JP2022541739A - 心臓治療薬 - Google Patents

Abstract

本発明は、心房細動（ａｔｒｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ：ＡＦ）に対して有効な新規の心臓治療薬、それを含む医薬組成物、心疾患を治療するためのその使用、及びそれを使用することを含む心疾患を治療する方法に関する。

Description

本発明は、心房細動（ａｔｒｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ：ＡＦ）、脳卒中、及び血栓塞栓症に対して有効な新規の心臓治療薬、それを含む医薬組成物、心疾患を治療するためのその使用、及びその使用を含む心疾患を治療する方法に関する。

心房細動（ＡＦ）は、高齢化人口により、有病率が世界的に増加している最も一般的な持続性不整脈である。北米では約２３０万人、欧州では４５０万人がＡＦに罹患している。ＡＦは、米国では年間７５万件を超える入院と推定１３万件の死亡の原因になっている。ＡＦは、結果的に脳卒中及び血栓塞栓症を５倍増加させ、かつ死亡率を２倍増加させる。世界のＡＦ市場は２０２０年までに１６０億ドルになると推定されている。今日でも、薬物療法が依然として臨床的に重要である。

ＡＦは、不規則で速い心拍を特徴とするが、それは事前の心臓合併症（孤立ＡＦ、３％）がなく起こる場合があり、あるいは、うっ血性心不全、冠動脈疾患、高血圧症、糖尿病、若しくはアテローム性動脈硬化症などの基礎心疾患に関係する場合がある。

アミオダロン（図１Ａ）及びドロネダロン（図１Ｂ）は、ベンゾフラン由来の複数の心臓イオンチャネル遮断薬及び食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：ＦＤＡ）承認の抗不整脈薬である。アミオダロンを用いて４５％のＡＦ症例が治療されるが、それには甲状腺傷害性、肺炎症、間質性肺炎、及び肺線維症を含む重篤な有害作用がある。ドロネダロンは、アミオダロンに関係する甲状腺傷害性及び肺傷害性を回避するものの、臨床治験では、プラセボと比較してドロネダロンの死亡リスクが高いことが報告されており、ニューヨーク心臓協会（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＮＹＨＡ）クラスＩＶの心不全、最近の代償不全又は持続性ＡＦを伴うＮＹＨＡクラスＩＩ～ＩＩＩの心不全の患者へのその使用に対しては枠組み警告文が出されている。カテーテルアブレーションによる外科的治療は代替の選択肢であるが、成功率が相対的に低く（最初の処置では２８％）、費用がかかり、特定の国の患者にはアクセスできないものである。

ヒト心臓のシトクロムＰ４５０ ２Ｊ２（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ｊ２：ＣＹＰ２Ｊ２）は、アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＡＡ）を、心臓の調律制御に関与しているエポキシエイコサトリエン酸（ｅｐｏｘｙｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ：ＥＥＴ）に代謝する。

本発明者らは、ドロネダロンなどの反応性代謝産物ベンゾフラン誘導体による心臓ＣＹＰ２Ｊ２の強力な共有結合不活性化と、心筋細胞の拍動間変動（ｂｅａｔ－ｔｏ－ｂｅａｔ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ：ＢＢＶ）との間の重要な相関関係を内密に発見した。本発明者らの観察結果を、ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ：ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）において評価した。

この情報を用いて、本発明者らは、本明細書でポイエンダロン（ｐｏｙｅｎｄａｒｏｎｅ）と称する、ドロネダロンの新規な部位指定重水素化類似体を開発した。

重水素化プロセスは、水素（周回電子を有するプロトン）を重水素（周回電子を有するタンパク質及び中性子）と交換する、標的化合物に対する原子スケールの改変を含む。薬理学では、薬物化合物を代謝的に安定化させてその薬物動態を改善するために、重水素化が適用されることが多い。この研究では、重水素化を用いて、ドロネダロンの求電子性中間体の化学反応性を改変してＣＹＰ２Ｊ２の阻害を回避し、そして重大なオフターゲットの心臓有害作用を緩和することによってその安全性プロファイルを改善した。直感に反して、ドロネダロンの薬物動態は、ランダムな重水素化を回避することによって、ポイエンダロン中に保たれている。

有利には、標的化された重水素化の結果、分子、ポイエンダロンが生成され、ポイエンダロンは、その非重水素化類似体（すなわちドロネダロン）と同じ好ましい薬物動態及び抗心房細動作用を有するが、不整脈誘発のリスクを非常に望ましく低減する分子である。一貫して、この知見により、本発明者らはまた、ヒト細胞モデル、すなわちｈｉＰＳＣ－ＣＭにおいて、ポイエンダロンが組換えＣＹＰ２Ｊ２酵素を不活性化せず、またＣＹＰ２Ｊ２も不活性化せず、すなわち、ドロネダロンとは異なり、ｈｉＰＳＣ－ＣＭにおいてＢＢＶを生じないことを発見した。さらに、本発明者らは、インビボで試験した場合、ポイエンダロンは、ドロネダロンと同様の薬物動態及び心臓血行動態プロファイルを生じ、抗心房細動能を示すが、ドロネダロンと比較して心室性不整脈誘発は軽微であることを見出した。

要約すると、本発明者らは、ドロネダロンなどのＦＤＡ承認のベンゾフラン由来薬物の好ましい薬物動態及び抗不整脈薬理を有するが、有意な心室性不整脈誘発の毒性がない、典型的には心不整脈を治療するための新規小分子治療薬を開発した。さらに、ヒトに用いられる場合、ポイエンダロンは、アミオダロンと比較した場合、臓器傷害性が最小限であると予想され、したがって、少なくとも甲状腺及び肺を保護する。

本発明の第１の態様によれば、式（Ｉ）で表される化合物又は医薬的に許容されるその塩が提供される。

式（Ｉ）

式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３はそれぞれ重水素を表し、
ｎは２又は３を表し、
各Ｒ^４は、独立して、ニトロ基、ハロゲン基、アミノ基、アミド基、シアノ基、カルボキシル基、スルホニル基、ヒドロキシル基、ケトン基、及びアルデヒド基の１つ又は複数で置換されていてもよいＣ_１－６ヒドロカルビル基を表し、
Ｒ^５は水素又は

を表し、
各Ｒ^６は、独立して、水素又はハロゲンを表し、
ただし、重水素として規定されていない各原子は、その天然の同位体存在量で存在し、重水素として規定されている各位置は、少なくとも４５％の重水素の取込みを有する。

本発明の化合物は、それらの非重水素化類似体（例えばドロネダロン）と同じ好ましい薬物動態及び抗心房細動作用を保持していることを示すだけでなく、心室性不整脈誘発の毒性がより低いことも示す。

本発明の化合物では、具体的に特定の同位体として規定されていない任意の原子が、その天然の同位体存在量で存在する。例えば、特に明記しない限り、位置が具体的に「Ｈ」又は「水素」と規定された場合、その位置は、その天然存在量の同位体組成で存在する水素を有すると理解される。また、特に明記しない限り、位置が特に「重水素」として規定された場合、その位置は、０．０１５％である重水素の天然存在量よりも少なくとも３０００倍多い存在量（すなわち、少なくとも４５％の重水素の取込みが必要である）で重水素（^２Ｈ）同位体を有すると理解される。

本発明の化合物では、３つの特定部位Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３のそれぞれに存在する重水素の量は、その天然の同位体存在量より高い。好ましくは、重水素として規定された各位置（すなわちＲ^１、Ｒ^２、及びＲ^３）は、少なくとも９０％（すなわち重水素の天然存在量よりも少なくとも６０００倍大きい）、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の重水素の取込みを有する。

本明細書で用いられる場合、本発明の化合物内の重水素の存在量に関して表される全ての百分率は、モル百分率である。

重水素化は、非重水素化類似体内でプロトンを重水素と交換することによって、又は重水素化された出発物質を用いて化合物を合成することによって達成することができる。

本発明の化合物において、各Ｒ^４は、独立して、ニトロ基、ハロゲン基、アミノ基、アミド基、シアノ基、カルボキシル基、スルホニル基、ヒドロキシル基、ケトン基、又はアルデヒド基の１つ又は複数で置換されていてもよいＣ_１－６ヒドロカルビル基を表す。本明細書で用いられる場合、「ヒドロカルビル」という表現は、炭素原子及び水素原子で構成された基を指す。これらには、脂肪族（すなわち、アルキル、アルケニル、又はアルキニル）基、並びにフェニルなどの芳香族基、又はこれらの組合せが含まれる。脂肪族基は、直鎖又は分岐鎖であってもよく、又は非芳香族環構造を形成してもよく、又は含んでもよい。容易に理解されるように、「Ｃ_１－６ヒドロカルビル」などの用語は、任意のそのような官能基が合計１～６個の炭素原子を含むという追加的要件と同様の意味を有する。

本明細書で用いられる場合、ハロゲンという用語は、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、又はヨード基を指す。

好ましい実施形態では、各Ｒ^４は、独立して、非置換のＣ_１－６ヒドロカルビル基、より好ましくは非置換のＣ_２－４ヒドロカルビル基を表す。特に好ましい実施形態では、前記ヒドロカルビル基はアルキル基である。特に好ましい実施形態では、各Ｒ^４はＣ_４アルキル基であり、典型的にはｎ－ブチルである。

本発明の化合物において、Ｒ^５は、水素又は

を表してもよい。ただし、Ｒ^５は、好ましくは

である。同様に、各Ｒ^６は、水素又はハロゲン基、典型的にはヨウ素を表してもよい。しかし、好ましい実施形態では、各Ｒ^６は水素である。ハロゲン原子を（Ｒ^６で）除外することで、肺及び甲状腺の傷害性がない化合物になり、そのようなメタンスルホンアミド基を（Ｒ^５に）包含することで、化合物の脂溶性を改変し、組織蓄積及び全身毒性をより低くする。

本発明の化合物において、ｎは、好ましくは３である。

本発明の特に適切な化合物は式（ＩＩ）による化合物であり、式中、Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３は上に定義される通りである。

式（ＩＩ）

上述のように、本発明の化合物は、心不整脈、特に心房細動の治療における使用に適している。さらに、非重水素化類似体とは対照的に、これらの化合物は、心室性不整脈誘発の毒性が軽微である。

したがって、本発明の第２の態様では、医薬に用いるための本発明の第１の態様による化合物が提供される。

また、心疾患の治療に用いるための本発明の第１の態様による化合物も提供される。好ましい実施形態では、心疾患は心不整脈であり、特に好ましい実施形態では心房細動である。

第３の態様では、本発明は、心疾患の治療方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする患者に、治療有効量の本発明の第１の態様による化合物を投与することを含む。

場合によっては、治療される心疾患は心不整脈であり、好ましくは心房細動である。

本発明の化合物は、通常、医薬組成物で投与され、したがって、本発明のさらなる態様では、本発明の第１の態様の化合物及び医薬的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物が提供される。

組成物は、任意の適切な経路、例えば、経口、頬側、鼻腔、経皮、又は非経口、例えば静脈内又は筋肉内の経路によって投与されてもよい。好ましくは、組成物は経口投与用である。

経口投与発明品のための本発明の製剤は、それぞれが所定量の活性薬剤を含有するカプセル剤、サシェ剤、錠剤、トローチ剤、又はロゼンジ剤などの個別の単位として、粉末又は顆粒として、水性液体又は非水性液体の活性薬剤の溶液又は懸濁液として、又は水中油型液体エマルジョン若しくは油中水型液体エマルジョンとして、又はシロップ若しくはエリキシル剤として、又はボーラスなどとして提示されてもよい。

経口投与用の組成物（例えば、錠剤、カプセル剤、粘膜付着剤などを含む製剤）の場合、「許容される担体」という用語は、通常の賦形剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、及びデンプンなどの結合剤；例えばコーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウム、及びアルギン酸などの充填剤及び担体；ポロクサマー、ポリソルベート、ドクサートナトリウム、及びラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤／界面活性剤；デンプン又はデンプングリコール酸ナトリウムなどの崩壊剤；並びに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、及び他の金属ステアリン酸塩、ステアリン酸グリセロール、ステアリン酸、シリコーン流体、タルクワックス、油、及びコロイド状シリカなどの潤滑剤などのビヒクルを含む。甘味剤、及びペパーミント、冬緑油、サクランボ香味料などの香味剤も用いることができる。剤形を容易に識別可能にするために、着色剤を添加することが望ましい場合がある。錠剤はまた、当技術分野で周知の方法によってコーティングされてもよい。

錠剤は、任意選択で１つ又は複数の補助成分と共に、圧縮又は成形によって作製されてもよい。圧縮錠剤は、任意選択で、バインダ、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤、又は分散剤と混合された粉末又は顆粒などの自由流動形態の活性薬剤を、適切な機械において圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を、適切な機械において成形することによって作製されてもよい。錠剤は、任意選択でコーティング又は刻み目が付けられてもよく、活性薬剤の持続放出性又は徐放性を提供するように製剤化されてもよい。

いくつかの製剤は、粘膜付着剤、例えばヒアルロン酸ナトリウムなどのムコ多糖を含んでもよい。そのような組成物は、例えば、液体、液体シロップ、ソフトゲル、液体ゲル、流動性ゲル、又は水性懸濁液として製剤化されてもよく、活性薬剤及び粘膜付着剤に加えて、上記の１つ又は複数の追加的賦形剤も含有してもよい。液体製剤は、通常、溶媒又は懸濁剤、例えば水又は生理食塩水であってもよい液体担体も含有し、それらの粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランも含有してもよい。

経口投与に適した他の製剤は、風味付けされた基材、通常スクロース及びアカシア又はトラガントの中に、活性薬剤を含むロゼンジ；ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアなどの不活性基材中に活性薬剤を含むパスティル；及び適切な液体担体中に活性薬剤を含む口腔洗浄薬を含む。

非経口製剤は、一般に滅菌されている。

本発明の第４の態様では、式（ＩＩＩ）で表される化合物又は医薬的に許容されるその塩が提供される。

式（ＩＩＩ）
（式中、各Ｒ^７は重水素を表す。）

本明細書の記載及び特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語及びその変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味し、他の部分、添加剤、成分、整数、又は工程を除外しない。本明細書の記載及び特許請求の範囲を通して、文脈上特に必要としない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、本明細書は、文脈上特に必要としない限り、複数並びに単数を企図するものとして理解されるべきである。

本明細書で引用されるいかなる特許又は特許出願も含む全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる参考文献も先行技術を構成することを認めるものではない。さらに、いかなる先行技術も、当技術分野における共通の一般知識の一部を構成することを認めるものではない。

本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかに関連して記載した通りであってもよい。

本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかになるであろう。一般的に言えば、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲及び図面を含む）に開示された特徴のいかなる新規なものにも、又はいかなる新規な組合せにも及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態、又は実施例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物、又は化学部分は、それらと非互換性でない限り、本明細書に記載されるいかなる他の態様、実施形態、又は実施例に適用可能であると理解されるべきである。

さらに、特に明記しない限り、本明細書に開示されるいかなる特徴も、同じ又は同様の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えられてもよい。

ここから、下記の実施例及び以下の図面を参照するのみである例によって、本発明を記載する。

ベンゾフラン由来でＦＤＡ承認の抗不整脈薬、（Ａ）アミオダロン及び（Ｂ）ドロネダロンの化学構造を示す。ドロネダロンにはヨウ素原子がないが、メタンスルホンアミド基を有する。加えて、ドロネダロンはＮ－ジブチルアミン部分を含むのに対して、アミオダロンはＮ－ジエチルアミン部分を含む。さらに、ドロネダロンは、Ｎ－ジブチルアミン部分とフェニル基との間にプロポキシ（－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－）リンカーを含むのに対して、アミオダロンは、Ｎ－ジエチルアミン部分とフェニル基との間にエトキシ（－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－）リンカーを含む。 シトクロムＰ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０：ＣＹＰ４５０）媒介ＡＡ代謝経路を示す。ＡＡは、ＣＹＰ２Ｊ２によって位置異性体の複数のＥＥＴに代謝される。ＥＥＴは、可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｐｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ：ｓＥＨ）によって、ジヒドロキシエイコサトリエン酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ：ＤＨＥＴ）にさらに代謝される。 ＣＹＰ２Ｊ２によるドロネダロンからキノンオキシム反応性代謝産物への代謝を示す。反応性代謝産物の求電子部位をアスタリスクで示す（４位及び６位）。 重水素化ベンゾフラン誘導体、ポイエンダロンの化学構造を示す。「Ｄ」は、重水素同位体の存在を表す。 重水素化ベンゾフラン誘導体、ポイエンダロンの塩酸塩（「ポイエンダロンＨＣｌ」）の合成を示す。「Ｄ」は、重水素同位体の存在を表す。試薬及び条件：（ａ）濃Ｈ_２ＳＯ_４、４８％ＨＢｒ、３５％ＨＣＨＯ、７５℃、６時間。Ｄ１収率：７６．５％；（ｂ）トルエン、ＰＰｈ_３、還流、１時間。Ｄ２収率：９９．０％；（ｃ）ＣＨＣｌ_３、ピリジン、バレロイルクロリド、還流２時間；トルエン、トリエチルアミン、還流、３時間。Ｄ３収率：７３．５％；（ｄ）ジクロロメタン、Ｃ_６Ｈ_５ＣＯＣｌ（ｐ－ＯＣＨ_３）、ＳｎＣｌ_４、室温、２４時間。Ｄ４収率：９３．５％；（ｅ）ジクロロメタン、ＡｌＣｌ_３、還流、２４時間。Ｄ５収率：９８．０％；（ｆ）アセトン、無水Ｋ_２ＣＯ_３、１－クロロ－３－ジ－ｎ－ブチルアミノプロパン、還流、一晩。Ｄ６収率：７７．０％；（ｇ）Ｆｅ、ＥｔＯＨ、Ｈ_２Ｏ、濃ＨＣｌ、６５℃、３時間。Ｄ７収率：８０．３％；（ｈ）ジクロロメタン、ピリジン、ＣＨ_３ＳＯ_２Ｃｌ、３５℃、３時間；（ｉ）メタノール、塩酸、０℃、３時間。Ｄ８収率：７９．０％。 ＣＹＰ２Ｊ２遺伝子発現に対する各ＣＹＰ２Ｊ２ ｓｉＲＮＡ処理条件の効果についての代表的なプロットを示す。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの９６時間後、それらのカルシウムトランジェントをビデオで捕えた後に、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｑＰＣＲ）を行った。全てのｓｉＲＮＡ処理にわたって、ＣＹＰ２Ｊ２の４０～８０％のノックダウンがみられる（＊＊＊：ｐ＜０．００１、Ｎ＝３）。 心筋細胞の個々のクラスタが受けた標準偏差での測定拍動間変動に対する各ＣＹＰ２Ｊ２ ｓｉＲＮＡ処理条件の効果を、生物学的反復全体で示す。各点は、３０秒ウィンドウの間に測定された心筋細胞の個々のクラスタの拍動間変動を表す。平均及び９５％信頼区間をプロットする。測定された個々のクラスタの数は、対照：６０、ｓｉＲＮＡ１：４８、ｓｉＲＮＡ２：６６、ｓｉＲＮＡ３：７２、ｓｉＲＮＡ４：８６、プール：８１である。シャピロ－ウィルク正規性検定（＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）を用いて決定されたデータの分布が正規性ではないため、ノンパラメトリックのマン・ホイットニーＵ検定を用いて有意性を評価した。 各処理条件の心筋細胞の個々のクラスタの代表的なラスタープロットを示す。各線は、３０秒以内の時間軸に沿った収縮発生を表す。収縮の規則性は、これらのグラフで視覚的に確認でき、収縮発生間の標準偏差を用いて定量化することができる。 心筋細胞の個々のクラスタが受けた標準偏差での測定拍動間変動に対するＣＹＰ２Ｊ２ ｓｉＲＮＡ処理の効果を、生物学的反復全体で示す。各点は、３０秒ウィンドウの間に測定された心筋細胞の個々のクラスタの拍動間変動を表す。平均及び９５％信頼区間をプロットする。測定された個々のクラスタの数は、対照：６０、ｓｉＲＮＡ（４つ全ての個々の処理条件及びプール条件を含む）：３５３である。シャピロ－ウィルク正規性検定（＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）を用いて決定されたデータの分布が正規性ではないため、ノンパラメトリックのマン・ホイットニーＵ検定を用いて有意性を評価した。 プローブ基質としてアステミゾールを用いたＣＹＰ２Ｊ２の時間依存的、濃度依存的、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＮＡＤＰＨ）依存的な不活性化を示す。図は、阻害剤の非存在下（薬物０μＭ）又はＮＡＤＰＨの非存在下（ＮＡＤＰＨなし）では、ＣＹＰ２Ｊ２が不活性化されないことを示す。しかし、阻害剤及びＮＡＤＰＨの存在下では、ＣＹＰ２Ｊ２活性の濃度依存的な減少がみられる。ＣＹＰ２Ｊ２活性百分率の対数を、（Ａ）ドロネダロン及び（Ｂ）ポイエンダロンの存在下でのプレインキュベーション時間に対してプロットした。観察された不活性化速度（ｋ_ｏｂｓ）の逆数を阻害剤濃度の逆数に対してプロットして、キッツーウィルソン（Ｋｉｔｚ－Ｗｉｌｓｏｎ）プロットを形成し、ｋｉｎａｃｔ／ＫＩを計算した。ｋｉｎａｃｔ／ＫＩ比が高いほど、ＣＹＰ２Ｊ２の機序的不活性化（ｍｅｃｈａｎｉｓｍ－ｂａｓｅｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ＭＢＩ）の能力が大きい。各点は３回の実験の平均値及びＳ．Ｄを表す。 プローブ基質としてリバーロキサバンを用いた、（Ａ）ドロネダロン及び（Ｃ）ポイエンダロンによるＣＹＰ２Ｊ２の時間依存的及び濃度依存的な不活性化を示す。非線形回帰を用い、（Ｂ）ドロネダロン及び（Ｄ）ポイエンダロンについて、観察された不活性化速度（ｋ_ｏｂｓ）を用いて不活性化反応速度定数Ｋ_Ｉ及びｋ_{ｉｎａｃｔ}を計算した。 プローブ基質としてリバーロキサバンを用いた、（Ａ）表３の化合物２及び（Ｃ）表３の化合物３によるＣＹＰ２Ｊ２の時間依存的及び濃度依存的な不活性化を示す。非線形回帰を用い、（Ｂ）化合物２及び（Ｄ）化合物３について、観察された不活性化速度（ｋ_ｏｂｓ）を用いて不活性化反応速度定数Ｋ_Ｉ及びｋ_{ｉｎａｃｔ}を計算した。 （Ａ）ＣＹＰ２Ｊ２及びｓＥＨｍＲＮＡの相対的発現を示す。全ＲＮＡを対照ｈｉＰＳＣ－ＣＭから単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ第一鎖合成系を用いてｃＤＮＡに転写した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ色素を用いたＱｕａｎｔｉｆａｓｔ ＰＣＲマスターミックスを用いて、５ｎｇの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を増幅した。試料を、３％アガロースゲル電気泳動で泳動した。ＨｉＰＳＣ－ＣＭは、分化の１４日後及び３０日後に、ＣＹＰ２Ｊ２及びｓＥＨの両方を発現する。（Ｂ）ＨｉＰＳＣ－ＣＭを、アステミゾール及び阻害剤で２４時間共処理し、アステミゾールの代謝産物、Ｏ－デスメチルアステミゾール（Ｏ－ｄｅｓｍｅｔｈｙｌａｓｔｅｍｉｚｏｌｅ）を、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて測定した。ＣＹＰ２Ｊ２活性の百分率を計算し、阻害剤と対照との間で比較した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５ （Ａ）ドロネダロンは心筋細胞に対して細胞傷害性である（死細胞プロテアーゼ活性の増加、細胞内のアデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＡＴＰ）の低減、テトラメチルローダミンメチルエステル過塩素酸（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ：ＴＭＲＭ）蛍光の低減）が、濃縮された１４、１５－ＥＥＴで濃度依存的に傷害性が救われることを示す。（Ｂ）ポイエンダロンは、心筋細胞に対して有意に傷害性が低い（ＡＴＰ減少のＩＣ_５０が１３分の１に低減、かつ細胞傷害性においてＥＣ_５０が２３分の１に低減、ドロネダロンのＩＣ_５０及びＥＣ_５０は、それぞれ３．１μＭ及び１．２μＭである）。 活動電位と細胞外フィールド電位との間の違いの概略図である。（Ａ）活動電位は、ホールセル・パッチクランプを用いて、単一細胞において従来法で測定し、単一イオンチャネル（例えば、ヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子（ｈｕｍａｎ ｅｔｈｅｒ－ａ－ｇｏ－ｇｏ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ：ｈＥＲＧ）チャネル）の作用を記録することができる。（Ｂ）フィールド電位は、複数の電極（例えば、窒化チタン、直径３０μｍ）を用いて細胞の群（例えば胚様体）で測定され、全てのイオンチャネル（例えば、ｈＥＲＧ及びＬ型カルシウムチャネル）及びイオン交換体（例えば、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（Ｎａ＋／Ｃａ２＋ｅｘｃｈａｎｇｅｒ：ＮＣＸ）に対する累積作用を同時に測定することができる。（Ｃ）ＨｉＰＳＣ－ＣＭをドロネダロン、アミオダロン、及びポイエンダロン（すなわち重水素化ドロネダロン）で５分間処理し、細胞外フィールド記録をベースラインで１８０～３００ミリ秒間行った。Ｃａｒｄｉｏ２Ｄソフトウェア（Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ、ロイトリンゲン）を用いて局所活性化マップを生成した。フィールド電位持続時間（ｆｉｅｌｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｕｒａｔｉｏｎ：ＦＰＤ）を、バゼット（Ｂａｚｚｅｔ）補正式で収縮領域の拍動数に対して正規化し、薬物濃度に対してプロットした。ドロネダロン、アミオダロン、及びポイエンダロンに対するｈｉＰＳＣ－ＣＭのＦＰＤの用量依存的増加。破線の囲みは、以前に公表されたドロネダロン及びアミオダロンの有効な治療上の非結合血漿濃度（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｎｂｏｕｎｄ ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＥＴＵＰＣ）を表す。比較のために、本発明者らは、ポイエンダロンのＥＴＵＰＣがドロネダロンと同様であると仮定した。 アミオダロンによるＮａ_Ｖ１．５ピーク電流の阻害を示す。Ａ．－１２０ｍＶの保持電位から－２０ｍＶで記録されたＮａ_Ｖ１．５チャネル電流。下：ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ）の存在下で記録された例示的なトレース、開始（黒）又は１１分後（赤）。スケールバー：Ｙ＝１０００ｐＡ、Ｘ＝１０ｍｓ。Ｂ．ＤＭＳＯの存在下（黒）、及びアミオダロン１０μＭ灌流の１１分後の、ＡのようにフォーマットしたＮａ_Ｖ１．５チャネル電流の例示的なトレース。Ｃ．それぞれの条件についての残存Ｎａ_Ｖ１．５ピーク電流％の平均ダイアリ（ｄｉａｒｙ）プロット。安定したベースラインピーク電流に対して電流を正規化した後に、平均をとった。Ｄ．Ｎａ_Ｖ１．５電流に対するアミオダロン阻害についての用量応答曲線。 ドロネダロンによるＮａ_Ｖ１．５ピーク電流の阻害を示す。Ａ．－１２０ｍＶの保持電位から－２０ｍＶで記録されたＮａ_Ｖ１．５チャネル電流。下：ＤＭＳＯの存在下で記録された例示的なトレース、開始（黒）又は１１分後（赤）。スケールバー：Ｙ＝１０００ｐＡ、Ｘ＝１０ｍｓ。Ｂ．ＤＭＳＯの存在下（黒）、及びドロネダロン５μＭ灌流の１１分後の、ＡのようにフォーマットしたＮａ_Ｖ１．５チャネル電流の例示的なトレース。Ｃ．それぞれの条件についての残存Ｎａ_Ｖ１．５ピーク電流％の平均ダイアリプロット。安定したベースラインピーク電流に対して電流を正規化した後に、平均をとった。Ｄ．Ｎａ_Ｖ１．５電流に対するドロネダロン阻害についての用量応答曲線。 ポイエンダロンによるＮａ_Ｖ１．５ピーク電流の阻害を示す。Ａ．－１２０ｍＶの保持電位から－２０ｍＶで記録されたＮａ_Ｖ１．５チャネル電流。下：ＤＭＳＯの存在下で記録された例示的なトレース、開始（黒）又は１１分後（赤）。スケールバー：Ｙ＝１０００ｐＡ、Ｘ＝１０ｍｓ。Ｂ．ＤＭＳＯの存在下（黒）、及びポイエンダロン６μＭ灌流の１１分後の、ＡのようにフォーマットしたＮａ_Ｖ１．５チャネル電流の例示的なトレース。Ｃ．それぞれの条件についての残存Ｎａ_Ｖ１．５ピーク電流％の平均ダイアリプロット。安定したベースラインピーク電流に対して電流を正規化した後に、平均をとった。Ｄ．Ｎａ_Ｖ１．５電流に対するポイエンダロン阻害についての用量応答曲線。 アミオダロンによるＣａ_Ｖ１．２ピーク電流の阻害を示す。Ａ．－８０ｍＶの保持電位から０ｍＶで記録されたＣａ_Ｖ１．２チャネル電流。下：ＤＭＳＯの存在下で記録された例示的なトレース、開始（黒）又は１０分後（赤）。スケールバー：Ｙ＝１００ｐＡ、Ｘ＝１００ｍｓ。Ｂ．ＤＭＳＯの存在下（黒）、及びアミオダロン５μＭ灌流後の、ＡのようにフォーマットしたＣａ_Ｖ１．２チャネル電流の例示的なトレース。Ｃ．それぞれの条件についての残存Ｃａ_Ｖ１．２ピーク電流％の平均ダイアリプロット。安定したベースラインピーク電流に対して電流を正規化した後に、平均をとった。Ｄ．Ｃａ_Ｖ１．２電流に対するアミオダロン阻害についての用量応答曲線。 ドロネダロンによるＣａ_Ｖ１．２ピーク電流の阻害を示す。Ａ．－８０ｍＶの保持電位から０ｍＶで記録されたＣａ_Ｖ１．２チャネル電流。下：ＤＭＳＯの存在下で記録された例示的なトレース、開始（黒）又は１０分後（赤）。スケールバー：Ｙ＝１００ｐＡ、Ｘ＝１００ｍｓ。Ｂ．ＤＭＳＯの存在下（黒）、及びドロネダロン２μＭ灌流後の、ＡのようにフォーマットしたＣａ_Ｖ１．２チャネル電流の例示的なトレース。Ｃ．それぞれの条件についての残存Ｃａ_Ｖ１．２ピーク電流％の平均ダイアリプロット。安定したベースラインピーク電流に対して電流を正規化した後に、平均をとった。Ｄ．Ｃａ_Ｖ１．２電流に対するドロネダロン阻害についての用量応答曲線。 ポイエンダロンによるＣａ_Ｖ１．２ピーク電流の阻害を示す。Ａ．－８０ｍＶの保持電位から０ｍＶで記録されたＣａ_Ｖ１．２チャネル電流。下：ＤＭＳＯの存在下で記録された例示的なトレース、開始（黒）又は１０分後（赤）。スケールバー：Ｙ＝１００ｐＡ、Ｘ＝１００ｍｓ。Ｂ．ＤＭＳＯの存在下（黒）、及びポイエンダロン０．５μＭ灌流後の、ＡのようにフォーマットしたＣａ_Ｖ１．２チャネル電流の例示的なトレース。Ｃ．それぞれの条件についての残存Ｃａ_Ｖ１．２ピーク電流％の平均ダイアリプロット。安定したベースラインピーク電流に対して電流を正規化した後に、平均をとった。Ｄ．Ｃａ_Ｖ１．２電流に対するポイエンダロン阻害についての用量応答曲線。 アミオダロンによるＫ_ｖ１１．１テール電流の阻害を示す。Ａ．Ｋ_ｖ１１．１電流を－８０ｍＶの保持電位から２０ｍＶの２．５秒パルスまで誘起した。その後、電圧を－６０ｍＶに戻してテール電流を記録した。下：ＤＭＳＯ（黒）又はアミオダロン０．２μＭ（赤）の存在下で記録された例示的なトレース。スケールバー：Ｙ＝２００ｐＡ、Ｘ＝５００ｍｓ。Ｂ．それぞれの条件についての残存Ｋ_ｖ１１．１テール電流％の平均ダイアリプロット。安定したベースラインのピークテール電流に対して電流を正規化した後に、平均をとった。Ｃ．Ｋ_ｖ１１．１電流に対するアミオダロン阻害についての用量応答曲線。 ドロネダロンによるＫ_ｖ１１．１テール電流の阻害を示す。Ａ．Ｋ_ｖ１１．１電流を－８０ｍＶの保持電位から２０ｍＶの２．５秒パルスまで誘起した。その後、電圧を－６０ｍＶに戻してテール電流を記録した。下：ＤＭＳＯ（黒）又はドロネダロン０．２μＭ（赤）の存在下で記録された例示的なトレース。スケールバー：Ｙ＝２００ｐＡ、Ｘ＝５００ｍｓ。Ｂ．それぞれの条件についての残存Ｋ_ｖ１１．１テール電流％の平均ダイアリプロット。安定したベースラインのピークテール電流に対して電流を正規化した後に、平均をとった。Ｃ．Ｋ_ｖ１１．１電流に対するドロネダロン阻害についての用量応答曲線。 ポイエンダロンによるＫ_ｖ１１．１テール電流の阻害を示す。Ａ．Ｋ_ｖ１１．１電流を－８０ｍＶの保持電位から２０ｍＶの２．５秒パルスまで誘起した。その後、電圧を－６０ｍＶに戻してテール電流を記録した。下：ＤＭＳＯ（黒）又は０．２μＭのポイエンダロン（赤）の存在下で記録された例示的なトレース。スケールバー：Ｙ＝２００ｐＡ、Ｘ＝５００ｍｓ。Ｂ．それぞれの条件についての残存Ｋ_ｖ１１．１テール電流％の平均ダイアリプロット。安定したベースラインのピークテール電流に対して電流を正規化した後に、平均をとった。Ｃ．Ｋ_ｖ１１．１電流に対するポイエンダロン阻害についての用量応答曲線。 対照、１０ｎＭのドロネダロン、１０ｎＭのアミオダロン、及び１０ｎＭのポイエンダロンについてのポアンカレプロットの代表的な図を示す。各点は、前後の拍動の間の拍動間の間隔（ｉｎｔｅｒ－ｂｅａｔ ｉｎｔｅｒｖａｌ：ＩＢＩ）を指す。挿入図：Ｒ－Ｒ間隔又は拍動間の間隔ＩＢＩを示す心電図（ｅｌｅｃｔｒｏｃａｒｄｉｏｇｒａｍ：ＥＣＧ）。ポイエンダロンに関係する拍動間変動（ＢＢＶ）がないことを示すために、ドロネダロン及びポイエンダロンのポアンカレプロットのスケールを比較している。 （Ａ）０．３ｍｇ／ｋｇ及び３．０ｍｇ／ｋｇの２つの用量のポイエンダロンで行われたインビボのイヌ実験の簡単な概略図を示す。ポイエンダロンについて、検証済みのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いて血漿試料を分析した。（Ｂ）ポイエンダロンは、ドロネダロンと同様の２コンパートメントモデルを示し、血漿クリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ：ＣＬ）及び分布容積（Ｖ）の両方の値は、それら２つの化合物間で同等である。このことは、ポイエンダロンの主要な脱ブチル化は概念的に重水素化の影響を受けないという本発明者らの推論と一致する。 （Ａ、Ｂ）ＣＹＰ３Ａ４、（Ｃ、Ｄ）ＣＹＰ３Ａ５、及び（Ｅ、Ｆ）ヒト肝臓ミクロソーム（ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｍｉｃｒｏｓｏｍｅ：ＨＬＭ）によるドロネダロン及びポイエンダロンのインビトロ代謝をそれぞれ示す。 以下の投与について臨床データに対して検証された、それぞれドロネダロン（左の列）及びポイエンダロン（右の列の赤色点線）のシミュレートした薬物動態プロファイルを示す。投与は、（Ａ、Ｂ）静脈内投与、（Ｃ、Ｄ）単回経口投与（絶食）、（Ｅ、Ｆ）単回経口投与（摂食）、（Ｇ、Ｈ）複数回経口投与（絶食）、（Ｉ、Ｊ）複数回経口投与（摂食）である。黒色の線は経時的な予測ドロネダロン濃度を示し、一方、灰色の線は９５パーセンタイル及び５パーセンタイルの濃度－時間プロファイルを表す。赤色の三角は臨床データを表す。赤色の点線は、ドロネダロンの場合と同じ臨床治験パラメータを用い、シミュレートしたポイエンダロンの濃度－時間プロファイルを表す。全ての研究は、ドロネダロンのＦＤＡレビューパッケージから得た。 ＬＩＮ２８９０臨床治験データ［２７］、（Ａ）ＭＢＩなし、及び（Ｃ）ＭＢＩありでの、ドロネダロン生理学的薬物動態（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ－ｂａｓｅｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ：ＰＢＰＫ）モデルについての複数回経口投与の検証を示す。グラフの拡大部分がそれぞれ（Ｂ）及び（Ｄ）に提示されており、読みやすさのために軸タイトルを除いている。赤色の三角は臨床濃度を示す。 洞房拍動数（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ ｒａｔｅ：ＳＡＲ）及び平均血圧（ｍｅａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ：ＭＢＰ）の変化の時間推移を示す。データを、平均±平均値の標準誤差（ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅａｎ：Ｓ．Ｅ．Ｍ．）（ｎ＝４）として提示する。 ４００ｍｓ（ＩＡＣＴ_{（ＣＬ４００）}）、３００ｍｓ（ＩＡＣＴ_{（ＣＬ３００）}）、及び２００ｍｓ（ＩＡＣＴ_{（ＣＬ２００）}）の心房ペーシング周期長での心房間伝導時間（ｉｎｔｅｒ－ａｔｒｉａｌ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ：ＩＡＣＴ、上）と、４００ｍｓ（ＡＥＲＰ_{（ＣＬ４００）}）、３００ｍｓ（ＡＥＲＰ_{（ＣＬ３００）}）、及び２００ｍｓ（ＡＥＲＰ_{（ＣＬ２００）}）の基本心房ペーシング周期長での心房有効不応期（ａｔｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｐｅｒｉｏｄ：ＡＥＲＰ、中央）と、４００ｍｓ（ＶＥＲＰ_{（ＣＬ４００）}）の基本心室ペーシング周期長での心室有効不応期（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｐｅｒｉｏｄ：ＶＥＲＰ、下）とにおける変化の時間推移を示す。データを、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４）として提示する。黒塗りの記号は、ｐ＜０．０５による各対照値（ｃｏｎｔｒｏｌ ｖａｌｕｅ：Ｃ）との統計学的に有意な差を表す。 薬物投与前の基本対照（対照、上）、及び３ｍｇ／ｋｇのポイエンダロン塩酸塩の投与の２０分後（３ｍｇ／ｋｇのポイエンダロン塩酸塩の２０分後、下）の、バーストペーシングの間及び後の右心房（ｒｉｇｈｔ ａｔｒｉｕｍ：ＲＡ）及び左心房（ｌｅｆｔ ａｔｒｉｕｍ：ＬＡ）の電位図、心電図（ＥＣＧ）、及び動脈圧（ａｒｔｅｒｉａｌ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ：ＢＰ）の典型的なトレーシングを示す。なお、心房細動の持続時間は、ポイエンダロン塩酸塩の投与後に、６．９秒から１．８秒に短縮された。 心房細動の持続時間（Ａｆ－持続時間）及び周期長（Ａｆ－ｃｙｃｌｅ ｌｅｎｇｔｈ：ＣＬ）の変化の時間推移を示す。データを、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４）として提示する。黒塗りの記号は、ｐ＜０．０５による各対照値（Ｃ）との統計学的に有意な差を表す。 図５に概略的に示す合成スキームに従って調製した２－（ブロモメチル）－４－ニトロフェノール（３，５，６－ｄ_３）（Ｄ１）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図５に概略的に示す合成スキームに従って調製した２－（（ブロモトリフェニルホスホラニル）メチル）－４－ニトロフェノール（３，５，６－ｄ_３）（Ｄ２）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図５に概略的に示す合成スキームに従って調製した２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン（Ｄ３）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図５に概略的に示す合成スキームに従って調製した（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－メトキシフェニル）メタノン（Ｄ４）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図５に概略的に示す合成スキームに従って調製した（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－ヒドロキシフェニル）メタノン（Ｄ５）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図５に概略的に示す合成スキームに従って調製した（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）－フラン－３－イル）（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）フェニル）メタノン（Ｄ６）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図５に概略的に示す合成スキームに従って調製した（５－アミノ－２－ブチル－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）－フラン－３－イル）（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）フェニル）メタノン（Ｄ７）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図５に概略的に示す合成スキームに従って調製したメタンスルホンアミド，Ｎ－（２－ブチル－３－（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）ベンゾイル）－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）－フラン－５－イル）塩酸塩（Ｄ８）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図５に概略的に示す合成スキームに従って調製したメタンスルホンアミド，Ｎ－（２－ブチル－３－（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）ベンゾイル）－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）－フラン－５－イル）塩酸塩（Ｄ８）の^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。 重水素化ドロネダロン誘導体「化合物３」の合成を示す。「Ｄ」は、重水素同位体の存在を表す。試薬及び条件：（ａ）濃Ｈ_２ＳＯ_４、４８％ＨＢｒ、３５％ＨＣＨＯ、７５℃、６時間、ＤＤ１：７６．０％。（ｂ）トルエン、ＰＰｈ_３、還流、１時間、ＤＤ２：９８．０％。（ｃ）ＣＨＣｌ_３、ピリジン、バレロイルクロリド、還流２時間；トルエン、トリエチルアミン、還流、３時間、ＤＤ３：７５．０％。（ｄ）ジクロロメタン、Ｃ_６Ｈ_５ＣＯＣｌ（ｐ－ＯＣＨ_３）、ＳｎＣｌ_４、室温、２４時間、ＤＤ４：９５．０％。（ｅ）ジクロロメタン、ＡｌＣｌ_３、還流、２４時間、ＤＤ５：９８．０％。（ｆ）アセトン、無水Ｋ_２ＣＯ_３、１－クロロ－３－ジ－ｎ－ブチルアミノプロパン、還流、一晩、ＤＤ６：７９．０％。（ｇ）Ｆｅ、ＥｔＯＨ、Ｈ_２Ｏ、濃ＨＣｌ、６５℃、３時間、ＤＤ７：８２．０％。（ｈ）ジクロロメタン、ピリジン、ＣＨ_３ＳＯ_２Ｃｌ、３５℃、３時間。（ｉ）メタノール、塩酸、０℃、３時間、ＤＤ－８：８０．０％。 図４３に概略的に示す合成スキームに従って調製した２－（ブロモメチル）－４－ニトロフェノール（２，３，５，６－ｄ_４）（ＤＤ１）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図４３に概略的に示す合成スキームに従って調製した２－（（ブロモトリフェニルホスホラニル）メチル）－４－ニトロフェノール（２，３，５，６－ｄ_４）（ＤＤ２）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図４３に概略的に示す合成スキームに従って調製した２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン（ＤＤ３）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図４３に概略的に示す合成スキームに従って調製した（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－メトキシフェニル（２，３，５，６－ｄ_４））メタノン（ＤＤ４）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図４３に概略的に示す合成スキームに従って調製した（（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－ヒドロキシフェニル（２，３，５，６－ｄ_４））メタノン（ＤＤ５）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図４３に概略的に示す合成スキームに従って調製した（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）フェニル（２，３，５，６－ｄ_４））メタノン（ＤＤ６）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図４３に概略的に示される合成スキームに従って調製した（５－アミノ－２－ブチル－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）フェニル（２，３，５，６－ｄ_４））メタノン（ＤＤ７）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図４３に概略的に示す合成スキームに従って調製したメタンスルホンアミド，Ｎ－（２－ブチル－３－（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）ベンゾイル（２，３，５，６－ｄ_４））－１－ベンゾフラン－５－イル）（ＤＤ８）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。 図４３に概略的に示す合成スキームに従って調製したメタンスルホンアミド，Ｎ－（２－ブチル－３－（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）ベンゾイル（２，３，５，６－ｄ_４））－１－ベンゾフラン－５－イル）（ＤＤ８）の^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。

表１．ｓｉＲＮＡ標的配列及びｑＰＣＲプライマーのリスト。

表２．Ｏ－デスメチルアステミゾール及びブスピロンの化合物依存的質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＳ）パラメータ。

表３．リバーロキサバンのＣＹＰ２Ｊ２媒介代謝のＭＢＩ。

表４．ヒトのＣＹＰ２Ｊ２、ＥＰＨＸ２、及びＧＡＰＤＨの遺伝子のためのプライマーの順方向配列及び逆方向配列。

表５．イヌ血漿中のドロネダロン、ポイエンダロン、及びＮ－デスエチルアミオダロン（Ｎ－ｄｅｓｅｔｈｙｌａｍｉｏｄａｒｏｎｅ：ＮＤＥＡ）（内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ：ＩＳ））の定量のための、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）の最適化条件。（Ａ）：源依存性パラメータ、（Ｂ）：化合物依存性パラメータ。Ｑ１：親イオンの質量、Ｑ３：娘イオンの質量、ＤＰ：デクラスタリング電位、ＥＰ：入口電位、ＣＥ：衝突エネルギー、ＣＸＰ：セル出口電位。

表６．基質枯渇並びに時間依存的及び濃度依存的な不活性化の結果。

表７．ＰＢＰＫモデリングに用いたパラメータ。

表８．計算されたＬｏｇ Ｐ（ｃＬｏｇＰ、ＣｈｅｍＳｋｅｔｃｈを用いて計算）、水溶解度（マルチスクリーンＨＴＳ ＰＣＦフィルタープレート３４を用いて汎用の緩衝液（ｐＨ７．４）中で測定）、有効透過率（並行人工膜透過率アッセイを用いて測定）、及びポイエンダロンとドロネダロンとを対比したインビトロ代謝半減期（Ｔ１／２、組換えＣＹＰ２Ｊ２とＮＡＤＰＨと１μＭ薬物とを用いて測定）。

表９．心房有効不応期（ΔＡＥＲＰ）及び心室有効不応期（ΔＶＥＲＰ）に対する抗不整脈薬の作用の比較。心房選択性は、ΔＡＥＲＰ対ΔＶＥＲＰの比（ΔＡＥＲＰ／ΔＶＥＲＰ）に基づいて測定され、ポイエンダロン＝ドロネダロン＞アミオダロン＞ベプリジル＞ｄｌ－ソタロールである。

表１０．終末再分極期（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ：ΔＴＲＰ）、早期再分極期（ΔＪ－Ｔｐｅａｋｃ）、及び後期再分極期（ΔＴｐｅａｋ－Ｔｅｎｄ）に対する抗不整脈薬の作用の比較。ΔＴＲＰは、リエントリー性心室性不整脈のリスクを示し、ドロネダロン＞ベプリジル＞ｄｌ－ソタロール＞アミオダロン＞ポイエンダロンである。

材料及び方法
全ての試薬及び溶媒は、特に示さない限り、汎用性又は分析用のものであり、Ｍｅｒｃｋ（以前はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入した。シリカゲルプレート（プレコート６０Ｆ_２５４Ｍｅｒｃｋプレート）上の薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ－ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＴＬＣ）によって、反応を常にモニターした。カラムクロマトグラフィーを、シリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ、７０～２３０メッシュ）を用いて行った。ＡＢＳｃｉｅｘ ２０００、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ質量分析計（イオン化源：エレクトロスプレーイオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＳＩ）プローブ）での質量対電荷ｍ／ｚを決定するために、化合物を高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）用のメタノールに溶解した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）分光計で、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ_３）重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ_６）及び重水素化メタノール（ＭｅＯＨ－ｄ_４）の溶液中で決定し、化学シフトは内部標準としてのテトラメチルシラン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ：ＴＭＳ）に対する百万分率（δ）ダウンフィールドで表し、Ｊ値（カップリング定数）をヘルツで表した。以下の略語を用いた。ｓ：一重線、ｄ：二重線、ｔ：三重線、ｍ：多重線。

ポイエンダロンの塩酸塩（「ポイエンダロンＨＣｌ」）の合成の詳細を以下に提供する。

図５に概略的に示すようなポイエンダロンＨＣｌの合成のための実験の詳細
２－（ブロモメチル）－４－ニトロフェノール（３，５，６－ｄ_３）（Ｄ１）の合成。４－ニトロ（２，３，５，６－ｄ_４）フェノール（１．２５ｇ、０．００８７３Ｍ）及び４８％ＨＢｒ溶液（１５．８ｍｌ）の混合物に、濃硫酸（０．１２１ｍｌ）を室温で添加し、続いて３５％ホルマリン溶液（０．７６０ｇ、０．０２４４Ｍ、２．８当量）を添加した。反応混合物を撹拌しながら７５℃で６時間加熱した。続いて、反応混合物を氷水混合物にゆっくり注ぎ、１時間撹拌した。得られた固体を濾過し、冷水で洗浄した後、真空下で乾燥させてベージュ色の固体を得た。トルエン（５０ｍｌ）をその固体に添加し、撹拌しながら混合物を８５℃で１時間加熱した。その混合物を５℃に冷却し、同じ温度で１時間撹拌した。得られた固体を濾過し、トルエンで洗浄し、次いで、真空下で乾燥させて白色固体を生成物として得た。収率：７６．５％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ４．７０（ｓ，２Ｈ），１１．６１（ｓ，１Ｈ）。合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図３４に示す。

２－（（ブロモトリフェニルホスホラニル）メチル）－４－ニトロフェノール（３，５，６－ｄ_３）（Ｄ２）の合成。１．５ｇ（０．００６３８Ｍ）の２－（ブロモメチル）－４－ニトロフェノール（３，５，６－ｄ_３）（Ｄ１）をトルエン（１０ｍｌ）に溶かした溶液に、１．６７ｇのトリフェニルホスフィン（０．００６３８Ｍ）を添加し、混合物を１時間還流した。反応の完了後、混合物を冷却し、得られた沈殿物を濾過した。濾液を蒸発乾固させ、トルエン（１０ｍｌ）と共に３０分間撹拌し、濾過して固体を得た。両方の固体を合わせ、真空下で乾燥させて白色固体を得た。収率：９９．０％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ４．７６－４．８０（ｄ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ，２Ｈ），７．５７－７．６６（ｍ，１２Ｈ），７．７８－７．８２（ｍ，３Ｈ）。合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図３５に示す。

２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン（Ｄ３）の合成。１．６５ｇ（０．００３３２Ｍ）の２－（（ブロモトリフェニルホスホラニル）メチル）－４－ニトロフェノール（３，５，６－ｄ_３）（Ｄ２）を１０ｍｌのＣＨＣｌ_３に溶かした溶液に、０．５２２ｇ（０．００６６Ｍ、２当量）のピリジンを添加した。次いで、その混合物に、室温で撹拌しながら、０．５００ｇ（０．００４０５Ｍ、１．２５当量）のバレロイルクロリドをゆっくり添加した。混合物を２時間還流し、次いで２５ｍｌのトルエンを添加し、溶媒の約半分を減圧下で蒸発させた。次いで、１．０ｇ（０．００９９６Ｍ、３当量）のトリエチルアミンを添加し、さらに３時間還流した。得られた反応混合物を冷却し、形成されたトリフェニルホスフィンオキシドを濾過し、酢酸エチルで洗浄し、濾液を真空下で濃縮した。形成された粘性残渣を、石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（９５：５）を用い、カラムクロマトグラフィーにより精製して無色の残渣を得た。収率：７３．５％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ０．８５－０．８９（ｔ，Ｊ＝７．２０Ｈｚ，３Ｈ），１．２８－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．７０－１．７８（ｍ，２Ｈ），２．８７－２．９１（ｔ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ，２Ｈ），７．５３－７．５５（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，１Ｈ）．合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図３６に示す。

（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－メトキシフェニル）メタノン（Ｄ４）の合成。２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン（Ｄ３）（１．４ｇ、０．００６２９Ｍ）を１５ｍｌジクロロメタン（７ｍｌ）に溶かした溶液に、４－メトキシベンゾイルクロリド（１．６１ｇ、０．００９４５Ｍ、１．５当量）及び塩化スズ（ＩＶ）（４．１ｇ、０．０１５７Ｍ、２．５当量）を０～５℃で１時間にわたってゆっくり添加し、撹拌を室温で２４時間続けた。反応混合物を０～５℃で冷却した後、水（１０ｍｌ）をゆっくり添加し、混合物を約３０分間撹拌した。水層を分離し、ジクロロメタン（３×１０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を減圧下で蒸発させた。得られた粗化合物を、石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（８５：１５）を用い、カラムクロマトグラフィーにより精製して白色固体を生成物として得た。収率：９３．５％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ０．８６－０．８９（ｔ，Ｊ＝７．４０Ｈｚ，３Ｈ），１．２９－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．７１－１．７８（ｍ，２Ｈ），２．８８－２．９２（ｔ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ，２Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），６．９６－６．９９（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，２Ｈ），７．８０－７．８３（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，２Ｈ）．合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図３７に示す。

（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－ヒドロキシフェニル）メタノン（Ｄ５）の合成。１．０２ｇ（０．００２８６Ｍ）の（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－メトキシフェニル）メタノン（Ｄ４）をジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶かした溶液に、ＡｌＣｌ３（２．２９ｇ、０．０１７２Ｍ、６当量）を０～５℃で撹拌しながら１時間にわたってゆっくり添加した。混合物を２４時間還流し、室温に、次いで０～５℃に冷却した。水（１０ｍｌ）をゆっくり添加し、混合物を約３０分間撹拌した。有機層を分離し、真空下で濃縮して残渣を得、これを石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（９０：１０）を用い、カラムクロマトグラフィーにより精製して黄色がかった油状物を得た。収率：９８．０％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ０．８７－０．９０（ｔ，Ｊ＝７．２０Ｈｚ，３Ｈ），１．３０－１．３９（ｍ，２Ｈ），１．７２－１．８０（ｍ，２Ｈ），２．９０－２．９４（ｔ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ，２Ｈ），６．９４－６．９６（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，２Ｈ），７．７７－７．８０（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，２Ｈ）．合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図３８に示す。

（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）－フラン－３－イル）（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）フェニル）メタノン（Ｄ６）の合成。０．８００ｇ（０．００２３Ｍ）の（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－ヒドロキシフェニル）メタノン（Ｄ５）を２０ｍｌのアセトンに溶かした溶液に、３．２３ｇ（０．００２３Ｍ、１当量）の無水Ｋ_２ＣＯ_３及び４．７９ｇ（０．００２３Ｍ、１当量）の１－クロロ－３－ジ－ｎ－ブチルアミノプロパンを室温で添加した。反応混合物を６０℃で一晩還流した。反応混合物を冷却し、減圧下で蒸発させた。得られた固体に水（２０ｍｌ）を添加し、５分間撹拌し、ジクロロメタン（３×２０ｍｌ）で抽出した。有機層を減圧下で蒸発させて粗残渣を得、これを石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（７０：３０）を用い、カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、黄色がかった油状残渣を得た。収率：７７．０％、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ ０．８０－０．８４（ｍ，９Ｈ），１．２２－１．２７（ｍ，６Ｈ），１．３０－１．３７（ｍ，４Ｈ），１．６４－１．７２（ｍ，２Ｈ），１．８２－１．８５（ｔ，Ｊ＝６．４０Ｈｚ，２Ｈ），２．３３－２．３６（ｔ，Ｊ＝７．００Ｈｚ，４Ｈ），２．５１－２．５３（ｍ，２Ｈ），２．８２－２．８６（ｔ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ，２Ｈ），４．１２－４．１５（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，２Ｈ），７．０８－７．１０（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，２Ｈ），７．８１－７．８３（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，２Ｈ）．合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図３９に示す。

（５－アミノ－２－ブチル－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）－フラン－３－イル）（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）フェニル）メタノン（Ｄ７）の合成。０．１１４ｇ（０．０００２２Ｍ）の（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ３）フラン－３－イル）（４（３（ジブチルアミノ）プロポキシ）フェニル）メタノン（Ｄ６）、０．１０６ｇ（０．００１３３Ｍ、６当量）の鉄粉、０．５ｍｌのエタノール、及び０．２５ｍｌの水の混合物を、室温で１０分間撹拌した。反応混合物を１５℃に冷却し、０．５ｍｌの濃ＨＣｌを添加した。反応混合物を６５℃で３時間撹拌し、冷却し、氷水混合物に注ぎ、３０分間撹拌した。水層をジクロロメタン（３×５ｍｌ）で抽出した。アンモニア水溶液を用いて、有機層のｐＨを８～９に調整した。有機層と水層の両方を分離した。水層をジクロロメタン（３×５ｍｌ）で抽出し、両方の有機層を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下で除去して無色の油状物を得た。収率８０．３％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ０．８７－０．９１（ｍ，９Ｈ），１．２５－１．３７（ｍ，６Ｈ），１．４２－１．４９（ｍ，４Ｈ），１．７１－１．７９（ｍ，２Ｈ），１．９９－２．０２（ｍ，２Ｈ），２．４７－２．５０（ｍ，４Ｈ），２．６５－２．６９（ｍ，２Ｈ），２．８９－２．９３（ｔ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ，２Ｈ），４．１１－４．１４（ｔ，Ｊ＝６．２０Ｈｚ，２Ｈ），６．９６－６．９８（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，２Ｈ），７．８０－７．８２（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，２Ｈ）．合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図４０に示す。

メタンスルホンアミド，Ｎ－（２－ブチル－３－（４－（３－（ジブチルアミノ）
プロポキシ）ベンゾイル）－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）－フラン－５－イル）塩酸塩（Ｄ８）の合成。０．１００ｇ（０．０００２０７Ｍ）の（５－アミノ－２－ブチル－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－（３（ジブチルアミノ）プロポキシ）フェニル）メタノン（Ｄ７）を無水ジクロロメタン（３ｍｌ）に溶かした加温溶液に、０．０１９７ｇ（０．０００２４９Ｍ、１．２当量）のピリジン及び０．０２８ｇ（０．０００２４９Ｍ、１．２当量）のメタンスルホニルクロリドを、３５℃で５分間にわたってゆっくり添加した。得られた混合物を同じ温度で３時間撹拌し、次いで室温に冷却した。次いで、この混合物を、２×５ｍｌの水、２×５ｍｌの５％ＮａＨＣＯ_３溶液、そして１×５ｍｌの水で洗浄した。有機相を分離し、濃縮し、これを石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（１０：９０）を用い、カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、褐色油状残渣を収率８０％で得た。この残渣に５ｍｌのメタノールを添加し、塩酸（０．１００ｍｌ）を０．４ｍｌのメタノールに溶かした溶液を２０分間にわたって添加した。反応混合物を０℃で３時間撹拌し、得られた固体を濾過し、メタノールで洗浄し、乾燥させて、標記化合物を淡褐色固体として得た。Ｃ_３１Ｈ_４１Ｄ_３Ｎ_２Ｏ_５Ｓ［Ｍ＋Ｈ］^＋について計算したＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）５５９．７７。収率：７９．０％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ－ｄ_４）：δ ０．８３－０．８８（ｍ，３Ｈ），０．８９－０．９３（ｔ，Ｊ＝７．２０Ｈｚ，６Ｈ），１．２７－１．３３（ｍ，６Ｈ），１．４３－１．４７（ｍ，４Ｈ），１．６９－１．７７（ｍ，２Ｈ），１．９４－１．９９（ｍ，２Ｈ），２．４５－２．４９（ｍ，４Ｈ），２．６４－２．６８（ｔ，Ｊ＝７．４０Ｈｚ，２Ｈ），２．８６－２．８９（ｔ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ，２Ｈ），２．９６（ｓ，３Ｈ），４．１２－４．１６（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，２Ｈ），７．０３－７．０６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．７８－７．８７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），^１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ－ｄ_４）：１３．７，１９．５，２０．７，２３．２，２４．７，２６．７，２８．７，３１．１，３８．８，５１．２，５４．０，６６．３，１１５．６，１１７．９，１２８．９，１２９．７，１３２．３，１３２．７，１３３．３，１３５．５，１５２．７，１６３．９，１６５．５，１６７．５，１９２．５．合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲのスペクトルを図４１及び図４２にそれぞれ示す。

図４３に概略的に示す重水素化ドロネダロン誘導体「化合物３」の合成の実験の詳細
２－（ブロモメチル）－４－ニトロフェノール（２，３，５，６－ｄ_４）（ＤＤ－１）の合成。４－ニトロフェノール（２，３，５，６－ｄ_４）（１．２５ｇ、０．００８７３Ｍ）及び４８％ＨＢｒ溶液（１５．８ｍｌ）の混合物に、濃硫酸（０．１２１ｍｌ）を室温で添加し、続いて３５％ホルマリン溶液（０．７６０ｇ、０．０２４４Ｍ、２．８当量）を添加した。反応混合物を撹拌しながら７５℃で６時間加熱した。続いて、反応混合物を氷水混合物にゆっくり注ぎ、１時間撹拌した。得られた固体を濾過し、冷水で洗浄した後、真空下で乾燥させてベージュ色の固体を得た。トルエン（５０ｍｌ）をその固体に添加し、撹拌しながら混合物を８５℃で１時間加熱した。その混合物を５℃に冷却し、同じ温度で１時間撹拌した。得られた固体を濾過し、トルエンで洗浄し、次いで、真空下で乾燥させて白色固体を生成物として得た。収率：７６．０％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ１１．６４（ｓ，１Ｈ）。合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図４４に示す。

２－（（ブロモトリフェニルホスホラニル）メチル）－４－ニトロフェノール（２，３，５，６－ｄ_４）（ＤＤ－２）の合成。１．５ｇ（０．００６３８Ｍ）の２－（ブロモメチル）－４－ニトロフェノール（２，３，５，６－ｄ_４）（ＤＤ－１）をトルエン（１０ｍｌ）に溶かした溶液に、１．６７ｇのトリフェニルホスフィン（０．００６３８Ｍ）を添加し、混合物を１時間還流した。反応の完了後、混合物を冷却し、得られた沈殿物を濾過した。濾液を蒸発乾固させ、トルエン（１０ｍｌ）と共に３０分間撹拌し、濾過して固体を得た。両方の固体を合わせ、真空下で乾燥させて白色固体を得た。収率：９８．０％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ４．７０－４．７４（ｄ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ，２Ｈ）。合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図４５に示す。

２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン（ＤＤ－３）の合成。１．６５ｇ（０．００３３４Ｍ）の２－（（ブロモトリフェニルホスホラニル）メチル）－４－ニトロフェノール２，３，５，６－ｄ_４）（ＤＤ－２）を１０ｍｌのＣＨＣｌ_３に溶かした溶液に、０．５２２ｇ（０．００６６３Ｍ、２当量）のピリジンを添加した。次いで、その混合物に、室温で撹拌しながら、０．５００ｇ（０．００４１７Ｍ、１．２５当量）のバレロイルクロリドをゆっくり添加した。混合物を２時間還流し、次いで２５ｍｌのトルエンを添加し、溶媒の約半分を減圧下で蒸発させた。次いで、１．０ｇ（０．０１００２Ｍ、３当量）のトリエチルアミンを添加し、さらに３時間還流した。得られた反応混合物を冷却し、形成されたトリフェニルホスフィンオキシドを濾過し、酢酸エチルで洗浄し、濾液を真空下で濃縮した。形成された粘性残渣を、石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（９５：５）を用い、カラムクロマトグラフィーによって精製して無色の残渣を得た。収率：７５．０％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ０．７５－０．９５（ｔ，Ｊ＝７．２０Ｈｚ，３Ｈ），１．１５－１．３６（ｍ，２Ｈ），１．４５－１．６７（ｍ，２Ｈ），２．３０－２．８０（ｔ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ，２Ｈ），５．８２（ｓ，１Ｈ）．合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図４６に示す。

（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－メトキシフェニル（２，３，５，６－ｄ_４））メタノン（ＤＤ－４）の合成。２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン（ＤＤ－３）（１．４ｇ、０．００６３０Ｍ）を１５ｍｌジクロロメタン（７ｍｌ）に溶かした溶液に、４－メトキシベンゾイル（ｄ_４）クロリド（１．６１ｇ、０．００９５８Ｍ、１．５当量）及び塩化スズ（ＩＶ）（４．１ｇ、０．０１５７Ｍ、２．５当量）を０～５℃で１時間にわたってゆっくり添加し、撹拌を室温で２４時間続けた。反応混合物を０～５℃で冷却した後、水（１０ｍｌ）をゆっくり添加し、混合物を約３０分間撹拌した。水層を分離し、ジクロロメタン（３×１０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を減圧下で蒸発させた。得られた粗化合物を、石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（８５：１５）を用い、カラムクロマトグラフィーにより精製して白色固体を生成物として得た。収率９５．０％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ０．８６－０．８９（ｔ，Ｊ＝７．４０Ｈｚ，３Ｈ），１．２９－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．７１－１．７９（ｍ，２Ｈ），２．８８－２．９２（ｔ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ，２Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ）．合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図４７に示す。

（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－ヒドロキシフェニル（２，３，５，６－ｄ_４））メタノン（ＤＤ－５）の合成。１．０２ｇ（０．０００２８３Ｍ）の（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－メトキシフェニル（２，３，５，６－ｄ_４）メタノン（ＤＤ－４）をジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶かした溶液に、ＡｌＣｌ_３（２．２９ｇ、０．０１６９Ｍ、６当量）を０～５℃で撹拌しながら１時間にわたってゆっくり添加した。混合物を２４時間還流し、室温に、次いで０～５℃に冷却した。水（１０ｍｌ）をゆっくり添加し、混合物を約３０分間撹拌した。有機層を分離し、真空下で濃縮して残渣を得、これを石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（９０：１０）を用い、カラムクロマトグラフィーにより精製して黄色がかった油状物を得た。収率：９８．０％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ０．８７－０．９０（ｔ，Ｊ＝７．２０Ｈｚ，３Ｈ），１．３０－１．３９（ｍ，２Ｈ），１．７２－１．８０（ｍ，２Ｈ），２．９０－２．９４（ｔ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ，２Ｈ）．合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図４８に示す。

（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）フェニル（２，３，５，６－ｄ_４））メタノン（ＤＤ－６）の合成。０．８００ｇ（０．００２３１Ｍ）の（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－ヒドロキシフェニル）（２，３，５，６－ｄ_４））メタノン（ＤＤ－５）を２０ｍｌのアセトンに溶かした溶液に、３．２３ｇ（０．００２３Ｍ、１当量）の無水Ｋ_２ＣＯ_３及び４．７９ｇ（０．００２３１Ｍ、１当量）の１－クロロ－３－ジ－ｎ－ブチルアミノプロパンを、室温で添加した。反応混合物を６０℃で一晩還流した。反応混合物を冷却し、減圧下で蒸発させた。得られた固体に水（２０ｍｌ）を添加し、５分間撹拌し、ジクロロメタン（３×２０ｍｌ）で抽出した。有機層を減圧下で蒸発させて粗残渣を得、これを石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（７０：３０）を用い、カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、黄色がかった油状残渣を得た。収率：：７９．０％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ ０．８１－０．８４（ｍ，９Ｈ），１．２２－１．２７（ｍ，６Ｈ），１．３０－１．３７（ｍ，４Ｈ），１．６４－１．７０（ｍ，２Ｈ），１．８３－１．８６（ｔ，Ｊ＝６．４０Ｈｚ，２Ｈ），２．３３－２．３７（ｔ，Ｊ＝７．００Ｈｚ，４Ｈ），２．５０－２．５３（ｍ，２Ｈ），２．８２－２．８６（ｔ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ，２Ｈ），４．１２－４．１６（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，２Ｈ）．合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図４９に示す。

（５－アミノ－２－ブチル－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）フェニル（２，３，５，６－ｄ_４））メタノン（ＤＤ－７）の合成。０．１１４ｇ（０．０００２３Ｍ）の（２－ブチル－５－ニトロ－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）フェニル（２，３，５，６－ｄ_４））メタノン（ＤＤ－６）、０．１０６ｇ（０．００１３８Ｍ、６当量）の鉄粉、０．５ｍｌのエタノール、及び０．２５ｍｌの水の混合物を、室温で１０分間撹拌した。反応混合物を１５℃に冷却し、０．５ｍｌの濃ＨＣｌを添加した。反応混合物を６５℃で３時間撹拌し、冷却し、氷水混合物に注ぎ、３０分間撹拌した。水層をジクロロメタン（３×５ｍｌ）で抽出した。アンモニア水溶液を用いて、有機層のｐＨを８～９に調整した。有機層と水層の両方を分離した。水層をジクロロメタン（３×５ｍｌ）で抽出し、両方の有機層を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下で除去して無色の油状物を得た。収率：８２．０％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ０．８７－０．９１（ｍ，９Ｈ），１．２６－１．３７（ｍ，６Ｈ），１．４２－１．４９（ｍ，４Ｈ），１．７１－１．７９（ｍ，２Ｈ），１．９９－２．０２（ｍ，２Ｈ），２．４７－２．５１（ｍ，４Ｈ），２．６６－２．６９（ｍ，２Ｈ），２．８９－２．９３（ｔ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ，２Ｈ），４．１１－４．１４（ｔ，Ｊ＝６．２０Ｈｚ，２Ｈ）．合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図５０に示す。

メタンスルホンアミド，Ｎ－（２－ブチル－３－（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）ベンゾイル（２，３，５，６－ｄ_４））－１－ベンゾフラン－５－イル）（ＤＤ－８）の合成。０．１００ｇ（０．０００２０６Ｍ）の（５－アミノ－２－ブチル－１－ベンゾ（４，６，７－ｄ_３）フラン－３－イル）（４－（３－（ジブチルアミノ）プロポキシ）フェニル（２，３，５，６－ｄ_４））メタノン（ＤＤ－７）を無水ジクロロメタン（３ｍｌ）に溶かした加温溶液に、０．０１９７ｇ（０．０００２４７Ｍ、１．２当量）のピリジン及び０．０２８ｇ（０．０００２４７Ｍ、１．２当量）のメタンスルホニルクロリドを、３５℃で５分間にわたってゆっくり添加した。得られた混合物を同じ温度で３時間撹拌し、次いで室温に冷却した。次いで、この混合物を、２×５ｍｌの水、２×５ｍｌの５％ＮａＨＣＯ_３溶液、そして１×５ｍｌの水で洗浄した。有機相を分離し、濃縮し、これを石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（１０：９０）を用い、カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、褐色油状残渣を収率８０％で得た。この残渣に５ｍｌのメタノールを添加し、塩酸（０．１００ｍｌ）を０．４ｍｌのメタノールに溶かした溶液を２０分間にわたって添加した。反応混合物を０℃で３時間撹拌し、得られた固体を濾過し、メタノールで洗浄し、乾燥させて、標記化合物を淡褐色固体として得た。Ｃ_３１Ｈ_３７Ｄ_７Ｎ_２Ｏ_５Ｓ［Ｍ＋Ｈ］^＋について計算したＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）５６３．８。収率：８０．０％、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ－ｄ_４）：δ ０．８４－０．８８（ｍ，３Ｈ），０．８９－０．９３（ｔ，Ｊ＝７．２０Ｈｚ，６Ｈ），１．２７－１．３４（ｍ，６Ｈ），１．４２－１．４９（ｍ，４Ｈ），１．６９－１．７６（ｍ，２Ｈ），１．９２－１．９９（ｍ，２Ｈ），２．４５－２．４９（ｍ，４Ｈ），２．６４－２．６８（ｔ，Ｊ＝７．４０Ｈｚ，２Ｈ），２．８５－２．８８（ｔ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ，２Ｈ），２．９１（ｓ，３Ｈ），４．１２－４．１５（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，２Ｈ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ－ｄ_４）：１３．９，１９．４，２０．９，２３．２，２４．６，２６．７，２８．７，３１．０，３８．８，５１．１，５４．０，６６．２，１１５．６，１１７．９，１２８．９，１２９．８，１３２．３，１３２．８，１３３．２，１３５．２，１５２．８，１６４．４，１６５．３，１６７．２，１９２．２．合成した生成物の^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲのスペクトルを図５１及び図５２にそれぞれ示す。

心拍間隔に対するＣＹＰ２Ｊ２発現のインビトロ評価
（Ａ）細胞培養。ノックインされ、構成的に発現される遺伝的コード化カルシウム標識（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ：ＧＥＣＩ）、ＧＣａＭＰ６ｓを有するヒトＥＳ細胞株（Ｈ７ ＥＳＣ）を、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ｉＰＳ－Ｂｒｅｗ ＸＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）においてマトリゲルでコーティングしたプレート上で維持し、コラゲナーゼＩＶ（１ｍｇ／ｍＬ）酵素処理を用いて凝集塊で継代した。分化のために、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ナカライテスク）を用いてＥＳＣを単一細胞で継代し、以前に確立された小分子ベースのＧｉＷｉ心筋細胞分化プロトコルに供した。７日目に、成熟のためにインスリン（Ｂ２７＋）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を含むＢ２７を補充したＲＰＭＩ１６４０（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培地を交換し、２日ごとにリフレッシュした。２１日目に、培地中のグルコースレベルを２８日目までに０％までゆっくりと低減させて、β酸化に依存する、より成熟した心筋細胞の代謝選択を促進した。心筋細胞（Ｈ７ ＣＭ）を２８日目にｓｉＲＮＡトランスフェクションに用いた。

（Ｂ）ＣＹＰ２Ｊ２のｓｉＲＮＡノックダウン。自己送達修飾された４つのＡｃｃｅｌｌ（商標）－ｓｉＲＮＡのセット（表１）及び送達培地（カタログ番号Ｂ－００５０００）をＤｈａｒｍａｃｏｎ（商標）から得た。供給業者のプロトコルに従って、接着細胞にトランスフェクションを実施した。簡潔には、２８日目のＨ７ ＣＭの個々のウェルを、Ａｃｃｅｌｌ ｓｉＲＮＡ送達培地において、１μＭの個々のｓｉＲＮＡ又は０．２５μＭの４つ全てのｓｉＲＮＡ（プール条件）で７２時間処理した。送達培地を低グルコースＢ２７＋培地と２４時間で交換した後、ｑＰＣＲ解析のために、ビデオ解析及びＲＮＡ採取を行った。

（Ｃ）ＲＮＡ単離。各処理について、約５×１０^６個の細胞を採取し、５００μＬのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解した。試料を室温で５分間静置した後、１８０μＬのクロロホルム（関東化学、日本）を添加し、続いて相分離のために４℃で１５分間、１２，０００×ｇで遠心した。次に、等量のイソプロパノール及びＧｌｙｃｏＢｌｕｅ共沈剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を入れた新しい管に水相を移した。その試料を室温で２０分間インキュベートした。その試料を４℃で１５分間、１２，０００×ｇでの遠心によってペレット化した。ＲＮＡペレットを１００％エタノールで洗浄し、風乾した後、ヌクレアーゼを含まない水（Ａｍｂｉｏｎ、米国）中で再構成した。

（Ｄ）定量的ＰＣＲ。ＲＮＡ試料（２５０ｎｇ）を、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用い、逆転写してｃＤＮＡを得た。５ｎｇのｃＤＮＡについて、ＦＡＳＴ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いてｑＰＣＲを行った。ΔΔＣ_Ｔに基づく相対定量法を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ ３８４－ｗｅｌｌ Ｂｌｏｃｋ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いたｑＰＣＲ解析に採用した。閾値サイクルを≧３５に決定した。ＣＴ値をβ－ＡＣＴＩＮに正規化した倍率変化としてデータを提示する。提示するデータは、特に明記しない限り、標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ：ＳＤ）を示すエラーバーを有する２つの独立した実験を代表するものである。

結果を図６に示す。

（Ｅ）ＧＣａＭＰ６ｓ Ｈ７ ＣＭの蛍光Ｃａ^２＋の画像化及びビデオ解析。処理後のＨ７ ＣＭのカルシウムトランジェントを、Ｎｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｉ－Ｓ蛍光顕微鏡を用いて画像化し、Ａｎｄｏｒ Ｚｙｌａ ４．２ ｓＣＭＯＳカメラを用いて１５ｆｐｓで記録した。ビデオデータをＮｉｋｏｎのＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲを用いて解析し、ＲＳｔｕｄｉｏ ｖ１．２．１３３５を用い加工して、単一の心臓収縮に対応する蛍光ピークを識別し、関連データをコンピュータ計算して拍動間隔データ及び変動データを得た。

結果を図７及び図８に示す。

（Ｆ）統計解析。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を用いてデータ点をプロットし、統計解析を実施した。ｓｉＲＮＡ処理のノックダウン効率を、スチューデントのｔ検定を用いて評価した。処理群間の拍動間変動の比較を、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定を用いて評価した。統計学的有意性をｐ＜０．０５とする。

結果を図９に示す。

ドロネダロン及びポイエンダロンによるＣＹＰ２Ｊ２のインビトロの時間依存的、濃度依存的、及びＮＡＤＰＨ依存的な不活性化
（Ａ）試薬。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用のアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ：ＡＣＮ）を、Ｔｅｄｉａ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．（オハイオ州フェアフィールド）から購入した。ドロネダロン塩酸塩、アステミゾール、及びブスピロン塩酸塩を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ヒト組換えＣＹＰ２Ｊ２ Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（商標）（ｒＣＹＰ２Ｊ２）、並びにＮＡＤＰＨ Ａ（ＮＡＤＰ＋及びグルコース６－リン酸）及びＮＡＤＰＨ Ｂ（グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ）からなるＮＡＤＰＨ再生システムを、ＢＤ Ｇｅｎｔｅｓｔ（マサチューセッツ州ウ－バン）から購入した。ポイエンダロン塩酸塩は、本明細書に詳述する合成に従って、社内で合成した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ浄水システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビレリカ）を用いて水を得た。他の全ての試薬は分析用のものであった。

（Ｂ）プローブ基質としてアステミゾールを用いた、ドロネダロン及びポイエンダロンによる時間依存的、濃度依存的、及びＮＡＤＰＨ依存的なＣＹＰ２Ｊ２の不活性化。様々な濃度のドロネダロン（０－１．０μＭ）又はポイエンダロン（０～１０．０μＭ）、２０ｐｍｏｌ／ｍＬのｒＣＹＰ２Ｊ２、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、及びＮＡＤＰＨ Ｂを含む一次インキュベーション混合物（１００μＬ）を、３７℃で３～５分間加温した。ＮＡＤＰＨ Ａを添加することによって酵素反応を開始した。異なるプレインキュベーション時点（０分、３分、８分、１５分、２２分、３０分、４５分）で、一次インキュベーション混合物の１０μＬアリコートを、緩衝液、アステミゾール（１５μＭ）、及びＮＡＤＰＨ再生システムを含む予め加温した９０μＬの二次インキュベーション混合物に移して、１０倍希釈物を得た。次いで、二次インキュベーション混合物を３７℃で１５分間さらにインキュベートした後、７０μＬアリコートを取り出し、０．１μＭのブスピロン塩酸塩（内部標準）を含有する氷冷ＡＣＮを用いて急冷した。その試料を２７５５ｇ、４℃で３０分間遠心し、その上清を、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）の解析によるＯ－デスメチルアステミゾールの決定に用いた。陰性対照として、ＮＡＤＰＨ Ａを１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液で置き換えた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムは、ＡＢ ＳＣＩＥＸ ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００タンデム質量分析（ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＳ／ＭＳ）システム（ＡＢ ＳＣＩＥＸ、マサチューセッツ州フレーミングハム）とインターフェース接続されたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ超高圧液体クロマトグラフィー（ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＨＰＬＣ）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ）からなった。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムは、全てのクロマトグラフィーのピーク積分を行うＡｎａｌｙｓｔ １．４．２ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって制御した。ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ_１８カラム、１．７μＭ、２．１×５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）を用いて、クロマトグラフィー分離を達成した。カラム及び試料の温度を、それぞれ４５℃及び４℃に維持した。用いた移動相は、水に溶かした５ｍＭ酢酸アンモニウムの０．２％酢酸（溶媒Ａ）及びＡＣＮの０．２％酢酸（溶媒Ｂ）であった。それらを０．６ｍＬ／ｍｉｎの流速で送達した。溶出条件を以下のように最適化した。すなわち、線形グラジエント３０～９５％Ｂ（０～１．６０分）、９５％Ｂでのアイソクラティック（１．６１～１．９９分）、及び３０％Ｂでのアイソクラティック（２．００～２．５０分）。）とした。正のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）モードで４４５～１２１及び３８６～１２２への質量対電荷比（ｍ／ｚ）の多重反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：ＭＲＭ）トランジションを実施して、Ｏ－デスメチルアステミゾール及びブスピロンをそれぞれ検出した。ＭＳ源条件は、カーテンガス：２５ｐｓｉ、衝突ガス：中、イオンスプレー電圧：５５００Ｖ、温度：５５０℃、イオン源ガス１：５０ｐｓｉ、イオン源ガス２：５５ｐｓｉであった。Ｏ－デスメチルアステミゾール及びブスピロンの化合物依存的質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＳ）パラメータを表２にまとめる。

（Ｃ）速度論的パラメータの計算。不活性化の速度論的パラメータを計算するために、３組のピーク面積比の平均をプレインキュベーション時間に対して０分に正規化した。プローブ活性の残存百分率を計算し、自然対数活性をプレインキュベーション時間に対してプロットした。データを線形回帰にフィットさせた。グラフの傾きにより、観察された不活性化の速度（Ｋ_ｏｂｓ）が決定される。速度論的パラメータＫ_Ｉ及びｋ_{ｉｎａｃｔ}、並びに不活性化の能力、ｋ_{ｉｎａｃｔ}／Ｋ_Ｉを、式１及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０１（カリフォルニア州サンディエゴ）を用いた非線形最小二乗回帰法を用いて計算した。ここで、ｋ_{ｉｎａｃｔ}は最大不活性化速度定数を表し、Ｋ_Ｉは不活性化速度定数の最大半値における阻害剤の濃度であり、［Ｉ］はインビトロ不活性化剤濃度である。

結果を図１０に示す。

（Ｄ）臨床的に関連するプローブ基質リバーロキサバンをプローブ基質として用いた、ドロネダロン、ポイエンダロン、及び追加的重水素化ドロネダロン類似体によるＣＹＰ２Ｊ２の時間依存的及び濃度依存的な不活性化。ドロネダロン、ポイエンダロン、化合物２、及び化合物３によるヒト組換えＣＹＰ２Ｊ２の不活性化を、プローブ基質としてリバーロキサバンを用いて調べた。９６ウェルプレートにおいて、３組でインキュベーションを行った。様々な濃度の阻害剤（０～２０μＭ）を含む一次インキュベーション混合物を、リン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）中で、ＣＹＰ４５０酵素（２０ｐｍｏｌ／ｍＬ）及びＮＡＤＰＨ Ｂと共に３７℃で３分間プレインキュベートした。酵素反応を開始するために、５μＬのＮＡＤＰＨ Ａを一次インキュベーションに添加した。最終的な一次インキュベーション混合物の体積は１００μＬであり、含有される有機溶媒は＜１％ｖ／ｖであった。ＮＡＤＰＨ Ａの添加後の異なるプレインキュベーション時点（３分、８分、１５分、２２分、３０分、及び４５分）で、一次インキュベーションの５μＬアリコートを、５０μＭのリバーロキサバン、ＮＡＤＰＨ Ａ及びＮＡＤＰＨ Ｂ、並びにリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）を含有する９５μＬの二次インキュベーションに移して、２０倍希釈液を得た。二次インキュベーション混合物をＣＹＰ２Ｊ２と共に３７℃で３０分間インキュベートした後、８０μＬアリコートを取り出し、ＩＳとして４μＭのデキサメタゾンを含有する等しい体積の氷冷ＡＣＮで急冷した。次いで、試料を４℃で３０分間、３２２０ｇで遠心した後、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）解析のために、上清を９６ウェルプレートに移した。主なリバーロキサバン代謝産物、モルホリノンヒドロキシル化代謝産物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析を用いて定量した。

（Ｅ）不活性化の速度論的パラメータ（Ｋ_Ｉ及びｋ_{ｉｎａｃｔ}）の計算
各濃度及びプレインキュベーション時間についての３組のピーク面積比の平均を、同じプレインキュベーション時間で０μＭのピーク面積比に対して正規化した。二次インキュベーション中に形成されたリバーロキサバン代謝産物の量（残存しているプローブ基質活性の尺度）をコンピュータ計算し、この尺度の自然対数を、各不活性化剤濃度についての不活性化プレインキュベーション時間に対してプロットした。次いで、各濃度について、データを線形回帰モデルにフィットさせることにより、ｋ_ｏｂｓ（見かけの不活性化速度定数）を線形回帰の負の勾配として得た。不活性化剤濃度（［Ｉ］）に対するｋ_ｏｂｓのプロットにより、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を用いて、式１に基づく非線形最小二乗回帰に不活性化速度論的パラメータ（以下に説明するＫ_Ｉ及びｋ_{ｉｎａｃｔ}）をフィットさせた。

式１において、ｋ_{ｉｎａｃｔ}＝無限不活性化剤濃度での最大不活性化速度定数（ｍｉｎ^－１）、Ｋ_Ｉ＝不活性化の最大半値の速度定数における不活性化剤の濃度（μＭ）、［Ｉ］＝インビトロ不活性化剤濃度（μＭ）。ヒト組換えＣＹＰ２Ｊ２に対するＭＢＩ能力（ｋ_{ｉｎａｃｔ}／Ｋ_Ｉ比、μＭ－１．ｍｉｎ－１）を、各化合物について決定する。ｋ_{ｉｎａｃｔ}／Ｋ_Ｉ比が高いほど、ＭＢＩ能力は大きくなる。

結果を図１１及び図１２に示し、表３にまとめる。

ＨｉＰＳＣ－ＣＭにおけるヒトＣＹＰ２Ｊ２及びｓＥＨ ｍＲＮＡのインビトロ発現、並びにアミオダロン、ドロネダロン、及びポイエンダロンによるｈｉＰＳＣ－ＣＭにおけるヒトＣＹＰ２Ｊ２のインビトロ阻害
（Ａ）試薬。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用のＡＣＮ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、Ｔｅｄｉａ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．（オハイオ州フェアフィールド）から購入した。ドロネダロン塩酸塩、アミオダロン塩酸塩、アステミゾール、及びブスピロン塩酸塩を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ浄水システムを、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（マサチューセッツ州ビレリカ）から入手した。ポイエンダロン塩酸塩は、本明細書に詳述する合成に従って、社内で合成した。他の全ての試薬は分析用のものであった。ドロネダロン、ポイエンダロン、アステミゾール、及びブスピロンの原液を、－２０℃で保存したＤＭＳＯ中で調製した。

（Ｂ）細胞株及び培養。ヒト包皮線維芽細胞を、ウイルスを含まない方法を用いて、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を形成するように再プログラム化した。ｈｉＰＳＣ細胞株を、以前に報告されたように^１心筋細胞（ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）に分化させた。

（Ｃ）全ＲＮＡ抽出及び定量的遺伝子発現。ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ドイツ、ヒルデン）を用いて、３０日齢のｈｉＰＳＣ－ＣＭから全ＲＮＡを単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、単離したＲＮＡを定量した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ第一鎖合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、１μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡ鋳型を、ＤＮＡ結合剤としてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ色素を含むＱｕａｎｔｉｆａｓｔ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ドイツ、ヒルデン）を用いたＰＣＲに用いた。Ｂｉｏｒａｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）サーモサイクラーを用いて、ＰＣＲを以下の条件で行った。すなわち、５５℃で２分、９５℃で５分、続いて伸長のために９５℃で１０秒及び６０℃で３０秒の４０サイクルで行った。プライマー二量体を確認するために鋳型対照を実行しなかった。内因性対照としてＧＡＰＤＨを用いたΔＣｔ法を用いて、相対定量化を実施した。ＰＣＲ産物を６×ローディング色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）と混合し、１×ＧｅｌＲｅｄ（商標）核酸染色剤（Ｂｉｏｔｉｕｍ、カリフォルニア州フリーモント）を含む１×ＴＡＥ緩衝液（Ｖｉｖａｎｔｉｓ、マレーシア、スバン・ジャヤ）中で調製した３％アガロースゲルにローディングした。分子量マーカーとして、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ ＤＮＡラダー（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）を用いた。Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ（商標）（Ｂｉｏ Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）画像処理ソフトウェアを伴ったＧｅｌ Ｄｏｃ（商標）ＥＺ（Ｂｉｏ ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて、分解されたｃＤＮＡ試料を解析した。ヒト心筋細胞では、ＣＹＰ２Ｊ２及びｓＥＨは、ＣＹＰ２Ｊ２遺伝子及びＥＰＨＸ２遺伝子によってコード化されている。ＧＡＰＤＨを内因性対照として用いた。ＣＹＰ２Ｊ２、ＥＰＨＸ２、及びＧＡＰＤＨの順方向プライマー配列および逆方向プライマー配列を、表４にまとめる。

（Ｄ）ＣＹＰ２Ｊ２媒介アステミゾール代謝の阻害。ＨｉＰＳＣ－ＣＭを１００，０００個の細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートに播種し、３０日間分化させた。分化後、ｈｉＰＳＣ－ＣＭを、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下、３７℃で２４時間、ＥＢ２培地において、ドロネダロン、アミオダロン、又はポイエンダロン（２μＭ）、及びアステミゾール（１μＭ）と共にインキュベートした。次いで、その細胞を１×リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）で２回洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）細胞剥離液を用いて除去した。次いで、その細胞を、２０００ｇ、４℃で、１０分間かけてペレット化した。上清を捨て、内部標準として０．１μＭのブスピロンを含む１００μＬの氷冷ＡＣＮに、ペレットを再懸濁した。細胞を氷上で１５分間超音波処理して、完全な細胞溶解を生じさせた。溶解物を１０，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心した。上清を回収し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。

（Ｅ）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる残留ＣＹＰ２Ｊ２酵素活性の測定。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムは、ＡＢ ＳＣＩＥＸ ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）システム（ＡＢ ＳＣＩＥＸ、マサチューセッツ州フレーミングハム）とインターフェース接続されたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ超高圧液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ）からなった。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムは、全てのクロマトグラフィーのピーク積分を行うＡｎａｌｙｓｔ １．４．２ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって制御した。ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ_１８カラム、１．７μＭ、２．１×５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）を用いて、クロマトグラフィー分離を達成した。カラム及び試料の温度を、それぞれ４５℃及び４℃に維持した。移動相は、５ｍＭ酢酸アンモニウムの０．２％酢酸（溶媒Ａ）及びＡＣＮの０．２％酢酸（溶媒Ｂ）であった。それらを０．６ｍＬ／ｍｉｎの流速で送達した。溶出条件を以下のように最適化した。すなわち、線形グラジエント３０～７０％Ｂ（０～１．６０分）、７０％Ｂでのアイソクラティック（１．６１～１．９９分）、及び３０％Ｂでのアイソクラティック（２．００～２．５０分）とした。ｍ／ｚ比のＭＲＭトランジションを正のＥＳＩモードで実施して、Ｏ－デスメチルアステミゾール及びブスピロン（内部標準）を検出した。化合物依存性のＭＳパラメータを表２にまとめる。

（Ｆ）データ解析。アミオダロン、ドロネダロン、及びポイエンダロンの間で、二元配置の分散分析（ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ：ＡＮＯＶＡ）、続いてテューキーの事後検定を用いて比較を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、平均±Ｓ．Ｄとして各値を提示した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＃ｐ＜０．０００１の場合で、統計学的有意性が確認された。

結果を図１３に示す。

ポイエンダロン及びドロネダロンの細胞傷害性測定
（Ａ）試薬。ドロネダロン塩酸塩及び全トランス型レチノイン酸（ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ：ＡＴＲＡ）を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ポイエンダロン塩酸塩を社内で合成した。１４，１５－ＥＥＴをＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ミシガン州アナーバー）から購入した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ浄水システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビレリカ）を用いて水を得た。他の全ての試薬は分析用のものであった。

（Ｂ）Ｈ９ｃ２細胞培養。Ｈ９ｃ２細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ））から購入した。１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、２５ｍＭのヘペス、１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、シンガポール）、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び２５０ｎｇ／ｍＬのアンホテリシンＢを補充した低グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）の増殖培地（カタログ番号：３１６００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）において、７５ｃｍ^２組織培養フラスコ中、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下で細胞を培養した。２～３日ごとに細胞に栄養を与え、７０～８０％の培養密度に達したところで継代培養して、分化能の喪失を防いだ。分化のために、Ｈ９ｃ２細胞を１００，０００個の細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートに播種した。細胞を低グルコース高血清増殖培地中で１日維持して、細胞を付着させた。その後、１μＭのＡＴＲＡを用いて細胞を分化させた。

（Ｃ）同時発生の細胞傷害性及び細胞内ＡＴＰの低減。Ｈ９ｃ２細胞を白色チムニープレートに播種し、分化させた。クラブトリー効果を克服するために、１０ｍＭのガラクトース、２ｍＭのグルタミン（最終濃度６ｍＭ）、５ｍＭのヘペス、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ、１％のＦＢＳ、１×インスリン－トランスフェリン－セレン、及び１μＭのＡＴＲＡを含むＤＭＥＭに、４８時間で培地を交換した。無血清ガラクトース培地において、ドロネダロン又はポイエンダロン（０～３０μＭ）で細胞を６時間処理した。Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＴｏｘＧｌｏ（商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、細胞傷害性及び細胞内ＡＴＰ含有量を、製造者のプロトコルを用い同時に測定した。Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＴｏｘＧｌｏ（商標）アッセイは、蛍光発生ペプチドのビス－アラニン－アラニン－フェニルアラニン－Ｒ１１０（ビス－ＡＡＦ－Ｒ１１０）を用いて細胞生存率を測定する。ビス－ＡＡＦ－Ｒ１１０は、生細胞に対して不透過性であるため、死細胞におけるプロテアーゼ活性を測定する選択的ペプチドである。ここで、代謝されたビス－ＡＡＦ－Ｒ１１０に由来する蛍光を、異なる濃度の試験化合物で測定し、対照と比較した。細胞傷害性化合物の濃度が増加するにつれて、死細胞の数が増加し、より高い蛍光シグナルをもたらす。ＡＴＰは、細胞溶解をもたらして、存在するＡＴＰの量に比例した発光シグナルを生成させるＡＴＰ検出試薬を添加することによって測定される。分化したＨ９ｃ２細胞を、無血清ガラクトース培地において、様々な濃度（０～１μＭ）の１４，１５－ＥＥＴで２時間、前処理した。培地を吸引し、細胞をドロネダロンで処理し、細胞傷害性及び細胞内ＡＴＰを記載のように測定した。

（Ｄ）ミトコンドリア膜電位（Δψ_ｍ）の測定。ミトコンドリア透過性色素、テトラメチルローダミンメチルエステル過塩素酸塩（ＴＭＲＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、各試験化合物によるΔψ_ｍの散逸を測定した。Ｈ９ｃ２細胞を、１ウェルあたり２０，０００個の細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。無血清低グルコース培地において、いずれかのドロネダロンで細胞を１時間処理した。培地を捨て、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄した。ＴＭＲＭ色素（２００ｎＭ）を無血清培地に溶解し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、５５７ｎｍの励起波長及び５７０ｎｍの発光波長で蛍光を測定した。ＴＭＲＭ濃度及び細胞密度を最適化した。分化したＨ９ｃ２細胞を、様々な濃度（０～１μＭ）の１４，１５－ＥＥＴで２時間、前処理した。培地を吸引し、次いで細胞をドロネダロンで処理し、ＡＡＤによるΔψ_ｍの散逸を記載のように測定した。

結果を図１４に示す。

アミオダロン、ドロネダロン、及びポイエンダロンによって誘発されたＨｉＰＳＣ－ＣＭの細胞外フィールド電位持続時間（Ｆｉｅｌｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｄｕｒａｔｉｏｎ：ＦＰＤ）の測定
（Ａ）電気生理学的測定。ｈｉＰＳＣ－ＣＭの電気生理学的摂動を、多電極アレイ（ｍｕｌｔｉ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ａｒｒａｙ：ＭＥＡ）記録システムＭｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ、ロイトリンゲン）を用いて測定した。２ｍＬの培地に投与したアミオダロン、ドロネダロン、又はアミオダロン（０～１０μＭ）でＨｉＰＳＣ－ＣＭを処理し、細胞外フィールド電位持続時間（ＦＰＤ）を既述のように測定した^２。既述のように、バゼット（Ｂａｚｚｅｔ）補正式：ｃＦＰＤ＝ＦＰＤ／√（ＲＲ間隔）で、収縮領域の拍動数に対してＦＰＤ測定値を正規化した（補正ＦＰＤ［ｃＦＰＤ］）^３。一相減衰アルゴリズムを用いて、補正されたＦＰＤ曲線をプロットした。

結果を図１５に示す。

（Ｂ）細胞培養及びトランスフェクション（Ｎａ_Ｖ１．５電流）。１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地においてＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を培養し、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で維持した。トランスフェクションのために、カバーガラスを備えたペトリ皿に細胞を播種し、一晩増殖させる。続いて、３．０μｇの野生株又は変異株のｈＮａ_Ｖ１．５チャネルのプラスミド及び１．５μｇのβ１プラスミドを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって細胞に同時にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、パッチクランプ解析の前に、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で２４時間増殖させ、パッチクランプ解析の２４時間前に、ポリＤコートのカバーガラス上に分割して播種した。

（Ｃ）ホールセル・パッチクランプ記録及びデータ解析。Ｎａ_Ｖ１．５電流を記録するために、内部溶液（ピペット溶液）は、ｍＭ単位で、１３０のＣｓＦ、５のＮａＣｌ、５のエチレングリコールビス２アミノエチルエーテル四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｂｉｓ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＥＧＴＡ）、１０のヘペス、２のＭｇＣｌ_２、２のテトラエチルアンモニウムクロリド（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＴＥＡ－Ｃｌ）、ｐＨ７．２（ＣｓＯＨで調整）を含有した。外部溶液は、ｍＭ単位で、１３５のＮａＣｌ、４．２のＣｓＣｌ、１．２のＭｇＣｌ_２、１．８のＣａＣｌ_２、１０のヘペス、及びグルコースを含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した。Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ又はＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ ２００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて電圧固定下でホールセル電流を得、ローパスフィルタリングを５～６ｋＨｚで行い、典型的には、＞７０％補償後に直列抵抗は＜５ＭΩであった。Ｐ／４プロトコルを用いて、リークトランジェント及び容量性トランジェントをオンラインで差し引いた。用量応答曲線を、ｌｏｇ（阻害剤）対応答変数勾配方程式、Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ－Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０－Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））でフィットした。

結果を図１６、図１７、及び図１８に示す。

（Ｄ）細胞培養及びトランスフェクション（Ｃａ_Ｖ１．２電流）。１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地においてＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を培養し、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で維持した。トランスフェクションのために、カバーガラスを備えたペトリ皿に細胞を播種し、一晩増殖させる。その後、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、１．７μｇのヒトＣａ_Ｖ１．２＿１ａ８ａ心臓変異体及び１．２５μｇのヒトβ２及びα２δ１サブユニットを得た。トランスフェクトした細胞を、パッチクランプ解析の前に、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で２４時間増殖させ、パッチクランプ解析の２４時間前に、ポリＤコートのカバーガラス上に分割して播種した。

（Ｅ）ホールセル・パッチクランプ記録及びデータ解析。Ｃａ_Ｖ１．２電流を記録するために、内部溶液（パッチピペット溶液）は、以下を含有した。すなわち、ｍＭ単位で、１３８のＣｓ－ＭｅＳＯ_３、５のＣｓＣｌ、５．０のＥＧＴＡ、１０のヘペス、１のＭｇＣｌ_２、２ｍｇ／ｍｌのＭｇ－ＡＴＰを含有し、ｐＨ７．３（ＣｓＯＨで調整）、グルコースで２９０ｍＯｓｍであった。外部溶液は以下を含有した。すなわち、ｍＭ単位で、１０のヘペス、１４０のテトラエチルアンモニウムメタンスルホナート、５のＣａＣｌ_２（ＣｓＯＨでｐＨを７．４に調整、グルコースで浸透圧を２９０～３１０に調整）を含有した。抵抗１．５～２ＭΩのピペットを用いた。Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ又はＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ ２００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて電圧固定下でホールセル電流を得、ローパスフィルタリングを１ｋＨｚで行い、典型的には、＞７０％補償後に直列抵抗は＜５ＭΩであった。Ｐ／４プロトコルを用いて、リークトランジェント及び容量性トランジェントをオンラインで差し引いた。用量応答曲線を、ｌｏｇ（阻害剤）対応答変数勾配方程式、Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ－Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０－Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））でフィットした。

結果を図１９、図２０、及び図２１に示す。

（Ｆ）細胞培養及びトランスフェクション（Ｋ_ｖ１１．１電流）。１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地においてＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を培養し、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で維持した。トランスフェクションのために、細胞をペトリ皿に播種し、一晩増殖させる。続いて、２μｇの野生株又は変異株のＫ_ｖ１１．１チャネルのプラスミド及び１μｇのＫＣＮＥ１プラスミドを、リポフェクタミン２０００によって細胞に同時にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で２４時間インキュベートした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を分割し、記録の１日前にポリ－Ｄリジンのカバーガラス上に播種した。

（Ｇ）ホールセル・パッチクランプ記録及びデータ解析。Ｋ_ｖ１１．１電流を記録するために、内部溶液（ピペット溶液）は、ｍＭ単位で、１３０のＫ－グルコン酸、１０のＫＣｌ、５のＥＧＴＡ、１０のヘペス、１のＭｇＣｌ_２、０．５のＮａ_３ＧＴＰ、４のＭｇ－ＡＴＰ、Ｎａ－ホスホクレアチン ｐＨ７．４（ＫＯＨで調整）を含有した。外部溶液は、ｍＭ単位で、１２５のＮａＣｌ、２．５のＫＣｌ、２５のＮａ－グルコン酸、１．０のＭｇＣｌ_２、１．８のＣａＣｌ_２、１０のヘペス、及び１１．１のグルコースを含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した。Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ又はｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ２００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて電圧固定下でホールセル電流を得、ローパスフィルタリングを１ｋＨｚで行い、典型的には、＞７０％補償後に直列抵抗は＜５ＭΩであった。Ｐ／４プロトコルを用いて、リークトランジェント及び容量性トランジェントをオンラインで差し引いた。Ｋ_ｖ１１．１電流を、－８０ｍＶの保持電位から２．５ｓパルスの２０ｍＶまで誘起した。その後、電圧を－６０ｍＶに戻してテール電流を記録した。用量応答曲線を、ｌｏｇ（阻害剤）対応答変数勾配方程式、Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ－Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０－Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））でフィットした。

結果を図２２、図２３、及び図２４に示す。

アミオダロン、ドロネダロン、及びポイエンダロンによって誘発されたＨｉＰＳＣ－ＣＭにおける拍動間変動（ＢＢＶ）のインビトロ測定
（Ａ）ＢＢＶの測定。ＢＢＶの計算は、Ｋｕｂｉｏｓ ＨＲＶ ２．２（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅａｓｔｅｒｎ Ｆｉｎｌａｎｄ、クオピオ、フィンランド）^４を用いて行った。ＢＢＶは、ポアンカレプロットとして知られる散布図として視覚化される。これらのプロットでは、２つの連続する拍動間の各時間間隔［拍動間の間隔（ＲＲ_ｎ）］が、後続の間隔（ＲＲ_ｎ＋１）に対してプロットされる。ポアンカレプロット記述子、ＳＤ１及びＳＤ２は、変動の程度を定義する。ＳＤ１は短期変動の尺度を表すのに対して、ＳＤ２は長期変動を表す^５。

結果を図２５に示す。

イヌにおけるドロネダロン及びポイエンダロンのインビボ薬物動態研究
（Ａ）試薬。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用のアセトニトリル（ＡＣＮ）を、Ｔｅｄｉａ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．（オハイオ州フェアフィールド）から購入した。ドロネダロン塩酸塩をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。Ｎ－デスエチルアミオダロン（ＮＤＥＡ）塩酸塩をＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ミシガン州アナーバー）から購入した。ポイエンダロン塩酸塩は、本明細書に詳述する合成に従って、社内で合成した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ浄水システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビレリカ）を用いて水を得た。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をＶＷＲ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ（米国、ペンシルベニア州）から購入した。

（Ｂ）血漿試料。各化合物（ドロネダロン又はポイエンダロン）について、北山ラベス株式会社（日本、長野県）からの体重およそ１０ｋｇの雄イヌ４匹より血漿試料を得た。全ての実験は、東邦大学の動物実験委員会（第１２－５２－１５１号）によって承認され、東邦大学の動物実験取扱規程に従って行われた。３．０ｍｇ／ｋｇのドロネダロン又はポイエンダロンの静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ：ＩＶ）ボーラス投与について、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、及び６０分で、血漿試料を得た。血漿試料を－８０℃で保存し、使用前に氷中で解凍した。

（Ｃ）試料調製。血漿：ＩＳ比が１：３でのタンパク質沈殿のために、氷冷ＮＤＥＡ内部標準（ＩＳ）溶液を用いた。混合物を１分間ボルテックス混合した後、４℃、１４，０００ｇで１５分間遠心した。次いで、上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のためにバイアルに移した。

（Ｄ）機器。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムは、ＡＢ ＳＣＩＥＸ ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）システム（ＡＢ ＳＣＩＥＸ、マサチューセッツ州フレーミングハム）を備えたＩｎｆｉｎｉｔｙ超高圧液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ）からなった。ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔソフトウェアバージョン１．４．０．１８０６７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、全てのクロマトグラフィーピーク積分を行った。

（Ｅ）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件。クロマトグラフィー分離は、グラジエント溶出プログラムで、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ_１８カラム、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）を用いて行った。移動相は、水に溶かした５ｍＭ酢酸アンモニウムの０．２％酢酸（Ａ）及びＡＣＮの０．２％酢酸（Ｂ）であった。溶出条件は、線形グラジエント３０～９５％Ｂ（０～１．６０分）、９５％Ｂでのアイソクラティック（１．６１～１．９９分）、３０％Ｂでのアイソクラティック（２．００～２．５０分）であった［２１］。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションを、ＮＤＥＡ（内部標準、ＩＳ）、ドロネダロン、及びポイエンダロンについて最適化した。他のＭＳ条件を表５に列挙する。

（Ｆ）非コンパートメント解析（ｎｏｎ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＮＣＡ）を用いた薬物動態パラメータの導出。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、米国）を用いて、ＩＶボーラスデータ（モデル２０１）についてＮＣＡを用い、個々の薬物動態パラメータを推定した。時間０分から最後の観察時間までの曲線下面積（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ：ＡＵＣ）及び無限大に外挿したＡＵＣ（ＡＵＣｉｎｆ）を、対数台形則を用いて計算した。ラムダＺ（λｚ）の計算に含まれるデータ点は、最初にＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）によって決定され、次いでそれに応じて視覚的に評価及び修正された。計算される他のパラメータには、見かけの全血漿クリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ：ＣＬ）、終末相に基づく見かけの分布容積（Ｖ_ｚ）、見かけの排出半減期（Ｔ_１／２）、定常状態での見かけの容積（Ｖ_ｓｓ）、平均滞留時間（ｍｅａｎ ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｔｉｍｅ：ＭＲＴ）、及び無限大に外挿したＭＲＴ（ＭＲＴｉｎｆ）が含まれる。Ｖ_ｓｓは、全てのコンパートメントにわたる血漿濃度が定常状態の条件に達したときの見かけの分布容積である。次いで、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）を用いて各薬物をコンパートメントモデルにフィットさせて、個々の消失モデル（ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ）を可視化した。

（Ｇ）統計解析。薬物動態パラメータを対数変換し、対数変換データの分布は正規分布であると仮定した。一元配置ＡＮＯＶＡの場合、帰無仮説は、ドロネダロンとポイエンダロンとの間で平均薬物動態パラメータ推定値（ＣＬ及びＶ_ｚ）の各々に差がないということであった。全ての統計的検定を、ＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ、バージョン２５．０（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ、ニューヨーク州アーモンク）を用いて行った。

結果を図２６に示す。

ポイエンダロンとドロネダロンのインビボ薬物動態の比較
（Ａ）化学物質。高速液体クロマトグラフィー用のアセトニトリル（ＡＣＮ）を、Ｔｅｄｉａ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．（オハイオ州フェアフィールド）から購入した。ドロネダロン塩酸塩及びデキサメタゾンをＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手した。ポイエンダロン塩酸塩を社内で合成した。プールヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）、組換えヒトＣＹＰ４５０ Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ、並びにＮＡＤＰＨ Ａ（ＮＡＤＰ^＋及びグルコース－６－リン酸）及びＮＡＤＰＨ Ｂ（グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ）からなる還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）再生系を、ＢＤ Ｇｅｎｔｅｓｔ（マサチューセッツ州ウ－バン）から得た。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ浄水システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビレリカ）を用いて水を得た。他の全ての試薬は分析用のものであった。

（Ｂ）代謝安定性研究。代謝安定性実験を行って、基質枯渇法によって固有クリアランス（ＣＬ_ｉｎｔ）値を導出した。１μＭのドロネダロン又はポイエンダロンを、リン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）中のＣＹＰ３Ａ４（１０ｐｍｏｌ／ｍＬ）、ＣＹＰ３Ａ５（１０ｐｍｏｌ／ｍＬ）、又はＨＬＭ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、及びＮＡＤＰＨ Ｂと共に、３７℃で５分間プレインキュベートした。その後、ＮＡＤＰＨ Ａを添加して反応を開始した。最終的なインキュベーション混合物の体積は１００μＬであり、含有される有機溶媒は＜１％ｖ／ｖであった。反応混合物を穏やかに撹拌しながら３７℃でインキュベートした。それぞれの時点（０～６０分）で、８０μＬの反応混合物を、内部標準（ＩＳ）として１μＭタモキシフェンを含んだ等容量の氷冷ＡＣＮを用いて急冷した。次いで、試料を４℃で３０分間、３２２０ｇで遠心した後、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）解析のために、上清を９６ウェルプレートに移した。

結果を図２７に示す。

（Ｃ）ＣＬ_ｉｎｔ値の計算。各化合物の３組のピーク面積比の平均を、０分の時点での同じ化合物のピーク面積比に対して正規化して、各時点で残存している基質の百分率を得た。これを各化合物のインキュベーション時間に対してプロットし、次いで、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、データを一相減衰モデルにフィットさせて、排出速度定数（ｋ）の推定値を得た。次いで、ＣＬ_ｉｎｔを式３に基づいて計算した。

式３において、ｋ＝排出速度定数（ｍｉｎ^－１）、Ｖ＝インキュベーション混合物の体積（ｍＬ）、Ｐ＝混合物中のタンパク質の量（ｍｇ）。

結果を表６に示す。

（Ｄ）ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ５の時間依存的及び濃度依存的な不活性化。ドロネダロン、ポイエンダロンによるヒト組換えＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ５の不活性化を、プローブ基質としてリバーロキサバンを用いて調べた。９６ウェルプレートにおいて、３組でインキュベーションを行った。様々な濃度の阻害剤（０～２０μＭ）を含む一次インキュベーション混合物を、リン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）中で、ＣＹＰ３Ａ４又はＣＹＰ３Ａ５（２０ｐｍｏｌ／ｍＬ）及びＮＡＤＰＨ Ｂと共に３７℃で３分間プレインキュベートした。酵素反応を開始するために、５μＬのＮＡＤＰＨ Ａを一次インキュベーションに添加した。最終的な一次インキュベーション混合物の体積は１００μＬであり、含有される有機溶媒は＜１％ｖ／ｖであった。ＮＡＤＰＨ Ａの添加後の異なるプレインキュベーション時点（３分、８分、１５分、２２分、３０分、及び４５分）で、一次インキュベーションの５μＬアリコートを、５０μＭのリバーロキサバン、ＮＡＤＰＨ Ａ及びＮＡＤＰＨ Ｂ、並びにリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）を含有する９５μＬの二次インキュベーションに移して、２０倍希釈液を得た。二次インキュベーション混合物をＣＹＰ３Ａ４又はＣＹＰ３Ａ５と共に３７℃で２分間インキュベートした後、８０μＬアリコートを取り出し、ＩＳとして４μＭのデキサメタゾンを含有する等しい体積の氷冷ＡＣＮで急冷した。次いで、試料を４℃で３０分間、３２２０ｇで遠心した後、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）解析のために、上清を９６ウェルプレートに移した。主なリバーロキサバン代謝産物、モルホリノンヒドロキシル化代謝産物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析を用いて定量した。

（Ｅ）不活性化の速度論的パラメータ（Ｋ_Ｉ及びｋ_{ｉｎａｃｔ}）の計算。各阻害剤濃度及びプレインキュベーション時間についての３組のピーク面積比の平均を、同じプレインキュベーション時間で阻害剤０μＭのピーク面積比に対して正規化した。二次インキュベーション中に形成されたリバーロキサバン代謝産物の量（残存しているプローブ基質活性の尺度）をコンピュータ計算し、この尺度の自然対数を、各不活性化剤濃度についての不活性化プレインキュベーション時間に対してプロットした。次いで、各濃度について、データを線形回帰モデルにフィットさせることにより、ｋ_ｏｂｓ（見かけの不活性化速度定数）を線形回帰の負の勾配として得た。不活性化剤濃度（［Ｉ］）に対するｋ_ｏｂｓのプロットにより、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を用いて、式４に基づく非線形最小二乗回帰に不活性化速度論的パラメータ（以下に説明するＫ_Ｉ及びｋ_{ｉｎａｃｔ}）をフィットさせた。

式４において、ｋ_{ｉｎａｃｔ}＝無限不活性化剤濃度での最大電位不活性化速度定数（ｍｉｎ^－１）、Ｋ_Ｉ＝不活性化の最大半値の速度定数（μＭ）、［Ｉ］＝インビトロ不活性化剤濃度（μＭ）。

結果を表６に示す。

（Ｆ）生理学的薬物動態（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ－ｂａｓｅｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ：ＰＢＰＫ）モデルの開発。Ｓｉｍｃｙｐシミュレータ（バージョン１９．０．９６．０、英国、シェフィールド）を用いて、ドロネダロン及びポイエンダロンのＰＢＰＫモデルを構築した。文献からの情報として、Ｓｉｍｃｙｐに実装された重要な薬物依存性パラメータを下の表７に列挙する。ドロネダロンのＰＢＰＫモデルの構築は、インビトロ実験及び観察された臨床パラメータからのデータを組み合わせたミドルアウト手法を用いて行った。

結果を図２８に示す。

（Ｇ）ＰＢＰＫモデルの検証。Ｓｉｍｃｙｐシミュレータを用い、２つのスケーリング因子（肝臓１グラムあたりのタンパク質のミリグラム数（ｍｉｌｌｉｇｒａｍｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｅｒ ｇｒａｍ ｏｆ ｌｉｖｅｒ：ＭＰＰＧＬ）並びに平均肝臓重量）により、ＣＬ_ｉｎｔ値及びｆ_{ｕ，ｍｉｃ}値をスケーリングして、非結合型肝固有クリアランスＣＬ_{ｕ，ｉｎｔ，Ｈ}を得た。肝クリアランスのｗｅｌｌ－ｓｔｉｒｒｅｄモデルを適用して、肝血液クリアランス、ＣＬ_ｂ，Ｈを計算し、続いて、これを血液対血漿の濃度比（ｂｌｏｏｄ－ｔｏ－ｐｌａｓｍａ：Ｂ／Ｐ）並びに代謝された割合（ｆ_ｍ）によって血漿クリアランスに変換した。

採用した仮想集団は、シミュレーションを検証するために用いた選択的臨床治験の年齢に一致するように、最大年齢を６７に変更したことを除いて、Ｓｉｍ－Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒであった。各投与レジメン（例えば、静脈内、単回経口投与、複数回経口投与）についてのシミュレートされた血漿濃度－時間プロファイルを生成し、ＷｅｂＰｌｏｔＤｉｇｉｔｉｚｅｒ（バージョン４．２）を用いて、公表された平均血漿濃度・時間データのデジタル化によって得られた臨床データと比較した。予測した薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ：ＰＫ）パラメータの妥当性を、可能であれば、Ａｂｄｕｌｊａｌｉｌら^９によって概説された方法を用いて、生成された妥当性の範囲と比較した。成功基準をコンピュータ計算できなかった場合、標準的な０．５倍対２倍の比を用いた。

結果を図２９に示す。

ドロネダロン及びポイエンダロンのｃＬｏｇＰ、水溶解度、有効透過率、及びインビトロ代謝半減期の測定
（Ａ）アッセイ。ドロネダロン及びポイエンダロンの計算Ｌｏｇ Ｐ（ｃＬｏｇＰ）は、ＣｈｅｍＳｋｅｔｃｈを用いてコンピュータ処理で計算した。Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ_ＨＴＳ ＰＣＦフィルタープレートを用いて、汎用の緩衝液（ｐＨ７．４）中で各化合物の水溶解度を測定した。並行人工膜透過率アッセイ（ｐａｒａｌｌｅｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ：ＰＡＭＰＡ）を用いて、各化合物の有効透過率を測定した。最後に、１μＭのドロネダロン及び１μＭのポイエンダロンのインビトロ代謝半減期（Ｔ_１／２）を、組換えヒトＣＹＰ２Ｊ２を用いて測定した。

結果を表８に示す。

心房（ＡＥＲＰ）及び心室（ＶＥＲＰ）の不応期に対する抗不整脈薬の作用の比較、並びに早期（Ｊ－Ｔｐｅａｋｃ）及び後期（Ｔｐｅａｋ－Ｔｅｎｄ）の再分極期に対する抗不整脈薬の作用の比較
（Ａ）材料及び方法。各薬物（ドロネダロン、アミオダロン、及びポイエンダロン）について、体重およそ１０ｋｇの雌イヌで実験を行った（ｎ＝４）。北山ラベス株式会社（日本、長野県）を通じて動物を得た。全ての実験は、東邦大学動物実験委員会（第１８－５１－３９５号）によって承認され、東邦大学の動物実験取扱規程に従って実施された。

（Ｂ）全身麻酔及び手術準備。イヌを最初にチオペンタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で麻酔した。カフ付き気管内チューブで挿管した後、酸素中で気化したハロタン（１％ｖ／ｖ）を、体積制限人工呼吸器（ＳＮ－４８０－３、株式会社シナノ製作所（日本、東京都））で吸入することにより麻酔を維持した。一回呼吸量及び呼吸数は、それぞれ２０ｍＬ／ｋｇ及び１５呼吸／分に設定した。６つの臨床的に利用可能なカテーテル－シースセット（ＦＡＳＴ－ＣＡＴＨ（商標）４０６１１９、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄａｉｇ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．、米国、ミネソタ州）を用い、２本を腹部大動脈に向かって左右の大腿動脈にそれぞれ挿入し、２本を右大腿静脈に挿入し、残りの２本を下大静脈に向かって左大腿静脈に挿入した。血液凝固を防ぐため、ヘパリンカルシウム（１００ＩＵ／ｋｇ）を、右大腿静脈に据えたカテーテルシースのフラッシュラインを通して静脈内投与した。

（Ｃ）心臓血行動態変数。右大腿動脈を通してピッグテールカテーテルを左心室に据えて左室圧を測定したのに対し、カテーテルシースの内側とピッグテールカテーテルの外側との間の空間で、フラッシュラインを通して大動脈圧を測定した。ＥＣＧ上のＲ波のピークの一時点での左室圧を左室拡張末期圧と定義した。左室圧の最大上昇速度（ＬＶｄＰ／ｄｔ_ｍａｘ）及び左室拡張末期圧を洞調律中に得て、収縮力及び左心室に対する前負荷をそれぞれ推定した。熱希釈カテーテル（ＴＣ－５０４ ＮＨ、日本光電工業株式会社、日本、東京都）を、右大腿静脈を通して心臓の右側に配置した。心拍出量コンピュータ（ＭＦＣ－１１００、日本光電工業株式会社）を用いて、標準的な熱希釈法を用いて心拍出量を測定した。基本式：全末梢血管抵抗＝平均血圧／心拍出量を用いて、全末梢血管抵抗を計算した。

（Ｄ）電気生理学的変数。四肢電極からＩＩ誘導心電図を得た。Ｐ波持続時間、ＰＲ間隔、ＱＲＳ幅、及びＱＴ間隔を測定し、ＱＴ間隔をＶａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒの式：ＱＴｃ＝ＱＴ－０．０８７×（ＲＲ－１，０００）（ＲＲはｍｓ単位で得られる）で補正した。Ｊ－Ｔ_ｐｅａｋ及びＴ_ｐｅａｋ－Ｔ_ｅｎｄを以下のようにして測定した。Ｔ波の終了が不明瞭であった場合は、本発明者らは、ガイドとして単相性活動電位（ｍｏｎｏｐｈａｓｉｃ ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：ＭＡＰ）シグナルを用いて終了を推定した。既述の係数（Ｊ－Ｔ_ｐｅａｋｃ＝Ｊ－Ｔ_ｐｅａｋ／ＲＲ^０．５８（ＲＲは秒単位で得られる）で、心拍数についてＪ－Ｔ_ｐｅａｋを補正した。以前のＱＴ／ＱＴｃ研究では、Ｔ_ｐｅａｋ－Ｔ_ｅｎｄが安静時心拍数で最小心拍数依存性を示したことが示されているので、Ｔ_ｐｅａｋ－Ｔ_ｅｎｄに対しては補正を行わなかった。

標準的な６フレンチの４極電極カテーテル（Ｃｏｒｄｉｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒ Ｉｎｃ．、米国、カリフォルニア州ボールドウィンパーク）を、左大腿動脈を通し大動脈弁の非冠状動脈尖に配置して、Ｈｉｓ束電位図を得た。別の６フレンチの４極電極カテーテル（Ｃｏｒｄｉｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒ Ｉｎｃ．）を、右大腿静脈を通して右心房の洞結節領域に配置して、電気的にペーシングし、局所電位図を記録した。双方向操縦可能なＭＡＰ記録／ペーシングの組合せカテーテル（１６７５Ｐ、ＥＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国、カリフォルニア州）を、左大腿静脈を通して右心室の心室中隔の心内膜に配置して、ＭＡＰシグナルを得た。シグナルをＤＣ前置増幅器（モデル３００、ＥＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で増幅した。ＭＡＰシグナルの持続時間を、拡張期ベースラインに相当する水平線に沿って、ＭＡＰ上昇行程から所望の再分極レベルまでの間隔として測定した。９０％再分極での間隔（ｍｓ）をＭＡＰ_９０と定義した。

右心室に据えた組合せカテーテルのペーシング電極又は右心房に据えたカテーテルの電極を介して、心臓刺激装置（ＳＥＣ－３１０２、日本光電工業株式会社）で、心臓を電気的に駆動した。刺激パルスは、形状が矩形、１～２Ｖ（閾値電圧の約２倍）、及び持続時間１ｍｓであった。洞調律中（ＭＡＰ_{９０（ｓｉｎｕｓ）}）に、４００ｍｓ（ＭＡＰ_{９０（ＣＬ４００）}）及び３００ｍｓ（ＭＡＰ_{９０（ＣＬ３００）}）のペーシング周期長で心室のＭＡＰ_９０を測定した。心房有効不応期（ＡＥＲＰ）及び心室有効不応期（ＶＥＲＰ）を、プログラム電気刺激で評価した。ペーシングプロトコルは、４００ｍｓの周期長での５拍の基礎刺激と、それに続く様々な連結期の期外刺激からなった。拡張末期から開始して、追加刺激がもはや応答を誘発できなくなるまで、連結期を５ｍｓの減衰で短縮した。ＡＥＲＰ及びＶＥＲＰは、応答を生成することができる最短の連結期として定義した。活動電位の３相再分極時間を反映する心室の終末再分極期の持続時間を、同じ部位でのＭＡＰ_{９０（ＣＬ４００）}とＶＥＲＰ（終末再分極期＝ＭＡＰ_{９０（ＣＬ４００）}－ＶＥＲＰ）との差によって計算して、心室筋の電気的脆弱性の程度を推定した。

（Ｅ）実験プロトコル。大動脈圧、左室圧、心電図、右心房電位図、Ｈｉｓ束電位図、及びＭＡＰシグナルを、ポリグラフシステム（ＲＭ－６０００、日本光電工業株式会社）でモニターし、リアルタイム全自動データ解析システム（Ｗｉｎ ＶＡＳ ３ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ ｖｅｒ．１．１Ｒ２４ｖ、フィジオテック、日本、東京都）を用いて解析した。連続複合体の３つの記録を用いて、心電図表示のための平均、ＭＡＰ持続時間、並びに心房－Ｈｉｓ（ＡＨ）及びＨｉｓ－心室（ＨＶ）の各間隔を計算した。心血管変数を以下の順序で評価した。心電図、心房、及びＨｉｓ束電位図、大動脈圧、左室圧、及びＭＡＰシグナルを、洞調律下で記録した。次いで、心拍出量を３回測定した。次に、４００ｍｓ及び３００ｍｓの周期長での心室ペーシング中にＭＡＰシグナルを記録した。最後に、ＶＥＲＰ及びＡＥＲＰを測定した。上記の全てのパラメータは、通常、各時点で２分以内に得た。

基本評価後、左大腿静脈に据えたカテーテルシースを通して、０．３ｍｇ／ｋｇの低用量のポイエンダロン塩酸塩を３０秒かけて静脈内注入し、投与開始から５分、１０分、１５分、２０分、３０分後に各変数を評価した（ｎ＝４）。次いで、３ｍｇ／ｋｇの高用量のポイエンダロン塩酸塩を同じやり方で注入し、投与開始から５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、及び６０分後に各変数を観察した。本発明者らは、ポイエンダロン塩酸塩の現段階での用量を選択して、その電気薬理学的作用をドロネダロン塩酸塩の作用^６と直接比較した。

結果を表９及び表１０に示す。

発作性ＡＦイヌモデルにおける抗心房細動薬としてのポイエンダロンの心房電気薬理特性
（Ａ）動物。実験は、体重およそ１０ｋｇの雌ビーグル犬（ｎ＝４）を用いて行った。北山ラベス株式会社（日本、長野県）を通じて動物を得た。全ての実験は、東邦大学動物実験委員会（第１９－５２－３９５号）によって承認され、東邦大学の動物実験取扱規程に従って実施された。

（Ｂ）慢性房室ブロックのイヌの作製。房室結節のカテーテルアブレーション技術を既述^{１１、１４}のように用いた。ペントバルビタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）でイヌに麻酔をかけた。カフ付き気管内チューブで挿管した後、体積制限人工呼吸器（ＳＮ－４８０－３、株式会社シナノ製作所（日本、東京都）を用いて室内空気で呼吸を制御した。一回呼吸量及び呼吸数は、それぞれ２０ｍＬ／ｋｇ及び１５呼吸／分に設定した。血液凝固を防ぐために、ヘパリンカルシウム（１００ＩＵ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）を投与した。表面ＩＩ誘導心電図を連続的にモニターした。大きなチップを備えた４極電極カテーテル４ｍｍ（Ｄ７－ＤＬ－２５２、Ｃｏｒｄｉｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒ Ｉｎｃ．、米国、カリフォルニア州）を、右大腿静脈に据えたカテーテルシース（ＦＡＳＴ－ＣＡＴＨ（商標）４０６１１９、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄａｉｇ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．、米国、ミネソタ州ミネトンカ）を通して挿入し、遠位電極対からの双極電位図のガイドの下で三尖弁をまたいで据えた。房室結節アブレーションに最適な部位、すなわち緻密な房室結節を、非常に小さいＨｉｓ振幅が記録され、心房／心室電圧比が＞２であった心臓内電位図に基づいて決定した。房室結節アブレーションのための電源は、５００ｋＨｚの周波数で連続無変調高周波エネルギーを送達する電気外科用発電機（ＭＳ－１５００、泉工医科工業株式会社、日本、東京都）から得た。適切な位置を決定した後、２０Ｗの高周波エネルギーを、チップ電極から動物の背中に配置した不関パッチ電極に１０秒間送達し、次いでこれを、接合部異所性複合体が誘発された場合には３０秒間続けた。この処置のエンドポイントは、安定した心室固有補充調律の発生を伴う完全房室ブロックの発症とした。上記の全ての外科的処置は、滅菌条件下で行った。ポイエンダロンの電気薬理学的作用及び抗心房細動作用が調べられる^{１１、１４}まで、動物に適切な注意を払った。

（Ｃ）発作性心房細動モデルの外科的準備。発作性心房細動モデルを、以前に報告^{１２、１３}されたように準備した。房室ブロックの誘発から３ヶ月を超えた後に、ペントバルビタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）でイヌ（ｎ＝４）に麻酔をかけた。カフ付き気管内チューブで挿管した後、体積制限人工呼吸器（ＳＮ－４８０－３、株式会社シナノ製作所（日本、東京都）を用いて、酸素中０．５～１．５％のイソフルランでイヌに人工呼吸した。一回呼吸量及び呼吸数は、それぞれ２０ｍＬ／ｋｇ及び１５呼吸／分に設定した。四肢電極から表面ＩＩ誘導心電図を得た。４つの臨床的に利用可能なカテーテル－シース（ＦＡＳＴ－ＣＡＴＨ（商標）、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄａｉｇ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を用い、２本を右大腿静脈に挿入し、残りの２本を下大静脈に向かって左大腿静脈に挿入した。右大腿動脈に留置針（Ｓｕｒｆｌｏ（登録商標）１８Ｇ、テルモ株式会社、日本、東京都）を据え、それによって動脈圧を測定した。

３セットの標準的な６フレンチの４極電極カテーテル（Ｃｏｒｄｉｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒ Ｉｎｃ．）を用いた。１つ目を、右大腿静脈を通して高位右房に配置して、洞結節領域を電気的にペーシングし、同時に右心房電位図を得た。２つ目を、ｏｓを介し食道に配置して、左心房電位図を記録した。３つ目を、左大腿静脈を通して右心房の心房中隔に配置して、下記のように発作性心房細動を電気的に誘発した。各カテーテルの最適部位を、遠位電極対からの双極心房電位図と心電図のＰ波との間の時間的関係によって決定した。標準的な４フレンチの４極電極カテーテル（４０１９９３、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄａｉｇ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を、右大腿静脈を通して右心室の心内膜に配置して、右心室を電気的に駆動した。

（Ｄ）電気生理学的変数の測定。洞結節領域又は右心室に据えたカテーテルのペーシング電極を通して、心臓刺激装置（ＳＥＣ－３１０２、日本光電工業株式会社）で心臓を電気的に駆動した。刺激パルスは、矩形形状に設定し、振幅２～２．５Ｖ（閾値電圧の約２倍）及び持続時間１ｍｓからなった。心房間伝導時間（ＩＡＣＴ）を、４００ｍｓ（ＩＡＣＴ_{（ＣＬ４００）}）、３００ｍｓ（ＩＡＣＴ_{（ＣＬ３００）}）、及び２００ｍｓ（ＩＡＣＴ_{（ＣＬ２００）}）のペーシング周期長で測定した左右心房電位図の間の時間的位置の差として定義した。心房有効不応期（ＡＥＲＰ）及び心室有効不応期（ＶＥＲＰ）を、それぞれ洞結節領域及び右心室へのプログラム電気刺激で評価した。ペーシングプロトコルは、ＡＥＲＰについて４００ｍｓ（ＡＥＲＰ_{（ＣＬ４００）}）、３００ｍｓ（ＡＥＲＰ_{（ＣＬ３００）}）、及び２００ｍｓ（ＡＥＲＰ_{（ＣＬ２００）}）、並びにＶＥＲＰについて４００ｍｓ（ＶＥＲＰ_{（ＣＬ４００）}）の周期長での５拍の基礎刺激、それに続く様々な連結期の期外刺激からなった。追加刺激がもはや応答を誘発できなくなるまで、連結期を５ｍｓの減衰で短縮した。ＡＥＲＰ及びＶＥＲＰを、刺激応答を誘起することができる最短の連結期として定義した。

（Ｅ）発作性心房細動の誘発。単離ユニット（ＳＳ－２０１Ｊ、日本光電工業株式会社）［２、３］を備えた刺激装置（ＳＥＮ－７２０３、日本光電工業株式会社）を用い、カテーテルの遠位電極対を通して６０ｍｓ（１，０００ｂｐｍ）の周期長で１０秒間、心房中隔を電気的にペーシングした（＝バーストペーシング）。心房細動を誘発するための刺激パルスは、矩形形状に設定し、振幅６０Ｖ及び持続時間１０ｍｓからなった。心房細動は、心電図上に不規則なベースラインをもたらす急速で不規則な心房調律の期間として定義した。心房細動の持続時間は、右心房電位図においてその誘発から終了まで測定したのに対し、心房細動の周期長は、左心房電位図を用いて決定した。

（Ｆ）実験プロトコル。左右の心房電位図、心電図、及び動脈圧を、ポリグラフシステム（ＲＭ－６０００、日本光電工業株式会社）でモニターし、リアルタイム全自動データ解析システム（ＷｉｎＶＡＳ３バージョン１．１Ｒ２４、株式会社フィジオテック、日本、東京都）で解析した。ＩＡＣＴ変数の各測定には、連続複合体の３回の記録の平均を採用した。電気薬理学的変数を以下の順序で評価した。１番目に、自発的な洞調律下で、左右の心房電位図、心電図、及び動脈圧を記録した。２番目に、洞結節領域を４００ｍｓ、３００ｍｓ、及び２００ｍｓの周期長で電気的にペーシングして、ＩＡＣＴを測定した。３番目に、ＡＥＲＰを、４００ｍｓ、３００ｍｓ、及び２００ｍｓの基本的なペーシング周期長で評価し、ＶＥＲＰを４００ｍｓの基本的なペーシング周期長で測定した。４番目に、発作性心房細動をバーストペーシングのプロトコルによって誘発し、これを各時点で１０回繰り返した。心房細動が心房粗動に変換されるか、又は＞３０秒に維持された場合、急速心房ペーシングによって終了し、その持続時間を３０秒とみなした。

基本評価後、左大腿静脈に据えたカテーテルシースを通して、０．３ｍｇ／ｋｇの低用量のポイエンダロン塩酸塩を３０秒かけて静脈内注入し、投与開始から１０分、２０分、及び３０分後に各変数を評価した（ｎ＝４）。次いで、３ｍｇ／ｋｇの高用量のポイエンダロン塩酸塩を同じやり方で注入し、投与開始から１０分、２０分、３０分、４５分、及び６０分後に各変数を観察した。

（Ｇ）ポイエンダロン塩酸塩及び薬物。ポイエンダロン塩酸塩を１００％エタノールで２０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解して、０．３ｍｇ／１５μＬ／ｋｇ及び３ｍｇ／１５０μＬ／ｋｇの注射液を調製した。用いた他の薬物は、ペントバルビタールナトリウム（東京化成工業株式会社、日本、東京）、イソフルラン（イソフルラン吸入液、ファイザー株式会社、日本、東京都）、及びヘパリンカルシウム（カプロシン（登録商標）、沢井製薬株式会社、日本、大阪府）であった。

（Ｈ）統計分析。データを平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として提示する。パラメータ内の差は、一元配置反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いて平均値比較のための事後検定としての対比により見積もった。ｐ値＜０．０５を有意とみなした。

結果を図３０、図３１、図３２、及び図３３に示す。

結果
アミオダロン（図１Ａ）は、重度の肺傷害性及び甲状腺傷害性に関係している。これは主に、分子中のヨウ素原子の存在、脂溶性、及び広範な組織蓄積に起因する。ドロネダロン（図１Ｂ）は、メタンスルホンアミド基の付加により組織蓄積がより低いために、前述の全身毒性がない、アミオダロンの非ヨウ素化類似体である。しかし、それは心不全を悪化させ、持続性のＡＦ並びにＮＹＨＡクラスＩＩＩ及びクラスＩＶの心不全の患者の死亡率を増加させる。これらの致命的な副作用により、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：ＵＳＦＤＡ）は、その心臓有害作用について黒枠警告を発している。

残念ながら、別のアミオダロン類似体、セリバロンの臨床開発は、有効性が低いため中止されている。

アラキドン酸（ＡＡ）は、内因性ω－６多価不飽和脂肪酸であり、プロスタグランジン及びトロンボキサンなどの複数の生物学的に重要な脂質の前駆体として働く。ＡＡは、主にシクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、及びＣＹＰ４５０の酵素類によって代謝される。肝外ＣＹＰ２Ｊ２は、ヒト心臓で主に発現されるエポキシゲナーゼであり、ＡＡを、４つの位置異性体の心保護性エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）に代謝する（図２）。ＥＥＴ類は、それらの血管拡張活性、抗炎症活性、抗アポトーシス活性、及びイオンチャネル調節活性により、心臓の恒常性を維持するのに役立つ。ＥＥＴ類は、可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）によってさらに代謝を受けて、それほど強力ではないジヒドロキシエイコサトリエン酸類（ＤＨＥＴ）に変化する（図２）。心臓ＣＹＰ２Ｊ２の変化及びそれに続くＡＡ代謝の摂動は、心肥大の開始、持続、及び悪化の原因である。心不全には通常、肥大応答が先行するので、ＥＥＴの摂動は、心肥大から心不全への悪化を加速する可能性がある。逆に、ＣＹＰ２Ｊ２の心臓特異的大量発現は、心肥大における不整脈感受性、心不全における小胞体ストレス、及びＥＥＴの産生増加によるドキソルビシン誘発性心毒性などの複数の病理学的状態を緩和する。興味深いことに、ＣＹＰ２Ｊ２の大量発現は、汎エポキシゲナーゼ阻害剤、ＭＳ－ＰＰＯＨによって引き起こされるＱＴ延長を軽減する。これによって、イオンチャネル調節因子としてのＥＥＴの役割がさらに重要視される。したがって、心臓ＡＡ代謝経路における摂動は、調節不全になった心臓の恒常性に現れる。

本発明者らは、アミオダロン及びドロネダロンが、ヒト心臓ＣＹＰ２Ｊ２を、機序的不活性化（ＭＢＩ）及び可逆的阻害によって阻害することを以前に報告した^７。本発明者らは、ＣＹＰ２Ｊ２のＭＢＩが、キノン－オキシム代謝産物によって仲立ちされることを解明した（図３）。ＣＹＰ２Ｊ２のＭＢＩを緩和するために、ドロネダロンの部位指定重水素化を試みた。重水素化は、分子中の少なくとも１つの水素原子が重水素で置換される化学的プロセスである。重水素は原子質量が大きいので、炭素－重水素（Ｃ－Ｄ）結合の開裂エネルギーは、炭素－水素（Ｃ－Ｈ）結合の開裂エネルギー（３３８．４ ｋＪ／ｍｏｌ）よりも相対的に大きい（３４１．４ ｋＪ／ｍｏｌ）。

本発明者らは重水素化実験を試みて、ある生成物を生成した。それは、
１．ＣＹＰ２Ｊ２のＭＢＩ能力を低減させ、ＡＡ代謝摂動を低減させる。

２．ドロネダロンの薬物動態特性及び薬力学特性を保ち、その心室性不整脈誘発特性及び関係する心不全増悪を寛解させる。

本発明者らの研究の結果として、ベンゾフラン環の４位、６位、及び７位にドロネダロンの部位指定重水素化を含む生成物を、本発明者らは開発した（すなわちポイエンダロン、図４）。

ポイエンダロンは、その非重水素化類似体、ドロネダロンと同様の物理化学的特性、有効透過率、及び代謝半減期をもたらす。

ベンゾフラン環の４位、６位、及び７位の水素を重水素原子で置き換えることを除いて、ポイエンダロン（図４）及びドロネダロン（図１Ｂ）は構造的に同一である。予想されるように、重水素化は、ドロネダロンと比較して、ポイエンダロンの脂溶性（ｃＬｏｇＰ）、水溶解度、及び有効透過率を変化させない（表８）。これは、両方の薬物が、ＵＳＦＤＡによって定義された生物薬剤学分類システム（Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：ＢＣＳ）の同じクラスに入る可能性があることを意味する。さらに、ポイエンダロンの代謝半減期（Ｔ_１／２）はドロネダロンと同等である。これは、ポイエンダロンがドロネダロンの代謝安定性を保っていることを意味する。まとめると、本発明者らの知見は、ポイエンダロンによって、ドロネダロンの好ましい薬物動態特性が潜在的に保たれていることを示している。

ＣＹＰ２Ｊ２のダウンレギュレーションが、心臓の拍動間隔を増加させており、ＣＹＰ２Ｊ２阻害がドロネダロンの不整脈誘発作用を支持していることを確認する
４つの異なるｓｉＲＮＡ（表１）を用いて、ヒト心筋細胞（Ｈ７ ＣＭ）においてヒトＣＹＰ２Ｊ２をノックダウンした。全てのｓｉＲＮＡはＣＹＰ２Ｊ２を有意にノックダウンし、ｓｉＲＮＡ１が最も有効であった（図６）。

４つのｓｉＲＮＡを用いた心臓ＣＹＰ２Ｊ２のノックダウンは、心筋細胞の個々のクラスタにおける拍動間隔を増加させた（図７）。拍動発生グラフに基づいて、対照心筋細胞の拍動は規則的であることが観察された（図８）。しかし、ＣＹＰ２Ｊ２のノックダウン時には、心筋細胞の拍動は明らかに不規則であった。ｓｉＲＮＡに関係するデータ点を組み合わせた場合、拍動間隔の増加は統計学的に有意であった（図９）。要約すると、これらの結果によって、心調律制御の維持におけるＣＹＰ２Ｊ２の中心的役割が強調され、ドロネダロンの不整脈誘発作用をＣＹＰ２Ｊ２阻害が支持することが確認される。

組換えヒトＣＹＰ２Ｊ２の機序的不活性化（ＭＢＩ）：ポイエンダロン＜＜ドロネダロン
本発明者らは以前に、ドロネダロン及びアミオダロンを、ＣＹＰ２Ｊ２の強力な機序的不活性化剤として報告した。当業者に容易に明らかなように、酵素に対する薬物のＭＢＩ能力は基質依存性である。アステミゾールをプローブ基質として用いた本発明者らの予備研究では、ポイエンダロンは、ＣＹＰ２Ｊ２のＭＢＩの能力がドロネダロンと比較して６２分の１であることが確認され（図１０）、ｋｉｎａｃｔ／ＫＩ比として測定されたＭＢＩ能力が、それぞれ０．００８ｍｉｎ^－１μＭ^－１及び０．５ｍｉｎ^－１μＭ^－１である。この知見は、重水素化キノン－オキシムは反応性が低いという本発明者らの仮定を裏付けている。さらに、ポイエンダロンは、効力がアミオダロンの９分の１である（データは示さず）。

ポイエンダロン、ドロネダロン、及びドロネダロンの他の２つの重水素化類似体のＭＢＩ能力をさらに検証するために、臨床的に関連するリバーロキサバンをプローブ基質として採用した。上記の事前のアステミゾール特異的ＭＢＩデータ（ポイエンダロンのかなり低いＭＢＩ能力を証明する）と一致して、ポイエンダロンについてリバーロキサバン特異的ＭＢＩを測定することはできなかった。具体的に、ポイエンダロン、ドロネダロン、化合物１、及び化合物２のＭＢＩ能力を表３にまとめる。注目すべきことに、ドロネダロンのみがＣＹＰ２Ｊ２の不活性化を示し（図１１Ａ、図１１Ｂ）、一方、ポイエンダロンはＣＹＰ２Ｊ２のＭＢＩを引き起こさなかった（図１１Ｃ、図１１Ｄ）。化合物２は、時間依存的及び濃度依存的にＣＹＰ２Ｊ２を不活性化したが（図１２Ａ、図１２Ｂ）、化合物３は不活性化しなかった（図１２Ｃ、図１２Ｄ）。差別的に重水素化されたドロネダロンの類似体を用いて得られたこれらのＭＢＩデータは、ベンゾフラン環の重水素化が、ＣＹＰ２Ｊ２のＭＢＩを緩和するために重要であることを証明している。

ｈｉＰＳＣ－ＣＭにおけるＣＹＰ２Ｊ２の阻害：ポイエンダロン＜＜ドロネダロン
ｈｉＰＳＣ－心筋細胞（ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）は、電気生理学的に成体ヒト心筋細胞と同様である。ｈｉＰＳＣ－ＣＭは、その自発的拍動能により、確立された新規化合物の抗不整脈活性を調べるための望ましいモデルとなる。さらに、ｈｉＰＳＣ－ＣＭは、薬物のトルサード・ド・ポアンツ発症（ｔｏｒｓａｄｏｇｅｎｉｃ）リスクを調査するための適切なモデルである。ここで、本発明者らは、ＣＹＰ２Ｊ２がｈｉＰＳＣ－ＣＭにおいて発現されるかどうか、及び本発明者らの試験薬物がｈｉＰＳＣ－ＣＭにおいてＣＹＰ２Ｊ２を阻害するかどうかを調べた。

本発明者らの知る限りでは、本発明者らは、ｈｉＰＳＣ－ＣＭにおけるＣＹＰ２Ｊ２及びｓＥＨの発現を実証する（図１３Ａ）初のグループである。この知見により、ＣＹＰ２Ｊ２が、初代ヒト心筋細胞並びに心臓組織において高度に発現されるという確立された知識が裏付けられている。したがって、ｈｉＰＳＣ－ＣＭは、インビトロでＣＹＰ２Ｊ２の生物学的事象を調べるための、代謝関連の手段である。その手段を用いて、本発明者らは、ＣＹＰ２Ｊ２が実際に活性であり、ドロネダロンによって強力に阻害される（９８％阻害）が、アミオダロンによっては阻害されないことを実証した（図１３Ｂ）。アミオダロンによるＣＹＰ２Ｊ２の阻害がないことは、初代ヒト心筋細胞を用いた以前の報告^８と一致している。重要なことは、ポイエンダロンにより、ＣＹＰ２Ｊ２の阻害が有意に低いことである（５０％阻害）（図１３Ｂ）。

ポイエンダロンは、ドロネダロンよりも心筋細胞に対して有意に細胞傷害性が低い。

ＥＥＴを用いた前処理がない場合、プロテアーゼ活性がおよそ１５０～２００％増加し、Ｈ９ｃ２細胞をドロネダロンで処理した場合に有意な細胞死を示した（図１４Ａ）。１４，１５－ＥＥＴでのＨ９ｃ２細胞の前処理がある場合、ビス－ＡＡＦ－Ｒ１１０蛍光シグナルは濃度依存的に減少し、ＥＥＴによる細胞傷害性の緩和が確認された。同様に、１４，１５－ＥＥＴは、濃度依存的に、細胞内ＡＴＰレベルの減少を緩和した。

ＴＭＲＭ蛍光色素を用いてΔψ_ｍの散逸を測定した。ドロネダロンは、Δψ_ｍの強力な散逸を示した（ＩＣ_５０＝０．５μＭ）。ここで、Ｈ９ｃ２細胞を１４，１５－ＥＥＴで前処理し、続いて５μＭのドロネダロンで処理した。１４，１５－ＥＥＴでの前処理について、Δψ_ｍ散逸の濃度依存的緩和が観察された（図１４Ａ）。

Ｈ９ｃ２細胞をドロネダロンに６時間曝露した後、蛍光シグナルが濃度依存的に増加し、Ｈ９ｃ２細胞に対するドロネダロンの細胞傷害性（ＥＣ_５０＝１．２１μＭ）が確認された（図１４Ｂ）。同時に、細胞内ＡＴＰレベルが、ドロネダロンによって誘発され、濃度依存的に減少した（ＩＣ_５０＝３．１０μＭ）（図１４Ｂ）。ポイエンダロンは、Ｈ９ｃ２細胞に対して有意に細胞傷害性が低い（ＥＣ_５０＝２７．６３μＭ）。その結果、ポイエンダロンは、ドロネダロン（ＩＣ_５０＝４１．５２μＭ）ほど強力にＨ９ｃ２細胞のＡＴＰレベルを低減させない。したがって、ポイエンダロンは、治療用血漿濃度（サブμＭ）において、またその実験能力に基づき、心筋細胞の細胞傷害性を引き起こさないと予想される。

ポイエンダロンは、ｈｉＰＳＣ－ＣＭにおいて、ドロネダロン及びアミオダロンと同様のイオンチャネル遮断活性を示す。

ＨｉＰＳＣ－ＣＭは、無限に増殖し、かつ全ての主要な心臓イオンチャネル、ギャップ結合タンパク質、及びイオン交換体の発現により、培養中に自発的に拍動するという独特の利点を有する。したがって、多数の薬物を、それらのイオンチャネル阻害特性について試験することができる。従来のパッチクランプ法（図１５Ａ）とは異なり、本研究では、我々はＭＥＡシステム（図１５Ｂ）を用いて、心臓活動電位を反映する細胞外のフィールド電位持続時間（ＦＰＤ）に対する薬物の「網羅的」作用を測定した。ＭＥＡの利点は単一の細胞ではなく細胞群のプロファイリングにあり、これによりバイアスを回避する。注目すべきことに、ポイエンダロンは、電気生理学的に関連したｈｉＰＳＣ－ＣＭ（図１５Ｂ、図１５Ｃ）の多電極アレイ（ＭＥＡ）アッセイを用いた細胞外のフィールド電位持続時間（ＦＰＤ）に対して、同様の濃度依存的作用を示す。

さらに、ポイエンダロン、ドロネダロン、及びアミオダロンは、パッチクランプ実験に基づいて、ヒト心臓Ｎａ_Ｖ１．５（図１６、図１７、及び図１８）、Ｃａ_Ｖ１．２（図１９、図２０、及び図２１）、及びＫ_ｖ１１．１（図２２、図２３、及び図２４）について同様の阻害能力を有することが示されている。これらの証拠により、ポイエンダロンの抗ＡＦ薬理が確認される。

ポイエンダロンは、ｈｉＰＳＣ－ＣＭにおいて、ドロネダロンと比較して不整脈誘発リスクが低い。

クラスＩＩＩ抗不整脈薬は、心房性不整脈の治療に有効であるが、逆に、生命を脅かす心室性不整脈のリスクを増加させる可能性のあることが知られている。したがって、カリウムチャネル遮断薬の不整脈誘発作用と抗不整脈作用とを区別することが重要である。慣例上、ｈＥＲＧ阻害及びＱＴ延長は、薬物誘発性の不整脈誘発の指標として用いられる。具体的には、不安定性を伴うＱＴ延長によって薬物誘発性の不整脈誘発を予測でき、一方、不安定性がない場合のＱＴ延長は抗不整脈性である。不安定性は、拍動間変動（ＢＢＶ）を測定することによって、ｈｉＰＳＣ－ＣＭにおいて評価することができる。ＢＢＶは、ポアンカレプロットを用いてグラフで視覚化することができる。ポアンカレプロットは、各Ｒ－Ｒ間隔又は拍動間の間隔（ＩＢＩ）が、その先行する間隔に対してプロットされ、連続する間隔の間の相関を図解形式で表示するチャートである（図２５）。対照及びポイエンダロンにおけるＩＢＩは、楕円の重心の周りに集まり、長手方向軸に整列し、葉巻形状のプロットとして定義される（図２５）。これは、拍動間の変動が最も少ないことを示している。しかし、ドロネダロンの場合には、ＩＢＩは楕円の重心に集まらず、プロットのいたる所に拡散する（図２５）。

ポイエンダロンは、ドロネダロンと同様のインビボ血漿薬物動態を有する。

３．０ｍｇ／ｋｇで投与したポイエンダロンとドロネダロンとの間で、同様の消失プロファイル（ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ）及び一次薬物動態パラメータ（クリアランス及び分布容積）が観察された。急性傷害性も致死もインビボで観察されなかった（図２６）。

ポイエンダロンは、ドロネダロンと同様のシミュレートインビボ血漿薬物動態を有する。

ポイエンダロンのＰＫをより理解するために、ＰＢＰＫモデルを構築した。各ＰＢＰＫモデルへの入力のための正確なＣＬ_ｉｎｔ値及びｋ_{ｉｎａｃｔ}／Ｋ_Ｉ値を導出することによって、各薬物の排出と予測される血漿濃度－時間プロファイルの時間依存性とが機構的に説明される。さらに、これらのインビトロのヒトのデータを生成することにより、予測されたプロファイルを、異なる対象集団に向けて可能な限り一般化することがさらに確実になる。

代謝安定性の研究。ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、又はＨＬＭ反応混合物中に残存している基質の百分率は、インキュベーション時間が経時的に進行するにつれて単一指数関数的に減少した。ドロネダロンのＴ_１／２及びｋは、ＣＹＰ３Ａ４では１６．７３ｍｉｎ及び０．０４１４４ｍｉｎ^－１、ＣＹＰ３Ａ５では１７．３７ｍｉｎ及び０．０３９８９ｍｉｎ^－１、ＨＬＭでは１０．７５ｍｉｎ及び０．０６４４６ｍｉｎ^－１であった（それぞれ、図２７Ａ、図２７Ｃ、図２７Ｅ）。ポイエンダロンのＴ_１／２及びｋは、ＣＹＰ３Ａ４では７．５５１ｍｉｎ及び０．０９１８ｍｉｎ^－１、ＣＹＰ３Ａ５では２５．１４ｍｉｎ及び０．０２７５７ｍｉｎ^－１、ＨＬＭでは１０．７１ｍｉｎ及び０．０６４７２ｍｉｎ^－１であった（それぞれ、図２７Ｂ、図２７Ｄ、図２７Ｆ）。全ての酵素系にわたって、ドロネダロンについて得られたＣＬ_ｉｎｔ値は、ポイエンダロンの値と同様であった（表６）。ポイエンダロンの実験のＣＬ_ｉｎｔ値（ＣＹＰ３Ａ４：９．１８μＬ／ｍｉｎ／ｐｍｏｌ、ＣＹＰ３Ａ５：２．７５７μＬ／ｍｉｎ／ｐｍｏｌ）は、ドロネダロンの値（ＣＹＰ３Ａ４：８．２８８μＬ／ｍｉｎ／ｐｍｏｌ、ＣＹＰ３Ａ５：３．９８９μＬ／ｍｉｎ／ｐｍｏｌ）と予想通り同様であった。これは、重水素化の部位が、ドロネダロンにおける代謝の主要部位（Ｎ－ブチル鎖）から離れているためである。加えて、ドロネダロンの実験のＣＬ_ｉｎｔ値は、同様の実験設定を用いてＨｏｎｇらによって報告された値（ＣＹＰ３Ａ４：６．４４２μＬ／ｍｉｎ／ｐｍｏｌ、ＣＹＰ３Ａ５：２．６０４μＬ／ｍｉｎ／ｐｍｏｌ）^１０と同様であり、ＰＢＰＫモデリングに用いられるそれらの妥当性を裏付けている。

ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｊ２の時間依存的及び濃度依存的な不活性化。ドロネダロン及びポイエンダロンは、リバーロキサバンをプローブ基質として、時間依存的及び濃度依存的にＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ５を不活性化した（表６）。不活性化の濃度依存性は、不活性化剤の様々な濃度レベルから計算されたｋ_ｏｂｓの飽和反応速度に見ることができ、不活性化剤濃度が増加するにつれて、不活性化の最大速度に近づいた。ドロネダロン及びポイエンダロンは、ＣＹＰ３Ａ５については同様のｋ_{ｉｎａｃｔ}／Ｋ_Ｉ値を有していたが、ＣＹＰ３Ａ４については、ポイエンダロンのｋ_{ｉｎａｃｔ}／Ｋ_Ｉ値がドロネダロンのｋ_{ｉｎａｃｔ}／Ｋ_Ｉ値よりも高かった（２．４倍の差）（表６）。

ＰＢＰＫモデルの開発及び検証。本発明者らのＰＢＰＫモデルによって、静脈内及び単回経口の投与だけでなく、複数回経口投与についてもドロネダロンの臨床データを特徴づけることに成功し（図２８）、複数回経口投与では、絶食状態では約１２％の誤差以内、摂食状態では約３４％の誤差以内にＡＵＣが再現されている。予測ＰＫパラメータを、関連した成功基準に基づく臨床データと比較した。ＭＢＩの作用がシミュレートされない場合（図２９Ｃ、図２９Ｄ）、シミュレートされた複数回経口投与データの臨床データ（図２９Ａ、図２９Ｂ）への満足のいくフィッティングは失われることに留意することも興味深い。これにより、ドロネダロンの時間依存的ＰＫをうまく予測するためには、正確なＭＢＩデータをＰＢＰＫモデリングに統合することが重要であることが強調されている。

ドロネダロン及びポイエンダロンは、ＣＹＰ３Ａ５に対して同様のＭＢＩ能力を生じるが（それぞれ０．００６３４μＭ^－１ｍｉｎ^－１及び０．００７９３μＭ^－１ｍｉｎ^－１、表６）、ＣＹＰ３Ａ４についてはそれほどではない（それぞれ０．００５０５μＭ^－１ｍｉｎ^－１及び０．０１２３μＭ^－１ｍｉｎ^－１、表６）。ＣＹＰ３Ａ４は、ＣＹＰ３Ａ５と比較して、ドロネダロンの主要な代謝酵素である。このことは、ポイエンダロンの代謝ホットスポットは重水素化されていないので、ポイエンダロンにも当てはまる可能性がある。まとめると、本発明者らは、ポイエンダロンはその重要な代謝酵素に対してより強力なＭＢＩ作用を有し、結果としてＣＹＰ３Ａ４のより大きな自己阻害となり、したがって結果的により高い全身曝露をもたらすと推論する。しかし、リードアクロスＰＢＰＫモデリングに基づくと、シミュレートしたポイエンダロンの複数回経口投与は、ドロネダロンのものとわずかしか異ならなかった。実際、ドロネダロンの通常用量が食物と一緒の１日２回４００ｍｇであると仮定すれば、ポイエンダロンがドロネダロンと同じ能力を有するとすると、ポイエンダロンについては、用量調整は要求されないと思われる。

ここで、この知見により、検証されたドロネダロンのＰＢＰＫモデルに基づいたポイエンダロンの臨床ＰＫプロファイルを予測するための、リードアクロスＰＢＰＫモデリングの実験的フレームワークが初めて実証された。ポイエンダロンの拡張全身曝露に基づき、かつドロネダロンと同等の曝露－有効性関係を仮定することにより、続いて、ポイエンダロンのファースト・イン・ヒューマン治験のために投薬レジメンを計画することができる。

ポイエンダロンは潜在的な抗心房細動作用を保っている
ドロネダロン及びアミオダロンと同様に、ポイエンダロンは、ＡＥＲＰ及びＶＥＲＰの両方を延長し、１．８～２．７倍高い心房選択性をもたらす（表９）。これにより、心房性不整脈に対するその潜在的な臨床的有効性が強調される。

ポイエンダロンは、ドロネダロンに関係する潜在的な不整脈誘発作用を回避する
ポイエンダロンは、終末再分極期（ΔＴＲＰ）に対するその作用が最も低いことに基づき、リエントリー性心室性不整脈のリスクが最も低いことを示している。早期再分極延長（ΔＪ－Ｔｐｅａｋｃ）がないこと、及び後期再分極期（ΔＴｐｅａｋ－Ｔｅｎｄ）の延長が最小であることにより、ポイエンダロンに関係するトルサード・ド・ポアンツのリスクが潜在的に低いことが強調される（表１０）。

ポイエンダロンは、発作性ＡＦイヌモデルにおいて、抗心房細動薬として好ましい心房電気薬理学的特性を有する
実験期間中に、死亡につながる致死的な心室性不整脈又は血行動態の崩壊を示した動物はいなかった。

洞房拍動数及び平均血圧に対する作用。洞房拍動数及び平均血圧の変化の経時変化を図３０にまとめる。それらの薬物投与前の基本対照値（Ｃ）は、それぞれ９６±１２ｂｐｍ及び８３±１２ｍｍＨｇであった。０．３ｍｇ／ｋｇの低用量並びに３ｍｇ／ｋｇの高用量は、これらの変数のいずれもほとんど変化させなかった。

ＩＡＣＴに対する作用。ＩＡＣＴの変化の経時変化を図３１にまとめる。ＩＡＣＴ_{（ＣＬ４００）}、ＩＡＣＴ_{（ＣＬ３００）}、及びＩＡＣＴ_{（ＣＬ２００）}の薬物投与前の基本対照値（Ｃ）は、それぞれ４４±２ｍｓ、４７±１ｍｓ、及び５５±２ｍｓであった。低用量では、ペーシング周期長のいずれにおいてもこれらのＩＡＣＴ値は変化しなかった。高用量では、１０分及び３０～６０分のＩＡＣＴ_{（ＣＬ４００）}、１０分のＩＡＣＴ_{（ＣＬ３００）}、及び１０～６０分のＩＡＣＴ_{（ＣＬ２００）}が延長した。

ＡＥＲＰ及びＶＥＲＰに対する作用。ＡＥＲＰ及びＶＥＲＰの変化の経時変化を図３１にまとめる。ＡＥＲＰ_{（ＣＬ４００）}、ＡＥＲＰ_{（ＣＬ３００）}、ＡＥＲＰ_{（ＣＬ２００）}、及びＶＥＲＰ_{（ＣＬ４００）}の薬物投与前の基本対照値（Ｃ）は、それぞれ１５０±１１ｍｓ、１４５±１２ｍｓ、１３９±１４ｍｓ、及び２３３±６ｍｓであった。低用量では２０分のＡＥＲＰ_{（ＣＬ４００）}が延長したが、他の変数では有意な変化は検出されなかった。高用量では、１０～６０分のＡＥＲＰ_{（ＣＬ４００）}及びＡＥＲＰ_{（ＣＬ３００）}が延長したのに対し、ＡＥＲＰ_{（ＣＬ２００）}又はＶＥＲＰ_{（ＣＬ４００）}に有意な変化は検出されなかった。

心房細動の持続時間及び周期長に対する作用。バーストペーシングの間及び後の左右の心房電位図、心電図、及び動脈圧の典型的な追跡グラフを図３２に表し、心房細動の持続時間及び周期長の変化の時間推移を図３３にまとめる。それらの薬物投与前の基本対照値（Ｃ）は、それぞれ４．０±０．９ｓ及び１５５±１５ｍｓであった。低用量では、これらの変数は変化しなかった。高用量では、１０～６０分間の持続時間が短縮したのに対し、周期長は延長される傾向にあったが、これは統計学的有意性には至らなかった。

要約すると、ポイエンダロンは、イヌにおいて発作性心房細動に対する心房選択的な抗心房細動作用を有する。

要約
本発明者らの説得力のあるインビトロ及びインビボの証拠によって、部位指定重水素化が、ドロネダロンなどのベンゾフラン由来抗不整脈薬の安全性及び有効性を最適化するための実行可能な戦略であることが確認される。

部位特異的重水素化化合物、ポイエンダロンは、以下を示す。

・ドロネダロンと同様の物理化学的な透過率及び代謝安定性、
・ドロネダロンと同等の心臓イオンチャネル遮断活性、
・ドロネダロンと同様の好ましい薬物動態、及び
・ドロネダロンと同等のインビボ抗心房細動の選択性及び活性。

さらに、ドロネダロンとは異なり、部位特異的重水素化化合物、ポイエンダロンは、以下を引き起こさない。

・ヒト心臓ＣＹＰ２Ｊ２の不活性化、
・心筋細胞におけるミトコンドリア機能不全（代わりに、より安全な細胞傷害性／ＡＴＰ枯渇プロファイルをもたらし、これはドロネダロンと比較して心毒性リスクが低減することを意味する）、
・ｈｉＰＳＣ－ＣＭ中のＢＢＶ、及び
・インビボでの潜在的な心不整脈誘発リスク。

したがって、部位特異的重水素化ベンゾフラン由来の抗不整脈薬、特にポイエンダロンは、ＡＦの治療のための実行可能な価値ある化合物である。

参考文献
１．Ａ．Ｍｅｈｔａ、Ｙ．Ｙ．Ｃｈｕｎｇ、Ａ．Ｎｇ、Ｆ．Ｉｓｋａｎｄａｒ、Ｓ．Ａｔａｎ、Ｈ．Ｗｅｉらによる「Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｖｉｒｕｓ－ｆｒｅｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．９１（２０１１）５７７－５８６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｃｖｒ／ｃｖｒ１３２．
２．Ａ．Ｍｅｈｔａ、Ｙ．Ｃｈｕｎｇ、Ｇ．Ｌ．Ｓｅｑｕｉｅｒａ、Ｐ．Ｗｏｎｇ、Ｒ．Ｌｉｅｗ、Ｗ．Ｓｈｉｍによる「Ｐｈａｒｍａｃｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｖｉｒａｌ－ｆｒｅｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ」、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．１３１（２０１３）４５８－６９．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｔｏｘｓｃｉ／ｋｆｓ３０９．
３．Ｌ．Ｚｗｉ、Ｏ．Ｃａｓｐｉ、Ｇ．Ａｒｂｅｌ、Ｉ．Ｈｕｂｅｒ、Ａ．Ｇｅｐｓｔｅｉｎ、Ｉ．－Ｈ．Ｐａｒｋ、Ｌ．Ｇｅｐｓｔｅｉｎによる「Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１２０（２００９）１５１３－２３．ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＯＮＡＨＡ．１０９．８６８８８５．
４．Ｍ．Ｐ．Ｔａｒｖａｉｎｅｎ、Ｊ．－Ｐ．Ｎｉｓｋａｎｅｎ、Ｊ．Ａ．Ｌｉｐｐｏｎｅｎ、Ｐ．Ｏ．Ｒａｎｔａ－ａｈｏ、Ｐ．Ａ．Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎによる「Ｋｕｂｉｏｓ ＨＲＶ－Ｈｅａｒｔ ｒａｔｅ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ」、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．１１３（２０１４）２１０－２０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｍｐｂ．２０１３．０７．０２４．
５．Ａ．Ｖｏｓｓ、Ｓ．Ｓｃｈｕｌｚ、Ｒ．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ、Ｍ．Ｂａｕｍｅｒｔ、Ｐ．Ｃａｍｉｎａｌによる「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｎｇ ｈｅａｒｔ ｒａｔｅ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ」、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ａ．Ｍａｔｈ．Ｐｈｙｓ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．３６７（２００９）２７７－９６．ｄｏｉ：１０．１０９８／ｒｓｔａ．２００８．０２３２．
６．Ｙ．Ｍｏｔｏｋａｗａ、Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｍ．Ｈ．Ｎａｇａｓａｗａ、Ａ．Ｇｏｔｏ、Ｋ．Ｃｈｉｂａ、Ｎ．Ｊ．Ｌｕｂｎａ、Ｈ．Ｉ．Ｎａｋａｓｅｋｏ、Ｋ．Ａｎｄｏ、Ａ．Ｔ．Ｎａｉｔｏ、Ｈ．Ｙａｍａｚａｋｉ、Ａ．Ｓｕｇｉｙａｍａによる「Ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ａｔｒｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｏｒｙ，ｐｒｏａｒｒｈｙｔｈｍｉｃ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｄｒｏｎｅｄａｒｏｎｅ ａｓ ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｓａｆｅｔｙ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉａｒｒｈｙｔｈｍｉｃ ｄｒｕｇｓ」、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８（２０１８）２４２－５１．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０１２－０１７－９４３４－ｙ．
７．Ａ．Ｋａｒｋｈａｎｉｓ、Ｈ．Ｙ．Ｌａｍ、Ｇ．Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ、Ｓ．Ｋ．Ｋｏｈ、Ｃ．Ｌ．Ｌ．Ｃｈａｉ、Ｌ．Ｚｈｏｕ、Ｙ．Ｈｏｎｇ、Ｐ．Ｋｏｊｏｄｊｏｊｏ、ＥＣＹ Ｃｈａｎによる「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｏｄｅｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ｊ２ ｂｙ ｄｒｏｎｅｄａｒｏｎｅ，ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０７（２０１６）６７－８０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｃｐ．２０１６．０３．００５．
８．Ｅ．Ａ．Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ、Ｒ．Ｋａｓｐｅｒａ、Ｎ．Ａ．Ｍｏｋａｄａｍ、Ｊ．Ｐ．Ｊｏｎｅｓ、Ｒ．Ａ．Ｔｏｔａｈによる「Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ｊ２ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ」、Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．４１（２０１３）２０８７－９４．ｄｏｉ：１０．１１２４／ｄｍｄ．１１３．０５３３８９．
９．Ｋ．Ａｂｄｕｌｊａｌｉｌ、Ｔ．Ｃａｉｎ、Ｈ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ、Ａ．Ｒｏｓｔａｍｉ－Ｈｏｄｊｅｇａｎによる「Ｄｅｃｉｄｉｎｇ ｏｎ ｓｕｃｃｅｓｓ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｕｄｉｅｓ：Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ」、Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．４２（２０１４）１４７８－８４．ｄｏｉ：１０．１１２４／ｄｍｄ．１１４．０５８０９９．
１０．Ｙ．Ｈｏｎｇ、Ｙ．Ｍ．Ｆ．Ｃｈｉａ、Ｒ．Ｈ．Ｙｅｏ、Ｇ．Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ、Ｓ．Ｋ．Ｋｏｈ、Ｃ．Ｌ．Ｌ．Ｃｈａｉ、Ｌ．Ｚｈｏｕ、Ｐ．Ｋｏｊｏｄｊｏｊｏ、Ｅ．Ｃ．Ｙ．Ｃｈａｎによる「Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ３Ａ４ ａｎｄ ３Ａ５ ｂｙ ｄｒｏｎｅｄａｒｏｎｅ ａｎｄ ｎ－ｄｅｓｂｕｔｙｌ ｄｒｏｎｅｄａｒｏｎｅ」、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８９（２０１６）１－１３．ｄｏｉ：１０．１１２４／ｍｏｌ．１１５．１００８９１．
１１．Ａ．Ｓｕｇｉｙａｍａ、Ｙ．Ｉｓｈｉｄａ、Ｙ．Ｓａｔｏｈ、Ｓ．Ａｏｋｉ、Ｍ．Ｈｏｒｉ、Ｙ．Ａｋｉｅ、Ｙ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、Ｋ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏによる「Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ ｔｏ ＡＶ ｂｌｏｃｋ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ａｒｒｈｙｔｈｍｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＱＴ－ｐｒｏｌｏｎｇｉｎｇ ｄｒｕｇｓ」、Ｊｐｎ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８８（２００２）３４１－５０．ｄｏｉ：１０．１２５４／ｊｊｐ．８８．３４１．
１２．Ｋ．Ｗａｎｇ、Ａ．Ｔａｋａｈａｒａ、Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｋ．Ａｏｎｕｍａ、Ｍ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ａ．Ｓｕｇｉｙａｍａによる「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ ａｎｄ ｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ ｏｎ ａｔｒｉａ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｂｌｏｃｋ ｄｏｇｓ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１０３（２００７）２０７－１３．ｄｏｉ：１０．１２５４／ｊｐｈｓ．ＦＰ００６０９４５．
１３．Ｈ．Ｉｗａｓａｋｉ、Ａ．Ｔａｋａｈａｒａ、Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｙ．Ｓａｔｏｈ、Ｔ．Ｎａｇａｉ、Ｎ．Ｓｈｉｎｋａｉ、Ａ．Ｓｕｇｉｙａｍａによる
「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｉｌｓｉｃａｉｎｉｄｅ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｐａｔｃｈ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｌｅｃｔｒｏｐａｈｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ａｔｒｉａ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｂｌｏｃｋ ｄｏｇｓ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１１０（２００９）４１０－１４．ｄｏｉ：１０．１２５４／ｊｐｈｓ．０９０６１ｓｃ．
１４．Ａ．Ｓｕｇｉｙａｍａによる「Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｐｒｏａｒｒｈｙｔｈｍｉａ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｄｒｕｇ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｒｓａｄｅｓ ｄｅ ｐｏｉｎｔｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｍｏｄｅｌｌｅｄ ｈｅａｒｔｓ」、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５４（２００８）１５２８－３７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｂｊｐ．２００８．２４０．

Claims (17)

1. 式（Ｉ）で表される化合物又は医薬的に許容されるその塩：
   

   

   式（Ｉ）
   式中、
   Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３はそれぞれ重水素を表し、
   ｎは２又は３を表し、
   各Ｒ^４は、独立して、ニトロ基、ハロゲン基、アミノ基、アミド基、シアノ基、カルボキシル基、スルホニル基、ヒドロキシル基、ケトン基、又はアルデヒド基の１つ又は複数で置換されていてもよいＣ_１－６ヒドロカルビル基を表し、
   Ｒ^５は水素又は
   

   

   を表し、
   各Ｒ^６は、独立して、水素又はハロゲンを表し、
   ただし、重水素として規定されていない各原子はその天然の同位体存在量で存在し、重水素として規定されている各位置は少なくとも４５％の重水素の取込みを有する。
2. 重水素として規定されている各位置が、少なくとも９０％の重水素の取込みを有する、請求項１に記載の化合物。
3. 重水素として規定されている各位置が、１００％の重水素の取込みを有する、請求項２に記載の化合物。
4. 各Ｒ^４がＣ_１－６アルキル鎖を表す、請求項１から３のいずれかに記載の化合物。
5. Ｒ^５が
   

   

   を表す、請求項１から４のいずれかに記載の化合物。
6. 各Ｒ^６が水素を表す、請求項１から５のいずれかに記載の化合物。
7. 前記化合物が、式（ＩＩ）の化合物又は医薬的に許容されるその塩である、請求項１から６のいずれかに記載の化合物。
   

   

   式（ＩＩ）
8. 請求項１から７のいずれかに記載の化合物と、医薬的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
9. 請求項１から７のいずれかに記載の化合物又は医薬に使用するための組成物。
10. 心疾患の治療に使用するための、請求項１から７のいずれかに記載の化合物。
11. 前記心疾患が心不整脈である、請求項１０に記載の化合物。
12. 前記心不整脈が心房細動である、請求項１１に記載の化合物。
13. 心疾患の治療方法であって、前記方法は、そのような治療を必要とする患者に、治療有効量の請求項１から７のいずれかに記載の化合物又は医薬的に許容されるその塩形態を投与することを含む、治療方法。
14. 前記心疾患が心不整脈である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記心不整脈が心房細動である、請求項１４に記載の方法。
16. 心疾患を治療するための医薬品の製造に使用するための、請求項１から７のいずれかに記載の化合物。
17. 式（ＩＩＩ）で表される化合物又は医薬的に許容されるその塩：
    

    

    式（ＩＩＩ）
    式中、各Ｒ^７は重水素を表す。

Images