JP2022539238A - ウイルスベクター療法 - Google Patents

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Abstract

ウイルスベクターおよび補体阻害剤との併用療法に関する方法および組成物が記載される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８７１，０５８号、２０１９年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８７１，７００号、２０１９年７月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／８７５，９２５号、および２０１９年１１月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／９３５，５６９号の利益を主張するものであり、その各内容は参照により本明細書に組み込まれる。
ウイルスベクターは、例えば遺伝子療法、遺伝子編集、遺伝子発現調節、およびエクソンスキッピングなどの様々な用途に対する有望な治療剤である。そのようなウイルスベクター治療剤の有効性は、例えばウイルスベクターに対する免疫反応などにより制限されてしまう場合がある。それゆえ、ウイルスベクター治療剤の有効性を高めるための方法および組成物に対するニーズが依然として存在する。
一つの態様では、本開示は、遺伝子療法を受けている、または受けていた対象における遺伝子療法の有効性を改善する方法を特徴とし、当該方法は、補体阻害剤を当該対象に投与し、それにより当該遺伝子療法の有効性を改善することを含む。一部の実施形態では、遺伝子療法の有効性は、遺伝子療法を受けている、または遺伝子療法を受けていたが、補体阻害剤を投与されていない対照対象と比較して、指定された期間にわたって対象において改善される。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、ウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、もしくはＡＡＶ１１ベクター、またはそれらの任意のバリアントである。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２）、サル免疫不全ウイルス（Ｓ１Ｖ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血（ＥＩＡ）、またはビスナウイルスである。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、治療用タンパク質、酵素、ホルモン、血液凝固因子、サイトカイン、または成長因子をコードする。一部の実施形態では、遺伝子療法は、血液障害、網膜疾患、自己免疫疾患、筋障害、神経障害、または癌の治療を目的としている。
一部の実施形態では、補体阻害剤は、対照（例えば、遺伝子療法を受けているが、補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、遺伝子療法に対する免疫応答（例えば、抗体、Ｂ細胞、および／またはＴ細胞の免疫応答）を減少させる。一部の実施形態では、遺伝子療法の有効性は、対照（例えば、遺伝子療法を受けているが、補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、約１週間、２週間、４週間、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、またはそれ以上で増加する。
一部の実施形態では、ウイルスベクターの形質導入は、対照（例えば、遺伝子療法を受けているが、補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、改善される。一部の実施形態では、形質導入は、導入遺伝子発現のレベルを測定することによって評価される。一部の実施形態では、ウイルスベクターの補体介在性のクリアランスは、対照（例えば、遺伝子療法を受けているが、補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、減少する。
一部の実施形態では、補体阻害剤は、Ｃ３阻害剤を含む。一部の実施形態では、Ｃ３阻害剤は、Ｃ３転写物もしくはＣ３タンパク質のレベルおよび／または活性を減少させる。
別の態様では、本開示は、遺伝子療法（例えば、ウイルスベクター療法）を受けた、または受けている対象において補体活性化を低下させる方法を特徴としており、当該方法は、遺伝子療法（例えば、ウイルスベクター療法）を対象に投与すること、および補体阻害剤を当該対象に投与することを含み、それによって当該対象における補体活性化を低下させる。
一部の実施形態では、補体阻害剤は、Ｃ３阻害剤である。一部の実施形態では、Ｃ３の発現および／または活性のレベルは、対照の対象（例えば、遺伝子療法を受けているが、補体阻害剤を投与されていない対照の対象、または遺伝子療法を受け、Ｃ３阻害剤を投与される前の対照の対象）におけるＣ３の発現および／または活性の測定レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または１００％超低下する。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、ウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、もしくはＡＡＶ１１ベクター、またはそれらの任意のバリアントである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、治療用タンパク質、酵素、ホルモン、血液凝固因子、サイトカイン、または成長因子をコードする。一部の実施形態では、遺伝子療法は、血液障害、網膜疾患、自己免疫疾患、筋障害、神経障害、または癌の治療を目的としている。
一部の実施形態では、補体阻害剤は、対照（例えば、遺伝子療法を受けているが、補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、遺伝子療法に対する免疫応答（例えば、抗体、Ｂ細胞、および／またはＴ細胞の免疫応答）を減少させる。一部の実施形態では、遺伝子療法の有効性は、対照（例えば、遺伝子療法を受けているが、補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、約１週間、２週間、４週間、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、またはそれ以上で増加する。一部の実施形態では、ウイルスベクターの形質導入は、対照（例えば、遺伝子療法を受けているが、補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、改善される。一部の実施形態では、形質導入は、導入遺伝子発現のレベルを測定することによって評価される。一部の実施形態では、ウイルスベクターの補体介在性のクリアランスは、対照（例えば、遺伝子療法を受けているが、補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、減少する。
別の態様では、本開示は、遺伝子療法を受けている対象において、導入遺伝子を含むウイルスベクターの形質導入を増加させる方法を特徴としており、当該方法は、補体阻害剤（例えば、Ｃ３阻害剤）を当該対象に投与することを含み、この場合において当該対象において導入遺伝子の発現は、遺伝子療法を受けているが補体阻害剤を投与されていない対照の対象と比較して増加する。一部の実施形態では、例えば１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、６ヶ月、またはそれ以上での対象における導入遺伝子の発現は、対照の対象（例えば、遺伝子療法を受けているが、補体阻害剤を投与されていない対照の対象）における導入遺伝子の対応する発現レベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、またはそれ以上高い。一部の実施形態では、対象における導入遺伝子の発現レベルは、例えば１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、６ヶ月、またはそれ以上での期間にわたり、対照の対象（例えば、遺伝子療法を受けているが、補体阻害剤を投与されていない対照の対象）における導入遺伝子の対応する発現レベルと比較して、より安定的である。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、もしくはＡＡＶ１１ベクター、またはそれらの任意のバリアントである。
一部の実施形態では、導入遺伝子は、治療用タンパク質、酵素、ホルモン、血液凝固因子、サイトカイン、または成長因子をコードする。一部の実施形態では、遺伝子療法は、血液障害、網膜疾患、自己免疫疾患、筋障害、神経障害、または癌の治療を目的としている。
別の態様では、本開示は、遺伝子療法を受けている、または受けた対象における遺伝子療法の有効性を改善する方法を特徴としており、当該方法は、ａ）当該対象の血清サンプル中の補体活性のレベルを検出すること、およびｂ）対照と比較して補体活性のレベルが増加している場合に、当該対象に補体阻害剤（例えば、Ｃ３阻害剤）を投与すること、を含み、この場合において当該補体阻害剤は、対象において補体活性化を阻害する。一部の実施形態では、血清補体活性のレベルの検出は、第二経路（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ）アッセイ、古典的経路（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙ）アッセイ、またはその両方を使用して測定される。
一部の実施形態では、当該方法はさらに、当該対象に遺伝子療法を投与することを含む。一部の実施形態では、遺伝子療法は、ウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、もしくはＡＡＶ１１ベクター、またはそれらの任意のバリアントである。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、治療用タンパク質、酵素、ホルモン、血液凝固因子、サイトカイン、または成長因子をコードする。一部の実施形態では、遺伝子療法は、血液障害、網膜疾患、自己免疫疾患、筋障害、神経障害、または癌の治療を目的としている。
本明細書に記載される態様のいずれかにおいて、Ｃ３阻害剤は、コンプスタチン類似体、抗Ｃ３抗体、哺乳動物の補体制御タンパク質（ＣＲ１、ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＦＨ、またはＣＦＩ）、Ｃ３もしくはＣ３ｂを分解する酵素、Ｃ１阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）、補体受容体１の可溶型（ｓＣＲ１）、ＴＰ１０もしくはＴＰ２０、ミニファクターＨ、Ｅｆｂタンパク質、または補体阻害剤（ＳＣＩＮ）を含んでもよい。
一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、長時間作用型コンプスタチン類似体（ＬＡＣＡ）、コンプスタチン模倣体、または標的化型コンプスタチン類似体を含む。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、クリアランス低下部分（ＣＲＭ）、および少なくとも一つのコンプスタチン類似体部分を含む。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、少なくとも二つのコンプスタチン類似体部分が付加されているＣＲＭを含む。
一部の実施形態では、ＣＲＭは、ＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ＣＲＭは、約１０ｋＤ～約５０ｋＤ、例えば、約３５ｋＤ～約４５ｋＤ、例えば、約４０ｋＤの平均分子量を有する。
一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、各末端にコンプスタチン類似体部分が付加されている線形ポリマーを含む。
一部の実施形態では、各コンプスタチン類似体部分は、配列番号３～３６、３７、６９、７０、７１、および７２のうちの一つのアミノ酸配列を含む環状ペプチドを含む。
一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、一つ以上のコンプスタチン類似体部分に付加された一つ以上のクリアランス低下部分を含み、この場合において、各コンプスタチン類似体部分は、配列番号３～３６のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端、Ｃ末端またはその両方で一つ以上の末端アミノ酸により伸長される環状ペプチドを含み、この場合において当該アミノ酸の一つ以上は、一級アミンまたは二級アミンを含む側鎖を有し、および任意でオリゴ（エチレングリコール）部分を含む硬直性スペーサーまたは柔軟性スペーサーにより当該環状ペプチドから分離されており、そして各クリアランス低下部分は任意で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、この場合において各クリアランス低下部分は、連結部分を介して一つ以上のコンプスタチン類似体部分に共有結合され、およびこの場合において当該連結部分は、不飽和アルキル部分、非芳香族環状環系を含む部分、芳香族部分、エーテル部分、アミド部分、エステル部分、カルボニル部分、イミン部分、チオエーテル部分、および／またはアミノ酸残基を含む。
一部の実施形態では、各コンプスタチン類似体部分は、Ｎ末端、Ｃ末端またはその両方で一つ以上のアミノ酸により伸長される環状ペプチドを含み、この場合において当該一つ以上のアミノ酸は、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＥＥＡｃ）または１１－アミノ－３，６，９－トリオキサウンデカン酸を含む硬直性スペーサーまたは柔軟性スペーサーにより当該ペプチドの環状部分から分離される。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、ＣＡ２８－２ＴＳ－ＢＦを含む。
本明細書に記載される態様のいずれかにおいて、当該方法はさらに、当該対象に遺伝子療法を投与することを含み得る。一部の実施形態では、遺伝子療法および補体阻害剤は、対象に同時に、または連続して投与される。
一部の実施形態では、補体阻害剤の投与は、網膜下、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、脳内、髄腔内、膣内、経皮、直腸、硝子体内、吸入、または局所の投与を含む。一部の実施形態では、遺伝子療法は、網膜下、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、脳内、髄腔内、膣内、経皮、直腸、硝子体内、吸入、または局所の投与により投与される。一部の実施形態では、補体阻害剤および遺伝子療法は、同じ経路により投与される。一部の実施形態では、補体阻害剤および遺伝子治療は、異なる経路により投与される。
一部の実施形態では、補体阻害剤の投与は、対象が遺伝子療法を受けているときに、毎日、毎週、または毎月、補体阻害剤を投与することを含む。
一部の実施形態では、対象は、一つ以上の追加の遺伝子療法の投与を用いて治療され、有効性は、対照の対象（例えば、一つ以上の追加の遺伝子療法の投与で治療されたが、補体阻害剤は投与されなかった対照の対象）における有効性と比較して、特定の期間にわたり、当該対象において改善される。
一部の実施形態では、一つ以上の追加の遺伝子療法の投与は、過去に投与された遺伝子療法とは異なる導入遺伝子を使用した遺伝子療法である。
一部の実施形態では、一つ以上の追加の遺伝子療法の投与は、過去に投与された遺伝子療法において使用された同じ導入遺伝子を使用した遺伝子療法である。
一部の実施形態では、一つ以上の追加の遺伝子療法の投与は、過去に投与された遺伝子療法と同じ血清型であるウイルスベクターを使用した遺伝子療法である。
一部の実施形態では、一つ以上の追加の遺伝子療法の投与は、過去に投与された遺伝子療法とは異なる血清型であるウイルスベクターを使用した遺伝子療法である。
図１（約４０ｋＤのＰＥＧ部分を想定）は、ＣＡ２８－２ＴＳ－ＢＦの構造を示す。
図２は、１／２０、１／４０、および１／８０の血清希釈、および約１０ｋＤのＰＥＧを有し、ＨｕＨ７細胞に送達された図１のＰＥＧ化コンプスタチン類似体（ＣＡ）を異なる量（０、１０、および１００μｍ）で含む培養培地中でインキュベートされたＡＡＶ３ｂウイルス粒子の相対的な形質導入効率を比較するグラフである。示される結果は、１００μＭのＣＡサンプルの値に対して正規化される。
図３は、１／２０、１／４０、および１／８０の血清希釈、および約１０ｋＤのＰＥＧを有し、ＨｕＨ７細胞に送達された図１のＰＥＧ化コンプスタチン類似体（ＣＡ）を異なる量（０、１０、および１００μｍ）で含む培養培地中でインキュベートされたＡＡＶ３ｂウイルス粒子の相対的な形質導入効率を比較するグラフである。示される結果は、１００μＭのＣＡサンプルの値に対して正規化される。定義
動物：本明細書において使用される場合、「動物」という用語は、動物界のいずれかを指す。一部の実施形態において、「動物」とは、いずれかの成長段階のヒトを指す。一部の実施形態において、「動物」とは、いずれかの成長段階の非ヒト動物を指す。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物としては限定されないが、哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類、および／または蠕虫が挙げられる。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作動物、および／またはクローンであってもよい。
抗体：本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原に結合する能力を有する免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンまたはその誘導体を指す。抗体は、例えば、ヒト、齧歯類、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどの任意の種の抗体であってもよい。抗体は、以下のヒトクラスのいずれかを含む、任意の免疫グロブリンクラスの一種であってもよい：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、または例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのそれらのサブクラス。本発明の様々な実施形態において、抗体は、例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（一本鎖可変）、または抗原結合部位を保持する他の断片、または組換え産生された断片を含む組換え産生されたｓｃＦｖ断片などの断片である。例えば、Ａｌｌｅｎ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．２，７５０－７６５，２００２、および当該文献中の参照文献を参照のこと。抗体は、一価、二価、または多価であり得る。抗体は、例えば、げっ歯類起源の可変ドメインが、ヒト起源の定常ドメインに融合されており、それに伴いげっ歯類抗体の特異性が保持されている、キメラ抗体または「ヒト化」抗体であってもよい。ヒト起源のドメインは、最初にヒトにおいて合成されているという意味で、直接ヒトを起源とする必要はない。むしろ「ヒト」ドメインは、そのゲノムがヒト免疫グロブリン遺伝子を組み込んでいる齧歯類において作製されてもよい。例えば、Ｖａｕｇｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５－５３９を参照のこと。抗体は、部分的または完全にヒト化されてもよい。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよいが、本発明の目的に対しては、モノクローナル抗体が概して好ましい。事実上、すべての対象分子に特異的に結合する抗体を作製する方法が、当分野に公知である。例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、（分子またはその抗原性断片への自然な暴露の後、またはそれらを用いた免疫化の後に）抗体を産生する動物の血液または腹水から精製することができ、細胞培養またはトランスジェニック生物体での組み換え技術を使用して作製することができ、または少なくとも部分的には化学合成により作製することができる。
およそ：本明細書で使用される場合、数値に関連した「およそ」または「約」という用語は概して、別段の記載がない限り、または文脈から別段であることが明白でない限り、数値のいずれかの方向（～よりも大きい、または未満）において、５％、１０％、１５％、または２０％の範囲内にある数を含むと捉えられる（当該数が、可能性のある値の０％未満であるか、または１００％を超える場合を除く）。
併用療法：本明細書で使用される場合、「併用療法」という用語は、重複するレジメンにおいて二つ以上の異なる薬剤が投与され、対象が両方の剤に同時に暴露される状況を指す。併用療法で使用される場合、二つ以上の異なる剤は、同時にまたは別々に投与されてもよい。この併用での投与は、同じ剤形の二つ以上の剤の同時投与、別個の剤形の同時投与、および別個の投与を含み得る。すなわち、二つ以上の剤を、同じ剤形で一緒に製剤化し、同時に投与されてもよい。あるいは、二つ以上の剤が同時に投与されてもよく、この場合において当該剤は別個の製剤中に存在する。別の代替例では、第一の薬剤を投与し、次いで一つ以上の追加の剤を投与してもよい。別個の投与プロトコルにおいて、二つ以上の剤は、数分、または数時間、数日、もしくは数週間を空けて投与してもよい。一部の実施形態において、二つ以上の剤は、１～２週間空けて投与されてもよい。
補体成分：本明細書で使用される場合、「補体成分」または「補体タンパク質」という用語は、補体系の活性化に関与する、または一つ以上の補体介在性の活性に関与する分子である。古典的補体経路の成分としては例えば、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、およびＣ５ｂ－９複合体が挙げられ、細胞膜障害性複合体（ＭＡＣ）や、前述のいずれか（例えば、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ５ａなど）の活性断片または酵素切断産物とも呼称される。第二経路の成分としては例えば、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｈ因子、およびＩ因子、ならびにプロペルジン（ｐｒｏｐｅｒｄｉｎ）が挙げられ、Ｈ因子は、当該経路の負の調節因子である。レクチン経路の成分としては例えば、ＭＢＬ２、ＭＡＳＰ－１、およびＭＡＳＰ－２が挙げられる。補体成分には、可溶性補体成分の細胞結合型受容体も含まれる。そのような受容体としては例えば、Ｃ５ａ受容体（Ｃ５ａＲ）、Ｃ３ａ受容体（Ｃ３ａＲ）、補体受容体１（ＣＲ１）、補体受容体２（ＣＲ２）、補体受容体３（ＣＲ３）などが挙げられる。「補体成分」という用語に、例えば、抗原抗体複合体、微生物または人工物表面上に存在する外来性構造などの補体活性化の「トリガー」としての役割を果たす分子および分子構造を含むことは意図されないことを認識するであろう。
相補的ＤＮＡ：本明細書で使用される場合、「相補的ＤＮＡ」、または「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡの逆転写により合成され、そこから介在配列（イントロン）が除去された組換えポリヌクレオチドを含む。
同時投与：本明細書で使用される場合、例えば治療剤などの二つ以上の剤に関して、「同時投与」という用語は、投与された剤が、例えば、体内の一つ以上の作用部位など体内において、無視できない量である期間にわたり一緒に存在する用量および期間を使用して実施される投与である。期間は、分（例えば、少なくとも１分、１～３０分、３０～６０分）、時間（例えば、少なくとも１時間、１～２時間、２～６時間、６～１２時間、１２～２４時間）、日（例えば、少なくとも１日、１～２日、２～４日、４～７日など）、週（例えば、少なくとも１、２、または３週間など）であってもよい。したがって剤は、単一の組成物の一部として一緒に投与されてもよいが、されなくてもよい。さらに剤は、本質的に同時に（例えば、５分未満空けて、または１分未満空けて）、または互いに短時間内に（例えば、１時間未満空けて、３０分未満空けて、１０分未満空けて、およそ５分開けて）投与されてもよいが、されなくてもよい。本開示の様々な実施形態によると、そのような期間内に投与される剤は、実質的に同時に投与されるとみなされ得る。本開示の特定の実施形態では、同時投与される薬剤は、期間にわたり、身体内（例えば、血中および／または局所補体活性化部位）で有効濃度で存在する。同時に投与されるとき、特定の生物学的応答を惹起させるために必要な各剤の有効濃度は、単独で投与されるときの各剤の有効濃度よりも低い場合があり、それに伴い、剤が単剤として投与されたときに必要とされるであろう投与量と比較して、当該剤の一つ以上の投与量が減少し得る。複数の剤の効果は、相加的または相乗的であってもよいが、なくてもよい。剤は複数回投与されてもよい。剤の無視できない濃度は、例えば、所望の生物学的応答などの特定の生物学的応答を惹起させるために必要とされるであろう濃度の約５％未満であってもよい。
宿主細胞：本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、外因性ＤＮＡ（組み換え、または別手段による）が導入される細胞を指す。本開示を読む当業者であれば、当該用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫細胞も指すことを理解するであろう。変異または環境的影響のいずれかに起因して特定の修飾がその後の世代に発生する場合があるため、そのような子孫細胞は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書において使用される場合において、それでも「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。一部の実施形態では、宿主細胞は、外因性ＤＮＡ（例えば、組み換え核酸配列）の発現に適した生物界のいずれかから選択される原核細胞および真核細胞を含む。例示的な細胞としては、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）の細胞、細菌細胞（例えば、大腸菌、バチルス種、ストレプトマイセス種などの株）、抗酸菌細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）など）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えばハイブリドーマやクアドローマなどの細胞融合体が挙げられる。一部の実施形態において、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウスの細胞である。一部の実施形態において、細胞は、真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えばＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えばＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３ Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ミエローマ細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞から誘導された細胞株。一部の実施形態では、細胞は、一つ以上のウイルス遺伝子を含有する。
同一性：本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、例えばポリペプチド分子間、および／または核酸分子間（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）などのポリマー分子間の全体的な関連性を指す。一部の実施形態では、ポリマー分子は、その配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合、相互に「実質的に同一」であると見なされる。二つの核酸配列またはポリペプチド配列の同一性のパーセントの計算は、例えば、最適比較を目的とした二つの配列のアライメント（例えば、最適アライメントを目的として第一の配列と第二の配列のうちの一つまたは両方にギャップが導入されてもよく、非同一配列は、比較目的に対し、無視されてもよい）を行うことにより実施することができる。特定の実施形態では、比較目的のためにアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次に、対応する位置のヌクレオチドが比較される。第一の配列中の位置が、第二の配列中の対応する位置と同じ残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）により占められているとき、当該分子は、当該位置で同一である。二つの配列間の同一性のパーセントは、当該配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、当該二配列の最適アライメントを目的として導入が必要なギャップ数、および各ギャップの長さを考慮する。配列の比較、および二配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して実施されてもよい。例えば、二つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれた、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１－１７）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。一部の例示的な実施形態では、ＡＬＩＧＮプログラムを用いて生成された核酸配列比較は、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用する。あるいは、二つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して決定されてもよい。
連結された：本明細書で使用される場合、二つ以上の部分に関して使用されるときの「連結された」という用語は、当該部分が物理的に互いに会合されて、または接続されて、充分に安定的な分子構造を形成し、それにより当該連結が形成される条件下で当該部分が会合を維持することを意味し、好ましくは当該条件は、例えば生理学的条件など、新たな分子構造が使用される条件である。本発明の特定の好ましい実施形態では、連結は、共有結合である。他の実施形態では、連結は、非共有結合性である。部分は、直接的または間接的のいずれかで連結されてもよい。二つの部分が直接連結されているとき、それら部分は、互いに共有結合されているか、または充分に近接し、当該二つの部分の間の分子間力がその会合を維持する。二つの部分が間接的に連結されるとき、それらは各々、共有結合的に、または非共有結合的に第三の部分に連結され、当該二つの部分の会合が維持される。概して二つの部分が「リンカー」または「連結部分」または「連結部分」により連結されると呼称される場合、当該二つの連結部分間の連結は間接的であり、典型的には、連結された各部分はリンカーに共有結合される。リンカーは、部分（条件に応じて保護される）の安定性に合致する条件下で、合理的な期間内、連結される二つの部分と反応する任意の適切な部分であってもよく、合理的な収率をもたらすために充分な量であってもよい。
局所投与：本明細書で使用される場合、「局所投与」または「局所送達」とは、本明細書に記載される補体阻害剤の送達に関連して、血管系を介した目的の標的組織または標的部位への補体阻害剤の輸送に頼らない送達を指す。本明細書に記載される補体阻害剤は、目的の標的組織もしくは標的部位、または例えば目的の標的組織もしくは標的部位に近接したその近傍に、直接送達されてもよい。例えば補体阻害剤は、組成物もしくは剤の注射または移植により送達されてもよく、または組成物もしくは剤を含むデバイスの注射または移植により送達されてもよい。標的組織または標的部位の近傍で局所投与を行った後、本明細書に記載される補体阻害剤、またはその一つ以上の成分が、目的の標的組織または標的部位へと拡散されてもよい。局所的に送達されると、本明細書に記載の補体阻害剤の一部（典型的には、投与された用量のごく一部のみ）は血管系に入り、目的の標的組織または標的部位への戻りを含む、別の場所へと輸送され得ることが理解されよう。本明細書で使用される場合、「局所投与」または「局所送達」とは、本明細書に記載されるウイルスベクターの送達に関連して、血管系を介した目的の標的組織または標的部位へのウイルスベクターの輸送に頼り得る送達を指す。
局所補体活性化：本明細書で使用される場合、「局所補体活性化」という用語は、血管系の外側で発生する補体活性化を指す。
動作可能に連結される：本明細書で使用される場合、「操作可能に連結した」という用語は、記載される構成要素が、それらが意図された様式で機能することができるような関係にある並置を指す。機能性要素に「動作可能に連結される」制御性要素は、当該機能性要素の発現および／または活性が、当該制御性要素に合致した条件下で実現されるような方法で会合される。一部の実施形態では、「動作可能に連結される」制御性要素は、対象のコード要素と連続的である（例えば共有結合されている）。一部の実施形態では、制御性要素は、対象の機能性要素で、トランスで、または別段により作用する。
組み換え体：本明細書で使用される場合、「組み換え体」という用語は、例えば宿主細胞内にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現されたポリペプチド；組み換え体から単離されたポリペプチド；コンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリ；ポリペプチドまたは一つ以上のその構成要素、部分、要素、もしくはドメインをコードする、および／またはその発現を指示する遺伝子または遺伝子構成用をに関しトランスジェニックである、または別段によりそれらを発現するよう操作された動物（例えばマウス、ウサギ、ヒツジ、魚など）から単離されたポリペプチド；ならびに／または選択核酸配列要素を互いにスプライシングする、もしくはライゲーションする、選択配列要素を化学合成する、ならびに／またはポリペプチドまたは一つ以上のその構成要素、部分、要素もしくはドメインをコードする、および／またはその発現を指示する核酸を別段で作製することを含む、任意の他の手段により調製、発現、生成、または単離されたポリペプチドなどの組み換え手段により設計され、操作され、調製され、発現され、生成され、製造され、および／または単離される核酸またはポリペプチドを指す。一部の実施形態では、そのような選択配列要素の一つ以上が、自然に存在する。一部の実施形態では、そのような選択配列要素の一つ以上が、インシリコで設計される。一部の実施形態では、一つ以上のそのような選択配列要素は、例えば、対象の供給生物体（例えば、ヒトまたはマウスなど）の生殖細胞系列における、天然源または合成源に由来する公知の配列要素の（例えば、インビトロまたはインビボの）突然変異誘導から生じる。
ＲＮＡ干渉：本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」という用語は概して、二本鎖ＲＮＡ分子または短ヘアピン型ＲＮＡ分子が実質的な、または完全な相同性を共有する核酸配列の発現を、二本鎖ＲＮＡ分子または短ヘアピン型ＲＮＡ分子が低下または阻害するプロセスを指す。いかなる理論にも拘束されることは望まないが、自然界においてＲＮＡｉ経路は、Ｄｉｃｅｒとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって開始されると考えられている。当該エンドヌクレアーゼは、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を、典型的には２塩基の３’オーバーハングを有する２１～２３塩基対の二本鎖断片へと切断する（長さおよびオーバーハングの変動も予期される）。これを「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）と呼称する。そのようなｓｉＲＮＡは、標的配列に対し実質的に相補的な領域を含む「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」と、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的な領域を含む「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」の二つの一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を含む。当業者であれば、ガイド鎖は、標的ＲＮＡの標的領域に対して完全に相補的であってもよく、または標的ＲＮＡの標的領域に対して完全ではない相補性であってもよいことを認識するであろう。
連続投与：本明細書で使用される場合、二つ以上の剤の「連続投与」という用語は、対象の体内に、または体内の関連する活性部位に、剤が無視できない濃度を超えて一緒に存在しないように、対象に二つ以上の薬剤を投与することを指す。剤の投与は、必ずではないが、交互であってもよい。各剤は、複数回投与されてもよい。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」または「被験対象」という用語は、例えば、実験、診断、予防、および／または治療目的のために、本発明に従って提供される化合物または組成物が投与される任意の生物体を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、および／またはヒトなどの哺乳動物、昆虫、蠕虫など）および植物が挙げられる。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、および／または状態に罹患していてもよく、および／またはそれらに対し感受性であってもよい。
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、対象の特徴もしくは特性の全て、もしくはほぼ全ての範囲または程度を示す定性的な状態を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的および化学的な現象が、完了まで到達すること、および／もしくは完全性にまで進展すること、または完全な結果を実現すること、または完全に結果を回避することは滅多にないことを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的および／または化学的な現象に固有の完全性の潜在的な欠落を捉えるために本明細書において使用される。
～に罹患する：疾患、障害、および／または状態に「罹患している」個体は、疾患、障害、および／または状態の一つ以上の症状で診断され、および／または症状を呈している。
全身的：本明細書で使用される場合、補体成分に関して「全身的」という用語は、肝臓の肝細胞によって合成され、血流に入るか、または循環マクロファージもしくは単球もしくは他の細胞によって合成され、血流中に分泌される補体タンパク質を指す。
全身補体活性化：本明細書で使用される場合、「全身補体活性化」という用語は、血液、血漿、または血清に生じる補体活性化であり、および／または体中の多くの場所での全身性の補体タンパク質の活性化を伴うもので、多くの体組織、システム、または器官に影響を及ぼす。
全身投与：本明細書で使用される場合、「全身投与」という用語および類似の用語は、薬剤が相当の量で体内に広く分布し、血液中で例えば所望の効果などの生物学的効果があり、および／または血管系を介して所望の作用部位に到達する剤の投与を指し、当分野でのその使用と一貫して本明細書で使用される。典型的な全身的な投与経路は、（ｉ）剤を血管系に直接導入すること、または（ｉｉ）剤が吸収され、血管系に入り、血液を介して一つ以上の所望の作用部位へと入る、皮下、経口、肺、もしくは筋肉内投与による投与を含む。
標的遺伝子：本明細書で使用される場合、「標的遺伝子」とは、その発現が調節される、例えば、阻害される遺伝子を指す。本明細書で使用される場合、「標的ＲＮＡ」とは、一つ以上の剤、例えば、一つ以上のｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用して、分解される、または翻訳的に抑制される、または他の方法で阻害されるＲＮＡを指す。標的ＲＮＡは、標的配列または標的転写物と呼称される場合もある。ＲＮＡは、標的遺伝子（例えば、プレｍＲＮＡ）から転写された一次ＲＮＡ転写物、またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡなどのプロセッシング済み転写物であってもよい。本明細書で使用される場合、「標的部分」または「標的領域」という用語は、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列の連続的な部分を指す。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの標的部分は、適切なｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの存在下で、その部分内でのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）介在性の切断の基質としての機能を果たすのに充分な長さである。標的部分は、約８～３６ヌクレオチドの長さであってもよく、例えば、約１０～２０または約１５～３０ヌクレオチドの長さであってもよい。標的部分の長さは、上述の範囲内の特定の値または部分範囲を有してもよい。例えば、特定の実施形態では、標的部分は、約１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチドの長さであってもよい。
治療剤：本明細書で使用される場合、「治療剤」という文言は、対象に投与されたとき、治療効果を有する、および／または所望の生物学的効果を発揮する、および／または薬理学的効果を発揮する任意の剤を指す。一部の実施形態では、治療剤は、対象に投与されたとき、例えば本明細書に記載のウイルスベクターに対する免疫反応などの望ましくない副作用を防止できる剤であってもよい。一部の実施形態では、治療剤は、疾患、障害、および／または状態の一つ以上の症状もしくは特性を軽減する、改善する、緩和する、抑制する、予防する、その開始を遅延する、その重症度を低減する、および／またはその発症率を低下するために使用することができる物質である。
治療有効量：本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、治療レジメンの一部として投与されるときに所望の生物学的応答を惹起させる物質（例えば、治療剤、組成物、および／または製剤）の量を意味する。一部の実施形態では、物質の治療有効量は、疾患、障害、および／もしくは状態に罹患しているか、または感受性の対象に投与されたとき、当該疾患、障害、および／または状態を治療、診断、予防、および／または発症遅延させるために充分な量である。一部の実施形態では、物質の治療有効量は、疾患、障害、および／もしくは状態に罹患しているか、または感受性の対象に投与されたとき、例えば本明細書に記載されるウイルスベクターに対する免疫応答などの望ましくない副作用の発生を治療、予防および／または遅延させるために充分な量である。当業者であれば理解されるように、物質の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される物質、標的の細胞または組織等の因子に応じて変化し得る。例えば、疾患、障害、および／または状態を治療するための製剤中の化合物の有効量は、疾患、障害、および／または状態の一つ以上の症状または兆候を緩和、改善、軽減、阻害、防止、その発生を遅延、その重症度を低下、および／またはその発生率を低下させる量である。一部の実施形態では、治療有効量は、単回投与量で投与される。一部の実施形態では、治療有効量を送達するために複数の単位用量が必要とされる。
治療すること：本明細書で使用される場合、「治療すること」という用語は、治療を提供すること、すなわち、任意のタイプの医学的または外科的な対象の管理を提供することを指す。治療は、疾患、障害、もしくは状態を逆転させる、緩和する、進行を阻害する、予防する、また可能性を低下させるために提供されてもよく、または疾患、障害、もしくは状態の一つ以上の症状または発現を逆転させる、緩和する、進行を阻害するもしくは予防する、予防する、または可能性を低下させるために提供されてもよい。「予防する」とは、少なくとも一部の個体において、少なくともある期間、疾患、障害、状態、またはその症状もしくは発現をさせないことを指す。治療することは、補体介在性の状態を示す一つ以上の症状の発生または発現の後に、対象に剤を投与して、例えば状態を逆転させる、緩和する、その重症度を低下させる、および／またはその進行を阻害するもしくは予防する、ならびに／または状態の一つ以上の症状もしくは発現を逆転させる、緩和する、その重症度を低下させる、および／または阻害することを含んでもよい。本開示の組成物は、補体介在性障害を発症した対象、または一般的な集団の人々と比較してそのような障害を発症するリスクが高い対象に投与してもよい。本開示の組成物は、予防的に、すなわち、状態の任意の症状または発現の前に投与されてもよい。この場合、典型的には対象は状態を発症するリスクがある。
核酸：「核酸」という用語は、任意のヌクレオチド、その類似体、およびそのポリマーを含む。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー型を指す。これらの用語は分子の一次構造を指し、ゆえに二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡを含む。これらの用語には、均等として、限定されないが、メチル化、保護、および／もしくはキャップ化ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体および修飾ポリヌクレオチドから作製されたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体を含む。当該用語は、ポリヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、核酸塩基および／もしくは修飾核酸塩基のＮ－グリコシドまたはＣ－グリコシドに由来するＲＮＡまたはＤＮＡ、糖および／もしくは修飾糖に由来する核酸、ならびにリン酸架橋および／または修飾リン原子架橋（本明細書において「ヌクレオチド間結合」とも呼称される）に由来する核酸を包含する。当該用語は、核酸塩基、修飾核酸塩基、糖、修飾糖、リン酸架橋、または修飾リン原子架橋の任意の組み合わせを含有する核酸を包含する。例としては限定されるないが、リボース部分を含有する核酸、デオキシ－リボース部分を含有する核酸、リボース部分とデオキシリボース部分の両方を含有する核酸、リボース部分を修飾リボース部分を含有する核酸が挙げられる。一部の実施形態では、接頭辞のポリ－は、２～約１０，０００個、２～約５０，０００個、または２～約１００，０００個のヌクレオチド単量体単位を含有する核酸を指す。一部の実施形態では、接頭辞のオリゴ－は、２～約２００個のヌクレオチド単量体単位を含有する核酸を指す。
ベクター：本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ある種のベクターは、「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントがその中にライゲーションされ得る環状二本鎖のＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、このベクターでは追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム内にライゲーションされ得る。特定のベクターは、自身が導入される宿主細胞内で自律複製することができる（例えば細菌複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム性の哺乳動物ベクターなど）。他のベクター（例えば非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内に導入されると、宿主細胞のゲノム内に組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに特定のベクターは、操作可能に連結された遺伝子の発現を指示する能力を有する。そのようなベクターは本明細書において、「発現ベクター」と呼称される。当業者であれば、本明細書に記載される「ウイルスベクター」が、本明細書に記載の導入遺伝子、例えばカプシドタンパク質に加えてウイルス構成要素を含むことを理解する。
組み換えＤＮＡ法、オリゴヌクレオチド合成法、および組織培養法、および形質転換法（例えばエレクトロポレーション法、リポフェクション法）に関し、標準的な技術を使用してもよい。酵素反応および精製技術は、メーカーの仕様に従って、または当該技術分野で普遍的に実施されるように、または本明細書に記載されるように実施されうる。前述の技術および手順は、当該技術分野で公知の従来的な方法に従って、および本明細書全体を通して引用および検討される様々な一般的およびより具体的な参照文献中に記載されているように、一般的に実施されることができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。本文献は、任意の目的に対し、参照により本明細書に組み込まれる。
ウイルスベクターは、例えば遺伝子療法などの様々な用途に対する有望な治療剤である。ウイルスベクターは、例えば治療用タンパク質または治療用核酸をコードする導入遺伝子を含み得る。しかし残念なことにウイルスベクター治療剤の使用は成功しない可能性があり、その原因は部分的にはウイルスベクターに対する免疫応答である。これらの免疫応答は、抗体、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の応答を含み得、例えばウイルスのカプシドタンパク質もしくはコートタンパク質またはそのペプチドなどのウイルスベクターのウイルス抗原に特異的であり得る（例えば、Ｃｏｌｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８：８７－１０４（２０１８）を参照のこと）。
本開示は、ウイルスベクター治療剤に関するそうした限界に対処する方法および組成物を提供する。特に本開示は、補体阻害剤（例えば、本明細書に記載される補体阻害剤）と組み合わされたウイルスベクターの使用を提供する。理論に拘束されることは望まないが、かかる組み合わせは、ウイルスベクター遺伝子の導入を改善し、カプシドのＣ３オプソニン化を防止し、および／または免疫反応（例えば、抗体、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の応答）を低下もしくは防止することができると考えられる。したがって本開示の方法は、ウイルスベクター治療剤の有効性を増加させ、および／またはウイルスベクター治療剤の有効性における実際的な減少を低下させることができる。
Ｉ．遺伝子療法／ウイルスベクター
本開示の方法および組成物は、当該技術分野で公知である、または本明細書に記載される任意のウイルスベクターの有効性を増加させることができ、本開示は、任意の特定のウイルスベクターに限定されない。例えば、理論に拘束されることは望まないが、本明細書に記載される補体阻害剤を使用して、例えば、投与部位から標的細胞または標的組織への輸送中にウイルスベクターを保護することができ、抗ウイルスベクター中和抗体（例えば、同じウイルスベクターを用いた再処置を妨げ得るか、または抑制し得る）の形成を低下させることができ、および／または例えば臓器損傷（例えば腎臓損傷）をもたらし得る炎症性反応を防止もしくは低下させることができる。好適なウイルスベクターの非限定的な例としては、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ラウス肉腫ウイルス）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ＳＶ４０型ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、エプスタインバールウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクタ、およびポリオウイルスベクターが挙げられる。
レトロウイルスは、レトロウイルス科に属するエンベロープ型ウイルスである。宿主細胞内に入ると、ウイルスは、ウイルス逆転写酵素酵素を使用して自身のＲＮＡをＤＮＡに転写することによって複製する。レトロウイルスのＤＮＡは、宿主ゲノムの一部として複製され、プロウイルスと呼ばれる。選択核酸は、当該技術分野で公知の技術を使用して、ベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。複製欠損レトロウイルスの作製のためのプロトコルは当該技術分野で公知である（例えば、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）ａｎｄ Ｍｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）を参照のこと）。次いで組換えウイルスを単離し、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達してもよい。多くのレトロウイルス系が当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，９９４，１３６号、第６，１６５，７８２号、および第６，４２８，９５３号を参照のこと。レトロウイルスには、アルファレトロウイルス属（例えば、ニワトリ白血病ウイルス）、ベータレトロウイルス属（例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルス）、デルタレトロウイルス属（例えば、ウシ白血病ウイルスおよびヒトＴリンパ球向性ウイルス）、イプシロンレトロウイルス属（例えば、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス）、およびレンチウイルス属が含まれる。
一部の実施形態では、レトロウイルスは、レトロウイルス科のレンチウイルスである。レンチウイルスベクターは、非増殖細胞を形質導入し、低免疫原性を示し得る。一部の例では、レンチウイルスは限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２）、サル免疫不全ウイルス（Ｓ１Ｖ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血（ＥＩＡ）、およびビスナウイルスである。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで相当なレベルの核酸伝達を実現することができる。
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）系のウイルスベクターも、本明細書に提供される使用に適している。多くの複製欠損ＨＳＶベクターが、一つ以上の中間－初期の遺伝子を除去する欠失を含有しており、複製が阻害されている。ヘルペスベクターの利点は、後期ステージに入り、長期的にＤＮＡ発現を生じさせ得ることができる能力と、最大２５ｋｂもの外因性ＤＮＡを収容できる、その巨大なウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶ系ベクターの説明については、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、第５，８４６，７８２号、第５，８４９，５７２号、および第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願公開ＷＯ９１／０２７８８、ＷＯ９６／０４３９４、ＷＯ９８／１５６３７、およびＷＯ９９／０６５８３を参照のこと。
一部の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡを含有する巨大なウイルス科である。アデノウイルスは宿主細胞の核内で複製し、宿主の細胞機構を使用してウイルスのＲＮＡ、ＤＮＡ、およびタンパク質を合成する。アデノウイルスは、当分野において、複製細胞および非複製細胞の両方に感染し、巨大な導入遺伝子を収容し、宿主細胞ゲノム内に統合されることなくタンパク質をコードすることが知られている。ウイルス複製に必要な選択遺伝子を削除することによって、アデノウイルスを複製欠損性とすることができる。より大きなＤＮＡの挿入用の追加スペースを得るために、必要性の低い複製必須ではないＥ３領域もよく削除される。ウイルスベクターの基となり得るアデノウイルスは、任意の起源、任意の亜群、任意のサブタイプ、サブタイプの混合、または任意の血清型に由来してもよい。例えばアデノウイルスは、亜群Ａ（例えば、血清型１２、１８、および３１）、亜群Ｂ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、および５０）、亜群Ｃ（例えば、血清型１、２、５、および６）、亜群Ｄ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２～３０、３２、３３、３６～３９、および４２～４８）、亜群Ｅ（例えば、血清型４）、亜群Ｆ（例えば、血清型４０および４１）、未分類亜群（例えば、血清型４９および５１）または任意の他のアデノウイルス血清型のウイルスであってもよい。アデノウイルス血清型１～５１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、バージニア州、マナッサス）から入手可能である。非Ｃ群アデノウイルス、さらには非ヒトアデノウイルスを使用して、複製欠損性アデノウイルスベクターを作製することもできる。非Ｃ群アデノウイルスベクター、非Ｃ群アデノウイルスベクターを作製する方法、および非Ｃ群アデノウイルスベクターを使用する方法は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号、第５，８３７，５１１号、および第５，８４９，５６１号、ならびに国際特許出願公開ＷＯ ９７／１２９８６およびＷＯ ９８／５３０８７に開示されている。アデノウイルスベクターのさらなる例は、米国特許公開２０１５００９３８３１、２０１４０２４８３０５、２０１２０２８３３１８、２０１００００８８８９、２００９０１７５８９７、および２００９００８８３９８に見出すことができる。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶ系は当該技術分野で一般的に公知である（例えば、Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０－１７（１９９４）；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９（１３）：６０９４－９８（１９９２）；Ｃｕｒｉｅｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ，１３（２－３）：１４１－６４（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９（１９９２）；およびＡｓｏｋａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０（４）：６９９－７０８（２０１２）を参照のこと。ＡＡＶベクターを作製および使用するための方法は、例えば、米国特第５，１３９，９４１号および第４，７９７，３６８号に記載されている。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（例えば、ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、およびＡＡＶ１１、ならびにそれらのバリアントを含む、いくつかのＡＡＶ血清型が特徴解析されている。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９ベクター（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型）である。他のＡＡＶベクターは、例えば、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ．２０１０ Ｆｅｂ １５；８１（２－３）：２７３に記載されている。概して、任意のＡＡＶ血清型を使用して、本明細書に記載される導入遺伝子を送達してもよい。しかしながら血清型は、異なる指向性を有しており、例えば、血清型は異なる組織に優先的に感染する。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶベクターである。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、天然ＡＡＶである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、改変ＡＡＶ（すなわち天然ＡＡＶのバリアント）である。一部の実施形態では、改変ＡＡＶベクターは、任意の公知のベクター操作法によって作製されてもよい。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、例えばＤＮＡシャッフリング、ペプチド挿入またはランダム突然変異誘導などの定方向進化により作製され、ＡＡＶ配列に改変を導入し、例えば中和抗体による免疫応答もしくは認識を回避または低減させるなど、遺伝子療法に関する一つ以上の特性を改善してもよく、ならびに／またはより効率的な形質導入および／もしくは標的化形質導入に関する一つ以上の特性を改善してもよい（Ａｓｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０．２（２０１２）：３２９－３３８）。ＡＡＶベクターを操作するための定方向進化の方法は、例えば米国特許第 ８，６３２，７６４号などに見出すことができる。一部の実施形態では、改変ＡＡＶは、特定の指向性を含むように改変される。
ＡＡＶベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性の５’および３’末端逆位リピート配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照のこと）。ＩＴＲ配列は約１４５ｂｐの長さである。一部の実施形態では、実質的にＩＴＲをコードする配列全体がＡＡＶベクターで使用されるが、これら配列のある程度の軽微な改変は許容される。これらのＩＴＲ配列を改変する技能は、当業者の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；ａｎｄ Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）などの書籍を参照のこと）。本開示のＡＡＶベクターの例は、導入遺伝子を含有する「シス作用型」プラスミドであり、その中で選択された導入遺伝子配列および関連する制御エレメントは、５’および３’のＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接される。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在特定されている哺乳動物ＡＡＶ型を含む、任意の公知のＡＡＶから取得されてもよい。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、例えば大型の導入遺伝子（例えば、およそ５ｋｂを超える導入遺伝子）の送達に関して、デュアルまたはトリプルのＡＡＶベクターであってもよい。一部の実施形態では、デュアルＡＡＶベクターは、二つの別個のＡＡＶベクターを含んでもよく、各ベクターが、対象の大型導入遺伝子の完全配列の断片を含み、そして再結合されると、当該断片は、当該対象の大型導入遺伝子の完全配列またはその機能的部分を形成する。
一部の実施形態では、トリプルＡＡＶベクターは、三つの別個のＡＡＶベクターを含んでもよく、各ベクターが、対象の大型導入遺伝子の配列の断片を含み、そして再結合されると、当該断片は、当該対象の大型導入遺伝子の完全配列またはその機能的部分を形成する。
デュアルまたはトリプルのＡＡＶベクターの複数のＡＡＶベクターが同じ細胞に送達され、同時に形質導入され、そこで導入遺伝子の二つまたは三つの断片が一緒に再結合され、対象の大型導入遺伝子全体の単一ｍＲＮＡ転写物が生成される。一部の実施形態では、断片化された導入遺伝子は、非重複配列を含む。一部の実施形態では、断片化された導入遺伝子は、特定の重複配列を含む。
一部の実施形態では、デュアルまたはトリプルの複数のＡＡＶベクターは、同じタイプのＡＡＶベクターであってもよい。一部の実施形態では、デュアルまたはトリプルの複数のＡＡＶベクターは、異なるタイプのＡＡＶベクターであってもよい。一部の実施形態では、対象の大型導入遺伝子の第一の断片を担持する第一のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（例えば、ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはそのバリアントを含んでもよい。一部の実施形態では、対象の大型導入遺伝子の第二の断片を担持する第二のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（例えば、ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはそのバリアントを含んでもよい。一部の実施形態では、対象の大型導入遺伝子の第三の断片を担持する第三のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（例えば、ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはそのバリアントを含んでもよい。ウイルスベクターは、アルファウイルスに基づいていてもよい。アルファウイルスには、シンドビス（およびＶＥＥＶ）ウイルス、アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス、バーマフォレストウイルス、べバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス、カバソウ（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレイズウイルス、フォートモルガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス、ゲタウイルス、ハイランドＪ（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ Ｊ）ウイルス、キジラガ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス、マヤロウイルス、Ｍｅ Ｔｒｉウイルス、ミデルブルグ（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ）ウイルス、モッソダスペドラ（Ｍｏｓｓｏ ｄａｓ ｐｅｄｒａｓ）ウイルス、ムカンボ（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス、Ｎｄｕｍｕウイルス、オニョンニョンウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、ロスリバーウイルス、サケ膵臓病（Ｓａｌｍｏｎ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス、セムリキ森林ウイルス、南部ゾウアザラシ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｌｅｐｈａｎｔ ｓｅａｌ ｖｉｒｕｓ）ウイルス、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）ウイルス、トロカラ（Ｔｒｏｃａｒａ）ウイルス、ウナ（Ｕｎａ）ウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、西部馬脳炎ウイルス、およびワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルスが含まれる。概して、こうしたウイルスのゲノムは、宿主細胞の細胞質内で翻訳され得る非構造タンパク質（例えば、レプリコン）および構造タンパク質（例えば、カプシドおよびエンベロープ）をコードする。ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、およびベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）はすべて、導入遺伝子送達のためのウイルス伝達ベクターの開発に使用されている。偽型ウイルスは、アルファウイルスエンベロープ糖タンパク質とレトロウイルスカプシドを組み合わせることによって形成され得る。アルファウイルスベクターの例は、米国特許出願公開２０１５００５０２４３、２００９０３０５３４４、および２００６０１７７８１９に見出すことができ、当該ベクターおよびその作製方法は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＡＶベクターについて上記で特定された主要要素に加えて、ベクターでトランスフェクトされた細胞、または本開示により産生されたウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳および／または発現を可能にする様式で、導入遺伝子に動作可能に連結された従来的な制御要素も含み得る。発現制御配列には、適切な転写の開始、終結、プロモーターおよびエンハンサーの配列、例えばスプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセッシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を強化する配列（すなわち、コザック配列）、タンパク質安定性を強化する配列、および望ましい場合には、コードされる生成物の分泌を強化する配列が含まれる。天然、構造的、誘導性および／または組織特異的であるプロモーターを含む、多数の発現制御配列が当技術分野で公知であり、本明細書に記載されるベクターに含まれ得る。一部の実施形態では、動作可能に連結されたコード配列は、機能性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を生じさせる。
構造的プロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意でＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意でＣＭＶエンハンサーを伴う）、ＳＶ４０プロモーター、およびジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターは遺伝子発現の制御を可能にし、外因性に供給される化合物、例えば温度などの環境要因、または例えば急性期などの特定の生理学的状態、細胞の特定の分化状態、または複製細胞のみにより制御されることができる。誘導性プロモーターおよび誘導性システムは、限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社およびＡｒｉａｄ社をはじめとする様々な商業的供給源から入手可能である。多くの他のシステムが報告されており、当業者によって容易に選択することができる。外因性に供給される化合物によって制御される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制系、テトラサイクリン誘導系、ＲＵ４８６－誘導系、およびラパマイシン誘導系が挙げられる。本背景において有用であり得る誘導性プロモーターのさらに他のタイプは、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態、または複製細胞のみによって制御されるプロモーターである。別の実施形態では、導入遺伝子用の天然プロモーターまたはその断片が使用される。さらなる実施形態では、例えばエンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、またはコザックコンセンサス配列などの他の天然発現制御要素を使用して、天然発現を模倣してもよい。
一部の実施形態では、制御配列は、組織特異的な遺伝子発現能力を付与する。一部の事例では、組織特異的な調節配列は、組織特異的な様式で転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。そうした組織特異的な調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は、当技術分野で周知である。一部の実施形態では、プロモーターは、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、またはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、肝細胞において本明細書に記載される導入遺伝子を発現するよう設計され、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）は、一つ以上の肝臓特異的調節因子を含み、それらは実質的に導入遺伝子の発現を肝細胞に限定する。概して、肝臓特異的調節因子は、肝臓で排他的に発現されることが知られている任意の遺伝子に由来し得る。ＷＯ２００９／１３０２０８は、肝臓に特異的な様式で発現されるいくつかの遺伝子を特定しており、ｓｅｒｐｉｎ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｃｌａｄｅ Ａ ｍｅｍｂｅｒ １、α－アンチトリプシンとしても知られる（ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＧｅｎｅＩＤ ５２６５）、アポリポプロテインＣ－Ｉ（ＡＰＯＣ１；ＧｅｎｅＩＤ ３４１）、アポリポプロテインＣ－ＩＶ（ＡＰＯＣ４；ＧｅｎｅＩＤ ３４６）、アポリポプロテインＨ（ＡＰＯＨ；ＧｅｎｅＩＤ ３５０）、トランスサイレチン（ＴＴＲ；ＧｅｎｅＩＤ ７２７６）、アルブミン（ＡＬＢ；ＧｅｎｅＩＤ ２１３）、アルドラーゼＢ（ＡＬＤＯＢ；ＧｅｎｅＩＤ ２２９）、チトクロームＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＥ、ポリペプチド１（ＣＹＰ２Ｅ１；ＧｅｎｅＩＤ １５７１）、フィブリノーゲンアルファ鎖（ＦＧＡ；ＧｅｎｅＩＤ ２２４３）、トランスフェリン（ＴＦ；ＧｅｎｅＩＤ ７０１８）、およびハプトグロビン関連タンパク質（ＨＰＲ；ＧｅｎｅＩＤ ３２５０）が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、これらタンパク質の一つ以上のゲノム座位に由来する肝臓特異的調節因子を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的プロモーターのサイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ：ｔｈｙｒｏｘｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）であってもよい。あるいは他の肝特異的プロモーターを使用してもよい（例えば、Ｌｉｖｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ／、例えば、ａｌｐｈａ １ ａｎｔｉ－ｔｒｙｐｓｉｎ（Ａ１ＡＴ）；ヒトアルブミン（Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５１２４ ３２（１９９７））；ｈｕｍＡ１ｂ；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１００２ ９（１９９６））；またはＬＳＰ１を参照。追加のベクターおよび制御因子は、例えばＢａｒｕｔｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．４０：４９７－５１７（２０１７）に記載されている）。
ＩＩ．導入遺伝子
本明細書に記載されるウイルスベクターの導入遺伝子は、遺伝子療法の導入遺伝子であってもよく、例えば疾患または障害を有する対象などの対象に有益な任意のタンパク質またはその部分をコードしてもよい。タンパク質は、細胞外タンパク質、細胞内タンパク質、または膜結合型タンパク質であってもよい。タンパク質は、治療用タンパク質であってもよい。一部の実施形態では、遺伝子療法が与えられる対象は、当該対象のタンパク質の内因性型が欠損しているか、または限定された量で産生されるか、または全く産生されない疾患または障害を有する。一部のかかる実施形態では、導入遺伝子は、タンパク質の非欠損型をコードする。一部の実施形態では、遺伝子療法が与えられる対象は、標的遺伝子によって（例えば、標的遺伝子の発現レベルおよび／または標的ポリペプチドの活性レベルによって）介在される疾患または障害を有し、導入遺伝子は、標的遺伝子または標的ポリペプチドの阻害剤をコードする。治療用タンパク質の例としては、限定されないが、点滴可能または注射可能な治療用タンパク質、酵素、酵素補因子、ホルモン、血液または血液凝固因子、サイトカインおよびインターフェロン、成長因子、アディポカインなどが挙げられる。
点滴可能または注射可能な治療用タンパク質の例としては 例えば、トシリズマブ（Ｒｏｃｈｅ社／Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標））、ＶＥＧＦ阻害剤、アルファ－１アンチトリプシン（Ｋａｍａｄａ社／ＡＡＴ）、Ｈｅｍａｔｉｄｅ（登録商標）（Ａｆｆｙｍａｘ社およびＴａｋｅｄａ社、合成ペプチド）、アルブインターフェロンアルファ－２ｂ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社／Ｚａｌｂｉｎ（商標））、Ｒｈｕｃｉｎ（登録商標）（Ｐｈａｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、 Ｃ１阻害剤補充療法）、テサモレリン（Ｔｈｅｒａｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社／Ｅｇｒｉｆｔａ、 合成成長ホルモン放出因子）、オクレリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社、Ｒｏｃｈｅ社およびＢｉｏｇｅｎ社）、ベリムマブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社／Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標））、ペグロティカーゼ（Ｓａｖｉｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社／Ｋｒｙｓｔｅｘｘａ（商標））、タリグルセラーゼアルファ（Ｐｒｏｔａｌｉｘ社／Ｕｐｌｙｓｏ）、アガルシダーゼアルファ（Ｓｈｉｒｅ社／Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標））、およびベラグルセラーゼアルファ（Ｓｈｉｒｅ社）が挙げられる。
酵素の例としては、リゾチーム、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、ウリラーゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパラナーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、リシン、およびリガーゼが挙げられる。酵素の他の例としては、限定されないが、イミグルセラーゼ（例えば、ＣＥＲＥＺＹＭＥ（商標））、ａ－ガラクトシダーゼＡ（ａ－ｇａｌ Ａ）（例えば、アガルシダーゼベータ、ＦＡＢＲＹＺＹＭＥ（商標））、酸性ａ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）（例えば、アルグルコシダーゼアルファ、ＬＵＭＩＺＹＭＥ（商標）、ＭＹＯＺＹＭＥ（商標））、およびアリールスルファターゼＢ（例えば、ラロニダーゼ、ＡＬＤＵＲＡＺＹＭＥ（商標）、イデュルスルファーゼ、ＥＬＡＰＲＡＳＥ（商標）、アリールスルファターゼＢ、ＮＡＧＬＡＺＹＭＥ（商標））をはじめとする酵素補充療法に使用されるものが挙げられる。
ホルモンの例としては、限定されないが、ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、メラノコルチン、下垂体ホルモン、バソプレッシン、オキシトシン、成長ホルモン、プロラクチン、オレキシン、ナトリウム利尿ホルモン、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、エリスロポエチン、および膵ホルモンが挙げられる。
血液または血液凝固因子の例としては、第Ｉ因子（フィブリノーゲン）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、組織因子、第Ｖ因子（プロアクセレリン、不安定因子）、第ＶＩＩ因子（安定因子、プロコンバーチン）、第ＶＩＩＩ因子（抗血友病グロブリン）、第ＩＸ因子（クリスマス因子または血漿トロンボプラスチン成分）、第Ｘ因子（スチュアート－プロワー因子）、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）、フォン・ヴィレブランド因子、フォン・ヘルデブラント（ｖｏｎ Ｈｅｌｄｅｂｒａｎｔ）因子、プレカリクレイン（フレッチャー因子）、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）（フィッジェラルド因子）、フィブロネクチン、フィブリン、トロンビン、アンチトロンビン、例えばアンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害物質（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、アルファ２－アンチプラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１（ＰＡＩ１：ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－２（ＰＡＩ２：ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－２）、癌性凝固促進物質、およびエポエチンアルファ（Ｅｐｏｇｅｎ、Ｐｒｏｃｒｉｔ）が挙げられる。
サイトカインの例としては、リンホカイン、インターロイキン、およびケモカイン、１型サイトカイン、例えばＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、ならびに２型サイトカイン、例えばＩＬ－４、ＩＬ－１０、およびＩＬ－１３が挙げられる。
成長因子の例としては、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型運動因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、成長分化因子－９（ＧＤＦ９）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ヘパトーマ由来成長因子（ＨＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、神経成長因子（ＮＧＦ）および他のニューロトロフィン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦα）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦａ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、Ｗｎｔシグナル伝達経路、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、［（ウシ胎児ソマトトロフィン）］（ＦＢＳ）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、およびＩＬ－７が挙げられる。アディポカインの例としては、レプチンおよびアディポネクチンが挙げられる。
治療用タンパク質の追加的な例としては限定されないが、受容体、シグナル伝達タンパク質、細胞骨格タンパク質、スキャホールドタンパク質、転写因子、構造タンパク質、膜タンパク質、細胞質タンパク質、結合タンパク質、核タンパク質、分泌タンパク質、ゴルジタンパク質、小胞体タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、および小胞タンパク質などが挙げられる。
本明細書に提供される遺伝子療法ウイルスベクターの導入遺伝子は、対象の内因性型の何らかの欠損（内因性型の発現の欠損を含む）を通して対象の疾患または障害をもたらす任意のタンパク質の機能性型をコードしてもよい。一部の実施形態では、対象のタンパク質の内因性型は、存在しないか、または過少発現され得る。そのような疾患または障害の例としては限定されないが、リソソーム蓄積症／障害、例えば、Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ－Ｈａｌｔｉａ病（小児神経セロイドリポフスチン症１型）、Ｊａｎｓｋｙ－Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ病（遅発型小児神経セロイドリポフスチン症２型）、バッテン病（若年性神経セロイドリポフスチン症３型）、クーフス病（神経セロイドリポフスチン症４型）、Ｖｏｎ Ｇｉｅｒｋｅ病（糖原病Ｉａ型）、糖原病Ｉｂ型、ポンペ病（糖原病ＩＩ型）、フォーブズ病またはコーリー病（糖原病ＩＩＩ型）、ムコリピドーシスＩＩ型（Ｉ－セル病）、ムコリピドーシスＩＩＩ型（偽ハーラー多発性ジストロフィー）、ムコリピドーシスＩＶ型（シアロリピドーシス）、シスチン症（成人非腎症型）、シスチン症（小児腎症型）、シスチン症（若年性または青年期腎症性）、サラ病／小児シアル酸蓄積症、およびサポシン欠損症；脂質およびスフィンゴ脂質の分解障害、例えばＧＭ１ガングリオシドーシス（小児、遅発型小児／若年性、および成人／慢性）、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、Ａｂバリアント、ファブリー病、ゴーシェ病、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病（早発型および遅発型）、ニーマン・ピック病、Ａ型、Ｂ型、Ｃ１型およびＣ２型、ファーバー病、およびウォルマン病（コレステリルエステル蓄積症）；ムコ多糖分解障害、例えば、ハーラー症候群（ＭＰＳＩ）、シェイエ症候群（ＭＰＳ ＩＳ）、ハーラー・シェイエ症候群（ＭＰＳ ＩＨ／Ｓ）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）、サンフィリポＡ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＡ）、サンフィリポＢ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）、サンフィリポＣ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＣ）、サンフィリポＤ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＤ）、モルキオＡ症候群（ＭＰＳ ＩＶＡ）、モルキオＢ症候群（ＭＰＳ ＩＶＢ）、マロトー・ラミー症候群（ＭＰＳ ＶＩ）、およびスライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ）；糖タンパク質分解障害、例えば、アルファマンノシドーシス、ベータマンノシドーシス、フコシドーシス、アスパリルグルコサミン尿症（ａｓｐａｒｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｕｒｉａ）、ムコリピドーシスＩ（シアリドーシス）、ガラクトシアリドーシス、シンドラー病、およびシンドラー病ＩＩ型／カンザキ病；ならびに白質ジストロフィー病／障害、例えば無βリポタンパク質血症、新生児型副腎白質ジストロフィー、カナバン病、脳腱黄色腫症、ペリツェウス・メルツバッハー病、タンジアー病、Ｒｅｆｕｍ病、小児型、およびＲｅｆｕｍ病、古典型が挙げられる。
本明細書に提示されるような対象のかかる疾患／障害のさらなる例としては限定されないが、酸性マルターゼ欠損症（例えば、ポンぺ病、糖原病２型、リソソーム蓄積症）；カルニチン欠損症；カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症；脱分岐酵素欠損症（例えば、コーリー陽またはフォーブズ病、糖原病３型）；乳酸脱水素酵素欠損症（例えば、糖原病１１型）；ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症；ホスホフルクトキナーゼ欠損症（例えば、タルイ病、糖原病７型）；ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症（例えば、糖原病９型）；ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症（例えば、糖原病１０型）；ホスホリラーゼ欠損症（例えば、マカードル病、ミオホスホリラーゼ欠損症、糖原病５型）；ゴーシェ病（例えば、１番染色体、酵素のグルコセレブロシダーゼが影響を受ける）；軟骨形成不全症（例えば、４番染色体、線維芽細胞増殖因子受容体３が影響を受ける）；ハンチントン病（例えば、４番染色体、ハンチンチン）；ヘモクロマトーシス（例えば、６番染色体、ＨＦＥタンパク質）；嚢胞性線維症（例えば、７番染色体、ＣＦＴＲ）；フリードライヒ運動失調症（９番染色体、フラタキシン）；ベスト病（１１番染色体、ＶＭＤ２）；鎌状赤血球症（１１番染色体、ヘモグロビン）；フェニルケトン尿症（１２番染色体、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）；マルファン症候群（１５番染色体、フィブリリン）；筋緊張性ジストフィー（１９番染色体、筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ）；副腎白質ジストロフィー（ｘ染色体、ペルオキシソーム中のリグノセロイル－ＣｏＡリガーゼ）；デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ｘ染色体、ジストロフィン）；レット症候群（ｘ染色体、メチルＣｐＧ結合タンパク質２）；レーベル遺伝性視神経症（ミトコンドリア、呼吸器系タンパク質）；ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシスおよび脳卒中（ＭＥＬＡＳ）（ミトコンドリア、トランスファーＲＮＡ）；ならびに尿素サイクルの酵素欠損症が挙げられる。
かかる疾患または障害のさらなる例としては限定されないが、鎌状赤血球貧血、筋細管ミオパチー、血友病Ｂ、リポタンパク質リパーゼ欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、クリーグラー・ナジャー病、ムコリピドーシスＩＶ型、ニーマン・ピックＡ型、サンフィリポＡ型、サンフィリポＢ型、サンフィリポＣ型、サンフィリポＤ型、ｂ－サラセミア、およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーが挙げられる。疾患または障害のさらなる例としては、脂質およびスフィンゴ脂質の分解、ムコ多糖類の分解、糖タンパク質の分解における欠陥、白質ジストロフィーなどの結果であるものが挙げられる。
本明細書に提供される疾患または障害のいずれか一つに記載の欠陥タンパク質の機能性型は、遺伝子療法用ウイルスベクターの導入遺伝子によりコードされてもよく、また治療用タンパク質ともみなされる。また治療用タンパク質としては、ミオホスホリラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、線維芽細胞増殖因子受容体３、ハンチンチン、ＨＦＥタンパク質、ＣＦＴＲ、フラタキシン、ＶＭＤ２、ヘモグロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、フィブリリン、筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ、リグノセロイル－ＣｏＡリガーゼ、ジストロフィン、メチルＣｐＧ結合タンパク質２、ベータヘモグロビン、ミオチューブラリン、カテプシンＡ、第ＩＸ因子、リポタンパク質リパーゼ、ベータガラクトシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、酸性アルファグルコシダーゼ、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ１－１、ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼ、ムコリピン－１、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質、スフィンゴミエリナーゼ、酸性セラミダーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、ヘパランＮ－スルファターゼ、アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル－ＣｏＡアルファ－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６スルファターゼ、アルファ－マンノシダーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、嚢胞性線維症コンダクタンス膜貫通型調節因子、および呼吸器系タンパク質が挙げられる。
さらなる例として、治療用タンパク質としては、脂質およびスフィンゴ脂質の分解の障害に関連するタンパク質（例えば、β－ガラクトシダーゼ－１、β－ヘキソサミニダーゼＡ、β－ヘキソサミニダーゼＡおよびＢ、ＧＭ２アクチベータータンパク質、８－ガラクトシダーゼＡ、グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、ガラクトシルセラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、ＮＰＣ１、ＨＥ１タンパク質（コレステロール輸送欠損）、酸性セラミダーゼ、リソソーム酸性リパーゼ）の機能性型；ムコ多糖の分解の障害に関連するタンパク質（例えば、Ｌ－イズロニダーゼ、Ｌ－イズロニダーゼ、Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランＮ－スルファターゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル－ＣｏＡ－グルコサミニダーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ、ガラクトサミン－６－スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、グルクロニダーゼ）の機能性型；糖タンパク質の分解の障害に関連するタンパク質（例えば、マンノシダーゼ、マンノシダーゼ、１－フコシダーゼ、アスパルチルグリコサミニダーゼ、ノイラミニダーゼ、リソソーム保護タンパク質、リソソーム８－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ、リソソーム８－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ）の機能性型；リソソーム蓄積障害に関連するタンパク質（例えば、パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ、少なくとも４つのサブタイプ、リソソーム膜タンパク質、不明、グルコース－６－ホスファターゼ、グルコース－６－リン酸トランスロカーゼ、酸性マルトース、脱分岐酵素アミロ－１，６グルコシダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ、ガングリオシドシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）、リソソームシスチン輸送タンパク質、リソソームシスチン輸送タンパク質、リソソームシスチン輸送タンパク質、シアル酸輸送タンパク質サポシン、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型）、および白質ジストロフィーに関連するタンパク質（例えば、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質／アポリポタンパク質Ｂ、ペルオキシソーム膜移行タンパク質、ペルオキシン、アスパルトアシラーゼ、ステロール－２７－ヒドロキシラーゼ、プロテオリピドタンパク質、ＡＢＣ１トランスポーター、ペルオキシソーム膜タンパク質３、またはペルオキシソーム生合成因子１、フィタン酸オキシダーゼ）の機能性型が挙げられる。
本明細書に提供されるウイルスベクターは、遺伝子編集に使用されてもよい。そうした実施形態では、ウイルスベクターの導入遺伝子は、遺伝子編集導入遺伝子である。かかる導入遺伝子は、遺伝子編集プロセスに関与する剤または構成要素をコードする。一般的に、こうしたプロセスにより、例えば標的ＤＮＡの挿入、置換、突然変異誘導、または除去など、ゲノムＤＮＡに対する長期持続的または永久的な改変が生じる。遺伝子編集は、対象のＤＮＡ配列をコードする核酸の送達、およびエンドヌクレアーゼを使用したゲノムＤＮＡの標的部位での対象配列の挿入を含み得る。したがって遺伝子編集の導入遺伝子は、挿入される対象のＤＮＡ配列をコードするこれらの核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、挿入されるＤＮＡ配列は、本明細書に記載される治療用タンパク質のいずれか一つをコードするＤＮＡ配列である。追加的または代替的に、遺伝子編集の導入遺伝子は、単独でまたは他の構成要素と組み合わせて遺伝子編集プロセスを実施することができる、複数の構成要素のうちの一つをコードする核酸を含んでもよい。本明細書に提供される遺伝子編集の導入遺伝子は、エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡなどをコードしてもよい。
エンドヌクレアーゼは、ゲノム内の所望の位置で二本鎖ＤＮＡの切断を生じさせ、宿主細胞の機構を使用して、相同組換え、非相同末端結合などを使用して当該切断を修復することができる。遺伝子編集に使用され得るエンドヌクレアーゼのクラスには、限定されないが、メガヌクレアーゼ（例えば、米国特許第８，８０２，４３７号、第８，４４５，２５１号、および第８，３３８，１５７号、ならびに米国特許出願公開２０１３０２２４８６３、２０１１０１１３５０９、および２０１１００３３９３５を参照のこと）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）（例えば、米国特許第８，９５６，８２８号、第８，９２１，１１２号、第８，８４６，５７８号、第８，５６９，２５３号を参照のこと）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）（例えば、米国特許第８，６９７，８５３号ならびに米国特許出願公開２０１５０１１８２１６、２０１５００７９０６４、および２０１４００８７４２６を参照のこと）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）、およびホーミングエンドヌクレアーゼ（例えば、米国特許出願公開２０１５０１６６９６９、および米国特許第９，００５，９７３号を参照のこと）が含まれる。
本明細書に提供されるウイルスベクターの遺伝子編集導入遺伝子は、本明細書に提供されるエンドヌクレアーゼのいずれか一つをコードしてもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ系を、遺伝子編集に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ゲノム上またはエピソーム性（例えば、プラスミド上）にコードされる。ｇＲＮＡは、転写後に、例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼと複合体を形成する。次いで複合体は、典型的には細胞のゲノム内に位置する、ｃＤＮＡに対するｇＲＮＡの特異性決定配列（ＳＤＳ）による誘導を受ける。Ｃａｓ９またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質、またはその断片（例えば、Ｃａｓ９の活性もしくは不活性のＤＮＡ切断ドメイン、または部分的に不活性なＤＮＡ切断ドメイン（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ、および／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）を含むＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲリピート配列中の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識し、自己と非自己の区別を補助する。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ（例えば、シングルガイドＲＮＡ）の配列および構造は、当業者に公知である（例えば、Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：４６５８－４６６３（２００１）；Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２－６０７（２０１１）；およびＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１（２０１２）を参照のこと）。
本明細書に提供されるウイルスベクターは、遺伝子発現調節に使用されてもよい。そうした実施形態では、ウイルスベクターの導入遺伝子は、遺伝子発現調節導入遺伝子である。かかる導入遺伝子は、一つ以上の内因性遺伝子の発現を増強、阻害（例えば、サイレンシング）、または調節することができる遺伝子発現調節因子をコードする。内因性遺伝子は、本明細書に提供されるタンパク質のいずれか一つをコードしてもよいが、ただし当該タンパク質は、対象の内因性タンパク質であるものとする。したがって、対象は、本明細書に提供される疾患または障害のいずれか一つを有する対象であってもよく、この場合において、遺伝子発現調節により提供される利益が存在する。
遺伝子発現調節因子としては、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、米国特許出願公開２０１４０２９６１２９などにある人工転写因子、および米国特許出願公開２００３０１２５２８６の転写サイレンサータンパク質ＮＲＦ）ならびに治療用ＲＮＡが挙げられる。治療用ＲＮＡとしては限定されないが、ｍＲＮＡ翻訳の阻害剤（アンチセンス）（例えば、米国特許出願公開２００５００２０５２９および２００５０２７１７３３を参照のこと）、ＲＮＡ干渉剤（ＲＮＡｉ）（例えば、米国特許第８，９９３，５３０号、第８，８７７，９１７号、第８，２９３，７１９号、第７，９４７，６５９号、第７，９１９，４７３号、第７，７９０，８７８号、第７，７３７，２６５号、第７，５９２，３２２、ならびに米国特許出願公開２０１５０１９７７４６、２０１４０３５００７１、２０１４０３１５８３５、２０１３０１５６８４５、および２０１００２６７８０５を参照のこと）、触媒活性ＲＮＡ分子（リボザイム）（例えば、Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５，１９８８；および米国特許出願公開２００５００２０５２９を参照のこと）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびタンパク質や他の分子リガンドに結合するＲＮＡ（アプタマー）が挙げられる。遺伝子発現調節因子は、前述のいずれかの剤を含み、ならびにアンチセンス核酸、ＲＮＡｉ分子（例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および三本鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を含む。遺伝子発現調節因子はまた、前述のＲＮＡ分子のいずれかの改変型を含んでもよく、したがって、例えば合成化学修飾ＲＮＡなどの改変ｍＲＮＡを含んでもよい。
例示的な導入遺伝子は、細胞中の血管新生因子のレベルを低下させる干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマーをコードする。例えば、ＲＮＡｉは、細胞中の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のレベルを低下させるｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡであり得る。例えば、ＲＮＡｉは、細胞中のＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）のレベルを低下させるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。ＶＥＧＦを標的とするＲＮＡｉ剤としては、例えば、米国特許公開第２０１１／０２２４２８２に記載されるＲＮＡｉが挙げられる。例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ１、またはＶＥＧＦＲ２に特異的なｓｉＲＮＡが好適であろう。好適な核酸遺伝子産物には、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ１、またはＶＥＧＦＲ２に特異的なリボザイム、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ１、またはＶＥＧＦＲ２に特異的なアンチセンス、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ１、またはＶＥＧＦＲ２に特異的なｓｉＲＮＡなども含まれる。また、例えば転写後抑制またはｍＲＮＡ分解を介してＶＥＧＦ遺伝子発現を調節することにより、ＶＥＧＦのレベルを低下させるｍｉＲＮＡも遺伝子産物として好適である。好適なｍｉＲＮＡの例としては、例えば、ｍｉＲ－１５ｂ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２０ａ、およびｍｉＲ－２０ｂが挙げられる。例えば、Ｈｕａ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＰＬｏＳ ＯＮＥ １：ｅ１１６を参照のこと。また、抗ＶＥＧＦアプタマー（例えば、ＥＹＥ００１）も好適である。抗ＶＥＧＦアプタマーについては、例えば、Ｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ５：１２３、ならびに米国特許第６，４２６，３３５号、第６，１６８，７７８号、第６，１４７，２０４号、第６，０５１，６９８号、および第６，０１１，０２０号を参照のこと。例えば、アプタマーは、ＶＥＧＦ１６５に指向性であってもよく、ＶＥＧＦ１６５は、病的な眼の新生血管形成および血管透過性の主原因であるアイソフォームである。
一部の実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に記載される一つ以上のポリペプチドの活性を阻害または低下させるポリペプチド（例えば、抗体または融合タンパク質）をコードする。例えば、一部の実施形態では、導入遺伝子は、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを含む抗血管新生ポリペプチドをコードする。好適なＶＥＧＦアンタゴニストとしては限定されないが、ＶＥＧＦＲ１チロシンキナーゼ活性の阻害剤、ＶＥＧＦＲ２チロシンキナーゼ活性の阻害剤、ＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦＲ１に対する抗体、ＶＥＧＦＲ２に対する抗体、可溶性ＶＥＧＦＲなどが挙げられる（例えば、Ｔａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：２１６９－２１７７；Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０２７－１０３３；およびＭａｈａｓｒｅｓｈｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７：２０５７－２０６６、ならびに米国特許出願公開２００３０１８１３７７を参照のこと）。ＶＥＧＦに特異的な抗体としては例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））およびラニビズマブ（ｒｈｕＦＡｂ Ｖ２としても知られる）が挙げられる。また、例えばエンドスタチン、ＰＥＤＦ、およびアンギオスタチンなどの抗血管新生ポリペプチドも使用に適している。
抗血管新生ポリペプチドとしては例えば、ＶＥＧＦ受容体を含む組換えポリペプチドが挙げられる。例えば、好適な抗血管新生ポリペプチドは、ｓＦｌｔ－１としても知られるＶＥＧＦＲ－１の可溶性形態であってもよい（Ｋｅｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２６：３２４を参照のこと）。好適な抗血管新生ポリペプチドはまた、第一のＶＥＧＦ受容体（例えば、Ｆｌｔ１）の免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメイン２を、単独で、または第二のＶＥＧＦ受容体（例えば、Ｆｌｋ１またはＦｌｔ４）のＩｇドメイン３と組み合わせて含む。抗血管新生ポリペプチドはまた、安定化および／または多量体化の構成要素を含んでもよい。そのような組換え抗血管新生ポリペプチドは、例えば、米国特許第７，５２１，０４９号に記載されている。異種遺伝子産物として好適な抗ＶＥＧＦ抗体には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体が含まれる。抗ＶＥＧＦ抗体について、例えば、米国特許第７，７５８，８５９号、および第７，７４０，８４４号を参照のこと。追加の導入遺伝子は、例えば、Ｂｏｒｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ．２０１９ Ｊｕｎ ５．ｐｉｉ：Ｓ１３５９－６４４６（１８）３０４７２－０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｒｕｄｉｓ．２０１９．０５．０３８を参照のこと。かかる導入遺伝子は、例えば、加齢性黄斑変性症などの眼の障害を治療するために使用することができる。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、筋特異的プロモーターの制御下にある短縮型ヒトジストロフィン遺伝子（ミニジストロフィン）を含むアデノ炊飯ウイルス、血清型９（ＡＡＶ９）ベクターを含む。一部の実施形態では、ミニジストロフィン遺伝子は、全長ジストロフィン遺伝子の６～８ｋｂの配列を含む。一部の実施形態では、ミニジストロフィン遺伝子は、機能性ジストロフィンタンパク質の産生に必要な最小量の情報を含みつつ、完全ジストロフィン遺伝子配列の断片を含有し得る。一部の実施形態では、ミニジストロフィン遺伝子は、ジストロフィン遺伝子の少なくともＲ１６／Ｒ１７ ｎＮＯＳ結合ドメイン配列を含有する（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｊａｎ；２３（１）：９８－１０３に記載される）。例えば、一部の実施形態では、遺伝子療法は、ＰＦ－０６９３９９２６であってもよい。遺伝子療法は、例えば、ＩＶ点滴により、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に罹患している対象に投与されてもよい。一部の実施形態では、ミニジストロフィン遺伝子療法は、例えばデュアルまたはトリプルＡＡＶベクターなどの複数のＡＡＶベクターを使用して送達されてもよい。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、筋特異的プロモーターの制御下にあるマイクロジストロフィン遺伝子を含むＡＡＶ９ベクターを含む。マイクロジストロフィン遺伝子は、機能性ジストロフィンタンパク質の産生に必要な最小量の情報を含みつつ、完全ジストロフィン遺伝子配列の断片を含有し得る。一部の実施形態では、マイクロジストロフィン遺伝子は、スペクトリン様リピートのＲ１－Ｒ２４セグメントのうちの一つ以上が除去されたジストロフィン遺伝子の配列を含み得る。例えば、一部の実施形態では、遺伝子療法は、ＳＧＴ－００１であってもよい。一部の実施形態では、マイクロジストロフィン遺伝子は、最初の合成マイクロジストロフィンであるΔＤｙｓＭ３、Δ３９９０、ΔＲ４－２３／ΔＣ、およびμＤｙｓ５Ｒ（Ｄｕａｎ ２０１８ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２６（１０）に記載される）を含み得る。一部の実施形態では、マイクロジストロフィン遺伝子療法は、複数のＡＡＶベクターを使用して送達されてもよく、各ベクターは、異なるマイクロジストロフィン遺伝子を含有する。遺伝子療法は、例えば、ＩＶ点滴により、ＤＭＤに罹患している対象に投与されてもよい。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、ヒト第ＩＸ因子遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス、血清型５（ＡＡＶ５）ベクターを含む。遺伝子療法は、例えば、ＩＶ点滴により、血友病Ｂに罹患する対象に投与されてもよい。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、機能獲得活性（例えば、野生型と比較して発現または活性の増加）を有する機能性型をコードする。例えば、第ＩＸ因子の欠落を伴う血友病については、第ＩＸ因子の発現の増強をもたらすＰａｄｕａ（Ｒ３３８Ｌ）として知られる機能獲得性の変異を含有する第ＩＸ因子バリアントが使用され得る。例えば、一部の実施形態では、遺伝子療法は、ＡＭＴ－０６１である。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）をコードする導入遺伝子を含むＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ベクターを含む。遺伝子療法は、例えば、ＩＶ点滴により、ＯＴＣ欠損症に罹患している対象に投与されてもよい。一部の実施形態では、遺伝子療法は、ＤＴＸ３０１である。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス、血清型５（ＡＡＶ５）ベクターを含む。遺伝子療法は、例えば、ＩＶ点滴により、血友病Ａに罹患する対象に投与されてもよい。一部の実施形態では、遺伝子療法は、Ｖａｌｏｃｔｏｃｏｇｅｎｅ Ｒｏｘａｐａｒｖｏｖｅｃである。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、ＬＳＰプロモーターの制御下にあるヒトＧＡＡ遺伝子を含むＡＡＶ８ベクターを含む。遺伝子療法は、例えば、ＩＶ点滴により、ポンぺ病に罹患している対象に投与されてもよい。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、ヒトグルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）をコードする導入遺伝子を含むＡＡＶ８ベクターを含む。遺伝子療法は、例えば、ＩＶ点滴により、糖原病Ｉａ型（ＧＳＤＩａ）に罹患している対象に投与されてもよい。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、ヒトリソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）をコードする導入遺伝子を含む、アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）ベクターを含む（例えば、ＲＰ－Ａ５０１）。一部の実施形態では、遺伝子療法は、例えば、ＩＶ点滴により、ダノン病に罹患している対象に投与されてもよい。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、ヒトＬＤＬ受容体をコードする導入遺伝子を含むＡＡＶベクター、例えばＡＡＶ８ベクターを含む。遺伝子療法は、例えば、ＩＶ点滴により、家族性高コレステロール血症（例えば、ホモ接合性家族性高コレステロール血症）に罹患する対象に投与されてもよい。一部の実施形態では、遺伝子療法は、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲを含む。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、正常なヒトＣＨＭ遺伝子（ＲＥＰ１をコードする）を含むアデノ随伴ウイルス血清型２ベクター（ＡＡＶ２）を含む。遺伝子療法は、先天性脈絡膜欠如に罹患している、または先天性脈絡膜欠如のリスクがある対象に、網膜下投与されてもよい。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、ヒトＲＰＥ６５をコードする導入遺伝子を含むＡＡＶ２ベクター、例えばＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５ｖ２を含む。遺伝子療法は、例えば、網膜下に、レーバー先天性黒内障に罹患する対象に投与されてもよい。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、Ｂドメインが欠失したヒト第ＶＩＩＩ因子をコードするアデノ随伴ウイルス２／６（ＡＡＶ２／６）ベクターを含む。（例えば、ＳＢ－５２５）一部の実施形態では、遺伝子療法は、Ｂドメインが欠失したヒト第ＶＩＩＩ因子をコードするアデノ随伴ウイルス８ベクターを含む。（例えば、ＢＡＸ８８８）Ｂドメイン欠失ヒト第ＶＩＩＩ因子をもたらす遺伝子療法は、例えば、ＩＶ点滴によって、血友病Ａに罹患する対象に投与されてもよい。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、ヒトＣＬＮ３導入遺伝子を含むＡＡＶ９ベクターを含む。当該療法は、例えば、髄腔内で、ＣＬＮ３変異を有する対象に投与されてもよい。一部の実施形態では、遺伝子療法は、ヒトＣＬＮ６導入遺伝子を含むＡＡＶ９ベクターを含む。当該療法は、例えば、髄腔内で、ＣＬＮ６変異を有する対象に投与されてもよい。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、ヒトＭＴＭ１（ｈＭＴＭ１）遺伝子の機能性コピーを含有するＡＡＶ８ベクターを含む（例えば、ＡＴ１３２）。遺伝子療法は、例えば、ＩＶ点滴により、Ｘ連鎖筋細管ミオパチーに罹患している対象に投与されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、（ｉ）本明細書に記載の導入遺伝子、および（ｉｉ）本明細書に記載の補体阻害剤をコードする核酸、を含む。
導入遺伝子の配列はまた、発現制御配列を含んでもよい。発現制御ＤＮＡ配列は、プロモーター、エンハンサー、およびオペレーターを含み、概して発現構築物が利用される発現系に応じて選択される。一部の実施形態では、プロモーター配列およびエンハンサー配列は、遺伝子発現を増加させる能力に関して選択され、一方でオペレーター配列は、遺伝子発現を制御する能力に関して選択されてもよい。導入遺伝子はまた、宿主細胞における相同組み換えを促進し、好ましくは相同組み換えを促進する配列を含んでもよい。導入遺伝子はまた、宿主細胞における複製に必要な配列を含んでもよい。
例示的な発現制御配列としては、プロモーター配列、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、およびシミアンウイルス４０プロモーター、ならびに本明細書において別段に開示される、または当技術分野で別段に公知である任意の他のタイプのプロモーターが挙げられる。概して、プロモーターは、所望の発現産物をコードする配列の上流（すなわち、５’側）に動作可能に連結される。導入遺伝子はまた、公的なポリアデニル化配列（例えば、ＳＶ４０またはヒト成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化配列）を含んでもよく、当該配列は、コード配列の下流（すなわち、３’側）に動作可能に連結されている。
ＩＩＩ．ウイルスベクターの作製
ウイルスベクターを得るための方法は、当該技術分野で公知である。例えば、ＡＡＶベクターを作製するために、方法は、典型的には、ＡＡＶカプシドタンパク質またはその断片をコードする核酸配列、機能性ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ末端逆位リピート（ＩＴＲ）と導入遺伝子から構成される組換えＡＡＶベクター、および／または組換えＡＡＶベクターをＡＡＶカプシドタンパク質内にパッケージングさせるために充分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。
ＡＡＶカプシドにＡＡＶベクターをパッケージングするために、宿主細胞中で培養される構成要素を、トランスで宿主細胞に提供してもよい。あるいは、任意の一つ以上の必要な構成要素（例えば、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、キャップ配列、および／またはヘルパー機能）は、当業者に公知の方法を使用して、当該一つ以上の必要な構成要素を含有するように操作された安定宿主細胞により提供されてもよい。一部の実施形態では、かかる安定宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下で必要とされる構成要素を含有する。他の実施形態では、必要とされる構成要素は、構造的プロモーターの制御下であってもよい。他の実施形態では、選択された安定宿主細胞は、構造的プロモーターの制御下で選択構成要素を含有してもよく、および一つ以上の誘導性プロモーターの制御下で他の選択構成要素を含有してもよい。例えば、２９３細胞（構造的プロモーターの制御下のＥ１ヘルパー機能を含有する）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下にあるｒｅｐタンパク質および／またはｃａｐタンパク質を含有する安定宿主細胞が作製されてもよい。他の安定宿主細胞は、日常的な方法を使用して当業者により作製され得る。
本開示のＡＡＶを作製するために必要な組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、キャップ配列、およびヘルパー機能は、任意の適切な遺伝子要素（例えば、ベクター）を使用してパッケージング宿主細胞へと送達されてもよい。選択された遺伝子要素は、遺伝子操作、組み換え操作および合成技術を含む当技術分野で公知の任意の適切な方法によって、例えば、核酸操作の技能を有する当業者に公知の任意の適切な方法よって送達されてもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。同様に、ＡＡＶビリオンを作製する方法も公知であり、任意の適切な方法を本開示とともに使用することができる（例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２（１９９３）ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４７８，７４５を参照のこと）。
一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、トリプルトランスフェクション法（例えば、米国特許第６，００１，６５０号に記載される）を使用して作製されてもよい。一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、組換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）を用いて宿主細胞をトランスフェクトすることによって作製され、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶヘルパー機能性ベクター、およびアクセサリー機能性ベクターにパッケージングされる。ＡＡＶヘルパー機能性ベクターは、「ＡＡＶヘルパー機能性」配列（すなわちｒｅｐおよびｃａｐ）をコードしており、生産的なＡＡＶの複製およびカプシド内包にトランスで機能する。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能性ベクターは、検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（すなわち、機能性ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶビリオン）を産生することなく、効率的なＡＡＶベクターの産生をサポートする。本開示での使用に適したベクターの非限定的な例としては、ｐＨＬＰ１９ベクター（例えば、米国特許第６，００１，６５０号）およびｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクター（例えば、米国特許第６，１５６，３０３号）が挙げられる。アクセサリー機能性ベクターは、ＡＡＶが複製に依存する、非ＡＡＶに由来するウイルス機能および／または細胞機能に関するヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能には、ＡＡＶ複製に必要な機能が含まれ、限定されないが、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的なＡＡＶ ｍＲＮＡのスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡの複製、キャップ発現産物の合成、およびＡＡＶカプシドのアセンブリに関与する部分が挙げられる。ウイルス系のアクセサリー機能は、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルスなどの任意の公知のヘルパーウイルスから誘導することができる。
一部の実施形態では、本開示は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来性ＤＮＡの取り込みを指し、細胞は、外来性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたときに、「トランスフェクト」される。多数のトランスフェクション技術が当該技術分野において一般的に公知である（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７）を参照のこと）。かかる技術を使用して、例えばヌクレオチド統合ベクターおよび他の核酸分子などの一つ以上の外来性核酸を、好適な宿主細胞に導入することができる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、アクセサリー機能ベクター、および／または組換えＡＡＶの産生に関連する他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用され得る。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫細胞を含む。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」とは、外来性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す場合がある。単一の親細胞の子孫細胞は、自然の、偶発的な、または意図的な変異によって、かならずしも元の親と形態またはゲノムまたは総合的なＤＮＡ相補体において完全に同一であるとは限らない場合がある。
対象への送達に適したＡＡＶウイルスベクターの作製および単離に関するさらなる方法は、例えば、米国特許第７，７９０，４４９号、米国特許第７，２８２，１９９号、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、および米国特許第７，５８８，７７２号に記載されている。一つのシステムでは、産生細胞株は、ＩＴＲに隣接した導入遺伝子をコードする構築物、ならびにｒｅｐおよびｃａｐをコードする構築物で一過性にトランスフェクトされる。別のシステムでは、ｒｅｐおよびｃａｐを安定的に供給するパッケージング細胞株が、ＩＴＲに隣接した導入遺伝子をコードする構築物で一過性にトランスフェクトされる。これらの各システムでは、ＡＡＶビリオンはヘルパーのアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答して産生され、そしてＡＡＶは混入ウイルスから分離される。他のシステムはＡＡＶを回復させるためのヘルパーウイルスの感染を必要としない。つまりヘルパーの機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、およびＥ４、またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２およびＵＬ２９ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）も、当該システムによりトランスで供給される。そのようなシステムでは、ヘルパー機能は、ヘルパー機能をコードする構築物を用いて細胞を一過性にトランスフェクトすることによって供給されることができる。または細胞を操作して、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定的に含有させることができ、その発現は、転写レベルまたは転写後レベルで制御されることができる。
さらに別のシステムでは、ＩＴＲに隣接される導入遺伝子、およびｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子は、バキュロウイルス系ベクターの感染により、昆虫宿主細胞に導入される。そのような生産システムは当該技術分野で公知である（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照のこと）。これらのＡＡＶ産生システムおよび他のＡＡＶ産生システムの作製方法ならびに使用方法は、米国特許第５，１３９，９４１号、第５，７４１，６８３号、第６，０５７，１５２号、第６，２０４，０５９号、第６，２６８，２１３号、第６，４９１，９０７号、第６，６６０，５１４号、第６，９５１，７５３号、第７，０９４，６０４号、第７，１７２，８９３号、第７，２０１，８９８号、第７，２２９，８２３号、および第７，４３９，０６５号にも記載される。
組換えベクターを作製するための前述の方法は、限定であることは意図されず、他の好適な方法も当業者には明らかであろう。
ＩＶ．補体系
補体は、自然免疫系の治療群であり、感染性因子に対する身体の防御に重要な役割を果たしている。補体系は、古典的経路、第二経路、およびレクチン経路として知られる三つの主要な経路に関与する、３０を超える血清タンパク質および細胞タンパク質を含む。古典的経路は通常、抗原とＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体の複合体をＣ１に結合させることによって誘発される（ただし特定の他の活性化因子も当該経路を開始することもできる）。活性化されたＣ１は、Ｃ４およびＣ２を切断して、Ｃ４ａおよびＣ４ｂを生成するとともに、Ｃ２ａおよびＣ２ｂも生成する。Ｃ４ｂとＣ２ａは結合してＣ３転換酵素を形成し、当該酵素がＣ３を切断してＣ３ａとＣ３ｂを形成する。Ｃ３ｂがＣ３転換酵素に結合すると、Ｃ５転換酵素が生成され、当該酵素がＣ５をＣ５ａとＣ５ｂに切断する。Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａは、アナフィロトキシンであり、急性炎症性反応において複数の反応を介在する。Ｃ３ａとＣ５ａはまた走化性因子でもあり、例えば好中球などの免疫系細胞を引き寄せる。
第二経路は、例えば、微生物表面や様々な複合的な多糖類によって開始され、増幅される。この経路では、低レベルで自然発生的に起こるＣ３からＣ３（Ｈ２Ｏ）への加水分解により、Ｂ因子への結合が生じ、そしてＤ因子によって切断され、Ｃ３をＣ３ａとＣ３ｂに切断することによって補体を活性化する液相Ｃ３転換酵素を生成する。Ｃ３ｂは、例えば細胞表面などの標的に結合して、Ｂ因子と複合体を形成し、これが後にＤ因子によって切断され、Ｃ３転換酵素が生成される。表面結合型Ｃ３転換酵素は、追加的なＣ３分子を切断および活性化し、活性化部位に近接した急速なＣ３ｂ沈着を生じさせ、追加的なＣ３転換酵素の形成がもたらされ、その結果として追加的なＣ３ｂが生成される。このプロセスにより、Ｃ３切断とＣ３転換酵素の形成のサイクルが生じ、反応を著しく増幅させる。Ｃ３の切断と、Ｃ３ｂの別の分子のＣ３転換酵素への結合は、Ｃ５転換酵素を生じさせる。この経路のＣ３転換酵素とＣ５転換酵素は、細胞分子のＣＲ１、ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＤ５９、およびｆＨによって制御される。これらのタンパク質の作用機序は、崩壊促進活性（すなわち、転換酵素を解離させる能力）、Ｉ因子によるＣ３ｂまたはＣ４ｂの分解における補因子としての役割を果たす能力、またはその両方のいずれかを伴う。通常、細胞表面上には補体制御タンパク質が存在するため、その上での著しい補体活性化は防がれている。
両方の経路で産生されるＣ５転換酵素は、Ｃ５を切断してＣ５ａとＣ５ｂを産生する。次にＣ５ｂは、Ｃ６、Ｃ７、およびＣ８に結合してＣ５ｂ－８を形成し、Ｃ９の重合を触媒して、Ｃ５ｂ－９細胞膜障害性複合体（ＭＡＣ）を形成する。ＭＡＣは標的細胞膜に自身を挿入させ、細胞溶解を引き起こす。細胞膜上の少量のＭＡＣによって、細胞死以外の様々な結果となり得る。
レクチン補体経路は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）およびＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）の炭水化物への結合によって開始される。ＭＢ１－１遺伝子（ヒトではＬＭＡＮ－１として知られる）は、小胞体とゴルジ体の間の中間領域に局在するＩ型内在性膜タンパク質をコードする。ＭＢＬ－２遺伝子は、血清中に存在する可溶性マンノース結合タンパク質をコードする。ヒトレクチン経路では、ＭＡＳＰ－１とＭＡＳＰ－２が、Ｃ４およびＣ２のタンパク質分解に関与し、上述のＣ３転換酵素を生じさせる。さらなる詳細については、例えば、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，２００６；Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；６ｔｈ ｅｄ．，２００８；およびＷａｌｐｏｒｔ ＭＪ．，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ．Ｆｉｒｓｔ ｏｆ ｔｗｏ ｐａｒｔｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，３４４（１４）：１０５８－６６，２００１に見出される。
補体活性は、補体制御タンパク質（ＣＣＰ）または補体活性化制御因子（ＲＣＡ）タンパク質（米国特許第６，８９７，２９０号）と呼称される様々な哺乳動物タンパク質により制御される。これらのタンパク質は、リガンドの特異性、および補体阻害の機構に関して異なっている。これらは、転換酵素の正常な崩壊を加速させ、および／またはＩ因子の補因子として機能して、Ｃ３ｂおよび／またはＣ４ｂを小さな断片へと酵素的に切断し得る。ＣＣＰは、短いコンセンサスリピート（ＳＣＲ）、補体制御タンパク質（ＣＣＰ）モジュール、またはＳＵＳＨＩドメインとして知られる複数の（典型的には４～５６個）の相同モチーフの存在を特徴とし、約５０～７０アミノ酸の長さで、四つのジスルフィド結合システイン（二つのジスルフィド結合）、プロリン、トリプトファン、および多くの疎水性残基を含む保存モチーフを含有する。ＣＣＰファミリーには、補体受容体１型（ＣＲ１；Ｃ３ｂ：Ｃ４ｂ受容体）、補体受容体２型（ＣＲ２）、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ；ＣＤ４６）、崩壊加速因子（ＤＡＦ）、補体因子Ｈ（ｆＨ）、およびＣ４ｂ－結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）が含まれる。ＣＤ５９は、ＣＣＰとは構造的に無関係な、膜結合型補体制御タンパク質である。補体制御タンパク質は通常、哺乳動物、例えばヒト宿主の細胞および組織上で、別段により発生する可能性のある補体活性化を制限する働きをする。したがって、「自己」細胞は通常、別段であれば後に続いて起こる補体活性化がこれら細胞上で進行する有害な作用から保護される。補体制御タンパク質の欠損または欠陥は、例えば本明細書で検討されるように、様々な補体介在性障害の病態に関与する。
Ｖ．補体阻害剤
（ｉ）コンプスタチン類似体
コンプスタチン（Ｃｏｍｐｓｔａｔｉｎ）は、Ｃ３に結合し、補体活性化を阻害する環状ペプチドである。米国特許第６，３１９，８９７号において、配列Ｉｌｅ－［Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ］－Ｔｈｒ（配列番号１）を有するペプチドが記載されており、二つのシステイン間のジスルフィド結合は、括弧で示される。米国特許第６，３１９，８９７号において、「コンプスタチン」という名称は私用されていないが、その後に科学文献および特許文献において採用され（例えば、Ｍｏｒｉｋｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，７（３）：６１９－２７，１９９８を参照）、米国特許第６，３１９，８９７号に開示される配列番号２と同じ配列を有するペプチドを指している。ただし、表１に示されるように、Ｃ末端でアミド化されている（配列番号８）。「コンプスタチン」という用語は、本明細書において、当該使用と合致して使用される（すなわち、配列番号８を指すために使用される）。補体阻害活性がコンプスタチンよりも高いコンプスタチン類似体が開発されている。例えば、ＷＯ２００４／０２６３２８（ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２９６５３）、Ｍｏｒｉｋｉｓ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．３２（Ｐｔ １）：２８－３２，２００４，Ｍａｌｌｉｋ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２７４－２８６，２００５；Ｋａｔｒａｇａｄｄａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４９：４６１６－４６２２，２００６；ＷＯ２００７０６２２４９（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５５３９）、ＷＯ２００７０４４６６８（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３９３９７）、ＷＯ／２００９／０４６１９８（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８５９３）、ＷＯ／２０１０／１２７３３６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３３３４５）、および以下の検討を参照のこと。
コンプスタチン類似体は、例えばＮ末端および／またはＣ末端で、アセチル化またはアミド化されてもよい。例えば、コンプスタチン類似体は、Ｎ末端でアセチル化され、Ｃ末端でアミド化されてもよい。当分野での使用と合致して、本明細書で使用される場合、「コンプスタチン」、および本明細書に記載されるコンプスタチン類似体のコンプスタチンと比較した活性は、Ｃ末端でアミド化されたコンプスタチンを指す（Ｍａｌｌｉｋ，２００５、上記）。
コンプスタチンのコンカタマーもしくは多量体、またはそれらの補体阻害類似体も、本発明において使用される。
本明細書で使用される場合、「コンプスタチン類似体」という用語は、コンプスタチンおよびその任意の補体阻害類似体を含む。「コンプスタチン類似体」という用語は、コンプスタチン、およびコンプスタチンに基づいて設計または特定された他の化合物を包含し、その補体阻害活性は、例えば当分野で受け入れられている任意の補体活性アッセイ、または実質的に類似した、もしくは均等のアッセイを使用して測定されたとき、コンプスタチンの活性の少なくとも５０％の大きさである。特定の好適なアッセイは、米国特許第６，３１９，８９７号、ＷＯ２００４／０２６３２８、Ｍｏｒｉｋｉｓ、上記、Ｍａｌｌｉｋ、上記Ｋａｔｒａｇａｄｄａ ２００６、上記、ＷＯ２００７０６２２４９（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５５３９）、ＷＯ２００７０４４６６８（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３９３９７）、ＷＯ／２００９／０４６１９８（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８５９３）、および／またはＷＯ／２０１０／１２７３３６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３３３４５）に記載されている。アッセイは、例えば、第二経路または古典経路介在性の赤血球溶解を測定してもよく、またはＥＬＩＳＡアッセイであってもよい。一部の実施形態では、ＷＯ／２０１０／１３５７１７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５８７１）に記載されるアッセイが使用される。
コンプスタチン類似体の活性は、そのＩＣ５０（補体活性化を５０％阻害する化合物の濃度）によって表されてもよく、当分野で認識されるように、ＩＣ５０が低ければ、活性が高いことを示す。本発明での使用に好ましいコンプスタチン類似体の活性は、コンプスタチンの活性と少なくとも同程度である。補体阻害活性を低下または除去することが知られている特定の改変は、本発明のいずれの実施形態からも明示的に除外され得ることに留意されたい。コンプスタチンのＩＣ５０は、第二経路介在性の赤血球溶解アッセイ（ＷＯ２００４／０２６３２８）を使用して、１２μＭと測定されている。所与のコンプスタチン類似体に対して測定されるＩＣ５０の正確な値は、実験条件（例えば、アッセイで使用される血清濃度）によって変化することが理解されよう。例えば、実質的に同一の条件下で複数の異なる化合物についてＩＣ５０が決定される実験から得られた値などの比較値が、使用される。一つの実施形態では、コンプスタチン類似体のＩＣ５０は、コンプスタチンのＩＣ５０以下である。本発明の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体の活性は、コンプスタチンの活性の２倍～９９倍の間である（すなわち、類似体は、コンプスタチンのＩＣ５０より２～９９倍少ないＩＣ５０を有する）。例えば、活性は、コンプスタチンの活性の１０倍～５０倍の大きさ、またはコンプスタチンの活性の５０倍～９９倍の大きさであってもよい。本発明の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体の活性は、コンプスタチンの９９倍～２６４倍である。例えば、活性は、コンプスタチンの活性の１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、または２６４倍であってもよい。特定の実施形態では、活性は、コンプスタチンの活性の２５０～３００倍、３００～３５０倍、３５０～４００倍、または４００～５００倍である。本発明はさらに、コンプスタチンの活性の５００倍～１０００倍以上の活性を有するコンプスタチン類似体を予期するものである。特定の実施形態では、コンプスタチン類似体のＩＣ５０は、約０．２μＭ～約０．５μＭである。特定の実施形態では、コンプスタチン類似体のＩＣ５０は、約０．１μＭ～約０．２μＭである。特定の実施形態では、コンプスタチン類似体のＩＣ５０は、約０．０５μＭ～約０．１μＭである。特定の実施形態では、コンプスタチン類似体のＩＣ５０は、約０．００１μＭ～約０．０５μＭである。
Ｃ３へのコンプスタチン結合のＫｄは、等温滴定熱量測定を使用して測定することができる（Ｋａｔｒａｇａｄｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（５３），５４９８７－５４９９５，２００４）。Ｃ３に対する様々なコンプスタチン類似体の結合アフィニティが、その活性と相関しており、Ｋｄが低いほど、結合アフィニティが高いことが示唆されることが当技術分野で認識されている。検証された特定の類似体について、結合アフィニティと活性との間に線形相関が示された（Ｋａｔｒａｇａｄｄａ，２００４、上記；Ｋａｔｒａｇａｄｄａ ２００６、上記）。本発明の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、０．１μＭ～１．０μＭ、０．０５μＭ～０．１μＭ、０．０２５μＭ～０．０５μＭ、０．０１５μＭ～０．０２５μＭ、０．０１μＭ～０．０１５μＭ、または０．００１μＭ～０．０１μＭのＫｄでＣ３に結合する。
「コンプスタチンに基づいて設計または特定された」化合物としては限定されないが、その配列が、（ｉ）コンプスタチンの配列を改変すること（例えば、コンプスタチン配列の一つ以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸またはアミノ酸アナログと置換すること、コンプスタチン配列に一つ以上のアミノ酸またはアミノ酸アナログを挿入すること、またはコンプスタチン配列から一つ以上のアミノ酸を除去すること）により取得される、（ｉｉ）コンプスタチンの一つ以上のアミノ酸が無作為化されたファージディスプレイペプチドライブラリから選択し、任意で方法（ｉ）に従いさらに改変することにより取得される、または（ｉｉｉ）Ｃ３またはその断片に対する結合に関し、方法（ｉ）または方法（ｉｉ）により取得された、コンプスタチンまたは任意のその類似体と競合する化合物をスクリーニングすることにより特定される、アミノ酸鎖を含む化合物を指す。多くの有用なコンプスタチン類似体が、疎水性クラスター、β－ターン、およびジスルフィド架橋を含む。
本発明の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体の配列は、コンプスタチン配列中に１個、２個、３個、または４個の置換を行うことにより取得される配列を含むか、または本質的にそれからなる。すなわち、コンプスタチン配列中の１個、２個、３個、または４個のアミノ酸が、異なる標準アミノ酸によって、または非標準アミノ酸によって置換される。本発明の特定の実施形態では、４位のアミノ酸が、変更される。本発明の特定の実施形態では、９位のアミノ酸が、変更される。本発明の特定の実施形態では、４位および９位のアミノ酸が、変更される。本発明の特定の実施形態では、４位および９位のアミノ酸のみが、変更される。本発明の特定の実施形態では、４位または９位のアミノ酸が、変更される。または特定の実施形態では、４位および９位のアミノ酸の両方が変更され、それに加えて、１位、７位、１０位、１１位、および１３位から選択される位置にある最大で２個のアミノ酸が変更される。本発明の特定の実施形態では、４位、７位、および９位のアミノ酸が、変更される。本発明の特定の実施形態では、２位、１２位、またはその両方でアミノ酸が変更されるが、ただし、当該変更は、化合物の環化能力を保持するものとする。２位および／または１２位でのこうした変更は、１位、４位、７位、９位、１０位、１１位、および／または１３位での変更に追加されてもよい。任意で、コンプスタチン配列の一つ以上のアミノ酸を置換することによってその配列が取得されるコンプスタチン類似体のいずれかの配列はさらに、Ｃ末端で最大１、２、または３個の追加のアミノ酸を含む。一つの実施形態では、追加のアミノ酸は、Ｇｌｙである。任意で、コンプスタチン配列の一つ以上のアミノ酸を置換することによってその配列が取得されるコンプスタチン類似体のいずれかの配列はさらに、Ｃ末端で最大５個または最大１０個の追加のアミノ酸を含む。コンプスタチン類似体は、本明細書に記載される様々な実施形態の特徴または特性のうちの任意の一つ以上を有し得、そして任意の実施形態の特徴または特性は、文脈から別段の記載がある、または文脈から明白でない限り、本明細書に記載される任意の他の実施形態を追加的に特徴付け得ることを理解されたい。本発明の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体の配列は、コンプスタチン配列中の４位および９位に相当する位置を除き、コンプスタチン配列と同一の配列を含むか、または本質的にコンプスタチン配列と同一の配列からなる。
コンプスタチン、およびコンプスタチンよりもいくらか大きな活性を有する特定のコンプスタチン類似体は、標準アミノ酸のみを含有する（「標準アミノ酸」は、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、メチオニン、アルギニン、リジン、プロリン、セリン、スレオニン、およびヒスチジンである）。活性が改善された特定のコンプスタチン類似体は、一つ以上の非標準アミノ酸を組み込んでいる。有用な非標準アミノ酸としては、単独で、および複合的にハロゲン化（例えばフッ素化）されたアミノ酸、Ｄ－アミノ酸、ホモ－アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、デヒドロアミノ酸、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン以外）、オルト－、メタ－、またはパラ－アミノ安息香酸、ホスホ－アミノ酸、メトキシ化アミノ酸、ならびにα，α－二置換アミノ酸が挙げられる。本発明の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、本明細書において別段に記載されるコンプスタチン類似体中の一つ以上のＬ－アミノ酸を、対応するＤ－アミノ酸で置換することによって設計される。こうした化合物およびその使用方法は、本発明の一態様である。使用される例示的な非標準アミノ酸としては、２－ナフチルアラニン（２－ＮａＩ）、１－ナフチルアラニン（１－ＮａＩ）、２－インダニルグリシンカルボン酸（２Ｉｇ１）、ジヒドロトリプトファン（Ｄｈｔ）、４－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン（Ｂｐａ）、２－αアミノ酪酸（２－Ａｂｕ）、３－α－アミノ酪酸（３－Ａｂｕ）、４－α－アミノ酪酸（４－Ａｂｕ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ホモシクロヘキシルアラニン（ｈＣｈａ）、４－フルオロ－Ｌ－トリプトファン（４ｆＷ）、５－フルオロ－Ｌ－トリプトファン（５ｆＷ）、６－フルオロ－Ｌ－トリプトファン（６ｆＷ）、４－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファン（４ＯＨ－Ｗ）、５－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファン（５ＯＨ－Ｗ）、６－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファン（６ＯＨ－Ｗ）、１－メチル－Ｌ－トリプトファン（１ＭｅＷ）、４－メチル－Ｌ－トリプトファン（４ＭｅＷ）、５－メチル－Ｌ－トリプトファン（５ＭｅＷ）、７－アザ－Ｌ－トリプトファン（７ａＷ）、α－メチル－Ｌ－トリプトファン（αＭｅＷ）、β－メチル－Ｌ－トリプトファン（βＭｅＷ）、Ｎ－メチル－Ｌ－トリプトファン（ＮＭｅＷ）、オルニチン（ｏｒｎ）、シトルリン、ノルロイシン、γ－グルタミン酸などが挙げられる。
本発明の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、（例えば、コンプスタチンの配列に対して、４位および／または７位で）一つ以上のＴｒｐ類似体を含む。例示的なＴｒｐ類似体は、上記に記載されている。また、Ｂｅｅｎｅ，ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１０２６２－１０２６９，２００２（ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ，ｉｎｔｅｒ ａｌｉａ，ｓｉｎｇｌｙ－ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｙ－ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ Ｔｒｐ ａｎａｌｏｇｓ）；Ｂａｂｉｔｚｋｅ ＆ Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１２４５２－１２４５６，１９９５（特にメチル化およびハロゲン化されたＴｒｐ、ならびに他のＴｒｐおよびインドール類似体について記載している）ならびに米国特許第６，２１４，７９０号、第６，１６９，０５７号、第５，７７６，９７０号、第４，８７０，０９７号、第４，５７６，７５０号、および第４，２９９，８３８号も参照のこと。他のＴｒｐ類似体としては、αまたはβ炭素で、および任意でインドール環の一つ以上の位置でも（例えばメチル基により）置換されるバリアントが挙げられる。置換、非置換、または代替的に置換されたそのバリアントを含む二つ以上の芳香族環を含むアミノ酸も、Ｔｒｐ類似体として対象である。本発明の特定の実施形態では、例えば４位のＴｒｐ類似体は、５－メトキシ、５－メチル－、１－メチル－、または１－ホルミル－トリプトファンである。本発明の特定の実施形態では、１－アルキル置換基、例えば、低級アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ５）置換基を含む（例えば４位の）Ｔｒｐ類似体が使用される。特定の実施形態では、Ｎ（α）メチルトリプトファンまたは５－メチルトリプトファンが使用される。一部の実施形態では、１－アルカノイル置換基、例えば、低級アルカノイル（例えば、Ｃ１～Ｃ５）を含む類似体が使用される。例としては、１－アセチル－Ｌ－トリプトファン、およびＬ－β－トリプトファンが挙げられる。
特定の実施形態では、Ｔｒｐ類似体は、Ｔｒｐと比較して疎水性の特性が強化されている。例えばインドール環は、一つ以上のアルキル（例えば、メチル）基によって置換されてもよい。特定の実施形態では、Ｔｒｐ類似体は、Ｃ３との疎水性相互作用に関与する。かかるＴｒｐ類似体は、例えば、コンプスタチン配列に対して４位に位置してもよい。特定の実施形態では、Ｔｒｐ類似体は、置換または非置換の二環式芳香族環成分、または二つ以上の置換もしくは非置換の単環式芳香族環成分を含む。
特定の実施形態では、Ｔｒｐ類似体は、Ｔｒｐと比較してＣ３と水素結合を形成する傾向が強いが、Ｔｒｐと比較して疎水性の特性は強化されていない。Ｔｒｐ類似体は、Ｔｒｐと比較して極性が増大してもよく、および／またはＣ３上の水素結合ドナーとの静電相互作用に関与する能力が増大してもよい。水素結合を形成する特性が増した特定の例示的なＴｒｐ類似体は、インドール環上に電気陰性置換基を含む。かかるＴｒｐ類似体は、例えば、コンプスタチン配列に対して７位に位置してもよい。
本発明の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、（例えば、コンプスタチン配列に対して９位で）一つ以上のＡｌａ類似体、例えば、側鎖に一つ以上のＣＨ２基を含むことを除き、Ａｌａと同一のＡｌａ類似体を含む。特定の実施形態では、Ａｌａ類似体は、例えば２－Ａｂｕなどの非分岐単メチルアミノ酸である。本発明の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、（例えば、コンプスタチンの配列に対して、４位および／または７位で）一つ以上のＴｒｐ類似体、および（コンプスタチン配列に対して９位で）Ａｌａ類似体を含む。
本発明の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、Ｘ’ａａ）ｎ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－（Ｘ”ａａ）ｍ，、（配列番号２）の配列を有するペプチドを含む化合物であり、式中、各Ｘ’ａａおよび各Ｘ”ａａは独立して、アミノ酸またはアミノ酸類似体から選択され、Ｘａａは、ＴｒｐまたはＴｒｐ類似体であり、ｎ＞１であり、ｍ＞１であり、ｎ＋ｍは５～２１である。ペプチドは、Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｘａａ－Ｇｌｙのコア配列を有し、式中、Ｘａａは、Ｔｒｐ、またはＴｒｐの類似体であり、例えば、Ｔｒｐと比較して、Ｈ－結合ドナーと水素結合を形成する傾向が強いＴｒｐの類似体であるが、特定の実施形態では、Ｔｒｐと比較して、疎水性の特性は増加していない。例えば、類似体は、Ｔｒｐのインドール環が、電気陰性部分、例えばフッ素などのハロゲンで置換されているものであってもよい。一つの実施形態では、Ｘａａは、５－フルオロトリプトファンである。反対であることが明白でなければ、当業者は、その配列が当該コア配列を含み、補体活性化を阻害し、および／またはＣ３に結合する、任意の非天然ペプチドが、コンプスタチン配列に基づいて設計されることを認識するであろう。代替的な実施形態では、Ｘａａは、Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｘａａ－Ｇｌｙペプチドにβ－ターンを形成させる、Ｔｒｐ類似体以外のアミノ酸またはアミノ酸類似体である。
本発明の特定の実施形態では、ペプチドは、Ｘ’ａａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｘａａ－Ｇｌｙ（配列番号３）のコア配列を有し、Ｘ’ａａおよびＸａａは、ＴｒｐおよびＴｒｐ類似体から選択される。本発明の特定の実施形態では、ペプチドは、Ｘ’ａａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｘａａ－Ｇｌｙ（配列番号３）のコア配列を有し、Ｘ’ａａおよびＸａａは、Ｔｒｐ、Ｔｒｐ類似体、および少なくとも一つの芳香族環を含む他のアミノ酸またはアミノ酸類似体から選択される。本発明の特定の実施形態では、コア配列は、ペプチドとの関連でβ－ターンを形成する。β－ターンは可撓性であってもよく、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して評価したときに、当該ペプチドに二つ以上の立体構造が想定される。特定の実施形態では、Ｘ’ａａは、置換または非置換の二環式芳香族環成分、または二つ以上の置換もしくは非置換の単環式芳香族環成分を含むＴｒｐ類似体である。本発明の特定の実施形態では、Ｘ’ａａは、２－ナフチルアラニン、１－ナフチルアラニン、２－インダニルグリシンカルボン酸、ジヒドロトリプトファン、およびベンゾイルフェニルアラニンからなる群から選択される。本発明の特定の実施形態では、Ｘ’ａａは、Ｔｒｐと比較して疎水性の特性が増加したＴｒｐの類似体である。例えば、Ｘ’ａａは、１－メチルトリプトファンであってもよい。本発明の特定の実施形態では、Ｘａａは、Ｔｒｐと比較して水素結合を形成する傾向が強いが、特定の実施形態では、Ｔｒｐと比較して疎水性の特性が増加していない、Ｔｒｐの類似体である。本発明の特定の実施形態では、Ｔｒｐと比較して、水素結合を形成する傾向が強いＴｒｐ類似体は、例えば、５位のＨ原子に対するハロゲン原子の置換など、例えば５位で、Ｔｒｐのインドール環上に改変を含む。例えば、Ｘａａは、５－フルオロトリプトファンであってもよい。
本発明の特定の実施形態では、ペプチドは、Ｘ’ａａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘ”ａａ（配列番号４）のコア配列を有し、式中、Ｘ’ａａおよびＸａａは各々独立して、ＴｒｐおよびＴｒｐ類似体から選択され、Ｘ”ａａは、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ａｌａ類似体、Ｐｈｅ、およびＴｒｐから選択される。本発明の特定の実施形態では、Ｘ’ａａは、Ｔｒｐと比較して疎水性の特性が増加したＴｒｐ類似体であり、例えば、１－メチルトリプトファン、または（１位、４位、５位または６位で）インドール環上にアルキル置換基を有する別のＴｒｐ類似体である。特定の実施形態では、Ｘ’ａａは、置換または非置換の二環式芳香族環成分、または二つ以上の置換もしくは非置換の単環式芳香族環成分を含むＴｒｐ類似体である。本発明の特定の実施形態では、Ｘ’ａａは、２－ナフチルアラニン、１－ナフチルアラニン、２－インダニルグリシンカルボン酸、ジヒドロトリプトファン、およびベンゾイルフェニルアラニンからなる群から選択される。本発明の特定の実施形態では、Ｘａａは、Ｔｒｐと比較してＣ３と水素結合を形成する傾向が強いが、特定の実施形態では、Ｔｒｐと比較して疎水性の特性が増加していない、Ｔｒｐの類似体である。本発明の特定の実施形態では、Ｔｒｐと比較して、水素結合を形成する傾向が強いＴｒｐ類似体は、例えば、５位のＨ原子に対するハロゲン原子の置換など、例えば５位で、Ｔｒｐのインドール環上に改変を含む。例えば、Ｘａａは、５－フルオロトリプトファンであってもよい。特定の実施形態では、Ｘ”ａａは、ＡｌａまたはＡｌａ類似体であり、例えばＡｂｕ、または別の非分岐単メチルアミノ酸である。本発明の特定の実施形態では、ペプチドは、Ｘ’ａａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘ”ａａ（配列番号４）のコア配列を有し、式中、Ｘ’ａａおよびＸａａは各々独立して、Ｔｒｐ、Ｔｒｐ類似体、および少なくとも一つの芳香族側鎖を含むアミノ酸またはアミノ酸類似体から選択され、Ｘ”ａａは、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ａｌａ類似体、Ｐｈｅ、およびＴｒｐから選択される。特定の実施形態では、Ｘ”ａａは、Ｔｒｐ類似体、芳香族アミノ酸、および芳香族アミノ酸類似体から選択される。
本発明の特定の好ましい実施形態では、ペプチドは、環状である。ペプチドは、任意の二つのアミノ酸間の結合を介して環化されてもよく、そのうちの一つのアミノ酸は、（Ｘ’ａａ）ｎであり、他方は、（Ｘ’ａａ）ｍ内に配置される。特定の実施形態では、ペプチドの環状部分は、９～１５アミノ酸の長さ、例えば、１０～１２アミノ酸の長さである。特定の実施形態では、ペプチドの環状部分は、１１アミノ酸の長さであり、２位と１２位のアミノ酸の間に結合（例えば、ジスルフィド結合）を含む。例えば、ペプチドは、１３アミノ酸の長さであってもよく、２位と１２位のアミノ酸の間の結合により、１１アミノ酸の長さの環状部分が生じる。
特定の実施形態では、ペプチドは、配列Ｘ’ａａ１－Ｘ’ａａ２－Ｘ’ａａ３－Ｘ’ａａ４－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘ”ａａ１－Ｘ”ａａ２－Ｘ”ａａ３－Ｘ”ａａ４－Ｘ”ａａ５（配列番号５）．を含むか、または当該配列からなる。特定の実施形態では、Ｘ’ａａ４およびＸａａは、ＴｒｐおよびＴｒｐ類似体から選択され、Ｘ’ａａ１、Ｘ’ａａ２、Ｘ’ａａ３、Ｘ”ａａ１、Ｘ”ａａ２、Ｘ”ａａ３、Ｘ”ａａ４、およびＸ”ａａ５は独立して、アミノ酸およびアミノ酸類似体から選択される。特定の実施形態では、Ｘ’ａａ４及びＸａａは、芳香族アミノ酸および芳香族アミノ酸類似体から選択される。Ｘ’ａａ１、Ｘ’ａａ２、Ｘ’ａａ３、Ｘ”ａａ１、Ｘ”ａａ２、Ｘ”ａａ３、Ｘ”ａａ４、およびＸ”ａａ５のうちのいずれか一つ以上が、コンプスタチン中の対応する位置のアミノ酸と同一であり得る。一つの実施形態では、Ｘ”ａａ１は、Ａｌａ、または単メチル非分岐アミノ酸である。ペプチドは、（ｉ）Ｘ’ａａ１、Ｘ’ａａ２、またはＸ’ａａ３と、（ｉｉ）Ｘ”ａａ２、Ｘ”ａａ３、Ｘ”ａａ４、またはＸ”ａａ５の間の共有結合を介して環化されてもよい。一つの実施形態では、ペプチドは、Ｘ’ａａ２とＸ’ａａ４の間の共有結合を介して環化される。一つの実施形態では、共有結合されるアミノ酸は、各々Ｃｙｓであり、共有結合は、ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合である。他の実施形態では、共有結合は、Ｃ－Ｃ、Ｃ－Ｏ、Ｃ－Ｓ、またはＣ－Ｎ結合である。特定の実施形態では、共有結合残基のうちの一つは、一級アミンまたは二級アミンを含む側鎖を有するアミノ酸またはアミノ酸類似体であり、他方の共有結合残基は、カルボン酸基を含む側鎖を有するアミノ酸またはアミノ酸類似体であり、共有結合はアミド結合である。一級アミンまたは二級アミンを含む側鎖を有するアミノ酸またはアミノ酸類似体としては、それぞれ、リシン、および一般構造ＮＨ２（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨのジアミノカルボン酸が挙げられ、例えば、２，３－ジアミノプロピオン酸（ｄａｐａ）、２，４－ジアミノ酪酸（ｄａｂａ）、およびオルニチン（ｏｒｎ）であり、式中、ｎはそれぞれ、１（ｄａｐａ）、２（ｄａｂａ）、および３（ｏｒｎ）である。カルボン酸基を含む側鎖を有するアミノ酸の例としては、例えばグルタミン酸およびアスパラギン酸などのジカルボン酸アミノ酸が挙げられる。例えばベータ－ヒドロキシ－Ｌ－グルタミン酸などの類似体も使用され得る。一部の実施形態では、ペプチドは、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５２４４２（ＷＯ／２０１２／０４０２５９）に記載されるように、チオエーテル結合で環化される。例えば、一部の実施形態では、ペプチドのいずれかのジスルフィド結合は、チオエーテル結合で置換される。一部の実施形態では、シスタチオニンが形成される。一部の実施形態では、シスタチオニンは、デルタ－シスタチオニンまたはガンマ－シスタチオニンである。一部の実施形態では、改変は、配列番号５のＸ’ａａ２とＸ’ａａ４（または他の配列中の対応する位置）の間のＣｙｓ－Ｃｙｓジスルフィド結合の置換を含み、ＣＨ２が加わりＸ’ａａ２またはＸ”ａａ４でホモシステインが形成され、チオエーテル結合が加わりシスタチオニンが形成される。一つの実施形態では、シスタチオニンは、ガンマ－シスタチオニンである。別の実施形態では、シスタチオニンは、デルタ－シスタチオニンである。本発明による別の改変は、ジスルフィド結合とチオエーテル結合の置換を含み、ＣＨ２の付加は伴わず、それによってランチチオニン（ｌａｎｔｉｔｈｉｏｎｉｎｅ）が形成される。一部の実施形態では、ジスルフィド結合の代わりにチオエーテル結合を有するコンプスタチン類似体は、ジスルフィド結合を有するコンプスタチン類似体と比較して、少なくともいくつかの条件下で安定性が増加した。
特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、以下の配列を有するペプチドを含む化合物である：
Ｘａａ１－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｘａａ２－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｘａａ２＊－Ｇｌｙ－Ｘａａ３－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｘａａ４（配列番号６）、式中、
Ｘａａ１は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｂ１－Ｉｌｅ、Ｂ１－Ｖａｌ、Ｂ１－Ｌｅｕ、またはＧｌｙ－ＩｌｅもしくはＢ１－Ｇｌｙ－Ｉｌｅを含むジペプチドであり、Ｂ１は、第一のブロッキング部分を表し、
Ｘａａ２およびＸａａ２＊は、ＴｒｐおよびＴｒｐ類似体から独立して選択され、
Ｘａａ３は、Ｈｉｓ、ＡｌａまたはＡｌａ類似体、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｒｐ類似体であり、
Ｘａａ４は、Ｌ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ－ＡｌａおよびＴｈｒ－Ａｓｎから選択されるジペプチド、またはＴｈｒ－Ａｌａ－Ａｓｎを含むトリペプチドであり、この場合において、Ｌ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＡｓｎのいずれかのカルボキシ末端－ＯＨは任意で、第二のブロッキング部分Ｂ２と置換され、
二つのＣｙｓ残基は、ジスルフィド結合により結合される。一部の実施形態では、Ｘａａ４は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｈｉｓ、もしくはＰｈｅ、またはＸａａ５－ＡｌａおよびＸａａ５－Ａｓｎから選択されるジペプチド、またはトリペプチドのＸａａ５－Ａｌａ－Ａｓｎであり、式中、Ｘａａ５は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、ＨｉｓまたはＰｈｅから選択され、Ｌ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、またはＡｓｎのいずれかのカルボキシ末端－ＯＨは、第二のブロッキング部分Ｂ２と置換され、二つのＣｙｓ残基は、ジスルフィド結合により結合される。
他の実施形態では、Ｘａａ１は存在しないか、または任意のアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であり、Ｘａａ２、Ｘａａ２＊、Ｘａａ３、およびＸａａ４は、上記に定義されるとおりである。Ｘａａ１が存在しない場合、Ｎ末端Ｃｙｓ残基は、それに結合されるブロッキング部分Ｂ１を有し得る。
別の実施形態では、Ｘａａ４は任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体であり、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ２＊、およびＸａａ３は、上記に定義されるとおりである。別の実施形態では、Ｘａａ４は、以下からなる群から選択されるジペプチドである：Ｔｈｒ－ＡｌａおよびＴｈｒ－Ａｓｎ、式中、カルボキシ末端－ＯＨまたはＡｌａまたはＡｓｎは任意で第二のブロッキング部分Ｂ２と置換される。
配列番号 ６のコンプスタチン類似体の実施形態のいずれかにおいて、Ｘａａ２は、Ｔｒｐであり得る。
配列番号 ６のコンプスタチン類似体の実施形態のいずれかにおいて、Ｘａａ２は、置換または非置換の二環式芳香族環成分、または二つ以上の置換もしくは非置換の単環式芳香族環成分を含むＴｒｐ類似体であり得る。例えば、Ｔｒｐ類似体は、２－ナフチルアラニン（２－ＮａＩ）、１－ナフチルアラニン（１－ＮａＩ）、２－インダニルグリシンカルボン酸（Ｉｇ１）、ジヒドロトリプトファン（Ｄｈｔ）、および４－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニンから選択され得る。
配列番号 ６のコンプスタチン類似体の実施形態のいずれかにおいて、Ｘａａ２は、Ｔｒｐと比較して疎水性の特性が増加したＴｒｐ類似体であり得る。例えば、Ｔｒｐ類似体は、１－メチルトリプトファン、４－メチルトリプトファン、５－メチルトリプトファン、および６－メチルトリプトファンから選択されてもよい。一つの実施形態では、Ｔｒｐ類似体は、１－メチルトリプトファンである。一つの実施形態では、Ｘａａ２は、１－メチルトリプトファンであり、Ｘａａ２＊は、Ｔｒｐであり、Ｘａａ３は、Ａｌａであり、他のアミノ酸は、コンプスタチンのアミノ酸と同一である。
配列番号６のコンプスタチン類似体の実施形態のいずれかにおいて、Ｘａａ２＊は、例えばＴｒｐと比較してＣ３との水素結合形成傾向が高いＴｒｐ類似体、特定の実施形態では、Ｔｒｐと比較して疎水性の特性は増大していないＴｒｐ類似体などのＴｒｐ類似体である。特定の実施形態では、Ｔｒｐ類似体は、インドール環上に電気陰性置換基を含む。例えば、Ｔｒｐ類似体は、５－フルオロトリプトファンおよび６－フルオロトリプトファンから選択されてもよい。
本発明の特定の実施形態では、Ｘａａ２は、Ｔｒｐであり、Ｘａａ２＊は、Ｔｒｐと比較してＣ３と水素結合を形成する傾向が高いＴｒｐ類似体が、特定の実施形態では、Ｔｒｐと比較して疎水性の特性が増加していないＴｒｐの類似体である。配列番号６のコンプスタチン類似体の特定の実施形態において、Ｘａａ２は、例えば、１－メチルトリプトファン、４－メチルトリプトファン、５－メチルトリプトファン、および６－メチルトリプトファンから選択されるＴｒｐ類似体など、Ｔｒｐと比較して疎水性の特性が増加したＴｒｐ類似体であり、Ｘａａ２＊は、Ｔｒｐと比較してＣ３と水素結合を形成する傾向が高いＴｒｐ類似体であり、特定の実施形態では、Ｔｒｐと比較して疎水性の特性が増加していないＴｒｐ類似体である。例えば、一つの実施形態では、Ｘａａ２は、メチルトリプトファンであり、Ｘａａ２＊は、５－フルオロトリプトファンである。
上述の実施形態のあるものは、Ｘａａ３は、Ａｌａである。上述の実施形態のあるものは、Ｘａａ３は、単メチル非分岐アミノ酸、例えば、Ａｂｕである。
本発明はさらに、上述のように、配列番号６のコンプスタチン類似体を提供するものであり、この場合においてＸａａ２およびＸａａ２＊は、Ｔｒｐ、Ｔｒｐ類似体、および少なくとも一つの芳香族環を含む他のアミノ酸またはアミノ酸類似体から独立して選択され、
Ｘａａ３は、Ｈｉｓ、ＡｌａまたはＡｌａ類似体、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｒｐ類似体、または別の芳香族アミノ酸もしくは芳香族アミノ酸類似体である。
本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載されるコンプスタチン類似体のいずれかのＮ末端またはＣ末端に存在するブロッキング部分は、哺乳動物（例えばヒトまたは非ヒト霊長類）の血中または間質液中にはさもなければ存在しないであろう、分解に対してペプチドを安定化させる任意の部分である。例えば、ブロッキング部分Ｂ１は、ペプチドのＮ末端の構造を変化させ、ペプチドのＮ末端アミノ酸と隣接アミノ酸との間のペプチド結合の切断を阻害する任意の部分であり得る。ブロッキング部分Ｂ２は、ペプチドのＣ末端の構造を変化させ、ペプチドのＣ末端アミノ酸と隣接アミノ酸との間のペプチド結合の切断を阻害する任意の部分であり得る。当該技術分野で公知の任意の適切なブロッキング部分を使用することができる。本発明の特定の実施形態では、ブロッキング部分Ｂ１は、アシル基（すなわち、－ＯＨ基の除去後に残るカルボン酸の部分）を含む。アシル基は、典型的には、１～１２個の炭素、例えば、１～６個の炭素を含む。例えば、本発明の特定の実施形態では、ブロッキング部分Ｂ１は、ホルミル、アセチル、プロプリオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリルなどからなる群から選択される。一つの実施形態では、ブロッキング部分Ｂ１は、アセチル基であり、すなわち、Ｘａａ１は、Ａｃ－Ｉｌｅ、Ａｃ－Ｖａｌ、Ａｃ－Ｌｅｕ、またはＡｃ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅである。
本発明の特定の実施形態では、ブロッキング部分Ｂ２は、一級アミンまたは二級アミン（－ＮＨ２または－ＮＨＲ１であり、式中、Ｒは、例えばアルキル基などの有機部分である）である。
本発明の特定の実施形態では、ブロッキング部分Ｂ１は、生理学的ｐＨで、さもなければＮ末端に存在し得る正電荷を中和または低下させる任意の部分である。本発明の特定の実施形態では、ブロッキング部分Ｂ２は、生理学的ｐＨで、さもなければＣ末端に存在し得る負電荷を中和または低下させる任意の部分である。
本発明の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、それぞれＮ末端および／またはＣ末端でアセチル化またはアミド化される。コンプスタチン類似体は、Ｎ末端でアセチル化され、Ｃ末端でアミド化され、およびまたはＮ末端でのアセチル化とＣ末端でのアミド化の両方を受けてもよい。本発明の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、アセチル基ではなく、Ｎ末端にアルキル基またはアリール基を含む。
特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、以下の配列を有するペプチドを含む化合物である：
Ｘａａ１－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｘａａ２－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｘａａ２＊－Ｇｌｙ－Ｘａａ３－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｘａａ４（配列番号７）、式中、
Ｘａａ１は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｃ－Ｉｌｅ、Ａｃ－Ｖａｌ、Ａｃ－Ｌｅｕ、またはＧｌｙ－ＩｌｅもしくはＡｃ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅを含むジペプチドであり、
Ｘａａ２およびＸａａ２＊は、ＴｒｐおよびＴｒｐ類似体から独立して選択され、
Ｘａａ３は、Ｈｉｓ、ＡｌａまたはＡｌａ類似体、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｒｐ類似体であり、
Ｘａａ４は、Ｌ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ－ＡｌａおよびＴｈｒ－Ａｓｎから選択されるジペプチド、またはＴｈｒ－Ａｌａ－Ａｓｎを含むトリペプチドであり、この場合において、Ｌ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＡｓｎのいずれかのカルボキシ末端－ＯＨは任意で、－ＮＨ２と置換され、二つのＣｙｓ残基は、ジスルフィド結合により結合される。一部の実施形態では、Ｘａａ４は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｈｉｓ、もしくはＰｈｅ、またはＸａａ５－ＡｌａおよびＸａａ５－Ａｓｎから選択されるジペプチド、またはトリペプチドのＸａａ５－Ａｌａ－Ａｓｎであり、式中、Ｘａａ５は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、ＨｉｓまたはＰｈｅから選択され、Ｌ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、またはＡｓｎのいずれかのカルボキシ末端－ＯＨは、第二のブロッキング部分Ｂ２と置換され、二つのＣｙｓ残基は、ジスルフィド結合により結合される。
一部の実施形態では、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ２＊、Ｘａａ３、およびＸａａ４は、配列番号６の様々な実施形態に関して上述される通りである。例えば、特定の実施形態では、Ｘａａ２＊は、Ｔｒｐである。特定の実施形態では、Ｘａａ２は、Ｔｒｐと比較して疎水性の特性が増加したＴｒｐ類似体であり、例えば、１－メチルトリプトファンである。特定の実施形態では、Ｘａａ３は、Ａｌａである。特定の実施形態では、Ｘａａ３は、単メチル非分岐アミノ酸である。
本発明の特定の実施形態では、Ｘａａ１は、Ｉｌｅであり、Ｘａａ４は、Ｌ－Ｔｈｒである。
本発明の特定の実施形態では、Ｘａａ１は、Ｉｌｅであり、Ｘａａ２＊は、Ｔｒｐであり、Ｘａａ４は、Ｌ－Ｔｈｒである。
本発明はさらに、上述のように、配列番号７のコンプスタチン類似体を提供するものであり、この場合においてＸａａ２およびＸａａ２＊は、Ｔｒｐ、Ｔｒｐ類似体、他のアミノ酸、または芳香族アミノ酸類似体であり、Ｘａａ３は、Ｈｉｓ、ＡｌａまたはＡｌａ類似体、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｒｐ類似体、または別の芳香族アミノ酸もしくは芳香族アミノ酸類似体である。
本明細書に記載されるコンプスタチン類似体のいずれかの特定の実施形態では、Ｐｈｅではなく、Ｐｈｅ類似体が使用される。
表１は、本発明に有用なコンプスタチン類似体の非限定的なリストを提供する。類似体は、親ペプチドであるコンプスタチンと比較した指定位置（１～１３）での特定の修飾を示すことによって、左列において略語形で称される。当分野での使用と合致して、本明細書で使用される場合、「コンプスタチン」、および本明細書に記載されるコンプスタチン類似体のコンプスタチンと比較した活性は、Ｃ末端でアミド化されたコンプスタチンペプチドを指す。別段の示唆が無い限り、表１のペプチドは、Ｃ末端でアミド化されている。太字は、特定の変更を示すために使用される。コンプスタチンと比較した活性は、公開データ、および本明細書に記載されるアッセイに基づいている（ＷＯ２００４／０２６３２８、ＷＯ２００７０４４６６８、Ｍａｌｌｉｋ，２００５；Ｋａｔｒａｇａｄｄａ，２００６）。活性を報告している複数の公表文献が参照される場合、より最近に公表された値が使用され、アッセイ間の差異の場合には値が調整され得ると認識される。また、本発明の特定の実施形態では、表１に列挙されるペプチドは、本発明の治療用組成物および方法で使用されるとき、二つのＣｙｓ残基間のジスルフィド結合を介して環化されることも認識されるであろう。ペプチドを環化するための代替手段も本発明の範囲内である。上述のように、本発明の様々な実施形態では、コンプスタチン類似体（例えば、本明細書に開示されるコンプスタチン類似体のいずれか）の一つ以上のアミノ酸が、Ｎ－アルキルアミノ酸（例えば、Ｎ－メチルアミノ酸）であってもよい。例えば限定されないが、ペプチドの環状部分の内の少なくとも一つのアミノ酸、環状部分に対してＮ末端の少なくとも一つのアミノ酸、および／または環状部分に対しＣ末端の少なくとも一つのアミノ酸は、Ｎ－アルキルアミノ酸、例えば、Ｎ－メチルアミノ酸であってもよい。本発明の一部の実施形態では、例えば、コンプスタチン類似体は、Ｎ－メチルグリシンを、例えば、コンプスタチンの８位に相当する位置で、および／またはコンプスタチンの１３位に相当する位置で、含む。本発明の一部の実施形態では、表１のコンプスタチン類似体のうちの一つ以上は、少なくとも一つのＮ－メチルグリシンを、例えば、コンプスタチンの８位に相当する位置で、および／またはコンプスタチンの１３位に相当する位置で、含む。本発明の一部の実施形態では、表１のコンプスタチン類似体のうちの一つ以上は、少なくとも一つのＮ－メチルグリシンを、例えば、コンプスタチンの１３位に相当する位置で、含む。例えば、その配列が表１に列挙されているペプチド、または任意の他のコンプスタチン類似体配列のＣ末端の、またはＣ末端近傍のＴｈｒは、ＮメチルＩｌｅにより置換されてもよい。理解されように、一部の実施形態では、Ｎ－メチル化アミノ酸は、８位でＮ－メチルＧｌｙ、１３位でＮ－メチルＩｌｅを含む。一部の実施形態では、Ｎ－メチル化アミノ酸は、例えば配列番号３または配列番号４などのコア配列中にＮ－メチルＧｌｙを含む。一部の実施形態では、Ｎ－メチル化アミノ酸は、例えば配列番号５、配列番号６、または配列番号７などのコア配列中にＮ－メチルＧｌｙを含む。
Figure 2022539238000002
本発明の組成物および方法の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、配列９～３６から選択される配列を有する。本発明の組成物および方法の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、配列番号１４、２１、２８、２９、３２、３３、３４、および３６から選択される配列を有する。本発明の組成物および／または方法の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、配列番号３０および３１から選択される配列を有する。本発明の組成物および方法の一つの実施形態では、コンプスタチン類似体は、配列番号２８の配列を有する。本発明の組成物および方法の一つの実施形態では、コンプスタチン類似体は、配列番号３２の配列を有する。本発明の組成物および方法の一つの実施形態では、コンプスタチン類似体は、配列番号３４の配列を有する。本発明の組成物および方法の一つの実施形態では、コンプスタチン類似体は、配列番号３６の配列を有する。
一部の実施形態では、ブロッキング部分Ｂ１は、Ｘａａ０と表され得るアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ブロッキング部分Ｂ２は、ＸａａＮと表され得るアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ブロッキング部分Ｂ１および／またはＢ２は、例えばＤ－アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸（例えば、Ｎ－メチルアミノ酸）などの非標準アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ブロッキング部分Ｂ１および／またはＢ２は、標準アミノ酸の類似体である非標準アミノ酸を含む。一部の実施形態では、アミノ酸類似体は、標準アミノ酸の類似体と比較して、低級アルキル、低級アルコキシ、またはハロゲン置換基を含む。一部の実施形態では、置換基は、側鎖上にある。一部の実施形態では、置換基は、アルファ炭素原子上にある。一部の実施形態では、例えば非標準アミノ酸などのアミノ酸を含むブロッキング部分Ｂ１はさらに、部分Ｂ１ａを含む。例えば、ブロッキング部分Ｂ１は、Ｂ１ａ－Ｘａａ０として表される場合がある。一部の実施形態では、Ｂ１ａは、生理学的ｐＨで、さもなければＮ末端に存在し得る正電荷を中和または低下させる。一部の実施形態では、Ｂ１ａは、例えば、１～１２個の炭素、例えば、１～６個の炭素を含むアシル基を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、ブロッキング部分Ｂ１ａは、ホルミル、アセチル、プロプリオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリルなどからなる群から選択される。一部の実施形態では、アミノ酸、例えば、非標準アミノ酸を含むブロッキング部分Ｂ２は、部分Ｂ２ａをさらに含み得る。例えば、ブロッキング部分Ｂ２は、ＸａａＮ－Ｂ２ａとして表される場合もあり、式中、Ｎは、当該アミノ酸に対する適切な数を表す（ペプチドの残りの部分で使用される番号に依存する）。一部の実施形態では、Ｂ２ａは、生理学的ｐＨで、さもなければＣ末端に存在し得る負電荷を中和または低下させる。一部の実施形態では、Ｂ２ａは、一級アミンまたは二級アミン（例えば、ＮＨ２）を含むか、またはからなる。部分Ｂ１ａ－Ｘａａ０および／またはＸａａＮ－Ｂ２ａのブロッキング活性は、様々な実施形態において当該部分のいずれかまたは両方の構成要素によって提供され得ることが理解されるであろう。一部の実施形態では、ブロッキング部分またはその一部、例えばアミノ酸残基は、Ｃ３またはＣ３ｂに対する化合物のアフィニティ増加に貢献し得、および／または化合物の活性を改善する。一部の実施形態では、アミノ酸残基のアフィニティまたは活性に対する貢献は、ブロッキング活性に対する貢献と少なくとも同じぐらい重要であり得る。例えば一部の実施形態では、Ｂ１ａ－Ｘａａ０および／またはＸａａＮ－Ｂ２ａにおけるＸａａ０および／またはＸａａＮは主に、化合物のアフィニティまた発生の増加に機能してもよく、一方で、Ｂ１ａおよび／またはＢ２ａは、ペプチド消化を阻害し得、および／またはペプチド電荷を中和し得る。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、配列番号５～３６のいずれかのアミノ酸配列を含み、この場合において配列番号５～３６は、Ｎ末端および／またはＣ末端でさらに延長される。一部の実施形態では、配列は、Ｂ１ａ－Ｘａａ０－配列－ＸａａＮ－Ｂ２ａと表されてもよく、この場合において配列とは、配列番号５～３６のいずれかを表し、式中、Ｂ１ａおよびＢ２ａは独立して、存在または非存在であり得る。例えば一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、Ｂ１ａ－Ｘａａ０－Ｘ’ａａ１－Ｘ’ａａ２－Ｘ’ａａ３－Ｘ’ａａ４－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘ”ａａ１－Ｘ”ａａ２－Ｘ”ａａ３－Ｘ”ａａ４－Ｘ”ａａ５－ＸａａＮ－Ｂ２ａ（配列番号６９）を含み、式中、Ｘ’ａａ１－Ｘ’ａａ２－Ｘ’ａａ３－Ｘ’ａａ４、Ｘａａ、Ｘ”ａａ１、Ｘ”ａａ２、Ｘ”ａａ３、Ｘ”ａａ４、およびＸ”ａａ５は、配列番号５に関し上述されるとおりである。
一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、Ｂ１ａ－Ｘａａ０－Ｘａａ１－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｘａａ２－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｘａａ２＊－Ｇｌｙ－Ｘａａ３－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｘａａ４－ＸａａＮ－Ｂ２ａ（配列番号７０）を含み、式中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ２＊、Ｘａａ３、およびＸａａ４は、配列番号６に関し上述されるとおりであり、または式中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ２＊、Ｘａａ３、およびＸａａ４は、配列番号６または配列番号７に関し記述されるとおりである。
一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、Ｂ１ａ－Ｘａａ０－Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｘａａ４－Ｘａａ５－Ｘａａ６－Ｘａａ７－Ｘａａ８－Ｘａａ９－Ｘａａ１０－Ｘａａ１１－Ｘａａ１２－Ｘａａ１３－ＸａａＮ－Ｂ２ａ（配列番号７１）を含み、式中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ１０、Ｘａａ１１、Ｘａａ１２、およびＸａａ１３は、配列番号９～３６のいずれかの１位～１３位のアミノ酸と同一である。
一部の実施形態では、任意のコンプスタチン類似体中のＸａａ０および／またはＸａａＮは、一つ以上の位置にアルキル置換基を有する芳香族環を含むアミノ酸を含む。一部の実施形態では、アルキル置換基は、低級アルキル置換基である。例えば、一部の実施形態では、アルキル置換基は、メチル基またはエチル基である。一部の実施形態では、置換基は、化合物の芳香族特性を破壊しない任意の位置に配置される。一部の実施形態では、置換基は、当該置換基が付加される環の芳香族特性を破壊しない任意の位置に配置される。一部の実施形態では、置換基は、１位、２位、３位、４位、または５位に位置する。一部の実施形態では、Ｘａａ０は、チロシンのＯ－メチル類似体、２－ヒドロキシフェニルアラニン、または３－ヒドロキシフェニルアラニンを含む。本開示の目的に関し、小文字の「ｍ」に続く３文字のアミノ酸の略語を使用して、アミノ酸がＮ－メチルアミノ酸であることを具体的に示す場合がある。例えば、略語の「ｍＧｌｙ」が本明細書に表示される場合、この略語はＮ－メチルグリシン（時にはサルコシンまたはＳａｒとも呼ばれる）を示す。一部の実施形態では、Ｘａａ０は、ｍＧｌｙ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ（Ｍｅ）、Ｃｈａ、ｍＰｈｅ、ｍＶａｌ、ｍＩｌｅ、ｍＡｌａ、ＤＴｙｒ、ＤＰｈｅ、ＤＡｒｇ、ＤＴｒｐ、ＤＴｈｒ、ＤＴｙｒ（Ｍｅ）、ｍＰｈｅ、ｍＶａｌ、ｍＩｌｅ、ＤＡｌａ、またはＤＣｈａであるか、またはこれを含む。例えば、一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、配列Ｂ１－Ｉｌｅ－［Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｔｒｐ（Ｍｅ）－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－ｍＧｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ］－ｍＩｌｅ－Ｂ２（配列番号７２）を有するペプチドを含む。二つのＣｙｓ残基は、活性化合物においてジスルフィド結合によって結合される。一部の実施形態では、ペプチドは、Ｎ末端でアセチル化され、および／またはＣ末端でアミド化される。一部の実施形態では、上述されるように、Ｂ１は、Ｂ１ａ－Ｘａａ０を含み、および／またはＢ２は、ＸａａＮ－Ｂ２ａを含む。例えば、一部の実施形態では、Ｂ１は、Ｇｌｙ、ｍＧｌｙ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ（Ｍｅ）、ｍＰｈｅ、ｍＶａｌ、ｍＩｌｅ、ｍＡｌａ、ＤＴｙｒ、ＤＰｈｅ、ＤＴｒｐ、ＤＣｈａ、ＤＡｌａを含むか、またはからなり、Ｂ２は、ＮＨ２を含み、例えばｍＩｌｅのカルボキシ末端－ＯＨは、ＮＨ２で置換される。一部の実施形態では、Ｂ１は、ｍＧｌｙ、Ｔｙｒ、ＤＴｙｒ、またはＴｙｒ（Ｍｅ）を含むか、またはからなり、Ｂ２は、ＮＨ２を含み、例えば、ｍＩｌｅのカルボキシ末端－ＯＨは、ＮＨ２で置換される。一部の実施形態では、Ｘａａ１位置のＩｌｅは、Ｇｌｙで置換される。選択されたコンプスタチン類似体の補体阻害効力および／またはＣ３ｂ結合パラメータは、ＷＯ／２０１０／１２７３３６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３３３４５）および／またはＱｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１２），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｂｉｏ．２０１２．０６．００３に記載される。
一部の実施形態では、ブロッキング部分またはその一部、例えばアミノ酸残基は、Ｃ３またはＣ３ｂに対する化合物のアフィニティ増加に貢献し得、および／または化合物の活性を改善する。一部の実施形態では、アミノ酸またはアミノ酸類似体のアフィニティまたは活性に対する貢献は、ブロッキング活性よりも重要である場合がある。
本発明の組成物および方法の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、表１に記載される配列を有するが、式中、Ａｃ－基は、本明細書に記載されるように、代替的ブロッキング部分Ｂ１により置換される。一部の実施形態では、－ＮＨ２基は、本明細書に記載されるように、代替的ブロッキング部分Ｂ２により置換される。
一つの実施形態では、コンプスタチン類似体は、コンプスタチンと同じように、ヒトＣ３のβ鎖の実質的に同じ領域を結合する。一つの実施形態では、コンプスタチン類似体は、コンプスタチンが結合する約４０ｋＤａの分子量を有するヒトＣ３のβ鎖のＣ末端部分の断片に結合する化合物である（Ｓｏｕｌｉｋａ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３５：１６０，１９９８；Ｓｏｕｌｉｋａ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３（１２）：２０２３－９，２００６を参照のこと）。特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、例えば結晶構造またはＮＭＲ誘導３Ｄ構造などのコンプスタチン－Ｃ３構造において決定される、コンプスタチンの結合部位に結合する化合物である。特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、コンプスタチン－Ｃ３構造においてコンプスタチンと置き換えられ得る化合物であり、コンプスタチンと実質的に同じ分子間接触をＣ３と形成する。特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、例えば結晶構造などのペプチド－Ｃ３構造において、表１に記載される配列、例えば配列番号１４、２１、２８、２９、３２、３３、３４、３６、３７、６９、７０、７１もしくは７２の配列、または本明細書に開示される別のコンプスタチン類似体配列を有するペプチドの結合部位に結合する化合物である。特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、例えば結晶構造などのペプチド－Ｃ３構造において、配列番号３０または３１を有するペプチドの結合部位に結合する化合物である。特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、ペプチド－Ｃ３構造において、配列番号９～３６のペプチドと置換し得る化合物、例えば、配列番号１４、２１、２８、２９、３２、３３、３４、３６、３７、６９、７０、７１、または７２のペプチドと置換し得る化合物、または本明細書に開示される別のコンプスタチン類似体配列であり、実質的に当該ペプチドと同じ分子間接触をＣ３と形成する。特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、ペプチド－Ｃ３構造において、配列番号３０または３１のペプチドと置き換えられ得る化合物であり、当該ペプチドと実質的に同じ分子間接触をＣ３と形成する。
当業者であれば、日常的な実験方法を使用して、コンプスタチン類似体が、Ｃ３のβ鎖のＣ末端部分の断片に結合するか否かを容易に決定することができる。例えば、当業者であれば、例えば配列のＣ末端など、化合物中にｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン（Ｂｐａ）などの光架橋性アミノ酸を化合物中に含有させることによって、コンプスタチン類似体の光架橋型を合成することができる（Ｓｏｕｌｉｋａ，Ａ．Ｍ．ら、上記）。任意で例えばＦＬＡＧタグまたはＨＡタグなどのエピトープタグといった追加のアミノ酸が含有されて、例えばウェスタンブロッティングによる化合物の検出が促進され得る。コンプスタチン類似体は、断片とともにインキュベートされ、架橋が開始される。コンプスタチン類似体とＣ３断片の共局在は、結合を示唆する。表面プラズモン共鳴を使用して、コンプスタチン類似体が、Ｃ３またはその断片上のコンプスタチン結合部位に結合するか否かを決定してもよい。当業者であれば、分子モデリングソフトウェアプログラムを使用して、化合物が、コンプスタチン、または表１のペプチドのいずれかの配列、例えば、配列番号１４、２１、２８、２９、３２、３３、３４、もしくは３６、または一部の実施形態では、配列番号３０、３１、３７、６９、７０、７１、７２、または本明細書に開示される別のコンプスタチン類似体配列を有するペプチドと実質的に同じ分子間接触をＣ３と形成するかを予測することができるであろう。
コンプスタチン類似体は、例えば従来的なペプチド合成法に従い、アミノ酸残基の縮合を介して、当分野に公知のペプチド合成に関する様々な合成方法により作製されてもよく、当分野に公知の方法を使用してそれらをコードする適切な核酸配列から、インビトロで、または生細胞において発現させることにより作製されてもよい。例えばペプチドは、Ｍａｌｉｋ、上記、Ｋａｔｒａｇａｄｄａ、上記、ＷＯ２００４０２６３２８、および／またはＷＯ２００７０６２２４９に記載されるように標準的な固相方法論を使用して合成されてもよい。例えばアミノ基やカルボキシル基などの潜在的な反応性部分、反応性官能基などが保護されてもよく、その後に当技術分野で公知の様々な保護基および方法論を使用して脱保護されてもよい。例えば、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，３ｒｄ ｅｄ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９９を参照のこと。ペプチドは、逆相ＨＰＬＣなどの標準的な方法を使用して精製されてもよい。所望の場合には、逆相ＨＰＬＣなどの公知の方法を使用してジアステレオマーペプチドの分離が実施されてもよい。所望の場合には、調製物は凍結乾燥されてもよく、その後、例えば水などの適切な溶媒中に溶解される。得られた溶液のｐＨは、例えばＮａＯＨなどの塩基を使用して生理学的なｐＨに調整されてもよい。ペプチド調製物は、所望の場合には例えば質量分析により特徴解析され、質量および／またはジスルフィド結合の形成が確認されてもよい。例えば、Ｍａｌｌｉｋ，２００５，ａｎｄ Ｋａｔｒａｇａｄｄａ，２００６を参照のこと。
特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、細胞反応性のコンプスタチン類似体であってもよく、またはこれを含んでもよい。細胞反応性コンプスタチン類似体は、コンプスタチン類似体部分と、例えば生理学的条件下で細胞表面に露出される官能基と反応して、共有結合を形成することができる細胞反応性官能基とを含む化合物である。したがって、細胞反応性コンプスタチン類似体は、細胞に共有結合される。任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、細胞に繋留されたコンプスタチン類似体は、例えば、細胞表面および／または細胞近傍でのＣ３への結合（Ｃ３（Ｈ２Ｏ）の形態であり得る）と、Ｃ３切断の阻害によって、および／またはＣ３ｂへの結合と、細胞上へのその沈着を阻害することによって、または補体活性化カスケードへの関与を阻害することによって、補体介在性損傷から細胞を保護する。本発明の一部の態様では、単離された細胞は、生体外（身体外）で、細胞反応性コンプスタチン類似体と接触される。本発明の一部の態様では、細胞は、単離された組織または器官内、例えば、対象に移植される組織または器官内に存在する。本発明の一部の態様では、細胞反応性コンプスタチン類似体を対象に投与することによって、細胞はインビボで当該細胞反応性コンプスタチン類似体と接触する。細胞反応性コンプスタチン類似体は、細胞にインビボで共有結合される。一部の態様では、本発明方法は、少なくとも２週間、当該期間中に再治療の必要なく、補体活性化の有害な作用から細胞、組織、および／または器官を保護する。
一部の実施形態では、本発明は、細胞もしくは組織の表面に存在する標的分子に共有結合する、または細胞もしくは組織に結合されていない細胞外物質に非共有結合する標的化部分を含む、コンプスタチン類似体を提供し、および／または利用する。そうしたコンプスタチン類似体は、本明細書において「標的化型コンプスタチン類似体」と呼称される。標的分子は多くの場合、細胞膜に結合され、細胞表面に露出されるタンパク質または炭水化物である。標的化部分は、補体活性化に感受性の細胞、組織、または位置に対し、コンプスタチン類似体を標的化する。本発明の一部の態様では、単離された細胞は、生体外（身体外）で、標的化型コンプスタチン類似体と接触される。本発明の一部の態様では、細胞は、単離された組織または器官内、例えば、対象に移植される組織または器官内に存在する。本発明の一部の態様では、標的化型コンプスタチン類似体は対象に投与され、インビボで細胞、組織または細胞外物質に非共有結合される。一部の態様では、本発明方法は、少なくとも２週間、当該期間中に再治療の必要なく、補体活性化の有害な作用から細胞、組織、および／または器官を保護する。一部の実施形態では、標的化型コンプスタチン類似体は、標的化部分と細胞反応性部分の両方を含む。標的化部分は、そのような細胞上の分子に非共有結合することによって、例えば特定の細胞型にコンプスタチン類似体を標的化する。次いで、細胞反応性部分は、細胞または細胞外物質に共有結合する。他の実施形態では、標的化型コンプスタチン類似体は、細胞反応性部分を含まない。
一部の態様では、コンプスタチン類似体は、長時間作用型コンプスタチン類似体であってもよく、または長時間作用型コンプスタチン類似体を含んでもよく、この場合において長時間作用型コンプスタチン類似体は、（例えば、血液からのクリアランスを低下させることによって）体内での化合物の寿命を延長させるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの部分を含む。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体は、標的化部分または細胞反応性部分を含まない。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体は、標的化部分および／または細胞反応性部分を含む。
細胞反応性部分または標的化部分に任意で連結されるコンプスタチン類似体は、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはそれに似た分子などの分子を加えることにより改変され、化合物を安定化し、その免疫原性を低下させ、体内でその寿命を延ばし、その溶解性を上昇もしくは低下させ、および／または分解に対するその耐性を増大させることができる。ＰＥＧ化の方法は当該技術分野で公知である（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．＆ Ｈａｒｒｉｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４，４５３－４５６，２００２；Ｄａｖｉｓ，Ｆ．Ｆ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４，４５７－４５８，２００２）；Ｈｉｎｄｓ，Ｋ．Ｄ．＆ Ｋｉｍ，Ｓ．Ｗ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４，５０５－５３０（２００２；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．＆ Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４，４５９－４７６；２００２）；Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４，５４７－５７０，２００２を参照のこと）。例えばＰＥＧ、およびポリペプチドが簡単に付加され得る誘導体化ＰＥＧをはじめとする改変ＰＥＧなどの様々なポリマーが、Ｎｅｋｔａｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ ２００５－２００６ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃａｔａｌｏｇ、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社、カリフォルニア州サンカルロスに記載されている。当該文献は、適切なコンジュゲーション手順の詳細も提示している。別の実施形態では、コンプスタチン類似体は、免疫グロブリンまたはその一部分のＦｃドメインに融合される。一部の他の実施形態では、コンプスタチン類似体は、アルブミン部分、またはアルブミン結合ペプチドにコンジュゲートされる。したがって一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、一つ以上のポリペプチドまたは非ポリペプチド構成要素を用いて改変される。例えば、コンプスタチン類似体は、ペグ化される、または別の部分にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、構成要素は、免疫グロブリンまたはその一部分のＦｃドメインではない。コンプスタチン類似体は、多量体として提供されてもよく、または超分子複合体の一部として提供されてもよく、それらは単一の分子種または複数の異なる種（例えば、複数の異なる類似体）のいずれかを含んでもよい。
一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、ポリマー骨格またはスキャホールドに共有結合された、または非共有結合された複数のコンプスタチン類似体部分を含む多価化合物である。コンプスタチン類似体部分は、同一であっても異なっていてもよい。本発明の特定の実施形態では、多価化合物は、単一のコンプスタチン類似体部分の複数の例、またはコピーを含む。本発明の他の実施形態では、多価化合物は、例えば、３個、４個、５個、またはそれ以上の異なるコンプスタチン類似体部分など、多くの非同一コンプスタチン類似体部分のうちの二つの各々の一つ以上の例を含む。本発明の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体部分の数（ｎ）は、２～６である。本発明の他の実施形態では、ｎは、７～２０である。本発明の他の実施形態では、ｎは、２０～１００である。他の実施形態では、ｎは、１００～１，０００である。本発明の他の実施形態では、ｎは、１，０００～１０，０００である。他の実施形態では、ｎは、１０，０００～５０，０００である。他の実施形態では、ｎは、５０，０００～１００，０００である。他の実施形態では、ｎは、１００，０００～１，０００，０００である。
コンプスタチン類似体部分は、ポリマースキャホールドに直接付加され得、またはコンプスタチン類似体部分をポリマースキャホールドに連結させる連結部分を介して付加され得る。連結部分は、単一のコンプスタチン類似体部分、およびポリマースキャホールドに連結され得る。あるいは連結部分は、複数のコンプスタチン類似体部分がその上に結合され、それによって、連結部分は、複数のコンプスタチン類似体部分をポリマースキャホールドに付加させる。
一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、例えばＬｙｓ残基などの一級アミンまたは二級アミンを含む側鎖を有するアミノ酸を含む。例えば、Ｌｙｓ残基、またはＬｙｓ残基を含む配列が、コンプスタチン類似体のＮ末端および／またはＣ末端に付加される。一部の実施形態では、Ｌｙｓ残基は、硬直性スペーサーまたは可塑性スペーサーによりコンプスタチン類似体の環状部分から分離される。スペーサーは、例えば、置換もしくは非置換、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖、オリゴ（エチレングリコール）鎖、および／または例えばリンカーに関して本明細書に記載されるような他の部分を含み得る。鎖の長さは、例えば、２～２０個の炭素原子であってもよい。他の実施形態では、スペーサーは、ペプチドである。ペプチドスペーサーは、例えば、１～２０アミノ酸の長さ、例えば、４～２０アミノ酸の長さであってもよい。好適なスペーサーは、例えば、複数のＧｌｙ残基、Ｓｅｒ残基、またはその両方を含むか、またはそれからなり得る。任意選択で、一級アミンまたは二級アミンを含む側鎖を有するアミノ酸、および／またはスペーサー中の少なくとも一つのアミノ酸は、Ｄ－アミノ酸である。様々なポリマー骨格またはスキャホールドのいずれを使用してもよい。例えば、ポリマー骨格またはスキャホールドは、ポリアミド、多糖類、ポリ無水物、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリペプチド、ポリエチレン酸化物、またはデンドリマーであり得る。好適な方法およびポリマー骨格は、例えばＷＯ９８／４６２７０（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７１７１）またはＷＯ９８／４７００２（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０６９６３）に記載される。一つの実施形態では、ポリマー骨格またはスキャホールドは、例えばカルボン酸、無水物、またはスクシンイミド基などの複数の反応性官能基を含む。ポリマー骨格またはスキャホールドは、コンプスタチン類似体と反応する。一つの実施形態では、コンプスタチン類似体は、例えばカルボン酸、無水物、またはスクシンイミド基などの多数の異なる反応性官能基のいずれかを含み、それらはポリマー骨格上の適切な基と反応する。あるいはポリマー骨格またはスキャホールドを形成するために互いに結合され得る単量体単位は、最初にコンプスタチン類似体と反応し、そして生じた単量体が重合される。別の実施形態では、短い鎖は前もって重合され、官能化され、次いで異なる組成の短い鎖の混合物が、長いポリマーへと組み立てられる。
（ｉｉ）コンプスタチン模倣体
コンプスタチンの構造は当該技術分野で公知であり、コンプスタチンよりも高い活性を有する多数のコンプスタチン類似体に関するＮＭＲ構造も公知である（Ｍａｌｉｋ、上記）。構造情報を使用して、コンプスタチン模倣体を設計してもよい。
一つの実施形態では、コンプスタチン模倣体は、Ｃ３またはその断片（コンプスタチンが結合するβ鎖の４０ｋＤ断片など）への結合に関し、コンプスタチンまたは任意のコンプスタチン類似体（例えば、その配列が表１に記載されるコンプスタチン類似体）と競合する任意の化合物である。一部の実施形態では、コンプスタチン模倣体は、コンプスタチン以上の活性を有する。一部の実施形態では、コンプスタチン模倣体は、コンプスタチンよりも安定であり、経口的に利用可能であり、またはコンプスタチンよりも良好な生体利用効率を有する。コンプスタチン模倣体は、ペプチド、核酸、または低分子であってもよい。特定の実施形態では、コンプスタチン模倣体は、例えば結晶構造またはＮＭＲ実験から導出される３Ｄ構造などのコンプスタチン－Ｃ３構造において決定される、コンプスタチン結合部位に結合する化合物である。特定の実施形態では、コンプスタチン模倣体は、コンプスタチン－Ｃ３構造においてコンプスタチンと置き換えられ得る化合物であり、コンプスタチンと実質的に同じ分子間接触をＣ３と形成する。特定の実施形態では、コンプスタチン模倣体は、ペプチド－Ｃ３構造において、表１に記載される配列、例えば配列番号１４、２１、２８、２９、３２、３３、３４、もしくは３６、または特定の実施形態では配列番号３０もしくは３１、または他のコンプスタチン類似体配列を有するペプチドの結合部位に結合する化合物である。特定の実施形態では、コンプスタチン模倣体は、ペプチド－Ｃ３構造において、表１に記載される配列、例えば配列番号１４、２１、２８、２９、３２、３３、３４、もしくは３６、または特定の実施形態では配列番号３０もしくは３１、または他のコンプスタチン類似体配列を有するペプチドと置き換えられ得る化合物であり、当該ペプチドと実質的に同じ分子間接触をＣ３と形成する。特定の実施形態では、コンプスタチン模倣体は、非ペプチド骨格を有するが、コンプスタチンの配列に基づき設計された配列中に側鎖を配置する。
当業者であれば、短いペプチドの特定の望ましい立体構造が確認されると、当該立体構造に適合するようにペプチドまたはペプチド模倣体を設計する方法が公知であることを認識するであろう。例えば、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９３），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４９：３５４７－３５５８；Ｈｒｕｂｙ ａｎｄ Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖｉｃｈ（１９９１），ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｐ．Ｂａｌａｒａｍ ＆ Ｓ．Ｒａｍａｓｅｈａｎ，ｅｄｓ．，Ｉｎｄｉａｎ Ａｃａｄ．ｏｆ Ｓｃｉ．，Ｂａｎｇａｌｏｒｅ，ＰＰ．４２９－４５５），Ｅｇｕｃｈｉ Ｍ，Ｋａｈｎ Ｍ．，Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．，２（５）：４４７－６２，２００２を参照のこと。本発明に特に関連するものとして、ペプチド類似体の設計は、例えば特に官能基の効果に関し、またはコンプスタチンおよびその類似体について当技術分野で報告される立体的検討に関し、アミノ酸残基の様々な側鎖の寄与を検討することによってさらに精密化され得る。
当業者であれば、ペプチド模倣体は、Ｃ３への結合および補体活性化の阻害に必要とされる特定の骨格立体構造および側鎖官能基を提供する目的に対し、ペプチドと同様に機能し得ることを認識するであろう。したがって、結合されて適切な骨格構造を形成することができる天然アミノ酸、アミノ酸誘導体、類似体または非アミノ酸分子のいずれかの使用を通じて、Ｃ３－結合性の補体阻害性化合物を作製および利用することは、本発明の範囲内として予期される。非ペプチド類似体、またはペプチドと非ペプチド成分を含む類似体は、補体活性化を阻害するために例示されるペプチドと充分に類似するように、ほぼ同じ骨格立体構造の特徴および／または他の機能性を有するペプチドの置換または誘導を指定するために、本明細書において時に「ペプチド模倣体」または「立体模倣体」と呼称される。より一般的には、コンプスタチン模倣体は、骨格が異なっても、コンプスタチンにおけるそれら位置と同様に、薬理作用因子を配置するであろう任意の化合物である。
高アフィニティのペプチド類似体の開発に関し、ペプチド模倣体使用することは、当技術分野で公知である。ペプチド内のアミノ酸残基と回転束縛が類似していると仮定すると、他の公知技術の中でも特に、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロット（Ｈｒｕｂｙ ＆ Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖｉｃｈ １９９１）の手段をとることにより非アミノ酸部分を含む類似体を分析し、それらの立体構造モチーフを検証してもよい。
当業者であれば、追加のコンプスタチン模倣体を特定し、所望の阻害活性を有するものを選択するための適切なスクリーニングアッセイを容易に確立することができるであろう。例えば、コンプスタチンまたはその類似体は、（例えば、放射性標識または蛍光標識で）標識され、異なる濃度の被験化合物の存在下でＣ３と接触され得る。コンプスタチン類似体のＣ３への結合を減弱させる被験化合物の能力が評価される。Ｃ３に対するコンプスタチン類似体の結合を著しく減弱させる被験化合物が、コンプスタチン模倣体候補である。例えば、コンプスタチン類似体－Ｃ３複合体の定常状態濃度を減少させる、またはコンプスタチン類似体－Ｃ３複合体の形成率を少なくとも２５％、または少なくとも５０％減少させる被験化合物が、コンプスタチン模倣体候補である。当業者であれば、当該スクリーニングアッセイに関する多数の変化形が採用され得ることを認識するであろう。スクリーニングされる化合物には、天然産物、アプタマーのライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、コンビナトリアル化学法を使用して合成された化合物ライブラリーなどが含まれる。本発明は、上述のコア配列に基づいて化合物のコンビナトリアルライブラリーを合成し、当該ライブラリーをスクリーニングして、コンプスタチン模倣体を特定することを包含する。これらの方法のいずれかを使用して、これまでに試験されたコンプスタチン類似体よりも高い阻害活性を有する新たなコンプスタチン類似体を特定し得る。コンプスタチン模倣体は、本発明の細胞反応性化合物に使用され得ること、および本発明は、こうした細胞反応性コンプスタチン模倣体を提供することも認識される。
（ｉｉｉ）細胞反応性または長時間作用型のコンプスタチン類似体
上述のように、特定の実施形態では、本発明は、様々な細胞反応性コンプスタチン類似体を提供および／または利用する。一部の態様では、細胞反応性コンプスタチン類似体は、式Ａ－Ｌ－Ｍの化合物を含み、式中、Ａは、細胞反応性官能基Ｊを含む部分であり、Ｌは、任意で存在する連結部分であり、Ｍは、コンプスタチン類似体部分を含む。コンプスタチン類似体部分は、任意のコンプスタチン類似体、例えば、様々な実施形態で、上述の任意のコンプスタチン類似体などを含み得る。式Ａ－Ｌ－Ｍは、Ａ－Ｌが、コンプスタチン類似体部分のＮ末端に存在する実施形態、Ａ－Ｌが、コンプスタチン類似体部分のＣ末端に存在する実施形態、Ａ－Ｌが、コンプスタチン類似体部分のアミノ酸の側鎖に付加される実施形態、および同一または異なるＡ－ＬがＭの両端に存在する実施形態を包含する。特定のコンプスタチン類似体が、式Ａ－Ｌ－Ｍの化合物のコンプスタチン類似体部分として存在するとき、当該コンプスタチン類似体の官能基は、Ｌの官能基と反応して、ＡまたはＬへの共有結合を形成することが認識される。例えば、コンプスタチン類似体部分が、一級アミン（ＮＨ２）基を含有する側鎖を伴うアミノ酸を含有するコンプスタチン類似体（当該コンプスタチン類似体は、式Ｒ１－（ＮＨ２）として表され得る）を含む、細胞反応性コンプスタチン類似体は、式Ｒ１－ＮＨ－Ｌ－Ａを有し得、この場合、Ｌへの新たな共有結合（例えば、Ｎ－Ｃ）が形成され、水素が失われる。したがって「コンプスタチン類似体部分」という用語は、コンプスタチン類似体の少なくとも一つの原子が、第二の部分との共有結合に関与する分子構造を含み、これが例えば側鎖の改変であり得る。同様の検討事項が、上述の多価化合物中に存在するコンプスタチン類似体部分に適用される。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体、例えば、本明細書に記載されるコンプスタチン類似体のＮ末端またはＣ末端のブロッキング部分は、細胞反応性コンプスタチン類似体の構造において、Ａ－Ｌにより置換される。一部の実施形態では、ＡまたはＬは、ブロッキング部分を含む。一部の実施形態では、細胞反応性コンプスタチン類似体は、同じアミノ酸配列（そして妥当な場合には一つ以上のブロッキング部分）を有し、しかし細胞反応性部分を含まない対応するコンプスタチン類似体の活性の少なくとも約１０％、２０％、または３０％のモル活性、例えば、３０％～４０％、３０％～５０％、３０％～６０％、３０％～７０％、３０％～８０％、３０％～９０％、またはそれ以上のモル活性を有する。細胞反応性コンプスタチン類似体が、複数のコンプスタチン類似体部分を含む一部の実施形態では、細胞反応性コンプスタチン類似体のモル活性は、当該コンプスタチン類似体部分の活性の合計の少なくとも約１０％、２０％、または３０％、例えば、３０％～４０％、３０％～５０％、３０％～６０％、３０％～７０％、３０％～８０％、３０％～９０％、またはそれ以上である。
細胞反応性部分Ａは、様々な実施形態において、様々な異なる細胞反応性官能基Ｊのいずれかを含み得る。概して細胞反応性官能基は、例えば（ａ）標的とされる特定の官能基、（ｂ）生理学的に許容可能な生体外条件下（例えば、 生理学的に許容可能なｐＨおよびオスモル濃度）、および／またはインビボ条件下（例えば、血液中）で、標的官能基と反応する、反応性官能基の能力、（ｃ）生理学的に許容可能な生体外条件下、および／またはインビボで、反応性官能基と標的官能基との間の反応の特異性、（ｄ）反応性官能基と、その標的官能基の反応から生じるであろう共有結合の安定性（例えば、インビボ条件下）、（ｅ）反応性官能基を含む細胞反応性コンプスタチン類似体の合成の容易さ、などの因子に少なくとも部分的に基づいて選択されてもよい。一部の実施形態では、脱離基を放出することなく、その標的の化学基と反応する反応性官能基が選択される。一部の実施形態では、標的との反応時に脱離基を放出させる反応性官能基が選択される。そうした基を含有する化合物は、例えば、反応の進行および／または程度のモニタリングに有用であり得る。一部の実施形態では、脱離基は、（例えば、生成される濃度および／または絶対量に基づき）生成される量で、細胞、組織、または器官に対し生理学的に許容可能であり、および／または（例えば、血液などの関連体液における濃度に基づいて、および／または生成される絶対量に基づいて）インビボで生成される量で、対象に対し医学的に許容可能である。一部の実施形態では、生体外で生成される脱離基は、例えば細胞を洗浄することにより、または組織もしくは器官を生理食塩水で洗浄もしくはかん流することにより、少なくとも部分的に除去される。
多くの実施形態では、本発明における使用に関する細胞反応性官能基は、アミノ酸残基の側鎖、および／またはタンパク質のＮ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応する。一部の実施形態では、細胞反応性官能基は、システイン残基の側鎖に存在するスルフヒドリル（－ＳＨ）基と反応性である。一部の実施形態では、マレイミド基が使用される。マレイミド基は、生理学的ｐＨでタンパク質のシステイン残基のスルフヒドリル基と反応し、安定したチオエーテル結合を形成する。一部の実施形態では、例えばヨードアセチル基またはブロモアセチル基などのハロアセチル基が使用される。ハロアセチルは、生理学的ｐＨでスルフヒドリル基と反応する。ヨードアセチル基の反応は、スルフヒドリル基の硫黄原子とヨウ素の求核性置換により進行し、安定したチオエーテル結合を生じさせる。他の実施形態では、ヨードアセトアミド基が使用される。一部の実施形態では、細胞反応性官能基は、タンパク質のＮ末端、およびリシン残基の側鎖に存在するアミノ（－ＮＨ２）基と反応する（ε－アミノ基）。一部の実施形態では、活性化エステル、例えば、スクシンイミジルエステル（すなわち、ＮＨＳエステル）が使用される。例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはその水溶性類似体（スルホ－ＮＨＳ）を、合成に使用することができる。その結果得られた細胞反応性コンプスタチン類似体は、ＮＨＳエステルを含む。一部の実施形態では、細胞反応性官能基は、タンパク質のＣ末端、および様々なアミノ酸残基の側鎖に存在するカルボキシル（－ＣＯＯＨ）基と反応する。一部の実施形態では、細胞反応性コンプスタチン類似体は、ヒドロキシル（－ＯＨ）基と反応性であり、ヒドロキシル基は、様々なアミノ酸の側鎖、およびグリコシル化タンパク質の炭水化物部分中に存在する。
概して連結部分Ｌは、当該連結部分を結合する安定的化合物の形成と適合する任意の一つ以上の脂肪族部分および／または芳香族部分を含み得る。本明細書で使用される場合、「安定」という用語は、好ましくは、製造を可能にするのに充分な安定性を有し、充分な期間、例えば、本明細書に記載される一つ以上の目的に有用であるように化合物の完全性を維持する化合物を指す。一部の実施形態では、Ｌは、１～３０、１～２０、１～１０、１～６、または５以下の炭素原子の長さを有する飽和または不飽和、置換または非置換、分岐または非分岐の脂肪族鎖を含み、この場合の長さは、主要（最長）鎖中のＣ原子の数を指す。一部の実施形態では、脂肪族鎖は、独立して選択され得る一つ以上のヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、Ｓ）を含む。一部の実施形態では、Ｌの主要鎖中の原子の少なくとも５０％は、炭素原子である。一部の実施形態では、Ｌは、飽和アルキル部分（ＣＨ２）ｎを含み、ｎは、１～３０である。
一部の実施形態では、Ｌは、一つ以上のヘテロ原子を含み、鎖中に合計で１～１０００、１～８００、１～６００、１～４００、１～３００、１～２００、１～１００、１～５０、１～３０、または１～１０の炭素原子の長さを有する。一部の実施形態では、Ｌは、オリゴ（エチレングリコール）部分（－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）ｎ）を含み、式中、ｎは、１～５００、１～４００、１～３００、１～２００、１～１００、１０～２００、２００～３００、１００～２００、４０～５００、３０～５００、２０～５００、１０～５００、１～４０、１～３０、１～２０、または１～１０である。
一部の実施形態では、Ｌは、例えば－ＣＨ＝ＣＨ－または－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－などの不飽和部分、非芳香族環状環系（例えば、シクロヘキシル部分）を含む部分、芳香族部分（例えば、フェニル部分などの芳香族環状環系）、エーテル部分（－Ｃ－Ｏ－Ｃ－）、アミド部分（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ－）、エステル部分（－ＣＯ－Ｏ－）、カルボニル部分（－Ｃ（＝Ｏ）－）、イミン部分（－Ｃ＝Ｎ－）、チオエーテル部分（－Ｃ－Ｓ－Ｃ－）、アミノ酸残基、および／または二つの適合する反応性官能基の反応によって形成され得る任意の部分、を含む。特定の実施形態では、連結部分のうちの一つ以上の部分、または細胞反応性部分は、その上の水素原子（または他の原子）のうちの一つ以上と、限定されないが、脂肪族、芳香族、アリール、アルキル、アラルキル、アルカノイル、アロイル、アルコキシ、チオ、Ｆ、Ｃ１、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＨ２ＣＦ３、－ＣＨＣ１２、－ＣＨ２ＯＨ、－ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、－ＣＨ２ＮＨ２、－ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、－、または－ＧＲＧ１を含む、一つ以上の部分との独立した置換により置換され、この場合において、Ｇは、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲＧ２－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－ＳＯ２－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＧ２－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲＧ２Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲＧ２－、－ＮＲＧ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲＧ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＧ２－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）－、－ＳＣ（＝Ｓ）Ｓ－、－Ｃ（＝ＮＲＧ２）－、－Ｃ（＝ＮＲＧ２）Ｏ－、－Ｃ（＝ＮＲＧ２）ＮＲＧ３－、－ＯＣ（＝ＮＲＧ２）－、－ＮＲＧ２Ｃ（＝ＮＲＧ３）－、－ＮＲＧ２ＳＯ２－、－ＮＲＧ２ＳＯ２ＮＲＧ３－、または－ＳＯ２ＮＲＧ２－であり、この場合において、ＲＧ１、ＲＧ２およびＲＧ３の各存在は独立して、限定されないが、水素、ハロゲン、または任意で置換される脂肪族部分、芳香族部分もしくはアリール部分を含む。環式環系は、置換基として存在する場合、任意選択的に直線部分を介して付加され得ることが認識される。本発明によって想定される置換基および変数の組み合わせは、好ましくは、本明細書に記載される方法の任意の一つ以上において有用な安定的化合物の形成をもたらす組み合わせであり、例えば、本明細書に記載の一つ以上の障害の治療に有用であり、および／または細胞、組織、もしくは器官の接触に有用であり、および／または一つ以上のそのような化合物の製造における中間体として有用である。
Ｌは、様々な実施形態で、前項に記載される部分のいずれか一つ以上を含み得る。一部の実施形態では、Ｌは、互いに連結された二つ以上の異なる部分を含み、典型的には、１～約６０原子、１～約５０原子、例えば、１～４０、１～３０、１～２０、１～１０、または１～６原子の長さを有する構造を形成し、この場合において長さは、主要（最長）鎖の原子の数を指す。一部の実施形態では、Ｌは、互いに連結された二つ以上の異なる部分を含み、典型的には、主要（最長）鎖中に１～約４０原子、例えば、１～３０、例えば、１～２０、１～１０、または１～６炭素を有する構造を形成する。概して、そのような細胞反応性コンプスタチン類似体の構造は、式Ａ－（ＬＰｊ）ｊ－Ｍにより表すことができ、式中、ｊは典型的には１～１０であり、各ＬＰｊは独立して、前段に記載される部分の中から選択される。多くの実施形態では、Ｌは、例えば、－（ＣＨ２）ｎ－および／または－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）ｎなどの一つ以上の炭素含有作を含み、それらは互いに、および／または細胞反応性官能基もしくはコンプスタチン類似体に、二つの適合反応性官能基の反応から生じた部分（例えば、アミド部分、エステル部分またはエーテル部分）によって、共有結合される。一部の実施形態では、Ｌは、オリゴ（エチレングリコール）部分および／または飽和アルキル鎖を含む。一部の実施形態では、Ｌは、－（ＣＨ２）ｍ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｐＣ（＝Ｏ）－または－（ＣＨ２）ｍ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）－を含む。一部の実施形態では、ｍ、ｎ、およびｐは、鎖中の炭素数が、１～５００、例えば２～４００、２～３００、２～２００、２～１００、２～５０、４～４０、６～３０、または８～２０となるように選択される。一部の実施形態では、ｍは、２～１０であり、ｎは１～５００であり、および／またはｐは、２～１０である。一部の実施形態では、ｍは、２～１０であり、ｎは１～４００であり、および／またはｐは、２～１０である。一部の実施形態では、ｍは、２～１０であり、ｎは１～３００であり、および／またはｐは、２～１０である。一部の実施形態では、ｍは、２～１０であり、ｎは１～２００であり、および／またはｐは、２～１０である。一部の実施形態では、ｍは、２～１０であり、ｎは１～１００であり、および／またはｐは、２～１０である。一部の実施形態では、ｍは、２～１０であり、ｎは１～５０であり、および／またはｐは、２～１０である。一部の実施形態では、ｍは、２～１０であり、ｎは１～２５であり、および／またはｐは、２～１０である。一部の実施形態では、ｍは、２～１０であり、ｎは１～８であり、および／またはｐは、２～１０である。任意で、少なくとも一つの－ＣＨ２－は、ＣＨ－Ｒで置換され、式中、Ｒは、任意の置換基であり得る。任意で、少なくとも一つの－ＣＨ２－は、ヘテロ原子、環状環系、アミド部分、エステル部分、またはエーテル部分によって置換される。一部の実施形態では、Ｌは、最長鎖中に３個を超える炭素原子を有するアルキル基を含まない。一部の実施形態では、Ｌは、最長鎖中に４、５、６、７、８、９、１０または１１個を超える炭素原子を有するアルキル基を含まない。
本発明の一部の実施形態では、Ａは、細胞反応性官能基Ｊと、連結部分ＬＰ１を含むリンカーＬ１と、コンプスタチン類似体と反応してＡ－Ｍを生成する反応性官能基とを含む。一部の実施形態では、二つの反応性官能基と、連結部分ＬＰ２とを含む二官能性リンカーＬ２が使用される。Ｌの反応性官能基は、ＡおよびＭの適切な反応性官能基と反応して、細胞反応性コンプスタチン類似体Ａ－Ｌ－Ｍを生成する。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、連結部分ＬＰ３を含むリンカーＬＰ３を含む。例えば、以下で検討されるように、反応性官能基を含むリンカーは、Ｎ末端またはＣ末端に存在してもよく、または反応性官能基を含む部分は、リンカーを介してＮ末端またはＣ末端に結合されてもよい。したがって、Ｌは、例えば、Ａによって、ＡとＭを結合するために使用されるリンカーによって、および／またはコンプスタチン類似体によって、提供される複数の連結部分ＬＰを含んでもよい。構造Ａ－Ｌ－Ｍ中に存在するとき、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３などの反応の前に存在する特定の反応性官能基は、反応を経て、当該反応性官能基の一部分のみが最終構造Ａ－Ｌ－Ｍ中に存在し、当該化合物は、当該官能基の反応によって形成される部分を含むことが理解される。概して化合物が二つ以上の連結部分を含有する場合、当該連結部分は同一であっても異なってもよく、様々な実施形態において独立して選択され得る。複数の連結部分ＬＰは、互いに結合してより大きな連結部分Ｌを形成することができ、そのような連結部分の少なくとも一部は、一つ以上のコンプスタチン類似体および／または細胞反応性官能基を、それらに結合させ得る。複数のコンプスタチン類似体を含む分子において、コンプスタチン類似体は、同一であっても異なっていてもよく、異なっている場合、独立して選択され得る。同じことが、連結部分および反応性官能基にも適用される。本発明は、一つ以上の細胞反応性官能基を含む多価コンプスタチン類似体の使用、および一つ以上の細胞反応性官能基を含むコンプスタチン類似体のコンカタマーの使用を包含する。一部の実施形態では、少なくとも一つの結合は、例えばビオチン／（ストレプト）アビジン結合、またはほぼ同等の強度の他の非共有結合結合などの安定した非共有結合である。
一部の実施形態では、細胞反応性コンプスタチン類似体は、配列番号３～３６、６９、７０、７１、または７２が、Ｎ末端、Ｃ末端またはその両方で一つ以上のアミノ酸によって伸長されるコンプスタチン類似体を含み、この場合においてアミノ酸の少なくとも一つは、例えば一級アミンもしくは二級アミン、スルフヒドリル基、カルボキシル基（カルボン酸基として存在してもよい）、グアニジノ基、フェノール基、インドール環、チオエーテル、またはイミダゾール環などの反応性官能基を含む側鎖を有する。一部の実施形態では、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。一部の実施形態では、アミノ酸のうちのいずれか一つ以上は、Ｄ－アミノ酸である。複数のアミノ酸が追加される場合、アミノ酸は、独立して選択され得る。一部の実施形態では、反応性官能基（例えば、一級アミンまたは二級アミン）は、細胞反応性官能基を含む部分の付加の標的として使用される。一級アミンまたは二級アミンを含む側鎖を有するアミノ酸としては、それぞれ、リシン（Ｌｙｓ）、および一般構造ＮＨ２（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨのジアミノカルボン酸が挙げられ、例えば、２，３－ジアミノプロピオン酸（ｄａｐａ）、２，４－ジアミノ酪酸（ｄａｂａ）、およびオルニチン（ｏｒｎ）であり、式中、ｎはそれぞれ、１（ｄａｐａ）、２（ｄａｂａ）、および３（ｏｒｎ）である。一部の実施形態では、少なくとも一つのアミノ酸は、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、またはヒスチジンである。システインは、スルフヒドリル基を含む側鎖を有する。アスパラギン酸およびグルタミン酸は、カルボキシル基（カルボン酸基にイオン化可能）を含む側鎖を有する。アルギニンは、グアニジノ基を含む側鎖を有する。チロシンは、フェノール基（フェノラートにイオン化可能）を含む側鎖を有する。トリプトファンは、インドール環を含む側鎖を有し、例えば、トリプトファンを含む。メチオニンは、チオエーテル基を含む側鎖を有し、例えば、メチオニンを含む。ヒスチジンは、イミダゾール環を含む側鎖を有する。天然アミノ酸および自然界では存在しないアミノ酸を含む、一つ以上のそのような反応性官能基を含む側鎖を有する数多の非標準アミノ酸が利用可能である。例えば、Ｈｕｇｈｅｓ，Ｂ．（ｅｄ．），Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２００９－２０１１）；Ｂｌａｓｋｏｖｉｃｈ，Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｒｏｕｔｅｓ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１０を参照のこと。本発明は、一つ以上の非標準アミノ酸を使用して、細胞反応性官能基を含む部分の付加のための標的を提供する実施形態を包含する。アミノ酸のいずれか一つ以上が、化合物の合成中に適宜保護されてもよい。例えば、一つ以上のアミノ酸が、標的アミノ酸側鎖が関与する反応中に保護されてもよい。一部の実施形態では、スルフヒドリル含有アミノ酸が、細胞反応性官能基を含む部分の付加の標的として使用され、例えばシステインなどの他のアミノ酸間の分子内ジスルフィド結合の形成によって化合物が環化されている間、当該スルフヒドリルは保護される。
本段落の検討において、アミン基を含有する側鎖を有するアミノ酸が、例として使用される。本発明は、異なる反応性官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸が使用される類似の実施形態を包含する。一部の実施形態では、一級アミンまたは二級アミンを含む側鎖を有するアミノ酸は、配列番号３－３６、３７、６９、７０、７１、または７２のいずれかのＮ末端またはＣ末端に直接、またはペプチド結合を介して結合される。一部の実施形態では、一級アミンまたは二級アミンを含む側鎖を有するアミノ酸は、配列番号３－３６、３７、６９、７０、７１、または７２のいずれかのＮ末端またはＣ末端に、または上述の連結部分のいずれか一つ以上を含有し得る連結部分を介して結合される。一部の実施形態では、少なくとも二つのアミノ酸が、末端のいずれか、または両端に付加される。二つ以上の付加アミノ酸が、ペプチド結合によって互いに結合されてもよく、または少なくとも付加アミノ酸の一部が、本明細書に記載される連結部分のいずれか一つ以上を含有し得る連結部分によって互いに結合されてもよい。したがって一部の実施形態では、細胞反応性コンプスタチン類似体は、式Ｂ１－Ｒ１－Ｍ１－Ｒ２－Ｂ２のコンプスタチン類似体部分Ｍを含み、式中、Ｍ１は、配列番号３～３６、３７、６９、７０、７１、または７２のいずれかを表し、Ｒ１またはＲ２のいずれかは存在せずともよく、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも一つは、一級アミンまたは二級アミンを含有する側鎖を有するアミノ酸を含み、そしてＢ１およびＢ２は任意で存在するブロッキング部分である。Ｒ１および／またはＲ２は、ペプチド結合または非ペプチド結合によりＭ１に結合されてもよい。Ｒ１および／またはＲ２は、連結部分ＬＰ３を含んでもよい。例えば、Ｒ１は、式Ｍ２－ＬＰ３を有してもよく、および／またはＲ２は、式ＬＰ３－Ｍ２を有してもよく、式中、ＬＰ３は、連結部分であり、Ｍ２は、一級アミンまたは二級アミンを含む側鎖を有する少なくとも一つのアミノ酸を含む。例えば、Ｍ２は、Ｌｙｓであってもよく、またはＬｙｓを含むアミノ酸鎖であってもよい。一部の実施形態では、ＬＰ３は、一つ以上のアミノ酸を含み、またはそれらからなる。例えば、ＬＰ３は、１～約２０アミノ酸の長さ、例えば、４～２０アミノ酸の長さであってもよい。一部の実施形態では、ＬＰ３は、複数のＧｌｙ残基、Ｓｅｒ残基、および／またはＡｌａ残基を含み、またはそれらからなる。一部の実施形態では、ＬＰ３は、例えばＣｙｓなどの反応性ＳＨ基を含むアミノ酸を含まない。一部の実施形態では、ＬＰ３は、オリゴ（エチレングリコール）部分および／または飽和アルキル鎖を含む。一部の実施形態では、ＬＰ３は、アミド結合を介してＭ１のＮ末端アミノ酸に結合される。一部の実施形態では、ＬＰ３は、アミド結合を介してＭ１のＣ末端アミノ酸に結合される。化合物は、さらなる連結部分および／またはアミノ酸を付加することにより、いずれか末端または両端でさらに伸長されてもよい。アミノ酸は、同一であっても異なっていてもよく、異なっている場合には、独立して選択され得る。一部の実施形態では、反応性官能基を含む側鎖を有する二つ以上のアミノ酸が使用され、当該反応性官能基は、同一であっても異なっていてもよい。二つ以上の反応性官能基を、二つ以上の部分の付加の標的として使用することができる。一部の実施形態では、二つ以上の細胞反応性部分が付加される。一部の実施形態では、細胞反応性部分および標的化部分が付加される。一部の実施形態では、リンカーおよび／または細胞反応性部分は、ペプチド鎖内にアミノ酸を組み込んだ後に、アミノ酸側鎖に結合される。一部の実施形態では、リンカーおよび／または細胞反応性部分は、細胞反応性コンプスタチン類似体の合成においてアミノ酸を使用する前にすでにアミノ酸側鎖に結合されている。例えば、その側鎖にリンカーを結合したＬｙｓ誘導体を使用してもよい。リンカーは、細胞反応性官能基を含んでもよく、またはその後に改変されて細胞反応性官能基を含んでもよい。
特定の細胞反応性コンプスタチン類似体を、以下にさらに詳述する。以下の説明では、アミノ酸配列Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ（配列番号３７）（配列番号２８のコンプスタチン類似体に相当し、配列番号３７のアスタリスクは、活性化合物中のジスルフィド結合によって結合されたシステインを表し、および（１Ｍｅ）Ｔｒｐは、１－メチル－トリプトファンを表す）を有するペプチドは、コンプスタチン類似体の一例として使用される。マレイミド（略称Ｍａｌ）は、細胞反応性官能基の一例として使用される。（ＣＨ２）ｎおよび（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎは、連結部分の例として使用される。リシンは、反応性官能基を含むアミノ酸の一例として使用される（一部の化合物）。Ｎ末端およびＣ末端のそれぞれアセチル化およびアミド化は、一部の化合物において任意で存在する例示的なブロッキング部分として使用され、斜体で表されている。すなわち、それぞれＡｃおよびＮＨ２と表されている。化合物は、様々な合成アプローチを使用して、および様々な前駆体を使用して、作製され得る。以下の様々な合成法および前駆体に関する検討は、本発明を限定することは意図されない。概して、以下または本明細書に記載される化合物の特性のいずれも、以下または本明細書において別段に記載される他の化合物の特性と自由に組み合わせることができ、本発明はそのような実施形態を包含する。
一部の実施形態では、細胞反応性部分は、（細胞反応性官能基として）マレイミド基、およびアルカン酸（ＲＣＯＯＨ）を含む細胞反応性化合物によって提供され、式中、Ｒは、アルキル基である。例えば、以下に記載される６－マレメイドカプロン酸（Ｍａｌ－（ＣＨ２）５－ＣＯＯＨ）を使用することができる。
Figure 2022539238000003
 化合物Ｉ
一部の実施形態では、細胞反応性部分は、例えばＯＨ部分が良好な脱離基へと転換されるなど、カルボン酸部分が活性化されたアルカン酸の誘導体によって提供される。例えば、化合物Ｉのカルボキシル基をＥＤＣと反応させ、続いてＮＨＳ（任意で水溶性スルホ－ＮＨＳとして提供され得る）と反応させて、６－マレメイドカプロン酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体、すなわち６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル（以下に図示）を生じさせる。
Figure 2022539238000004
 化合物ＩＩ
配列番号３７の化合物は、Ｎ末端および／またはＣ末端で改変されて、細胞反応性コンプスタチン類似体を生成し得る。例えば、化合物ＩＩを使用して、ＩｌｅのＮ末端アミノ基と反応させることにより、以下の細胞反応性コンプスタチン類似体を生成することができる。
マレイミド－（ＣＨ２）５－Ｃ（＝Ｏ）－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ２（配列番号３８）。配列番号３８では、－Ｃ（＝Ｏ）部分は、Ｃ－Ｎ結合を介して、すぐＣ末端のアミノ酸（Ｉｌｅ）に付加され、この場合においてＮはアミノ酸の一部であり、図示されていないことが理解される。
他の実施形態では、マレイミド基は、Ｃ末端でＴｈｒに連結され、以下の細胞反応性コンプスタチン類似体を生成する：
Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ２）５－マレイミド（配列番号３９）。
一部の実施形態では、細胞反応性コンプスタチン類似体は、二官能性リンカー（例えば、ヘテロ二官能性リンカー）を使用して合成することができる。以下に（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎおよび（ＣＨ２）ｍ（式中、ｍ＝２）部分を含むヘテロ二官能性リンカーの例を示す。
Figure 2022539238000005
 化合物ＩＩＩ
化合物ＩＩＩは、細胞反応性官能基としてのマレイミド基と、アミノ基（例えば、アミノ酸側鎖のＮ末端アミノ基またはアミノ基）と容易に反応するＮＨＳエステル部分とを含む。
化合物ＩＩＩの実施形態では、式中、ｎ＝２であり、これを使用して、配列番号３７のコンプスタチン類似体を使用した以下の細胞反応性コンプスタチン類似体が作製され得る。
マレイミド－（ＣＨ２）２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ２（配列番号４０）
配列番号４０の化合物では、－Ｃ（＝Ｏ）部分は、Ｎ末端アミノ酸（Ｃ－Ｎ結合を介したＩｌｅ残基）に結合され、この場合においてＮはアミノ酸の一部であり、図示されていないことが理解される。一部の実施形態では、リンカーは、化合物ＩＩＩの式を有し、式中、ｎ≧１である。（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ部分中のｎの例示的な値が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、配列番号３９または４０の化合物と比較して、マレイミド部分を分子の残りの部分に連結するアルキル鎖は、より多くの、または少ないメチレン単位を含有し、オリゴ（エチレングリコール）部分は、より多くの、または少ないエチレングリコール単位を含有し、および／またはより多くの、もしくは少ないメチレン単位が、オリゴ（エチレングリコール）部分のいずれか、または両側に隣接する。そうした変化に関する、いくつかの例示的な細胞反応性コンプスタチン類似体の図を、以下に提示する（配列番号４１～４６）：
マレイミド－（ＣＨ２）２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ２（配列番号４１）
マレイミド－（ＣＨ２）３－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ２（配列番号４２）
マレイミド－（ＣＨ２）５－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ２（配列番号４３）
マレイミド－（ＣＨ２）４－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ２（配列番号４４）
マレイミド－（ＣＨ２）２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ２（配列番号４５）
マレイミド－（ＣＨ２）５－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ２（配列番号４６）
一部の実施形態では、配列番号３７が伸長されて、例えば、Ｃ末端結合について以下に例示されるように、ペプチドのＮ末端またはＣ末端にＬｙｓ残基を含む。
Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－ＮＨ２（配列番号４７）。
一部の実施形態では、例えば、Ｃ末端結合について以下に例示されるように、Ｌｙｓ残基が配列番号３７のＮ末端またはＣ末端にペプチドリンカーを介して付加される。
Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－（Ｇｌｙ）５－Ｌｙｓ－ＮＨ２（配列番号４８）。
一部の実施形態では、一級アミンまたは二級アミンを含むリンカーが、コンプスタチン類似体のＮ末端またはＣ末端に付加される。一部の実施形態では、リンカーは、アルキル鎖および／またはオリゴ（エチレングリコール）部分を含む。例えば、ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（例えば、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＥＥＡｃ）または１１－アミノ－３，６，９－トリオキサウンデカン酸）またはそれらのＮＨＳエステル（例えば、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸または１１－アミノ－３，６，９－トリオキサウンデカン酸のＮＨＳエステル）が使用されてもよい。一部の実施形態では、得られた化合物は、以下のとおりである（リンカーによって与えられる部分は太字で示されている）。
ＮＨ２（ＣＨ２）５Ｃ（＝Ｏ）－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－ＮＨ２（配列番号４９）
ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－ＮＨ２（配列番号５０）
一部の実施形態では、Ｌｙｓ残基は、非ペプチド部分を含むリンカーを介して配列番号３７のＮ末端またはＣ末端に付加される。例えば、リンカーは、アルキル鎖、オリゴ（エチレングリコール）鎖、および／または環状環系を含んでもよい。一部の実施形態では、８－ＡＥＥＡｃまたはそのＮＨＳエステルが使用され、以下の化合物が得られる（Ｃ末端にＬｙｓを付加させる場合）（式中、８－ＡＥＥＡｃが寄与する部分は太字で示される）。
Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ －ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌｙｓ－ＮＨ２（配列番号５１）
配列番号４９および５０では、－Ｃ（＝Ｏ）部分は、Ｃ－Ｎ結合を介して、隣接Ｉｌｅ残基に付加され、この場合においてＮはアミノ酸の一部であり、示されていないことが理解される。同様二、配列番号５１では、－Ｃ（＝Ｏ）部分は、Ｃ－Ｎ結合を介して、隣接Ｌｙｓ残基に付加され、この場合においてＮはアミノ酸の一部であり、示されていないことが理解される。配列番号５１では、ＮＨ部分は、Ｃ－Ｎ結合を介して、すぐＮ末端のアミノ酸（Ｔｈｒ）に付加され、この場合においてＣはアミノ酸のカルボニル炭素であり、示されていないことが理解される。
配列番号４７～５１の化合物は、一級アミン基で容易に改変されて、細胞反応性コンプスタチン類似体を生成することができる。例えば、配列番号４７～５１の化合物（または一級アミンもしくは二級アミン、およびコンプスタチン類似体部分を含む他の化合物）を、６－マレイミドカプロン酸Ｎ－スクシンイミジルエステルと反応させて、以下の細胞反応性コンプスタチン類似体を生成することができる。
Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－（Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）５－Ｍａｌ）－ＮＨ２（配列番号５２）。
Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－（Ｇｌｙ）５－Ｌｙｓ－－（Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）５－Ｍａｌ）－ＮＨ２（配列番号５３）。
Ｍａｌ－（ＣＨ２）５－（Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ（ＣＨ２）５Ｃ（＝Ｏ）－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－ＮＨ２（配列番号５４）
Ｍａｌ－（ＣＨ２）５－（Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－ＮＨ２（配列番号５５）
Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌｙｓ－（Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）５－Ｍａｌ）－ＮＨ２（配列番号５６）
別の実施形態では、細胞反応性コンプスタチン類似体は、以下のようにあらわされる：Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨ（Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）５－Ｍａｌ）－ＮＨ２（配列番号５７）。
本発明は、配列番号３８～５７のバリアントを提供するものであり、この場合において、－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－は、例えば配列番号３－２７、２９－３６、３７、６９、７０、７１、または７２のいずれかの任意の他のコンプスタチン類似体のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列により置き換えられるが、ただし、コンプスタチン類似体のＮ末端および／またはＣ末端に存在するブロッキング部分は、存在しなくてもよく、リンカー（ブロッキング部分を含んでもよい）により置き換えられてもよく、または対応するバリアントに存在する異なるＮ末端またはＣ末端のアミノ酸に付加されてもよい。
本発明の様々な実施形態における使用に関し、細胞反応性部分としてマレイミド、およびアミン反応性部分としてＮＨＳエステルを含む、他の二官能性架橋剤としては、例えば、スクシンイミジル ４－（ｐ－マレイミドフェニル）酪酸塩（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）、Ｎ－γ－マレイミドブチリル－オキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）が挙げられる。ＮＨＳ環にスルホン酸塩を付加することにより、水溶性類似体、例えばスルホ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）－アミノ安息香酸（スルホ－ＳＩＡＢ）、スルホ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボン酸塩（スルホ－ＳＭＣＣ）、スルホ－スクシンイミジル ４－（ｐ－マレイミドフェニル）酪酸塩（スルホ－ＳＭＰＢ）、スルホ－Ｎ－γ－マレイミドブチリル－オキシスクシンイミドエステル（スルホ－ＧＭＢＳ）などが生じ、それらは有機溶媒を必要性を避けることができる。一部の実施形態では、ＮＨＳエステル部分と分子の残りの部分との間にスペーサーアームを含む、前述のいずれかの長鎖型が使用される。スペーサーは、例えば、アルキル鎖を含んでもよい。例は、スクシンイミジル－４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシ－［６－アミドカプロン酸塩］である。
一部の実施形態では、ＮＨＳエステル（アミン反応性部分として）およびヨードアセチル基（スルフヒドリル基と反応性）を含む二官能性リンカーが使用される。そのようなリンカーとしては、例えば、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）－アミノ安息香酸塩（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル６－［（ヨードアセチル）－アミノ］ヘキサン酸塩（ＳＩＡＸ）、スクシンイミジル６－［６－（（ヨードアセチル）－アミノ）ヘキサン酸塩（ＳＩＡＸＸ）、スクシンイミジル４－（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）－シクロヘキサン－１－カルボン酸塩（ＳＩＡＣ）、スクシンイミジル６－（（（（４－（ヨードアセチル）アミノ）メチル－シクロヘキサン－１－カルボニル）アミノ）ヘキサン酸塩（ＳＩＡＣＸ）、が挙げられる。
一部の実施形態では、ＮＨＳエステル（アミン反応性部分として）およびピリジジスルフィド基（スルフヒドリル基と反応性の細胞反応性部分として）を含む二官能性リンカーが使用される。例としては、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＴＰ）、およびＮＨＳ環にスルホン酸塩を含む型、および／またはＮＨＳエステル部分と残りの分子の間にアルキル鎖を含むスペーサー（例えば、スクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサン酸塩）（ＬＣ－ＳＰＤＰ）が挙げられる。追加部分または異なる部分を含む、そうしたリンカーの変形が使用され得る。例えば、より長い、またはより短いアルキル鎖をスペーサーに使用してもよく、またはアルキル鎖の代わりにオリゴ（エチレングリコール）部分を使用してもよい。
概して、細胞反応性コンプスタチン類似体は、様々な方法を使用して合成することができる。細胞反応性官能基およびリンカーを含む細胞反応性化合物は、多くの場合、予め形成された構成単位として購入することができる。例えば、６－マレメイドカプロン酸および６－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルは、様々な供給業者から購入することができる。あるいは、そうした化合物は、当該技術分野で公知の方法を使用して合成することもできる。例えば、Ｋｅｌｌｅｒ Ｏ，Ｒｕｄｉｎｇｅｒ Ｊ．Ｈｅｌｖ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．５８（２）：５３１－４１，１９７５、およびＨａｓｈｉｄａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６（１－２）：５６－６３，１９８４を参照のこと。コンジュゲート合成用の使用に関する方法および試薬についての検討は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ、上記、およびその中の参照文献も参照のこと。概して、本発明は、コンプスタチン類似体部分および細胞反応性官能基を含む化合物を作製する任意の方法、および得られた化合物を包含する。
一部の実施形態では、リンカーが側鎖に結合したアミノ酸が、線形ペプチドの合成に使用される。線形ペプチドは、当技術分野で公知のペプチド合成のための標準的な方法、例えば、標準的な固相ペプチド合成法を使用して合成することができる。次いで線形ペプチドを、（例えば、Ｃｙｓ残基を酸化して分子内ジスルフィドを形成させることにより）環化する。次いで、当該環状化合物を、細胞反応性官能基を含むリンカーと反応させてもよい。他の実施形態では、細胞反応性官能基を含む部分は、その環化の前に、線形化合物と反応する。概して、反応性官能基は、細胞反応性コンプスタチン類似体の合成の間、互いに望ましくない反応を回避するために適切に保護され得る。細胞反応性官能基、アミノ酸側鎖のいずれか、および／またはペプチドの末端のいずれかまたは両端は、反応中に保護され、その後に脱保護されてもよい。例えば、Ｃｙｓ残基のＳＨ基、および／または例えばマレイミドなどのＳＨ反応性部分は、それらの間の反応を避けるために環化後まで保護されてもよい。反応条件は、合理的な期間内に合理的な収率を達成するために、特定の反応性官能基の要件に少なくとも部分的に基づいて選択される。試薬の温度、ｐＨ、および濃度は、所望の反応の範囲または速度を達成するために調整することができる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、上記を参照のこと。所望の生成物は精製されて、例えば、細胞反応性官能基を含む未反応化合物、未反応コンプスタチン類似体、リンカー、反応中に生成される可能性のある所望の細胞反応性コンプスタチン類似体以外の生成物、反応混合物中に存在する他の物質を取り除いてもよい。細胞反応性コンプスタチン類似体を作製するための組成物および方法、ならびに合成における中間体は、本発明の態様である。
本発明の一部の態様では、上述のリンカーは、例えば、化合物を安定化させ、体内でその寿命を延ばし、その溶解性を増加させ、その免疫原性を減少させ、および／または分解に対するその耐性を増大させる、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖または他のポリマーなどの部分を含むコンプスタチン類似体の作製に使用される。いかなる方法でも本発明は限定されず、かかる部分は本明細書において、「クリアランス低下部分」（ＣＲＭ）と呼称される場合があり、そのような部分を含むコンプスタチン類似体は、「長時間作用型コンプスタチン類似体」（ＬＡＣＡ）と呼称される場合がある。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体は、ヒトまたは非ヒト霊長類に対し、１０ｍｇ／ｋｇの用量でＩＶ投与されたとき、または約１～３ｍｇ／ｋｇ、３～５ｍｇ／ｋｇ、５～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば７ｍｇ／ｋｇの用量でＩＶ投与されたとき、少なくとも１日、例えば１～３日、３～７日、７～１４日、または１４～２８日の平均血漿半減期を有する。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体は、ヒトまたは非ヒト霊長類に対し、例えば、約１～３ｍｇ／ｋｇ、３～５ｍｇ／ｋｇ、５～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、７ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与されたとき、少なくとも１日、例えば１～３日、３～７日、７～１４日、または１４～２８日の平均血漿半減期を有する。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体は、ヒトまたは非ヒト霊長類に対し、約１～３ｍｇ／ｋｇ、３～５ｍｇ／ｋｇ、または５～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば７ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与されたとき、約４～１０、５～９、５～８、６～９、７～９、または８～９日、例えば約４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０日の平均血漿半減期（例えば終末相半減期）を有する。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体は、ヒトまたは非ヒト霊長類に対し、約１～３ｍｇ／ｋｇ、３～５ｍｇ／ｋｇ、５～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば７ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与されたとき、約４～１０、５～９、５～８、６～９、７～９、または８～９日、例えば約４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０日の平均血漿半減期（例えば終末相半減期）を有する。特定の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体は、皮下注射後の期間中、投与部位から広範囲に吸収され、例えば、投与後約１～２日で、または投与から１～２日後に、同じ量の化合物が代わりに静脈内投与されたときに達成されるであろうレベルと同等の血中レベルを提供するという点で特徴付けられる。一部の実施形態では、皮下用量の投与から約２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の日数で、または日数後の血中レベルは、同じ量の化合物を代わりに静脈内投与したときに達成されるであろう血中レベルの約５％、１０％、１５％、２０％、または２５％以内である。一部の実施形態では、ヒトまたは非ヒト霊長類への１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＩＶ投与後の長時間作用型コンプスタチン類似体の平均血漿半減期は、同じアミノ酸配列を有する（および妥当であれば、一つ以上のブロッキング部分を有するが、ＣＲＭを含まない）対応するコンプスタチン類似体と比較して、少なくとも２倍、例えば２～５倍、５～１０倍、１０～５０倍、または５０～１００倍、または１００～１５０倍、または１５０～２００倍増加する。様々な実施形態では、このような半減期の増加は、例えば皮下投与などの他の経路を介し、および／または例えば２０ｍｇ／ｋｇなど本明細書に記載される他の用量を使用して、投与した後に観察され得ることが理解される。
上述のように一部の実施形態では、配列番号３～３６、３７、６９、７０、７１、または７２のいずれかのコンプスタチン類似体は、Ｎ末端、Ｃ末端またはその両方で一つ以上のアミノ酸によって伸長され、この場合においてアミノ酸の少なくとも一つは、例えば一級アミンもしくは二級アミン、スルフヒドリル基、カルボキシル基（カルボン酸基として存在してもよい）、グアニジノ基、フェノール基、インドール環、チオエーテル、またはイミダゾール環などの反応性官能基を含む側鎖を有し、それらは反応性官能基とのコンジュゲーションを促進して、コンプスタチン類似体にＣＲＭを付加させる。ＣＲＭを含まない対応するコンプスタチン類似体は、それに対応する長時間作用型コンプスタチン類似体には存在する一つ以上のかかるアミノ酸を欠落し得ることが理解される。したがって、配列番号３～３６、３７、６９、７０、７１、または７２のいずれかを含み、ＣＲＭを欠く、対応するコンプスタチン類似体は、それぞれ配列番号３～３６、３７、６９、７０、７１、または７２と「同じアミノ酸配列を有する」と理解される。例えば、配列番号１４、２１、２８、２９、３２、３３、３４、または３６のアミノ酸配列を含み、ＣＲＭを欠く、対応するコンプスタチン類似体は、それぞれ配列番号１４、２１、２８、２９、３２、３３、３４、または３６と「同じアミノ酸配列を有する」と理解される。
一部の実施形態では、血漿半減期は、単回ＩＶ用量の投与後の終末相半減期である。一部の実施形態では、血漿半減期は、複数回のＩＶ用量の投与後に定常状態に達した後の終末相半減期である。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体は、霊長類への単回ＩＶ用量の投与後、または複数のＩＶ用量の投与後に、ＣＲＭを含まない対応するコンプスタチン類似体の少なくとも５倍、例えば、５倍～５０倍高い血漿中のＣｍａｘを達成する。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体は、霊長類への単回ＩＶ用量の投与後、または複数のＩＶ用量の投与後に、ＣＲＭを含まない対応するコンプスタチン類似体の１０倍～２０倍高い血漿中のＣｍａｘを達成する。
一部の実施形態では、霊長類はヒトである。一部の実施形態では、霊長類は、非ヒト霊長類、例えば、カニクイザルまたはアカゲザルなどのサルである。
一部の実施形態では、ヒトまたは非ヒト霊長類への１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇの用量でのＩＶ投与後の最初の２４時間の長時間作用型コンプスタチン類似体の腎クリアランスは、対応するコンプスタチン類似体の腎クリアランスと比較して、少なくとも２倍、例えば、２～５倍、５～１０倍、１０～５０倍、または５０～１００倍、または１００～１５０倍もしくは１５０～２００倍低下する。様々な実施形態では、腎クリアランスにおけるかかる低下は、例えば皮下投与などの他の経路を介し、および／または例えば２０ｍｇ／ｋｇなど本明細書に記載される他の用量を使用して、投与した後に観察され得ることが理解される。
コンプスタチン類似体の濃度は、例えば、ＵＶ、ＨＰＬＣ、質量分析（ＭＳ）、もしくはＣＲＭに対する抗体、または例えばＬＣ／ＭＳもしくはＬＣ／ＭＳ／ＭＳなどのそれら方法の組み合わせを使用して、血液サンプルおよび／または尿サンプルで測定することができる。半減期およびクリアランスなどの薬物動態パラメータは、当業者に公知の方法を使用して決定することができる。薬物動態解析は、例えば、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアｖ５．２（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミズーリ州セントルイス）または他の適切なプログラムを用いて実施することができる。
特定の実施形態では、ＣＲＭは、生理学的条件下で少なくとも２４時間、またはそれ以上安定である。特定の実施形態では、ＣＲＭは、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトまたは非ヒト霊長類（例えば、サル）の血液、血漿、または血清において少なくとも２４時間安定である。様々な実施形態では、ＣＲＭ分子の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上は、生理学的条件下での２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、またはそれ以上のインキュベーションでも完全性を維持する。様々な実施形態では、ＣＲＭ分子の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上は、３７℃、血液、血漿または血漿中での４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、またはそれ以上のインキュベーションでも完全性を維持する。インキュベーションは、様々な実施形態において、１マイクログラム／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＲＭを使用して実施され得る。サンプルは、様々な時点で分析され得る。サイズまたは完全性は、例えば、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、質量分析、ウェスタンブロット、または任意の他の適切な方法を使用して評価され得る。そうした安定性の特性は、ＣＲＭにコンジュゲートされた部分に対して与えられ得る。様々な実施形態において、ＣＲＭを含む長時間作用型コンプスタチン類似体は、上述の安定性の特性のいずれかを有し得る。一部の態様では、長時間作用型コンプスタチン類似体に関する完全性とは、コンプスタチン類似体部分が、ＣＲＭにコンジュゲートされたままであり、ＣＲＭのサイズが、インキュベーションまたは投与の開始時とほぼ同じままであることを意味する。
一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体は、同じアミノ酸配列（そして妥当な場合には一つ以上のブロッキング部分）を有し、しかしＣＲＭを含まない対応するコンプスタチン類似体の活性の少なくとも約１０％、２０％、３０％のモル活性、例えば、３０％～４０％、３０％～５０％、３０％～６０％、３０％～７０％、３０％～８０％、３０％～９０％、またはそれ以上のモル活性を有する。長時間作用型コンプスタチン類似体が、複数のコンプスタチン類似体部分を含む一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体のモル活性は、当該コンプスタチン類似体部分の活性の合計の少なくとも約１０％、２０％、または３０％、例えば、３０％～４０％、３０％～５０％、３０％～６０％、３０％～７０％、３０％～８０％、３０％～９０％、またはそれ以上である。
一部の実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、少なくとも５００ダルトンの分子量を有する（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分を含む。
一部の実施形態では、上述のリンカーは、約５００、１，０００、１，５００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、および１００，０００ダルトンの平均分子量を有する（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分を含む。
一部の実施形態では、ＰＥＧの平均分子量は、少なくとも２０，０００ダルトン、最大約１００，０００ダルトン、１２０，０００ダルトン、１４０，０００ダルトン、１６０，０００ダルトン、１８０，０００ダルトン、または２００，０００ダルトンである。「平均分子量」とは、平均分子量の数を指す。一部の実施形態では、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分の多分散度Ｄは、１．０００５～１．５０、例えば、１．００５～１．１０、１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．４０もしくは１．５０、または１．０００５～１．５０の間の任意の値である。
一部の実施形態では、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分は一分散であり、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分の多分散度は、１．０である。そのような一分散性の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分は当該技術分野で公知であり、Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ社（オハイオ州ポウェル）から入手可能されており、非限定的な例として、ｎが、２、４、６、８、１２、１６、２０、または２４である一分散性部分が挙げられる。
一部の実施形態では、化合物は、複数の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分を含み、この場合において当該（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分の総分子量は、約１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、および１００，０００ダルトンの間である。一部の実施形態では、化合物または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分の平均総分子量は、少なくとも２０，０００ダルトン、最大約１００，０００ダルトン、１２０，０００ダルトン、１４０，０００ダルトン、１６０，０００ダルトン、１８０，０００ダルトン、または２００，０００ダルトンである。一部の実施形態では、化合物は、例えば、ｎ＝４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０以上など、既定の長さを有する複数の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分を含む。一部の実施形態では、化合物は、約１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、および１００，０００ダルトンの間の当該（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分の総分子量を生じさせるのに充分な数の規定の長さの（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎを含む。一部の実施形態では、化合物または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分の平均総分子量は、少なくとも２０，０００ダルトン、最大約１００，０００ダルトン、１２０，０００ダルトン、１４０，０００ダルトン、１６０，０００ダルトン、１８０，０００ダルトン、または２００，０００ダルトンである。一部の実施形態では、ｎは、約３０～約３０００である。
一部の実施形態では、コンプスタチン類似体部分は、線形ＰＥＧの各末端に付加される。鎖の各末端に反応性官能基を有する二官能性ＰＥＧは、例えば、上述のように使用され得る。一部の実施形態では、反応性官能基は同一であるが、一部の実施形態では、各末端に異なる反応性官能基が存在する。
一部の実施形態では、複数の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分が、分岐構造として提供される。分岐は、線形ポリマー骨格（例えば、くし形構造として）に結合されてもよく、または例えば、星型構造として、一つ以上の中心コア群から伸びていてもよい。一部の実施形態では、分岐分子は、３～１０個の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖を有する。一部の実施形態では、分岐分子は、４～８個の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖を有する。一部の実施形態では、分岐分子は、１０、９、８、７、６、５、４、または３個の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖を有する。一部の実施形態では、星型分子は、中心コア群から伸びる１０～１００個、１０～５０個、１０～３０個、または１０～２０個の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖を有する。ゆえに一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体は、例えば、３～１０個のコンプスタチン類似体部分、例えば、４～８個のコンプスタチン類似体部分を含んでもよく、各々が鎖の末端で官能基を介して（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖に結合される。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体は、例えば、１０～１００個のコンプスタチン類似体部分を含んでもよく、各々が鎖の末端で官能基を介して（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖に結合される。一部の実施形態では、分岐型または星型のＰＥＧの分岐（時には「アーム」とも呼称される）は、ほぼ同じ数の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）部分を含有する。一部の実施形態では、少なくとも一部の分岐の長さが異なり得る。一部の実施形態では、一つ以上の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖が、その上に結合されたコンプスタチン類似体部分を有しないことが理解されよう。一部の実施形態では、鎖の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％が、その上に結合されたコンプスタチン類似体部分を有する。
概して、本明細書に示される化合物では、ポリエチレングリコール部分は、反復単位の右側または反復単位の左側の酸素原子とともに描かれる。一つの方向のみが描かれる場合でも、本発明は、所与の化合物もしくは属に対するポリエチレングリコール部分の両方の方向性（すなわち、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎおよび（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ）を包含する。または化合物もしくは属が複数のポリエチレングリコール部分を含有する場合、方向性の全ての組み合わせが本開示に包含される。
反応性官能基を含むいくつかの例示的な一官能性ＰＥＧの式を以下に示す。例示的な目的のために、反応性官能基がＮＨＳエステルを含む式が記載されているが、例えば、上述のように、他の反応性官能基も使用され得る。一部の実施形態では、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎは、メトキシ基（ＯＣＨ３）とともに左端で終結するものとして示されるが、本明細書の以下および別段に示される鎖は、異なるＯＲ部分（例えば、脂肪族基、アルキル基、低級アルキル基、または任意の他の適切なＰＥＧ末端基）またはＯＨ基で終結し得ることが理解される。また、示されたもの以外の部分は、様々な実施形態において、ＮＨＳ基で（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分に連結し得ることが理解される。
一部の実施形態では、一官能性ＰＥＧは、以下の式ＡのＰＥＧである。
Figure 2022539238000006
 式中、「反応性官能基」およびｎは、上記に定義され、本明細書のクラスおよびサブクラスにおいて記述されるとおりであり、
Ｒ１は、水素、脂肪族基、または任意の適切な末端基であり、および
Ｔは、共有結合またはＣ１－１２直鎖または分岐鎖の炭水化物鎖であり、この場合においてＴの一つ以上の炭素単位は、任意で、および独立して、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒｘ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｎ（Ｒｘ）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｘ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒｘ）ＳＯ２－、または－ＳＯ２Ｎ（Ｒｘ）－により置換され、および
各Ｒｘは、独立して、水素またはＣ１－６脂肪族である。
式Ａの例示的な一官能性ＰＥＧとしては、以下が挙げられる。
Figure 2022539238000007
 式Ｉ
式Ｉにおいて、反応性官能基を含む部分は、一般構造－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯＯ－ＮＨＳを有し、式中、ｍ＝２である。一部の実施形態では、一官能性ＰＥＧは、式Ｉの構造を有し、式中、ｍは１～１０、例えば１～５である。例えば、一部の実施形態では、ｍは、以下に示されるように３である。
Figure 2022539238000008
 式Ｉａ
Figure 2022539238000009
 式ＩＩ
式ＩＩにおいて、反応性官能基を含む部分は、一般構造－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯＯ－ＮＨＳを有し、式中、ｍ＝１である。一部の実施形態では、一官能性ＰＥＧは、式ＩＩの構造を有し、式中、ｍは、１～１０である（例えば、以下の式ＩＩＩに示されるように５である）か、またはｍは、０である（例えば、以下の式ＩＩＩａに示される）。
Figure 2022539238000010
 式ＩＩＩ
Figure 2022539238000011
 式ＩＩＩａ
一部の実施形態では、二官能性線形ＰＥＧは、その各末端で反応性官能基を含む部分を含む。反応性官能基は、同一であっても（ホモ二官能性）、異なっていてもよい（ヘテロ二官能性）。一部の実施形態では、二官能性ＰＥＧの構造は、対称的であってもよく、この場合において同じ部分を使用して、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖の各末端の酸素原子に反応性官能基を連結する。一部の実施形態では、異なる部分を使用して、分子のＰＥＧ部分に二つの反応性官能基を連結する。例示的な二官能性ＰＥＧの構造を、以下に示す。例示的な目的のために、反応性官能基がＮＨＳエステルを含む式が記載されているが、他の反応性官能基も使用され得る。
一部の実施形態では、二官能性線形ＰＥＧは、以下の式Ｂである。
Figure 2022539238000012
 式中、各Ｔおよび「反応性官能基」は独立して、上記に定義され、本明細書のクラスおよびサブクラスに記載されるとおりであり、ｎは、上記に定義され、本明細書のクラスおよびサブクラスに記載されるとおりである。
式Ｂの例示的な二官能性ＰＥＧとしては以下が挙げられる。
Figure 2022539238000013
 式ＩＶ
式ＩＶにおいて、反応性官能基を含む部分は、一般構造－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯＯ－ＮＨＳを有し、式中、ｍ＝１である。一部の実施形態では、二官能性ＰＥＧは、式ＩＶの構造を有し、式中、ｍは１～１０、例えば１～５である。特定の実施形態では、ｍは０であり、例えば、反応性官能基を含む部分は、一般構造－ＣＯＯ－ＮＨＳを有する。例えば、一部の実施形態では、二官能性ＰＥＧは、以下に示されるように、式ＩＶａの構造を有する。
Figure 2022539238000014
 式ＩＶａ
Figure 2022539238000015
 式Ｖ
式Ｖにおいて、反応性官能基を含む部分は、一般構造－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯＯ－ＮＨＳを有し、式中、ｍ＝２である。一部の実施形態では、二官能性ＰＥＧは、式Ｖの構造を有し、式中、ｍは１～１０、例えば１～５である。特定の実施形態では、例えば、ｍは、以下に示されるように２である。
Figure 2022539238000016
 式Ｖａ
一部の実施形態では、本発明は、ポリマーにコンジュゲートされたコンプスタチン類似体を提供する。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に図示されるＰＥＧ含有化合物および属のコンプスタチン類似コンジュゲートを提供する。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体上の官能基（例えば、アミン、ヒドロキシル、またはチオール基）は、本明細書に記載される「反応性官能基」を有するＰＥＧ含有化合物と反応して、当該コンジュゲートを生成する。例として、式ＩＩＩおよびＩＶはそれぞれ、以下の構造を有するコンプスタチン類似体コンジュゲートを形成し得る。
Figure 2022539238000017
 式中、
Figure 2022539238000018
 は、コンプスタチン類似体上のアミン基の結合点を表す。特定の実施形態では、アミン基は、リシン側鎖基である。
対応するコンジュゲートは、反応性官能基および／またはコンプスタチン官能基の選択に応じて、本明細書に示されるＰＥＧ含有化合物および属のいずれかとともに形成され得ることが理解される。例えば、式ＩＶａおよびＶａはそれぞれ、以下の構造を有するコンプスタチン類似体コンジュゲートを形成し得る：
Figure 2022539238000019
 特定の実施形態では、当該コンジュゲートのＰＥＧ構成要素は、約１０ｋＤ～１００ｋＤ、約１０ｋＤ～９０ｋＤ、約１０ｋＤ～８０ｋＤ、約１０ｋＤ～７０ｋＤ、約２０ｋＤ～６０ｋＤ、約２０ｋＤ～５０ｋＤ、約３０ｋＤ～８０ｋＤ、約３０ｋＤ～７０ｋＤ、約３０ｋＤ～６０ｋＤ、約３０ｋＤ～５０ｋＤ、約３０ｋＤ～４５ｋＤ、約３５ｋＤ～５０ｋＤ、約３５ｋＤ～４５ｋＤ、約３６ｋＤ～４４ｋＤ、約３７ｋＤ～４３ｋＤ、約３８ｋＤ～４２ ｋＤ、または約３９ｋＤ～４１ｋＤの平均分子量を有する。特定の実施形態では、当該コンジュゲートのＰＥＧ構成要素は、約１０ｋＤの平均分子量を有する。特定の実施形態では、当該コンジュゲートのＰＥＧ構成要素は、約４０ｋＤの平均分子量を有する。
「二官能性」または「二官能基化」という用語は、本明細書において、ＣＲＭに連結された二つのコンプスタチン類似体部分を含む化合物を指すために使用される場合がある。そのような化合物は、「ＢＦ」という文字で指定される場合がある。一部の実施形態では、二官能基化化合物は、対称性である。一部の実施形態では、二官能基化化合物のＣＲＭと各コンプスタチン類似体部分の間の連結は、同一である。一部の実施形態では、二官能基化化合物のＣＲＭとコンプスタチン類似体の間の各連結は、カルバミン酸塩を含む。一部の実施形態では、二官能基化化合物のＣＲＭとコンプスタチン類似体の間の各連結は、カルバミン酸塩を含み、エステルを含まない。一部の実施形態では、二官能基化化合物の各コンプスタチン類似体は、カルバミン酸塩を介して直接ＣＲＭに連結される。一部の実施形態では、二官能基化化合物の各コンプスタチン類似体は、カルバミン酸塩を介して直接ＣＲＭに連結され、二官能基化化合物は、以下の構造を有する。
Figure 2022539238000020
本明細書に記載される実施形態、および式の一部の実施形態において、
Figure 2022539238000021
 は、以下の構造を有するコンプスタチン類似体中のリシン側鎖基の結合点を表す。
Figure 2022539238000022
 式中、
Figure 2022539238000023
 という記号は、分子または化学式の残りの部分への化学的部分の結合点を示す。
一部の実施形態では、分岐型、くし形、または星型のＰＥＧは、複数の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖のそれぞれの末端に反応性官能基を含む部分を含む。反応性官能基は、同一であってもよく、または少なくとも二つの異なる基があってもよい。一部の実施形態では、分岐型、くし形、または星型のＰＥＧは、以下の式のＰＥＧである。
Figure 2022539238000024
Figure 2022539238000025
式中、各Ｒ２は独立して「反応性官能基」またはＲ１であり、ならびに各Ｔ、ｎ、および「反応性官能基」は独立して上記に定義され、本明細書のクラスおよびサブクラスに記載されるとおりである。反応性官能基としてＮＨＳ部分を含む例示的な分岐型ＰＥＧ（８つのアームまたは分岐を有する）の構造を、以下に示す。
Figure 2022539238000026
 式ＶＩ
Figure 2022539238000027
 式ＶＩＩ
反応性官能基としてＮＨＳ部分を含む例示的な分岐型ＰＥＧ（４つのアームまたは分岐を有する）の構造を、以下に示す：
Figure 2022539238000028
 式ＶＩＩＩ
Figure 2022539238000029
 式ＩＸ
骨格から伸びる分岐の数は変化し得る。例えば、上記の式ＶＩおよびＶＩＩの数の４は、様々な実施形態において、０～１０の任意の他の整数に変更され得る。特定の実施形態では、一つ以上の分岐が、反応性官能基を含有せず、分岐は、上述のように、－ＣＨ２ＣＨ２ ＯＨ基または－ＣＨ２ＣＨ２ ＯＲ基で終結する。
一部の実施形態では、分岐型ＰＥＧは、式ＶＩＩ、式ＶＩＩＩ、または式ＩＸ（または異なる数の分岐を有するそのバリアント）の構造を有するが、ただしｘは、以下である。
Figure 2022539238000030
一部の実施形態では、分岐型ＰＥＧは、式ＶＩＩ、式ＶＩＩＩ、または式ＩＸ（または異なる数の分岐を有するそのバリアント）の構造を有するが、ただしｘは、以下である。
Figure 2022539238000031
当然のことながら、上記のｘ部分のメチレン（ＣＨ２）基は、より長いアルキル鎖（ＣＨ２）ｍを代わりに含んでもよく、この場合において、ｍは、最大２、３、４、５、６、８、１０、２０、または３０であり、または本明細書に記載の一つ以上の他の部分を含んでもよい。
一部の実施形態では、ＮＨＳまたはマレイミド反応基を有する例示的な分岐型ＰＥＧを以下に示す。
Figure 2022539238000032
 式Ｘ
Figure 2022539238000033
 式ＸＩ
一部の実施形態では、式Ｘまたは式ＸＩのバリアントが使用され、この場合において４個の分岐のうちの３個または各々が、反応性官能基を含む。
ＰＥＧのさらに他の例は、以下のように表され得る。
Figure 2022539238000034
 式ＸＩＩ
Figure 2022539238000035
式ＸＩＩＩ
上述のように、本明細書に記載される場合、様々な実施形態では、例えば線形アルキル、エステル、アミド、芳香族環（例えば、置換または非置換のフェニル）、置換もしくは非置換のシクロアルキル構造、またはそれらの組み合わせなどの様々な部分のいずれも、長時間作用型コンプスタチン類似体のペプチド構成要素と（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｒ部分の間に組み込まれ得ることが理解される。一部の実施形態では、そうした部分は、化合物をさらに加水分解され易くさせ得、加水分解はＣＲＭから化合物のペプチド部分を放出させ得る。一部の実施形態では、そうした放出は、化合物のインビボでの組織浸透および／または活性を強化し得る。一部の実施形態では、加水分解は、一般的な（例えば、酸－塩基）加水分解である。一部の実施形態では、加水分解は、酵素触媒型、例えば、エステラーゼ触媒型である。当然のことながら、両方のタイプの加水分解が発生し得る。一つ以上のそうした部分、および反応性官能基としてＮＨＳエステルを含むＰＥＧの例は以下のとおりである。
Figure 2022539238000036
 式ＸＩＶ

Figure 2022539238000037
 式ＸＶ
Figure 2022539238000038
 式ＸＶＩ
一部の実施形態では、分岐型（マルチアーム）ＰＥＧまたは星型ＰＥＧは、ペンタエリスリトールコア、ヘキサグリセリンコア、またはトリペンタエリスリトールコアを含む。分岐は、特定の実施形態では、一つの点からすべてが伸びるわけではないことが理解される。
一つ以上の反応性官能基を含む一官能基型、二官能基型、分岐型、および他のＰＥＧは、一部の実施形態では、例えば特にＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐ．ニューヨーク州ホワイトプレインズ、またはＢＯＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社 ４５－１６ Ｒａｍｓｅｙ Ｒｏａｄ Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ １１９６７、米国から取得されてもよく、または当分野に公知の方法を使用して作製されてもよい。
一部の実施形態では、ＣＲＭとコンプスタチン類似体の間の連結は、カルバミン酸塩を含む。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、カルバミン酸塩を介して直接ＣＲＭに連結される。一部の実施形態では、ＣＲＭとコンプスタチン類似体の間の連結は、エステルを含まない。一部の実施形態では、ＣＲＭとコンプスタチン類似体の間の連結は、カルバミン酸塩を含み、エステルを含まない。一部の実施形態では、ＣＲＭとコンプスタチン類似体の間の連結は、カルバミン酸塩を含み、水性媒体中で加水分解に対する感受性がカルバミン酸塩よりも高い結合を含まない。一部の実施形態では、ＣＲＭは、ＰＥＧ部分を含むか、またはＰＥＧ部分からなる。
一部の実施形態では、ＣＲＭとコンプスタチン類似体の間の連結は、アミドを含む。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、アミドを介して直接ＣＲＭに連結される。一部の実施形態では、ＣＲＭとコンプスタチン類似体の間の連結は、アミドを含み、エステルを含まない。一部の実施形態では、ＣＲＭとコンプスタチン類似体の間の連結は、アミドを含み、水性媒体中で加水分解に対する感受性がアミドよりも高い結合を含まない。一部の実施形態では、ＣＲＭは、ＰＥＧ部分を含むか、またはＰＥＧ部分からなる。
一部の実施形態では、多官能基化化合物（例えば、二官能基化、三官能基化、またはより多くの官能基化がされた化合物）の一つ以上のコンプスタチン類似体は、カルバミン酸塩を含む連結によりＣＲＭに連結される。一部の実施形態では、多官能基化化合物（例えば、二官能基化、三官能基化、またはより多くの官能基化がされた化合物）の一つ以上のコンプスタチン類似体は、エステルを含まない連結によりＣＲＭに連結される。一部の実施形態では、多官能基化化合物（例えば、二官能基化、三官能基化、またはより多くの官能基化がされた化合物）の一つ以上のコンプスタチン類似体は、カルバミン酸塩を含み、エステルを含まない連結によりＣＲＭに連結される。一部の実施形態では、多官能基化化合物（例えば、二官能基化、三官能基化、またはより多くの官能基化がされた化合物）の一つ以上のコンプスタチン類似体は、カルバミン酸塩を含み、水性媒体中で加水分解に対する感受性がカルバミン酸塩よりも高い結合を含まない連結によりＣＲＭに連結される。一部の実施形態では、多官能基化化合物（例えば、二官能基化、三官能基化、またはより多くの官能基化がされた化合物）の各コンプスタチン類似体は、カルバミン酸塩を介して直接ＣＲＭに連結される。
一部の実施形態では、ＣＲＭは、ＰＥＧ部分を含むか、またはＰＥＧ部分からなる。一部の実施形態では、多官能基化化合物（例えば、二官能基化、三官能基化、またはより多くの官能基化がされた化合物）の一つ以上のコンプスタチン類似体は、アミドを含む連結によりＣＲＭに連結される。一部の実施形態では、多官能基化化合物（例えば、二官能基化、三官能基化、またはより多くの官能基化がされた化合物）の一つ以上のコンプスタチン類似体は、アミドを含み、エステルを含まない連結によりＣＲＭに連結される。一部の実施形態では、多官能基化化合物（例えば、二官能基化、三官能基化、またはより多くの官能基化がされた化合物）の一つ以上のコンプスタチン類似体は、アミドを含み、水性媒体中で加水分解に対する感受性がアミドよりも高い結合を含まない連結によりＣＲＭに連結される。一部の実施形態では、多官能基化化合物（例えば、二官能基化、三官能基化、またはより多くの官能基化がされた化合物）の各コンプスタチン類似体は、アミドを介して直接ＣＲＭに連結される。一部の実施形態では、ＣＲＭは、ＰＥＧ部分を含むか、またはＰＥＧ部分からなる。
一部の実施形態では、本発明は、ポリマーとコンジュゲートされたコンプスタチン類似体を提供するものであり、この場合において当該ポリマーは、ＰＥＧ以外である。一部の実施形態では、ポリマーは、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）である。直接的なコンジュゲーション、またはリンカーを介したコンジュゲーションのための一官能基化および多官能基化ポリオキサゾリン誘導体の例を以下に示す：
Ｚ－Ｔ－［Ｎ（ＣＯＲｘ）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ－Ｔ－Ｒ１；
Ｒ１－｛［Ｎ（ＣＯ－Ｔ－Ｚ）ＣＨ２ＣＨ２］ｍ－［Ｎ（ＣＯＲｘ）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ｝ａ－Ｔ－Ｒ１；
Ｒ１－｛［Ｎ（ＣＯ－Ｔ－Ｚ１）ＣＨ２ＣＨ２］ｐ－［Ｎ（ＣＯＲｘ）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ－［Ｎ（ＣＯ－Ｔ－Ｚ２）ＣＨ２ＣＨ２］ｍ｝ａ－Ｔ－Ｒ１；
Ｒ１－｛［Ｎ（ＣＯ－Ｔ－Ｚ１）ＣＨ２ＣＨ２］ｐ－［Ｎ（ＣＯＲｘ）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ－［Ｎ（ＣＯ－Ｔ－Ｚ２）ＣＨ２ＣＨ２］ｍ｝ａ－Ｔ－Ｚ；
Ｒ１－［Ｎ（ＣＯＲｘ）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ－Ｔ－Ｂ（－Ｒ１）（－Ｔ－Ｚ）－Ｔ－［Ｎ（ＣＯＲｘ）ＣＨ２ＣＨ２］ｍ－Ｒ１；
式中：
Ｚ、Ｚ１、およびＺ２の各々は独立して、上記に定義され、および本明細書のクラスおよびサブクラスに記載される反応性官能基であり、
Ｔ、Ｒｘ、およびＲ１の各々は独立して、上記に定義され、および本明細書のクラスおよびサブクラスに記載されるとおりであり、
ｍ、ｎ、およびｐの各々は独立して、０～１０００の整数であるが、各式のｍ、ｎ、およびｐの合計は０ではないという制限があり、
ａは、ランダムコポリマーを示す「ｒａｎ」、またはブロックコポリマーを示す「ｂｌｏｃｋ」であり、
Ｂは、ポリマーの他の部分に、リンカーで、またはリンカーを伴わずに連結される分岐部分である。
コンジュゲーションのための官能基化ポリオキサゾリン誘導体のその他の例は、当分野において多く報告されており、限定されないが、ＰＣＲ国際特許出願公開ＷＯ／２０１０／００６２８２、ＷＯ／２００９／０８９５４２、ＷＯ／２００９／０４３０２７、およびＷＯ／２００８／１０６１８６に記載されるものが挙げられる。それら各文献の全体が、参照により本明細書に援用される。
ポリオキサゾリンポリマーとのコンプスタチン類似体コンジュゲートの例を以下に示す。
Figure 2022539238000039
 式中、各変数は独立して、上記に定義され、および本明細書のクラスおよびサブクラスに記載されるとおりである。
一部の実施形態では、本発明は、ポリマーとコンジュゲートされたコンプスタチン類似体を提供するものであり、この場合においてコンプスタチン類似体は、一つ以上のリンカーを介してポリマーに結合される。一部の実施形態では、ポリマーは、上述され、本明細書のクラスおよびサブクラスにおいて記載されるＰＥＧ含有化合物および属から選択される。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるＰＥＧ含有化合物および属のコンプスタチン類似体のコンジュゲートを提供するものであり、この場合においてコンプスタチン類似体は、一つ以上のリンカーを介してＰＥＧ含有部分に結合される。コンジュゲーション用の一つ以上の反応性官能基を含む一官能性ＰＥＧおよび多官能性ＰＥＧは、上記に定義され、および本明細書のクラスおよびサブクラスに記載されており、限定されないが、式Ａ、Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、Ｂ、ＩＶ、ＩＶａ、Ｖ、Ｖａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、またはＸＶＩのものが挙げられる。
例えばＰＥＧやポリオキサゾリンなど、コンプスタチン類似体とポリマー部分を結合させるのに適したリンカーは、上記、および本明細書のクラスおよびサブクラスにおいて、詳述される。一部の実施形態では、リンカーは、複数の官能基を有し、この場合において一つの官能基はコンプスタチン類似体に結合され、別の官能基はポリマー部分に結合される。一部の実施形態では、リンカーは、二官能基化合物である。一部の実施形態では、リンカーは、ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨの構造を有し、ｎは、１～１０００である。一部の実施形態では、リンカーは、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＥＥＡｃ）である。一部の実施形態では、リンカーは、コンプスタチン類似体のポリマー部分または官能基とのコンジュゲーションのために活性化される。例えば、一部の実施形態では、ＡＥＥＡｃのカルボキシル基が活性化され、その後にリシン基の側鎖のアミン基とコンジュゲーションされる。
一部の実施形態では、コンプスタチン類似体上の適切な官能基（例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、またはカルボン酸基）は、直接的に、またはリンカーを介して、ポリマー部分とのコンジュゲーションに使用される。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、アミン基を通じ、リンカーを介してＰＥＧ部分にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、アミン基は、アミノ酸残基のα－アミノ基である。一部の実施形態では、アミン基は、リシン側鎖のアミン基である。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、リシン側鎖のアミノ基（ε－アミノ基）を通じ、ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨの構造を有するリンカーを介してＰＥＧ部分にコンジュゲートされ、式中、ｎは１～１０００である。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、リシン側鎖のアミノ基を通じ、ＡＥＥＡｃリンカーを介してＰＥＧ部分にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨリンカーは、コンジュゲーション後にコンプスタチンのリシン側鎖上に－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－部分を導入する。一部の実施形態では、ＡＥＥＡｃリンカーは、コンジュゲーション後にコンプスタチンのリシン側鎖上に－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－部分を導入する。
一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、リンカーを介してポリマー部分にコンジュゲートされ、この場合においてリンカーは、ＡＥＥＡｃ部分とアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、リンカーを介してポリマー部分にコンジュゲートされ、この場合においてリンカーは、ＡＥＥＡｃ部分とリシン残基を含む。一部の実施形態では、ポリマーは、ＰＥＧである。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体のＣ末端は、ＡＥＥＡｃのアミノ基に結合され、ＡＥＥＡｃのＣ末端は、リシン残基に結合される。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体のＣ末端は、ＡＥＥＡｃのアミノ基に結合され、ＡＥＥＡｃのＣ末端は、リシン残基のα－アミノ基に結合される。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体のＣ末端は、ＡＥＥＡｃのアミノ基に結合され、ＡＥＥＡｃのＣ末端は、リシン残基のα－アミノ基に結合され、そして例えばＰＥＧ部分などのポリマー部分は、当該リシン残基のε－アミノ基を通じてコンジュゲートされる。一部の実施形態では、リシン残基のＣ末端は、改変される。一部の実施形態では、リシン残基のＣ末端は、アミド化によって改変される。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体のＮ末端は、改変される。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体のＮ末端は、アセチル化される。
ＡＥＥＡｃリンカーとポリマーを含む例示的なコンジュゲートを以下に示し、この場合において
Figure 2022539238000040
 は、コンプスタチン類似体のアミン基の結合点を表し、
Figure 2022539238000041
 は、そのＣ末端を介して結合するコンプスタチン類似体を表し、他の各変数は独立して上記に定義され、本明細書のクラスおよびサブクラスで記載されている。一部の実施形態では、アミン基は、リシン側鎖のアミノ基である。
Figure 2022539238000042
Figure 2022539238000043
Figure 2022539238000044
特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、Ｍ－ＡＥＥＡｃ－Ｌｙｓ－Ｂ２として表される場合があり、式中、Ｂ２は、ブロッキング部分、例えばＮＨ２であり、Ｍは、配列番号３～３６、３７、６９、７０、７１、または７２のいずれかを表し、ただし配列番号３～３６、３７、６９、７０、７１、または７２のいずれかのＣ末端アミノ酸は、ペプチド結合を介してＡＥＥＡｃ－Ｌｙｓ－Ｂ２に連結されるものとする。一官能性または多官能性（例えば、二官能性）ＰＥＧのＮＨＳ部分は、リシン側鎖の遊離アミンと反応して、一官能基化（一つのコンプスタチン類似体部分）または多官能基化（複数のコンプスタチン類似体部分）の長時間作用型コンプスタチン類似体を生成する。様々な実施形態では、反応性官能基を含む側鎖を含む任意のアミノ酸を、Ｌｙｓの代わりに（またはＬｙｓに加えて）使用してもよい。好適な反応性官能基を含む一官能性ＰＥＧまたは多官能性ＥＧは、ＮＨＳ－エステル活性化ＰＥＧとＬｙｓの反応に似た様式で、そうした側鎖と反応し得る。
上述の式および構造のいずれかに関して、コンプスタチン類似体の構成要素が、本明細書に記載される任意のコンプスタチン類似体、例えば、配列番号３～３６、３７、６９、７０、７１、または７２の任意のコンプスタチン類似体を含む実施形態が、明示的に開示されていることが理解される。例えば、限定されないが、コンプスタチン類似体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含んでもよい。コンプスタチン類似体構成要素が、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、例示的な長時間作用型コンプスタチン類似体は、図１に示される。ＰＥＧ部分は、本明細書に記載の様々な実施形態において、様々な異なる分子量または平均分子量を有し得ることが理解される。例えば、調製物内の個々のＰＥＧ鎖は、分子量が変化してもよく、および／または異なる調製物は、本明細書に記載されるように、異なる平均分子量および／または多分散性を有してもよい。特定の実施形態では、図１の化合物中のＰＥＧ部分は、約５ｋＤ～１００ｋＤ、約５ｋＤ～９０ｋＤ、約１０ｋＤ～８０ｋＤ、約２０ｋＤ～７０ｋＤ、約２０ｋＤ～６０ｋＤ、約２０ｋＤ～５０ｋＤ、約３０ｋＤ～８０ｋＤ、約３０ｋＤ～７０ｋＤ、約３０ｋＤ～６０ｋＤ、約３０ｋＤ～５０ｋＤ、約３０ｋＤ～４５ｋＤ、約３５ｋＤ～５０ｋＤ、約３５ｋＤ～４５ｋＤ、約３６ｋＤ～４４ｋＤ、約３７ｋＤ～４３ｋＤ、約３８ｋＤ～４２ｋＤ、または約３９ｋＤ～４１ｋＤの平均分子量を有する。一部の実施形態では、図１の化合物中のＰＥＧ部分は、約３０ｋＤ～約５０ｋＤ、例えば、約３５ｋＤ～約４５ｋＤ、約３７．５ｋＤ～約４２．５ｋＤの平均分子量を有する。ＰＥＧ部分が約４０ｋＤ、例えば、３７．５ｋＤ～４２．５ｋＤ、３８ｋＤ、３９ｋＤ、４０ｋＤ、４１ｋＤ、４２ｋＤの平均分子量を有する特定の実施形態では、化合物は、本明細書において、ＣＡ２８－２ＴＳ－ＢＦと呼称される場合がある。一部の実施形態では、図１の化合物中のＰＥＧ部分は、約１０ｋＤの平均分子量を有する。約４０ｋＤ、例えば、３７．５ｋＤ～４２．５ｋＤ、３８ｋＤ、３９ｋＤ、４０ｋＤ、４１ｋＤ、４２ｋＤの平均分子量を有する例えばＰＥＧ部分などのＣＲＭを含む化合物である特定の実施形態では、当該化合物は、例えば約１～３ｍｇ／ｋｇ、３～５ｍｇ／ｋｇ、もしくは５～１０ｍｇ／ｋｇの用量で非ヒト霊長類またはヒトにＩＶ投与または皮下投与されたとき、少なくとも約５日、例えば、約５～１０日、例えば、約５、６、７、８、９日の終末相半減期を有する。
一部の態様では、本発明は、コンプスタチン類似体に関連したクリックケミストリーの使用に関連する。「クリックケミストリー」は、当技術分野で公知であり、本発明の一部の態様において有用である。クリックケミストリーは、特定の実施形態では、アジドとアルキンの間の多用途な付加環化反応であり、数多くの有用な適用を可能にする。クリックケミストリーを実施する方法は、当該技術分野で公知であり、Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ，２００３，１１２８－１１３７；Ｍｏｓｅｓ，Ｊ．Ｅ．；Ｍｏｏｒｈｏｕｓｅ，Ａ．Ｄ．；Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２００７，１２４９－１２６２に記載されている。各文献の全内容が、参照により本明細書に援用される。クリックケミストリーは、バイオコンジュゲーションの一般的な方法であり、生体媒体中であっても高い反応性および選択性を有する。Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．；Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００１，４０，２００４－２０２１；およびＷａｎｇ，Ｑ．；Ｃｈａｎ，Ｔ．Ｒ．；Ｈｉｌｇｒａｆ，Ｒ．；Ｆｏｋｉｎ，Ｖ．Ｖ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．；Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，３１９２－３１９３を参照のこと。さらに、現在利用可能な組み換え技術および合成方法によって、ペプチド、タンパク質、細胞、ウイルス、細菌、およびタンパク質からなる、またはタンパク質を提示する他の生物学的実体へのアジドおよびアルキン－担持非標準アミノ酸の導入が可能となる。Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．；Ｖｉｎｋ，Ｍ．Ｋ．Ｓ．；Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｄ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６，１０５９８－１０６０２；Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ａ．；Ｃｒｏｐｐ，Ｔ．Ａ．；Ｍｕｋｈｅｒｊｉ，Ｍ．；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１１７８２－１１７８３を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「クリックケミストリー基」という用語は、時に、適切な第二の反応性官能基とのクリックケミストリー反応に関与することができる反応性官能基を指すために使用され、当該第二の反応性官能基もクリックケミストリー基である。第一および第二のクリックケミストリー基、またはそのような基を含む実体（例えば、分子）は、相補的と呼ばれる場合もある。相補的なクリックケミストリー基を含む第一および第二の実体、例えば分子は、クリックケミストリーパートナーと呼ばれる場合もある。クリックケミストリー基を含む実体または分子は、「クリック官能基化された」と呼ばれる場合もある。相補的なクリックケミストリーパートナーの反応によって形成される結合は、「クリックケミストリー結合」と呼ばれる場合もある。
一部の実施形態では、本発明は、例えば、パートナー分子または生体分子上の相補的部分へのコンジュゲーションのための、クリック官能基化されたコンプスタチン類似体を提供する。一部の実施形態では、相補的パートナーの分子または生体分子は、クリアランス低下部分として機能するポリマー、ペプチド、タンパク質、または分子である。一部の実施形態では、「クリック官能基化」部分は、相補的なアジド担持分子および生体分子との［３＋２］付加環化反応を受けることができるアルキンまたはアルキン誘導体である。別の実施形態では、「クリック官能基化」官能基は、相補的なアルキン担持分子および生体分子との［３＋２］付加環化反応を受けることができるアジドまたはアジド誘導体である（すなわちクリックケミストリー）。
一部の実施形態では、クリック官能基コンプスタチン類似体は、当該コンプスタチン類似体の任意の側鎖基上にアジド基を担持する。一部の実施形態では、クリック官能基コンプスタチン類似体は、リシン側鎖基上にアジド基を担持する。
一部の実施形態では、クリック官能基コンプスタチン類似体は、当該コンプスタチン類似体の任意の側鎖基上にアルキン基を担持する。一部の実施形態では、クリック官能基コンプスタチン類似体は、リシン側鎖基上にアルキン基を担持する。
一部の実施形態では、本発明は、コンプスタチン類似体、クリアランス低下部分として機能する分子、およびトリアゾールリンカーを含む、コンプスタチンコンジュゲートを提供する。一部の実施形態では、トリアゾールリンカーは、コンプスタチンコンジュゲートと、クリアランス低下部分として機能する分子との間のクリックコンジュゲーションケミストリーの結果である。一部の実施形態では、ＣＲＭは、本明細書に開示される任意のＣＲＭであってもよい。例えば、ＣＲＭは、ＰＥＧ、ポリペプチド、またはＰＯＺであってもよい。
一部の実施形態では、本発明は、コンプスタチン類似体、ＰＥＧ部分、およびトリアゾールリンカーを含む、コンプスタチンコンジュゲートを提供する。一部の実施形態では、トリアゾールリンカーは、コンプスタチンコンジュゲートと、ＰＥＧとの間のクリックコンジュゲーションケミストリーの結果である。
一部の実施形態では、本発明は、コンプスタチン類似体、ポリオキサゾリン部分、およびトリアゾールリンカーを含む、コンプスタチンコンジュゲートを提供する。一部の実施形態では、トリアゾールリンカーは、コンプスタチンコンジュゲートと、Ｐポリオキサゾリンとの間のクリックコンジュゲーションケミストリーの結果である。
一部の実施形態では、コンプスタチン類似体と別の部分との間のクリックケミストリーは、遷移金属で触媒される。「クリック」反応を触媒する銅含有分子としては限定されないが、銅線、臭化銅（ＣｕＢｒ）、塩化銅（ＣｕＣｌ）、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）、硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、酢酸銅（Ｃｕ２（ＡｃＯ４）、ヨウ化銅（ＣｕＩ）、［Ｃｕ（ＭｅＣＮ）４］（ＯＴｆ）、［Ｃｕ（ＭｅＣＮ）４］（ＰＦ６）、コロイド状銅源、および固定銅源が挙げられる。一部の実施形態では、例えばルテニウム他のなどの金属である。還元剤ならびに有機金属および無機金属結合錯体を、金属触媒とのコンジュゲーションに使用することもでき、限定されないが、アスコルビン酸ナトリウム、トリス（トリアゾリル）アミン錯体、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、スルホン化バソフェナントロリン錯体、およびベンズイミダゾール系錯体が挙げられる。
一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、無金属クリックケミストリー（無銅クリックケミストリーとしても知られる）を使用して他の部分にコンジュゲートされ、無金属組成物またはコンジュゲートが得られる。銅補助クリックケミストリー（ＣｕＡＣＣ）としても知られる標準的なクリックケミストリーとは対照的に、無金属クリックケミストリーは、ひずみのある環状アルキンまたはアルキン前駆体、例えばオキサノルボルナジエンと、アジド基との間で発生する。その名前が示すように、反応を発生させるための金属触媒は必要ではない。そのようなケミストリーの例としては、シクロオクチン誘導体が関与する反応（Ｃｏｄｅｌｌｉ，ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００８，１３０，１１４８６－１１４９３；Ｊｅｗｅｔｔ，ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１０，１３２，３６８８－３６９０；Ｎｉｎｇ，ｅｔ．ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００８，４７，２２５３－２２５５）、ジフルオロ－オキサノルボルネン誘導体が関与する反応（ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ，ｅｔ．ａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００７，８，１５０４－１５０８）、ニトリル酸化物誘導体が関与する反応（Ｌｕｔｚ，ｅｔ．ａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００９，４２，５４１１－５４１３）が挙げられる。特定の実施形態では、無金属クリックケミストリー反応は、無金属［３＋２］付加環化反応、Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応、またはチオール－アルケンラジカル付加反応である。例示的なクリックケミストリー反応およびクリックケミストリー基は、例えば、Ｊｏｅｒｇ Ｌａｈａｎｎ，Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ，ＩＳＢＮ ９７８－０－４７０－６９９７０－６；Ｂｅｃｅｒ，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ａｎｄ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｅｙｏｎｄ Ｍｅｔａｌ－Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００９）４８：４９００－４９０８に記載されている。特定の実施形態では、クリックケミストリー基は、ジアリールシクロオクチンを含む。
無金属クリックケミストリーの特定の例を、以下のスキームに示す。
Figure 2022539238000045
特定の無金属クリックケミストリーは、文献において公知である。例としては、４－ジベンゾシクロオクチノール（ＤＩＢＯ）
Figure 2022539238000046
 （Ｎｉｎｇ ｅｔ．ａｌ；Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ，２００８，４７，２２５３より）、二フッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯまたはＤＦＯ）
Figure 2022539238000047
 （Ｃｏｄｅｌｌｉ，ｅｔ．ａｌ．；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１１４８６－１１４９３より）、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）
Figure 2022539238000048
 （Ｊｅｗｅｔｔ ｅｔ．ａｌ．；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０，１３２，３６８８より）、またはビシクロノニン（ＢＣＮ）
Figure 2022539238000049
 （Ｄｏｍｍｅｒｈｏｌｔ，ｅｔ．ａｌ．；Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ，２０１０，４９，９４２２－９４２５より）、またはジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）が挙げられる。
Figure 2022539238000050
ＤＢＣＯとアジドの反応を含む反応スキームを以下に示す。
Figure 2022539238000051
上記のスキームにおいて様々な実施形態では、Ａは、コンプスタチン類似体部分を含むか、またはコンプスタチン類似体部分からなってもよく、およびＢは、例えば、ＰＥＧまたはＰＯＺまたはポリペプチドなどのポリマーなどのＣＲＭを含むか、またはＣＲＭからなってもよく、または、Ｂは、コンプスタチン類似体部分を含むか、またはコンプスタチン類似体部分からなってもよく、およびＡは、例えば、ＰＥＧまたはＰＯＺまたはポリペプチドなどのポリマーなどのＣＲＭを含むか、またはＣＲＮからなってもよい。
一部の実施形態では、「無金属クリック官能基化」部分は、金属触媒を使用することなく、相補的なアジド担持分子および生体分子との［３＋２］付加環化反応を受けることができるアセチレンまたはアセチレン誘導体である。
一部の実施形態では、無金属クリックケミストリー試薬のＲ基およびＲ’基は、コンプスタチン類似体、またはコンプスタチン類似体がコンジュゲートされ得る本明細書に記載される任意の分子である。一部の実施形態では、かかるコンプスタチン類似体は、リシン側鎖上にクリック官能基化部分を担持する。一部の実施形態では、かかるコンプスタチン類似体は、リンカーを介してクリック官能基化部分に結合される。一部の実施形態では、かかるコンプスタチン類似体は、ＡＥＥＡｃを介してクリック官能基化部分に結合される。
一部の実施形態では、クリックケミストリー試薬は、ＤＢＣＯを含む。試薬の例およびその使用例は、以下に記載される：
Figure 2022539238000052
ＤＢＣＯ－酸。一部の実施形態では、ＤＢＣＯ－酸を使用して、アミン含有部分と反応してもよい。
Figure 2022539238000053
ＤＢＣＯ－ＮＨＳエステル（上記）またはＤＢＣＯ－スルホ－ＮＨＳエステル（以下）を使用して、ＤＢＣＯ官能基を、例えば、コンプスタチン類似体またはリシン残基を含むポリペプチドなどのアミン含有分子に組み込んでもよい。
Figure 2022539238000054
Figure 2022539238000055
ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル。一部の実施形態では、そうした試薬は、利用可能なアミン官能基との反応によるＤＢＣＯ部分の導入に有用である。一部の態様では、親水性スペーサーとしてのＰＥＧ鎖の存在が、例えば溶解性の増加または可塑性の提供に有用であり得る。
Figure 2022539238000056
ＤＢＣＯ－アミン。一部の実施形態では、クリックケミストリー試薬は、カルボニル／カルボキシル反応性ジベンジルシクロオクチンを含み、これは、酸、活性エステル、および／またはアルデヒドと反応し得る。
特定の実施形態では、クリックケミストリー反応は、以下に示されるシクロオクチンを含む。
Figure 2022539238000057
特定の実施形態では、クリックケミストリー反応は、ニトロンとシクロオクチンとの間の反応（例えば、Ｎｉｎｇ，Ｘｉｎｇｈａｉ；Ｔｅｍｍｉｎｇ，Ｒｉｎｓｋｅ Ｐ．；Ｄｏｍｍｅｒｈｏｌｔ，Ｊａｎ；Ｇｕｏ，Ｊｕｎ；Ａｎｉａ，Ｄａｎｉｅｌ Ｂ．；Ｄｅｂｅｔｓ，Ｍａｒｊｏｋｅ Ｆ．；Ｗｏｌｆｅｒｔ，Ｍａｒｇｒｅｅｔ Ａ．；Ｂｏｏｎｓ，Ｇｅｅｒｔ－Ｊａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）．“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｔｒａｉｎ－Ｐｒｏｍｏｔｅｄ Ａｌｋｙｎｅ－Ｎｉｔｒｏｎｅ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ”．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ４９（１７）：３０６５を参照）、アルデヒドとケトンからのオキシム／ヒドラゾンの形成、テトラジンライゲーション（例えば、Ｂｌａｃｋｍａｎ，Ｍｅｌｉｓｓａ Ｌ．；Ｒｏｙｚｅｎ，Ｍａｋｓｉｍ；Ｆｏｘ，Ｊｏｓｅｐｈ Ｍ．（２００８）．“Ｔｈｅ Ｔｅｔｒａｚｉｎｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ：Ｆａｓｔ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｉｎｖｅｒｓｅ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３０（４１）：１３５１８－９）、テトラゾールライゲーション、イソニトリル系のクリック反応（例えば、Ｓｔａｃｋｍａｎｎ，Ｈｅｎｎｉｎｇ；Ｎｅｖｅｓ，ＡｎｄｒＡＣＡ．；Ｓｔａｉｒｓ，Ｓｈａｕｎ；Ｂｒｉｎｄｌｅ，Ｋｅｖｉｎ Ｍ．；Ｌｅｅｐｅｒ，Ｆｉｎｉａｎ Ｊ．（２０１１）．“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｉｓｏｎｉｔｒｉｌｅ－ｂａｓｅｄ ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”．Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９（２１）：７３０３を参照）、およびクアドリシクランライゲーション（例えば、Ｓｌｅｔｔｅｎ，Ｅｌｌｅｎ Ｍ．；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃａｒｏｌｙｎ Ｒ．（２０１１）．“Ａ Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｑｕａｄｒｉｃｙｃｌａｎｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３３（４４）：１７５７０－３を参照）を含む。特定の実施形態では、クリックケミストリー反応は、シュタウディンガーライゲーション（ホスフィン－アジド）である。
任意のコンプスタチン類似体を改変して、様々な実施形態において、クリックケミストリー基を組み込んでもよい。例えば、配列番号３～３６、３７、６９、７０、７１、または７２のいずれかの配列を含むコンプスタチン類似体がそのように改変されてもよい。一部の実施形態では、任意のかかる配列はさらにリシン残基、またはＡＥＥＡｃ－Ｌｙｓ部分を例えばＣ末端に含む。一部の実施形態では、クリックケミストリー基は、ペプチド合成後に組み込まれる。例えば、Ｌｙｓ側鎖を、アジド酢酸と反応させ、クリックケミストリー基としてアジド部分を組み込んでもよい。一部の実施形態では、クリックケミストリー基は、環化後に組み込まれ、および一部の実施形態では、Ｎ末端および／またはＣ末端でのブロッキング部分の付加後に組み込まれる。一部の実施形態では、クリックケミストリー基は、ペプチド合成中に組み込まれる。例えば、クリックケミストリー基を含む側鎖を含むアミノ酸を、コンプスタチン類似体の合成に使用してもよい。様々なそうしたアミノ酸が、例えば、ＡＡＰＰＴｅｃ（ケンタッキー州ルイビル）、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍＢＨ（ドイツ、ジェナ）などの多くの供給源から市販されている。一部の態様では、クリックケミストリー官能基化コンプスタチン類似体を作製する方法が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、コンプスタチン類似体およびクリックケミストリー試薬を含む組成物が提供される。クリックケミストリー試薬は、例えば、当技術分野で公知の任意のクリックケミストリー基などのクリックケミストリー基を導入するために、コンプスタチン類似体を含む化合物のアミノ酸側鎖または末端と反応することができる任意の分子であってもよい。一部の態様では、組成物は、適切な条件下（適切な触媒、光（例えば、ＵＶ）を提供することを含み得る）でインキュベートされて、クリックケミストリー官能基でコンプスタチン類似体を官能基化してもよい。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるものを含むがこれに限定されない任意のクリックケミストリー基を含む、コンプスタチン類似体を提供する。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体を作製する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、クリックケミストリー反応が発生するのに適した条件下で、第一のクリックケミストリー基を含むコンプスタチン類似体と、相補的なクリックケミストリー基を含むＣＲＭとを混合することを含む。追加工程は、得られたコンジュゲートを精製する工程を含んでもよい。一部の実施形態では、精製工程は、例えば、適切なスカベンジャーを用いて、少なくともいくらかの未反応構成要素を除去する工程を含む。
一部の実施形態では、クリックケミストリー反応を使用して、二つ以上のＣＲＭを結合させ、そのうち少なくとも二つは、自身にコンプスタチン類似体部分が付加されている。コンプスタチン類似体部分は、様々な実施形態において、同一であっても異なっていてもよい。コンプスタチン類似体部分は、クリックケミストリー反応を介してＣＲＭに結合されてもよく、または結合されなくてもよい。例えば、一部の実施形態では、第一の末端に第一のクリックケミストリー基、および第二の末端にＮＨＳエステルを含む第一のヘテロ二官能性ＰＥＧが、ＮＨＳエステルを介してコンプスタチン類似体部分に結合される。別の反応において、第一の末端に第二のクリックケミストリー基、および第二の末端にＮＨＳエステルを含む第二のヘテロ二官能性ＰＥＧが、ＮＨＳエステルを介してコンプスタチン類似体部分に結合される。次いで得られた二つの化合物を、クリックケミストリー反応を介して反応させ、二つのコンプスタチン類似体部分を含むより大きな分子を形成させる。ＰＥＧは、ＣＲＭの例として言及されているが、当該方法は、任意のＣＲＭで使用され得ることが理解されたい。例えば、一部の実施形態では、当該方法は、例えばＨＳＡもしくはその一部分、またはアルブミンもしくはアルブミン結合ペプチド、または抗体もしくはその一部などのポリペプチドを含むＣＲＭで使用され得る。一部の実施形態では、当該方法は、ＰＯＺで使用され得る。
クリックケミストリー基を含むコンプスタチン類似体は、様々な用途を有する。一部の実施形態では、第一のクリックケミストリー基を含むコンプスタチン類似体は、相補的なクリックケミストリー基を含む任意の実体と反応する。相補的クリックケミストリー基を含む実体は、例えば、標識（例えば、フルオロフォア、蛍光タンパク質、放射性同位体など）、アフィニティ試薬、抗体、標的化部分、金属、粒子などを含んでもよい。一部の実施形態では、クリックケミストリー基を使用して、コンプスタチン類似体部分を表面に付加し、この場合において当該表面は、相補的クリックケミストリー基を含むか、または相補的クリックケミストリー基を含むように官能基化される。一部の実施形態では、表面は、センサーのためであり、例えば、Ｃ３の捕捉／検出のための表面またはセンサーである。一部の実施形態では、表面は、（例えば、体外で）血液と接触し得るか、または対象の身体内に一時的にもしくは永久的に移植され得る（例えば、人工装具または薬剤送達デバイス）、医療機器、チューブ、膜、貯蔵部、インプラント、またはその他の材料の一部を形成する。一部の実施形態では、表面は、コンプスタチン類似体で官能基化され、その上での補体活性化を低下させる。一部の実施形態では、機器またはチューブは、例えば外科手術中の透析用など、血液を循環させるために使用される。一部の実施形態では、機器は、血液透析装置または体外循環支持ユニットである。そうしたコンプスタチン類似体官能基化デバイスおよびその作製方法が、本明細書に提供される。
本発明の一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、細胞反応性官能基およびＣＲＭの両方を含む。一部の態様では、本発明は、上述の細胞反応性コンプスタチン類似体のいずれかの分子のバリアントを提供するものであり、この場合において細胞反応性の官能基または部分は、少なくとも５００ダルトン、例えば少なくとも１，５００ダルトン、最大で約１００，０００ダルトン（例えば、約２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、または１００，０００ダルトン）の分子量を有する（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分（例えば、本明細書に記載されるＰＥＧのいずれか）または他のポリマー（例えば、ＰＯＺ、ポリペプチド）により置換される。一部の実施形態では、化合物または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分（または他のポリマー、例えばＰＯＺまたはポリペプチド）の平均分子量は、少なくとも２０，０００ダルトン、最大約１００，０００ダルトン、１２０，０００ダルトン、１４０，０００ダルトン、１６０，０００ダルトン、１８０，０００ダルトン、または２００，０００ダルトンである。したがって、例えば使用されるコンプスタチン類似体部分などの細胞反応性コンプスタチン類似体、およびコンプスタチン類似体部分が細胞反応性部分に付加される結合に関する本明細書に記載の教示は、長時間作用型コンプスタチン類似体に適用することができ、および長時間作用型コンプスタチン類似体は、上述のようにＡ－Ｌ－Ｍで示される構造のいずれかを有することができ、この場合においてＡは、クリアランス低下部分（例えば、本明細書に記載されるクリアランス低下部分のいずれか）を含み、さらにこの場合において、本明細書においてＬ（またはＬＰ１、ＬＰ２、またはＬＰ３）と示される連結部分を介してＡに付加されるコンプスタチン類似体部分Ｍが、１、２またはそれ以上（例えば３、４、５、６、７、８）存在してもよい。コンプスタチン類似体部分は、その配列が配列番号３～３６、３７、６９、７０、７１、もしくは７２、またはそのバリアント（例えば、本明細書に記載される任意のバリアント）のいずれかを含み、任意でＮ末端、Ｃ末端またはその両方で一つ以上のアミノ酸により伸長されるペプチドを含んでもよく、この場合において当該アミノ酸の少なくとも一つは、例えば一級アミンもしくは二級アミン（例えば、Ｌｙｓ）、スルフヒドリル基、スルフヒドリル基、カルボキシル基（カルボン酸基として存在してもよい）、グアニジノ基、フェノール基、インドール環、チオエーテル、またはイミダゾール環などの反応性官能基を含む側鎖を有し、それらは、ＣＲＭを含む部分と、コンプスタチン類似体のコンジュゲーションを促進する（コンジュゲーションの後、そうした反応性官能基が反応して結合を形成すると理解される）。さらに、配列番号３～３６、３７、６９、７０、７１、もしくは７２、またはそれらのバリアントのいずれかを含むコンプスタチン類似体部分は、Ｎ末端、Ｃ末端またはその両方で一つ以上のアミノ酸により伸長され、この場合において当該アミノ酸のうちの少なくとも一つは、反応性官能基を含む側鎖を有し、かかる一つ以上のアミノ酸の伸長は、硬直性または可塑性のスペーサー部分によってコンプスタチン類似体部分の環状部分から分離されてもよく、スペーサー部分は、例えば、置換もしくは非置換、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖、オリゴ（エチレングリコール）鎖、および／または本明細書においてＬ（またはＬＰ１、ＬＰ２、もしくはＬＰ３）により示される他の部分のいずれかを含む。
例示的な長時間作用型コンプスタチン類似体は、以下に記載され、この場合においてｎは、約５００、１，０００、１，５００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、および１００，０００ダルトンの平均分子量を提供するのに充分である。一部の実施形態では、ｎは、約２０，０００ダルトンから最大約１００，０００ダルトン、１２０，０００ダルトン、１４０，０００ダルトン、１６０，０００ダルトン、１８０，０００ダルトン、または２００，０００ダルトンの平均分子量を提供するのに充分である。
（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣ（＝Ｏ）－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－ＮＨ２）（配列番号５８）
Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌｙｓ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＮＨ２（配列番号５９）
Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＮＨ２（配列番号６０）。
Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－（Ｇｌｙ）５－Ｌｙｓ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＮＨ２（配列番号６１）
Ａｃ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣ（＝Ｏ）Ｌｙｓ－（Ｇｌｙ）５－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ２）（配列番号６２）
Ａｃ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣ（＝Ｏ）Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ２）（配列番号６３）
配列番号５８では、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎは、アミド結合を介してＮ末端アミノ酸に結合される。配列番号５９～６３では、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分は、アミド結合を介してＬｙｓ側鎖に結合される。したがって、上述のように、配列番号５９、６０、および６１のＣ末端のＮＨ２は、ペプチドのＣ末端のアミド化を表すことが理解され、配列番号６２および６３では、Ｎ末端のＡｃは、ペプチドのＮ末端のアセチル化を表すことが理解される。また当業者であれば、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分の遊離末端は、典型的には、（ＯＲ）で終結し、この場合において下線のＯは、末端（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）基中のＯ原子を表すことが認識される。（ＯＲ）は多くの場合、例えばヒドロキシル（ＯＨ）基またはメトキシ（－ＯＣＨ３）基などの部分であるが、他の基（例えば、他のアルコキシ基）も使用され得る。したがって配列番号５９は、例えば、Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌｙｓ－（Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｒ）－ＮＨ２（配列番号６４）と表されてもよく、式中、Ｒは、線形ＰＥＧの場合ではＨまたはＣＨ３のいずれかである。二官能性で分岐型または星型のＰＥＧの場合、Ｒは、分子の残りの部分を表す。さらに、反応官能基を含む部分は、本明細書に記載されるように（例えば、本明細書に記載される式のいずれかに従って）変化し得ることが理解される。例えば、配列番号６４と同じペプチド配列を含む長時間作用型コンプスタチン類似体は、以下のように表され得、その反応性官能基を含む部分は、エステルおよび／またはアルキル鎖を含む：
Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌｙｓ－（Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｍ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｒ）－ＮＨ２（配列番号６５）、
Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌｙｓ－（Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｍ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｒ）－ＮＨ２（配列番号６６）
Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌｙｓ－（Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｍ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｊ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｒ）－ＮＨ２（配列番号６７）
配列番号６５～６７において、ｍは、様々な実施形態において、１から最大約２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０、または３０の範囲であってもよい。配列番号６７において、ｊは、様々な実施形態において、１から最大約２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０、または３０の範囲であってもよい。
本明細書に記載されるように、様々な実施形態では、例えば、アミド、芳香族環（例えば、置換または非置換のフェニル）、または置換もしくは非置換のシクロアルキル構造などの他の部分が、Ｌｙｓ－（Ｃ（＝Ｏ）－と（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｒの間に組み込まれ得ることも認識される。
本発明は、配列番号５８～６７のバリアントを提供するものであり、この場合において、－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－（１Ｍｅ）Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－は、例えば配列番号３～２７、２９～３６、３７、６９、７０、７１、または７２のいずれかの任意の他のコンプスタチン類似体のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列により置き換えられるが、ただし、コンプスタチン類似体のＮ末端および／またはＣ末端に存在するブロッキング部分は、存在しなくてもよく、リンカー（ブロッキング部分を含んでもよい）により置き換えられてもよく、または対応するバリアントに存在する異なるＮ末端またはＣ末端のアミノ酸に付加されてもよい。
配列番号３～３７、６９、７０、７１、または７２のいずれかを含む任意の化合物などの任意のコンプスタチン類似体は、様々な実施形態では、そのＮ末端またはＣ末端を介して（例えば、そのＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸の側鎖、またはそのＮ末端もしくはＣ末端の近傍のアミノ酸の側鎖を介して）、直接または間接的に、反応性官能基を含む任意の部分、例えば、式Ｉ～ＸＶＩまたは式Ａ～Ｈの任意の化合物に付加され得る。
一部の実施形態では、ＣＲＭは、ヒト血清中に存在するポリペプチドもしくはその断片、または当該ポリペプチドもしくはその断片の実質的な類似バリアントを含む。一部の実施形態では、ポリペプチド、断片、またはバリアントは、５ｋＤ～１５０ｋＤ、例えば、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｋｄまたはそれ以上、例えば、１００～１２０、または１２０～１５０ｋＤの分子量を有する。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体の作製は、反応性官能基を含むコンプスタチン類似体と、ポリペプチドの一つ以上のアミノ酸側鎖とを反応させることを含み、この場合において当該側鎖は、適合した官能基を含む。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体の作製は、反応性官能基を含むコンプスタチン類似体と、ポリペプチドのＮ末端アミン基および／またはＣ末端カルボキシル基とを反応させることを含む。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体の作製は、アミン反応性官能基を含むコンプスタチン類似体と、一級アミン（例えば、リシン）を含む側鎖を有するアミノ酸、および／またはポリペプチドのＮ末端アミンとを反応させることを含む。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体の作製は、カルボキシル反応性官能基を含むコンプスタチン類似体と、ポリペプチドのＣ末端カルボキシル基とを反応させることを含む。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体部分は、ポリペプチドの各末端で、および任意で一つ以上の内部アミノ酸の側鎖に付加される。一部の実施形態では、長時間作用型コンプスタチン類似体の作製は、スルフヒドリル反応性官能基を含むコンプスタチン類似体と、ポリペプチドの一つ以上のスルフヒドリル基とを反応させることを含む。
一部の実施形態では、少なくとも一つの反応性官能基が、ポリペプチド内に導入される。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドの少なくとも一つの側鎖が改変されて、第一の反応性官能基が異なる反応性官能基に変換され、その後にコンプスタチン類似体との反応が行われる。一部の実施形態では、チオールが導入される。チオールを生体分子に導入するためのいくつかの方法が利用可能であり、これには、内在ジスルフィドの還元、ならびにアミン、アルデヒド、またはカルボン酸基のチオール基への変換が含まれる。タンパク質中のシスチンのジスルフィド架橋は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス－（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、またはトリス－（２－シアノエチル）ホスフィンによりシステイン残基へと還元され得る。アミンは、スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）との反応によって間接的にチオール基が導入され、続いて、ＤＴＴまたはＴＣＥＰを用いて３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニルコンジュゲートの還元が行われる。アミンは、スクシンイミジル アセチルチオ酢酸塩との反応によって間接的にチオール基が導入され、続いて、ほぼ中性ｐＨで、５０ｍＭヒドロキシルアミンまたはヒドラジンを用いてアセチル基の除去が行われる。アミンは、２－イミノチオランとの反応によって直接チオール基が導入されることができる。この反応は分子の全体的な電荷を保持し、遊離チオールを導入する。無チオールタンパク質中のトリプトファン残基は、メルカプトトリプトファン残基へと酸化されることができる。次いでこれを、ヨードアセトアミドまたはマレイミドによって修飾することができる。一つ以上のチオールを含むポリペプチドを、例えば、Ａｃ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ＊－Ｖａｌ－Ｔｒｐ（１－Ｍｅ）－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ＊－Ｔｈｒ－ＡＥＥＡｃ－Ｌｙｓ－（Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）５－Ｍａｌ）－ＮＨ２（配列番号６８）などのマレイミド基を含有するコンプスタチン類似体と反応させ、長時間作用型コンプスタチン類似体を作製してもよい。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、組換え産生される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも部分的に（例えば細菌において、または例えば真菌、昆虫、植物、または脊椎動物などの真核宿主細胞において）組み換え産生され、および／または少なくとも部分的に化学合成法を使用して作製される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、精製される。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、宿主細胞溶解物から精製され、または宿主細胞によって分泌された培養培地から精製される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、グリコシル化される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、グリコシル化されない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。一部の実施形態では、ポリペプチドの実質的に類似したバリアントは、例えばヒト対象などの対象の正常な免疫システムによって外来性であると認識されないように、そのバリアントであるポリペプチドに充分に類似している。一部の実施形態では、そのバリアントであるポリペプチドと比較して実質的に類似したバリアントの配列の変更は、ＭＨＣクラスＩエピトープの生成を回避するように選択される。当分野に公知の様々な方法を使用して、配列がＭＨＣクラスＩエピトープを含むかどうかを予測することができる。
一部の実施形態では、ポリペプチドまたはリンカーまたは組成物中の一つ以上のアミノ酸は、疎水性もしくは親水性であるように選択されてもよく、またはそれを含有する化合物に対して、親水性の向上をもたらすように選択されてもよく、または一部の実施形態では、疎水性の向上をもたらすように選択されてもよい。当技術分野で公知のように、「親水性」および「疎水性」という用語は、物質と水とのアフィニティの程度を指すために使用される。一部の態様では、親水性の物質は、水に溶解する傾向、水と混合する傾向、または水により湿潤する傾向にある、水に対する強いアフィニティを有する。一方で疎水性の物質は、水に対するアフィニティを実質的に欠き、水をはじき、吸収しない傾向、水に溶解しない傾向、または水と混合しない傾向、または水によって湿潤しない傾向にある。アミノ酸は、当該技術分野で公知のように、その疎水性に基づいて分類することができる。「親水性アミノ酸」の例としては、アルギニン、リシン、スレオニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、およびグリシンが挙げられる。「疎水性アミノ酸」の例としては、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンが挙げられる。特定の実施形態では、標準アミノ酸の類似体が使用され、この場合において当該類似体は、その類似体であるアミノ酸と比較して、親水性または疎水性の特性が増加または減少している。
本発明はさらに、ＣＲＭを含む二つ以上の（例えば、２～１０）コンプスタチン類似体を含む例えばコンカタマーなどの多量体を提供するものであり、この場合において得られる分子（またはそのＣＲＭ構成要素）の平均分子量は、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、と１００，０００ダルトンの間である。一部の実施形態では、得られる分子（またはそのＣＲＭ構成要素）の平均分子量は、少なくとも２０，０００ダルトン、最大約１００，０００ダルトン、１２０，０００ダルトン、１４０，０００ダルトン、１６０，０００ダルトン、１８０，０００ダルトン、または２００，０００ダルトンである。一部の実施形態では、ＣＲＭを含むコンプスタチン類似体は、上述の連結部分のいずれかを使用して連結され得る。長時間作用型コンプスタチン類似体を作製するための組成物および方法、ならびに合成における中間体は、本発明の態様である。
一部の実施形態では、コンプスタチン類似体部分を含む長時間作用型コンプスタチン類似体の総分子量は、５０ｋＤ以下である。例えば、４０ｋＤのＰＥＧを含むＬＡＣＡの場合、一部の実施形態では、コンプスタチン類似体を含む化合物の残りの部分によって与えられる分子量は、１０ｋＤ以下、例えば、１．５ｋＤ～５．０ｋＤまたは５．０ｋＤ～１０ｋＤであってもよい。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体部分を含む、ＬＡＣＡの総分子量は、４５ｋＤ～５０ｋＤである。一部の実施形態では、コンプスタチン類似体部分を含む、ＬＡＣＡの総分子量は、４０ｋＤ～４５ｋＤ、１５ｋＤ～４０ｋＤ、例えば、１５ｋＤ～２５ｋＤ、２５ｋＤ～３５ｋＤ、３５ｋＤ～４０ｋＤである。したがって本開示は、特定の分子量を有する、または特定の範囲内の分子量を有するポリマーまたはＣＲＭを含むコンプスタチン類似体を指す場合であれば、一部の実施形態では、コンプスタチン類似体の総分子量は、例えば、ポリマーまたはＣＲＭの分子量よりも１．５ｋＤ～５ｋＤ大きいか、または一部の実施形態では、ポリマーの分子量よりも５ｋＤ～１０ｋＤ大きい場合がある。例えば、ポリマーを含む化合物などの化合物の分子量とは、組成物中のかかる化合物の分子の平均分子量を指す場合もあることが理解される。
例えば、ＰＥＧ、ＰＯＺ、および／またはポリペプチドなどのポリマーの検出に有用な、および／または例えば、ＰＥＧ、ＰＯＺおよび／またはポリペプチドなどのポリマーの物理的および／または構造的な特性の測定に有用な様々な方法およびアッセイが、当分野で公知であり、望ましい場合には、これを使用して、例えば細胞反応性、長時間作用型、標的化型コンプスタチン類似体などのコンプスタチン類似体、またはコンプスタチン類似体部分を検出してもよい。例えば、凝集、溶解性、サイズ、構造、溶解特性、純度、分解生成物または汚染物質の存在、水分含量、流体力学半径などの特性の判定に有用な方法およびアッセイが利用可能である。そのような方法としては例えば、分析的遠心分離、例えば液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ－イオン交換、ＨＰＬＣサイズ排除、ＨＰＬＣ－逆相）などの様々なタイプのクロマトグラフィー、光散乱、キャピラリー電気泳動、円偏光二色性、定温熱量測定、示差走査熱量測定、蛍光、赤外線（ＩＲ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、ラマン分光法、屈折率測定法、ＵＶ／可視光分光法、質量分析法、免疫学的方法などが挙げられる。方法は組み合わされ得ることが理解される。一部の態様では、細胞反応性、長時間作用型、または標的化型コンプスタチン類似体（または細胞反応性、長時間作用型、または標的化されたコンプスタチン類似体を含む組成物）は、前述の方法のいずれかを使用して評価されたとき、本明細書に記載される一つ以上の特性を有する。一部の態様では、長時間作用型コンプスタチン類似体の検出および／または定量に有用な方法が本明細書に記述される。
（ｉｖ）標的化型コンプスタチン類似体
本発明は、標的化部分およびコンプスタチン類似体部分を含む標的化型コンプスタチン類似体を提供および／または利用するものであり、この場合において標的化部分は、標的分子に非共有結合する。一部の態様では、本発明は、本明細書に記載の細胞反応性コンプスタチン類似体に似た標的化型コンプスタチン類似体を提供するものであり、この場合において当該化合物は、細胞反応性部分に加えて、または細胞反応性部分の代わりに、標的化部分を含む。標的化部分は、例えば、標的分子に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、ペプチド、核酸（例えば、アプタマー）、炭水化物、低分子、または超分子複合体を含み得る。一部の実施形態では、標的分子に対する標的化部分のアフィニティ（平衡解離定数、Ｋｄによって測定される）は、１０－３Ｍ以下、例えば、生理学的条件下などの検証される条件下で、１０－４Ｍ以下、１０－５Ｍ以下、１０－６Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、または１０－９Ｍ以下である。
標的化部分が抗体である本発明の実施形態では、抗体は、結合能力を維持する任意の免疫グロブリンまたはその誘導体であってもよく、または免疫グロブリン結合ドメインに対して相同であるか、または概ね相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質であってもよい。そのようなタンパク質は、天然源から誘導されてもよく、または部分的にもしくは完全に合成生産されてもよい（例えば、組換えＤＮＡ技術、化学合成などを使用する）。抗体は、例えば、ヒト、齧歯類、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどの任意の種の抗体であってもよい。抗体は、以下のヒトクラスのいずれかを含む、任意の免疫グロブリンクラスの一種であってもよい：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ。本発明の様々な実施形態において、抗体は、例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（一本鎖可変）、または抗原結合部位を保持する他の断片、または組換え産生された断片を含む組換え産生されたｓｃＦｖ断片などの抗体の断片であってもよい。例えば、Ａｌｌｅｎ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．２，７５０－７６５，２００２、およびその中の参照文献を参照のこと。一価抗体、二価抗体、または多価抗体を使用することができる。抗体は、例えば、げっ歯類起源の可変ドメインが、ヒト起源の定常ドメインに融合されており、それに伴いげっ歯類抗体の特異性が保持されている、キメラ抗体であってもよい。一部の実施形態では、ヒト抗体またはその一部分は、例えば、ゲノムがヒト免疫グロブリン遺伝子を組み込んでいる齧歯類において、例えばファージディスプレイなどのディスプレイ技術を使用して作製される。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒト種（例えば、マウス）に由来する一つ以上の相補性決定領域をヒト抗体配列に移植することによって作製される。抗体は、部分的または完全にヒト化されてもよい。例えば、本発明で使用される標的化部分の取得に使用され得る、様々なヒト化抗体の取得方法の概要に関しては、Ａｌｍａｇｒｏ ＪＣ，Ｆｒａｎｓｓｏｎ Ｊ．Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－３３（２００８）を参照のこと。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよいが、本発明の目的に対しては、モノクローナル抗体が概して好ましい。本発明の特定の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２断片またはＦ（ａｂ’）断片が使用され、一方で他の実施形態では、Ｆｃドメインを含む抗体が使用される。事実上、すべての対象分子に特異的に結合する抗体を作製する方法が、当分野に公知である。例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、（分子またはその抗原性断片への免疫化の後に）抗体を産生する動物の血液または腹水などの天然源から精製することができ、または細胞培養において組み換え産生させることもできる。例えば消化、ジスルフィド還元、または合成による抗体断片の作製方法が、当分野に公知である。
本発明の様々な実施形態では、標的化部分は、抗原－抗体相互作用以外の機構を介して標的分子に特異的に結合する任意の分子であり得る。こうした標的化部分は、「リガンド」と呼称される。例えば、本発明の様々な実施形態では、リガンドは、ポリペプチド、ペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、炭水化物、脂質もしくはリン脂質、または低分子であり得る。一部の実施形態では、低分子は、天然か、人工的に作製されたかにかかわらず、比較的低い分子量を有し、タンパク質、ポリペプチド、核酸、または脂質ではなく、典型的には、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を伴い、および典型的には複数の炭素－炭素結合を有する、有機化合物である。概して、アプタマーは、特定のタンパク質に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、任意で一つ以上の修飾ヌクレオシド（例えば、５つの標準塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）以外の塩基もしくは糖）、もしくはＲＮＡおよびＤＮＡに最も普遍的に存在する糖（リボースおよびデオキシリボース）を含むＲＮＡまたはＤＮＡ、または例えばヌクレアーゼ分解に対する高い抵抗性を与えることにより分子を安定化させる改変ヌクレオシド間結合（非ホスホジエステル結合）を含むＤＮＡまたはＲＮＡ）である。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、最大約１００ヌクレオシドの長さ、例えば、１２～１００ヌクレオシドの長さである。アプタマーは、ＳＥＬＥＸと呼ばれるインビトロ進化プロセスを使用して誘導することができ、対象タンパク質に特異的なアプタマーを取得する方法は当技術分野で公知である。例えば、Ｂｒｏｄｙ Ｅ Ｎ，Ｇｏｌｄ Ｌ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００ Ｍａｒｃｈ；７４（１）：５－１３を参照のこと。一部の実施形態では、ペプチド核酸またはロック核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）が使用される。
本発明の特定の実施形態では、標的化部分は、ペプチドを含む。一部の実施形態では、対象標的分子に結合するペプチドは、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイなどのディスプレイ技術を使用して特定される。
低分子をリガンドとして使用することができる。そのようなリガンドを特定する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、コンビナトリアルライブラリーを含む低分子ライブラリーのインビトロスクリーニング、および例えば、タンパク質の凹面（ポケット）に結合する小さな有機化合物を特定するコンピュータベースのスクリーニングは、多くの対象タンパク質に対する低分子リガンドを特定することができる（Ｈｕａｎｇ，Ｚ．，Ｐｈａｒｍ．＆ Ｔｈｅｒ．８６：２０１－２１５，２０００）。
本発明の特定の実施形態では、標的化部分は、典型的には担体として使用され、抗体産生の目的で抗原にコンジュゲートされるタンパク質または分子ではない。例としては、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシガンマグロブリン、およびジフテリア毒素などの担体タンパク質または担体分子が挙げられる。本発明の特定の実施形態では、標的化部分は、免疫グロブリン分子のＦｃ部分ではない。一部の実施形態では、標的化部分は、共有結合または非共有結合される一つ以上の追加部分を含む複合体の一部である。
本発明の様々な実施形態では、標的分子は、細胞により産生される任意の分子（細胞表面上に発現される任意の形態、または少なくとも部分的に細胞外修飾により生じるその改変型）であり得る。一部の実施形態では、標的分子は、組織内または組織上に存在する細胞外物質である。一部の実施形態では、標的分子は、特定の疾患もしくは生理学的状態の特徴、または一つ以上の細胞型もしくは組織型の特徴である。標的分子は多くの場合、細胞表面に少なくとも部分的に存在する分子であり（例えば、膜貫通型タンパク質または別手段により膜に結合したタンパク質）、それにより当該分子の少なくとも一部は、例えば抗体などの細胞外結合剤による結合がアクセス可能となる。標的分子は、細胞型特異的であり得るが、必ずではない。例えば、細胞型特異的な標的分子は、多くの場合、多数の他の細胞型上よりも、または多数の他の細胞型中よりも、特定の細胞型上または特定の細胞型中で高レベルで存在するタンパク質、ペプチド、ｍＲＮＡ、脂質、または炭水化物である。一部の例では、細胞型特異的な標的分子は、特定の対象の細胞型上または細胞型中でのみ、検出可能なレベルで存在する。しかしながら、有用な細胞型特異的標的分子は、細胞型特異的であるとみなされるために、対象の細胞型に対して完全に特異的である必要はないことが理解される。一部の実施形態では、特定の細胞型に対する細胞型特異的標的分子は、例えば、複数（例えば、５～１０以上）の異なる組織または器官に由来する細胞を含有する混合物からなり得る、参照の細胞群よりも、当該細胞型において少なくとも３倍高いレベルで発現される。一部の実施形態では、細胞型特異的標的分子は、参照群における平均発現よりも少なくとも４～５倍、５～１０倍、または１０倍よりも高いレベルで存在する。一部の実施形態では、細胞型特異的標的分子の検出または測定により、当業者は、多くの、最大の、またはすべての他の細胞型から、対象の細胞型を識別することが可能となる。概してほとんどの標的分子の存在および／または存在量は、例えばノーザンブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＴ－ＰＣＲ、シーケンシング、例えばイムノブロッティング、免疫学的検出（例えば、免疫組織化学法）、または例えば蛍光標識抗体を用いた染色後の蛍光検出（例えば、ＦＡＣＳを使用する）などの免疫学的方法、オリゴヌクレオチドもしくはｃＤＮＡのマイクロアレイまたは膜アレイ、タンパク質マイクロアレイ分析、質量分析法などの一つ以上の標準的な技術を使用して判定され得る。
一部の実施形態では、標的分子は、チャンネル、トランスポーター、受容体、または細胞表面に少なくとも部分的に露出される他の分子である。一部の実施形態では、標的分子は、アニオントランスポーターまたは水チャネル（例えば、アクアポリンタンパク質）である。
一部の実施形態では、標的分子は、例えばグリコホリン（例えば、グリコホリンＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤ）またはバンド３など，赤血球の表面で少なくとも部分的に露出されｒｕタンパク質である。
一部の実施形態では、標的分子は、内皮細胞の表面で少なくとも部分的に露出されるタンパク質である。一部の実施形態では、標的分子は、正常で健康な血管系の表面に存在する。一部の実施形態では、標的分子は、活性化された内皮細胞の表面に存在する。一部の実施形態では、標的分子は、活性化された内皮細胞の表面に存在するが、活性化されていない内皮細胞の表面には存在しない。一部の実施形態では、標的分子は、その発現または曝露が、例えば傷害または炎症などの刺激によって誘導される分子である。一部の実施形態では、標的分子は、標的分子を発現する細胞を含有する移植を受けるレシピエントによって、「非自己」として認識されるであろう。一部の実施形態では、標的分子は、それに対する抗体がヒトにおいて普遍的に存在する炭水化物異種抗原である。一部の実施形態では、炭水化物は、血液群抗原を含む。一部の実施形態では、炭水化物は、異種抗原、例えば、アルファ－ｇａｌエピトープ（Ｇａｌａｌｐｈａ１－３Ｇａｌｂｅｔａ１－（３）４ＧｌｃＮＡｃ－Ｒ）（例えば、Ｍａｃｈｅｒ ＢＡ ａｎｄ Ｇａｌｉｌｉ Ｕ．Ｔｈｅ Ｇａｌａｌｐｈａ１，３Ｇａｌｂｅｔａ１，４ＧｌｃＮＡｃ－Ｒ（ａｌｐｈａ－Ｇａｌ）ｅｐｉｔｏｐｅ：ａ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｏｆ ｕｎｉｑｕｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１７８０（２）：７５－８８（２００８）を参照のこと）を含む。
本発明の一部の実施形態では、コンプスタチン類似体は、標的化部分とＣＲＭの両方を含む。
一部の実施形態では、標的化型コンプスタチン類似体は、複数の標的化部分を含み、それらは同一であっても異なっていてもよい。異なる標的化部分は、同じ標的分子に結合してもよく、または異なる標的分子に結合してもよい。本発明は、標的化部分、コンプスタチン類似体、またはその両方に関して多価である、標的化型コンプスタチン類似体を提供する。
概して本発明は、コンプスタチン類似体部分と標的化部分を含む化合物を作製する任意の方法、および得られた化合物を包含する。一部の実施形態では、標的化型コンプスタチン類似体は、本明細書に記載される方法と概ね類似した方法を使用して作製されてもよく、この場合において標的化部分は、細胞反応性部分の代わりに、または細胞反応性部分に加えて使用される。一部の実施形態では、標的化部分としてのペプチドを含む標的化型コンプスタチン類似体は、コンプスタチン類似体部分とペプチド標的化部分を含むポリペプチド鎖として合成される。任意で、ポリペプチド鎖は、コンプスタチン類似体部分と標的化部分との間に一つ以上のスペーサーペプチドを含む。
一部の実施形態では、標的化型コンプスタチン類似体は、同じアミノ酸配列（そして妥当な場合には一つ以上のブロッキング部分）を有し、しかし標的化部分を含まない対応するコンプスタチン類似体の活性の少なくとも約１０％、２０％、または３０％のモル活性、例えば、３０％～４０％、３０％～５０％、３０％～６０％、３０％～７０％、３０％～８０％、３０％～９０％、またはそれ以上のモル活性を有する。標的化型コンプスタチン類似体が、複数のコンプスタチン類似体部分を含む一部の実施形態では、標的化型コンプスタチン類似体のモル活性は、当該コンプスタチン類似体部分の活性の合計の少なくとも約１０％、２０％、または３０％、例えば、３０％～４０％、３０％～５０％、３０％～６０％、３０％～７０％、３０％～８０％、３０％～９０％、またはそれ以上である。標的化型コンプスタチン類似体を作製するための組成物および方法、ならびに合成における中間体は、本発明の態様である。
（ｖ）抗体
本開示はまた、補体活性化を阻害する抗体の使用も予期される。そのような抗体は、一つ以上の補体経路タンパク質に結合し、阻害することができる。一部の実施形態では、補体活性化は、Ｃ３活性化またはＣ５活性化を阻害することによって阻害されてもよい。Ｃ３またはＣ５依存性の補体活性化は、Ｃ３またはＣ５補体阻害剤によって阻害されてもよい。例示的な剤は、抗体または抗体断片を含んでもよい。一部の実施形態では、抗体は、Ｃ３またはＣ５に結合してもよい。一部の実施形態では、抗体断片を使用して、Ｃ３またはＣ５の活性化を阻害してもよい。断片化された抗Ｃ３抗体または抗Ｃ５抗体は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’（２）、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖであってもよい。一部の実施形態では、抗Ｃ３抗体または抗Ｃ５抗体は、モノクローナルである。一部の実施形態では、抗Ｃ３抗体または抗Ｃ５抗体は、ポリクローナルである。一部の実施形態では、抗Ｃ３抗体または抗Ｃ５抗体は、脱免疫化される。一部の実施形態では、抗Ｃ３抗体または抗Ｃ５抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、エクリズマブである。
一部の実施形態では、抗Ｃ３抗体または抗Ｃ５抗体（または抗Ｃ３抗体断片もしくは抗Ｃ５抗体断片）は、Ｃ３またはＣ５に結合して、補体活性化を阻害してもよい。一部の実施形態では、抗Ｃ３抗体または抗Ｃ５抗体（または抗Ｃ３抗体断片もしくは抗Ｃ５抗体断片）は、Ｃ３またはＣ５の断片に結合して、補体活性化を阻害してもよい。一部の実施形態では、Ｃ３断片は、Ｃ３ｂである。
（ｖｉ）マイクロＲＮＡ
本開示はまた、補体活性化を阻害するマイクロＲＮＡの使用も予期される。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、植物および動物のゲノムＤＮＡから転写されるが、タンパク質に翻訳されない、高度に保存された低分子ＲＮＡ種である。天然ｍｉＲＮＡは、最初に長いヘアピン含有一次転写物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）として転写される。一次転写物は、ＤｒｏｓｈａリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素によって切断され、およそ７０ｎｔのステムループ型前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）が生成される。このｍｉＲＮＡには、「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」（標的配列に対し実質的に相補的な領域を含む）、および「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」（アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的な領域を含む）が含まれる。次いで、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが細胞質に能動的にエクスポートされ、そこでＤｉｃｅｒリボヌクレアーゼによって切断されて成熟ｍｉＲＮＡが形成される。処理されたマイクロＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれて成熟型遺伝子サイレンシング複合体を形成し、これが標的ｍＲＮＡの分解および／または翻訳抑制を誘導する。これまでに特定されたｍｉＲＮＡ配列の数は多く、そして増え続けている。見出され得る例としては例えば、“ｍｉＲＢａｓｅ：ｍｉｃｒｏＲＩＶＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ Ｓ，Ｇｒｏｃｏｃｋ ＲＪ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ Ｓ，Ｂａｔｅｍａｎ Ａ，Ｅｎｒｉｇｈｔ ＡＪ．ＮＡＲ，２００６，３４，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１４０－Ｄ１４４；“Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ Ｓ．ＮＡＲ，２００４，３２，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１０９－Ｄ１１１にある。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、治療目的で合成され、局所的に、または全身的に対象に投与されることができる。ｍｉＲＮＡは、成熟分子として、または前駆体（例えば、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）として設計および／または合成されることができる。一部の実施形態では、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ガイド鎖とパッセンジャー鎖を含み、それらは同じ長さである（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド）。一部の実施形態では、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ガイド鎖とパッセンジャー鎖を含み、それらは異なる長さである（例えば、一つの鎖は約１９ヌクレオチドであり、他方は約２１ヌクレオチドである）。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡのコード領域、５’非翻訳領域、および／または３’非翻訳領域を標的とすることができる。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、対象の内因性ｍＲＮＡと充分に配列相補性を有するヌクレオチド配列を含むガイド鎖を含み、当該内因性ｍＲＮＡとハイブリダイズし、発現を阻害する。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、例えばＣ３ ｍＲＮＡなどのＣ３転写物の標的部分に相補的である（例えば、配列番号７５の一部分に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列に対して相補的である）に対して相補的である核酸鎖を含む。標的部分は、１５～３０ヌクレオチド長、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であってもよいが、より短い標的部分、および長い標的部分も予期される。ヒトＣ３は、本明細書において特に対象となる。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号７５の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の連続したヌクレオチドに対して完全に相補的な領域を含む核酸鎖を含む。ヒトＣ３のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は当技術分野で公知であり、公的に利用可能なデータベース、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＲｅｆＳｅｑ）データベース中に見出すことができ、当該データベースにおいてそれぞれ、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＰ＿００００５５（現在のアクセッション．バージョン番号はＮＰ＿００００５５．２）およびＮＭ＿００００６４（現在のアクセッション．バージョン番号は、ＮＭ＿００００６４．３）でリスト化されている（「アミノ酸配列」とは、Ｃ３ポリペプチドの配列を指し、本文脈において「ヌクレオチド配列」とは、ゲノムＤＮＡにおいて表されているＣ３ ｍＲＮＡ配列を指す。実際のｍＲＮＡヌクレオチド配列は、ＴではなくＵを含有すると理解される）。当業者であれば、上述の配列は、補体Ｃ３プレプロタンパク質に関するものであり、切断され、したがって成熟タンパク質中には存在しないシグナル配列が含まれることを理解するであろう。ヒトＣ３遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７１８に割り当てられており、ゲノムＣ３配列は、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＧ＿００９５５７（現在のアクセッション．バージョン番号ＮＧ＿００９５５７．１）を有する。ヒトＣ３ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を、以下に示す（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿００００６４．３。ＴはＵで置換される。ＡＵＧ開始コドンは９４位に始まる下線部分）。
AGAUAAAAAGCCAGCUCCAGCAGGCGCUGCUCACUCCUCCCCAUCCUCUCCCUCUGUCCCUCUGUCCCUCUGACCCUGCACUGUCCCAGCACCAUGGGACCCACCUCAGGUCCCAGCCUGCUGCUCCUGCUACUAACCCACCUCCCCCUGGCUCUGGGGAGUCCCAUGUACUCUAUCAUCACCCCCAACAUCUUGCGGCUGGAGAGCGAGGAGACCAUGGUGCUGGAGGCCCACGACGCGCAAGGGGAUGUUCCAGUCACUGUUACUGUCCACGACUUCCCAGGCAAAAAACUAGUGCUGUCCAGUGAGAAGACUGUGCUGACCCCUGCCACCAACCACAUGGGCAACGUCACCUUCACGAUCCCAGCCAACAGGGAGUUCAAGUCAGAAAAGGGGCGCAACAAGUUCGUGACCGUGCAGGCCACCUUCGGGACCCAAGUGGUGGAGAAGGUGGUGCUGGUCAGCCUGCAGAGCGGGUACCUCUUCAUCCAGACAGACAAGACCAUCUACACCCCUGGCUCCACAGUUCUCUAUCGGAUCUUCACCGUCAACCACAAGCUGCUACCCGUGGGCCGGACGGUCAUGGUCAACAUUGAGAACCCGGAAGGCAUCCCGGUCAAGCAGGACUCCUUGUCUUCUCAGAACCAGCUUGGCGUCUUGCCCUUGUCUUGGGACAUUCCGGAACUCGUCAACAUGGGCCAGUGGAAGAUCCGAGCCUACUAUGAAAACUCACCACAGCAGGUCUUCUCCACUGAGUUUGAGGUGAAGGAGUACGUGCUGCCCAGUUUCGAGGUCAUAGUGGAGCCUACAGAGAAAUUCUACUACAUCUAUAACGAGAAGGGCCUGGAGGUCACCAUCACCGCCAGGUUCCUCUACGGGAAGAAAGUGGAGGGAACUGCCUUUGUCAUCUUCGGGAUCCAGGAUGGCGAACAGAGGAUUUCCCUGCCUGAAUCCCUCAAGCGCAUUCCGAUUGAGGAUGGCUCGGGGGAGGUUGUGCUGAGCCGGAAGGUACUGCUGGACGGGGUGCAGAACCCCCGAGCAGAAGACCUGGUGGGGAAGUCUUUGUACGUGUCUGCCACCGUCAUCUUGCACUCAGGCAGUGACAUGGUGCAGGCAGAGCGCAGCGGGAUCCCCAUCGUGACCUCUCCCUACCAGAUCCACUUCACCAAGACACCCAAGUACUUCAAACCAGGAAUGCCCUUUGACCUCAUGGUGUUCGUGACGAACCCUGAUGGCUCUCCAGCCUACCGAGUCCCCGUGGCAGUCCAGGGCGAGGACACUGUGCAGUCUCUAACCCAGGGAGAUGGCGUGGCCAAACUCAGCAUCAACACACACCCCAGCCAGAAGCCCUUGAGCAUCACGGUGCGCACGAAGAAGCAGGAGCUCUCGGAGGCAGAGCAGGCUACCAGGACCAUGCAGGCUCUGCCCUACAGCACCGUGGGCAACUCCAACAAUUACCUGCAUCUCUCAGUGCUACGUACAGAGCUCAGACCCGGGGAGACCCUCAACGUCAACUUCCUCCUGCGAAUGGACCGCGCCCACGAGGCCAAGAUCCGCUACUACACCUACCUGAUCAUGAACAAGGGCAGGCUGUUGAAGGCGGGACGCCAGGUGCGAGAGCCCGGCCAGGACCUGGUGGUGCUGCCCCUGUCCAUCACCACCGACUUCAUCCCUUCCUUCCGCCUGGUGGCGUACUACACGCUGAUCGGUGCCAGCGGCCAGAGGGAGGUGGUGGCCGACUCCGUGUGGGUGGACGUCAAGGACUCCUGCGUGGGCUCGCUGGUGGUAAAAAGCGGCCAGUCAGAAGACCGGCAGCCUGUACCUGGGCAGCAGAUGACCCUGAAGAUAGAGGGUGACCACGGGGCCCGGGUGGUACUGGUGGCCGUGGACAAGGGCGUGUUCGUGCUGAAUAAGAAGAACAAACUGACGCAGAGUAAGAUCUGGGACGUGGUGGAGAAGGCAGACAUCGGCUGCACCCCGGGCAGUGGGAAGGAUUACGCCGGUGUCUUCUCCGACGCAGGGCUGACCUUCACGAGCAGCAGUGGCCAGCAGACCGCCCAGAGGGCAGAACUUCAGUGCCCGCAGCCAGCCGCCCGCCGACGCCGUUCCGUGCAGCUCACGGAGAAGCGAAUGGACAAAGUCGGCAAGUACCCCAAGGAGCUGCGCAAGUGCUGCGAGGACGGCAUGCGGGAGAACCCCAUGAGGUUCUCGUGCCAGCGCCGGACCCGUUUCAUCUCCCUGGGCGAGGCGUGCAAGAAGGUCUUCCUGGACUGCUGCAACUACAUCACAGAGCUGCGGCGGCAGCACGCGCGGGCCAGCCACCUGGGCCUGGCCAGGAGUAACCUGGAUGAGGACAUCAUUGCAGAAGAGAACAUCGUUUCCCGAAGUGAGUUCCCAGAGAGCUGGCUGUGGAACGUUGAGGACUUGAAAGAGCCACCGAAAAAUGGAAUCUCUACGAAGCUCAUGAAUAUAUUUUUGAAAGACUCCAUCACCACGUGGGAGAUUCUGGCUGUGAGCAUGUCGGACAAGAAAGGGAUCUGUGUGGCAGACCCCUUCGAGGUCACAGUAAUGCAGGACUUCUUCAUCGACCUGCGGCUACCCUACUCUGUUGUUCGAAACGAGCAGGUGGAAAUCCGAGCCGUUCUCUACAAUUACCGGCAGAACCAAGAGCUCAAGGUGAGGGUGGAACUACUCCACAAUCCAGCCUUCUGCAGCCUGGCCACCACCAAGAGGCGUCACCAGCAGACCGUAACCAUCCCCCCCAAGUCCUCGUUGUCCGUUCCAUAUGUCAUCGUGCCGCUAAAGACCGGCCUGCAGGAAGUGGAAGUCAAGGCUGCUGUCUACCAUCAUUUCAUCAGUGACGGUGUCAGGAAGUCCCUGAAGGUCGUGCCGGAAGGAAUCAGAAUGAACAAAACUGUGGCUGUUCGCACCCUGGAUCCAGAACGCCUGGGCCGUGAAGGAGUGCAGAAAGAGGACAUCCCACCUGCAGACCUCAGUGACCAAGUCCCGGACACCGAGUCUGAGACCAGAAUUCUCCUGCAAGGGACCCCAGUGGCCCAGAUGACAGAGGAUGCCGUCGACGCGGAACGGCUGAAGCACCUCAUUGUGACCCCCUCGGGCUGCGGGGAACAGAACAUGAUCGGCAUGACGCCCACGGUCAUCGCUGUGCAUUACCUGGAUGAAACGGAGCAGUGGGAGAAGUUCGGCCUAGAGAAGCGGCAGGGGGCCUUGGAGCUCAUCAAGAAGGGGUACACCCAGCAGCUGGCCUUCAGACAACCCAGCUCUGCCUUUGCGGCCUUCGUGAAACGGGCACCCAGCACCUGGCUGACCGCCUACGUGGUCAAGGUCUUCUCUCUGGCUGUCAACCUCAUCGCCAUCGACUCCCAAGUCCUCUGCGGGGCUGUUAAAUGGCUGAUCCUGGAGAAGCAGAAGCCCGACGGGGUCUUCCAGGAGGAUGCGCCCGUGAUACACCAAGAAAUGAUUGGUGGAUUACGGAACAACAACGAGAAAGACAUGGCCCUCACGGCCUUUGUUCUCAUCUCGCUGCAGGAGGCUAAAGAUAUUUGCGAGGAGCAGGUCAACAGCCUGCCAGGCAGCAUCACUAAAGCAGGAGACUUCCUUGAAGCCAACUACAUGAACCUACAGAGAUCCUACACUGUGGCCAUUGCUGGCUAUGCUCUGGCCCAGAUGGGCAGGCUGAAGGGGCCUCUUCUUAACAAAUUUCUGACCACAGCCAAAGAUAAGAACCGCUGGGAGGACCCUGGUAAGCAGCUCUACAACGUGGAGGCCACAUCCUAUGCCCUCUUGGCCCUACUGCAGCUAAAAGACUUUGACUUUGUGCCUCCCGUCGUGCGUUGGCUCAAUGAACAGAGAUACUACGGUGGUGGCUAUGGCUCUACCCAGGCCACCUUCAUGGUGUUCCAAGCCUUGGCUCAAUACCAAAAGGACGCCCCUGACCACCAGGAACUGAACCUUGAUGUGUCCCUCCAACUGCCCAGCCGCAGCUCCAAGAUCACCCACCGUAUCCACUGGGAAUCUGCCAGCCUCCUGCGAUCAGAAGAGACCAAGGAAAAUGAGGGUUUCACAGUCACAGCUGAAGGAAAAGGCCAAGGCACCUUGUCGGUGGUGACAAUGUACCAUGCUAAGGCCAAAGAUCAACUCACCUGUAAUAAAUUCGACCUCAAGGUCACCAUAAAACCAGCACCGGAAACAGAAAAGAGGCCUCAGGAUGCCAAGAACACUAUGAUCCUUGAGAUCUGUACCAGGUACCGGGGAGACCAGGAUGCCACUAUGUCUAUAUUGGACAUAUCCAUGAUGACUGGCUUUGCUCCAGACACAGAUGACCUGAAGCAGCUGGCCAAUGGUGUUGACAGAUACAUCUCCAAGUAUGAGCUGGACAAAGCCUUCUCCGAUAGGAACACCCUCAUCAUCUACCUGGACAAGGUCUCACACUCUGAGGAUGACUGUCUAGCUUUCAAAGUUCACCAAUACUUUAAUGUAGAGCUUAUCCAGCCUGGAGCAGUCAAGGUCUACGCCUAUUACAACCUGGAGGAAAGCUGUACCCGGUUCUACCAUCCGGAAAAGGAGGAUGGAAAGCUGAACAAGCUCUGCCGUGAUGAACUGUGCCGCUGUGCUGAGGAGAAUUGCUUCAUACAAAAGUCGGAUGACAAGGUCACCCUGGAAGAACGGCUGGACAAGGCCUGUGAGCCAGGAGUGGACUAUGUGUACAAGACCCGACUGGUCAAGGUUCAGCUGUCCAAUGACUUUGACGAGUACAUCAUGGCCAUUGAGCAGACCAUCAAGUCAGGCUCGGAUGAGGUGCAGGUUGGACAGCAGCGCACGUUCAUCAGCCCCAUCAAGUGCAGAGAAGCCCUGAAGCUGGAGGAGAAGAAACACUACCUCAUGUGGGGUCUCUCCUCCGAUUUCUGGGGAGAGAAGCCCAACCUCAGCUACAUCAUCGGGAAGGACACUUGGGUGGAGCACUGGCCCGAGGAGGACGAAUGCCAAGACGAAGAGAACCAGAAACAAUGCCAGGACCUCGGCGCCUUCACCGAGAGCAUGGUUGUCUUUGGGUGCCCCAACUGACCACACCCCCAUUCCCCCACUCCAGAUAAAGCUUCAGUUAUAUCUCAAAAAAAAAAAAAAAAA（配列番号７５）
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ヒトＣ３に加えて、一つ以上の非ヒト種、例えばカニクイザルＣ３などの非ヒト霊長類Ｃ３の発現を阻害することができる。カニクイザルＣ３遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１０２１３１４５８を割り当てられており、カニクイザルＣ３の予測アミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＸＰ＿００５５８７７７６．１およびＸＭ＿００５５８７７１９．２でリスト化されている。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ヒトＣ３転写物およびカニクイザルＣ３転写物中の同一である標的部分に対して相補的である。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、カニクイザル Ｃ３転写物中の配列とは１、２または３ヌクレオチド異なるヒトＣ３転写物の標的部分に対して相補的である。ヒトＣ３の発現を阻害するｍｉＲＮＡは、特にＣ３転写物の保存領域が標的とされている場合には、例えばラットＣ３またはマウスＣ３などの非霊長類Ｃ３の発現も阻害し得ることが理解される。
（ｖｉｉ）ｓｉＲＮＡ
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスであり、このプロセスによって、標的座位に相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、遺伝子機能を特異的に不活化することができる（Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２００１；２：１１０－１１９；Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９９；１３：１３９－１４１）。このｄｓＲＮＡ誘導型の遺伝子サイレンシングは、長いｄｓＲＮＡがリボヌクレアーゼＩＩＩ切断されることにより生成された短い二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって介在され得る（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００１；４０９：３６３－３６６およびＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００１；１５：１８８－２００）。ＲＮＡｉ介在性遺伝子サイレンシングは、配列特異的ＲＮＡの分解を介して発生すると考えられており、配列特異性は、ｓｉＲＮＡと、標的ＲＮＡ内の相補配列との相互作用によって決定される（例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１；２：２３９－２４５を参照のこと）。ＲＮＡｉは、例えば、ｓｉＲＮＡ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００１；４１１：４９４－４９８）、または折り返しステムループ構造を有する短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｓ）（Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００２；１６：９４８－９５８；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２；９９：５５１５－５５２０；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９６：５５０－５５３；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；２０：５０５－５０８）の使用を伴い得る。
本開示は、Ｃ３転写物、例えばＣ３ ｍＲＮＡ（配列番号７５）を標的とするｓｉＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、本開示のｓｉＲＮＡは、アニーリングされた相補的な一本鎖核酸分子を含む二本鎖核酸二重鎖（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７塩基対の鎖）である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、アニーリングされた相補的な一本鎖ＲＮＡを含有する短いｄｓＲＮＡである。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、アニーリングされたＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を含み、当該二重鎖のセンス鎖はＤＮＡ分子であり、当該二重鎖のアンチセンス鎖はＲＮＡ分子である。
一部の実施形態では、二重鎖ｓｉＲＮＡは、当該二重鎖の各鎖上に２または３ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、５’－リン酸基と３’－ヒドロキシル基を含有する。
一部の実施形態では、本開示のｓｉＲＮＡ分子は、一つ以上の天然核酸塩基を含み、および／または天然核酸塩基に由来する一つ以上の修飾核酸塩基を含む。例としては限定されないが、アシル保護基で保護された各アミノ基を有するウラシル、チミン、アデニン、シトシン、およびグアニン、２－フルオロウラシル、２－フルオロシトシン、５－ブロモウラシル、５－ヨードウラシル、２，６－ジアミノプリン、アザシトシン、ピリミジン類似体、例えばシュードイソシトシンおよびシュードウラシル、ならびに他の修飾核酸塩基、例えば８－置換プリン、キサンチンまたはヒポキサンチン（後者二つは天然分解産物）が挙げられる。修飾核酸塩基の例は、Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ，ＲＮＡ，２００３，９，１０３４－１０４８，Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，２１８３－２１９６およびＲｅｖａｎｋａｒ ａｎｄ Ｒａｏ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７，３１３に開示されている。
修飾核酸塩基はまた、例えばフェニル環などの一つ以上のアリール環が付加されたサイズ拡大された核酸塩基も含む。核酸塩基置換は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃａｔａｌｏｇ（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）；Ｋｒｕｅｇｅｒ ＡＴ ｅｔ ａｌ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００７，４０，１４１－１５０；Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００２，３５，９３６－９４３；Ｂｅｎｎｅｒ Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，６，５５３－５４３；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００３，７，７２３－７３３；Ｈｉｒａｏ，Ｉ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６，１０，６２２－６２７に記載されており、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ分子に有用であることが予期される。修飾核酸塩基はまた、核酸塩基とはみなされないが、例えば限定されないがコリンまたはポルフィリン誘導環などの他の部分である構造も包含する。ポルフィリン誘導塩基置換は、Ｍｏｒａｌｅｓ－Ｒｏｊａｓ，Ｈ ａｎｄ Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００２，４，４３７７－４３８０に記載されている。
一部の実施形態では、修飾核酸塩基は、任意で置換される、以下の構造のうちのいずれか一つである。
Figure 2022539238000058
一部の実施形態では、修飾核酸塩基は、蛍光性である。そのような蛍光修飾核酸塩基の例としては、以下に示されるように、フェナントレン、ピレン、スチルベン、イソキサンチン、イソザントプテリン（ｉｓｏｚａｎｔｈｏｐｔｅｒｉｎ）、テルフェニル、テルチオフェン、ベンゾテルチオフェン、クマリン、ルマジン、テザードスチルベン（ｔｅｔｈｅｒｅｄ ｓｔｉｌｌｂｅｎｅ）、ベンゾ－ウラシル、およびナフトウラシルが挙げられる。
Figure 2022539238000059
一部の実施形態では、修飾核酸塩基は、置換されない。一部の実施形態では、修飾核酸塩基は、置換される。一部の実施形態では、修飾核酸塩基は、例えば、ヘテロ原子、アルキル基、または蛍光部分、ビオチン部分もしくはアビジン部分、または他のタンパク質もしくはペプチドに結合される連結部分などを含有するよう置換される。一部の実施形態では、修飾核酸塩基は、最も古典的な意味では核酸塩基ではないが、核酸塩基と同様に機能する「ユニバーサル塩基」である。そのようなユニバーサル塩基の代表的な一例は、３－ニトロピロールである。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子は、修飾核酸塩基、および／または修飾糖に共有結合した核酸塩基を組み込むヌクレオシドを含む。修飾核酸塩基を組み込むヌクレオシドのいくつかの例としては、４－アセチルシチジン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２’－Ｏ－メチルシチジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン、ベータ、Ｄ－ガラクトシルキュエオシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、１－メチルアデノシン、１－メチルシュードウリジン、１－メチルグアノシン、ｌ－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアノシン、２－メチルアデノシン、２－メチルグアノシン、Ｎ７－メチルグアノシン、３－メチル－シチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、Ｎ６－メチルアデノシン、７－メチルグアノシン、５－メチルアミノエチルウリジン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウリジン、ベータ、Ｄ－マンノシルキュエオシン、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、５－メトキシウリジン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ－（（９－ベータ、Ｄ－リボフラノシル－２－メチルチオプリン－６－イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ－（（９－ベータ、Ｄ－リボフラノシルプリン－６－イル）－Ｎ－メチルカルバモイル）トレオニン、ウリジン－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン－５－オキシ酢酸（ｖ）、シュードウリジン、キュエオシン、２－チオシチジン、５－メチル－２－チオウリジン、２－チオウリジン、４－チオウリジン、５－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン、および２’－Ｏ－メチルウリジンが挙げられる。
一部の実施形態では、ヌクレオシドは、６’位に（Ｒ）または（Ｓ）－キラル性のいずれかを有する６’－修飾二環式ヌクレオシド類似体を含み、米国特許第７，３９９，８４５号に記載される類似体が挙げられる。一部の実施形態では、ヌクレオシドは、５’位に（Ｒ）または（Ｓ）－キラル性のいずれかを有する５’－修飾二環式ヌクレオシド類似体を含み、米国特許出願公開２００７０２８７８３１に記載される類似体が挙げられる。一部の実施形態では、核酸塩基または修飾核酸塩基は、５－ブロモウラシル、５－ヨードウラシル、または２，６－ジアミノプリンである。一部の実施形態では、核酸塩基または修飾核酸塩基は、蛍光部分との置換により修飾される。
修飾核酸塩基を作製する方法は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５７，１９１号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６８１，９４１号、第５，７５０，６９２号、第６，０１５，８８６号、第６，１４７，２００号、第６，１６６，１９７号、第６，２２２，０２５号、第６，２３５，８８７号、第６，３８０，３６８号、第６，５２８，６４０号、第６，６３９，０６２号、第６，６１７，４３８号、第７，０４５，６１０号、第７，４２７，６７２号、および第７，４９５，０８８号に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子は、一つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、この場合においてヌクレオチド中のリン酸基または連結リンは、糖または修飾糖の様々な位置に連結される。非限定的な例として、リン酸基または連結リンは、糖または修飾糖の２’、３’、４’、または５’のヒドロキシル部分に連結され得る。本明細書に記載の修飾核酸塩基を組み込むヌクレオチドも、本背景において予期される。
他の修飾糖も、ｓｉＲＮＡ分子内に組み込まれ得る。一部の実施形態では、修飾糖は、２’位に、以下のうちの一つを含む、一つ以上の置換基を含有する：－Ｆ、－ＣＦ３、－ＣＮ、－Ｎ３、－ＮＯ、－ＮＯ２、－ＯＲ’、－ＳＲ’、もしくは－Ｎ（Ｒ’）２で、式中、Ｒ’は独立して上記に定義され、本明細書に記載される通りである；－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）２；－Ｏ－（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）、－Ｓ－（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）、－ＮＨ－（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）もしくは－Ｎ（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）２；－Ｏ－（Ｃ２－Ｃ１０アルキニル）、－Ｓ－（Ｃ２－Ｃ１０アルキニル）、－ＮＨ－（Ｃ２－Ｃ１０アルキニル）もしくは－Ｎ（Ｃ２－Ｃ１０アルキニル）２；または－Ｏ－－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、もしくは－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）２、－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）で、式中、アルキル、アルキレン、アルケニルおよびアルキニルは、置換されても、置換されなくてもよい。置換基の例としては限定されないが、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、および－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２が挙げられ、式中、ｎは、１～約１０、ＭＯＥ、ＤＭＡＯＥ、ＤＭＡＥＯＥである。また本明細書において、ＷＯ２００１／０８８１９８、およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６－５０４に記載される修飾糖も予期される。一部の実施形態では、修飾糖は、置換シリル基、ＲＮＡ切断基、レポーター基、蛍光標識、インターカレーター、核酸の薬物動態特性を改善するための基、核酸の薬力学特性を改善するための基、または類似の特性を有する他の置換基から選択される一つ以上の基を含む。一部の実施形態では、修飾は、糖または修飾糖の２’、３’、４’、５’、または６’位のうちの一つ以上で行われ、これには、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または５’末端ヌクレオチドの５’位置が含まれる。
一部の実施形態では、リボースの２’－ＯＨは、以下のうちの一つを含む置換基で置換される：－Ｈ、－Ｆ、－ＣＦ３、－ＣＮ、－Ｎ３、－ＮＯ、－ＮＯ２、－ＯＲ’、－ＳＲ’、もしくは－Ｎ（Ｒ’）２で、式中、Ｒ’は独立して上記に定義され、本明細書に記載される通りである；－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）２；－Ｏ－（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）、－Ｓ－（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）、－ＮＨ－（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）もしくは－Ｎ（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）２；－Ｏ－（Ｃ２－Ｃ１０アルキニル）、－Ｓ－（Ｃ２－Ｃ１０アルキニル）、－ＮＨ－（Ｃ２－Ｃ１０アルキニル）もしくは－Ｎ（Ｃ２－Ｃ１０アルキニル）２；または－Ｏ－－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、もしくは－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）２、－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）で、式中、アルキル、アルキレン、アルケニルおよびアルキニルは、置換されても、置換されなくてもよい。一部の実施形態では、２’－ＯＨは、－Ｈ（デオキシリボース）で置換される。一部の実施形態では、２’－ＯＨは、－Ｆで置換される。一部の実施形態では、２’－ＯＨは、－ＯＲ’で置換される。一部の実施形態では、２’－ＯＨは、－ＯＭｅで置換される。一部の実施形態では、２’－ＯＨは、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＭｅで置換される。
修飾糖には、ロック核酸（ＬＮＡ）も含まれる。一部の実施形態では、ロック核酸は、以下に示される構造を有する：以下の構造のロック核酸が示されるが、式中、Ｂａは、本明細書に記載される核酸塩基または修飾核酸塩基を表し、および式中、Ｒ２ｓは、－ＯＣＨ２Ｃ４’－である。
Figure 2022539238000060
一部の実施形態では、修飾糖は、例えば、Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１０ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２７；１３２（４２）：１４９４２－１４９５０に記載されるＥＮＡである。一部の実施形態では、修飾糖は、ＸＮＡ（異種核酸）に見出されるもののいずれか、例えば、アラビノース、アンヒドロヘキシトール、トレオース、２’－フルオロアラビノース、またはシクロヘキセンである。
修飾糖には、例えばペントフラノシル糖の代わりのシクロブチル部分またはシクロペンチル部分などの糖模倣体が含まれる（例えば、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、および第５，３５９，０４４号を参照）。予期される修飾糖のいくつかには、リボース環内の酸素原子が窒素、硫黄、セレン、または炭素で置換される糖が含まれる。一部の実施形態では、修飾糖は、リボース環内の酸素原子が窒素で置換され、当該窒素が任意でアルキル基（例えば、メチル、エチル、イソプロピルなど）で置換される修飾リボースである。
修飾糖の非限定的な例にはグリセロールが含まれ、グリセロール核酸（ＧＮＡ）類似体を形成する。ＧＮＡ類似体の一例は、Ｚｈａｎｇ，Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００８，１３０，５８４６－５８４７；Ｚｈａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００５，１２７，４１７４－４１７５およびＴｓａｉ ＣＨ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００７，１４５９８－１４６０３に記載されている。ＧＮＡ誘導型の類似体の別の例は、ホルミルグリセロールの混合アセタールアミナルに基づく柔軟性核酸（ＦＮＡ）であり、Ｊｏｙｃｅ ＧＦ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８７，８４，４３９８－４４０２ ａｎｄ Ｈｅｕｂｅｒｇｅｒ ＢＤ、およびＳｗｉｔｚｅｒ Ｃ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００８，１３０，４１２－４１３に記載されている。修飾糖に関する追加の非限定的な例としては、ヘキソピラノシル（６’～４’）、ペントピラノシル（４’～２’）、ペントピラノシル（４’～３’）、またはテトロフラノシル（３’～２’）の糖が挙げられる。
修飾糖および糖模倣体は、限定されないが、以下をはじめとする当技術分野で公知の方法によって作製することができる：Ａ．Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９），２８４：２１１８；Ｍ．Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（１９９２），７５：１４１６－１４７７；Ｍ．Ｅｇｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００６），１２８（３３）：１０８４７－５６；Ａ．Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｇｎｏｓｉｓ ｔｏ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，Ｃ．Ｃｈａｔｇｉｌｉａｌｏｇｌｕ ａｎｄ Ｖ．Ｓｎｉｅｋｕｓ，Ｅｄ．，（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９９６），ｐ．２９３；Ｋ．－Ｕ．Ｓｃｈｏｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００），２９０：１３４７－１３５１；Ａ．Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（１９９２），７５：２１８；Ｊ．Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（１９９３），７６：２５９；Ｇ．Ｏｔｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（１９９３），７６：２７０１；Ｋ．Ｇｒｏｅｂｋｅ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（１９９８），８１：３７５；およびＡ．Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９），２８４：２１１８。２’修飾に対する修飾は、Ｖｅｒｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，６７，９９－１３４、および当該文献中の全ての参照文献において見出すことができる。リボースに対する特定の修飾は、以下の文献中に見出すことができる：２’－フルオロ（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１－８４１）、２’－ＭＯＥ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９６，７９，１９３０－１９３８）、「ＬＮＡ」（Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９９，３２，３０１－３１０）、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２０１２／０３０６８３。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｓｉＲＮＡは、アニーリングされた二重鎖ｓｉＲＮＡとして標的細胞に導入することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡは、標的細胞、一本鎖のセンス核酸配列およびアンチセンス核酸配列として導入され、標的細胞内に入ってから、アニーリングしてｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する。あるいは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、標的細胞に導入される発現ベクター（例えば、本明細書に記載される発現ベクターなど）によってコードされてもよい。標的細胞内で発現することにより、転写されたセンス鎖およびアンチセンス鎖がアニーリングされて、ｓｉＲＮＡを再構成することができる。
本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ分子は、当技術分野で公知の標準的な方法、例えば、自動化合成装置を使用して合成することができる。そのような方法論により作製されるＲＮＡは、純度が高く、効率的にアニーリングしてｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する傾向がある。化学合成の後、一本鎖ＲＮＡ分子を脱保護し、アニーリングさせて、ｓｉＲＮＡを形成させ、（例えば、ゲル電気泳動またはＨＰＬＣにより）精製することができる。あるいは、例えば、一つ以上のＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列（例えば、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列）を担持するなど、標準的な手順を使用して、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡのインビトロ転写を行うことができる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したｓｉＲＮＡの作製のためのプロトコルは、当該技術分野で公知である（例えば、Ｄｏｎｚｅ ａｎｄ Ｐｉｃａｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２；３０：ｅ４６、およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２；９９：６０４７－６０５２を参照のこと）。センス転写物およびアンチセンス転写物を、二つの独立した反応において合成して、後にアニーリングしてもよく、または一つの反応で同時に合成してもよい。
ｓｉＲＮＡ分子は、細胞内に導入された発現構築物からのＲＮＡの転写によって、細胞内で形成されてもよい（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２；９９：６０４７－６０５２を参照のこと）。ｓｉＲＮＡ分子のインビボ生産のための発現構築物は、例えば、プロモーター因子および転写終結シグナルを含む、ｓｉＲＮＡコード配列の妥当な転写に必要な因子に動作可能に連結された一つ以上のｓｉＲＮＡコード配列を含んでもよい。そのような発現構築物での使用に好ましいプロモーターとしては、ポリメラーゼ－ＩＩＩ ＨＩ－ＲＮＡプロモーター（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９６：５５０－５５３を参照のこと）、およびＵ６ ポリメラーゼ－ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；２０：５０５－５０８；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２；９９：６０４７－６０５２を参照のこと）。ｓｉＲＮＡ発現構築物はさらに、発現構築物のクローニングを促進する一つ以上のベクター配列を含んでもよい。使用され得る標準ベクターとしては、例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ２．０－Ｕ６ ｖｅｃｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．テキサス州オースティン）が挙げられる。
（ｖｉｉｉ）他の補体阻害剤
本開示の様々な実施形態で、様々な他の補体阻害剤が使用され得る。一部の実施形態では、補体阻害剤は、天然の哺乳動物補体制御タンパク質またはその断片もしくは誘導体である。例えば、補体制御タンパク質は、ＣＲ１、ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＦＨ、またはＣＦＩであってもよい。一部の実施形態では、補体制御ポリペプチドは、通常、その自然発生状態では膜結合型であるポリペプチドである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインの一部または全てを欠く、当該ポリペプチドの断片が使用される。例えば、補体受容体１の可溶型（ｓＣＲ１）も使用され得る。例えば、ＴＰ１０またはＴＰ２０（Ａｖａｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）として知られる化合物が使用され得る。Ｃ１阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）も、使用され得る。一部の実施形態では、可溶性補体対照タンパク質、例えば、ＣＦＨが使用される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、その溶解性を増加させるように修飾される。
Ｃ１ｓ阻害剤も使用され得る。例えば、米国特許第６，５１５，００２号は、Ｃ１ｓを阻害する化合物（フラニルアミジンおよびチエニルアミジン、複素環式アミジン、ならびにグアニジン）を記載している。米国特許第６，５１５，００２号および第７，１３８，５３０号は、Ｃ１ｓを阻害する複素環式アミジンを記載している。米国特許第７，０４９，２８２号は、古典的経路の活性化を阻害するペプチドを記載している。特定のペプチドは、ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ（配列番号７３）もしくはＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ（配列番号７４）、またはそれらに対して、高い配列同一性および／または三次元構造の類似性を有するペプチドを含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、これらのペプチドは、ＩｇＧ分子またはＩｇＭ分子の一部分と同一であるか、または実質的に同一である。米国特許第７，０４１，７９６号は、補体活性化を阻害する、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体受容体様分子およびその使用を開示している。米国特許第６，９９８，４６８号は、補体活性化の抗Ｃ２／Ｃ２ａ阻害剤を開示している。米国特許第６，６７６，９４３号は、肺炎連鎖球菌に由来するヒト補体Ｃ３分解タンパク質を開示している。
一部の実施形態では、補体阻害剤は、Ｃ５阻害剤である（すなわち、典型的にはＣ５に結合することによって、Ｃ５の活性化および／または活性を阻害する剤）。一部の実施形態では、Ｃ５阻害剤は、例えばエクリズマブなどの抗Ｃ５抗体、例えばＡＬＮ－ＣＣ５（Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）などの抗Ｃ５ ｓｉＲＮＡ、例えばＣｏｖｅｒｓｉｎ（Ｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）などの抗Ｃ５ポリペプチド、または抗Ｃ５低分子である。
一部の実施形態では、補体阻害剤は、例えば、Ｓｃｈｕｂａｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １１６：７９２６－７９３１（２０１９）に記載されるＬＮＰ０２３阻害剤である。
ＶＩ．医薬組成物
本明細書に記載されるウイルスベクターおよび／または補体阻害剤は、医薬組成物に組み込まれ得る。かかる医薬組成物は、特に、インビボまたは生体外での対象への投与および送達に有用である。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤も含有する。かかる賦形剤は、任意の医薬品、例えば、組成物を投与される個体に対して有害な免疫反応をそれ自体は誘導しない医薬品であって、過度の毒性を伴わずに投与され得る医薬品を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」および「生理学的に許容可能な」という用語は、生物学的に許容可能な製剤、気体、液体もしくは固体、またはそれらの混合物を意味し、一つ以上の投与経路、インビボでの送達、または接触に適している。薬学的に許容可能な賦形剤には限定されないが、例えば水、生理食塩水、グリセロール、糖、およびエタノールなどの液体が含まれる。薬学的に許容可能な塩は、その中に、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのミネラル酸塩、および例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩も含まれ得る。さらに、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、そうしたビヒクル中に存在し得る。
医薬組成物は、塩として提供されてもよく、および限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などをはじめとする多くの酸で形成されてもよい。塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性または他のプロトン性溶媒での溶解性が高い傾向にある。一部の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥粉末であってもよい。
医薬組成物には、医薬投与またはインビボ接触または送達に適合性がある、溶媒（水性または非水性）、溶液（水性または非水性）、エマルション（例えば、水中油または油中水）、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散媒体および懸濁媒体、コーティング、等張剤、および吸収促進剤または遅延剤が含まれてもよい。水性溶媒および非水性溶媒、溶液、ならびに懸濁液は、懸濁剤および増粘剤を含み得る。そのような薬学的に許容可能な担体には、錠剤（コーティングまたは非コーティング）、カプセル（硬質または軟質）、マイクロビーズ、粉末、顆粒、および結晶が含まれる。補足的な活性化合物（例えば、保存剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、および抗真菌剤）も、組成物に組み込まれ得る。
医薬組成物は、本明細書に明記される、または当業者に公知の特定の投与経路または送達経路と適合性があるように製剤化され得る。したがって、医薬組成物は、様々な経路による投与に適した担体、希釈剤、または賦形剤を含む。
非経口投与に適した組成物は、活性化合物の水溶液および非水性溶液、懸濁液、またはエマルションを含んでもよく、それら調製物は、典型的には滅菌されており、目的のレシピエントの血液と等張であり得る。非限定的な例には、水、緩衝生理食塩水、ハンクス溶液、リンゲル溶液、デキストロース、フルクトース、エタノール、動物油、植物油または合成油が挙げられる。水性注射懸濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油注入懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性の溶媒またはビヒクルは、例えばゴマ油などの脂肪酸、または例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。任意選択で、懸濁液は、溶解性を増加させて、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする好適な安定剤または薬剤も含有し得る。
共溶媒およびアジュバントを製剤に添加してもよい。共溶媒の非限定的な例は、ヒドロキシル基または他の極性基、例えばイソプロピルアルコールなどのアルコール；例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテルなどのグリコール；グリセロール；ポリオキシエチレンアルコール、およびポリオキシエチレン脂肪酸エステルを含有する。アジュバントとしては、例えば、例えば大豆レシチンおよびオレイン酸などの界面活性剤；ソルビタンエステル、例えばトリオレイン酸ソルビタン；およびポリビニルピロリドンが挙げられる。
医薬組成物が調製された後、それらを適切な容器に入れ、処置に関してラベリングしてもよい。そのようなラベリングは、投与の量、頻度、および方法を含み得る。
本開示の組成物、方法および使用に適切な医薬組成物および送達系は、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ．２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５を参照のこと）。
ＶＩＩ．併用治療
一部の態様では、本開示の方法は、遺伝子療法（例えば、本明細書に記載のウイルスベクター）を受けている、または過去に受けていた対象に、一つ以上の補体阻害剤（例えば、本明細書に記載の補体阻害剤）を投与することを含む。一部の方法では、一つ以上の補体阻害剤および遺伝子療法（例えば、ウイルスベクター）が対象に投与される。
一部の実施形態では、補体阻害剤は、一つ以上の遺伝子療法の投与を受けた、または同時に、もしくは連続して受けた対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子療法は、ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、対象は、補体阻害剤の投与の１日前に、１週間前、２週間前、４週間前、２ヶ月前、４ヶ月前、６ヶ月前、またはそれ以上前に遺伝子療法を受けている。
一部の実施形態では、補体阻害剤は、遺伝子療法を受けていない対象に投与される。一部の実施形態では、対象は、補体阻害剤の投与の約１日前に、１週間前、２週間前、４週間前、２ヶ月前、４ヶ月前、６ヶ月前、１年前、２年前、５年前、またはそれ以上前に遺伝子療法を受けていない。一部の実施形態では、対象は、遺伝子療法を決して受けていない。
一部の実施形態では、補体阻害剤および遺伝子療法が、対象に投与される。一部の実施形態では、補体阻害剤および遺伝子療法は、同時に投与される（例えば、互いに約１分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、１時間、または２時間以内）。一部の実施形態では、補体阻害剤および遺伝子療法は、連続して投与される（例えば、１時間超、６時間超、１２時間超、１８時間超、２４時間超、２日超、３日超、４日超、５日超、６日超、７日超、２週間超、４週間超、またはそれ以上の間隔をあけて）。
一部の実施形態では、対象は、遺伝子療法を受ける前に、補体阻害剤で前治療される。一部の実施形態では、補体阻害剤は、遺伝子療法の投与の２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２４時間前に、対象に投与される。一部の実施形態では、補体阻害剤は、遺伝子療法の投与の２４時間よりも前に、対象に投与される。
一部の実施形態では、対象は、補体阻害剤（例えば、Ｃ３阻害剤、例えば、ＬＡＣＡ）の短期治療を投与されてもよい。一部の実施形態では、短期治療は、補体阻害物質の単回投与を含み得る。一部の実施形態では、短期治療は、最大２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回の用量を含み得る。
一部の実施形態では、短期治療は、投与された最初の用量と最後の用量の間の日数（最初と最後の用量が投与された日を含む）が、１、２、３、４、５、６、または７日である治療レジメンである。一部の実施形態では、短期治療は、投与された最初の用量と最後の用量の間の日数（最初と最後の用量が投与された日を含む）が、最大で１０、１４、２１、または２８日である治療レジメンである。
一部の実施形態では、補体阻害剤が最初に投与され、その後に長い期間、例えば、６ヵ月、１年、２年、３年、４年、５年、またはそれ以上の期間、対象に補体が投与されない期間が続く。一部の実施形態では、遺伝子療法を受ける対象は、１クールの補体阻害剤療法を投与されてもよい。一部の実施形態では、対象は、遺伝子療法の第二の（またはその後の）投与を受けるのと併せて、補体阻害剤療法の第二の（またはその後の）クールを投与されてもよい。
一部の実施形態では、補体阻害剤の短期治療は、例えばＡＡＶベクターなどの一つ以上の用量の遺伝子療法が対象に投与される期間中、比較的短い期間（例えば、最大１２時間または２４時間、または最大１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日、または最大１週、２週、３週、４週、５週、または６週間）、補体を阻害し得る。
一部の実施形態では、補体阻害剤は、遺伝子療法のウイルスベクターが一つ以上の標的細胞によって取り込まれるまで（例えば、あるレベルまたはある範囲まで標的細胞に取り込まれるまで）、補体を阻害するために一定期間投与される。一部の実施形態では、細胞取り込みは、対象から取得されたサンプル（例えば、血清サンプル）中のウイルスベクターのレベル低下を検出するアッセイ、および／または一つ以上の標的細胞中のウイルスベクターのレベル上昇を検出するアッセイを使用して、対象において示され、または測定される。ウイルスベクターのレベルは、サンプル中のウイルスベクターを検出するための任意の公知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲなど）によって測定することができる。
一部の実施形態では、短期治療は、例えば、１５分～４８時間、例えば、３０分、１時間、２時間、４～８時間、８～１６時間、１６～２４時間、２４～４８時間、または４８～７２時間持続するＩＶ投与（例えば、ＩＶ点滴による）を含み得る。一部の実施形態では、ＩＶ点滴による短期治療は、対象が遺伝子療法を受けるときに及ぶ場合がある。一部の実施形態では、ＩＶ点滴による短期治療は、対象が遺伝子療法を受ける前であってもよい。一部の実施形態では、ＩＶ点滴による短期治療は、対象が遺伝子療法を受けた後であってもよい。
一部の実施形態では、対象は、遺伝子療法を受ける前に、補体阻害剤の短期治療を投与されてもよい。一部の実施形態では、補体阻害剤の短期治療は、対象が遺伝子療法治療を受ける前に、１５分～４８時間、例えば、３０分、１時間、２時間、４～８時間、８～１６時間、１６～２４時間、２４～４８時間、または４８～７２時間の間、投与されてもよい。
一部の実施形態では、対象は、遺伝子療法を受けた後に、補体阻害剤の短期治療を投与されてもよい。一部の実施形態では、補体阻害剤の短期治療は、対象が遺伝子療法治療を受けた後に、１５分～４８時間、例えば、３０分、１時間、２時間、４～８時間、８～１６時間、１６～２４時間、２４～４８時間、または４８～７２時間の間、投与されてもよい。
一部の実施形態では、補体阻害剤は、免疫抑制療法と併せて投与される。
一部の実施形態では、併用療法は、遺伝子療法のみを受けている対象と比較して、特定の期間にわたり（例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、２４ヶ月、３年、４年、５年、またはそれ以上にわたり）、対象において、遺伝子療法の改善（例えば、本明細書に記載される疾患もしくは障害、またはその症状の改善）をもたらす。一部の実施形態では、遺伝子療法は、補体阻害剤を受ける対象に投与される。一部の実施形態では、補体阻害剤は、遺伝子療法を受けている対象に投与される。
一部の実施形態では、併用療法は、遺伝子療法のみを受けている対象と比較して、特定の期間にわたり（例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、２４ヶ月、３年、４年、５年、またはそれ以上にわたり）、対象において、遺伝子療法の副作用の減少（例えば、ウイルスベクターに対する免疫応答の低下）をもたらす。一部の実施形態では、遺伝子療法は、補体阻害剤を受ける対象に投与される。一部の実施形態では、補体阻害剤は、遺伝子療法を受けている対象に投与される。
一部の実施形態では、補体阻害剤の投与は、遺伝子療法（例えば、ウイルスベクター）の第一の用量を投与された対象が、遺伝子療法の一つ以上の追加用量を投与されることを可能にする。一部の実施形態では、遺伝子療法の一つ以上の追加の用量は、遺伝子療法の最初の用量から少なくとも６か月後、例えば、少なくとも１年、２年、３年、５年、またはそれ以上後に投与されてもよい。
一部の実施形態では、補体阻害剤は、例えばＡＡＶベクターなどのウイルスベクターの第一の用量と共に投与される。一部のそのような実施形態では、最初の組み合わせは、ＡＡＶベクターの一つ以上の追加用量の投与を可能にする。
一部の実施形態では、遺伝子療法の一つ以上の追加の用量は、当該遺伝子療法の最初の用量と同じ血清型のウイルスベクターを使用した遺伝子療法を含む。一部の実施形態では、遺伝子療法の一つ以上の追加の用量は、最初の用量のウイルスベクターと同じウイルスカプシドおよび／またはウイルスエンベロープを含むウイルスベクター使用した遺伝子療法を含む。
一部の実施形態では、遺伝子療法の一つ以上の追加の用量は、最初の用量で使用されたウイルスベクターとは異なる血清型のウイルスベクターを使用した遺伝子療法を含む。一部の実施形態では、遺伝子療法の一つ以上の追加の用量は、最初の用量で使用されたウイルスベクターとは異なるウイルスカプシドおよび／またはウイルスエンベロープを含むウイルスベクター使用した遺伝子療法を含む。
一部の実施形態では、遺伝子療法の一つ以上の追加の用量は、最初の用量と同じ導入遺伝子を使用した遺伝子療法を含む。一部の実施形態では、遺伝子療法の一つ以上の追加の用量は、最初の用量とは異なる導入遺伝子を使用した遺伝子療法を含む。一部の実施形態では、対象は、遺伝子療法（例えば、ウイルスベクター）に対する検出可能な既存抗体を有していない。
一部の実施形態では、対象の年齢は、１２歳未満である。一部の実施形態では、対象の年齢は、１～１２歳である。一部の実施形態では、対象の年齢は、６～１２歳である。一部の実施形態では、対象の年齢は、１２～１８歳である。一部の実施形態では、対象の年齢は、１２歳よりも高い。一部の実施形態では、対象の年齢は、１８歳よりも高い。
一部の実施形態では、本明細書に記載される補体阻害剤と、本明細書に記載される遺伝子療法との併用療法は、当該遺伝子療法または補体阻害剤のいずれか単独によって生じる改善よりも高い程度に、本明細書に記載される疾患もしくは障害またはその症状の改善をもたらす。併用効果と、遺伝子療法または補体阻害剤の単独の効果との間の差は、統計的に有意な差であり得る。一部の実施形態では、併用の結果は、相乗的である。
一部の実施形態では、補体阻害剤と遺伝子療法との併用療法は、遺伝子療法単独の有効投与レジメンと比較して、および／または遺伝子療法に対して承認されている標準的な投与レジメンと比較して、低い用量、少ない投与回数、および／または少ない投薬頻度での遺伝子療法の投与を可能にする。一部の実施形態では、補体阻害剤と遺伝子療法との併用療法は、補体阻害剤単独の有効投与レジメンと比較して、低い用量、少ない投与回数、および／または少ない投薬頻度での補体阻害剤の投与を可能にする。
一部の実施形態では、遺伝子療法および／または補体阻害剤の有効性は、例えば、治療投与の１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、６週間後、８週間後、３ヶ月後、６ヶ月後、またはそれ以上後で評価される。
一部の実施形態では、遺伝子療法および／または補体阻害剤の有効性は、遺伝子療法のみ、または補体阻害剤のみを受ける対象と比較して、疾患徴候または症状の無再発期間によって測定され、または示される。一部の実施形態では、遺伝子療法および／または補体阻害剤の有効性は、遺伝子療法のみ、または補体阻害剤のみを受ける対象と比較して、疾患徴候または症状の再発までの時間の増加によって測定され、または示される。
一部の実施形態では、遺伝子療法および／または補体阻害剤の有効性は、遺伝子療法のみ、および／または補体阻害剤のみを受ける対象と比較して、液性応答の低下、および／または細胞応答の低下によって測定され、または示される。一部の実施形態では、液性応答の低下は、抗体（例えば、中和抗体）レベルのベースラインからの応答の大きさの低下、または倍率の低下によって測定され、または示される。一部の実施形態では、抗体レベルは、ウイルスベクター、例えば、カプシドタンパク質に対する抗体のレベルである。一部の実施形態では、ベースラインは、遺伝子療法および／または補体阻害剤の投与前に対象（本明細書に記載される疾患または障害を有する）において測定され、もしくは示される値、レベル、量、または数量である。一部の実施形態では、ベースラインは、遺伝子療法および／または補体阻害剤の投与前に対象（本明細書に記載される疾患または障害を有していない）において測定され、もしくは示される値、レベル、量、または数量である。一部の実施形態では、液性応答の低下は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のベースラインからの抗体価の低下によって示される。
一部の実施形態では、細胞応答は、グランザイムＢ（ＧｒＢ）および／またはＩＦＮγの分泌によって示され、または測定される。一部の実施形態では、細胞応答の低下は、ＧｒＢおよび／またはＩＦＮγレベルのベースラインからの応答の大きさの低下、または倍率の低下によって測定され、または示される。一部の実施形態では、細胞応答の低下は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のベースラインからのＧｒＢおよび／またはＩＦＮγレベルの低下によって示される。一部の実施形態では、ベースラインは、遺伝子療法および／または補体阻害剤の投与前に対象（本明細書に記載される疾患または障害を有する）において測定され、もしくは示される値、レベル、量、または数量である。一部の実施形態では、ベースラインは、遺伝子療法および／または補体阻害剤の投与前に対象（本明細書に記載される疾患または障害を有していない）において測定され、もしくは示される値、レベル、量、または数量である。
一部の実施形態では、遺伝子療法の有効性は、本明細書に記載される導入遺伝子の存在または発現のレベル、および／または本明細書に記載される導入遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルまたは活性によって測定される。例えば、補体阻害剤と遺伝子療法の併用療法は、例えば併用療法から１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、６ヶ月、またはそれ以上後での対象（例えば、対象の細胞または組織）において、補体阻害剤を投与されていない対象における導入遺伝子の対応するレベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、またはそれ以上高い、導入遺伝子のレベルをもたらす。一部の実施形態では、補体阻害剤と遺伝子療法の併用療法は、例えば併用療法から１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、６ヶ月、またはそれ以上後での対象（例えば、対象の細胞または組織）において、補体阻害剤を投与されていない対象における対応する発現および／または活性のレベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、またはそれ以上高い、導入遺伝子の発現レベル（および／または当該導入遺伝子によりコードされるタンパク質の活性レベル）をもたらす。
一部の実施形態では、遺伝子療法の有効性は、例えば１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、６ヶ月、またはそれ以上での期間にわたる、対照の対象（例えば、遺伝子療法を受けているが、補体阻害剤を投与されていない対照の対象）での同期間にわたる導入遺伝子の対応する発現レベルと比較した、対象における導入遺伝子の安定的な発現レベルにより測定される。一部の実施形態では、安定した発現レベルは、既定の期間にわたって３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以下まで異なる発現レベルである。
一部の実施形態では、標的遺伝子またはポリペプチドの阻害剤をコードする導入遺伝子を用いた遺伝子療法の有効性は、標的遺伝子の発現レベル、ならびに／または標的ポリペプチドの発現レベルおよび／もしくは活性レベルによって測定される。一部の実施形態では、補体阻害剤と遺伝子療法の併用療法は、例えば併用療法から１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、６ヶ月、またはそれ以上後での対象（例えば、対象の細胞または組織）において、補体阻害剤を投与されていない対象における対応する発現および／または活性のレベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低い、標的遺伝子の発現レベル、ならびに／または標的ポリペプチドの発現レベルおよび／もしくは活性レベルをもたらす。
遺伝子療法および／または補体阻害剤は、任意の適切な経路によって投与され得る。投与経路および／または投与様式は、望まれる結果に応じて変化し得る。本開示の方法および使用には、全身的、局部的、局所的、または任意の経路による、例えば、注射または点滴による送達および投与が含まれる。投与方法は、医師の判断に委ねられる。インビボでの医薬組成物の送達は概して、従来的なシリンジを使用した注射を介して達成され得るが、例えば対流強化送達などの他の送達方法も使用され得る（例えば、米国特許第５，７２０，７２０号を参照のこと）。例えば、組成物は、皮下、表皮、硬膜外、大脳内、皮内、鼻腔内、髄腔内、眼窩内、粘膜内、腹腔内、静脈内、胸膜内、網膜下、動脈内、舌下、肝内、門脈を介して、および筋肉内に送達されてもよい。他の投与様式には、経口投与および肺投与、座薬、ならびに経皮塗布が含まれる。臨床医は、最適な投与経路を決定し得る。
一部の実施形態では、遺伝子療法および補体阻害剤は、同じ経路で投与される。一部の実施形態では、遺伝子療法および補体阻害剤は、異なる経路で投与される。
本開示はまた、本明細書に記載されるウイルスベクターおよび補体阻害剤を細胞内または動物内に導入する方法を提供する。一部の実施形態では、当該方法は、補体阻害剤、および導入遺伝子を備えるウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）と、対象（例えば、対象の細胞または組織）を接触させること、または対象（例えば、哺乳動物などの対象）に投与し、その結果、当該導入遺伝子は、対象中（例えば、対象の細胞中または組織中）で発現されることを含む。別の実施形態では、方法は、個体（例えば、哺乳動物などの患者または対象）の細胞に、補体阻害剤、および本明細書に記載される導入遺伝子を備えるウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を提供し、その結果、当該導入遺伝子が、当該個体中で発現されることを含む。
本明細書に記載の導入遺伝子を備えるベクター（例えば、ＡＡＶベクター）の組成物は、その必要のある対象に、充分な量または有効量で投与され得る。用量は、治療が指示される疾患の種類、発症、進行、重症度、頻度、期間、または確率、望ましい臨床エンドポイント、過去の治療または同時治療、対象の全般的な健康状態、年齢、性別、人種、または免疫能力、および当業者によって認識される他の要因によって変化し、依存し得る。投与の量、回数、頻度、または期間は、治療または療法の任意の有害な副作用、合併症、または他のリスク要因、および対象の状態によって示唆される場合に、比例的に増加または減少させてもよい。当業者であれば、治療的または予防的な利益を提供するのに十分な量を提供するために必要な投薬量およびタイミングに影響を与え得る要因を認識するであろう。
治療効果を得るための用量、例えば、ベクターゲノム／体重１キログラム当たりの用量（ｖｇ／ｋｇ）は、限定されないが、投与経路、治療効果を得るために必要な導入遺伝子発現レベル、治療される特定の疾患、および発現される導入遺伝子の安定性をはじめとするいくつかの因子に応じて変化する。当業者は、ＡＡＶ／ベクターゲノムの用量範囲を決定し、前述の因子ならびに他の因子に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を治療することができる。概して、治療効果を得るための用量は、対象の体重１キログラム当たり、少なくとも１ｘ１０８以上、例えば、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、またはそれ以上のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲である。
有効量または充分な量は、単回投与で提供することができ（必ずではない）、または複数回の投与を必要とする場合もある。例えば、量は、治療を必要とする対象、治療される疾患のタイプ、状態および重症度、または治療の副作用（もしあれば）により指摘される場合、比例的に増加されてもよい。治療有効用量の決定は、本開示に提供される技術およびガイダンスを使用した医師の能力の範囲内にある。
一部の実施形態では、本明細書に記載される補体阻害剤の投与は、本明細書に記載されるように遺伝子療法の有効性が増強されるように、対象の血液中のＣ３の量および／または活性を充分に低下させ得る。一部の実施形態では、補体阻害剤は、およそ４０ｋＤのＰＥＧを含むＬＡＣＡであり、例えば、６０ｍｇ／日～１５０ｍｇ／日、例えば、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０ｍｇ／日の１日用量で皮下投与される。ある特定の実施形態では、１日用量は、１５０ｍｇ／日～３５０ｍｇ／日、例えば、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００ｍｇ／日またはそれ以上である。
一部の実施形態において、ＬＡＣＡの用量は、単回の１日用量として、例えば、皮下投与される。一部の実施形態において、ＬＡＣＡの用量は、単回の１週用量として、例えば、皮下投与される。一部の実施形態では、補体阻害剤は、遺伝子療法の投与の２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２４時間前に、対象に投与される。
一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、単回用量として投与される。一部の実施形態では、単回用量は、ボーラスである。一部の実施形態では、ボーラスは、例えば、約３０分、２０分、１０分、５分、またはそれ以下にわたるＩＶ点滴または他の投与経路によって投与されるＬＡＣＡの量である。
一部の実施形態では、単回用量は、点滴である。一部の実施形態では、点滴は、約１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、またはそれ以上にわたって点滴により投与されるＬＡＣＡの量である。
一部の実施形態では、対象は、例えば第二経路アッセイ、古典的経路アッセイ、またはその両方を使用して測定される、Ｃ３の発現および／または活性のレベルに関し、補体阻害剤を用いた治療の前および／または後にモニタリングされる。適切なアッセイは当該技術分野で公知であり、例えば、溶血アッセイが挙げられる。一部の実施形態では、対象は、Ｃ３の発現および／または活性の測定レベルが、対照対象におけるＣ３の発現および／または活性の測定レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、またはそれ以上高い場合、補体阻害剤で治療され、または補体阻害剤で再治療される。
一部の実施形態では、投与レジメンは、選択された期間、選択されたレベルの補体阻害（例えば、第二経路、古典的経路またはその両方の阻害）を達成するように選択されてもよい。一部の実施形態では、選択されたレベルの補体阻害は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。一部の実施形態では、選択された期間は、例えば、８時間～７２時間、例えば、１２時間～４８時間、例えば、約１６時間、２０時間、２４時間、２８時間、３２時間、３６時間、４０時間、または４４時間であってもよい。一部の実施形態では、選択された期間は、例えば、４４時間～７２時間、または７２時間～１２８時間であってもよい。
一部の実施形態では、方法は、補体阻害剤が投与された対象から、例えば血液サンプルなどの一つ以上のサンプルを取得すること、および一つ以上のアッセイを使用して、補体阻害のレベル（例えば、Ｃ３の発現および／または活性）を測定することを含んでもよい。一部の実施形態では、補体阻害剤療法は、選択されたレベルの阻害が達成されるまで継続されてもよい。当該選択されたレベルの阻害が達成された後、遺伝子療法の一つ以上の用量が投与されてもよい。対象は、一つ以上の遺伝子療法の用量の投与中および／または投与後も、補体阻害剤療法を受け続けてもよい。
一部の実施形態では、方法は、遺伝子療法の投与中または投与後の補体活性化に関連する兆候および／または症状について、代替的にまたは追加的に対象をモニタリングすることを含んでもよい。一部の実施形態では、例えば、補体活性化の一つ以上の兆候または症状が検出された場合、例えば、参照レベルの補体活性化または参照レベルを超える補体活性化が検出された場合、補体阻害剤の用量を増加させてもよく、または一つ以上の追加用量を投与してもよい。一部の実施形態では、例えば、補体活性化の一つ以上の兆候が検出されない場合、例えば、補体活性化が参照レベルを下回って維持される場合、補体阻害剤の用量を減少させてもよく、もしくは同レベルに維持してもよく、または追加の用量を投与しなくてもよい。一部の実施形態では、参照レベルは、例えば典型的には、対象が補体を活性化し得る感染症または他の刺激を患っていない時、特定の対象において遺伝子療法の投与前に特定される補体活性化のレベルである。一部の実施形態では、参照レベルは、一般集団で測定される正常範囲の上限であってもよい。
一部の実施形態では、投与期間中に投与される補体阻害剤の用量は、投与期間中、同一、またはほぼ同一に維持されうる。一部の実施形態では、そうした投与期間中に投与される用量は、当該投与期間中に変化する場合がある。
一部の実施形態では、補体阻害剤は、二つ以上の用量として投与される。一部の実施形態では、第一の用量（例えば、負荷用量）、および第二の用量（例えば、維持用量）が投与される。一部の実施形態では、第一の用量はボーラスであり、第二の用量はボーラスである。一部の実施形態では、第一の用量はボーラスであり、第二の用量は点滴である。一部の実施形態では、第一の用量は点滴であり、第二の用量は点滴である。一部の実施形態では、第一の用量は点滴であり、第二の用量はボーラスである。一部の実施形態では、補体阻害剤の一つ以上の用量は、約１５分～約４８時間、例えば、約３０分、約１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、または４８時間にわたって、点滴として投与される。一部の実施形態では、第一の用量は、約１０ｍｇ～約１２００ｍｇを含み、例えば約１０ｍｇ～約６００ｍｇのＬＡＣＡ（例えば約１０～２０ｍｇ、約２０～４０ｍｇ、約４０～６０ｍｇ、約６０～８０ｍｇ、約８０～１００ｍｇ、約１００～１２０ｍｇ、約１２０～１４０ｍｇ、約１４０～１６０ｍｇ、約１６０～１８０ｍｇ、約１８０～２００ｍｇ、約２００～２２０ｍｇ、約２２０～２４０ｍｇ、約２４０～２６０ｍｇ、約２６０～２８０ｍｇ、約２８０～３００ｍｇ、約３００～３２０ｍｇ、約３２０～３４０ｍｇ、約３４０～３６０ｍｇ、約３６０～３８０ｍｇ、約３８０～４００ｍｇ、約４００～４２０ｍｇ、約４２０～４４０ｍｇ、約４４０～４６０ｍｇ、約４６０～４８０ｍｇ、約４８０～５００ｍｇ、約５００～５２０ｍｇ、約５２０～５４０ｍｇ、約５４０～５６０ｍｇ、約５６０～５８０ｍｇ、約５８０～６００ｍｇ）を含み、第二の用量は、約１０ｍｇ～約６００ｍｇのＬＡＣＡ（例えば、約１０～２０ｍｇ、約２０～４０ｍｇ、約４０～６０ｍｇ、約６０～８０ｍｇ、約８０～１００ｍｇ、約１００～１２０ｍｇ、約１２０～１４０ｍｇ、約１４０～１６０ｍｇ、約１６０～１８０ｍｇ、約１８０～２００ｍｇ、約２００～２２０ｍｇ、約２２０～２４０ｍｇ、約２４０～２６０ｍｇ、約２６０～２８０ｍｇ、約２８０～３００ｍｇ、約３００～３２０ｍｇ、約３２０～３４０ｍｇ、約３４０～３６０ｍｇ、約３６０～３８０ｍｇ、約３８０～４００ｍｇ、約４００～４２０ｍｇ、約４２０～４４０ｍｇ、約４４０～４６０ｍｇ、約４６０～４８０ｍｇ、約４８０～５００ｍｇ、約５００～５２０ｍｇ、約５２０～５４０ｍｇ、約５４０～５６０ｍｇ、約５６０～５８０ｍｇ、約５８０～６００ｍｇ）を含む。維持用量は、例えば、最大１週間、１０日間、２週間など、所望の限り投与され続け得ることが理解される。
一部の実施形態では、対象は、補体阻害剤の負荷用量を投与されてもよく、その負荷用量の後に、例えば、異なる投薬レベルで、一つ以上の維持用量が投与される。一部の実施形態では、負荷用量は、一つ以上の維持用量よりも多い量の補体阻害剤を含有する。
一部の実施形態では、負荷用量は、補体活性（例えば、Ｃ３）のレベルに基づいて決定されてもよい。一部の実施形態では、一つ以上の維持用量は、補体活性（例えば、Ｃ３）のレベルに基づいて決定されてもよい。
一部の実施形態では、負荷用量は、対象への遺伝子療法の投与の前に投与される。一部の実施形態では、補体阻害剤の負荷用量は、遺伝子療法の投与の２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２４時間前に、対象に投与される。一部の実施形態では、補体阻害剤の負荷用量は、遺伝子療法の投与の２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２４時間前に、対象に投与される。一部の実施形態では、負荷用量は、対象への遺伝子療法の投与の後に投与される。一部の実施形態では、少なくとも一つの維持用量は、対象への遺伝子療法の投与の前に投与される。一部の実施形態では、少なくとも一つの維持用量は、対象への遺伝子療法の投与の後に投与される。一部の実施形態では、その後の遺伝子療法（例えば、ＡＡＶベクター）の用量は、少なくとも一つの維持用量の後に投与される。一部の実施形態では、少なくとも一つのその後の維持用量は、その後の遺伝子療法の用量の後に投与される。
一部の実施形態では、維持用量は、一つ以上の補体阻害剤の用量を含んでもよい。一部の実施形態では、維持用量は、８時間～７２時間、例えば、１２時間～４８時間、例えば、約１６時間、２０時間、２４時間、２８時間、３２時間、３６時間、４０時間、４４時間、または４８時間にわたって投与される複数の用量からなる。一部の実施形態では、選択された期間は、例えば、４４時間～７２時間、または７２時間～１２８時間であってもよい。
一部の実施形態では、維持用量は、例えば、１５分～４８時間、例えば、３０分、１時間、２時間、４～８時間、８～１６時間、１６～２４時間、２４～４８時間、または４８～７２時間持続するＩＶ投与（例えば、ＩＶ点滴による）を含み得る。一部の実施形態では、ＩＶ点滴による維持用量は、対象が遺伝子療法を受けるときに及ぶ場合がある。
一部の実施形態では、補体阻害剤は、例えば、ＷＯ２０１８／１８７８１３またはＷＯ２０１９／１１８９３８に記載される投与レジメンに従って投与される。
特定の実施形態では、約４０ｋＤのＰＥＧを含むＬＡＣＡが使用されてもよい。一部の実施形態では、例えば、米国特許出願公開２０１９０３８１１２９、米国特許出願公開２０２０００３８５１６、および／またはＷＯ／２０１９／１１８９３８に記載される、方法、製剤、および／または皮下投与に適した投薬レジメンなどの投薬レジメンが使用されてもよい。例えば、以下の用量のいずれかが、様々な実施形態で使用されてもよい。一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、１用量当たり５４５ｍｇ～１６９０ｍｇの量で毎週三回投与されてもよい。一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、１用量当たり６３０ｍｇ～９３０ｍｇの量で毎週三回投与される。一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、１用量当たり７９５ｍｇ～８８５ｍｇの量で毎週三回投与される。一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、１用量当たり５８５ｍｇ～２５１０ｍｇの量で毎週二回投与される。一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、１用量当たり９００ｍｇ～１３９５ｍｇの量で毎週二回投与される。一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、１用量当たり９９０ｍｇ～１２１５ｍｇの量で毎週二回投与される。一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、１用量当たり１２１５ｍｇ～１３９５ｍｇの量で毎週二回投与される。一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、１用量当たり１０８０ｍｇ～５０４０ｍｇの量で毎週投与される。一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、１用量当たり２１６０ｍｇ～２５２０ｍｇの量で毎週投与される。一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、１用量当たり２５２０ｍｇ～２８８０ｍｇの量で毎週投与される。一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、１用量当たり２８８０ｍｇ～３２４０ｍｇの量で毎週投与される。一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、１用量当たり３２４０ｍｇ～３６００ｍｇの量で毎週投与される。一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、約１０８０ｍｇの用量で、週に２回、週に３回、または３日ごとに投与される。一部の実施形態では、かかる投与は皮下である。一部の実施形態では、隔日投与を含む投与レジメンが使用されてもよい。
特定の実施形態では、約４０ｋＤのＰＥＧを含むＬＡＣＡが静脈内投与されてもよい。一部の実施形態では、約１～２グラム以上、例えば、最大約４～５グラム、または最大約６．０グラム、または最大約１０グラムの初回用量が投与されてもよい。一部の実施形態では、投与レジメンは、ＩＶ投与されるＬＡＣＡの単回投与を含む。一部の実施形態では、ＩＶ投与レジメンは、ＬＡＣＡの初回ＩＶ用量と、例えばＩＶ投与されるなどの一つ以上の追加用量とを含む。一部の実施形態では、投与レジメンは、ＬＡＣＡの負荷用量と、一つ以上の追加用量とを含む。一部の実施形態では、ＬＡＣＡの単回用量および／または負荷用量および／または追加用量は、約４．０ｇ～約６．０ｇ、例えば、約４．５ｇ～約５．５ｇ、例えば、約５．０ｇである。一部の実施形態では、ＬＡＣＡの単回用量および／または初回用量および／または追加用量は、約５．０ｇ～約７．０ｇ、例えば、約５．０ｇ、約５．５ｇ、約６．０ｇ、約６．５ｇ、または約７．０ｇである。一部の実施形態では、単回用量および／または初回用量および／または追加用量は、約８．０ｇ～約１０．０ｇ、例えば、約８．０ｇ、約８．５ｇ、約９．０ｇ、約９．５ｇ、または約１０．０ｇの間である。一部の実施形態では、約４．０ｇ～約１０．０ｇの用量、例えば、約５．０ｇ、約６．０ｇ、約７．０ｇ、約８．０ｇ、約８．５ｇ、約９．０ｇ、約９．５ｇ、または約１０．０ｇの用量がＩＶ投与される。一部の実施形態では、追加の当該用量は、約５～１０日後、例えば、約６日後、約７日後、約８日後、または約９日後に投与されてもよい。一部の実施形態では、第二の用量の後に例えば同じ投与間隔で一つ以上の追加の当該用量が続いてもよい。
一部の実施形態では、第一の用量は、静脈内に投与されてもよく、ＳＣ治療がほぼ同時に開始されてもよい。一部の実施形態では、第一の用量は、静脈内に投与されてもよく、ＳＣ治療は、ＩＶ投与の約２４、４８、７２、または９６時間以内に開始されてもよい。例示的な実施形態では、約４０ｋＤのＰＥＧを含むＬＡＣＡは、約４，０００ｍｇのＩＶ用量で投与される。別の例示的な実施形態では、ＬＡＣＡは、約２，０００ｍｇの用量でＩＶ投与され、および１，３００ｍｇの用量でＳＣ投与される。一部の実施形態では、ＳＣ用量は、例えば、ＩＶ投与の内、またはＩＶ投与の約１時間後に投与されてもよい。ＳＣ用量は、例えば、最大１時間にわたって投与されてもよい。次いで患者は、例えば、週に２回１，０８０ｍｇ、または３日ごとに１，０８０ｍｇ、または週に３回１，０８０ｍｇ、または一日おきに１，０８０ｍｇなどの前述の投与レジメンのいずれかに従って、ＬＡＣＡ ＳＣのさらなる用量を受けてもよい。一部の実施形態では、ＬＡＣＡは、約０．５ｇ～約２．５ｇの負荷用量としてＩＶ投与され、次いで患者は、例えば、週に２回１，０８０ｍｇ、または３日ごとに１，０８０ｍｇ、または週に３回１，０８０ｍｇ、または一日おきに１，０８０ｍｇなどの前述の投与レジメンのいずれかに従って、ＬＡＣＡ ＳＣのさらなる用量を受けてもよい。ＷＯ２０１９１１８９３８に記載されるように、週２回または週３回の投与レジメンの用量は、用量が投与されない１日または２日の間隔をあけて離されることが認識される（例えば、週２回の投与レジメンについては、各週の１日目および４日目に用量が投与されてもよく、週３回の投与レジメンについては、各週の１、４および６日目、または１、３および５日目に用量が投与されてもよい。
一部の実施形態では、例えば約４０ｋＤのＰＥＧを含むＬＡＣＡなどのコンプスタチン類似体は、毎日投与される。一部の実施形態では、例えば約４０ｋＤのＰＥＧを含むＬＡＣＡなどのコンプスタチン類似体は、約２７０ｍｇ～約４４０ｍｇ、例えば、約２７０ｍｇ／日または約３６０ｍｇ／日の用量で毎日投与される。一部の実施形態では、かかる投与は、ＳＣ経路を介して行われる。一部の実施形態では、約４０ｋＤのＰＥＧを含むＬＡＣＡは、約０．５ｇ～約２．５ｇの負荷用量としてＩＶ投与され、および約２７０ｍｇ～約４４０ｍｇで１日１回の維持用量、例えば、１日１回約２７０ｍｇまたは１日１回約３６０ｍｇの維持用量が皮下投与される。
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を含む、本明細書において言及されるすべての公表文献、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体で組み込まれる。さらに材料、方法および実施例は、解説のみを目的としており、限定であることは意図されない。別段の規定が無い限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと類似した、または均等の方法および材料を、本発明の実施または検証に使用することができるが、本明細書では公的な方法および材料を記載する。
本開示は、以下の実施例によってさらに解説される。実施例は、例示のみを目的として提供される。実施例は、本開示の範囲または内容をいかなる方法によっても限定していると解釈されるべきではない。
実施例１：補体阻害は、ＡＡＶ形質導入効率を向上させる
形質導入アッセイは、ｌａｃＺレポーターを含むＡＡＶ３ｂベクターと、約１０ｋＤのＰＥＧを有する、図１の様々な量のＰＥＧ化コンプスタチン類似体（ＣＡ）を含有する培地中で培養されたＨｕＨ７細胞を使用して実施された。
方法
１．非ヒト霊長類（ＮＨＰ）血清の連続希釈を、ＤＭＥＭ（１／１０、１／２０、１／４０、１／８０、１／１６０、および１／３２０）で調製した。各血清希釈の６０μＬを、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。
２．ＮＨＰ血清の連続希釈を、ＣＡ（０、１０、１００μｍ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。
３．６０μｌのＡＡＶ３ｂ ｌａｃＺ粒子を各ウェルに添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。
４．１００μｌの培地（血清、ＤＭＥＭ、ＣＡ、およびＡＡＶ３ｂ ｌａｃＺ粒子を含有する）を各ウェルから移動させ、ＨｕＨ７細胞を含有する細胞プレートの各ウェルに添加した。
５．細胞プレート中の各ウェルの最終体積は２６０μｌであり、ＡＡＶ３ｂ粒子は、１０，０００のＭＯＩで、ＨｕＨ７細胞に形質導入された。
６．ＨｕＨ７細胞を、ＡＡＶ３ｂ ｌａｃＺと共に一晩インキュベートした。
吸光度を測定し、データを、１００μｍのＣＡサンプルからの値に対して正規化された相対形質導入率として表した（図２および３に示す）。
図２および３は、１／２０、１／４０、および１／８０（ならびに図３の１／１０、１／１６０および１／３２０）の血清希釈、および約１０ｋＤのＰＥＧを有し、ＨｕＨ７細胞に送達された図１のＰＥＧ化コンプスタチン類似体（ＣＡ）を異なる量（０、１０、および１００μｍ）で含む培養培地中での、ＡＡＶ３ｂウイルス粒子の相対的な形質導入効率を比較するグラフを含む。
１／１０の血清希釈では検出可能な形質導入はなく、１／８０を超える血清希釈の群間で有意差はなかった。
均等
当分野の当業者であれば、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を、通常の実験の範囲内で認識することができ、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることは意図されず、以下の請求の範囲に記載される。

Claims (71)

  1. 遺伝子療法を受けている、または受けていた対象における前記遺伝子療法の有効性を改善する方法であって、補体阻害剤を前記対象に投与し、それにより前記遺伝子療法の有効性を改善することを含む、方法。
  2. 前記遺伝子療法の有効性は、前記遺伝子療法を受けている、または遺伝子療法を受けていたが、前記補体阻害剤を投与されていない対照の対象と比較して、指定された期間にわたって前記対象において改善される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記遺伝子療法が、ウイルスベクターを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、もしくはＡＡＶ１１ベクター、またはそれらの任意のバリアントである請求項４に記載の方法。
  6. 前記ウイルスベクターが、導入遺伝子を含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記導入遺伝子は、治療用タンパク質、酵素、ホルモン、血液凝固因子、サイトカイン、または成長因子をコードする、請求項６に記載の方法。
  8. 前記遺伝子療法は、血液障害、網膜疾患、自己免疫疾患、筋障害、神経障害、または癌の治療を目的としている、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記補体阻害剤は、対照（例えば、前記遺伝子療法を受けているが、前記補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、前記遺伝子療法に対する免疫応答（例えば、抗体、Ｂ細胞、および／またはＴ細胞の免疫応答）を減少させる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記遺伝子療法の有効性は、対照（例えば、前記遺伝子療法を受けているが、前記補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、約１週間、２週間、４週間、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、またはそれ以上で増加する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ウイルスベクターの形質導入は、対照（例えば、前記遺伝子療法を受けているが、前記補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、改善される、請求項３～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 形質導入は、導入遺伝子発現のレベルを測定することによって評価される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ウイルスベクターの補体介在性のクリアランスは、対照（例えば、前記遺伝子療法を受けているが、前記補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、減少する、請求項３～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記補体阻害剤が、Ｃ３阻害剤を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記Ｃ３阻害剤は、Ｃ３転写物もしくはＣ３タンパク質のレベルおよび／または活性を減少させる、請求項１４に記載の方法。
  16. 遺伝子療法（例えば、ウイルスベクター療法）を受けた、または受けている対象における補体活性化を低下させる方法であって、
    前記対象に遺伝子療法（例えば、ウイルスベクター療法）を投与すること、および
    前記対象に補体阻害剤を投与することを含み、
    それにより、前記対象における補体活性化を低下させる、方法。
  17. 前記補体阻害剤が、Ｃ３阻害剤である、請求項１６に記載の方法。
  18. Ｃ３の発現および／または活性のレベルは、対照の対象（例えば、前記遺伝子療法を受けているが、前記補体阻害剤を投与されていない対照の対象、または前記遺伝子療法を受け、前記Ｃ３阻害剤を投与される前の対照の対象）におけるＣ３の発現および／または活性の測定レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または１００％超低下する、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記遺伝子療法が、ウイルスベクターを含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、もしくはＡＡＶ１１ベクター、またはそれらの任意のバリアントである請求項２０に記載の方法。
  22. 前記ウイルスベクターが、導入遺伝子を含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記導入遺伝子は、治療用タンパク質、酵素、ホルモン、血液凝固因子、サイトカイン、または成長因子をコードする、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記遺伝子療法は、血液障害、網膜疾患、自己免疫疾患、筋障害、神経障害、または癌の治療を目的としている、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記補体阻害剤は、対照（例えば、前記遺伝子療法を受けているが、前記補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、前記遺伝子療法に対する免疫応答（例えば、抗体、Ｂ細胞、および／またはＴ細胞の免疫応答）を減少させる、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記遺伝子療法の有効性は、対照（例えば、前記遺伝子療法を受けているが、前記補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、約１週間、２週間、４週間、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、またはそれ以上で増加する、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記ウイルスベクターの形質導入は、対照（例えば、前記遺伝子療法を受けているが、前記補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、改善される、請求項１６～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 形質導入は、導入遺伝子発現のレベルを測定することによって評価される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ウイルスベクターの補体介在性のクリアランスは、対照（例えば、前記遺伝子療法を受けているが、前記補体阻害剤を投与されていない対照の対象）と比較して、減少する、請求項１６～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 遺伝子療法を受けている対象における、導入遺伝子を含むウイルスベクターの形質導入を増加させる方法であって、
    補体阻害剤（例えば、Ｃ３阻害剤）を前記対象に投与することを含み、前記対象において前記導入遺伝子の発現は、前記遺伝子療法を受けているが前記補体阻害剤を投与されていない対照の対象と比較して増加する、方法。
  31. 例えば１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、６ヶ月、またはそれ以上での前記対象における前記導入遺伝子の発現レベルは、対照の対象（例えば、前記遺伝子療法を受けているが、前記補体阻害剤を投与されていない対照の対象）における前記導入遺伝子の対応する発現レベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、またはそれ以上高い、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記対象における前記導入遺伝子の前記発現レベルは、例えば１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、６ヶ月、またはそれ以上での期間にわたり、対照の対象（例えば、前記遺伝子療法を受けているが、前記補体阻害剤を投与されていない対照の対象）における前記導入遺伝子の対応する発現レベルと比較して、より安定的である、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、もしくはＡＡＶ１１ベクター、またはそれらの任意のバリアントである請求項３３に記載の方法。
  35. 前記導入遺伝子は、治療用タンパク質、酵素、ホルモン、血液凝固因子、サイトカイン、または成長因子をコードする、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記遺伝子療法は、血液障害、網膜疾患、自己免疫疾患、筋障害、神経障害、または癌の治療を目的としている、請求項３０～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 遺伝子療法を受けている、または受けていた対象における前記遺伝子療法の有効性を改善する方法であって、
    ａ）前記対象の血清サンプル中の補体活性のレベルを検出すること、および
    ｂ）前記補体活性のレベルが対照と比較して増加する場合、前記対象に補体阻害剤（例えば、Ｃ３阻害剤）を投与することを含み、前記補体阻害剤は、前記対象において補体活性化を阻害する、方法。
  38. 前記血清補体活性のレベルの検出は、第二経路アッセイ、古典的経路アッセイ、またはその両方を使用して測定される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記対象に前記遺伝子療法を投与することをさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
  40. 前記遺伝子療法が、ウイルスベクターを含む、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、もしくはＡＡＶ１１ベクター、またはそれらの任意のバリアントである請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ウイルスベクターが、導入遺伝子を含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記導入遺伝子は、治療用タンパク質、酵素、ホルモン、血液凝固因子、サイトカイン、または成長因子をコードする、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記遺伝子療法は、血液障害、網膜疾患、自己免疫疾患、筋障害、神経障害、または癌の治療を目的としている、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記Ｃ３阻害剤は、コンプスタチン類似体、抗Ｃ３抗体、哺乳動物の補体制御タンパク質（ＣＲ１、ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＦＨ、またはＣＦＩ）、Ｃ３もしくはＣ３ｂを分解する酵素、Ｃ１阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）、補体受容体１の可溶型（ｓＣＲ１）、ＴＰ１０もしくはＴＰ２０、ミニファクターＨ、Ｅｆｂタンパク質、または補体阻害剤（ＳＣＩＮ）を含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記コンプスタチン類似体は、長時間作用型コンプスタチン類似体（ＬＡＣＡ）、コンプスタチン模倣体、または標的化型コンプスタチン類似体を含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記コンプスタチン類似体は、クリアランス低下部分（ＣＲＭ）、および少なくとも一つのコンプスタチン類似体部分を含む、請求項４６または４７に記載の方法。
  49. 前記コンプスタチン類似体は、少なくとも二つのコンプスタチン類似体部分が付加されているＣＲＭを含む、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記ＣＲＭが、ＰＥＧを含む、請求項４８または４９に記載の方法。
  51. 前記ＣＲＭは、約１０ｋＤ～約５０ｋＤ、例えば、約３５ｋＤ～約４５ｋＤ、例えば、約４０ｋＤの平均分子量を有する、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記コンプスタチン類似体は、各末端にコンプスタチン類似体部分が付加されている線形ポリマーを含む、請求項４６～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 各コンプスタチン類似体部分は、配列番号３～３６、３７、６９、７０、７１、および７２のうちの一つのアミノ酸配列を含む環状ペプチドを含む、請求項４６～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記コンプスタチン類似体は、一つ以上のコンプスタチン類似体部分に付加された一つ以上のクリアランス低下部分を含み、各コンプスタチン類似体部分は、配列番号３～３６のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端、Ｃ末端またはその両方で一つ以上の末端アミノ酸により伸長される環状ペプチドを含み、前記アミノ酸の一つ以上は、一級アミンまたは二級アミンを含む側鎖を有し、および任意でオリゴ（エチレングリコール）部分を含む硬直性スペーサーまたは柔軟性スペーサーにより前記環状ペプチドから分離されており、そして各クリアランス低下部分は任意で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、各クリアランス低下部分は、連結部分を介して一つ以上のコンプスタチン類似体部分に共有結合され、および前記連結部分は、不飽和アルキル部分、非芳香族環状環系を含む部分、芳香族部分、エーテル部分、アミド部分、エステル部分、カルボニル部分、イミン部分、チオエーテル部分、および／またはアミノ酸残基を含む、請求項４６～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 各コンプスタチン類似体部分は、Ｎ末端、Ｃ末端またはその両方で一つ以上のアミノ酸により伸長される環状ペプチドを含み、前記一つ以上のアミノ酸は、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＥＥＡｃ）または１１－アミノ－３，６，９－トリオキサウンデカン酸を含む硬直性スペーサーまたは柔軟性スペーサーにより前記ペプチドの環状部分から分離される、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記コンプスタチン類似体が、ＣＡ２８－２ＴＳ－ＢＦを含む、請求項４６～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記対象に前記遺伝子療法を投与することをさらに含む、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記遺伝子療法および前記補体阻害剤は、前記対象に同時に、または連続して投与される、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記補体阻害剤の投与は、網膜下、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、脳内、髄腔内、膣内、経皮、直腸、硝子体内、吸入、または局所の投与を含む、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記遺伝子療法は、網膜下、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、脳内、髄腔内、膣内、経皮、直腸、硝子体内、吸入、または局所の投与により投与される、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記補体阻害剤を投与することが、前記対象が前記遺伝子療法を受けているときに、毎日、毎週、または毎月、前記補体阻害剤を投与することを含む、請求項１～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記補体阻害剤を投与することが、前記対象が前記遺伝子療法を受ける前に、前記補体阻害剤の一つ以上の用量を前記対象に投与することを含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記補体阻害剤が、前記遺伝子療法が投与される２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２４時間前に、対象に投与される、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記補体阻害剤が、前記遺伝子療法が投与される２４時間より前に、対象に投与される、請求項６２に記載の方法。
  65. 前記補体阻害剤が、ＩＶ点滴を介して前記対象に投与される、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記補体阻害剤の前記ＩＶ点滴が、１５分～４８時間、例えば、３０分、１時間、２時間、４～８時間、８～１６時間、１６～２４時間、２４～４８時間、または４８～７２時間投与される、請求項６５に記載の方法。
  67. 対象は、一つ以上の追加の遺伝子療法の投与を用いて治療され、前記有効性は、対照の対象（例えば、前記一つ以上の追加の遺伝子療法の投与で治療されたが、前記補体阻害剤は投与されなかった対照の対象）における前記有効性と比較して、特定の期間にわたり、前記対象において改善される、請求項１～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記一つ以上の追加の遺伝子療法の投与は、過去に投与された遺伝子療法とは異なる導入遺伝子を使用した遺伝子療法である、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記一つ以上の追加の遺伝子療法の投与は、過去に投与された遺伝子療法において使用された同じ導入遺伝子を使用した遺伝子療法である、請求項６７または６８に記載の方法。
  70. 前記一つ以上の追加の遺伝子療法の投与は、過去に投与された遺伝子療法と同じ血清型であるウイルスベクターを使用した遺伝子療法である、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記一つ以上の追加の遺伝子療法の投与は、過去に投与された遺伝子療法とは異なる血清型であるウイルスベクターを使用した遺伝子療法である、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の方法。
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