JP2013015325A

JP2013015325A - Ｄｎａ二本鎖切断損傷の解析装置及び解析方法

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Publication number: JP2013015325A
Application number: JP2011146381A
Authority: JP
Inventors: Akihiro Kurimasa; 明弘栗政; Yuichiro Tomita; 祐一郎冨田; Yuya Watabe; 勇哉渡部
Original assignee: Ebase Solutions Laboratory; Tottori University NUC
Current assignee: Ebase Solutions Laboratory; Tottori University NUC
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2011-06-30
Publication date: 2013-01-24
Anticipated expiration: 2031-06-30
Also published as: JP5938764B2

Abstract

【課題】細胞で生じるＤＮＡ損傷を迅速かつ定量的に測定できる解析技術を提供する。
【解決手段】ＤＮＡ解析装置（１）は、ＤＮＡ二本鎖切断箇所に集積する第１の蛍光タンパク質を観察対象の細胞に導入して時系列で撮影された画像を取得する画像取り込み手段（２５）と、取得した画像を解析する画像解析手段（１５）とを備える。画像解析手段（１５）は、時系列で撮影された画像の各々について、各画像に含まれる細胞核の画像の領域を検出し、検出した領域に含まれる、第１の蛍光タンパク質の発光による発光スポットの数をカウントし、さらに、検出した領域に含まれる、第１の蛍光タンパク質の発光による発光領域の面積を求め、時系列で求めた発光スポットのカウント値及び発光領域の面積のデータを解析データとして生成する。
【選択図】図７

Description

本発明は、細胞のＤＮＡ二本鎖切断損傷を定量的に解析する装置及び方法に関する。

がんは我が国の死因の第１位であり、生涯のうちにがんに罹患する可能性は、おおよそ２人に１人とされる。がんは加齢により発症リスクが高まり、高齢化社会の進行にともない罹患者・死者数は今後とも増加していくと推測される。そのような状況で日本におけるがん治療は、これまでの手術療法を中心としたものであったが、今後は化学療法、放射線療法により重きが置かれると考えられている。

がんの放射線治療や化学療法剤の多くはがん細胞のＤＮＡを標的とし、その損傷を引き起こすことによりがん細胞を死滅させる。がん細胞で起こるＤＮＡ損傷を生きたまま鋭敏に観察・評価できれば、迅速に新規の抗がん剤のスクリーニングが可能となり、また放射線照射の有効性を評価でき、新規抗がん剤や放射線治療の増感補助薬の開発の迅速化を図ることができる。

本発明は、上記のような課題を鑑み、細胞で生じるＤＮＡ損傷を迅速かつ定量的に測定できる解析技術を提供することを目的とする。

本発明のＤＮＡ解析装置は、ＤＮＡ二本鎖切断損傷を定量的に解析する装置であって、ＤＮＡ二本鎖切断箇所に集積する第１の蛍光タンパク質を観察対象の細胞に導入して時系列で撮影された画像を取得する画像取り込み手段と、取得した画像を解析する画像解析手段とを備える。画像解析手段は、時系列で撮影された画像の各々について、各画像に含まれる細胞核の画像の領域を検出し、検出した領域に含まれる、第１の蛍光タンパク質の発光による発光スポットの数をカウントし、さらに、検出した領域に含まれる、第１の蛍光タンパク質の発光による発光領域の面積を求め、時系列で求めた発光スポットのカウント値及び発光領域の面積のデータを解析データとして生成する。

さらに、取得した画像は、第１の蛍光タンパク質に加えて、細胞周期のＳ期にある細胞を標識する第２の蛍光タンパク質を観察対象の細胞に導入して撮影された画像であってもよい。この場合、画像解析手段は、第１の蛍光タンパク質の発光による発光スポットのカウント及び発光領域の面積の算出に加えて、さらに、第２の蛍光タンパク質の発光による発光スポットの数をカウントする。

本発明に係る解析方法は、ＤＮＡ二本鎖切断損傷を定量的に解析する方法であって、
ＤＮＡ二本鎖切断箇所に集積する第１の蛍光タンパク質を観察対象の細胞に導入して時系列で画像を撮影し、
時系列で撮影された複数の画像の各々について、
各画像に含まれる細胞核の画像の領域を検出し、
前記検出した領域に含まれる、前記第１の蛍光タンパク質の蛍光発光による発光スポットの数をカウントし、
前記検出した領域に含まれる、前記第１の蛍光タンパク質の蛍光発光による発光領域の面積を求め、
時系列で求めた前記発光スポットのカウント値及び前記発光領域の面積のデータを解析データとして生成する。

本発明によれば、蛍光タンパク質をバイオセンサーとして用いて、細胞核においてＤＮＡ損傷が生じた箇所を検出する。具体的には、細胞核を時系列で撮影した画像を解析して、蛍光発光による発光スポットの数、発光領域の面積を求めることで、ＤＮＡの損傷の程度を定量的に測定する。これにより、ＤＮＡの損傷及び損傷の修復の時間的な変化を定量的にかつ迅速に測定することが可能となる。このようなＤＮＡ損傷解析技術を利用することで、がん細胞で起こるＤＮＡ損傷を生きたまま鋭敏に観察・評価でき、迅速に新規の抗がん剤のスクリーニングが可能となり、また放射線照射の有効性を評価でき、新規抗がん剤や放射線治療の増感補助薬の開発の迅速化を図ることができる。

ＤＮＡ二本鎖切断とＤＮＡ損傷応答を説明した図ＧＦＰ−５３ＢＰ１タンパク質の蛍光を利用して、細胞核のＤＮＡ損傷の状態を撮影した画像（（ａ）ＤＮＡ損傷がない場合、（ｂ）ＤＮＡ損傷がある場合）細胞周期を説明した図（ａ）緑色蛍光タンパク質であるＧＦＰ−５３ＢＰ１タンパク質をバイオセンサーとして導入し、細胞核の状態を撮影した画像であり、（ｂ）赤色蛍光タンパク質であるＤｓＲｅｄ−ＰＣＮＡタンパク質をバイオセンサーとして導入し、細胞核の状態を撮影した画像細胞にＤＮＡ損傷を与えた後のバイオセンサーによる発光状態の時間経過に伴う変化を撮影した画像ｚ軸方向における複数の平面でスライスして細胞核の画像データを取得する方法を説明した図ＤＮＡ損傷解析装置の構成を示す図顕微鏡により時系列で撮影された細胞画像（画像の一部）の例を示す図ＤＮＡ損傷解析装置の解析処理を示すフローチャート画像データにおいて細胞核を特定する処理を説明するための図画像データにおける発光スポット数のカウント及び発光領域の面積の算出処理を説明するための図ＤＮＡ損傷解析装置により得られた解析データをグラフ表示した図（抗がん剤として、ＮＣＳ(Neocarzinostanin)を投与した場合）ＤＮＡ損傷解析装置により得られた解析データをグラフ表示した図（抗がん剤として、ＣＰＴ(Camptothecin)を投与した場合）

以下、添付の図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。

１．ＤＮＡ２本鎖切断損傷の検出方法の基本原理
図１を参照し、本実施形態におけるＤＮＡ２本鎖切断損傷を検出する方法の基本原理について説明する。

通常、がんに対して放射線治療あるいは化学療法を行うと、ＤＮＡに損傷が発生する。そのうち最も細胞にダメージを与える損傷がＤＮＡ２本鎖切断である。２本鎖切断が起きると、図１に示すように、細胞の中では、「ＡＴＭ」と呼ばれるタンパク質キナーゼが活性化され、種々のタンパク質が連鎖的に反応を起こし、最終的にＤＮＡが巻き付いているヒストン１００にメチル化などの変化が起こり、５３ＢＰ１タンパク質が集積する。本実施形態では、このようなＤＮＡ損傷箇所に５３ＢＰ１タンパク質が集積するという現象を利用して、ＤＮＡ２本鎖切断損傷を検出する。

ここで、ＤＮＡ２本鎖切断損傷を検出するためのバイオセンサーについて説明する。バイオセンサーの基本技術として、２００８年ノーベル化学賞受賞対象となった緑色蛍光タンパク質ＧＦＰを用いている。特に、本発明者は、ＤＮＡ２本鎖切断損傷に特異的に集積するように５３ＢＰ１タンパク質に改変を加え、ヒトがん培養細胞内で安定に発現できるＧＦＰ−５３ＢＰ１融合タンパク質（以下「ＧＦＰ−５３ＢＰ１タンパク質」という）をバイオセンサーとして用いた。これにより、細胞が生きたままの状態でＤＮＡ損傷を蛍光顕微鏡で緑色のスポットとして観察することを可能とした。

図１では、便宜上、一つの５３ＢＰ１しか示していないが、実際は数百の分子が集積する。このため、ＤＮＡ損傷箇所は、光のスポットとして観察することが出来る。図２（ａ）は、ＤＮＡの損傷がない細胞核の状態を示した画像であり、図２（ｂ）は、８Gy（８Sv）の放射線により損傷が与えられたＤＮＡの細胞核の状態を示した画像である。図２（ｂ）に示すように、８Gy（８Sv）の放射線によりＤＮＡの複数箇所に損傷が発生すると、それらの損傷箇所に集積したＧＦＰ−５３ＢＰ１タンパク質が蛍光発光することにより光スポットとして観察される。

さらに、本実施形態では、ＧＦＰ−５３ＢＰ１タンパク質に加えて、観察対象の細胞の細胞周期を検出できるセンサータンパク質を一緒に導入している。

ここで、細胞周期について説明する。細胞周期とは、増殖・分裂する細胞が一連の過程を経て２つの細胞に分裂する全行程である（図３参照）。細胞周期は、Ｇ０期、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の５つの期を有している。分裂する細胞は、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の順に変化する。また、分裂・増殖せずに休止期にある細胞（多くの正常な体細胞）は、Ｇ０期に停止している。特に、Ｓ期では、活発に増殖・分裂を繰り返すがん細胞のＤＮＡ複製が行われており、このＳ期におけるＤＮＡ損傷を検出することは、ＤＮＡ損傷を誘導する薬剤のスクリーニングにおいてきわめて有用である。

具体的には、細胞分裂に際してＤＮＡを複製している細胞周期のＳ期を標識するＰＣＮＡ−ＤｓＲｅｄタンパク質をセンサーとして観察対象の細胞に導入する。ＰＣＮＡ−ＤｓＲｅｄタンパク質は赤色蛍光を示すタンパク質である。これにより、活発に分裂する細胞のＳ期にある細胞が、赤いスポットを多量に含む細胞として標識される。その結果、がん細胞を観察対象とした場合、がん細胞がＳ期にあるときに、ＤＮＡ損傷を引き起こす抗がん剤の候補を迅速にスクリーニングできる。正常細胞は通常分裂を停止して静止状態にあるものが多く、活発に分裂するＳ期細胞のみで未知の薬剤がＤＮＡ損傷を引き起こすことが認識できれば、正常細胞に影響の少ない（副作用の少ない）抗がん剤の発見につながる。

図４（ａ）は、緑色蛍光タンパク質であるＧＦＰ−５３ＢＰ１タンパク質をバイオセンサーとして導入し、細胞核の状態を撮影した画像であり、図４（ｂ）は、図４（ａ）に示す細胞と同じ細胞について、赤色蛍光タンパク質であるＤｓＲｅｄ−ＰＣＮＡタンパク質をバイオセンサーとして導入し、細胞核の状態を撮影した画像である。図４（ｂ）に示すように、Ｓ期にある細胞核の全体において、赤色蛍光タンパク質であるＤｓＲｅｄ−ＰＣＮＡタンパク質による発光スポットが散在していることが分かる。

図５は、細胞にＤＮＡ損傷を与えた後のバイオセンサーによる発光状態の時間経過に伴う変化を撮影した図である。図５の（ａ）〜（ｇ）は、それぞれ別々の細胞核の時間変化（損傷前、損傷直後、１分後、２分後、３分後）を示している。ここでは、レーザー照射によりＤＮＡ損傷を発生させている。図５の（ａ）〜（ｇ）より、レーザーが照射されＤＮＡ損傷が発生した部分において、時間経過とともに、発光スポットが増加している様子、すなわち、ＧＦＰ−５３ＢＰ１が集積している様子が理解できる。このように、損傷を生きたまま観察できることが分かる。

本実施形態では、以上のようにＧＦＰ−５３ＢＰ１タンパク質及びＤｓＲｅｄ−ＰＣＮＡタンパク質のような蛍光タンパク質をバイオセンサーとして細胞に加え、その発光状態を撮影し、撮影した画像を解析することによりＤＮＡ損傷の状態を検出する。

また、細胞は３次元形状を有することから、図６に示すように、ｚ軸方向における複数の平面でスライスした画像データを取得するようにしてもよい。この場合、撮影された画像情報は、細胞の３次元の座標情報に加えて、時間情報、緑／赤の２つの蛍光色情報を含めた５次元の画像情報となる。このような５次元の画像情報を利用することで、３次元的に存在する発光スポットをより精度よく検出でき、結果としてより精度のよい解析が可能となる。

２．ＤＮＡ損傷解析装置の構成
図７に、本実施形態のＤＮＡ損傷解析装置の構成の一例を示す。ＤＮＡ損傷解析装置１は例えばパーソナルコンピュータのような情報処理装置で構成される。ＤＮＡ損傷解析装置１は、顕微鏡３１により撮影されて記録された画像情報を入力し、画像解析することによりＤＮＡの損傷状態を定量的に解析する。

ＤＮＡ損傷解析装置１は、その全体動作を制御する制御部１１と、画面表示を行う表示部１７と、ユーザが操作を行う操作部１９と、データやプログラムを記憶するデータ格納部２１とを備える。例えば、表示部１７は液晶ディスプレイで構成され、操作部１９はキーボードやマウス等である。さらに、ＤＮＡ損傷解析装置１は、外部機器やネットワークと接続するためのインタフェース２５を含む。ＤＮＡ損傷解析装置１は例えばパーソナルコンピュータ等で実現できる。

制御部１１は、ＣＰＵやＭＰＵからなり、制御プログラムを実行することで後述する解析処理を実現する。制御部１１で実行される制御プログラムは、データ格納部２１に格納されている。制御プログラムは、通信回線を通じて又は光ディスクや半導体メモリ等の記録媒体を介して提供されてもよい。

データ格納部２１はデータやプログラムを記憶する手段であり、例えばハードディスク、半導体メモリ等で構成できる。データ格納部２１は、制御部１１で実行されるプログラムや解析後のデータ等を格納する。

顕微鏡３１は観察対象３３の拡大画像を撮影可能であり、少なくとも２種類の波長の画像を撮影可能である。顕微鏡３１は動画像または静止画の撮影が可能である。顕微鏡３１により撮影された画像は、所定の記録媒体（ハードディスク装置、光ディスク記録装置、サーバ装置等）３５に記録される。なお、記録媒体３５は顕微鏡３１内部に設けられても良い。または、顕微鏡３１により撮影された画像は、インタフェース２５を介してＤＮＡ損傷解析装置１に入力され、ＤＮＡ損傷解析装置１内のデータ格納部２１に記録されるようにしてもよい。また、顕微鏡３１は、フォーカス位置を変更することで、図６に示すような、ｚ方向に異なる位置を有する複数のスライス面上で画像データを撮影することが可能となる。

３．ＤＮＡ損傷解析処理
以上のように構成されるＤＮＡ損傷解析装置１によるＤＮＡの損傷状態の解析処理について説明する。

３．１画像撮影
前述の２種の蛍光タンパク質をバイオセンサーとして導入して、顕微鏡３１により細胞の画像を生きたまま撮影する。画像撮影中、所定のタイミングで、検査したい薬物を投与する。薬物の投与前から投与後所定時間が経過するまで、細胞の画像を、時間経過を追って撮影し、記録する。なお、以下の説明では、顕微鏡３１により、所定の時間間隔毎に、緑色の蛍光を示すＧＦＰ−５３ＢＰ１タンパク質による発光状態を撮影した画像（静止画）と、赤色の蛍光を示すＤｓＲｅｄ−ＰＣＮＡタンパク質による発光状態を撮影した画像（静止画）とが撮影され、記録媒体３５に記録されるとする。また、顕微鏡３１により、１つのスライス面での画像のみが撮影、記録されるとする。すなわち、顕微鏡３１により、緑色の蛍光画像及び赤色の蛍光画像それぞれについて一連の複数枚の静止画が時系列で撮影され、記録媒体３５に記録される。なお、本実施形態では、細胞の静止画を撮影したが、動画を撮影し、動画を構成するフレーム画像毎に解析処理を行っても良い。

なお、顕微鏡３１のフォーカスを調整しながら、図６に示すようにｚ方向において位置が異なる複数のスライス平面上で画像を撮影してもよい。

図８は、顕微鏡３１により時系列で撮影された細胞画像（画像の一部）の例を示す図である。図８において、（ａ１）〜（ａ４）は、緑色の蛍光を示すＧＦＰ−５３ＢＰ１タンパク質による発光状態を撮影した蛍光画像である。各列（ａ１）〜（ａ４）においては上から下に時間が経過し、（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ａ４）の順に時間が経過している。図８において、（ｂ１）〜（ｂ４）は、赤色の蛍光を示すＤｓＲｅｄ−ＰＣＮＡタンパク質による発光状態を撮影した蛍光画像である。各列（ｂ１）〜（ｂ４）においては上から下に時間が経過し、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｂ４）の順に時間が経過している。

３．２画像解析
顕微鏡３１により撮影され、記録された２種の蛍光画像は、インタフェース２５を介してＤＮＡ損傷解析装置１に入力され、時間経過とともに細胞核で変化する緑色ならびに赤色のスポットが定量解析される。以下、ＤＮＡ損傷解析装置１による画像解析の詳細を説明する。なお、記録媒体３５には、顕微鏡３１により撮影された、緑色の蛍光画像及び赤色の蛍光画像それぞれについての一連の複数の静止画が時系列で予め記録されており、ＤＮＡ損傷解析装置１は記録媒体３５から画像を読み出しながら以下の処理を実行する。

図９は、ＤＮＡ損傷解析装置１の画像解析処理を示したフローチャートである。ＤＮＡ損傷解析装置１は、インタフェース２５を介して記録媒体３５に記録された画像の中から１つの画像を取り込む（Ｓ１１）。具体的には、ＤＮＡ損傷解析装置１は、記録媒体３５に記録された画像において時系列で最初の画像を取り込む。

制御部１１は、取り込んだ画像を画像解析し、画像中の細胞核を特定する（Ｓ１２）。次に、制御部１１は、特定した細胞核について、蛍光発光による発光スポットの数をカウントするとともに、発光領域の面積を求める（Ｓ１３）。これらの処理の詳細は後述する。なお、発光領域の面積については、ＧＦＰ−５３ＢＰ１タンパク質による緑色の蛍光画像に対してのみ求める。

制御部１１は、発光スポットのカウント数及び発光領域の面積を細胞核と関連づけて解析データとして生成し、データ格納部２１に出力して記録する（Ｓ１４）。画像内の１つの細胞核について、上記の処理（Ｓ１３、Ｓ１４）が終了すると、ステップＳ１２に戻り、画像内に他の細胞核が含まれるか否かを検査し、他の細胞核が特定されたときは、発光スポット数のカウント、発光領域の面積の算出等の処理（Ｓ１３）を行う。

取り込んだ画像に含まれる全ての細胞核について、細胞核の特定、発光スポット数のカウント、発光領域の面積の算出（Ｓ１２〜Ｓ１４）を実行する（Ｓ１５）。これらの処理が終了すると、記録媒体３５に記録された一連の画像において時系列で次の画像について同様の処理を行い、記録媒体３５に記録された全ての画像について上記の処理を行う（Ｓ１１〜Ｓ１６）。

ここで、本実施形態では、顕微鏡３１により、生きている細胞の画像を撮影しているが、生きている細胞は時間とともに除々に移動し、変形する。このため、前回処理された画像（静止画）における細胞核と、今回処理された画像における細胞核とを同定する必要がある。この同定は、例えば、細胞核の形状を考慮することで実現できる。例えば、公知の顔認識技術と同様の技術を用いて、細胞核の形状（特徴）に基づいて時間的に除々に移動、変化する細胞核をトラッキングすることができる。

なお、上記の例では、時系列で連続して撮影された一連の画像を連続的に処理（ステップＳ１３）したが、所定の時間間隔毎の画像のみを抽出して処理するようにしてもよい。

また、図６に示すように、ｚ方向において位置が異なる複数のスライス平面上で画像が撮影されている場合は、各スライス平面の画像データをそれぞれ解析し、得られた発光スポット数や発光領域の面積の値を合算してもよい。または、複数のスライス平面上の画像の中で最も好適と考えられる１つの画像について上記の処理（ステップＳ１２〜１４）を実施するようにしてもよい。

３．２．１細胞核の特定、発光スポット数のカウント、発光領域の面積の算出
図１０、図１１を参照して、上記の、細胞核の特定処理（ステップＳ１２）、並びに、発光スポット数のカウント及び発光領域の面積の算出処理（ステップＳ１３）の詳細を説明する。これらの処理（ステップＳ１２、Ｓ１３）は特に制御部１１の画像解析部１５により実行される。

図１０（ａ）は、記録媒体３５から取り込まれた一の画像を示す。画像解析部１５は、まず、図１０（ａ）に示す画像を、画素値（輝度）に関する所定の閾値に基づき二値化し、図１０（ｂ）に示すような二値化画像を生成する。制御部１１は、二値化画像において、同じ輝度を含む連続した画素からなる領域５１を特定する。次に、画像解析部１５は特定した領域５１を含む矩形枠５５を設定する（図１０（ｃ）参照）。そして、画像解析部１５は、図１０（ｄ）に示すように、撮影された画像上に矩形枠５５を設定し、矩形枠５５で囲まれる領域の画像を切り出す（図１０（ｅ）参照）。

上記のようにして切り出された領域に対して、画像解析部１５は、発光スポット数のカウント及び発光領域の面積の算出を行う。図１１（ａ）は、上記の方法で切り出された画像である（図１０（ｅ）と同様）。画像解析部１５は、切り出された画像（図１１（ａ）参照）において、図１１（ｂ）に示すように細胞核の領域を特定し、特定した細胞核の背景の画像を削除する。図１１（ｃ）は、特定した細胞核の背景の画像が削除された画像を示す。画像解析部１５は、細胞核の背景の画像が削除された画像において、所定の画素値（輝度）以上の値を持つ領域（発光スポット）を特定し（図１１（ｄ）参照）、その領域の数をカウントすることで、発光スポットの数をカウントする。さらに、画像解析部１５は、所定の画素値（輝度）以上の値を持つ画素の数をカウントすることで、発光領域の面積を求める。

上記のようにして、細胞核の特定、発光スポット数のカウント及び発光領域の面積の算出処理（ステップＳ１２、Ｓ１３）が実行される。

なお、本実施形態では、発光スポット数及び発光領域の面積の双方を測定している。画像の状況によって、発光スポット数または発光領域の面積が良好に観察できないことがある。例えば、ざらついた画像においては、発光スポット数よりも発光面積の方が良好に測定できる。よって、発光スポット数及び発光領域の面積の双方を測定しておくことで、画像の状況に応じて適宜良好な方のデータを選択することが可能となる。

４．解析データのグラフ化
以上のようにして、ＤＮＡ損傷解析装置１によるＤＮＡの損傷状態の解析処理が実行されることで、細胞核毎に、発光スポットの数及び発光領域の面積のデータを時系列で求めることができる。このようにして求められたデータは、解析データとしてデータ格納部２１に格納される。

図１２及び図１３は、ＤＮＡ損傷解析装置１により以上のようにして得られた解析データをグラフとして表示したものである。図１２は、抗がん剤としてＮＣＳ(Neocarzinostanin)を投与した際のＤＮＡ損傷の状況についての、ＤＮＡ損傷解析装置１による解析結果をグラフ化した図である。図１３は、抗がん剤としてＣＰＴ(Camptothecin)を投与した際のＤＮＡ損傷の状況についての、ＤＮＡ損傷解析装置１による解析結果をグラフ化した図である。図中、「ＤＮＡ損傷の数」は、ＧＦＰ−５３ＢＰ１タンパク質による発光スポット数の時間変化をプロットしたものであり、「ＤＮＡ損傷の占める面積」は、ＧＦＰ−５３ＢＰ１タンパク質による発光領域の面積の時間変化をプロットしたものである。また、「Ｓ期のＤＮＡ複製スポット数」は、ＤｓＲｅｄ−ＰＣＮＡタンパク質による発光スポット数の時間変化をプロットしたものである。

図１２、１３において、時間ＧＦＰ−５３ＢＰ１タンパク質による発光スポット数の時間変化（実線Ｘ）及び発光領域の面積の時間変化（実線Ｙ）を参照すると、ＤＮＡ損傷やその修復状況の時間的な変化を把握することができる。また、ＤｓＲｅｄ−ＰＣＮＡタンパク質による発光スポット数（実線Ｚ）の時間変化を参照することで、細胞周期のＳ期の範囲を推定することができる。よって、ＤｓＲｅｄ−ＰＣＮＡタンパク質による発光スポット数（実線Ｚ）の時間変化とともに、時間ＧＦＰ−５３ＢＰ１タンパク質による発光スポット数の時間変化（実線Ｘ）及び発光領域の面積の時間変化（実線Ｙ）を観察することで、Ｓ期におけるＤＮＡ損傷及び損傷の修復状態の時間的変化を把握することができる。

５．まとめ
以上のように、本実施形態のＤＮＡ損傷解析装置１によれば、細胞核において発生したＤＮＡ損傷の程度を定量的に測定することができる。具体的には、ＤＮＡ損傷部位に集積する蛍光タンパク質をバイオセンサーとして用いて、細胞核においてＤＮＡ損傷が生じた箇所を検出する。具体的には、細胞核を撮影した画像を解析して、蛍光発光による発光スポットの数及び発光領域の面積を求めることで、ＤＮＡの損傷の程度を定量的に測定する。また、ＤＮＡ損傷部位に集積する蛍光タンパク質に加えて、細胞周期のＳ期を標識する蛍光タンパク質をもバイオセンサーとして用いることで、細胞周期のＳ期を検出する。このような定量的な測定を時系列で行うことにより、ＤＮＡの損傷及び損傷の修復の時間的な変化を定量的に測定することが可能となり、生きた細胞におけるＤＮＡ損傷の時間的な変化の定量的な観察が可能となる。このようなＤＮＡ損傷解析技術を利用することで、がん細胞で起こるＤＮＡ損傷を生きたまま鋭敏に観察・評価でき、迅速に新規の抗がん剤のスクリーニングが可能となり、また放射線照射の有効性を評価でき、新規抗がん剤や放射線治療の増感補助薬の開発の迅速化を図ることができる。

１ＤＮＡ損傷解析装置
１１制御部
１７表示部
１９操作部
２１データ格納部
２５インタフェース
３１顕微鏡
３３観察対象
３５記録媒体

特表２００５−５０２３２３号公報

Claims

ＤＮＡ二本鎖切断損傷を定量的に解析する装置であって、
ＤＮＡ二本鎖切断箇所に集積する第１の蛍光タンパク質を観察対象の細胞に導入して時系列で撮影された画像を取得する画像取り込み手段と、
取得した画像を解析する画像解析手段とを備え、
前記画像解析手段は、時系列で撮影された画像の各々について、
各画像に含まれる細胞核の画像の領域を検出し、
前記検出した領域に含まれる、前記第１の蛍光タンパク質の蛍光発光による発光スポットの数をカウントし、
前記検出した領域に含まれる、前記第１の蛍光タンパク質の蛍光発光による発光領域の面積を求め、
時系列で求めた前記発光スポットのカウント値及び前記発光領域の面積のデータを解析データとして生成する、
解析装置。
前記画像は、前記第１の蛍光タンパク質に加えて、細胞周期のＳ期にある細胞を標識する第２の蛍光タンパク質をさらに観察対象の細胞に導入して撮影された画像であり、
前記画像解析手段は、前記第１の蛍光タンパク質の蛍光発光による発光スポットのカウント及び発光領域の面積の算出に加えて、さらに、前記第２の蛍光タンパク質の蛍光発光による発光スポットの数をカウントする、
請求項１記載の解析装置。
前記第１の蛍光タンパク質と前記第２の蛍光タンパク質とは異なる色の蛍光発光を示す、請求項２記載の解析装置。
ＤＮＡ二本鎖切断損傷を定量的に解析するためのプログラムであって、
コンピュータを、
ＤＮＡ二本鎖切断箇所に集積する第１の蛍光タンパク質を観察対象の細胞に導入して時系列で撮影された画像を取得する画像取り込み手段と、
取得した画像を解析する画像解析手段と
して実行させ、
前記画像解析手段は、時系列で撮影された画像の各々について、
各画像に含まれる細胞核の画像の領域を検出し、
前記検出した領域に含まれる、前記第１の蛍光タンパク質の蛍光発光による発光スポットの数をカウントし、
前記検出した領域に含まれる、前記第１の蛍光タンパク質の蛍光発光による発光領域の面積を求め、
時系列で求めた前記発光スポットのカウント値及び前記発光領域の面積のデータを解析データとして生成する、
プログラム。
前記画像は、前記第１の蛍光タンパク質に加えて、細胞周期のＳ期にある細胞を標識する第２の蛍光タンパク質をさらに観察対象の細胞に導入して撮影された画像であり、
前記画像解析手段は、前記第１の蛍光タンパク質の蛍光発光による発光スポットのカウント及び発光領域の面積の算出に加えて、さらに、前記第２の蛍光タンパク質の蛍光発光による発光スポットの数をカウントする、
請求項４記載のプログラム。
ＤＮＡ二本鎖切断損傷を定量的に解析する方法であって、
ＤＮＡ二本鎖切断箇所に集積する第１の蛍光タンパク質を観察対象の細胞に導入して時系列で画像を撮影し、
時系列で撮影された複数の画像の各々について、
各画像に含まれる細胞核の画像の領域を検出し、
前記検出した領域に含まれる、前記第１の蛍光タンパク質の蛍光発光による発光スポットの数をカウントし、
前記検出した領域に含まれる、前記第１の蛍光タンパク質の蛍光発光による発光領域の面積を求め、
時系列で求めた前記発光スポットのカウント値及び前記発光領域の面積のデータを解析データとして生成する、
解析方法。
前記第１の蛍光タンパク質に加えて、細胞周期のＳ期にある細胞を標識する第２の蛍光タンパク質をさらに前記観察対象の細胞に導入して画像を撮影し、
前記第１の蛍光タンパク質の蛍光発光による発光スポットのカウント及び発光領域の面積の算出に加えて、さらに、前記第２の蛍光タンパク質の蛍光発光による発光スポットの数をカウントする、
請求項６記載の解析方法。