JP2022542559A - Ｍａｇｅ－ａ４特異性を有するキメラ抗原受容体およびそれらの使用 - Google Patents

Ｍａｇｅ－ａ４特異性を有するキメラ抗原受容体およびそれらの使用 Download PDF

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Abstract

ＭＡＧＥ－Ａ４、または黒色腫関連抗原Ａ４は、Ｘ染色体上のがん精巣抗原（ＣＴＡ）である。本開示は、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体およびそのようなキメラ抗原受容体を発現する細胞を提供する。特定の実施形態において、本開示のキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍の成長を阻害することができる。本開示の操作された細胞は、上方調節または誘導されたＭＡＧＥ－Ａ４を標的とする免疫応答が望まれ、かつ／または治療的に有益である、疾患および障害の治療に有用である。例えば、本開示のＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体を発現する操作された細胞は、様々ながんの治療に有用である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／８７８，１２５号、２０２０年５月５日に出願された同第６３／０２０，１７７号、および２０２０年５月７日に出願された同第６３／０２１，４０７号の優先権を主張し、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、２０２０年７月２４日に作成され、１２３，６５０バイトを含むファイル１０６００ＷＯ０１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照により組み込む。
本開示は、黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）に特異的である、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびそのようなＣＡＲを含む操作された細胞、ならびにそれらの使用方法を提供する。
ＭＡＧＥ－Ａ４、または黒色腫関連抗原Ａ４は、Ｘ染色体上のがん精巣抗原（ＣＴＡ）である。ＭＡＧＥ－Ａ４の機能は不明であるが、細胞周期の進行／調節、転写制御、細胞の生存および／またはアポトーシスに関与している可能性がある。例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４の過剰発現は、自発的に形質転換された経口ケラチノサイトの成長を促進し、Ｇ１期の細胞の成長停止を阻害することが示されている。
ＭＡＧＥ－Ａ４は、頭頸部扁平上皮がん、非小細胞肺がんなどの肺がん、食道扁平上皮がん、結腸がん、膀胱がん、粘膜および皮膚黒色腫、卵巣がん、例えば、漿液性がん、および子宮がんなどの種々の組織型の多くの腫瘍によって豊富に発現しているが、正常な健康な成人組織においては、ＭＡＧＥ－Ａ４の発現は精巣に限定されている。
制限された発現パターンとともに免疫応答を誘発するＭＡＧＥ－Ａ４抗原の能力により、ＭＡＧＥ－Ａ４はがん免疫療法についての優れた候補となっている。
エクスビボで生成された自己抗原特異的Ｔ細胞の移入を含む養子免疫療法は、ウイルス感染およびがんを治療するための有望な戦略である。養子免疫療法に使用されるＴ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞の増殖または遺伝子工学によるＴ細胞の方向転換のいずれかによって生成され得る。
Ｔ細胞における新しい特異性は、トランスジェニックＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の遺伝子導入を介して成功裏に生成されている（Ｊｅｎａ，Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ＣＡＲは、単一の融合分子における１つ以上のシグナル伝達ドメインに関連する標的化部分からなる合成受容体である。概して、ＣＡＲの結合部分は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインからなり、可撓性リンカーによって接合されたモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変フラグメントを含む。第１世代のＣＡＲについてのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの細胞質領域またはＦｃ受容体ガンマ鎖に由来する。第一世代のＣＡＲは、Ｔ細胞の細胞傷害性を成功裏に方向転換することが示されている。しかしながら、それらはインビボでの長期の増殖および抗腫瘍活性を提供することができなかった。共刺激分子由来のシグナル伝達ドメインならびに膜貫通ドメインおよびヒンジドメインが追加されて、第２世代および第３世代のＣＡＲを形成し、ヒトにおける治療試験のいくつかの成功をもたらしている。例えば、Ｂ細胞分化抗原ＣＤ１９に特異的なＣＡＲに方向転換されたＴ細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療において劇的な効果を示し、ＴＣＲに方向転換されたＴ細胞は固形がんに罹患する患者において有益性を示している。Ｓｔａｕｓｓらは、例えば、抗原特異的エフェクター機能を増強し、操作されたＴ細胞の毒性を制限する、がんの治療において使用するための治療用ＣＡＲおよびＴＣＲを修飾する戦略を説明している（非特許文献１）。
ＭＡＧＥ－Ａ４抗原に特異的に結合するＣＡＲに基づく新しい標的化剤、ならびに治療および診断の設定においてそのような薬剤を産生および使用するための方法についての必要性が満たされていない。
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０１５，２４：１１３－１１８
本開示は、ＭＨＣ（ＨＬＡ－Ａ２）の状況下でＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド抗原に対して生成されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ配列は、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される小さなペプチドＭＡＧＥ－Ａ４ ２８６－２９４またはＭＡＧＥ－Ａ４ ２３０－２３９に特異的に結合する。
一態様において、本開示は、黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、該ＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体は、配列番号３２のアミノ酸２８６～２９４、もしくは２３０～２３９、またはその一部分と相互作用し、該ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、ＨＬＡが結合したＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端へ、（ａ）抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗原結合ドメインを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通ドメインと、（ｄ）共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＭＡＧＥ－Ａ４単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ｓｃＦｖドメインは、ＬＣＶＲとＨＣＶＲとの間に第１のリンカーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインとヒンジとの間に第２のリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のリンカーおよび第２のリンカーは、配列番号２３～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のリンカーは、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、第２のリンカーは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲのヒンジ、膜貫通ドメイン、またはそれらの両方は、ＣＤ８αポリペプチド由来である。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ、膜貫通ドメイン、またはそれらの両方は、ＣＤ２８ポリペプチド由来である。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＬＣＶＲは、配列番号１０または配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＣＶＲは、それぞれ、配列番号１２－１４－１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、ＨＣＶＲは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＨＣＶＲは、それぞれ、配列番号４－６－８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号１０もしくは配列番号３７のアミノ酸配列、または配列番号１０もしくは配列番号３７のアミノ酸配列に対して９５％～９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列に対して９５％～９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＶＲとを含む。いくつかの実施形態において、ＬＣＶＲは、配列番号１０または配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＨＣＶＲは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＣＶＲは、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＣＶＲは、それぞれ、配列番号６１－６３－６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、ＨＣＶＲは、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＨＣＶＲは、それぞれ、配列番号５３－５５－５７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号５９のアミノ酸配列、または配列番号５９のアミノ酸配列に対して９５％～９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、配列番号５１のアミノ酸配列、または配列番号５１のアミノ酸配列に対して９５％～９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＶＲとを含む。いくつかの実施形態において、ＬＣＶＲは、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、ＨＣＶＲは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、配列番号３２の２８６～２９４位の１つ以上のアミノ酸に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号３２の２３０～２３９位の１つ以上のアミノ酸に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡは、ＨＬＡ－Ａ２である。
一態様において、本開示は、本明細書に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲをコードする単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号３８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号４８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号７０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号７２のヌクレオチド配列を含む。一態様において、本開示は、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターはレンチウイルスベクターである。
一態様において、本開示は、本明細書に記載の核酸分子、または本明細書に記載のベクターを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体を含む。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫エフェクター細胞またはＴリンパ球（例えば、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球）などの免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、多発性骨髄腫または黒色腫などのＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんの治療において使用するためのものである。
一態様において、本開示は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ａ）軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＭＡＧＥ－Ａ４単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通ドメインと、（ｄ）４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインと、を含むキメラ抗原受容体を含む操作されたヒトＴ細胞を提供する。いくつかの実施形態において、抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ｓｃＦｖは、配列番号３２の２８６～２９４位の１つ以上のアミノ酸残基に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、配列番号２／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、配列番号２／３７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、配列番号３２の２３０～２３９位の１つ以上のアミノ酸残基に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、配列番号５１／５９のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。いくつかの実施形態において、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号３９のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。いくつかの実施形態において、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号４７のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。いくつかの実施形態において、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号７１のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。いくつかの実施形態において、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号７３のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。
一態様において、本開示は、遺伝子改変されたヒトＴ細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供し、遺伝子改変されたヒトＴ細胞は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の操作された細胞または操作されたヒトＴ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、多発性骨髄腫または黒色腫などのＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんの治療において使用するためのものである。
一態様において、本開示は、多発性骨髄腫または黒色腫などのＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんの治療のための医薬品の製造における、本明細書に記載のキメラ抗原受容体、本明細書に記載の核酸分子、本明細書に記載のベクター、本明細書に記載の細胞、本明細書に記載の操作された細胞、または本明細書に記載の操作されたヒトＴ細胞の使用を提供する。
一態様において、本開示は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体を含むＴリンパ球を対象に導入することを含む、対象におけるＴリンパ球活性を増強する方法を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体を含む治療有効量のＴリンパ球を対象に導入することを含む、がんに罹患している対象を治療するための方法を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変された有効量の細胞を対象に投与することを含む、対象において標的細胞集団または組織へのＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を提供する。一態様において、本開示は、対象に抗腫瘍免疫を提供する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変された有効量の細胞を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道がん、頭頸部がん、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮がん、胃がん、子宮頸がん、乳がん、または黒色腫を有する。いくつかの実施形態において、対象は、多発性骨髄腫を有する。
一態様において、本開示は、キメラ抗原受容体を発現するように細胞の集団を操作する方法を提供し、（ａ）本明細書に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸分子を免疫細胞の集団に導入することと、（ｂ）該核酸分子を発現する条件下で該免疫細胞の集団を培養することと、（ｃ）細胞の表面で該キメラ抗原受容体を発現する該免疫細胞を単離することと、を含む。いくつかの実施形態において、方法は、該核酸分子を導入する前に、対象から該免疫細胞の集団を取得することをさらに含む。
一態様において、本開示は、対象においてＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんを治療する方法を提供し、（ａ）本明細書に記載の細胞の集団を操作することと、（ｂ）該キメラ抗原受容体を発現する該細胞の集団を該対象に再導入することと、を含む。いくつかの実施形態において、該ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんは、多発性骨髄腫である。
一態様において、本開示は、本明細書に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲとの結合に対して競合する単離された抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、ＣＡＲである。一態様において、本開示は、本明細書に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲと同じエピトープに結合する単離された抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、該単離された抗原結合タンパク質は、ＣＡＲである。
一態様において、本開示は、黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）ポリペプチドに特異的に結合する、単離された組換え抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、抗体は、以下の特徴、（ａ）約１０－９Ｍ未満のＥＣ５０でＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドに結合すること、（ｂ）がんを有する動物において、該動物への投与後の生存が、該投与なしの相当の動物と比較して、増加を示すこと、および／または（ｃ）（ｉ）表１に記載のＨＣＶＲに対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに（ｉｉ）表１に記載のＬＣＶＲに対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含むこと、のうちの１つ以上を有する。いくつかの実施形態において、ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ａ２が結合したＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。場合によっては、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５１のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。場合によっては、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２／３７のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
一態様において、本開示は、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、（ｅ）アミノ酸１４を有するＬＣＤＲ２ドメイン、および（ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５９のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
一態様において、本開示は、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、（ｂ）配列番号５５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、（ｃ）配列番号５７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、（ｄ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、（ｅ）配列番号６３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、および（ｆ）配列番号６５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５１／５９のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、二重特異性抗体である。
一態様において、本開示は、上記または本明細書で論じられる、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、第２の治療剤をさらに含む。場合によっては、第２の治療剤は、抗腫瘍剤、ステロイド、および標的療法からなる群から選択される。
一態様において、本開示は、上記または本明細書で論じられる、抗体のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。
一態様において、本開示は、上記で論じられるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
一態様において、本開示は、上記で論じられるベクターを含む細胞を提供する。
一態様において、本開示は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんを治療する方法を提供し、方法は、抗体または抗原結合フラグメント、または上記または本明細書で論じられる医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、第２の治療剤と組み合わせて投与される。場合によっては、第２の治療剤は、抗腫瘍剤、ステロイド、および標的療法からなる群から選択される。ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんを治療するための、またはＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんを治療するための医薬品の製造における、抗体、その抗原結合フラグメント、および医薬組成物の使用もまた、本開示の範囲内で企図される。
他の実施形態は、後述の詳細な説明の精査から明らかとなるであろう。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を発現させるための例示的なヌクレオチド構築物を示す。例示的なヌクレオチド構築物は、抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ＶＬ－リンカー－ＶＨ ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、ならびにＣＡＲが形質導入された細胞を追跡するためのＩＲＥＳ：ｅＧＦＰ配列を含む。 図２Ａは、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞が、Ａ３７５細胞に対する対照ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、Ａ３７５ヒト黒色腫腫瘍細胞（白丸、破線）、およびＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４を過剰発現するＡ３７５細胞（黒丸、実線、Ａ３７５＋＋で示される）に対して増強された細胞傷害性を示すことを示すインビトロ細胞傷害性データを示す（Ａ３７５およびＡ３７５＋＋は上部の２つの曲線として見ることができる）。 図２Ｂは、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞が、Ａ３７５細胞に対する対照ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＩＭ９多発性骨髄腫細胞（白丸、破線）およびＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４を過剰発現するＩＭ９細胞標的細胞（黒丸、実線、ＩＭ９＋＋として示される）に対して増強された細胞傷害性を示すことを示すインビトロ細胞傷害性データを示す（ＩＭ９およびＩＭ９＋＋は上部の２つの曲線として見ることができる）。 図３Ａは、対照ＣＡＲ Ｔ細胞（抗ＨＬＡ－Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７（１１－１９）ＣＡＲ Ｔ細胞）で処置された、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥ－Ａ４＋Ａ３７５ヒト黒色腫腫瘍細胞異種移植片を有するマウスにおける経時的な腫瘍体積を示す。試験した５匹のマウスのうち、研究終了時に腫瘍のないマウスはいなかった（４２日目に動物を殺処分）。 図３Ｂは、抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４ＣＡＲ Ｔ細胞で処置された、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥ－Ａ４＋Ａ３７５ヒト黒色腫腫瘍細胞異種移植片を有するマウスにおける経時的な腫瘍体積を示す。試験した５匹のマウスはすべて、研究終了時（５５日目）に腫瘍がなかった。 図４Ａは、対照ＣＡＲ Ｔ細胞（抗ＨＬＡ－Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７（１１－１９）ＣＡＲ Ｔ細胞）で処置された、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥ－Ａ４＋ＩＭ９ヒト多発性骨髄腫腫瘍細胞異種移植片を有するマウスにおける経時的な腫瘍体積を示す。試験した５匹のマウスのうち、研究終了時に腫瘍のないマウスはいなかった（２９日目に動物を殺処分）。 図４Ｂは、抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４ＣＡＲ Ｔ細胞で処置された、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥ－Ａ４＋ＩＭ９ヒト多発性骨髄腫腫瘍細胞異種移植片を有するマウスにおける経時的な腫瘍体積を示す。試験した５匹のマウスのうち、３匹は、研究終了時（５２日目）に腫瘍がなかった。
本明細書に記載される発明は、記載される特定の方法および実験条件は変化し得るため、そのような方法および条件に限定されないことを理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。任意の実施形態または実施形態の特徴は、互いに組み合わせることができ、そのような組み合わせは、本発明の範囲内に明示的に含まれる。上記または本明細書で論じられるいずれの特定の値も、上記または本明細書で論じられる別の関連値と組み合わせられて、それらの値が範囲の上限および下限を表す範囲を列挙することができ、かかる範囲は本開示の範囲内に包含される。
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現は、９９および１０１ならびにそれらの間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
本明細書に説明されるものと類似のまたは同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書において言及されるすべての特許、出願および非特許刊行物は、それらの全体の参照により本明細書に組み込まれる。
定義
本明細書で使用される場合、「ＭＡＧＥ－Ａ４」という用語は、黒色腫関連抗原Ａ４を指す。ＭＡＧＥ－Ａ４は、様々な種々の腫瘍細胞によって発現される細胞内タンパク質である。本明細書で使用される場合、「ＭＡＧＥ－Ａ４」は、非ヒト種（例えば、「マウスＭＡＧＥ－Ａ４」、「サルＭＡＧＥ－Ａ４」など）に由来するものとして特定されない限り、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質を指す。ヒトＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列および配列番号３１のポリ核酸配列を有する。ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチド（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４ ２８６－２９４またはＭＡＧＥ－Ａ４ ２３０－２３９）の特定の領域への言及は、配列番号３２に関するものである。本明細書で使用される場合、「ＭＡＧＥ－Ａ４ ２８６－２９４」、「ＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）」、および「ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４」という用語は、互換的に使用され得る。同様に、「ＭＡＧＥ－Ａ４ ２３０－２３９」、「ＭＡＧＥ－Ａ４（２３０－２３９）」、および「ＭＡＧＥＡ４２３０－２３９」という用語は、互換的に使用され得る。ＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）（ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ）のポリペプチド配列は、配列番号３３として与えられる。ＭＡＧＥ－Ａ４（２３０－２３９）（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）のポリペプチド配列は、配列番号４９として与えられる。
本明細書で使用される場合、「ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体」または「抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体」は、ＭＡＧＥ－Ａ４を特異的に認識する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体は、ＭＡＧＥ－Ａ４のアミノ酸２８６～２９４またはＭＡＧＥ－Ａ４のアミノ酸２３０～２３９と相互作用する。
「リガンド結合ドメイン」および「抗原結合ドメイン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、所定の抗原（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４）に特異的に結合するキメラ抗原受容体または対応する抗体の部分を指す。「対応する抗体」への言及は、キメラ抗原受容体において使用されるＣＤＲまたは可変領域（重鎖可変領域（略称ＨＣＶＲまたはＶＨ）および軽鎖可変領域（略称ＬＣＶＲまたはＶＬ））が由来する抗体を指す。例えば、実施例において論じられるキメラ抗原受容体構築物は、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体に由来する可変領域を有するｓｃＦｖを含む。この抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体が、それぞれのキメラ抗原受容体に対して「対応する抗体」である。
本発明で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４）に特異的に結合するかまたはそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＨＬＡが結合したポリペプチドなどのＭＨＣが結合したポリペプチドに結合するか、またはそれと相互作用し得る。本開示の文脈において、抗体は、いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ２によって提示されるＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチド（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４ ２８６－２９４または２３０－２３９）などのＨＬＡ－Ａ２が結合したポリペプチドに結合し得る。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子も含む。各重鎖（本明細書ではＨＣと略される）は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖（本明細書ではＬＣと略される）は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分され得る。ＶＨおよびＶＬは各々、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順にアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本開示の異なる実施形態において、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、または天然もしくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合フラグメントを含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」および同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然の、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗体結合フラグメントは、例えば、抗体可変ドメインおよび任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関連するタンパク質消化技術または組換え遺伝子操作技術などの任意の好適な標準的技術を使用して、完全抗体分子から誘導され得る。かかるＤＮＡは既知であり、かつ／または例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、または合成され得る。ＤＮＡは、化学的に、または分子生物学技術を使用することによって配列決定および操作されて、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な立体配置に配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などすることができる。
抗体結合フラグメントの非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール型免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用する「抗原結合フラグメント」という表現に包含される。
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであり得、一般に、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか、またはそれとインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＨドメインがＶＬドメインに結合した抗原結合フラグメントでは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに対して位置付けられてもよい。例えば、可変領域は二量体であり、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬ、またはＶＬ－ＶＬ二量体を含んでもよい。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを含んでもよい。
特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含んでもよい。本開示の抗体の抗原結合フラグメント内に見出され得る可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的で例示的な構成として、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが挙げられる。上に列記される例示的な立体配置のうちのいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインのいずれの立体配置でも、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されているか、または完全もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結されているかのいずれかであり得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の連結をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれより多数の）アミノ酸からなり得る。そのうえ、本開示の抗体の抗原結合フラグメントは、互いと、かつ／または１つ以上の単量体ＶＨドメインもしくはＶＬドメインと非共有結合性会合している（例えば、ジスルフィド結合によって）、先に列挙した可変ドメイン立体配置および定常ドメイン立体配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
特定の実施形態において、抗原結合フラグメントが由来する抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体は、ヒト抗体に由来する。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本開示のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞変異によって、導入された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列へと移植された抗体を含むことを意図するものではない。
抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗原結合フラグメントを生成するために使用される抗体は、いくつかの実施形態において、組換えヒト抗体であり得る。「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体など組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されるすべてのヒト抗体（後述）、組換え型コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体（後述）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離される抗体を含むことを意図する。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態において、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が使用される際の、インビボ体細胞変異誘発）に供され、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来しそれらに関連しているが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。
ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連する２つの形態で存在することができる。第１の形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されているおよそ１５０～１６０ｋＤａの安定した四本鎖構築体を含む。第２の形態では、二量体は鎖間ジスルフィド結合によって連結されておらず、共有結合した軽鎖および重鎖からなる約７５～８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製後でさえも分離することが極めて困難とされている。
様々な無傷のＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造上の相違によるが、それに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルまで第２の形態の出現を有意に減少させることができる（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）。本開示は、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域に１つ以上の変異を有する抗体を包含し、例えば産生において、所望の抗体形態の収率を改善するのに望ましい場合がある。
抗体は、単離された抗体であり得る。「単離された抗体」は、本明細書で使用される場合、その天然環境の少なくとも１つの成分から同定され、分離および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するかもしくは天然に産生される組織または細胞から分離または除去された抗体は、本開示の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体は、組換え細胞内の原位置の抗体も含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離ステップに供された抗体である。特定の実施形態によると、単離された抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
本明細書に開示される抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体が由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域において１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本開示は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗体およびその抗原結合フラグメントを含み、１つ以上のフレームワークおよび／もしくはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基へ、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基へ、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換へ変異する（そのような配列変化は本明細書でまとめて「生殖系列変異」と称される）。当業者は、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組み合わせを含む多くの抗体および抗体結合フラグメントを容易に産生することができる。特定の実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のうちのすべてが、抗体が由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと再び変異する。他の実施形態において、特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基はＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくは変異した残基はＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められるか、または変異した残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内にのみ認められる。他の実施形態において、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基へ変異する。さらに、本開示の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なる特定の他の残基は、維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ変異する。取得されると、１つ以上の生殖系列変異を含む抗体および抗原結合フラグメントは、結合特異性の改善、結合親和性の増加、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または増強（場合によって）、免疫原性の低減などの１つ以上の所望の特性について容易に試験され得る。この一般的な様式で取得される抗体および抗原結合フラグメントは、本開示内に包含される。
抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体は、１つ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかのバリアントを含み得る。例えば、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体は、本明細書に記載のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかに対して、例えば、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個の保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有し得る。
「エピトープ」という用語は、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、２つ以上のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は抗原上の異なる領域に結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座または直鎖状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基によって産生されたものである。特定の状況では、エピトープは、抗原上のサッカリド、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
「実質的な同一性」または「実質的に同一である」という用語は、核酸またはそのフラグメントを指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列した場合、以下に論じられるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなど、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定される場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の場合では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号２２もしくは配列番号３９の配列、または配列番号２２もしくは配列番号３９の一部分（例えば、配列番号２の配列などのＨＣＶＲ、または配列番号１０もしくは配列番号３７の配列などのＬＣＶＲ、あるいは配列番号２、１０、２２、３７、または３９に見られるものなどポリペプチド配列のフレームワーク領域）に対して、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％同一である配列を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、そのようなポリペプチドをコードするポリ核酸を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号２１もしくは配列番号３８の配列、または配列番号２１もしくは配列番号３８の一部分（例えば、配列番号１の配列などのＨＣＶＲ、または配列番号９もしくは配列番号３６の配列などのＬＣＶＲ、あるいは配列番号１、９、２１、３６、または３８などのポリヌクレオチド配列のフレームワーク領域）に対して、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％同一である配列を含むポリ核酸を提供する。
ポリペプチドへ適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列の保存的置換が互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。
ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には配列分析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、および他の修飾に割り当てられた類似性の測定値を使用して類似の配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間または野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメータとともに使用され得るＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムである既定パラメータまたは推奨パラメータを用いたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列との間の最良重複領域の整列および配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）（上記参照））。ギャップオープンペナルティが１２、ギャップ拡張ペナルティが２、ＢＬＯＳＵＭ行列が６２でのアフィンギャップ検索を使用したＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して、配列を比較することもできる。本開示の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、各々参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されるフラグメント、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成されたフラグメントなどのヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）、もしくは天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのエナンチオマー型）、またはそれらの両方の組み合わせである単量体からなり得る。修飾されたヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンまたはプリン塩基部分において変化を有し得る。糖修飾は、例えば、１つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での置換を含み、または糖は、エーテルもしくはエステルとして官能化され得る。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環式糖類似体などの立体的および電子的に類似した構造と置換し得る。塩基部分における修飾の例としては、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはそのような連結の類似体によって連結され得る。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）という用語は、標的細胞上に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、所望の抗原（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４などの腫瘍抗原）に対する抗体ベースの特異性をＴ細胞受容体を活性化する細胞内ドメインと組み合わせて、特異的な抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子を指す。概して、ＣＡＲは、Ｔ細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインに融合した細胞外単鎖抗体結合ドメイン（ｓｃＦｖ）からなり、Ｔ細胞で発現すると、モノクローナル抗体の特異性に基づいて抗原認識を方向転換する能力を有する。
「ＨＬＡ」という用語は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系または複合体を指し、これは、ヒトにおける主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。これらの細胞表面タンパク質は、ヒトにおける免疫系の調節に関与している。ＭＨＣクラスＩ（Ａ、Ｂ、およびＣ）に対応するＨＬＡは、細胞内からペプチドを提示する。
「ＨＬＡ－Ａ」という用語は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座によってコードされるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の群を指す。ＨＬＡ－Ａは、３つの主要な種類のヒトＭＨＣクラスＩ細胞表面受容体のうちの１つである。受容体は、ヘテロ二量体であり、重α鎖および小さなβ鎖からなる。α鎖はバリアントＨＬＡ－Ａ遺伝子によってコードされており、β鎖（β２－ミクログロブリン）は不変のβ２ミクログロブリン分子である。
「ＨＬＡ－Ａ２」という用語は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座にある１つの特定のクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）対立遺伝子群であり、α鎖はＨＬＡ－Ａ＊０２遺伝子によってコードされ、β鎖はβ２－ミクログロブリンまたはＢ２Ｍ遺伝子座によってコードされる。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、または染色体、非染色体、半合成もしくは合成核酸からなり得る線状もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。場合によっては、ベクターは、自律複製（エピソームベクター）および／またはそれらが連結されている核酸の発現（発現ベクター）が可能なものである。多数の好適なベクターが当業者に既知であり、市販されている。ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）などのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水胞性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、はしかおよびセンダイ）、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、カナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスを含む。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスを含む。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳類のＣ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ群、およびレンチウイルスが挙げられる。
「共刺激ドメイン」または「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが増殖などの細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族の結合パートナーを指す。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、およびＴｏｌｌリガンド受容体を含むが、これらに限定されない。共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）（配列番号２９）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。
「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族の共刺激分子に特異的に結合し、それによりシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子を指し、そのシグナルは、例えば、ペプチドを担持したＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介する。共刺激リガンドは、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７－Ｈ３と特異的に結合するリガンドを含み得るが、これらに限定されない。
「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞増殖および／または重要な分子の上方調節または下方調節をもたらすシグナルを指す。
本明細書で使用される場合、「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンド、例えば細胞表面分子に結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の病状（例えば、がん）に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌、および寄生虫の感染、自己免疫疾患、ならびにがん細胞に関連するものが挙げられる。細胞外リガンド結合ドメインは、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域（例えば、ｓｃＦｖとして形式を合わせた）を含み得、任意選択でリンカーによって接合され得る。
本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」という用語は、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界のすべてのメンバーを含む。一実施形態において、患者は、がん（例えば、多発性骨髄腫または黒色腫）を有するヒトである。
本明細書で使用される場合、ＣＡＲの「シグナル伝達（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ）ドメイン」または「シグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）ドメイン」は、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合に続く細胞内シグナル伝達に関与し、免疫細胞および免疫応答の活性化をもたらす。言い換えれば、シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化に関与する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実施するように指示するタンパク質の部分を指す。ＣＡＲにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体の関与に続いて協調して作用してシグナル伝達を開始する、Ｔ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアントおよび同じ機能を有する任意の合成配列であり得る。場合によっては、シグナル伝達ドメインは、抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルを提供するものの２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列を含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフとして知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスのチロシンキナーゼについての結合部位として機能する様々な受容体の細胞質内尾部において見出された、明確に定義されたシグナル伝達モチーフである。例示的なＩＴＡＭとして、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＦｃＲイプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（配列番号３０）を含み得る。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞の特異性を、細胞（例えば、がん細胞）の表面上の抗体に認識される抗原が細胞表面で発現しようとも、細胞内で発現し、例えばＨＬＡによって提示されようとも、それらの抗原に方向転換することができる。
本開示の一態様は、腫瘍細胞などの細胞の表面上に提示されるＭＡＧＥ－Ａ４抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。この提示は、例えば、ＨＬＡ－Ａ２などのＨＬＡによるものであり得る。本開示の一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲは、細胞外標的特異的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ゼータまたはＦｃＲガンマに由来するシグナル伝達ドメインなど）、および／または４－１ＢＢなどであるがこれに限定されない、共刺激分子に由来する１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、ＣＡＲは、細胞外結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に、ＣＤ８アルファヒンジなどのヒンジまたはスペーサー領域を含む。
ＣＡＲの結合ドメインまたは細胞外ドメインは、目的の標的抗原に結合する能力をＣＡＲに提供する。結合ドメイン（例えば、リガンド結合ドメインまたは抗原結合ドメイン）は、生体分子（例えば、細胞表面受容体または腫瘍タンパク質、またはそれらの成分）を特異的に認識して結合する能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドであり得る。結合ドメインは、目的の生体分子に対して、天然に存在する、合成の、半合成の、または組換えにより産生された結合パートナーを含む。例えば、本明細書でさらに説明されるように、結合ドメインは、抗体軽鎖および重鎖可変領域であり得るか、または軽鎖および重鎖可変領域は、単鎖およびいずれかの方向で一緒に接合され得る（例えば、ＶＬ－ＶＨまたはＶＨ－ＶＬ）。ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、または表面プラズモン共鳴分析（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ分析を使用）を含む、特定の標的と特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための様々なアッセイが知られている。標的は、腫瘍の死滅をもたらすエフェクター免疫応答を誘発することが望ましい、臨床的な目的の抗原であり得る。一実施形態において、キメラ抗原受容体の結合ドメインの標的抗原は、腫瘍細胞の表面上のＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２に提示されたＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質などのＨＬＡに提示されたＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質）である。
例示的なリガンド結合ドメインとして、ｓｃＦｖ、ｓｃＴＣＲなどの抗体の抗原結合フラグメントなどの抗原結合タンパク質、受容体の細胞外ドメイン、細胞表面分子／受容体に対するリガンド、またはそれらの受容体結合ドメイン、および腫瘍結合タンパク質が挙げられる。特定の実施形態において、本開示のＣＡＲに含まれる抗原結合ドメインは、可変領域（Ｆｖ）、ＣＤＲ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、ドメイン抗体バリアント（ｄＡｂ）、ラクダ抗体（ＶＨＨ）、フィブロネクチン３ドメインバリアント、アンキリン反復バリアント、および他のタンパク質足場に由来する他の抗原特異的結合ドメインであり得る。
一実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインは、抗ＭＡＧＥ－Ａ４単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、マウス、ヒト、またはヒト化ｓｃＦｖであり得る。単鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローン化され得る。可変領域重鎖（ＶＨ）および可変領域軽鎖（ＶＬ）のクローニングのために使用され得る技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８９；８６：３８３３－３８３７に記載されている。したがって、特定の実施形態において、結合ドメインは、抗体由来の結合ドメインを含むが、非抗体由来の結合ドメインであり得る。抗体由来の結合ドメインは、抗体のフラグメント、または１つ以上の抗体のフラグメントの遺伝子操作された産物であり得、そのフラグメントは、抗原との結合に関与する。
特定の実施形態において、本開示のＣＡＲは、分子の適切な間隔およびコンフォメーションのために付加された、様々なドメイン間のリンカーを含み得る。例えば、一実施形態において、１～２０アミノ酸長であり得る、結合ドメインＶＨまたはＶＬの間にリンカーが存在し得る。他の実施形態において、キメラ抗原受容体のドメインのうちのいずれかの間のリンカーは、１～１５または１５アミノ酸長であり得る。これに関して、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長であり得る。さらなる実施形態において、リンカーは、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸長であり得る。本明細書に記載の数を含む範囲もまた本明細書に含まれ、例えば、１０～３０アミノ酸長のリンカーである。
特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲにおける使用に適したリンカーは、可撓性リンカーである。好適なリンカーは、容易に選択され得、４アミノ酸～１０アミノ酸、５アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、または７アミノ酸～８アミノ酸を含む、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～２０アミノ酸、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸などの種々の長さの好適なもののうちのいずれかであり得、１、２、３、４、５、６または７アミノ酸であり得る。
例示的な可撓性リンカーとして、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー、式中、ｎは、少なくとも１つの整数であり、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および当技術分野において既知の他の可撓性リンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン－セリンポリマーは比較的構造化されておらず、したがって、本明細書に記載のＣＡＲなどの融合タンパク質のドメイン間の中性テザーとして機能することができる可能性がある。グリシンは、アラニンよりもはるかに多くのファイ－プサイ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少なくなる（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１１７３－１４２（１９９２）を参照）。通常、当業者は、リンカーが、可撓性リンカーおよび所望のＣＡＲ構造について提供するためのより可撓性の低い構造を与える１つ以上の部分を含み得るように、ＣＡＲの設計が、すべてまたは部分的に可撓性であるリンカーを含み得ることを認識するであろう。特定のリンカーは、配列番号２３～２５に示されるように、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーを含み、式中、ｎ＝１～３である。別の例示的なリンカーは、配列番号２６として提供される。リンカーは、ＣＡＲのＬＣＶＲ領域とＨＣＶＲ領域との間に、可変領域（ＨＣＶＲなど）とヒンジ領域（ＣＤ８αヒンジなど）との間に、またはそれらの両方に存在し得る。例えば、本開示は、ＬＣＶＲとＨＣＶＲとの間の（Ｇ４Ｓ）３リンカー、およびＨＣＶＲとＣＤ８αヒンジとの間の（Ｇ４Ｓ）１リンカーを含むＣＡＲを提供する。
ＣＡＲの結合ドメインの後には、「スペーサー」または「ヒンジ」が続いてもよく、これは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から遠ざけて、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、および活性化を可能にする領域を指す（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２－４１９）。ＣＡＲのヒンジ領域は、概して膜貫通（ＴＭ）と結合ドメインとの間にある。特定の実施形態において、ヒンジ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域であり、野生型免疫グロブリンヒンジ領域または改変された野生型免疫グロブリンヒンジ領域であり得る。本明細書に記載のＣＡＲにおいて使用される他の例示的なヒンジ領域として、ＣＤ８アルファ、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＤ７などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、これらはこれらの分子からの野生型ヒンジ領域であり得るか、または改変され得る。一実施形態において、ヒンジ領域は、ＣＤ８アルファヒンジ（配列番号２７）を含む。
「膜貫通」領域またはドメインは、細胞外結合部分を免疫エフェクター細胞の原形質膜に固定し、結合ドメインの標的抗原への結合を促進するＣＡＲの部分である。膜貫通ドメインはＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインであり得るが、採用され得る他の膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファ、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４から取得されたものを含む。一実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ１３７の膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、膜貫通ドメインは合成であり、その場合、それは、ロイシンおよびバリンなどの主に疎水性の残基を含むであろう。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「シグナル伝達ドメイン」は、キメラ抗原受容体タンパク質の一部を指し、それは標的抗原に結合する効果的なＣＡＲのメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、および細胞傷害性因子のＣＡＲが結合した標的細胞への放出を含む細胞傷害性活性、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合で誘発される他の細胞応答を誘発することに関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含む助けまたは活性であり得る。したがって、本明細書で互換的に使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実施するように指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を採用することができるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が使用される範囲で、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、ドメイン全体の代わりにそのような短縮部分を使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。細胞内シグナル伝達ドメインは「シグナル伝達ドメイン」としても知られており、典型的には、ヒトＣＤ３またはＦｃＲｙ鎖の部分に由来する。
Ｔ細胞受容体のみを介して生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次的または共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、すなわち、Ｔ細胞受容体を介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）、および抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると言うことができる。共刺激的に作用する細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。
本開示において特に有用である一次細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。１つの特定の実施形態において、本明細書に記載される抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータに由来する。いくつかの実施形態において、シグナル伝達ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。共刺激分子は、抗原受容体またはＦｃ受容体以外の細胞表面分子であり、抗原に結合するとＴリンパ球の効率的な活性化および機能に必要な第２のシグナルを提供する。このような共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＤ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ２、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドが挙げられる。したがって、本開示は、ＣＤ３ゼータおよび４－１ＢＢに由来する例示的な共刺激ドメインを提供するが、一方で他の共刺激ドメインは、本明細書に記載のＣＡＲでの使用が企図される。１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含むことによって、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および増殖が増強され得る。細胞内シグナル伝達および共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に直列で任意の順序で連結され得る。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
ＣＤ３またはＦｃＲガンマ由来のシグナル伝達ドメインを含むように操作されたｓｃＦｖベースのＣＡＲは、Ｔ細胞の活性化およびエフェクター機能についての強力なシグナルを伝達することが示されているが、それらは、付随する共刺激シグナルの非存在下においては、Ｔ細胞の生存および増殖を促進するシグナルを誘発するのに十分ではない。１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４およびＣＤ２７８に由来する細胞内共刺激ドメイン）とともに、結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通、およびＣＤ３ゼータまたはＦｃＲガンマに由来するシグナル伝達ドメインを含む他のＣＡＲは、インビトロのＣＡＲを発現するＴ細胞において、ならびに動物モデルおよびがん患者において、抗腫瘍活性ならびにサイトカイン分泌、溶解活性、生存および増殖の増加をより効果的に指示し得る（Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００９；１７：１４５３－１４６４、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１０；１８：４１３－４２０、Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００９；１０６：３３６０－３３６５）。
様々な実施形態において、本開示の抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＡＲは、（ａ）結合ドメインとして抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ｓｃＦｖ（例えば、表１において同定された抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体由来の結合領域（例えば、ＣＤＲまたは可変ドメイン）を有するｓｃＦｖ）、（ｂ）ヒトＣＤ８アルファに由来するヒンジ領域、（ｃ）ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン、および（ｄ）ヒトＴ細胞受容体ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３）細胞内シグナル伝達ドメイン、および任意選択で１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４－１ＢＢを含む。一実施形態において、種々のタンパク質ドメインは、アミノ末端からカルボキシル末端へ、結合ドメイン、ヒンジ領域、および膜貫通ドメインの順序で配置される。細胞内シグナル伝達ドメインおよび任意選択の共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通のカルボキシ末端に任意の順序で直列に連結されて、単鎖キメラポリペプチドを形成する。一実施形態において、抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＡＲをコードする核酸構築物は、種々のコード配列、例えば、（５’から３’へ）ヒト抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８アルファヒンジ、ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインのコード配列を含む核酸分子を含むキメラ核酸分子である。別の実施形態において、抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＡＲをコードする核酸構築物は、種々のコード配列、例えば、（５’から３’へ）ヒト抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８アルファヒンジ、ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ共刺激ドメインのコード配列を含む核酸分子を含むキメラ核酸分子である。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、ベクターに挿入される。ベクターは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを共有結合で挿入して、そのタンパク質の発現および／またはポリヌクレオチドのクローニングについてもたらすことができるビヒクルである。そのようなベクターは、「発現ベクター」と称される場合もある。単離されたポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の任意の好適な方法を使用してベクターに挿入され得、例えば、限定することなく、ベクターを適切な制限酵素を使用して消化し、次いで、一致する制限末端を有する単離ポリヌクレオチドとライゲーションし得る。発現ベクターは、細胞内で転写されることができる遺伝子産物の少なくとも一部についてコードする異種または修飾された核酸配列を組み込んで発現する能力を有し得る。ほとんどの場合、ＲＮＡ分子はタンパク質に翻訳される。発現ベクターは、様々な制御配列を含み得、それは、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の転写および場合によっては翻訳のために必要な核酸配列を指す。転写および翻訳を調節する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、同様に他に機能も果たす核酸配列を含み得、以下で論じられる。発現ベクターは、追加の要素を含み得、例えば、発現ベクターは、２つの複製システムを有し得、したがって、それを２つの生物、例えば、発現のためのヒト細胞ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主において維持されることを可能にする。
発現ベクターは、ＣＭＶ、ＰＧＫおよびＥＦ１アルファプロモーターなどのプロモーター配列、リボソーム認識および結合ＴＡＴＡボックス、およびそれぞれの宿主細胞における効率的な遺伝子転写および翻訳のための３’ＵＴＲ ＡＡＵＡＡＡ転写終結配列などの必要な５’上流および３’下流調節要素を有し得る。他の好適なプロモーターには、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、ＥＢＶ即時初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルスプロモーターの構成的プロモーターを含む。アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターを含むがこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーターも使用され得る。特定の実施形態において、誘導性プロモーターも、キメラ抗原受容体を発現するベクターの一部として企図される。これは、目的のポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、またはテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
発現ベクターは、発現されたＣＡＲに組み込まれる６ｘ－ヒスチジン、ｃ－Ｍｙｃ、およびＦＬＡＧタグなどの追加の配列を有し得る。したがって、発現ベクターは、５’および３’の非翻訳調節配列を含むように操作され得、これは、発現ベクター上で運ばれる目的の核酸の効率的な転写を促進または増強することができるエンハンサー配列、プロモーター領域および／またはターミネーター配列として機能し得る。発現ベクターはまた、特定の細胞型、細胞位置、または組織型における複製および／または発現機能性（例えば、転写および翻訳）のために操作され得る。発現ベクターは、宿主またはレシピエント細胞におけるベクターの維持のための選択可能なマーカーを含み得る。
様々な実施形態において、ベクターは、プラスミド、自律的に複製する配列、および転位要素である。追加の例示的なベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターの例としては、哺乳類細胞における発現のためのＬｅｎｔｉ－Ｘ（商標）バイシストロン性発現システム（Ｎｅｏ）ベクター（Ｃｌｏｎｔｒｃｈ）、ｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳類細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子導入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ．ＴＭ．、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ．ＴＭ．、およびｐＬｅｎｔｉ６．２Ｎ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。本明細書に開示されるＣＡＲのコード配列は、哺乳類細胞におけるキメラタンパク質の発現のためにそのような発現ベクターにライゲーションされ得る。
特定の実施形態において、本開示のＣＡＲをコードする核酸は、ウイルスベクターにおいて提供される。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、または泡沫状ウイルスに由来するものであり得る。本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、少なくとも１つのウイルス起源の要素を含み、ウイルスベクター粒子にパッケージ化される能力を有する核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載の様々なキメラタンパク質についてのコード配列を含み得る。インビトロまたはインビボのいずれかでＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の核酸を細胞に移す目的で、ベクターおよび／または粒子を利用し得る。ウイルスベクターの多くの形態が当技術分野において既知である。
特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲのコード配列を含むウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的および機能的遺伝子要素を含むベクターを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来する、ＬＴＲの外側の構造的および機能的な遺伝的要素を含むベクターを指す。
本明細書で使用するレトロウイルスベクターは、任意の既知のレトロウイルス（例えば、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、フレンド、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などのｃ型レトロウイルス）に由来し得る。本開示の「レトロウイルス」はまた、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ＨＴＬＶ－１およびＨＴＬＶ－２、ならびにヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ）およびその他のクラスのレトロウイルスなどレトロウイルスのレンチウイルスファミリーを含む。
本明細書で使用するレンチウイルスベクターは、ゆっくりと進行する疾患を引き起こすレトロウイルスの群（または属）であるレンチウイルスに由来するベクターを指す。この群に含まれるウイルスは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）、ビスナ・マエディ、ヤギ関節炎－脳炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む。組換えレンチウイルスの調製は、ＤｕｌｌらおよびＺｕｆｆｅｒｅｙらによる方法を使用して達成され得る（Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８；７２：８４６３－８４７１およびＺｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８；７２：９８７３－９８８０）。
本開示において使用するためのレトロウイルスベクター（すなわち、レンチウイルスおよび非レンチウイルスの両方）は、本明細書に記載の順序および方向で所望のＤＮＡ配列を組み合わせることにより、標準的なクローニング技術を使用して形成され得る（分子生物学における現在のプロトコル、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ９．１０－９．１４ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｔａｎｄａｒｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌｓ、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３９５－１３９８、Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：６４６０－６４６４、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０１４－３０１８、Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１－６１４５、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０３９－８０４３、Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３７７－８３８１、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２－１８０５、ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７６４０－７６４４、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１－６４７、Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０８９２－１０８９５、Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：４１０４－４１１５、米国特許第４，８６８，１１６号、米国特許第４，９８０，２８６号、ＰＣＴ出願第８９／０７１３６号、ＰＣＴ出願第８９／０２４６８号、ＰＣＴ出願第８９／０５３４５号、およびＰＣＴ出願第９２／０７５７３号）。
ベクターの形成において使用するためのレトロウイルス（すなわち、レンチウイルスおよび非レンチウイルスの両方）配列を取得するための好適な供給源は、例えば、Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄを含む市販の供給源から入手可能なゲノムＲＮＡおよびｃＤＮＡを含む。配列を化学的に合成することもできる。
抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＡＲの発現のために、ベクターを宿主細胞に導入して、宿主細胞内でのポリペプチドの発現を可能にし得る。発現ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能なマーカー、およびシグナル配列を含むがこれらに限定されない発現を制御するための様々な要素を含み得る。これらの要素は、本明細書に記載されるように、当業者によって適切に選択され得る。例えば、プロモーター配列は、ベクターにおけるポリヌクレオチドの転写を促進するように選択され得る。好適なプロモーター配列は、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ベータアクチンプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＣＭＶプロモーター、およびＳＶ４０プロモーターを含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの転写を増強するために、エンハンサー配列を選択し得る。ベクターが挿入された宿主細胞をそうでないものから選択できるように、選択可能なマーカーを選択し得、例えば、選択可能なマーカーは、抗生物質耐性を付与する遺伝子であり得る。シグナル配列は、発現されたポリペプチドが宿主細胞の外に輸送されることを可能にするように選択され得る。
ポリヌクレオチドのクローニングのために、ベクターを宿主細胞（単離された宿主細胞）に導入して、ベクター自体の複製を可能にし、それにより、そこに含まれるポリヌクレオチドのコピーを増幅し得る。クローニングベクターは、概して、複製起点、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、および選択可能なマーカーを含むがこれらに限定されない配列成分を含み得る。これらの要素は、当業者によって適切に選択され得る。例えば、複製起点は、宿主細胞におけるベクターの自律複製を促進するように選択され得る。
特定の実施形態において、本開示は、本明細書で提供されるベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。ベクターを含む宿主細胞は、ベクター中に含まれるポリヌクレオチドの発現またはクローニングにおいて有用であり得る。好適な宿主細胞は、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞などの高等真核細胞を含み得るがこれらに限定されない。この目的に適した原核生物細胞は、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓおよびＳｈｉｇｅｌｌａなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｈａｃｅａｅ、ならびに、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどのＢａｃｉｌｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含むが、これらに限定されない。
本開示のＣＡＲは、当技術分野で既知のトランスフェクションおよび／または形質導入技術を使用して宿主細胞に導入される。本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」および「形質導入」という用語は、外因性核酸配列が宿主細胞に導入されるプロセスを指す。核酸は、宿主細胞のＤＮＡに組み込まれ得るか、または染色体外で維持され得る。核酸は一過性に維持され得るか、または安定した導入であり得る。トランスフェクションは、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、およびバイオリスティック法を含むがこれらに限定されない当技術分野で既知の様々な手段によって達成され得る。形質導入は、トランスフェクションによってではなくウイルス感染によるウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用した遺伝子の送達を指す。特定の実施形態において、レトロウイルスベクターは、細胞と接触する前にベクターをビリオンにパッケージングすることによって形質導入される。例えば、レトロウイルスベクターによって運ばれる抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＡＲをコードする核酸は、感染およびプロウイルスの組み込みを介して細胞に形質導入され得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という用語は、細胞内の全遺伝物質へのＤＮＡまたはＲＮＡの形態の余分な遺伝物質の添加を指す。「遺伝子改変細胞」、「改変細胞」、および「方向転換された細胞」という用語は、互換的に使用される。
特に、本開示のＣＡＲは、それらの特異性を、目的の標的抗原、例えば、ＨＬＡ－Ａ２とともにＭＡＧＥ－Ａ４を提示する悪性細胞などの悪性のＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞に方向転換するように、免疫エフェクター細胞に導入および発現される。
本開示は、本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作製するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、免疫エフェクター細胞が本明細書に記載の１つ以上のＣＡＲを発現するように、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍細胞を有する対象などの対象から単離された免疫エフェクター細胞にトランスフェクションまたは形質導入することを含む。特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、個体から単離され、インビトロでさらに操作することなく遺伝子改変される。次いで、そのような細胞は、個体に直接再投与され得る。さらなる実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される前に、インビトロで最初に活性化および刺激されて増殖する。これに関して、免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される（すなわち、本明細書に記載されるように、ＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクションされる）前または後に培養され得る。
本明細書に記載の免疫エフェクター細胞のインビトロ操作または遺伝子改変の前に、細胞の供給源を対象から取得することができる。特に、本明細書に記載のＣＡＲとともに使用するための免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺の問題、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍など、多くの供給源から取得され得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ分離などの当業者に既知の任意の数の技術を使用して、対象から収集された一単位の血液から取得され得る。一実施形態において、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって取得され得る。アフェレーシス産物は典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、その他の有核白血球、赤血球、血小板を含むリンパ球を含む。一実施形態において、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理のために細胞を適切な緩衝液または培地に入れることができる。本開示の一実施形態において、細胞をＰＢＳで洗浄する。代替の実施形態において、洗浄された溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠くか、またはすべてではないにしても多くの二価カチオンを欠く可能性がある。当業者によって理解されるように、洗浄ステップは、半自動フロースルー遠心分離機を使用することなど、当業者に既知の方法によって達成され得る。洗浄後、細胞を様々な生体適合性緩衝液または緩衝液の有無にかかわらず他の生理食塩水溶液に再懸濁し得る。特定の実施形態において、アフェレーシス試料の望ましくない成分は、細胞が直接再懸濁された培養培地において除去され得る。
特定の実施形態において、Ｔ細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心分離によって、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定の亜集団を、陽性または陰性選択技術によってさらに単離し得る。例えば、陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせで達成され得る。本明細書で使用するための一方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞について濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。フローサイトメトリーおよび細胞選別もまた、本開示において使用するための目的の細胞集団を単離するために使用され得る。
ＰＢＭＣは、本明細書に記載の方法を使用して、ＣＡＲでの遺伝子改変に直接使用され得る。特定の実施形態において、ＰＢＭＣの単離後、Ｔリンパ球がさらに単離され、特定の実施形態において、細胞傷害性およびヘルパーＴリンパ球の両方を、遺伝子改変および／または増殖の前または後のいずれかで、ナイーブ、メモリー、およびエフェクターＴ細胞亜集団に選別し得る。標準的な方法を使用することによってＣＤ８＋細胞を取得し得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋細胞は、これらの種類のＣＤ８＋細胞の各々に関連する細胞表面抗原を同定することによって、ナイーブ、中央メモリー、およびエフェクター細胞にさらに選別される。実施形態において、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ６２Ｌ－サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８および抗ＣＤ６２Ｌ抗体で染色した後、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ８＋およびＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分に選別される。いくつかの実施形態において、中央メモリーＴＣＭの表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、およびＣＤ１２７を含み、グランザイムＢに対して陰性である。いくつかの実施形態において、中央メモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ１２７に対して陰性であり、グランザイムＢおよびパーフォリンに対して陽性である。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、およびＣＤ４５ＲＡを含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられる。
特定の実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、さらに亜集団に選別される。例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することにより、ナイーブ、中央メモリー、エフェクター細胞に選別され得る。標準的な方法によってＣＤ４＋リンパ球を取得し得る。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、中央メモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性およびＣＤ４５ＲＯ陽性である。いくつかの実施形態において、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＯ陰性である。
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、既知の方法を使用して単離の後に遺伝子改変され得るか、または免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される前にインビトロで活性化および増殖（または前駆細胞の場合は分化）し得る。別の実施形態において、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体で遺伝子改変され（例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターで形質導入される）、次いで、インビトロで活性化および増殖する。Ｔ細胞を活性化および拡大するための方法は当技術分野において既知であり、例えば、米国特許第６，９０５，８７４号、米国特許第６，８６７，０４１号、米国特許第６，７９７，５１４号、ＷＯ２０１２／０７９０００に記載されている。概して、そのような方法は、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞を、ＩＬ－２などの適切なサイトカインを含む培地において、概してビーズまたは他の表面に結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体などの刺激剤および共刺激剤と接触させることを含む。同じビーズに結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体は、「代理」抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能する。他の実施形態において、Ｔ細胞は、米国特許第６，０４０，１７７号、米国特許第５，８２７，６４２号、およびＷＯ２０１２／１２９５１４に記載されているものなどの方法を使用して、フィーダー細胞および適切な抗体およびサイトカインとともに活性化および刺激されて、増殖し得る。
本開示は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍、例えば、多発性骨髄腫または黒色腫によって引き起こされる悪性腫瘍を有する患者の治療のための改変された免疫エフェクター細胞の集団を提供し、改変された免疫エフェクター細胞は、本明細書に開示される抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＡＲを含む。
本明細書に記載されるように調製されたＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、既知の技術、または本開示に基づいて当業者に明らかであろうそのバリエーションによる養子免疫療法のための方法および組成物において利用され得る。例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇらの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号を参照されたい。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５号も参照されたい。
いくつかの実施形態において、細胞は、最初にそれらの培養培地からそれらを採取し、次いで、治療有効量での投与に適した培地および容器系（「薬学的に許容される」担体）において細胞を洗浄および濃縮することによって製剤化される。好適な注入培地は、任意の等張培地製剤、典型的には通常の生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）またはＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）であり得るが、水中５％のデキストロースまたはリンガー乳酸も利用され得る。注入培地は、ヒト血清アルブミンが補充され得る。
組成物中の治療有効量の細胞は、少なくとも２つの細胞（例えば、少なくとも１つのＣＤ８＋中央メモリーＴ細胞および少なくとも１つのＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のサブセット）であるか、またはより典型的には１０２細胞超で、最大１０６まで、最大１０８または１０９細胞を含み、および１０１０細胞超であり得る。細胞の数は、その中に含まれる細胞の種類と同様に、組成物が意図される最終的な用途に依存するであろう。
細胞は、療法を受けている患者に対して自家または異種であり得る。必要に応じて、処置は、免疫応答の誘導を増強するために本明細書に記載のマイトジェン（例えば、ＰＨＡ）またはリンホカイン、サイトカイン、および／もしくはケモカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１８、およびＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与も含み得る。
本開示のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞集団は、単独で、または、希釈剤および／もしくはＩＬ－２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分との組み合わせで医薬組成物として、投与され得る。簡単に言えば、本開示の医薬組成物は、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載のＴ細胞などのＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞集団を含み得る。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、および防腐剤を含み得る。本開示の組成物は、好ましくは、静脈内投与用に製剤化される。
本明細書に記載の方法または当技術分野において既知の他の方法を使用して本明細書に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞を投与することによって対象において誘導される抗腫瘍免疫応答は、感染した細胞を死滅させることができる細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、およびヘルパーＴ細胞応答によって媒介される細胞性免疫応答を含み得る。Ｂ細胞を活性化して抗体産生をもたらすことができるヘルパーＴ細胞によって主に媒介される液性免疫応答も誘導され得る。本開示の組成物によって誘導される免疫応答の種類を分析するために、様々な技術を使用し得、それは当技術分野において、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００１）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．で十分に説明されている。
したがって、本開示は、がん細胞（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する固形腫瘍細胞）によるＭＡＧＥ－Ａ４の発現によって少なくとも部分的に特徴付けられる悪性腫瘍と診断されるか、またはそれを有する疑いがあるか、またはそれを発症するリスクがある個体を治療する方法を提供し、本明細書に記載の治療有効量のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を個体に投与することを含む。
一実施形態において、本開示は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんと診断された対象を治療する方法を提供し、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんと診断された対象由来の免疫エフェクター細胞を除去すること、該免疫エフェクター細胞を、本開示のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターで遺伝子改変すること、それにより、改変された免疫エフェクター細胞の集団を産生すること、および改変された免疫エフェクター細胞の集団を同じ対象に投与することを含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
本明細書に記載の細胞組成物を投与するための方法は、エクスビボ遺伝子改変された免疫エフェクター細胞の再導入をもたらすのに有効な任意の方法を含み、それは、対象において本開示のＣＡＲを直接発現するか、または対象に導入されるとＣＡＲを発現する成熟免疫エフェクター細胞に分化する免疫エフェクター細胞の遺伝子改変された前駆細胞の再導入のいずれかである。１つの方法は、エクスビボで本開示による核酸構築物を末梢血Ｔ細胞に形質導入し、形質導入された細胞を対象に戻すことを含む。
キメラ抗原受容体および対応する抗体の結合特性
本明細書で使用される場合、キメラ抗原受容体または対応する抗体の、例えば、細胞表面タンパク質またはそのフラグメントなどの所定の抗原へ（またはＨＬＡ分子などの細胞表面タンパク質に結合した抗原へ）の結合の文脈における「結合」という用語。結合は、典型的に、抗原結合ドメイン、抗原相互作用など、最低限の２つの存在物または分子構造間の相互作用または関連性を指す。
例えば、結合親和性は、例えば、リガンドとして抗原を、分析物（または抗リガンド）として抗体またはキメラ抗原受容体を使用したＢＩＡｃｏｒｅ ３０００機器での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により決定される場合、典型的には、約１０－８Ｍ以下など、約１０－９Ｍ以下などの約１０－７Ｍ以下のＫＤ値に対応する。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）結合アッセイなどの細胞ベースの結合戦略もまた、日常的に使用されており、ＦＡＣＳデータは、放射性リガンド競合結合およびＳＰＲなどの他の方法とよく相関する（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，ＣＡ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７，２０１（２）：２２３－３１、Ｇｅｕｉｊｅｎ，ＣＡ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５，３０２（１－２）：６８－７７）。
したがって、本開示のキメラ抗原受容体または対応する抗体は、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）へ結合するその親和性よりも少なくとも１０倍低いＫＤ値に対応する親和性を有する所定の抗原または細胞表面分子（受容体）に結合する。本明細書に記載されるように、本開示のキメラ抗原受容体または対応する抗体は、ＨＬＡに提示されたＭＡＧＥ－Ａ４抗原、例えば、ＨＬＡ－Ａ２に提示されたＭＡＧＥ－Ａ４抗原に結合し得る。本開示によれば、非特異的抗原と同等かそれより１０倍未満で低いＫＤ値を有するキメラ抗原受容体または対応する抗体の親和性は、検出不可能な結合とみなされ得る。
「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗原結合ドメイン対抗原の相互作用の解離平衡定数、または抗原に対する対応する抗体の解離平衡定数を指す。ＫＤと結合親和性との間には逆の関係があり、したがって、ＫＤ値が小さいほど、親和性は高い、すなわちより強い。したがって、「より高い親和性」または「より強い親和性」という用語は、相互作用を形成するより高い能力、つまりより小さいＫＤ値に関し、逆に「より低い親和性」または「より弱い親和性」という用語は、相互作用を形成するより低い能力、つまりより大きなＫＤ値に関する。状況によっては、特定の分子（例えば、キメラ抗原受容体または対応する抗体）のその相互作用パートナー分子（例えば抗原Ｘ）に対する結合親和性（またはＫＤ）が、分子（例えば、キメラ抗原受容体または対応する抗体）の別の相互作用パートナー分子（例えば、抗原Ｙ）に対する結合親和性と比較して、より高いことは、より大きなＫＤ値（より低い、またはより弱い親和性）をより小さなＫＤ（より高い、またはより強い親和性）で割ることによって決定される結合比として、例えば、場合によって５倍または１０倍高い結合親和性として、表され得る。
「ｋｄ」（秒－１または１／ｓ）という用語は、特定の抗原結合ドメイン対抗原の相互作用の解離速度定数、またはキメラ抗原受容体もしくは対応する抗体の解離速度定数を指す。その値はｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
「ｋａ」（Ｍ－１×秒－１または１／Ｍ）という用語は、特定の抗原結合ドメイン対抗原の相互作用の会合速度定数、またはキメラ抗原受容体もしくは対応する抗体の会合速度定数を指す。
「ＫＡ」（Ｍ－１または１／Ｍ）という用語は、特定の抗原結合ドメイン対抗原の相互作用の会合平衡定数、またはキメラ抗原受容体もしくは対応する抗体の会合平衡定数を指す。会合平衡定数は、ｋａをｋｄで割ることによって得られる。
「ＥＣ５０」または「ＥＣ５０」という用語は、最大半量の有効濃度を指し、指定された曝露時間後にベースラインと最大値との間の中間で応答を誘導するキメラ抗原受容体の濃度を含む。ＥＣ５０は本質的に、その最大効果の５０％が観察されるキメラ抗原受容体または抗体の濃度を表す。特定の実施形態において、ＥＣ５０値は、例えばＦＡＣＳ結合アッセイによって決定された場合に、抗原（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４などの腫瘍関連抗原）を発現する細胞への最大半量の結合を与える本開示のキメラ抗原受容体または対応する抗体の濃度に等しい。したがって、低下したまたは弱い結合は、ＥＣ５０の増加、または最大半量の有効濃度で観察される。
一実施形態において、結合の減少は、最大半量の標的細胞への結合を可能にするＥＣ５０キメラ抗原受容体または対応する抗体濃度の増加として定義することができる。
キメラ抗原受容体の配列バリアント
キメラ抗原受容体または本開示は、対応する抗体の個々の抗原結合ドメインが由来する対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域において１つ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本開示のキメラ抗原受容体は、本明細書に開示される例示的なＣＤＲまたは可変領域アミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗原結合ドメインを含み得、１つ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、対応する抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基へ、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基へ、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換へ変異する（このような配列変化は本明細書ではまとめて、「生殖系列変異」と呼ばれる）。当業者は、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組み合わせを含む多くの抗体を容易に産生することができる。特定の実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基はすべて、抗原結合ドメインが本来由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと再び変異する。他の実施形態において、ある特定の残基のみが、元の生殖系列配列へと再び変異し、例えば、変異した残基のみが、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められるか、または変異した残基のみが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に見出される。他の実施形態において、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗原結合ドメインが本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基へ変異する。さらに、抗原結合ドメインは、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含んでもよく、例えば、特定の個々の残基が、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基に変異する。
キメラ抗原受容体および対応する抗体の生物学的特徴
本開示は、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４に高い親和性（例えば、ナノモルまたはサブナノモルのＫＤ値）で結合する抗体に由来する抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体を提供する。
特定の実施形態によれば、本開示は、表面プラズモン共鳴によって測定される場合、約５ｎＭ未満のＫＤでヒトＭＡＧＥ－Ａ４（例えば、２５℃で）に結合する対応する抗体に由来する抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体を提供する。特定の実施形態において、表面プラズモン共鳴によって測定される場合、対応する抗体は、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、または約２５ｐＭ未満のＫＤでＭＡＧＥ－Ａ４に結合する。
本開示はまた、２５℃での表面プラズモン共鳴によって測定される場合、約１０分超または約１２５分超の解離半減期（ｔ１／２）でＭＡＧＥ－Ａ４に結合する対応する抗体に由来する抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体を提供する。特定の実施形態において、２５℃での表面プラズモン共鳴によって測定される場合、対応する抗体は、約３分超、約４分超、約１０分超、約２０分超、約３０分超、約４０分超、約５０分超、約６０分超、約７０分超、約８０分超、約９０分超、約１００分超、約１１０分超、または約１２０分超のｔ１／２でＭＡＧＥ－Ａ４に結合する。
本開示はまた、ＦＡＣＳ結合アッセイによって決定される場合、内因性ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するヒト細胞株に特異的に結合する対応する抗体に由来する抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体を提供する。
本開示はまた、（ｉ）ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞によって活性化される、かつ／または（ｉｉ）ヒト多発性骨髄腫または黒色腫の異種移植片を有する免疫無防備状態のマウスにおいて腫瘍の成長の阻害を示す、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体を発現する操作された細胞を提供する。
抗原結合ドメインの調製
特定の抗原（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４）に特異的である、本開示のキメラ抗原受容体の抗原結合ドメインは、当技術分野で既知の任意の抗体生成技術によって調製され得る。特定の実施形態において、本開示の対応する抗体の個々の成分（例えば、重鎖および軽鎖）のうちの１つ以上は、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体に由来する。そのような抗体を作製するための方法は当該技術分野において周知である。例えば、重鎖および／または軽鎖のうちの１つ以上は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を使用して調製され得る。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（または任意の他のヒト抗体生成技術）を使用して、特定の抗原（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４）に対する高親和性キメラ抗体が、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有して最初に単離される。抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けられ、選択される。本明細書で論じられるように、次いで、これらのヒト可変領域（またはＣＤＲ）は、キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインに組み込まれ得る。
ポリヌクレオチドおよびベクター
本開示はまた、本明細書で論じられるキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドおよびベクターを提供する。
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞に導入するためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または哺乳類宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスなどのプラスミドまたはウイルスベクター）を含み得る。
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、または配列番号２２のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、配列番号３８のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、または配列番号３９のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を操作する方法
本開示は、免疫療法のための免疫細胞を調製する方法を提供し、エクスビボで、そのような免疫細胞に、本明細書に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体のうちの１つをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを導入することを含む。
本開示は、本明細書で論じられるＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体のうちの１つをコードするポリヌクレオチドまたはレンチウイルスベクターを含む免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態において、これらの免疫細胞は、免疫療法（例えば、がんの治療）のために使用される。
本開示は、免疫細胞を同種異系移植により適したものにするためにそれらを遺伝子改変する方法を提供する。第１の態様によれば、例えば、ＷＯ２０１３／１７６９１５に記載されているように、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の１つ以上の成分を発現する少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによって免疫細胞を同種異系にすることができ、それはＨＬＡまたはβ２ｍタンパク質の発現をコードまたは調節する遺伝子の不活化と組み合わされ得る。したがって、移植片対宿主症候群および移植片拒絶のリスクは顕著に減少する。本開示のさらなる態様によれば、免疫細胞をさらに操作して、ＰＤ１またはＣＴＬＡ－４などのＴ細胞活性化の調節因子として作用する「免疫チェックポイント」として作用するタンパク質をコードする遺伝子を不活性化することによって、それらをより活性にするかまたは消耗を制限するようにすることができる。
操作された免疫細胞
本開示はまた、本明細書に記載のキメラ抗原受容体を含む免疫細胞（例えば、操作された免疫細胞）を提供する。場合によっては、免疫細胞は、免疫エフェクター細胞である。場合によっては、免疫細胞は、Ｔ細胞である。場合によっては、免疫細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球から選択されるＴリンパ球である。場合によっては、免疫細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球である。
いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ａ）軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＭＡＧＥ－Ａ４単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通ドメインと、（ｄ）共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインと、を含むキメラ抗原受容体を含む操作されたヒトＴ細胞である。
いくつかの実施形態において、操作されたヒトＴ細胞のｓｃＦｖドメインは、配列番号２／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。いくつかの実施形態において、操作されたヒトＴ細胞のｓｃＦｖドメインは、配列番号２／３７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。場合によっては、ヒンジは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。場合によっては、膜貫通ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。場合によっては、共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインである。場合によっては、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。場合によっては、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインである。場合によっては、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
様々な実施形態において、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。様々な実施形態において、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号３９のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。
生物学的等価物
本開示は、キメラ抗原受容体およびキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞を提供し、それらは、本明細書に開示される例示的な分子のものとは異なるが、ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する能力を保持するか、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞の存在下でキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を活性化するか、またはＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍細胞の成長または増殖を抑制するアミノ酸配列を有する。このようなバリアント分子は、親配列と比較した場合、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含み得るが、記載された二重特異性抗原結合分子の生物学的活性と本質的に同等である生物学的活性を示す。
一実施形態において、本開示のキメラ抗原受容体を発現する２つの操作された免疫細胞は、それらの安全性、純度、および効力に臨床的に意味のある差異がない場合、生物学的に等価である。
一実施形態において、参照産物と生物学的産物との間での切り替えなしで持続される療法と比較して、免疫原性の臨床的に顕著な変化または有効性の減退を含む有害作用のリスクの予想される増加なしに、患者が参照産物と生物学的産物との間で１回以上切り替えることができる場合、２つの操作された免疫細胞は、生物学的に等価である。
一実施形態において、２つの操作された免疫細胞は、それらが両方とも、使用条件についての共通の作用機序によって、このような機序が既知である範囲で作用する場合、生物学的に等価である。
生物学的等価性は、インビボおよびインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性測定法には、例えば、（ａ）操作された細胞の濃度が、時間の関数として、血液、血漿、血清または他の生体液中で測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験、（ｂ）ヒトのインビボ生物学的利用能データと相関し、合理的に予測するインビトロ試験、（ｃ）操作された細胞の適切な急性薬理学的効果が、時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験、および（ｄ）操作された細胞の安全性、効能、または生物学的利用能もしくは生物学的等価性を確立する、十分に管理された臨床試験が含まれる。
本明細書に記載の例示的な操作された細胞の生物学的に等価なバリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を生じること、または生物活性に必要とされない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失することによって構築され得る。
種の選択性および種の交差反応性
本開示の特定の実施形態によれば、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４に結合するが他の種由来のＭＡＧＥ－Ａ４には結合しない抗原結合ドメインが提供される。本開示はまた、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４および１つ以上の非ヒト種由来のＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗原結合ドメインを提供する。いくつかの実施形態において、本開示の抗原結合ドメインは、ＭＡＧＥ－Ａ４ ２８６－２９４または２３０－２３９に結合する。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインが結合するＭＡＧＥ－Ａ４（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４ ２８６－２９４または２３０－２３９）は、ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡ－Ａ２によって細胞の表面上に提示される。
本開示の特定の例示的な実施形態によれば、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４に結合し、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーのＭＡＧＥ－Ａ４のうちの１つ以上に結合し得るか、または結合し得ない抗原結合ドメインが提供される。さらに、ＭＡＧＥ－Ａ４への結合は、ＨＬＡに提示されたＭＡＧＥ－Ａ４などのＭＨＣに提示されたＭＡＧＥ－Ａ４の状況かであり得る。例示的なＨＬＡに提示されたＭＡＧＥ－Ａ４は、ＨＬＡ－Ａ２が結合したヒトＭＡＧＥ－Ａ４である。
操作された免疫細胞の活性化および増殖
操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）の遺伝子改変の前であろうと後であろうと、本開示の遺伝子改変された免疫細胞が活性化され、抗原結合メカニズムとは無関係に増殖する場合でも、免疫細胞、特に本開示のＴ細胞を、概して、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号に記載の方法を使用して、さらに活性化および増殖させ得る。インビトロまたはインビボでＴ細胞を増殖させ得る。
概して、本開示のＴ細胞は、ＣＤ３ ＴＣＲ複合体およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤との接触によって増殖し、Ｔ細胞の活性化シグナルを生成する。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）、または有糸分裂レクチン様フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの化学物質を使用して、Ｔ細胞の活性化シグナルを生成し得る。
非限定的な例として、Ｔ細胞集団は、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または表面に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によってなど、インビトロで刺激され得る。Ｔ細胞の表面のアクセサリー分子の共刺激については、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。Ｔ細胞培養に適した条件には、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－ｇ、１Ｌ－４、１Ｌ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、１Ｌ－１５、ＴＧＦｐ、およびＴＮＦ－αを含む増殖および生存に必要な因子、または当業者に既知の細胞の成長のための任意の他の添加剤を含み得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ－ｖｉｖｏ５、（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の成長のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノールなどの還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、無血清で、または、適切な量の血清（もしくは血漿）もしくは定義されたホルモンのセット、および／もしくはＴ細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカインを補充した、ＲＰＭＩ１６４０、Ａ１Ｍ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１、Ｘ－Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は、実験培養においてのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気に加えて５％Ｏ２）で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、様々な特徴を示す可能性がある。
いくつかの実施形態において、組織または細胞と共培養することによって細胞を増殖させ得る。細胞はまた、例えば、該細胞を対象に投与した後、対象の血液中でインビボで増殖させ得る。
治療への応用
本開示は、本開示のキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）および薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物を提供する。場合によっては、操作された細胞は、特に免疫療法のための医薬品を形成する。場合によっては、操作された細胞は、がん（例えば、多発性骨髄腫または黒色腫）の治療のために使用される。場合によっては、操作された細胞は、免疫療法および／またはがん（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがん）の治療のための医薬品の製造において使用される。
本開示は、それを必要とする対象に、本明細書で論じられるキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む治療用組成物を投与することを含む方法を提供する。治療用組成物は、本明細書に開示される任意のキメラ抗原受容体を発現する細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤またはビヒクルとを含み得る。本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という表現は、がんの１つ以上の症状または徴候を示すヒトまたは非ヒト動物（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍を有する対象または本明細書に記載のがんのうちのいずれかに罹患している対象）、またはそうでなければＭＡＧＥ－Ａ４活性の阻害もしくは減少もしくはＭＡＧＥ－Ａ４＋細胞の枯渇から利益を得るであろう者を意味する。
本開示の操作された細胞は、とりわけ、免疫応答の刺激、活性化、および／または標的化が有益である任意の疾患または障害を治療するために有用であり得る。特に、本開示の操作された細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ４の発現もしくは活性、またはＭＡＧＥ－Ａ４＋細胞の増殖に関連するかまたはそれによって媒介される任意の疾患または障害の治療、予防、および／または改善のために使用され得る。本開示の操作された細胞を使用して阻害または殺す死滅することができるＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞は、例えば、多発性骨髄腫細胞、黒色腫細胞、または他の固形腫瘍細胞を含む。
本開示の操作された細胞は、例えば、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道がん、頭頸部がん、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮がん、胃がん、子宮頸がん、乳がん、および黒色腫を含むがこれらに限定されないがんを含む、ＭＡＧＥ－Ａ４発現に関連する疾患または障害を治療するために使用され得る。本開示の操作された細胞は、概して、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍を治療するために使用され得る。本開示の他の関連する実施形態によれば、本明細書に開示される操作された細胞を、上記のがんからの腫瘍を含む、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍に罹患している患者に投与することを含む方法が提供される。腫瘍スキャニングなどの当技術分野において既知の分析的／診断的方法を使用して、患者がそのような腫瘍、疾患、または状態を抱えているかどうかを確認し得る。
本開示はまた、対象における残存がんを治療するための方法を提供する。本明細書で使用される場合、「残存がん」という用語は、抗がん療法による治療後の対象における１つ以上のがん性細胞の存在または持続を意味する。
特定の態様によれば、本開示は、対象が疾患または傷害を有すると決定された後、本明細書の他所に記載の操作された細胞の集団を対象に投与することを含む、ＭＡＧＥ－Ａ４発現に関連する疾患または障害（例えば、がん）を治療するための方法を提供する。例えば、本開示は、対象が他の免疫療法または化学療法を受けてから１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、または４週間、２カ月、４カ月、６カ月、８カ月、１年、またはそれ以上後に、操作された免疫細胞を患者に投与することを含む、疾患または障害を治療するための方法を提供する。
本明細書で論じられる治療は、改善、治癒、または予防的であり得る。治療は、自家免疫療法の一部または同種異系免疫療法の一部のいずれかであり得る。自家によるとは、患者の治療のために使用される細胞、細胞株、または細胞の集団が、患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合ドナーに由来することを意味する。同種異系によるとは、患者の治療のために使用される細胞、細胞株、または細胞の集団が、患者ではなくドナーに由来することを意味する。
開示された方法で使用され得る細胞は、本明細書に記載されている。治療は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞、特にＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞の過剰によって特徴付けられる前悪性または悪性のがん状態と診断された患者を治療するために使用され得る。そのような状態はがんにおいて見出され得る。
本開示の操作された細胞で治療されるがんの種類は、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道がん、頭頸部がん、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮がん、胃がん、子宮頸がん、乳がん、および黒色腫を含むがこれらに限定されない。
本開示の組成物および方法は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞または組織を有すると特徴付けられた、またはＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞または組織を有することが疑われる対象を治療するために使用され得る。例えば、本開示による治療から利益を得る対象は、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道がん、頭頸部がん、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮がん、胃がん、子宮頸がん、乳がん、または黒色腫を有する対象を含む。
本開示による細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、埋め込みまたは移植を含む、任意の便利な様式で実施され得る。本明細書に記載の組成物は、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に投与され得る。一実施形態において、本開示の細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。
細胞または細胞の集団の投与は、体重ｋｇ当たり１０４～１０９細胞、好ましくは１０５～１０６細胞／ｋｇ体重の投与からなり得、これらの範囲内の細胞数のすべての整数値を含む。細胞または細胞の集団は、１つ以上の用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、有効量の細胞は、単回投与として投与される。いくつかの実施形態において、有効量の細胞は、ある期間にわたって２回以上の用量として投与される。投与のタイミングは、主治医の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の供給源から得ることができる。個々のニーズは異なるが、特定の疾患または状態についての所与の細胞型の有効量の範囲の決定は当業者の範囲内である。有効量は、治療的または予防的利益をもたらす量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康および体重、同時治療の種類、もしあれば、治療の頻度、および望まれる効果の性質に依存するであろう。
一実施形態において、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口で投与される。この投与は静脈内投与であり得る。場合によっては、投与は、腫瘍内に注射することによって行われ得る。
本開示の特定の実施形態において、細胞は、抗ウイルス療法、シドフォビルおよびインターロイキン－２、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃとしても知られる）またはＭＳ患者に対するナタリズマブ治療または乾癬患者に対するエファリズチマブ治療またはＰＭＬ患者に対する他の治療などの薬剤での治療を含むがこれらに限定されない、任意の数の関連する治療法と併せて（例えば、前に、同時にまたは後に）患者に投与される。さらなる実施形態において、本開示のＴ細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノーレート、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体などの他の免疫除去剤、または他の抗体療法、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射と組み合わせて使用され得る。
さらなる実施形態において、本開示の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用したＴ細胞除去療法と併せて（例えば、前に、同時にまたは後に）患者に投与される。別の実施形態において、本開示の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばＲｉｔｕｘａｎなどのＢ細胞除去療法の後に投与される。例えば、一実施形態において、対象は、高用量化学療法とそれに続く末梢血幹細胞移植による標準的な治療を受け得る。特定の実施形態において、移植に続いて、対象は、本開示の増殖された免疫細胞の注入を受ける。追加の実施形態において、増殖した細胞は、手術の前または後に投与される。特定の実施形態において、任意の手段（例えば、外科手術、化学療法、または放射線療法）を使用して、本開示の増殖された免疫細胞の投与前に腫瘍負荷を減少させ得る。一実施形態において、本開示の操作された細胞の投与前に腫瘍負荷を低減することにより、ＣＡＲ Ｔ細胞療法に関連し得る副作用であるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの可能性を減少またはそれらを防止することができる。
併用療法
本開示は、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて、本明細書に記載のキメラ抗原受容体のうちのいずれかを含む操作された細胞または細胞の集団を投与することを含む方法を提供する。本開示の細胞または細胞の集団と組み合わせ得る、または組み合わせて投与され得る例示的な追加の治療剤は、例えば、抗腫瘍剤（例えば、メルファラン、ビンクリスチン（オンコビン）、シクロホスファミド（シトキサン）、エトポシド（ＶＰ－１６）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、リポソームドキソルビシン（ドキシル）、オベンダムスチン（トレアンダ）を含む化学療法剤、または対象における形質細胞腫瘍の治療に有効であることが知られている任意の他のもの）を含む。いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、ステロイドを含む。いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、サリドマイド、レナリドマイド、およびボルテゾミブを含む標的療法を含み、これらは、新たに診断された患者を治療するために承認された療法である。例えば、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、パノビノスタット、イキサゾミブ、エロツズマブ、およびダラツムマブは、再発性骨髄腫を治療するために有効な第２の治療剤の例である。特定の実施形態において、第２の治療剤は、放射線療法または幹細胞移植を含むレジメンである。特定の実施形態において、第２の治療剤は、免疫調節剤であり得る。特定の実施形態において、第２の治療剤は、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））、カルフィルゾミブ（Ｋｙｐｒｏｌｉｓ（登録商標））、イキサゾミブ（Ｎｉｎｌａｒｏ（登録商標））を含むプロテアソーム阻害剤であり得る。特定の実施形態において、第２の治療剤は、パノビノスタット（Ｆａｒｙｄａｋ（登録商標））などのヒストンデアセチラーゼ阻害剤であり得る。特定の実施形態において、第２の治療剤は、モノクローナル抗体、抗体薬物コンジュゲート、抗腫瘍剤にコンジュゲートした二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、またはそれらの組み合わせであり得る。本開示の抗原結合分子と組み合わせて有益に投与され得る他の薬剤は、小分子サイトカイン阻害剤およびＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８などのサイトカイン、またはそれらのそれぞれの受容体に結合する抗体を含むサイトカイン阻害剤を含む。本開示の医薬組成物（例えば、本明細書に開示される操作された細胞または細胞の集団を含む医薬組成物）はまた、形質細胞表面上の異なる抗原と相互作用し得る本明細書に記載のもの以外のモノクローナル抗体、腫瘍細胞表面上の抗原に結合する一方のアームおよびＴ細胞上の抗原に結合する他方のアームを有する二重特異性抗体、抗体薬物コンジュゲート、抗腫瘍剤とコンジュゲートした二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４を標的とするもの、またはそれらの組み合わせ、から選択される１つ以上の治療的組み合わせを含む治療レジメンの一部として投与され得る。特定の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、またはセミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））などのＰＤ－１阻害剤から選択され得る。特定の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、またはデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））などのＰＤ－Ｌ１阻害剤から選択され得る。特定の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））などのＣＴＬＡ－４阻害剤から選択され得る。
本開示はまた、本明細書に記載の操作された細胞または細胞の集団のうちのいずれかと、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ－ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＤＧＦＲ－β、ＦＯＬＨ１（ＰＳＭＡ）、ＰＲＬＲ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＳＬＮ、ＣＡ９、ウロプラキンのうちの１つ以上の阻害剤、または前述のサイトカインのうちのいずれかと、を含む治療的組み合わせを含み、阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディまたは抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ、ｄＡｂフラグメント、またはダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、および最小認識ユニットなどの他の操作された分子）である。いくつかの実施形態において、本開示の操作された細胞または細胞の集団はまた、放射線治療および／または従来の化学療法も含む治療レジメンの一部として投与され得る。
追加の治療活性成分は、本開示の操作された細胞の投与の直前、同時に、または直後に投与され得る（本開示の目的のために、そのような投与レジメンは、追加の治療活性成分「と組み合わせて」操作された細胞の投与とみなされる）。
本開示は、本開示の操作された細胞または細胞の集団が、本明細書の他所に記載の追加の治療活性成分のうちの１つ以上と同時製剤化された医薬組成物を提供する。
投与レジメン
本開示の特定の実施形態によれば、複数の用量の操作された細胞が、定義された時間経過にわたって対象に投与され得る。この態様による方法は、対象に複数の用量の細胞を連続的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続的に投与すること」は、各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間、または数か月）よって分けられた異なる日に、対象へ投与されることを意味する。本開示は、患者へ単回の一次用量、それに続く１回以上の二次用量、および任意選択でそれに続く１回以上の三次用量を連続的に投与することを含む方法を提供する。
「一次用量」、「二次用量」、および「三次用量」という用語は、本開示の操作された細胞の投与の時系列を指す。したがって、「一次用量」とは、治療レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）であり、「二次用量」とは、一次用量後に投与される用量であり、「三次用量」とは、二次用量後に投与される用量である。一次用量、二次用量、および三次用量はすべて、操作された細胞を含み得るが、概して、投与頻度に関して互いに異なり得る。しかしながら、特定の実施形態において、１次用量、２次用量および／または３次用量に含まれる操作された細胞の量は、治療経過の間、互いに異なる（例えば、適宜上下に調整される）。特定の実施形態において、２回以上（例えば、２回、３回、４回、または５回）の用量が治療レジメンの開始時において「負荷用量（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｏｓｅ）」として投与され、続いてより低い頻度に基づいて投与される後続用量（例えば、「維持用量」）が投与される。
本開示の一例示的な実施形態において、各二次および／または三次用量は、直前の用量の１～２６（例えば、１、１と１／２、２、２と１／２、３、３と１／２、４、４と１／２、５、５と１／２、６、６と１／２、７、７と１／２、８、８と１／２、９、９と１／２、１０、１０と１／２、１１、１１と１／２、１２、１２と１／２、１３、１３と１／２、１４、１４と１／２、１５、１５と１／２、１６、１６と１／２、１７、１７と１／２、１８、１８と１／２、１９、１９と１／２、２０、２０と１／２、２１、２１と１／２、２２、２２と１／２、２３、２３と１／２、２４、２４と１／２、２５、２５と１／２、２６、２６と１／２、またはそれ以上）週間後に投与される。「直前の用量」という句は、本明細書で使用される場合、一連の複数回の投与において、介入用量のない順序の次の用量の投与の前に患者へ投与される用量を意味する。
本発明のこの態様による方法は、患者に任意の数の二次および／または三次用量を投与することを含み得る。例えば、特定の実施形態において、単回の二次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の二次用量が患者に投与される。同様に、特定の実施形態において、単回の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の三次用量が患者に投与される。
複数回の二次用量を伴う実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の用量の１～２週間後に患者に投与されてもよい。同様に、複数の三次用量を含む実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各三次用量は、直前の用量の２～４週間後に患者に投与されてもよい。あるいは、二次用量および／または三次用量が患者へ投与される頻度は、治療レジメンの経過にわたって変動し得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療経過の間に調整され得る。
以下の実施例は、本開示の方法および組成物を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
実施例１：抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体の生成
抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体は、遺伝子改変マウス（例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む操作されたマウス）をヒトＭＡＧＥ－Ａ４抗原（例えば、ｍＡｂ３１３４５の場合ｈＭＡＧＥ－Ａ４ ２３０－２３９またはｍＡｂ３３２２９の場合ｈＭＡＧＥ－Ａ４ ２８６－２９４）およびＨＬＡ－Ａ２で免疫付与することにより得られた。
免疫付与後、各マウスから脾細胞を採取して、（１）マウス骨髄腫細胞と融合してそれらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞を形成してＭＡＧＥ－Ａ４特異性についてスクリーニングし、または（２）反応性抗体（抗原陽性Ｂ細胞）に結合して同定する選別試薬としてヒトＭＡＧＥ－Ａ４フラグメントを使用して、Ｂ細胞を選別した（米国特許公開第２００７／０２８０９４５Ａ１号に記載のとおり）。
ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するＭＡＧＥ－Ａ４に対するキメラ抗体が最初に単離された。抗体を、親和性、選択性などを含む望ましい特徴について特徴付けし選択する。必要ならば、マウス定常領域を所望のヒト定常領域、例えば野生型または改変されたＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域と置き換えて、完全ヒト型抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体を生成した。選択される定常領域は特異的用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特徴および標的特異性特徴は、可変領域に存在する。
抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸および核酸配列：表１は、本開示の選択された抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。表１のｍＡｂ３１３４５およびｍＡｂ３１３４５＊配列は、ｍＡｂ３１３４５＊の「呼び出された（ｃａｌｌｅｄ）」ＬＣＶＲ配列における１つの余分なＣ末端アミノ酸を除いて同一である（すなわち、ＬＣＶＲ領域に注釈を付ける場合、全長抗体は同一であるが、１つの追加アミノ酸がｍＡｂ３１３４５＊のＬＣＶＲに割り当てられた）。対応する核酸配列識別子を表２に記載する。本明細書に含まれるすべての配列の要約を表５６に提供する。
Figure 2022542559000001
Figure 2022542559000002
実施例２：ＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体の生成
表１の抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ３１３４５および３３２２９抗体は、ＶＬ－ＶＨ単鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）に再形式化され、それぞれ、配列番号１および３６に対応する抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲヌクレオチド配列を使用して、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ刺激ドメイン、またはＣＤ２８ヒンジ、膜貫通、およびシグナル伝達ドメインを使用するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物に入れられた。対応する３１３４５抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体の全長核酸およびポリペプチド重鎖配列は、それぞれ配列番号１７および１８に対応する。対応する３１３４５抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体の全長核酸およびポリペプチド軽鎖配列は、それぞれ配列番号１９および２０に対応する。全長核酸およびポリペプチド３１３４５ ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４を標的とするＣＡＲ配列は、それぞれ配列番号３８および３９に対応する。非結合対照として、無関係なｓｃＦｖのヌクレオチド配列を使用して同様のＣＡＲを設計した（配列番号３４のＣＡＲ構築物、対照ＣＡＲのポリペプチド配列は配列番号３５に対応する）。ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲをレンチウイルス発現ベクター（Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（商標）バイシストロン性発現システム（Ｎｅｏ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃａｔ＃６３２１８１）にクローン化し、レンチウイルス粒子をＬｅｎｔｉ－Ｘパッケージングシングルショット（ＶＳＶ－Ｇ）システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃａｔ＃６３１２７６）を介して製造元のプロトコルに従って生成した。次いで、ＮＦＫＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ＮＫＦＢＬｕｃ ｃｌ １Ｃ１１）に、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）予めコーティングされたディッシュ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃Ｔ１１０ａ）を使用して、製造元のプロトコルに従ってＣＡＲ構築物を形質導入した。５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１１８１１－０９８）で少なくとも２週間選択した後、次のＣＡＲ Ｔ細胞株、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＫＦＢＬｕｃ ｃｌ １Ｃ１１／ＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）３１３４５ ＶＬ－ＶＨ ＣＡＲＴが生成された。非結合対照として、無関係なｓｃＦｖのヌクレオチド配列を使用して同様のＣＡＲを設計した。このＣＡＲ Ｔ細胞株は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞への応答において細胞表面発現および機能的活性について評価された。
実施例３：Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＡＲ構築物の細胞表面発現およびＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化
Ｊｕｒｋａｔ／Ｊｕｒｋａｔ／ＮＫＦＢＬｕｃ細胞におけるＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＡＲ構築物の細胞表面発現の相対レベルをフローサイトメトリーによって評価した。染色するために、細胞をカルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳの染色緩衝液（Ｉｒｖｉｎｇ９２４０）、および２％のＦＢＳ（ＡＴＣＣ３０－２０２０）中で、９６ウェルＶ底プレートのウェル当たり２００，０００細胞の密度で播種し、１０μｇ／ｍｌのプロテインＬ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ ビオチンプロテインＬ）で、４℃で３０分間染色した。インキュベーション後、細胞を染色緩衝液で１回洗浄し、０．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジンＡｌｅｘａ－６４７二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で、４℃で３０分間染色した。次いで、細胞を洗浄し、染色緩衝液中に希釈したＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の５０％溶液を使用して固定した。試料を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅフローサイトメーターで実行し、ＦｌｏｗＪｏ １０．２で分析して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。プロテインＬ陽性細胞の割合（表３）は、細胞の総数に関してプロテインＬ陽性細胞の割合をとることによって計算された。
ＣＡＲ Ｔ細胞株の活性は、ＣＡＲ Ｔ／ＡＰＣ（抗原提示細胞）バイオアッセイで評価された。バイオアッセイを実施するために、５０μｌのアッセイ培地（１０％のＦＢＳおよび１％のＰ／Ｓ／Ｇを含むＲＰＭＩ培地）中の５０，０００個のＣＡＲ Ｔ細胞をＴｈｅｒｍｏ－Ｎｕｎｃ ９６ウェル白色プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加し、続いて５０μｌのアッセイ培地中のＡＰＣの３倍段階希釈（５００，０００細胞～６８５細胞）を添加した。次のＡＰＣを利用した。ＩＭ９（ＭＡＧＥ－Ａ４ ２８６－２９４ペプチドを内因的に発現する）およびＨＥＫ２９３（ＭＡＧＥ－Ａ４ ２８６－２９４陰性である）。細胞混合物を、３７℃、５％のＣＯ２で、加湿インキュベーター内で５時間インキュベーションした。ＮＦＫＢ－ルシフェラーゼ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｏｎｅ－ＧｌｏおよびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して測定した。相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を生成し、８ポイントの応答曲線上で４パラメータのロジスティック方程式を使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにプロットした。各用量応答曲線についてのゼロＡＰＣ条件も、３倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表された。最大ＣＡＲ Ｔ活性は、曲線上の最高ＲＬＵの最低に対する比率をとることによって決定され、信号：ノイズ（Ｓ：Ｎ）として表４に表される。プロテインＬ染色およびＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＡＲ Ｔ細胞活性化の結果を表３および４に示す。
Figure 2022542559000003
表３は、プロテインＬ染色によって測定された場合のＣＡＲ陽性Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＫＢＬｕｃ細胞の割合を示す。ｍＡｂ３１３４５から生成されたＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、４９．９％の細胞において発現したが、非標的対照ＣＡＲは、６７．２％の細胞において発現し、ＣＡＲ発現は３．９％の陰性対照（Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＫＢＬｕｃ ｃｌ．１Ｃ１１）細胞においてしか見られなかった。
Figure 2022542559000004
表４は、ＨＬＡ－Ａ２：ＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）３１３４５ ＣＡＲ Ｔ細胞株が、３５．０の信号対ノイズ比でＩＭ９細胞によって活性化されたが、ＨＬＡ－Ａ２：ＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）ＣＡＲ Ｔ細胞株は、ＨＥＫ２９３陰性対照細胞株によって活性化されなかったことを示している。
実施例４：ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞の生成
実施例２のＣＡＲ（抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ＶＬ－ＶＨ ｓｃＦｖ、ｈｕＣＤ８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、それぞれ配列番号１および３６に対応するＭＡＧＥ－Ａ４抗体のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲヌクレオチド配列を使用して構築された）、および実施例２の非結合対照ＣＡＲ（配列番号３４のＣＡＲ構築物、対照ＣＡＲのポリペプチド配列は配列番号３５に対応する）を、ＥＦ１ａプロモーターおよびＩＲＥＳ：ｅＧＦＰ配列（ＣＡＲ形質導入細胞を追跡するため）を有するｐＬＶＸレンチウイルスベクターにクローン化し、ＶＳＶ疑似型レンチウイルスを産生した。次いで、ＣＤ３＋Ｔ細胞をヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズおよび１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２で刺激し、ＭＯＩ＝５でレンチウイルスで形質導入した。形質導入された細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズおよび１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２とともに１９日間増殖させた後、インビボ実験で使用するまで凍結保存した。ＣＡＲ Ｔ細胞のこれらの株は、インビトロでの細胞傷害性およびインビボでの腫瘍量の減少における有効性を評価するために使用された。
実施例５：ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞の細胞溶解を媒介する
上記のとおり、ＣＤ３＋Ｔ細胞をヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズおよび１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２で刺激し、ＭＯＩ＝５でレンチウイルスで形質導入した。形質導入された細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズおよび１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２とともに１９日間増殖させた後、細胞溶解アッセイを設定した。
ＭＡＧＥ－Ａ４を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の細胞溶解能を測定するために、増殖したＣＡＲ Ｔ細胞および様々なレベルのＭＡＧＥ－Ａ４を発現する様々な腫瘍標的細胞株を使用して細胞溶解アッセイを実施した。増殖の１９日目に、増殖したＣＡＲ Ｔ細胞を、カルセイン標識したＭＡＧＥ－Ａ４＋または対照標的細胞株と様々な比率で三重に共培養した。カルセインは、励起波長および発光波長がそれぞれ４９５ｎｍおよび５１５ｎｍである、細胞透過性蛍光色素である。２．５時間後、細胞傷害性の割合は、膜の完全性が失われたときに発生する、標的細胞から放出されたカルセイン色素の量に基づいて、（（カルセイン信号－自発的なカルセイン放出）／（カルセイン最大放出－自発的なカルセイン放出））＊１００として、計算された。最大カルセイン放出を決定するために、アッセイの過程にわたって標的細胞をＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１１４界面活性剤の１％溶液で処理した。自発的なカルセイン放出を測定するために、ＭＡＧＥ－Ａ４＋標的細胞をカルセインで標識し、ＣＡＲ Ｔ細胞の非存在下で培養した。
２時間のカルセイン細胞傷害性アッセイ：採取時に、増殖するＣＡＲ Ｔ細胞を洗浄し、Ｏｐｔｍｉｚｅｒ細胞培養培地中に再懸濁した。各標的細胞株を回収し、２ｘ１０６／ｍＬの密度で再懸濁した後、カルセイン－ＡＭ色素を８μＭの濃度で、３７℃で３５分間添加した。カルセイン標識後、標的細胞を２回洗浄して、余分なカルセインを除去した。続いて、Ｔ細胞および標的細胞を９６ウェル丸底プレート上で様々な比率で共培養し、培養上清を回収する場合、３７℃で２．５時間培養した。陰性対照については、ＨＬＡ－Ａ２が結合したＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４を認識しない無関係なｓｃＦｖを含むように設計された同様のＣＡＲを使用して生成されたＴ細胞とともに標的細胞を共培養した。このＣＡＲ ｓｃＦｖ対照は、抗ＨＬＡ－Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７（１１－１９）ｓｃＦｖ（ＶＬ－ＶＨ方向）であった。レンチウイルスをベクターとして使用して、ｓｃＦｖを細胞に導入した。ＣＡＲ陰性対照として、同じ正常な健康なドナー由来の非形質導入であり、増殖させたＴ細胞を使用した。抗原特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を介した死滅の対照として、ＳＶ４０抗原を発現する２９３Ｔヒト胎児腎臓細胞株を使用した。この細胞株はＭＡＧＥ－Ａ４発現が陰性であるためである。カルセインがＭＡＧＥ－Ａ４＋標的細胞株から自発的に放出されたかどうかを判断するために、各細胞株をＣＡＲ Ｔ細胞の非存在下で培養した。カルセインの可能な最大放出を決定するために、標的細胞株を培養し、１％のＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１１４界面活性剤を含むように補充されたＯｐｔｍｉｚｅｒ培地を使用して溶解した。上澄み内で、Ｖｉｋｔｏｒ Ｘ４プレートリーダーを使用して相対カルセインレベルを測定し、細胞傷害性の割合を、（（カルセイン信号－自発的なカルセイン放出）／（カルセイン最大放出－自発的なカルセイン放出））＊１００として計算した。
このアッセイについて使用された細胞株は、以下を含んだ。Ａ３７５ヒト黒色腫腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）、細胞株番号：ＣＲＬ－９０６８（商標））、ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４ペプチドを担持したＨＬＡ－Ａ２を過剰発現するように操作されたＡ３７５ヒト黒色腫腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ、細胞株番号：ＣＲＬ－９０６８（商標））、ＩＭ９多発性骨髄腫細胞株（ＤＳＭＺ、ＣＡＴ＃：ＡＣＣ５６９）、ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４ペプチドを担持したＨＬＡ－Ａ２を過剰発現するように操作されたＩＭ９多発性骨髄腫細胞株（ＤＳＭＺ、ＣＡＴ＃：ＡＣＣ５６９（商標））、ＳＶ４０抗原を発現する２９３Ｔヒト胎児腎臓細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）、細胞株番号：ＣＲＬ－３２１６（商標））、およびＨＰＶ１６Ｅ７１１－１９ペプチドを担持したＨＬＡ－Ａ２を過剰発現するように操作されたＣａＳＫＩ頸部類表皮がん（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５５０（商標））。
図２Ａおよび図２Ｂならびに表５、６、および７に示すように、３１３４５ ｓｃＦｖ誘導Ａ３７５細胞を使用して生成されたＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４を標的とするＣＡＲ＋Ｔ細胞からなる培養物（図２Ａ：白丸、破線）、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４を過剰発現するＡ３７５細胞（図２Ａ：黒丸、実線、Ａ３７５＋＋で示される）、ＩＭ９細胞（図２Ｂ：白丸、破線）、およびＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４を過剰発現するＩＭ９細胞（図２Ｂ：黒丸、実線、ＩＭ９＋＋で示される）。Ａ３７５細胞と比較して、内因性ＩＭ９細胞に対してより高いレベルの細胞傷害性が観察された。Ａ３７５細胞におけるＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４の過剰発現は、内因性Ａ３７５細胞と比較して細胞傷害性のレベルを高めなかった。理論に縛られることを望まないが、この結果は、ＩＭ９細胞がＡ３７５細胞よりも高レベルのＭＡＧＥ－Ａ４抗原を発現するためである可能性がある。
Figure 2022542559000005
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表５、６、および７に見られるように、ＭＡＧＥ－Ａ４＋標的細胞で共培養した場合、非形質導入であり、増殖させた（ＭＯＩ ０）Ｔ細胞、およびＭＡＧＥ－Ａ４に特異的ではないＣＡＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞（Ａ３７５、Ａ３７５＋＋、ＩＭ９、ＩＭ９＋＋）は、１つの標的細胞に対する５０個のＴ細胞の最大比率でさえ、ＭＡＧＥ－Ａ４＋腫瘍細胞に対して標的細胞の有意な細胞溶解を誘発することができなかった。これらの結果は、ＣＡＲ構造がＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４を認識する３１３４５ ｓｃＦｖを含む場合にのみ細胞溶解が観察されたことを示している。さらに、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ４発現を欠く２９３Ｔ細胞に対してごくわずかな細胞傷害性を示し、細胞溶解を観察するにはＭＡＧＥ－Ａ４発現が必要であることを示している。
実施例６：ＭＡＧＥ－Ａ４を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞は、異種黒色腫モデルにおいてインビボでＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍の成長を減少させる
ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞のインビボ有効性を決定するために、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するＡ３７５ヒト黒色腫腫瘍細胞を使用してマウスにおける異種腫瘍研究を実施した。０日目に、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ（商標）１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに５×１０６個のＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥ－Ａ４＋Ａ３７５ヒト黒色腫腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が定着するのに十分な時間をとった後、実験の１０日目に、マウスに、対照ＣＡＲ（抗ＨＬＡ－Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７１１－１９ｓｃＦｖ、ＶＬ－ＶＨ方向）または抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４ＣＡＲ（ＣＡＲで形質導入された細胞についてのマーカーであるＧＦＰを発現する細胞の頻度によって決定される）のいずれかを発現する４×１０６個のＴ細胞を静脈内注射した。具体的には、マウス（群当たりｎ＝５）に、４×１０６個の無関係のｓｃＦｃ ＣＡＲ Ｔ細胞（対照のｓｃＦｖ ＣＡＲ）または３１３４５ ｓｃＦｖ ＣＡＲをコードする４×１０６個の抗ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを投与した。腫瘍の体積を測定することにより、５２日目まで腫瘍の成長を評価した。
外部キャリパーによって腫瘍体積を決定するために、最大長径（ｍｍの長さ）および最大横径（ｍｍの幅）を決定した。キャリパー測定値に基づいて、腫瘍体積を、式：体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２）／２により計算した。
Figure 2022542559000008
Figure 2022542559000009
表８および９、ならびに図３Ａおよび図３Ｂに示すとおり、Ａ３７５腫瘍は、無関係なｓｃＦｖ ＣＡＲ Ｔ細胞を受けたマウスにおいては進行性に成長したが、３１３４５抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４ｓｃＦｖ ＣＡＲをコードするＣＡＲ Ｔ細胞は、インビボで定着したＡ３７５腫瘍の成長を抑制し、その後根絶した。
実施例７：ＭＡＧＥ－Ａ４を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞は、異種多発性骨髄腫モデルにおいてインビボでＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍の成長を減少させる
ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞のインビボ有効性を決定するために、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するＩＭ９ヒト多発性骨髄腫腫瘍細胞を使用してマウスにおける異種腫瘍研究を実施した。０日目に、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ（商標）１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに５×１０６個のＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥ－Ａ４＋ＩＭ９ヒト多発性骨髄腫腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が定着するのに十分な時間をとった後、実験の７日目に、マウスに、対照ＣＡＲ（抗ＨＬＡ－Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７（１１－１９）ｓｃＦｖ、ＶＬ－ＶＨ方向）または抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４ＣＡＲ（ＣＡＲで形質導入された細胞についてのマーカーであるＧＦＰを発現する細胞の頻度によって決定される）のいずれかを発現する４×１０６個のＴ細胞を静脈内注射した。具体的には、マウス（群当たりｎ＝５）に、４×１０６個の無関係のｓｃＦｃ ＣＡＲ Ｔ細胞（対照のｓｃＦｖ ＣＡＲ）または３１３４５ ｓｃＦｖ ＣＡＲをコードする４×１０６個の抗ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを投与した。腫瘍の体積を測定することにより、５２日目まで腫瘍の成長を評価した。
外部キャリパーによって腫瘍体積を決定するために、最大長径（ｍｍの長さ）および最大横径（ｍｍの幅）を決定した。キャリパー測定値に基づいて、腫瘍体積を、式：体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２）／２により計算した。
Figure 2022542559000010
Figure 2022542559000011
表１０および１１、ならびに図４Ａおよび図４Ｂに示すとおり、ＩＭ９腫瘍は、無関係なｓｃＦｖ ＣＡＲ Ｔ細胞を受けたマウスにおいては進行性に成長したが、３１３４５抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４ｓｃＦｖ ＣＡＲをコードするＣＡＲ Ｔ細胞は、インビボで５匹のマウスのうちの３匹において定着したＩＭ９腫瘍の成長を抑制し、その後根絶した。
実施例８：ＭＡＧＥ－Ａ４を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞は、異種Ａ３７５黒色腫モデルにおいてインビボでＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍の成長を減少させる
ＶＬ－ＶＨの方向の抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４ ｓｃＦｖのいずれかに加えて、１）ｈｕＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ｚシグナル伝達ドメイン（ＢＢ／ｚ ＣＡＲ）、または２）ｈｕＣＤ２８ヒンジ／膜貫通／共刺激ドメインおよびＣＤ３ｚシグナル伝達ドメイン（２８／ｚ ＣＡＲ）のいずれかを含むキメラ抗原受容体を、抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４抗体、ｍＡｂ３１３４５のＶＬおよびＶＨ配列を使用して構築した。非結合対照として、ＢＢ／ｚ ＣＡＲは、ｓｃＦｖに加えてｈｕＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを使用して設計された。これらのＣＡＲを、ＥＦ１ａプロモーターおよびＩＲＥＳ：ｅＧＦＰ配列（ＣＡＲ形質導入細胞を追跡するため）を有するｐＬＶＸレンチウイルスベクターにクローン化し、ＶＳＶ疑似型レンチウイルスを産生した。
ＣＤ３＋Ｔ細胞を、２人の正常なドナー（「ドナー１」および「ドナー２」）由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズおよび１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２で刺激し、ＭＯＩ＝５でレンチウイルスで形質導入した。形質導入された細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズおよび１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２とともに１９日間増殖させた後、インビボ実験で使用するまで凍結保存した。
ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞のインビボ有効性を決定するために、異種腫瘍研究を実施した。０日目に、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ（商標）１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに５×１０６個のＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥＡ４＋Ａ３７５ヒト黒色腫腫瘍細胞を皮下注射した。質量分析技術を使用して、Ａ３７５黒色腫細胞がＭＡＧＥＡ４２８６－２９４ペプチドの約４２４個の細胞表面コピーを発現することを決定した。腫瘍が定着した後１３日目に、マウス（群当たりＮ＝５）に、２人の異なるドナー由来の、非結合対照ＢＢ／ｚ ＣＡＲ（対照ＣＡＲ Ｔ）、抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４ＢＢ／ｚ ＣＡＲ、または抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４２８／ｚ ＣＡＲ（ＣＡＲで形質導入された細胞についてのマーカーであるＧＦＰを発現する細胞の頻度によって決定される）のいずれかを発現する４×１０６個のＴ細胞を静脈内注射した。腫瘍の体積を測定することにより、６４日目まで腫瘍の成長を評価した。
外部キャリパーによって腫瘍体積を決定するために、最大長径（ｍｍの長さ）および最大横径（ｍｍの幅）を決定した。キャリパー測定値に基づいて、腫瘍体積を、式：体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２）／２により計算した。
ドナー１：Ａ３７５腫瘍は、対照ＣＡＲ Ｔ細胞またはＭＡＧＥＡ４２８６－２９４ＢＢ／ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを受けたマウスにおいて進行性に増殖した。対照的に、ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４２８／ｚは、インビボで定着したＡ３７５腫瘍の成長を抑制し、６４日目に５匹中１匹のマウスに腫瘍がなかった。ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４ＢＢ／ｚ ＣＡＲに対するＭＡＧＥＡ４２８６－２９４２８／ｚ ＣＡＲの有効性の増強が確認され、２７、２９、３３、３６、４０、および４４日目の腫瘍サイズは、二元配置ＡＮＯＶＡ検定によるｐ＜０．０００１で統計的に有意であった。
ドナー２：Ａ３７５腫瘍は、対照ＣＡＲ Ｔ細胞を受けたマウスにおいて進行性に増殖した。ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４ＢＢ／ｚおよびＭＡＧＥＡ４２８６－２９４２８／ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の両方での処置はＡ３７５腫瘍の成長を抑制したが、動態が異なった。ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４２８／ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞はより速い動態で作用し、２７日目までに５匹中５匹のマウスの腫瘍を根絶した。ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４ＢＢ／ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞はより遅い動態で働き、４４日目までに５匹中４匹のマウスの腫瘍を根絶した。ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４ＢＢ／ｚ ＣＡＲに対するＭＡＧＥＡ４２８６－２９４２８／ｚ ＣＡＲの抗腫瘍活性の増強された動態が確認され、１９日目および２２日目の腫瘍サイズは、それぞれ、二元配置ＡＮＯＶＡ検定によるｐ＝０．００７１およびｐ＝０．０００８で統計的に有意である。表１２～２７は、これらのデータの要約を提供する。
Figure 2022542559000012
Figure 2022542559000013
Figure 2022542559000014
Figure 2022542559000015
Figure 2022542559000016
Figure 2022542559000017
Figure 2022542559000018
Figure 2022542559000019
Figure 2022542559000020
Figure 2022542559000021
Figure 2022542559000022
Figure 2022542559000023
Figure 2022542559000024
Figure 2022542559000025
Figure 2022542559000026
Figure 2022542559000027
これらの結果は、本開示のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲがインビボで強力な抗腫瘍効果を有することを示している。
実施例９：ＭＡＧＥ－Ａ４を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞は、異種ＳＫ－ＭＥＬ－３７黒色腫モデルにおいてインビボでＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍の成長を減少させる
ＶＬ－ＶＨの方向の抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４ ｓｃＦｖのいずれかに加えて、１）ｈｕＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ｚシグナル伝達ドメイン（ＢＢ／ｚ ＣＡＲ）、または２）ｈｕＣＤ２８ヒンジ／膜貫通／共刺激ドメインおよびＣＤ３ｚシグナル伝達ドメイン（２８／ｚ ＣＡＲ）のいずれかを含むキメラ抗原受容体を、抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４抗体、ｍＡｂ３１３４５のＶＬおよびＶＨ配列を使用して構築した。非結合対照として、ＢＢ／ｚ ＣＡＲは、異なるｓｃＦｖに加えて、ｈｕＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを使用して設計された。これらのＣＡＲを、ＥＦ１ａプロモーターおよびＩＲＥＳ：ｅＧＦＰ配列（ＣＡＲ形質導入細胞を追跡するため）を有するｐＬＶＸレンチウイルスベクターにクローン化し、ＶＳＶ疑似型レンチウイルスを産生した。
ＣＤ３＋Ｔ細胞を、２人の正常なドナー（「ドナー１」および「ドナー２」）由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズおよび１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２で刺激し、ＭＯＩ＝５でレンチウイルスで形質導入した。形質導入された細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズおよび１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２とともに１９日間増殖させた後、インビボ実験で使用するまで凍結保存した。
ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞のインビボ有効性を決定するために、異種腫瘍研究を実施した。０日目に、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ（商標）１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに５×１０６のＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥＡ４＋ＳＫ－ＭＥＬ－３７ヒト黒色腫腫瘍細胞を皮下注射した。質量分析技術を使用して、ＳＫ－ＭＥＬ－３７黒色腫細胞がＭＡＧＥＡ４２８６－２９４ペプチドの約１，３２６個の細胞表面コピーを発現することを決定した。腫瘍が定着した後７日目に、マウス（群当たりＮ＝５）に、２人の異なるドナー由来の、非結合対照ＢＢ／ｚ ＣＡＲ（対照ＣＡＲ Ｔ）、抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４ＢＢ／ｚ ＣＡＲ、または抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４２８／ｚ ＣＡＲ（ＣＡＲで形質導入された細胞についてのマーカーであるＧＦＰを発現する細胞の頻度によって決定される）のいずれかを発現する４×１０６個のＴ細胞を静脈内注射した。腫瘍の体積を測定することにより、６４日目まで腫瘍の成長を評価した。
外部キャリパーによって腫瘍体積を決定するために、最大長径（ｍｍの長さ）および最大横径（ｍｍの幅）を決定した。キャリパー測定値に基づいて、腫瘍体積を、式：体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２）／２により計算した。
Figure 2022542559000028
ドナー１：ＳＫ－ＭＥＬ－３７腫瘍は、対照ＣＡＲ Ｔ細胞またはＭＡＧＥＡ４２８６－２９４ＢＢ／ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを受けたマウスにおいて進行性に増殖した。対照的に、ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４２８／ｚは、インビボで定着したＳＫ－ＭＥＬ－３７腫瘍の成長を抑制した。ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４ＢＢ／ｚ ＣＡＲに対するＭＡＧＥＡ４２８６－２９４２８／ｚ ＣＡＲの有効性は、二元配置ＡＮＯＶＡ検定によるｐ＜０．０００１で統計的に有意であった、３１、３５、４０、４７、５５、および６２日目の腫瘍サイズから観測された。
ドナー２：ＳＫ－ＭＥＬ－３７腫瘍は、対照ＣＡＲ Ｔ細胞を受けたマウスにおいて進行性に増殖した。ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４ＢＢ／ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞での処置は有効性を示し、腫瘍の成長を約１週間遅らせ、ＭＡＧＥＡ４２８６－２９４２８／ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、２０日目までに５匹中５匹のマウスにおいてＳＫ－ＭＥＬ－３７腫瘍の成長を強力に抑制し、腫瘍を検出不能（触知不能）なレベルにした。これらの腫瘍は、腫瘍が再発した時点の６２～６９日目まで検出されないままであった。
まとめると、結果は、本開示のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲがインビボでの抗腫瘍活性および抗腫瘍動態を示すことを示している（表２９～４５）。
Figure 2022542559000029
Figure 2022542559000030
Figure 2022542559000031
Figure 2022542559000032
Figure 2022542559000033
Figure 2022542559000034
Figure 2022542559000035
Figure 2022542559000036
Figure 2022542559000037
Figure 2022542559000038
Figure 2022542559000039
Figure 2022542559000040
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Figure 2022542559000042
Figure 2022542559000043
Figure 2022542559000044
Figure 2022542559000045
実施例１０：ＭＡＧＥ－Ａ４（２３０－２３９）を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞は、異種Ａ３７５黒色腫モデルにおいてインビボでＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍の成長を減少させる
ＶＬ－ＶＨの方向の抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２３０－２３９ ｓｃＦｖのいずれかに加えて、１）ｈｕＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ｚシグナル伝達ドメイン（ＢＢ／ｚ ＣＡＲ）、または２）ｈｕＣＤ２８ヒンジ／膜貫通／共刺激ドメインおよびＣＤ３ｚシグナル伝達ドメイン（２８／ｚ ＣＡＲ）のいずれかを含むキメラ抗原受容体を、ｍＡｂ３３２２９のＶＬおよびＶＨ配列を使用して構築した。非結合対照として、２８／ｚ ＣＡＲは、無関係なｓｃＦｖに加えて、ｈｕＣＤ２８ヒンジ／膜貫通／共刺激ドメインおよびＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを使用して設計された。これらのＣＡＲを、ＥＦ１ａプロモーターおよびＰ２Ａ：ｅＧＦＰ配列（ＣＡＲ形質導入細胞を追跡するため）を有するｐＬＶＸレンチウイルスベクターにクローン化し、ＶＳＶ疑似型レンチウイルスを産生した。
ＣＤ３＋Ｔ細胞を、正常なドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズおよび１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２で刺激し、ＭＯＩ＝５でレンチウイルスで形質導入した。形質導入された細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズおよび１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２とともに約１４日間増殖させた後、インビボ実験で使用するまで凍結保存した。
抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２３０－２３９を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞のインビボ有効性を決定するために、異種腫瘍研究を実施した。０日目に、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ（商標）１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに５×１０６のＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥＡ４＋Ａ３７５ヒト黒色腫腫瘍細胞を皮下注射した。質量分析技術を使用して、Ａ３７５黒色腫細胞がＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２３０－２３９ペプチドの約５５３個の細胞表面コピーを発現することを決定した。腫瘍が定着した後１３日目に、マウス（群当たりＮ＝４または５）に、非結合対照ＢＢ／ｚ ＣＡＲ（対照ＣＡＲ Ｔ）、抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２３０－２３９ＢＢ／ｚ ＣＡＲ、または抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２３０－２３９２８／ｚ ＣＡＲ（ＣＡＲで形質導入された細胞についてのマーカーであるＧＦＰのいずれかを発現する細胞の頻度によって決定される）のいずれかを発現する４×１０６個のＴ細胞を静脈内注射した。腫瘍の体積を測定することにより、２８日目まで腫瘍の成長を評価した。
外部キャリパーによって腫瘍体積を決定するために、最大長径（ｍｍの長さ）および最大横径（ｍｍの幅）を決定した。キャリパー測定値に基づいて、腫瘍体積を、式：体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２）／２により計算した。
Ａ３７５腫瘍は、未処置のマウスおよび対照ＣＡＲ Ｔ細胞を受けたマウスにおいて進行性に増殖した。抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２３０－２３９ＢＢ／ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞を受けたマウスは、１９日目（ｐ＜０．０２）、２３日目（ｐ＜０．０２）、および２６日目（ｐ＜０．０００１）に対照ＣＡＲ Ｔで処置されたマウスと比較して腫瘍の成長が減少し、腫瘍制御を示した（二元配置ＡＮＯＶＡによって分析された統計）。抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４２３０－２３９２８／ｚ ＣＡＲ Ｔ処置は、１９日目（ｐ＝０．００７）、２３日目（ｐ＜０．０００１）、および２６日目（ｐ＜０．０００１）に定着したＡ３７５腫瘍の成長の抑制ももたらした（二元配置ＡＮＯＶＡによって分析された統計）。表４６～５４を参照されたい。
Figure 2022542559000046
Figure 2022542559000047
Figure 2022542559000048
Figure 2022542559000049
Figure 2022542559000050
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Figure 2022542559000054
実施例１１：ＨＬＡ－Ａ２が結合したＭＡＧＥ－Ａ４（２３０－２３９）ポリペプチドに結合するＦａｂ／可溶性ＴＣＲの構造分析
抗体またはＴＣＲとＨＬＡ－ペプチド複合体との間の特定の相互作用をよりよく理解するために、２つのＸ線結晶構造および３つの低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）構造が、ＨＬＡペプチド結合溝にＭＡＧＥ－Ａ４ ２３０－２３９ポリペプチドを表示するＨＬＡ－Ａ２およびベータ－２－ミクログロブリンの複合体（ＨＬＡ－Ａ２／ｂ２ｍ）に結合する、抗体ＦａｂフラグメントまたはＴＣＲの操作された可溶性部分について決定された（表５５）。２つのＦａｂを含む複合体のＸ線構造は、１．４および２．５Åの分解能で決定された。これらの２つのＦａｂは非常に類似した配列を有し、ほぼ同一の結合モードを示す。３３２２９ Ｆａｂを含む複合体のＣｒｙｏＥＭ構造は、３．７Åの分解能で決定され、追加のＦａｂおよびｓＴＣＲのＣｒｙｏＥＭ構造は、それぞれ３．０Åおよび２．９Åの分解能で決定された。それらは様々な解像度を包含しているが、構造の各々において、ＨＬＡで表示されたＭＡＧＥＡ４：２３０－２３９ペプチド残基が電子／ｃｒｙｏ－ＥＭ密度マップにおいて明確に可視化され、ＨＬＡ表示ペプチドとＦａｂまたはｓＴＣＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）との間の残基レベルの相互作用を正確に決定できる。
構造は、ＦａｂがＨＬＡペプチド複合体に全体的に類似した方向で結合したことを示している。重鎖ＣＤＲはペプチドのＮ末端の近位に位置し、軽鎖ＣＤＲはペプチドのＣ末端の近位に位置していた。Ｆａｂが結合した構造の各々において、溶媒に曝露されたＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチド残基アルギニン２３５は、重鎖および軽鎖のＣＤＲを分割する中心面の近くに位置していた。４つのＦａｂは、アルギニン２３５の３つの異なる回転異性体を認識して結合した。ＨＬＡで表示されるペプチドコンフォメーションの残りの部分は、構造全体で非常に類似していた。
ｓＴＣＲは、ＴＣＲに典型的な方向でＨＬＡペプチド複合体に結合し、α鎖はペプチドのＮ末端側に近く、β鎖はＣ末端側に近かった。ｓＴＣＲのＣＤＲは、Ｆａｂと比較してペプチドのＮ末端近くにシフトした。ｓＴＣＲは、４つのＦａｂを含む構造において観察されたものとは異なるペプチド残基アルギニン２３５の回転異性体に結合した。
ＦａｂまたはｓＴＣＲとペプチドとの間の接触を表５５に要約する。ここでの「接触」は、ＨＬＡが表示するペプチドの非水素原子の３．５Å以内にある非水素原子を有するＦａｂ／ｓｔＣＲ残基として定義され、水素結合、電荷－電荷相互作用、または疎水性／ファンデルワールス相互作用を伴い得る。結合したペプチドは、ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドにおける残基位置に従って次のように番号が付けられる。
Figure 2022542559000055
Ｆａｂの各々によって作成されたペプチドの接触は、ほぼ独占的にＣＤＲ ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ３に集中している。各抗体のＨＣＤＲ３は、ＭＡＧＥ－Ａ４残基２３３の側鎖と複数の接触をした。各ＦａｂのＨＣＤＲ３および／またはＬＣＤＲ３は、残基２３５の側鎖に接触した。ペプチド残基２３６の主鎖カルボニルは、各ＦａｂのＬＣＤＲ１と接触した。４つのＦａｂのいずれもペプチド残基２３０、２３１、２３２、２３４、または２３９に接触せず、これらのほとんどは、ＨＬＡ溝内に埋め込まれているため、Ｆａｂ結合にアクセスできない。ペプチド残基２３４は溶媒に曝露されているが、グリシン制限としての側鎖の欠如は、ＣＤＲ接触の能力である。それにもかかわらず、このグリシン２３４での置換は、よりかさばるペプチド残基と近接しているＨＣＤＲ３ループとの間に生じる立体衝突のために、これらの抗体の結合活性を低下させる可能性がある。
ｓＴＣＲは、そのα１およびα３ループを介して残基２３３に接触し、ならびにそのβ１およびβ３ループを介してペプチド残基２３５に接触した。ペプチド残基２３０、２３１、２３２、２３４、２３６、２３７、２３８、２３９はｓＴＣＲにより接触されなかった。したがって、ｓＴＣＲのペプチド接触カバレッジは、上記のＦａｂの各々よりも、またはデカメリックペプチドに結合したＴＣＲの他の構造（例えば、ＰＤＢ ３ＱＤＧ）で観察されたものよりも完全ではなかった。
Figure 2022542559000056
配列の説明
Figure 2022542559000057
Figure 2022542559000058
Figure 2022542559000059
注釈付き配列
以下の注釈付き配列において、下線なしのセクションと下線付きのセクションとを交互に配置することで部分を識別する。部分の順序は、各配列の下に列挙されている順序に対応する（すなわち、最初の下線なしのセクションはＶＬであり、次の下線付きのセクションは（Ｇ４Ｓ）３であり、次の下線なしのセクションはＶＨなどである）。
ＭＡＧＥＡ４（２８６－２９４）３１３４５ ＶＬ－ＶＨ ＢＢｚ ＣＡＲ Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（配列番号７６）
Figure 2022542559000060
 ＶＬ
（Ｇ４Ｓ）３
ＶＨ
Ｇ４Ｓ
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ
４－１ＢＢ共刺激ドメイン
ＣＤ３Ｚ
Ｐ２Ａ／ＧＦＰ
ＭＡＧＥＡ４（２８６－２９４）３１３４５ ＶＬ－ＶＨ ＣＤ２８ヒンジ／ＴＭ／ｃｙｔｏＣＤ３ｚ ＣＡＲ Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（配列番号７７）
Figure 2022542559000061
 ＶＬ
（Ｇ４Ｓ）３
ＶＨ
Ｇ４Ｓ
ＣＤ２８ヒンジ
ＣＤ２８ ＴＭ
ＣＤ２８共刺激ドメイン
ＣＤ３Ｚ
Ｐ２Ａ／ＧＦＰ
ＭＡＧＥＡ４（２８６－２９４）３１３４５＊ＶＬ－ＶＨ ＢＢｚ ＣＡＲ Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（配列番号７８）
Figure 2022542559000062
 ＶＬ
（Ｇ４Ｓ）３
ＶＨ
Ｇ４Ｓ
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ
４－１ＢＢ共刺激ドメイン
ＣＤ３Ｚ
Ｐ２Ａ／ＧＦＰ
ＭＡＧＥＡ４（２８６－２９４）３１３４５＊ＶＬ－ＶＨ ＣＤ２８ヒンジ／ＴＭ／ｃｙｔｏＣＤ３ｚ ＣＡＲ Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（配列番号７９）
Figure 2022542559000063
 ＶＬ
（Ｇ４Ｓ）３
ＶＨ
Ｇ４Ｓ
ＣＤ２８ヒンジ
ＣＤ２８ ＴＭ
ＣＤ２８共刺激ドメイン
ＣＤ３Ｚ
Ｐ２Ａ／ＧＦＰ
ＭＡＧＥＡ４（２３０－２３９）３３２２９ ＶＬ－ＶＨ ＢＢｚ ＣＡＲ Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（配列番号８０）
Figure 2022542559000064
 ＶＬ
（Ｇ４Ｓ）３
ＶＨ
Ｇ４Ｓ
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ
４－１ＢＢ共刺激ドメイン
ＣＤ３Ｚ
Ｐ２Ａ／ＧＦＰ
ＭＡＧＥＡ４（２３０－２３９）３３２２９ ＶＬ－ＶＨ ＣＤ２８ヒンジ／ＴＭ／ｃｙｔｏＣＤ３ｚ ＣＡＲ Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（配列番号８１）
Figure 2022542559000065
 ＶＬ
（Ｇ４Ｓ）３
ＶＨ
Ｇ４Ｓ
ＣＤ２８ヒンジ
ＣＤ２８ ＴＭ
ＣＤ２８共刺激ドメイン
ＣＤ３Ｚ
Ｐ２Ａ／ＧＦＰ
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な変更が前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims (129)

  1. 黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体が、配列番号３２のアミノ酸２８６～２９４またはその一部分と相互作用し、前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲが、ＨＬＡが結合したＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドに特異的に結合する、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  2. 黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体が、配列番号３２のアミノ酸２３０～２３９またはその一部分と相互作用し、前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲが、ＨＬＡが結合したＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドに特異的に結合する、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  3. 前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲが、Ｎ末端からＣ末端へ、（ａ）抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗原結合ドメインを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通ドメインと、（ｄ）共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインと、を含む、請求項１または２に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  4. 前記細胞外リガンド結合ドメインが、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＭＡＧＥ－Ａ４単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインを含む、請求項３に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  5. 前記抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ｓｃＦｖドメインが、前記ＬＣＶＲと前記ＨＣＶＲとの間に第１のリンカーを含む、請求項４に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  6. 前記細胞外リガンド結合ドメインと前記ヒンジとの間に第２のリンカーをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  7. 前記第１のリンカーおよび前記第２のリンカーが、配列番号２３～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  8. 前記第１のリンカーが、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、前記第２のリンカーが配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  9. 前記ヒンジ、前記膜貫通ドメイン、またはそれらの両方が、ＣＤ８αポリペプチド由来である、請求項１～８のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  10. 前記共刺激ドメインが、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  11. 前記ヒンジ、前記膜貫通ドメイン、またはそれらの両方が、ＣＤ２８ポリペプチド由来である、請求項１～９のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  12. 前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む、請求項１１に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  13. 前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  14. 前記ＬＣＶＲが、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１または３～１３のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  15. 前記ＬＣＶＲが、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１または３～１３のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  16. 前記ＬＣＶＲが、それぞれ、配列番号１２－１４－１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３を含む、請求項１４または１５に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  17. 前記ＨＣＶＲが、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲの前記ＣＤＲを含む、請求項１または３～１６のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  18. 前記ＨＣＶＲが、それぞれ、配列番号４－６－８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３を含む、請求項１７に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  19. 前記ＬＣＶＲが、配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１０のアミノ酸配列に対して９５％～９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＶＲが、配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して９５％～９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または３～１８のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  20. 前記ＬＣＶＲが、配列番号３７のアミノ酸配列、または配列番号３７のアミノ酸配列に対して９５％～９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＶＲが、配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列に対して９５％～９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または３～１８のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  21. 前記ＬＣＶＲが、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＶＲが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１９または２０に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  22. 前記ＬＣＶＲが、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＶＲが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１９または２０に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  23. 前記ＬＣＶＲが、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項２～１３のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  24. 前記ＬＣＶＲが、それぞれ、配列番号６１－６３－６５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３を含む、請求項２３に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  25. 前記ＨＣＶＲが、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲの前記ＣＤＲを含む、請求項２～１３または２３～２４のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  26. 前記ＨＣＶＲが、それぞれ、配列番号５３－５５－５７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３を含む、請求項２５に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  27. 前記ＬＣＶＲが、配列番号５９のアミノ酸配列、または配列番号５９のアミノ酸配列に対して９５％～９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＶＲが、配列番号５１のもの、または配列番号５１のアミノ酸配列に対して９５％～９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２～１３または２３～２６のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  28. 前記ＬＣＶＲが、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＶＲが、配列番号５１のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  29. 前記ヒンジが、配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０および１３～２８のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  30. 前記膜貫通ドメインが、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０および１３～２９のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  31. 前記４－１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０および１３～３０のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  32. 前記ヒンジが、配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項１～８および１１～２８のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  33. 前記膜貫通ドメインが、配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項１～８、１１～２８および３２のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  34. 前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号４５のアミノ酸配列を含む、請求項１～８、および１１～２８および３２～３３のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  35. 前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  36. 配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  37. 配列番号３９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  38. 配列番号４７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  39. 配列番号７１のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  40. 配列番号７３のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  41. 前記キメラ抗原受容体が、配列番号３２の２８６～２９４位の１つ以上のアミノ酸に特異的に結合する、請求項１および３～２２のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  42. 前記キメラ抗原受容体が、配列番号３２の２３０～２３９位の１つ以上のアミノ酸に特異的に結合する、請求項２～１３および２３～２８のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  43. 前記ＨＬＡが、ＨＬＡ－Ａ２である、請求項１～２６のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
  44. 請求項１～４３のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲをコードする、単離された核酸分子。
  45. 配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の単離された核酸分子。
  46. 配列番号３８のヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の単離された核酸分子。
  47. 配列番号４８のヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の単離された核酸分子。
  48. 配列番号７０のヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の単離された核酸分子。
  49. 配列番号７２のヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の単離された核酸分子。
  50. 請求項４４～４９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  51. 前記ベクターが、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである、請求項５０に記載のベクター。
  52. 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項５１に記載のベクター。
  53. 請求項４４～４９のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項５０～５２のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
  54. 前記細胞が、ヒトＴ細胞である、請求項５３に記載の細胞。
  55. 請求項１～４３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含む、操作された細胞。
  56. 免疫細胞である、請求項５５に記載の操作された細胞。
  57. 前記免疫細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項５６に記載の操作された細胞。
  58. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔリンパ球である、請求項５７に記載の操作された細胞。
  59. 前記Ｔリンパ球が、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球である、請求項５８に記載の操作された細胞。
  60. ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球である、請求項５９に記載の操作された細胞。
  61. ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんの治療において使用するための、請求項５５～６０のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  62. 前記ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんが、多発性骨髄腫である、請求項６１に記載の操作された細胞。
  63. 前記ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんが、黒色腫である、請求項６１に記載の操作された細胞。
  64. Ｎ末端からＣ末端へ、（ａ）軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＭＡＧＥ－Ａ４単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通ドメインと、（ｄ）４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインと、を含むキメラ抗原受容体を含む、操作されたヒトＴ細胞。
  65. 前記抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ｓｃＦｖが、配列番号３２の２８６～２９４位の１つ以上のアミノ酸残基に特異的に結合する、請求項６４に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  66. 前記ｓｃＦｖドメインが、配列番号２／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項６４または６５に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  67. 前記ｓｃＦｖドメインが、配列番号２／３７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項６４または６５に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  68. 前記抗ＭＡＧＥ－Ａ４ ｓｃＦｖドメインが、配列番号３２の２３０～２３９位の１つ以上のアミノ酸残基に特異的に結合する、請求項６４に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  69. 前記ｓｃＦｖドメインが、配列番号５１／５９のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項６４または６５に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  70. 前記ヒンジが、配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項６４～６９のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  71. 前記膜貫通ドメインが、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項６４～７０のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  72. 前記４－１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項６４～７１のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  73. 前記ヒンジが、配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項６４～６９のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  74. 前記膜貫通ドメインが、配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項６４～６９および７３のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  75. 前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号４５のアミノ酸配列を含む、請求項６４～６９および７３～７４のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  76. 前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項６４～７５のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  77. 配列番号２２のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項６４に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  78. 配列番号３９のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項６５に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  79. 配列番号４７のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項６５に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  80. 配列番号７１のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項６５に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  81. 配列番号７３のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項６５に記載の操作されたヒトＴ細胞。
  82. 遺伝子改変されたヒトＴ細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記遺伝子改変されたヒトＴ細胞は、請求項１～４３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含む、医薬組成物。
  83. 請求項５５～６３のいずれか一項に記載の操作された細胞および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  84. 請求項６４～８１のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  85. ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんの前記治療において使用するための、請求項８２～８４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  86. 前記ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんが、多発性骨髄腫である、請求項８５に記載の医薬組成物。
  87. 前記ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんが、黒色腫である、請求項８５に記載の医薬組成物。
  88. ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんの前記治療のための医薬品の製造における、請求項１～４３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項４４～４９のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項５０～５２のいずれか一項に記載のベクター、請求項５３もしくは５４に記載の細胞、請求項５５～６３のいずれか一項に記載の操作された細胞、または請求項６４～８１のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞の、使用。
  89. 前記ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんが、多発性骨髄腫である、請求項８８に記載の使用。
  90. 前記ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんが、黒色腫である、請求項８８に記載の使用。
  91. 対象においてＴリンパ球活性を増強する方法であって、請求項１～４３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含むＴリンパ球を前記対象に導入することを含む、方法。
  92. がんに罹患している対象を治療するための方法であって、請求項１～４３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含む治療有効量のＴリンパ球を前記対象に導入することを含む、方法。
  93. 対象において標的細胞集団または組織へのＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、請求項１～４３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変された有効量の細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
  94. 対象において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、請求項１～４３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変された有効量の細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
  95. 前記対象が、ヒトである、請求項９１～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記対象が、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道がん、頭頸部がん、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮がん、胃がん、子宮頸がん、乳がん、または黒色腫を有する、請求項９１～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記対象が、多発性骨髄腫を有する、請求項９６に記載の方法。
  98. キメラ抗原受容体を発現するように細胞の集団を操作する方法であって、
    （ａ）請求項１～４３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸分子を免疫細胞の集団に導入することと、
    （ｂ）前記核酸分子を発現する条件下で前記免疫細胞の集団を培養することと、
    （ｃ）前記細胞の表面で前記キメラ抗原受容体を発現する前記免疫細胞を単離することと、を含む、方法。
  99. 前記核酸分子を導入する前に、対象から前記免疫細胞の集団を取得することをさらに含む、請求項９８に記載の方法。
  100. 対象においてＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんを治療する方法であって、
    （ａ）請求項９９に従って細胞の集団を操作することと、
    （ｂ）前記キメラ抗原受容体を発現する前記細胞の集団を前記対象に再導入することと、を含む、方法。
  101. 前記ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんが、多発性骨髄腫である、請求項１００に記載の方法。
  102. 請求項１～４３のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲとの結合に対して競合する、単離された抗原結合タンパク質。
  103. 前記単離された抗原結合タンパク質が、ＣＡＲである、請求項１０２に記載の単離された抗原結合タンパク質。
  104. 請求項１～４３のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲと同じエピトープに結合する、単離された抗原結合タンパク質。
  105. 前記単離された抗原結合タンパク質が、ＣＡＲである、請求項１０４に記載の単離された抗原結合タンパク質。
  106. 黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）ポリペプチドに特異的に結合する、単離された組換え抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体が、以下の特徴、
    （ａ）約１０－９Ｍ未満のＥＣ５０で前記ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドに結合すること、
    （ｂ）がんを有する動物において、前記動物への投与後の生存が、前記投与なしの相当の動物と比較して、増加を示すこと、および／または
    （ｃ）（ｉ）表１に記載のＨＣＶＲに対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに（ｉｉ）表１に記載のＬＣＶＲに対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含むこと、のうちの１つ以上を有する、単離された組換え抗体またはその抗原結合フラグメント。
  107. 前記ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドが、ＨＬＡ－Ａ２が結合したＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドである、請求項１０６に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  108. 配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項１０６または１０７に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  109. 配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１０７または１０８に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  110. 配列番号２／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１０６～１０９のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  111. 配列番号３７のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１０７または１０８に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  112. 配列番号２／３７のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１０６～１０８および１１１のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  113. （ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
    （ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
    （ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
    （ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
    （ｅ）アミノ酸１４を有するＬＣＤＲ２ドメイン、および
    （ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１０６～１１２のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  114. 配列番号５１のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項１０６または１０７に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  115. 配列番号５９のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１０６、１０７、および１１４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  116. （ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
    （ｂ）配列番号５５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
    （ｃ）配列番号５７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
    （ｄ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
    （ｅ）配列番号６３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、および
    （ｆ）配列番号６５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１０６、１０７、１１４および１１５のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  117. 配列番号５１／５９のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１０６、１０７、および１１４～１１６のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  118. ＩｇＧ１抗体である、請求項１０６～１１７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  119. ＩｇＧ４抗体である、請求項１０６～１１７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  120. 二重特異性抗体である、請求項１０６～１１９のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  121. 請求項１０６～１２０のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む医薬組成物。
  122. 前記医薬組成物が、第２の治療剤をさらに含む、請求項１２１に記載の医薬組成物。
  123. 前記第２の治療剤が、抗腫瘍剤、ステロイド、および標的療法からなる群から選択される、請求項１２２に記載の医薬組成物。
  124. 請求項１０６～１２０のいずれか一項に記載の抗体のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分子。
  125. 請求項１２４に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  126. 請求項１２５に記載のベクターを含む、細胞。
  127. ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんを治療する方法であって、請求項１０６～１２０のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、または請求項１２１～１２３のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
  128. 前記医薬組成物が、第２の治療剤と組み合わせて投与される、請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記第２の治療剤が、抗腫瘍剤、ステロイド、および標的療法からなる群から選択される、請求項１２８に記載の方法。
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