JP2022546590A

JP2022546590A - がんの処置のためのキメラ抗原受容体ならびに関連した方法および組成物

Info

Publication number: JP2022546590A
Application number: JP2022514665A
Authority: JP
Inventors: クリスティーナプイグ－サウス; アントニリバス; イボンヌチェン
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2022-11-04
Also published as: WO2021046432A1; AU2020343025A1; CA3153311A1; EP4025225A1; KR20220077127A; IL291090A; CN114765980A; US20230049954A1; EP4025225A4

Abstract

TYRP-1に特異的に結合することができるキメラ抗原受容体（CAR）を含む治療用受容体に関連した、方法および組成物が提供される。開示される組成物は、例えば、TYRP-1特異的CARを発現する細胞（例えば、免疫細胞）、TYRP-1特異的CARをコードする核酸、およびTYRP-1特異的CARポリペプチドを含む。ある特定の局面は、TYRP-1特異的CARを含む組成物を使用する、例えば、TYRP-1特異的CARを発現する細胞を使用する、黒色腫を含むがんを処置する方法に関する。いくつかの態様において、TYRP-1結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラポリペプチドが、本明細書において提供される。TIFF2022546590000044.tif88166

Description

相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2019年9月6日に出願された米国特許仮出願第62/897,062号に対して優先権を主張する。

本発明は、National Institutes of Healthによって授与された助成金番号CA197633の下、政府の支援で行われた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、概して、分子生物学および免疫療法の分野に関する。

背景
黒色腫は、皮膚のがんであり、毎年96,000例を上回る新たながんの診断を占める。免疫チェックポイント遮断（ICB）は、進行性転移性黒色腫のための最前線治療法として承認されている。抗CTLA-4と抗PD-1との併用療法での奏効率が約60％である、ICBによって達成される臨床応答にもかかわらず、患者の大部分は処置に応答せず、いくらかのレスポンダーは再発する。したがって、ICBに対して非応答性または抵抗性である黒色腫患者に適した治療法が必要である。

チロシナーゼ関連タンパク質-1（TYRP-1）は、メラニン細胞および黒色腫細胞において特異的に発現している、膜貫通糖タンパク質である。TYRP-1は、メラノーマ腫瘍において広く発現しており、高レベルでのその発現は、好ましくない転帰に関連している。黒色腫の処置用のTYRP-1の有効なターゲティングのための組成物および方法の必要が、本明細書において認識される。

本開示の概要
本開示は、がんの処置のためにTYRP-1を標的とする、キメラ抗原受容体（CAR）を含む治療用受容体についての、当技術分野における必要を満たす。したがって、本開示のある特定の局面は、黒色腫を処置することに関する。さらなる態様は、SEQ ID NO:5またはSEQ ID NO:10に対して少なくとも90％の配列同一性を有する配列を含む、TYRP-1を標的とする抗原結合ドメインに関する。TYRP-1に結合する治療用受容体であるポリペプチドに関わる組成物および方法が、黒色腫などのがんを処置するための解決策として提供される。態様は、TYRP-1標的ポリペプチド、TYRP-1標的ポリペプチドをコードする核酸、TYRP-1標的ポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、TYRP-1標的ポリペプチドをコードする核酸またはベクターを含む細胞、TYRP-1標的ポリペプチドをその表面上に発現する細胞、TYRP-1標的ポリペプチドを含む薬学的組成物、TYRP-1標的ポリペプチドを発現する細胞を含む薬学的組成物、TYRP-1標的ポリペプチドを作製する方法、TYRP-1標的ポリペプチドを発現するT細胞を作製する方法、TYRP-1標的ポリペプチドを含む組成物で対象を処置する方法、TYRP-1標的ポリペプチドを含む細胞の集団、およびTYRP-1標的抗原結合ドメインを含むポリペプチド、を含む。これらの要素の1つまたは複数は、本開示のある特定の態様から除外されてもよいことが、具体的に企図される。

いくつかの態様において、本明細書で議論されるCAR分子は、1つまたは複数の標的分子に結合する細胞外ドメイン、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含有する細胞質領域、および細胞外ドメインと細胞質ドメインとの間の膜貫通領域である、CAR分子の3つの主要領域を有する。いくつかのCAR分子は、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にあるスペーサーを有する。さらに、1つまたは複数のリンカーは、CAR分子において、1つまたは複数の領域の間またはその内部、例えば、細胞外ドメイン内のまたは結合領域内の異なる結合領域の間、例えば、軽鎖の可変領域（VH）と重鎖の可変領域（VL）との間に含まれてもよい。1つまたは複数のタグが、本開示のCAR分子に含まれてもよい。タグは、1つまたは複数の領域の間またはその内部にあってもよい。例えば、CAR分子は、VH領域とVL領域との間にタグを含んでもよい。別の例において、CAR分子は、2つの異なる抗原結合領域の間にタグを含んでもよい。さらなる例において、CAR分子は、分子のN末端にタグを含んでもよい。特定の領域に関する任意の態様が、本明細書に開示される任意の他の特定の領域に関して実施されてもよい。任意の他の特定の領域と共に実施することができる領域の例には、以下が含まれるが、それらに限定されない：細胞外ドメイン、TYRP-1標的ドメイン、SEQ ID NO:10と少なくとも90％の配列同一性を有するVHドメイン、SEQ ID NO:10を含むVhドメイン、SEQ ID NO:5と少なくとも90％の配列同一性を有するVLドメイン、SEQ ID NO:5を含むVLドメイン、リンカー、ヒンジ、細胞外スペーサー、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン、タグ、検出ペプチド、およびリーダーペプチド。これらの領域の1つまたは複数は、本開示のある特定の態様から除外されてもよい。これらの領域の任意は、その機能に依存して、別の領域のN末端側またはC末端側のいずれかにすぐ隣接してもよいが、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99アミノ酸長、または多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99アミノ酸長（またはその中の任意の導き出せる範囲）である、連続した領域の間に介在するアミノ酸があってもよいこともまた、企図される。

さらなる局面は、（a）（i）可変重鎖（VH）領域；および（ii）可変軽鎖（VL）領域を含む抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン、ならびに細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラポリペプチドに関する。いくつかの態様において、VH領域は、SEQ ID NO:10と少なくとも90％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、VH領域は、SEQ ID NO:11（HCDR1）、SEQ ID NO:12（HCDR2）、およびSEQ ID NO:13（HCDR3）を含む。いくつかの態様において、VL領域は、SEQ ID NO:5と少なくとも90％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、VL領域は、SEQ ID NO:6（LCDR1）、SEQ ID NO:7（LCDR2）、およびSEQ ID NO:8（LCDR3）を含む。

本開示の方法の局面は、がんの処置のための、本開示のCAR分子、組成物、および細胞の使用に関する。いくつかの態様において、がんは皮膚がんである。いくつかの態様において、がんは、TYRP-1+がんを含み、TYRP-1+がんは、TYRP-1+細胞を含むか、または腫瘍細胞の集団中に少なくとも0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、もしくは90％（もしくはその中の任意の導き出せる範囲）のTYRP-1+がん細胞を含むものである。いくつかの態様において、がんは黒色腫を含む。本開示のCARポリペプチドは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のすべてまたは一部分に対して少なくとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％同一、多くとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％同一、または正確に50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％同一（またはその中の任意の導き出せる範囲）であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、その領域、ドメイン、リンカー、スペーサー、または他の部分を有してもよい。ある特定の態様において、CARポリペプチドは、SEQ ID NO:1～89のいずれか1つに対して、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％同一（もしくはその中の任意の導き出せる範囲）である、少なくとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％同一（もしくはその中の任意の導き出せる範囲）である、多くとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％同一（もしくはその中の任意の導き出せる範囲）である、または正確に50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％同一（もしくはその中の任意の導き出せる範囲）である、アミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの態様において、本開示のポリペプチドは、VHドメインおよびVLドメインを含む。いくつかの態様において、VHドメインおよびVLドメインは、リンカーによって隔てられている。1つの態様において、可変領域の順序は、VH-VLである。別の態様において、可変領域の順序は、VL-VHである。ポリペプチドは、1、2、3、4、5つ、またはそれよりも多いリンカーなどの、複数のリンカーを含んでもよいことが企図される。リンカーは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99アミノ酸長（もしくはその中の任意の導き出せる範囲）であるか、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99アミノ酸長（もしくはその中の任意の導き出せる範囲）であるか、または多くとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99アミノ酸長（もしくはその中の任意の導き出せる範囲）である。ある特定の態様において、リンカーは4～40アミノ酸長である。リンカーは、本明細書に記載されるCARポリペプチドにおける任意のドメイン/領域を隔ててもよいことが企図される。いくつかの態様において、リンカーは、グリシン残基およびセリン残基のみで構成される（グリシン-セリンリンカー）。いくつかの態様において、リンカーは、配列

を有するリンカーである。

「一本鎖Fv」または「scFv」抗体断片は、抗体のVHドメインおよびVLドメインの少なくとも一部分、例えば、各々のCDRを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。scFvは、いくつかの態様において、重鎖可変領域のCDR1、CDR2、および/またはCDR3、ならびに軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、および/またはCDR3を含むことが企図される。CDR1、CDR2、またはCDR3は、それぞれCDR1、CDR2、またはCDR3として本明細書で提供される、SEQ ID NOに示される配列を含むか、またはそれからなってもよいことが、さらに企図される。CDRはまた、特定のCDR配列の片側または両側に隣接する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれよりも多い連続したアミノ酸残基（またはその中の任意の導き出せる範囲）を含んでもよく；したがって、表1～3に示されるものなどの、特定のCDR配列のN末端またはC末端の端に、1つまたは複数の追加のアミノ酸があってもよい。

scFvは、軽鎖可変領域および/または重鎖領域のCDRよりも多くを含んでもよいこともまた、企図される。いくつかの態様において、軽鎖可変領域のすべてもしくは一部、および/または重鎖可変領域のすべてもしくは一部は、結合ドメインの一部であるscFvに含まれる。いくつかの態様において、順序はVH-VLであるが、他の態様においては、順序はVL-VHである。さらに、本明細書で提供されるVH、VL、VH-VL、またはVL-VH配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれよりも多い付加、欠失、および/または置換を、特に、そのような変化が軽鎖および重鎖の可変領域のCDRを変更しないのであれば、有してもよい。

いくつかの態様において、本開示のCAR分子は、細胞外ドメインと細胞質領域（細胞内ドメインとも呼ばれる）との間に膜貫通ドメインを含む。態様は、T細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137、またはCD154の膜貫通ドメインである、膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、膜貫通ドメインはSEQ ID NO:17を含む。

いくつかの態様において、本開示のCAR分子は、内部細胞シグナル伝達を媒介する、細胞質領域を有する。いくつかの態様において、これは、一次のまたは主な細胞内として作用する、CD3ζ（ゼータ）由来のシグナル伝達ドメインで達成される。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:19を含む一次シグナル伝達ドメインを含む。細胞質領域は、さらなる態様において、1、2、または3つの共刺激ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞質領域は、2つの共刺激ドメインを含む。ある特定の態様において、共刺激ドメインは、4-1BB（CD137）、CD28、IL-15Rα、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、またはICOS（CD278）由来であるが、他の共刺激ドメインがまた、含まれてもよい。ある特定の態様において、共刺激ドメインは4-1BB共刺激ドメインである。いくつかの態様において、共刺激ドメインはSEQ ID NO:70を含む。いくつかの態様において、共刺激ドメインはCD28共刺激ドメインである。いくつかの態様において、共刺激ドメインはSEQ ID NO:18を含む。

ある特定の態様において、本開示を通して記載されるポリペプチドは、単離されており、これは、それらが細胞環境で見出されないことを意味する。場合によっては、それらは精製されており、これは、異なるアミノ酸配列および/または化学式を有するポリペプチドから、完全にではないとしてもほとんど分離されていることを意味する。

本明細書に開示されるキメラ抗原受容体をコードする配列を含む核酸、およびその一部分が、態様において提供される。核酸は、RNAまたはDNAを含んでもよい。ある特定の態様において、核酸は発現構築物である。いくつかの態様において、発現構築物はベクターである。ある特定の態様において、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、特定の態様において、レトロウイルスベクターであるか、またはレトロウイルスに由来する。いくつかの態様において、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターを含むか、またはレンチウイルスに由来する。ウイルスベクターは、ある特定の態様において、組込み核酸であることが注目される。追加的に、核酸は、CARをコードする核酸（例えば、DNA、RNA）が、TRAC遺伝子座などのゲノムの特定の遺伝子座中にCARコード配列を組み込むために用いられるように、遺伝子編集に関与する分子であってもよい。これは、いくつかの態様において、CRISPR/Cas9などの遺伝子編集システムを含む。核酸、ポリヌクレオチド、もしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％、またはその中の任意の導き出せる範囲）の「配列同一性」または「相同性」を有し、これは、整列させた時に、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が、2つの配列の比較において同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biologyに記載されているものを用いて決定することができる。核酸は、本明細書で提供される任意の核酸SEQ ID NOに対してそのような配列同一性または相同性を有してもよいことが企図される。

他の態様において、本明細書で議論される任意のCARのすべてまたは一部をコードする核酸を含む、細胞または細胞の集団が存在する。ある特定の態様において、細胞または細胞の集団は、本明細書に記載されるCARポリペプチドのいずれかをコードする配列を、そのゲノム内に含有する。これは、細胞のゲノム中に組み込まれているレンチウイルスまたはレトロウイルスを含むが、それらに限定されない。いくつかの態様において、細胞または細胞の集団は、SEQ ID NO:1～89のいずれかのアミノ酸配列を有するものを含むがそれらに限定されない、本明細書で議論される任意のCARのすべてまたは一部を発現する。CARポリペプチドをコードする核酸が導入された細胞の子孫（F1、F2、およびそれ以降）は、本明細書に開示される細胞または細胞の集団に含まれる。いくつかの態様において、細胞または細胞の集団は、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT）、インバリアントナチュラルキラーT細胞（iNKT）、幹細胞、リンパ球前駆細胞、末梢血単核細胞（PBMC）、末梢血幹細胞（PBSC）、骨髄細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞、人工多能性幹細胞（iPS細胞）である。具体的な態様は、T細胞またはNK細胞である細胞に関わる。いくつかの態様において、T細胞は、ナイーブメモリーT細胞を含む。いくつかの態様において、ナイーブメモリーT細胞は、CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の両方を含む細胞の集団である。いくつかの態様において、細胞は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含むナイーブメモリーT細胞を含む細胞の集団である。いくつかの態様において、T細胞は、CD14が枯渇した、CD25が枯渇した、かつ/またはCD62Lが濃縮されたPBMCの集団由来のT細胞を含む。細胞の集団を含む態様において、集団は、約10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²細胞（もしくはその中の任意の導き出せる範囲）であるか、少なくとも約10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²細胞（もしくはその中の任意の導き出せる範囲）であるか、または多くとも約10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²細胞（もしくはその中の任意の導き出せる範囲）である。ある特定の態様において、約10³～10⁸細胞が存在する。ある特定の態様において、細胞は、それらを受け取る患者に対して自己由来である。他の態様において、細胞は、自己由来ではなく、同種異系であってもよい。

いくつかの局面において、本開示は、本明細書に記載される1つまたは複数のポリペプチドを含む細胞に関する。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞は、前駆細胞または幹細胞である。いくつかの態様において、前駆細胞または幹細胞は、インビトロで免疫細胞に分化する。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。いくつかの態様において、細胞は、CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞である。いくつかの態様において、細胞はナチュラルキラー細胞である。いくつかの態様において、細胞はエクスビボである。免疫細胞という用語には、感染症および外来物質の両方に対して体を防御することに関与する、免疫系の細胞が含まれる。免疫細胞には、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、B細胞およびT細胞などのリンパ球、ならびに単球が含まれ得る。T細胞には、例えば、CD4+、CD8+、Tヘルパー細胞、細胞傷害性T細胞、γδT細胞、制御性T細胞、サプレッサーT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、およびナチュラルキラーT細胞が含まれ得る。具体的な態様において、T細胞は制御性T細胞である。

また、細胞の集団を含む組成物も、態様として含まれ、該組成物は、薬学的に許容される製剤である。

キメラ抗原受容体、そのようなCARをコードする核酸、ならびにこれらのCARを含有する細胞および組成物を作製および使用する方法もまた、提供される。方法には、CARを発現する細胞を作製するため、がんを有する患者を処置するため、黒色腫を有する患者を処置するため、CARを発現するT細胞またはNK細胞を開発するため、TYRP-1標的CAR分子を発現させるための方法が含まれる。

方法の工程には、以下の工程のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれよりも多くが含まれる：TYRP-1特異的CARの領域をクローニングする工程；TYRP-1特異的CARをコードする核酸を細胞中に導入する工程；TYRP-1特異的CARを発現するように細胞のゲノムを編集する工程；TYRP-1特異的CARをコードするウイルスベクターを細胞に感染させる工程；TYRP-1特異的CARを発現するようにゲノムを編集するためのガイドRNA（gRNA）および/もしくは鋳型を細胞中に導入する工程；細胞もしくは細胞の集団を培養する工程；細胞もしくは細胞の集団を増大させる工程；細胞もしくは細胞の集団を、1つもしくは複数のT細胞もしくはNK細胞の特性を有する細胞に分化させる工程；細胞を無血清培地で培養する工程；T細胞もしくはNK細胞を生じる条件下で細胞を培養する工程；TYRP-1特異的CARを発現する細胞を精製する工程；TYRP-1特異的CARを発現する細胞を患者に投与する工程；患者から細胞を取得する工程；患者から細胞を単離する工程；TYRP-1特異的CARを発現する細胞を選択する工程；選別可能なタグを用いて細胞を単離する工程；TYRP-1特異的CARに関連するタグを検出する工程；TYRP-1特異的CARに関連するタグを測定する工程；または、TYRP-1特異的CAR分子を発現する細胞の投与に加えて、他のがん療法を患者に投与する工程。

ある特定の態様において、本明細書で議論されるCAR分子の1つをコードする核酸、または本明細書で議論されるCAR分子の1つを発現するように細胞のゲノムの遺伝子編集を可能にする核酸を細胞中に導入する工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞を作製する方法がある。ある特定の態様において、細胞は、CARをコードするレンチウイルスで形質導入される。いくつかの態様において、細胞は、CARをコードするレトロウイルスで形質導入される。いくつかの態様において、細胞は、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT）、インバリアントナチュラルキラーT細胞（iNKT）、幹細胞、リンパ球前駆細胞、末梢血単核細胞（PBMC）、末梢血幹細胞（PBSC）、骨髄細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞、人工多能性幹細胞（iPS細胞）である。細胞がまだT細胞またはNK細胞ではない場合には、方法はまた、細胞のT細胞またはNK細胞への分化を促進する条件下で細胞を培養する工程を含んでもよい。追加の態様において、方法は、核酸を細胞中に導入する前および/または後に、細胞を増大させる条件下で細胞を培養する工程を含む。いくつかの態様において、細胞を、無血清培地で培養する。

追加の方法は、TYRP-1標的CARを発現する細胞集団を含む組成物の有効量を患者に投与する工程を含む、がんを有する患者を処置することに関わる。いくつかの態様において、患者は皮膚がんを有する。特定の態様において、患者は黒色腫を有する。追加の態様において、患者は再発性黒色腫を有する。さらなる態様は、追加の治療法を患者に投与する工程を含む。さらなる態様は、化学療法および/または放射線を患者に投与する工程を含む。いくつかの態様において、追加の治療法は、免疫療法を含む。いくつかの態様において、追加の治療法は、本明細書に記載される追加の治療法を含む。いくつかの態様において、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤療法を含む。いくつかの態様において、免疫療法は、本明細書に記載される免疫療法を含む。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤療法は、PD-1阻害剤および/またはCTLA-4阻害剤を含む。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤療法は、本明細書に記載される1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質の1つまたは複数の阻害剤を含む。

いくつかの態様において、（a）（i）SEQ ID NO:10と少なくとも90％の配列同一性を有する可変重鎖（VH）領域および（ii）SEQ ID NO:5と少なくとも90％の配列同一性を有する可変軽鎖（VL）領域を含む抗原結合ドメイン、（b）膜貫通ドメイン、ならびに（c）細胞内ドメイン、を含むキメラポリペプチドが、本明細書に開示される。いくつかの態様において、VH領域はSEQ ID NO:10を含む。いくつかの態様において、VL領域はSEQ ID NO:5を含む。いくつかの態様において、キメラポリペプチドは、シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、キメラポリペプチドは、ヒンジ領域をさらに含む。いくつかの態様において、VH領域およびVL領域は、リンカー、例えば、4～40アミノ酸長のリンカーによって隔てられている。いくつかの態様において、リンカーはSEQ ID NO:9を含む。いくつかの態様において、リンカーはSEQ ID NO:89を含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、T細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、またはCD28、CD3ε（イプシロン）、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137、もしくはCD154由来の膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、膜貫通ドメインはSEQ ID NO:17を含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζ（ゼータ）シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインはSEQ ID NO:19を含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、サイトカイン受容体由来のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、4-1BB（CD137）、CD28、IL-15Rα、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、またはICOS（CD278）由来のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインはSEQ ID NO:18を含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインはSEQ ID NO:70を含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインは、ヒンジ領域によって隔てられている。いくつかの態様において、ヒンジ領域は、IgG4ヒンジ、CD8αヒンジ、IgG1ヒンジ、またはCD34ヒンジを含む。いくつかの態様において、ヒンジ領域はSEQ ID NO:14を含む。いくつかの態様において、ヒンジ領域はSEQ ID NO:15を含む。いくつかの態様において、ヒンジ領域はSEQ ID NO:16を含む。

いくつかの局面において、（a）シグナルペプチド；（b）（i）SEQ ID NO:10を含む可変重鎖領域および（ii）SEQ ID NO:5を含む可変軽鎖領域を含む抗原結合ドメイン；（c）8～300アミノ酸長のヒンジ領域；（d）膜貫通ドメイン；ならびに（e）細胞内ドメイン、を含むキメラポリペプチドが、本明細書に開示される。いくつかの態様において、膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD28シグナル伝達ドメインおよびCD3ζ（ゼータ）シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、VH領域およびVL領域は、リンカーによって隔てられている。いくつかの態様において、リンカーはSEQ ID NO:9を含む。いくつかの態様において、ヒンジ領域はSEQ ID NO:14を含む。いくつかの態様において、ヒンジ領域はSEQ ID NO:15を含む。いくつかの態様において、ヒンジ領域はSEQ ID NO:16を含む。いくつかの態様において、キメラポリペプチドはSEQ ID NO:1を含む。いくつかの態様において、キメラポリペプチドはSEQ ID NO:2を含む。いくつかの態様において、キメラポリペプチドはSEQ ID NO:3を含む。いくつかの態様において、キメラポリペプチドはSEQ ID NO:88を含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、TYRP-1タンパク質に特異的に結合する。

いくつかの態様において、本明細書に記載されるキメラポリペプチド（例えば、CAR）のいずれかをコードする核酸が、本明細書に開示される。いくつかの態様において、核酸は発現構築物である。いくつかの態様において、発現構築物はプラスミドである。いくつかの態様において、発現構築物はウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルスに由来するベクターまたはレンチウイルスに由来するベクターである。いくつかの局面において、本明細書に記載される核酸のいずれかを含む細胞が、本明細書に開示される。いくつかの態様において、核酸は、細胞のゲノム中に組み込まれる。いくつかの局面において、本明細書に記載されるキメラポリペプチド（例えば、CAR）のいずれかを含む細胞が、本明細書に開示される。

いくつかの態様において、細胞は免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞は、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT）、インバリアントナチュラルキラーT細胞（iNKT）、幹細胞、リンパ球前駆細胞、末梢血単核細胞（PBMC）、末梢血幹細胞（PBSC）、骨髄細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞、または人工多能性幹細胞（iPS細胞）である。いくつかの態様において、細胞はメモリーT細胞である。いくつかの態様において、本明細書に開示される細胞を含む細胞の集団が、本明細書に開示される。さらなる態様は、細胞の集団を含む薬学的組成物に関係する。

本開示は、いくつかの態様において、がんを有する対象を処置するための方法であって、該対象に、キメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸を含む細胞の集団または薬学的組成物の有効量を投与する工程を含む、方法を提供する。

1つまたは複数の配列または組成物の使用は、本明細書に記載される方法のいずれかに基づいて行使されてもよい。他の態様が、本出願を通して議論される。本開示の1つの局面に関して議論される任意の態様が、本開示の他の局面に同様に適用され、逆もまた同じである。例えば、本明細書に記載される方法における任意の工程を、任意の他の方法に適用することができる。さらに、本明細書に記載される任意の方法は、任意の工程または工程の組み合わせの除外を有してもよい。実施例のセクションにおける態様は、本明細書に記載される技術のすべての局面に適用可能である態様と理解される。

本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の精神および範囲内の様々な変化および改変が、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明および具体的な例は、本発明の好ましい態様を示しながら、例証として与えられるだけであることが、理解されるべきである。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つまたは複数を参照することによって、より良好に理解され得る。

TYRP-1が高発現のヒト黒色腫細胞株（図1A）およびTYRP-1が低発現のヒト黒色腫細胞株（図1B）に対する、示されたCAR構築物を発現するT細胞のインビトロ細胞傷害性を示す。 TYRP-1が高発現のヒト黒色腫細胞株（図1A）およびTYRP-1が低発現のヒト黒色腫細胞株（図1B）に対する、示されたCAR構築物を発現するT細胞のインビトロ細胞傷害性を示す。 TYRP-1が高発現（上）、TYRP-1が低発現（左下）、またはTYRP-1が陰性発現（右下）のいずれかのヒト黒色腫細胞株との共培養時の、示されたCAR構築物を発現するヒトPBMCによるインビトロサイトカイン分泌を示す。マウス黒色腫細胞株B16-F10に対する、示されたCAR構築物を発現するマウスCD3+ T細胞のインビトロ細胞傷害性（図3A）およびサイトカイン分泌（図3B）を示す。マウス黒色腫細胞株B16-F10に対する、示されたCAR構築物を発現するマウスCD3+ T細胞のインビトロ細胞傷害性（図3A）およびサイトカイン分泌（図3B）を示す。 B16-F10メラノーマ腫瘍を有するC57/B6免疫適格性マウスにおける、20D7SS、20D7SM、または20D7SL CAR構築物を発現するT細胞のインビボ抗腫瘍活性を示す。 B16-F10メラノーマ腫瘍を有するC56/B6免疫適格性マウスにおける、異なる用量の、20D7SL CAR構築物を発現するマウスT細胞のインビボ抗腫瘍活性を示す。 B16-F10メラノーマ腫瘍を有するC57/B6免疫適格性マウスにおける、20D7SL CAR構築物を発現するマウスT細胞の単独または標準的なIL-2処置との組み合わせでの処置の、インビボ抗腫瘍活性を示す。図7Aおよび7Bは、免疫不全マウスモデルでの患者由来黒色腫モデルにおける、20D7SL CARを発現するヒトT細胞のインビボ抗腫瘍活性を示す。 TYRP-1が陰性発現のヒト非黒色腫細胞株のパネルにおける、20D7SL CARを発現するT細胞の経時的なインビトロ細胞傷害性を示す。 TYRP-1が陰性発現のヒト非黒色腫細胞株のパネルにおける、20D7SL CARを発現するT細胞の経時的なインビトロ細胞傷害性を示す。 TYRP-1が陰性発現のヒト非黒色腫細胞株のパネルにおける、20D7SL CARを発現するT細胞の経時的なインビトロ細胞傷害性を示す。 TYRP-1ノックアウト細胞株との共培養時の、インビトロサイトカイン分泌および細胞傷害性の喪失を実証する。 TYRP-1ノックアウト細胞株との共培養時の、インビトロサイトカイン分泌および細胞傷害性の喪失を実証する。異なる共刺激ドメインを含むCARを発現するT細胞のインビトロ抗腫瘍活性を示す。異なる共刺激ドメインを含むCARを発現するT細胞のインビトロ抗腫瘍活性を示す。免疫不全マウスモデルでの患者由来黒色腫モデルにおける、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを含むCARを発現するT細胞のインビボ抗腫瘍活性を示す。免疫不全マウスモデルでの患者由来黒色腫モデルにおける、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを含むCARを発現するT細胞のインビボ抗腫瘍活性を示す。図12A～12Cは、TCGAデータセット、BMS-CA029、およびMK3475-001臨床試験データセットを組み合わせた、すべての患者におけるTYRP-1発現を示す。

例示的態様の説明
がんの処置のための、TYRP-1を標的とすることができるキメラ抗原受容体（CAR）を含む治療用受容体が、本明細書に開示される。いくつかの態様において、本開示のCARは、黒色腫の処置において使用される。本発明者らは、モジュラーDNAアセンブリおよびハイスループット特徴決定法を用いて、TYRP-1に応答する色々なターゲティング効率を有するCARのパネルを開発し、健常組織に対する潜在的な毒性を回避しながら治療効力を達成する、理想的な構築物の選択を可能にした。本開示の態様は、ヒンジ領域の長さが異なる、20D7SS（SEQ ID NO:1）、20D7SM（SEQ ID NO:2）、および20D7SL（SEQ ID NO:3）という名称のCARを対象とする。TYRP-1標的CARは、多様な患者由来黒色腫細胞株を効果的に標的とすることができ、標的細胞の表面上のTYRP-1発現のレベルに基づいて、色々な程度のターゲティング効力を有する。TYRP-1 CARは、TYRP-1に選択的であり、TYRP-1が陰性発現の細胞においては、細胞傷害性またはサイトカイン放出を示さない。TYRP-1標的CARはまた、IL-2を伴うおよび伴わない免疫適格性マウスにおいて、ならびに免疫低下マウスでの様々な患者由来黒色腫モデルにおいて、確立された黒色腫の制御を発揮することもできる。追加的に、異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有するTYRP-1 CARは、インビトロおよびインビボで類似した抗腫瘍活性を有する。

I. 定義
本開示のペプチドは、キメラ抗原受容体、すなわちCARを含むペプチドに関する。CARは、免疫エフェクター細胞上に任意の特異性を移植することができる、操作された受容体である。場合によっては、これらの受容体は、T細胞上にモノクローナル抗体の特異性を移植するために用いられる。受容体は、様々な供給源由来の部分で構成されているため、キメラと呼ばれる。

「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、遺伝子産物を指す場合に、本明細書において互換的に用いられる。

「相同性」または「同一性」は、2つのペプチド間または2つの核酸分子間の配列類似性を指す。同一性は、比較の目的で整列され得る各配列における位置を比較することによって、決定することができる。比較された配列における位置が、同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合には、分子は、その位置で配列同一性を共有する。配列間の同一性の程度は、配列によって共有される一致するかまたは相同の位置の、数の関数である。「無関係の」または「非相同の」配列は、本開示の配列のうちの1つと、60％未満の同一性、50％未満の同一性、40％未満の同一性、30％未満の同一性、または25％未満の同一性を共有する。

本明細書において用いられる「アミノ部分」、「N末端」、「アミノ末端」などの用語は、ポリペプチドの領域の順序を指すために用いられる。さらに、何かが領域に対してN末端にある場合、それは、必ずしもポリペプチド全体の末端（または端）にあるわけではなく、領域またはドメインのN末端にあるだけである。同様に、本明細書において用いられる「カルボキシ部分」、「C末端」、「カルボキシ末端」などの用語は、ポリペプチドの領域の順序を指すために用いられ、何かが領域に対してC末端にある場合、それは、必ずしもポリペプチド全体の末端（または端）にあるわけではなく、領域またはドメインのC末端にあるだけである。

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知または未知である任意の機能を果たしてもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ESTまたはSAGEタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの、修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合には、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に与えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって、重合後にさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の態様は、二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが知られているかまたは予測される2つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。

特定のタンパク質を「コードする」「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」、または「導入遺伝子」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にインビトロまたはインビボで、転写され、任意でまた遺伝子産物、例えばポリペプチドに翻訳される、核酸分子である。コード領域は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNA形態のいずれかで存在してもよい。DNA形態で存在する場合、核酸分子は、一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であってもよい。コード領域の境界は、5'（アミノ）末端の開始コドンおよび3'（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子は、原核生物または真核生物のmRNA由来のcDNA、原核生物または真核生物のDNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列を含むことができるが、それらに限定されない。転写終結配列は通常、遺伝子配列に対して3'に位置する。

「抗体」という用語は、ヒト、マウス、ヒト化、キメラ、または別の種由来であってもよい、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体、および抗体断片を含む。「モノクローナル抗体」は、特異的な抗原部位に対して向けられている、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体である。

「抗体またはその機能的断片」は、特定の抗原またはエピトープに特異的に結合するか、またはそれと免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子を意味し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含む。抗体という用語は、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、およびテトラボディ（tetrabody））などの、免疫グロブリンの遺伝子操作された形態または別の方法で改変された形態を含む。機能的抗体断片という用語は、例えば、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG、およびscFv断片を含む、抗体の抗原結合断片を含む。scFvという用語は、伝統的な2本鎖の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが、1本の鎖を形成するように連結されている、一本鎖Fv抗体を指す。

本明細書において用いられる場合、「結合親和性」という用語は、2つの剤の可逆的結合の平衡定数を指し、解離定数（Kd）として表される。結合親和性は、無関係のアミノ酸配列に対する抗体の結合親和性よりも、少なくとも25％大きい、少なくとも50％大きい、少なくとも75％大きい、少なくとも１倍大きい、少なくとも2倍大きい、少なくとも3倍大きい、少なくとも4倍大きい、少なくとも5倍大きい、少なくとも6倍大きい、少なくとも7倍大きい、少なくとも8倍大きい、少なくとも9倍大きい、少なくとも10倍大きい、少なくとも20倍大きい、少なくとも30倍大きい、少なくとも40倍大きい、少なくとも50倍大きい、少なくとも60倍大きい、少なくとも70倍大きい、少なくとも80倍大きい、少なくとも90倍大きい、少なくとも100倍大きい、または少なくとも1000倍大きい、またはそれ以上（またはその中の任意の導き出せる範囲）であることができる。本明細書において用いられる場合、「結合力」という用語は、希釈後の解離に対する2つ以上の剤の複合体の抵抗力を指す。「免疫反応性」および「優先的に結合する」という用語は、抗体および/または抗原結合断片に関して、本明細書において互換的に用いられる。

「結合」という用語は、例えば、塩橋および水架橋などの相互作用を含む、共有結合性、静電気的、疎水性、ならびにイオン性および/または水素結合相互作用による、2つの分子間の直接的な会合を指す。

「個体」、「対象」、および「患者」は、互換的に用いられ、ヒトまたは非ヒトを指すことができる。

「より低い」、「低減した」、「低減」、「減少」、または「阻害する」という用語はすべて、概して、統計的に有意な量の減少を意味するように本明細書において用いられる。しかし、疑いの回避のために、「より低い」、「低減した」、「低減」、「減少」、または「阻害する」とは、参照レベルと比較して少なくとも10％の減少、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の減少、または100％までのおよび100％を含む減少（すなわち、参照試料と比較して無いレベル）、または10～100％の任意の減少を意味する。

本出願を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するために使用されているデバイスおよび/または方法についての誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。

「増加した」、「増加」、「増強する」、または「活性化する」という用語はすべて、概して、静的に有意な量の増加を意味するように本明細書において用いられ；いずれかの疑いの回避のために、「増加した」、「増加」、「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の増加、または100％までのおよび100％を含む増加、または10～100％の任意の増加、または、参照レベルと比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、または2倍～10倍以上の任意の増加を意味する。

本明細書において用いられる場合、「含む（comprising）」または「含む（comprises）」という用語は、本発明に必須であるが、必須であろうとなかろうと、指定されていない要素の包含を受け入れる、組成物、方法、およびそれらのそれぞれの成分に関して用いられる。

本明細書において用いられる場合、「から本質的になる」という用語は、所与の態様に必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のその態様の基本的なかつ新規のまたは機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない、追加の要素の存在を許容する。薬学的組成物に関して、「から本質的になる」という用語は、列挙された有効成分を含み、任意の他の有効成分を除外するが、治療的に活性を有さない任意の薬学的賦形剤または他の成分を除外しない。

「からなる」という用語は、態様のその説明において列挙されていない任意の要素を除く、本明細書に記載されるような組成物、方法、およびそれらのそれぞれの成分を指す。

「含む」という用語の文脈において説明される態様はまた、「からなる」または「から本質的になる」という用語の文脈において実施されてもよいことが企図される。

本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかに別のことを指示しない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、1つまたは複数の方法、および/または本明細書に記載される、かつ/もしくは本開示を読むと当業者に明らかになるであろうタイプの工程などを含む。

本発明の1つの態様に関して議論される任意の限定は、本発明の任意の他の態様に適用されてもよいことが、具体的に企図される。さらに、本発明の任意の組成物は、本発明の任意の方法において使用されてもよく、かつ本発明の任意の方法は、本発明の任意の組成物を製造するためまたは利用するために使用されてもよい。実施例に示される態様の局面はまた、異なる実施例における他の場所、または、発明の概要、態様の詳細な説明、特許請求の範囲、および図面凡例の説明などの、本出願における他の場所で議論される態様の文脈において実施されてもよい態様である。

治療的、診断的、または生理学的な目的または効果の文脈における任意の方法はまた、記載された治療的、診断的、または生理学的な目的または効果を達成するかまたは実施するための、本明細書で議論される任意の化合物、組成物、または剤「の使用」などの、「使用」クレーム言語で記載されてもよい。

II. ポリペプチド
A. シグナルペプチド
本開示のポリペプチドは、シグナルペプチドを含んでもよい。「シグナルペプチド」とは、例えば、ある特定の細胞小器官（小胞体など）および/または細胞表面に対する、細胞内のタンパク質の輸送および局在化を方向付ける、ペプチド配列を指す。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、新生タンパク質を小胞体中に方向付ける。受容体が、グリコシル化されて、細胞膜に固定されることになる場合には、これは必須である。概して、最もアミノ末端の成分に天然で結合したシグナルペプチドが、用いられる（例えば、軽鎖-リンカー-重鎖の配向を有するscFvにおいては、軽鎖の天然シグナルが用いられる）。いくつかの態様において、シグナルペプチドはSEQ ID NO:4を含む。

いくつかの態様において、シグナルペプチドは、小胞体（ER）の通過後に切断され、すなわち、切断可能なシグナルペプチドである。いくつかの態様において、制限部位は、切断を促進するために、シグナルペプチドのカルボキシ末端にある。

B. 抗原結合ドメイン
本開示のポリペプチドは、1つまたは複数の抗原結合ドメインを含んでもよい。いくつかの態様において、ポリペプチドは、TYRP-1結合ドメインを含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、TYRP-1結合ドメインおよび1つまたは複数の追加の結合ドメインを含む。「抗原結合ドメイン」とは、適切な条件下で抗原に結合することができるポリペプチドの領域を説明する。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、1つまたは複数の抗体に基づく一本鎖可変断片（scFv）である。いくつかの態様において、本開示のポリペプチドの抗原結合ドメインは、TYRP-1抗体、例えば、IMC-20D7Sまたは任意の他のTYRP-1抗体に基づくscFvである。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域を含み、VH領域およびVL領域は同じポリペプチド上にある。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、VH領域とVL領域との間にリンカーを含む。リンカーは、抗原結合ドメインが、抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能にし得る。

本開示のポリペプチドの抗原結合ドメインの可変領域は、抗体の1つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善するために、VHおよび/またはVLのCDR1 、CDR2、および/またはCDR3領域内のアミノ酸残基を変異させることによって、改変することができる。「CDR」という用語は、それぞれB細胞およびT細胞によって生成される、免疫グロブリン（抗体）およびT細胞受容体における可変鎖の一部に基づく、相補性決定領域を指し、これらの分子は、それらの特異的な抗原に結合する。免疫グロブリンおよびT細胞受容体に関連するほとんどの配列変動は、CDRにおいて見出されるため、これらの領域は、時には超可変領域と呼ばれる。変異は、様々な技法（例えば、部位特異的変異誘発またはPCR媒介性変異誘発）によって導入されてもよく、抗体結合、または関心対象の他の機能的特性に対する効果を、適切なインビトロまたはインビボのアッセイで評価することができる。好ましくは、保存的改変が導入され、典型的には、CDR領域内の1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ以下の残基が変更される。変異は、アミノ酸の置換、付加、または欠失であってもよい。

フレームワーク改変は、例えば、1つまたは複数のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「逆変異」させることによって、免疫原性を減少させるために抗体に対して行うことができる。

抗原結合ドメインは、同じ抗原（多価）または異なる抗原（多重特異性）のいずれかに結合するVH領域およびVL領域のペアで抗原結合ドメインを多量体化することによって、多重特異性または多価であってもよいこともまた、企図される。

可変領域（重鎖および/もしくは軽鎖可変領域）などの抗原結合領域の、またはCDRの結合親和性は、少なくとも10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M、または10^-13Mであってもよい。いくつかの態様において、可変領域（重鎖および/もしくは軽鎖可変領域）などの抗原結合領域の、またはCDRのK_Dは、少なくとも10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M、または10^-13M（またはその中の任意の導き出せる範囲）であってもよい。

結合親和性、K_A、またはK_Dは、当技術分野において公知の方法によって、例えば、表面プラズモン共鳴（SRP）ベースのバイオセンサーによって、結合平衡除外法（KinExA）によって、偏光変調の斜入射反射率の差（OI-RD）に基づくマイクロアレイ検出用の光学スキャナーによって、またはELISAによって、決定することができる。

いくつかの態様において、TYRP-1結合領域はヒト化されている。いくつかの態様において、ヒト化結合領域を含むポリペプチドは、マウス由来の結合領域などの非ヒト化結合領域を含むポリペプチドと比較して、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、104、106、106、108、109、110、115、または120％（またはその中の任意の導き出せる範囲）と同等の、これらよりも良好な、または少なくともこれらの結合親和性および/または宿主細胞における発現レベルを有する。

いくつかの態様において、ヒトフレームワークのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4などのフレームワーク領域は、マウスフレームワークに対して、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、もしくは200個、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、もしくは200個、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、もしくは200個（またはその中の任意の導き出せる範囲）のアミノ酸置換、連続したアミノ酸付加、または連続したアミノ酸欠失を、各々または集合的に有することができる。

いくつかの態様において、マウスフレームワークのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4などのフレームワーク領域は、ヒトフレームワークに対して、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、もしくは200個、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、もしくは200個、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、もしくは200個（またはその中の任意の導き出せる範囲）のアミノ酸置換、連続したアミノ酸付加、または連続したアミノ酸欠失を、各々または集合的に有することができる。

置換は、重鎖または軽鎖可変領域のFR1、FR2、FR3、またはFR4の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100位にあってもよい。

C. 細胞外スペーサー
細胞外スペーサーは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結し得る。いくつかの態様において、ヒンジは、抗原結合ドメインが様々な方向に向いて抗原結合を促進することを可能にするほど十分に可動性である。1つの態様において、スペーサーは、IgG由来のヒンジ領域である。代替には、免疫グロブリンのCH2CH3領域およびCD3の一部分が含まれる。いくつかの態様において、CH2CH3領域は、L235E/N297QもしくはL235D/N297Qの改変、または少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは100％のアミノ酸配列同一性のCH2CH3領域を有してもよい。いくつかの態様において、スペーサーはIgG4由来である。細胞外スペーサーは、ヒンジ領域を含んでもよい。

本明細書において用いられる場合、「ヒンジ」という用語は、構造的可動性を提供する、および隣接ポリペプチド領域に対して間隔をあける、可動性ポリペプチドコネクタ領域（本明細書において「ヒンジ領域」とも呼ばれる）を指し、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドからなることができる。免疫グロブリン（例えば、IgG1）に由来する「ヒンジ」は、概して、ヒトIgG1のGlu216からPro230まで伸びるとして定義される（Burton (1985) Molec. Immunol., 22: 161- 206）。他のIgGアイソタイプのヒンジ領域を、重鎖間ジスルフィド（S-S）結合を形成する最初および最後のシステイン残基を同じ位置に置くことによって、IgG1配列と整列させてもよい。ヒンジ領域は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,677,425号に記載されているような、変更されたヒンジ領域を含むがそれに限定されない、天然に存在するものまたは天然に存在しないものであってもよい。ヒンジ領域は、CH1ドメインのものとは異なるクラスまたはサブクラスの抗体に由来する、完全なヒンジ領域を含むことができる。「ヒンジ」という用語はまた、可動性の提供および隣接領域に対する間隔において類似した機能を提供する、CD8および他の受容体に由来する領域を含むこともできる。

細胞外スペーサーは、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、12、15、16、17、18、19、20、20、25、30、35、40、45、50、75、100、110、119、120、130、140、150、160、170、180、190、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、260、270、280、290、300、325、350、もしくは400アミノ酸、多くとも4、5、6、7、8、9、10、12、15、16、17、18、19、20、20、25、30、35、40、45、50、75、100、110、119、120、130、140、150、160、170、180、190、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、260、270、280、290、300、325、350、もしくは400アミノ酸、または正確に4、5、6、7、8、9、10、12、15、16、17、18、19、20、20、25、30、35、40、45、50、75、100、110、119、120、130、140、150、160、170、180、190、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、260、270、280、290、300、325、350、もしくは400アミノ酸（またはその中の任意の導き出せる範囲）の長さを有することができる。いくつかの態様において、細胞外スペーサーは、免疫グロブリン（例えば、IgG）由来のヒンジ領域からなるか、またはそれを含む。免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列は、当技術分野において公知である；例えば、Tan et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 162およびHuck et al. (1986) Nucl. Acids Resを参照されたい。

細胞外スペーサーの長さは、CARのシグナル伝達活性、および/または抗原により刺激されたCARシグナル伝達に応答したCAR-T細胞の増大特性に対して、影響を有し得る。いくつかの態様において、50、45、40、30、35、30、25、20、15、14、13、12、11、または10アミノ酸未満などの、より短いスペーサーが用いられる。いくつかの態様において、少なくとも50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、260、270、280、または290アミノ酸であるものなどの、より長いスペーサーは、インビボまたはインビトロで、増大の増加という利点を有し得る。

非限定的な例として、免疫グロブリンヒンジ領域は、以下のアミノ酸配列のうちの1つを含むことができる:

など。いくつかの態様において、ヒンジ領域はSEQ ID NO:15を含む。いくつかの態様において、ヒンジ領域はSEQ ID NO:16を含む。

細胞外スペーサーは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のヒンジ領域のアミノ酸配列を含むことができる。細胞外スペーサーはまた、野生型（天然に存在する）ヒンジ領域と比較して、1つまたは複数のアミノ酸の置換および/または挿入および/または欠失を含んでもよい。例えば、ヒンジ領域が、配列

を含むように、ヒトIgG1ヒンジのHis229を、Tyrで置換することができる。

細胞外スペーサーは、ヒトCD8に由来するアミノ酸配列を含むことができ；例えば、ヒンジ領域は、アミノ酸配列：

またはそのバリアントを含むことができる。

細胞外スペーサーは、CH2領域を含んでもよく、またはさらに含んでもよい。例示的なCH2領域は、

である。細胞外スペーサーは、CH3領域を含んでもよく、またはさらに含んでもよい。例示的なCH3領域は、

である。

細胞外スペーサーが複数の部分を含む場合は、様々な部分の間にどこにでも0～50アミノ酸が存在してもよい。例えば、ヒンジとCH2領域もしくはCH3領域との間、または両方が存在する場合にはCH2領域とCH3領域との間に、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、もしくは50アミノ酸、多くとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、もしくは50アミノ酸、または正確に0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、もしくは50アミノ酸（またはその中の任意の導き出せる範囲）が存在してもよい。いくつかの態様において、細胞外スペーサーは、ヒンジ、CH2、および/またはCH3領域から本質的になり、これは、ヒンジ、CH2、および/またはCH3領域が、存在する唯一の特定可能な領域であり、すべての他のドメインまたは領域が除外されるが、特定可能な領域の一部ではないさらなるアミノ酸が存在してもよいことを意味する。

D. 膜貫通ドメイン
本開示のポリペプチドは、膜貫通ドメインを含んでもよい。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、膜にわたる疎水性αヘリックスである。異なる膜貫通ドメインは、異なる受容体安定性を結果としてもたらし得る。

いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、細胞外スペーサーと細胞質領域との間に挿入される。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、細胞外スペーサーと1つまたは複数の共刺激領域との間に挿入される。いくつかの態様において、リンカーは、膜貫通ドメインと1つまたは複数の共刺激領域との間にある。

真核生物（例えば、哺乳動物）細胞の細胞膜中へのポリペプチドの挿入を提供する任意の膜貫通ドメインが、使用に適している可能性がある。1つの非限定的な例として、CD28由来である膜貫通配列

を用いることができる。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、

である。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、CD28、CD8、CD4、CD3-ζ、CD134、またはCD7に由来する。

E. 細胞質領域
本開示の受容体は、抗原認識後、クラスター化し、シグナルが、細胞質領域を通して細胞に伝達され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載される共刺激ドメインは、細胞質領域の一部である。いくつかの態様において、細胞質領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインおよび1つまたは複数の共刺激ドメインを含んでもよい。

本開示のポリペプチドにおける使用に適している細胞質領域および/または共刺激領域は、抗原結合ドメインに対する抗原の結合を介した活性化に応答して、別個のかつ検出可能なシグナル（例えば、細胞による1つまたは複数のサイトカインの産生の増加；標的遺伝子の転写の変化；タンパク質の活性の変化；細胞挙動の変化、例えば、細胞死；細胞増殖；細胞分化；細胞生存；細胞シグナル伝達応答の調節など）を提供する任意の望ましいシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞質領域は、本明細書に記載されるような少なくとも1つ（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つなど）のITAMモチーフを含む。いくつかの態様において、細胞質領域は、DAP10/CD28型シグナル伝達鎖を含む。

本開示のポリペプチドにおける使用に適している細胞質領域は、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含有する細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含む。ITAMモチーフは、YX1X2(L/I)であり、ここで、X1およびX2は独立して、任意のアミノ酸である。場合によっては、細胞質領域は、1、2、3、4、または5つのITAMモチーフを含む。場合によっては、ITAMモチーフは、エンドドメインにおいて2回繰り返され、ITAMモチーフの第1および第2の例は、6～8アミノ酸によって互いに隔てられ、例えば、(YX1X2(L/I))(X3)n(YX1X2(L/I))であり、ここで、nは、6から8までの整数であり、6～8のX3の各々は、任意のアミノ酸であることができる。

適している細胞質領域は、ITAMモチーフを含有するポリペプチドに由来する、ITAMモチーフ含有部分であり得る。例えば、適している細胞質領域は、任意のITAMモチーフ含有タンパク質由来のITAMモチーフ含有ドメインであることができる。したがって、適しているエンドドメインは、それが由来するタンパク質全体の配列全体を含有する必要はない。適しているITAMモチーフ含有ポリペプチドの例には、以下が含まれるが、それらに限定されない：DAP12、DAP10、FCER1G（Fcε受容体Iγ鎖）；CD3D（CD3δ）；CD3E（CD3ε）；CD3G（CD3γ）；CD3-ζ；およびCD79A（抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖）。

場合によっては、細胞質領域は、DAP12（TYROBP；TYROタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；KARAP；PLOSL；DN AX-活性化タンパク質12；KAR-関連タンパク質；TYROタンパク質チロシンキナーゼ-結合タンパク質；キラー活性化受容体関連タンパク質；キラー-活性化受容体-関連タンパク質などとしても知られている）に由来する。例えば、適しているエンドドメインポリペプチドは、

に対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの態様において、適している細胞質領域は、完全長DAP12アミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。したがって、適しているエンドドメインポリペプチドは、

いくつかの態様において、細胞質領域は、FCER1G（FCRG；Fcε受容体Iγ鎖；Fc受容体γ-鎖；fc-εR1-γ；fcRγ；fceRIγ；高親和性免疫グロブリンε受容体サブユニットγ；免疫グロブリンE受容体、高親和性、γ鎖などとしても知られている）に由来する。例えば、適しているエンドドメインポリペプチドは、

いくつかの態様において、適している細胞質領域は、完全長FCER1Gアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。したがって、適しているエンドドメインポリペプチドは、

いくつかの態様において、細胞質領域は、T細胞表面糖タンパク質CD3δ鎖（CD3D；CD3-DELTA；T3D；CD3抗原、デルタサブユニット；CD3デルタ；CD3δ；CD3d抗原、デルタポリペプチド（TiT3複合体）；OKT3、デルタ鎖；T細胞受容体T3デルタ鎖；T細胞表面糖タンパク質CD3デルタ鎖などとしても知られている）に由来する。例えば、適しているエンドドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（2つのアイソフォーム）：

のいずれかの、約100アミノ酸から約110アミノ酸（aa）まで、約110 aaから約115 aaまで、約115 aaから約120 aaまで、約120 aaから約130 aaまで、約130 aaから約140 aaまで、約140 aaから約150 aaまで、または約150 aaから約170 aaまでの連続した区間に対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの態様において、適している細胞質領域は、完全長CD3δアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。したがって、適しているエンドドメインポリペプチドは、

いくつかの態様において、細胞質領域は、T細胞表面糖タンパク質CD3ε鎖（CD3e、CD3ε；T細胞表面抗原T3/Leu-4イプシロン鎖、T細胞表面糖タンパク質CD3イプシロン鎖、AI504783、CD3、CD3イプシロン、T3eなどとしても知られている）に由来する。例えば、適しているエンドドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：

の、約100アミノ酸から約110アミノ酸（aa）まで、約110 aaから約115 aaまで、約115 aaから約120 aaまで、約120 aaから約130 aaまで、約130 aaから約140 aaまで、約140 aaから約150 aaまで、または約150 aaから約205 aaまでの連続した区間に対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの態様において、適している細胞質領域は、完全長CD3εアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。したがって、適しているエンドドメインポリペプチドは、

いくつかの態様において、細胞質領域は、T細胞表面糖タンパク質CD3γ鎖（CD3G、CD3γ、T細胞受容体T3ガンマ鎖、CD3-GAMMA、T3G、ガンマポリペプチド（TiT3複合体）などとしても知られている）に由来する。例えば、適している細胞質領域は、以下のアミノ酸配列：

の、約100アミノ酸から約110アミノ酸（aa）まで、約110 aaから約115 aaまで、約115 aaから約120 aaまで、約120 aaから約130 aaまで、約130 aaから約140 aaまで、約140 aaから約150 aaまで、または約150 aaから約180 aaまでの連続した区間に対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの態様において、適している細胞質領域は、完全長CD3γアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。したがって、適している細胞質領域は、

いくつかの態様において、細胞質領域は、T細胞表面糖タンパク質CD3ζ鎖（CD3Z、CD3ζ、T細胞受容体T3ゼータ鎖、CD247、CD3-ZETA、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZなどとしても知られている）に由来する。例えば、適している細胞質領域は、以下のアミノ酸配列（2つのアイソフォーム）：

のいずれかの、約100アミノ酸から約110アミノ酸（aa）まで、約110 aaから約115 aaまで、約115 aaから約120 aaまで、約120 aaから約130 aaまで、約130 aaから約140 aaまで、約140 aaから約150 aaまで、または約150 aaから約160 aaまでの連続した区間に対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、細胞質領域は、

を含む。

いくつかの態様において、適している細胞質領域は、完全長CD3ζアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。したがって、適している細胞質領域は、以下のアミノ酸配列：

のいずれかに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの態様において、細胞質領域は、CD79A（B細胞抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖；CD79a抗原（免疫グロブリン関連α）；MB-1膜糖タンパク質；ig-α；膜結合免疫グロブリン関連タンパク質；表面IgM関連タンパク質などとしても知られている）に由来する。例えば、適している細胞質領域は、以下のアミノ酸配列（2つのアイソフォーム）：

のいずれかの、約100アミノ酸から約110アミノ酸（aa）まで、約110 aaから約115 aaまで、約115 aaから約120 aaまで、約120 aaから約130 aaまで、約130 aaから約150 aaまで、約150 aaから約200 aaまで、または約200 aaから約220 aaまでの連続した区間に対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの態様において、適している細胞質領域は、完全長CD79Aアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。したがって、適している細胞質領域は、以下のアミノ酸配列：

いくつかの態様において、適している細胞質領域は、DAP10/CD28型シグナル伝達鎖を含むことができる。CD28シグナル伝達鎖の例は、アミノ酸配列

である。いくつかの態様において、適しているエンドドメインは、アミノ酸配列

の全長に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本開示のペプチドにおける使用に適しているさらなる細胞質領域は、ZAP70ポリペプチド、例えば、以下のアミノ酸配列：

の、約300アミノ酸から約400アミノ酸まで、約400アミノ酸から約500アミノ酸まで、または約500アミノ酸から619アミノ酸までの連続した区間に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

1. 共刺激領域
細胞質領域に含まれるものなどの、適している共刺激領域の非限定的な例には、4-1BB（CD137）、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR、およびHVEM由来のポリペプチドが含まれるが、それらに限定されない。

共刺激領域は、少なくとも20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、もしくは300アミノ酸、多くとも20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、もしくは300アミノ酸、または正確に20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、もしくは300アミノ酸、またはその中の任意の導き出せる範囲の長さを有してもよい。いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質4-1BB（TNFRSF9；CD137；CDwl37；ILAなどとしても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適している共刺激領域は、

いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質CD28（Tp44としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適している共刺激領域は、

いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質ICOS（AILIM、CD278、およびCVID1としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適している共刺激領域は、

いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質OX-40（TNFRSF4、RP5-902P8.3、ACT35、CD134、OX40、TXGP1Lとしても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適している共刺激領域は、

いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質BTLA（BTLA1およびCD272としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適している共刺激領域は、

いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質CD27（S 152、T14、TNFRSF7、およびTp55としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適している共刺激領域は、

いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質CD30（TNFRSF8、D1S166E、およびKi-1としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適している共刺激領域は、

いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質GITR（TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357、およびGITR-Dとしても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適している共刺激領域は、

いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質HVEM（TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR、およびTR2としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適している共刺激領域は、

いくつかの態様において、共刺激ドメインは、

に対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、共刺激ドメインアミノ酸配列は、サイトカイン受容体由来のシグナル伝達ドメインに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有する。

F. 検出ペプチド
いくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチドは、検出ペプチド（同様に「タグ」）をさらに含んでもよい。適している検出ペプチドには、血球凝集素（HA；例えば、YPYDVPDYA（SEQ ID NO:79））；FLAG（例えば、DYKDDDDK（SEQ ID NO:80））；c-myc（例えば、EQKLISEEDL；SEQ ID NO:81））などが含まれる。いくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチドは、CD-20ミモトープペプチド（例えば、CPYSNPSLC（SEQ ID NO:89））をさらに含む。いくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチドは、SEQ ID NO:89に対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するタグ配列を含む。他の適している検出ペプチドが、当技術分野において公知である。

G. ペプチドリンカー
いくつかの態様において、本開示のポリペプチドは、ペプチドリンカー（時にはリンカーと呼ばれる）を含む。ペプチドリンカーは、本明細書に記載されるペプチドドメイン/領域のいずれかを隔てるために用いられてもよい。例として、リンカーは、シグナルペプチドと抗原結合ドメインとの間、抗原結合ドメインのVHとVLとの間、抗原結合ドメインとペプチドスペーサーとの間、ペプチドスペーサーと膜貫通ドメインとの間、共刺激領域に隣接して、もしくは共刺激領域のN領域上もしくはC領域上、および/または膜貫通ドメインとエンドドメインとの間にあってもよい。ペプチドリンカーは、多様なアミノ酸配列のいずれかを有し得る。ドメインおよび領域は、他の化学的結合が除外されないが、概して可動性の性質であるペプチドリンカーによって連結することができる。リンカーは、約6～約40アミノ酸長、または約6～約25アミノ酸長のペプチドであることができる。これらのリンカーは、タンパク質をカップリングするために、合成のリンカーをコードするオリゴヌクレオチドを用いることによって、製造することができる。

ある程度の可動性を有するペプチドリンカーを、用いることができる。適しているペプチドリンカーが、概して可動性ペプチドを結果としてもたらす配列を有することを念頭に置いて、ペプチドリンカーは、事実上任意のアミノ酸配列を有してもよい。グリシンおよびアラニンなどの小さなアミノ酸の使用は、可動性ペプチドを作り出すのに有用である。そのような配列の作出は、当業者にとって日常的である。

適しているリンカーは、容易に選択することができ、任意の適している長さ、例えば、4アミノ酸から10アミノ酸、5アミノ酸から9アミノ酸、6アミノ酸から8アミノ酸、または7アミノ酸から8アミノ酸を含む、1アミノ酸（例えば、Gly）から20アミノ酸まで、2アミノ酸から15アミノ酸まで、3アミノ酸から12アミノ酸までのものであることができ、1、2、3、4、5、6、または7アミノ酸であってもよい。

適しているリンカーは、容易に選択することができ、適している様々な長さの任意、例えば、4アミノ酸から10アミノ酸、5アミノ酸から9アミノ酸、6アミノ酸から8アミノ酸、または7アミノ酸から8アミノ酸を含む、1アミノ酸（例えば、Gly）から20アミノ酸まで、2アミノ酸から15アミノ酸まで、3アミノ酸から12アミノ酸までのものであることができ、1、2、3、4、5、6、または7アミノ酸であってもよい。

例となる可動性リンカーには、グリシンポリマーである(G)n、例えば、(GS)n、(GSGGS)n、(G4S)n、および(GGGS)nを含むグリシン-セリンポリマーが含まれ、ここで、nは、少なくとも1の整数である。いくつかの態様において、nは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10（またはその中の任意の導き出せる範囲）である。グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、および他の可動性リンカーが、当技術分野において公知である。グリシンポリマーおよびグリシン-セリンポリマーを、用いることができ；GlyおよびSerは両方とも、比較的構造化されておらず、そのため、成分間の中性テザーとして働くことができる。グリシンポリマーを、用いることができ；グリシンは、アラニンよりも有意に大きなphi-psi空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ない。例示的なスペーサーは、GGSG（SEQ ID NO:82）、GGSGG（SEQ ID NO:83）、GSGSG（SEQ ID NO:84）、GSGGG（SEQ ID NO:85）、GGGSG（SEQ ID NO:86）、GSSSG（SEQ ID NO:87）などを含むがそれらに限定されない、アミノ酸配列を含むことができる。

さらなる態様において、リンカーは、(EAAAK)nを含み、ここで、nは、少なくとも1の整数である。いくつかの態様において、nは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10（またはその中の任意の導き出せる範囲）である。

いくつかの態様において、リンカーはWhitlowリンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、

H. 追加の修飾およびポリペプチドの増強
追加的に、本開示のポリペプチドは、化学的に修飾されてもよい。ポリペプチドのグリコシル化は、例えば、抗原に対するポリペプチドの親和性を増加させるようにポリペプチド配列内のグリコシル化の1つまたは複数の部位を改変することによって、変更することができる（米国特許第5,714,350号および第6,350,861号）。

本開示のポリペプチドの領域または断片は、SEQ ID NO:1～89のいずれかに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200個、またはそれよりも多いアミノ酸置換、連続したアミノ酸付加、または連続したアミノ酸欠失を有するか、少なくともこれらを有するか、または多くともこれらを有する、アミノ酸配列を有してもよいことが企図される。あるいは、本開示のポリペプチドの領域または断片は、SEQ ID NO:1～89のいずれかに対して50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）同一である、少なくとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）同一である、または多くとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）同一である、アミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、アミノ酸配列を有してもよい。さらに、いくつかの態様において、領域または断片は、SEQ ID NO:1～89のいずれかにおける1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、または500位（1位はSEQ ID NOのN末端である）から始まる、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500個、またはそれよりも多い連続したアミノ酸のアミノ酸領域を含む。本開示のポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50個、もしくはそれよりも多いバリアントアミノ酸を含んでもよく、またはSEQ ID NO:1～89のいずれかの、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、600個、もしくはそれよりも多い連続したアミノ酸、もしくは多くとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、600個、もしくはそれよりも多い連続したアミノ酸、もしくはその中の任意の導き出せる範囲と、少なくとも60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％（もしくはその中の任意の導き出せる範囲）類似、同一、もしくは相同であってもよい。

本開示のポリペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、もしくは615個、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、もしくは615個、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、もしくは615個の置換（またはその中の任意の導き出せる範囲）を含んでもよい。

置換は、SEQ ID NO:1～89のいずれかのアミノ酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、または650位（またはその中の任意の導き出せる範囲）にあってもよい。

本明細書に記載されるポリペプチドは、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個、もしくはそれよりも多いアミノ酸、多くとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個、もしくはそれよりも多いアミノ酸、または正確に5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個、もしくはそれよりも多いアミノ酸（またはその中の任意の導き出せる範囲）の固定された長さのものであってもよい。

置換バリアントは、典型的には、タンパク質内の1つまたは複数の部位で1つのアミノ酸の別のアミノ酸への交換を含有し、他の機能または特性の喪失を伴うかまたは伴わずに、ポリペプチドの1つまたは複数の特性を調節するように設計されてもよい。置換は、保存的であってもよく、すなわち、1つのアミノ酸が、類似した形状および電荷のもので置き換えられる。保存的置換は、当技術分野において周知であり、例えば、以下の変化を含む：アラニンからセリンへ；アルギニンからリジンへ；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへ；アスパラギン酸からグルタミン酸へ；システインからセリンへ；グルタミンからアスパラギンへ；グルタミン酸からアスパラギン酸へ；グリシンからプロリンへ；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ；イソロイシンからロイシンまたはバリンへ；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへ；リジンからアルギニンへ；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへ；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニンへ；セリンからスレオニンへ；スレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへ；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへ。あるいは、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響を受けるように、非保存的であってもよい。非保存的変化は、典型的には、残基を、化学的に類似していない残基で、例えば、非極性または非荷電アミノ酸を極性または荷電アミノ酸で、およびその逆で、置換することを含む。

タンパク質は、組換えであってもよく、またはインビトロで合成されてもよい。あるいは、非組換えタンパク質または組換えタンパク質が、細菌から単離されてもよい。そのようなバリアントを含有する細菌が、組成物および方法において実施されてもよいこともまた、企図される。結果的に、タンパク質を単離する必要がない。

「機能的に等価のコドン」という用語は、アルギニンまたはセリンに対する6つのコドンなどの、同じアミノ酸をコードするコドンを指すように、本明細書において用いられ、かつまた、生物学的に等価のアミノ酸をコードするコドンも指す。

アミノ酸配列および核酸配列は、配列が、タンパク質発現が関わる生物学的タンパク質活性の維持を含む、上記に示される基準を満たす限り、それぞれ、追加のN末端アミノ酸もしくはC末端アミノ酸、または5'配列もしくは3'配列などの、追加の残基を含んでもよいが、依然として本質的に本明細書に開示される配列の1つに示される通りであることもまた、理解される。末端配列の付加は、例えば、コード領域の5'部分または3'部分のいずれかに隣接する様々な非コード配列を含み得る核酸配列に、特に適用される。

他の態様において、ポリペプチドの機能の変更は、1つまたは複数の置換を導入することによって意図される。例えば、ある特定のアミノ酸が、相互作用成分の相互作用的結合能力を改変する意図で、タンパク質構造中の他のアミノ酸の代わりに用いられてもよい。例えば、タンパク質相互作用ドメイン、核酸相互作用ドメイン、および触媒部位などの構造は、そのような機能を変更するために置換されたアミノ酸を有してもよい。そのタンパク質の生物学的機能活性を定義するのは、タンパク質の相互作用的な能力および性質であるため、ある特定のアミノ酸置換を、タンパク質配列において、およびその基礎となるDNAコード配列において行うことができ、それにもかかわらず、異なる特性を有するタンパク質を生じ得る。したがって、それらの生物学的有用性または活性の評価可能な改変を伴う様々な変更を、遺伝子のDNA配列において行ってもよいことが、本発明者らによって企図される。

そのような変更を行う際に、アミノ酸のハイドロパシー指数が考慮されてもよい。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、概して、当技術分野において理解されている（Kyte and Doolittle, 1982）。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性が、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与し、それが次に、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが認められている。

同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行われ得ることもまた、当技術分野において理解されている。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,554,101号は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるようなタンパク質の最大局所平均親水性が、タンパク質の生物学的特性と相関することを述べている。アミノ酸を、類似した親水性値を有する別のアミノ酸で置換することができ、依然として生物学的に等価かつ免疫学的に等価のタンパク質を生じ得ることが理解される。

上記で概説されるように、アミノ酸置換は、概して、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。前述の様々な特徴を考慮に入れた例示的な置換は、周知であり、以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。

具体的な態様において、本明細書に記載されるタンパク質のすべてまたは一部はまた、従来の技法に従って、溶液中または固体支持体上で合成することもできる。様々な自動合成機が市販されており、公知のプロトコルに従って用いることができる。例えば、各々が参照により本明細書に組み入れられるStewart and Young, (1984)；Tam et al., (1983)；Merrifield, (1986)；およびBarany and Merrifield (1979)を参照されたい。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、発現ベクター中に挿入し、適切な宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクトし、発現に適している条件下で培養する、組換えDNA技術が使用されてもよい。

1つの態様は、タンパク質の産生および/または提示のための、微生物を含む細胞への遺伝子導入の使用を含む。関心対象のタンパク質の遺伝子を、適切な宿主細胞中に導入し、続いて、適切な条件下で細胞を培養してもよい。事実上任意のポリペプチドをコードする核酸が、使用されてもよい。組換え発現ベクター、およびその中に含まれる要素の生成は、本明細書で議論される。あるいは、産生されるタンパク質は、タンパク質産生に用いられる細胞によって通常合成される、内在性タンパク質であってもよい。

III. 細胞
ある特定の態様は、本開示のポリペプチドまたは核酸を含む細胞に関する。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。「T細胞」（同様に「T-細胞」）には、Tヘルパー細胞、インバリアントナチュラルキラーT（iNKT）細胞、細胞傷害性T細胞、およびT制御性細胞（Treg）、γ-δT細胞を含むがそれらに限定されない、CD3を発現するすべてのタイプの免疫細胞が含まれる。T細胞は、CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞を指してもよい。T細胞は、CD62L濃縮T細胞を指してもよい。免疫細胞は、ナチュラルキラー（NK）細胞、B細胞、または免疫系の任意の他の細胞であってもよい。

適している哺乳動物細胞には、初代細胞および不死化細胞株が含まれる。適している哺乳動物細胞株には、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株などが含まれる。適している哺乳動物細胞株には、HeLa細胞（例えば、American Type Culture Collection（ATCC）番号CCL-2）、CHO細胞（例えば、ATCC番号CRL9618、CCL61、CRL9096）、ヒト胚性腎臓（HEK）293細胞（例えば、ATCC番号CRL-1573）、Vero細胞、NIH 3T3細胞（例えば、ATCC番号CRL-1658）、Huh-7細胞、BHK細胞（例えば、ATCC番号CCL10）、PC12細胞（ATCC 番号CRL1721）、COS細胞、COS-7細胞（ATCC番号CRL1651）、RATI細胞、マウスL細胞（ATCC番号CCLI.3）、HLHepG2細胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK細胞株（例えば、NKL、NK92、およびYTS）などが含まれるが、それらに限定されない。

いくつかの例において、細胞は、不死化細胞株ではなく、その代わりに、個体から得られた細胞（例えば、初代細胞）である。例えば、場合によっては、細胞は、個体から得られた免疫細胞である。例として、細胞は、個体から得られたTリンパ球である。別の例として、細胞は、個体から得られた細胞傷害性細胞である。別の例として、細胞は、個体から得られた幹細胞（例えば、末梢血幹細胞）または前駆細胞である。

本開示の細胞は、1つまたは複数の治療用ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの態様において、1つまたは複数のCARポリペプチドを含む細胞が開示される。いくつかの態様において、細胞は、腫瘍抗原結合ドメインを含むCARポリペプチドを含む。いくつかの態様において、細胞は、TYRP-1結合ドメインを含むCARポリペプチドを含む。CARポリペプチドを含む細胞は、ある特定の態様において、1つまたは複数の追加の治療用ポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。本開示の治療用ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む細胞は、いくつかの態様において、治療用細胞の効力または安全性を改善する、1つまたは複数の追加の遺伝子改変（例えば、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子付加など）をさらに含んでもよい。そのような遺伝子改変のある特定の非限定的な例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるPuig-Saus and Ribas. Gene editing: towards the third generation of adoptive T cell transfer therapies. Immuno-Oncology Technology. 2019 June 13; 1:19-26に記載されている。

IV. ゲノムDNAを改変するための方法
ある特定の態様において、ゲノムDNAは、追加の変異、挿入、もしくは欠失を含むように、または構築物をゲノムDNAから発現させるために本開示のある特定の分子構築物を組み込むように、のいずれかで改変される。いくつかの態様において、本開示のポリペプチドをコードする核酸は、細胞のゲノムDNA中に組み込まれる。いくつかの態様において、核酸は、レンチウイルスまたはレトロウイルス形質導入による遺伝子導入などの、ウイルス形質導入を介して細胞中に組み込まれる。いくつかの態様において、ゲノムDNAは、本開示のポリペプチド（例えば、CAR）をコードする核酸の、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターを介した宿主細胞のゲノム中への組込みによって改変される。

いくつかの態様において、組込みは標的組込みである。いくつかの態様において、標的組込みは、部位特異的リコンビナーゼおよび/またはターゲティングエンドヌクレアーゼなどの、DNA消化剤/ポリヌクレオチド修飾酵素の使用を通して達成される。「DNA消化剤」という用語は、核酸のヌクレオチドサブユニット間の結合（すなわち、ホスホジエステル結合）を切断することができる剤を指す。1つの具体的な標的は、TRAC（T細胞受容体α定常）遺伝子座である。例えば、細胞に最初に、TRAC（T細胞受容体α定常）遺伝子座を標的とするシングルガイドRNA（sgRNA）と複合体形成したCas9タンパク質からなるリボ核タンパク質（RNP）複合体をエレクトロポレーションする。エレクトロポレーションの15分後に、細胞を、CARをコードする相同組換え修復（HDR）鋳型を保有するAAV6で処理する。別の例においては、二本鎖DNAまたは一本鎖DNAが、HDR鋳型を含み、RNP複合体と一緒にエレクトロポレーションを介して細胞中に導入される。

したがって、1つの局面で、本開示は、標的組込みを含む。これを達成する1つの様式は、部位特異的リコンビナーゼおよび/またはターゲティングエンドヌクレアーゼなどの、少なくとも1つのポリヌクレオチド修飾酵素の少なくとも1つの認識配列を含む外因性核酸配列（すなわち、ランディングパッド）の使用によるものである。部位特異的リコンビナーゼは、当技術分野において周知であり、概して、インベルターゼ、リゾルバーゼ、またはインテグラーゼと呼ばれてもよい。部位特異的リコンビナーゼの非限定的な例には、λインテグラーゼ、Creリコンビナーゼ、FLPリコンビナーゼ、γ-δリゾルバーゼ、Tn3リゾルバーゼ、ΦC31インテグラーゼ、Bxb1-インテグラーゼ、およびR4インテグラーゼが含まれ得る。部位特異的リコンビナーゼは、特異的な認識配列（もしくは認識部位）またはそのバリアントを認識し、そのすべては、当技術分野において周知である。例えば、Creリコンビナーゼは、LoxP部位を認識し、FLPリコンビナーゼは、FRT部位を認識する。

企図されるターゲティングエンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、CRISPR/Cas様エンドヌクレアーゼ、I-Tevlヌクレアーゼもしくは関連モノマーハイブリッド、または人工標的DNA二本鎖切断誘導剤が含まれる。例示的なターゲティングエンドヌクレアーゼを、以下でさらに説明する。例えば、典型的には、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、DNA結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含み、その両方を、以下で説明する。また、ポリヌクレオチド修飾酵素の定義には、例えば、DNA結合ドメインおよびヌクレアーゼを含んでもよい、当業者に公知の任意の他の有用な融合タンパク質も含まれる。

ランディングパット配列は、部位特異的リコンビナーゼおよび/またはターゲティングエンドヌクレアーゼなどの特異的なポリヌクレオチド修飾酵素によって選択的に結合および修飾される少なくとも1つの認識配列を含む、ヌクレオチド配列である。概して、ランディングパッド配列中の認識配列は、改変される細胞のゲノムに内在性に存在しない。例えば、改変される細胞がCHO細胞である場合、ランディングパッド配列中の認識配列は、内在性CHOゲノムに存在しない。標的組込みの割合は、標的細胞のゲノム内に内在性に存在しない高効率ヌクレオチド修飾酵素の認識配列を選択することによって、改善され得る。内在性に存在しない認識配列の選択はまた、潜在的なオフターゲット組込みも低減させる。他の局面において、改変される細胞で天然である認識配列の使用が望ましいことがある。例えば、複数の認識配列がランディングパッド配列において使用される場合、1つまたは複数が外因性であってもよく、かつ1つまたは複数が天然であってもよい。

当業者は、部位特異的リコンビナーゼおよび/またはターゲティングエンドヌクレアーゼによって結合および切断される配列を、容易に決定することができる。

複数の認識配列が、単一のランディングパッドに存在してもよく、これは、ランディングパッドが、（とりわけ、受容体遺伝子および/または誘導性レポーターを含む）2つ以上の固有の核酸を挿入することができるように、2つ以上のポリヌクレオチド修飾酵素によって連続的に標的とされることを可能にする。あるいは、ランディングパッドにおける複数の認識配列の存在により、複数コピーの同じ核酸をランディングパッド中に挿入することが可能になる。2つの核酸が単一のランディングパッドを標的とする場合、ランディングパッドは、第1のポリヌクレオチド修飾酵素用の第1の認識配列（第1のZFNペアなど）、および第2のポリヌクレオチド修飾酵素用の第2の認識配列（第2のZFNペアなど）を含む。代替的にまたは追加的に、1つまたは複数の認識配列を含む個々のランディングパッドが、複数の場所で組み込まれてもよい。タンパク質発現の増加が、複数コピーのペイロードで形質転換された細胞において観察され得る。あるいは、異なる発現カセットを含む複数の固有の核酸配列が挿入される場合、同じランディングパッドにあろうとまたは異なるランディングパッドにあろうと、複数の遺伝子産物が同時に発現され得る。核酸の数およびタイプにかかわらず、ターゲティングエンドヌクレアーゼがZFNである場合、例示的なZFNペアには、認識配列が付随する、hSIRT、hRSK4、およびhAAVS1が含まれる。

一般的に言うと、標的組込みを容易にするために用いられるランディングパッドは、少なくとも1つの認識配列を含んでもよい。例えば、ランディングパッドは、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10、またはそれよりも多い認識配列を含んでもよい。1つよりも多い認識配列を含む態様において、認識配列は、互いに固有であってもよく（すなわち、異なるポリヌクレオチド修飾酵素によって認識されてもよく）、同じ反復配列であってもよく、または反復配列および固有配列の組み合わせであってもよい。

当業者は、ランディングパッドとして用いられる外因性核酸が、認識配列に加えて他の配列も含み得ることを容易に理解するであろう。例えば、抗生物質耐性遺伝子、代謝選択マーカー、または蛍光タンパク質などの、本明細書に記載されるような選択可能またはスクリーニング可能な遺伝子をコードする1つまたは複数の配列を含むことが、好都合であり得る。転写調節および制御エレメントなどの他の補足配列（すなわち、プロモーター、部分的プロモーター、プロモータートラップ、開始コドン、エンハンサー、イントロン、インスレーター、および他の発現エレメント）の使用もまた、存在することができる。

適切な認識配列の選択に加えて、高い切断効率を有するターゲティングエンドヌクレアーゼの選択もまた、ランディングパッドの標的組込みの割合を改善する。ターゲティングエンドヌクレアーゼの切断効率は、例えば、CEL-1アッセイまたはPCRアンプリコンにおける挿入/欠失（インデル）の直接シーケンシングなどのアッセイを用いることを含む、当技術分野において周知の方法を用いて決定することができる。

本明細書に開示される方法および細胞において用いられるターゲティングエンドヌクレアーゼのタイプは、変動することができ、変動するであろう。ターゲティングエンドヌクレアーゼは、天然に存在するタンパク質であってもよく、または操作されたタンパク質であってもよい。ターゲティングエンドヌクレアーゼの1つの例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼであり、これを、以下でさらに詳細に議論する。

用いることができるターゲティングエンドヌクレアーゼの別の例は、真核細胞の核中へのエンドヌクレアーゼの侵入を可能にする、少なくとも1つの核局在化シグナルを含むRNA誘導型エンドヌクレアーゼである。RNA誘導型エンドヌクレアーゼはまた、少なくとも1つのヌクレアーゼドメイン、およびガイドRNAと相互作用する少なくとも1つのドメインも含む。RNA誘導型エンドヌクレアーゼは、RNA誘導型エンドヌクレアーゼが特異的な染色体配列を切断するように、ガイドRNAによって特異的な染色体配列に方向付けられる。ガイドRNAは標的切断に特異性を提供するため、RNA誘導型エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼは、汎用性であり、異なる標的染色体配列を切断するために異なるガイドRNAと共に用いられてもよい。例示的なRNA誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質を、以下でさらに詳細に議論する。例えば、RNA誘導型エンドヌクレアーゼは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspersed short palindromic repeats）（CRISPR）/CRISPR関連（Cas）システムに由来するRNA誘導型エンドヌクレアーゼである、CRISPR/Casタンパク質またはCRISPR/Cas様融合タンパク質であることができる。

ターゲティングエンドヌクレアーゼはまた、メガヌクレアーゼであることができる。メガヌクレアーゼは、大きな認識部位を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、すなわち、認識部位は、概して、約12塩基対から約40塩基対の範囲である。この要求の結果として、認識部位は、概して、任意の所与のゲノムにおいて1回のみ生じる。メガヌクレアーゼの中で、「LAGLIDADG」という名称のホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーは、ゲノムの研究およびゲノム工学のための価値あるツールになっている。メガヌクレアーゼは、当業者に周知の技法を用いてそれらの認識配列を改変することによって、特異的な染色体配列を標的とし得る。例えば、Epinat et al., 2003, Nuc. Acid Res., 31(11):2952-62およびStoddard, 2005, Quarterly Review of Biophysics, pp. 1-47を参照されたい。

用いることができるターゲティングエンドヌクレアーゼのさらに別の例は、転写活性化因子様エフェクター（TALE）ヌクレアーゼである。TALEは、新たなDNA標的に結合するように容易に操作され得る、植物病原体ザントモナス属（Xanthomonas）由来の転写因子である。TALEまたはその短縮バージョンは、TALEヌクレアーゼまたはTALENと呼ばれるターゲティングエンドヌクレアーゼを作り出すように、FokIなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに連結され得る。例えば、Sanjana et al., 2012, Nature Protocols 7(1):171-192；Bogdanove A J, Voytas D F., 2011, Science, 333(6051):1843-6；Bradley P, Bogdanove A J, Stoddard B L., 2013, Curr Opin Struct Biol., 23(1):93-9を参照されたい。

別の例示的なターゲティングエンドヌクレアーゼは、部位特異的ヌクレアーゼである。特に、部位特異的ヌクレアーゼは、その認識配列がゲノムにおいてめったに生じない「レアカッター」エンドヌクレアーゼであってもよい。好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼの認識配列は、ゲノムにおいて1回のみ生じる。あるいは、ターゲティングヌクレアーゼは、人工標的DNA二本鎖切断誘導剤であってもよい。

いくつかの態様において、標的組込みは、インテグラーゼの使用を通して達成することができる。例えば、phiC31インテグラーゼは、バクテリオファージphiC31のゲノム内にコードされる配列特異的リコンビナーゼである。phiC31インテグラーゼは、一方はファージにおいて見出され、もう一方は細菌宿主において見出される、付着部位（att）と呼ばれる2つの34塩基対の配列間の組換えを媒介する。このセリンインテグラーゼは、哺乳動物細胞を含む多くの異なる細胞型において、効率的に機能することが示されている。phiC31インテグラーゼの存在下で、attBを含有するドナープラスミドは、天然attP部位に対して配列類似性を有する部位（疑似attP部位と呼ばれる）での組換えを通して、標的ゲノム中に一方向性に組み込むことができる。phiC31インテグラーゼは、任意のサイズのプラスミドを単一コピーとして組み込むことができ、補因子を必要としない。組み込まれた導入遺伝子は、安定して発現され、遺伝性である。

1つの態様において、本開示のポリヌクレオチドのゲノム組込みは、トランスポザーゼの使用を通して達成される。例えば、正確に定義されたDNA配列を脊椎動物の染色体中に導入するように設計された合成DNAトランスポゾン（例えば、「Sleeping Beauty」トランスポゾンシステム）を、用いることができる。Sleeping Beautyトランスポゾンシステムは、Sleeping Beauty（SB）トランスポザーゼ、および特異的な配列のDNAを脊椎動物のゲノム中に挿入するように設計されたトランスポゾンから構成される。DNAトランスポゾンは、単純なカットアンドペースト様式で、1つのDNA部位から別のDNA部位に移動する。転位は、定義されたDNAセグメントが1つのDNA分子から切り出され、同じかまたは異なるDNA分子またはゲノム中の別の部位に動かされる、正確なプロセスである。

すべての他のTc1/マリナー型トランスポザーゼのように、SBトランスポザーゼは、レシピエントDNA配列におけるTAジヌクレオチド塩基対中にトランスポゾンを挿入する。挿入部位は、同じDNA分子における、または別のDNA分子（または染色体）における他の場所であることができる。ヒトを含む哺乳動物ゲノムには、およそ2億のTA部位がある。TA挿入部位は、トランスポゾン組込みのプロセスにおいて複製される。TA配列のこの複製は、転位の証しであり、いくつかの実験においては機序を確かめるために用いられる。トランスポザーゼは、トランスポゾン内にコードされることができるか、または別の供給源によって供給することができ、その場合、トランスポゾンは、非自律性エレメントになる。非自律性トランスポゾンは、挿入後に、独立して切り出しおよび再挿入を続けることができないため、遺伝学的ツールとして最も有用である。ヒトゲノムおよび他の哺乳動物ゲノムにおいて特定されたDNAトランスポゾンのすべては、トランスポザーゼ遺伝子を含有しているにもかかわらず、遺伝子が非機能的であり、かつトランスポゾンを動員できるトランスポザーゼを生成することができないため、非自律性である。

V. 方法
本開示の局面は、皮膚がんなどのがんを処置するための方法に関する。いくつかの態様において、黒色腫を有する対象を処置するための方法が開示される。いくつかの態様において、TYRP-1⁺がんを処置するための方法が開示される。さらなる態様において、本明細書に記載される治療用受容体（例えば、CAR）は、免疫応答を刺激するために用いられてもよい。免疫応答刺激は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで行われてもよい。いくつかの態様において、本明細書に記載される治療用受容体は、再発を予防するためである。方法は、概して、本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、もしくはDNA、RNA（例えば、インビトロ転写されたRNA）、もしくはアデノ随伴ウイルス（AAV）で哺乳動物細胞を遺伝子改変すること、またはポリペプチドを細胞に直接導入することを含む。細胞は、免疫細胞（例えば、Tリンパ球またはNK細胞）、幹細胞、前駆細胞などであることができる。いくつかの態様において、細胞は、本明細書に記載される細胞である。

いくつかの態様において、遺伝子改変は、エクスビボで実施される。例えば、Tリンパ球、幹細胞、またはNK細胞（または本明細書に記載される細胞）は、個体から得られ；個体から得られた細胞は、本開示のポリペプチドを発現するように遺伝子改変される。場合によっては、遺伝子改変された細胞は、エクスビボで活性化される。他の場合には、遺伝子改変された細胞は、個体（例えば、細胞が得られた個体）中に導入され；かつ遺伝子改変された細胞は、インビボで活性化される。

いくつかの態様において、方法は、がんの処置のための本明細書に記載される細胞もしくはペプチドの投与、またはがんを有する人に対する投与に関する。いくつかの態様において、がんはTYRP-1⁺がんである。いくつかの態様において、がんは皮膚がんである。いくつかの態様において、がんは黒色腫である。いくつかの態様において、黒色腫は、表在拡大型黒色腫、モジュラー（modular）黒色腫、末端黒子型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、線維形成性黒色腫、眼性黒色腫、粘膜黒色腫、または転移性黒色腫である。さらなる態様において、本明細書で議論されるがんに関する処置は、光線性角化症（AK）などの前がんに適用されてもよい。他の態様において、がんは、皮膚の扁平上皮がんであることができる。追加の態様において、患者は、以前に黒色腫または前がん性黒色腫を有しており、かつ/または黒色腫のリスクがある。

VI. 追加の治療法
A. 免疫療法
いくつかの態様において、方法は、がん免疫療法の投与を含む。がん免疫療法（時には、IOと省略される免疫腫瘍学と呼ばれる）は、がんを処置するための免疫系の使用である。免疫療法は、能動的、受動的、またはハイブリッド（能動的および受動的）に分類することができる。これらのアプローチは、がん細胞が多くの場合、腫瘍関連抗原（TAA）として知られる、免疫系によって検出され得る分子をその表面上に有し；それらは多くの場合、タンパク質または他の高分子（例えば、炭水化物）であるという事実を活用する。能動免疫療法は、TAAを標的とすることによって腫瘍細胞を攻撃するように、免疫系を方向付ける。受動免疫療法は、既存の抗腫瘍応答を増強し、モノクローナル抗体、リンパ球、およびサイトカインの使用を含む。本開示の方法において有用な免疫療法を、以下で説明する。

1. チェックポイント阻害剤および併用処置
本開示の態様は、免疫チェックポイント阻害剤（チェックポイント阻害剤療法とも呼ばれる）の投与を含んでもよく、これを、以下でさらに説明する。チェックポイント阻害剤療法は、1つの細胞チェックポイントタンパク質のみを標的とする単剤療法であってもよく、または少なくとも2つの細胞チェックポイントタンパク質を標的とする併用療法であってもよい。例えば、チェックポイント阻害剤単剤療法は、PD-1、PD-L1、もしくはPD-L2阻害剤のうちの1つを含んでもよく、またはCTLA-4、B7-1、もしくはB7-2阻害剤のうちの1つを含んでもよい。チェックポイント阻害剤併用療法は、PD-1、PD-L1、またはPD-L2阻害剤のうちの1つを含んでもよく、かつ組み合わせて、CTLA-4、B7-1、またはB7-2阻害剤のうちの1つをさらに含んでもよい。併用療法における阻害剤の組み合わせは、同じ組成物中にある必要はないが、同時に、実質的に同時に、または阻害剤の両方の周期的投与を含む投薬レジメンにおいてのいずれかで投与することができ、周期は、本明細書に記載される時間周期であってもよい。

a. PD-1、PD-L1、およびPD-L2阻害剤
PD-1は、T細胞が感染または腫瘍に遭遇する腫瘍微小環境において作用することができる。活性化されたT細胞は、末梢組織において、PD-1を上方制御し、発現し続ける。IFN-γなどのサイトカインは、上皮細胞および腫瘍細胞上のPD-L1の発現を誘導する。PD-L2は、マクロファージおよび樹状細胞上に発現している。PD-1の主な役割は、末梢においてエフェクターT細胞の活性を限定し、免疫応答中の組織に対する過剰な損傷を防ぐことである。本開示の阻害剤は、PD-1および/またはPD-L1活性の1つまたは複数の機能を遮断し得る。

「PD-1」の代替名には、CD279およびSLEB2が含まれる。「PD-L1」の代替名には、B7-H1、B7-4、CD274、およびB7-Hが含まれる。「PD-L2」の代替名には、B7-DC、Btdc、およびCD273が含まれる。いくつかの態様において、PD-1、PD-L1、およびPD-L2は、ヒトPD-1、PD-L1、PD-L2である。

いくつかの態様において、PD-1阻害剤は、PD-1のそのリガンド結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な局面において、PD-1リガンド結合パートナーは、PD-L1および/またはPD-L2である。別の態様において、PD-L1阻害剤は、PD-L1のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な局面において、PD-L1結合パートナーは、PD-1および/またはB7-1である。別の態様において、PD-L2阻害剤は、PD-L2のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な局面において、PD-L2結合パートナーはPD-1である。阻害剤は、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであってもよい。例示的な抗体は、参照により本明細書にすべて組み入れられる米国特許第8,735,553号、第8,354,509号、および第8,008,449号に記載されている。本明細書で提供される方法および組成物における使用のための他のPD-1阻害剤は、参照により本明細書にすべて組み入れられる米国特許出願番号US2014/0294898、US2014/022021、およびUS2011/0008369に記載されているように、当技術分野において公知である。

いくつかの態様において、PD-1阻害剤は、抗PD-1抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。いくつかの態様において、抗PD-1抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびピジリズマブからなる群より選択される。いくつかの態様において、PD-1阻害剤は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のFc領域）に融合したPD-L1またはPD-L2の細胞外またはPD-1結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの態様において、PD-L1阻害剤はAMP-224を含む。ニボルマブは、MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558、およびOPDIVO（登録商標）としても知られ、WO2006/121168に記載されている抗PD-1抗体である。ペムブロリズマブは、MK-3475、Merck 3475、ラムブロリズマブ、KEYTRUDA（登録商標）、およびSCH-900475としても知られ、WO2009/114335に記載されている抗PD-1抗体である。ピジリズマブは、CT-011、hBAT、またはhBAT-1としても知られ、WO2009/101611に記載されている抗PD-1抗体である。AMP-224は、B7-DCIgとしても知られ、WO2010/027827およびWO2011/066342に記載されているPD-L2-Fc融合可溶性受容体である。追加のPD-1阻害剤には、AMP-514としても知られるMEDI0680、およびREGN2810が含まれる。

いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、MEDI4736としても知られるデュルバルマブ、MPDL3280Aとしても知られるアテゾリズマブ、MSB00010118Cとしても知られるアベルマブ、MDX-1105、BMS-936559、またはそれらの組み合わせなどのPD-L1阻害剤である。ある特定の局面において、免疫チェックポイント阻害剤は、rHIgM12B7などのPD-L2阻害剤である。

いくつかの態様において、阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、またはピジリズマブの重鎖および軽鎖のCDRまたはVRを含む。したがって、1つの態様において、阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、またはピジリズマブのVH領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン、ならびにニボルマブ、ペムブロリズマブ、またはピジリズマブのVL領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインを含む。別の態様において、抗体は、結合について上述の抗体と競合し、かつ/または上述の抗体と同じPD-1、PD-L1、もしくはPD-L2上のエピトープに結合する。別の態様において、抗体は、上述の抗体と少なくとも約70、75、80、85、90、95、97、または99％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の可変領域アミノ酸配列同一性を有する。

b. CTLA-4、B7-1、およびB7-2阻害剤
本明細書で提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントは、CD152としても知られる細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）である。ヒトCTLA-4の完全なcDNA配列は、Genbankアクセッション番号L15006を有する。CTLA-4は、T細胞の表面上に見出され、抗原提示細胞の表面上のB7-1（CD80）またはB7-2（CD86）に結合した時に「オフ」スイッチとして作用する。CTLA-4は、ヘルパーT細胞の表面上に発現し、T細胞に抑制性シグナルを伝達する、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。CTLA-4は、T細胞共刺激タンパク質であるCD28に類似しており、両方の分子は、抗原提示細胞上のB7-1およびB7-2に結合する。CTLA-4は、T細胞に抑制性シグナルを伝達するのに対して、CD28は、刺激性シグナルを伝達する。細胞内CTLA-4はまた、制御性T細胞においても見出され、それらの機能に重要であり得る。T細胞受容体およびCD28を通したT細胞活性化は、B7分子に対する抑制性受容体であるCTLA-4の発現の増加をもたらす。本開示の阻害剤は、CTLA-4、B7-1、および/またはB7-2活性の1つまたは複数の機能を遮断し得る。いくつかの態様において、阻害剤は、CTLA-4とB7-1との相互作用を遮断する。いくつかの態様において、阻害剤は、CTLA-4とB7-2との相互作用を遮断する。

いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。

本発明の方法における使用に適している抗ヒトCTLA-4抗体（またはそれに由来するVHおよび/もしくはVLドメイン）は、当技術分野において周知の方法を用いて生成することができる。あるいは、当技術分野で認識されている抗CTLA-4抗体を使用することができる。例えば、US 8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504（トレメリムマブ；以前はチシリムマブとしても知られている、CP675,206）、米国特許第6,207,156号；Hurwitz et al., 1998に開示されている抗CTLA-4抗体を、本明細書に開示される方法において使用することができる。前述の刊行物の各々の教示は、参照により本明細書に組み入れられる。CTLA-4に対する結合について当技術分野で認識されているこれらの抗体のいずれかと競合する抗体もまた、使用することができる。例えば、ヒト化CTLA-4抗体は、参照により本明細書にすべて組み入れられる国際特許出願番号WO2001/014424、WO2000/0377504、および米国特許第8,017,114号に記載されている。

本開示の方法および組成物においてチェックポイント阻害剤として有用なさらなる抗CTLA-4抗体は、イピリムマブ（10D1、MDX- 010、MDX- 101、およびYervoy（登録商標）としても知られる）、またはその抗原結合断片およびバリアントである（例えば、WO01/14424を参照されたい）。

いくつかの態様において、阻害剤は、トレメリムマブまたはイピリムマブの重鎖および軽鎖のCDRまたはVRを含む。したがって、1つの態様において、阻害剤は、トレメリムマブまたはイピリムマブのVH領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン、ならびにトレメリムマブまたはイピリムマブのVL領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインを含む。別の態様において、抗体は、結合について上述の抗体と競合し、かつ/または上述の抗体と同じPD-1、B7-1、もしくはB7-2上のエピトープに結合する。別の態様において、抗体は、上述の抗体と少なくとも約70、75、80、85、90、95、97、または99％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の可変領域アミノ酸配列同一性を有する。

2. 共刺激分子の阻害
いくつかの態様において、免疫療法は、共刺激分子の阻害剤を含む。いくつかの態様において、阻害剤は、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、CD28、ICOS、OX40（TNFRSF4）、4-1BB（CD137；TNFRSF9）、CD40L（CD40LG）、GITR（TNFRSF18）の阻害剤、およびそれらの組み合わせを含む。阻害剤には、阻害性抗体、ポリペプチド、化合物、および核酸が含まれる。

3. 樹状細胞療法
樹状細胞療法は、樹状細胞に、リンパ球に対して腫瘍抗原を提示させ、これが、それらを活性化し、抗原を提示する他の細胞を殺傷するようにそれらをプライミングすることによって、抗腫瘍応答を誘発する。樹状細胞は、哺乳動物免疫系における抗原提示細胞（APC）である。がんの処置において、それらは、がん抗原ターゲティングを助ける。樹状細胞に基づく細胞がん療法の1つの例は、sipuleucel-Tである。

腫瘍抗原を提示するように樹状細胞を誘導する1つの方法は、自己腫瘍溶解物または短いペプチド（がん細胞上のタンパク質抗原に対応するタンパク質の小さな部分）でのワクチン接種によるものである。これらのペプチドは、多くの場合、免疫応答および抗腫瘍応答を増加させるために、アジュバント（高度に免疫原性の物質）と組み合わせて与えられる。他のアジュバントには、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）などの、樹状細胞を誘引および/または活性化するタンパク質または他の化学物質が含まれる。

樹状細胞はまた、腫瘍細胞にGM-CSFを発現させることによって、インビボで活性化することができる。これは、GM-CSFを産生するように腫瘍細胞を遺伝子操作すること、またはGM-CSFを発現する腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞に感染させることのいずれかによって、達成することができる。

別の戦略は、患者の血液から樹状細胞を取り出し、それらを体外で活性化することである。樹状細胞は、単一の腫瘍特異的ペプチド/タンパク質または腫瘍細胞溶解物（壊れた腫瘍細胞の溶液）であってもよい、腫瘍抗原の存在下で活性化される。これらの細胞を（任意のアジュバントと共に）注入し、免疫応答を誘発する。

樹状細胞療法は、樹状細胞の表面上の受容体に結合する抗体の使用を含む。抗原を、抗体に加えることができ、樹状細胞が成熟して、腫瘍に対する免疫を提供するように誘導することができる。

4. サイトカイン療法
サイトカインは、腫瘍内に存在する多くのタイプの細胞によって産生されるタンパク質である。それらは、免疫応答を調節することができる。腫瘍は多くの場合、成長し、免疫応答を低減させることを可能にするために、それらを使用する。これらの免疫調節効果により、免疫応答を誘発する薬物としてそれらを用いることが可能になる。一般的に用いられる2つのサイトカインは、インターフェロンおよびインターロイキンである。

インターフェロンは、免疫系によって産生される。それらは通常、抗ウイルス応答に関与しているが、がんについての用途も有する。それらは、3つの群：I型（IFNαおよびIFNβ）、II型（IFNγ）、ならびにIII型（IFNλ）に分類される。

インターロイキンは、数々の免疫系効果を有する。IL-2は、例示的なインターロイキンサイトカイン療法である。

5. 養子T細胞療法
養子T細胞療法は、T細胞の輸注（養子細胞移入）による受動免疫の形態である。それらは、血液および組織において見出され、通常、外来病原体を見出した時に活性化する。具体的には、それらは、T細胞の表面受容体が、その表面抗原上に外来タンパク質の一部を提示する細胞に遭遇した時に活性化する。これらは、感染細胞または抗原提示細胞（APC）のいずれかであることができる。それらは、正常組織において、および腫瘍組織において見出され、そこでは、それらは腫瘍浸潤リンパ球（TIL）として知られている。それらは、腫瘍抗原を提示する樹状細胞などのAPCの存在によって活性化される。これらの細胞は、腫瘍を攻撃することができるが、腫瘍内の環境は、高度に免疫抑制性であり、免疫媒介性の腫瘍死を防ぐ。

腫瘍標的T細胞を製造する、および取得する複数の方法が、開発されてきている。腫瘍抗原に特異的なT細胞は、腫瘍試料（TIL）から取り出すか、または血液から濾過することができる。その後の活性化および培養は、エクスビボで行い、結果を再注入する。腫瘍標的T細胞は、遺伝子治療によって生成することができる。腫瘍標的T細胞は、T細胞を腫瘍抗原に曝露することによって、増大させることができる。

がんの処置は、本明細書に記載されるがんの処置のいずれかを除外してもよいことが企図される。さらに、本開示の態様は、本明細書に記載される治療法について以前に処置されたことがある、本明細書に記載される治療法について現在処置されている、または本明細書に記載される治療法について処置されたことがない患者を含む。いくつかの態様において、患者は、本明細書に記載される治療法に対して抵抗性であると決定されている患者である。いくつかの態様において、患者は、本明細書に記載される治療法に対して感受性であると決定されている患者である。

B. 腫瘍溶解性ウイルス
いくつかの態様において、追加の治療法は、腫瘍溶解性ウイルスを含む。腫瘍溶解性ウイルスとは、がん細胞に優先的に感染し、殺傷するウイルスである。感染したがん細胞は、腫瘍溶解によって破壊されるため、それらは、新たな感染性ウイルス粒子またはビリオンを放出して、残っている腫瘍を破壊するのを手助けする。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞の直接破壊を引き起こすだけではなく、長期の免疫療法のために宿主の抗腫瘍免疫応答を刺激するとも考えられている。

C. 多糖類
いくつかの態様において、追加の治療法は、多糖類を含む。キノコにおいて見出されるある特定の化合物、主として多糖類は、免疫系を上方制御することができ、抗がん特性を有する可能性がある。例えば、レンチナンなどのβ-グルカンは、マクロファージ、NK細胞、T細胞、および免疫系サイトカインを刺激することが実験室の研究において示されており、免疫学的アジュバントとして臨床試験で調査されている。

D. 新生抗原
いくつかの態様において、追加の治療法は、新生抗原変異のターゲティングを含む。多くの腫瘍は、変異を発現する。これらの変異は、潜在的に、T細胞免疫療法における使用のための新たな標的化可能な抗原（新生抗原）を作り出す。がん病変におけるCD8+ T細胞の存在は、RNAシーケンシングデータを用いて特定されるように、高い変異負荷を有する腫瘍において、より高い。ナチュラルキラー細胞およびT細胞の細胞溶解活性に関連する転写産物のレベルは、多くのヒト腫瘍における変異荷重と正の相関がある。

E. 化学療法
いくつかの態様において、追加の治療法は、化学療法を含む。化学療法剤の適しているクラスには、以下が含まれる：（a）アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミン、チオテパ）、アルキルスルホナート（例えば、ブスルファン）、ニトロ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、クロロゾチシン（chlorozoticin）、ストレプトゾシン）、ならびにトリアジン（例えば、ジカルバジン（dicarbazine））、（b）代謝拮抗薬、例えば、葉酸類似体（例えば、メトトレキサート）、ピリミジン類似体（例えば、5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、アザウリジン）、ならびにプリン類似体および関連物質（例えば、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、ペントスタチン）、（c）天然物、例えば、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、テニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、およびミトキサントロン）、酵素（例えば、L-アスパラギナーゼ）、ならびに生物学的応答修飾因子（例えば、インターフェロン-α）、ならびに、（d）種々雑多な剤、例えば、白金配位錯体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）、置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）、メチルヒジアジン（methylhydiazine）誘導体（例えば、プロカルバジン）、ならびに副腎皮質抑制薬（例えば、taxolおよびミトタン）。いくつかの態様において、シスプラチンは、特に適している化学療法剤である。

シスプラチンは、例えば、転移性精巣がんもしくは卵巣がん、進行性膀胱がん、頭頸部がん、子宮頸がん、肺がん、または他の腫瘍などのがんを処置するために、広く使用されている。シスプラチンは、経口で吸収されず、したがって、例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、または腹腔内注射などの他の経路を介して送達しなければならない。シスプラチンは、単独で、または他の剤との組み合わせで使用することができ、ある特定の態様において企図される合計で3つのコースにわたって、3週間ごとに5日間の約15 mg/m2～約20 mg/m2を含む効果的な用量が、臨床応用において使用される。いくつかの態様において、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたEgr-1プロモーターを含む構築物と共に、細胞および/または対象に送達されるシスプラチンの量は、シスプラチンを単独で使用する時に送達される量よりも少ない。

他の適している化学療法剤には、抗微小管剤、例えば、パクリタキセル（「Taxol」）および塩酸ドキソルビシン（「ドキソルビシン」）が含まれる。アデノウイルスベクターを介して送達されるEgr-1プロモーター/TNFα構築物とドキソルビシンとの組み合わせは、化学療法および/またはTNF-αに対する抵抗性を克服するのに有効であると判定され、これは、構築物とドキソルビシンとの併用処置が、ドキソルビシンおよびTNF-αの両方に対する抵抗性を克服することを示唆する。

ドキソルビシンは、吸収が不十分であり、好ましくは、静脈内投与される。ある特定の態様において、成人に対する適切な静脈内用量は、約21日間隔での約60 mg/m2～約75 mg/m2、または約3週間から約4週間の間隔で反復される、連続した2日もしくは3日の各々の約25 mg/m2～約30 mg/m2、または1週間に1回の約20 mg/m2を含む。以前の化学療法もしくは新生物性骨髄浸潤によって引き起こされた以前の骨髄抑制がある場合、または薬物が他の骨髄造血抑制薬と組み合わされる場合は、最低用量が、高齢患者において使用されるべきである。

ナイトロジェンマスタードは、本開示の方法において有用な、別の適している化学療法剤である。ナイトロジェンマスタードには、メクロレタミン（HN2）、シクロホスファミドおよび/またはイホスファミド、メルファラン（L-サルコリシン）、ならびにクロラムブシルが含まれ得るが、それらに限定されない。シクロホスファミド（CYTOXAN（登録商標））は、Mead Johnsonから入手可能であり、NEOSTAR（登録商標）は、Adriaから入手可能であり、別の適している化学療法剤である。成人に適している経口用量は、例えば、約1 mg/kg/日～約5 mg/kg/日を含み、静脈内用量は、例えば、最初に、約2日から約5日の期間にわたる分割用量での約40 mg/kg～約50 mg/kg、または約7日から約10日ごとの約10 mg/kg～約15 mg/kg、または1週間に2回の約3 mg/kg～約5 mg/kg、または約1.5 mg/kg/日～約3 mg/kg/日を含む。有害な胃腸効果のために、静脈内経路が好ましい。薬物はまた、時には、浸潤によって筋肉内に、または体腔中に投与される。

追加の適している化学療法剤には、ピリミジン類似体、例えば、シタラビン（シトシンアラビノシド）、5-フルオロウラシル（フルオウラシル（fluouracil）；5-FU）、およびフロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン；FudR）が含まれる。5-FUは、約7.5から約1000 mg/m2のどこかの投薬量で対象に投与されてもよい。さらに、5-FU投薬スケジュールは、様々な期間、例えば、最大で6週間、または本開示が関係する当業者によって決定される通りであってもよい。

別の適している化学療法剤であるゲムシタビン二リン酸（GEMZAR（登録商標）、Eli Lilly & Co.、「ゲムシタビン」）は、進行性および転移性膵臓がんの処置に推奨され、したがって、これらのがんに対して本開示において同様に有用であろう。

患者に送達される化学療法剤の量は、可変であり得る。1つの適している態様において、化学療法が構築物と共に投与される場合、化学療法剤は、宿主においてがんの停止または退縮を引き起こすのに有効な量で投与されてもよい。他の態様において、化学療法剤は、化学療法剤の化学療法有効用量よりも2から10,000倍少ない量で投与されてもよい。例えば、化学療法剤は、化学療法剤の化学療法有効用量よりも約20倍少ない、約500倍少ない、またはさらには約5000倍少ない量で投与されてもよい。本開示の化学療法薬は、構築物との組み合わせでの所望の治療活性について、および有効投薬量の決定について、インビボで試験することができる。例えば、そのような化合物は、ヒトにおいて試験する前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどを含むがそれらに限定されない、適している動物モデル系において試験することができる。実施例に記載されるように、インビトロ試験がまた、適している組み合わせおよび投薬量を決定するために用いられてもよい。

F. 放射線療法
いくつかの態様において、追加の治療法または以前の治療法は、電離放射線などの放射線照射を含む。本明細書において用いられる場合、「電離放射線」は、十分なエネルギーを有するか、または電離（電子の獲得もしくは喪失）を生じるために核相互作用を介して十分なエネルギーを生じることができる、粒子または光子を含む放射線を意味する。例示的な、かつ好ましい電離放射線は、x線照射である。標的組織または細胞にx線照射を送達するための手段は、当技術分野において周知である。

いくつかの態様において、電離放射線の量は、20 Gyより大きく、1回の線量で投与される。いくつかの態様において、電離放射線の量は、18 Gyであり、3回の線量で投与される。いくつかの態様において、電離放射線の量は、少なくとも2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは40 Gy、多くとも2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは40 Gy、または正確に2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは40 Gy（またはその中の任意の導き出せる範囲）である。いくつかの態様において、電離放射線は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10回、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10回、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10回の線量（またはその中の任意の導き出せる範囲）で投与される。1回よりも多い線量が投与される場合、線量は、約1、4、8、12、もしくは24時間、または1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、もしくは16週間離れていてもよく、またはその中の任意の導き出せる範囲であってもよい。

いくつかの態様において、IRの量は、IRの総線量として提示されてもよく、次いで、それが分割線量で投与される。例えば、いくつかの態様において、総線量は、50 Gyであり、各々5 Gyの10回の分割線量で投与される。いくつかの態様において、総線量は、50～90 Gyであり、各々2～3 Gyの20～60回の分割線量で投与される。いくつかの態様において、IRの総線量は、少なくとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、もしくは150、多くとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、もしくは150、または約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、もしくは150（またはその中の任意の導き出せる範囲）である。いくつかの態様において、総線量は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50 Gy、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50 Gy、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50 Gy（またはその中の任意の導き出せる範囲）の分割用量で投与される。いくつかの態様において、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40,41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100回、多くとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40,41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100回、または正確に2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40,41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100回の分割用量が投与される（またはその中の任意の導き出せる範囲）。いくつかの態様において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12回、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12回、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12回（またはその中の任意の導き出せる範囲）の分割用量が、1日あたりに投与される。いくつかの態様において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30回、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30回、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30回（またはその中の任意の導き出せる範囲）の分割用量が、1週あたりに投与される。

G. 手術
がんを有する人のおよそ60％は、予防的、診断的または病期分類、治癒的、および対症的な手術を含む、いくつかのタイプの手術を受けるであろう。治癒的手術は、がん性組織のすべてまたは一部が物理的に除去され、摘出され、かつ/または破壊される切除を含み、本態様の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法、および/または代替療法などの、他の治療法と共に用いられてもよい。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。手術による処置には、腫瘍切除に加えて、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡制御手術（モース手術）が含まれる。

がん性細胞、組織、または腫瘍の一部またはすべての摘出時には、身体に空洞が形成される可能性がある。処置は、灌流、直接注射、または追加の抗がん療法での領域の局所適用によって達成されてもよい。そのような処置は、例えば、1、2、3、4、5、6、もしくは7日ごと、または1、2、3、4、および5週間ごと、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12か月ごとに繰り返されてもよい。これらの処置は、同様に変動する投与量のものであってもよい。

H. 他の剤
処置の治療効力を改善するために、他の剤が、本態様のある特定の局面と組み合わせて使用されてもよいことが企図される。これらの追加の剤には、細胞表面受容体およびギャップ結合の上方制御に影響を及ぼす剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる剤、または他の生物学的剤が含まれる。ギャップ結合の数を増やすことによる細胞間シグナル伝達の増加は、近隣の過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増加させるであろう。他の態様において、細胞増殖抑制剤または分化剤を、処置の抗過剰増殖効力を改善するために、本態様のある特定の局面と組み合わせて使用することができる。細胞接着の阻害剤は、本態様の効力を改善するために企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着班キナーゼ（FAK）阻害剤およびロバスタチンである。抗体c225などの、アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる他の剤が、処置効力を改善するために、本態様のある特定の局面と組み合わせて使用され得ることが、さらに企図される。

VII. 薬学的組成物
本開示は、その必要がある対象において疾患を処置するため、および免疫応答を調節するための方法を含む。本開示は、免疫応答を誘導するかまたは改変するために使用され得る薬学的組成物の形態であってもよい、細胞を含む。

本開示による組成物の投与は、典型的には、任意の一般的な経路を介する。これには、非経口、同所性、皮内、皮下、経口、経皮、筋肉内、腹腔内（intraperitoneal）、腹腔内（intraperitoneally）、眼窩内、移植による、吸入による、脳室内、鼻腔内、または静脈内注射が含まれるが、それらに限定されない。いくつかの態様において、本開示の組成物（例えば、治療用受容体を発現する細胞を含む組成物）は、静脈内注射を介して投与される。

典型的には、本開示の組成物および治療法は、剤形と適合性の様式で、および治療的に有効であり、かつ免疫改変性であるような量で投与される。投与される量は、処置される対象に依存する。投与される必要のある有効成分の正確な量は、実施者の判断に依存する。

適用の様式は、大幅に変動してもよい。細胞成分を含む薬学的組成物の投与のための従来の方法のいずれかが、適用可能である。薬学的組成物の投薬量は、投与の経路に依存し、対象のサイズおよび健康に応じて変動する。

多くの例において、多くとも約3、4、5、6、7、8，9、10回、もしくはそれよりも多く、または少なくとも約3、4、5、6、7、8、9、10回、もしくはそれよりも多くの、複数投与を有することが望ましいであろう。投与は、2日から12週間の間隔、より一般的には1から2週間の間隔の範囲であってもよい。投与の経過は、アロ反応性免疫応答およびT細胞活性のアッセイによって追跡されてもよい。

「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という句は、動物またはヒトに投与された時に、有害な、アレルギー性の、または他の不適当な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される担体」には、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または剤が、有効成分と不適合である場合を除いて、免疫原性組成物および治療用組成物におけるその使用が企図される。本開示の薬学的組成物は、薬学的に許容される組成物である。

本開示の組成物は、非経口投与のために製剤化することができ、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、またはさらに腹腔内経路を介した注射のために製剤化することができる。典型的には、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能物質として調製することができ、調製物はまた、乳剤にすることもできる。

注射可能な使用に適している薬学的形態には、滅菌の水溶液または分散液；ゴマ油、落花生油、または水性プロピレングリコールを含む製剤が含まれる。それはまた、製造および保管の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。

滅菌注射可能溶液は、必要とされる量の活性成分（すなわち、本開示の細胞）を、上記に列挙された様々な他の成分と共に適切な溶媒を組み込み、必要に応じて、続いて濾過滅菌を行うことによって、調製される。概して、分散液は、様々な滅菌された有効成分を、基本的な分散媒および上記に列挙されたものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって、調製される。

組成物の有効量は、意図された目標に基づいて決定される。「単位用量」または「投薬量」という用語は、対象における使用に適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路およびレジメンに関連して、本明細書で議論される所望の応答を生じるように計算された組成物のあらかじめ決定された量を含有する。投与される量は、処置の数および単位用量の両方に応じて、所望の結果および/または防護に依存する。組成物の正確な量はまた、実施者の判断に依存し、各個体に特有である。用量に影響を及ぼす要因には、対象の身体的および臨床的状態、投与の経路、処置の意図された目標（症状の緩和対治癒）、ならびに特定の組成物の力価、安定性、および毒性が含まれる。製剤化時に、溶液は、剤形と適合性の様式で、および治療的または予防的に有効であるような量で投与される。製剤は、上記の注射可能溶液のタイプなどの、多様な剤形で容易に投与される。

本開示の組成物および関連した方法、特に、本開示の組成物の投与はまた、本明細書に記載される追加の治療薬などの追加の治療法の投与と組み合わせて、または当技術分野において公知の他の伝統的な治療薬と組み合わせて、使用されてもよい。

本明細書に開示される治療用組成物および処置は、数分から数週間の範囲の間隔で、別の処置または剤に先行し、それと同時であり、かつ/またはそれに続いてもよい。剤が細胞、組織、または生物に別々に適用される態様においては、概して、治療剤が細胞、組織、または生物に対して有利に組み合わされた効果を依然として発揮できるように、各送達の時間の間に有意な期間が満了しなかったことを確実にする。例えば、そのような例において、細胞、組織、または生物を、2つ、3つ、4つ、またはそれよりも多い剤または処置と実質的に同時に（すなわち、約1分未満以内に）接触させてもよいことが企図される。他の局面において、1つまたは複数の治療剤または処置は、別の治療剤または処置を投与する前および/または後の1分、5分、10分、20分、30分、45分、60分、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、22時間、23時間、24時間、25時間、26時間、27時間、28時間、29時間、30時間、31時間、32時間、33時間、34時間、35時間、36時間、37時間、38時間、39時間、40時間、41時間、42時間、43時間、44時間、45時間、46時間、47時間、48時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、または8週間、またはそれよりも長く、およびその中の任意の導き出せる範囲以内に、投与されるかまたは提供されてもよい。

処置は、様々な「単位用量」を含んでもよい。単位用量は、あらかじめ決定された量の治療用組成物を含有するとして定義される。投与される量、ならびに特定の経路および製剤は、臨床分野におけるそれらの決定の技能内である。単位用量は、単回注射として投与される必要はなく、設定期間にわたる連続注入を含んでもよい。いくつかの態様において、単位用量は、単一の投与可能な用量を含む。

投与される量は、処置の数および単位用量の両方に応じて、所望の処置効果に依存する。有効用量は、特定の効果を達成するために必要な量を指すと理解される。ある特定の態様における実施において、10 mg/kgから200 mg/kgの範囲の用量が、これらの剤の防護能力に影響を及ぼし得ることが企図される。したがって、用量には、約0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、および200、300、400、500、1000μg/kg、mg/kg、μg/日、またはmg/日、またはその中の任意の導き出せる範囲の用量が含まれることが企図される。さらに、そのような用量は、1日の間に複数回、および/または複数の日、週、もしくは月に投与することができる。

いくつかの態様において、ヒトに投与される、抗体および/または微生物モジュレーターなどの免疫チェックポイント阻害剤の治療的に有効または十分な量は、1回の投与によろうとまたは複数の投与によろうと、約0.01～約50 mg/kg患者体重の範囲であろう。いくつかの態様において、使用される治療法は、例えば、毎日投与される、約0.01～約45 mg/kg、約0.01～約40 mg/kg、約0.01～約35 mg/kg、約0.01～約30 mg/kg、約0.01～約25 mg/kg、約0.01～約20 mg/kg、約0.01～約15 mg/kg、約0.01～約10 mg/kg、約0.01～約5 mg/kg、または約0.01～約1 mg/kgである。1つの態様において、本明細書に記載される治療法は、21日サイクルの1日目に、約100 mg、約200 mg、約300 mg、約400 mg、約500 mg、約600 mg、約700 mg、約800 mg、約900 mg、約1000 mg、約1100 mg、約1200 mg、約1300 mg、または約1400 mgの用量で対象に投与される。用量は、注入などの、単一用量としてまたは複数用量（例えば、2回または3回の用量）として、投与されてもよい。この治療法の進行は、従来の技法によって容易にモニターされる。

ある特定の態様において、薬学的組成物の有効用量は、約1μM～150μMの血中レベルを提供することができるものである。別の態様において、有効用量は、約4μM～100μM；または約1μM～100μM；または約1μM～50μM；または約1μM～40μM；または約1μM～30μM；または約1μM～20μM；または約1μM～10μM；または約10μM～150μM；または約10μM～100μM；または約10μM～50μM；または約25μM～150μM；または約25μM～100μM；または約25μM～50μM；または約50μM～150μM；または約50μM～100μM（またはその中の任意の導き出せる範囲）の血中レベルを提供する。他の態様において、用量は、対象に投与される治療剤から結果として生じる、剤の以下の血中レベルを提供することができる：約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100μM、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100μM、または多くとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100μM、またはその中の任意の導き出せる範囲。ある特定の態様において、対象に投与される治療剤は、体において代謝されて、代謝された治療剤になり、その場合、血中レベルはその剤の量を指してもよい。あるいは、治療剤が対象によって代謝されない範囲まで、本明細書で議論される血中レベルは、代謝されていない治療剤を指してもよい。

治療用組成物の正確な量はまた、実施者の判断に依存し、各個体に特有である。用量に影響を及ぼす要因には、患者の身体的および臨床的状態、投与の経路、処置の意図された目標（症状の緩和対治癒）、ならびに対象が受けている可能性がある特定の治療物質または他の治療法の力価、安定性、および毒性が含まれる。

μg/kg体重またはmg/kg体重の投薬量単位は、4μM～100μMなどの、μg/mlまたはmM（血中レベル）の比較可能な濃度単位に変換され、表現され得ることが、当業者によって理解され、承知されるであろう。取り込みは、種および器官/組織に依存することもまた、理解される。取り込みおよび濃度測定に関してなされる適用可能な変換係数および生理学的仮定は、周知であり、当業者が、1つの濃度測定値を別のものに変換し、本明細書に記載される用量、効力、および結果に関して合理的な比較および結論を出すことを可能にする。

VIII. 配列
本開示の方法および組成物において有用な例となるキメラポリペプチドおよびCAR分子のアミノ酸配列を、以下の表1に提供する。

（表１）CAR

本開示のTYRP-1結合領域の例となるCDRの態様は、以下の表2に提供されるものを含む。

（表２）TYRP-1結合領域のCDR

本開示の方法および組成物において有用な追加のポリペプチド、ドメイン、および領域を、以下の表3に提供する。

（表３）本開示の態様において有用なポリペプチドドメイン

IX. 実施例
以下の実施例は、本開示の好ましい態様を実証するために含まれる。以下に続く実施例に開示される技法は、本開示の実施において良好に機能することが本発明者によって発見された技法を表し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成するとみなされ得ることが、当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、開示される具体的な態様において多くの変更を行うことができ、依然として同様のまたは類似した結果を得ることができると、認識するべきである。実施例は、決して限定するものとして解釈されるべきではない。すべての引用される参考文献（本出願を通して引用されるような文献の参考文献、発行された特許、公開された特許出願、およびGenBankアクセッション番号を含む）の内容は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。参照により本明細書に組み入れられる文書における用語の定義が、本明細書において用いられるものと矛盾する場合は、本明細書において用いられる定義が支配する。

実施例1：異なるレベルのTYRP-1発現を有するヒト黒色腫細胞株のパネルにおけるインビトロ細胞傷害性
ヒトPBMCを、活性化して、20D7SS（SEQ ID NO:1）、20D7SM（SEQ ID NO:2）、または20D7SL（SEQ ID NO:3）CAR構築物のいずれかをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。T細胞を5日間増大させ、続いて、5:1、1:1、または1:5のT細胞産物対黒色腫細胞（P:T）の比を用いて、黒色腫細胞単層と共培養した。形質導入していないT細胞（モック）または培地のみにおいて培養した黒色腫細胞（RPMI）を、対照として用いた。用いた黒色腫細胞株は、核RFP（nRFP）を安定して発現する。細胞傷害性を測定するために、nRFPのパーセンテージを経時的に追跡した。高いTYRP-1発現を有する黒色腫細胞であるM285、M230、M249、およびM207についての結果を、図1Aに示す。試験したCAR構築物の少なくとも1つは、測定した比の各々（5:1、1:1、および1:5）で、4つの細胞株すべてにおいて黒色腫細胞の生存率を低減させるのに有効であった。低いTYRP-1発現を有する黒色腫細胞であるM202およびM229についての結果を、図1Bに示す。平均値±SDを、グラフに示す。

実施例2：異なるレベルのTYRP-1発現を有するヒト黒色腫細胞株のパネルとの共培養時の、T細胞によるインビトロサイトカイン分泌
ヒトPBMCを、活性化して、20D7SS（SEQ ID NO:1）、20D7SM（SEQ ID NO:2）、または20D7SL（SEQ ID NO:3）CAR構築物のいずれかをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。T細胞を5日間増大させ、続いて、5:1、1:1、または1:5のT細胞産物対黒色腫細胞（P:T）の比を用いて、黒色腫細胞単層と共培養した。形質導入していないT細胞（モック）を、対照として用いた。共培養の24時間後に、上清を収集し、ELISAによってIFNγ分泌を定量化した。追加の対照として、IFNγの分泌をまた、標的黒色腫細胞の非存在下で測定した（RPMI、T細胞のみの対照）。すべての細胞についての結果を、図2に示す。平均値±SDを、グラフに示す。*は、多重比較のためのHolm-Sidak補正を伴うt検定を用いて、モックT細胞に対してp＜0.05を示す。試験した各比（5:1、1:1、および1:5）について、図2は、左から右に、モック細胞、20D7SS、20D7SM、20D7SL、およびRPMIでの処理由来のIFNγ分泌を示す。

実施例3：マウス黒色腫細胞株におけるインビトロ細胞傷害性およびサイトカイン分泌
C57/B6マウスを安楽死させ、それらの脾臓を収集して、CD3+ T細胞を、精製し、CD3/28ビーズおよびインターロイキン-2（IL2）で活性化した。活性化の24時間後に、T細胞を、20D7SS（SEQ ID NO:1）、20D7SM（SEQ ID NO:2）、または20D7SL（SEQ ID NO:3）CAR構築物のいずれかをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。T細胞を6日間増大させ、続いて、5:1、1:1、または1:5のT細胞産物対黒色腫細胞（P:T）の比を用いて、B16-F10黒色腫単層と共培養した。形質導入していないT細胞（モック）または細胞培養培地のみ（RPMI）を、対照として用いた。T細胞の細胞傷害性を、経時的にnRFPコンフルエンスのパーセンテージによって測定し；これらの結果を、図3Aに示す。すべての3つのCAR構築物での処理は、3つの比すべて（5:1、1:1、および1:5）で、モックまたはRPMI処理と比べて、低減した細胞生存率を結果としてもたらした。B16-F10細胞株は、nRFPを構成的に発現するように以前に改変されていた。共培養の24時間後に、ELISAによってIFNγの存在を定量化した。追加の対照として、IFNγの分泌をまた、標的黒色腫細胞の非存在下で測定した（RPMI、T細胞のみの対照）。これらの結果を、図3Bに示す。すべての3つのCAR構築物での処理は、3つの比すべて（5:1、1:1、および1:5）で、IFNγを刺激したが、対照処理は刺激しなかった。平均値±SDを、グラフに示す。

実施例4：免疫適格性マウスモデルにおける20D7SS、20D7SM、および20D7SL CAR構築物のインビボ抗腫瘍活性
C57/B6マウス由来のマウスT細胞を、実施例3に記載されるように精製し、形質導入して、増大させた。形質導入の4日後に、20D7SS（SEQ ID NO:1）、20D7SM（SEQ ID NO:2）、または20D7SL（SEQ ID NO:3）CAR構築物のいずれかをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した500万個のT細胞を、B16-F10メラノーマ腫瘍を有するC57/B6マウス中に静脈内投与した。形質導入していないT細胞（モック）またはPBSを、対照として用いた。マウスを、T細胞投与の前日に、リンパ球枯渇全身照射（500cGy）でプレコンディショニングした。3用量の50,000 IU/マウスのヒトIL2を、T細胞移入後0、1、および2日目に投与した。腫瘍体積を、キャリパーを用いて経時的に追跡した。結果を、図4に示す。平均値±SDを、グラフに示す。多重比較のためのTukey補正を伴う二元配置分散分析を用いて、20D7SL CAR処置群と比較して、*** p＜0.001、**** p＜0.0001。20D7SLを発現する細胞での処置は、対照処置と比べて、このモデルにおいて腫瘍成長を有意に遅らせた。

実施例5：免疫適格性マウスモデルにおける20D7SL CAR構築物のインビボ抗腫瘍活性
C57/B6マウス由来のマウスT細胞を、実施例3に記載されるように精製し、形質導入して、増大させた。形質導入の4日後に、20D7SL（SEQ ID NO:3）CAR構築物をコードするレトロウイルスベクターで形質導入した500万（5M）個または1000万（10M）個のT細胞を、B16-F10メラノーマ腫瘍を有するC57/B6マウス中に静脈内投与した。形質導入していないT細胞（モック）またはPBSを、対照として用いた。マウスを、T細胞投与の前日に、リンパ球枯渇全身照射（500cGy）でプレコンディショニングした。3用量の50,000 IU/マウスのヒトIL2を、T細胞移入後0、1、および2日目に投与した。腫瘍体積を、キャリパーを用いて経時的に追跡した。結果を、図5に示す。平均値±SDを、グラフに示す。多重比較のためのTukey補正を伴う二元配置分散分析を用いて、モック5M処置群と比較して、**** p＜0.0001、モック10M処置群と比較して、#### p＜0.0001。20D7SLを発現する5Mおよび10M両方の細胞での処置は、対照処置と比べて、このモデルにおいて腫瘍成長を有意に遅らせた。

実施例6：免疫適格性マウスモデルにおける20D7SL CAR構築物の、単独または標準的なIL-2処置との組み合わせでのインビボ抗腫瘍活性
C57/B6マウス由来のマウスT細胞を、精製し、活性化し、形質導入して、5日間増大させた。形質導入の4日後に、20D7SL CAR構築物をコードするレトロウイルスベクターで形質導入した1000万個のT細胞を、B16-F10メラノーマ腫瘍を有するC57/B6マウス中に静脈内投与した。形質導入していないT細胞（モック）またはPBSを、対照として用いた。マウスを、T細胞投与の前日に、リンパ球枯渇全身照射（500cGy）でプレコンディショニングした。3用量の50,000 IU/マウスのヒトIL2を、示された群においてT細胞移入後0、1、および2日目に投与した。腫瘍体積を、キャリパーを用いて経時的に追跡した（平均値±SDを、グラフに示す）。結果を、図6に示す。多重比較のためのHolm-Sidak補正を伴う独立t検定で、モックに対して、* p＜0.05；モック＋IL2に対して、# p＜0.05。IL-2を伴うおよび伴わない、20D7SLを発現する細胞での処置は、対照処置と比べて、このモデルにおいて腫瘍成長を有意に遅らせた。

実施例7：免疫不全マウスモデルでの患者由来黒色腫モデルにおける20D7SL CAR Tのインビボ抗腫瘍活性
ヒトPBMCを、活性化し、20D7SL CARを発現するレトロウイルスベクターで形質導入して、9日間増大させた。20D7SL CAR構築物をコードするレトロウイルスベクターで形質導入した1000万個のT細胞を、M207（図7A）およびM249（図7B）皮下腫瘍を有するNSGマウス中に静脈内投与した。CD19 CAR-T細胞またはビヒクルのみを、陰性対照として用いた。腫瘍体積を、キャリパーを用いて経時的に追跡した（平均値±SDを、グラフに示す）。結果を、図7A（M207細胞）および図7B（M249細胞）に示す。多重比較のためのHolm-Sidak補正を伴う独立t検定で、PBSに対して、* p＜0.05；CD19 CAR-T細胞に対して、# p＜0.05。

実施例8：TYRP-1が陰性発現のヒト非黒色腫細胞株のパネルにおける20D7SL CAR構築物の経時的なインビトロ細胞傷害性
ヒトPBMCを、活性化し、20D7SL-28z CAR構築物（CD28共刺激シグナル伝達ドメインを含む）または20D7SL-BBZ構築物（4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインを含む）のいずれかをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。これらの細胞を、9日間増大させた。CAR-T細胞および対照を、1:1のT細胞産物対腫瘍細胞の比を用いて、A549（図8A、肺腺がん）、UPS-03（図8B、肉腫）、およびUPS-04（図8C、肉腫）細胞と共培養した。形質導入していないT細胞（モック）または細胞培養培地のみ（RPMI）を、対照として用いた。これらの非メラノーマ腫瘍細胞株は、核RFP（nRFP）を安定して発現する。細胞傷害性を測定するために、nRFPのパーセンテージを経時的に追跡した。結果を、図8A～8Cに示す。平均値±SDを、グラフに示す。生存率は、TYRP-1が陰性発現の細胞株において低減しなかった。

実施例9：TYRP-1ノックアウト細胞株との共培養時の、インビトロサイトカイン分泌および細胞傷害性の喪失
ヒトPBMCを、活性化し、CD28共刺激シグナル伝達ドメインを有する20D7SL CAR構築物をコードするレンチウイルスベクターで形質導入して、9日間増大させた。CAR-T細胞および対照を、5:1のT細胞産物対黒色腫細胞の比を用いて、M285ヒト黒色腫細胞株野生型（TYRP-1が高発現）またはM285-TYRP-1ノックアウト細胞株と共培養した。形質導入していないT細胞（モック）を、対照として用いた。共培養の24時間後に、上清を収集し、ELISAによってIFNγ分泌を定量化した（図9A）。細胞傷害性を経時的に測定した（図9B）。これらのメラノーマ腫瘍細胞株は、核RFP（nRFP）を安定して発現する。細胞傷害性を測定するために、nRFPのパーセンテージを経時的に追跡した。結果を、図9A～9Bに示す。平均値±SDを、グラフに示す。CAR-T細胞での処理は、TYPR-1発現細胞においてIFNγ発現を刺激し、腫瘍細胞成長を阻害した。

実施例10：異なる共刺激シグナル伝達ドメインを有する20D7SL CAR-T細胞のインビトロ抗腫瘍活性
ヒトPBMCを、活性化し、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインを有する20D7SL CAR構築物（20D7SL-BBZ）またはCD28共刺激シグナル伝達ドメインを有する20D7SL CAR構築物（20D7SL-28z）のいずれかをコードするレンチウイルスベクターで形質導入して、9日間増大させた。CAR-T細胞および対照を、5:1のT細胞産物対黒色腫細胞の比を用いて、TYRP-1が高発現の黒色腫細胞株のパネルと共培養した。形質導入していないT細胞（モック）を、対照として用いた。共培養の24時間後に、上清を収集し、ELISAによってIFNγ分泌を定量化した（図10A）。追加の対照として、インターフェロン-γの分泌をまた、標的黒色腫細胞の非存在下で測定した（RPMI、T細胞のみの対照）。成長阻害のパーセンテージを、共培養の48時間後に測定した（図10B）。これらのメラノーマ腫瘍細胞株は、核RFP（nRFP）を安定して発現する。細胞傷害性を測定するために、nRFPのパーセンテージを経時的に追跡した。腫瘍成長阻害のパーセンテージを計算するために、CAR-T細胞で処理した腫瘍細胞単層におけるnRFPのパーセンテージを、形質導入していないT細胞で処理した腫瘍細胞単層におけるnRFPのパーセンテージに対して正規化した。結果を、図10Aおよび10Bに示す。平均値±SDおよび単一の値を、グラフに示す。20D7SL-BBZおよび20D7SL-28zは両方とも、IFNγ分泌を刺激し、腫瘍細胞成長を阻害した。

実施例11：免疫不全マウスモデルでの患者由来黒色腫モデルにおける、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを有する20D7SL CAR Tのインビボ抗腫瘍活性
ヒトPBMCを、活性化し、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインを有する20D7SL CAR構築物（20D7SL-BBZ）またはCD28共刺激シグナル伝達ドメインを有する20D7SL CAR構築物（20D7SL-28z）のいずれかをコードするレンチウイルスベクターで形質導入して、9日間増大させた。レンチウイルスベクターで形質導入した1000万個のT細胞を、M230（図11A）およびM249（図11B）皮下腫瘍を有するNSGマウス中に静脈内投与した。腫瘍体積を、キャリパーを用いて経時的に追跡した（平均値±SDを、グラフに示す）。形質導入していないT細胞またはビヒクルを、陰性対照として用いた。結果を、図11Aおよび図11Bに示す。多重比較のためのHolm-Sidak補正を伴う独立t検定で、PBSに対して、* p＜0.05；形質導入していないT細胞に対して、# p＜0.05。20D7SL-BBZおよび20D7SL-28zは両方とも、腫瘍成長を阻害した。

実施例12：TCGAデータセット、ならびにBMS-CA029およびMK3475-001臨床試験データセットを組み合わせた、すべての患者におけるTYRP-1発現
様々なデータベース由来のTYRP-1発現データを解析した。図12Aは、すべての黒色腫患者についてのTYRP-1発現を示し、図12Bは、末端黒色腫患者についてのTYRP-1発現を示す。図12Cは、粘膜黒色腫患者についてのTYRP-1発現を示す。図12Dは、ブドウ膜黒色腫患者についてのTYRP-1発現を示す。灰色の点線は、陽性のTYRP-1発現（≧1 Log2 FPKM）および高いTYRP発現（≧7 Log2 FPKM）を示す。

本明細書において開示され、特許請求される方法のすべては、本開示に照らして過度の実験なしで作製し、実行することができる。本開示の組成物および方法を、好ましい態様に関して説明してきたが、本開示の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される方法に、および方法の工程においてまたは方法の工程の順序において、変形が適用されてもよいことが、当業者には明らかであろう。より具体的には、同じかまたは類似した結果が達成される限り、化学的にかつ生理学的に関連するある特定の剤が、本明細書に記載される剤の代わりに用いられてもよいことが、明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似した置換および改変はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本開示の精神、範囲、および概念の内であると考えられる。

本出願において列挙される参考文献は、本明細書に示されるものを補足する例示的な手順のまたは他の詳細を提供する程度まで、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。

参考文献
以下の参考文献および本明細書を通して参照される刊行物は、本明細書に示されるものを補足する例示的な手順のまたは他の詳細を提供する程度まで、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。

Claims

（a）（i）SEQ ID NO:10と少なくとも90％の配列同一性を有する可変重鎖（VH）領域、および
（ii）SEQ ID NO:5と少なくとも90％の配列同一性を有する可変軽鎖（VL）領域
を含む、抗原結合ドメイン；
（b）膜貫通ドメイン；ならびに
（c）細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む、キメラポリペプチド。
（a）（i）SEQ ID NO:11（HCDR1）と、SEQ ID NO:12（HCDR2）と、SEQ ID NO:13（HCDR3）とを含む可変重鎖（VH）領域、および
（ii）SEQ ID NO:6（LCDR1）と、SEQ ID NO:7（LCDR2）と、SEQ ID NO:8（LCDR3）とを含む可変軽鎖（VL）領域
を含む、抗原結合ドメイン；
（b）膜貫通ドメイン；ならびに
（c）細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む、キメラポリペプチド。
前記VH領域およびVL領域が、リンカーによって隔てられている、請求項1または2記載のキメラポリペプチド。
前記リンカーが4～40アミノ酸長である、請求項1～3のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
前記リンカーが(G₄S)_n配列を含み、ここで、nが1、2、3、4、5、または6である、請求項4記載のキメラポリペプチド。
前記リンカーが(EAAAK)_n配列を含み、ここで、nが1、2、3、4、5、または6である、請求項4記載のキメラポリペプチド。
前記リンカーがSEQ ID NO:9を含む、請求項4記載のキメラポリペプチド。
シグナルペプチドをさらに含む、請求項1～7のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
前記シグナルペプチドがマウスκ鎖シグナルペプチドである、請求項8記載のキメラポリペプチド。
前記シグナルペプチドがSEQ ID NO:4を含む、請求項9記載のキメラポリペプチド。
前記膜貫通ドメインが、T細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、またはCD28、CD3ε（イプシロン）、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137、もしくはCD154由来の膜貫通ドメインである、請求項1～10のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
前記膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインである、請求項11記載のキメラポリペプチド。
前記膜貫通ドメインがSEQ ID NO:17を含む、請求項11または12記載のキメラポリペプチド。
前記細胞内シグナル伝達ドメインが一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項1～13のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
前記一次シグナル伝達ドメインがCD3ζ（ゼータ）シグナル伝達ドメインである、請求項14記載のキメラポリペプチド。
前記一次シグナル伝達ドメインがSEQ ID NO:19を含む、請求項14または15記載のキメラポリペプチド。
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメインをさらに含む、請求項14～16のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
前記共刺激ドメインが、4-1BB（CD137）、CD28、IL-15Rα、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、またはICOS（CD278）由来のシグナル伝達ドメインを含む、請求項17記載のキメラポリペプチド。
前記共刺激ドメインがCD28シグナル伝達ドメインを含む、請求項18記載のキメラポリペプチド。
前記共刺激ドメインがSEQ ID NO:18を含む、請求項17～19のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
前記共刺激ドメインが4-1BBシグナル伝達ドメインを含む、請求項18記載のキメラポリペプチド。
前記共刺激ドメインがSEQ ID NO:70を含む、請求項21記載のキメラポリペプチド。
前記VH領域が、VL領域と比べてキメラポリペプチドのアミノ末端により近い、請求項1～22のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
前記VL領域が、VH領域と比べてキメラポリペプチドのアミノ末端により近い、請求項1～22のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
前記抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインが、ヒンジ領域によって隔てられている、請求項1～24のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
前記ヒンジ領域が、IgG4ヒンジ、CD8αヒンジ、IgG1ヒンジ、またはCD34ヒンジを含む、請求項25記載のキメラポリペプチド。
前記ヒンジ領域が8～50アミノ酸長である、請求項25または26記載のキメラポリペプチド。
前記ヒンジ領域が10～15アミノ酸長である、請求項27記載のキメラポリペプチド。
前記ヒンジ領域がSEQ ID NO:14を含む、請求項28記載のキメラポリペプチド。
前記ヒンジ領域が50～150アミノ酸長である、請求項25または26記載のキメラポリペプチド。
前記ヒンジ領域が110～125アミノ酸長である、請求項30記載のキメラポリペプチド。
前記ヒンジ領域がSEQ ID NO:15を含む、請求項31記載のキメラポリペプチド。
前記ヒンジ領域が150～300アミノ酸長である、請求項25または26記載のキメラポリペプチド。
前記ヒンジ領域が215～250アミノ酸長である、請求項33記載のキメラポリペプチド。
前記ヒンジ領域がSEQ ID NO:16を含む、請求項34記載のキメラポリペプチド。
（a）シグナルペプチド；
（b）（i）SEQ ID NO:10を含む可変重鎖（VH）領域、および
（ii）SEQ ID NO:5を含む可変軽鎖（VL）領域
を含む、抗原結合ドメイン；
（c）8～300アミノ酸長のヒンジ領域；
（d）CD28膜貫通ドメイン；ならびに
（e）CD28シグナル伝達ドメインおよびCD3ζ（ゼータ）シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む、キメラポリペプチド。
前記VH領域およびVL領域が、リンカーによって隔てられている、請求項36記載のキメラポリペプチド。
前記リンカーが4～40アミノ酸長である、請求項36または37記載のキメラポリペプチド。
前記リンカーが(G₄S)_n配列を含み、ここで、nが1、2、3、4、5、または6である、請求項38記載のキメラポリペプチド。
前記リンカーが(EAAAK)_n配列を含み、ここで、nが1、2、3、4、5、または6である、請求項38記載のキメラポリペプチド。
前記リンカーがSEQ ID NO:9を含む、請求項38記載のキメラポリペプチド。
前記ヒンジ領域がSEQ ID NO:14を含む、請求項36～41のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
SEQ ID NO:1を含む、請求項42記載のキメラポリペプチド。
前記ヒンジ領域がSEQ ID NO:15を含む、請求項36～41のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
SEQ ID NO:2を含む、請求項44記載のキメラポリペプチド。
前記ヒンジ領域がSEQ ID NO:16を含む、請求項36～41のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
SEQ ID NO:3を含む、請求項46記載のキメラポリペプチド。
前記抗原結合ドメインが、TYRP-1タンパク質に特異的に結合する、請求項1～47のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
請求項1～48のいずれか一項記載のキメラポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
発現構築物である、請求項49記載の核酸。
前記発現構築物がプラスミドである、請求項49記載の核酸。
前記発現構築物がウイルスベクターである、請求項49記載の核酸。
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスに由来するベクターまたはレンチウイルスに由来するベクターである、請求項52記載の核酸。
請求項49～53のいずれか一項記載の核酸を含む、細胞。
前記核酸が、細胞のゲノム中に組み込まれている、請求項54記載の細胞。
請求項1～48のいずれか一項記載のキメラポリペプチドを含む、細胞。
免疫細胞である、請求項54～56のいずれか一項記載の細胞。
T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT）、インバリアントナチュラルキラーT細胞（iNKT）、幹細胞、リンパ球前駆細胞、末梢血単核細胞（PBMC）、末梢血幹細胞（PBSC）、骨髄細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞、人工多能性幹細胞（iPS細胞）である、請求項54～57のいずれか一項記載の細胞。
T細胞またはNK細胞である、請求項58記載の細胞。
メモリーT細胞である、請求項59記載の細胞。
前記メモリーT細胞が、CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞である、請求項60記載の細胞。
請求項54～61のいずれか一項記載の細胞を含む、細胞の集団。
（a）請求項54～61のいずれか一項記載の細胞または請求項62記載の細胞の集団、および
（b）薬学的に許容される賦形剤
を含む、薬学的組成物。
請求項49～53のいずれか一項記載の核酸を細胞中に導入する工程を含む、操作された細胞を作製する方法。
前記細胞が免疫細胞である、請求項64記載の方法。
前記細胞が、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT）、インバリアントナチュラルキラーT細胞（iNKT）、幹細胞、リンパ球前駆細胞、末梢血単核細胞（PBMC）、末梢血幹細胞（PBSC）、骨髄細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞、人工多能性幹細胞（iPS細胞）である、請求項64または65記載の方法。
前記細胞が、T細胞またはNK細胞である、請求項66記載の方法。
前記細胞がメモリーT細胞である、請求項67記載の方法。
前記メモリーT細胞が、CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞である、請求項68記載の方法。
前記細胞が免疫細胞ではなく、前記方法が、細胞を免疫細胞に分化させるのに十分な条件に細胞を供する工程をさらに含む、請求項64記載の方法。
操作された細胞を、該操作された細胞を増大させて操作された細胞の集団を生成するのに十分な条件下で培養する工程をさらに含む、請求項64～70のいずれか一項記載の方法。
がんを有する対象を処置するための方法であって、該対象に、（a）請求項62記載の細胞の集団の有効量、または（b）請求項63記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
前記がんが黒色腫である、請求項72記載の方法。
追加の治療法を前記対象に提供する工程をさらに含む、請求項72または73記載の方法。
前記追加の治療法が、化学療法、放射線療法、または免疫療法である、請求項74記載の方法。
前記追加の治療法が免疫療法である、請求項75記載の方法。
前記免疫療法が、免疫チェックポイント阻害剤療法を含む、請求項76記載の方法。
前記免疫チェックポイント阻害剤療法が、PD-1阻害剤またはCTLA-4阻害剤を含む、請求項77記載の方法。
TYRP-1タンパク質に結合することができるキメラポリペプチドを含む細胞を対象に投与する工程を含む、黒色腫について対象を処置する方法であって、該キメラポリペプチドが、
（a）シグナルペプチド；
（b）（i）SEQ ID NO:10を含む可変重鎖（VH）領域、および
（ii）SEQ ID NO:5を含む可変軽鎖（VL）領域
を含む、抗原結合ドメイン；
（c）8～300アミノ酸長のヒンジ領域；
（d）膜貫通ドメイン；ならびに
（e）細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む、方法。
前記膜貫通ドメインが、T細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、またはCD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137、もしくはCD154由来の膜貫通ドメインである、請求項79記載の方法。
前記膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインである、請求項79または80記載の方法。
前記膜貫通ドメインがSEQ ID NO:17を含む、請求項81記載の方法。
前記細胞内シグナル伝達ドメインが一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項79～82のいずれか一項記載の方法。
前記一次シグナル伝達ドメインがCD3ζシグナル伝達ドメインである、請求項83記載の方法。
前記一次シグナル伝達ドメインがSEQ ID NO:19を含む、請求項84記載の方法。
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメインをさらに含む、請求項83～85のいずれか一項記載の方法。
前記共刺激ドメインが、4-1BB（CD137）、CD28、IL-15Rα、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、またはICOS（CD278）由来のシグナル伝達ドメインを含む、請求項86記載の方法。
前記共刺激ドメインがCD28シグナル伝達ドメインを含む、請求項87記載の方法。
前記共刺激ドメインがSEQ ID NO:18を含む、請求項88記載の方法。
前記共刺激ドメインが4-1BBシグナル伝達ドメインを含む、請求項87記載の方法。
前記共刺激ドメインがSEQ ID NO:70を含む、請求項90記載の方法。
前記VH領域およびVL領域が、リンカーによって隔てられている、請求項79～91のいずれか一項記載の方法。
前記リンカーが4～40アミノ酸長である、請求項79～92のいずれか一項記載の方法。
前記リンカーが(G₄S)_n配列を含み、ここで、nが1、2、3、4、5、または6である、請求項93記載の方法。
前記リンカーが(EAAAK)_n配列を含み、ここで、nが1、2、3、4、5、または6である、請求項93記載の方法。
前記リンカーがSEQ ID NO:9を含む、請求項93記載の方法。
前記ヒンジ領域がSEQ ID NO:14を含む、請求項79～96のいずれか一項記載の方法。
前記キメラポリペプチドがSEQ ID NO:1を含む、請求項97記載の方法。
前記ヒンジ領域がSEQ ID NO:15を含む、請求項79～96のいずれか一項記載の方法。
前記キメラポリペプチドがSEQ ID NO:2を含む、請求項99記載の方法。
前記ヒンジ領域がSEQ ID NO:16を含む、請求項79～96のいずれか一項記載の方法。
前記キメラポリペプチドがSEQ ID NO:3を含む、請求項101記載の方法。
前記キメラポリペプチドがSEQ ID NO:88を含む、請求項79記載の方法。