可用于实施所公开的方法。

实施例7：在Sf9细胞中产生DRD1-GFP的表达

使用Sf9(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))细胞代替HEK293重复实施例2的实验。从EG8构建体或工业和理论标准构建体EG10表达DRD1-GFP。

在Sf9细胞中表达DRD1-GFP融合物。Sf9细胞以0.4x10⁶细胞/孔接种在6孔板中，并在室温下孵育15分钟，然后使用Cellfectin Reagent II(Thermofisher)、根据制造商的说明、使用EG10或EG8瞬时转染。72小时后使用荧光显微镜监测DRD1-GFP表达。通过EchoRevolve显微镜系统拍摄和分析图像。

图15证明，EG10不仅不能正确易位表达的受体，而且表达的受体对细胞具有高毒性。在因表达基因的毒性而死亡的细胞中观察到最高的荧光信号(图15A,红色箭头)。相反，使用所公开的方法表达DRD1-GFP防止了由DRD1-GFP表达引起的细胞毒性，并且观察到膜并入受体(图15B,红色箭头)。有趣的是，与HEK细胞相比，Sf9细胞中人DRD1受体过表达的结果似乎更严重。在标准系统EG10中不受调控的表达会引起大量细胞死亡，从而导致无法使用的蛋白质。当从EG8中表达DRD1-GFP和L蛋白时，从整体细胞健康和膜结合受体显而易见表明毒性作用明显较轻。该实施例证明了示例性增强子蛋白(EMCV的L蛋白)与示例性靶膜蛋白(DRD1)的共表达导致膜蛋白的表达和定位得到改善，并且具有明显改善的对毒性作用的控制。此外，该实施例证明所公开的方法与各种真核细胞类型相容。

实施例8：IL2诱导型T细胞激酶(ITK)的产生

ITK用作示例性靶蛋白以举例说明应用所公开的系统来表达通常难以表达的可溶性蛋白。ITK是TEC激酶家族的成员，被认为在T细胞增殖和T细胞分化中发挥作用。此外，ITK用于证明在批次之间酶活性的一致性以及本文公开的方法的可扩展性。在3x10ml、100ml和1000ml生长培养基中表达ITK。此外，使用ITK-L-his蛋白融合构建体(EG9)来证明增强子蛋白可以与重组表达的靶蛋白融合，而不会失去控制调节的能力。从EG17、以及从用作比较的理论和工业标准(EG18)中表达ITK-his融合物。

ITK-his和ITK-L-his融合物在HEK293细胞中表达。HEK293细胞以2x10⁶细胞/ml接种在10ml、100ml或1000ml Expi293培养基中，并在37℃、120rpm和5％CO₂下过夜孵育，然后使用如上所述的EG9、EG17或EG18瞬时转染。48h后收获细胞(5,000xg,15min,4C)，将细胞沉淀储存在-80℃直至进一步使用。

为了纯化ITK，将细胞重悬于裂解缓冲液(40mM Tris,7.5；20mM MgCl₂；0.1mg/mlBSA；50μM DTT；和2mM MnCl₂,蛋白酶抑制剂,DNAse),通过超声裂解(2min,10s ON,10sOFF,40％Amplitude)并使粗细胞提取物澄清(5,000x g,20min,4℃)。用洗涤缓冲液(40mMTris,7.5；20mM MgCl2；0.1mg/ml BSA；50μM DTT；和2mM MnCl2)平衡5ml His-树脂柱(GEHealthcare HisTrap)，然后使用蠕动泵加载澄清裂解液。加载后，在

系统(Cytiva Life Sciences(之前的GE Healthcare))上进行纯化。用5CV洗涤缓冲液洗涤柱，然后用经25CV的连续梯度0-100％洗脱缓冲液(洗涤缓冲液+300mM咪唑)洗脱。通过SDS-PAGE(6-12％BOLT，ThermoFisher)分析含有蛋白质的级分，合并并浓缩含有蛋白质的级分。

通过尺寸排阻色谱法(SEC)(Superdex 200,ThermoFisher)使用SEC-缓冲液(40mMTris,7.5；20mM MgCl₂,150mM NaCl)进一步纯化蛋白质，并通过SDS-PAGE(6-12％BOLT，ThermoFisher)分析级分。根据其外观合并含有蛋白质的级分，并使用ITK激酶系统结合ADP-Glo^TM测定法(Promega)根据制造商的说明分析活性。简而言之，从EG17和EG18表达的全长ITK用于测定法中，总酶浓度为200ng、100ng、50ng和0ng。以0.2μg/μl的浓度使用底物PolyE4Y1，并将ATP以25μM添加到反应中。在96孔板中，将5μl反应缓冲液(随试剂盒提供)与10μl酶稀释液和10μl ATP/PolyE4Y1混合物混合。将板在室温下孵育60分钟。添加25μlADP-Glo试剂，并将板在室温下再次孵育40分钟。通过添加50μl激酶检测试剂并在室温下再孵育30分钟来停止反应。通过发光读取反应，积分时间为1秒。

图16显示ITK蛋白和与增强子蛋白L融合的ITK蛋白的纯化过程。在使用SEC纯化期间，可以将两个峰(P1和P2)鉴定为靶蛋白，其可以通过蛋白印迹鉴定为单体(P2)和二聚体(P1)种类(数据未显示)。不受理论束缚，认为ITK需要形成二聚体以实现活性形式。ITK是一种已知的激酶，过度表达时会对细胞产生毒性。因此，ITK的活性越高，表达越多，将被宿主细胞下调或转化为单体无活性形式。

图17A显示鉴定种类的最终SDS-PAGE纯化。需要注意的是，仅仅P1种类是有活性的，因此增强子蛋白与ITK组合的表达导致活性ITK种类的表达大幅增加。图17B通过使用发光作为主要读取证明了活性的差异。只有从EG17表达的P1表现出高活性，因此是唯一可用于针对该激酶进行药物筛选的蛋白质。尽管两种系统似乎都表达相似量的感兴趣蛋白，但使用本文公开的方法表达的ITK显示出比不存在增强子蛋白时表达的ITK蛋白更高的活性。该实施例证明，本文公开的方法可用于生产活性蛋白，而在其他方式中生产的该蛋白质将具有毒性或被宿主细胞转变为无活性。此外，所公开的方法不仅可用于生产活性蛋白(在其他方式中该蛋白质将具有毒性)，而且这些蛋白质随后可用于药物筛选，例如小分子筛选以发现新的治疗剂。

实施例9：在CHO-K1细胞中生产IL2诱导型T细胞激酶(ITK)

使用CHO细胞代替HEK293重复实施例8的实验。从EG17或对照构建体EG18表达ITK-his。

在CHO-K1细胞中表达ITK-his融合物。对于每个构建体总共8个150mm平板中，CHO-K1细胞以5x10⁶细胞/每皿接种，并在37℃和5％CO₂下过夜孵育，然后根据制造商的说明使用Lipofectamine 3000(Thermofisher)瞬时转染EG17或EG18。48小时后通过剥离收获细胞并离心以除去上清液(5,000xg，15分钟，4℃)。将细胞沉淀储存在-80℃直到进一步使用。为了纯化ITK，将细胞重悬于裂解缓冲液(40mM Tris,7.5；20mM MgCl₂；0.1mg/ml BSA；50μMDTT；和2mM MnCl₂,蛋白酶抑制剂,DNAse),通过超声裂解(2min,10s ON,10s OFF,40％Amplitude)并清除粗细胞提取物(5,000x g,20min,4℃)。用洗涤缓冲液(40mM Tris,7.5；20mM MgCl2；0.1mg/ml BSA；50μM DTT；和2mM MnCl2)平衡5ml His-树脂柱(GE HealthcareHisTrap)，然后使用蠕动泵加载澄清的裂解液。加载后，在AEKTA系统上进行纯化。用5CV洗涤缓冲液洗涤柱子，然后用经20CV的连续梯度0-75％洗脱缓冲液(洗涤缓冲液+300mM咪唑)洗脱。通过5CV 100％洗脱缓冲液完成洗脱。

通过SDS-PAGE(6-12％SurePAGE,Bis-Tris,GenScript)分析含有蛋白质的级分，合并并浓缩含有蛋白质的级分。通过尺寸排阻色谱法(SEC)(Superdex 200,ThermoFisher)使用SEC-缓冲液(40mM Tris,7.5；20mM MgCl₂,150mM NaCl)进一步精纯蛋白质，并通过SDS-PAGE(6-12％SurePAGE,Bis-Tris,GenScript)分析级分。根据其外观合并含有蛋白质的级分，并使用ITK激酶系统结合ADP-Glo Assay^TM(Promega)根据制造商的说明分析活性。

在Sf9昆虫细胞中表达的ΔITK用作标准。从EG17和EG18表达的ΔITK以及全长ITK用于测定法中，总酶浓度为200ng、100ng、50ng和0ng。以0.2μg/μl的浓度使用底物PolyE4Y1，并将ATP以25μM添加到反应中。在96孔板中，将5μl反应缓冲液(随试剂盒提供)与10μl酶稀释液和10μl ATP/PolyE4Y1混合物混合。将板在室温下孵育60分钟。添加25μlADP-Glo试剂，并将板在室温下再次孵育40分钟。通过添加50μl激酶检测试剂并在室温下再孵育30分钟来停止反应。通过发光读取反应，积分时间为1秒。

图18显示了在有和没有增强子蛋白L的情况下表达的ITK的纯化过程。如上所述，在使用SEC的纯化过程中，可以将两个峰(P1和P2)鉴定为靶蛋白。不受理论束缚，认为ITK需要形成二聚体以实现活性形式。ITK是一种已知的激酶，过度表达时会对细胞产生毒性。因此，ITK的活性越高，表达越多，将被宿主细胞下调或转化为单体无活性形式。

图19通过使用发光作为主要读取证明了活性的差异。只有从EG17表达的P1表现出与ΔITK阳性对照提供的活性相当的活性。尽管这两个系统似乎都表达了相似数量的感兴趣蛋白，但本文提出的系统通过控制宿主细胞的调节实现了产生活性蛋白质。该实施例证明，本文公开的方法可用于生产活性蛋白质，而在其他方式中该蛋白质将具有毒性或被宿主细胞转变为无活性。

实施例10：在Sf9细胞中生产IL2诱导型T细胞激酶(ITK)

使用Sf9细胞代替HEK293重复实施例8。ITK-his由EG17构建体或由工业和理论标准EG18构建体表达。如实施例7所述进行在Sf9细胞中的表达，如实施例8和9所述进行His标记的ITK蛋白的蛋白质纯化。

实施例11：囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)的表达

CFTR被用作另一个示例来证明作为靶蛋白的膜蛋白与作为增强子蛋白的孔阻断蛋白的共表达产生了高密度的活性离子通道。CFTR是ABC转运蛋白类的跨膜转运蛋白，其可指导氯离子穿过上皮细胞膜。已知在使用理论标准(EG24)时CFTR以异质方式表达。异质性增加了纯化或分析ABC转运蛋白的难度。为了证明同质性的改善，或者将CFTR克隆到示例性系统(EG25)的骨架中，或者将CFTR用作PCR产物。作为比较，理论标准(EG24)被一起用作对照。

在HEK293细胞中表达CFTR构建体。HEK293细胞以0.3x10⁶细胞/孔接种在6孔板中，并在37℃和5％CO₂下过夜孵育，然后使用如上所述的EG25、EG25插入物的PCR产物或EG24瞬时转染。在24小时和48小时后使用荧光显微镜监测CFTR表达。48小时后，使用RIPA(放射免疫沉淀测定法)缓冲液(CellGene)收获并裂解细胞。使裂解物澄清并通过SDS-PAGE(6-12％BOLT，ThermoFisher)分析，然后使用抗CFTR(Abcam，二抗-抗小鼠-HRP)进行蛋白印迹(硝酸纤维素膜,ThermoFisher)。

图7证明了L蛋白与CFTR共表达的影响。理论标准在蛋白印迹上产生了宽条带，然而基于EG25构建体的转录和翻译产生了轮廓清晰的条带，表明ABC转运蛋白的高度同质表达。此外，该实施例证明表达系统可以作为载体或作为PCR产物递送到细胞中。

实施例12：NADase的表达

NADase被用作示例性靶蛋白，以举例说明所公开的系统在难以表达的有毒可溶性蛋白中的应用。NADase是酶蛋白，其催化从NAD+到ADP-核糖和烟酰胺的反应。NADase的过表达通常会导致细胞死亡增加，因为细胞被剥夺了其天然能源NAD+。为了证明本系统能够产生高产量的活性NADase，将NADase-Flag融合物克隆到示例性系统(EG13)的骨架中。

在HEK293细胞中表达NADase-flag构建体。HEK293细胞以5x10⁶细胞接种在T225烧瓶中，并在37℃和5％CO₂下过夜孵育，然后使用如上所述的EG13瞬时转染。在24小时和48小时后使用荧光显微镜监测NADase-flag表达。48小时后通过在37℃下使用0.5％胰蛋白酶溶液5分钟分离并剥离细胞来收获细胞。使细胞沉淀(5,000xg，15分钟，4℃)并弃去上清液。将细胞沉淀储存在-80℃直到进一步使用。为了纯化NADase-flag，将细胞重悬于裂解缓冲液(50mM NaHPO4 pH 8.0,300mM NaCl,0.01％Tween20,蛋白酶抑制剂,DNAse),通过超声裂解(2min,10s ON,10s OFF,40％Amplitude)并使粗细胞提取物澄清(100,000x g,45min,4℃)。使用洗涤缓冲液(50mM NaHPO4 pH 8.0,300mM NaCl,0.01％Tween20)平衡ANTI-FLAGM2亲和凝胶(Sigma)，然后添加到澄清的裂解物中。裂解物与树脂在4℃下振荡孵育2小时。沉积树脂并用5CV洗涤缓冲液洗涤，并使用旋转柱用4x 1CV的洗脱缓冲液(洗涤缓冲液+0.2mg/ml 3x Flag-peptide(Sigma))洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE(6-12％BOLT，ThermoFisher)分析纯化(图8A)并合并含有蛋白质的级分。使用A280(NanoDrop One，FisherScientific)测量蛋白质浓度。确定蛋白质产量为26mg/L表达培养基。通过HPLC分析NAD+向ADP-核糖的转化率来测试NADase的活性(图8B)。

实施例13：分泌蛋白C1酯酶抑制剂(C1-Inh)的生产

C1-Inh用作示例性靶蛋白以举例说明所公开的方法用于表达具有正确翻译后修饰的分泌蛋白的应用。C1-Inh是一种蛋白酶抑制剂，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族。作为一种分泌蛋白，C1-Inh是高度糖基化的，因此被证明是重组表达的困难靶标。在存在或不存在来自EMCV的L蛋白的情况下表达C1-Inh-myc-flag融合蛋白，该L蛋白由单独的构建体表达。在这个实施例中，来自EMCV的L蛋白在CMV启动子的控制下由一个单独的构建体共表达。

在HEK293细胞中表达C1-Inh-Myc-Flag融合物。HEK293细胞以1.75x10⁶/ml细胞接种在100ml摇瓶中，并在37℃、5％CO₂和120rpm下过夜孵育，然后使用本领域已知的和/或本文公开的方法用编码C1-Inh(OriGene；CAT#:RC203767)的载体单独或与EG11组合瞬时转染悬浮细胞。72小时后收获含有表达的重组C1-Inh蛋白的上清液，通过离心和之后的过滤(22um，硝酸纤维素)使上清液澄清。为了纯化C1-Inh，用20mM Tris pH 7.5、50mM NaCl平衡Anti-Flag树脂(ANTI-FLAG M2 Affinity Gel,Millipore Sigma)，然后添加到上清液。将上清液与树脂在4℃下振荡孵育2小时。沉积树脂并用5CV 20mM Tris pH 7.5、50mM NaCl洗涤树脂，并用4CV 20mM Tris pH 7.5、50mM NaCl、0.2mg/ml 3x Flag Peptide洗脱蛋白。通过SDS-PAGE(SurePAGE,Bis-Tris,GenScript)分析纯化，并合并含有蛋白质的级分。根据制造商的说明通过BCA测定法(ThermoFisher)分析蛋白浓度，并按照制造商的说明使用免疫测定法(MicroVue C1-Inihibitor Plus EIA,Quidel)测试标准化的C1-Inh的活性。

图20A显示了在增强子蛋白不存在(左)和存在(右)的情况下C1-抑制剂的纯化。在增强子蛋白存在的情况下，生产的C1-抑制剂的总量增加了>30％。图20B证明纯化样品中活性C1抑制剂总量的改善。对于活性测定，在测试活性C1抑制剂之前对蛋白质浓度进行标准化。通过同时共表达增强子蛋白与GOI，活性C1抑制剂的量可以增加>10％。这些结果证明本文公开的方法导致分泌的靶蛋白(例如C1-抑制剂)的更高的产量和改善的活性。

实施例14：分泌蛋白，妊娠特异性糖蛋白1(PSG1)的生产

PSG1用作示例性靶蛋白以举例说明所公开的方法用于表达具有正确翻译后修饰的分泌蛋白的应用。PSG1是癌胚抗原超家族中人PSG家族的一种高度糖基化的分泌蛋白。PSG1是怀孕期间在母体血液中发现的最丰富的胎儿蛋白之一。PSG1已被证明通过上调巨噬细胞、单核细胞和滋养层细胞中的TGF-β来作为免疫调节剂发挥功能。此外，已显示PSG1在人单核细胞中诱导抗炎性细胞因子IL-10和IL-6的分泌。这些功能使PSG1成为有吸引力的药物靶标。表达PSG1的困难在于使用非人细胞时无法重建正确的糖基化模式。在这个实施例中，来自EMCV的L蛋白在CMV启动子的控制下与PSG1共表达。

在HEK293细胞中表达PSG1。HEK293细胞以1.75x10⁶/ml细胞接种在100ml摇瓶中，并在37℃、5％CO₂和120rpm下过夜孵育，然后使用编码与来自EMCV的L蛋白串联的PSG1的载体瞬时转染。72小时后收获含有表达的重组PSG1蛋白的上清液，通过离心和之后的过滤(22um，硝酸纤维素)使上清液澄清。为了纯化PSG1，使用洗涤缓冲液(10mM Tris pH 7.6)平衡HiTrap^TMDEAE Sepharose Fast Flow IEX Columns(Cytiva(Formerly GE HealthcareLife Sciences)，然后使用蠕动泵将上清液加载到柱。加载后，在

系统(CytivaLife Sciences(之前的GE Healthcare))上进行纯化。用5CV洗涤缓冲液洗涤柱，然后用多步骤梯度10％、20％、30％、50％和100％的洗脱缓冲液(洗涤缓冲液+200mM NaCl)洗脱。合并、浓缩含有蛋白质的级分，通过SDS-PAGE(6-12％BOLT，ThermoFisher)并使用抗-PSG1(Invitrogen，二抗-抗兔-HRP)的蛋白印迹(硝酸纤维素膜，ThermoFisher)进行分析。

图21显示PSG1的离子交换色谱图(左)。合并并浓缩含有蛋白质的级分(图21A，红色框)，然后通过SDS-PAGE和蛋白印迹确认PSG1的存在，并进行鉴定(图21B，红色箭头)。

进一步编号的实施方案

在以下编号的实施方案中提供了本发明的进一步实施方案：

实施方案1.一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的系统，其包含一个或多个载体，所述一个或多个载体包含：

a.编码靶蛋白的第一多核苷酸；和

b.编码增强子蛋白的第二多核苷酸，其中：

i.所述增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂，和/或

ii.所述增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白，

其中第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

实施方案2.根据实施方案1所述的系统，其中所述增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂。

实施方案3.根据实施方案2所述的系统，其中NCT抑制剂是病毒蛋白。

实施方案4.根据实施方案1-3中任一项所述的系统，其中NCT抑制剂选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、冠状病毒ORF6蛋白、埃博拉病毒VP24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白。

实施方案5.根据实施方案4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是小核糖核酸病毒前导(L)蛋白或其功能变体。

实施方案6.根据实施方案4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是小核糖核酸病毒2A蛋白酶或其功能变体。

实施方案7.根据实施方案4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是鼻病毒3C蛋白酶或其功能变体。

实施方案8.根据实施方案4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是冠状病毒ORF6蛋白或其功能变体。

实施方案9.根据实施方案4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是埃博拉病毒VP24蛋白或其功能变体。

实施方案10.根据实施方案4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白或其功能变体。

实施方案11.根据实施方案4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白或其功能变体。

实施方案12.根据实施方案4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是弹状病毒基质(M)蛋白或其功能变体。

实施方案13.根据实施方案5所述的系统，其中所述L蛋白是Theiler氏病毒的L蛋白或其功能变体。

实施方案14.根据实施方案5所述的系统，其中所述L蛋白与SEQ ID NO：1共有至少90％的同一性。

实施方案15.根据实施方案5所述的系统，其中所述L蛋白是脑心肌炎病毒(EMCV)的L蛋白或其功能变体。

实施方案16.根据实施方案5所述的系统，其中所述L蛋白与SEQ ID NO：2共有至少90％的同一性。

实施方案17.根据实施方案5所述的系统，其中所述L蛋白选自脊髓灰质炎病毒的L蛋白、HRV16的L蛋白、孟戈病毒的L蛋白和Saffold病毒2的L蛋白或其功能变体。

实施方案18.根据实施方案1-17中任一项所述的系统，其中所述系统包括包含表达盒的单个载体，所述表达盒包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。

实施方案19.根据实施方案18所述的系统，其中所述表达盒包含与第一多核苷酸可操作地连接的第一启动子；和与第二多核苷酸可操作地连接的第二启动子。

实施方案20.根据实施方案18所述的系统，其中所述表达盒包含与第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接的共有启动子。

实施方案21.根据实施方案20所述的系统，其中所述表达盒包含编码多核苷酸，所述编码多核苷酸包含通过编码核糖体跳跃位点的多核苷酸连接的第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述编码多核苷酸与共有启动子可操作地连接。

实施方案22.根据实施方案20所述的系统，其中所述表达盒包含编码多核苷酸，所述编码多核苷酸编码通过核糖体跳跃位点连接的增强子蛋白和靶蛋白，所述编码多核苷酸与共有启动子可操作地连接。

实施方案23.根据实施方案18-22中任一项所述的系统，其中所述表达盒被配置用于转录单个信使RNA，所述单个信使RNA编码通过核糖体跳跃位点连接的靶蛋白和增强子蛋白；其中信使RNA的翻译导致靶蛋白和L蛋白作为不同的多肽表达。

实施方案24.根据实施方案1-23中任一项所述的系统，其中所述系统包含一个载体。

实施方案25.根据实施方案1-17中任一项所述的系统，其中所述系统包含：

a.包含与第一启动子可操作地连接的第一多核苷酸的第一载体；和

b.包含与第二启动子可操作地连接的第二多核苷酸的第二载体。

实施方案26.根据实施方案1-17或实施方案25中任一项所述的系统，其中所述系统包含两个载体。

实施方案27.根据实施方案1-26中任一项所述的系统，其中第一多核苷酸或第二多核苷酸或两者可操作地连接至内部核糖体进入位点(IRES)。

实施方案28.根据实施方案1-27中任一项所述的系统，其中所述一个或多个载体中的至少一个包含T7启动子，所述T7启动子被配置用于通过T7RNA聚合酶转录所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸任一者或两者。

实施方案29.根据实施方案1-28中任一项所述的系统，其中所述一个或多个载体中的至少一个包含编码T7 RNA聚合酶的多核苷酸序列。

实施方案30.一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的载体，其包含：

a.编码靶蛋白的第一多核苷酸；和

b.编码增强子蛋白的第二多核苷酸，其中：

i.所述增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂，和/或

ii.所述增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、冠状病毒ORF6蛋白、埃博拉病毒VP24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白。

其中第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至至少一个启动子。

实施方案31.根据实施方案30所述的载体，其中表达盒包含与第一多核苷酸可操作地连接的第一启动子；和与第二多核苷酸可操作地连接的第二启动子。

实施方案32.根据实施方案30所述的载体，其中表达盒包含与第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接的共有启动子。

实施方案33.一种用于表达靶蛋白的真核细胞，其包含编码增强子蛋白的外源多核苷酸，其中：

a.所述增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂，和/或

b.所述增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、冠状病毒ORF6蛋白、埃博拉病毒VP24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白，

其中外源多核苷酸可操作地连接至启动子。

实施方案34.根据实施方案33所述的真核细胞，其中所述多核苷酸可操作地连接至内部核糖体进入位点(IRES)。

实施方案35.根据实施方案33或实施方案34所述的真核细胞，其中所述启动子是诱导型启动子。

实施方案36.一种用于重组表达靶蛋白的方法，所述方法包括将与启动子可操作地连接的编码靶蛋白的多核苷酸引入实施方案33-35中任一项所述的细胞中。

实施方案37.一种用于重组表达靶蛋白的方法，所述方法包括将实施方案1-29中任一项所述的系统或实施方案30-32中任一项所述的载体引入真核细胞中。

实施方案38.根据实施方案36或实施方案37所述的方法，其中所述靶蛋白是膜蛋白。

实施方案39.根据实施方案38任意所述的方法，其中与在没有增强子蛋白的情况下表达膜蛋白时观察到的定位相比，膜蛋白在细胞膜上的定位增加。

实施方案40.一种真核细胞，其通过将实施方案1-29中任一项所述的系统或实施方案30-32中任一项所述的载体引入真核细胞中而产生。

实施方案41.一种靶蛋白，其通过将实施方案1-29中任一项所述的系统或实施方案30-32中任一项所述的载体引入真核细胞中而表达。

实施方案42.一种用于在真核细胞中表达靶蛋白的方法，所述方法包括将编码靶蛋白的多核苷酸引入真核细胞中，所述多核苷酸与启动子可操作地连接，其中所述方法利用增强子蛋白的共表达来增强靶蛋白的表达水平、溶解度和/或活性，其中：(a)所述增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂，和/或(b)所述增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、冠状病毒ORF6蛋白、埃博拉病毒VP24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白。

实施方案43.根据是实施方案42所述的方法，其中增强子蛋白的共表达包括将编码增强子蛋白的多核苷酸引入真核细胞中，所述多核苷酸与启动子可操作地连接。

实施方案44.根据是实施方案42或实施方案43所述的方法，其中一个或多个引入步骤包括用一个或多个DNA分子转染真核细胞、用单个病毒载体转导真核细胞和/或用两个病毒载体转导真核细胞。

实施方案45.根据实施方案1-29中任一项所述的系统、根据实施方案30-32中任一项所述的载体、根据实施方案33-35中任一项所述的真核细胞、根据实施方案36-39和42-44中任一项的所述方法、根据实施方案40所述的真核细胞和根据实施方案41所述的靶蛋白，其中所述靶蛋白是可溶性蛋白。

实施方案46.根据实施方案1-29中任一项所述的系统、根据实施方案30-32中任一项所述的载体、根据实施方案33-35中任一项所述的细胞、根据实施方案36-44中任一项的所述方法，其中所述靶蛋白是分泌蛋白。

实施方案47.根据实施方案1-29中任一项所述的系统、根据实施方案30-32中任一项所述的载体、根据实施方案33-35中任一项所述的真核细胞、根据实施方案36-39和42-44中任一项的所述方法、根据实施方案40所述的真核细胞和根据实施方案41所述的靶蛋白，其中所述靶蛋白是膜蛋白。

实施方案48.根据实施方案1-29中任一项所述的系统、根据实施方案30-32中任一项所述的载体、根据实施方案33-35中任一项所述的真核细胞、根据实施方案36-39和42-44中任一项的所述方法、根据实施方案40所述的真核细胞和根据实施方案41所述的靶蛋白，其中所述靶蛋白是多巴胺受体1(DRD1)，任选地其中DRD1包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：19具有至少90％的同一性。

实施方案49.根据实施方案1-29中任一项所述的系统、根据实施方案30-32中任一项所述的载体、根据实施方案33-35中任一项所述的真核细胞、根据实施方案36-39和42-44中任一项的所述方法、根据实施方案40所述的真核细胞和根据实施方案41所述的靶蛋白，其中所述靶蛋白是囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)，任选地其中CFTR包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：18具有至少90％的同一性。

实施方案50.根据实施方案1-29中任一项所述的系统、根据实施方案30-32中任一项所述的载体、根据实施方案33-35中任一项所述的真核细胞、根据实施方案36-39和42-44中任一项的所述方法、根据实施方案40所述的真核细胞和根据实施方案41所述的靶蛋白，其中所述靶蛋白是C1酯酶抑制剂(C1-Inh)，任选地其中C1-Inh包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：16具有至少90％的同一性。

实施方案51.根据实施方案1-29中任一项所述的系统、根据实施方案30-32中任一项所述的载体、根据实施方案33-35中任一项所述的真核细胞、根据实施方案36-39和42-44中任一项的所述方法、根据实施方案40所述的真核细胞和根据实施方案41所述的靶蛋白，其中所述靶蛋白是ITK，任选地其中ITK包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：15具有至少90％的同一性。

实施方案52.根据实施方案1-29中任一项所述的系统、根据实施方案30-32中任一项所述的载体、根据实施方案33-35中任一项所述的真核细胞、根据实施方案36-39和42-44中任一项的所述方法、根据实施方案40所述的真核细胞和根据实施方案41所述的靶蛋白，其中所述靶蛋白是NADase，任选地其中NADase包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO：20具有至少90％的同一性。

实施方案53.一种生产针对靶蛋白的抗体的方法，所述方法包括用实施方案33-35中任一项所述的细胞、实施方案40所述的细胞或实施方案41所述的靶蛋白免疫受试者。

实施方案54.根据实施方案53所述的方法，进一步包括分离一个或多个表达对靶蛋白特异的免疫球蛋白的免疫细胞。

实施方案55.根据实施方案53或实施方案54所述的方法，所述方法包括从一个或多个免疫细胞产生一个或多个杂交瘤。

实施方案56.根据实施方案53-55中任一项所述的方法，所述方法包括从一个或多个免疫细胞克隆一个或多个免疫球蛋白基因。

实施方案57.一种通过细胞分选发现抗体的方法，所述方法包括提供一种溶液，所述溶液包含：

a.根据实施方案33-35中任一项所述的细胞、根据实施方案40所述的真核细胞、或根据实施方案41所述的靶蛋白，其中所述细胞或靶蛋白被标记，和

b.重组细胞群，其中所述重组细胞表达多肽文库，每个多肽文库包含抗体或其抗原结合片段；通过分选与标记细胞或标记靶蛋白结合的重组细胞，从溶液中分离一个或多个重组细胞。

实施方案58.一种用于淘选噬菌体展示文库的方法，所述方法包括：

a.将噬菌体展示文库与实施方案33-35中任一项所述的真核细胞、实施方案40所述的真核细胞或实施方案41所述的靶蛋白混合；和

b.纯化和/或富集结合细胞或靶蛋白的噬菌体展示文库的成员。

实施方案59.根据实施方案33-35和40中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞是人细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。

实施方案60.根据实施方案33-35、40和59中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞是真核细胞系。

实施方案61.根据实施方案33-35、40、59和60中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞是Bc HROC277、COS、CHO、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NSO、5P2/0-Ag14、HeLa、HEK293、HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T、perC6细胞、Sf9细胞、酵母细胞、毕赤酵母细胞或裂殖酵母细胞。

实施方案62.根据实施方案60所述的真核细胞，其中所述真核细胞系是稳定的细胞系。

实施方案63.根据实施方案1-29和45-52中任一项所述的系统，其中所述一个或多个载体选自腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、具有复制能力的腺病毒载体、复制缺陷型腺病毒载体、疱疹病毒载体、杆状病毒载体或非病毒质粒。

实施方案64.根据实施方案63所述的系统，其中所述一个或多个载体中的至少一个是AAV载体。

实施方案65.根据实施方案30-32中任一项所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、具有复制能力的腺病毒载体、复制缺陷型腺病毒载体、疱疹病毒载体、杆状病毒载体或非病毒质粒。

实施方案66.根据实施方案65所述的载体，其中所述载体是AAV载体。

实施方案67.根据实施方案4所述的系统，其中所述弹状病毒基质(M)蛋白是水疱性口炎病毒(VSV)的M蛋白。

实施方案68.根据实施方案67所述的系统，其中所述M蛋白与SEQ ID NO：9共有至少90％的同一性。

实施方案69.一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的系统，其包含一个或多个载体，所述一个或多个载体包含：

a.编码靶蛋白的第一多核苷酸；和

b.编码脑心肌炎病毒(EMCV)的L蛋白的第二多核苷酸，任选地其中所述L蛋白与SEQ ID NO:2共有至少90％的同一性，并且

其中第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

实施方案70.一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的系统，其包含一个或多个载体，所述一个或多个载体包含：

a.编码靶蛋白的第一多核苷酸；和

b.编码Theiler氏病毒的L蛋白的第二多核苷酸，任选地其中所述L蛋白与SEQ IDNO:1共有至少90％的同一性，并且

其中第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

实施方案71.一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的系统，其包含一个或多个载体，所述一个或多个载体包含：

a.编码靶蛋白的第一多核苷酸；和

b.编码小核糖核酸病毒2A蛋白酶的第二多核苷酸，任选地其中所述小核糖核酸病毒2A蛋白酶与SEQ ID NO:7共有至少90％的同一性，并且

其中第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

实施方案72.一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的系统，其包含一个或多个载体，所述一个或多个载体包含：

a.编码靶蛋白的第一多核苷酸；和

b.编码水疱性口炎病毒(VSV)的M蛋白的第二多核苷酸，任选地，其中所述M蛋白与SEQ ID NO：9共有至少90％的同一性，并且

其中第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

实施方案73.根据实施方案69-72中任一项所述的系统，其中所述靶蛋白是多巴胺受体1(DRD1)，任选地其中所述DRD1包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％的同一性。

实施方案74.根据实施方案69-72中任一项所述的系统，其中所述靶蛋白是囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)，任选地其中所述CFTR包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:18的氨基酸序列具有至少90％的同一性。

实施方案75.根据实施方案69-72中任一项所述的系统，其中所述靶蛋白是C1酯酶抑制剂(C1-Inh)，任选地其中所述C1-Inh包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少90％的同一性。

实施方案76.根据实施方案69-72中任一项所述的系统，其中所述靶蛋白是ITK，任选地其中所述ITK包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少90％的同一性。

实施方案77.根据实施方案69-72中任一项所述的系统，其中所述靶蛋白是NADase，任选地其中所述NADase包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少90％的同一性。

Claims (77)

1.一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的系统，其包含一个或多个载体，所述一个或多个载体包含：

a)编码靶蛋白的第一多核苷酸；和

b)编码增强子蛋白的第二多核苷酸，其中：

i)所述增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂，和/或

ii)所述增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白，

其中第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

2.根据权利要求1所述的系统，其中所述增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂。

3.根据权利要求2所述的系统，其中NCT抑制剂是病毒蛋白。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的系统，其中NCT抑制剂选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、冠状病毒ORF6蛋白、埃博拉病毒VP24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白。

5.根据权利要求4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是小核糖核酸病毒前导(L)蛋白或其功能变体。

6.根据权利要求4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是小核糖核酸病毒2A蛋白酶或其功能变体。

7.根据权利要求4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是鼻病毒3C蛋白酶或其功能变体。

8.根据权利要求4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是冠状病毒ORF6蛋白或其功能变体。

9.根据权利要求4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是埃博拉病毒VP24蛋白或其功能变体。

10.根据权利要求4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白或其功能变体。

11.根据权利要求4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白或其功能变体。

12.根据权利要求4所述的系统，其中所述NCT抑制剂是弹状病毒基质(M)蛋白或其功能变体。

13.根据权利要求5所述的系统，其中所述L蛋白是Theiler氏病毒的L蛋白或其功能变体。

14.根据权利要求5所述的系统，其中所述L蛋白与SEQ ID NO：1共有至少90％的同一性。

15.根据权利要求5所述的系统，其中所述L蛋白是脑心肌炎病毒(EMCV)的L蛋白或其功能变体。

16.根据权利要求5所述的系统，其中所述L蛋白与SEQ ID NO：2共有至少90％的同一性。

17.根据权利要求5所述的系统，其中所述L蛋白选自脊髓灰质炎病毒的L蛋白、HRV16的L蛋白、孟戈病毒的L蛋白和Saffold病毒2的L蛋白或其功能变体。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的系统，其中所述系统包括包含表达盒的单个载体，所述表达盒包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。

19.根据权利要求18所述的系统，其中所述表达盒包含与第一多核苷酸可操作地连接的第一启动子；和与第二多核苷酸可操作地连接的第二启动子。

20.根据权利要求18所述的系统，其中所述表达盒包含与第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接的共有启动子。

21.根据权利要求20所述的系统，其中所述表达盒包含编码多核苷酸，所述编码多核苷酸包含通过编码核糖体跳跃位点的多核苷酸连接的第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述编码多核苷酸与共有启动子可操作地连接。

22.根据权利要求20所述的系统，其中所述表达盒包含编码多核苷酸，所述编码多核苷酸编码通过核糖体跳跃位点连接的增强子蛋白和靶蛋白，所述编码多核苷酸与共有启动子可操作地连接。

23.根据权利要求18-22中任一项所述的系统，其中所述表达盒被配置用于转录单个信使RNA，所述单个信使RNA编码通过核糖体跳跃位点连接的靶蛋白和增强子蛋白；其中信使RNA的翻译导致靶蛋白和L蛋白作为不同的多肽表达。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的系统，其中所述系统包含一个载体。

25.根据权利要求1-17中任一项所述的系统，其中所述系统包含：

a)包含与第一启动子可操作地连接的第一多核苷酸的第一载体；和

b)包含与第二启动子可操作地连接的第二多核苷酸的第二载体。

26.根据权利要求1-17或权利要求25中任一项所述的系统，其中所述系统包含两个载体。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的系统，其中第一多核苷酸或第二多核苷酸或两者可操作地连接至内部核糖体进入位点(IRES)。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的系统，其中所述一个或多个载体中的至少一个包含T7启动子，所述T7启动子被配置用于通过T7 RNA聚合酶转录所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸任一者或两者。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的系统，其中所述一个或多个载体中的至少一个包含编码T7 RNA聚合酶的多核苷酸序列。

30.一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的载体，其包含：

a)编码靶蛋白的第一多核苷酸；和

b)编码增强子蛋白的第二多核苷酸，其中：

i)所述增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂，和/或

ii)所述增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、冠状病毒ORF6蛋白、埃博拉病毒VP24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白,

其中第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至至少一个启动子。

31.根据权利要求30所述的载体，其中所述表达盒包含与第一多核苷酸可操作地连接的第一启动子；和与第二多核苷酸可操作地连接的第二启动子。

32.根据权利要求30所述的载体，其中所述表达盒包含与第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接的共有启动子。

33.一种用于表达靶蛋白的真核细胞，其包含编码增强子蛋白的外源多核苷酸，其中：

a)所述增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂，和/或

b)所述增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、冠状病毒ORF6蛋白、埃博拉病毒VP24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白，

其中外源多核苷酸可操作地连接至启动子。

34.根据权利要求33所述的真核细胞，其中所述多核苷酸可操作地连接至内部核糖体进入位点(IRES)。

35.根据权利要求33或权利要求34所述的真核细胞，其中所述启动子是诱导型启动子。

36.一种用于重组表达靶蛋白的方法，所述方法包括将与启动子可操作地连接的编码靶蛋白的多核苷酸引入权利要求33-35中任一项所述的细胞中。

37.一种用于重组表达靶蛋白的方法，所述方法包括将权利要求1-29中任一项所述的系统或权利要求30-32中任一项所述的载体引入真核细胞中。

38.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其中所述靶蛋白是膜蛋白。

39.根据权利要求38任意所述的方法，其中与在没有增强子蛋白的情况下表达膜蛋白时观察到的定位相比，膜蛋白在细胞膜上的定位增加。

40.一种真核细胞，其通过将权利要求1-29中任一项所述的系统或权利要求30-32中任一项所述的载体引入真核细胞中产生。

41.一种靶蛋白，其由权利要求1-29中任一项所述的系统或权利要求30-32中任一项所述的载体引入的真核细胞表达。

42.一种用于在真核细胞中表达靶蛋白的方法，所述方法包括将编码靶蛋白的多核苷酸引入真核细胞中，所述多核苷酸与启动子可操作地连接，

其中所述方法利用增强子蛋白的共表达来增强靶蛋白的表达水平、溶解度和/或活性，

其中：

a)所述增强子蛋白是核质转运蛋白(NCT)的抑制剂，和/或

b)所述增强子蛋白选自小核糖核酸病毒前导(L)蛋白、小核糖核酸病毒2A蛋白酶、鼻病毒3C蛋白酶、冠状病毒ORF6蛋白、埃博拉病毒VP24蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)衣壳蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)ICP27蛋白和弹状病毒基质(M)蛋白。

43.根据权利要求42所述的方法，其中增强子蛋白的共表达包括将编码增强子蛋白的多核苷酸引入真核细胞中，所述多核苷酸与启动子可操作地连接。

44.根据权利要求42或权利要求43所述的方法，其中一个或多个引入步骤包括用一个或多个DNA分子转染真核细胞、用单个病毒载体转导真核细胞，和/或用两个病毒载体转导真核细胞。

45.根据权利要求1-29中任一项所述的系统、根据权利要求30-32中任一项所述的载体、根据权利要求33-35中任一项所述的真核细胞、根据权利要求36-39和42-44中任一项的所述方法、根据权利要求40所述的真核细胞和根据权利要求41所述的靶蛋白，其中所述靶蛋白是可溶性蛋白。

46.根据权利要求1-29中任一项所述的系统、根据权利要求30-32中任一项所述的载体、根据权利要求33-35中任一项所述的细胞、根据权利要求36-44中任一项的所述方法，其中所述靶蛋白是分泌蛋白。

47.根据权利要求1-29中任一项所述的系统、根据权利要求30-32中任一项所述的载体、根据权利要求33-35中任一项所述的真核细胞、根据权利要求36-39和42-44中任一项的所述方法、根据权利要求40所述的真核细胞和根据权利要求41所述的靶蛋白，其中所述靶蛋白是膜蛋白。

48.根据权利要求1-29中任一项所述的系统、根据权利要求30-32中任一项所述的载体、根据权利要求33-35中任一项所述的真核细胞、根据权利要求36-39和42-44中任一项的所述方法、根据权利要求40所述的真核细胞和根据权利要求41所述的靶蛋白，其中所述靶蛋白是多巴胺受体1(DRD1)，任选地其中DRD1包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO：19具有至少90％的同一性。

49.根据权利要求1-29中任一项所述的系统、根据权利要求30-32中任一项所述的载体、根据权利要求33-35中任一项所述的真核细胞、根据权利要求36-39和42-44中任一项的所述方法、根据权利要求40所述的真核细胞和根据权利要求41所述的靶蛋白，其中所述靶蛋白是囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)，任选地其中CFTR包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：18具有至少90％的同一性。

50.根据权利要求1-29中任一项所述的系统、根据权利要求30-32中任一项所述的载体、根据权利要求33-35中任一项所述的真核细胞、根据权利要求36-39和42-44中任一项的所述方法、根据权利要求40所述的真核细胞和根据权利要求41所述的靶蛋白，其中所述靶蛋白是C1酯酶抑制剂(C1-Inh)，任选地其中C1-Inh包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO：16具有至少90％的同一性。

51.根据权利要求1-29中任一项所述的系统、根据权利要求30-32中任一项所述的载体、根据权利要求33-35中任一项所述的真核细胞、根据权利要求36-39和42-44中任一项的所述方法、根据权利要求40所述的真核细胞和根据权利要求41所述的靶蛋白，其中所述靶蛋白是ITK，任选地其中ITK包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：15具有至少90％的同一性。

52.根据权利要求1-29中任一项所述的系统、根据权利要求30-32中任一项所述的载体、根据权利要求33-35中任一项所述的真核细胞、根据权利要求36-39和42-44中任一项的所述方法、根据权利要求40所述的真核细胞和根据权利要求41所述的靶蛋白，其中所述靶蛋白是NADase，任选地其中NADase包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：20具有至少90％的同一性。

53.一种生产针对靶蛋白的抗体的方法，所述方法包括用权利要求33-35中任一项所述的细胞、权利要求40所述的细胞或权利要求41所述的靶蛋白免疫受试者。

54.根据权利要求53所述的方法，进一步包括分离一个或多个表达对靶蛋白特异的免疫球蛋白的免疫细胞。

55.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，所述方法包括从一个或多个免疫细胞产生一个或多个杂交瘤。

56.根据权利要求53-55中任一项所述的方法，所述方法包括从一个或多个免疫细胞克隆一个或多个免疫球蛋白基因。

57.一种通过细胞分选发现抗体的方法，所述方法包括提供一种溶液，所述溶液包含：

a)根据权利要求33-35中任一项所述的细胞、根据权利要求40所述的真核细胞、或根据权利要求41所述的靶蛋白，其中所述细胞或靶蛋白被标记，和

b)重组细胞群，其中所述重组细胞表达多肽文库，每个多肽文库包含抗体或其抗原结合片段；和

通过分选与标记细胞或标记靶蛋白结合的重组细胞，从溶液中分离一个或多个重组细胞。

58.一种用于淘选噬菌体展示文库的方法，所述方法包括：

a)将噬菌体展示文库与权利要求33-35中任一项所述的真核细胞、权利要求40所述的真核细胞或权利要求41所述的靶蛋白混合；和

b)纯化和/或富集结合细胞或靶蛋白的噬菌体展示文库的成员。

59.根据权利要求33-35和40中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞是人细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。

60.根据权利要求33-35、40和59中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞是真核细胞系。

61.根据权利要求33-35、40、59和60中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞是BcHROC277、COS、CHO、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NSO、5P2/0-Ag14、HeLa、HEK293、HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T、perC6细胞、Sf9细胞、酵母细胞、毕赤酵母细胞或裂殖酵母细胞。

62.根据权利要求60所述的真核细胞，其中所述真核细胞系是稳定的细胞系。

63.根据权利要求1-29和45-52中任一项所述的系统，其中所述一个或多个载体选自腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、具有复制能力的腺病毒载体、复制缺陷型腺病毒载体、疱疹病毒载体、杆状病毒载体或非病毒质粒。

64.根据权利要求63所述的系统，其中所述一个或多个载体中的至少一个是AAV载体。

65.根据权利要求30-32中任一项所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、具有复制能力的腺病毒载体、复制缺陷型腺病毒载体、疱疹病毒载体、杆状病毒载体或非病毒质粒。

66.根据权利要求65所述的载体，其中所述载体是AAV载体。

67.根据权利要求4所述的系统，其中所述弹状病毒基质(M)蛋白是水疱性口炎病毒(VSV)的M蛋白。

68.根据权利要求67所述的系统，其中所述M蛋白与SEQ ID NO：9共有至少90％的同一性。

69.一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的系统，其包含一个或多个载体，所述一个或多个载体包含：

a)编码靶蛋白的第一多核苷酸；和

b)编码脑心肌炎病毒(EMCV)的L蛋白的第二多核苷酸，任选地其中所述L蛋白与SEQ IDNO:2共有至少90％的同一性，并且

其中第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

70.一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的系统，其包含一个或多个载体，所述一个或多个载体包含：

a)编码靶蛋白的第一多核苷酸；和

b)编码Theiler氏病毒的L蛋白的第二多核苷酸，任选地其中所述L蛋白与SEQ ID NO:1共有至少90％的同一性，并且

其中第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

71.一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的系统，其包含一个或多个载体，所述一个或多个载体包含：

a)编码靶蛋白的第一多核苷酸；和

b)编码小核糖核酸病毒2A蛋白酶的第二多核苷酸，任选地其中所述小核糖核酸病毒2A蛋白酶与SEQ ID NO:7共有至少90％的同一性，并且

其中第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

72.一种用于在真核细胞中重组表达靶蛋白的系统，其包含一个或多个载体，所述一个或多个载体包含：

a)编码靶蛋白的第一多核苷酸；和

b)编码水疱性口炎病毒(VSV)的M蛋白的第二多核苷酸，任选地，其中所述M蛋白与SEQID NO：9共有至少90％的同一性，并且

其中第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

73.根据权利要求69-72中任一项所述的系统，其中所述靶蛋白是多巴胺受体1(DRD1)，任选地其中所述DRD1包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％的同一性。

74.根据权利要求69-72中任一项所述的系统，其中所述靶蛋白是囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)，任选地其中所述CFTR包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％的同一性。

75.根据权利要求69-72中任一项所述的系统，其中所述靶蛋白是C1酯酶抑制剂(C1-Inh)，任选地其中所述C1-Inh包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少90％的同一性。

76.根据权利要求69-72中任一项所述的系统，其中所述靶蛋白是ITK，任选地其中所述ITK包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少90％的同一性。

77.根据权利要求69-72中任一项所述的系统，其中所述靶蛋白是NADase，任选地其中所述NADase包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少90％的同一性。

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