JP2022546427A - 組換え絨毛性性腺刺激ホルモン、その調製のための方法、医薬組成物、及び使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、グリコシル化部位を含む１つ又は複数の配列に連結した、ウマ絨毛性性腺刺激ホルモンのベータ鎖及びアルファ鎖をコードするアミノ酸配列を有し、その結果、優れたｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ活性をもたらす、組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンポリペプチドに関する。組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子もまた教示され、これらのＤＮＡ分子を含む発現ベクター、組換えタンパク質を含む組成物、及びそれらを調製する方法もまた開示される。【選択図】なし
Description
[001]ウマ絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）は、妊娠しているウマの子宮内膜杯によって産生されるホルモンである（Ｃｈｒｉｓｔａｋｏｓ及びＢａｈｌ、１９７９）。以前は妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）として知られていたこのホルモンは、家畜事業において人工受精前に排卵を誘導するために一般的に使用される。ｅＣＧは、２つのα及びβヘテロ二量体鎖から構成される高度にグリコシル化された糖タンパク質である。アルファサブユニットは全ての糖タンパク質ホルモン（ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ＣＧ）に共通する一方、ベータサブユニットは各ホルモンに特異的であり、受容体結合の特異性を担うが、ＧＣの場合、ベータサブユニットはＬＨと同じ受容器に結合する。ウマ科（ウマ、ロバ、シマウマ）では、胎盤性ＣＧ及び下垂体ＬＨは、同じ遺伝子から発現し、したがって同じタンパク質配列を有し、特にベータサブユニットに位置する炭水化物側鎖のみが異なるため、胎盤性ＣＧ及び下垂体ＬＨをｅＬＨ／ＣＧと称すことがコンセンサスにもなっている（Ｓｈｅｒｍａｎら、１９９２）。
[002]ｅＬＨ及びｅＣＧは、上に記載したように同じ遺伝子によってコードされ、アルファサブユニットにおける２つのＮ－グリコシル化に加えて、ベータサブユニットにＯ－グリコシル化Ｃ末端伸長とＮ－グリコシル化とを有するが（Ｍｕｒｐｈｙ及びＭａｒｔｉｎｕｋ、１９９１）、異なる組織において発現及び分泌される場合、ｅＬＨ及びｅＣＧは炭水化物側鎖のＮ及びＯの点で大きく異なり（Ｓｍｉｔｈら １９９３、Ｍａｔｓｕｉら １９９４、Ｂｏｕｓｆｉｅｌｄ及びＢｕｔｎｅｖ ２００１）、このことは、ｅＬＨと比較して長いｅＣＧの半減期（Ｋｌｅｔｔら、２００３）、及び異なる熱安定性（Ｇａｌｅｔら、２００４）に起因するｉｎ ｖｉｖｏにおける異なる生物学的能力をｅＬＨ及びｅＣＧに与える。
[003]ｅＣＧの生産は、現在、妊娠４０～１３０日の間の、ホルモンを分泌する妊娠しているウマを出血させることによって実施される（Ａｌｌｅｎ及びＭｏｏｒ、１９７２）。ｅＣＧは、精製、製剤化、及び調節後に販売され、とりわけ雌ヤギ、ウシ、及びブタの発情を人工的に誘導するために使用される。ｅＣＧは、家畜産業における使用のための２つの顕著な特徴を有し、ウマにおいて生じる、黄体活性のみを有する事象とは異なり、他の種では卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）と黄体形成ホルモン（ＬＨ）の両方の活性を有し、他方、その四次構造及び複数のグリコシル化部位のために、上昇した血流における半減期を有する（Ｓｔｅｗａｒｔら、１９７６；Ｃｏｍｂａｒｎｏｕｓら、１９８１）。
[004]現行の生産手順は、抽出ホルモンの生産及び精製に関連する、とりわけ動物の維持費及び医療費に関連する全ての問題、並びに最終製剤の純度を最大化することにおける困難を有する。したがって、代替的な生産方法を開発可能であることは非常に重要である。
[005]本発明者らは、脳下垂体によって分泌されるｅＬＨと栄養膜細胞によって分泌されるｅＣＧとの生物活性の差が、基本的には、グリカンの長さ及びシアリル化の差に起因し得るということを認識している。加えて、組換えタンパク質産生系における十分なグリコシル化の不足が、これまでのところ、ｉｎ ｖｉｖｏにおける生物活性を示すのに十分な血漿半減期を有する組換えｅＬＨ／ＣＧを妨げていることも明らかである。
[006]ＧａｌｅｔらがＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １７４（２０００）３１～４０ページに発表した「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＢＥＴＡ ＡＬＰＨＡ ｃｈａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｅｑｕｉｎｅ ＬＨ／ＣＧ ｉｎ ｍｉｌｋ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒａｂｂｉｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．」という文献は、リンカーの付加を伴わないベータ／アルファ鎖融合タンパク質のコンストラクトを教示している。前記コンストラクトはトランスジェニックウサギの乳において発現する。取得されるタンパク質は、天然タンパク質と類似したｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を有するが、ｉｎ ｖｉｖｏでは活性を有せず、産生される組換えホルモンの半減期は非常に短い。
[007]他方、ＭＩＮ Ｋｗａｎ－Ｓｉｋらは、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第５０巻、第３号、２００４年に発表した「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｔｅｔｈｅｒｅｄ Ｅｑｕｉｎｅ Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ （ｅＣＧ） ａｎｄ Ｉｔｓ Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｍｕｔａｎｔｓ．」において、グリコシル化を減少する変異を伴う及び伴わない、ＣＨＯ－Ｋ１細胞におけるベータ及びアルファ鎖の融合を証明し、アルファ及びベータ鎖を融合するためにいかなるリンカーも使用していない。これらの研究者は、ＬＨ活性とＦＳＨ活性の両方に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性（細胞培養）のみを評価し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性はグリコシル化していない変異体においてより低い。研究者らは活性なホルモンを得ているが、活性なホルモンはｉｎ ｖｉｔｒｏのみである。
[008]ベータ及びアルファ鎖の発現をＳＦ９及び模倣昆虫細胞（５つの付加されたグリコシルトランスフェラーゼを有するＳＦ９）において別個に示す、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｑｕｉｎｅ ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ／ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ （ｅＬＨ／ＣＧ） ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｓｆ９ ａｎｄ Ｍｉｍｉｃ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ」、Ｌｅｇａｒｄｉｎｉｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００５）３４、４７～６０ページにおいて報告されている組換えホルモンを取得する試みもまた不首尾であった。Ｓｆ９及び模倣細胞において産生された２つのｅＬＨ／ＣＧは、ＬＨ及びＦＳＨのｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイにおいて活性であり、ｅＣＧと類似した効力を有したが、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）としてもｅＣＧ特異的アッセイにおいても有意なｉｎ ｖｉｖｏ生理活性を呈しなかった。模倣細胞において産生された組換えｅＬＨ／ＣＧは、Ｓｆ９細胞において産生された組換えｅＬＨ／ＣＧよりも多くグリコシル化されているが、炭水化物鎖の不十分な末端シアリル化が血液からの急速な消失を引き起こしたため、ｉｎ ｖｉｖｏ活性において差を有しなかった。
[009]別のグループは、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｑｕｉｎｅ ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ （ｒｅＬＨ）．」、Ｊａｂｌｏｎｋａ－Ｓｈａｒｉｆｆら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ６７（２００７）３１１～３２０ページにおいて、いかなるリンカーも使用しないベータ及びアルファ鎖の融合を報告している。発現はＣＨＯ－Ｋ１細胞において行われる。彼らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（ライディッヒ細胞によるテストステロン産生）及びｉｎ ｖｉｖｏにおけるＬＨ活性を記載し、ウマにおけるテストステロン産生のピークによってもＬＨ活性を記載している。しかしながら、彼らはＦＳＨ活性の存在を示していない。研究者らは、下垂体において産生されるＬＨが栄養膜細胞において産生されるＧＣよりもグリコシル化されていないこと、彼らが得る組換え産物（ｒｅＬＨ）がｅＣＧよりもｅＬＨに類似していることを認識し、したがって、ＣＨＯ細胞がｅＣＧ合成に必要とされる適切なグリコシルトランスフェラーゼ活性を欠くと論じている。
[0010]最後に、Ｓｏｇａｙａｒらは、国際公開第２０１７／１１２９８７号において、ＣＨＯ ｄｇ４４細胞の形質転換（Ｊａｂｌｏｎｋａ－Ｓｈａｒｉｆｆに記載されている融合を用いた、ｄｈｆｒ遺伝子がノックアウトされたＣＨＯＫ１株）、ＣＨＯ ｄｇ４４細胞の選択、並びに組換えグリコシル化ｅＣＧの高産生クローンの増幅及び選択を報告している。彼らは、形質転換されたＣＨＯ細胞がグリコシル化に関与する全ての酵素を発現し、そのためにｅＣＧがｉｎ ｖｉｔｒｏ並びにｉｎ ｖｉｖｏ（ラット及びウシ）において活性となり得ると評価する。しかしながら、提唱された手順は、栄養膜細胞と類似したプロファイルを有する、偶発的にグリコシル化するある特定のクローンの選択を必要とし、結果として、前記クローンの安定性は、大規模生産のための前記戦略の有用性を相対的なものにする。
[011]そのため、本発明者らは、受容体に対するｅＬＨ／ＣＧの親和性を変化させることなく、ｅＬＨ／ＣＧが、組換え発現系において翻訳後により効率的にグリコシル化される可能性を高め、ｅＬＨ／ＣＧの流体力学的体積を増加させ、結果としてｉｎ ｖｉｖｏにおける生物活性を高めるために、ｅＬＨ／ＣＧの構造を改変することを決定した。
[012]本発明は、グリコシル化部位を含む１つ又は複数の配列に連結している、ウマ絨毛性性腺刺激ホルモンのベータ鎖及びアルファ鎖をコードするアミノ酸配列を有することを特徴とする、組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンポリペプチドに関する。
[013]好ましい一実施形態では、組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、及び配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
[014]組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子もまた、本出願の関連する実施形態である。特に、配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７からなる群から選択される配列を有するＤＮＡ分子。
[015]これらのＤＮＡ分子を含む発現ベクターもまた、本出願の対象である。
[016]一実施形態では、これらのポリペプチドは医薬組成物の一部である。
[017]これらの組換えタンパク質及び組成物は、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、シカ、ヤギ、及び実験動物等の哺乳動物における、過剰排卵、排卵不全、卵巣発育障害、分娩後発情の誘導、又は睾丸機能低下症（ｈｙｐｏｏｒｃｈｉｄｉａ）等の哺乳動物の生殖又は排卵に関連する状態の治療のための医薬の製造に有用である。
[018]別の実施形態は、ベクターをトランスフェクトするステップ、組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンポリペプチドをＣＨＯ細胞において発現させるステップ、及び任意選択で、免疫親和性によって組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンポリペプチドを精製するステップによる、組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンポリペプチドを製造する方法に言及する。
ｅＣＧアルファ－ベータ融合タンパク質の組換えバリアントの取得
[031]ｅＣＧの血漿半減期を増加させるためのグリコシル化部位の付加を伴う、ｅＣＧの一本鎖組換えアルファ／ベータ鎖（ｒｅＣＧ）の製造を本明細書に記載する。一本鎖の構築は、リンカーとしての複数のグリコシル化部位の配列の導入を可能にし、サブユニットの会合／解離の問題を回避する。
[031]ｅＣＧの血漿半減期を増加させるためのグリコシル化部位の付加を伴う、ｅＣＧの一本鎖組換えアルファ／ベータ鎖（ｒｅＣＧ）の製造を本明細書に記載する。一本鎖の構築は、リンカーとしての複数のグリコシル化部位の配列の導入を可能にし、サブユニットの会合／解離の問題を回避する。
[032]これを行うために、複数のＯ－グリコシル化又はＮ－グリコシル化部位を有する２つの配列を付加することによって、遺伝子配列を改変した。Ｏ－グリコシル化配列は、ベータ鎖に特徴的であり、カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）に存在することを特徴とし、Ｎ－グリコシル化配列は、哺乳動物におけるＮ－グリコシル化のコンセンサス配列から設計され、アミノ（Ｎ）末端ペプチドにおいて使用されることから、本発明者らはＣＴＰに対してＮＴＰと称す。
[033]種々のリンカーの機能性を評価するために、図１に記載する様々なコンストラクトを含む発現ベクターを調製した。これらのバリアントのそれぞれのヌクレオチド及びアミノ酸配列を添付の配列表に示す。
[034]配列番号１はＮＴＰ－ベータＣＴＰ－ＮＴＰ－アルファをコードするコンストラクト（コンストラクト＃２）のポリヌクレオチド配列に対応し、配列番号２はそのアミノ酸配列に対応する。配列番号３はＮＴＰ－ベータＣＴＰ－ＣＴＰ－アルファをコードするコンストラクト（コンストラクト＃５）のポリヌクレオチド配列に対応し、配列番号４はそのアミノ酸配列に対応する。配列番号５はＮＴＰ－ベータＣＴＰ－アルファをコードするコンストラクト（コンストラクト＃８）のポリヌクレオチド配列に対応し、配列番号６はそのアミノ酸配列に対応する。配列番号７はＮＴＰ－ベータ－ＮＴＰ－アルファをコードするコンストラクト（コンストラクト＃１０）のポリヌクレオチド配列に対応し、配列番号８はそのアミノ酸配列に対応する。配列番号９はＣＴＰ－ベータＣＴＰ－ＣＴＰ－アルファをコードするコンストラクト（コンストラクト＃６）のポリヌクレオチド配列に対応し、配列番号１０はそのアミノ酸配列に対応する。配列番号１１はベータＣＴＰ－ＣＴＰ－アルファをコードするコンストラクト（コンストラクト＃４）のポリヌクレオチド配列に対応し、配列番号１２はそのアミノ酸配列に対応する。
競合ＥＬＩＳＡによりｅＣＧを決定する方法の開発
[035]捕捉抗体（Ａｂ）は、Ｓｙｎｔｅｘによって提供されるウサギ抗ｅＣＧポリクローナル抗体である。特異的免疫グロブリンは、ＣＬアガロースと共有結合したｅＣＧ親和性カラムを用いた精製によって取得した。トレーサーは、アルコキシアミン－ＰＥＧ１２－ビオチンを用いたシアル残基のビオチン化によって取得した。
[035]捕捉抗体（Ａｂ）は、Ｓｙｎｔｅｘによって提供されるウサギ抗ｅＣＧポリクローナル抗体である。特異的免疫グロブリンは、ＣＬアガロースと共有結合したｅＣＧ親和性カラムを用いた精製によって取得した。トレーサーは、アルコキシアミン－ＰＥＧ１２－ビオチンを用いたシアル残基のビオチン化によって取得した。
[036]アルカリストレプトアビジンホスファターゼ（Ｓｔｒｐ－ＦＡ）を使用して、試料又は標準曲線に存在する非解離Ｂｉｏｔ－ｅＣＧを定量した。
[037]試験は９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにおいて実施し、標準曲線はＳｔｄ１ ｅＣＧ Ｓｙｎｔｅｘ標準物質を用いて構築した。アルカリホスファターゼ濃度は、１００ｍＭトリスｐＨ９．２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２中、４－ニトロフェニルリン酸を基質として使用して決定する。４０５ｎｍで読み取る。アッセイのダイナミックレンジは２０～０．１６ｎｇ／ウェルである。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ性腺刺激（ＦＳＨ）生物活性決定試験
[038]ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ウシＦＳＨホルモン受容体導入遺伝子及び選択抗生物質ネオマイシンを保有するプラスミドをトランスフェクトした。抗生物質耐性を選択し、耐性クローンを増幅した後、ｂＦＳＨ受容体の発現を、特異的結合を裏付ける競合因子としてのＩＮＡＭＥによって提供される１ＩＵの標準物質の存在又は非存在下で、１２５Ｉ－ＦＳＨと結合させることによって確認した。
[038]ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ウシＦＳＨホルモン受容体導入遺伝子及び選択抗生物質ネオマイシンを保有するプラスミドをトランスフェクトした。抗生物質耐性を選択し、耐性クローンを増幅した後、ｂＦＳＨ受容体の発現を、特異的結合を裏付ける競合因子としてのＩＮＡＭＥによって提供される１ＩＵの標準物質の存在又は非存在下で、１２５Ｉ－ＦＳＨと結合させることによって確認した。
[039]リガンドと高親和性で結合し、この結合がセカンドメッセンジャーｃＡＭＰを合成する応答を生じたＦＳＨ受容体を発現したクローンに、ＣＲＥプロモーター（ｐＧＬ４ Ｐｒｏｍｅｇａ）下のルシフェラーゼレポーターコンストラクトをトランスフェクトした。ｃＡＭＰの存在下でこのコンストラクトを有する細胞は、セカンドメッセンジャーの量に比例してルシフェラーゼを産生する。酵素ルシフェラーゼは、ＡＴＰ＋Ｏ２の存在下でルシフェリンを代謝産物と光に変換する。この発光は、系の全体が組織化される場合、卵胞刺激活性を有する分析物の濃度に比例する。試験のダイナミックレンジは１２．５～０．４ｍＵ／チューブである。
[040]ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性の典型的な用量応答曲線を図２に示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ黄体刺激生物活性決定試験
[041]マウスライディッヒ細胞株は、ＬＨ受容体を恒常的に発現し、性腺刺激前に、ｃＡＭＰ産生及びプロゲステロン分泌と応答する。現行の株を、ＬＨ／ｈＣＧに対する応答の部分的喪失に基づいて再クローニングし、ｈＣＧに対する最も高い応答を有するクローンを選択し、そのクローンに、ＦＳＨ活性アッセイＨＥＫ細胞と同様に、ＣＲＥ－Ｌｕｃレポーター遺伝子をトランスフェクトした。
[041]マウスライディッヒ細胞株は、ＬＨ受容体を恒常的に発現し、性腺刺激前に、ｃＡＭＰ産生及びプロゲステロン分泌と応答する。現行の株を、ＬＨ／ｈＣＧに対する応答の部分的喪失に基づいて再クローニングし、ｈＣＧに対する最も高い応答を有するクローンを選択し、そのクローンに、ＦＳＨ活性アッセイＨＥＫ細胞と同様に、ＣＲＥ－Ｌｕｃレポーター遺伝子をトランスフェクトした。
[042]試験は、コラーゲンでコーティングしたＰ９６プレートにおいて、ウェル１つ当たり２５，０００個の細胞を蒔き、４８時間プレインキュベートすることによって行い、次いで標準曲線のｈＧＣ又は試料を添加し、インキュベーションを３時間継続する。刺激時間が経過した後、培養培地を除去し、試薬を添加して、以前の試験と同様にルシフェラーゼ活性を決定する。試験のダイナミックレンジは５０～０．８ｍＩＵ／ウェルである。
[043]ｈＣＧに対する典型的な用量応答曲線を図３に示す。
ｉｎ ｖｉｖｏ生物活性決定試験
[044]欧州薬局方第９版（Ｅｈ．Ｐｈ．９）、分析標準物質としての獣医学使用に関するウマ絨毛性性腺刺激ホルモン専攻論文を使用して、試料を分析した。
[044]欧州薬局方第９版（Ｅｈ．Ｐｈ．９）、分析標準物質としての獣医学使用に関するウマ絨毛性性腺刺激ホルモン専攻論文を使用して、試料を分析した。
[045]天然又は組換えのウマ絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）の存在、及びその結果としての生物活性（ＦＳＨ）は、産物を注射した未成熟雌ラットにおいて、卵巣の質量の増加を引き起こすはずである。この増加は、投与後に取得される一対の卵巣の平均重量を、無投与の一対の卵巣の平均重量（ベースライン重量）に対して比較することによって決定する。本研究に使用した系統（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ｓｄ））の一対の卵巣のベースライン重量は、２５ｍｇ未満である。
[046]方法：０．２ｍＬの試料を、選択されたラットに皮下注射した。
[047]注射は、初回注射の１８、２１、２４、４２、及び４８時間後に繰り返した（溶液は冷蔵庫に保管した）。動物を最終注射の４０時間以上７２時間以下後に屠殺した。その後、脂肪、癒着物、及び卵管を各動物から分離して卵巣を摘出し、最後に、各投与ラットの両方の卵巣の重量を測定した。
[048]動物のハンドリング、注射、屠殺、卵巣の摘出、洗浄、及び重量測定の全ては、これらの方法及び動物のハンドリングにおいて熟練した人員によって実施された。
[049]２１～２８日齢（互いの差が３日齢以下）及びおよそ５０～５５ｇ（±１０ｇの範囲）の重量のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ｓｄ）系統の雌ラットを、選択群内で使用した。
コンストラクトの機能性の決定
Ａ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における評価
[050]種々のｒｅＣＧコンストラクトの性腺刺激活性の試験のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を組換えタンパク質の合成プラットフォームとして選択した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、プラスミドがＳＶ４０遺伝子を有する場合にプラスミドの増殖を引き起こすＴ抗原を有するという特徴を有し、このことは、一過性トランスフェクションによって、好適なプラスミドにおいてクローニングされた組換えタンパク質の並外れた発現が生じることを意味する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、この株によって合成される組換えタンパク質が、一度複雑系に存在すると非常に短い半減期を有するようになる、グリコシル化パターンの欠点を有する。一般に、排出能を有しないシステムにおける活性は影響を受けず、したがって、これらのタンパク質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系における活性を試験するために使用される。
Ａ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における評価
[050]種々のｒｅＣＧコンストラクトの性腺刺激活性の試験のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を組換えタンパク質の合成プラットフォームとして選択した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、プラスミドがＳＶ４０遺伝子を有する場合にプラスミドの増殖を引き起こすＴ抗原を有するという特徴を有し、このことは、一過性トランスフェクションによって、好適なプラスミドにおいてクローニングされた組換えタンパク質の並外れた発現が生じることを意味する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、この株によって合成される組換えタンパク質が、一度複雑系に存在すると非常に短い半減期を有するようになる、グリコシル化パターンの欠点を有する。一般に、排出能を有しないシステムにおける活性は影響を受けず、したがって、これらのタンパク質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系における活性を試験するために使用される。
[051]ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させたコンストラクト２、５、８、及び１０のそれぞれについて決定したｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性を図４に示す。図４が典型的な結果である、ＨＥＫ細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏにおける結果は、設計した融合タンパク質がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて両方のｅＧＣ活性を有すると本発明者らが結論することを可能にした。
[052]他方、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株において合成されたこれらの同じｒｅＣＧコンストラクト（組換え）のｉｎ ｖｉｖｏ生物活性を研究した。試料の生物活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験から取得された結果に従って５００ＩＵ／ｍＬと推定した。
[053]全ての事例において、取得された結果は２５ｍｇ未満、すなわち、研究中の系統のベースライン重量と同等の平均卵巣重量を示す。
[054]したがって、ＨＥＫ細胞において合成されたコンストラクトは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは生物活性を有するが、ｉｎ ｖｉｖｏでは生物活性を欠くと結論される。
Ｂ ＣＨＯＫ１細胞における評価
[055]ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において取得された結果により、ＨＥＫ及びＳＦ９よりも長い血漿半減期を一般的に有する糖タンパク質を産生するＣＨＯＫ１細胞をプラットフォームとして使用して、ｒｅＣＧの開発を継続した。選択したコンストラクトは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験においてより多くの量が発現されたため、＃５及び＃８であった。
[055]ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において取得された結果により、ＨＥＫ及びＳＦ９よりも長い血漿半減期を一般的に有する糖タンパク質を産生するＣＨＯＫ１細胞をプラットフォームとして使用して、ｒｅＣＧの開発を継続した。選択したコンストラクトは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験においてより多くの量が発現されたため、＃５及び＃８であった。
[056]１０×１０６個のＨＥＫ又はＣＨＯ細胞によって合成されたタンパク質の比較されるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＳＨ生物活性を図５に示す。
[057]他方、上清に存在するタンパク質を、２つの非変性ポリアクリルアミドゲルにおいて、２つのゲルのうちの１つをクマシーＧ２５０染色による総タンパク質の検出のために使用して分析し、別のニトロセルロース膜に転写して、転写したものを、ウサギにおいて生成された天然ｅＣＧに対する抗体を用いて分析した。取得された結果を図６に示す。
[058]ＨＥＫ細胞において合成された組換えタンパク質の見かけのサイズは、抽出ｅＧＣのパターンと類似する。このことは、ｉｎ ｖｉｖｏ活性の観察の欠如が、ＨＥＫ細胞において合成されたポリペプチドの流体力学的体積に起因するのでもグリコシル化の量に起因するのでもなく、グリコシル化の質に起因することを示す。
[059]したがって、ＣＨＯＫ１細胞において、より多くの量が発現されるコンストラクト＃５及び＃８を用いて産生される組換えタンパク質を継続した。
[060]ｉｎ ｖｉｖｏ生物活性試験は、標準曲線の最小刺激値の範囲内において卵巣の重量の増加を示した。対照条件培地は対照以外の値を生じなかった。
[061]天然ｅＣＧに対して生成された抗体を用いて実施したウェスタンブロットにおける組換えホルモンの認識を考慮して、一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上清を、親和性カラムを用いてｅＣＧ＃５コンストラクトに関して精製した。合計で６１ＩＵのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＳＨ活性を有する１３μｇのタンパク質を取得した。ｉｎ ｖｉｖｏ活性を、標準曲線の最大値と同等の刺激値である２０３．９ｍｇ、１１９．８ｍｇ、及び１７２．９ｍｇの卵巣重量を示した３匹の動物において決定した。
安定にタンパク質を産生するクローンの生成
[062]ＣＨＯＫ１細胞にｅＣＧ＃５及び＃８コンストラクトをトランスフェクトし、Ｇ４１８抗生物質を用いてＣＨＯＫ１細胞を選択して、導入遺伝子を安定に有する細胞を取得した。集密に達したら、ホルモンの発現を、上清の５０ｕｌのアリコート中０．６ｎｇの活性を検出するように設定したＥＬＩＳＡによって決定した。
[062]ＣＨＯＫ１細胞にｅＣＧ＃５及び＃８コンストラクトをトランスフェクトし、Ｇ４１８抗生物質を用いてＣＨＯＫ１細胞を選択して、導入遺伝子を安定に有する細胞を取得した。集密に達したら、ホルモンの発現を、上清の５０ｕｌのアリコート中０．６ｎｇの活性を検出するように設定したＥＬＩＳＡによって決定した。
[063]クローンの選択基準は、良好な成長と１．５ＩＵ／ｍｌ超の産生であり、コンストラクト＃５の４つのクローン及び＃８の３つのクローンが候補として残った。結果を図７に示す。
[064]クローン５Ｄ、５Ｇ、５Ｊ、及び８Ｆを増殖して、ｉｎ ｖｉｖｏにおける生物活性を決定し、その結果に基づいてクローン５Ｇ及び８Ｆを選択して、２つのコンストラクトのアフィニティークロマトグラフィーによる組換えタンパク質の単離を、そのさらなる特性解析のために継続した。
免疫親和性によるＲｅＣＧ精製
[065]ヒツジにおいて生成された、Ｓｙｎｔｅｘによる抗ｅＣＧ免疫血清を使用した。特異的ＩｇＧを、ｅＣＧ－セファロースカラムを用いて親和性によって単離して、血清１ｍｌ当たり３ｍｇの抗ｅＣＧ ＩｇＧを取得した。抗ｅＣＧのアリコートをカップリング緩衝液（重炭酸塩－ＮａＣｌ）に対して透析して、９ｍｌのセファロース－ＮＨＳにカップリングした合計９０ｍｇのＩｇＧを取得した。
[065]ヒツジにおいて生成された、Ｓｙｎｔｅｘによる抗ｅＣＧ免疫血清を使用した。特異的ＩｇＧを、ｅＣＧ－セファロースカラムを用いて親和性によって単離して、血清１ｍｌ当たり３ｍｇの抗ｅＣＧ ＩｇＧを取得した。抗ｅＣＧのアリコートをカップリング緩衝液（重炭酸塩－ＮａＣｌ）に対して透析して、９ｍｌのセファロース－ＮＨＳにカップリングした合計９０ｍｇのＩｇＧを取得した。
[066]０．２２μｇによって濾過した条件培地に対して１ｍｌ／ｃｍ２／分でクロマトグラフィーを行い、ベッドを、ベースラインに戻るまでＰＢＳを用いて洗浄し、３ｍｌのグリシンｐＨ３を用いて溶出し、２８０ｎｍの吸光度ピークを回収した。グリシン溶出液ｐＨ３を中和し、ＰＢＳに対して透析濾過し、濃縮した。
[067]８５０μｇのコンストラクト＃５及び３６０μｇの＃８を取得する。これらを、還元薬を含まないＰＡＧＥによって分析して、クマシー染色による総タンパク質バンド、及びウサギにおける天然ホルモンを用いてＳｙｎｔｅｘによって生成された抗体を第１の抗体として使用するウェスタンブロットによる特異的バンドを明らかにする。結果を図８に示す。
[068]組換えホルモンの場合、抗体を用いて明らかになるバンドのみがクマシーを用いて染色されたバンドと同じであることに注意すべきである。非常に高い分子量のバンドは融合タンパク質の二量体である可能性があり、天然タンパク質において観察された低分子量のバンドは、ＳＤＳを含むが還元剤を含まない泳動条件下でのヘテロ二量体の部分的解離に起因する。
[069]両タンパク質及び標準物質１ ｅＣＧ Ｓｙｎｔｅｘの、ｉｎ ｖｉｔｒｏ性腺刺激及び黄体刺激活性を決定した。質量に関する用量応答活性及び相対発光量（ＲＬＵ）として表されるルシフェラーゼ活性の結果を図９に示す。組換えホルモンと天然ホルモンとの間の特異的活性の差は顕著であり、黄体刺激活性の場合ではより顕著で、黄体刺激活性においては、天然ホルモンはより高用量の場合であっても活性を飽和しない。
安定に生成されるタンパク質産生クローンの生物活性の研究
[070]ＣＨＯＫ１細胞にコンストラクト＃５及び＃８をトランスフェクトし、ＣＨＯＫ１細胞を選択して、導入遺伝子を安定に有する細胞を取得した。
[070]ＣＨＯＫ１細胞にコンストラクト＃５及び＃８をトランスフェクトし、ＣＨＯＫ１細胞を選択して、導入遺伝子を安定に有する細胞を取得した。
[071]良好な成長及び産生のクローンを選択し、５Ｄ、５Ｇ、５Ｊ、及び８Ｆクローンを増殖し、それらの生物活性を決定した。結果を以下に示す：
[072]陽性ｅＣＧという確認試験の結果、及び投与動物の、２５ｍｇのベースライン重量と比較して高度な卵巣成長により、前記試料の評価の一次近似を行うことが決定される。
[073]このために、種々のクローンの試料を、種々の濃度の標準３点ｅＣＧ曲線に基づく分析技法によって、Ｓｙｎｔｅｘにおいて生産され、標準物質「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＮＩＢＳＣ Ｃｏｄｅ ６２／００１（ＮＩＢＳＣ）」に対して評価されたＳｙｎｔｅｘ二次ｅｃＧ標準物質を使用して、分析する。
[074]前回の試験における高い応答により、試料を３０ＩＵ／ｍＬの理論力価と推定し、取得された結果を、取得された生データを処理するために使用される形式において検討する。
[075]分析されたクローンは、陽性生物活性を有する組換えタンパク質を産生し、卵巣の重量の著しい増加を伴うと結論される。
[076]全ての投与動物（分析した各試料につき８匹）は例外なく投与に応答した。
[077]加えて、本発明者らが認識し、天然ホルモンを投与した動物において得られる応答と比較して、組換え体について示された応答は同一であり、投与動物において奇妙なシグナルも異常行動も観察されない。
[078]取得されたデータのために、クローンの力価は以下のものとなる：
・５Ｄ：２６ＩＵ／ｍｌ
・５Ｇ：３３ＩＵ／ｍｌ
・５Ｊ：２０ＩＵ／ｍｌ
・８Ｆ：１７ＩＵ／ｍｌ
・５Ｄ：２６ＩＵ／ｍｌ
・５Ｇ：３３ＩＵ／ｍｌ
・５Ｊ：２０ＩＵ／ｍｌ
・８Ｆ：１７ＩＵ／ｍｌ
精製処理の研究：
[079]目的は、精製が分子を分解したかどうか、又は処理の結果として分子の喪失が存在したかどうかを評価することであった。
[079]目的は、精製が分子を分解したかどうか、又は処理の結果として分子の喪失が存在したかどうかを評価することであった。
[080]精製処理を受けた５Ｇコンストラクトの試料を３匹の動物に注射した。取得された応答は以下のものであった：
・２０３．９ｍｇ－１７２．９ｍｇ－１１９．８ｍｇ
・２０３．９ｍｇ－１７２．９ｍｇ－１１９．８ｍｇ
[081]成長値が前記未精製クローンを用いて取得された値と一致するため、ｅＣＧは精製中に失われることも分解されることもないと結論される。
[082]コンストラクト８Ｆの場合、ｉｎ ｖｉｖｏ生物活性決定に十分な質量を取得するためのその後の試みは否定的であった。したがって、生産方法が確定されるまでは、コンストラクト＃５のみが本計画の進行を継続する。
黄体活性研究（ＬＨ）：
[083]試料＃５を投与した場合の、２１～２８日齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ｓｄ）ラットの生体応答を研究した。
[083]試料＃５を投与した場合の、２１～２８日齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ｓｄ）ラットの生体応答を研究した。
[084]方法：
[085]１群の２１～２８日齢（互いに３日齢以下）及びおよそ６０～６５グラムの重量（±１０グラムの差）のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（ｓｄ）の選択群を調製した。
[086]試料を、連続する４日間、０．５ｍＬの容量で２４時間ごとに皮下注射した。
[087]ラットを最終注射の２４時間後に屠殺し、次いで精嚢を摘出し、洗浄し、濾紙を用いて乾燥し、重量を測定した。
[088]動物操作、注射、屠殺、精嚢の摘出、洗浄、及び重量測定の作業は、動物飼養施設の熟練した人員によって実施された。
[089]得られる質量又は容量を試料溶液の効力に基づいて算出することによって試料溶液を調製し、次いで５．２６４ＩＵ／ｍＬの濃度にした。
[090]結果：４匹の動物に投与し、投与後の精嚢の重量は以下の通りであった：
・４４．０ｍｇ－５８．０ｍｇ－４８．０ｍｇ－５２．０ｍｇ
・４４．０ｍｇ－５８．０ｍｇ－４８．０ｍｇ－５２．０ｍｇ
[091]本発明者らは、使用したラット系統に関して、精嚢（無投与）のベースライン重量は１２ｍｇ未満であること、及び５０ｍｇ以内に応答が飽和し始めることを認識しているため、黄体活性の存在が立証されると結論することができる。
[092]このアッセイは、組換えｅＣＧの二重活性、すなわち、卵胞刺激活性及び黄体活性が存在することを裏付ける。
最終５Ｇ試料の卵胞刺激及び黄体活性の決定
[093]黄体及び卵胞刺激活性を欧州薬局方第９版に従って分析した。
[093]黄体及び卵胞刺激活性を欧州薬局方第９版に従って分析した。
[094]８匹以上の動物の群を、ｈＣＧのＩＮＡＭＥ国内標準物質及びｅＣＧの二次標準物質Ｓｙｎｔｅｘを使用して分析した。
結果：
結果：
[095]上記に基づいて、コンストラクト＃５に由来する組換えｅＣＧが天然ホルモンと同様に２種類の顕著な活性、すなわち卵胞刺激（ＦＳＨ）と黄体形成ホルモン（ＬＨ）の両方を有すると結論される。
アミノ末端ペプチドによる修飾のｉｎ ｖｉｖｏ活性に対する利点の決定
[096]ＳＦ９細胞において合成されたｅＣＧと模倣細胞において合成されたｅＣＧの両方（Ｌｅｇａｒｄｉｎｉｅｒ、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏ（２００５）３４）、ＣＨＯＫ１において合成されたｅＣＧ（Ｍｉｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９６）、４３ ５８５～５９３ページ）、又はトランスジェニックウサギの乳腺において産生されたｅＣＧ（Ｇａｌｅｔら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １７４（２０００）３１）における、ｅＣＧのβ鎖のＣＴＰをリンカーとして使用する融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ生物活性の欠如は、グリコシル化の量の重要性だけでなく、グリコシル化の質の重要性も示す。したがって、＃５の代替となる２つのコンストラクト、すなわち、コンストラクト＃５としてのｅＣＧの融合したα及びβ鎖の融合であるがアミノ末端に修飾を有しない＃４と呼ばれる一方のコンストラクトと、アミノ末端が修飾されている点では＃５と同様であるが、この場合はＣＴＰペプチド配列を有する他方のコンストラクト＃６とを試験した。この修飾は、同じリンカー配列の場合におけるアミノ末端修飾の重要性を評価する。
[096]ＳＦ９細胞において合成されたｅＣＧと模倣細胞において合成されたｅＣＧの両方（Ｌｅｇａｒｄｉｎｉｅｒ、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏ（２００５）３４）、ＣＨＯＫ１において合成されたｅＣＧ（Ｍｉｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９６）、４３ ５８５～５９３ページ）、又はトランスジェニックウサギの乳腺において産生されたｅＣＧ（Ｇａｌｅｔら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １７４（２０００）３１）における、ｅＣＧのβ鎖のＣＴＰをリンカーとして使用する融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ生物活性の欠如は、グリコシル化の量の重要性だけでなく、グリコシル化の質の重要性も示す。したがって、＃５の代替となる２つのコンストラクト、すなわち、コンストラクト＃５としてのｅＣＧの融合したα及びβ鎖の融合であるがアミノ末端に修飾を有しない＃４と呼ばれる一方のコンストラクトと、アミノ末端が修飾されている点では＃５と同様であるが、この場合はＣＴＰペプチド配列を有する他方のコンストラクト＃６とを試験した。この修飾は、同じリンカー配列の場合におけるアミノ末端修飾の重要性を評価する。
[097]ＣＨＯＫ１細胞にコンストラクト＃４及び＃６をコードするプラスミドをトランスフェクトし、ネオマイシン耐性に関してＣＨＯＫ１細胞を選択した。耐性細胞を希釈によってクローニングし、最も多い量のタンパク質を発現する細胞をＥＬＩＳＡによって決定して選択した（クローン４Ｃ及び６Ａ）。クローン４Ｃ及び６ＡをＤＭＥＮ－Ｆ１２ ５％ＳＦＢ培地において培養し、条件培地を回収し、硫酸アンモニウムを用いてタンパク質を沈殿させ、ＰＢＳに懸濁し、ＰＢＳに対して３６～４８時間、緩衝液交換を３回行って透析した。組換えタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生物活性をルシフェラーゼ活性の刺激によって決定した。
ｅＣＧコンストラクト４Ｃ １３３４１ＩＵ／ｍｇ
ｅＣＧコンストラクト５Ｇ ４０１３ＩＵ／ｍｇ
ｅＣＧコンストラクト６Ａ ４７６８ＩＵ／ｍｇ
ｅＣＧコンストラクト４Ｃ １３３４１ＩＵ／ｍｇ
ｅＣＧコンストラクト５Ｇ ４０１３ＩＵ／ｍｇ
ｅＣＧコンストラクト６Ａ ４７６８ＩＵ／ｍｇ
[098]４Ｃコンストラクトによって合成されたタンパク質のより大きなｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性は、ベータ－アルファ鎖の融合に関して認められた結果と類似する（Ｍｉｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９６）、４３ ５８５～５９３ページ）。ｉｎ ｖｉｖｏ系では、このタンパク質が活性を示した場合、活性は他の組換えタンパク質（ｒｅＣＧ－５Ｇ及びｒｅＧＣ－６Ｃ）よりも小さくなることもまた予期された。
[099]これらのタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて試験した場合、アミノ末端にＮＴＰペプチドを有する５Ｇコンストラクトを用いて生成したタンパク質は５４７７ＩＵ／ｍｇの活性を示したが、アミノ末端にＣＴＰペプチドを有するコンストラクト及びアミノ末端に修飾を有しないコンストラクト（それぞれ６Ａ及び４Ｃ）は投与動物の卵巣重量の増加を生じなかった。
[100]これらのデータは、ウマ絨毛性性腺刺激ホルモンのアルファ及びベータ鎖の融合タンパク質について、ＮＴＰペプチドを用いたアミノ末端の修飾がｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の増加、したがって活性の存在を与えることを明確に実証する。
比較野外試験
[101]野外における組換えホルモンの挙動を評価するために、コンストラクト＃５を起源とする２０００ＩＵの推定用量の組換えｅＣＧタンパク質（ｒｅＣＧ＃５）の筋肉内注射が、２０００ＩＵ用量の天然ｅＣＧ（ノボルモン５０００、Ｓｙｎｔｅｘ）の注射の結果として生じるものと同じ過剰刺激及び過剰排卵応答を生じるか否かを試験した。
[101]野外における組換えホルモンの挙動を評価するために、コンストラクト＃５を起源とする２０００ＩＵの推定用量の組換えｅＣＧタンパク質（ｒｅＣＧ＃５）の筋肉内注射が、２０００ＩＵ用量の天然ｅＣＧ（ノボルモン５０００、Ｓｙｎｔｅｘ）の注射の結果として生じるものと同じ過剰刺激及び過剰排卵応答を生じるか否かを試験した。
[102]排卵後３及び７日目のプロゲステロン（Ｐ４）レベルは、２０００ＩＵ用量の天然ｅＣＧ又はｒｅＣＧ＃５を投与したウシにおいて同等である。
[103]試験は、２０１９年５月、６月、及び７月の間、コルドバ・カトリック大学（ＵＣＣ）のＳａｎｔａ Ｊｕｌｉａ Ｚｏｏｔｅｃｈｎｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎにおいて行った。
[104]放牧されている１４匹の３～５歳のアンガス／ヘレフォード種のウシを使用し（試験は、各繰返しの１群当たり７匹の２回の繰返しにおいて行った）、全てのウシは投与（周期）の開始時に黄体を提示した。ボディコンディション（ＢＣＳ）は平均で２．５であった（尺度１～５、画像１）。
[105]動物に、良質のアルファルファロールを自由摂取させ、１日２回の給餌において、給餌者において投与され、配給ミキサーを備えるトラクターによって運搬された、ウシ１匹当たり１日１５ｋｇの細断されたサイロのトウモロコシを摂取させた。
投与の群：
[106]合計１８匹のウシに、投与の－１０日目に５００μｇの用量のクロプロステノール（シクラーゼ、Ｓｙｎｔｅｘ）を投与し、ＰＧＦの適用後に発情検出を実施し、ＰＧＦ後に発情を示した１４匹のウシを選択して試験に組み入れた。
[106]合計１８匹のウシに、投与の－１０日目に５００μｇの用量のクロプロステノール（シクラーゼ、Ｓｙｎｔｅｘ）を投与し、ＰＧＦの適用後に発情検出を実施し、ＰＧＦ後に発情を示した１４匹のウシを選択して試験に組み入れた。
[107]全てのウシ（１４匹）に、投与の０日目に膣内デバイス（ＤＩＢ、１グラムのＰ４、Ｓｙｎｔｅｘ）及び２ｍｇの安息香酸エストラジオール（ゴナジオール、Ｓｙｎｔｅｘ）を投与して、新たな卵胞波の出現を投与の４日目にほぼ同期した（Ｂｏら、１９９４）。
[108]４日目に、ウシを２つの群に分けて、２０００ＩＵの天然ｅＣＧ（ｅＣＧ群、ｎ＝７）又は２０００ＩＵの天然ｅＣＧに等しいと推定された３５０μｇの用量のＳｙｎｔｅｘによって生産された産物（ｒｅＣＧ群＃５、ｎ＝７）を投与した。全ての注射の容量は１０ｍｌとし、注射は深部筋肉内であった。
[109]投与の６．５日目に５００μｇの用量のＰＧＦ（シクラーゼ、Ｓｙｎｔｅｘ）、及び７日目に第２の用量を適用し、７日目にＰ４を含有するデバイス（ＤＩＢ １ｇ、Ｓｙｎｔｅｘ Ａｒｇｅｎｔｉｎａ）を除去した。１日後（８日目）、１００μｇの用量のＧｎＲＨ（ゴナシン、Ｓｙｎｔｅｘ）を適用した。
[110]繰返し１の終了（１７日目）の２０日後（反復２の－１０日目）、同じプロトコルを用いてウシに投与したが、この場合、天然ｅＣＧ群のウシにはｒｅＣＧ＃５を投与し、逆もまた同様であった。このように、全てのウシは両投与群を経験した。
[111]卵巣超音波検査を上記の表４及び５に示された日に実施した。卵巣構造を、この目的のために設計したスプレッドシートに描出し記録した。
[112]動物を経直腸超音波検査（Ｃｈｉｓｏｎ５００、７．５ＭＨｚ、ドプラ）によって検査した。直径３ｍｍ超の全ての卵胞を同定し、測定し、卵巣中の位置に関して図示して、それぞれの変化を個々に評価した。使用した追跡技法は、（Ｋｎｏｐｆら、１９８９）の研究に記載され、Ｂｏ（Ｂｏら、１９９４）によって改変された技法であった。評価されるデータは、支配的な卵胞及びその下位の主要な卵胞の直径、卵巣に存在する３ｍｍ超の卵胞の数である。ｅＣＧ又はｒｅＣＧ＃５の注射後、直径８ｍｍ超の全ての卵胞を同定した。ＧｎＲＨの適用後、排卵を、これまでの観察において同定された８ｍｍ超の卵胞の消失と定義した。排卵後、排卵の結果として生じる黄体（ＣＬ）のサイズ及び量を測定した（Ａｄａｍｓら、１９９２）。
[113]他方、表４及び５に示したように、血液試料を投与の１４及び１７日目に採取して、排卵後に結果として生じるプロゲステロン（Ｐ４）レベルを決定した。
[114]全てのウシの頸静脈に穿刺することによって血液試料を取得して、血漿プロゲステロンレベルを決定した。使い捨て針（１８Ｇ）を各動物に対して使用し、血液を、ゴムキャップを備える滅菌１０ｍｌガラス管から採取した。試料は常にヘパリン管において取得し、採取直後に２連（Ａ又はＢ）で、試料を遠心分離し、血漿を－２０℃で凍結し、ウシタグ番号、投与の日数及び時間、並びにＡ又はＢに基づいて正しく同定した。
[115]試料を免疫化学発光法（ＥＣＬＩＡ、コバスモジュールｅ６０１、Ｒｏｃｈｅ）によって処理した。
[116]サイズごと（８～１０ｍｍ、１０～１２ｍｍ、１２～１４ｍｍ、及び１４ｍｍ超）並びに投与の日数当たり（５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、及び１０日目）の卵胞の数の平均をＡＮＯＶＡによって比較した。
[117]投与の日数当たりの排卵の数の平均を、同じ統計値を使用して比較した。
[118]同様に、プロトコルの１４及び１７日目のＰ４レベルを比較した。全ての事例において、投与群効果、反復、及びその相互作用を検討した。インフォスタットソフトウェアを使用した（Ｄｉ Ｒｉｅｎｚｏら、２０１８）。
[119]結果：
[120]反復２におけるｅＣＧ群の１匹のウシは、呼吸器疾患のため、投与の６日目に試験を中止した。このウシは、担当の獣医師の監督下で、研究センターの通常の手順に従って治療された。
[121]いずれの投与日数においても、（サイズに応じた）卵胞の数の間に差は認められなかった（Ｐ＞０．１）。反復効果（Ｐ＞０．０７）も反復相互作用×群（Ｐ＞０．４）も存在しなかった。
[122]これらの結果を、膣内デバイスでの投与期間中の卵胞の数（サイズごとに分類）（プロトコルの５～７日目）に関する情報を観察することができる図１０にも示す。グラフにより、両群に存在する卵胞の量が異ならないことを観察することができる。
[123]同様に、図１１において、プロゲステロンを含有するデバイスを除去した後の卵胞の数を見ることができる。
[124]診断された排卵（８ｍｍ超の卵胞の消失）の全体は、投与の９、１０、及び１１日目の間に生じた（ｅＣＧ群の１匹のウシのみ１１日目に排卵した）。両投与群間で排卵の数に差は認められなかった（Ｐ＝０．８３、表３）。また、反復効果（Ｐ＝０．０６）も反復×群相互作用（Ｐ＝０．８５）も存在しなかった。
[125]両投与群間で投与の１４及び１７日目のＰ４の平均レベルに差（Ｐ＞０．７）は認められなかった。反復効果も認められなかった（Ｐ＞０．９）。以下の表は結果を示す。
[126]図１２は、両群のサンプリング日におけるＰ４のレベルを示す。
[127]取得された結果に基づいて、試験動物に注射したｒｅＣＧ＃５は、天然ｅＣＧ（ノボルモン）によって生じるものと同等の性腺刺激活性をもたらすと結論することができる。この理由は、両群のウシに認められた過剰刺激応答がプロゲステロンを含有するデバイスの除去前及び後で同等であり、デバイスを除去した後に認められた排卵の数も同等であったためである。
[128]他方、卵胞成長の速度が両群で同等であったため、両産物の半減期は同等であると推論可能であるが、半減期を決定するための具体的な試験は将来的に実施されるべきである。
[129]本研究において２０００ＩＵのｅＣＧを使用して認められた排卵率は、生物型が類似しているウシにおいて同じ用量を使用した他の著者ら（Ａｌｆｕｒａｉｊｉら、１９９３；Ｇｏｕｌｄｉｎｇら、１９９６）によって報告された排卵率と同等であった。
[130]投与の１４及び１７日目のＰ４レベルに差は認められず、このことは、各投与群に存在する黄体の機能性及び量が互いに等しいことを示す。
[131]最後に、取得された類似した応答に基づいて、本発明者らは、本研究に使用したｒｅＣＧ＃５はより低い用量（４００ＩＵ）において使用されて、ＦＴＡＩプログラムにおいて取得される無発情肉牛及び乳牛の妊娠率を高めることができると考える。すなわち、ｒｅＣＧ＃５は、この目的のために使用する場合、天然ｅＣＧと同じ効果を有し得る。
Claims (13)
- グリコシル化部位を含む１つ又は複数の配列に連結した、ウマ絨毛性性腺刺激ホルモンのベータ鎖及びアルファ鎖をコードするアミノ酸配列を有することを特徴とする、組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンポリペプチド。
- 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンポリペプチド。
- 請求項１に記載の組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンポリペプチドをコードすることを特徴とする、ＤＮＡ分子。
- 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１１からなる群から選択される配列を有することを特徴とする、請求項３に記載のＤＮＡ分子。
- 請求項３又は４に記載のＤＮＡ分子を含むことを特徴とする、発現ベクター。
- 請求項１又は２に記載の組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンポリペプチドと、薬学的に許容されるビヒクルとを含むことを特徴とする、医薬組成物。
- 哺乳動物の生殖又は排卵に関連する状態の治療のための医薬の製造のためであることを特徴とする、請求項１若しくは２に記載の組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンポリペプチド又は請求項６に記載の医薬組成物の使用。
- 過剰排卵、排卵不全、卵巣発育障害、分娩後発情の誘導、又は睾丸機能低下症において適用されることを特徴とする、請求項１若しくは２に記載の組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンポリペプチド又は請求項６に記載の医薬組成物の使用。
- 哺乳動物におけるものであることを特徴とする、請求項１若しくは２に記載の組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンポリペプチド又は請求項６に記載の医薬組成物の使用。
- 前記動物が、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、シカ、ヤギ、及び実験動物から選択されることを特徴とする、請求項７～９のいずれか一項に記載の使用。
- 請求項５に記載のベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトするステップを含むことを特徴とする、組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンポリペプチドを製造する方法。
- 前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
- 免疫親和性によって組換え一本鎖絨毛性性腺刺激ホルモンを精製するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
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