JP2022546423A - 血流変化部位ターゲッティングナノベシクルを用いた動脈硬化の診断および治療方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、血流変化部位ターゲッティングナノベシクルを用いた動脈硬化の診断および治療方法に関し、より詳細には、本発明は、渦流部位をターゲッティングできるペプチドを利用する抗動脈硬化診断治療プラットフォームである幹細胞由来のナノベシクルを提供し、前記ナノベシクルは、間葉系幹細胞と類似した強力な抗炎症およびプレ内皮修復効果を提供して、動脈硬化の発病を予防できる新しい診断治療剤として使用できる。【選択図】図１ａ

Description

本発明は、血流変化部位ターゲッティングナノベシクルを用いた動脈硬化の診断および治療方法に関する。

動脈硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）は、死亡の主な原因であるが、現在の診断方法は、非可逆的カスケードと関連した早期病因性シグナルを未だ感知しない。病気進行の実質的な危険が残っているが、低いコレステロールレベル、血圧またはプラーク形成を目標とする従来の予防および治療オプションが広く使用されている。分岐点、曲がった領域または末梢で狭窄を来す早期動脈硬化イベントである渦流（ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ）の発生は、血管内皮細胞（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ：ＥＣ）の機能障害を招く。正常血流で、ＥＣは、血流方向に整列され、抗炎症および抗血栓機能を維持する。対照的に、粥状動脈硬化症、渦流は、増加した炎症および血栓性イベントと共にＥＣ機能障害を活性化させて、究極的に動脈硬化を誘発する。この致命的な慢性疾患に対する有望な解決策として提案できる渦流をターゲットとする診断治療（Ｔｈｅｒａｇｎｏｓｔｉｃ）が徹底的に立証されなければならない。

間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）は、免疫反応を調節し、血管平滑筋細胞（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ：ＶＳＭＣ）の増殖を弱化させて、抗動脈硬化治療のための治療的約束を維持することが報告されている。しかしながら、これらの低い生存率および不十分なターゲッティング効率は、臨床的適用のために依然として克服されなければならない。ＭＳＣ由来ナノベシクルは、細胞由来の抗炎症およびプレ再生特性が内在しているだけでなく、細胞相互作用を促進できる向上した生体内循環時間を設ける治療ナノ担体として登場した。心血管疾患、腎臓損傷、肝疾患および神経疾患を含むいくつかの致命的な疾患および損傷に対するナノベシクル基盤治療法を開発しようとする試みにもかかわらず、長期的かつ難しい生産工程で高い収率でサイズ均一性および有効成分の一貫性を維持することは依然として挑戦である。最近の代案のエンジニアリング接近法は、微細気孔ろ過を通じて細胞を物理的に破砕し、生成された細胞膜断片および内部内容物の自己組立を誘導して、細胞由来ナノベシクルを１００倍以上の高い収率で生産することができる。

非可逆的カスケードは、動脈硬化の重要な発病につながり、早期診断および予防に対する不十分な必要性を示す。渦流の形成は、最も速い動脈硬化イベントの一つであり、これは、内皮透過性および後続の単核球動員を増加させる。

本発明の目的は、動脈硬化を誘発する渦流部位にターゲッティングできるペプチドを表面に提示する幹細胞由来のナノベシクルおよびその製造方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記ナノベシクルの動脈硬化の予防、診断および治療的用途を提供することにある。

しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者が明確に理解できる。

上記目的を達成するために、本発明は、渦流（ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ）部位ターゲッティングペプチドを表面に提示する幹細胞由来のナノベシクルを提供する。

本発明は、また、シグナルペプチド－渦流部位ターゲッティングペプチド－トランスメンブレンタンパク質のコーディング配列が順次に挿入されたベクターでトランスフェクションされた幹細胞から渦流部位ターゲッティングペプチドを表面に提示するナノベシクルを得る段階を含む前記ナノベシクルの製造方法を提供する。

本発明は、また、前記ナノベシクルを含む動脈硬化の診断用組成物を提供する。

本発明は、また、前記ナノベシクルを含む動脈硬化の予防または治療用組成物を提供する。

本発明は、また、治療的有効量の前記ナノベシクルを個体に投与する段階を含む動脈硬化の治療方法を提供する。

本発明は、渦流部位をターゲッティングできるペプチドを利用する抗動脈硬化診断治療プラットフォームである幹細胞由来のナノベシクルを提供し、前記ナノベシクルは、間葉系幹細胞と類似した強力な抗炎症およびプレ内皮修復効果を提供して、動脈硬化の発病を予防できる新しい診断治療剤として使用できる。

ＰＲＥＹ／ＭＳＣ由来ナノベシクル（ＰＭＳＣ－ＮＶ）の作動メカニズムおよびＰＲＥＹペプチド提示概略図を示す図であり、具体的に、渦流部位ターゲッティングペプチド（ＰＲＥＹ）は、ファージディスプレイスクリーニングから選別され、特異的に設計されたプラスミドのトランスフェクションおよび発現を通じてＭＳＣ膜（ＰＭＳＣ）の外部に提示される。 ＰＭＳＣ由来ＮＶ（ＰＭＳＣ－ＮＶ）は、一連の微細気孔サイズに制御されたメンブレンを用いた連続押出工程を通じて生産され、ＰＭＳＣ－ＮＶは、ＰＭＳＣと同じトランスメンブレンおよび細胞内成分を含むことを示す図である。 部分頸動脈結紮（Ｐａｒｔｉａｌ ｃａｒｏｔｉｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ：ＰＣＬ）モデルがインビボ試験に使用されることを示す図であり、ＰＭＳＣ－ＮＶを静脈内に投与し、全身に循環するようにして渦流部位をターゲッティングすることでこれらの診断治療性能をテストする。 ＭＳＣ膜の外層にＰＲＥＹを発現させるためのプラスミド設計に対する概略図である。ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ：内膜シグナル）－トランスメンブレンタンパク質－ｖ５タグ（外膜シグナル）－ＰＲＥＹを設計してＰＲＥＹの発現および位置を検証する。 ３種のトランスメンブレンタンパク質（ＣＤ８６、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１）と２種のｈＭＳＣタイプ（ＡＳＣおよびＢＭＳＣ）がペアを成し、ＦＡＣＳ（ｘ軸：ＧＦＰ＋細胞／ｙ軸：Ｖ５タグ＋細胞）を通じてトランスフェクション効率を定量的に比較した結果である。この際、ＣＤ２７１－ＡＳＣペアは、最も高いトランスフェクション効率を有するので、あらかじめ選択した。 トランスフェクション３０分後にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートされたＡｎｎｅｘｉｎ Ｖを用いてＰＲＥＹ－ＣＤ２７１プラスミド用量依存的細胞死滅（０Ｘ：プラスミドなしで電気穿孔および１Ｘ、２Ｘ：１００、２００ｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ／１０^５ ｃｅｌｌｓ）を評価した結果である。 ＧＦＰ（緑色内膜シグナル）およびＰＲＥＹ－ｖ５タグ（赤色外膜シグナル）の位置は、ＰＲＥＹ－ＣＤ２７１－ｖ５タグプラスミドをＡＳＣでトランスフェクションした後、ＰＭＳＣで視覚化した結果であって、赤色および緑色シグナルは、それぞれ細胞膜の外部および内部で主に観察されることを示す。 透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いてＰＭＳＣ－ＮＶのサイズおよび形態分布を測定した結果であり、黄色点線は、ＰＭＳＣ－ＮＶの膜を示す。 トランスフェクションの発現および細胞膜タンパク質ＣＤ９をウェスタンブロットで分析した結果である。 内部ｍｉＲＮＡ成分の保存の有無をｍｉＲＮＡアレイを用いて分析した結果である。 ＰＲＥＹ融合タンパク質を発現するためのベクター設計の模式図を示す図であり、ＰＲＥＹ融合タンパク質の配列遺伝子は、クローニングのためにアンピシリン耐性遺伝子とともに共通ＣＭＶプロモーターバックボーンに挿入する。 ｈＭＳＣタイプによるトランスフェクション効率を調べてみるために、ＰＲＥＹ－ＣＤ２７１プラスミドをトランスフェクションし、２４時間後にそれぞれＢＭＳＣおよびＡＳＣで１Хプラスミドのトランスフェクション効率を示す蛍光イメージである（青色：ＤＡＰＩ染色された核）。 ＢＭＳＣおよびＡＳＣでＰＲＥＹ－ＣＤ２７１プラスミドのトランスフェクション用量（０Ｘ、０．５Ｘ、１Ｘ、２Ｘ）による生存細胞数を測定した結果であって、ＡＳＣの生存細胞数がさらに多いので、ｈＭＳＣタイプとして選択した（＊ｐ＜０．０５ ＢＭＳＣ対ＡＳＣ、＃ｐ＜０．０５対０Ｘ ＢＭＳＣ、＄ｐ＜０．０５対０Ｘ ＡＳＣ）。 ＡＳＣでＰＲＥＹ－ＣＤ２７１プラスミドの用量（０．５Ｘ、１Ｘ、２Ｘ）によるトランスフェクション効率をＦＡＣＳで分析した結果である。 ＰＲＥＹ－ＣＤ２７１の発現を示す共焦点イメージング結果であって、隣接するＡＳＣの細胞膜でＧＦＰおよびＰＲＥＹ－Ｖ５タグの発現を通じてＰＲＥＹ－ＣＤ２７１の発現を確認できる（青色：ＤＡＰＩ染色された核）。 トランスフェクション後、ＡＳＣ（ＰＭＳＣ－ＮＶ）からＮＶを押出する前後のサンプルに対してトランスフェクションの発現および細胞膜タンパク質ＣＤ９水準をウェスタンブロットで分析した結果である（ＭＳＣ－ＮＶ：トランスフェクションされないＡＳＣからＮＶ押出、＊ｐ＜０．０５）。 ＢＭＳＣ（ＢＭＳＣ－ＮＶ）またはＡＳＣ（ＡＳＣ－ＮＶ）由来ＭＳＣ－ＮＶ（ＰＲＥＹトランスフェクションがない）処理により活性化した単核球による抗炎症効果をイメージで示す図であり、単核球は、ＭＳＣ－ＭＶを吸収して抗炎症および食菌阻害を示す。 ＲＡＷ２６４．７細胞およびＭＳＣ－ＮＶをそれぞれＤｉＯ（緑色）およびＤｉＩ（赤色）を使って視覚化したイメージング結果であって、２つのＭＳＣ－ＮＶタイプが全部マクロファージに効率的に内在化することを示す結果である（青色：ＤＡＰＩ染色された核）。 ｑＲＴ－ＰＣＲを通じてマウスＲａｗ ２６４．７細胞でＬＰＳを処理したとき、抗炎症（ＩＬ－１０およびＩＬ－１３）および前炎症性マーカー（ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－α）ｍＲＮＡの発現を測定した結果である。 コンデイションド培地を使用したドットブロットアッセイ結果であって、各タイプの抗炎症サイトカインの右下の黒色ドットの量がナノベシクルを処理したグループで減少したことを示す。左上の黒色ドット（円形の実線で表示）は、試験培地で抗炎症サイトカインの量がすべてのグループにおいて類似していることを示す。 内在化した大腸菌粒子（緑色）の量を測定して食菌活性を分析した結果であって、すべてのＭＳＣ－ＮＶタイプ間の有意な差異はないことを示し、下方のパネルは、ＯＸ－ＬＤＬのＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ ｓｔａｉｎｉｎｇを行った結果であって、ＢＭＳＣ－ＮＶグループを除いてすべてのＮＶ処理グループにおいてｏｘ－ＬＤＬ ｕｐｔａｋｅが減少したことを示し、下記の図表は定量結果である。 ＢＭＳＣ（ＢＭＳＣ－ＮＶ）またはＡＳＣ（ＡＳＣ－ＮＶ）由来のＭＳＣ－ＮＶ（ＰＲＥＹトランスフェクションがない）処理によるＥＣの血管保護効果を示すイメージであり、ＭＳＣ－ＮＶがＥＣ保護を提供し、単核球動員を抑制することによって、ＭＳＣ－ＮＶ吸収によってＥＣ機能障害が復旧されることを示す。 ｉＭＡＥＣ（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｍｏｕｓｅ ＥＣ）およびＭＳＣ－ＮＶをそれぞれＤｉＯ（緑色）およびＤｉＩ（赤色）を使って視覚化したイメージング結果であって、２つのＭＳＣ－ＮＶタイプが両方ともｉＭＡＥＣに効率的に内在化することを示す結果である（青色：ＤＡＰＩ染色された核）。 ｑＲＴ－ＰＣＲを通じてＥＣ機能障害マーカー（Ｅ－セレクチン、ＩＣＡＭ－１およびＶＣＡＭ－１）遺伝子の発現レベルを測定した結果であって、すべてのＭＳＣ－ＮＶ処理により各遺伝子の発現が減少することを示す。 ｉＭＡＥＣでＶＣＡＭ－１（緑色）のタンパク質発現を免疫染色で分析したイメージおよびその定量分析結果である（青色：ＤＡＰＩ染色された核）。 サイクロスポリンＡ（ＣｙＡ）処理により誘導されるＥＣ脈管形成の破裂に対してＢＭＳＣ－ＮＶまたはＡＳＣ－ＮＶ処理による血管保護効果を示す結果であって、２つのＭＳＣ－ＮＶタイプ間には有意差がないことを示す（＊ｐ＜０．０５対ＬＰＳ／食塩水処理群）。 ＣｙＡ処理によるＥＣ脈管形成妨害に対する反応においてＭＳＣ－ＮＶのプレ血管形成効果を分析した図であって、カルセインＡＭでＨＵＶＥＣを染色したイメージおよび脈管構造因子の定量分析結果を示す図である（食塩水処理群対＊ｐ＜０．０５）。 ＶＣＡＭ１発現、脈管破裂および抗血管形成に対する反応においてＰＭＳＣ－ＮＶのプレＥＣ修復効果を示す結果である。 マウスＰＣＬモデルで結紮前（左側）および後（右側）を示す写真であり、４個のＬＣＡ枝のうち３個（ＥＣＡ：外部頸動脈、ＩＣＡ：内部頸動脈およびＯＡ：喉頭動脈）は１０－０ナイロン縫合糸を使って結紮され、上甲状腺動脈（ＳＴＡ）は結紮されないことを示す。 マウスＰＣＬモデルでドップラー超音波イメージングを通じてＬＣＡ後の結紮における渦流形成の検証結果を示す図であって、ＲＣＡイメージ（上段）は、正常な脈動層流を示すのに対し、ＬＣＡイメージ（下段）は、ＲＣＡイメージと比較して流速での有意的な減少とともに異常な前後に動く血流を示す。 マウスＰＣＬモデルで渦流部位でのＰＭＳＣ－ＮＶの診断治療効果を示す図であって、Ｖｉｖｏｔｒａｃｋ６８０標識されたＭＳＣ－ＮＶおよびＰＭＳＣ－ＮＶをマウスにＰＣＬ手術を進め、３日後に全身循環するように静脈内投与した後、２４時間後に生体内イメージングシステム（ＩＶＩＳ）を通じて全体マウス身体でＭＳＣ－ＮＶ、ＰＭＳＣ－ＮＶおよびＰＭＳＣの生体内分布を分析した結果である。 図１３ａと同一に実験を進めた後、採取されたＲＣＡ（対照群）およびＬＣＡ（結紮された）において生体内イメージングシステム（ＩＶＩＳ）を通じてＭＳＣ－ＮＶ、ＰＭＳＣ－ＮＶおよびＰＭＳＣの分布を確認し、これを定量分析した結果である（グループ間の＊ｐ＜０．０５）。 採取されたＲＣＡおよびＬＣＡにおいてフィラミンＡタンパク質の発現、およびＭＳＣ－ＮＶおよびＰＭＳＣ－ＮＶとの共存の有無を免疫染色で分析したイメージ結果およびその定量分析結果である（グループ間＊ｐ＜０．０５および＊ｐ＜０．００１）。 ＰＣＬ手術後に１４日にＬＣＡをＨ＆Ｅ染色したイメージ結果（上段ライン）および新生血管内膜構造パラメーターの定量分析を通じてＰＭＳＣ－ＮＶ処理による新生血管形成阻害を示し、採取されたＬＣＡ（青色：ＤＡＰＩ染色された核）においてＣＤ６８（中間ライン）およびＶＣＡＭ－１（下段ライン）の免疫染色を通じてＥＣによるマクロファージ動員を示す結果である。この際、白色線は、内膜に向かったメディア層の内部境界を示す（＊ｐ＜０．０５対食塩水処理群）。 ＰＣＬマウスにＭＳＣ－ＮＶ、ＰＭＳＣ－ＮＶおよびＰＭＳＣをそれぞれ注射した後、ＩＶＩＳシステムのイメージング（左側）を通じて主要臓器で生体分布を分析したイメージ結果およびその定量分析結果である（ＨＴ：心臓、ＬＧ：肺、ＬＶ：肝、ＳＰ：脾臓およびＫＮ：腎臓）。この際、試験群のうちＬＧにおいてＰＭＳＣ－ＮＶの最も低い蛍光強度は、細胞が肺毛細管捕捉（右側）を外れることができるようにするＰＲＥＹおよびＮＶの相乗役割を示す（グループ間＊ｐ＜０．００１）。 結紮後１４日に動脈硬化性食事を供給したＡｐｏＥ ＫＯおよび正常マウス（ｂａｌｂ／ｃ）のＬＣＡにおいて加速化したアテローム形成を示すイメージおよびその定量分析結果である。動脈硬化性食事を供給されたが、結紮を受けなかったマウスは、ＬＣＡにおいて目に見えるアテローム形成を示さない（ＮＤ：検出不可）。 ＰＣＬマウスモデルにＭＳＣ－ＮＶまたはＰＭＳＣ－ＮＶを処理し、１１日後にマウス臓器（肺、肝、心臓および脾臓）をＨ＆Ｅ染色した結果を示す図である。 ステンレススチール棒（直径＝０．９ｍｍ）を使ってＬＣＡの外科的結紮を誘導してブタＰＣＬモデルを製作し、結紮後に棒を除去した写真、および結紮手術後に正常状態（上）とＬＣＡの部分閉塞状態（下）を示す超音波映像を示す図である（黄色矢印：結紮の上段および下段）。 ドップラー超音波イメージを通じて正常およびＲＣＡ群における一方向層流とは対照的にＬＣＡの結紮点の遠位領域で渦流形成を示す結果である（黄色矢印：血流方向）。 ＲＣＡおよびＬＣＡにおいて内皮層のフィラミンＡ発現を示すイメージ結果である。 ブタでＰＣＬ手術後に３日目にＮＶを静脈内に投与し、２４時間後に血管を採取して分析した結果であって、採取されたＬＣＡ（図１７ｄおよび図１７ｅ）および大動脈弓（図１７ｆおよび図１７ｇ）（自然渦流形成領域）においてＩＶＩＳおよび免疫染色を通じてブタモデルで渦流部位の効果的なＰＭＳＣ－ＮＶターゲッティングを示す結果である（グループ間＊＊＊ｐ＜０．００１）。 ブタＰＣＬモデルでＰＭＳＣ－ＮＶ処理後に２４時間にＲＣＡおよびＬＣＡ（誘導渦流）（左側）および大動脈弓（自然渦流）（右側）のＩＶＩＳイメージング結果を示す図である。 微小流体モデルを用いて渦流下でヒト動脈ＥＣのＰＭＳＣ－ＮＶターゲッティング効率を分析するために、ヒト冠状動脈内皮細胞（ｈＣＡＥＣ）を付着培養し、１２時間後に１日間一方向層流または渦流下で培養した後、１時間の間ＮＶで処理する過程を示す図である。 正常（層）流れおよび渦流パターンをプロットで示す図である。 フィラミンＡの発現（緑色）だけでなく、Ｆ－アクチンの発現（赤色）を通したｈＣＡＥＣの整列を分析するために免疫染色を実施した結果である。 図１９ｃの結果を基に流れ方向へのＦ－アクチン整列を定量的に分析した結果である。 図１９ｃの結果を基に渦流下で細胞質内フィラミンＡの発現レベルを定量的に分析した結果である（グループ間＊ｐ＜０．０５）。 図１９ｃの結果を基にＮＶ蛍光強度を測定して渦流部位でｈＣＡＥＣに対するＭＳＣ－ＮＶおよびＰＭＳＣ－ＮＶのインビトロターゲッティング効率を定量的に分析した結果である（グループ間＊＊＊ｐ＜０．００１）。 図１９ｃの結果を基にＮＶとフィラミンＡの共存を定量的に分析してフィラミンＡのＰＲＥＹターゲッティングを確認した結果である（グループ間＊＊＊ｐ＜０．００１）。 インビトロ微小流体モデルを用いてヒト大動脈ＥＣ（ｈＡＥＣ）をターゲットとするＰＭＳＣ－ＮＶの効率をＩＶＩＳイメージングを通じて分析した結果である。

以下、本発明の構成を具体的に説明する。

本発明は、渦流（ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ）部位ターゲッティングペプチドを表面に提示する幹細胞由来のナノベシクルに関する。

また、本発明は、シグナルペプチド－渦流部位ターゲッティングペプチド－トランスメンブレンタンパク質－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のコーディング配列が順次に挿入されたベクターでトランスフェクションされた幹細胞から渦流部位ターゲッティングペプチドを表面に提示するナノベシクルを得る段階を含む前記ナノベシクルの製造方法を提供する。

本明細書において、「渦流（ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ）」は、血管の構造的特性による異常かつ不規則な血流の流れを意味し、血管内皮細胞の機能障害を招く早期動脈硬化イベントである。

本明細書において、「ナノベシクル（ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅ：ＮＶ）」は、人為的に細胞をフィルターに通過させる方式で粉砕して自己組立により製造されたものを意味し、細胞から抽出したエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）とは異なるものと理解される。

本発明は、渦流部位をターゲッティングするペプチドで機能化された幹細胞由来のナノベシクルを提供する（図１ａ～図１ｃ参照）。

前記渦流部位ターゲッティングペプチドは、配列番号１～５からなる群から選択できる。より具体的に、配列番号１は、ＧＳＰＲＥＹＴＳＹＭＰＨのアミノ酸配列を有するＰＲＥＹペプチド、配列番号２は、ＳＰＲＥＹＴＳＹＭＰＨのアミノ酸配列を有するＭｙｏｆｅｒｌｉｎペプチド、配列番号３は、ＳＬＳＳＹＮＧＳＡＬＡＳのアミノ酸配列を有するＥｙｅｓ ａｂｓｅｎｔ ｈｏｍｏｌｏｇ １ ｉｓｏｆｏｒｍ ２ペプチド、配列番号４は、ＡＣＮＴＧＳＰＹＥＣのアミノ酸配列を有するＺｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ｐａｒｔｉａｌペプチド配列番号５は、ＡＣＴＰＳＦＳＫＩＣのアミノ酸配列を有するＣａｌｓｙｎｔｅｎｉｎ １、ｉｓｏｆｏｒｍ ＣＲＡ＿ｂペプチドである。

本発明のナノベシクルは、従来の渦流部位ターゲッティングペプチド－リポソームと比べて渦流部位ターゲッティングペプチド発現の確認が容易であるが、ナノベシクル抽出前に細胞段階でのＧＦＰ／ｖ５ ｔａｇ ＦＡＣＳ ｓｏｒｔｉｎｇを通じて渦流部位ターゲッティングペプチド発現比率を高めることができる。また、リポソームと比べて、ナノベシクルは、幹細胞に由来する動脈硬化阻害治療物質を自体的に含有している。これは、他の化学薬物と比べて安定性や副作用の危険などに対して長所を有するものである。また、患者由来自己幹細胞を使用できるので、免疫反応などで自由であり、特に間葉系幹細胞由来のナノベシクルは、宿主－免疫拒否反応に対して自由な細胞であり、該間葉系幹細胞の表面マーカーをそのまま有しているＰＭＳＣ－ＮＶも、そのような特徴を有しているので、他家移植に対する可能性もあり、本発明においてマウスおよびブタを用いた前臨床実験を通じてその可能性を一部確認した。また、間葉系幹細胞の宿主－免疫拒否回避機序によってリポソームと比べてマクロファージから自由であることが予想され、これは、ターゲッティング効率の上昇につながることが期待される。

前記ナノベシクルは、公知の形質転換技術を用いてシグナルペプチド－渦流部位ターゲッティングペプチド－トランスメンブレンタンパク質（ＴＭＰ）－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のコーディング配列が順次に挿入されたベクターでトランスフェクションされた幹細胞をサイズ制御方式の押出を通じて分離することができる。

本発明の一具体例によれば、渦流部位をターゲッティングするＰＲＥＹペプチドをＭＳＣ膜の外部に提示するように機能化し、物理的細胞粉砕および後続の自己組立を通じてＮＶを生成するように設計されたプラスミドＤＮＡを使用する。このために、外部Ｎ末端－プロモーター－シグナルペプチド－ＰＲＥＹ－ｖ５タグ－ＴＭＰ－ＧＦＰ－内部Ｃ末端構造のプラスミドを構築する（図２ａ～図２ｇ、図３参照）。前記シグナルペプチドは、ＰＲＥＹペプチドの細胞膜外部への局所化を誘導し、切断を通じて誘導シグナルを不活性化させることができる。前記ｖ５タグおよびＧＦＰは、ＰＲＥＹの位置および発現レベルをモニタリングするために使用できる。本発明の一具体例によれば、細胞膜の内側にＧＦＰ、細胞膜の外側にｖ５タグおよびＰＲＥＹペプチドが発現する。

また、渦流部位ターゲッティングペプチド発現を改善するために、トランスメンブレンタンパク質（ＴＭＰ）を使用することによって、渦流部位を探索およびターゲッティングするペプチドの能力を最大化させることができる。したがって、前記トランスメンブレンタンパク質は、
ｉ）幹細胞またはナノベシクルで発現するタンパク質でありうる。例えば、前記トランスメンブレンタンパク質は、ＣＤ８６のようなエキソソームマーカー、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１のような間葉系幹細胞マーカーなどを使用できる。
ｉｉ）タンパク質のＮ末端とＣ末端が細胞膜を間にして反対方向に向かって位置しなければならない。

好ましくは、トランスフェクション効率が高いＣＤ２７１を使用できる。

前記シグナルペプチドは、Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆ（ＢＫＵ００２５８７，Ｋｏｒｅａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）およびＳｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒ（ＢＫＵ００８３９６，Ｋｏｒｅａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を使用できるが、これらに制限されない。

前記シグナルペプチド－渦流部位ターゲッティングペプチド－トランスメンブレンタンパク質－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のコーディング配列は、核酸配列であり、前記核酸は、最も広義的な意味に使用され、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、（－）－ＲＮＡ、（＋）－ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなどを含む。好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。

好ましくは、前記シグナルペプチド－渦流部位ターゲッティングペプチド－トランスメンブレンタンパク質のコーディング配列でＤＮＡを選択する場合、発現ベクターに挿入された形態で使用できる。

本明細書において、用語「ベクター」は、自分に連結された他の核酸を運搬できる核酸分子をいう。ベクターの一タイプとして、「プラスミド」があるが、プラスミドとは、追加のＤＮＡセグメントを結紮させることができる円形の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターのさらに他のタイプとしては、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムで結紮させることができるウイルスベクターがある。一部のベクターは、宿主細胞に導入されるとき、該宿主細胞内で自己複製することができる（例えば、バクテリア複製起点を有するバクテリアベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されるとき、宿主細胞のゲノムに統合されて、宿主ゲノムと共に複製されうる。また、一部のベクターは、これらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示できる。本明細書においてこのようなベクターを「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）という。一般的に、組換えＤＮＡ技法に有用な発現ベクターは、一般的にプラスミドの形態であり、プラスミドが最も一般的に使用されるベクタータイプであるから、「プラスミド」と「ベクター」は、互いに交換して使用できる。しかしながら、本発明は、同等な機能を提供するウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター）のような他の形態の発現ベクターをも含む。好ましくは、レンチウイルスベクターを使用できる。形質転換は、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入するいかなる方法も含まれ、当該分野において公知となっているように、宿主細胞によって好適な標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、炭化珪素繊維を用いた撹拌、アグロバクテリウム媒介形質転換、ＰＥＧ、硫酸デキストラン、リポフェクタミンなどが含まれるが、これらに制限されない。

前記幹細胞は、骨髄、臍帯、臍帯血、胎盤、血液、皮膚、脂肪組織、神経組織、肝、膵胆道、筋肉および羊膜からなる群から選ばれた１種以上の組織由来の幹細胞；間葉系幹細胞；胚性幹細胞；または誘導万能幹細胞などを使用できる。好ましくは、抗動脈硬化特性を有するｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１０、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１４３およびｌｅｔ ７のようなｍｉＲＮＡを含む幹細胞を使用できる。例えば、トランスフェクション効率が高く、細胞死滅比率が低い脂肪由来幹細胞を使用できる。

本発明の一具体例によれば、本発明のナノベシクルは、ＰＲＥＹペプチドを発現するベクターでトランスフェクションされた幹細胞に対して１０μｍ、５μｍおよび４００ｎｍの多孔性メンブレンを順次に変えながら、押出を通じて得ることができる。本発明の一具体例によれば、ＴＥＭおよびＤＬＳ分析結果、それぞれ約４７．２±１２．１ｎｍおよび約８３．７±２０．６ｎｍの平均を有するナノベシクル直径の均一な分布を得ることができ、幹細胞のＤＬＳにおける１４．９±２．０μｍ直径より小さい。

本発明のナノベシクルは、幹細胞の細胞内成分と比較して、押出後にも細胞内成分を保有していて、抗動脈硬化ｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１０、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１４３およびｌｅｔ ７のレベルが押出時に増加することを特徴とする。

本発明のナノベシクルは、ＬＰＳ処理により活性化したマクロファージに処理すると、抗炎症性サイトカインの遺伝子発現を増加させて抗炎症効果を示すことを特徴とする。また、酸化したＬＤＬの吸収によるマクロファージの泡沫細胞形成は、ＶＳＭＣの表現型変化および内部成長が結果的に誘導されるので、動脈硬化発達の重要な部分である。この結果は、ナノベシクルこの動脈硬化過程を予防できることを示唆する。

また、ｉＭＡＥＣの前炎症性機能障害を活性化させて、ナノベシクル処理による内皮細胞修復効果をテストした結果、内皮細胞は、Ｅ－セレクチン、ＩＣＡＭ－１およびＶＣＡＭ－１を優勢に発現して機能障害活性化時に炎症細胞を動員するので、これらのマーカーの遺伝子発現を測定すると、ＬＰＳ処理により全部上向き調節されるが、ナノベシクルを処理すると、有意的に下向き調節されて、ナノベシクルは内皮細胞修復効果を示す。また、ＨＵＶＥＣでＣｙＡ処理に対してナノベシクルはプレ内皮細胞修復およびプレ血管形成効果を向上させる。

また、マウスおよびブタＰＣＬモデルでナノベシクルの渦流部位ターゲッティング効果をテストした結果、渦流部位ターゲッティングペプチドであるＰＲＥＹペプチドは、渦流部位で過発現するフィラミンＡをターゲットとすることが分かり、動脈硬化の早期進行を予防する相乗的診断治療効果を確認できる。また、インビトロ微小流体モデルでナノベシクルは、フィラミンＡと共存し、渦流条件で増加して、ナノベシクルの診断治療的潜在力を立証する。

また、本発明のナノベシクルは、全身循環後に心臓、肺、肝および脾臓で目につく毒性効果を有さない対照群の発現レベルに減少する。

したがって、本発明は、また、前記ナノベシクルを含む動脈硬化の予防、診断および治療用組成物を提供する。

本発明の動脈硬化の予防または治療用組成物は、インビトロ、インビボまたはエクスビボで予防、診断または治療的用途に適した組成物を成す活性成分および活性または不活性な薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。

前記薬学的に許容可能な担体は、リン酸緩衝生理食塩水、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどを含むタンパク質賦形剤のように、ナノベシクルと混用可能な任意の薬学的担体を含む。担体、安定化剤および補強剤の例は、Ｍａｒｔｉｎ ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ、１８ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９９５））およびｔｈｅ “ＰＨＹＳＩＣＩＡＮ’Ｓ ＤＥＳＫ ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ”，５８ｎｄ Ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ．（２００４）を参照する。用語「担体」は、緩衝液またはｐＨ調整剤を含んでもよく、典型的に、緩衝液は、有機酸または塩基から製造された塩である。代表的な緩衝液としては、クエン酸の塩、アスコルビン酸の塩、グルコン酸の塩、カーボン酸の塩、酒石酸の塩、コハク酸の塩、酢酸の塩またはフタル酸の塩などの有機酸塩；トリス、トロメタミンヒドロクロリドまたはホスフェート緩衝液を含む。さらなる担体として、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば、シクロデキストリン、例えば２－ヒドロキシプロピル－クアドラチャ（ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ）－シクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、抗酸化剤、抗帯電剤、界面活性剤（例、「ＴＷＥＥＮ（登録商標） ２０」および「ＴＷＥＥＮ（登録商標） ８０」などのポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）およびキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）などのポリマー賦形剤／添加剤を含む。また、氷結防止剤または降下剤を含んでもよい。

本発明の動脈硬化の予防、診断または治療用組成物は、多様な適正剤形に製造することができる。例えば、動脈内（関節で）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、結節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）および皮下経路のような非経口投与に適した剤形と担体は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および剤形を目的するレシピエントの血液と等張性にする溶質、および懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。静脈内または腹腔投与が好適な方法である。個体に投与された細胞の投与量は、時間の経過につれて個体で目的する有益な治療的反応を達成するのに有効な量である。例えば、注入前に個体から血液試料を収得した後、保管して、後続的な分析および比較に使用する方式で実施することができる。一般的に、少なくとも約１０^４～１０^６および典型的に１×１０^８～１×１０^１０個の細胞を７０ｋｇの患者に略６０分～１２０分にわたって静脈内または腹腔内に注入できる。投与の場合、個体の全般的健康状態および体重を考慮して、本発明のナノベシクルを細胞のタイプによるＬＤ－５０（またはその他毒性測定方法）および多様な濃度での細胞のタイプによる副作用によって決定された割合で投与する。投与は、一回にまたは多回に分けて投与できる。本発明のナノベシクルは、細胞毒性剤、ヌクレオチド類似体および生物学的反応変形剤を含む公知の通常の治療法を使って他の特定症状に対する治療を補充できる。同様に、生物学的反応変形剤は、本発明のナノベシクルによる治療に選択的に追加できる。

本発明は、また、治療的有効量の前記ナノベシクルを個体に投与する段階を含む動脈硬化の治療方法を提供する。

動脈硬化の治療方法に使用されるナノベシクルおよび投与方法は、前記で記述したので、この両者に共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

前記個体は、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ヒトなどの哺乳動物であってもよいが、これらに制限ない。

本発明のメリットおよび特徴、そして、それらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すると明確になる。しかしながら、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態で具現されるものであり、単に本実施例は、本発明の開示を完全にし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、ただ本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されると解されないことは、当該分野における通常の知識を有する者に自明だろう。

＜実施例１＞ＰＲＥＹペプチド－ナノベシクル（ＮＶ）の製造および特性糾明
（ＰＲＥＹ発現のためのプラスミド設計およびクローニング）
細胞膜でＰＲＥＹを外部に発現させ、局所化するプラスミドは、外部側Ｎ末端－プロモーター－シグナルペプチド－ＰＲＥＹ－Ｖ５－ＴＭＰ－ＧＦＰ－内部側Ｃ末端で構成される。シグナルペプチドは、Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆ（ＢＫＵ００２５８７，Ｋｏｒｅａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）またはＳｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒ（ＢＫＵ００８３９６，Ｋｏｒｅａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を使用する。プラスミド配列で、ｉ）シグナルペプチドは、ＰＲＥＹペプチドの細胞膜外部への局所化を誘導し；およびｉｉ）Ｖ５タグおよびＧＦＰは、ＰＲＥＹの位置および発現レベルをモニタリングする。発現ベクターは、ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ）を使って製造メーカーの説明書に従ってクローニングした。シグナルペプチドおよびトランスメンブレンタンパク質の各タイプは、次の鋳型を用いたＰＣＲを通じて別に増幅した：Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆ（ＢＫＵ００２５８７，Ｋｏｒｅａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）、Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒ（ＢＫＵ００８３９６，Ｋｏｒｅａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）、ＣＤ８６、ＣＤ１０５および切断されたＣＤ２７１（ＬＮＧＦＲ）に対しては、ＮＧＦＲ（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃２７４８９；Ａｄｄｇｅｎｅ，ＭＡ）。ベクター成分は、プラスミド合成（Ｍａｃｒｏｇｅｎ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）と共にＣａｓ９－ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｐ３Ｓ－Ｃａｓ９－ＨＮ（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃１０４１７１）バックボーンに挿入された。この手順に従ってＰＣＲ増幅およびギブスンクローニングを行った。すべてのプライマーおよびプラスミドは、表１および２に羅列される。

（トランスフェクション効率測定）
ＰＲＥＹトランスフェクション効率は、２種のＭＳＣタイプ（ＡＳＣおよびＢＭＳＣ）と比較してトランスフェクション後１日に定量的分析と共にＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ）を使ってフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を通じてトランスメンブレンタンパク質の試験候補物質（ＣＤ８６、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１）の中で比較した。したがって、細胞は、抗ｖ５タグ１次抗体（ａｂ２７６７１，Ａｂｃａｍ，ＭＡ）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートされた２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＰＡ）で免疫染色された。プラスミド用量依存性細胞死滅を評価するために、トランスフェクションされたＡＳＣおよびＢＭＳＣをトランスフェクション後３０分に採取し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートされたＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ）で免疫染色し、フローサイトメトリーを行った。また、トランスフェクション後１日目にトリパンブルー染色を通じて生存細胞数を計数した。

（ＮＶ押出）
トランスフェクション後３日にヒトＡＳＣ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＢＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＰＭＳＣをＰＢＳで２回洗浄し、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡで脱着させた。次に、ナノベシクルを生成するために、ＰＢＳに溶かした細胞懸濁液１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを押出キット（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，ＡＬ）を使って１０μｍ、５μｍおよび４００ｎｍ気孔サイズのポリカーボネートメンブレンフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，ＵＫ）を順次に変えながら６回押出させた。１５，０００ｇで３０分間遠心分離してＮＶを収集した。次に、ペレットをＰＢＳに再懸濁させ、０．２０μｍ注射器フィルター（Ａｖａｎｔｅｃ，Ｊａｐａｎ）を用いてろ過し、使用時まで－７０℃で保管した。ＰＭＳＣ－ＮＶのサイズおよび形態は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ；ＪＥＭ－Ｆ２００，ＪＥＯＬ，Ｊａｐａｎ）および動的光散乱（ＤＬＳ；ＥＬＳ－１０００ＺＳ，Ｏｔｓｕｋａ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｊａｐａｎ）により測定された。

（インビトロ抗炎症効果の測定）
ＲＡＷ２６４．７細胞を２４ウェルプレートにシーディングした（５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。ＲＡＷ２６４．７細胞の前炎症性活性化は、２４時間の間ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；１００ｎｇ／ｍＬ）処理後に２４時間の間ＡＳＣ－ＮＶまたはＢＭＳＣ－ＮＶ（１０μｇ／ｍＬ）処理を通じて誘導された。細胞性吸収を視覚化するために、ＲＡＷ２６４．７細胞およびＮＶをそれぞれＤｉＯおよびＤｉＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で標識し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７８０；Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で映像化した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析のために、ＮＶ処理後に２４時間に細胞を採取した。ＩＬ－１０、ＩＬ－１β、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αのプライマー配列は、表３に羅列されている。マウス炎症抗体アレイ（ａｂ１３３９９９，Ａｂｃａｍ）を用いたサイトカイン分析のために、製造メーカーの説明書に従って細胞上澄み液を採取した。ＭＳＣ－ＮＶの抗食菌効果は、Ｖｙｂｒａｎｔ^ＴＭ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｖ６６９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，ＯＲ）を使って製造メーカーの説明書に従って測定した。イメージは、共焦点顕微鏡を通じて得、蛍光強度は、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（登録商標） ＬＵＸ ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ）を使って測定した。

（インビトロプレＥＣ修復効果の評価）
ｉＭＡＥＣ（ＡＴＣＣ，ＶＡ）を２４ウェルプレートにシーディングしてから（１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、２４時間の間ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）を処理した。次に、追加で２４時間の間ＡＳＣ－ＮＶ、ＢＭＳＣ－ＮＶまたはＰＭＳＣ－ＮＶ（１０μｇ／ｍＬ）を処理した。細胞吸収を視覚化するために、ｉＭＡＥＣおよびＮＶをそれぞれＤｉＯおよびＤｉＩで標識し、共焦点顕微鏡を用いて映像化した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析のために、ＮＶ処理後に２４時間にｉＭＡＥＣを採取した。Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＩＣＡＭ－１およびＶＣＡＭ－１のプライマー配列は、表３に羅列した。ｉＭＡＥＣは、ＶＣＡＭ－１抗体（ａｂ１３４０４７，Ａｂｃａｍ）で免疫染色し、ＩｍａｇｅＪを用いて定量的分析と共に共焦点顕微鏡を用いて映像化した。ＮＶ（１０μｇ／ｍＬ）およびＣｙＡ（２５μｇ／ｍＬ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）をＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ）に処理し、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＡ）でそれぞれ２時間および２４時間の間培養して、抗血管形成および脈管破裂に対するプレＥＣ修復効果を測定した。イメージは、共焦点顕微鏡を用いて得、ＩｍａｇｅＪを用いて定量化した。

（マウスＰＣＬモデル）
すべての動物研究は、延世大学校医科大学の施設内の動物管理および使用委員会（ＩＡＣＵＣ）が承認した手続き（２０１８－００４４）によって行われた。手術手続きは、６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃ（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ Ｉｎｃ，韓国）またはＫＯＲ－ＡｐｏＥ（ｓｈｌ）（ＳＬＣ，Ｊａｐａｎ）マウスで行われた。ＰＣＬ手術のために、ザイラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびゾレチル（５０ｍｇ／ｋｇ）混合物の腹腔内注射を通じて麻酔させた。首のひげを剃り、ベタジンを用いて消毒した。次に、中間線切開を行った（５ｍｍ）。ＬＣＡ露出後、ＬＣＡの４種の枝のうち３個（ＥＣＡ、ＩＣＡ、ＯＡ）を１０－０ポリアミド縫合糸で結紮し、ＳＴＡは結紮させなかった状態にした。次に、切開部を６－０シルク縫合糸で縫い合わせた。それから、マウスをモニタリングし、動脈硬化性食事（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，ＮＪ）を供給し、結紮後３日にＭＳＣ－ＮＶ、ＰＭＳＣまたはＰＭＳＣ－ＮＶを静脈投与した。

（マウスＰＣＬモデルでターゲッティング効率および抗動脈硬化効果の測定）
渦流部位のインビボＰＭＳＣ－ＮＶターゲッティング効率は、試験群の注射後２４時間にＩＶＩＳイメージング（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＷＡ）および組織学的分析を通じてマウスＰＣＬモデルで測定した。ＭＳＣおよびＮＶ群は、ＶｉｖｏＴｒａｃｋ ６８０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で３０分間標識され、ＰＣＬモデルに注射された。次に、イソフルランで呼吸麻酔下でＩＶＩＳイメージングを行った。それから、マウスを犠牲にさせ、これらのＬＣＡｓ、ＲＣＡｓおよび主要臓器を採取して、エクスビボＩＶＩＳイメージングおよび組織学的分析を行った。ＬＣＡおよびＲＣＡの組織セクションは、抗フィラミンＡ抗体（ａｂ５１２１７，Ａｂｃａｍ）で免疫染色し、相当する蛍光強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使って定量化した。組織セクションは、また、Ｈ＆Ｅで染色したり、抗ＣＤ６８抗体（ａｂ１２５２１２，Ａｂｃａｍ）および抗ＶＣＡＭ－１抗体（ａｂ１３４０４７，Ａｂｃａｍ）で免疫染色した。新生血管内膜（Ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）構造因子（新生血管内膜対新生血管内膜＋ルーメンの面積比率、新生血管内膜対培地の面積比率および新生血管内膜面積）または相当する蛍光強度をＩｍａｇｅＪを使って定量的に分析した。

（ブタＰＣＬモデルでターゲッティング効率の測定）
ＰＣＬ手術は、２５～３０ｋｇ重量の雌ヨークシャーブタ（ＸＰ ｂｉｏ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）で以前の研究に従って行った。ブタに前処置（ｐｒｅｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）としてアトロピン（０．０４ｍｇ／ｋｇ）、ザイラジン（２ｍｇ／ｋｇ）およびアザペロン（２ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内注射した。マウスは、アルファキサン（１ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、手術中に２％イソフルランの器官内挿管によりこの状態に維持された。首は、ベタジンを使って消毒し、次に、中間線皮膚切開を行った。滅菌されたステンレススチール棒（外径＝０．９ｍｍ）をＬＣＡにスペーサーとして配置し、５－０シルク縫合糸とともに結紮した。棒を順次に除去し、縫い合わせて、切開を防いで、頸動脈の８０％閉塞を誘発した。ＲＣＡは、正常群として結紮なしで放置された。血流パターンは、超音波（Ｓ２２Ｖ；ＳｏｎｏＳｃａｐｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｃｈｉｎａ）により観察された。Ｖｉｖｏｔｒａｃｋ６８０標識されたＭＳＣ－ＮＶまたはＰＭＳＣ－ＮＶを結紮後３日に耳静脈（１ｍｇ／ｐｉｇ）を通じて静脈内注射し、ブタを注射後１日または２１日に犠牲にさせた。エクスビボＩＶＩＳおよび組織学的分析のためにＲＣＡ、ＬＣＡおよび大動脈弓を採取した。これらの組織セクションは、抗フィラミンＡ抗体および抗ＣＤ３１抗体（ｓｃ－１５０６，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）で免疫染色され、次に、ＩｍａｇｅＪ分析と共に蛍光イメージングを行った。

（インビトロ血流モデルでヒトＥＣのターゲッティング効率の測定）
以前に記述された通り（Ｓｅｉ，Ｙ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，１００１９，２０１７）、微小流体装置は、ソフトリソグラフィーによりポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ，Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＭＩ）で製造し、ガラスカバースリップ（ＶＷＲ，ＰＡ）と結合させてポリスチレンボックス（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．，ＣＡ）に入れた。装置は、７０％エタノールで滅菌し、ＰＢＳで洗浄した。次に、５０μｇ／ｍＬのコラーゲンＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＭＡ）で３７℃で１時間の間チャネルをコーティングした。ヒト冠状動脈内皮細胞（ｈＣＡＥＣ；Ｌｏｎｚａ）またはヒト大動脈内皮細胞（ｈＡＥＣ；Ｌｏｎｚａ）を１２時間の間チャネルに（２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで）シーディングした。各装置の排出口は、ＰｈＤ Ｕｌｔｒａシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，ＭＡ）に連結されて、正常な培地流れおよび渦流が形成されるようにした。正常な層流を形成するために、２２．５μｌ／ｍｉｎの培地を１０ｄｙｎｅ／ｃｍ^２のせん断応力で灌流させた。渦流は、それぞれ２２．５μｌ／ｍｉｎ（１０ｄｙｎｅ／ｃｍ^２）および２０μｌ／ｍｉｎ（９ｄｙｎｅ／ｃｍ^２）の流速で培地を注射および除去する反復サイクルを通じて生成した。ヒトＥＣをどちらか一方の流れタイプに露出させた後、ＮＶ（１０μｇ／ｍＬ）を３７℃で１時間の間チャネルに灌流させた。各試験群においてヒトＥＣへのＮＶ吸収は、ＩｍａｇｅＪを使って定量的に分析された。

（ｑＲＴ－ＰＣＲおよびｍｉＲＮＡアレイ）
トータルＲＮＡは、製造メーカーの説明書に従って１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って各サンプルから抽出された。ＲＮＡをジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）ウォーターに溶かし、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を使ってｃＤＮＡを合成した。次に、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＰＣＲを行った。グリセルアルデヒド３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をハウスキーピング遺伝子として提供し、各マーカーの遺伝子発現は、相対定量化方法２－ΔΔ^Ｃｔを使って測定した。プライマー配列は、表３に羅列した。溶解したＲＮＡは、ｍｉＲＮＡアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ ４．０ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ；Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ，Ｊａｐａｎ）を使って製造メーカーの説明書に従ってプロファイリングした。

（細胞および組織の免疫蛍光染色）
細胞サンプルを４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間固定し、組織サンプルは、１０％パラホルムアルデヒドで３日間固定し、両方とも室温で行った。固定されたサンプルは、ＰＢＳで洗浄し、パラフィンに固定して、組織セクションを作成した。次に、一連のキシレンおよびエタノール溶液（蒸留水内で１００％、９５％、８０％、７０％ ｖ／ｖ）を用いてこれらを水和させ、抗原修復のためにペプシン試薬（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を３７℃で３０分間処理した。次に、組織セクションにブロッキング溶液（５％ウシ胎児血清アルブミン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＤ）＋０．３％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））を１時間の間室温で処理した。１次抗体は、抗ｖ５タグ抗体（ａｂ２７６７１，Ａｂｃａｍ）、抗ＶＣＡＭ－１（ａｂ１３４０４７，Ａｂｃａｍ）、抗ＣＤ６８（ａｂ１２５２１２，Ａｂｃａｍ）、抗Ｆｉｌａｍｉｎ Ａ（ａｂ５１２１７，Ａｂｃａｍ）および抗ＣＤ３１（ｓｃ－１５０６，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）である。これらの抗体は、１：１００で希釈してＰＢＳに処理し、次に、後続２次抗体を１：２００で希釈してＰＢＳに処理した。２次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４にコンジュゲートされた抗マウス抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４にコンジュゲートされた抗ウサギ抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートされた抗ウサギ抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートされた抗ヤギ抗体（ａｌｌ ｆｒｏｍ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。次に、サンプルを載置し、４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ）を含有するマウンティング溶液で対比染色させて、細胞核を視覚化した。

（ウェスタンブロット分析）
サンプルをＲＩＰＡバッファー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶解させて総タンパク質を収得し、タンパク質の濃度は、ブラッドフォードアッセイ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使って測定した。タンパク質抽出物を１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、ニトロセルロースメンブレン上に移動させた。メンブレンを５％（ｗ／ｖ）スキムミルクとともにＴＢＳＴ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．９％ＮａＣｌ、０．１％ツイン２０、ｐＨ７．４）で遮断した後、１次抗体である抗ｖ５タグ（ａｂ２７６７１，Ａｂｃａｍ）、抗ＣＤ２７１（３４５１０２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＣＡ）、抗ＧＦＰ（ａｂ３２１４６，Ａｂｃａｍ）、抗ＣＤ９（ａｂ９２７２６，Ａｂｃａｍ）および抗β－アクチン（ａｂ８２２７，Ａｂｃａｍ）とインキュベーションした。次に、２次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰコンジュゲートおよびヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰコンジュゲートされた抗体（全部Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を製造メーカーの説明書に従って適用した。シグナルは、ＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ）を使って製造メーカーの説明書に従って視覚化とＬＡＳ－３０００イメージ リーダー（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｊａｐａｎ）を使って分析した。

（統計分析）
定量的データは、平均±標準偏差（ｓｔｄｅｖ）で表示される。結果は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ １２．０（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用したＴｕｒｋｅｙ’ｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔで一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）により統計的に分析された。

＜実験例１＞膜の外部へのＲＰＥＹ提示
ＮＶが渦流部位をターゲッティングできるようにするために、ターゲッティングペプチドであるＰＲＥＹをＭＳＣ膜（ＰＭＳＣ：ＰＲＥＹ－発現ヒトＭＳＣ）全体にわたって特異的に設計されたプラスミドを発現させることによって外部に提示した。プラスミドは、Ｎ末端でシグナルペプチドとともにＰＲＥＹ細胞外ドメインを発現するように設計されることによって、シグナルペプチドは、ＭＳＣ膜からＰＲＥＹ細胞外ドメインの外部側局所化を誘導し、切断を通じて誘導シグナルを不活性化させることができる。

また、ＰＲＥＹ発現を改善するための３個のトランスメンブレンタンパク質（ＴＭＰ）、すなわちエキソソームマーカー（ＣＤ８６）およびＭＳＣマーカー（ＣＤ１０５およびＣＤ２７１）の能力をテストした。このような方式で渦流部位を探索およびターゲッティングするＰＲＥＹの能力を最大化させた。ＰＲＥＹは、Ｖ５タグと連結した後、ＧＦＰ（外部Ｎ末端－プロモーター－シグナルペプチド－ＰＲＥＹ－Ｖ５タグ－ＴＭＰ－ＧＦＰ－内部Ｃ末端）と連結されて、細胞膜の外部および内部でＰＲＥＹの局所化および発現レベルを確認した（図２ａ、図３）。

３個のトランスメンブレンタンパク質を有する試験群のうち脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）および骨髓由来幹細胞（ＢＭＳＣ）は、いずれも、ＰＲＥＹ－ＣＤ２７１（神経成長因子受容体：ＮＧＦＲ）の発現レベルが、ＰＲＥＹ－ＣＤ８６およびＰＲＥＹ－ＣＤ１０５の発現レベルよりさらに高くて、優れたトランスフェクション効率を示した（図２ｂ、図４ａ～図４ｃ）。ＰＲＥＹ－ＣＤ２７１プラスミドの用量が増加した場合、発現レベルは、用量依存的に増加したのに対し、２Х用量のトランスフェクション後に細胞生存能は急激に減少した（図２ｃ、図４ａ～図４ｃ）。したがって、細胞生存能との均衡を考慮して、プラスミド用量を１×（１×１０^６細胞当たり１μｇのＰＲＥＹ－プラスミド）に決定した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋で死んだ細胞数を比較すると、トランスフェクション後にＢＭＳＣより生存可能なＡＳＣがさらに多く、これは、ＡＳＣがＰＲＥＹトランスフェクションより適合した供給源であることを示す（図２ｃ、図４ａ～図４ｃ）。

ＭＳＣ膜でＰＲＥＹの外部提示を確認するために、配列でＰＲＥＹのそばにあるとき、Ｖ５タグを免疫染色した（外部Ｎ末端－プロモーター－シグナルペプチド－ＰＲＥＹ－Ｖ５－ＴＭＰ－ＧＦＰ－内部Ｃ末端）。２つの形式のうちいずれも２つの情報タイプを全部明確に得るように作動しなかったため、ＰＭＳＣの付着された（図５）および懸濁された（図２ｄ、図１ａ～図１ｃ）形態をそれぞれＰＲＥＹの発現レベルおよび位置を測定するために使用した。

付着性形態で、ＰＲＥＹは、ｖ５タグおよびＧＦＰシグナルにより提示されたように、細胞膜に沿って高度で発現することによって、成功的なトランスフェクションを示した。ゼラチンハイドロゲルに細胞を挿入して懸濁された形態を形成すると、共焦点イメージは、それぞれ、ＭＳＣ膜境界の外部および内部でｖ５タグ（赤色）およびＧＦＰ（緑色）シグナルの外観を示すことによって、細胞膜の外部でのＰＲＥＹ提示を確認した。

＜実験例２＞ナノベシクルの押出および特性糾明
ＰＭＳＣ－ＮＶを生産するために、気孔直径を１０μｍ～５μｍまでおよび最後に０．４μｍに次第に低減しながら、一連のポリカーボネート微細気孔膜を通じてＰＭＳＣを順次に押出させた（図１ｂ）。ＴＥＭ結果（図２ｅ）は、４７．２±１２．１ｎｍの平均を有するＰＭＳＣ－ＮＶ直径の均一な分布を示す。また、トランスフェクションおよびＮＶ押出中にＰＲＥＹ－ペプチド（ＧＦＰおよびｖ５タグ）の完全な保存およびエキソソーム特性（ＣＤ９）は、ウェスタンブロット分析を通じて測定した（図２ｆ、図６）。

次に、ＭＳＣ－ＮＶ、ＰＭＳＣおよびＰＭＳＣ－ＮＶで内部成分を比較してＰＲＥＹトランスフェクションおよびＮＶ押出後に細胞内成分の保存を確認した。ｍｉＲＮＡは、重要な治療剤として提供し、大多数は、エキソソームにより伝達される。ＮＶは、本質的にエキソソームと類似しているので、ＰＭＳＣ－ＮＶ、ＭＳＣ－ＮＶ、およびＰＭＳＣのｍｉＲＮＡ内容物は、ｍｉＲＮＡアレイによりプロファイリングされた（図２ｇおよび表４および５、図６）。トランスフェクション（ＭＳＣ－ＮＶ対ＰＭＳＣ－ＮＶ）および押出工程（ＰＭＳＣ対ＰＭＳＣ－ＮＶ）は、トータルｍｉＲＮＡの２．７２および６．７１％に対して２倍以上発現レベルを変えて、これらの生産中に細胞内内容物の保存を立証する。抗動脈硬化ｍｉＲＮＡのうち、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１０、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１４３およびｌｅｔ ７のレベルは、押出中に増加するが、他のｍｉＲＮＡは、ＭＳＣからＮＶ生産中にこれらの発現レベルを維持した。

＜実験例３＞ＭＳＣ－ＮＶのインビトロ抗炎症効果
ＭＳＣおよびＭＳＣに由来する細胞内の内容物が強力な抗炎症効果を示すことはよく知られている。したがって、ＢＭＳＣ－ＮＶおよびＡＳＣ－ＮＶの抗炎症効果は、ＰＲＥＹトランスフェクション前にテストした（図７ａ）。マウス単核球／マクロファージ（ＲＡＷ２６４．７ ｃｅｌｌｓ）にＭＳＣ－ＮＶを処理してこれらの炎症反応を抑制した。活性化マクロファージによるＭＳＣ－ＮＶの効果的な細胞性吸収は、それぞれ、ＤｉＯおよびＤｉＩで細胞およびＭＳＣ－ＮＶを視覚化して確認した（図７ｂ）。ＡＳＣ－ＮＶおよびＢＭＳＣ－ＮＶは、両方とも活性化マクロファージにより類似に吸収された。

ＭＳＣ－ＮＶ、ＡＳＣ－ＮＶおよびＰＭＳＣ－ＮＶの抗炎症活性は、ｑＲＴ－ＰＣＲ（図７ｃ）、ドットブロットサイトカインアレイ（図７ｄ）および食菌作用アッセイ（図７ｅ）を通じて分析した。抗炎症性インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）とＩＬ－１３遺伝子発現は上向き調節されるが、前炎症性マーカー（ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α）はそうでないので、これは、ＭＳＣ－ＮＶによるマクロファージの抗炎症性潜在力が、ＭＳＣから排出後にも維持されることを示す。これらの結果は、また、コンデイションド培地から分泌されたサイトカイン（図７ｄ）およびすべてのＮＶ処理群において細菌性成分の減少した食菌活性（図７ｅ）で抗炎症効果を示す分析により支持された。酸化したＬＤＬのｕｐｔａｋｅ程度をＯｉｌ ｒｅｄ Ｏ ｓｔａｉｎｉｎｇで（図７ｅ、下方パネル）ＢＭＳＣ－ＮＶを除いたすべてのＭＳＣ－ＮＶで酸化したＬＤＬ ｕｐｔａｋｅが低くなったことを確認し、これは、ＡＳＣ－ＮＶとＰＭＳＣ－ＮＶの泡沫細胞の阻害効果を支持する。酸化したＬＤＬの吸収によるマクロファージの泡沫細胞形成は、ＶＳＭＣの表現型変化および内部成長が結果的に誘導されるので、動脈硬化発達の重要な部分である。その結果は、ＭＳＣ－ＮＶが動脈硬化過程を予防できることを示唆する。

＜実験例４＞ＭＳＣ－ＮＶのインビトロプレＥＣ修復効果
ＬＰＳ処理による不滅化マウス大動脈内皮細胞（ｉＭＡＥＣ）の前炎症性機能障害を活性化させて、ＭＳＣ－ＮＶ処理のＥＣ－修復効果をテストした（図８ａ）。ＡＳＣ－ＮＶおよびＢＭＳＣ－ＮＶ両方とも活性化したｉＭＡＥＣへの効果的な内在化は、それぞれ、ＤｉＯおよびＤｉＩで標識して視覚化した（図８ｂ）。ＡＳＣ－ＮＶおよびＢＭＳＣ－ＮＶ間のＮＶ吸収での顕著な差異はなかった。ＥＣは、Ｅ－セレクチン、ＩＣＡＭ－１およびＶＣＡＭ－１を優勢に発現して、機能障害活性化時に炎症細胞を動員する。したがって、ｉＭＡＥＣでこれらのマーカーの遺伝子発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより測定すると（図８ｃ）、ＬＰＳ処理により全部上向き調節されるが、２つのＭＳＣ－ＮＶタイプで処理し、しかも、処理しなくても、有意的に下向き調節されて、これは、２つのＭＳＣ－ＮＶタイプのＥＣ－修復効果を約束するだけでなく、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳによるＥＣ機能障害の効果的な誘導を示唆する。その結果は、また、ＶＣＡＭ－１が最初内皮機能障害マーカーの一つであるから、免疫染色からＶＣＡＭ－１タンパク質発現によっても支持された（図８ｄ）。プレＥＣ修復効果は、ＡＳＣ－ＮＶ、ＢＭＳＣ－ＮＶ、およびＰＭＳＣ－ＮＶのうち有意差がなくて（図９および図１０）、ＰＲＥＹトランスフェクションがＭＳＣ－ＮＶの治療的効果を損傷させないことを示唆する。

サイクロスポリンＡ（ＣｙＡ）処理は、血管形成ＥＣ活性を阻害して脈管形成を妨害することが知られている。したがって、マトリゲルでヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を培養した後、シーディング後に２時間（図９）または１２時間（図８ｅ）にＣｙＡおよびＮＶを共に処理して、ＭＳＣ（ＢＭＳＣ大ＡＳＣ）－ＮＶのプレ血管形成（図９）およびプレＥＣ修復効果（図８ｅ）をテストした。次に、ＨＵＶＥＣの脈管構造因子（すなわち、ジャンクション、マスタセグメント、総長さおよびエクストリームノードの数）を測定した。結果的に、ＭＳＣ－ＮＶ処理は、ＭＳＣソースと関係なく、ＣｙＡ処理に対する反応でＨＵＶＥＣのプレＥＣ修復およびプレ血管形成効果を向上させた。また、ＨＵＶＥＣでＰＭＳＣ－ＮＶのプレＥＣ修復およびプレ血管形成効果の一貫性は、シーディング後にそれぞれ１２時間および２時間にＣｙＡ処理時に確認された（図１０）。

＜実験例５＞インビボターゲッティングおよび抗動脈硬化機能
ＰＭＳＣ－ＮＶの診断治療効率は、マウスＰＣＬモデルで測定した。４個の左側頸動脈（ＬＣＡ）枝のうち３個である、外部頸動脈（ＥＣＡ）、内部頸動脈（ＩＣＡ）および喉頭動脈（ＯＡ）を結紮させると（図１１）、渦流形成がドップラー超音波イメージングにより確認された（図１２）。次に、結紮後３日間ＭＳＣ－ＮＶ、ＰＭＳＣ－ＮＶ、およびＰＭＳＣを尾静脈を通じて静脈内に注射した。インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を使って注射後２４時間にこれらの生体内分布を視覚化した（図１３ａおよび図１３ｂ、図１４）。ＰＭＳＣ－ＮＶのＬＣＡ－ターゲッティング効率は、ＭＳＣ－ＮＶまたはＰＭＳＣよりさらに良く、これは、ＰＲＥＹおよびＮＶが細胞の肺毛細管捕捉を妨害して、渦流部位を効果的にターゲッティングする相乗作用の役割を示唆する。肺毛細管捕捉は、全身性細胞伝達のための主な妨害物である。本発明者らの以前のプロテオミクス分析でＰＲＥＹのターゲット分子としてフィラミンＡを同定した。ＲＣＡおよびＬＣＡを採取し、注射後２４時間に免疫染色した（図１３ｃ）。フィラミンＡ発現は、ＲＣＡよりＬＡＣにおいて有意的にさらに高く、これは、ＰＭＳＣ動員のために渦流部位でのそれの過発現を確認させることである。ＮＶをＶｉｖｏｔｒａｃｋ６８０で標識した試験群のうち、ＰＭＳＣ－ＮＶのみが、フィラミンＡとともに明白に一緒に内在化した。

ＭＳＣ－ＮＶの抗炎症およびプレＥＣ修復効果（図７ａ～図７ｅ、図８ａ～図８ｅ、図９および図１０）およびＰＲＥＹのターゲッティング効率（図１３ａ～図１３ｃ）が立証されたので、これらの組み合わせ（ＰＭＳＣ－ＮＶ）が動脈硬化の早期進行を予防する相乗的診断治療効果を示すことができるという仮設をたてた。本実験のこの部分のために、ＰＣＬ手術を受けたＡｐｏＥ ＫＯマウスを使用した。このマウス菌株は、相当する正常菌株と比べてさらに攻撃的動脈硬化の発生を示したためである（図１５）。ＡｐｏＥ ＫＯ ＰＣＬモデルでＮＶ注射後１１日にＬＣＡおよびＲＣＡを採取すると、ＰＭＳＣ－ＮＶは、正常対照群と類似した血管形態を維持しつつ、新生血管形成を効果的に防止するが、他の試験群は、明確な治療効果を示さなかった（図１３ｄの上段ライン）。一方、ＰＭＳＣは、用量が効率的なターゲッティングを許容するのに十分でないため、ＰＭＳＣ－ＮＶと比べて新生血管形成を効果的に予防できなかった（図１３ｂ）。ＣＤ６８（図１３ｄの中間ライン）およびＶＣＡＭ－１（図１３ｄの下段ライン）のタンパク質発現は、それぞれ、単核球動員およびＥＣ活性化の標識として測定された。ＰＭＳＣ－ＮＶを処理するとき、これらの発現レベルは、全身循環後に心臓、肺、肝および脾臓で目につく毒性効果を有さない対照群の発現レベルに減少した（図１６）。対照的に、他の試験群は、正常対照群およびＰＭＳＣ－ＮＶ群よりマーカーの発現が有意にさらに高かった。

＜実験例６＞インビボブタＰＣＬおよびインビトロヒトＥＣモデル
プレ臨床の大きい動物モデルで、ブタＰＣＬモデルを使って以前に確立された方法によって渦流部位に対するＰＭＳＣ－ＮＶのターゲッティング効率を確認した。簡単に言えば、ステンレススチール棒（直径＝０．９ｍｍ）をＬＣＡ（直径＝４．５ｍｍ）で堅固に結紮させてから除去し（図１７ａの上段）、ＬＣＡの７０～８０％閉塞を誘導した（図１７ｂの下段）。結紮されたＬＣＡの遠位部分で渦流の明確な形成がドップラー超音波イメージングにより確認された（図１７ｂ）。また、フィラミンＡは、ＲＣＡよりＬＣＡの内皮で高く発現した（図１７ｃ）。Ｖｉｖｏｔｒａｃｋ６８０標識されたＭＳＣ－ＮＶまたはＰＭＳＣ－ＮＶを耳静脈を通じて静脈内に投与し、結紮後３日間全身循環させた。ＲＣＡ、ＬＣＡおよび大動脈弓は、それぞれ、ＮＶ注入後２４時間または２１日に正常、誘導渦流および自然渦流部位から組織サンプルとして採取した。自然渦流は、曲率と枝構造に起因して大動脈弓で形成される。ＩＶＩＳイメージは、ＰＭＳＣ－ＮＶが病原性リモデリングの指標であるＬＣＡの結紮点の遠位領域にさらに多く蓄積されるが、ＲＣＡでは観察されなかった（図１７ｄ、図１８の左側）。大動脈弓サンプルでＰＭＳＣ－ＮＶのＩＶＩＳ蛍光分布は、ＭＳＣ－ＮＶと比較して渦流部位とさらに高い相関関係を示し、ＰＲＥＹの効果的なターゲッティング機能を示し（図１７ｆ、図１８の右側）、ＭＳＣ－ＮＶよりＰＭＳＣ－ＮＶによるＣＤ３１のさらに大きい共存（図１７ｅおよび図１７ｇ）により支持された。

最後に、渦流下でヒト冠状動脈ＥＣ（ｈＣＡＥＣ；図１９ａ～図１９ｇ）およびヒト大動脈ＥＣ（ｈＡＥＣ；図２０）をターゲットとするＰＭＳＣ－ＮＶの効率をインビトロ微小流体モデルを使って測定した。この微小流体モデルで、コラーゲンコーティングされたガラス表面上に付着したＥＣ単層は、ポンピングシステムにより生成された培地流れに露出し、これは、健康または動脈硬化の条件下で血流を成功裏に模倣する。また、この微小流体システムは、インビボ実験で達成しにくいＰＭＳＣ－ＮＶのターゲッティング効率だけでなく、ターゲッティング部位の精密な観察が可能である。血管で健康な状態および動脈硬化状態を模倣するために、ＭＳＣ－ＮＶ処理前にＥＣを正常（１０ｄｙｎｅ／ｃｍ^２）または渦流（１ｄｎｅパルスとともに１０ｄｙｎｅ／ｃｍ^２および－９ｄｙｎｅ／ｃｍ^２）に露出させた（図１９ａ～図１９ｃ）。正常流れに露出したＥＣは、流れ方向に整列していることを確認したが、渦流に露出したＥＣの場合にはそうではなかった（図１９ｄ）。また、フィラミンＡ発現は、渦流下で増加したのに対し（図１９ｅ）、Ｆ－アクチン発現は、正常流れおよび渦流に露出したＥＣの間で類似していた（図１９ｆ）。さらに重要なことは、微小流体モデルは、ＰＭＳＣ－ＮＶのシグナルが正常流れ条件と比較してフィラミンＡとの高い共存で渦流条件（図２０）で増加して、臨床分析時にＰＭＳＣ－ＮＶの診断治療潜在力を立証するという事実を明らかにしたことである。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当該技術分野における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は、単に好適な実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明白だろう。

本発明による渦流部位をターゲッティングできるペプチドを利用する幹細胞由来ナノベシクルは、抗動脈硬化診断治療プラットフォームであって、間葉系幹細胞と類似した強力な抗炎症およびプレ内皮修復効果を提供するところ、動脈硬化の発病を予防し治療できる新しい診断治療剤として関連医療産業分野において有用に用いられ得るものと期待される。

Claims (11)

1. 渦流（ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ）部位ターゲッティングペプチドを表面に提示する幹細胞由来のナノベシクル。
2. 渦流部位ターゲッティングペプチドは、配列番号１～５からなる群から選はれる、請求項１に記載のナノベシクル。
3. ナノベシクルは、シグナルペプチド－渦流部位ターゲッティングペプチド－トランスメンブレンタンパク質のコーディング配列が順次に挿入されたベクターでトランスフェクションされた幹細胞に由来するものである、請求項１に記載のナノベシクル。
4. トランスメンブレンタンパク質は、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＣＤ３４およびＣＤ２２からなる群から選ばれた一つ以上である、請求項３に記載のナノベシクル。
5. 幹細胞は、骨髄、臍帯、臍帯血、胎盤、血液、皮膚、脂肪組織、神経組織、肝、膵胆道、筋肉および羊膜からなる群から選ばれた１種以上の組織由来の幹細胞；間葉系幹細胞；胚性幹細胞；および誘導万能幹細胞のうちいずれか一つである、請求項１に記載のナノベシクル。
6. シグナルペプチド－渦流部位ターゲッティングペプチド－トランスメンブレンタンパク質のコーディング配列が順次に挿入されたベクターでトランスフェクションされた幹細胞から渦流部位ターゲッティングペプチドを表面に提示するナノベシクルを得る段階を含む請求項１に記載のナノベシクルの製造方法。
7. 請求項１に記載のナノベシクルを含む動脈硬化の診断用組成物。
8. 請求項１に記載のナノベシクルを含む動脈硬化の予防または治療用組成物。
9. 請求項１に記載のナノベシクルを個体に投与する段階を含む、動脈硬化の診断方法。
10. 請求項１に記載のナノベシクルを個体に投与する段階を含む、動脈硬化の予防または治療方法。
11. 請求項１に記載のナノベシクルの、動脈硬化の予防または治療用途。
    

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