JP2022548005A

JP2022548005A - 操作された細胞及びその使用

Info

Publication number: JP2022548005A
Application number: JP2022515958A
Authority: JP
Inventors: ドン，イージョウ; ホウ，シューチョン; ジャン，シンフー
Original assignee: オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション
Priority date: 2019-09-11
Filing date: 2020-09-11
Publication date: 2022-11-16
Also published as: US20230000908A1; AU2020344609A1; CA3150777A1; EP4028024A1; WO2021050848A1; EP4028024A4; CN114867483A

Abstract

本開示は、抗原提示細胞及び敗血症の治療のためのその使用に関する。いくつかの態様において、抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、カテプシンＢをコードする第２の核酸、及びリンカーをコードする第３の核酸を含む組換えポリヌクレオチドと、ビタミン－脂質とを含む、脂質ベースのナノ粒子を含む抗原提示細胞が本明細書に開示される。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月１１日に出願した米国仮特許出願第６２／８９８，８４６号の利益を主張するものであり、これは参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

連邦政府後援の研究に関する声明文
本発明は、国立衛生研究所により付与された助成金番号Ｒ３５ＧＭ１１９６７９の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

本開示は、操作された細胞及びその使用に関する。

敗血症は、かつては病原体に対する制御不能な炎症反応とみなされていた。しかしながら、研究者は、４０回以上の抗炎症剤の臨床試験の失敗後に、敗血症の治療アプローチを再評価している。最近の臨床データは、敗血症患者の６０％以上が最初の炎症ストームを経て生存するが、免疫細胞の麻痺及び死亡を特徴とする、より長い免疫抑制状態に急速に進行し、侵入病原体を排除することができず、病院で獲得した感染症に対する感受性が増加し、死亡率が高いことを明らかにしている。したがって、必要とされるのは、細胞を操作するための新規組成物及び方法、ならびに疾患（例えば、敗血症）を治療するための方法である。

いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、抗原提示細胞であって、
脂質ベースのナノ粒子を含み、脂質ベースのナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
カテプシンＢをコードする第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、抗原提示細胞である。

いくつかの実施形態において、第１の核酸及び第２の核酸は、第３の核酸によって連結される。

いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドはビタミン－脂質によって封入される。

いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡを含む。

いくつかの実施形態において、抗菌ペプチドは配列番号１の配列を含む。

いくつかの実施形態において、第１の核酸は配列番号２の配列を含む。

いくつかの実施形態において、第２の核酸は配列番号４の配列を含む。

いくつかの実施形態において、リンカーはカテプシンＢ感受性リンカーを含む。いくつかの実施形態において、第３の核酸は配列番号６の配列を含む。

いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８の配列を含む。

いくつかの実施形態において、ビタミン－脂質はビタミン部分を含み、ビタミン部分は、ビタミンＢ３、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＨ、またはそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態において、ビタミン部分はビタミンＣである。

いくつかの実施形態において、ビタミン－脂質は、以下からなる群から選択され、

式中、Ｒは、

である。

いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、マクロファージまたは樹状細胞を含む。いくつかの実施形態において、マクロファージは、骨髄由来マクロファージまたは単球由来マクロファージを含む。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、骨髄由来樹状細胞、単球由来樹状細胞、従来の樹状細胞－１、または従来の樹状細胞－２を含む。

いくつかの態様において、本明細書において開示されるのは、敗血症の治療方法であって、１つ以上の抗原提示細胞を対象に投与することを含み、抗原提示細胞が、
ナノ粒子を含み、ナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
カテプシンＢをコードする第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、方法である。

いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は対象から得られる。いくつかの実施形態において、対象はヒトを含む。いくつかの実施形態において、ヒトは敗血症を有するか、または有すると疑われる。

添付の図面は、本明細書に援用されるとともに、本明細書の一部を構成し、以下に説明するいくつかの態様を示す。

ビタミン由来脂質の養子マクロファージ移入及び化学構造の概略図。ａ）敗血症療法のためのＭＡＣの構築。ＭＡＣは、リソソーム中に抗菌ペプチド／カテプシンＢを負荷したマクロファージを表す。ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡは、ビタミンＣ脂質ナノ粒子（Ｖ_ＣＬＮＰ）に封入され、マクロファージに送達され、ｍＲＮＡは、内質網内で翻訳され、リソソーム内にトランスロケーションされる。リソソーム内では、切断可能なリンカーがリソソームＣａｔＢによって切断され、ＡＭＰ－ＩＢ３６７が放出される。ＭＤＲ細菌を運ぶファゴソームがリソソームと融合した後、摂取したＭＤＲ細菌は、予め保存されたＡＭＰ－ＩＢ３６７によって根絶される。ｂ）Ｖ_Ｂ３－脂質、Ｖ_Ｃ－脂質、Ｖ_Ｄ－脂質、Ｖ_Ｅ－脂質、及びＶ_Ｈ－脂質を含むビタミン由来脂質の化学構造。ビタミン由来脂質の養子マクロファージ移入及び化学構造の概略図。ａ）敗血症療法のためのＭＡＣの構築。ＭＡＣは、リソソーム中に抗菌ペプチド／カテプシンＢを負荷したマクロファージを表す。ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡは、ビタミンＣ脂質ナノ粒子（Ｖ_ＣＬＮＰ）に封入され、マクロファージに送達され、ｍＲＮＡは、内質網内で翻訳され、リソソーム内にトランスロケーションされる。リソソーム内では、切断可能なリンカーがリソソームＣａｔＢによって切断され、ＡＭＰ－ＩＢ３６７が放出される。ＭＤＲ細菌を運ぶファゴソームがリソソームと融合した後、摂取したＭＤＲ細菌は、予め保存されたＡＭＰ－ＩＢ３６７によって根絶される。ｂ）Ｖ_Ｂ３－脂質、Ｖ_Ｃ－脂質、Ｖ_Ｄ－脂質、Ｖ_Ｅ－脂質、及びＶ_Ｈ－脂質を含むビタミン由来脂質の化学構造。Ｖ_Ｂ３－脂質の合成：化合物１（１５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌｅ）を、２ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２及び２ｍＬのＤＭＦの混合物中に溶解した。ビタミンＢ３誘導体（６２ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌｅ）、ＥＤＣ（８７ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌｅ）及びＤＭＰＡ（１０ｍｇ）を溶液に添加した。混合物を、室温で一晩撹拌した。反応混合物を、１００％のＣＨ_２Ｃｌ_２～０％のＣＨ_２Ｃｌ_２（ｕｌｔｒａ：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ＝７５／２２／３体積）の勾配溶出（ＣＨ_２Ｃｌ_２及びｕｌｔｒａ）を有するＲｅｄｉＳｅｐＧｏｌｄＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎシリカカラム（ＴｅｌｅｄｙｎｅＩｓｃｏ）を有するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈＲｆシステムを使用して、カラムクロマトグラフィーによって精製して、８０ｍｇの無色油Ｖ_Ｂ３－脂質を収率３７％で得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝１０．７５（１Ｈ，ｓ），９．９２（１Ｈ，ｓ），９．１７－９．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４），８．９４（１Ｈ，ｓ），８．０９－８．０６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４），６．２０（１Ｈ，ｓ），４．８８－４．８５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４），４．０６－４．０３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４），２．４７（１１Ｈ，ｍ），２．３１－２．２８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４），２．１３（２Ｈ，ｓ），１．６４－１．６３（７Ｈ，ｍ），１．４５（１２Ｈ，ｍ），１．２６（５６Ｈ，ｓ），０．８９－０．８７（９Ｈ，ｔ，Ｊ＝４）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｍ^＋Ｃ_５７Ｈ_１０９Ｎ_４Ｏ_３の計算値：８９７．８４９４；実測値：８９７．８４９６。Ｖ_Ｃ－脂質の合成：化合物１（１５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌｅ）を２ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２中に溶解した。ビタミンＣ誘導体（７７ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌｅ）、ＥＤＣ（８７ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌｅ）及びＤＭＰＡ（１０ｍｇ）を溶液に添加した。混合物を、室温で一晩撹拌した。反応混合物を、１００％ＣＨ_２Ｃｌ_２～８０％ＣＨ_２Ｃｌ_２（ｕｌｔｒａ：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ＝７５／２２／３体積）の勾配溶出（ＣＨ_２Ｃｌ_２及びｕｌｔｒａ）を有するＲｅｄｉＳｅｐＧｏｌｄＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎシリカカラム（ＴｅｌｅｄｙｎｅＩｓｃｏ）を有するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈＲｆシステムを使用して、カラムクロマトグラフィーにより精製して、１０５ｍｇの無色の油Ｖ_Ｃ－脂質を収率４４％で得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．４０－７．２５（１０Ｈ，ｍ），５．２６－５．１３（４Ｈ，ｍ），４．６７（１Ｈ，ｓ），４．３３－４．０８（３Ｈ，ｍ），２．６５（１Ｈ，ｓ），２．４２（１２Ｈ，ｍ），１．６７－１．６０（１３Ｈ，ｍ），１．２８（５７Ｈ，ｓ），０．９２－０．８９（９Ｈ，ｔ，Ｊ＝４）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋Ｃ_６５Ｈ_１１１Ｎ_２Ｏ_７の計算値：１０３１．８３９１；実測値：１０３１．８３７９。Ｖ_Ｄ－脂質の合成：化合物１（１５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌｅ）を２ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２中に溶解した。ビタミンＤ（８３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌｅ）、ＥＤＣ（８７ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌｅ）及びＤＭＰＡ（１０ｍｇ）を溶液に添加した。混合物を、室温で一晩撹拌した。反応混合物を、１００％ＣＨ_２Ｃｌ_２～８５％ＣＨ_２Ｃｌ_２（ｕｌｔｒａ：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ＝７５／２２／３体積）の勾配溶出（ＣＨ_２Ｃｌ_２及びｕｌｔｒａ）を有するＲｅｄｉＳｅｐＧｏｌｄＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎシリカカラム（ＴｅｌｅｄｙｎｅＩｓｃｏ）を有するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈＲｆシステムを使用して、カラムクロマトグラフィーにより精製し、４０ｍｇの無色油Ｖ_Ｄ－脂質を収率１６％で得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝６．２２－６．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２），６．０４－６．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８），５．０６（１Ｈ，ｓ），４．９４（１Ｈ，ｓ），４．８４（１Ｈ，ｓ），２．８２－２．５６（１２Ｈ，ｍ），２．３８－２．２８（４Ｈ，ｍ），１．９９－１．９６（５Ｈ，ｍ），１．６７－１．４９（１５Ｈ，ｍ），１．３０－１．２６（７１Ｈ，ｍ），０．９３－０．８７（２１Ｈ，ｍ），０．５４（２Ｈ，ｓ）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋Ｃ_７２Ｈ_１３５Ｎ_２Ｏ_２の計算値：１０６０．０５２４；実測値：１０６０．０５２９。Ｖ_Ｅ－脂質の合成：化合物１（１５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌｅ）を２ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２中に溶解した。ビタミンＥ（９９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌｅ）、ＥＤＣ（８７ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌｅ）及びＤＭＰＡ（１０ｍｇ）を溶液に添加した。混合物を、室温で一晩撹拌した。反応混合物を、１００％ＣＨ_２Ｃｌ_２～８５％ＣＨ_２Ｃｌ_２（ｕｌｔｒａ：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ＝７５／２２／３体積）の勾配溶出（ＣＨ_２Ｃｌ_２及びｕｌｔｒａ）を有するＲｅｄｉＳｅｐＧｏｌｄＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎシリカカラム（ＴｅｌｅｄｙｎｅＩｓｃｏ）を有するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈＲｆシステムを使用して、カラムクロマトグラフィーにより精製し、６６ｍｇの無色油Ｖ_Ｅ－脂質を収率２６％で得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝２．８３－２．５７（１４Ｈ，ｍ），２．０８（３Ｈ，ｓ），２．００（３Ｈ，ｓ），１．９６（３Ｈ，ｓ），１．８１（４Ｈ，ｍ），１．６２（５Ｈ，ｍ），１．５４－１．５２（１１Ｈ，ｍ），１．２８－１．２３（６７Ｈ，ｍ），１．１４（７Ｈ，ｍ），０．８９－０．８４（２４Ｈ，ｍ）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋Ｃ_７４Ｈ_１４１Ｎ_２Ｏ_３の計算値：１１０６．０９４２；実測値：１１０６．０９４４。Ｖ_Ｈ－脂質の合成：化合物１（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌｅ）を３ｍＬのＴＨＦの混合物中に溶解した。ＮＨＳ（５０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌｅ）及びＤＣＣ（８０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌｅ）を一晩攪拌した溶液に添加した。溶液にビタミンＨ誘導体（１４０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌｅ）及び２００μＬのトリメチルアミンを加えた。混合物を、室温で一晩撹拌した。反応混合物を、１００％ＣＨ_２Ｃｌ_２～７５％ＣＨ_２Ｃｌ_２（ｕｌｔｒａ：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ＝７５／２２／３体積）の勾配溶出（ＣＨ_２Ｃｌ_２及びｕｌｔｒａ）を有するＲｅｄｉＳｅｐＧｏｌｄＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎシリカカラム（ＴｅｌｅｄｙｎｅＩｓｃｏ）を有するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈＲｆシステムを使用して、カラムクロマトグラフィーにより精製し、６０ｍｇの無色油Ｖ_Ｈ－脂質を収率４１％で得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．１１（１Ｈ，ｓ），６．７０（１Ｈ，ｓ），５．９８（１Ｈ，ｓ），４．５２－４．４９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４），４．３３－４．３０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４），３．２７－３．２８（４Ｈ，ｍ），２．７５－２．６０（１１Ｈ，ｍ），２．２５－２．１９（４Ｈ，ｍ），１．７４－１．６４（１１Ｈ，ｍ），１．５１－１．４９（１１Ｈ，ｍ），１．２８（５９Ｈ，ｓ），０．９０－０．８７（９Ｈ，ｔ，Ｊ＝４）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋Ｃ_５８Ｈ_１１５Ｎ_６Ｏ_３Ｓの計算値：９７５．８７５１；実測値：９７５．８６２９。ＶＬＮＰのスクリーニング及び特徴付け。サイズ。データは、平均±ｓ．ｄ．であり、３回である。ＶＬＮＰのスクリーニング及び特徴付け。ＰＤＩ。データは、平均±ｓ．ｄ．であり、３回である。ＶＬＮＰのスクリーニング及び特徴付け。封入効率。データは、平均±ｓ．ｄ．であり、３回である。ＶＬＮＰのスクリーニング及び特徴付け。ＶＬＮＰのゼータ電位。データは、平均±ｓ．ｄ．であり、３回である。ＶＬＮＰのスクリーニング及び特徴付け。直交アレイ表Ｌ_１６（４）^４及びＫ_ｎ＊値。ＶＬＮＰのスクリーニング及び特徴付け。最適なＶ_ＣＬＮＰ製剤のＣｒｙｏ－ＴＥＭ画像（スケールバー＝５０ｎｍ）。ビタミン－脂質ナノ粒子（ＶＬＮＰ）のスクリーニング及び特徴付け。ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＶＬＮＰのｍＲＮＡ送達効率。データは、平均±ｓ．ｄ．であり、ｎ＝３独立した実験である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ビタミン－脂質ナノ粒子（ＶＬＮＰ）のスクリーニング及び特徴付け。ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＶ_ＣＬＮＰによって送達されるｍＲＮＡの発現動態。データは、平均±ｓ．ｄ．であり、ｎ＝３独立した実験である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ビタミン－脂質ナノ粒子（ＶＬＮＰ）のスクリーニング及び特徴付け。特徴付けの第１のラウンド：各Ｖ_ＣＬＮＰの成分の４つのレベル及び影響傾向。ビタミン－脂質ナノ粒子（ＶＬＮＰ）のスクリーニング及び特徴付け。予測される製剤の検証のための製剤表、及び特徴付けの第２のラウンド：Ｖ_Ｃ－脂質：ｍＲＮＡの質量比。ビタミン－脂質ナノ粒子（ＶＬＮＰ）のスクリーニング及び特徴付け。２ラウンドの特徴付けにおける発光強度の倍率変化。データは、平均±ｓ．ｄ．であり、ｎ＝３独立した実験である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ビタミン－脂質ナノ粒子（ＶＬＮＰ）のスクリーニング及び特徴付け。サイズ分布、多分散性指数（ＰＤＩ）、封入効率、ゼータ電位、及びＣｒｙｏ－ＴＥＭ画像（スケールバー＝１００ｎｍ）を含む最適なＶ_ＣＬＮＰ製剤の特徴付け。データは、平均±ｓ．ｄ．であり、ｎ＝３独立した実験である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ビタミン－脂質ナノ粒子（ＶＬＮＰ）のスクリーニング及び特徴付け。ｅＧＦＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡを封入するＶ_ＣＬＮＰでインキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞の共焦点顕微鏡検査（スケールバー＝１０μｍ）。ｅＧＦＰ－ＣａｔＢ（緑）及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＲｅｄＤＮＤ－９９（赤）をリソソームに共局在させ、ピアソンの相関係数は０．９１±０．１５であった。ビタミン－脂質ナノ粒子（ＶＬＮＰ）のスクリーニング及び特徴付け。ＰＢＳ（ＰＢＳ－ＲＡＷ）、遊離ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡ（Ｆｒ－ＲＡＷ）、空のＶ_ＣＬＮＰ（Ｅｍ－ＲＡＷ）、ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰ／ＣａｔＢ阻害剤ＩＩ（Ｉｎ－ＲＡＷ）、及びＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰ（ＭＡＣ－ＲＡＷ）に曝露したＲＡＷ２６４．７細胞中のＭＤＲＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＭＤＲＳＡ）の細胞内生存率。データは、平均±ｓ．ｄ．であり、ｎ＝３独立した実験である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ＭＤＲＳＡ中のＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。細胞移植後２４時間の血液中の細菌負荷。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）、ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．）、及びＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）の群におけるマウスの数は、それぞれ８、１０、１０、及び１２匹であった。データは、平均±ｓ．ｄ．＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ＮＤは未検出。ＭＤＲＳＡ中のＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。敗血症を伴うマウスの生存率。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）、ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．）、及びＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）の群におけるマウスの数は、それぞれ８、１０、１０、及び１２匹であった。ＭＤＲＳＡ中のＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。敗血症を伴うマウスの体重（ＢＷ）、白血球（ＷＢＣ）、及びリンパ球（ＬＹＭ）。ＢＷ。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）、ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．）、及びＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）の群におけるマウスの数は、それぞれ８、１０、１０、及び１２匹であった。データは、平均±ｓ．ｄ．＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ＮＤは未検出。ＭＤＲＳＡ中のＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。敗血症を伴うマウスの体重（ＢＷ）、白血球（ＷＢＣ）、及びリンパ球（ＬＹＭ）。ＷＢＣ。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）、ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．）、及びＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）の群におけるマウスの数は、それぞれ８、１０、１０、及び１２匹であった。データは、平均±ｓ．ｄ．＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ＮＤは未検出。ＭＤＲＳＡ中のＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。敗血症を伴うマウスの体重（ＢＷ）、白血球（ＷＢＣ）、及びリンパ球（ＬＹＭ）。ＬＹＭ。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）、ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．）、及びＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）の群におけるマウスの数は、それぞれ８、１０、１０、及び１２匹であった。データは、平均±ｓ．ｄ．＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ＮＤは未検出。ＭＤＲＳＡ中のＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。ＭＡＣ－ＲＡＷによって治療した各マウスの血液中の細菌負荷（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）、ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．）、及びＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）の群におけるマウスの数は、それぞれ８、１０、１０、及び１２匹であった。ＭＤＲＳＡ中のＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。ＭＡＣ－ＲＡＷによって治療した各マウスの血液中の細菌負荷（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）、ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．）、及びＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）の群におけるマウスの数は、それぞれ８、１０、１０、及び１２匹であった。ＢＭＤＭにおけるＶＬＮＰのスクリーニング、及びＢＭＤＭにおけるＭＤＲ細菌の細胞内生存。Ｆ４／８０、成熟マクロファージメーカー、陽性細胞（８３．５±０．７％）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ試験）。この図のデータは、平均±ｓ．ｄ．であり、ｎ＝３の独立した実験である。ＢＭＤＭにおけるＶＬＮＰのスクリーニング、及びＢＭＤＭにおけるＭＤＲ細菌の細胞内生存。ＢＭＤＭにおけるＶＬＮＰのｍＲＮＡ送達効率。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ試験）。この図のデータは、平均±ｓ．ｄ．であり、ｎ＝３の独立した実験である。ＢＭＤＭにおけるＶＬＮＰのスクリーニング、及びＢＭＤＭにおけるＭＤＲ細菌の細胞内生存。ＢＭＤＭにおけるＶ_ＣＬＮＰによって送達されるｍＲＮＡの発現動態。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ試験）。この図のデータは、平均±ｓ．ｄ．であり、ｎ＝３の独立した実験である。ＢＭＤＭにおけるＶＬＮＰのスクリーニング、及びＢＭＤＭにおけるＭＤＲ細菌の細胞内生存。ＰＢＳ（ＰＢＳ－ＢＭＤＭ）、遊離ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡ（Ｆｒ－ＢＭＤＭ）、空のＶ_ＣＬＮＰ（Ｅｍ－ＢＭＤＭ）、ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰ／ＣａｔＢ阻害剤ＩＩ（Ｉｎ－ＢＭＤＭ）、及びＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰ（ＭＡＣ－ＢＭＤＭ）、及びｄ）ＭＤＲＳＡ、ｆ）ＭＤＲＥ．ｃｏｌｉ．。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ試験）。この図のデータは、平均±ｓ．ｄ．であり、ｎ＝３の独立した実験である。ＢＭＤＭにおけるＶＬＮＰのスクリーニング、及びＢＭＤＭにおけるＭＤＲ細菌の細胞内生存。１２時間でＰＢＳ－ＢＭＤＭ群に正規化されたＢＭＤＭのパーセンテージ。ＭＤＲＳＡ。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ試験）。この図のデータは、平均±ｓ．ｄ．であり、ｎ＝３の独立した実験である。ＢＭＤＭにおけるＶＬＮＰのスクリーニング、及びＢＭＤＭにおけるＭＤＲ細菌の細胞内生存。ＰＢＳ（ＰＢＳ－ＢＭＤＭ）、遊離ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡ（Ｆｒ－ＢＭＤＭ）、空のＶ_ＣＬＮＰ（Ｅｍ－ＢＭＤＭ）、ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰ／ＣａｔＢ阻害剤ＩＩ（Ｉｎ－ＢＭＤＭ）、及びＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰ（ＭＡＣ－ＢＭＤＭ）、及びｄ）ＭＤＲＳＡ、ｆ）ＭＤＲＥ．ｃｏｌｉ．。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ試験）。この図のデータは、平均±ｓ．ｄ．であり、ｎ＝３の独立した実験である。ＢＭＤＭにおけるＶＬＮＰのスクリーニング、及びＢＭＤＭにおけるＭＤＲ細菌の細胞内生存。１２時間でＰＢＳ－ＢＭＤＭ群に正規化されたＢＭＤＭのパーセンテージ。ＭＤＲＥ．ｃｏｌｉ．。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ試験）。この図のデータは、平均±ｓ．ｄ．であり、ｎ＝３の独立した実験である。ＢＭＤＭにおけるＶＬＮＰのスクリーニング、及びＢＭＤＭにおけるＭＤＲ細菌の細胞内生存。ＢＭＤＭにおけるＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡを封入するＶ_ＣＬＮＰの細胞内生存率を、ＭＴＴアッセイによって測定した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ試験）。この図のデータは、平均±ｓ．ｄ．であり、ｎ＝３の独立した実験である。ＭＤＲＳＡ中のＭＡＣ－ＢＭＤＭの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。細胞移植後２４時間の血液中の細菌負荷。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＢＭＤＭ、及びＭＡＣ－ＢＭＤＭ群のマウスの数は、それぞれ８匹、１０匹、及び１２匹であった。データは、平均±ｓ．ｄ．＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ＮＤは未検出。ＭＤＲＳＡ中のＭＡＣ－ＢＭＤＭの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。敗血症を伴うマウスの生存率。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＢＭＤＭ、及びＭＡＣ－ＢＭＤＭ群のマウスの数は、それぞれ８匹、１０匹、及び１２匹であった。ＭＤＲＳＡ中のＭＡＣ－ＢＭＤＭの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。敗血症を伴うマウスのＢＷ、ＷＢＣ、及びＬＹＭ。ＢＷ。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＢＭＤＭ、及びＭＡＣ－ＢＭＤＭ群のマウスの数は、それぞれ８匹、１０匹、及び１２匹であった。データは、平均±ｓ．ｄ．＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ＮＤは未検出。ＭＤＲＳＡ中のＭＡＣ－ＢＭＤＭの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。敗血症を伴うマウスのＢＷ、ＷＢＣ、及びＬＹＭ。ＷＢＣ。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＢＭＤＭ、及びＭＡＣ－ＢＭＤＭ群のマウスの数は、それぞれ８匹、１０匹、及び１２匹であった。データは、平均±ｓ．ｄ．＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ＮＤは未検出。ＭＤＲＳＡ中のＭＡＣ－ＢＭＤＭの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。敗血症を伴うマウスのＢＷ、ＷＢＣ、及びＬＹＭ。ＬＹＭ。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＢＭＤＭ、及びＭＡＣ－ＢＭＤＭ群のマウスの数は、それぞれ８匹、１０匹、及び１２匹であった。データは、平均±ｓ．ｄ．＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ＮＤは未検出。ＭＤＲＳＡ中のＭＡＣ－ＢＭＤＭの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。ＭＡＣ－ＢＭＤＭによって治療した各マウスの血液中の細菌負荷。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＢＭＤＭ、及びＭＡＣ－ＢＭＤＭ群のマウスの数は、それぞれ８匹、１０匹、及び１２匹であった。ＭＤＲＳＡ中のＭＡＣ－ＢＭＤＭの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。ＭＡＣ－ＢＭＤＭによって治療した各マウスの血液中の細菌負荷。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＢＭＤＭ、及びＭＡＣ－ＢＭＤＭ群のマウスの数は、それぞれ８匹、１０匹、及び１２匹であった。混合ＭＤＲＳＡ細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）におけるＭＡＣ－ＢＭＤＭの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。細胞移植後２４時間の血液中の細菌負荷。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＢＭＤＭ、及びＭＡＣ－ＢＭＤＭ群のマウスの数は、それぞれ８匹、１０匹、及び１２匹であった。データは、平均±ｓ．ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ＮＤは未検出。混合ＭＤＲＳＡ細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）におけるＭＡＣ－ＢＭＤＭの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。敗血症を伴うマウスの生存率。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＢＭＤＭ、及びＭＡＣ－ＢＭＤＭ群のマウスの数は、それぞれ８匹、１０匹、及び１２匹であった。混合ＭＤＲＳＡ細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）におけるＭＡＣ－ＢＭＤＭの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。敗血症を伴うマウスのＢＷ、ＷＢＣ、及びＬＹＭ。ＢＷ。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＢＭＤＭ、及びＭＡＣ－ＢＭＤＭ群のマウスの数は、それぞれ８匹、１０匹、及び１２匹であった。データは、平均±ｓ．ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ＮＤは未検出。混合ＭＤＲＳＡ細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）におけるＭＡＣ－ＢＭＤＭの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。敗血症を伴うマウスのＢＷ、ＷＢＣ、及びＬＹＭ。ＷＢＣ。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＢＭＤＭ、及びＭＡＣ－ＢＭＤＭ群のマウスの数は、それぞれ８匹、１０匹、及び１２匹であった。データは、平均±ｓ．ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ＮＤは未検出。混合ＭＤＲＳＡ細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）におけるＭＡＣ－ＢＭＤＭの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。敗血症を伴うマウスのＢＷ、ＷＢＣ、及びＬＹＭ。ＬＹＭ。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＢＭＤＭ、及びＭＡＣ－ＢＭＤＭ群のマウスの数は、それぞれ８匹、１０匹、及び１２匹であった。データは、平均±ｓ．ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。ＮＤは未検出。混合ＭＤＲＳＡ細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）におけるＭＡＣ－ＢＭＤＭの治療効果は、免疫抑制を伴う敗血症マウスを誘発した。ＭＡＣ－ＢＭＤＭによって治療した各マウスの血液中の細菌負荷。ＰＢＳ、ＰＢＳ－ＢＭＤＭ、及びＭＡＣ－ＢＭＤＭ群のマウスの数は、それぞれ８匹、１０匹、及び１２匹であった。細胞取り込み、エンドサイトーシス経路、エンドソーム脱出、及び免疫抑制を伴うＭＤＲＳＡ誘発敗血症マウスにおけるＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果。Ｖ_ＣＬＮＰ、リポフェクタミン３０００、及びエレクトロポレーションでの処理後の細胞取り込み。Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ６４７陽性細胞のパーセンテージ。データは、平均±ｓ．ｄ．であり、３回である。マウスの数は各群で６匹であった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。細胞取り込み、エンドサイトーシス経路、エンドソーム脱出、及び免疫抑制を伴うＭＤＲＳＡ誘発敗血症マウスにおけるＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果。Ｖ_ＣＬＮＰ、リポフェクタミン３０００、及びエレクトロポレーションでの処理後の細胞取り込み。細胞の蛍光強度。データは、平均±ｓ．ｄ．であり、３回である。マウスの数は各群で６匹であった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。細胞取り込み、エンドサイトーシス経路、エンドソーム脱出、及び免疫抑制を伴うＭＤＲＳＡ誘発敗血症マウスにおけるＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果。マクロピノサイトーシス、カベオラエ－及びクラスリン－媒介性エンドサイトーシスをそれぞれ阻害する、エンドサイトーシス阻害剤であるＥＩＰＡ、ＭβＣＤ、及びＣＰＺの存在下での細胞取り込み。Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ６４７陽性細胞のパーセンテージ。データは、平均±ｓ．ｄ．であり、３回である。マウスの数は各群で６匹であった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。細胞取り込み、エンドサイトーシス経路、エンドソーム脱出、及び免疫抑制を伴うＭＤＲＳＡ誘発敗血症マウスにおけるＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果。マクロピノサイトーシス、カベオラエ－及びクラスリン－媒介性エンドサイトーシスをそれぞれ阻害する、エンドサイトーシス阻害剤であるＥＩＰＡ、ＭβＣＤ、及びＣＰＺの存在下での細胞取り込み。細胞の蛍光強度。データは、平均±ｓ．ｄ．であり、３回である。マウスの数は各群で６匹であった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。細胞取り込み、エンドサイトーシス経路、エンドソーム脱出、及び免疫抑制を伴うＭＤＲＳＡ誘発敗血症マウスにおけるＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果。カルセイン単独、またはＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ６４７ＲＮＡを含有するカルセイン及びＶ_ＣＬＮＰでインキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞の共焦点顕微鏡。カルセイン単独。マウスの数は各群で６匹であった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。細胞取り込み、エンドサイトーシス経路、エンドソーム脱出、及び免疫抑制を伴うＭＤＲＳＡ誘発敗血症マウスにおけるＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果。カルセイン単独、またはＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ６４７ＲＮＡを含有するカルセイン及びＶ_ＣＬＮＰでインキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞の共焦点顕微鏡。Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ６４７ＲＮＡを含有するカルセイン及びＶ_ＣＬＮＰ。マウスの数は各群で６匹であった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。細胞取り込み、エンドサイトーシス経路、エンドソーム脱出、及び免疫抑制を伴うＭＤＲＳＡ誘発敗血症マウスにおけるＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果。ｅＧＦＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰでインキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞の３Ｄ共焦点顕微鏡画像。マウスの数は各群で６匹であった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。細胞取り込み、エンドサイトーシス経路、エンドソーム脱出、及び免疫抑制を伴うＭＤＲＳＡ誘発敗血症マウスにおけるＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果。１２時間でＰＢＳ－ＲＡＷ群に正規化したＲＡＷ２６４．７細胞のパーセンテージ。データは、平均±ｓ．ｄ．であり、３回である。マウスの数は各群で６匹であった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。細胞取り込み、エンドサイトーシス経路、エンドソーム脱出、及び免疫抑制を伴うＭＤＲＳＡ誘発敗血症マウスにおけるＭＡＣ－ＲＡＷの治療効果。ＰＢＳ、ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｖ．）、またはＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）で治療された敗血症を有するマウスのパーセンテージ生存率。マウスの数は各群で６匹であった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない（両側スチューデントｔ－テスト）。マウスにおけるＢＭＤＭ及びＭＤＲＳＡの生体内分布。ａ、健常マウスまたは敗血症マウスにおける投与６時間後の腹膜液、血液、及び主要臓器におけるＢＭＤＭの分布。ｂ、感染６時間後の腹膜液、血液、及び主要臓器における細菌分布。Ｖ_ＣＬＮＰは、骨髄由来樹状細胞におけるルシフェラーゼｍＲＮＡ送達を媒介する。Ｖ_ＣＬＮＰは、リポフェクタミン３０００（Ｌｉｐｏ３０００）よりも１７倍有効であり、骨髄由来樹状細胞において同じｍＲＮＡ濃度での電気穿孔よりも８倍有効である。

敗血症は、伝統的に病原体に対する制御不能な炎症反応とみなされていた。しかしながら、研究者は、４０回以上の抗炎症剤の臨床試験の失敗後に、敗血症の治療アプローチを再評価している。臨床データは、６０％以上の敗血症患者が最初の炎症ストームを経て生存するが、免疫細胞の麻痺及び死亡を特徴とする、より長い免疫抑制状態に急速に進行し、侵入病原体を排除することができず、病院で獲得した感染症に対する感受性が増加し、死亡率が高いことを明らかにしている。結果として、潜在的な治療標的は、アナフィラトキシンＣ５ａの除去またはＣ５ａ受容体の遮断等の敗血症を治療するために広範囲にわたって探索されている。一方、免疫機能の回復を目指すアプローチが開発され、敗血症患者において試験が行われている。

マクロファージは、感染時に最も効率的な病原体スカベンジャーの１つである。敗血症の患者では、マクロファージ／単球の障害は、抗菌防御が不十分である主な原因となり得る。免疫刺激剤のいくつかの小規模な臨床試験は、非活性化されたマクロファージ／単球を逆転させることで、感染撲滅を促進する利点を示している。対照的に、大規模な臨床試験のメタアナリシスは、患者死亡率を低下させる際に有意な変化を示さなかった。いくつかの理由が、これらの異なる臨床結果につながる可能性がある。まず、免疫刺激剤は、障害されたマクロファージ／単球の機能を元のレベルに復元することができない。第二に、侵入した細菌は、通常、マクロファージファゴソームに閉じ込められ、マクロファージファゴソームはさらにリソソームと融合してファゴリソソームを形成する。ファゴリソソーム内では、反応性酸素種（ＲＯＳ）、反応性窒素種（ＲＮＳ）及び溶解酵素が相乗的に働き、細菌を除去する。しかしながら、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ等の多くの細菌は、ＲＯＳ及びＲＮＳを掃除すること、及び溶解酵素に抵抗することを含むファゴリソソーム殺傷を妨げるための免疫逃避機構を進化させ、細胞内生存及び再発感染をもたらしている。第三に、敗血症臨床ガイドラインでは併用抗生物質療法が標準的な治療法であるが、敗血症死の７０％～８０％が持続感染症に関連しており、抗生物質耐性の有病率と新しい抗菌剤の不足が示されている。代替として、養子細胞移入に基づく免疫療法は、機能不全の免疫細胞を回復する必要性を迂回し、したがって、免疫不全患者に潜在的な利益をもたらす。

本明細書に開示されるのは、リソソーム中に抗菌ペプチド／カテプシンＢを負荷したマクロファージ（ＭＡＣ）を使用した養子移入である。ＭＡＣを構築するために、抗菌ペプチド／カテプシンＢ（ＡＭＰ－ＣａｔＢ）ｍＲＮＡを設計した。ビタミンＣ脂質ナノ粒子（Ｖ_ＣＬＮＰ）は、ＲＡＷ２６４．７細胞株及び骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の両方におけるリポフェクタミン３０００及びエレクトロポレーションよりも効率的なｍＲＮＡの送達により同定された。Ｖ_ＣＬＮＰは、抗菌活性の重要な位置であるマクロファージリソソームにおけるＡＭＰ－ＣａｔＢの特異的な蓄積を可能にする。また、本明細書において、養子ＭＡＣ移行は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉを含むＭＤＲ細菌を排除し、免疫不全敗血症モデルにおいてマウスの体調を回復させ、ＭＤＲ細菌誘発性敗血症を克服するための戦略を提供し、感染症に対するナノ粒子細胞療法の開発について明らかにすることも開示される。本発明の実施形態を詳細に参照するが、それらの例は、図面及び実施例に例証されている。しかし、本発明は、多くの異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。

別途に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に普通に理解されるのと同じ意味を有する。

用語
本出願を通じて使用される用語は、当業者にとって一般的で典型的な意味で解釈されるべきである。しかしながら、出願人は、以下に定義される特定の定義を与えることを望む。

本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、冠詞が使用される文脈が明らかにそうではないと指示しない限り、「少なくとも１つ」を意味する。

本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語及びその変形は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語及びその変形と同義に用いられ、限定されていない、非限定的な用語である。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、様々な実施形態を説明するために本明細書で使用されてきたが、「本質的にからなる」及び「からなる」という用語は、より具体的な実施形態を提供するために「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の代わりに使用している場合があり、また開示されている。

本明細書で使用される場合、「得る（ｍａｙ）」、「任意により（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」、「任意によりあり得る（ｍａｙｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」という用語は同義的に使用され、この状態が発生する場合、及びこの状態が発生しない場合を含むことを意味する。したがって、例えば、製剤が「賦形剤を含み得る」という記述は、製剤が賦形剤を含む場合、及び製剤が賦形剤を含まない場合を含むことを意味する。

「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように、「に近い」と定義される。１つの非限定的な実施形態では、該用語は、１０％以内であると定義される。別の非限定的な実施形態において、該用語は、５％以内であると定義される。さらに別の非限定的な実施形態では、該用語は、１％内にあると定義される。

本明細書で使用される「核酸」という用語は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）から構成されるポリマーを意味する。

本明細書で使用される「リボ核酸」及び「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。

本明細書で使用される「デオキシリボ核酸」及び「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖ヌクレオチド多量体を示す。好適なオリゴヌクレオチドは、ＢｅａｕｃａｇｅａｎｄＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，２２：１８５９－１８６２（１９８１）によって記載されているホスホラミダイト法、もしくはＭａｔｔｅｕｃｃｉ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５（１９８１）によるトリエステル法（ともに参照により本明細書に組み込まれる）によって、または商業的な自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーもしくはＶＬＳＩＰＳＴＭ技術のいずれかを使用する他の化学的方法によって調製され得る。オリゴヌクレオチドが「二本鎖」と称される場合、当業者であれば、一対のオリゴヌクレオチドが、典型的には、例えば、ＤＮＡと会合した水素結合螺旋配列中に存在することを理解する。本明細書で使用される「二本鎖」という用語は、二本鎖オリゴヌクレオチドの１００％相補的形態に加えて、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＴｈｉｒｄＥｄ．，（１９８８）等の生化学テキストでより完全に記載される、バルジ及びループ等の構造的特徴を含む形態を指すことも意味する。

「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドモノマーから構成される一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。

「ポリペプチド」という用語は、Ｄ－アミノ酸もしくはＬ－アミノ酸の一本鎖、またはペプチド結合によって連結されたＤ－アミノ酸及びＬ－アミノ酸の混合物から構成される化合物を指す。

「プロモーター」または「調節エレメント」という用語は、転写開始から上流または下流に位置し、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ及び他のタンパク質の認識及び結合に関与する領域または配列決定因子を指す。プロモーターは、細菌起源である必要はなく、例えば、ウイルスまたは他の生物に由来するプロモーターは、本明細書に記載の組成物、システム、または方法で使用することができる。

「組換え」という用語は、ヒト操作核酸（例えば、ポリヌクレオチド）もしくはヒト操作核酸（例えば、ポリヌクレオチド）の複製もしくは相補体を指し、またはタンパク質（すなわち、「組換えタンパク質」）に関しては、組換え核酸によってコードされるタンパク質（例えば、ポリヌクレオチド）を指す。いくつかの実施形態において、第２の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）に操作可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットは、ヒト操作の結果として第２の核酸（例えば、ポリヌクレオチド等）に対して異種であるプロモーターを含み得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ－ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＶｏｌｕｍｅｓ１－３，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４－１９９８）に記載されている方法による）。別の例では、組換え発現カセットは、核酸（例えば、ポリヌクレオチド）が自然界に見出される可能性が非常に低いように組み合わされた核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を含み得る。例えば、ヒトが操作する制限部位またはプラスミドベクター配列は、プロモーターを第２の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）に隣接させるかまたは分離させ得る。当業者であれば、核酸（例えば、ポリヌクレオチド）が多くの方法で操作され得、上記の例に限定されないことを認識するであろう。

「発現カセット」または「ベクター」という用語は、宿主細胞に導入されたときに、それぞれ、ＲＮＡまたはポリペプチドの転写及び／または翻訳をもたらす核酸コンストラクトを指す。いくつかの実施形態において、第２の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）に操作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットは、ヒトによる操作の結果として第２の核酸（例えば、ポリヌクレオチド等）に対して異種であるプロモーターを含み得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ－ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＶｏｌｕｍｅｓ１－３，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４－１９９８）に記載されている方法による）。

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一性」またはパーセント「同一性」という用語は、下記のデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０シーケンス比較アルゴリズムを使用して、または手動のアラインメント及び目視検査によって測定された（例えば、ＮＣＢＩＷｅｂサイト等を参照）、同一であるか、または同一である特定のパーセンテージ（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域で最大の対応を得るために比較し、アラインされた場合、指定された領域で、約６０％の同一性、好ましくは６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。そのような配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義は、試験配列の相補体を指すか、または相補体に適用され得る。この定義には、欠失及び／または付加を有する配列、及び置換を有する配列も含む。以下に記載のとおり、好ましいアルゴリズムは、ギャップ等を説明できる。好ましくは、同一性は、少なくとも約１０アミノ酸もしくは２０ヌクレオチド長である領域、またはより好ましくは、１０～５０アミノ酸もしくは２０～５０ヌクレオチド長である領域に存在する。本明細書で使用される場合、アミノ酸配列同一性パーセント（％）は、参照配列内のアミノ酸と同一である候補配列内のアミノ酸のパーセンテージとして定義され、配列をアラインさせ、必要に応じてギャップを導入した後、最大の配列同一性パーセントを得る。配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等、公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメータは、既知の方法によって決定できる。

配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として機能し、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、デフォルトのプログラムパラメータを使用することができるか、または代替的パラメータを指定することができる。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。

配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するために好適であるアルゴリズムの好ましい一例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである（それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９－３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０に記載されている）。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して一般に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列における同じ長さのワードと整列するときに何らかの正値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たす、問い合わせ配列における長さの短いワードＷを特定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を特定することを伴う。Ｔは、近傍のワードスコア閾値と称する（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）。これらの最初の近傍のワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すために検索を開始するためのシード値として機能する。ワードヒットは、累積整列スコアが増加することができる限り、各配列に沿って両方向に延びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチする残基の対に対するリワードスコア；常に０超）及びＮ（ミスマッチの残基に対するペナルティスコア；常に０未満）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコア化マトリックスを使用して累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの拡張は、累積整列スコアがその最大の実績値から量Ｘ分減少する場合、累積スコアが、１つ以上の負のスコアの残基整列の蓄積に起因してゼロ以下になる場合、またはいずれかの配列の終端に達する場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、１１のワード長（Ｗ）、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較をデフォルトで使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）、及び５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９），Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ８９：１０９１５を参照）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較をデフォルトで使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う（例えば、ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－５７８７を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の１つの測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こり得る確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸とを比較した際の最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満である場合に、参照配列に類似しているとみなされる。

「コドン最適化」という句は、様々な宿主へのトランスフォーメーション用の核酸分子の遺伝子またはコード領域に関する場合、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変せずに、選択された生物の典型的なコドン使用頻度を反映するように、そのポリ核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンを改変することを指す。このような最適化としては、少なくとも１つ、２つ以上または有意な数のコドンを、選択された生物の遺伝子での使用頻度がより高い１つ以上のコドンに置き換えることが挙げられる。

「核酸塩基」という用語は、ワトソン／クリックの塩基対形成機能を保有するヌクレオチドの部分を指す。最も一般的な天然の核酸塩基であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、及びチミン（Ｔ）は、ある核酸鎖を別の核酸鎖に配列特異的に結合する水素結合機能を保有する。

核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係性におかれるとき、「操作可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結しているか、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列に操作可能に連結しているか、あるいはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に操作可能に連結されている。概して、「操作可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡまたはＲＮＡ配列が互いに近接し、分泌リーダーの場合、連続的であり、リーディング相内にあることを意味する。しかし、操作可能に連結された核酸（例えば、エンハンサー及びコード配列）は、連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。かかる部位が存在していない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣例に従って使用される。いくつかの実施形態おいて、プロモーターは、そのコード配列からのタンパク質の発現に影響を与える（例えば、プロモーターの非存在に対して調節する）ことができる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列と操作可能に連結される。

用語「遺伝子」または「遺伝子配列」は、コード配列または対照配列、またはその断片を指す。遺伝子は、コード配列及び制御配列、またはその断片の任意の組み合わせを含んでもよい。したがって、本明細書で言及される「遺伝子」は、天然遺伝子のすべてまたは一部であり得る。本明細書で言及されるポリヌクレオチド配列は、「遺伝子」という用語と互換的に使用されてもよく、または任意のコード配列、非コード配列もしくは対照配列、それらの断片、及びそれらの組み合わせを含んでもよい。用語「遺伝子」または「遺伝子配列」は、例えば、コード配列の上流の制御配列（例えば、リボソーム結合部位）を含む。

「ナノ粒子」という用語は、本明細書で使用される場合、そのような使用の環境による化学的及び／または物理的破壊と生体適合性であり、それに十分に耐性がある粒子または構造を指し、その結果、十分な数のナノ粒子が、適用または治療の部位に送達された後も実質的に無傷のままであり、そのサイズがナノメートル範囲にある。本発明の目的のために、ナノ粒子は、典型的には、約１ｎｍ～約１０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約３５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２５０ｎｍ、または約１１０ｎｍ～約１５０ｎｍの範囲である。

「敗血症の症状」という語句は、動脈性低血圧、代謝性アシドーシス、発熱、全身血管抵抗の低下、頻呼吸及び臓器機能障害を含むがこれらに限定されない敗血症を有する対象の任意の症状特性を指す。敗血症は、菌血症（すなわち、血液中の細菌）等の敗血症（すなわち、生物、それらの代謝最終産物、または血流中の毒素）、及び内毒素血症（すなわち、血液中の内毒素）等の毒素血症（すなわち、血液中の毒素）から生じ得る。「敗血症」という用語はまた、真菌血症（すなわち、血液中の真菌）、ウイルス血症（すなわち、血液中のウイルスまたはウイルス粒子）、及び寄生虫斑症（すなわち、血液中の蠕虫寄生虫または原虫寄生虫）を包含する。したがって、敗血症及び敗血症性ショックに関連する表現型（敗血症に起因する急性循環不全は、しばしば多臓器不全及び高い死亡率に関連する）は、敗血症の症状である。

本明細書で使用される場合、対象の「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を治癒する（ｃｕｒｉｎｇ）、解消する（ｈｅａｌｉｎｇ）、緩和させる（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）、取り除く（ｒｅｌｉｅｖｉｎｇ）、変化させる、治療する、軽減する、改善する、安定化させるまたは影響を与える目的で対象へ薬物を投与することを含む。「治療する」及び「治療」という用語はまた、症状の重症度及び／または頻度の減少、症状及び／または根本的な原因の排除、及び損傷の改善または修復を指すこともある。

「治療剤」は、有益な生物学的効果を有する任意の組成物を指す。有益な生物学的効果は、例えば、障害または他の望ましくない生理学的状態の治療等の治療効果と、例えば、障害または他の望ましくない生理学的状態の予防等の予防効果の両方を含む。これらの用語はまた、細胞、塩、エステル、アミド、プロエージェント、活性代謝物、異性体、断片、類似体等を含むがこれらに限定されない、本明細書で具体的に言及される有益な剤の薬学的に許容される薬理学的に活性な誘導体を包含する。「治療剤」という用語が使用される場合、または特定の薬剤が具体的に特定される場合、その用語は、薬剤自体、及び薬学的に許容される薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロエージェント、コンジュゲート、活性代謝物、異性体、断片、類似体等を含む。

組成物の「治療有効量」または「治療有効用量」は、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。いくつかの実施形態において、所望の治療結果は、敗血症の治療である。いくつかの実施形態において、所望の治療結果は、敗血症患者の免疫系を回復することである。いくつかの実施形態において、所望の治療結果は、病原体の低減またはクリアランスである。所与の治療剤の治療有効量は、典型的には、治療される障害または疾患の種類及び重症度、及び対象の年齢、性別、及び体重等の因子に関して変化するであろう。この用語はまた、所望の治療効果を促進するのに有効な治療剤の量、または治療剤の送達速度（例えば、経時的な量）を指すことができる。正確な所望の治療効果は、治療される状態、対象の寛容度、投与される薬剤及び／または薬剤製剤（例えば、治療剤の効力、製剤中の薬剤の濃度等）、及び当業者に理解される様々な他の因子に応じて変化するであろう。いくつかの場合において、所望の生物学的または医学的応答は、複数の用量の組成物を対象に数日、数週間、または数年にわたって投与した後に達成される。

「薬学的に許容される担体」（「担体」と呼ばれることもある）は、一般に安全かつ毒性のない医薬組成物または治療用組成物を調製する際に有用な担体または賦形剤を意味し、獣医及び／またはヒトの薬学的使用または治療的使用に許容される担体を含む。「担体」または「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（油／水もしくは水／油エマルジョン等）及び／または様々なタイプの湿潤剤を含むことができるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、または医薬製剤中で使用するため当技術分野で周知の他の材料を包含する。組成物に使用するための担体の選択は、組成物の意図される投与経路に依存する。これらの材料を含有する薬学的に許容される担体及び製剤の調製は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅＳｃｉｅｎｃｅｓｉｎＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５に記載されている。生理学的に許容される担体の例としては、生理食塩水、グリセロール、ＤＭＳＯ、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩、及び他の有機酸を含む緩衝液等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールもしくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）（ＩＣＩ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）（ＢＡＳＦ；ＦｌｏｒｈａｍＰａｒｋ，ＮＪ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。所望の治療的処置のためのかかる用量の投与を提供するために、本明細書に開示される組成物は、有利には、担体または希釈剤を含む全組成物の重量に基づいて、対象化合物のうちの１つ以上の総量の約０．１重量％～９９重量％を含むことができる。

全体を通して使用される場合、「対象」（または「宿主」）は、個体を意味する。したがって、「対象」には、例えば、ネコ、イヌ等の飼育動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット等）、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、霊長類、非ヒト霊長類、げっ歯類、トリ、爬虫類、両生類、魚、及び任意の他の動物を挙げることができる。対象は、霊長類またはヒト等の哺乳動物であり得る。

抗原提示細胞
いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、抗原提示細胞であって、
脂質ベースのナノ粒子を含み、脂質ベースのナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
カテプシンＢをコードする第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、抗原提示細胞である。

いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、抗原提示細胞であって、
脂質ベースのナノ粒子を含み、脂質ベースのナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
カテプシンＢペプチドをコードする第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、抗原提示細胞である。

いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、抗原提示細胞であって、
脂質ベースのナノ粒子を含み、脂質ベースのナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
カテプシンペプチドをコードする第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、抗原提示細胞である。

いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、マクロファージまたは樹状細胞を含む。

本明細書で使用される「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という用語は、特定のリンパ球（例えば、Ｔ細胞及びＢ細胞）の応答を刺激するための抗原を処理し、提示することができる免疫細胞の異種群を指すことを理解されたい。古典的ＡＰＣとしては、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、及び好中球が挙げられる。

マクロファージは、免疫細胞を貪食すると一般に知られていることを本明細書で理解されたい（Ｍｅｓｚａｒｏｓｅｔａｌ，１９９９）。また、それらは、ケモカインまたはサイトカイン等の因子を分泌する。貪食作用及び抗原提示に加えて、これらの細胞は、形質膜及び分泌分子の多様なレパートリーを通じて支持的な役割を果たし得る（Ｇｏｒｄｏｎ１９９５，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，Ｖｏｌｕｍｅ１７，Ｉｓｓｕｅ１１）、このことは、以前に赤芽球、肝細胞及びニューロンについて示されている（Ｓａｄａｈｉｒａ＆Ｍｏｒｒ，ＰａｔｈｏｌＩｎｔ．１９９９Ｏｃｔ；４９（１０）：８４１－８．）、（Ｔａｋｅｉｓｈｉ，Ｈｉｒａｎｏ，ｅｔａｌ．ＡｒｃｈＨｉｓｔｏｌＣｙｔｏｌ．１９９９Ｄｅｃ；６２（５）：４１３－２２．）、（Ｐｏｌａｚｚｉ，Ｇｉａｎｎｉ，ｅｔａｌ．，Ｇｌｉａ．２００１Ｄｅｃ；３６（３）：２７１－８０．）。「マクロファージ」とは、通常、食作用、ＣＤ６４、ＣＤ１４及びＨＬＡ－ＤＲ抗原発現等の定義された細胞表面マーカーの発現を含む、マクロファージについて記載される特性を示す細胞を意味する。本発明によるマクロファージは、血液単球（本明細書では「単球由来マクロファージ」とも呼ばれる）、骨髄前駆細胞（本明細書では「骨髄由来マクロファージ」とも呼ばれる）、または任意の他の可能な前駆体からのエクスビボ分化によって、または優先的に、任意の分化方法、前駆体、及び任意の当業者によって知られている方法を使用することによって、組織から単離され得る。したがって、いくつかの実施形態において、マクロファージは、骨髄由来マクロファージを含む。いくつかの実施形態において、マクロファージは、単球由来マクロファージを含む。いくつかの実施形態において、マクロファージは、ｉＰＳＣ－由来マクロファージを含む。いくつかの実施形態において、マクロファージは、例えば、ＲＡＷ２６４．７、ＴＨＰ－１、Ｕ９３７、ＩＣ－２１、Ｊ７７４Ａ．１、ＭＶ－４－１１、またはＫＧ１を含むマクロファージ細胞株を含む。

本明細書で使用される「樹状細胞」または「ＤＣ」は、抗原提示細胞の種類を指し、典型的には、その細胞表面上の以下のマーカーのうちの１つ以上の発現によって識別されることも理解されたい：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、及びＣＤ１ｃ、ＣＤ４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、及びＨＬＡ－ＤＲ。いくつかの実施形態において、樹状細胞は成熟ＤＣである。いくつかの実施形態において、樹状細胞は未成熟ＤＣである。本発明によるＤＣは、血液単球（本明細書では「単球由来樹状細胞」とも呼ばれる）、骨髄前駆細胞（本明細書では「骨髄由来樹状細胞」とも呼ばれる）、または任意の他の可能な前駆体からのエクスビボ分化によって、または優先的に、任意の分化方法、前駆体、及び任意の当業者によって知られている方法を使用することによって、組織から単離され得る。したがって、いくつかの実施形態において、樹状細胞は、骨髄由来樹状細胞を含む。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、単球由来の樹状細胞である。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、ｉＰＳＣ由来の樹状細胞である。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、従来の樹状細胞１（またはｃＤＣ１、リンパ系ＤＣ）であり、これは典型的には、その細胞表面上の以下のマーカーのうちの１つ以上の発現によって識別される：ＣＤ１４１、ＣＬＥＣ９Ａ、及びＸＣＲ１。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、従来の樹状細胞２（またはｃＤＣ２、骨髄ＤＣ）であり、これは典型的には、その細胞表面上の以下のマーカーのうちの１つ以上の発現によって識別される：ＣＤ１ｃ及びＣＤ１７２ａ。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、形質細胞様ＤＣ（またはｐＤＣ）であり、これは典型的には、その細胞表面上の以下のマーカーのうちの１つ以上の発現によって識別される：ＣＤ１２３、ＣＤ３０３、及びＣＤ３０４。

いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、マウス、ラット、ヒト、または非ヒト霊長類からなる群から選択される対象に由来する。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞はマウスに由来する。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞はラットに由来する。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞はヒトに由来する。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、非ヒト霊長類に由来する。

ナノ粒子
多数のナノ粒子が本明細書に記載されているが、当該技術分野で既知の追加のナノ粒子も本明細書で使用することができる。

いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、脂質ベースのナノ粒子であって、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
カテプシンＢをコードする第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、脂質ベースのナノ粒子である。

いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、脂質ベースのナノ粒子であって、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
カテプシンＢペプチドをコードする第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、脂質ベースのナノ粒子である。

いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、脂質ベースのナノ粒子であって、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
カテプシンペプチドをコードする第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン脂－質と、を含む、脂質ベースのナノ粒子である。

本明細書で使用される「ビタミン－脂質」という用語は、ビタミン部分及び脂質を含む化合物を指し、脂質は、脂質様部分であり得る。「ビタミン－脂質」という用語はまた、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１９／０２７９９９により完全に記載される形態を指すことを意味する。したがって、ビタミン－脂質は、例えば、式Ａの化合物

またはその塩であり得、式中、
Ｒ^１はアルキルまたはエーテルリンカーであり、ここでアルキルまたはエーテルリンカーはビタミン部分で置換され、
Ｒ^２は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル、アミド、アルキルアミド、エーテル、アルキルエーテルであり、

式中、ｍは１～２０の整数であり、
ｎは１～３の整数であり、
各Ｒ^３は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、エステル、またはアルキルエステルから選択される。

１つの実施形態では、ビタミン－脂質は、式Ｉの化合物

またはその塩であり得、式中、
Ｒ^１は、アルキルまたはエーテルリンカーであり、アルキルまたはエーテルリンカーは、炭水化物部分、リン酸部分、またはビタミン部分で置換され、
各Ｒ^３は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、エステル、またはアルキルエステルから選択される。

ビタミン部分は、例えば、ビタミンＢ３、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＨ、またはそれらの誘導体であり得る。いくつかの実施形態において、ビタミン部分は、ビタミンＣまたはその誘導体である。ビタミン部分を以下に示す。

いくつかの実施形態において、ビタミン－脂質は、以下を含む。

いくつかの実施形態において、ビタミン－脂質は、

またはそれらの塩からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、ビタミン－脂質は、

またはそれらの塩からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、脂質ベースのナノ粒子は、約１０％～約６０％のモル比のビタミン－脂質を含む。いくつかの実施形態において、脂質ベースのナノ粒子は、約１０％～約４０％のモル比のビタミン－脂質を含む。いくつかの実施形態において、脂質ベースのナノ粒子は、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、または約８０％のモル比でビタミン－脂質を含む。１つの実施形態において、脂質ベースのナノ粒子は、約３０％のモル比のビタミン－脂質を含む。

いくつかの実施形態において、脂質ベースのナノ粒子は、非陽イオン性脂質をさらに含み、非陽イオン性脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン、１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２－ジオレオイル－５／７－グリセロ－３－ホスホ（ｌ’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、脂質ベースのナノ粒子は、ポリエチレングリコール脂質（ＰＥＧ脂質）をさらに含み、これは、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジル酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、及びＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールを含むことができるが、これらに限定されない。代表的なポリエチレングリコール脂質としては、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＤＬＰＥ－ＰＥＧ、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ、ＤＰＰＣ－ＰＥＧ、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧが挙げられる。

いくつかの実施形態において、脂質ベースのナノ粒子は、ＰＥＧ化コレステロール、ＤＣ－Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン、またはそれらの組み合わせをさらに含む。

いくつかの実施形態において、脂質ベースのナノ粒子は、組換えポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドは、ビタミン－脂質によって封入され得る。

ポリヌクレオチド及びポリペプチド
いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドはＤＮＡである。

本明細書に開示される「抗菌ペプチド」という用語は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌等の細菌及び酵母、カビ等の真菌からなる群から選択される１つ以上に対する抗菌活性を有するペプチドまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、抗菌ペプチドは、配列番号１、またはその断片もしくは機能的に活性な変異体を含む。いくつかの実施形態において、抗菌ペプチドは、配列番号１と少なくとも６０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一であるポリペプチド配列を含む群から選択される。いくつかの実施形態において、抗菌ペプチドは、プロテグリン１、Ｃ１６Ｇ２、オミガナン、β－デフェンシンズ、ｈＬＦ１－１１、ＬＬ３７、またはＭＳＩ－７８、またはそれらの断片もしくは機能的に活性な変異体から選択される。これらの抗菌ペプチド配列及び追加の抗菌ペプチドは、当該技術分野で既知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，７５４，０３９号を参照されたい。

任意の前述の態様の抗菌ペプチドは、組換えポリヌクレオチドの第１の核酸によってコードされ得る。いくつかの実施形態において、第１の核酸は、配列番号２、またはその断片もしくは機能的に活性な変異体を含む。いくつかの実施形態において、第１の核酸は、配列番号２と少なくとも６０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一であるポリヌクレオチド配列を含む群から選択される。

本明細書に開示されるカテプシンＢは、配列番号３に記載されるポリペプチド配列、またはその断片もしくは機能的に活性な変異体を含む。いくつかの実施形態において、カテプシンＢは、配列番号３と少なくとも６０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一であるポリペプチド配列を含む群から選択される。

任意の前述の態様のカテプシンＢは、組換えポリヌクレオチドの第２の核酸によってコードされ得る。いくつかの実施形態において、第２の核酸は、配列番号４、またはその断片もしくは機能的に活性な変異体を含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸は、配列番号４と少なくとも６０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一であるポリヌクレオチド配列を含む群から選択される。

いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、抗原提示細胞であって、
脂質ベースのナノ粒子を含み、脂質ベースのナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、抗原提示細胞である。

いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、抗原提示細胞であって、
脂質ベースのナノ粒子を含み、脂質ベースのナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
カテプシンペプチドをコードする第２の核酸、及び、
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン脂質と、を含む、抗原提示細胞である。

いくつかの実施形態において、カテプシンペプチドをコードする第２の核酸は、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＦ、もしくはカテプシンＧ、またはその断片もしくは機能的に活性な変異体を含む。これらの配列は当該技術分野で既知であり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で見つけることができる。いくつかの実施形態において、該配列は哺乳類由来である。いくつかの実施形態において、該配列はマウス由来ある。いくつかの実施形態において、該配列は霊長類由来である。いくつかの実施形態において、該配列はヒト由来である。

いくつかの実施形態において、リンカーはカテプシンＢ感受性リンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号５に記載のポリペプチド配列、またはその断片もしくは機能的に活性な変異体を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号５と少なくとも６０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一であるポリペプチド配列を含む群から選択される。

任意の前述の態様のリンカーは、第３の核酸によってコードされ得る。いくつかの実施形態において、第３の核酸は、配列番号６、またはその断片もしくは機能的に活性な変異体を含む。いくつかの実施形態において、第３の核酸は、配列番号６と少なくとも６０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一であるポリヌクレオチド配列を含む群から選択される。

いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２に示されるポリペプチド配列、またはその断片もしくは機能的に活性な変異体を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２と少なくとも６０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一であるポリヌクレオチド配列を含む群から選択される。いくつかの実施形態において、リンカーはＰｈｅ－Ｌｙｓでもあり得る。

いくつかの実施形態において、任意の前述の態様の組換えポリヌクレオチドは、配列番号７、またはその断片もしくは機能的に活性な変異体を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号７と少なくとも６０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一であるポリヌクレオチド配列を含む群から選択される。

いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８に記載の配列を含む組換えポリペプチド、またはその断片もしくは機能的に活性な変異体をコードする。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８と少なくとも６０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一であるポリヌクレオチド配列を含む群から選択される。

治療の方法
いくつかの態様において、本明細書において開示されるのは、敗血症の治療方法であって、１つ以上の抗原提示細胞を対象に投与することを含み、抗原提示細胞が、

ナノ粒子を含み、ナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
カテプシンＢをコードする第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、方法である。

いくつかの態様において、本明細書において開示されるのは、敗血症の治療方法であって、１つ以上の抗原提示細胞を対象に投与することを含み、抗原提示細胞が、
ナノ粒子を含み、ナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、方法である。

いくつかの態様において、本明細書において開示されるのは、敗血症の治療方法であって、１つ以上の抗原提示細胞を対象に投与することを含み、抗原提示細胞が、
ナノ粒子を含み、ナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
カテプシンペプチドをコードする第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、方法である。

いくつかの態様において、本明細書において開示されるのは、敗血症の治療方法であって、１つ以上の抗原提示細胞を対象に投与することを含み、抗原提示細胞が、
ナノ粒子を含み、ナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
カテプシンＢペプチドをコードする第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、方法である。

上記に開示されるように、「敗血症」という用語はまた、細菌血症（すなわち、血液中の細菌）、毒素血症（すなわち、血液中の毒素）、真菌血症（すなわち、血液中の真菌）、ウイルス血症（すなわち、血液中のウイルスまたはウイルス粒子）、及び寄生虫斑症（すなわち、血液中のヘルミンシックまたは原虫寄生虫）を包含する。したがって、敗血症及び敗血症性ショックに関連する表現型（敗血症に起因する急性循環不全は、しばしば多臓器不全及び高い死亡率に関連する）は、敗血症の症状である。したがって、本明細書に開示されるのは、敗血症または敗血症の症状（例えば、血液中の細菌、毒素、真菌、ウイルスもしくは寄生虫の負荷を低減すること、及び／または罹患した対象の免疫系を回復、維持、もしくは改善すること）を治療、阻害、または低減する方法である。

いくつかの実施形態において、任意の先行する態様の抗原提示細胞は対象に由来する。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は対象に由来する。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は異なる対象に由来する。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、ヒトは敗血症を有するか、または有すると疑われる。

いくつかの実施形態において、敗血症の治療方法は、対象に任意の前述の態様の１つ以上の抗原提示細胞を投与することを含み、１つ以上の抗原提示細胞が調製され、薬学的に許容される担体とともに投与される。

敗血症のタイミングはしばしば予測できないため、敗血症症状の発症前または発症後に、敗血症を治療、予防、阻害、及び／または低減するために、敗血症の治療、予防、低減、及び／または阻害の開示された方法を使用することができることを理解されたい。ここで、開示される方法は、敗血症の前の任意の時間に実施することができる。１つの態様では、開示された方法は、敗血症の前の、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１か月、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３日、６０、４８、３６、３０、２４、１８、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２時間、６０、４５、３０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１分、または敗血症の後の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、９０、１０５、１２０分、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４５、６０、９０以上の日、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上の月、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１年に使用することができる。

本発明の抗原提示細胞は、当該技術分野で既知の任意の方法で、例えば、経口、筋肉内、静脈内、舌下粘膜、動脈内、髄腔内、皮内、腹腔内、鼻腔内、肺内、眼内、膣内、直腸内、または皮下に適切な対象に投与することができる。これらは、消化管または呼吸器に導入され得る。組成物の非経口投与は、使用される場合、一般に注射を特徴とする。

いくつかの態様において、本明細書において開示されるのは、疾患の治療方法であって、１つ以上の抗原提示細胞を対象に投与することを含み、抗原提示細胞が、
ナノ粒子を含み、ナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
第２の核酸（例えば、カテプシンＢペプチド等のカテプシンペプチドをコードする）、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、方法である。

いくつかの態様において、本明細書において開示されるのは、がんの治療方法であって、１つ以上の抗原提示細胞を対象に投与することを含み、抗原提示細胞が、
ナノ粒子を含み、ナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
第２の核酸（例えば、カテプシンＢペプチド等のカテプシンペプチドをコードする）、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、方法である。

いくつかの実施形態において、疾患は、リソソーム貯蔵障害、アスパルチルグルコサミン尿症、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、またはムコ多糖症から選択される。

いくつかの態様において、本明細書において開示されるのは、神経変性疾患を治療する方法であって、１つ以上の抗原提示細胞を対象に投与することを含み、抗原提示細胞が、
ナノ粒子を含み、ナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
第２の核酸（例えば、カテプシンＢペプチド等のカテプシンペプチドをコードする）、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、方法である。

いくつかの実施形態において、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病から選択される。

さらに他の実施形態において、治療有効量の任意の先行態様の免疫細胞を対象に投与することを含む、疾患の治療方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、疾患は、リソソーム貯蔵障害、アスパルチルグルコサミン尿症、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、またはムコ多糖症から選択される。

追加の組成物及び方法
いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、免疫細胞であって、
脂質ベースのナノ粒子を含み、脂質ベースのナノ粒子が、
免疫タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン脂質と、を含み、
免疫細胞がＴ細胞を含む、免疫細胞である。

いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドはＤＮＡである。

いくつかの実施形態において、免疫タンパク質は、キメラ抗原受容体または細胞傷害性サイトカインを含む。

いくつかの実施形態において、免疫タンパク質はキメラ抗原受容体である。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、またはＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。

いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に結合する。

いくつかの実施形態において、免疫タンパク質は、例えば、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子、グランザイムＡ、グランザイムＢ、またはパーフォリンを含む細胞傷害性サイトカインである。

いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるのは、対象に治療有効量の任意の前述の態様の免疫細胞を投与することを含む、がんの治療方法である。

いくつかの実施形態において、治療有効量の任意の先行態様の免疫細胞を対象に投与することを含む、神経変性疾患の治療方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病から選択される。

いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、ヒトは、がんを有するか、または有すると疑われる。

以下の実施例は、開示された主題による組成物、方法、及び結果を説明するために以下に記載している。これらの実施例は、本明細書に開示される主題のすべての態様を含むことを意図するものではなく、むしろ代表的な方法及び結果を説明することを意図している。これらの実施例は、当業者に明らかである本発明の同等物及び変形を除外することを意図するものではない。

実施例１．ビタミン脂質ナノ粒子は、治療に養子マクロファージ移入を提供する
多剤耐性細菌性敗血症
本明細書に開示されるデータは、リソソーム中の抗菌ペプチド／カテプシンＢを負荷したマクロファージ（ＭＡＣ）の養子移入が、免疫不全敗血症宿主を提供して、先天性免疫を増強し、細菌の免疫回避を防止し、多剤耐性（ＭＤＲ）細菌を排除することを示す。図１ａに示すように、ｍＲＮＡ（ＡＭＰ－ＣａｔＢ）を、抗菌ペプチドＩＢ３６７（ＡＭＰ－ＩＢ３６７）、カテプシンＢ（ＣａｔＢ）、及び切断可能なリンカーをコードする複数の構成要素で設計及び構築した。ＡＭＰ－ＩＢ３６７は、迅速な殺菌活性を有する広域ＡＭＰであり、臨床試験において確認されている。内因性タンパク質であるＣａｔＢは、まず、細胞質内で不活性前駆体として翻訳され、リソソーム内にトランスロケーションされる。次いで、これらの前駆体を成熟ＣａｔＢに加工する。ＣａｔＢ成分の機能は、ＡＭＰ－ＩＢ３６７をリソソーム内に輸送するために組み込まれ、リソソームは、細菌含有ファゴソームと融合する。細菌を根絶するためには、遊離ＡＭＰ－ＩＢ３６７をＡＭＰ－ＣａｔＢタンパク質から放出する必要がある。したがって、ｍＲＮＡ配列にＣａｔＢ感受性リンカーを添加した。リソソームは、大量のＣａｔＢタンパク質を有し、ＡＭＰ－ＩＢ３６７の放出を促進する。設計されたｍＲＮＡをマクロファージに備えるためには、マクロファージのための効率的なｍＲＮＡ送達システムが必要であり、これは、トランスフェクションが最も困難な細胞の１つである。マクロファージは、生物学的機能を達成するために異なるビタミンを取り込む。

最初のスクリーニング及び２ラウンドの特徴付けを通じて、ビタミンＣ脂質ナノ粒子（Ｖ_ＣＬＮＰ）の製剤は、ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡをマクロファージに効果的に送達することができた。ｍＲＮＡは細胞質内の機能性タンパク質に翻訳され、タンパク質はさらにリソソームにトランスロケーションされる。リソソームにおいて、ＣａｔＢ感受性リンカーは、ＣａｔＢタンパク質によって切断され、したがって、ＡＰＭ－ＩＢ３６７が放出される。細菌を封入するファゴソームがリソソームと融合すると、摂取した細菌は、事前に保存されたＡＭＰ－ＩＢ３６７及びリソソーム抗菌成分の両方に曝露される。免疫回避戦略は、ファゴリソソーム殺傷機構からＭＤＲ細菌を保護することができるが、ＡＭＰ－ＩＢ３６７は、動物モデル及びヒトにおけるＭＤＲ細菌に対する高い抗菌活性を有するため、これらの細菌を殺傷することができる。したがって、ＭＡＣの養子移入は、先天性免疫の回復、細菌の免疫回避の克服、及び感染の根絶によって、免疫抑制を伴う敗血症を誘発するＭＤＲ細菌を救出する。

最初にビタミンＢ３、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、及びビタミンＨ（ビタミンＢ７とも呼ばれる）の５つのビタミンが選択され、その後、以前に報告された方法を用いて脂質尾部が組み込まれた。アミノ酸脂質は、エステル結合またはアミド結合を介してこれらのビタミン上に設置された（図１ｂ）。これらの５つのビタミン由来脂質は、Ｖ_Ｂ３－脂質、Ｖ_Ｃ－脂質、Ｖ_Ｄ－脂質、Ｖ_Ｅ－脂質、及びＶ_Ｈ－脂質と命名された。脂質鎖中の三級アミンは、酸性条件でイオン化され、ｍＲＮＡと相互作用することができる。これらのビタミン由来脂質の構造を、^１ＨＮＭＲ及びマススペクトル（ＭＳ）によって確認した（図２～６）。

次に、これらのビタミン由来脂質を、それに応じてビタミン－脂質ナノ粒子（ＶＬＮＰ）に製剤化した。ＶＬＮＰの粒径は、１２７±１～１７４±１ｎｍの範囲であり、多分散性指数（ＰＤＩ）は、Ｖ_ＨＬＮＰを除いて＜０．３であった（図７ａ及び７ｂ）。ｍＲＮＡの閉じ込め効率は５２％～９９％の範囲内であり、すべてのＶＬＮＰが正に荷電した（図７ｃ及び７ｄ）。ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを使用したＲＡＷ２６４．７細胞の初期スクリーニングでは、Ｖ_ＣＬＮＰは、他の４つのＶＬＮＰよりも、ｍＲＮＡ送達に対して２０倍有効であった（図８ａ）。さらに、Ｖ_ＣＬＮＰは、リポフェクタミン３０００よりも１０倍優れており、同じｍＲＮＡ濃度でのエレクトロポレーションよりも５０倍優れていた（図８ａ）。加えて、Ｖ_ＣＬＮＰ群の最高発光強度は、６～２４時間での１２時間で観察された（図８ｂ）。Ｖ_ＣＬＮＰの製剤をさらに調べるために、直交アレイ設計を行って、成分比を微調整した。Ｌ_１６（４）^４直交アレイ設計表（図７ｅ）に基づいて、１６種の異なる製剤を調製した。この研究から、製剤Ｂ２（脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール＝３０：３０：４０）が得られた（図８ｃ及び８ｅ）。次いで、送達効率を、直交表における上位製剤Ａ１０（脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール＝３０：３０：５０）と比較して検証した。予測される製剤Ｂ２の発光強度は、製剤Ａ１０（Ｐ＜０．０５、図８ｄ及び８ｅ）よりも有意に高かった。ｍＲＮＡ送達効率をさらに向上させるために、５：１～２０：１の、製剤Ｂ２のＶ_Ｃ－脂質：ｍＲＮＡの質量比を調べた（図８ｄ）。第２のラウンドの特徴付けでは、Ｖ_Ｃ－脂質：ｍＲＮＡの質量比が１５：１になるまで増加するにつれて、発光強度が増強された（製剤Ｃ５、図８ｅ）。Ｖ_ＣＬＮＰの製剤Ｃ５は、Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ画像から球状形態で正に荷電した（図８ｆ及び図７ｆ）。これらの結果に基づいて、ｍＲＮＡ送達効率がその初期製剤の７倍以上向上したこのＶ_ＣＬＮＰの製剤を、さらなる研究のために選択した。

蛍光プローブを使用して、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ６４７標識ＲＮＡ、９９．２％のＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ６４７陽性細胞がＶ_ＣＬＮＰの群で、２１．５％がリポフェクタミン３０００の群で、２．４％がエレクトロポレーションの群で観察された（図１３ａ）。さらに、蛍光強度は、Ｖ_ＣＬＮＰで処理した細胞において、リポフェクタミン３０００またはエレクトロポレーションで処理した細胞と比較して、それぞれ約４倍及び１６倍であった（図１３ｂ）。これらのデータは、Ｖ_ＣＬＮＰの効率的な細胞取り込みを実証した。次いで、細胞を、マクロピノサイトーシス、カベオラエ－、及びクラスリン－媒介性エンドサイトーシスをそれぞれ阻害する異なるエンドサイトーシス阻害剤である、５－（Ｎ－メチル－Ｎ－イソプロピル）アミロライド（ＥＩＰＡ）、メチル－ベータ－シクロデキストリン（ＭβＣＤ）、及びクロルプロマジン塩酸塩（ＣＰＺ）の存在下で、Ｖ_ＣＬＮＰとともにインキュベートした。Ｖ_ＣＬＮＰの細胞取り込みは、ＭβＣＤの群で約９６％劇的に減少し（図１３ｃ及び１３ｄ）、これは、これらのＶ_ＣＬＮＰについてのカベオラエ－媒介性エンドサイトーシスの主要な役割を示した。エンドソーム脱出機構を探索するために、カルセインアッセイを行った。膜不透過性色素であるカルセインは、通常、細胞エンドソームに閉じ込められる。細胞をカルセイン及びＶ_ＣＬＮＰの両方で処理し、細胞質内の拡散緑色蛍光を観察し、エンドソーム膜が破裂し、その結果Ｖ_ＣＬＮＰが細胞質に放出されることを示した（図１３ｅ及び１３ｆ）。

カテプシンＢ（ＣａｔＢ）がペイロードをリソソームに輸送することができたかどうかを試験するために、ｅＧＦＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡを構築し、Ｖ_ＣＬＮＰを使用してＲＡＷ２６４．７細胞に送達した。生細胞の共焦点顕微鏡法は、ｅＧＦＰ－ＣａｔＢがリソソーム内でＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＲｅｄＤＮＤ－９９と共局在し、ピアソンの相関係数が０．９１±０．１５であることを示し（図８ｇ及び図１３ｇ）、これは、ＣａｔＢがそのペイロードをリソソーム内に運ぶことを示した。次いで、リソソーム中にＡＭＰ－ＩＢ３６７を負荷したマクロファージ（ＭＡＣ）の殺菌活性を評価するために、ＰＢＳ（ＰＢＳ－ＲＡＷ）、遊離ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡ（Ｆｒ－ＲＡＷ）、空のＶ_ＣＬＮＰ（Ｅｍ－ＲＡＷ）、ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰ／ＣａｔＢ阻害剤ＩＩ（Ｉｎ－ＲＡＷ）、及びＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰ（ＭＡＣ－ＲＡＷ）で処理したＲＡＷ２６４．７細胞において、多剤耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＭＤＲＳＡ）の細胞内生存率を定量化した。他の４つの処理と比較して、ＭＡＣ－ＲＡＷは、３３％～８７％の阻害率で試験したすべての時点で最強の殺菌活性を示した（図８ｈ）。ＣａｔＢ阻害剤ＩＩを用いてＣａｔＢ機能を阻害すると、殺菌活性が劇的に低下し（図８ｈ）、ＡＭＰ－ＩＢ３６７の放出の重要性が示された。すべての５つの群で細胞数に有意差は見られなかった（図１３ｈ）。したがって、これらの結果は、事前に保存されたＡＭＰ－ＩＢ３６７が細菌による免疫回避を妨げ、ファゴリソソーム内でそれらを排除することができたことを実証した。

ＭＡＣ－ＲＡＷの強力なインビトロ殺菌活性を考慮して、ＭＤＲＳＡ誘発性敗血症マウスの免疫抑制による治療効果を評価する試験を実施した。３日連続のシクロホスファミド（ＣＹ）治療後、体重（ＢＷ）、白血球（ＷＢＣ）、及びリンパ球（ＬＹＭ）の減少は、敗血症患者における免疫不全状態に類似した。ＭＤＲＳＡに感染させた後、マウスをＰＢＳ、ＰＢＳ－ＲＡＷまたはＭＡＣ－ＲＡＷで治療した。ＰＢＳ－ＲＡＷを腹腔内（ｉ．ｐ．）及び静脈内（ｉ．ｖ．）の両方に注入して、局所細菌及び血液細菌を治療した。ＭＡＣ－ＲＡＷについては、同じ総細胞数で３つの投与方法：ｉ．ｐ．注射単独、ｉ．ｖ．注射単独、及びｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．注射を行った。免疫抑制された敗血症における致死性は非ラジカル病原体に関連するため、マウス血液中の細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）を、細胞移入の２４時間後に測定した。ＰＢＳ処理と同様に、ＰＢＳ－ＲＡＷは血液中の細菌負荷を減少させなかったが、ｉ．ｐ．注射のみを介して投与されたＭＡＣ－ＲＡＷ（ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．））及びｉ．ｐ．及びｉ．ｖ．注射の両方を介して投与されたＭＡＣ－ＲＡＷ（ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．））は、血液中の細菌ＣＦＵを有意に減少させた（それぞれＰ＜０．０１及びＰ＜０．００１）（図９ａ）。これらの結果は、インビボにおける殺菌活性を示した。興味深いことに、ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）は、ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．）よりもはるかに強力な細菌除去能力を示した（Ｐ＜０．００１、図３ａ）。さらに、３０日目にはＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）群の生存率は５８％であり、ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．）群と比較して有意に改善した（Ｐ＜０．０１、図９ｂ）。同様に、ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）は、ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｖ．）よりも生存率（Ｐ＜０．０５）に優れた治療効果を示した（図１３ｉ）。

ＭＡＣ－ＲＡＷ（ｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．）群では、４８０時間で生存した７匹のマウスのうち３匹では、血液中の細菌は検出できなかった（図９ｆ）。次いで、持続的感染を有する４匹のマウスの繰り返し治療を行い、その結果、これらのマウスの残存細菌を除去した（図９ｇ）。１か月後、７匹のマウスのＢＷ、ＷＢＣ及びＬＹＭのレベルは完全に回復した（図９ｃ～９ｅ）。さらに、細菌は、これらのマウスの血液及び主要な臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓）では検出できなかった。

次に、臨床用途のために翻訳可能である、原発性骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を使用した殺菌活性を評価した。ＢＭＤＭは、文献に報告されているようにマウス骨髄から生成され、約８３．５％の細胞がＦ４／８０陽性であることが確認された。（図１０ａ）。次いで、ＶＬＮＰもスクリーニングし、ＢＭＤＭにおけるそれらの発現プロファイルについて試験した。ＲＡＷ２６４．７細胞における結果と同様に、Ｖ_ＣＬＮＰは、他の４つのＶＬＮＰよりもｍＲＮＡ送達において５倍、リポフェクタミン３０００よりも６倍、及びエレクトロポレーションよりも１５０倍有効であった。（図１０ｂ）。一方、ＢＭＤＭにおけるＶ_ＣＬＮＰは、１２時間での最大発光強度を有する一貫した発現プロファイルに従った。（図１０ｃ）。次に、ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰを用いてＭＡＣ－ＢＭＤＭを調製し、ＭＤＲＳＡ及び多剤耐性大腸菌（ＭＤＲＥ．ｃｏｌｉ）に対するインビトロ殺菌活性について評価した。ＰＢＳ（ＰＢＳ－ＢＭＤＭ）、遊離ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡ（Ｆｒ－ＢＭＤＭ）、空のＶ_ＣＬＮＰ（Ｅｍ－ＢＭＤＭ）、及びＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰ／ＣａｔＢ阻害剤ＩＩ（Ｉｎ－ＢＭＤＭ）によって処理されたＢＭＤＭと比較して、ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰ（ＭＡＣ－ＢＭＤＭ）は、それぞれ８５％及び７４％の最大パーセンテージ阻害を有するＭＤＲＳＡ及びＭＤＲＥ．ｃｏｌｉの両方に対して最も強い殺菌活性を示した（図１０ｄ及び１０ｆ）。加えて、５つの群はすべて、同等の細胞数を示し（図１０ｅ及び１０ｇ）、ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰは、ＢＭＤＭにおいて明らかな細胞毒性を誘導しなかった（図１０ｈ）。

インビトロで結果を検証した後、ＭＡＣ－ＢＭＤＭを、免疫抑制を有するマウスに適用して、ＭＤＲＳＡ誘発性敗血症を治療した。ＲＡＷ２６４．７細胞からのデータに基づいて、ＭＡＣ－ＢＭＤＭを、ｉ．ｐ．及びｉ．ｖ．の注射の両方によってマウスに投与した。２４時間時点での血液の分析は、ＭＡＣ－ＢＭＤＭがＰＢＳ－ＢＭＤＭよりも細菌を排除するのに有効であることを示した（Ｐ＜０．００１、図１１ａ）。さらに、ＭＡＣ－ＢＭＤＭは、ＰＢＳ－ＢＭＤＭによって救出された１０％のみと比較して、免疫抑制敗血症から５８％のマウスを救出した（Ｐ＜０．０１、図１１ｂ）。ＭＡＣ－ＢＭＤＭ群の１匹のマウスが持続的な感染を示した以外、４８０時間で他の６匹の生存マウスの血液中に細菌は発見されなかった（図１１ｆ及び１１ｇ）。同様に、そのマウスについての反復治療後、すべてのマウスは、正常レベルのＢＷ、ＷＢＣ、及びＬＹＭを示し（図１１ｃ～１１ｅ）、それらの血液及び主要な臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓）において、検出不可能レベルのＭＤＲＳＡを示した。

細菌は、感染から数時間以内に複数の臓器に分布する。これらのマクロファージの生体分布をプロファイリングするために、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡをＢＭＤＭ（ＦＬｕｃ－ＢＭＤＭ）に送達した。ＦＬｕｃ－ＢＭＤＭのｉ．ｐ．＋ｉ．ｖ．の６時間後、発光強度を、このマウスモデルにおいて通常細菌によって感染している以下の主要な臓器：腹腔、脾臓、肝臓、肺、腎臓、心臓、及び血液において測定した。結果は、健常マウス及び敗血症マウスにおいて、健常マウスよりも高い発光強度が敗血症マウスの肺において検出されたことを除いて、同様の生体分布を示した（図１４ａ）。敗血症マウスでは、発光強度の順位は、腹腔（５２．７％）、脾臓（２１．１％）、肺（１２．９％）、肝臓（９．１％）、及び血液（３．０％）である。ＢＭＤＭの生体内分布は、これらの敗血症マウスにおける細菌分布と比較的一致していた（図１４ｂ）。

敗血症の宿主は通常、敗血症を治療するための難しい課題である、混合細菌感染に曝露されるため、マウス敗血症モデルは、ＭＤＲＳＡ及びＭＤＲＥ．ｃｏｌｉの両方による感染で確立された。混合感染は単一の細菌感染と比較してより重篤な症状をもたらすため、マウスに合計２×１０^８個の細菌ＣＵＦを感染させ、単一感染モデルと比較して細菌用量の２．５倍少なかった。ＭＡＣ－ＢＭＤＭでの治療は、ＰＢＳ及びＰＢＳ－ＢＭＤＭでの治療と比較して、血液中の４３％（Ｐ＜０．０１）及び３９％（Ｐ＜０．０５）の細菌負荷を有意に減少させ（図１２ａ）、これは、混合されたＭＤＲ細菌を排除するＭＡＣ－ＢＭＤＭの能力の増強を示した。ＭＡＣ－ＢＭＤＭの治療効果は、ＰＢＳ群（Ｐ＜０．０１）及びＰＢＳ－ＢＭＤＭ群（Ｐ＜０．０５）よりもはるかに高い生存率（８３％）にも反映された（図１２ｂ）。対照的に、ＰＢＳ－ＢＭＤＭは、ＰＢＳと比較して生存率を有意に変化させなかった。（図１２ｂ）。最後に、生存したすべてのマウスにおいて、正常レベルのＢＷ、ＷＢＣ、及びＬＹＭが観察され（図１２ｃ～１２ｆ）、４８０時間で、血液及び主要な臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓）において持続的な感染は検出されなかった。

本明細書に示されるのは、ビタミンＣ脂質ナノ粒子（Ｖ_ＣＬＮＰ）に封入されたｍＲＮＡの送達によって、リソソーム中に抗菌ペプチド／カテプシンＢを負荷したマクロファージ（ＭＡＣ）である。データは、ＭＡＣの養子移行が、先天性免疫防御を回復し、細菌免疫回避を防止し、ＭＤＲ細菌を死滅させることによって、免疫抑制を有する多剤耐性（ＭＤＲ）細菌誘発性敗血症マウスにおける細菌負荷を有益に軽減し、生存率を改善したことを示す。ＭＡＣは、ＭＤＲ細菌の混合株によって誘発される敗血症に対して有効であった。ｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．注射単独よりも、ｉ．ｐ．注射＋ｉ．ｖ．注射を介して投与されるＭＡＣの優れた治療効果は、敗血症の感染プロセスに起因し得る。敗血症マウスでは、細菌は短時間でリンパ系によって血液に輸送され、その後血液循環を介して他の臓器に分布する。ｉ．ｖ．＋ｉ．ｐ．投与は、血液中に侵入した、または腹腔内にコロニーを形成した細菌を排除することに寄与し、細菌ＣＦＵを低下させ、生存率を向上させる。敗血症が初期段階で診断されると、自己マクロファージを調製し、約７日で操作することができる。次に、これらの自己ＭＡＣは、現在の治療ガイドライン下での敗血症患者の大部分である免疫抑制を有する患者に戻すことができる。さらに、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）技術の進歩に伴い、同種の「普遍的」マクロファージを製造することができ、ｉＰＳＣ由来のＭＡＣが、敗血症を含む広範な臨床用途のための既製の療法になることを可能にする。全体的に、ＭＡＣの養子移行は、将来的に敗血症及びＭＤＲ細菌感染を有する患者のための治癒可能な戦略を提供する。

実施例２．材料及び方法
化学物質及び試薬。コレステロール、ゲンタマイシン、カテプシンＢ（ＣａｔＢ）阻害剤ＩＩ、シクロホスファミド（ＣＹ）、及びアキュターゼ細胞剥離液を含む以下の薬剤をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。以下の薬剤は、Ｆ４／８０モノクローナル抗体、組換えマウスマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＤＮＤ－９９を含み、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓから購入した。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質をＰｒｏｍｅｇａから購入した。

細胞及び細菌。ＲＡＷ２６４．７細胞株は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＡＴＣＣ）で培養した。マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、１０％ウシ胎仔血清及び１００ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦを含有するＤＭＥＭ中で培養し、以前の手順の適応によって得た。ＭＤＲＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＭＤＲＳＡ、ＡＴＣＣＢＡＡ－４４）を、トリプチケース大豆寒天またはブロス中で、３７℃で通気しながら増殖させた。ＡＴＣＣからのデータによると、ＭＤＲＳＡは、以下の抗生物質：アモキシシリン／クラブラン酸、ペニシリン、シプロフロキサシン、セファロチン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、イミペネム、メチシリン、テトラサイクリン、オキサシリン、アジスロマイシン、クリンダマイシン、セフトリアキソン、リファンピン、アミカシン、及びトブラマイシンに耐性がある。多剤耐性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（ＭＤＲＥ．ｃｏｌｉ、ＡＴＣＣＢＡＡ－２３４０）を、栄養寒天または栄養ブロス（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で、３７℃で通気しながら増殖させた。ＡＴＣＣのデータによると、ＭＤＲＥ．ｃｏｌｉは、以下：アモキシシリン／クラブラン酸、チカルシリン、ピペラシリン、アンピシリン／スルバクタム、セファロチン、セフロキシム、セフォテタン、セフポドキシム、セフォタキシム、セフチゾキシム、セファゾリン、セフォキシチン、セフタジジム、セフトリアキソン、セフェピム、ドリペネム、メロペネム、エルタペネム、イミペネム、ナリジキシン酸、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、トブラマイシン、アズトレオナム、及びトリメトプリム／スルファメトキサゾールに耐性がある。

ビタミン由来脂質の合成。化合物１、ビタミンＢ３誘導体、ビタミンＣ誘導体、及びビタミンＨ（ビタミンＢ７とも呼ばれる）誘導体を、先に報告された方法に従って合成した。

本明細書で使用するＶＬＮＰ．ｍＲＮＡの調製及び特徴付けを、報告された方法に基づいてｍＲＮＡプラットフォームによって構築した。ｍＲＮＡＬＮＰの調製は以前に報告された。簡単に述べると、新たに合成されたビタミン由来脂質を、インビボスクリーニングのためのピペッティングによって、またはエクスビボ研究のためのマイクロ流体混合デバイスによって、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）ｍＲＮＡとともに製剤化した。ＮａｎｏＺＳＺｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して、サイズ及びゼータ電位を測定した。閉じ込め効率をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイにより測定した。Ｖ_ＣＬＮＰの形態を、前述の方法を使用してＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｇｌａｃｉｏｓ（商標）ＣｒｙｏＴＥＭで調べた。マクロファージにｍＲＮＡを効果的に送達するために、５つのビタミン－脂質ナノ粒子（ＶＬＮＰ）、リポフェクタミン３０００、及びエレクトロポレーションを用いて初期スクリーニングを行った。新たに合成したビタミン由来脂質を、最初のスクリーニングにおいて、ＤＯＰＥ、コレステロール（脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール＝２０：３０：４０、モル比）、及びＦＬｕｃｍＲＮＡ（脂質：ｍＲＮＡ＝１０：１、質量比）とともに製剤化した。ｍＲＮＡの送達効率は、ルシフェラーゼ発現アッセイによって決定した。次に、ＦＬｕｃ発現の動力学、続いて２ラウンドの特徴付けを、初期スクリーニング後に行った。簡単に述べると、Ａ－１からＡ－１６までのＶｃＬＮＰを直交配列設計表Ｌ_１６（４）^４に基づいて調製し、ＦＬｕｃ発現データによって最上位製剤を予測した。トップ製剤を検証し後、第２のラウンドの特徴付けは、Ｖ_Ｃ－脂質：ｍＲＮＡの質量比の微調整に焦点を当てた。マクロファージのためのエレクトロポレーションを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ）及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ２ｂＤｅｖｉｃｅによって示唆されるプロトコルを使用して行った。

細胞取り込み及びエンドソーム脱出。ＲＡＷ２６４．７細胞を６ウェルプレートに１０^５細胞／ウェルで播種し、２４時間培養した。次いで、細胞を、リポフェクタミン３０００、ＶｃＬＮＰ、またはエレクトロポレーションを使用して、ＦＬｕｃｍＲＮＡ及びＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ６４７標識ＲＮＡ（１：１、重量比）によって処理した。３時間インキュベーション後、フローサイトメーター（ＬＳＲＩＩ、ＢＤ）を用いて細胞取り込みを定量化した。ＶｃＬＮＰのエンドサイトーシス経路を研究するために、細胞取り込みアッセイを、５－（Ｎ－メチル－Ｎ－イソプロピル）アミロライド（ＥＩＰＡ）、メチル－ベータ－シクロデキストリン（ＭβＣＤ）、及び塩酸クロルプロマジン（ＣＰＺ）を含む異なるエンドサイトーシス阻害剤の存在下で行った。エンドソーム脱出アッセイのために、２×１０^４個の細胞をイメージングディッシュ（ｉｂｉｄｉ）に２４時間播種し、次に３７℃で６時間、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ６４７標識ＲＮＡを含むＶｃＬＮＰの有無にかかわらず、１５０μｇ／ｍＬのカルセインを細胞に加えた。細胞外カルセイン及びナノ粒子を除去するためにＰＢＳで洗浄した後、細胞を、４８７ｎｍ及び６４７ｎｍレーザーを介してＮｉｋｏｎＡ１ＲＬｉｖｅＣｅｌｌＩｍａｇｉｎｇＣｏｎｆｏｃａｌＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅの下で活発にイメージングした。

リソソームの共局在の分析。ＡＭＰ－ＣａｔＢがリソソーム内に特異的に蓄積できるかどうかを試験するために、ｅＧＦＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡを調製し、Ｖ_ＣＬＮＰを用いてＲＡＷ２６４．７細胞に送達した。次に、十分に確立されたリソソームプローブであるＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＲｅｄＤＮＤ－９９でリソソームを染色した。ｅＧＦＰ－ＣａｔＢとＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＲｅｄＤＮＤ－９９の共局在を、４８７ｎｍ及び５６１ｎｍレーザーを介してＮｉｋｏｎＡ１ＲＬｉｖｅＣｅｌｌＩｍａｇｉｎｇＣｏｎｆｏｃａｌＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ下で分析した。

ＢＭＤＭにおけるビタミンＣ脂質ナノ粒子の細胞毒性。ＢＭＤＭにおけるＶ_ＣＬＮＰの細胞毒性をＭＴＴアッセイによって検査した。２×１０^４個のＢＭＤＭを、１００μＬの増殖培地中の９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。ＰＢＳ、遊離ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡ、空のＶ_ＣＬＮＰ、ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰ／ＣａｔＢ阻害剤ＩＩ、及びＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰで１２時間インキュベーションした後、ＭＴＴ溶液を添加した。追加の４時間インキュベーション後、１００ｕＬの１０％ＳＤＳ－ＨＣｌを各ウェルに添加した。紫色のホルマザンを一晩溶解させ、吸光度をプレートリーダーによって５７０ｎｍにて測定した。

インビトロ抗菌アッセイ。細胞内抗菌アッセイは、報告された方法に従って実施した。簡潔に述べると、ＰＢＳ、遊離ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡ、空のＶ_ＣＬＮＰ、ＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰ／ＣａｔＢ阻害剤ＩＩ、及びＡＭＰ－ＣａｔＢｍＲＮＡＶ_ＣＬＮＰで処理した後、ＲＡＷ２６４．７細胞またはＢＭＤＭを、２５の感染多重度（ＭＯＩ）でＭＤＲＳＡまたはＭＤＲＥ．ｃｏｌｉとともに１２０分間インキュベートした。ＰＢＳによる洗浄後、ゲンタマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含む培地を補充し、細胞をさらに１時間インキュベートして細胞外細菌を除去した。異なる時点で、細胞をＰＢＳによって洗浄し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で溶解した。最後に、溶解物を、細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）をカウントするための栄養寒天またはトリプチカーゼ大豆寒天上で培養した。

免疫抑制を有するＭＤＲ誘発性敗血症マウスのインビボ治療。すべてのマウス実験は、オハイオ州立大学の動物愛護及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコル下で実施した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～７週齡）をＪａｃｋｓｏｎＬａｂから購入した。免疫抑制された敗血症モデルを、文献における方法として実施した。簡単に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、細菌感染の３日間連続で１００ｍｇ／ｋｇの投薬量でシクロホスファミド（ＣＹ）を腹腔内注射した。それらの免疫不全状態を、体重（ＢＷ）をモニタリングし、血球測定器によって白血球（ＷＢＣ）をカウントし、Ｋｗｉｋ－Ｄｉｆｆ染色によってリンパ球（ＬＹＭ）をカウントすることによって評価した。次いで、マウスに、０．１ｍＬの細菌懸濁液（ＭＤＲＳＡ感染の場合は５×１０^８ＣＦＵ／マウス、ＭＤＲＳＡ及びＭＤＲＥ．ｃｏｌｉ感染の場合は２×１０^８ＣＦＵ／マウス）を腹腔内に接種した。その後、マウスに、０．２ｍＬのＰＢＳまたは０．２ｍＬの細胞懸濁液（合計２００万個の細胞／マウス）を投与した。感染２４時間後、血液を顔面静脈から収集し、細菌ＣＦＵを定量化した。マウスの生存率を、最初の６日以内に１２時間毎に評価し、次いで、ＢＷの２０％の喪失及び早期除去基準に基づいて２４時間毎に評価した。３０日後、生存したすべてのマウスから血液を採取し、ＷＢＣ及びＬＹＭの数をカウントした。その後、マウスを安楽死させ、主要な臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓）を無菌的に均質化して、細菌ＣＦＵを定量化した。

マクロファージ及び細菌の生体分布。マクロファージの生体内分布を、健常および敗血症の両方のＣ５７ＢＬ／６マウス（６～７週齡）で実施した。この実験では、まず、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡをＢＭＤＭ（ＦＬｕｃ－ＢＭＤＭ）に１２時間送達した。次に、各マウスに、腹腔内（ｉ．ｐ．）＋静脈内（ｉ．ｖ．）注入により、０．２ｍＬのＰＢＳまたは０．２ｍＬの細胞懸濁液（合計４００万個の細胞）を投与した。６時間後、Ｄ－ルシフェリン基質（３０ｍｇ／ｍＬ）１５０μＬをマウスに静脈内注射し、次いで、８分間の注射後、ＣＯ_２によって安楽死させた。ＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳイメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を使用して、血液、腹膜液、及び主要臓器内の生物発光シグナルを直ちに測定した。敗血症マウスの血液、腹膜液、及び主要臓器中の細菌ＣＦＵを、感染６時間後に定量化した。

参考文献
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配列
配列番号１、抗菌ペプチドのアミノ酸配列
ＲＧＧＬＣＹＣＲＧＲＦＣＶＧＲ
配列番号２、抗菌ペプチドをコードするヌクレオチド配列
ＡＧＧＧＧＣＧＧＣＵＵＧＵＧＣＵＡＣＵＧＵＣＧＣＧＧＡＡＧＧＵＵＵＵＧＵＧＵＡＧＧＣＡＧＡ
配列番号３、カテプシンＢのアミノ酸配列
ＭＷＷＳＬＩＬＬＳＣＬＬＡＬＴＳＡＨＤＫＰＳＦＨＰＬＳＤＤＬＩＮＹＩＮＫＱＮＴＴＷＱＡＧＲＮＦＹＮＶＤＩＳＹＬＫＫＬＣＧＴＶＬＧＧＰＫＬＰＧＲＶＡＦＧＥＤＩＤＬＰＥＴＦＤＡＲＥＱＷＳＮＣＰＴＩＧＱＩＲＤＱＧＳＣＧＳＣＷＡＦＧＡＶＥＡＩＳＤＲＴＣＩＨＴＮＧＲＶＮＶＥＶＳＡＥＤＬＬＴＣＣＧＩＱＣＧＤＧＣＮＧＧＹＰＳＧＡＷＳＦＷＴＫＫＧＬＶＳＧＧＶＹＮＳＨＶＧＣＬＰＹＴＩＰＰＣＥＨＨＶＮＧＳＲＰＰＣＴＧＥＧＤＴＰＲＣＮＫＳＣＥＡＧＹＳＰＳＹＫＥＤＫＨＦＧＹＴＳＹＳＶＳＮＳＶＫＥＩＭＡＥＩＹＫＮＧＰＶＥＧＡＦＴＶＦＳＤＦＬＴＹＫＳＧＶＹＫＨＥＡＧＤＭＭＧＧＨＡＩＲＩＬＧＷＧＶＥＮＧＶＰＹＷＬＡＡＮＳＷＮＬＤＷＧＤＮＧＦＦＫＩＬＲＧＥＮＨＣＧＩＥＳＥＩＶＡＧＩＰＲＴＤＱＹＷＧＲ
配列番号４、カテプシンＢをコードするヌクレオチド配列
ＡＵＧＵＧＧＵＧＧＵＣＣＵＵＧＡＵＣＣＵＵＣＵＵＵＣＵＵＧＣＣＵＧＣＵＧＧＣＡＣＵＧＡＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＵＧＡＣＡＡＧＣＣＵＵＣＣＵＵＣＣＡＣＣＣＧＣＵＧＵＣＧＧＡＵＧＡＣＣＵＧＡＵＵＡＡＣＵＡＵＡＵＣＡＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＵＡＣＡＡＣＡＵＧＧＣＡＧＧＣＵＧＧＡＣＧＣＡＡＣＵＵＣＵＡＣＡＡＵＧＵＵＧＡＣＡＵＡＡＧＣＵＡＵＣＵＧＡＡＧＡＡＧＣＵＧＵＧＵＧＧＣＡＣＵＧＵＣＣＵＧＧＧＵＧＧＡＣＣＣＡＡＡＣＵＧＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧＵＵＧＣＧＵＵＣＧＧＵＧＡＧＧＡＣＡＵＡＧＡＵＣＵＡＣＣＵＧＡＡＡＣＣＵＵＵＧＡＵＧＣＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＵＧＧＵＣＣＡＡＣＵＧＣＣＣＧＡＣＣＡＵＵＧＧＡＣＡＧＡＵＵＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＧＣＵＣＣＵＧＣＧＧＣＵＣＵＵＧＵＵＧＧＧＣＡＵＵＵＧＧＧＧＣＡＧＵＧＧＡＡＧＣＣＡＵＵＵＣＵＧＡＣＣＧＡＡＣＣＵＧＣＡＵＵＣＡＣＡＣＣＡＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＣＡＡＣＧＵＧＧＡＧＧＵＧＵＣＵＧＣＵＧＡＡＧＡＣＣＵＧＣＵＵＡＣＵＵＧＣＵＧＵＧＧＵＡＵＣＣＡＧＵＧＵＧＧＧＧＡＣＧＧＣＵＧＵＡＡＵＧＧＵＧＧＣＵＡＵＣＣＣＵＣＵＧＧＡＧＣＡＵＧＧＡＧＣＵＵＣＵＧＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＧＧＣＣＵＧＧＵＵＵＣＡＧＧＵＧＧＡＧＵＣＵＡＣＡＡＵＵＣＵＣＡＵＧＵＡＧＧＣＵＧＣＵＵＡＣＣＡＵＡＣＡＣＣＡＵＣＣＣＵＣＣＣＵＧＣＧＡＧＣＡＣＣＡＵＧＵＣＡＡＵＧＧＣＵＣＣＣＧＵＣＣＣＣＣＡＵＧＣＡＣＵＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＣＵＣＣＣＡＧＧＵＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＵＧＵＧＡＡＧＣＵＧＧＣＵＡＣＵＣＣＣＣＡＵＣＣＵＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＵＡＡＧＣＡＣＵＵＵＧＧＧＵＡＣＡＣＵＵＣＣＵＡＣＡＧＣＧＵＧＵＣＵＡＡＣＡＧＵＧＵＧＡＡＧＧＡＧＡＵＣＡＵＧＧＣＡＧＡＡＡＵＣＵＡＣＡＡＡＡＡＵＧＧＣＣＣＡＧＵＧＧＡＧＧＧＵＧＣＣＵＵＣＡＣＵＧＵＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＵＵＧＡＣＵＵＡＣＡＡＡＵＣＡＧＧＡＧＵＡＵＡＣＡＡＧＣＡＵＧＡＡＧＣＣＧＧＵＧＡＵＡＵＧＡＵＧＧＧＵＧＧＣＣＡＣＧＣＣＡＵＣＣＧＣＡＵＣＣＵＧＧＧＣＵＧＧＧＧＡＧＵＡＧＡＧＡＡＵＧＧＡＧＵＵＣＣＣＵＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＡＧＣＣＡＡＣＵＣＵＵＧＧＡＡＣＣＵＵＧＡＣＵＧＧＧＧＵＧＡＵＡＡＵＧＧＣＵＵＣＵＵＵＡＡＡＡＵＣＣＵＣＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＣＵＧＵＧＧＣＡＵＵＧＡＡＵＣＡＧＡＡＡＵＵＧＵＧＧＣＵＧＧＡＡＵＣＣＣＡＣＧＣＡＣＵＧＡＣＣＡＧＵＡＣＵＧＧＧＧＡＡＧＡ
配列番号５、リンカーのアミノ酸配列
ＦＧＦＬＧ
配列番号６、リンカーをコードするヌクレオチド配列
ＵＵＣＧＧＡＵＵＵＣＵＧＧＧＣ
配列番号７
ＭＷＷＳＬＩＬＬＳＣＬＬＡＬＴＳＡＨＤＫＰＳＦＨＰＬＳＤＤＬＩＮＹＩＮＫＱＮＴＴＷＱＡＧＲＮＦＹＮＶＤＩＳＹＬＫＫＬＣＧＴＶＬＧＧＰＫＬＰＧＲＶＡＦＧＥＤＩＤＬＰＥＴＦＤＡＲＥＱＷＳＮＣＰＴＩＧＱＩＲＤＱＧＳＣＧＳＣＷＡＦＧＡＶＥＡＩＳＤＲＴＣＩＨＴＮＧＲＶＮＶＥＶＳＡＥＤＬＬＴＣＣＧＩＱＣＧＤＧＣＮＧＧＹＰＳＧＡＷＳＦＷＴＫＫＧＬＶＳＧＧＶＹＮＳＨＶＧＣＬＰＹＴＩＰＰＣＥＨＨＶＮＧＳＲＰＰＣＴＧＥＧＤＴＰＲＣＮＫＳＣＥＡＧＹＳＰＳＹＫＥＤＫＨＦＧＹＴＳＹＳＶＳＮＳＶＫＥＩＭＡＥＩＹＫＮＧＰＶＥＧＡＦＴＶＦＳＤＦＬＴＹＫＳＧＶＹＫＨＥＡＧＤＭＭＧＧＨＡＩＲＩＬＧＷＧＶＥＮＧＶＰＹＷＬＡＡＮＳＷＮＬＤＷＧＤＮＧＦＦＫＩＬＲＧＥＮＨＣＧＩＥＳＥＩＶＡＧＩＰＲＴＤＱＹＷＧＲＦＧＦＬＧＲＧＧＬＣＹＣＲＧＲＦＣＶＧＲ
配列番号８
ＡＵＧＵＧＧＵＧＧＵＣＣＵＵＧＡＵＣＣＵＵＣＵＵＵＣＵＵＧＣＣＵＧＣＵＧＧＣＡＣＵＧＡＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＵＧＡＣＡＡＧＣＣＵＵＣＣＵＵＣＣＡＣＣＣＧＣＵＧＵＣＧＧＡＵＧＡＣＣＵＧＡＵＵＡＡＣＵＡＵＡＵＣＡＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＵＡＣＡＡＣＡＵＧＧＣＡＧＧＣＵＧＧＡＣＧＣＡＡＣＵＵＣＵＡＣＡＡＵＧＵＵＧＡＣＡＵＡＡＧＣＵＡＵＣＵＧＡＡＧＡＡＧＣＵＧＵＧＵＧＧＣＡＣＵＧＵＣＣＵＧＧＧＵＧＧＡＣＣＣＡＡＡＣＵＧＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧＵＵＧＣＧＵＵＣＧＧＵＧＡＧＧＡＣＡＵＡＧＡＵＣＵＡＣＣＵＧＡＡＡＣＣＵＵＵＧＡＵＧＣＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＵＧＧＵＣＣＡＡＣＵＧＣＣＣＧＡＣＣＡＵＵＧＧＡＣＡＧＡＵＵＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＧＣＵＣＣＵＧＣＧＧＣＵＣＵＵＧＵＵＧＧＧＣＡＵＵＵＧＧＧＧＣＡＧＵＧＧＡＡＧＣＣＡＵＵＵＣＵＧＡＣＣＧＡＡＣＣＵＧＣＡＵＵＣＡＣＡＣＣＡＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＣＡＡＣＧＵＧＧＡＧＧＵＧＵＣＵＧＣＵＧＡＡＧＡＣＣＵＧＣＵＵＡＣＵＵＧＣＵＧＵＧＧＵＡＵＣＣＡＧＵＧＵＧＧＧＧＡＣＧＧＣＵＧＵＡＡＵＧＧＵＧＧＣＵＡＵＣＣＣＵＣＵＧＧＡＧＣＡＵＧＧＡＧＣＵＵＣＵＧＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＧＧＣＣＵＧＧＵＵＵＣＡＧＧＵＧＧＡＧＵＣＵＡＣＡＡＵＵＣＵＣＡＵＧＵＡＧＧＣＵＧＣＵＵＡＣＣＡＵＡＣＡＣＣＡＵＣＣＣＵＣＣＣＵＧＣＧＡＧＣＡＣＣＡＵＧＵＣＡＡＵＧＧＣＵＣＣＣＧＵＣＣＣＣＣＡＵＧＣＡＣＵＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＣＵＣＣＣＡＧＧＵＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＵＧＵＧＡＡＧＣＵＧＧＣＵＡＣＵＣＣＣＣＡＵＣＣＵＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＵＡＡＧＣＡＣＵＵＵＧＧＧＵＡＣＡＣＵＵＣＣＵＡＣＡＧＣＧＵＧＵＣＵＡＡＣＡＧＵＧＵＧＡＡＧＧＡＧＡＵＣＡＵＧＧＣＡＧＡＡＡＵＣＵＡＣＡＡＡＡＡＵＧＧＣＣＣＡＧＵＧＧＡＧＧＧＵＧＣＣＵＵＣＡＣＵＧＵＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＣＵＵＧＡＣＵＵＡＣＡＡＡＵＣＡＧＧＡＧＵＡＵＡＣＡＡＧＣＡＵＧＡＡＧＣＣＧＧＵＧＡＵＡＵＧＡＵＧＧＧＵＧＧＣＣＡＣＧＣＣＡＵＣＣＧＣＡＵＣＣＵＧＧＧＣＵＧＧＧＧＡＧＵＡＧＡＧＡＡＵＧＧＡＧＵＵＣＣＣＵＡＣＵＧＧＣＵＧＧＣＡＧＣＣＡＡＣＵＣＵＵＧＧＡＡＣＣＵＵＧＡＣＵＧＧＧＧＵＧＡＵＡＡＵＧＧＣＵＵＣＵＵＵＡＡＡＡＵＣＣＵＣＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＣＵＧＵＧＧＣＡＵＵＧＡＡＵＣＡＧＡＡＡＵＵＧＵＧＧＣＵＧＧＡＡＵＣＣＣＡＣＧＣＡＣＵＧＡＣＣＡＧＵＡＣＵＧＧＧＧＡＡＧＡＵＵＣＧＧＡＵＵＵＣＵＧＧＧＣＡＧＧＧＧＣＧＧＣＵＵＧＵＧＣＵＡＣＵＧＵＣＧＣＧＧＡＡＧＧＵＵＵＵＧＵＧＵＡＧＧＣＡＧＡ
配列番号９リンカーのアミノ酸配列
ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ
配列番号１０リンカーのアミノ酸配列
ＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ
配列番号１１リンカーのアミノ酸配列
ＡｌａＧｌｙＶａｌＰｈｅ
配列番号１２リンカーのアミノ酸配列
ＶａｌＬｙｓＬｙｓＡｒｇ

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、開示されている本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書において引用される刊行物及び引用される資料は、参照により具体的に組み込まれる。

当業者は、多くの変更及び修正が本発明の好ましい実施形態に対して行われ、そのような変更及び修正が本発明の趣旨から逸脱することなく行われ得ることを理解するだろう。したがって、付属の請求項は、本発明の真の趣旨及び範囲に入るすべてのそのような等しい変形例を網羅することが意図される。

Claims

抗原提示細胞であって、
脂質ベースのナノ粒子を含み、前記脂質ベースのナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
カテプシンＢをコードする第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、前記組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、前記抗原提示細胞。
前記第１の核酸及び前記第２の核酸が、前記第３の核酸によって連結されている、請求項１に記載の抗原提示細胞。
前記組換えポリヌクレオチドが、前記ビタミン－脂質によって封入されている、請求項１または２に記載の抗原提示細胞。
前記組換えポリヌクレオチドが、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗原提示細胞。
前記抗菌ペプチドが、配列番号１の配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗原提示細胞。
前記第１の核酸が、配列番号２の配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗原提示細胞。
前記第２の核酸が、配列番号４の配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗原提示細胞。
前記リンカーが、カテプシンＢ感受性リンカーである、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗原提示細胞。
前記第３の核酸が、配列番号６の配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗原提示細胞。
前記組換えポリヌクレオチドが、配列番号８の配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗原提示細胞。
前記ビタミン－脂質がビタミン部分を含み、前記ビタミン部分が、ビタミンＢ３、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＨ、またはそれらの誘導体を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原提示細胞。
前記ビタミン部分がビタミンＣである、請求項１１に記載の抗原提示細胞。
前記ビタミン－脂質が、式Ａの化合物、

またはその塩を含み、式中、
Ｒ^１はアルキルまたはエーテルリンカーであり、前記アルキルまたはエーテルリンカーはビタミン部分で置換され、
Ｒ^２は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル、アミド、アルキルアミド、エーテル、アルキルエーテルである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗原提示細胞。
前記ビタミン－脂質が、以下からなる群から選択され、

式中、Ｒは、

である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗原提示細胞。
前記抗原提示細胞が、マクロファージまたは樹状細胞を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗原提示細胞。
前記マクロファージが、骨髄由来マクロファージまたは単球由来マクロファージを含む、請求項１５に記載の抗原提示細胞。
前記樹状細胞が、骨髄由来樹状細胞、単球由来樹状細胞、従来の樹状細胞－１、または従来の樹状細胞－２を含む、請求項１６に記載の抗原提示細胞。
敗血症の治療方法であって、
ナノ粒子を含む１つ以上の抗原提示細胞を対象に投与することを含み、前記ナノ粒子が、
組換えポリヌクレオチドであって、
抗菌ペプチドをコードする第１の核酸、
カテプシンＢをコードする第２の核酸、及び
リンカーをコードする第３の核酸を含む、前記組換えポリヌクレオチドと、
ビタミン－脂質と、を含む、前記方法。
前記第１の核酸及び前記第２の核酸が、前記第３の核酸によって連結されている、請求項１８に記載の方法。
前記組換えポリヌクレオチドが、前記ビタミン－脂質によって封入されている、請求項１８または１９に記載の方法。
前記組換えポリヌクレオチドが、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
前記抗菌ペプチドが、配列番号１の配列を含む、請求項１８～２１のいずれか１項に記載の方法。
前記第１の核酸が、配列番号２の配列を含む、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の方法。
前記第２の核酸が、配列番号４の配列を含む、請求項１８～２３のいずれか１項に記載の方法。
前記リンカーが、カテプシンＢ感受性リンカーを含む、請求項１８～２４のいずれか１項に記載の方法。
前記第３の核酸が、配列番号６の配列を含む、請求項１８～２５のいずれか１項に記載の方法。
前記組換えポリヌクレオチドが、配列番号８の配列を含む、請求項１８～２６のいずれか１項に記載の方法。
前記ビタミン－脂質がビタミン部分を含み、前記ビタミン部分が、ビタミンＢ３、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＨ、またはそれらの誘導体を含む、請求項１８～２７のいずれか１項に記載の方法。
前記ビタミン部分がビタミンＣである、請求項２８に記載の方法。
前記ビタミン－脂質が、式Ａの化合物、

またはその塩を含み、式中、
Ｒ^１はアルキルまたはエーテルリンカーであり、前記アルキルまたはエーテルリンカーはビタミン部分で置換され、
Ｒ^２は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル、アミド、アルキルアミド、エーテル、アルキルエーテルである、請求項１８～２９のいずれか１項に記載の方法。
前記ビタミン－脂質が、以下からなる群から選択され、

式中、Ｒは、

である、請求項１８～３０のいずれか１項に記載の方法。
前記抗原提示細胞が、マクロファージまたは樹状細胞である、請求項１８～３１のいずれか１項に記載の方法。
前記マクロファージが、骨髄由来マクロファージまたは単球由来マクロファージを含む、請求項３２に記載の方法。
前記樹状細胞が、骨髄由来樹状細胞、単球由来樹状細胞、従来の樹状細胞－１、または従来の樹状細胞－２を含む、請求項３２に記載の方法。
前記抗原提示細胞が、前記対象に由来する、請求項１８～３４のいずれか１項に記載の方法。
前記対象がヒトを含む、請求項１８～３５のいずれか１項に記載の方法。
前記ヒトが、敗血症を有するか、または敗血症を有すると疑われる、請求項３６に記載の方法。