JP2022538231A - 生物学的細胞からの振動蛍光の分析 - Google Patents

生物学的細胞からの振動蛍光の分析 Download PDF

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Abstract

1つ以上の生物学的細胞と関連付けられる振動イオンフラックスを表す振動蛍光を分析するための方法およびシステム。分析の例証的方法(50)は、振動パターン(110)を記述する一連のデータ点(120)を生成するために、1つ以上の生物学的細胞(72)から蛍光(91)を検出するステップ(54)を含み得る。一連の勾配が、振動パターン(110)に関して計算され得る(60)。例えば、スライディングウィンドウ(122)が、それから一連の勾配が計算される一連のデータ点(120)のサブセット(126)を定義するために使用され得る。振動パターン(110)のピーク(118、150a、150b)が、一連の勾配を使用して識別され得る(62)。

Description

(関連出願)
本願は、その内容が、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる、2019年6月25日に出願された米国仮出願第62/866524号の優先権を主張する。
本開示は、生物学的細胞から振動蛍光を分析するための方法およびシステムに関する。より具体的には、開示される実施例は、生物学的細胞におけるカルシウム振動等の振動イオンフラックスを表す振動蛍光を分析し、振動蛍光に対する細胞処理の効果を試験するための方法およびシステムに関する。
緒言
薬物の大部分は、心毒性または神経毒性に起因して、臨床研究において失敗する。これらの失敗の発生を低減させるために、高感度生体外アッセイが、臨床研究が開始される前に、心臓および神経細胞に対する化合物の有害効果を確実に評価するために必要とされる。これらの生体外アッセイは、薬物開発を促進および合理化し得る。
心筋細胞およびニューロンのための培養システムが、開発されており、これらの細胞は、カルシウム振動等の自発的な同期されたイオンフラックスを呈する。カルシウム振動は、蛍光性カルシウムインジケータを用いて細胞を標識化することによって検出されることができる。
分析ソフトウェアを含む撮像システムもまた、細胞内のカルシウム振動を表す振動蛍光を記録および分析するために開発されている。撮像システムは、培養下の心筋細胞およびニューロンのカルシウム振動に対する薬理的化合物の影響を測定するために利用されている。有意なこととして、これらのカルシウム振動は、公知の心毒性または神経毒性効果を有する薬理的化合物によって、生体外で擾乱される。故に、本方法論は、薬物および他の化学物質の安全性試験および臨床研究に先立つ薬物候補の効能および投与量の予測のための有望性を示す。
カルシウム振動が薬物および他の化合物によって擾乱されるときに生成される振動パターンは、非常に複雑であり得る。これらの複雑な振動パターンの生物学的に関連する特徴を検出し、最も有益な読出値に関する値を抽出するためのより良好な方法およびシステムが、必要とされる。
本開示は、1つ以上の生物学的細胞と関連付けられる振動イオンフラックスを表す振動蛍光を記録および分析するための方法およびシステムを提供する。分析の例証的方法は、振動パターンを記述する一連のデータ点を生成するために、1つ以上の生物学的細胞から蛍光を検出するステップを含んでもよい。一連の勾配が、振動パターンに関して計算されてもよい。スライディングウィンドウが、それから一連の勾配が計算される一連のデータ点のサブセットを定義するために使用されてもよい。振動パターンのピークが、一連の勾配を使用して識別されてもよい。分析の別の例証的方法は、振動パターンを記述する一連のデータ点を生成するために、1つ以上の生物学的細胞から蛍光を検出するステップを含んでもよい。振動パターンにおける一次ピークおよび二次ピークが、存在する場合、識別されてもよい。二次ピークの側面が、決定されてもよい。
図1は、生物学的細胞から振動蛍光パターンを分析する例証的方法において実施され得る、ステップのフローチャートである。
図2は、生物学的細胞から振動蛍光パターンを検出および分析するための例証的システムの概略図である。
図3は、振動イオンフラックスを受ける生物学的細胞から検出される蛍光信号によって生成される、比較的に単純な擾乱されていない振動パターンのグラフである。
図4は、データ点のサブセットが一連の勾配の計算のためにスライディングウィンドウを用いて選択され得る方法を図示するために、領域が、概して、図3の「4」に示され、スライディングウィンドウが、3つの異なる時間的位置において図式的に示される、単一の振動を包含する図3の蛍光信号の領域に関する一連のデータ点のグラフである。
図5は、図3におけるように検出されるより複雑な擾乱される振動パターンの単一の振動(「事象」)のグラフであり、雑音であると仮定される蛍光信号におけるより小さい「スプリアス」変動を無視しながら、図4におけるように計算される勾配が、生物学的に関連するピークおよびトラフを検出するために使用され得る方法を図示する。
図6は、二次ピークの周囲でとられる図5の単一の振動の一部のみのグラフであり、一次/二次ピークが、小さいおよび/または過渡ピークを無効として除斥するために、所定の振幅および/または持続時間基準を使用してフィルタリングされ得る方法を図示する。
図7は、図3におけるように検出される振動パターンのグラフであり、振動パターンに関するベースラインを自動的に設定する、すなわち、一時的基準線および基準線に対する閾値線を設定するためのアルゴリズムの側面を図示する。
図8は、閾値線の下方に位置し、勾配に基づいて識別される、負のピーク(図7の基準線に対して)を示す、図7の振動パターンの下側部分の断片図である。
図9は、例証的パラメータが識別される、概して、図3におけるように検出される複雑な振動パターンの3つの振動のグラフである。
図10および11は、一次ピークが円によってマーキングされ、二次ピークが菱形によってマーキングされる、スライディングウィンドウに関する異なるサイズ(それぞれ、11個の点および5個の点)を使用して分析される、同一の複雑な振動パターンのグラフである。 図10および11は、一次ピークが円によってマーキングされ、二次ピークが菱形によってマーキングされる、スライディングウィンドウに関する異なるサイズ(それぞれ、11個の点および5個の点)を使用して分析される、同一の複雑な振動パターンのグラフである。
図12Aおよび12Bは、ダイアログボックスの「オプション」タブが選択される、分析ソフトウェアによって作成されるグラフィカルユーザインターフェースの例示的ダイアログボックスの断片図である。 図12Aおよび12Bは、ダイアログボックスの「オプション」タブが選択される、分析ソフトウェアによって作成されるグラフィカルユーザインターフェースの例示的ダイアログボックスの断片図である。
図13Aおよび13Bは、ダイアログボックスの「測定」タブが選択されることを除いて、図12Aおよび12Bのダイアログボックスの断片図である。 図13Aおよび13Bは、ダイアログボックスの「測定」タブが選択されることを除いて、図12Aおよび12Bのダイアログボックスの断片図である。
図14-21は、対照群として処理される(図14)、および種々の公知の心毒性化合物を用いて処理される(図15-21)、心筋細胞から検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次(「主要」)ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。 図14-21は、対照群として処理される(図14)、および種々の公知の心毒性化合物を用いて処理される(図15-21)、心筋細胞から検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次(「主要」)ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。 図14-21は、対照群として処理される(図14)、および種々の公知の心毒性化合物を用いて処理される(図15-21)、心筋細胞から検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次(「主要」)ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。 図14-21は、対照群として処理される(図14)、および種々の公知の心毒性化合物を用いて処理される(図15-21)、心筋細胞から検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次(「主要」)ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。 図14-21は、対照群として処理される(図14)、および種々の公知の心毒性化合物を用いて処理される(図15-21)、心筋細胞から検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次(「主要」)ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。 図14-21は、対照群として処理される(図14)、および種々の公知の心毒性化合物を用いて処理される(図15-21)、心筋細胞から検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次(「主要」)ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。 図14-21は、対照群として処理される(図14)、および種々の公知の心毒性化合物を用いて処理される(図15-21)、心筋細胞から検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次(「主要」)ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。 図14-21は、対照群として処理される(図14)、および種々の公知の心毒性化合物を用いて処理される(図15-21)、心筋細胞から検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次(「主要」)ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。
図22は、化合物毎の血中最大臨床レベルに対する示される濃度における、示される高リスク、中リスク、および低リスクTdP(トルサードドポワンツ)化合物を用いて処理される心筋細胞から検出される蛍光振動パターンを分析することによって、本明細書に開示されるようなソフトウェアを用いて取得された種々のピーク関連読出値をプロットする、グラフである。
図23-30は、対照群として処理される(図23)、および種々の公知の神経毒性化合物を用いて処理される(図24-30)、ニューロンから検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。振動パターンの修正は、化合物の効果を反映し、ソフトウェア分析によって提供される複数の測定を介して特性評価されることができる。 図23-30は、対照群として処理される(図23)、および種々の公知の神経毒性化合物を用いて処理される(図24-30)、ニューロンから検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。振動パターンの修正は、化合物の効果を反映し、ソフトウェア分析によって提供される複数の測定を介して特性評価されることができる。 図23-30は、対照群として処理される(図23)、および種々の公知の神経毒性化合物を用いて処理される(図24-30)、ニューロンから検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。振動パターンの修正は、化合物の効果を反映し、ソフトウェア分析によって提供される複数の測定を介して特性評価されることができる。 図23-30は、対照群として処理される(図23)、および種々の公知の神経毒性化合物を用いて処理される(図24-30)、ニューロンから検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。振動パターンの修正は、化合物の効果を反映し、ソフトウェア分析によって提供される複数の測定を介して特性評価されることができる。 図23-30は、対照群として処理される(図23)、および種々の公知の神経毒性化合物を用いて処理される(図24-30)、ニューロンから検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。振動パターンの修正は、化合物の効果を反映し、ソフトウェア分析によって提供される複数の測定を介して特性評価されることができる。 図23-30は、対照群として処理される(図23)、および種々の公知の神経毒性化合物を用いて処理される(図24-30)、ニューロンから検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。振動パターンの修正は、化合物の効果を反映し、ソフトウェア分析によって提供される複数の測定を介して特性評価されることができる。 図23-30は、対照群として処理される(図23)、および種々の公知の神経毒性化合物を用いて処理される(図24-30)、ニューロンから検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。振動パターンの修正は、化合物の効果を反映し、ソフトウェア分析によって提供される複数の測定を介して特性評価されることができる。 図23-30は、対照群として処理される(図23)、および種々の公知の神経毒性化合物を用いて処理される(図24-30)、ニューロンから検出される代表的蛍光振動パターンのグラフである。一次ピークおよび二次ピークが、それぞれ、円および菱形を用いてソフトウェアによってマーキングされる。振動パターンの修正は、化合物の効果を反映し、ソフトウェア分析によって提供される複数の測定を介して特性評価されることができる。
詳細な説明
本開示は、1つ以上の生物学的細胞と関連付けられる振動イオンフラックスを表す振動蛍光を記録および分析するための方法およびシステムを提供する。分析の例証的方法は、振動パターン(同義的に、振動トレースまたは蛍光トレースと呼ばれる)を記述する一連のデータ点を生成するために、1つ以上の生物学的細胞から蛍光を検出するステップを含んでもよい。一連の勾配が、振動パターンに関して計算されてもよい。例えば、スライディングウィンドウが、それから一連の勾配が計算される一連のデータ点のサブセットを定義するために使用されてもよい。振動パターンのピークが、一連の勾配を使用して識別されてもよい。分析の別の例証的方法は、振動パターンを記述する一連のデータ点を生成するために、1つ以上の生物学的細胞から蛍光を検出するステップを含んでもよい。振動パターンにおける一次ピークおよび二次ピークが、存在する場合、識別されてもよい。二次ピークの側面が、決定されてもよい。
本開示の方法およびシステムは、いくつかの着目成分を有する振動蛍光を分析するように設計される複雑事象分析(CEA)アルゴリズムを利用してもよい。これらの成分は、ピークの複数の形状、ピークのクラスタ化、二次ピーク、規則的または不規則な異常事象、不規則な振幅または周波数、移動する閾値レベル等を含んでもよい。CEAアルゴリズムは、多くの付加的読出値を含む、平均化された値または個々の値のいずれかの一次および二次ピークの両方に関する複数の測定値を報告する能力を有する。
CEAアルゴリズムの目的は、ピーク振幅、立ち上がりおよび減衰時間、事象持続時間、周波数等の種々のパラメータを検出および測定するために、生物学的事象の一般的な形状をデジタル的に「可視化」することである。生物学的事象を可視化するために、スプリアスの非生物学的遷移(雑音)は、除斥される必要がある。
多くの「点毎」検出方法は、データ完全性を損なう事前フィルタリングのため、または雑音から生物学的に関連する遷移を区別することができないことに起因して、正確性を失う。その設計の性質によって、CEAアルゴリズムは、振動パターンを記述するデータ点のサブセットから勾配を計算することによって、事前フィルタリングを伴わずに、雑音の影響を有意に低減させる。勾配は、雑音によって発生されるより低い振幅および/または急速な遷移(すなわち、無効なピーク)を無視しながら、ピークおよびトラフの検出を可能にする。
本開示のさらなる側面が、以下の節、すなわち、(I)定義、(II)方法およびシステム概観、および(III)実施例に説明される。
I.定義
本開示に使用される技術的用語は、当業者によって一般的に認識される意味を有する。しかしながら、以下の用語は、以下のようにさらに定義され得る。
事象-振動パターンの単一の振動。事象は、とりわけ、ベースラインから所定の振幅において、および/またはベースラインから所定の振幅範囲内で開始および終了し得る。
光-紫外線、可視、および/または赤外線放射。
最大値-これの周囲の点よりも大きい値を有する、および/またはこれの周囲の点よりも基準線(例えば、下側または上側ベースライン)から遠い、実際の/概念的グラフの(および/または一連の点の)点。複数の「最大値(maximum)」は、「最大値(maxima)」である。
最小値-これの周囲の点よりも小さい値を有する、および/またはこれの周囲の点よりも基準線(例えば、下側または上側ベースライン)により近接する、実際の/概念的グラフの(および/または一連の点の)点。複数の「最小値(minimum)」は、「最小値(minima)」である。
ピーク-最大値および最大値の周囲の点を含み、随意に、最小値の対によって境界される、実際の/概念的グラフの(および/または一連の点の)点のシーケンス。ピークは、ピークの最大値の時間的位置および振幅に従って特徴付けられ得、これは、集合的に、「ピーク位置」を定義し得る一方、最大値の振幅は、「ピーク値」または「ピーク振幅」を定義する。最大値が、基準線(例えば、下側または上側ベースライン)に対して定義されるとき、基準線を上回る最大値は、正のピークを形成する一方、基準線を下回る最大値は、負のピークを形成する。
一次ピーク-事象の先行する/唯一のピーク(または有効なピーク)。
二次ピーク-事象内の一次ピークに続く任意のピーク(または有効なピーク)。
トラフ-最小値および最小値の周囲の点を含む、実際の/概念的グラフの(および/または一連の点の)点のシーケンス。トラフは、トラフの最小値の時間的位置および振幅に従って特徴付けられ得、これは、集合的に、「トラフ位置」を定義し得る一方、最小値の振幅は、「トラフ値」または「トラフ振幅」を定義する。最小値が、基準線(ベースライン等)に対して定義されるとき、基準線を上回る最小値は、正のトラフを形成する一方、基準線を下回る最小値は、負のトラフを形成する。
有効なピーク-有効性に関する所定の基準を満たす任意のピーク。
ウィンドウ-処理のためにデータセットから所与の数のデータ点を選択するアルゴリズム。例えば、5の幅を有するウィンドウが、処理のためにデータセットの5つの連続する点等の5つの点を選択する。「スライディングウィンドウ」が、処理のためにデータ点のサブセットを選択するために、点毎等でデータセットを横断して移動する。例えば、5つの点の幅を有するスライディングウィンドウが、点1~5を処理し、次いで、点毎に移動し、点2~6、3~7等を処理し得る。
II.方法およびシステム概観
本節は、本開示の例示的方法およびシステムの概観を提供する(図1および2参照)。
図1は、1つ以上の生物学的細胞(「細胞」とも呼ばれる)から振動蛍光を分析する例証的方法において実施され得る、ステップのフローチャート50を示す。ステップは、任意の好適な順序および組み合わせで実施されてもよい。
細胞は、培養下で振動イオンフラックスを呈する、任意の細胞タイプを含んでもよい。故に、細胞は、筋肉細胞(すなわち、心臓筋肉細胞(心筋細胞)、骨格筋細胞、または平滑筋細胞)または神経細胞(ニューロン)を含んでもよい。振動イオンフラックスは、細胞が、やり取りし得るように、相互に密接に関連付けて培養される細胞のセットに関して、同期された方式で、随意に、自発的に起こり得る。細胞のセットは、とりわけ、細胞スフェロイド等の3次元集合体において相互と関連付けられてもよい、または実質的な単層として配列されてもよい。下記にさらに解説されるように、細胞の単一のセットが、容器内で分析されてもよい、または細胞の単離された複製セットが、分析の前/間に別個の容器内で異なる処理に暴露されてもよい。例示的容器は、ペトリ皿、マイクロプレートのウェル、フラスコ、または同等物を含む。
細胞は、任意の好適な手順によって任意の好適な源から取得されてもよい。細胞は、幹細胞から生体外で分化されてもよい。幹細胞は、とりわけ、胚性幹細胞、成体幹細胞、または誘導多能性幹細胞(iPSC)であってもよい。他の実施例では、細胞は、動物から取得された一次心筋細胞等または一次ニューロン等の一次細胞であってもよい。
振動イオンフラックスは、イオン特有フラックスまたは集合的イオンフラックスであってもよい。例示的イオン特有フラックスは、カルシウム振動を生成する振動カルシウムフラックスである。フラックスは、プラズマメンブレンを横断する(すなわち、細胞の中および/または外への)、および/または細胞内の(例えば、筋小胞体(SR)の膜を横断する(すなわち、SRから細胞質の中への、またはそれから外への))、または同等物のイオンの移動を表し得る。
細胞の各セットが、52に示されるように、標識化および/または処理されてもよい。標識化は、細胞に対して起こる振動イオンフラックスに敏感である蛍光を有する蛍光性インジケータを用いて実施されてもよい。蛍光性インジケータは、例えば、細胞内カルシウム濃度に敏感であり、細胞内カルシウム濃度が増加するにつれてより多くの光(またはより少ない光)を放出する、蛍光性カルシウムインジケータであってもよい。例示的蛍光性カルシウムインジケータは、FLIPR(登録商標) カルシウム6、FLIPR(登録商標) カルシウム6-QF、カルシウムグリーン1、Fluo-3、Fluo-4、Fura-2、lndo-1、オレゴングリーン488、Bapta-1、Fura-4F、Fura-5F、カルシウムクリムゾン、X-rhod-1、および同等物等の化学的インジケータである。細胞は、細胞が配置される培地を介した接触によって、化学的インジケータを用いて標識化されてもよい。他の例示的蛍光性カルシウムインジケータは、遺伝子的にコード化され、(トランスフェクション、感染、または同等物を介して等)細胞の中へのコード配列の導入後に細胞内で発現される。好適な遺伝子的コード化カルシウムインジケータは、カメレオン、ペリカム、GCaMP、TN-L15、TN-humTnC、TN-XL、TN-XXL、Twitches、または同等物を含んでもよい。他の実施例では、蛍光性インジケータは、膜電位インジケータ(例えば、FluoVolt(登録商標) 膜電位染料、Di-3-ANEPPDHQ、Di-4-ANEPPDHQ等)、カリウムインジケータ、ナトリウムインジケータ、マグネシウムインジケータ、亜鉛インジケータ、pHインジケータ、または同等物であってもよい。
細胞の各セットは、選択された濃度において少なくとも1つの着目物質を用いて処理され、存在する場合、蛍光性インジケータから検出される細胞の振動蛍光に対する効果に関して物質/濃度を試験してもよい。物質は、とりわけ、10、5、2、または1キロダルトンを下回る分子量を有する小分子(例えば、薬物または薬物候補)、タンパク質、RNAまたはDNA分子等の化合物であってもよい。異なる化合物および/または異なる濃度の同一の化合物が、化合物をスクリーニングする、および/または所与の化合物に関する用量応答曲線を決定するために、細胞の個別のセットに対して試験されてもよい。細胞の各セットは、とりわけ、少なくとも1、2、5、10、30、または60分、または2、4、6、8、10、12、18、または24時間、または24~72時間等の任意の好適な長さの時間にわたって物質を用いて処理されてもよい。処理および標識化は、並行して、連続的に、または時間的オフセットを伴う重複する時間に実施されてもよい。
蛍光が、54に示されるように、生物学的細胞の各セットのうちの少なくとも1つの細胞から検出されてもよい。本蛍光検出は、時間に対して信号の強度等の少なくとも1つの細胞からの蛍光信号をサンプリングし、蛍光信号に関する振動パターンを記述する一連のデータ点(時間点とも呼ばれる)を生成する。故に、振動パターンは、時間の関数としての検出された蛍光強度としてグラフ化されてもよい。蛍光信号は、任意の好適な率、概して、とりわけ、1~100Hzの率等の1Hzを上回る一定の率において、かつ少なくとも10、30、または60秒、または少なくとも2、5、または10分等の任意の好適なサンプリング持続時間にわたってサンプリングされてもよい。蛍光検出は、画像センサ、光学点センサ、または同等物を用いて実施されてもよい。
振動パターンに関するベースラインが、56に示されるように、確立されてもよい。ベースラインは、例えば、実施例2において下記に説明されるように、ソフトウェアを使用して自動的に設定されてもよい、および/またはグラフィカルユーザインターフェースを介してユーザによって設定されてもよい。ベースラインは、デフォルトで、またはユーザからの入力に応答してのいずれかで、振動パターンの下側または上側に位置付けられてもよい(例えば、実施例2および5参照)。いくつかの実施形態では、一時的基準線が、確立されるべきベースラインの見込み場所に対向して、振動パターンの上側(または下側)に設定されてもよい。基準線に対するピークが、識別され得、ピークまたはトラフ位置の線形回帰が、ピークおよびトラフの後続識別の間にベースラインとしての役割を果たす線を見出し得る。
振動パターンの雑音レベルが、58に示されるように、推定されてもよい。雑音レベルは、振動パターンの上側または下側の近傍の信号変動に基づいて推定されてもよい(実施例2および5参照)。例えば、振動パターンのベースラインの近傍のピーク値(すなわち、最大値)(またはトラフ値(すなわち、最小値))の間の連続する差異の平均が、雑音レベルの推定値を決定するために使用されてもよい。
一連の勾配が、60に示されるように、振動パターンの一連のデータ点から計算されてもよい。例えば、振動パターンの時間軸に沿ってスライドするスライディングウィンドウが、線形回帰によって線を各サブセットにフィットすることによる一連の勾配の計算のために、データ点の連続するサブセットを選択するために利用されてもよい(例えば、実施例1参照)。言い換えると、スライディングウィンドウは、各連続する勾配の計算のために、1つの点(または2つ以上の点)だけ振動パターンの時間軸に沿ってスライドしてもよい。スライディングウィンドウは、一連の勾配が、(例えば、所与のウェルからの)所与のデータセットに関して計算される間、固定された数の3つ以上の点を包含する一定のサイズを有する。スライディングウィンドウのサイズは、ソフトウェアによって(例えば、データセットの雑音レベルおよび/またはデータ点のサンプリング率に基づいて)自動的に選択されてもよい、またはユーザによって選択されてもよい。スライディングウィンドウのサイズは、異なるデータセット(例えば、各データセットは、異なるウェルから収集される)の間で変更されてもよく、これは、サイズがデータセット毎に最適化されることを可能にする。
各振動パターンのピーク(およびトラフ)が、62に示されるように、勾配を使用して識別されてもよい。すなわち、一連の最大値および最小値が、一連の勾配に沿った(すなわち、時間に対する)勾配の符号の変化に基づいて、識別されてもよい。ベースラインを上回る各最大値は、正から負への(または振動パターンの上側におけるベースラインに関して負から正への)一連の勾配内の変化によって、密接に近似されることができる。同様に、ベースラインを上回る各最小値は、負から正への(または振動パターンの上側におけるベースラインに関して正から負への)一連の勾配内の変化によって、密接に近似されることができる。一連の勾配を使用して識別される最大値および最小値は、必要とされる場合、とりわけ、点の局所的分析および/または補間によって精緻化されてもよい。最大値および/または最小値(および対応するピークおよびトラフ)はまた、所定の基準を満たさない最大値(およびピーク)および/または最小値(およびトラフ)を除斥するために、1つ以上の他の所定の基準に従ってフィルタリング(すなわち、制限)されてもよい。所定の基準は、各対応するピーク/トラフの、および/またはピークのうちの少なくとも1つを含有する各事象の少なくとも1つの振幅および/または持続時間に関連してもよい(例えば、実施例1および5参照)。所定の基準は、蛍光信号の雑音レベルに基づいて自動的に割り当てられてもよい、および/またはユーザによって主観的に割り当てられてもよい。
各振動パターンの1つ以上のピーク関連パラメータの値が、64に示されるように、決定されてもよい。パラメータおよびそれらの値は、同義的に、読出値または記述子と呼ばれ得る。値は、62に識別されるピークを使用して決定されてもよい。値は、振動パターン測定値に関する(または少なくともその複数の事象に関する)平均値または個々の事象/ピークに関する値であってもよい。例示的値は、一次ピークのみ、二次ピークのみ、または集合的に一次および二次ピークに関するものである。値は、個々の/平均一次/二次ピーク振幅、平均一次/二次ピーク周波数、二次ピークの平均事象内周波数、事象面積、一次/二次ピーク間隔、立ち上がり勾配、減衰勾配、立ち上がり時間、減衰時間等を含んでもよい。ピーク関連パラメータのさらなる実施例が、実施例1、3、および5に説明される。
存在する場合、各処理の効果が、66に示されるように、対応する振動パターンから決定された値のうちの少なくとも1つに基づいて査定されてもよい。例えば、効果は、二次ピークの数、周波数、および/または周期等の振動パターンにおける二次ピークの側面に基づいて査定されてもよい。
図1のステップの任意の組み合わせまたは本明細書に開示される他の方法が、コンピュータ方法、コンピュータシステム、またはコンピュータプログラム製品として具現化されてもよい。故に、分析方法の側面は、完全にハードウェアの実施例、完全にソフトウェアの実施例(ファームウェア、常駐ソフトウェア、マイクロコード、および同等物を含む)、またはソフトウェアおよびハードウェア側面を組み合わせる実施例の形態をとってもよく、その全ては、概して、本明細書では、「回路」、「モジュール」、または「システム」と称され得る。さらに、分析方法の側面は、その上に具現化されるコンピュータ可読プログラムコード/命令を有するコンピュータ可読媒体(または複数の媒体)において具現化される、コンピュータプログラム製品の形態をとってもよい。
コンピュータ可読媒体の任意の組み合わせが、利用されてもよい。コンピュータ可読媒体は、コンピュータ可読信号媒体および/またはコンピュータ可読記憶媒体であり得る。コンピュータ可読記憶媒体は、電子、磁気、光学、電磁、赤外線、および/または半導体システム、装置、またはデバイス、またはこれらの任意の好適な組み合わせを含んでもよい。コンピュータ可読記憶媒体のより具体的な実施例は、以下、すなわち、ポータブルコンピュータディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ(RAM)、読取専用メモリ(ROM)、消去可能プログラマブル読取専用メモリ(EPROMまたはフラッシュメモリ)、ポータブルコンパクトディスク読取専用メモリ(CD-ROM)、光学記憶デバイス、磁気記憶デバイス、これらの任意の好適な組み合わせ、および/または同等物を含んでもよい。本開示の文脈では、コンピュータ可読記憶媒体は、命令実行システム、装置、またはデバイスによる、またはそれに関連する使用のためのプログラムを含有または記憶し得る、任意の好適な非一過性有形媒体を含んでもよい。
コンピュータ可読信号媒体は、例えば、ベースバンドにおいて、または搬送波の一部として、その中に具現化されるコンピュータ可読プログラムコードを伴う伝搬されるデータ信号を含んでもよい。そのような伝搬される信号は、限定ではないが、電磁、光学、および/またはそれらの任意の好適な組み合わせを含む、種々の形態のうちのいずれかをとってもよい。コンピュータ可読信号媒体は、コンピュータ可読記憶媒体ではなく、命令実行システム、装置、またはデバイスによる、またはそれに関連する使用のためのプログラムを通信、伝搬、またはトランスポートすることが可能である、任意のコンピュータ可読媒体を含んでもよい。
コンピュータ可読媒体上で具現化されるプログラムコードは、限定ではないが、とりわけ、無線、有線、光ファイバケーブル、および/またはこれらの任意の好適な組み合わせを含む、任意の適切な媒体を使用して伝送されてもよい。
本明細書に開示される方法の側面に関する動作を実行するためのコンピュータプログラムコードは、Java(登録商標)、Smalltalk、C++、および/または同等物等のオブジェクト指向プログラミング言語およびC等の従来の手続き型プログラミング言語を含む、プログラミング言語のうちの1つまたは任意の組み合わせにおいて書き込まれてもよい。モバイルアプリが、前述で言及されるものおよびObjective-C、Swift、C#、HTML5、および同等物を含む、任意の好適な言語を使用して開発されてもよい。プログラムコードは、完全にユーザのコンピュータ上で、部分的にユーザのコンピュータ上で、スタンドアロンソフトウェアパッケージとして、部分的にユーザのコンピュータ上かつ部分的に遠隔コンピュータ上で、または完全に遠隔コンピュータまたはサーバ上で実行されてもよい。後者のシナリオでは、遠隔コンピュータは、ローカルエリアネットワーク(LAN)または広域ネットワーク(WAN)を含む、任意のタイプのネットワークを通してユーザのコンピュータに接続されてもよい、および/または接続は、外部コンピュータに(例えば、インターネットサービスプロバイダを使用してインターネットを通して)行われてもよい。
本明細書に開示される方法の側面は、方法、装置、システム、および/またはコンピュータプログラム製品のフローチャート図示および/またはブロック図を参照して下記に説明される。フローチャートおよび/またはブロック図における各ブロックおよび/またはブロックの組み合わせは、コンピュータプログラム命令によって実装されてもよい。コンピュータプログラム命令は、コンピュータまたは他のプログラマブルデータ処理装置のプロセッサを介して実行される、命令が、フローチャートおよび/またはブロック図のブロックにおいて規定される機能/行為を実装するように、汎用コンピュータ、専用コンピュータ、または他のプログラマブルデータ処理装置のプロセッサに提供され、機械を生成してもよい。いくつかの実施例では、機械可読命令が、フィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)等のプログラマブル論理デバイス上にプログラムされてもよい。
コンピュータプログラム命令はまた、コンピュータ可読媒体内に記憶されることができ、これは、コンピュータ可読媒体内に記憶される命令が、フローチャートおよび/またはブロック図のブロックに規定される機能/行為を実装する命令を含む、製造品を生成するように、特定の様式で機能するようにコンピュータに指示することができる。
コンピュータプログラム命令はまた、コンピュータ上で実行される命令が、フローチャートおよび/またはブロック図のブロックに規定される機能/行為を実装するためのプロセスを提供するように、一連の動作ステップをデバイス上で実施させ、コンピュータ実装プロセスを生成するために、コンピュータ上にロードされることができる。
図面の任意のフローチャートおよび/またはブロック図は、本明細書に開示される方法の側面による、システム、方法、およびコンピュータプログラム製品の可能性として考えられる実装のアーキテクチャ、機能性、および/または動作を図示することを意図している。この点で、各ブロックは、規定される論理機能を実装するための1つ以上の実行可能命令を構成する、モジュール、セグメント、またはコードの部分を表し得る。いくつかの実装では、ブロックに記述される機能は、図面に記述される順序以外で行われてもよい。例えば、連続して示される2つのブロックは、実際には、実質的に並行して実行されてもよい、またはブロックは、時として、関与する機能性に応じて、逆の順序で実行されてもよい。各ブロックおよび/またはブロックの組み合わせは、規定される機能または行為を実施する、専用ハードウェアベースのシステム(または専用ハードウェアおよびコンピュータ命令の組み合わせ)によって実装されてもよい。
図2は、サンプル保持器74によって保持される生物学的細胞72から振動蛍光を検出および分析するための例証的システム70を示す。サンプル保持器74は、ここでは、それぞれ、細胞72の複製セットを含有する、複数のウェル78を有する、マイクロプレート76として描写される。システム70は、サンプル保持器を支持するためのステージ80と、相互に対してステージ80およびサンプル保持器74を移動させ、システム70の光軸上に各ウェル78を設置するための駆動機構82とを含んでもよい。
システム70はまた、対物レンズ84と、光源86と、光学センサ88(例えば、画像センサ)とを備えてもよい。光源86は、細胞72の各セットを照射し、細胞から蛍光を誘発するために、光87を発生させてもよい。細胞照射のための光は、図2に示される落射照明構成において、ビームスプリッタ90および対物レンズ84を介して細胞に伝搬してもよい。光によって誘発された蛍光91は、光学センサ88による検出のために、対物レンズ84、ビームスプリッタ90、および随意の管レンズ92を通した伝搬のために対物レンズ84によって収集され、時間依存性蛍光信号を作成してもよい。
コンピュータ94が、光学センサ88と通信し、光学センサ88から受信された蛍光信号を処理する。コンピュータ94は、命令を処理するためのプロセッサ96と、命令を記憶するためのメモリ98と、コンピュータ94とユーザとの間の通信のためのユーザインターフェース100とを含んでもよい。ユーザインターフェースは、キーボード、マウス、またはタッチスクリーン等のユーザ入力デバイスと、モニタ等のディスプレイデバイスとを含んでもよい。
III.実施例
本節は、本開示の分析方法およびシステムのさらなる実施例および側面を説明する。これらの実施例および側面は、例証のみを意図しており、本発明の全体的範囲を限定するべきではない。
(実施例1)勾配の計算
本実施例は、スライディングウィンドウを使用した振動パターンに関する勾配の例示的計算および勾配の振動パターンにおけるピークおよびトラフを識別するための勾配の使用を説明する(図3-6参照)。
図3は、カルシウムの単純な振動フラックスを受ける生物学的細胞から検出される蛍光信号112によって生成される、振動パターン110のグラフを示す。蛍光は、細胞を標識化する蛍光性カルシウムインジケータから検出される。蛍光強度は、離散的時間に検出され、一連のデータ点を生成し、データ点は、点接続線トレースを使用して、時間の関数としてプロットされる。
振動パターン110は、ベースライン116からの増加された蛍光の一連の振動114(事象とも呼ばれる)から成る。各振動114は、ここで示されるように、1つのピーク118のみを有してもよい、または下記に説明されるように、一次ピークと、1つ以上の二次ピークとを有してもよい。他の実施例では、ベースライン116は、振動パターン110の上側に位置付けられてもよく、各事象は、ベースラインの下方に進行する蛍光信号112によって特徴付けられてもよい。
図4は、蛍光信号の単一の振動114に関する図3の振動パターン110からの副次的な一連のデータ点120のグラフを示す。図3の点接続線トレースは、省略される。スライディングウィンドウ122が、それから、随意に、各データ点を中心とする、一連の最良適合線および対応する一連の勾配が算出され得る、データ点120のサブセットを選択するために使用されてもよい。スライディングウィンドウ122のサイズは、時間軸に平行に測定されるその幅を表す。スライディングウィンドウ122は、実線の輪郭で左側に図式的に示され、124における運動矢印によって示されるように、時間軸に沿って概念的にスライドした後、2つの他の例証的位置において破線の輪郭で示される。スライディングウィンドウ122は、時間軸に沿った複数の増分位置において「停止」し、それから勾配が計算される各位置を中心とするデータ点120のサブセット126を選択する。ここでは、スライディングウィンドウ122は、各増分位置において5つのデータ点120を選択する幅を有するが、任意の好適な数の3つ以上のデータ点120が、選択されてもよい。スライディングウィンドウのサイズ(すなわち、持続時間)は、一連の勾配が、所与の振動パターン110(すなわち、データ点のデータセット)に関して計算される間、各勾配の計算のために同一の数のデータ点120を選択するために、一定のままであってもよい。勾配は、点毎に計算されてもよい。スライディングウィンドウのサイズは、同一の振動パターンのための新しい一連の勾配を再計算するために、または異なる振動パターンのための一連の勾配を計算するために、変更されてもよい。振動パターンに関して計算される一連の勾配は、スライディングウィンドウ122の対応する一連の増分的オフセット位置を表してもよい。言い換えると、スライディングウィンドウ122は、データ点120のサブセット126を選択するために、とりわけ、1つまたは2つのデータ点等の固定された整数のデータ点によって、および/または固定された時間増分によって増分的に連続してオフセットされてもよい。データ点120のサブセット126は、スライディングウィンドウ122のサイズが、連続するサブセットに関するスライディングウィンドウの増分オフセットを上回る場合、相互に重複してもよい。
いくつかの実施形態では、勾配が、各データ点において計算され、勾配が算出される「スライディングウィンドウ」は、一度に1つの点を移動させる。これらの実施形態では、ウィンドウによって選択されるデータ点のサブセットは、常に相互に重複する。各点における勾配の「方向」が、勾配の方向の変化によって暗示されるような事象の全体的曲率を査定するために評価される。各点において計算される勾配は、点の時間的に前方の1つ以上の点および点の時間的に後方の1つ以上の点が、勾配に寄与するため、前向きおよび後向きの両方である。
サブセット126毎の勾配が、線形回帰によってサブセット126の点120に直線をフィットし、次いで、線の勾配をとることによって計算されてもよい。図4は、3つの例証的サブセット126にフィットされる個別の線に平行である3つのベクトル128を示す。各ベクトル128の配向は、対応するフィットされる線の勾配に合致する。各ベクトル128は、対応するサブセット126の中間点130を中心としてもよく、スライディングウィンドウ122のサイズ(すなわち、幅)に合致する時間成分を有してもよい。故に、一連のベクトル128が、スライディングウィンドウのサイズを、対応する一連のデータ点130または位置(時間および振幅)を有する一連の勾配と関連付けるために、スライディングウィンドウ122を用いて発生されることができる。
ベクトル128の一連の勾配は、データの形状、特に、データ逸脱の方向を検証することを可能にする。振動パターンの下側に位置するベースラインに関して、正の勾配は、立ち上がり位相を反映する一方、負の勾配は、減衰位相と関連付けられる。各勾配は、3つ以上の点120を有するサブセット126から計算されるため、サブセット126内の雑音は、雑音レベルが、スライディングウィンドウのサイズに対して低い場合、勾配の正確度に有意に影響を及ぼさない。このように、雑音は、本質的に除斥される。連続するベクトル128の方向の変化は、振動パターン内の遷移の対応する方向変化を反映する。したがって、連続するベクトル128の勾配が、正から負に(振動パターンの下側におけるベースラインに関して)変化するとき、これは、ピークの最大値が横断されたインジケーションである。同様に、同一のベースラインでは、勾配が、負から正に変化するとき、これは、トラフの最小値が横断されたインジケーションである。各遷移領域内のデータ点のさらなる検証が、次いで、振動パターンの各最大値および最小値の位置(時間および振幅)をより精密に決定するために実施されてもよい。
スライディングウィンドウ122のサイズは、雑音レベルに従って、特定のデータセットに関して最適化されることができる。スライディングウィンドウは、ある範囲のデータ点に及ぶため、ウィンドウは、ランダム雑音の寄与を低減させる自然な「ダンパ」として作用する。また、勾配は、関連付けられるデータ点の完全性に影響を及ぼさず、したがって、振幅値または有効な二次ピークの検出および測定を改変しない。故に、スライディングウィンドウを用いて選択されるデータ点のサブセットから計算される勾配の使用は、従来のフィルタリングに伴って起こるデータ破壊を伴わずに、データの種々のパラメータの正確な検出および測定を可能にする。
図5は、図3におけるように検出されるより複雑な振動パターン140の単一の振動114(「事象」138)のグラフを示す。ベースライン116が、振動パターン140の下側に位置付けられる。本図は、図4におけるように計算される勾配を有するベクトル128が、生物学的に関連する活性の代わりに雑音からもたらされ得る、蛍光信号のより小さい「スプリアス」変動を無視しながら、より大きいピークおよびトラフを検索するために使用され得る方法を図示する。(ベクトル128は、図示を簡略化するために、ここでは、一定の時間成分ではなく、一定の全長とともに示される。)
1つ以上の所定の基準が、振動パターン140内の有効な事象138を識別するために使用されてもよい。基準はそれぞれ、有効な事象によって満たされる。基準は、蛍光信号の他の逸脱から有効な事象を区別するために、少なくとも1つの振幅閾値142および/または少なくとも1つの持続時間閾値を含んでもよい。例えば、振幅閾値142は、蛍光信号によって横断されるトリガレベル144(線)の単一の点であってもよく、事象が、両方の方向においてトリガレベルを横断する蛍光信号によって特徴付けられる。トリガレベル144は、ベースライン116からのスパンの10%、15%、20%等の振動パターンの全振幅スパンのあるパーセンテージにおいて設定されてもよい。トリガレベルは、自動的に、および/またはユーザによって設定されてもよく、時間軸に沿って(例えば、トリガレベルを定義するトリガ線に沿って)一定であってもよい、または変動してもよい。ある場合には、第2の振幅閾値が、ベースライン(またはトリガレベル144)からの所定の振幅オフセット未満の最大値を有する各事象および/またはその中の各ピークを除斥するために設定されてもよい。第2の振幅閾値は、とりわけ、全振幅スパンのあるパーセンテージ(例えば、25%、50%、60%、70%、80%等)において、または相対蛍光単位における絶対値として設定されてもよい。
振動パターン140に沿った検索の間、事象138の開始は、蛍光信号が、ベースライン116から離れる方向においてトリガレベル144を横断するときに検出され得る。本横断は、ピーク検出を開始し得る。事象138は、トリガレベル144が、ベースライン116に向かう方向において横断されるときに終了すると見なされ得る。しかしながら、事象138の周囲の左側および右側トラフは、下記に解説されるように、トリガレベル144の下方にマーキングされてもよい。
各点130におけるベクトル128の勾配は、遷移の方向を決定するために、検索の間に評価されてもよい。(例示的点130a-130hが、ここで示される。)点130aにおける正の勾配が、蛍光信号の立ち上がり位相146と関連付けられ、点130bにおける負の勾配が、蛍光信号の減衰位相148と関連付けられる。ピーク毎の最大値の近傍が、連続するベクトル128の勾配が、正から負に(下側におけるベースライン116を用いて)変化するときに検出される。例えば、ベクトル128の点130c、130d、および130eは、少なくとも、同一の事象138の一次ピーク118および二次ピーク150a、150bに関する個別の最大値に非常に近接する。トラフ毎の最小値の近傍が、連続するベクトル128の勾配が、負から正に(下側におけるベースライン116を用いて)変化するときに検出される。例えば、ベクトル128の点130f、130gは、少なくとも、事象138を境界する左側トラフ152aおよび右側トラフ152bに関する個別の最小値に非常に近接する。(ピーク118と150aと150bとの間のトラフは、図示を簡略化するために、ここでは明確に識別されない。)
ベクトル128を作成するために使用されるスライディングウィンドウのサイズは、検索によって迂回されるであろう低振幅遷移の大きさを決定する。例えば、点130hの周囲の遷移154は、本領域における勾配が、符号の変化を受けない(すなわち、それらが、負のままである)ため、検索においてピークまたはトラフとして識別されない。ウィンドウのサイズ(したがって、ベクトル128の長さ)が、大きくなるほど、迂回されるであろう遷移振幅は、より大きくなる。故に、ベクトル128は、集合的に、蛍光信号を破壊しないフィルタとして作用する。
各遷移点の周囲の狭い領域内の雑音分析が、随意に、適用され、数点離れたより良好なピーク位置の近位にあり得る非常に短い事象または「低振幅」事象を除斥することによって、各ピーク/トラフ位置の検出正確度をさらに改良することができる。
図6は、二次ピーク150aの周囲でとられる、図5の単一の振動114(および事象138)の一部のみのグラフを示す。ピークは、ピーク最大値156および少なくとも1つの隣接する左側または右側トラフ最小値158a、158bに関連し得る、1つ以上の基準に従って、有効性に関してフィルタリングされてもよい。例えば、所定の基準は、(最大値156と左側最小値158aおよび/または右側最小値158bとの間で測定される)各ピークの局所的振幅160に関する閾値を超えること、および/または所定の振幅において(例えば、左側最小値158aにおいて)測定されるピークの持続時間162に関する閾値を超えることに関連してもよい。局所的振幅160および/または持続時間162に関する閾値は、ユーザ規定される、または振動パターンの雑音レベルおよび/または振動パターンのサンプリング間隔(すなわち、サンプリング率の逆数)から自動的に発生されてもよい。
(実施例2)ベースライン設置および雑音推定
本実施例は、振動パターンに関するベースラインを自動的に設定し、ベースラインを設定する間に識別される負のピークから振動パターンの雑音レベルを推定することに対する例示的アプローチを説明する(図7および8参照)。
本明細書に開示されるアルゴリズムは、データ振幅スパンの10%以内に該当する変動の振幅を測定し、四分位数間範囲分析を用いて外れ値を除去し、最後に、線形回帰を用いて結果として生じる振幅に線をフィットすることによって、データセット毎に自動的にベースラインを推定することができる。結果として生じる回帰線は、ベースラインとして提案または使用されてもよい。
図7および8は、データセットに関するベースライン116を確立することに対する例示的アプローチを図示する。一時的基準線170(例えば、上側ベースライン)が、設定されてもよい。例えば、基準線170は、それぞれ、データセットの先行区分176および後続区分178に関する最大振幅を表す、点172、174の対によって定義されてもよい。各区分176、178は、とりわけ、10、20、30、40、または50%等のデータセットの任意の好適な割合を表してもよい。振動パターンの先行端部および後続端部の近傍の点は、端部が、多くの場合、アーチファクトを含むため、除外されてもよい。基準線170の位置は、ユーザが、グラフィカルユーザインターフェースを介してハンドル180a、180bを移動させることを可能にすることによって、一方または両方の端部において変更されてもよい。また、または代替として、ユーザは、グラフィカルユーザインターフェースを介して、時間軸に沿って個別のハンドル182a、182bを移動させることによって、一方または両方の端部において分析のために有効であると見なされるデータセットの時間範囲を調節してもよい。
データセットの振幅スパンが、算出されてもよい。グローバル振幅最大値(Ymax)およびグローバル振幅最小値(Ymin)が、検索を用いて見出されてもよい。振幅スパンは、以下、すなわち、Ymax-Yminとして定義される。
閾値線183が、基準線170からの振幅スパンの70、80、90、または95%において等、基準線170に対向する振幅スパンの下側に向かって設定されてもよい。例えば、基準線170からの振幅スパンの90%における閾値線183に関する位置が、以下、すなわち、Ymin+0.1×(振幅スパン)として計算されてもよい。ユーザは、グラフィカルユーザインターフェースを介して、振幅軸に沿って個別のハンドル184a、184bを移動させることによって、一方または両方の端部において閾値線183を調節してもよい。
基準線170に対するピークに関する検索が、実施されてもよい(図7および8参照)。本実施例では、検索は、同様に閾値線183の下方に位置する、基準線170から離れるような(その下方の)局所的最大逸脱を識別することによって、負のピークを見出す。(言い換えると、本ピーク検索は、図5に関して上記に説明されるものの逆である。)検索は、図4および5に関して上記に説明されるような一連の勾配を使用して実施され、勾配は、スライディングウィンドウに関する比較的に小さいサイズ(例えば、3、4、または5つのデータ点の幅)を使用して取得されてもよい。小さいスライディングウィンドウは、雑音の排除を殆ど伴わずに、ピーク検出に関する高い感度を提供する。故に、データセットに関する雑音レベルもまた、検索において見出されるピークの振幅値から推定されてもよい。
一次ピーク118および二次ピーク150が、識別されてもよい。ここでは、および続く実施例では、円が、一次ピーク118の最大値をマーキングし、菱形が、二次ピーク150の最大値をマーキングする(図8参照)。これらの2つのタイプのピーク118、150はまた、振動パターンが、グラフ化され、(例えば、グラフィカルユーザインターフェースを介して)ユーザに表示されるとき、区別可能にマーキングされてもよい。しかしながら、ベースラインを設定するために、全ての検出されたピークは、記録され、同等に、すなわち、一次ピークと二次ピークとの間のいかなる区別も伴わずに扱われてもよい。
線形回帰を使用して、直線が、検出されたピーク振幅を通してフィットされてもよい。本線は、ベースライン116の初期近似値としてとられてもよい。トリガレベル144は、最初に、ベースラインの上方のデータスパンの10%において設定されてもよい。これらの自動的に割り当てられるレベルは、続けて、グラフィカルインターフェースを介してユーザによって、または値を明示的に設定することによって調節されることができる。
線形回帰に先立って、ピーク118、150の最大値におけるデータ点は、フィルタリングされる場合とそうではない場合がある。例えば、ベースラインを選定する前に、外れ値が、四分位数間範囲分析を使用して等、除去されてもよい。第1四分位数を下回る、または第3四分位数を上回る1.5四分位数間範囲を上回る点は、除斥されてもよい。
雑音レベルが、ピーク118、150から推定されてもよい(図8参照)。例えば、雑音推定値が、(群と見なされる)ピーク118、150の振幅の間の連続する差異の平均として計算されてもよい。雑音推定値は、雑音レベルとして直接使用されてもよい、または雑音レベルを計算するために使用されてもよい。本雑音レベルは、単独で、またはサンプリング間隔と併せて、所与のデータセットに関するスライディングウィンドウ(実施例2参照)に関する好適なサイズの自動的選択を可能にし得る。本サイズ選択に関する例示的アルゴリズムは、ヒューリスティック、すなわち、[0.3/サンプリング間隔(秒単位)]に[雑音レベル/100]の「雑音係数」を加算したものである。アルゴリズムは、許可されるサイズの範囲からウィンドウサイズを選択してもよい。範囲は、奇数のデータ点のみ(例えば、3、5、7等)、偶数のデータ点のみ(例えば、4、6、8等)、または奇数および偶数(例えば、3、4、5、6等)を含んでもよい。雑音レベルはまた、局所的振幅160に関する好適な閾値に関する自動的に発生される値を算出し、より小さいピークを無効として除斥するために利用されてもよい(実施例1および5もまた参照)。データサンプリング率は、持続時間162に関する好適な閾値を自動的に発生させ、非常に短期的なピークを無効として除斥するために使用されてもよい。
(実施例3)着目パラメータ
本実施例は、本明細書に説明されるアルゴリズムを使用して振動パターンから測定され得る、例示的着目パラメータを説明する(図9参照)。
振動パターンの3つの事象138が、示される。開始点190および終了点192が、事象138毎にマーキングされ、蛍光信号は、対向する方向においてトリガレベル144を横断する。
本明細書に説明されるパラメータのうちのいずれかが、個々のピーク/事象に関して報告されてもよい、または所与の振動パターンの一連のピーク/事象にわたって平均化されてもよい。事象138の各一次ピーク118は、一次ピーク振幅194を有する。一次ピーク振幅は、一次ピーク118の最大値とベースライン116との間の振幅差として測定されることができる。線形減衰勾配196が、一次ピーク118の最大値と事象138に関する終了点192との間に延在する直線によって定義されてもよい。
一次ピーク間隔198(一次ピーク周期とも呼ばれる)が、隣接する一次ピーク118の最大値の間に定義される。一連の事象138が、連続する一次ピーク間隔198を定義し、これは、1分あたりピーク(PpM)等の単位時間あたりの一次ピークとして表される、一連の事象に関する一次ピーク率に変換されてもよい。
二次ピーク周期200が、事象内またはその間の隣接する二次ピーク150の最大値の間に定義される。振動パターンに関する二次ピーク周期200は、1分あたりピーク(PpM)等の単位時間あたりの二次ピークとして表される、二次ピーク率に変換されてもよい。各二次ピーク150は、二次ピーク振幅202を有し、これは、二次ピークの最大値とベースライン116との間で測定されてもよい。
立ち上がり勾配204および減衰勾配206が、事象138毎に計算されてもよい。これらの勾配はそれぞれ、最大値の10~80%または30~70%等の事象の最大値のパーセンテージの間で定義されてもよい。
各事象138の持続時間208が、最大振幅から、とりわけ、10、20、30、40、50、60、70、80、または90%において等の事象の最大振幅からの規定されたパーセンテージにおいて計算されてもよい。代替として、または加えて、ピーク210からの持続時間が、事象の一次ピーク118の最大値において開始される事象毎に測定されてもよい。ピークからの持続時間は、最大値から、とりわけ、10、20、30、40、50、60、70、80、または90%等の事象の最大値からの規定されたパーセンテージにおいて測定されてもよい。
(実施例4)ピーク検出に対するウィンドウサイズの効果
本実施例は、ピーク検出の感度に対するウィンドウサイズの変更の効果を説明する(図10および11参照)。
実施例1におけるように計算される勾配に基づくピーク見出アルゴリズムの性能が、拍動する心筋細胞から収集された蛍光強度データに対して試験された。心筋細胞は、蛍光性カルシウムインジケータを用いて生体外で標識化され、対照群心筋細胞に存在する規則的なカルシウム振動を擾乱させるために、心毒性化合物を用いて処理された(例えば、実施例1参照)。同一のデータが、図10および11にグラフ化され、複雑な振動パターン220を生成する。パターンは、それぞれ、対照群細胞の振動に対してより長い不規則な減衰位相を呈する、一連の振動114から成る。減衰位相は、早期の後脱分極(EAD)様ピーク(すなわち、二次ピーク)によって特徴付けられる。
ピーク検索が、11個の点の自動的に決定されたスライディングウィンドウサイズ(図10)または3個の点のユーザ選択されたウィンドウサイズ(図11)を用いてデータに対して実施された。各振動の一次ピーク118が、円を用いてマーキングされ、二次ピーク150が、菱形を用いてマーキングされる。図10では、より大きいウィンドウサイズでは、低振幅遷移は、無視される。図11では、より小さいウィンドウサイズでは、低振幅遷移は、ピークとして検出される。故に、ピーク検出の感度は、随意に、小さすぎる/過渡的である検出されたピークを無効として見なすための雑音除斥と併せて、ウィンドウサイズの思慮深い選択によって制御されることができる(例えば、実施例1および5参照)。
(実施例5)分析ソフトウェアのためのダイアログボックス
本実施例は、分析ソフトウェアへのユーザ入力を促進するためにグラフィカルユーザインターフェースによって表示される、例示的ダイアログボックスを説明する(図12A、12B、13A、および13B参照)(図9もまた参照)。
図12A、12B、13A、および13Bは、分析最適化およびピーク分析の読出値(すなわち、記述子)のリストを制御する、ダイアログボックスのスクリーンショットを示す。ダイアログボックスは、2つのタブを含有する。「オプション」タブは、分析設定およびデータ範囲へのアクセスを提供する。「測定値」タブは、出力シートにおける表示のために選択され得る、事象の性質を含有する。これらのタブの例示的側面および特徴が、下記に説明される。
オプションタブ
事象極性。2つのボタン、すなわち、正および負が、事象極性を選定するために利用可能である(図12A参照)。正の事象は、下側ベースラインを上回る蛍光の増加を伴い、負の事象は、上側ベースラインを下回る蛍光の減少を伴う。
ベクトル長を選択する。検索ベクトル長(すなわち、スライディングウィンドウのサイズ)は、良好なピーク検出のための最も重要な変数であり得る(図12A参照、図4および5もまた参照)。検索ベクトルは、データセットのデータ点の一連のサブセットから発生され、サブセットは、時間軸に沿ってスライディングウィンドウを増分的に移動させることによって選択される。検索ベクトルが、各点において発生される。ベクトルは、ウィンドウ幅を中心とし、-((ウィンドウ幅-1)/2から+((ウィンドウ幅)-1)/2に及ぶ、前向きおよび後向きデータ点の両方を使用して算出される。データセットの対向する端部の近傍の勾配は、適切に減少する数のデータ点を使用して算出される。線形回帰が、一連の検索ベクトルを発生させるために、データ点のサブセット毎に実施される。言い換えると、スライディングウィンドウは、データセットに沿ってスライドし、各データ点における勾配をチェックし、勾配の方向の変化(すなわち、正から負または負から正への勾配の符号変化)に注目することによって、遷移(最大値/ピークおよび最小値/トラフ)の存在を決定する。サンプリング率に対する検索ベクトルの長さは、遷移を検出する感度を決定する。より長いベクトル長は、雑音(すなわち、より低い振幅および/またはより短い持続時間の事象/ピーク)を自動的にフィルタリングして除去するであろう一方、より短いベクトル長は、より低い振幅およびより短い持続時間の遷移を検出するであろう。
3つのボタン、すなわち、「自動的に割り当てられる長さ」、「全てのウェルに対して同一の長さ」、および「ウェル毎」が、ベクトル長が割り当てられる方法を選定するために利用可能である(図12A参照)。ソフトウェアは、「自動的に割り当てられる長さ」が、選定されるとき、サンプリング率および雑音振幅の推定値を使用し、ベクトル長を自動的に算出する。自動的に発生されるベクトル長は、概して、データ分析のための良好な開始点である。ユーザは、「ウェル毎」ボタンが、選定される場合、ウェル毎に(すなわち、各異なる振動パターンを記述するデータ点のセット毎に)異なるベクトル長を選択することができる。
動的閾値。本オプションは、有効なピークに関する下限を設定する(図12A参照)。本閾値を下回るピーク振幅を有する全ての検出されたピークは、無効と見なされ、無視されるであろう。本限界の値は、本実施例におけるベースラインを上回る相対蛍光単位(RFU)として与えられる。2つのボックスが、動的閾値を定義する線の左側端部および右側端部に関するベースラインを上回る異なる閾値振幅値を打ち込むために利用可能である。他の実施例では、動的閾値は、データセットの振幅スパンのパーセンテージとして設定されてもよい。例えば、所与のウェルに関するデータ点が、10,000相対蛍光単位(RFU)の範囲に及ぶ場合、80%の設定は、8,000RFUのカットオフ限界を規定するであろう。
トリガレベル。本レベルは、時間軸に沿って延在するトリガ線によって定義され、事象が、開始され、終了すると見なされるときを決定する(図12A参照)。「事象」が、両方の方向においてトリガ線を横断する蛍光信号によって定義される。しかしながら、事象の振幅は、ベースラインに対して測定される。事象の左側および右側トラフの検出は、トリガレベルによって限定されず、これらの測定値は、ベースラインまで延在することができる。事象持続時間は、とりわけ、2つの側方のトラフ位置の間の時間的距離として、またはトリガ線上の事象に関する2つの横断する点の間の時間的距離によって測定されることができる。トリガレベルは、デフォルトで(データ範囲に対して)ベースラインの10%上方に設定される。本レベルは、データセット(ウェルデータ)毎に個々に設定および変更されることができる。
ベースラインレベル。ベースラインレベルは、検出範囲の下端およびベースラインの位置を定義する。全ての振幅が、トラフ値ではなく、ベースラインレベルに対して測定される。
レベル名(動的閾値、トリガレベル、およびベースラインレベル)は、グラフウィンドウ内の対応する線の色に合致するように、ダイアログボックス内で色分けされる。これらのレベルはそれぞれ、左側端部および右側端部を有する個別の線によって定義されることができる。端部は、左側マウスボタンを用いて端部におけるハンドルを掴み、上下に移動させることによって別個に移動されることができる。レベル線全体が、左側マウスボタンを用いてハンドルから離れた任意の場所の線を掴み、上下に移動させることによって上下に移動されることができる。レベル線位置もまた、スピンナを用いてか、または値を直接打ち込むかのいずれかによって、個別のL(左側)またはR(右側)編集ボックス内の値を変更することによって設定されることができる。「ロック」特徴は、右側または左側のいずれかのエッジ値の調節に応じて、線端部を一斉に移動させるであろう。本特徴は、ダイアログボックスのみに適用され、マウスによる位置付けに影響を及ぼさない。
デフォルトレベルを設定する。本ボタンを押すことは、ベースラインおよびトリガレベルをそれらのデフォルト位置にリセットするであろう(図12A参照)。
全てのウェルを処理する(図12B参照)。本アイテムが、チェックされる場合、全ての選択されたウェルデータが、処理されるであろう。チェックされない場合、現在選択されているウェルのみが、処理されるであろう。
データ群(図12B参照):
ウェル。分析が、選択され、「詳細」グラフウィンドウ内に現れるウェルのみに適用されるであろう。選択されたウェルのみが、任意の所与の時間にグラフ内に現れる。表示するウェルデータは、「ウェル」コンボボックス内の個別のデータ系列を選択することによって規定されることができる。
事象除斥群(図12B参照):
最小振幅。本アイテムは、有効として許容されるであろう、ベースラインから測定されるような最小振幅を規定する。最小振幅値を下回る最大値を有する一次/二次ピークを形成する逸脱は、除斥されるであろう。最小振幅は、最小振幅が、独立して調節可能である左側および右側端部を有する線に沿った値によって定義される代わりに、単一の値であることを除いて、「動的閾値」(図12A参照)と実質的に同一である。
最小持続時間。本アイテムは、有効として許容されるであろう事象の最小持続時間を規定する(図12B参照)。事象持続時間は、トリガレベルを横断することによって定義されるように、左側および右側トラフ値の間で、または事象の開始と終了との間で測定されてもよい。最小持続時間値よりも短い持続時間を伴う逸脱は、除斥されるであろう。
全てのウェルに適用する。本アイテムが、チェックされる場合、編集ボックス内に現れる振幅および持続時間値は、全てのウェルからのデータに適用されるであろう。チェックされない場合、個々のウェル毎に規定される値が、使用されるであろう。
雑音除斥群(図12B参照):
最小振幅。本アイテムは、有効なピークの局所的振幅に関する最小振幅閾値を規定する。ピーク(有効または無効)に関する局所的振幅は、ピークの振幅値と最近傍の左側(および/または右側)トラフの振幅値との間の振幅差として測定される。最小振幅閾値を下回る局所的振幅を有するピークは、無効として除斥されるであろう。
最小持続時間。本アイテムは、有効なピークに関する最小持続時間閾値を規定する。ピーク(有効または無効)に関する持続時間は、(a)2つの隣接するトラフのより低い方に関する時間値と(b)ピークの対向する側上の同等の振幅に関する時間値との間の時間差の絶対値として測定される。最小持続時間閾値よりも短い持続時間を有するピークは、無効として除斥されるであろう。
全てのウェルに適用する。本アイテムが、チェックされる場合、編集ボックス内に現れる振幅および持続時間閾値に関する値は、全てのウェルからのデータ(すなわち、別個の振動パターンに関するデータセットの全て)に適用されるであろう。チェックされない場合、個々のウェル毎に規定される値が、使用されるであろう。
自動。ソフトウェアは、各データセットのおおよその雑音レベルを測定する。最初に、ピーク見出アルゴリズムは、短い検索ベクトル長(3等)を使用して、ベースラインからのデータセットの振幅スパンのパーセンテージ範囲(例えば、0~10%)内の全てのピーク(「雑音ピーク」)を位置特定する。雑音ピークは、ベースラインに対向する基準線に対して最大値を有し得る。(例えば、下側ベースラインでは、雑音ピークは、振動パターンの上側に位置する基準線に対して最大値を有する負のピークであり得る(実施例2参照)。)雑音推定値が、次いで、四分位数間範囲内に該当する雑音ピークの連続する最大値の間の絶対差の平均として算出される。雑音レベルは、雑音推定値の30%としてとられる。雑音推定値および雑音レベルは、データが、比較的にクリーンであり、雑音の大部分が、ベースラインの近傍に位置する場合のみ妥当である。
測定値タブ(図13Aおよび13B参照):
本タブは、統計ページにおいて報告されるべきであるそれらの測定値を規定するために使用される。本ページは、ウェル(群)毎の結果、ウェルにおいて検出される事象の平均、および該当する場合、事象毎の個々の値を表示する。
全てを選択する。本ボタンは、表示のために事象の全てを選択する(図13A参照)。
いずれも選択しない。本ボタンは、事象表示選択をクリアする。
平均ピーク振幅。平均ピーク振幅は、相対蛍光単位(RFU)において表される、所与のウェルに関して検出される事象の有効な一次ピークの最大値の代表的振幅である。代表値を計算するための各ピーク振幅は、ピークの最大値とベースラインとの間で測定される。
ピークの数。本記述子は、所与のウェルに関して組み合わせられる有効な一次ピークの合計数または有効な一次ピークおよび有効な二次ピークの合計数である。
平均ピーク率。本記述子は、有効な1分あたりの一次ピーク(PpM)の数である。心臓データに関して、これは、「1分あたり心拍数」(BPM)と同等である。
事象あたりのEAD様ピークの数。本記述子は、事象における、またはデータセットに関する有効な二次ピーク(EAD様ピーク)の数である。本アイテムは、有効な事象あたりの二次ピークの平均数、平均の標準偏差、データセットに関する有効な二次ピークの合計数を報告する。
平均EAD様ピーク率(PpM)。本記述子は、1分あたりピーク(PpM)において表される、データセット(所与のウェルに関する)において検出される有効な二次ピーク(EAD様ピーク)の代表的率である。
EAD様ピークの数のSD。事象あたりのEAD様ピークの数の標準偏差。
10~90%CTD。これらの記述子は、事象の一次ピークの最大値からベースラインまでの規定されたレベルにおける秒単位における事象の持続時間(例えば、カルシウム過渡持続時間)である。例えば、CTD10は、最大値からベースラインまでの振幅距離の10%である振幅レベルにおいて測定される事象の持続時間である。上側における10%から下側における90%までのCTDが、測定される。随時、トラフは、ベースラインからある程度の距離にあり、ピークから最も遠いCTDの測定を省略する。
10~90%CTDP。これらの記述子は、一次ピークの最大値の時間的位置からベースラインに対する最大値からの規定されたレベルまでの事象の持続時間である。(CTDPは、ピークからのカルシウム過渡持続時間である。)例えば、CTDP10は、ピークの最大値からの振幅距離の10%のレベルにおけるピークからベースラインまでの事象の持続時間である。10%~90%のCTDが、測定される。随時、トラフは、ベースラインからある程度の距離にあり、ピークから最も遠いCTDPの測定を省略する。
面積。事象に関する左側および右側トラフによって定義されるような、事象の開始から終了までに測定される、所与の事象に関する振動トレースとベースラインとの間の面積。面積に関する単位は、RFU・秒である。
ピーク間隔。本測定値は、間隔の標準偏差および平均を比較することによって、有効な一次ピークの間隔の規則性(秒単位)を決定する。測定値は、標準偏差が、平均の閾値パーセンテージ(例えば、50%)を下回る場合、ピークの均一な間隔(OK)を報告するか、標準偏差が、閾値パーセンテージを上回る場合、不規則な間隔(IRREG)を報告するかのいずれかである。
勾配。勾配測定に関するピークへの、およびそれからのパーセンテージが、関連付けられる編集ボックス内で規定される。典型的には、勾配は、ピーク値から10~80%または30~70%で測定される。
(実施例6)心筋細胞を用いた化合物試験
本実施例は、実施例5に説明されるソフトウェアによって測定される種々のパラメータに対する効果に関して心筋細胞に対して心毒性化合物を試験することから取得された結果を説明する(図14-22参照)。
化合物スクリーニングおよび毒性査定のための生物学的に関連する予測的細胞ベースのアッセイの開発は、薬物発見における主要な課題である。本研究の焦点は、ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の心筋細胞を使用して、高処理能力適合心毒性アッセイを確立することであった。生体外不整脈誘発モデルとしてのヒトiPSC由来の心筋細胞の有用性を査定するために、濃度依存性および応答が、低、中、および高トルサードドポワンツ(TdP)リスクカテゴリに関連する28種の薬物に関して評価された。(化合物は、Comprehensive in Vitro Proarrhythmia Assay (CiPA) Initiativeによって提案された。)心筋細胞自発活性の収縮率およびパターンに対する種々の化合物の影響が、カルシウム感受性染料を用いた高速運動学的蛍光によって測定された細胞内Ca2+振動の変化によって監視された。高度な画像分析方法が、Ca2+振動パターンのマルチパラメータの特性評価を提供するために実装された。本アッセイは、拍動周波数、振幅、ピーク幅、および立ち上がりおよび減衰時間等のパラメータの特性評価を可能にする。結果は、生体外の薬物誘発催不整脈性効果を検出するためのhiPSC心筋細胞の有用性を実証する。
iPSC由来の心筋細胞は、自発的な同期されたカルシウム振動を発生させる。FLIPR(登録商標) Penta(登録商標)システムを用いた高速蛍光撮像が、EarlyTox(登録商標)心毒性キットを用いた細胞内Ca2+レベルの変化によって監視されるような心筋細胞におけるCa2+振動のパターンおよび周波数を測定するために使用された。28種の公知の心毒性化合物のセットに加えて、いくつかのベンチマーク化合物および陰性対照群が、アッセイにおいて試験された。
iPSC由来の心筋細胞:Cellular Dynamics International (CDI) iCell(登録商標) 心筋細胞2からの凍結保存されたヒトiPSC由来の細胞が、実験のために使用された。細胞は、解凍され、20,000/ウェル(96ウェルフォーマット)または10,000/ウェルにおいて384ウェルフォーマットプレート(Corning)にプレーティングされ、維持培地において7日にわたって培養された。3D培養における強い同期性収縮の存在が、実験を実行することに先立って目視で確認された。加えて、心筋細胞1を伴うアッセイ用384ウェルプレートが、Ncardia, Inc.から取得された。プレートは、事前プレーティングされた状態で出荷され、到着後2日にわたって回復することを可能にされた。
心筋細胞は、15、30、60、または90分、または24時間にわたって化合物に暴露された。
細胞内Ca2+振動が、通常のプロトコルに従って、EarlyTox(登録商標)カルシウム染料(Molecular Devices)を使用して査定され、細胞は、測定前に2時間にわたって染料を装填された。
iPSC由来の心筋細胞におけるカルシウム振動の測定は、毒性査定のための有望な方法である。本作業は、臨床データによる、高、中、または低リスクとしてカテゴリ化される28種のCiPA化合物のセットの評価に焦点を当てる。
新しい高速カメラを装備するFLIPR(登録商標) Penta(登録商標)システムは、心筋細胞におけるカルシウム振動パターンのより良好な分解能を可能にする。ScreenWorks(登録商標) Peak Pro(登録商標) 2ソフトウェアは、20個を上回る利用可能なパターン記述子を使用して、複雑な事象分析およびパターンの詳細な特性評価を可能にする。アッセイは、開発中の薬物を試験し、潜在的心毒性有害性に関して化学物質をスクリーニングするために使用されることができる。
図14-21は、示される化合物および濃度を用いた30分にわたる処理後に開始される、2分にわたって記録された対照群および化合物処理心筋細胞に関するカルシウム振動の代表的トレースを示す。カルシウム振動パターンへの擾乱が、化合物毎に説明される。
対照群トレース(心筋細胞のDMSO処理)が、図14に示される。一次ピーク118(円を用いてマーキングされる)のみが、検出可能である。一次ピークは、相互から均一の振幅および間隔を有する。
図15は、1μMの濃度におけるE-4031を用いて処理された心筋細胞からのトレースを示す。一次ピーク118および二次ピーク150が、存在する。一次ピークは、延長される。
図16は、1μMの濃度におけるイブチリドを用いて処理された心筋細胞からのトレースを示す。一次ピーク118および二次ピーク150が、存在する。一次ピークは、延長される。
図17は、10μMの濃度におけるドフェチリドを用いて処理された心筋細胞からのトレースを示す。一次ピーク118のみが、検出されるが、相互から不規則な間隔を伴う。
図18は、10μMの濃度におけるキニジンを用いて処理された心筋細胞からのトレースを示す。一次ピーク118および二次ピーク150が、検出される。一次ピークは、延長され、任意の相互から不規則な間隔を有する。
図19は、10μMの濃度におけるソタロールを用いて処理された心筋細胞からのトレースを示す。一次ピーク118および二次ピーク150が、検出される。一次ピークは、延長され、任意の相互から不規則な間隔を有する。
図20は、1μMの濃度におけるアステミゾールを用いて処理された心筋細胞からのトレースを示す。いかなる有効なピークも、検出されず、したがって、「停止」振動条件が、報告される。
図21は、1μMの濃度におけるニフェジピンを用いて処理された心筋細胞からのトレースを示す。一次ピーク118のみが、検出されるが、対照群よりも有意に高い周波数において検出される。
図22は、正規化された濃度の範囲にわたる化合物に関する異なる読出値の集計および比較を示し、化合物は、公知の心毒性に従って、3つの群、すなわち、高毒性、中毒性、および低毒性に群化される。読出値は、二次ピークの存在、ピーク延長、一次ピークの間隔/振幅の不規則性、対照群に対する一次ピークの周波数の増加、停止条件(有効なピークなし)、対照群に対する一次ピークの周波数の減少、および振動パターン内の一次ピークの振幅変化を含む。グラフは、Cmax(血中最大臨床濃度)に匹敵する濃度における二次ピークおよびピーク延長の出現が、明白に心臓毒性の強いインジケータである(またはそれと相関する)一方、他の読出値の修正が、必ずしも心毒性効果を示すわけではないことを実証する。
(実施例7)ニューロンを用いた化合物試験
本実施例は、分析ソフトウェアによって測定される種々のパラメータに対する効果に関して生体外でニューロンを用いて神経毒性化合物を試験することから取得された結果を説明する(図23-30参照)。
より効果的かつより安全な薬物の開発を加速させるために、薬物発見および毒性学スクリーニングのためのより複雑な生物学的に関連する予測的細胞ベースのアッセイの必要性が、高まっている。ヒトiPSC由来の神経3D共培養(StemoniX(登録商標) microBrain(登録商標) 3Dプラットフォーム)が、生来のヒト皮質脳組織の構成により密接に類似する高処理能力スクリーニングプラットフォームとして開発された。神経スフェロイド3D共培養は、同一のドナーからのアストロサイトとともに共分化および成熟される、iPSC由来の機能的に活性の皮質グルタミン酸作動性およびGABA作動性ニューロンの生理学的に関連する共培養である。3D神経スフェロイドは、高度に機能的な神経回路を作成する、シナプスが富化される神経ネットワークを含有し、自発的な同期された容易に検出可能なカルシウム振動を示す。
複雑なカルシウム振動の分析のための新しい方法が、本明細書に開示される。本方法は、振動ピークの検出およびマルチパラメータの特性評価を可能にする。マルチパラメータの特性評価は、振動率(すなわち、一次ピークの周波数)、一次ピークの幅および振幅、二次ピークの記述子、波形不規則性、およびいくつかの他の重要な読出値を含んでもよい。
microBrain(登録商標) 3Dスフェロイドにおける神経細胞は、自発的な同期されたカルシウム振動を発生させる。FLIPR(登録商標) Penta(登録商標)システムによる高速運動学的蛍光撮像が、FLIPR(登録商標)カルシウム6アッセイキットを用いた細胞内Ca2+レベルの変化によって監視されるような神経スフェロイドのCa2+振動のパターンおよび周波数を測定するために採用された。NMDA、GABA、およびAMPA受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト、カイニン酸、および鎮痛薬および抗癲癇薬を含む、公知の神経調節物質のセットが、試験された。384ウェルプレート全体の各ウェルからの蛍光が、FLIPR(登録商標) Penta(登録商標)システムを使用する高速撮像によって、2Hz(0.5秒サンプリング間隔)の周波数において同時に記録された。
ScreenWorks(登録商標) Peak Pro(登録商標) 2ソフトウェアモジュールにおいて実装される高度な分析方法が、Ca2+フラックス振動パターンのマルチパラメータの特性評価を提供する。本表現型アッセイは、振動周波数、振幅、ピーク幅、ピーク立ち上がりおよび減衰時間、およびピーク振幅/間隔不規則性等の読出値を作成する。神経活性の調節物質の効果が、いくつかの測定値における変化を測定することによって評価された。
神経活性のいくつかの公知の調節物質を含む、20種以上の化合物のセットが、異なる時点および濃度においてアッセイされ、EC50値が、化合物効果に関して計算された。時点は、0、15、30、60、90、および120分、および24時間を含んでいた。変化が、対応する神経調節物質の予期される効果に対応する、ピーク周波数の抑制または活性化、または他の測定値として観察された。
図23-30は、示される化合物および濃度を用いた30分の処理後に開始される、10分にわたって記録された対照群および化合物処理神経スフェロイドに関するカルシウム振動の代表的トレースを示す。
対照群トレース(スフェロイドのDMSO処理)が、図23に示される。一次ピーク118(円を用いてマーキングされる)のみが、検出可能である。一次ピークは、相互から若干均一の振幅および間隔を有する。
図24は、3μMの濃度におけるMK-801を用いて処理されたスフェロイドからのトレースを示す。一次ピーク118は、(図23と比較して)可変振幅を有する。1つの二次ピーク150のみが、検出される。
図25は、10μMの濃度におけるGABAを用いて処理されたスフェロイドからのトレースを示す。一次ピーク118のみが、検出されるが、対照群よりも有意に低い周波数において検出される。
図26は、10μMの濃度におけるバクロフェンを用いて処理されたスフェロイドからのトレースを示す。一次ピーク118のみが、検出されるが、対照群よりも有意に低い周波数において、不規則な間隔および振幅を伴って検出される。
図27は、30μMの濃度における4-アミノピリジンを用いて処理されたスフェロイドからのトレースを示す。一次ピーク118および二次ピーク150が、検出される。一次ピーク118の周波数は、対照群に対して増加される。
図28は、(0.3μM)の濃度におけるバリノマイシンを用いて処理されたスフェロイドからのトレースを示す。一次ピーク118および二次ピーク150が、検出される。一次ピーク118の周波数は、対照群をはるかに下回り、振幅および間隔は、はるかに可変である。
図29は、1μMの濃度におけるカイニン酸を用いて処理されたスフェロイドからのトレースを示す。一次ピーク118および多数の二次ピーク150が、検出される。一次ピーク118の周波数は、対照群に対して増加される。
図30は、30μMの濃度におけるタモキシフェンを用いて処理されたスフェロイドからのトレースを示す。一次ピーク118のみが、検出されるが、対照群よりも有意に低い周波数において、可変振幅を伴って検出される。
アッセイは、化合物効果を試験し、神経毒性化学物質をスクリーニングするために使用されることができる。二次ピークおよび低振幅一次ピークの出現は、神経毒性活性を伴う化合物を示し得る。ピーク率および振幅に対する効果のみでは、神経毒性を十分に予測できない場合がある。
(実施例8)選択された実施例
本実施例は、本開示の選択された実施例を一連のインデックス付き段落として説明する。
段落1.分析の方法であって、(i)振動パターンを記述する一連のデータ点を生成するために、1つ以上の生物学的細胞と関連付けられる振動イオンフラックスを表す蛍光を検出するステップと、(ii)振動パターンに関する一連の勾配を計算するステップと、(iii)一連の勾配を使用して、振動パターンのピークを識別するステップとを含む、方法。
段落2.計算するステップは、スライディングウィンドウを使用し、それから一連の勾配が計算される一連のデータ点のサブセットを定義する、段落1に記載の方法。
段落3.複数の許可されるサイズからスライディングウィンドウのサイズを選択するステップをさらに含み、スライディングウィンドウのサイズは、スライディングウィンドウによって包含される一連のデータ点からのデータ点の数に対応する、段落2に記載の方法。
段落4.スライディングウィンドウのサイズは、振動パターンにおける雑音のレベルおよび/またはデータ点のセットに関するサンプリング間隔に基づいて、プロセッサによって自動的に割り当てられ、随意に、プロセッサはまた、一連の勾配を計算し、ピークを識別する、段落3に記載の方法。
段落5.スライディングウィンドウのサイズを選択するステップは、ユーザによって実施され、同様に一連の勾配を計算し、ピークを識別する、プロセッサに通信される、段落3または4に記載の方法。
段落6.データ点のセットは、一連の勾配を計算するステップに先立って、雑音を低減させるためにフィルタリングされない、段落1-5のいずれかに記載の方法。
段落7.ピークは、一連の一次ピークを含み、振動パターンは、それぞれ、一次ピークのうちの1つのみを含む、一連の事象を備え、本方法はさらに、識別されたピークの二次ピークの少なくとも1つの側面を決定するステップを含み、各二次ピークは、事象内で一次ピークのうちの1つに続く、段落1-6のいずれかに記載の方法。
段落8.二次ピークのうちの少なくとも1つの側面は、振動パターン内の二次ピークの数、周波数、または周期に関連する、段落7に記載の方法。
段落9.振動パターンは、事象毎に2回所定のトリガレベルを横断し、トリガレベルは、振動パターンのベースラインに対して設定される、段落7または8に記載の方法。
段落10.トリガレベルは、一連のデータ点が及ぶ振幅範囲のあるパーセンテージにおいて設定される、段落9に記載の方法。
段落11.トリガレベルは、ユーザによって選択されるトリガレベルである、段落9に記載の方法。
段落12.ベースラインおよびトリガレベルは、グラフィカルユーザインターフェースを介してユーザによって調節可能である、段落9-11のいずれかに記載の方法。
段落13.ピークを識別するステップは、一連の勾配内の勾配に関する正から負または負から正への遷移を検索するステップを含む、段落1-12のいずれかに記載の方法。
段落14.ピークを識別するステップは、有効であると見なされるピークのセットを取得するために、遷移と関連付けられるピークをフィルタリングするステップを含む、段落13に記載の方法。
段落15.ピークをフィルタリングするステップは、1つ以上の所定の振幅および/または持続時間基準に基づいて、ピークをフィルタリングするステップを含む、段落14に記載の方法。
段落16.有効であると見なされるピークのセットに関するピーク関連パラメータの値を決定するステップをさらに含む、段落14または15に記載の方法。
段落17.ピークを識別するステップは、検索によって見出される複数の遷移の各遷移と関連付けられるピークの少なくとも1つの振幅および/または持続時間を決定するステップと、少なくとも1つの振幅および/または持続時間を少なくとも1つの閾値と比較するステップと、比較するステップが、少なくとも1つの振幅および/または持続時間に関する1つ以上の所定の基準を満たさない場合、遷移と関連付けられるピークを無効として除斥するステップとを含む、段落14-16のいずれかに記載の方法。
段落18.少なくとも1つの振幅および/または持続時間を比較するステップは、振動パターンに関するベースラインに対して測定されるピークに関する振幅を比較するステップを含む、段落17に記載の方法。
段落19.少なくとも1つの振幅および/または持続時間を比較するステップは、ピークに隣接する局所的トラフに対して測定されるピークに関する局所的振幅を比較するステップを含む、段落17または18に記載の方法。
段落20.少なくとも1つの振幅および/または持続時間を比較するステップは、少なくとも1つの局所的トラフに対して測定されるピークに関する持続時間を比較するステップを含む、段落17-19のいずれかに記載の方法。
段落21.少なくとも1つの閾値の各閾値は、グラフィカルユーザインターフェースを介してユーザによって調節可能である、および/または少なくとも1つの閾値は、プロセッサによって自動的に設定される、段落17-20のいずれかに記載の方法。
段落22.振動パターンは、一連の事象を含み、一連の事象の事象毎に2回所定のトリガレベルを横断し、本方法はさらに、存在する場合、所定の持続時間未満を有する各事象を除斥するために、一連の事象をフィルタリングするステップを含み、除斥された事象内の各ピークは、無効であると見なされる、段落1-21のいずれかに記載の方法。
段落23.カルシウムインジケータを用いて1つ以上の生物学的細胞を標識化するステップをさらに含み、蛍光は、カルシウムインジケータによって放出される、段落1-22のいずれかに記載の方法。
段落24.1つ以上の生物学的細胞は、1つ以上の心筋細胞またはニューロンを含む、段落1-23のいずれかに記載の方法。
段落25.1つ以上の生物学的細胞は、主として、心筋細胞またはニューロンである、段落24に記載の方法。
段落26.1つ以上の生物学的細胞は、少なくとも1つの幹細胞から生体外で分化される1つ以上の心筋細胞またはニューロンを含む、段落24または25に記載の方法。
段落27.1つ以上の生物学的細胞は、ペトリ皿、フラスコ、およびマルチウェルマイクロプレートから選択される容器によって含有される、段落1-26のいずれかに記載の方法。
段落28.一連のデータ点は、1Hzを上回るサンプリング率を表す、段落1-27のいずれかに記載の方法。
段落29.振動パターンは、それぞれ、単一の一次ピークを含む、一連の事象を含み、振動パターンは、それぞれ、一連の事象の事象において含まれる、1つ以上の二次ピークを含み、本方法はさらに、1つ以上の二次ピークに関連する1つ以上のパラメータに関する少なくとも1つの値を決定するステップを含む、段落1-28のいずれかに記載の方法。
段落30.少なくとも1つの値は、二次ピークの数、周波数、または周期に対応する、段落29に記載の方法。
段落31.蛍光を検出するステップ、一連の勾配を計算するステップ、およびピークを識別するステップは、1つ以上の生物学的細胞の複数の別個のセットの別個のセット毎に実施され、各別個のセットは、異なる化合物または異なる濃度の同一の化合物に暴露される、段落1-30のいずれかに記載の方法。
段落32.存在する場合、それぞれ、ピークの少なくともサブセットに関連する1つ以上のパラメータに対する各異なる化合物または濃度の効果を決定するステップをさらに含む、段落31に記載の方法。
段落33.1つ以上のパラメータは、振動パターン内の二次ピークの数、周波数、または周期に対応する、段落32に記載の方法。
段落34.存在する場合、1つ以上のパラメータに対する効果に基づいて、各化合物または濃度の心毒性または神経毒性の程度を予測するステップをさらに含む、段落32または33に記載の方法。
段落35.振動パターンに関するベースラインを自動的に確立するステップをさらに含む、段落1-34のいずれかに記載の方法。
段落36.ベースラインを確立するステップは、振動パターンの上側における基準線および振動パターンの下側に向かう閾値線を作成するステップと、基準線に対する最大値を見出すステップであって、最大値は、閾値線の下方に位置する、ステップと、最大値の少なくともサブセットを使用して、線形回帰を実施するステップとを含む、段落35に記載の方法。
段落37.最大値の少なくともサブセットを使用して、振動パターンの雑音レベルを計算するステップをさらに含む、段落36に記載の方法。
段落38.一連の勾配を計算するステップは、スライディングウィンドウを使用し、それから一連の勾配が計算される一連のデータ点のサブセットを定義し、スライディングウィンドウのサイズは、雑音レベルに基づいて選択される、段落37のいずれかに記載の方法。
段落39.分析の方法であって、(i)振動パターンを記述する一連のデータ点を生成するために、1つ以上の生物学的細胞と関連付けられる振動イオンフラックスを表す蛍光を検出するステップと、(ii)存在する場合、振動パターンにおける一次ピークおよび二次ピークを識別するステップと、(iii)二次ピークの側面を決定するステップとを含む、方法。
段落40.二次ピークの側面を決定するステップは、二次ピークの数、周波数、または周期を決定するステップを含む、段落39に記載の方法。
段落41.1つ以上の生物学的細胞を化合物に暴露するステップと、二次ピークの側面に対する化合物の効果を決定するステップとをさらに含む、段落39または40に記載の方法。
段落42.振動パターンは、それぞれ、一次ピークのうちの1つのみを含む、一連の事象を備え、各二次ピークは、事象内の一次ピーク後に起こる、段落39-41のいずれかに記載の方法。
段落43.二次ピークは、心筋細胞またはニューロンによって生成される二次ピークである、段落39-42のいずれかに記載の方法。
段落44.カルシウムインジケータを用いて1つ以上の生物学的細胞を標識化するステップをさらに含み、蛍光は、カルシウムインジケータから検出される、段落39-43のいずれかに記載の方法。
段落45.一次ピークの間隔規則性/不規則性を決定するステップをさらに含む、段落39-44のいずれかに記載の方法。
段落46.間隔規則性/不規則性を決定するステップは、一次ピークの間隔の標準偏差を一次ピークの平均間隔と比較するステップを含む、段落45に記載の方法。
段落47.一次ピークの振幅規則性/不規則性を決定するステップをさらに含む、段落39-46のいずれかに記載の方法。
段落48.振幅規則性/不規則性を決定するステップは、一次ピークの振幅の標準偏差を一次ピークの平均振幅と比較するステップを含む、段落47に記載の方法。
段落49.存在する場合、一次ピークのより小さいピークを列挙するために、各一次ピークの振幅を所定の閾値と比較するステップをさらに含む、段落39-48のいずれかに記載の方法。
段落50.検出するステップ、識別するステップ、および決定するステップは、1つ以上の生物学的細胞の複数の別個のセットの別個のセット毎に実施され、各別個のセットは、異なる化合物または異なる濃度の同一の化合物に暴露される、段落39-49のいずれかに記載の方法。
段落51.存在する場合、二次ピークの側面に対する各異なる化合物または濃度の効果を決定するステップをさらに含む、段落50に記載の方法。
段落52.存在する場合、一次ピークの間隔規則性/不規則性に対する各異なる化合物または濃度の効果を決定するステップをさらに含む、段落50または51に記載の方法。
段落53.存在する場合、一次ピークの振幅規則性/不規則性に対する各異なる化合物または濃度の効果を決定するステップをさらに含む、段落50-52のいずれかに記載の方法。
段落54.二次ピークの側面および一次ピークの間隔規則性/不規則性に基づいて、各化合物または濃度の心毒性または神経毒性の程度を予測するステップをさらに含む、段落50-53のいずれかに記載の方法。
段落55.二次ピークの側面および一次ピークの振幅規則性/不規則性に基づいて、各化合物または濃度の心毒性または神経毒性の程度を予測するステップをさらに含む、段落50-54のいずれかに記載の方法。
段落56.二次ピークの側面および所定の閾値を下回る振幅を有するより小さいピークである一次ピークの数、周波数、または周期に基づいて、各化合物または濃度の心毒性または神経毒性の程度を予測するステップをさらに含む、段落50-55のいずれかに記載の方法。
段落57.システムであって、(i)振動パターンを記述する一連のデータ点を生成するために、1つ以上の生物学的細胞と関連付けられる振動イオンフラックスを表す蛍光を検出するように構成される、光学センサと、(ii)(1)随意に、スライディングウィンドウを使用して、振動パターンに関する一連の勾配を計算し、それから一連の勾配が計算される一連のデータ点のサブセットを定義し、(2)一連の勾配を使用して、振動パターンのピークを識別するように構成される、プロセッサとを備える、システム。
段落58.段落1-56のステップの任意の組み合わせを実施するように構成される、段落57に記載のシステム。
段落59.システムであって、(i)振動パターンを記述する一連のデータ点を生成するために、1つ以上の生物学的細胞と関連付けられる振動イオンフラックスを表す蛍光を検出するように構成される、光学センサと、(ii)(1)存在する場合、振動パターンにおける一次ピークおよび二次ピークを識別し、(2)二次ピークの側面を決定するように構成される、プロセッサとを備える、システム。
段落60.段落1-56のステップの任意の組み合わせを実施するように構成される、段落59に記載のシステム。
本開示に使用されるような用語「例示的」は、「例証的」または「実施例としての役割を果たす」を意味する。同様に、用語「~を例示する」は、「実施例を与えることによって~を例証する」を意味する。いずれの用語も、所望性または優位性を含意しない。
上記に記載される開示は、独立した有用性を伴う複数の明確に異なる発明を包含し得る。これらの発明はそれぞれ、その好ましい形態において開示されたが、本明細書に開示および例証されるようなその具体的実施形態は、多数の変形例が、可能性として考えられるため、限定的意味で考慮されるものではない。本発明の主題は、本明細書に開示される種々の要素、特徴、機能、および/または性質のあらゆる新規かつ非自明な組み合わせおよび副次的組み合わせを含む。

Claims (20)

  1. 分析の方法(50)であって、前記方法は、
    振動パターン(110)を記述する一連のデータ点(120)を生成するために、1つ以上の生物学的細胞(72)と関連付けられる振動イオンフラックスを表す蛍光(91)を検出すること(54)と、
    前記振動パターン(110)に関する一連の勾配を計算すること(60)と、
    前記一連の勾配を使用して、前記振動パターン(110)のピーク(118、150a、150b)を識別すること(62)と
    を含む、方法。
  2. 計算すること(60)は、スライディングウィンドウ(122)を使用し、それから前記一連の勾配が計算される前記一連のデータ点(120)のサブセット(126)を定義する、請求項1に記載の方法。
  3. 複数の許可されるサイズから前記スライディングウィンドウ(122)のサイズを選択することをさらに含み、前記スライディングウィンドウ(122)のサイズは、前記スライディングウィンドウ(122)によって包含される前記一連のデータ点(120)からのデータ点(126)の数に対応する、請求項2に記載の方法。
  4. 前記スライディングウィンドウ(122)のサイズは、前記振動パターン(110)における雑音のレベルおよび/または前記一連のデータ点(120)に関するサンプリング間隔に基づいて、プロセッサ(96)によって自動的に割り当てられ、前記プロセッサ(96)はまた、前記一連の勾配を計算し、前記ピーク(118、150a、150b)を識別する、請求項3に記載の方法。
  5. 前記スライディングウィンドウ(122)のサイズを選択することは、ユーザによって実施され、同様に前記一連の勾配を計算し、前記ピーク(118、150a、150b)を識別するプロセッサ(96)に通信される、請求項3に記載の方法。
  6. 前記一連のデータ点(120)は、一連の勾配を計算すること(60)に先立って、雑音を低減させるためにフィルタリングされない、請求項1に記載の方法。
  7. 前記ピークは、一連の一次ピーク(118)を含み、前記振動パターン(110)は、それぞれが前記一次ピーク(118)のうちの1つのみを含む一連の事象(138)を備え、前記方法はさらに、前記識別されたピークの二次ピーク(150a、150b)の少なくとも1つの側面を決定することを含み、各二次ピークは、事象(138)内で前記一次ピーク(118)のうちの1つに続く、請求項1に記載の方法。
  8. 前記二次ピーク(150a、150b)のうちの少なくとも1つの側面は、前記振動パターン(110)内の前記二次ピーク(150a、150b)の数、周波数、または周期に関連する、請求項7に記載の方法。
  9. 前記振動パターン(110)は、事象(138)毎に2回所定のトリガレベル(144)を横断し、前記トリガレベル(144)は、前記振動パターン(110)のベースライン(116)に対して設定される、請求項7に記載の方法。
  10. ピーク(118、150a、150b)を識別すること(62)は、前記一連の勾配内の勾配に関する正から負または負から正への遷移を検索することを含む、請求項1に記載の方法。
  11. ピークを識別すること(62)は、有効であると見なされるピークのセットを取得するために、前記遷移と関連付けられるピークをフィルタリングすることを含む、請求項10に記載の方法。
  12. 前記有効であると見なされるピークのセットに関するピーク関連パラメータの値を決定することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
  13. カルシウムインジケータを用いて前記1つ以上の生物学的細胞(72)を標識化すること(52)をさらに含み、前記蛍光(91)は、前記カルシウムインジケータによって放出される、請求項1に記載の方法。
  14. 前記1つ以上の生物学的細胞(72)は、1つ以上の心筋細胞またはニューロンを含む、請求項1に記載の方法。
  15. 前記振動パターン(110)は、それぞれが単一の一次ピーク(118)を含む一連の事象(138)を含み、前記振動パターン(110)は、それぞれが前記一連の事象(138)の事象において含まれる1つ以上の二次ピーク(150a、150b)を含み、前記方法はさらに、前記1つ以上の二次ピーク(150a、150b)に関連する1つ以上のパラメータに関する少なくとも1つの値を決定すること(64)を含む、請求項1に記載の方法。
  16. 分析の方法であって、前記方法は、
    振動パターン(110)を記述する一連のデータ点(120)を生成するために、1つ以上の生物学的細胞(72)と関連付けられる振動イオンフラックスを表す蛍光(91)を検出すること(54)と、
    前記振動パターン(110)における一次ピーク(118)および二次ピーク(150a、150b)を識別すること(62)と、
    前記二次ピーク(150a、150b)の側面を決定することと
    を含む、方法。
  17. 前記二次ピーク(150a、150b)の側面を決定することは、前記二次ピーク(150a、150b)の数、周波数、または周期を決定することを含む、請求項16に記載の方法。
  18. 前記一次ピーク(118)の間隔規則性/不規則性および/または前記一次ピーク(118)の振幅規則性/不規則性を決定することをさらに含む、請求項16に記載の方法。
  19. 存在する場合、前記一次ピークのより小さいピークを列挙するために、各一次ピーク(118)の振幅(194)を所定の閾値と比較することをさらに含む、請求項16に記載の方法。
  20. システム(70)であって、
    光学センサ(88)であって、前記光学センサ(88)は、振動パターン(110)を記述する一連のデータ点(120)を生成するために、1つ以上の生物学的細胞(72)と関連付けられる振動イオンフラックスを表す蛍光(91)を検出するように構成される、光学センサ(88)と、
    プロセッサ(96)であって、前記プロセッサ(96)は、(1)スライディングウィンドウ(122)を使用して、前記振動パターン(110)に関する一連の勾配を計算し、それから前記一連の勾配が計算される前記一連のデータ点(120)のサブセット(126)を定義し、(2)前記一連の勾配を使用して、前記振動パターン(110)のピーク(118、150a、150b)を識別するように構成される、プロセッサ(96)と
    を備える、システム(70)。
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