CN114867483A - 工程化细胞及其用途 - Google Patents

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侯续成
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Abstract

本公开涉及抗原呈递细胞及其用于治疗脓毒症的用途。在一些方面，本文公开了一种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：基于脂质的纳米颗粒，所述基于脂质的纳米颗粒包含：重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：编码抗菌肽的第一核酸：编码组织蛋白酶B的第二核酸：和编码接头的第三核酸：以及维生素一脂质。

Description

工程化细胞及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年9月11日提交的美国临时申请序列号62/898,846的权益，所述申请以引用的方式明确地并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明根据国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号R35GM119679下的政府资助产生。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
本公开涉及工程化细胞及其用途。
背景技术
脓毒症曾经被认为是对病原体的不可控制的炎性反应。然而，研究人员在40多次抗炎剂的临床试验失败后重新评价了脓毒症的治疗方法。最近的临床数据揭示超过60％的脓毒性患者经过初始的炎症风暴存活，但迅速进展为更久的免疫抑制状态，这种免疫抑制状态的特征在于免疫细胞的麻痹和死亡，从而导致不能清除入侵的病原体、对医院获得性感染的易感性增加和高死亡率。因此，需要用于工程化细胞的新型组合物和方法以及用于治疗疾病(例如，脓毒症)的方法。
发明内容
在一些方面，本文公开了一种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
基于脂质的纳米颗粒，所述基于脂质的纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸；
编码组织蛋白酶B的第二核酸；和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些实施方案中，所述第一核酸和所述第二核酸通过第三核酸连接。
在一些实施方案中，所述重组多核苷酸由所述维生素-脂质包封。
在一些实施方案中，所述重组多核苷酸包含RNA或DNA。
在一些实施方案中，所述抗菌肽包含序列SEQ ID NO：1。
在一些实施方案中，所述第一核酸包含序列SEQ ID NO：2。
在一些实施方案中，所述第二核酸包含序列SEQ ID NO：4。
在一些实施方案中，所述接头包括组织蛋白酶B敏感接头。在一些实施方案中，所述第三核酸包含序列SEQ ID NO：6。
在一些实施方案中，所述重组多核苷酸包含序列SEQ ID NO：8。
在一些实施方案中，所述维生素-脂质包含维生素部分，并且其中所述维生素部分包括维生素B3、维生素C、维生素D、维生素E、维生素H或其衍生物。在一些实施方案中，所述维生素部分是维生素C。
在一些实施方案中，所述维生素-脂质选自由以下组成的组：
Figure BPA0000319804310000031
其中R是
Figure BPA0000319804310000032
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞包括巨噬细胞或树突细胞。在一些实施方案中，所述巨噬细胞包括骨髓源性巨噬细胞或单核细胞源性巨噬细胞。在一些实施方案中，所述树突细胞包括骨髓源性树突细胞、单核细胞源性树突细胞、常规树突细胞-1或常规树突细胞-2。
在一些方面，本文公开了一种治疗脓毒症的方法，所述方法包括向受试者施用一种或多种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸，
编码组织蛋白酶B的第二核酸，和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞来源于所述受试者。在一些实施方案中，所述受试者包括人。在一些实施方案中，所述人患有或疑似患有脓毒症。
附图说明
并入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图示出了下文描述的几个方面。
图1A至图1B.过继性巨噬细胞转移和维生素衍生的脂质的化学结构的示意图。a)用于脓毒症疗法的MAC的构建。MAC代表在溶酶体中负载有抗菌肽/组织蛋白酶B的巨噬细胞。AMP-CatB mRNA被包封在维生素C脂质纳米颗粒(VCLNP)中并被递送至巨噬细胞，在巨噬细胞中mRNA在内质网中被翻译并易位到溶酶体中。在溶酶体内，可切割接头由溶酶体CatB切割，从而释放AMP-IB367。携带MDR细菌的吞噬体与溶酶体融合后，摄入的MDR细菌将被预储存的AMP-IB367根除。b)维生素衍生的脂质的化学结构，所述维生素衍生的脂质包括VB3-脂质、VC-脂质、VD-脂质、VE-脂质和VH-脂质。
图2.VB3-脂质的合成：将化合物1(150mg，0.23mmol)溶解于2mL CH2Cl2和2mL DMF的混合物中。将维生素B3衍生物(62mg，0.21mmol)、EDC(87mg，0.46mmol)和DMPA(10mg)添加到所述溶液中。将所得混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过柱色谱法使用具有RediSep Gold Resolution二氧化硅柱(Teledyne Isco)的CombiFlash Rf系统，用100％CH2Cl2至0％CH2Cl2的梯度洗脱(CH2Cl2和ultra)(ultra：CH2Cl2/MeOH/NH4OH＝75/22/3，按体积计)进行纯化，以得到80mg无色油状VB3-脂质，产率37％。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.75(1H，s)，9.92(1H，s)，9.17-9.16(1H，d，J＝4)，8.94(1H，s)，8.09-8.06(1H，t，J＝4)，6.20(1H，s)，4.88-4.85(2H，t，J＝4)，4.06-4.03(2H，t，J＝4)，2.47(11H，m)，2.31-2.28(2H，t，J＝4)，2.13(2H，s)，1.64-1.63(7H，m)，1.45(12H，m)，1.26(56H，s)，0.89-0.87(9H，t，J＝4)。C57H109N4O3的MS(m/z)：M+计算值：897.8494；实验值：897.8496。
图3.VC-脂质的合成：将化合物1(150mg，0.23mmol)溶解于2mL CH2Cl2中。将维生素C衍生物(77mg，0.23mmol)、EDC(87mg，0.46mmol)和DMPA(10mg)添加到所述溶液中。将所得混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过柱色谱法使用具有RediSep GoldResolution二氧化硅柱(Teledyne Isco)的CombiFlash Rf系统，用100％CH2Cl2至80％CH2Cl2的梯度洗脱(CH2Cl2和ultra)(ultra：CH2Cl2/MeOH/NH4OH＝75/22/3，按体积计)进行纯化，以得到105mg无色油状VC-脂质，产率44％。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.40-7.25(10H，m)，5.26-5.13(4H，m)，4.67(1H，s)，4.33-4.08(3H，m)，2.65(1H，s)，2.42(12H，m)，1.67-1.60(13H，m)，1.28(57H，s)，0.92-0.89(9H，t，J＝4)。MS(m/z)：[M+H]+计算值：C65H111N2O7，1031.8391；实验值：1031.8379。
图4.VD-脂质的合成：将化合物1(150mg，0.23mmol)溶解于2mL CH2Cl2中。将维生素D(83mg，0.23mmol)、EDC(87mg，0.46mmol)和DMPA(10mg)添加到所述溶液中。将所得混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过柱色谱法使用具有RediSep Gold Resolution二氧化硅柱(Teledyne Isco)的CombiFlash Rf系统，用100％CH2Cl2至85％CH2Cl2的梯度洗脱(CH2Cl2和ultra)(ultra：CH2Cl2/MeOH/NH4OH＝75/22/3，按体积计)进行纯化，以得到40mg无色油状VD-脂质，产率16％。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝6.22-6.19(1H，d，J＝12)，6.04-6.02(1H，d，J＝8)，5.06(1H，s)，4.94(1H，s)，4.84(1H，s)，2.82-2.56(12H，m)，2.38-2.28(4H，m)，1.99-1.96(5H，m)，1.67-1.49(15H，m)，1.30-1.26(71H，m)，0.93-0.87(21H，m)，0.54(2H，s)。C72H135N2O2的MS(m/z)：[M+H]+计算值：1060.0524；实验值：1060.0529。
图5.VE-脂质的合成：将化合物1(150mg，0.23mmol)溶解于2mL CH2Cl2中。将维生素E(99mg，0.23mmol)、EDC(87mg，0.46mmol)和DMPA(10mg)添加到所述溶液中。将所得混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过柱色谱法使用具有RediSep Gold Resolution二氧化硅柱(Teledyne Isco)的CombiFlash Rf系统，用100％CH2Cl2至85％CH2Cl2的梯度洗脱(CH2Cl2和ultra)(ultra：CH2Cl2/MeOH/NH4OH＝75/22/3，按体积计)进行纯化，以得到66mg无色油状VE-脂质，产率26％。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝2.83-2.57(14H，m)，2.08(3H，s)，2.00(3H，s)，1.96(3H，s)，1.81(4H，m)，1.62(5H，m)，1.54-1.52(11H，m)，1.28-1.23(67H，m)，1.14(7H，m)，0.89-0.84(24H，m)。C74H141N2O3的MS(m/z)：[M+H]+计算值：1106.0942；实验值：1106.0944。
图6.VH-脂质的合成：将化合物1(100mg，0.15mmol)溶解于3mL THF的混合物中。将NHS(50mg，0.43mmol)和DCC(80mg，0.39mmol)添加到所述溶液中，搅拌过夜。将维生素H衍生物(140mg，0.46mmol)和200μL三甲胺添加到所述溶液中。将所得混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过柱色谱法使用具有RediSep Gold Resolution二氧化硅柱(TeledyneIsco)的CombiFlash Rf系统，用100％CH2Cl2至75％CH2Cl2的梯度洗脱(CH2Cl2和ultra)(ultra：CH2Cl2/MeOH/NH4OH＝75/22/3，按体积计)进行纯化，以得到60mg无色油状VH-脂质，产率41％。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.11(1H，s)，6.70(1H，s)，5.98(1H，s)，4.52-4.49(1H，t，J＝4)，4.33-4.30(1H，t，J＝4)，3.27-3.28(4H，m)，2.75-2.60(11H，m)，2.25-2.19(4H，m)，1.74-1.64(11H，m)，1.51-1.49(11H，m)，1.28(59H，s)，0.90-0.87(9H，t，J＝4)。C58H115N6O3S的MS(m/z)：[M+H]+计算值：975.8751；实验值：975.8629。
图7A至图7F.VLNP的筛选和表征。VLNP的a)大小，b)PDI，c)包封效率，和d)ζ电位。e)正交阵列表L16(4)4和Kn*值。f)最佳VCLNP制剂的Cryo-TEM图像(比例尺＝50nm)。a、b、c和d中的数据是平均值±s.d.，一式三份。
图8A至图8H.维生素-脂质纳米颗粒(VLNP)的筛选和表征。a)VLNP在RAW264.7细胞中的mRNA递送效率。b，通过VCLNP递送的mRNA在RAW264.7细胞中的表达动力学。c)第一轮表征：每种VCLNP组分的四种水平和影响趋势。d)用于验证预测的制剂的制剂表，和第二轮表征：VC-脂质：mRNA的质量比。E，两轮表征中发光强度的倍数变化。f)最佳VCLNP制剂的表征，包括大小分布、多分散性指数(PDI)、包封效率、ζ电位和Cryo-TEM图像(比例尺＝100nm)。g)与包封eGFP-CatB mRNA的VCLNP一起孵育的RAW264.7细胞的共聚焦显微镜检查(比例尺＝10μm)。eGFP-CatB(绿色)和
Figure BPA0000319804310000071
红DND-99(红色)共定位在溶酶体中，其中皮尔逊相关系数为0.91±0.15。h)MDR金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MDRSA)在暴露于PBS(PBS-RAW)、游离AMP-CatB mRNA(Fr-RAW)、空VCLNP(Em-RAW)、AMP-CatB mRNA VCLNP/CatB抑制剂II(In-RAW)和AMP-CatB mRNA VCLNP(MAC-RAW)的RAW264.7细胞中的细胞内存活。a、b、e、f和h中的数据是平均值±s.d.，n＝3次独立实验。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；ns，不显著(双尾学生t检验)。
图9A至图9G.MAC-RAW在伴有免疫抑制的MDRSA诱导的脓毒症小鼠中的治疗效果。a)细胞转移后24小时时血液中的细菌负荷。b，患有脓毒症的小鼠的存活百分比。c)至e)患有脓毒症的小鼠的体重(BW)、白细胞(WBC)和淋巴细胞(LYM)。c)BW；d)WBC；e)LYM。f)和g)用MAC-RAW(i.p.+i.v.)治疗的每个存活小鼠的血液中的细菌负荷。PBS、PBS-RAW(i.p.+i.v.)、MAC-RAW(i.p.)和MAC-RAW(i.p.+i.v.)组中的小鼠数量分别为8只、10只、10只和12只。a、c、d和e中的数据是平均值±s.d.。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；ns，不显著(双尾学生t检验)。ND，未检测到。
图10A至图10H.BMDM中VLNP的筛选和BMDM中MDR细菌的细胞内存活。a)F4/80(一种成熟巨噬细胞标记物)阳性细胞(83.5±0.7％)。b)BMDM中VLNP的mRNA递送效率。c)BMDM中由VCLNP递送的mRNA的表达动力学。d)和f)MDR细菌在用PBS(PBS-BMDM)、游离AMP-CatBmRNA(Fr-BMDM)、空VCLNP(Em-BMDM)、AMP-CatB mRNA VCLNP/CatB抑制剂II(In-BMDM)和AMP-CatB mRNA VCLNP(MAC-BMDM)处理的BMDM中的细胞内存活。d)MDRSA；f)MDR大肠杆菌(E.coli)。e)和g)在12小时时相对PBS-BMDM组归一化的BMDM的百分比，e)MDRSA；g)MDR大肠杆菌。h)通过MTT测定来测定包封AMP-CatB mRNA的VCLNP在BMDM中的细胞毒性。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；ns，不显著(双尾学生t检验)。此图中的数据是平均值±s.d.，n＝3次独立实验。
图11A至图11G.MAC-BMDM在伴有免疫抑制的MDRSA诱导的脓毒症小鼠中的治疗效果。a)细胞转移后24小时时血液中的细菌负荷。b)患有脓毒症的小鼠的存活百分比。c)至e)患有脓毒症的小鼠的BW、WBC和LYM。c)BW；d)WBC；e)LYM。f)和g)用MAC-BMDM治疗的每只存活小鼠的血液中的细菌负荷。PBS、PBS-BMDM和MAC-BMDM组中的小鼠数量分别为8只、10只和12只。a、c、d和e中的数据是平均值±s.d.。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；ns，不显著(双尾学生t检验)。ND，未检测到。
图12A至图12F.MAC-BMDM在伴有免疫抑制的混合的MDRSA细菌(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)诱导的脓毒症小鼠中的治疗效果。a)细胞转移后24小时时血液中的细菌负荷。b)患有脓毒症的小鼠的存活百分比。c)至e)患有脓毒症的小鼠的BW、WBC和LYM。c)BW；d)WBC；e)LYM。f)用MAC-BMDM治疗的每只存活小鼠的血液中的细菌负荷。PBS、PBS-BMDM和MAC-BMDM组中的小鼠数量分别为8只、10只和12只。a、c、d和e中的数据是平均值±s.d.。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；ns，不显著(双尾学生t检验)。ND，未检测到。
图13A至图13I.MAC-RAW在伴有免疫抑制的MDRSA诱导的脓毒症小鼠中的细胞摄取、内吞通路、内体逃逸和治疗效果。a至b，用VCLNP、脂质体3000和电穿孔处理后的细胞摄取。a，Alexa-Fluor647阳性细胞的百分比；b，细胞的荧光强度。c至d，在内吞抑制剂EIPA、MβCD和CPZ存在下的细胞摄取，所述内吞抑制剂分别抑制大型胞饮作用、小窝介导的内吞作用和网格蛋白介导的内吞作用。c，Alexa-Fluor 647阳性细胞的百分比；d，细胞的荧光强度。e至f，与单独的钙黄绿素或钙黄绿素和含有Alexa-Fluor 647 RNA的VCLNP一起孵育的RAW264.7细胞的共聚焦显微镜检查。e，单独的钙黄绿素；f，钙黄绿素和含有Alexa-Fluor647 RNA的VCLNP。g，与eGFP-CatB mRNA VCLNP一起孵育的RAW264.7细胞的3D共聚焦显微图像。h，在12小时时相对PBS-RAW组归一化的RAW264.7细胞的百分比。a、b、c、d和h中的数据是平均值±s.d.，一式三份。i，用PBS、MAC-RAW(i.v.)或MAC-RAW(i.p.+i.v.)治疗的患有脓毒症的小鼠的存活百分比。每组的小鼠数量是6只。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；ns，不显著(双尾学生t检验)。
图14A至图14B.BMDM和MDRSA在小鼠中的生物分布。a，在健康小鼠或脓毒症小鼠中施用6小时后，腹膜液、血液和主要器官中的BMDM分布。b，感染6小时后腹膜液、血液和主要器官中的细菌分布。
图15.VCLNP介导了骨髓源性树突细胞中的荧光素酶mRNA递送。在骨髓源性树突细胞中在相同mRNA浓度下，VCLNP比脂质体3000(Lipo3000)有效17倍，并且比电穿孔有效8倍。
具体实施方式
传统上，脓毒症被认为是对病原体的不可控制的炎性反应。然而，研究人员在40多次抗炎剂的临床试验失败后重新评价了脓毒症的治疗方法。临床数据揭示超过60％的脓毒性患者经过初始的炎症风暴存活，但迅速进展为更久的免疫抑制状态，这种免疫抑制状态的特征在于免疫细胞的麻痹和死亡，从而导致不能清除入侵的病原体、对医院获得性感染的易感性增加和高死亡率。因此，为了治疗脓毒症，已经广泛研究了潜在的治疗靶标，诸如去除过敏毒素C5a或阻断C5a受体。同时，已经开发了旨在恢复免疫功能的方法，并在患有脓毒症的患者中进行了测试。
巨噬细胞是感染期间最有效的病原体清除剂之一。在患有脓毒症的患者中，受损的巨噬细胞/单核细胞可能主要造成抗菌防御不足。免疫刺激剂的几项小型临床试验已经表明在逆转失活的巨噬细胞/单核细胞，由此增强感染根除方面的益处。相反，大型临床试验的荟萃分析在降低患者死亡率方面没有显示出显著变化。几个原因可以导致这些不同的临床结果。首先，免疫刺激剂不能将受损的巨噬细胞/单核细胞的功能恢复到它们的原始水平。其次，侵入的细菌通常被捕获在巨噬细胞吞噬体中，所述巨噬细胞吞噬体进一步与溶酶体融合以形成吞噬溶酶体。在吞噬溶酶体内，活性氧(ROS)、活性氮(RNS)和溶菌酶协同作用以清除细菌。然而，许多细菌诸如金黄色葡萄球菌和大肠杆菌已经进化了免疫逃逸机制，用于阻遏吞噬溶酶体杀伤，包括清除ROS和RNS，以及抵抗溶菌酶，从而导致细胞内存活和复发性感染。第三，尽管联合抗生素疗法是脓毒症临床指南中的标准治疗，70％-80％的脓毒症死亡与持续感染有关，这表明抗生素抗性的流行和新抗菌剂的缺乏。作为替代方案，基于过继性细胞转移的免疫疗法绕过了恢复功能障碍的免疫细胞的需要，因此在免疫受损患者中提供潜在益处。
本文公开了使用在溶酶体中负载有抗菌肽/组织蛋白酶B的巨噬细胞(MAC)的过继性转移。为了构建MAC，设计了抗菌肽/组织蛋白酶B(AMP-CatB)mRNA。在RAW264.7细胞系和骨髓源性巨噬细胞(BMDM)两者中鉴定出维生素C脂质纳米颗粒(VCLNP)比脂质体3000和电穿孔更有效地递送mRNA。VCLNP允许AMP-CatB在巨噬细胞溶酶体中的特异性累积，巨噬细胞溶酶体是抗细菌活性的关键位置。本文还公开了过继性MAC转移消除包括金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在内的MDR细菌，并且在免疫受损的脓毒症模型中恢复小鼠身体状况，这提供了克服MDR细菌诱导的脓毒症的策略，并且阐明了感染性疾病的纳米颗粒细胞疗法的发展。现在将详细参考本发明的实施方案，其实例在附图和实施例中示出。然而，本发明可以以许多不同的形式体现，并且不应当被解释为限于本文阐述的实施方案。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。
术语
贯穿本申请使用的术语应被解释为对于本领域普通技术人员普通且典型的含义。然而，申请人期望以下术语具有如下所定义的特定定义。
如本文所用，冠词“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”意指“至少一个/种”，除非使用此冠词的上下文另外清楚地指示。
如本文所用的术语“包含”及其变型与术语“包括”及其变型同义使用，并且是开放的非限制性术语。尽管术语“包含”和“包括”在本文用于描述各种实施方案，但是术语“基本上由......组成”和“由......组成”可以代替“包含”和“包括”使用，以提供更具体的实施方案，并且也被公开。
如本文所用，术语“可以”、“任选地”和“可以任选地”可互换使用，并且旨在包括其中条件发生的情况以及其中条件不发生的情况。因此，例如，制剂“可以包含赋形剂”的陈述旨在包括其中制剂包含赋形剂的情况以及其中制剂不包含赋形剂的情况。
术语“约”和“大约”被定义为如本领域普通技术人员所理解的“接近”。在一个非限制性实施方案中，所述术语被定义为在10％内。在另一个非限制性实施方案中，所述术语被定义为在5％内。在再另一个非限制性实施方案中，所述术语被定义为在1％内。
如本文所用的术语“核酸”意指由核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)构成的聚合物。
如本文所用的术语“核糖核酸”和“RNA”意指由核糖核苷酸构成的聚合物。
如本文所用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”意指由脱氧核糖核苷酸构成的聚合物。
术语“寡核苷酸”表示单链或双链核苷酸多聚体。合适的寡核苷酸可以通过Beaucage和Carruthers，Tetrahedron Lett.，22：1859-1862(1981)描述的亚磷酰胺方法或者通过根据Matteucci，等人，J.Am.Chem.Soc.，103：3185(1981)描述的三酯方法(两者都以引用的方式并入本文)或者通过使用商业自动化寡核苷酸合成仪或VLSIPSTM技术的其他化学方法来制备。当寡核苷酸被称为“双链”时，本领域技术人员应理解，一对寡核苷酸以通常与例如DNA相关联的氢键键结的螺旋阵列存在。除了100％互补形式的双链寡核苷酸外，如本文所用的术语“双链”还旨在指包括诸如凸起和环的结构特征的那些形式，在诸如Stryer，Biochemistry，第三版，(1988)的生物化学文献中有更全面的描述，所述文献出于所有目的以引用的方式并入本文。
术语“多核苷酸”是指由核苷酸单体构成的单链或双链聚合物。
术语“多肽”是指由通过肽键连接的D-氨基酸或L-氨基酸的单链或者D-氨基酸和L-氨基酸的混合物组成的化合物。
术语“启动子”或“调控元件”是指位于转录起始上游或下游的区域或序列决定簇，并且其参与RNA聚合酶和启动转录的其他蛋白质的识别和结合。启动子不必是细菌来源的，例如，来源于病毒或其他生物体的启动子可以用于本文所述的组合物、系统或方法中。
术语“重组”是指人操纵的核酸(例如多核苷酸)或者人操纵的核酸(例如多核苷酸)的拷贝或互补体，或者如果涉及蛋白质(即，“重组蛋白”)，则指由重组核酸(例如多核苷酸)编码的蛋白质。在一些实施方案中，包含可操作地连接至第二核酸(例如多核苷酸)的启动子的重组表达盒可以包含由于人操纵(例如，通过Sambrook等人，Molecular Cloning-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)或Current Protocols in Molecular Biology第1-3卷，John Wiley&Sons，Inc.(1994-1998)中描述的方法)而与第二核酸(例如多核苷酸)异源的启动子。在另一个实例中，重组表达盒可以包含以使得核酸(例如多核苷酸)极不可能在自然界中发现的方式组合的核酸(例如多核苷酸)。例如，人操纵的限制性位点或质粒载体序列可以侧接启动子或将启动子与第二核酸(例如多核苷酸)分开。技术人员将认识到，核酸(例如多核苷酸)可以以许多方式操纵，并且不限于以上实例。
术语“表达盒”或“载体”是指核酸构建体，当其被引入宿主细胞时，分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。在一些实施方案中，包含可操作地连接至第二核酸(例如多核苷酸)的启动子的表达盒可以包含由于人操纵(例如，通过Sambrook等人，Molecular Cloning-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)或Current Protocols in Molecular Biology第1-3卷，John Wiley&Sons，Inc.(1994-1998)中描述的方法)而与第二核酸(例如多核苷酸)异源的启动子。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗口或指定区域上对于最大对应性进行比较和比对时，在指定区域上约60％同一性，优选61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法用下文所述的默认参数或通过手动比对和目视检查(参见例如NCBI网址等)测量的。然后将此类序列称为“基本上相同的”。此定义还指或可适用于测试序列的互补体。此定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。如下所述，优选的算法可以考虑空隙等。优选地，同一性存在于长度为至少约10个氨基酸或20个核苷酸的区域上，或更优选地存在于长度为10-50个氨基酸或20-50个核苷酸的区域上。如本文所用，核苷酸序列同一性百分比(％)定义为在比对序列并引入空隙(如果需要)以实现最大序列同一性百分比后，候选序列中与参考序列中的核苷酸相同的氨基酸的百分比。用于确定序列同一性百分比的目的的比对可以在本领域技术范围内的各种方式来实现，例如，使用公众可得到的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。可以通过已知方法确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，将测试序列与所述参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认的程序参数，或者可以指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
适合确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述在Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402以及Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。此算法涉及首先通过以下方式来辨识高评分序列对(high scoring sequence pair，HSP)：识别查询序列中长度为W的短字，所述短字当与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某个正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。这些最初的邻域字命中充当种子以用于启动搜索来找到包含它们的更长HSP。只要累积比对得分可增加，字命中就沿着每个序列在两个方向上扩展。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是＞0)和N(错配残基的惩罚得分；总是＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当在以下情况下时，字命中在每个方向上的扩展停止：累积比对得分从其最大实现值下降了量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用为11的字长(wordlength，W)、为10的期望值(expectation，E)、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用为3的字长、为10的期望值(E)和为50的BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对(B)、为10的期望值(E)、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性执行统计分析(参见例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总概率(P(N))，其提供了对两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总概率小于约0.2，更优选小于约0.01，则认为核酸与参考序列相似。
短语“密码子优化的”当提及用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区时，是指改变多核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映所选生物体的典型密码子使用，而不改变由所述DNA编码的多肽。这种优化包括用一个或多个在所选生物体的基因中更频繁使用的密码子置换至少一个或一个以上或显著数量的密码子。
术语“核碱基”是指具有沃森/克里克碱基配对功能的核苷酸部分。最常见的天然存在的核碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)具有氢键合功能，所述氢键合功能可将一条核酸链与另一条核酸链以序列特异性方式结合。
当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时，所述核酸是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其可操作地连接至编码序列；或者如果核糖体结合位点的位置便于翻译，则其可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA或RNA序列彼此靠近，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且处于阅读阶段。然而，可操作地连接的核酸(例如增强子和编码序列，或多个编码序列)不必是连续的。通过在方便的限制性位点连接完成连接。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。在一些实施方案中，当启动子能够影响(例如相对于不存在启动子的情况进行调节)来自编码序列的蛋白质的表达时，启动子与所述编码序列可操作地连接(即，所述编码序列处于所述启动子的转录控制下)。
术语“基因”或“基因序列”是指编码序列或控制序列或其片段。基因可以包括编码序列和控制序列或其片段的任何组合。因此，如本文提及的“基因”可以是天然基因的全部或部分。如本文提及的多核苷酸序列可以与术语“基因”互换使用，或者可以包括任何编码序列、非编码序列或控制序列、其片段及其组合。术语“基因”或“基因序列”包括例如编码序列上游的控制序列(例如，核糖体结合位点)。
如本文所用的术语“纳米颗粒”是指与使用环境生物相容并且足够耐受使用环境的化学和/或物理破坏的颗粒或结构，所述使用环境使得足够数量的纳米颗粒在递送至施加或治疗部位后保持基本上完整，并且所述颗粒或结构的大小在纳米范围内。对于本发明的目的，纳米颗粒通常在约1nm至约1000nm、约50nm至约500nm、约50nm至约350nm、约100nm至约250mm、或约110nm至约150nm的范围内。
短语“脓毒症的症状”是指患有脓毒症的受试者特有的任何症状，包括但不限于动脉低血压、代谢性酸中毒、发热、降低的全身血管阻力、呼吸急促和器官功能障碍。脓毒症可以由败血症(即，生物体、其代谢终产物或血流中的毒素)导致，所述败血症包括菌血症(即，血液中的细菌)以及毒血症(即，血液中的毒素)，包括内毒素血症(即，血液中的内毒素)。术语“脓毒症”还涵盖真菌血症(即，血液中的真菌)、病毒血症(即，血液中的病毒或病毒颗粒)和寄生虫血症(即，血液中的蠕虫或原生动物寄生虫)。因此，与败血症和败血性休克相关联的表型(由败血症引起的急性循环衰竭通常与多器官衰竭和高死亡率相关联)是脓毒症的症状。
如本文所用，术语受试者的“治疗(treating或treatment)”包括向受试者施用治疗剂，其目的是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改进、改善、稳定或影响疾病或病症或者疾病或病症的症状。术语“治疗”也可以指症状的严重性和/或频率的降低、症状和/或潜在病因的消除以及损伤的改善或补救。
“治疗剂”是指具有有益生物学作用的任何组合物。有益生物学作用包括治疗作用(例如治疗病症或其他不期望的生理状况)和预防作用(例如预防病症或其他不期望的生理状况(例如，脓毒症))两者。所述术语还涵盖本文具体提到的有益剂的药学上可接受的、药理学活性的衍生物，包括但不限于细胞、盐、酯、酰胺、前剂(proagent)、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，或当具体鉴定特定的剂时，应当理解所述术语包括剂本身以及药学上可接受的、药理学活性的盐、酯、酰胺、前剂、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
组合物的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效实现期望的治疗结果的量。在一些实施方案中，期望的治疗结果是脓毒症的治疗。在一些实施方案中，期望的治疗结果是恢复脓毒症患者的免疫系统。在一些实施方案中，期望的治疗结果是病原体的减少或清除。给定治疗剂的治疗有效量通常将相对于诸如所治疗的病症或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。所述术语还可以指有效促进期望的治疗效果的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间推移的量)。精确的期望的治疗效果将根据待治疗的病状、受试者的耐受性、待施用的剂和/或剂制剂(例如，治疗剂的效力、制剂中剂的浓度等)以及本领域普通技术人员所理解的多种其他因素而变化。在一些情况下，在数天、数周或数年的时间段内向受试者施用多剂量的组合物之后，实现期望的生物学或医学反应。
“药学上可接受的载剂”(有时称为“载剂”)意指可用于制备药物或治疗组合物的载剂或赋形剂，其通常是安全和无毒的，并且包括对于兽医学和/或人药物或治疗用途可接受的载剂。术语“载剂”或“药学上可接受的载剂”可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如水包油乳液或油包水乳液)和/或各种类型的润湿剂。
如本文所用，术语“载剂”涵盖任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域熟知的用于药物制剂的其他物质。用于组合物的载剂的选择将取决于组合物的预期施用途径。药学上可接受的载剂和含有这些物质的制剂的制备描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第21版编辑University of the Sciencesin Philadelphia，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA，2005中。生理上可接受的载剂的实例包括盐水；甘油；DMSO；缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和具有其他有机酸的缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐反离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM(ICI，Inc.；Bridgewater，New Jersey)、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM(BASF；Florham Park，NJ)。为了提供用于期望的治疗性治疗的此类剂量的施用，本文公开的组合物可以有利地包含基于包含载剂或稀释剂的总组合物的重量总共约0.1重量％与99重量％之间的一种或多种主题化合物。
如全文所用，“受试者”(或“宿主”)意指个体。因此，“受试者”可以包括例如驯养动物，诸如猫、犬等，家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)，实验室动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)，哺乳动物，非人哺乳动物，灵长类动物，非人灵长类动物，啮齿动物，鸟类，爬行动物，两栖动物，鱼和任何其他动物。受试者可以是哺乳动物，诸如灵长类动物或人。
抗原呈递细胞
在一些方面，本文公开了一种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
基于脂质的纳米颗粒，所述基于脂质的纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸；
编码组织蛋白酶B的第二核酸；和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些方面，本文公开了一种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
基于脂质的纳米颗粒，所述基于脂质的纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸；
编码组织蛋白酶B肽的第二核酸；和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些方面，本文公开了一种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
基于脂质的纳米颗粒，所述基于脂质的纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸；
编码组织蛋白酶肽的第二核酸；和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞包括巨噬细胞或树突细胞。
应当理解，本文所用的术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指可以加工和呈递抗原以刺激某些淋巴细胞(例如，T细胞和B细胞)的反应的异源免疫细胞群。典型的APC包括例如树突细胞、巨噬细胞、B细胞和嗜中性粒细胞。
本文中应当理解，巨噬细胞通常称为吞噬免疫细胞(Meszaros等人，1999)。它们还分泌因子，诸如趋化因子或细胞因子。除吞噬作用和抗原呈递外，这些细胞还可以通过质膜和分泌的分子的不同库发挥支持作用(Gordon 1995，BioEssays，第17卷，增刊11)，如先前对于成红细胞、肝细胞和神经元所示(Sadahira和Morr，Pathol Int.1999年10月；49(10)：841-8.)(Takeishi，Hirano等人，Arch Histol Cytol.1999年12月；62(5)：413-22.)(Polazzi，Gianni等人，Glia.2001年12月；36(3)：271-80.)。“巨噬细胞”意指展现出通常对于巨噬细胞描述的特性的细胞，所述特性包括吞噬作用、限定的细胞表面标记物的表达诸如CD64、CD14和HLA-DR抗原表达。根据本发明的巨噬细胞可以从组织中分离，或者优先通过自血液单核细胞(本文也称为“单核细胞源性巨噬细胞”)、骨髓前体细胞(本文也称为“骨髓源性巨噬细胞”)或自任何其他可能的前体并通过使用任何分化方法离体分化，所述前体和方法是本领域技术人员已知的。因此，在一些实施方案中，所述巨噬细胞包括骨髓源性巨噬细胞。在一些实施方案中，所述巨噬细胞包括单核细胞源性巨噬细胞。在一些实施方案中，所述巨噬细胞包括iPSC源性巨噬细胞。在一些实施方案中，所述巨噬细胞包括巨噬细胞系，包括例如RAW264.7、THP-1、U937、IC-21、J774A.1、MV-4-11或KG1。
本文中还应当理解，如本文所用，“树突细胞”或“DC”是指一种类型的抗原呈递细胞，其通常通过在其细胞表面上表达一种或多种下列标记物来鉴定：CD1a、CD1b和CD1c、CD4、CD11c、CD33、CD40、CD80、CD86、CD83和HLA-DR。在一些实施方案中，所述树突细胞是成熟DC。在一些实施方案中，所述树突细胞是未成熟DC。根据本发明的DC可以从组织中分离，或者优先通过自血液单核细胞(本文也称为“单核细胞源性树突细胞”)、骨髓前体细胞(本文也称为“骨髓源性树突细胞”)或自任何其他可能的前体并通过使用任何分化方法离体分化，所述前体和方法是本领域技术人员已知的。因此，在一些实施方案中，所述树突细胞包括骨髓源性树突细胞。在一些实施方案中，所述树突细胞包括单核细胞源性树突细胞。在一些实施方案中，所述树突细胞包括iPSC源性树突细胞。在一些实施方案中，所述树突细胞是常规树突细胞1(或cDC1，淋巴DC)，其通常通过在其细胞表面上表达一种或多种下列标记物来鉴定：CD141、CLEC9A和XCR1。在一些实施方案中，所述树突细胞是常规树突细胞2(或cDC2，骨髓DC)，其通常通过在其细胞表面上表达一种或多种下列标记物来鉴定：CD1c和CD172a。在一些实施方案中，所述树突细胞是浆细胞样DC(或pDC)，其通常通过在其细胞表面上表达一种或多种下列标记物来鉴定：CD123、CD303和CD304。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞来源于选自由小鼠、大鼠、人或非人灵长类动物组成的组的受试者。在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞来源于小鼠。在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞来源于大鼠。在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞来源于人。在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞来源于非人灵长类动物。
纳米颗粒
虽然本文描述了许多纳米颗粒，但本文也可以使用本领域已知的另外的纳米颗粒。
在一些方面，本文公开了一种基于脂质的纳米颗粒，所述基于脂质的纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸；
编码组织蛋白酶B的第二核酸；和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些方面，本文公开了一种基于脂质的纳米颗粒，所述基于脂质的纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸；
编码组织蛋白酶B肽的第二核酸；和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些方面，本文公开了一种基于脂质的纳米颗粒，所述基于脂质的纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸；
编码组织蛋白酶肽的第二核酸；和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
本文所用的术语“维生素-脂质”是指包含维生素部分和脂质的化合物，其中所述脂质可以是脂质样部分。术语“维生素-脂质”还意指WO2019/027999中更充分描述的那些形式，所述专利出于所有目的以引用的方式并入本文。因此，所述维生素-脂质可以是例如式A的化合物：
Figure BPA0000319804310000231
Figure BPA0000319804310000241
或其盐，其中：
R1为烷基或醚接头，其中所述烷基或醚接头被维生素部分取代；
R2为烷基、环烷基、杂环烷基、烷基杂环烷基、酰胺、烷基酰胺、醚、烷基醚、
Figure BPA0000319804310000242
其中m是1至20的整数，
其中n是1至3的整数；并且
每个R3独立地选自烷基、烯基、炔基、酯或烷基酯。
在一个实施方案中，所述维生素-脂质可以是式I的化合物：
Figure BPA0000319804310000243
或其盐，其中：
R1为烷基或醚接头，其中所述烷基或醚接头被碳水化合物部分、磷酸酯部分或维生素部分取代；并且
每个R3独立地选自烷基、烯基、炔基、酯或烷基酯。
所述维生素部分可以是例如维生素B3、维生素C、维生素D、维生素E、维生素H或其衍生物。在一些实施方案中，所述维生素部分是维生素C或其衍生物。所述维生素部分如下所示：
Figure BPA0000319804310000251
在一些实施方案中，维生素-脂质包含：
Figure BPA0000319804310000252
在一些实施方案中，所述维生素-脂质选自由以下组成的组：
Figure BPA0000319804310000261
或其盐。
在一些实施方案中，所述维生素-脂质选自由以下组成的组：
Figure BPA0000319804310000262
Figure BPA0000319804310000271
或其盐。
在一些实施方案中，所述基于脂质的纳米颗粒包含约10％至约60％的摩尔比的维生素-脂质。在一些实施方案中，所述基于脂质的纳米颗粒包含约10％至约40％的摩尔比的维生素-脂质。在一些实施方案中，所述基于脂质的纳米颗粒包含约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约60％、约70％或约80％的摩尔比的维生素-脂质。在一个实施方案中，所述基于脂质的纳米颗粒包含约30％的摩尔比的维生素-脂质。
在一些实施方案中，所述基于脂质的纳米颗粒还包含非阳离子脂质，所述非离子脂质可以包括但不限于1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SOPE)、DPPC(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1，2-二油酰基-5/7-甘油基-3-磷酸-(l′-rac-甘油)(DOPG)或其组合。
在一些实施方案中，所述基于脂质的纳米颗粒还包含聚乙二醇-脂质(PEG-脂质)，所述聚乙二醇-脂质可以包括但不限于PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油和PEG修饰的二烷基甘油。代表性聚乙二醇-脂质包括DMG-PEG、DLPE-PEG、DMPE-PEG、DPPC-PEG和DSPE-PEG。
在一些实施方案中，所述基于脂质的纳米颗粒还包含PEG化的胆固醇、DC-Choi(N，N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇)、1，4-双(3-N-油烯基氨基-丙基、)哌嗪或其组合。
在一些实施方案中，所述基于脂质的纳米颗粒还包含重组多核苷酸，其中所述多核苷酸可以被维生素-脂质包封。
多核苷酸和多肽
在一些实施方案中，所述重组多核苷酸包含RNA或DNA。在一些实施方案中，所述重组多核苷酸是RNA。在一些实施方案中，所述重组多核苷酸是mRNA。在一些实施方案中，所述重组多核苷酸是DNA。
如本文公开的术语“抗菌肽”包括对于选自由细菌诸如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等和真菌诸如酵母、霉菌等组成的组的一种或多种具有抗菌活性的肽或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗菌肽包含序列SEQ ID NO：1，或其片段或功能活性变体。在一些实施方案中，所述抗菌肽选自包含与SEQ ID NO：1至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)相同的多肽序列的组。在一些实施方案中，所述抗菌肽选自Protegrin 1、C16G2、Omiganan、β-防卫素、hLF1-11、LL37或MSI-78，或其片段或功能活性变体。这些抗菌肽序列和另外的抗菌肽是本领域已知的，例如参见美国专利8,754,039，所述专利以引用的方式整体并入本文。
任何前述方面的抗菌肽可以由重组多核苷酸的第一核酸编码。在一些实施方案中，所述第一核酸包含序列SEQ ID NO：2，或其片段或功能活性变体。在一些实施方案中，第一核酸选自包含与SEQ ID NO：2至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)相同的多核苷酸序列的组。
本文公开的组织蛋白酶B包含SEQ ID NO：3中所示的多肽序列，或其片段或功能活性变体。在一些实施方案中，组织蛋白酶B选自包含与SEQ ID NO：3至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)相同的多肽序列的组。
任何前述方面的组织蛋白酶B可以由重组多核苷酸的第二核酸编码。在一些实施方案中，第二核酸包含序列SEQ ID NO：4，或其片段或功能活性变体。在一些实施方案中，第二核酸选自包含与SEQ ID NO：4至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)相同的多核苷酸序列的组。
在一些方面，本文公开了一种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
基于脂质的纳米颗粒，所述基于脂质的纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸；
第二核酸；和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些方面，本文公开了一种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
基于脂质的纳米颗粒，所述基于脂质的纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸；
编码组织蛋白酶肽的第二核酸；和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些实施方案中，编码组织蛋白酶肽的第二核酸包括组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶F或组织蛋白酶G，或其片段或功能活性变体。这些序列是本领域已知的，并且可以在国家生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)找到。在一些实施方案中，所述序列来自哺乳动物。在一些实施方案中，所述序列来自小鼠。在一些实施方案中，所述序列来自灵长类动物。在一些实施方案中，所述序列来自人。
在一些实施方案中，所述接头包括组织蛋白酶B敏感接头。在一些实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO：5中所示的多肽序列，或其片段或功能活性变体。在一些实施方案中，所述接头选自包含与SEQ ID NO：5至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)相同的多肽序列的组。
任何前述方面的接头可以由第三核酸编码。在一些实施方案中，所述第三核酸包含序列SEQ ID NO：6，或其片段或功能活性变体。在一些实施方案中，第三核酸选自包含与SEQ ID NO：6至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)相同的多核苷酸序列的组。
在一些实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中所示的多肽序列，或其片段或功能活性变体。在一些实施方案中，所述接头选自包含与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)相同的多肽序列的组。在一些实施方案中，所述接头还可以是Phe-Lys。
在一些实施方案中，任何前述方面的重组多核苷酸包含序列SEQ ID NO：7，或其片段或功能活性变体。在一些实施方案中，所述重组多核苷酸选自包含与SEQ ID NO：7至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)相同的多核苷酸序列的组。
在一些实施方案中，所述重组多核苷酸编码包含SEQ ID NO：8中所示的序列的重组多肽，或其片段或功能活性变体。在一些实施方案中，所述重组多肽选自包含与SEQ IDNO：8至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)相同的多核苷酸序列的组。
在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸通过第三核酸连接。
治疗方法
在一些方面，本文公开了一种治疗脓毒症的方法，所述方法包括向受试者施用一种或多种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸，
编码组织蛋白酶B的第二核酸，和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些方面，本文公开了一种治疗脓毒症的方法，所述方法包括向受试者施用一种或多种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸，
第二核酸，和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些方面，本文公开了一种治疗脓毒症的方法，所述方法包括向受试者施用一种或多种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸，
编码组织蛋白酶肽的第二核酸，和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些方面，本文公开了一种治疗脓毒症的方法，所述方法包括向受试者施用一种或多种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸，
编码组织蛋白酶B肽的第二核酸，和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
如上文所公开，术语“脓毒症”还涵盖细菌血症(即，血液中的细菌)、毒血症(即，血液中的毒素)、真菌血症(即，血液中的真菌)、病毒血症(即，血液中的病毒或病毒颗粒)和寄生虫血症(即，血液中的蠕虫或原生动物寄生虫)。因此，与败血症和败血性休克相关联的表型(由败血症引起的急性循环衰竭通常与多器官衰竭和高死亡率相关联)是脓毒症的症状。因此，本文公开了一种治疗、抑制或减轻脓毒症或脓毒症的症状(例如，减少血液中细菌、毒素、真菌、病毒或寄生虫的负荷，和/或恢复、维持或改善受影响的受试者的免疫系统)的方法。
在一些实施方案中，任何前述方面的抗原呈递细胞来源于所述受试者。在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞来源于所述受试者。在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞来源于不同的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述人患有或疑似患有脓毒症。
在一些实施方案中，治疗脓毒症的方法包括向受试者施用任何前述方面的一种或多种抗原呈递细胞，其中所述一种或多种抗原呈递细胞与药学上可接受的载剂一起制备和施用。
由于脓毒症的时机通常是无法预测的，因此应当理解，所公开的治疗、预防、减轻和/或抑制脓毒症的方法可以在脓毒症症状发作之前或之后使用，以治疗、预防、抑制和/或减轻脓毒症。其中，所公开的方法可以在脓毒症前的任何时间进行。在一个方面，所公开的方法可以在脓毒症前12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个月，30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3天，60、48、36、30、24、18、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2小时，60、45、30、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟；或在脓毒症后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、90、105、120分钟，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、24、30、36、48、60小时，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、45、60、90天或更久，4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更久，30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1年使用。
本发明的抗原呈递细胞可以以本领域已知的任何方式施用至适当的受试者，所述方式例如口服、肌内、静脉内、舌下粘膜、动脉内、鞘内、皮内、腹膜内、鼻内、肺内、眼内、阴道内、直肠内或皮下。可以将它们引入胃肠道或呼吸道中。肠胃外施用(如果使用)通常以注射为特征。
在一些方面，本文公开了一种治疗疾病的方法，所述方法包括向受试者施用一种或多种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸，
第二核酸(例如，编码组织蛋白酶肽，诸如组织蛋白酶B肽)，和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些方面，本文公开了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用一种或多种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸，
第二核酸(例如，编码组织蛋白酶肽，诸如组织蛋白酶B肽)，和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些实施方案中，所述疾病选自溶酶体贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、戈谢病、GM1神经节苷脂贮积症或粘多糖贮积症。
在一些方面，本文公开了一种治疗神经变性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用一种或多种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸，
第二核酸(例如，编码组织蛋白酶肽，诸如组织蛋白酶B肽)，和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
在一些实施方案中，所述神经变性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病或亨延顿病。
在再其他实施方案中，本文公开了一种治疗疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的任何前述方面的免疫细胞。在一些实施方案中，所述疾病选自溶酶体贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、戈谢病、GM1神经节苷脂贮积症或粘多糖贮积症。
另外的组合物和方法
在一些方面，本文公开了一种免疫细胞，所述免疫细胞包含：
基于脂质的纳米颗粒，所述基于脂质的纳米颗粒包含：
编码免疫蛋白的重组多核苷酸；和
维生素-脂质；
其中所述免疫细胞包括T细胞。
在一些实施方案中，所述重组多核苷酸由所述维生素-脂质包封。
在一些实施方案中，所述重组多核苷酸包含RNA或DNA。在一些实施方案中，所述重组多核苷酸是RNA。在一些实施方案中，所述重组多核苷酸是mRNA。在一些实施方案中，所述重组多核苷酸是DNA。
在一些实施方案中，所述免疫蛋白包括嵌合抗原受体或细胞毒性细胞因子。
在一些实施方案中，所述免疫蛋白是嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区或CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与肿瘤抗原结合。
在一些实施方案中，所述免疫蛋白是细胞毒性细胞因子，包括例如干扰素γ、肿瘤坏死因子、颗粒酶A、颗粒酶B或穿孔素。
在一些实施方案中，本文公开了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的任何前述方面的免疫细胞。
在再其他实施方案中，本文公开了一种治疗疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的任何前述方面的免疫细胞。在一些实施方案中，所述疾病选自溶酶体贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、戈谢病、GM1神经节苷脂贮积症或粘多糖贮积症。
在一些实施方案中，本文公开了一种治疗神经变性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的任何前述方面的免疫细胞。在一些实施方案中，所述神经变性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病或亨廷顿病。
在一些实施方案中，所述受试者包括人。在一些实施方案中，所述人患有或疑似患有癌症。
实施例
下面阐述以下实施例以说明根据所公开主题的化合物、系统、方法和结果。这些实施例并非旨在包括本文公开的主题的所有方面，而是要说明代表性的方法和结果。这些实施例并非旨在排除对本领域技术人员显而易见的本发明的等同物和变化。
实施例1.维生素脂质纳米颗粒提供过继性巨噬细胞转移以治疗
多药耐药性细菌脓毒症
本文公开的数据显示，在溶酶体中负载有抗菌肽/组织蛋白酶B的巨噬细胞(MAC)的过继性转移为免疫受损的脓毒症宿主提供了增强先天免疫、防止细菌免疫逃避和消除多药耐药性(MDR)细菌的能力。如图1a中所示，设计并构建具有编码抗菌肽IB367(AMP-IB367)、组织蛋白酶B(CatB)和可切割接头的多种组分的mRNA(AMP-CatB)。AMP-IB367是具有快速杀菌活性的广谱AMP并且已经在临床试验中得到证实。内源蛋白CatB首先在细胞质中翻译为无活性前体并易位到溶酶体中。然后将这些前体加工成成熟的CatB。并入CatB组分的功能以将AMP-IB367转运到溶酶体中，所述溶酶体与含细菌的吞噬体融合。游离AMP-IB367需要从AMP-CatB蛋白中释放出来，以便根除细菌。因此，在mRNA序列中加入CatB敏感接头。溶酶体具有大量的CatB蛋白，从而促进AMP-IB367的释放。为了使巨噬细胞具备设计的mRNA，需要对于巨噬细胞有效的mRNA递送系统，巨噬细胞是最难转染的细胞之一。巨噬细胞摄取不同的维生素以实现其生物学功能。
通过初始筛选和两轮表征，维生素C脂质纳米颗粒(VCLNP)制剂允许将AMP-CatBmRNA有效地递送至巨噬细胞中。mRNA在细胞质中被翻译成功能性蛋白质，并且所述蛋白质进一步易位到溶酶体中。在所述溶酶体中，CatB敏感接头被CatB蛋白切割，并因此释放APM-IB367。当包封细菌的吞噬体与溶酶体融合时，摄取的细菌暴露于预储存的AMP-IB367和溶酶体抗菌组分两者。尽管免疫逃避策略可以保护MDR细菌不受吞噬溶酶体杀伤机制的影响，但AMP-IB367能够杀伤这些细菌，因为它在动物模型和人中对于MDR细菌具有高抗细菌活性。因此，通过恢复先天免疫、克服细菌免疫逃避和根除感染，MAC的过继性转移拯救了伴有免疫抑制的MDR细菌诱导的脓毒症。
首先选择五种维生素：维生素B3、维生素C、维生素D、维生素E和维生素H(也称为维生素B7)，然后使用先前报道的方法并入脂质尾部。氨基脂质通过酯键或酰胺键安装在这些维生素上(图1b)。这五种维生素衍生的脂质被命名为VB3-脂质、VC-脂质、VD-脂质、VE-脂质和VH-脂质。脂质链中的叔胺可以在酸性条件下电离并与mRNA相互作用。这些维生素衍生的脂质的结构通过1H NMR和质谱(MS)证实(图2至图6)。
接着，将这些维生素衍生的脂质相应地配制成维生素-脂质纳米颗粒(VLNP)。VLNP的粒度范围为127±1nm至174±1nm，并且多分散性指数(PDI)＜0.3，VHLNP除外(图7a和图7b)。mRNA的截留效率在52％至99％范围内，并且所有VLNP都是带正电荷的(图7c和图7d)。在使用编码萤火虫荧光素酶的mRNA的RAW264.7细胞中的初始筛选中，对于mRNA递送，VCLNP比其他四种VLNP有效20倍(图8a)。此外，在相同的mRNA浓度下，VCLNP比脂质体3000好10倍，并且比电穿孔好50倍(图8a)。另外，从6小时到24小时，在12小时时观察到VCLNP组的最高发光强度(图8b)。为了进一步研究VCLNP的制剂，进行正交阵列设计以微调组分比率。基于L16(4)4正交阵列设计表(图7e)制备16种不同的制剂。制剂B2(脂质∶DOPE∶胆固醇＝30∶30∶40)从此研究中出现(图8c和图8e)。然后，通过与正交表中的最佳制剂A10(脂质∶DOPE∶胆固醇＝30∶30∶50)比较验证了递送效率。预测的制剂B2的发光强度显著高于制剂A10(P＜0.05，图8d和图8e)。为了进一步改善mRNA递送效率，检查制剂B2的5∶1至20∶1的VC-脂质：mRNA的质量比(图8d)。在第二轮表征中，发光强度随着VC-脂质：mRNA的质量比增加而增强，直至质量比为15∶1(制剂C5，图8e)。VCLNP的制剂C5根据Cryo-TEM图像以球形形态带正电荷(图8f和图7f)。基于这些结果，选择mRNA递送效率比其初始制剂提高超过7倍的这种VCLNP制剂用于进一步研究。
使用荧光探针，Alexa-Fluor 647标记的RNA，在VCLNP组中观察到99.2％的Alexa-Fluor 647阳性细胞，在脂质体3000组中观察到21.5％的Alexa-Fluor 647阳性细胞，而在电穿孔组中观察到2.4％的Alexa-Fluor 647阳性细胞(图13a)。此外，与脂质体3000处理的细胞或电穿孔处理的细胞相比，VCLNP处理的细胞中的荧光强度分别高约4倍和16倍(图13b)。这些数据证明VCLNP的有效细胞摄取。然后，将细胞与VCLNP在不同的内吞抑制剂5-(N-甲基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)、甲基-β-环糊精(MβCD)和盐酸氯丙嗪(CPZ)存在下一起孵育，所述内吞抑制剂分别抑制大型胞饮作用、小窝介导的内吞作用和网格蛋白介导的内吞作用。在MβCD组中，VCLNP的细胞摄取急剧降低约96％(图13c和图13d)，这表明小窝介导的内吞作用对于这些VCLNP的重要作用。为了研究内体逃逸机制，进行钙黄绿素测定。钙黄绿素(一种膜不可渗透的染料)通常被截留在细胞内体中。用钙黄绿素和VCLNP两者处理细胞，并且观察到细胞质中的扩散的绿色荧光，这表明内体膜破裂，VCLNP因此被释放到细胞质中(图13e和图13f)。
为了测试组织蛋白酶B(CatB)是否能够将有效载荷转运到溶酶体中，构建了eGFP-CatB mRNA并使用VCLNP将其递送至RAW264.7细胞中。活细胞的共聚焦显微镜检查展现eGFP-CatB与
Figure BPA0000319804310000401
Red DND-99共定位在溶酶体中，其中皮尔逊相关系数为0.91±0.15(图8g和图13g)，这表明CatB将其有效载荷运载到溶酶体中。然后，为了评价溶酶体中负载有AMP-IB367的巨噬细胞(MAC)的杀菌活性，在用PBS(PBS-RAW)、游离AMP-CatB mRNA(Fr-RAW)、空VCLNP(Em-RAW)、AMP-CatB mRNA VCLNP/CatB抑制剂II(In-RAW)和AMP-CatBmRNA VCLNP(MAC-RAW)处理的RAW264.7细胞中量化多药耐药性金黄色葡萄球菌(MDRSA)的细胞内存活。相对于其他四种处理，MAC-RAW在所有测试的时间点都显示出最强的杀菌活性，其中抑制百分比为33％至87％(图8h)。当使用CatB抑制剂II抑制CatB功能时，杀菌活性急剧降低(图8h)，这表明AMP-IB367释放的重要性。在所有五个组中都没有观察到细胞数量的显著差异(图13h)；因此，这些结果证明预储存的AMP-IB367能够阻止细菌的免疫逃避，并在吞噬溶酶体中消除它们。
考虑到MAC-RAW的有效体外杀菌活性，进行测试以评估在伴有免疫抑制的MDRSA诱导的脓毒症小鼠中的治疗效果。环磷酰胺(CY)连续治疗3天后，体重(BW)、白细胞(WBC)和淋巴细胞(LYM)的降低模拟了脓毒症患者的免疫受损状态。在被MDRSA感染后，用PBS、PBS-RAW或MAC-RAW治疗小鼠。经腹膜内(i.p.)和静脉内(i.v.)两者注射PBS-RAW以治疗局部细菌和血液细菌。对于MAC-RAW，在相同的总细胞数下进行三种施用方法：单独的i.p.注射、单独的i.v.注射和i.p.+i.v.注射。因为免疫抑制的脓毒症的致死率与不能根除的病原体相关联，所以在细胞转移24小时后测量小鼠血液中的细菌菌落形成单位(CFU)。与PBS治疗类似，PBS-RAW并未降低血液中的细菌负荷，而仅经由i.p.注射施用的MAC-RAW(MAC-RAW(i.p.))和经由i.p.注射和i.v.注射两者施用的MAC-RAW(MAC-RAW(i.p.+i.v.))显著降低血液中的细菌CFU(分别地，P＜0.01和P＜0.001)(图9a)。这些结果显示出体内杀菌活性。有趣的是，MAC-RAW(i.p.+i.v.)显示出比MAC-RAW(i.p.)更强的清除细菌的能力(P＜0.001，图3a)。此外，在第30天，MAC-RAW(i.p.+i.v.)组的存活率为58％，与MAC-RAW(i.p.)组相比有显著改善(P＜0.01，图9b)。类似地，与MAC-RAW(i.v.)相比，MAC-RAW(i.p.+i.v.)在存活率方面显示出更好的治疗效果(P＜0.05)(图13i)。
在MAC-RAW(i.p.+i.v.)组中，在480小时时在7只存活小鼠中的3只中的血液中未检测到细菌(图9f)。然后，对4只持续感染的小鼠进行重复治疗，从而清除这些小鼠中的残余细菌(图9g)。一个月后，7只存活小鼠的BW、WBC和LYM水平完全恢复(图9c至图9e)。此外，在这些小鼠的血液和主要器官(心脏、肝、脾、肺和肾)中未检测到细菌。
接着评价使用原代骨髓源性巨噬细胞(BMDM)的杀菌活性，这可用于临床应用。如文献中所报道，从小鼠骨髓产生BMDM，并且证实约83.5％的细胞是F4/80阳性的。(图10a)。然后，同样筛选VLNP并测试其在BMDM中的表达谱。与RAW264.7细胞中的结果类似，VCLNP在mRNA递送方面比其他四种VLNP有效5倍，比脂质体3000有效6倍，并且比电穿孔有效150倍。(图10b)。同时，BMDM中的VCLNP遵循一致的表达谱，其中在12小时时具有最大发光强度。(图10c)。接着，使用AMP-CatB mRNA VCLNP制备MAC-BMDM，并且关于对MDRSA和多药耐药性大肠杆菌(MDR大肠杆菌)的体外杀菌活性进行评价。与用PBS(PBS-BMDM)、游离AMP-CatB mRNA(Fr-BMDM)、空VCLNP(Em-BMDM)和AMP-CatB mRNA VCLNP/CatB抑制剂II(In-BMDM)处理的BMDM相比，AMP-CarB mRNA VCLNP(MAC-BMDM)对MDRSA和MDR大肠杆菌两者显示出最强杀菌活性，其中最高抑制百分比分别为85％和74％(图10d和10f)。另外，所有五个组都显示出相当的细胞数量(图10e和图10g)，并且AMP-CatB mRNA VCLNP在BMDM中没有诱导明显的细胞毒性(图10h)。
在体外验证结果后，将MAC-BMDM施加到伴有免疫抑制的小鼠以治疗MDRSA诱导的脓毒症。基于来自RAW264.7细胞的数据，MAC-BMDM经由i.p.注射和i.v.注射两者施用至小鼠。24小时时的血液分析显示MAC-BMDM比PBS-BMDM更有效地消除细菌(P＜0.001，图11a)。此外，MAC-BMDM拯救了58％的患有免疫抑制的脓毒症的小鼠，相比之下PBS-BMDM仅拯救了10％的患有免疫抑制的脓毒症的小鼠(P＜0.01，图11b)。除了一只来自MAC-BMDM组的小鼠表现出持续感染外，在480小时时在另外6只存活小鼠的血液中没有发现细菌(图11f和图11g)。类似地，在对所述小鼠重复治疗后，所有小鼠都显示正常水平的BW、WBC和LYM(图11c至图11e)，并且在它们的血液和主要器官(心脏、肝、脾、肺和肾)中显示出未检测到的MDRSA水平。
细菌是在感染的几小时内分布到多个器官中。为了分析这些巨噬细胞的生物分布，将编码萤火虫荧光素酶的mRNA递送至BMDM(FLuc-BMDM)中。i.p.+i.v.注射FLuc-BMDM后六小时，在此小鼠模型中在下列通常被细菌感染的主要器官中测量发光强度：腹膜腔、脾、肝、肺、肾、心脏和血液。结果显示在健康小鼠和脓毒症小鼠中类似的生物分布，不同之处在于在脓毒症小鼠的肺中检测的发光强度到比健康小鼠高(图14a)。在脓毒症小鼠中，发光强度的等级顺序为腹膜腔(52.7％)、脾(21.1％)、肺(12.9％)、肝(9.1％)和血液(3.0％)。BMDM生物分布与这些脓毒症小鼠中的细菌分布相对一致(图14b)。
因为脓毒症宿主通常暴露于混合细菌感染，这是治愈脓毒症的艰巨挑战，所以建立了具有被MDRSA和MDR大肠杆菌两者感染的小鼠脓毒症模型。因为与单一细菌感染相比，混合感染导致更严重的症状，所以将小鼠用总共2×108CUF细菌感染，比单一感染模型中的细菌剂量低2.5倍。与用PBS和PBS-BMDM的治疗相比，用MAC-BMDM的治疗使血液中的细菌负荷分别显著降低了43％(P＜0.01)和39％(P＜0.05)(图12a)，这表明MAC-BMDM消除混合MDR细菌的能力增强。MAC-BMDM的治疗功效还反映在存活率(83％)上，其远高于PBS组(P＜0.01)和PBS-BMDM组(P＜0.05)(图12b)。相反，与PBS相比，PBS-BMDM没有显著改变存活率。(图12b)。最后，在所有存活的小鼠中观察到BW、WBC和LYM的正常水平(图12c至图12f)，并且在480小时时在血液和主要器官(心脏、肝、脾、肺和肾)中未检测到持续感染。
本文显示的是通过递送包封在维生素C脂质纳米颗粒(VCLNP)中的mRNA而在溶酶体中负载有抗菌肽/组织蛋白酶B的巨噬细胞(MAC)。数据显示，在伴有免疫抑制的多药耐药性(MDR)细菌诱导的脓毒症小鼠中，通过恢复先天免疫防御、防止细菌免疫逃避和杀伤MDR细菌，MAC的过继性转移有益地降低了细菌负荷并改善了存活。MAC对由混合的MDR细菌菌株诱导的脓毒症是有效的。经由i.p.+i.v.注射施用的MAC的治疗效果优于经由单独i.p.或i.v.注射施用的MAC，可能是由于脓毒症的感染过程。在脓毒症小鼠中，细菌在短时间内通过淋巴系统转运到血液中，然后经由血液循环分布到其他器官。i.v.+i.p.施用有助于消除侵入血液或定植在腹膜腔中的细菌，从未使得降低细菌CFU和改善存活。当在早期诊断出脓毒症时，自体巨噬细胞可以在大约七天内被制备和工程化。接着，这些自体MAC可以被转移回伴有免疫抑制的患者，在目前的治疗指导下，伴有免疫抑制的患者占脓毒症患者的大多数。另外，随着诱导多能干细胞(iPSC)技术的发展，可以制造同种异体的“通用”巨噬细胞，使得iPSC源性MAC能够成为包括脓毒症在内的广泛临床应用的现成疗法。总之，MAC的过继性转移为将来患有脓毒症和MDR细菌感染的患者提供了一种可治愈的策略。
实施例2.方法和材料
化学品和试剂。下列剂购自Sigma-Aldrich，包括胆固醇、庆大霉素、组织蛋白酶B(CatB)抑制剂II、环磷酰胺(CY)和细胞消化液细胞分离溶液。下列剂获自Thermo FisherScientific，包括F4/80单克隆抗体、重组鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和
Figure BPA0000319804310000441
DND-99。2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)购自Avanti PolarLipids。Bright-Glo荧光素酶底物购自Promega。
细胞和细菌。RAW264.7细胞系获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并在具有10％胎牛血清(Gibco，Invitrogen)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM，ATCC)中培养。通过对先前工序的改进获得鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM)，将其在含有10％胎牛血清和100ng/ml M-CSF的DMEM中培养。MDR金黄色葡萄球菌(MDRSA，ATCC BAA-44)在37℃下在通气条件下在胰酪胨大豆琼脂或肉汤中生长。根据来自ATCC的数据，MDRSA对下列抗生素有抗性：阿莫西林/克拉维酸、青霉素、环丙沙星、头孢噻吩、多西环素、庆大霉素、红霉素、亚胺培南、甲氧西林、四环素、苯唑西林、阿奇霉素、克林霉素、头孢曲松、利福平、阿米卡星和妥布霉素。多药耐药性大肠杆菌(MDR大肠杆菌，ATCC BAA-2340)在37℃下在通气条件下在营养琼脂或营养肉汤(BD Biosciences)中生长。根据来自ATCC的数据，MDR大肠杆菌对下列抗生素有抗性：阿莫西林/克拉维酸、替卡西林、哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢洛汀、头孢呋辛、头孢替坦、头孢泊肟、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢唑啉、头孢西丁、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、多尼培南、美洛培南、厄他培南、亚胺培南、萘啶酸、莫西沙星、诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、妥布霉素、氨曲南和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。
维生素衍生的脂质的合成。根据先前报道的方法合成化合物1、维生素B3衍生物、维生素C衍生物和维生素H(也称为维生素B7)衍生物。
VLNP的制备和表征。本文所用的mRNA是基于报道的方法通过mRNA平台构建的。mRNA LNP的制备先前已有报道。简短地讲，通过移液进行体外筛选或通过微流体混合装置进行离体研究，将新合成的维生素衍生的脂质与DOPE、胆固醇以及萤火虫荧光素酶(FLuc)mRNA一起配制。NanoZS Zetasizer(Malvern)用于测量大小和ζ电位。通过Ribogreen测定来测量截留效率。在Thermo ScientificTM GlaciosTM CryoTEM上使用前述方法检查VCLNP的形态。为了有效地将mRNA递送至巨噬细胞中，使用五种维生素-脂质纳米颗粒(VLNP)、脂质体3000和电穿孔进行初始筛选。在初始筛选中，将新合成的维生素衍生的脂质与DOPE、胆固醇(脂质∶DOPE∶胆固醇＝20∶30∶40，摩尔比)以及FLuc mRNA(脂质∶mRNA＝10∶1，质量比)一起配制。通过荧光素酶表达测定来确定mRNA的递送效率。接着，在初始筛选后进行FLuc表达的动力学，接着进行两轮表征。简短地讲，基于正交阵列设计表L16(4)4制备A-1至A-16的VcLNP，并通过FLuc表达数据预测最佳制剂。在验证了最佳制剂后，第二轮表征集中于微调VC-脂质：mRNA的质量比。使用Nucleofector试剂盒(Lonza)和Nucleofector2b装置的建议方案进行巨噬细胞的电穿孔。
细胞摄取和内体逃逸。将RAW264.7细胞以105细胞/孔接种在6孔板中，并且培养24小时。然后，使用脂质体3000、VcLNP或电穿孔，用FLuc mRNA和Alexa-Fluor 647标记的RNA(1∶1，重量比)处理细胞。孵育3小时后，通过流式细胞仪(LSRII，BD)量化细胞摄取。为了研究VcLNP的内吞通路，在不同的内吞抑制剂包括5-(N-甲基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)、甲基-β-环糊精(MβCD)和盐酸氯丙嗪(CPZ)存在下进行细胞摄取测定。对于内体逃逸测定，将2×104细胞铺板在成像皿(ibidi)中24小时，然后将150μg/mL钙黄绿素添加到具有或没有含Alexa-Fluor 647标记的RNA的VcLNP的细胞中，在37℃下保持6小时。用PBS洗涤以去除细胞外钙黄绿素和纳米颗粒后，在Nikon A1R活细胞成像共聚焦显微镜下经由487nm和647nm激光对细胞进行活体成像。
溶酶体共定位的分析。为了测试AMP-CatB是否可以在溶酶体中特异性累积，制备eGFP-CatB mRNA并使用VCLNP将其递送至RAW264.7细胞中。然后，用
Figure BPA0000319804310000461
RedDND-99(一种成熟的溶酶体探针)对溶酶体染色。在Nikon A1R活细胞成像共聚焦显微镜下经由487nm和561nm激光分析eGFP-CatB和
Figure BPA0000319804310000462
Red DND-99的共定位。
维生素C脂质纳米颗粒在BMDM中的细胞毒性。通过MTT测定检查VCLNP在BMDM中的细胞毒性。将2×104BMDM在100μL生长培养基中接种到96孔板的每个孔中。在与PBS、游离AMP-CatB mRNA、空VCLNP、AMP-CatB mRNA VCLNP/CatB抑制剂II和AMP-CatB mRNA VCLNP一起孵育12小时后，添加MTT溶液。再孵育4小时后，将100uL 10％SDS-HCl添加到每个孔中。将紫色甲臜(formazan)溶解过夜，并且通过酶标仪在570nm下测量吸光度。
体外抗菌测定。根据报道的方法进行细胞内抗菌测定。简短地讲，通过PBS、游离AMP-CatB mRNA、空VCLNP、AMP-CarB mRNA VCLNP/CatB抑制剂II和AMP-CatB mRNA VCLNP处理后，将RAW264.7细胞或BMDM与MDRSA或MDR大肠杆菌在25的感染复数(MOI)下一起孵育120分钟。通过PBS洗涤后，补充含有庆大霉素(100μg/mL)的培养基，并将细胞再孵育1小时以清除细胞外细菌。在不同的时间点，将细胞通过PBS洗涤，并且用0.1％Triton-X 100裂解。最后，将裂解物在营养琼脂或胰酪胨大豆琼脂上培养，以计数细菌菌落形成单位(CFU)。
伴有免疫抑制的MDR诱导的脓毒症小鼠的体内治疗。所有小鼠实验都是在由俄亥俄州立大学的动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案下进行的。C57BL/6小鼠(6-7周)购自Jackson Lab。脓毒症的免疫抑制模型按照文献中的方法进行。简短地讲，在细菌感染前，连续3天对C57BL/6小鼠腹膜内注射100mg/kg剂量的环磷酰胺(CY)。通过监测体重(BW)、用血细胞计数器计数白细胞(WBC)和用Kwik-Diff染色计数淋巴细胞(LYM)来评估它们的免疫受损状态。然后对小鼠腹膜内接种0.1ml细菌悬浮液(对于MDRSA感染，5×108CFU/小鼠，并且对于混合的MDRSA和MDR大肠杆菌感染，2×108CFU/小鼠)。然后，向小鼠施用0.2mL PBS或0.2mL细胞悬浮液(总共2百万细胞/小鼠)。感染24小时后，从面静脉收集血液以量化细菌CFU。基于20％的BW损失和早期去除标准，在前6天内每12小时评估小鼠的存活，然后在随后的24天中每24小时评估小鼠的存活。30天后，从所有存活的小鼠中收集血液，并计数WBC和LYM的数目。此后，对小鼠实施安乐死，并将主要器官(心脏、肝、脾、肺和肾)无菌匀浆以量化细菌CFU。
巨噬细胞和细菌的生物分布。巨噬细胞的生物分布在健康和脓毒症C57BL/6小鼠(6-7周)两者中进行。在此实验中，首先将编码萤火虫荧光素酶的mRNA递送至BMDM(FLuc-BMDM)中，持续12小时。接着，经由腹膜内(i.p.)+静脉内(i.v.)注射向每只小鼠施用0.2mLPBS或0.2mL细胞悬浮液(总共4百万细胞)。6小时后，对小鼠i.p.注射150μL的D-荧光素底物(30mg/mL)，然后在注射8分钟后用CO2实施安乐死。使用Xenogen IVIS成像系统(Caliper，Alameda，CA)立即测量血液、腹膜液和主要器官中的生物发光信号。在感染6小时后量化脓毒症小鼠的血液、腹膜液和主要器官中的细菌CFU。
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Figure BPA0000319804310000502
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序列
SEQ ID NO：1，抗菌肽的氨基酸序列
Figure BPA0000319804310000503
SEQ ID NO：2，编码抗菌肽的核苷酸序列
Figure BPA0000319804310000501
SEQ ID NO：3，组织蛋白酶B的氨基酸序列
Figure BPA0000319804310000511
SEQ ID NO：4，编码组织蛋白酶B的核苷酸序列
Figure BPA0000319804310000512
Figure BPA0000319804310000521
SEQ ID NO：5，接头的氨基酸序列
Figure BPA0000319804310000524
SEQ ID NO：6，编码接头的核苷酸序列
Figure BPA0000319804310000525
SEQ ID NO：7
Figure BPA0000319804310000522
SEQ ID NO：8
Figure BPA0000319804310000523
Figure BPA0000319804310000531
SEQ ID NO：9接头的氨基酸序列
Gly Phe Leu Gly
SEQ ID NO：10接头的氨基酸序列
Ala Leu Ala Leu；
SEQ ID NO：11接头的氨基酸序列
Ala Gly Val Phe
SEQ ID NO：12接头的氨基酸序列
Val Lys Lys Arg
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与所公开的发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。本文所引用的出版物以及引用所述出版物所涉及到的材料明确地以引用的方式并入。
本领域技术人员应当理解，可以对本发明的优选实施方案进行许多改变和修改，并且可以在不偏离本发明的精神的情况下进行此类改变和修改。因此，意图是所附权利要求涵盖如在本发明的真实精神和范围内的所有此类等效物和变化。
Figure IPA0000319804250000011
Figure IPA0000319804250000021
Figure IPA0000319804250000031
Figure IPA0000319804250000041
Figure IPA0000319804250000051
Figure IPA0000319804250000061
Figure IPA0000319804250000071
Figure IPA0000319804250000081
Figure IPA0000319804250000091
Figure IPA0000319804250000101
Figure IPA0000319804250000111
Figure IPA0000319804250000121

Claims (37)

1.一种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
基于脂质的纳米颗粒，所述基于脂质的纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸；
编码组织蛋白酶B的第二核酸；和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
2.如权利要求1所述的抗原呈递细胞，其中所述第一核酸和所述第二核酸通过所述第三核酸连接。
3.如权利要求1或2所述的抗原呈递细胞，其中所述重组多核苷酸由所述维生素-脂质包封。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗原呈递细胞，其中所述重组多核苷酸包含RNA或DNA。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗原呈递细胞，其中所述抗菌肽包含序列SEQ IDNO：1。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗原呈递细胞，其中所述第一核酸包含序列SEQ IDNO：2。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗原呈递细胞，其中所述第二核酸包含序列SEQ IDNO：4。
8.如权利要求1-7中任一项所述的抗原呈递细胞，其中所述接头包括组织蛋白酶B敏感接头。
9.如权利要求1-8中任一项所述的抗原呈递细胞，其中所述第三核酸包含序列SEQ IDNO：6。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗原呈递细胞，其中所述重组多核苷酸包含序列SEQ ID NO：8。
11.如权利要求1-10中任一项所述的抗原呈递细胞，其中所述维生素-脂质包含维生素部分，并且其中所述维生素部分包括维生素B3、维生素C、维生素D、维生素E、维生素H或其衍生物。
12.如权利要求11所述的抗原呈递细胞，其中所述维生素部分是维生素C。
13.如权利要求1-12中任一项所述的抗原呈递细胞，其中所述维生素-脂质包含式A的化合物：
Figure FPA0000319804300000021
或其盐，其中：
R1为烷基或醚接头，其中所述烷基或醚接头被维生素部分取代；
R2为烷基、环烷基、杂环烷基、烷基杂环烷基、酰胺、烷基酰胺、醚、烷基醚。
14.如权利要求1-13中任一项所述的抗原呈递细胞，其中所述维生素-脂质选自由以下组成的组：
Figure FPA0000319804300000031
其中R是
Figure FPA0000319804300000032
15.如权利要求1-14中任一项所述的抗原呈递细胞，其中所述抗原呈递细胞包括巨噬细胞或树突细胞。
16.如权利要求15所述的抗原呈递细胞，其中所述巨噬细胞包括骨髓源性巨噬细胞或单核细胞源性巨噬细胞。
17.如权利要求16所述的抗原呈递细胞，其中所述树突细胞包括骨髓源性树突细胞、单核细胞源性树突细胞、常规树突细胞-1或常规树突细胞-2。
18.一种治疗脓毒症的方法，所述方法包括向受试者施用一种或多种抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含：
纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含：
编码抗菌肽的第一核酸，
编码组织蛋白酶B的第二核酸，和
编码接头的第三核酸；以及
维生素-脂质。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸通过所述第三核酸连接。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述重组多核苷酸由所述维生素-脂质包封。
21.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述重组多核苷酸包含RNA或DNA。
22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述抗菌肽包含序列SEQ ID NO：1。
23.如权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述第一核酸包含序列SEQ ID NO：2。
24.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述第二核酸包含序列SEQ ID NO：4。
25.如权利要求18-24中任一项所述的方法，其中所述接头包括组织蛋白酶B敏感接头。
26.如权利要求18-25中任一项所述的方法，其中所述第三核酸包含序列SEQ ID NO：6。
27.如权利要求18-26中任一项所述的方法，其中所述重组多核苷酸包含SEQ ID NO：8中所示的序列。
28.如权利要求18-27中任一项所述的方法，其中所述维生素-脂质包含维生素部分，并且其中所述维生素部分包括维生素B3、维生素C、维生素D、维生素E、维生素H或其衍生物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述维生素部分是维生素C。
30.如权利要求18-29中任一项所述的方法，其中所述维生素-脂质包含式A的化合物：
Figure FPA0000319804300000051
或其盐，其中：
R1为烷基或醚接头，其中所述烷基或醚接头被维生素部分取代；
R2为烷基、环烷基、杂环烷基、烷基杂环烷基、酰胺、烷基酰胺、醚、烷基醚。
31.如权利要求18-30中任一项所述的方法，其中所述维生素-脂质选自由以下组成的组：
Figure FPA0000319804300000061
其中R是
Figure FPA0000319804300000062
32.如权利要求18-31中任一项所述的方法，其中所述抗原呈递细胞包括巨噬细胞或树突细胞。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述巨噬细胞包括骨髓源性巨噬细胞或单核细胞源性巨噬细胞。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述树突细胞包括骨髓源性树突细胞、单核细胞源性树突细胞、常规树突细胞-1或常规树突细胞-2。
35.如权利要求18-34中任一项所述的方法，其中所述抗原呈递细胞来源于所述受试者。
36.根据权利要求18-35中任一项所述的方法，其中所述受试者包括人。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述人患有或疑似患有脓毒症。
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