CN114375390A

CN114375390A - 生物细胞振荡荧光分析

Info

Publication number: CN114375390A
Application number: CN202080058604.5A
Authority: CN
Inventors: 奥克萨纳·西连科; 卡罗勒·克里滕登; 克里蒂卡·斯里达; 鲍里斯·布雷斯登
Original assignee: Molecular Devices LLC
Current assignee: Molecular Devices LLC
Priority date: 2019-06-25
Filing date: 2020-06-25
Publication date: 2022-04-19
Also published as: JP2022538231A; EP3990917A4; WO2020264148A1; EP3990917A1; US20220364990A1

Abstract

用于分析振荡荧光的方法和系统，所述振荡荧光表示与一个或多个生物细胞相关联的振荡离子流。一种说明性分析方法(50)可包括检测(54)来自一个或多个生物细胞(72)的荧光(91)以产生描述振荡模式(110)的一系列数据点(120)。可以计算(60)振荡模式(110)的一系列斜率。例如，滑动窗口(122)可以用来定义所述一系列数据点(120)的子集(126)，根据所述子集计算所述一系列斜率。可以使用所述一系列斜率来识别(62)振荡模式(110)的波峰(118、150a、150b)。如果有的话，可通过多次测量来识别和表征振荡模式(110)中的主峰(118)和次峰(150a，150b)。可以确定次峰(150a，150b)的一个方面。次峰(150a，150b)的出现可以指示心脏毒性或神经毒性的潜在风险。

Description

生物细胞振荡荧光分析

相关申请

本申请要求在2019年6月25日提交的美国临时申请No.62/866524的优先权，其内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及用于分析来自生物细胞的振荡荧光的方法和系统。更具体地，所公开的示例涉及用于分析表示生物细胞中的振荡离子流(诸如钙振荡)的振荡荧光，以及用于测试细胞处理对振荡荧光的影响的方法和系统。

背景技术

由于心脏或神经毒性，大部分药物在临床研究中失败。

为了降低这些失败的发生率，需要灵敏的体外测定，以在临床研究开始之前可靠地评估化合物对心脏细胞和神经细胞的不利影响。这些体外测定可加速和简化药物开发。

已经开发了心肌细胞和神经元的培养系统，其中，这些细胞表现出自发的、同步的离子流，例如钙振荡。钙振荡可通过用荧光钙指示剂标记细胞来检测。

还开发了包括分析软件的成像系统以记录和分析代表细胞中钙振荡的振荡荧光。成像系统已经用于测量药理学化合物对培养中的心肌细胞和神经元的钙振荡的影响。值得注意的是，这些钙振荡在体外被具有已知的心脏毒性或神经毒性作用的药理学化合物干扰。因此，该方法显示了在临床研究之前对药物和其它化学品进行安全性测试以及预测药物候选物的功效和剂量的前景。

当钙振荡被药物和其它化合物干扰时产生的振荡模式可能非常复杂。需要更好的方法和系统来检测这些复杂振荡模式的生物相关特征，并提取用于最具信息性的读数的值。

发明内容

本公开提供了用于记录和分析振荡荧光的方法和系统，所述振荡荧光表示与一个或多个生物细胞相关联的振荡离子流。说明性分析方法可包括检测来自一个或多个生物细胞的荧光以产生描述振荡模式的一系列数据点。可以为振荡模式计算一系列斜率。滑动窗口可以用于定义所述一系列数据点的子集，根据所述子集计算所述一系列斜率。可以使用一系列斜率来识别振荡模式的波峰。另一种说明性分析方法可包括检测来自一个或多个生物细胞的荧光以产生描述振荡模式的一系列数据点。可以识别振荡模式中的主峰和次/副峰(如果有的话)。可以确定次峰的一个方面。

附图说明

图1是可以在分析来自生物细胞的振荡荧光模式的说明性方法中执行的步骤的流程图。

图2是用于检测和分析来自生物细胞的振荡荧光模式的说明性系统的示意图。

图3是由从经受振荡离子流的生物细胞检测到的荧光信号产生的相对简单的无扰振荡模式的曲线图。

图4是图3的荧光信号的包含单个振荡的区域的一系列数据点的图，其中该区域在图3中一般地以“4”指示，并且其中在三个不同的时间位置处示意性地示出了滑动窗口，以图示如何利用滑动窗口来选择数据点的子集以用于计算一系列斜率。

图5是如图3中检测到的更复杂的干扰振荡模式的单次振荡(“事件”)的曲线图，并且示出了如图4中计算的斜率如何可以用于检测生物相关的波峰和波谷，同时忽略荧光信号中被假定为噪声的较小的“假”波动。

图6是图5的单个振荡围绕次峰截取的仅一部分的曲线图，并且示出了如何使用预定的振幅和/或持续时间标准来滤波主/次峰，以将小的和/或瞬时波峰作为无效的来排除。

图7是如图3中所检测的振荡模式的曲线图，并且示出了用于自动设置振荡模式的基线(即，设置临时参考线以及相对于参考线的阈值线)的算法的各方面。

图8是图7的振荡模式的底部的局部视图，示出了位于阈值线之下并且基于斜率识别的负峰(相对于图7的参考线)。

图9是如图3中一般地检测到的复杂振荡模式的三个振荡的曲线图，其中标识了说明性参数。

图10和图11是使用不同大小的滑动窗口(分别为十一个点和五个点)分析的相同复杂振荡模式的曲线图，其中主峰由圆圈标记，次峰由菱形标记。

图12A和图12B是由分析软件创建的图形用户界面的示例性对话框的局部视图，其中选择了对话框的“选项”标签。

图13A和13B是图12A和图12B的对话框的局部视图，除了选择了对话框的“测量”标签。

图14至图21是从作为对照(图14)和用各种已知心脏毒性化合物(图15至图21)处理的心肌细胞中检测到的代表性荧光振荡模式的曲线图。主(main)峰和次峰分别由软件用圆圈和菱形标记。

图22是绘制用本文公开的软件获得的各种波峰相关读数的图表，其通过在相对于每种化合物在血液中的最大临床水平的所示浓度下，分析从用所示高风险、中风险和低风险TdP(尖端扭转型室性心动过速)化合物处理的心肌细胞检测到的荧光振荡模式。

图23至图30是从作为对照(图23)和用各种已知神经毒性化合物(图24至图30)处理的神经元中检测到的代表性荧光振荡模式的曲线图。主峰和次峰分别由软件用圆圈和菱形标记。振荡模式的改变反映了化合物的作用，并且可以通过由软件分析提供的多次测量来表征。

具体实施方式

本公开提供了用于记录和分析振荡荧光的方法和系统，所述振荡荧光表示与一个或多个生物细胞相关联的振荡离子流。说明性分析方法可包括检测来自一个或多个生物细胞的荧光以产生描述振荡模式的一系列数据点(可互换地称为振荡轨迹或荧光轨迹)。可以为振荡模式计算一系列斜率。例如，滑动窗口可以用于定义从其计算一系列斜率的一系列数据点的子集。可以使用一系列斜率来识别振荡模式的波峰。另一种说明性分析方法可包括检测来自一个或多个生物细胞的荧光以产生描述振荡模式的一系列数据点。可以识别振荡模式中的主峰和次峰(如果有的话)。可以确定次峰的一个方面。

本公开的方法和系统可以利用复杂事件分析(CEA)算法，该算法被设计为分析具有若干感兴趣分量的振荡荧光。这些分量可包括波峰的多种形状、波峰的聚类、次峰、规则或不规则的异常事件、不规则的振幅或频率、迁移的阈值水平等。CEA算法能够报告主峰和次峰的多次测量值，平均值或单个值，包括许多附加的读数。

CEA算法的目的是数字地“可视化”生物事件的一般形状，以便检测和测量各种参数，诸如波峰振幅、上升和衰减时间、事件持续时间、频率等。为了可视化生物事件，需要拒绝假的非生物转变(噪声)。许多“逐点”检测方法由于损害数据完整性的先前滤波或由于不能区分生物相关转变与噪声而失去准确性。根据其设计的性质，CEA算法通过计算描述振荡模式的数据点子集的斜率，在没有先前滤波的情况下显著地降低了噪声的影响。斜率使得能够检测波峰和波谷，同时忽略由噪声产生的较低振幅和/或快速转变(即，无效波峰)。

本公开的另外方面在以下章节中描述：(I)定义，(II)方法和系统概述，以及(III)示例。

I.定义

本公开中使用的技术术语具有本领域技术人员通常认可的含义。然而，以下术语可以进一步定义如下。

事件——振荡模式的单个振荡。事件可以在距基线的(一个或多个)预定义振幅处和/或距基线的(一个或多个)预定义振幅范围内开始和结束，等等。

光——紫外、可见和/或红外辐射。

最大值(Maximum)——实际/概念图的点(和/或一系列点)，具有比其周围的点更大的值，和/或比其周围的点更远离参考线(例如，底部或顶部基线)。“最大值”(maximum)的复数是“最大值”(maxima)。

最小值(Minimum)——实际/概念图的点(和/或一系列点)，具有比其周围的点更小的值，和/或比其周围的点更接近参考线(例如，底部或顶部基线)。“最小值”(minimum)的复数是“最小值”(minima)。

波峰(Peak)——实际/概念图的点序列(和/或一系列点)，包括最大值和最大值周围的点，并且可选地由一对最小值界定。可以根据时间位置和波峰的最大值的振幅来表征波峰，时间位置和波峰的最大值的振幅可以共同定义“波峰位置”，而最大值的振幅定义“波峰值”或“波峰振幅”。当相对于参考线(例如，底部或顶部基线)定义最大值时，参考线上方的最大值形成正波峰，而参考线下方的最大值形成负波峰。

主峰(Primary peak)——事件的前导/唯一波峰(或有效波峰)。

次峰(Secondary peak)——事件内主峰之后的任何波峰(或有效波峰)。

波谷(Trough)——包括最小值和最小值周围的点的实际/概念图的点序列(和/或一系列点)。波谷可以根据时间位置和波谷的最小值的振幅来表征，时间位置和波谷的最小值的振幅可以共同地定义“波谷位置”，而最小值的振幅定义“波谷值”或“波谷振幅”。当相对于参考线(例如，基线)定义最小值时，参考线上方的最小值形成正波谷，而参考线下方的最小值形成负波谷。

有效波峰——满足预定义的有效性标准的任何波峰。

窗口——从数据集中选择给定数量的数据点用于处理的算法。例如，宽度为五的窗口选择五个点，诸如数据集的五个连续点，进行处理。“滑动窗口”例如逐点地在数据集上移动，以选择数据点的子集进行处理。例如，具有宽度为五个点的滑动窗口可处理点1至5，然后逐点移动，以处理点2至6、点3至7等。

II.方法和系统概述

本节提供了本公开的示例性方法和系统的概述；参见图1和图2。

图1示出了可以在分析来自一个或多个生物细胞(也称为“细胞”)的振荡荧光的说明性方法中执行的步骤的流程图50。可以以任何适当的顺序和组合来执行这些步骤。

细胞可以包括在培养中显示振荡离子流的任何细胞类型。因此，细胞可以包括肌细胞(即，心肌细胞(cardiomyocytes)、骨骼肌细胞或平滑肌细胞)或神经细胞(神经元)。对于一个彼此紧密缔合培养的细胞集合，振荡离子流可以同步方式发生，任选地自发发生，使得细胞可以交流。该细胞集合可以以三维聚集体(如细胞球状体)彼此缔合，或者可以被排列成基本单层等。可以在容器中分析单个细胞集合，或者可以在分析之前/期间在单独的容器中将分离的重复细胞集合暴露于不同的处理，如下面进一步解释的。示例性的容器包括皮氏培养皿、(一个或多个)微孔板的井/孔、烧瓶等。

细胞可以通过任何合适的方法从任何合适的(一个或多个)来源获得。细胞可以在体外从干细胞分化。干细胞可以是胚胎干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)等。在其它实例中，细胞可以是原代细胞，例如，从动物获得的原代心肌细胞或原代神经元。

振荡离子流可以是离子特异性流(ion-specific flux)或集体离子流(collective ion flux)。示例性的离子特异性流是产生钙振荡的振荡钙流。流可代表离子穿过质膜(即进入和/或离开细胞)和/或在细胞内(例如穿过肌质网(SR)的膜)(即从SR进入或离开细胞质)等的运动。

每个细胞集合可以被标记和/或处理，如52所示。标记可以用荧光指示剂进行，该荧光指示剂具有对关于细胞出现的振荡离子流敏感的荧光。荧光指示剂可以是例如对细胞内钙浓度敏感并且随着细胞内钙浓度增加而发出更多光(或更少光)的荧光钙指示剂。示例性的荧光钙指示剂是化学指示剂，例如

Calcium 6、

Calcium 6-QF、Calcium Green-1、Fluo-3、Fluo-4、Fura-2、Indo-1、Oregon Green 488、Bapta-1、Fura-4F、Fura-5F、Calcium Crimson、X-rhod-1等。细胞可以通过与细胞所处的介质接触而用化学指示剂标记。其它示例性荧光钙指示剂是在将编码序列引入细胞(例如通过转染、感染等)后在细胞中遗传编码和表达的。合适的遗传编码钙指示剂可包括Cameleons,Pericams,GCaMP,TN-L15,TN-humTnC,TN-XL,TN-XXL,Twitches等。在其它实例中，荧光指示剂可以是膜电位指示剂(例如，

Membrane Potential Dye,Di-3-ANEPPDHQ,Di-4-ANEPPDFIQ等)、钾指示剂、钠指示剂、镁指示剂、锌指示剂、pH指示剂等。

可以用至少一种选定浓度的目标物质处理每个细胞集合，以测试物质/浓度对从荧光指示剂检测的细胞的振荡荧光的影响，如果有的话。物质可以是化合物，例如分子量小于10、5、2或1千道尔顿的小分子(例如，药物或候选药物)、蛋白质、RNA或DNA分子等。可以在各个细胞集合上测试不同化合物和/或不同浓度的相同化合物，以筛选化合物和/或确定给定化合物的剂量反应曲线。每个细胞集合可以用物质处理任何合适的时间长度，例如至少1、2、5、10、30或60分钟，或2、4、6、8、10、12、18或24小时，或24至72小时，等等。处理和标记可以并行地、串行地或在具有时间偏移的重叠时间执行。

可以检测每个生物细胞集合中至少一个细胞的荧光，如54所示，这种荧光检测对至少一个细胞的荧光信号，如信号强度，相对于时间进行采样，以产生一系列数据点(也称为时间点)，其描述荧光信号的振荡模式。因此，振荡模式可以被图示为作为时间函数的所检测的荧光强度。可以以任何合适的速率(通常大于1Hz的恒定速率，例如1Hz至100Hz的速率等)和以任何合适的采样持续时间(例如至少10、30或60秒，或至少2、5或10分钟)对荧光信号进行采样。荧光检测可以利用图像传感器、光学点传感器等来执行。

可建立振荡模式的基线，如56所示。可使用软件自动设置基线，例如，如下文示例2中所述，和/或可由用户通过图形用户界面设置基线。基线可以默认地或响应于来自用户的输入而定位在振荡模式的底部或顶部(例如，参见示例2和5)。在一些实施例中，可在振荡模式的顶部(或底部)设置临时参考线，与待建立的基线的预期位置相对。可以识别相对于参考线的波峰，并且波峰或波谷位置的线性回归可以找到在后续识别波峰和波谷期间充当基线的线。

可估计振荡模式的噪声水平，如58所示。可基于振荡模式顶部或底部附近的信号波动来估计噪声水平(见示例2和5)。例如，振荡模式的基线附近的峰值(即最大值)(或谷值(即最小值))之间的连续差值的平均值可用于确定噪声水平的估计。

如60所示，可从振荡模式的一系列数据点计算一系列斜率。例如，可利用沿振荡模式的时间轴滑动的滑动窗口来选择数据点的连续子集，以通过线性回归将线拟合到每个子集来计算一系列斜率(例如，参见示例1)。换句话说，滑动窗口可沿着振荡模式的时间轴滑动一个点(或两个或更多个点)以用于计算每个连续斜率。滑动窗口具有包含固定数量的三个或更多个点的恒定大小，同时针对给定数据集(例如，来自给定井)计算一系列斜率。滑动窗口的大小可以由软件自动选择(例如，基于数据集的噪声水平和/或数据点的采样率)，或者可以由用户选择。滑动窗口的大小可以在不同的数据集之间改变(例如，每个数据集从不同的井收集)，这允许优化每个数据集的大小。

可以使用斜率来识别每个振荡模式的波峰(和波谷)，如62处所示。也就是说，可以基于沿着一系列斜率的斜率符号的变化(例如，相对于时间)来识别一系列最大值和最小值。基线以上的每个最大值可通过一系列斜率内从正到负(或对于振荡模式顶部的基线从负到正)的变化来近似。类似地，基线以上的每个最小值可通过一系列斜率内从负到正(或对于振荡模式顶部的基线从正到负)的变化来近似。如果需要，通过点的局部分析和/或内插等，可以细化使用该系列斜率识别的最大值和最小值。最大值和/或最小值(以及相应的波峰和波谷)也可以根据一个或多个其他预定标准被滤波(即，被限制)，以拒绝不满足预定标准的最大值(和波峰)和/或最小值(和波谷)。预定标准可以涉及每个相应波峰/波谷和/或包含至少一个波峰的每个事件的至少一个振幅和/或持续时间(例如，参见示例1和5)。预定标准可以基于荧光信号的噪声水平自动指定，和/或可以由用户主观指定。

可以确定每个振荡模式的一个或多个波峰相关参数的值，如64所示。参数和它们的值可以互换地被称为读数或描述符。这些值可以使用在62处识别的波峰来确定。这些值可以是振荡模式测量值(或至少其多个事件)的平均值，或单个事件/波峰的值。示例性的值仅针对主峰、仅针对次峰、或主峰和次峰二者。值可以包括单个/平均主峰/次峰振幅、平均主峰/次峰频率、次峰的平均事件内频率、事件面积、主峰/次峰间距、上升斜率、衰减斜率、上升时间、衰减时间等。波峰相关参数的其他示例在示例1、3和5中进行了描述。

如果有的话，每种处理的效果可基于从对应振荡模式确定的值中的至少一个来评估，如66处指示的。例如，效果可基于振荡模式中的次峰的一个方面(诸如次峰的数量、频率和/或周期)来评估。

图1的步骤或本文公开的其它方法的任何组合可体现为计算机方法、计算机系统或计算机程序产品。因此，分析方法的各方面可以采取完全硬件示例、完全软件示例(包括固件、驻留软件、微代码等)或组合软件和硬件方面的示例的形式，所有这些在本文中一般可以被称为“电路”、“模块”或“系统”。此外，分析方法的各方面可以采取在具有体现在其上的计算机可读程序代码/指令的(一个或多个)计算机可读介质中体现的计算机程序产品的形式。

可以利用计算机可读介质的任何组合。计算机可读介质可以是计算机可读信号介质和/或计算机可读存储介质。计算机可读存储介质可以包括电子、磁、光、电磁、红外和/或半导体系统、装置或设备，或者这些的任何合适的组合。计算机可读存储介质的更具体的示例可以包括以下：便携式计算机磁盘、硬盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM或闪存)、便携式光盘只读存储器(CD-ROM)、光存储设备、磁存储设备、这些的任何合适的组合等。在本公开的上下文中，计算机可读存储介质可以包括任何合适的非暂态有形介质，其可以包含或存储由指令执行系统、装置或设备使用或与指令执行系统、装置或设备结合使用的程序。

计算机可读信号介质可以包括例如在基带中或作为载波的一部分传播的数据信号，其中传播的数据信号具有在其中体现的计算机可读程序代码。这种传播信号可以采取多种形式中的任何一种，包括但不限于电磁、光和/或其任何合适的组合。计算机可读信号介质可以包括不是计算机可读存储介质并且能够传送、传播或传输程序以供指令执行系统、装置或设备使用或与其结合使用的任何计算机可读介质。

包含在计算机可读介质上的程序代码可以使用任何适当的介质来传输，包括但不限于无线、有线、光纤线缆和/或这些的任何适当组合等。

用于执行本文公开的方法的各方面的操作的计算机程序代码可以用编程语言之一或其任意组合来编写，所述编程语言包括面向对象的编程语言，诸如Java、Smalltalk、C++等，以及常规的过程编程语言，诸如C。移动应用可以使用任何合适的语言来开发，包括先前提到的语言，以及目标C、Swift、C#、HTML5等。程序代码可以完全在用户的计算机上执行，部分在用户的计算机上执行，作为独立的软件包执行，部分在用户的计算机上并且部分在远程计算机上执行，或者完全在远程计算机或服务器上执行。在后一种情况下，远程计算机可以通过任何类型的网络(包括局域网(LAN)或广域网(WAN))连接到用户的计算机和/或可以连接到外部计算机(例如，使用因特网服务提供商通过因特网)。

下面参考方法、装置、系统和/或计算机程序产品的流程图图示和/或框图来描述本文公开的方法的方面。流程图和/或框图中的每个框和/或框的组合可以由计算机程序指令实现。计算机程序指令可以被提供给通用计算机、专用计算机或其他可编程数据处理装置的处理器以产生机器，使得经由计算机或其他可编程数据处理装置的处理器执行的指令实现流程图和/或框图的(一个或多个)框中指定的功能/动作。在一些示例中，机器可读指令可以被编程到可编程逻辑器件上，例如现场可编程门阵列(FPGA)。

计算机程序指令还可以存储在计算机可读介质中，其可以引导计算机以特定方式运行，使得存储在计算机可读介质中的指令产生包括实现流程图和/或框图的框中指定的功能/动作的指令的制品。

计算机程序指令还可以被加载到计算机上，以使得在设备上执行一系列操作步骤以产生计算机实现的过程，从而在计算机上执行的指令提供用于实现流程图和/或框图的框中指定的功能/动作的进程。

附图中的任何流程图和/或框图旨在示出根据本文公开的方法的方面的系统、方法和计算机程序产品的可能实现的架构、功能和/或操作。在这点上，每个框可以表示代码的模块、段或部分，其包括用于实现(一个或多个)指定的逻辑功能的一个或多个可执行指令。在一些实施方式中，在块中标注的功能可以不按附图中标注的顺序发生。例如，连续示出的两个框实际上可以基本上同时执行，或者这些框有时可以以相反的顺序执行，这取决于所涉及的功能。每个框和/或框的组合可以由执行指定功能或动作的基于专用硬件的系统(或专用硬件和计算机指令的组合)来实现。

图2示出了用于检测和分析来自由样品固定器74固定的生物细胞72的振荡荧光的示例性系统70。样品固定器74在此被描述为具有多个井78的微孔板76，每个井包含一个重复的细胞集合72。系统70可以包括支撑样品架的平台80，以及使平台80和样品架74相对于彼此移动以将每个井78置于系统70的光轴上的驱动机构82。

系统70还可以包括物镜84、光源86和光学传感器88(例如，图像传感器)。光源86可以产生光87以照射每个细胞集合72，从而从细胞诱导荧光。在图2所示的落射照射配置中，用于细胞照射的光可以通过分束器90和物镜84传播到细胞。由光诱导的荧光91可以由物镜84收集并通过物镜84、分束器90和可选的镜筒透镜92来传播，并且由光学传感器88检测，以产生时间相关的荧光信号。

计算机94与光学传感器88通信，并处理从光学传感器88接收的荧光信号。计算机94可以包括处理指令的处理器96、存储指令的存储器98和用于计算机94和用户之间通信的用户界面100。用户界面可以包括诸如键盘、鼠标或触摸屏的用户输入设备，以及诸如监视器的显示设备。

III.示例

本部分描述了本公开的分析方法和系统的进一步的示例和方面。这些示例和方面仅用于说明，不应限制本发明的整个范围。

示例1.斜率的计算

该示例描述了使用滑动窗口的振荡模式的斜率的示例性计算，以及使用斜率来识别振荡模式中的波峰和波谷；参见图3至图6。

图3示出了由经历简单的钙振荡流的生物细胞检测到的荧光信号112产生的振荡模式110的曲线图。从标记细胞的荧光钙指示剂检测荧光。在离散时间检测荧光强度，以产生一系列数据点，并且使用点连接线轨迹将数据点绘制为时间的函数。

振荡模式110由从基线116增加荧光的一系列振荡114(也称为事件)组成。每次振荡114可如这里所示仅具有一个波峰118，或者可具有主峰和一个或多个次峰，如下所述。在其它示例中，基线116可位于振荡模式110的顶部，并且每个事件可由在基线下方传播的荧光信号112表征。

图4示出了来自图3的振荡模式110的针对荧光信号的单次振荡114的子系列数据点120的曲线图。图3的点连接线轨迹被省略。滑动窗口122可以用于选择数据点120的子集，从所述子集可以计算可选地以每个数据点为中心的一系列最佳拟合线和相应的一系列斜率。滑动窗口122的大小表示其平行于时间轴测量的宽度。在由124处的运动箭头指示的沿着时间轴概念性地滑动之后，滑动窗口122在左边以实线示意性地示出，并且在两个其他说明性位置以虚线示意性地示出。滑动窗口122“停止”在沿时间轴的多个增量的位置，并选择以每个位置为中心的数据点120的子集126，从该子集计算斜率。这里，滑动窗口122具有宽度，该宽度在每个增量位置处选择五个数据点120，但是可以选择任何适当数量的三个或更多个数据点120。滑动窗口的大小(即持续时间)可保持恒定，以选择相同数量的数据点120用于计算每个斜率，同时对于给定的振荡模式110(即数据点的数据集)计算一系列斜率。可以为每个点计算斜率。可以改变滑动窗口的大小，以便为相同的振荡模式重新计算新的一系列斜率，或者为不同的振荡模式计算一系列斜率。针对振荡模式计算的一系列斜率可表示滑动窗口122的相应的一系列递增偏移位置。换句话说，滑动窗口122可以连续递增地偏移固定的整数个数据点，例如一个或两个数据点等等，和/或偏移固定时间增量，以选择数据点120的子集126。如果滑动窗口122的大小大于连续子集的滑动窗口的增量偏移，则数据点120的子集126可以彼此重叠。

在一些实施例中，在每个数据点计算斜率，并且计算斜率的“滑动窗口”一次移动一个点。在这些实施例中，由窗口选择的数据点子集总是彼此重叠。评估在每个点的斜率的“方向”以评估由斜率方向的变化所暗示的事件的总体曲率。在每个点计算的斜率是前向的也是后向的，因为时间上在该点前面的一个或多个点和时间上在该点后面的一个或多个点对斜率有贡献。

通过线性回归将直线拟合到子集126的点120，然后取该线的斜率，可以计算每个子集126的斜率。图4示出了与拟合到三个说明性子集126的相应线平行的三个向量128。每个向量128的方向与相应拟合线的斜率相匹配。每个向量128可以以相应子集126的(一个或多个)中点130为中心，并且可以具有与滑动窗口122的大小(即，宽度)相匹配的时间分量。因此，可以利用滑动窗口122生成一系列向量128，以将滑动窗口的大小与具有对应的一系列数据点130或位置(时间和振幅)的一系列斜率相关联。

向量128的一系列斜率使得能够检查数据的形状，并且尤其是数据偏移的方向。对于位于振荡模式底部的基线，正斜率反映上升阶段，而负斜率与衰减阶段相关联。因为从具有三个或更多个点120的子集126计算每个斜率，所以如果噪声电平相对于滑动窗口的大小较低，那么子集126内的噪声不会显著影响斜率的准确性。以这种方式，固有地抑制了噪声。连续向量128的方向变化反映了振荡模式内的转变的相应方向变化。因此，当连续向量128的斜率从正变为负(对于振荡模式底部的基线)时，表明已经经过波峰的最大值。类似地，对于相同的基线，当斜率从负变为正时，表明已经经过波谷的最小值。然后可以执行对每个过渡区域内的数据点的进一步检查，以更精确地确定振荡模式的每个最大值和最小值的位置(时间和振幅)。

可以根据噪声水平针对特定数据集优化滑动窗口122的大小。由于滑动窗口跨越了数据点的范围，因此该窗口充当了减少随机噪声的影响的自然“阻尼器”。此外，斜率不影响相关数据点的完整性，因此不改变振幅值或有效次峰的检测和测量。因此，使用从利用滑动窗口选择的数据点的子集计算的斜率使得能够准确检测和测量数据的各种参数，而不会产生在常规滤波下发生的数据破坏。

图5示出了如图3中所检测到的更复杂的振荡模式140的单个振荡114(“事件”138)的曲线图。基线116位于振荡模式140的底部。该图显示了具有如图4中计算的斜率的向量128如何能够用于搜索更大的波峰和波谷，同时忽略荧光信号中可能由噪声而不是生物相关活性引起的更小的“假”波动。(为了简化说明，向量128在此示出为具有恒定的总长度，而不是恒定的时间分量。)

可使用一个或多个预定标准来识别振荡模式140内的有效事件138。有效事件满足每个标准。标准可以包括至少一个振幅阈值142和/或至少一个持续时间阈值，以将有效事件与荧光信号的其他偏移区分开。例如，振幅阈值142可以是由荧光信号穿过的触发水平144(线)的单个点，其中事件的特征在于荧光信号在两个方向上都穿过触发水平。触发水平144可被设置为振荡模式的全振幅跨度的百分比，诸如从基线116的跨度的10％、15％、20％。触发水平可以自动地和/或由用户设置，并且可以是恒定的或者可以沿着时间轴(例如，沿着定义触发水平的触发线)变化。在一些情况下，第二振幅阈值可以被设置为拒绝每个事件和/或其中具有最大值的每个波峰，该最大值具有小于从基线(或触发水平144)偏移的预定义的振幅。第二振幅阈值可以被设置为全振幅跨度的百分比(例如，25％、50％、60％、70％、80％等)或者被设置为相对荧光单位的绝对值，等等。

在沿着振荡模式140的搜索期间，当荧光信号在远离基线116的方向上穿过触发水平144时，可以检测到事件138的开始。这种穿过可以启动波峰检测。当触发水平144在朝向基线116的方向上被穿过时，事件138可被认为结束。然而，事件138周围的左波谷和右波谷可以被标记为低于触发水平144，如下所述。

在搜索期间可以评估每个点130处的向量128的斜率以确定转变的方向。(这里示出了示例性点130a至130h。)点130a处的正斜率与荧光信号的上升阶段146相关联，而点130b处的负斜率与荧光信号的衰减阶段148相关联。当连续向量128的斜率从正变为负(基线116在底部)时，检测到每个波峰的最大值附近。例如，向量128的点130c、130d和130e至少非常接近同一事件138的主峰118和次峰150a、150b的相应最大值。当连续向量128的斜率从负变为正(基线116在底部)时，检测到每个波谷的最小值附近。例如，向量128的点130f、130g至少非常接近界定事件138的左波谷152a和右波谷152b的相应最小值。(在波峰118、150a和150b之间的波谷在这里没有明确地标识以简化图示)

用于创建向量128的滑动窗口的大小确定了将被搜索绕过的低振幅转换的大小。例如，点130h周围的过渡154在搜索中未被识别为波峰或波谷，因为该区域中的斜率不经历符号的改变(即，它们保持为负)。窗口的大小(以及因此向量128的长度)越大，将被绕过的转变振幅越大。因此，向量128共同地充当不破坏荧光信号的滤波器。

可以可选地应用每个转变点周围的窄区域内的噪声分析，以通过拒绝可接近较好的波峰位置几个点的非常短暂的事件或“低振幅”事件来进一步提高每个波峰/波谷位置的检测精度。

图6示出了在次峰150a附近截取的图5的单个振荡114(和事件138)的仅一部分的曲线图。可以根据一个或多个标准对波峰进行有效性滤波，所述标准可以与波峰最大值156和至少一个相邻的左波谷或右波谷最小值158a、158b相关。例如，预定标准可以涉及超过每个峰值的局部振幅160的阈值(在最大值156和左最小值158a和/或右最小值158b之间测量)和/或超过波峰的持续时间162的阈值(在预定振幅处(例如，在左最小值158a处)测量)。局部振幅160和/或持续时间162的阈值可以是用户指定的，或者根据振荡模式的噪声水平和/或振荡模式的采样间隔(即，采样速率的倒数)自动生成。

示例2.基线设置和噪声估计

该示例描述了自动设置振荡模式的基线，以及根据在设置基线时识别的负峰来估计振荡模式的噪声水平的示例性方法；参见图7和图8。

本文公开的算法可通过测量落在数据振幅跨度的10％内的波动振幅、借助于四分位距分析去除异常值、以及最终用线性回归将线拟合到所得振幅来自动地估计每个数据集的基线。可以建议或使用所得到的回归线作为基线。

图7和图8示出了为数据集建立基线116的示例性方法。可以设置临时参考线170(例如，顶部基线)。例如，参考线170可以由分别表示数据集的前端部分176和后端部分178的最大振幅的一对点172、174来定义。每个部分176、178可以表示数据集的任何合适的比例，诸如10％、20％、30％、40％或50％等等。可以排除靠近振荡模式的前端和后端的点，因为这些端通常包括伪像。通过允许用户经由图形用户界面移动控键180a、180b，可以在任一端或两端改变参考线170的位置。此外或可选地，用户可以通过经由图形用户界面沿时间轴移动相应的控键182a、182b来调整被认为对在任一端或两端的分析有效的数据集的时间范围。

可以计算数据集的振幅跨度。全局振幅最大值(Ymax)和全局振幅最小值(Ymin)可以通过搜索找到。振幅跨度被定义如下：Ymax至Ymin。

阈值线183可以被设置为朝向与参考线170相对的振幅跨度的底部，诸如在距离参考线170的振幅跨度的70％、80％、90％或95％处。例如，在距离参考线170的90％的振幅跨度处的阈值线183的位置可以如下计算：Ymin+0.1×(振幅跨度)。用户可以通过经由图形用户界面沿着振幅轴移动相应的控键184a、184b来调节任一端或两端的阈值线183。

可以执行相对于参考线170的波峰搜索(见图7和图8)。在本示例中，搜索通过识别远离(低于)参考线170且也位于阈值线183以下的局部最大偏移来找到负峰。(换句话说，该波峰搜索与上面针对图5所描述的波峰搜索相反(inverse)。)可以使用如上针对图4和图5所描述的一系列斜率来执行搜索，其中使用滑动窗口的相对小的尺寸(例如，3、4或5个数据点的宽度)来获得斜率。小的滑动窗口提供了波峰检测的高灵敏度，同时消除了最小的噪声。因此，数据集的噪声水平也可以从搜索中找到的波峰的振幅值来估计。

可以识别出主峰118和次峰150。在此和随后的实施例中，圆圈标记主峰118的最大值，菱形标记次峰150的最大值(参见图8)。当振荡模式被图示并显示给用户(例如，通过图形用户界面)时，这两种类型的波峰118、150也可以被区别地标记。然而，为了设定基线，所有检测到的波峰都可以被记录并同等地处理，即，在主峰和次峰之间没有任何区别。

使用线性回归，可以拟合通过所检测的波峰振幅的直线。该直线可以被认为是基线116的初始近似值。触发水平144最初可以被设置为基线以上的数据跨度的10％。这些自动分配的水平随后可以由用户通过图形界面或通过明确地设置值来调整。

在线性回归之前，可以对波峰118、150的最大值处的数据点进行滤波，也可以不进行滤波。例如，在选择基线之前，可以移除异常值，诸如使用四分位距分析。可以拒绝在第一四分位数以下或第三四分位数以上的1.5个四分位距以上的点。

可以从波峰118、150估计噪声水平(参见图8)。例如，噪声估计可以被计算为波峰118、150(被认为是一组)的振幅之间的连续差的平均值。噪声估计可以直接用作噪声水平，或者可以用于计算噪声水平。该噪声水平单独或与采样间隔结合，可以为给定数据集自动选择滑动窗口(参见示例2)的合适尺寸。用于这种尺寸选择的示例性算法是启发式算法：[0.3/采样间隔(秒)]，加上“噪声因子”即[噪声水平/100]。算法可以从允许的尺寸范围中选择窗口尺寸。该范围可以仅包括奇数个数据点(例如，3、5、7等)、仅偶数个数据点(例如，4、6、8等)或者奇数和偶数(例如，3、4、5、6等)。噪声水平还可以用于计算局部振幅160的合适阈值的自动生成值，以将较小峰拒绝为无效(也参见示例1和5)。数据采样率可以用于自动生成持续时间162的合适阈值，以将非常短暂的波峰拒绝为无效。

示例3.感兴趣的参数

该示例描述了可以使用本文所述的算法从振荡模式测量的感兴趣的示例性参数；参见图9。

示出了振荡模式的三个事件138。对于每个事件138标记起点190和终点192，其中荧光信号在相反方向上穿过触发水平144。

本文所述的任何参数可针对单独的波峰/事件报告，或可在给定振荡模式的一系列波峰/事件上求平均值。事件138的每个主峰118具有主峰振幅194。主峰振幅可以测量为主峰118的最大值和基线116之间的振幅差。线性衰减斜率196可以由在事件138的主峰118的最大值和终点192之间延伸的直线来定义。

主峰间隔198(也称为主峰周期/时间段)被限定在相邻主峰118的最大值之间。一系列事件138定义了连续的主峰间隔198，其可以被转换为该系列事件的主峰速率，表示为每单位时间的主峰，例如波峰/分钟(PpM)。

次峰周期200被定义在事件内或事件之间的相邻次峰150的最大值之间。用于振荡模式的次峰周期200可被转换为次峰速率，其被表示为每单位时间的次峰，诸如波峰/分钟(PpM)。每个次峰150具有次峰振幅202，其可以在次峰的最大值和基线116之间测量。

可为每个事件138计算上升斜率204和衰减斜率206。这些斜率中的每一个可以被定义在事件的最大值的百分比之间，诸如在最大值的10％至80％或30％至70％之间。

每个事件138的持续时间208可以以事件的最大振幅的指定百分比计算，例如以最大振幅的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％等计算。可替换地或另外地，可以针对每个事件测量从波峰210起的持续时间，该持续时间开始于事件的主峰118的最大值处。从波峰开始的持续时间可以在事件的最大值的指定百分比处测量，例如从最大值开始的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％等。

示例4.窗口尺寸对波峰检测的影响

该示例描述了改变窗口尺寸对波峰检测的灵敏度的影响；参见图10和11。

基于如示例1中计算的斜率的寻峰算法的性能在从跳动的心肌细胞收集的荧光强度数据上测试。心肌细胞在体外用荧光钙指示剂标记，并用心脏毒性化合物处理以扰乱对照心肌细胞中存在的规则钙振荡(例如，参见示例1)。相同的数据在图10和图11中图示，并产生复杂振荡模式220。该模式由一系列振荡114组成，每个振荡相对于对照细胞的振荡表现出更长的、不稳定的衰减阶段。衰减阶段的特征在于早期后去极化(EAD)类波峰(即，次峰)。

利用自动确定的十一个点的滑动窗口尺寸(图10)或用户选择的三个点的窗口尺寸(图11)对数据执行波峰搜索。每次振荡的主峰118用圆圈标记，次峰150用菱形标记。在图10中，在较大的窗口尺寸的情况下，忽略低振幅转变。在图11中，利用较小的窗口尺寸，低振幅转变被检测为波峰。因此，可以通过明智地选择窗口尺寸来控制波峰检测的灵敏度，可选地与噪声抑制相结合，以将太小/瞬态的检测波峰视为无效(例如，参见示例1和5)。

实施例5.分析软件的对话框

该示例描述了由图形用户界面显示的示例性对话框，以便于用户输入到分析软件；参见图12A、图12B、图13A和图13B(也参见图9)。

图12A、图12B、图13A和图13B示出了对话框的截图，其控制分析优化和波峰分析的读数(即，描述符)列表。对话框包含两个标签。“选项”标签提供对分析设置和数据范围的访问。“测量”标签包含可被选择用于在输出表中显示的事件的属性。下面描述这些标签的示例性方面和特征。

选项标签：

事件极性。两个按钮，正向和负向，可用于选择事件极性(见图12A)。正向事件涉及在底部基线以上的荧光增加，负向事件涉及在顶部基线以下的荧光减少。

选择向量长度。搜索向量长度(即，滑动窗口的尺寸)可以是用于良好波峰检测的最重要的变量(参见图12A；还参见图4和图5)。从数据集的数据点的一系列子集生成搜索向量，其中通过沿着时间轴递增地移动滑动窗口来选择子集。在每个点生成搜索向量。使用前向和后向数据点计算向量，以窗口宽度为中心，范围从-((窗口宽度)-1)/2到+((窗口宽度)-1)/2。使用合适的下降数量的数据点计算数据集的相对端附近的斜率。对数据点的每个子集执行线性回归以生成一系列搜索向量。换句话说，滑动窗口沿着数据集滑动，以检查每个数据点的斜率，并且通过记录斜率方向的变化(即，斜率从正到负或从负到正的符号变化)来确定转变(最大值/波峰和最小值/波谷)的存在。搜索向量相对于采样率的长度确定了检测转换的灵敏度。较长的向量长度将自动地滤除噪声(即，较低振幅和/或较短持续时间的事件/波峰)，而较短的向量长度将检测较低振幅和较短持续时间的转变。

三个按钮可用于选择如何分配向量长度：“自动分配长度”、“所有井长度相同”和“逐个井”(参见图12A)。当选择“自动分配长度”时，软件使用采样率和噪声振幅的估计来自动计算向量长度。自动生成的向量长度通常是数据分析的良好起始点。如果选择“逐个井”按钮，用户可以为每个井(即，为描述每个不同振荡模式的每个数据点集合)选择不同的向量长度。

动态阈值。该选项为有效波峰设置下限(参见图12A)。所有检测到的具有低于该阈值的波峰振幅的波峰将被认为是无效的并被忽略。在本实施例中，该极限值作为高于基线的相对荧光单位(RFU)给出。两个框可用于输入定义动态阈值的线的左端和右端的高于基线的不同阈值振幅值。在其他示例中，动态阈值可以被设置为数据集的振幅跨度的百分比。例如，如果给定井的数据点跨越10000个相对荧光单位(RFU)的范围，则80％的设置将指定8000RFU的截止限值。

触发水平。该水平由沿时间轴延伸的触发线定义，并确定认为事件何时开始和结束(见图12A)。“事件”由在两个方向上穿过触发线的荧光信号定义。然而，相对于基线测量事件的振幅。事件的左和右波谷的检测不受触发水平的限制；这些测量可以延伸到基线。事件持续时间可以被测量为两侧波谷位置之间的时间距离，或者通过触发线上的事件的两个交叉点之间的时间距离等测量。触发水平默认设置为基线(相对于数据范围)以上10％。可以为每个数据集(井数据)单独地设置和改变该水平。

基线水平。基线水平限定了检测范围的下端和基线的位置。所有振幅都是相对于基线水平而不是波谷值测量的。

水平名称(动态阈值、触发水平和基线水平)在对话框中进行颜色编码，以匹配图形窗口中的相应线的颜色。这些水平中的每一个可由具有左端和右端的相应线来定义。通过用鼠标左键抓住端部的控键并上下移动，可以单独移动端部。通过用鼠标左键抓住远离控键的任何地方的线并向上或向下移动，可以向上或向下移动整个水平线。也可以通过改变各个L(左)或R(右)编辑框中的值，或者通过微调器或者直接输入值来设置水平线位置。“锁定”特征将导致线端部在调整右边缘值或左边缘值时一致地移动。这个特征仅应用于对话框，并且不影响鼠标的定位。

设置默认水平。按下该按钮将把基线和触发水平复位到它们的默认位置(见图12A)。

处理所有井(参见图12B)。如果检查了该项目，则将处理所有选择的井数据。如果未检查，则仅处理当前选择的井。

数据组(参见图12B)：

井。分析将仅应用于所选择的并且出现在“细节”图形窗口中的井。在任何给定时间，在图中仅出现所选的井。要显示的井数据可以通过选择“井”组合框中的相应数据序列来指定。

事件拒绝组(参见图12B)：

最小振幅。该项指定了从基线测量的将被接受为有效的最小振幅。将拒绝形成具有低于最小振幅值的最大值的主/次峰的偏移。除了最小振幅是单一值而不是由沿着具有可独立调节的左端和右端的线的值来定义之外，最小振幅与“动态阈值”(参见图12A)基本相同。

最小持续时间。该项指定将被接受为有效的事件的最小持续时间(参见图12B)。事件持续时间可以在左和右波谷值之间测量，或者在事件的开始和结束之间测量，如通过穿过触发水平所定义的。具有比最小持续时间值短的持续时间的偏移将被拒绝。

适用于所有井。如果检查了该项，则出现在编辑框中的振幅和持续时间值将应用于来自所有井的数据。如果未检查，将使用为每个单独的井指定的值。

噪声拒绝组(参见图12B)：

最小振幅。该项指定了有效波峰的局部振幅的最小振幅阈值。波峰(有效或无效)的局部振幅被测量为波峰的振幅值与最近的左(和/或右)波谷的振幅值之间的振幅差。具有低于最小振幅阈值的局部振幅的波峰将被作为无效而被拒绝。

最小持续时间。该项指定有效波峰的最小持续时间阈值。波峰(有效或无效)的持续时间被测量为(a)两个相邻波谷中的较低波谷的时间值与(b)波峰的相对侧上的等效振幅的时间值之间的时间差的绝对值。持续时间短于最小持续时间阈值的波峰将被作为无效而被拒绝。

适用于所有井。如果检查了该项，则出现在编辑框中的振幅和持续时间阈值的值将应用于来自所有井的数据(即，用于单独的振荡模式的所有数据集)。如果未检查，将使用为每个单独的井指定的值。

自动。软件测量每个数据集的近似噪声水平。首先，使用短搜索向量长度(例如3)的波峰寻找算法定位数据集距离基线的振幅跨度的百分比范围(例如0至10％)内的所有波峰(“噪声波峰”)。噪声波峰可以具有相对于与基线相对的参考线的最大值。(例如，对于底部基线，噪声波峰可以是相对于位于振荡模式顶部的参考线具有最大值的负峰值(参见示例2)。)然后将噪声估计计算为落入四分位距内的噪声波峰的连续最大值之间的绝对差的平均值。噪声水平被认为是噪声估计的30％。噪声估计和噪声水平仅在数据相对干净并且大部分噪声位于基线附近时才是合理的。

测量标签(参见图13A和图13B)：

该标签用于指定将在统计页面中报告的那些测量。该页面显示了每个井(集合)的结果、在井中检测到的事件的平均值、以及在适用的情况下每个事件的单独值。

选择所有。该按钮选择所有事件用于显示(见图13A)。

选择无。该按钮清除事件显示选择。

平均波峰振幅。平均波峰振幅是对于给定井检测的事件的有效主峰的最大值的平均振幅，以相对荧光单位(RFU)表示。在波峰的最大值和基线之间测量用于计算平均值的每个波峰振幅。

波峰的数量。该描述符是有效主峰的总数或对于给定井组合的有效主峰和有效次峰的总数。

平均波峰速率。该描述符是每分钟有效主峰的数量(PpM)。对于心脏数据，这相当于“每分钟搏动”(BPM)。

每次事件的EAD类波峰的数量。该描述符是事件中或数据集的有效次峰(EAD类波峰)的数量。该项报告了每个事件的有效次峰的平均数、平均数的标准偏差和数据集的有效次峰的总数。

平均EAD类波峰速率(PpM)。该描述符是以每分钟的波峰(PpM)表示的在数据集(对于给定井)中检测到的有效次峰(EAD类波峰)的平均速率。

EAD类波峰的数量S.D。每次事件的EAD类波峰的数量的标准偏差。

10％至90％钙瞬变持续时间CTD。这些描述符是以秒为单位的事件持续时间(例如，钙瞬变持续时间)，其处于从事件的主峰的最大值到基线的指定水平。例如，CTD10是在从最大值到基线的振幅距离的10％的振幅水平测量的事件的持续时间。测量顶部10％至底部90％的CTDs。有时，波谷在离基线的一定距离处，避免了离波峰最远的CTDs的测量。

10％至90％从波峰开始的钙瞬变持续时间CTDP。这些描述符是从主峰的最大值的时间位置到相对于基线的从最大值的指定水平的事件的持续时间。(CTDP是从波峰开始的钙瞬变持续时间)。例如，CTDP10是从波峰的最大值到基线的振幅距离的10％的水平的波峰的事件的持续时间。测量从10％到90％的CTDs。有时，波谷在离基线一定距离处，避免了离波峰最远的CTDPs的测量。

面积。从事件的开始到结束测量的给定事件的振荡轨迹和基线之间的面积，如由事件的左和右波谷定义的。该面积的单位是相对荧光单位·秒。

波峰间距。该测量通过比较间距的标准偏差和平均值来确定有效主峰的间距的规则性(以秒为单位)。如果标准偏差小于平均值的阈值百分比(例如，50％)，则测量结果报告均匀的波峰间距(OK)，或者如果标准偏差大于阈值百分比，则测量结果报告不规则的间距(IRREG)。

斜率。在相关的编辑框中指定斜率测量的波峰的百分比和来自斜率测量的波峰的百分比。通常，斜率被测量为在波峰值的10％至80％或30％至70％之间。

示例6.使用心肌细胞的化合物测试

本示例描述了通过测试心肌细胞上的心脏毒性化合物对由实施例5中所述的软件测量的各种参数的影响而获得的结果；参见图14至图22。

开发用于化合物筛选和毒性评估的生物学相关的和预测性的基于细胞的测定是药物发现中的主要挑战。本研究的焦点是使用人诱导的多能干细胞(iPSC)衍生的心肌细胞建立高通量相容的心脏毒性测定。为了评价人iPSC衍生的心肌细胞作为体外心律失常模型的效用，评价了与低、中和高尖端扭转型室速(TdP)风险类别相关的28种药物的浓度依赖性和反应。(化合物由综合的体外致心律失常试验(CiPA)倡议提出。)通过用钙敏感染料的快速动力学荧光测量的细胞内Ca²⁺振荡的变化，监测各种化合物对心肌细胞自发活动的收缩率和模式的影响。实施先进的图像分析方法以提供Ca²⁺振荡模式的多参数表征。该测定允许表征参数，例如拍频、振幅、峰宽以及上升和衰减时间。结果证明了hiPSC心肌细胞用于体外检测药物诱导的致心律失常作用的效用。

iPSC衍生的心肌细胞产生自发的同步钙振荡。用

系统的高速荧光成像用于测量心肌细胞中Ca²⁺振荡的模式和频率，如用EarlyTox^TM心脏毒性试剂盒通过细胞内Ca²⁺水平的变化所监测的。在该试验中测试了一组28种已知的心脏毒性化合物，加上几种基准化合物和阴性对照。

iPSC衍生的心肌细胞：来自细胞动力学国际(CDI)

Cardiomyocytes2的低温保存的人iPSC衍生细胞用于实验。将细胞解冻并以20000/井(96个井的规格)或10000/井铺板(plate)到384个井的规格的板(Corning)中，并在维持培养基中培养7天。在进行实验之前，视觉上证实了3D培养物中存在强同步收缩。此外，从Ncardia公司获得具有cardiomyocytes1的测定即用具有384个井的板。板在铺板前运输，并允许在到达2天后恢复。

将心肌细胞暴露于化合物15、30、60或90分钟或24小时。

根据常规协议，使用

钙染料(分子装置公司(Molecular Devices))评估细胞内Ca²⁺振荡；在测量前，用染料加载细胞2小时。

iPSC衍生的心肌细胞中钙振荡的测量是一种有前景的毒性评估方法。本工作集中于评价根据临床数据被分类为高、中或低风险的一组28种CiPA化合物。

装备有新的高速照相机的

系统允许心肌细胞中钙振荡模式的更好的分辨率。Screen

Peak Pro^TM2软件允许使用超过20种可用的模式描述符进行复杂事件分析和模式的详细表征。该分析可用于测试开发药物和筛选潜在心脏毒性危害的化学品。

图14至图21示出了在用所示化合物和浓度处理三十分钟后开始，记录两分钟的对照和化合物处理的心肌细胞的钙振荡的代表性轨迹。描述了每种化合物对钙振荡模式的扰动。

对照轨迹(心肌细胞的DMSO处理)示于图14。仅可检测到主峰118(用圆圈标记)。主峰具有均匀的振幅并且彼此之间间隔开。

图15示出来自用浓度为1μM的E-4031处理的心肌细胞的轨迹。存在主峰118和次峰150。主峰延长。

图16示出来自用浓度为1μM的伊布利特(IBUTILIDE)处理的心肌细胞的轨迹。存在主峰118和次峰150。主峰延长。

图17示出来自用10μM浓度的多非利特(DOFETILIDE)处理的心肌细胞的轨迹。仅检测到主峰118，但是彼此之间具有不规则的间距。

图18示出来自用浓度为10μM的奎尼丁(QUINIDINE)处理的心肌细胞的轨迹。检测到主峰118和次峰150。主峰是延长的并且彼此具有任意不规则的间距。

图19示出来自用浓度为10μM的索他洛尔(SOTALOL)处理的心肌细胞的轨迹。检测到主峰118和次峰150。主峰是延长的并且彼此具有任意不规则的间距。

图20示出来自用浓度为1μM的阿司咪唑(ASTEMIZOLE)处理的心肌细胞的轨迹。没有检测到有效波峰，因此报告“停止”振荡条件。

图21示出来自用浓度为1μM的硝苯地平(NIFEDIPINE)处理的心肌细胞的轨迹。仅检测到主峰118，但其频率显著高于对照。

图22示出化合物在一定范围的标准化浓度内的不同读数的汇编和比较，其中根据已知心脏毒性将化合物分为三组：高毒性、中等毒性和低毒性。读数包括次峰的存在、波峰延长、主峰的间距/振幅的不规则性、主峰相对于对照的频率增加、停止条件(无有效波峰)、主峰相对于对照的频率降低、以及振荡模式内主峰的振幅变化。该图表明，在与Cmax(血液中的最大临床浓度)相当的浓度下出现的次峰和波峰延长显然是心脏毒性的强指示剂(或与心脏毒性相关)，而其它读数的改变不一定指示心脏毒性作用。

示例7.使用神经元的化合物测试

本示例描述了通过利用体外神经元测试神经毒性化合物对分析软件所测量的各种参数的影响而获得的结果；参见图23至图30。

为了加速开发更有效和更安全的药物，越来越需要更复杂、生物学相关和预测性的基于细胞的测定，用于药物发现和毒理学筛选。已经开发了人iPSC衍生的神经3D共培养物(

3D平台)作为高通量筛选平台，其更接近地类似于天然人脑皮层组织的构造。神经球状体3D共培养物是iPSC衍生的、功能活性的皮层谷氨酸能神经元和γ-氨基丁酸能神经元的生理学相关共培养物，所述神经元与来自相同供体的星形胶质细胞共分化和成熟。3D神经球体包含富含突触的神经网络，产生高功能性神经元回路并显示自发同步的、易于检测的钙振荡。

本文公开了一种用于分析复杂钙振荡的新方法。该方法允许检测和多参数表征振荡波峰。多参数表征可以包括振荡速率(即，主峰的频率)、主峰的宽度和振幅、次峰的描述符、波形不规则性和若干其它重要的读数。

在

3D球体中的神经元细胞产生自发的同步钙振荡。使用

系统的快速动力学荧光成像来测量神经球的Ca²⁺振荡的模式和频率，如使用

Calcium 6测定试剂盒通过细胞内Ca²⁺水平的变化所监测的。测试了一组已知的神经调节剂，包括NMDA、GABA和AMPA受体的激动剂和拮抗剂；红藻氨酸；以及镇痛和抗癫痫药物。通过使用

系统的高速成像，以2Hz的频率(0.5秒采样间隔)同时记录来自整个具有384个井的板的每个井的荧光。

在Screen

Peak Pro^TM2软件模块中实施的先进分析方法提供Ca²⁺流振荡模式的多参数表征。该表型测定产生读数，例如振荡频率、振幅、峰宽、峰上升和衰减时间以及峰振幅/间距不规则性。通过测量若干测量结果的变化来评估神经元活性调节剂的作用。

在不同的时间点和浓度测定一组超过二十种化合物，包括许多已知的神经元活性调节剂，并计算化合物作用的EC50值。时间点包括0、15、30、60、90和120分钟，以及24小时。观察到作为波峰频率的抑制或激活或其它测量的变化，对应于相应神经调节剂的预期效果。

图23至图30示出在用所示化合物和浓度处理三十分钟后开始，记录十分钟的对照和化合物处理的神经球体的钙振荡的代表性轨迹。

对照轨迹(球状体的DMSO处理)示于图23中。仅可检测到主峰118(用圆圈标记)。主峰具有相当均匀的振幅和彼此之间的间距。

图24示出来自用浓度为3μM的MK-801处理的球状体的轨迹。主峰118具有可变的振幅(与图23相比)。仅检测到一个次峰150。

图25示出来自用浓度为10μM的GABA处理的球状体的轨迹。仅检测到主峰118，但其频率显著低于对照。

图26示出来自用10μM浓度的巴氯芬(BACLOFEN)处理的球状体的轨迹。仅检测到主峰118，但是其频率显著低于对照并且具有不规则的间距和振幅。

图27示出来自用30μM浓度的4-氨基吡啶(4-AMINOPYRIDINE)处理的球状体的轨迹。检测到主峰118和次峰150。主峰118的频率相对于对照增加。

图28示出来自用浓度为(0.3μM)的缬氨霉素(VALINOMYCIN)处理的球状体的轨迹。检测到主峰118和次峰150。主峰118的频率远小于对照，并且振幅和间距变化更大。

图29示出来自用浓度为1μM的红藻氨酸(KAINIC ACID)处理的球状体的轨迹。检测到主峰118和多个次峰150。主峰118的频率相对于对照增加。

图30示出来自用30μM浓度的他莫昔芬(TAMOXIFEN)处理的球状体的轨迹。仅检测到主峰118，但是其频率显著低于对照并且具有可变的振幅。

该测定可用于测试化合物的作用和筛选神经毒性化学物质。出现次峰和低振幅主峰可说明化合物具有神经毒性活性。单独对波峰速率和振幅的影响可能不足以预测神经毒性。

示例8.选择的示例

该示例将本公开的所选示例描述为一系列索引段落。

段落1.一种分析方法，所述方法包括：(i)检测表示与一个或多个生物细胞相关的振荡离子流的荧光，以产生描述振荡模式的一系列数据点；(ii)计算所述振荡模式的一系列斜率；以及(iii)使用所述一系列斜率来识别所述振荡模式的波峰。

段落2.如段落1所述的方法，其中，计算使用滑动窗口来定义所述一系列数据点的子集，根据所述子集来计算所述一系列斜率。

段落3.如段落2所述的方法，还包括从多个允许的尺寸中选择所述滑动窗口的尺寸，其中，所述滑动窗口的尺寸对应于来自所述数据点集合的被所述滑动窗口包含的数据点的数量。

段落4.如段落3所述的方法，其中，所述滑动窗口的尺寸由处理器基于所述振荡模式中的噪声水平和/或所述数据点集的采样间隔自动地分配，并且其中，可选地，所述处理器还计算所述一系列斜率并识别所述波峰。

段落5.如段落3或4所述的方法，其中，选择所述滑动窗口的尺寸由用户执行，并且被传送到还计算所述一系列斜率并识别所述波峰的处理器。

段落6.如段落1至5中的任一段的方法，其中，在计算一系列斜率之前，不对该数据点集合进行滤波降噪。

段落7.如段落1至6中任一段的方法，其中，所述波峰包括一系列主峰，其中，所述振荡模式包括一系列事件，每个事件仅包括所述主峰中的一个，所述方法还包括确定所识别的波峰中的次峰的至少一个方面，每个次峰在事件内在所述主峰中的一个之后。

段落8.如段落7所述的方法，其中，次峰的至少一个方面涉及振荡模式内的次峰的数量、频率或周期。

段落9.如段落7或8所述的方法，其中，对于每个事件，所述振荡模式与预定触发水平交叉两次，并且其中，相对于所述振荡模式的基线设置所述触发水平。

段落10.如段落9所述的方法，其中，所述触发水平被设置为由所述一系列数据点跨越的振幅范围的百分比。

段落11.如段落9所述的方法，其中，所述触发水平是由用户选择的触发水平。

段落12.如段落9至11中的任一段的方法，其中，所述基线和所述触发水平可由用户经由图形用户界面来调整。

段落13.如段落1至12中任一段的方法，其中，识别波峰包括搜索该系列斜率内的斜率的从正到负或从负到正的转变。

段落14.如段落13的方法，其中，识别波峰包括滤波与所述转变相关联的波峰以获得被认为有效的波峰集合。

段落15.如段落14所述的方法，其中，滤波波峰包括基于一个或多个预定义的振幅和/或持续时间标准，滤波波峰。

段落16.如段落14或15的方法，还包括确定被认为有效的波峰集合的波峰相关参数的值。

段落17.如段落14至16中任一段的方法，其中，识别波峰包括确定与通过搜索找到的多个转变中的每个转变相关联的波峰的至少一个振幅和/或持续时间；将所述至少一个振幅和/或所述持续时间与至少一个阈值进行比较；以及如果比较不满足针对所述至少一个振幅和/或所述持续时间的一个或多个预定义的标准，则将与所述转变相关联的所述波峰拒绝为无效。

段落18.如段落17所述的方法，其中，比较所述至少一个振幅和/或所述持续时间包括比较相对于所述振荡模式的基线测量的所述波峰的振幅。

段落19.如段落17或18所述的方法，其中，比较所述至少一个振幅和/或持续时间包括比较相对于与波峰相邻的局部波谷测量的波峰的局部振幅。

段落20.如段落17到19中的任一段的方法，其中，比较至少一个振幅和/或持续时间包括比较相对于至少一个局部波谷测量的波峰的持续时间。

段落21.如段落17至20中任一段所述的方法，其中，所述至少一个阈值中的每个阈值可由用户经由图形用户界面调整，和/或至少一个阈值由处理器自动设置。

段落22.段落1至21中的任一段的方法，其中，所述振荡模式包括一系列事件，并且对于该系列事件中的每个事件，所述振荡模式两次穿过预定触发水平，所述方法还包括滤波该系列事件以拒绝具有小于预定持续时间的每个事件，如果有的话，其中，被拒绝的事件内的每个波峰被认为是无效的。

段落23.如段落1至22中的任一段的方法，还包括用钙指示剂标记所述一种或多种生物细胞，其中，所述荧光由所述钙指示剂发射。

段落24.如段落1至23中的任一段的方法，其中，一种或多种生物细胞包括一种或多种心肌细胞或神经元。

段落25.如段落24所述的方法，其中，所述一种或多种生物细胞主要是心肌细胞或神经元。

段落26.如段落24或25所述的方法，其中，所述一种或多种生物细胞包括在体外从至少一种干细胞分化的一种或多种心肌细胞或神经元。

段落27.如段落1至26中的任一段的方法，其中，所述一种或多种生物细胞包含在选自培养皿、烧瓶和多井微孔板的器皿中。

段落28.如段落1至27中任一段的方法，其中，该系列数据点代表大于1Hz的采样率。

段落29.如段落1至28中任一段的方法，其中，所述振荡模式包括一系列事件，每个事件包括单个主峰，并且其中，所述振荡模式包括一个或多个次峰，每个次峰包括在所述一系列事件的一个事件中，所述方法还包括确定与所述一个或多个次峰相关的一个或多个参数的至少一个值。

段落30.如段落29所述的方法，其中，该至少一个值对应于次峰的数量、频率或周期。

段落31.如段落1至30中任一段的方法，其中，对于一个或多个生物细胞的多个单独集合的每个单独集合进行检测荧光、计算一系列斜率和识别波峰，并且其中，将每个单独集合暴露于不同的化合物或不同浓度的相同化合物。

段落32.如段落31所述的方法，还包括，如果存在，确定每种不同的化合物或浓度对均与波峰的至少一个子集相关的一个或多个参数的影响。

段落33.如段落32所述的方法，其中，所述一个或多个参数对应于所述振荡模式内的次峰的数量、频率或周期。

段落34.如段落32或33的方法，进一步包括，如果存在，基于对所述一个或多个参数的影响，预测每种化合物的心脏毒性或神经毒性的程度或浓度。

段落35.如段落1至34中任一段的方法，还包括自动地建立用于所述振荡模式的基线。

段落36.如段落35所述的方法，其中，建立基线包括在振荡模式的顶部创建参考线并且朝向振荡模式的底部创建阈值线，相对于参考线寻找最大值，最大值位于阈值线之下，并且使用最大值的至少一个子集来执行线性回归。

段落37.如段落36所述的方法，还包括使用最大值的至少一个子集来计算振荡模式的噪声水平。

段落38.如段落37中任一段的方法，其中，计算一系列斜率使用滑动窗口来定义该系列数据点的子集，从该子集计算该系列斜率，并且其中，基于该噪声水平来选择该滑动窗口的尺寸。

段落39.一种分析方法，所述方法包括：(i)检测表示与一个或多个生物细胞相关的振荡离子流的荧光，以产生描述振荡模式的一系列数据点；(ii)如果有的话，识别所述振荡模式中的主峰和次峰；和(iii)确定次峰的一个方面。

段落40.如段落39的方法，其中，确定次峰的一个方面包括确定次峰的数量、频率或周期。

段落41.如段落39或40的方法，还包括将一种或多种生物细胞暴露于化合物，并确定化合物对次峰的所述一个方面的作用。

段落42.如段落39到41中的任何段的方法，其中，振荡模式包括一系列事件，每个事件包括仅一个主峰，并且其中，在事件内每个次峰在主峰之后出现。

段落43.如段落39到42任一段的方法，其中，次峰是由心肌细胞或神经元产生的次峰。

段落44.如段落39至43任一段的方法，还包括用钙指示剂标记所述一种或多种生物细胞，其中，从钙指示剂检测荧光。

段落45.如段落39到44任一段的方法，还包括确定主峰的间距规则性/不规则性。

段落46.如段落45的方法，其中，确定间距规则性/不规则性包括比较主峰的间距的标准偏差与主峰的平均间距。

段落47.如段落39到46中的任一段的方法，还包括确定主峰的振幅规则性/不规则性。

段落48.如段落47的方法，其中，确定振幅规则性/不规则性包括比较主峰的振幅的标准偏差与主峰的平均振幅。

段落49.如段落39到48中的任一段的方法，还包括将每个主峰的振幅与预定阈值进行比较，以枚举主峰中的较小波峰，如果有的话。

段落50.如段落39至49中的任一段的方法，其中，对一个或多个生物细胞的多个单独集合的每个单独集合进行检测、识别和确定，并且其中，将每个单独集合暴露于不同的化合物或暴露于不同浓度的相同化合物。

段落51.如段落50的方法，进一步包括确定每种不同的化合物或浓度对次峰的一个方面的影响，如果有的话。

段落52.如段落50或51的方法，还包括确定每种不同化合物或浓度对主峰的间距规则性/不规则性的影响，如果有的话。

段落53.如段落50到52中任一段的方法，还包括确定每种不同化合物或浓度对主峰的振幅规则性/不规则性的影响，如果有的话。

段落54.如段落50至53中任一段的方法，还包括基于次峰的一个方面和主峰的间距规则性/不规则性，预测每种化合物的心脏毒性或神经毒性程度或浓度。

段落55.如段落50至54中任一段的方法，还包括基于次峰的一个方面和主峰的振幅规则性/不规则性，预测每种化合物的心脏毒性或神经毒性程度或浓度。

段落56.如段落50至55中任一段的方法，还包括基于次峰的一个方面和主峰的数量、频率或周期来，预测每种化合物的心脏毒性或神经毒性的程度或浓度，所述主峰是具有低于预定阈值的振幅的较小波峰。

段落57.一种系统，包括：(i)光学传感器，其被配置成检测表示与一个或多个生物细胞相关联的振荡离子流的荧光，以产生描述振荡模式的一系列数据点；以及(ii)处理器，其被配置为(1)计算所述振荡模式的一系列斜率，可选地，计算所述振荡模式的一系列斜率使用滑动窗口来定义所述一系列数据点的子集，从所述子集计算所述一系列斜率，以及(2)使用所述一系列斜率来识别所述振荡模式的波峰。

段落58.如段落57所述的系统，被配置成执行段落1至56的步骤的任何组合。

段落59.一种系统，包括：(i)光学传感器，其被配置成检测表示与一个或多个生物细胞相关联的振荡离子流的荧光，以产生描述振荡模式的一系列数据点；以及(ii)处理器，其被配置为(1)识别振荡模式中的主峰和次峰，如果有的话，以及(2)确定次峰的一个方面。

段落60.如段落59的系统，被配置成执行段落1至56的步骤的任何组合。

本公开中使用的术语“示例性”意味着“说明性的”或“用作示例”。类似地，术语“例证”意味着“通过给出示例来说明”。术语既不意味着可取性(desirability)也不意味着优越性。

上述公开内容可以包括具有独立效用的多个不同的发明。尽管这些发明中的每一个都以其(一个或多个)优选形式公开，但是这里公开和示出的其具体实施例不应被认为是限制性的，因为许多变形是可能的。本发明的主题包括这里公开的各种元件、特征、功能和/或特性的所有新颖和非显而易见的组合和子组合。

Claims

1.一种分析方法(50)，所述方法包括：

检测(54)表示与一个或多个生物细胞(72)相关联的振荡离子流的荧光(91)，以产生描述振荡模式(110)的一系列数据点(120)；

计算(60)所述振荡模式(110)的一系列斜率；以及

使用所述一系列斜率来识别(62)所述振荡模式(110)的波峰(118、150a、150b)。

2.如权利要求1所述的方法，其中，计算(60)使用滑动窗口(122)来定义所述一系列数据点(120)的子集(126)，根据所述子集来计算所述一系列斜率。

3.如权利要求2所述的方法，还包括从多个允许的尺寸中选择所述滑动窗口(122)的尺寸，其中，所述滑动窗口(122)的尺寸对应于来自所述一系列数据点(120)的由所述滑动窗口(122)包含的数据点(126)的数量。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述滑动窗口(122)的尺寸由处理器(96)基于所述振荡模式(110)中的噪声水平和/或所述一系列数据点(120)的采样间距来自动地分配，并且其中，所述处理器(96)还计算所述一系列斜率并识别所述波峰(118、150a、150b)。

5.如权利要求3所述的方法，其中，选择所述滑动窗口(122)的尺寸由用户执行，并且被传送到处理器(96)，所述处理器还计算所述一系列斜率并且识别所述波峰(118、150a、150b)。

6.如权利要求1所述的方法，其中，在计算(60)一系列斜率之前，不对所述一系列数据点(120)进行滤波降噪。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述波峰包括一系列主峰(118)，其中，所述振荡模式(110)包括一系列事件(138)，每个事件仅包括所述主峰(118)中的一个，所述方法还包括确定所识别的波峰的次峰(150a、150b)的至少一个方面，在事件(138)内，每个次峰在所述主峰(118)中的一个之后。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述次峰(150a、150b)的至少一个方面与所述振荡模式(110)内的所述次峰(150a、150b)的数量、频率或周期有关。

9.如权利要求7所述的方法，其中，所述振荡模式(110)针对每个事件(138)与预定的触发水平(144)交叉两次，并且其中，所述触发水平(144)是相对于所述振荡模式(110)的基线(116)设置的。

10.如权利要求1所述的方法，其中，识别(62)波峰(118、150a、150b)包括搜索所述一系列斜率内的斜率的从正到负的转变或者从负到正的转变。

11.如权利要求10所述的方法，其中，识别(62)波峰包括滤波与所述转变相关联的波峰，以获得被认为有效的波峰集合。

12.如权利要求11所述的方法，其进一步包括确定用于所述被认为有效的波峰集合的波峰相关参数的值。

13.如权利要求1所述的方法，还包括用钙指示剂标记(52)所述一个或多个生物细胞(72)，其中，所述荧光(91)由所述钙指示剂发射。

14.如权利要求1所述的方法，其中，所述一个或多个生物细胞(72)包括一个或多个心肌细胞或神经元。

15.如权利要求1所述的方法，其中，所述振荡模式(110)包括一系列事件(138)，每个事件包括单个主峰(118)，并且其中，所述振荡模式(110)包括一个或多个次峰(150a、150b)，每个次峰包括在所述一系列事件(138)的一个事件中，所述方法还包括确定(64)与所述一个或多个次峰(150a、150b)相关的一个或多个参数的至少一个值。

16.一种分析方法，所述方法包括：

识别(62)所述振荡模式(110)中的主峰(118)和次峰(150a，150b)；以及

确定所述次峰(150a、150b)的一个方面。

17.如权利要求16所述的方法，其中，确定所述次峰(150a、150b)的一个方面包括确定所述次峰(150a、150b)的数量、频率或周期。

18.如权利要求16所述的方法，还包括确定所述主峰(118)的间距规则性/不规则性和/或所述主峰(118)的振幅规则性/不规则性。

19.如权利要求16所述的方法，还包括将每个主峰(118)的振幅(194)与预定阈值进行比较，以枚举所述主峰中的较小峰，如果有的话。

20.一种系统(70)，包括：

光学传感器(88)，其被配置成检测表示与一个或多个生物细胞(72)相关联的振荡离子流的荧光(91)，以产生描述振荡模式(110)的一系列数据点(120)；以及

处理器(96)，其被配置为(1)使用滑动窗口(122)来定义所述一系列数据点(120)的子集(126)，以计算所述振荡模式(110)的一系列斜率，所述一系列斜率是从所述子集计算的，以及(2)使用所述一系列斜率来识别所述振荡模式(110)的波峰(118、150a、150b)。