JP2022533545A - Ａｓｘ特異的タンパク質リガーゼおよびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、酵素技術の技術分野にあり、具体的にはＡｓｘ特異的リガーゼおよびシクラーゼ活性を有する酵素、ならびにこれらをコードする核酸、ならびに前記酵素を製造する方法に関する。Ａｓｘ特異的リガーゼおよびシクラーゼを有する酵素は、スミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）の植物から単離される。これらの酵素の方法および使用がさらに包含される。

Description

本発明は、酵素技術の技術分野にあり、具体的にはＡｓｘ特異的リガーゼおよびシクラーゼ活性を有する酵素、ならびにこれらをコードする核酸、ならびに前記酵素を製造する方法に関する。これらの酵素の方法および使用がさらに包含される。

ペプチドおよびタンパク質のヘッドトゥーテールの大環状化は、構造を制約し、タンパク質分解に対する代謝安定性を増強するための戦略として使用されてきた。加えて、制約された大環状コンフォメーションはまた、薬理活性および経口バイオアベイラビリティーを改善し得る。ほとんどのペプチドおよびタンパク質は直鎖として生成されるものの、６～７８残基の範囲の環状ペプチドが、多様な生物において天然に存在する。これらの環状ペプチドは通常、熱変性およびタンパク質分解に対する高い耐性を表し、サイトカイン、ヒスタチン、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ、コノトキシンおよびブラジキニングラフトシクロチドの環化における近年の成功によって実証されるように、タンパク質工学における新たな傾向に刺激を与えている。さらに、バリノマイシン、グラミシジンＳおよびシクロスポリンを含む環状ペプチドは、治療薬として使用されている。

現在まで、ペプチドの環化には化学的方法が典型的に使用されている。１つの可能な戦略は、ネイティブ・ケミカル・ライゲーションである。この方法は、Ｎ末端システインおよびＣ末端チオエステルを必要とし、この要件によって非システイン含有ペプチドへの適用が制限される。さらに、化学的方法は、特に大型ペプチドおよびタンパク質のために常に実行可能であるわけではない。

天然シクラーゼを利用する酵素的方法が理想的であろうが、現在、ごく少数のシクラーゼしか知られておらず、これらは様々な理由のために十分には活用されていない。
シクロチド産生植物クリトリア・テルナテア（Ｃｌｉｔｏｒｉａ ｔｅｒｎａｔｅａ）由来の新規なシクラーゼ、ブテラーゼ－１の近年の発見は、特有のタイプのアスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）がシクロチドの直鎖前駆体を環化するプロセシング酵素であることを証明した（非特許文献１）。ＡＥＰ（またはレグマイン）は、クランＣＤのサブファミリーＣ１３に属するシステインプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２．３４）である。ヒドロラーゼであるＡＥＰと比較して、ブテラーゼ－１は、ＡＥＰの酵素方向性を逆転させ、アミノリシスを強力に促進してペプチド結合形成を触媒する。バイオアッセイは、ブテラーゼ－１がシクラーゼであるだけでなく、現在までの報告最高触媒効率１，３４０，０００Ｍ^－１秒^－１で、Ａｓｎ／ＡｓｐとＰｒｏを除く任意のアミノ酸との間でペプチド結合を形成することによって生体分子をライゲーションすることができる効率的なペプチドリガーゼでもあることを示す。ブテラーゼ－１は、タンパク質およびペプチドのライゲーション、修飾、環化、タグ付けおよび生細胞標識のための多用途のタンパク質工学ツールであり、特許文献１に、その使用を含めて詳細に記載されている。このようなブテラーゼ－１様ペプチドリガーゼは、ペプチドアスパラギニルリガーゼ（ＰＡＬ）と称され、結合特異的および部位特異的タンパク質修飾ならびに抗体－薬物複合体などのバイオ医薬品の正確なバイオマニュファクチャリングのための有用な生化学的および生物工学的ツールである。

ＡＥＰおよびＰＡＬは、一般的に約１０ｋＤａのプロドメインと、５つのα－ヘリックスによって囲まれた６つのβ－ストランドによって形成される活性のある約３２ｋＤａコアドメインと、６つの密接に結合したヘリックスによって形成される１５ｋＤａのＣ末端キャップドメインとからなるプロ酵素として発現される。ＡＥＰとＰＡＬの両方が、自己分解成熟のための酸性ｐＨでの固有のプロテアーゼ活性を表す。これらの生合成プロセシングは類似であり、リソソームおよび分解液胞などの酸性細胞内区画中での自己分解活性化を伴う。インビトロでは、活性化が通常、ｐＨ４～５で実施される。酸性活性化後の主な構造変化は、Ｃ末端キャップドメインの切断および解離であり、これにより、コアドメインの触媒部位が露出する。キャップドメインとコアドメインの再ライゲーションが、両ドメインが切断後にインタクトなままであり、近接している場合に、中性付近のｐＨで報告されている。

植物ＡＥＰは、液胞の酸性環境中で誘因されるそのタンパク質分解活性を介して、タンパク質分解、成熟、プログラム細胞死および宿主防御において重要な役割を果たす。ブテラーゼ２、ＯａＡＥＰ２およびＨａＡＥＰ１（ヒマワリである、ヘリアンサス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））などのＡＥＰは、中性ｐＨでさえ優勢にプロテアーゼ活性を表示し、比較的低レベルのリガーゼ活性を有する。一定のＡＥＰは、中性付近のｐＨ（６～７．５）でＡＥＰ認識シグナルを保有するペプチド基質からのライゲーション生成物と加水分解生成物の両方を触媒する。ごくまれに、ＡＥＰは、環状置換を媒介することによって、例えばコンカナバリンＡの成熟において、ペプチド結合の破壊と形成の両方を含むペプチドスプライシングを媒介する。これらの「二機能性」または「優勢」ＡＥＰと対照的に、ＰＡＬ、例えばブテラーゼ１およびＯａＡＥＰ１ｂは、中性付近のｐＨで任意の加水分解性生成物を本質的に欠くライゲーション生成物の形成を触媒し、これらのライゲーション活性は、穏やかな酸性条件（ｐＨ６未満）下でさえ圧倒的である。

現在、ごく一握りのこのようなＰＡＬが同定されている。これらには、プロトタイプＰＡＬブテラーゼ－１、そのうえその後の発見であるブテラーゼ－１様酵素、それぞれ他のシクロチド産生植物オルデンランディア・アフィニス（Ｏｌｄｅｎｌａｎｄｉａ ａｆｆｉｎｉｓ）およびヒバンサス・エンネアスペルムス（Ｈｙｂａｎｔｈｕｓ ｅｎｎｅａｓｐｅｒｍｕｓ）から同定されたＯａＡＥＰ１ｂ（非特許文献２）およびＨｅＡＥＰ３（非特許文献３）が含まれる。

現在まで、ＡＥＰとＰＡＬを区別する分子機構は知られていない。プロ酵素と活性形態の両方を含む、いくつかの植物ＡＥＰ結晶構造の公開にもかかわらず、プロテアーゼまたはリガーゼとしてのそれらの性質を支える構造決定因子はまだ未解明である。両極端の酵素は、ｒ．ｍ．ｓ．ｄが１Å未満で同じ構造を有する（例えば、ＯａＡＥＰ１ｂおよびＨａＡＥＰ１）。

国際公開第２０１５／１６３８１８号

グエン・ジーケーティーら（Ｎｇｕｙｅｎ ＧＫＴ，ｅｔ ａｌ．）（２０１４）Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０（９）：７３２－７３８） ハリス・ケーエスら（Ｈａｒｒｉｓ ＫＳ，ｅｔ ａｌ．）（２０１５）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ６（１）：１０１９９ ジャクソン・エムエーら（Ｊａｃｋｓｏｎ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．）（２０１８）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９（１）：２４１１２３

リガーゼ／シクラーゼ活性は大いに望ましく、ペプチドライゲーションおよび環化のための分子ツールとして確実に使用することができる新規なリガーゼ／シクラーゼが当技術分野で必要とされているから、ＰＡＬおよびＡＥＰの酵素方向性を制御する決定因子を同定することは、具体的なニーズにこれらの酵素を計画的に適合させる機会を提供するので、役立つであろう。

本発明の発明者らは、ＡＥＰおよびＰＡＬの酵素活性が、触媒中心付近の重要な位置の微妙な差異によって制御されることを見出した。これらの位置での変更は、水分子（加水分解をもたらす）および入ってくる求核剤（ライゲーションをもたらす）のＳ－アセチル酵素中間体へのアクセスを制御する。２種のシクロチド産生植物ノジスミレ（Ｖｉｏｌａ ｙｅｄｏｅｎｓｉｓ）（変種フィリピカ（ｖａｒ．ｐｈｉｌｌｉｐｉｃａ））およびヴィオラ・カナデンシス（Ｖｉｏｌａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）由来の一連の推定上のＡＥＰおよびＰＡＬを試験することによって、ならびにリガーゼ触媒活性を担う分子機構を調査するために組換え酵素を使用することによって、２つの推定上のリガーゼ活性決定因子（ＬＡＤ）を同定することができ、構造比較、ＭＤシミュレーションおよび部位特異的変異誘発によって検証することができた。これらの結果は、ＡＥＰのＰＡＬへの変換を可能にする分子機構を説明し、新たなリガーゼの発見および操作のための有用なツールを提供する。これらの試験の過程で、効率的な組換え発現を可能にし、高い環化活性を示すさらなる有用なＰＡＬが同定された。

よって、第１の態様では、本発明は、タンパク質リガーゼ活性、好ましくはシクラーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列；または
（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つの断片
を含むか、またはからなる、単離ポリペプチドに関する。

配列番号１からなるポリペプチドは、本明細書で「ＶｙＰＡＬ２」または「ＶｙＰＡＬ２活性形態／ドメイン」とも呼ばれる。
別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにこのような核酸分子を含有するベクター、特にコピーベクターまたは発現ベクターに関する。

さらなる態様では、本発明はまた、本明細書で企図される核酸または本明細書で企図されるベクターを含有する宿主細胞、好ましくは非ヒト宿主細胞に向けられる。宿主細胞は、Ｓｆ９（ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））細胞などの昆虫細胞であり得る。

本発明のなおさらなる態様は、本明細書で企図される宿主細胞を培養する工程と；培養培地または宿主細胞からポリペプチドを単離する工程とを備える、本明細書に記載されるポリペプチドを製造する方法である。

なおさらなる態様では、本発明は、タンパク質ライゲーションのための、特に１つまたは複数のペプチドを環化するための本明細書に記載されるポリペプチドの使用に関する。
なお別の態様では、本発明は、ペプチドを環化する方法であって、ペプチドを、前記ペプチドの環化を可能にする条件下で、本発明の使用に関連して上に記載されるポリペプチドと共にインキュベーションする工程を備える、方法に関する。

なおさらなる態様では、本発明は、少なくとも２つのペプチドをライゲーションする方法であって、ペプチドを、前記ペプチドのライゲーションを可能にする条件下で、本発明の使用に関連して上に記載されるポリペプチドと共にインキュベーションする工程を備える、方法に関する。

別の態様では、本発明は、本発明の単離ポリペプチドが固定化される固体支持体材料、ならびにその使用およびこのような基質を使用する方法に関する。
別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載されるタンパク質リガーゼおよび／またはシクラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む、植物などのトランスジェニック生物を包含する。ポリペプチドは、好ましくは前記生物中に天然に存在しない。したがって、本発明はまた、本発明による異種ポリペプチドを発現する、植物などのトランスジェニック生物を特徴とする。

なお別の態様では、本発明はまた、アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）活性を有するポリペプチドのタンパク質リガーゼ活性を増加させる方法であって、配列番号１の１２６位に対応する位置のアミノ酸残基をＡまたはＧのいずれかの残基で置換する工程を備える方法を包含する。これらの実施形態では、配列番号１の１２７位に対応する位置のアミノ酸残基が、１２６／１２７位の配列がＧＡまたはＡＰまたはＡＡ、好ましくはＧＡまたはＡＰのいずれかとなるように選択され得る。配列番号１の１２６位に対応する位置のアミノ酸がＧである場合、配列番号１の１２７位に対応する位置のアミノ酸がＰではないことが好ましい。

なおさらなる態様では、本発明はまた、タンパク質リガーゼ活性を有するポリペプチドを生成する方法であって、
（ｉ）アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）活性を有するポリペプチドを提供する工程と；
（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸置換をアスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）活性を有するポリペプチドに導入する工程であって、前記置換は、配列番号１の１２６／１２７位に対応する位置のアミノ酸配列がＧＡ、ＡＡまたはＡＰ、好ましくはＧＡまたはＡＰのいずれかとなるように、配列番号１の１２６位に対応する位置のアミノ酸残基をＡまたはＧ残基で置換すること、および任意選択で配列番号１の１２７位に対応する位置のアミノ酸残基をＰまたはＡのいずれかの残基で置換することを含む、工程と
を備える、方法に向けられる。

組換えＶｙＰＡＬ１～３およびＶｙＡＥＰ１の酵素活性を示す図。（Ａ）ＧＮ１４－ＳＬ（配列番号５９）のリガーゼ媒介環化の反応スキーム。（Ｂ）異なる反応ｐＨ値下でのＶｙＰＡＬ２媒介環化の分析ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析データ。^＊：ラセミ化合成ＧＮ１４－ＳＬ。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳが、直鎖種よりも環状ｃＧＮ１４に対する感受性が高かったことに留意されたい。（Ｃ）ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して分析した各酵素の生成物比および反応収率の定量的要約。各反応について、精製活性酵素：ＧＮ１４－ＳＬ＝１：５００のモル比を混合し、３７℃で１０分間反応させた。平均収率およびエラーバーを、３連で実施した実験から計算した。 （Ａ）配列番号４８および５９～７７に記載のＶｙおよびＣｔシクロチドに由来する変性天然認識モチーフを保有する基質に対するＶｙＰＡＬ２の基質特異性を示す図。（Ｂ）Ｐ１’位に２０の異なるアミノ酸を有する基質（Ｘ＝２０ＡＡ；配列番号７８）に対するＶｙＰＡＬ２の基質特異性を示す図。（Ｃ）Ｐ２’位に２０の異なるアミノ酸を有する基質（配列番号７９）に対するＶｙＰＡＬ２の基質特異性を示す図。全ての反応は、活性ＶｙＰＡＬ基質＝１：５００のモル比で、ｐＨ６．５、３７℃で１０分間実施した。収率は、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して定量的に分析した。 ＶｙＰＡＬ２およびブテラーゼ１の酵素速度論を示す図。ペプチド基質：ＧＩＳＴＫＳＩＰＰＩＳＹＲＮＳＬＡＮ（配列番号６０）を使用したＨＰＬＣに基づく速度論試験。ある量の５０ｎＭ精製活性ＶｙＰＡＬ２（または植物から抽出したブテラーゼ１（１５））を各反応に使用した。各時点の環化生成物の量を、分析ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して決定した。３回の反復実験の平均初期速度（Ｖ_０）をミカエリス・メンテン曲線プロットに使用した。 ＶｙＰＡＬ３のＳ１’ポケットにおけるレトロエンジニアリング実験を描く図。全ての反応をｐＨ範囲４．５～８．０で実施した。加水分解生成物ＧＮ１４（配列番号４８）のＭＳピークに破線で印をつける。（Ａ）ＶｙＰＡＬ３野生型によって触媒された反応のＭＳ分析。（Ｂ）ＶｙＰＡＬ３－Ｙ１７５Ｇによって触媒された反応のＭＳスペクトル。（Ｃ）ＶｙＰＡＬ３およびＶｙＰＡＬ３－Ｙ１７５Ｇによって触媒された反応のＨＰＬＣプロファイル。（Ｄ）ＶｙＰＡＬ３－Ｙ１７５ＧについてのＲＰ－ＨＰＬＣを使用して分析した生成物比および反応収率の定量的要約。 ＶｃＡＥＰおよびＶｃＡＥＰ－Ｙ１６８Ａ変異体（ＬＡＤ２）の活性を示す図。（Ａ）ＶｃＡＥＰ野生型によって触媒された反応のＭＳ分析およびＨＰＬＣに基づく定量的要約。（Ｂ）ＬＡＤ２領域を標的化するＶｃＡＥＰ－Ｙ１６８Ａ変異体によって触媒された反応のＭＳ分析およびＨＰＬＣに基づく定量的要約。全ての反応を４．５～８．０の範囲のｐＨ値で実施した。加水分解生成物ＧＮ１４、環化生成物ｃＧＮ１４およびｃＧＮ１４のナトリウムイオン付加物のＭＳピークに破線で印をつける。ＶｃＡＥＰ－Ｙ１６８Ａ変異体についてのリガーゼ活性の劇的な改善がはっきりと見える。 ＰＡＬのリガーゼ活性決定因子（ＬＡＤ）および提案される触媒機構を示す図。（Ａ）この研究で試験したＰＡＬおよびＡＥＰの配列アラインメント。触媒三残基Ａｓｎ－Ｈｉｓ－Ｃｙｓは黒色で陰影をつけている。Ｓ１ポケットに属する残基は青色で陰影をつけている。提案されるＬＡＤ残基は赤色で囲っている。ＬＡＤ１およびＬＡＤ２の残基を示す。ＬＡＤ１付近の保存されたジスルフィド結合は橙色で強調する。ポリＰｒｏループ（ＰＰＬ）は緑色ボックス中にあり、ＭＬＡループは紫色ボックス中にある。二次構造の命名法は、ＶｙＰＡＬ２（この研究）の結晶構造に従って変更をして、トラビら（トラビ・エムら（Ｔｒａｂｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．）（２００４）Ｊ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ６７（５）：８０６－８１０）から適合させた。活性にとって重大な残基およびモチーフを、配列アラインメントに使用されるのと同じ色コードで標識する。点線の下の残基はオキシアニオンホールに対応し、点線より上の残基は提案される活性決定因子に対応する。（Ｂ）ＶｙＰＡＬ２によるライゲーションおよび加水分解について提案されるスキームならびにＬＡＤ１およびＬＡＤ２の役割。この機構の第１の工程は、加水分解およびライゲーションについて同一であり、Ｓ－アセチル酵素中間体の形成につながり、速度制限工程である。その主な決定因子はＬＡＤ１である。ＬＡＤ２は、ペプチド（ライゲーション）または水分子（加水分解）による求核攻撃のいずれかを好む活性の性質を制御する。全てのアラインメントされたポリペプチドの完全配列は配列番号５～１４、１８および８０～８７に記載のものである（ＶｙＰＡＬ１＝配列番号５；ＶｙＰＡＬ２＝配列番号６；ＶｙＰＡＬ３＝配列番号７；ＶｙＰＡＬ４＝配列番号８；ＶｙＰＡＬ５＝配列番号９；ＶｙＡＥＰ１＝配列番号１０；ＶｙＡＥＰ２＝配列番号１１；ＶｙＡＥＰ３＝配列番号１２；ＶｙＡＥＰ４＝配列番号１３；ＶｃＡＥＰ＝配列番号１４；ブテラーゼ－１＝配列番号８８；ブテラーゼ２＝配列番号８０；ＯａＡＥＰ１ｂ＝配列番号８１；ＯａＡＥＰ２＝配列番号８２；ＨｅＡＥＰ３＝配列番号８３；ＰｘＡＥＰ３ｂ＝配列番号８４；ＣｅＡＥＰ＝配列番号８５；ＨａＡＥＰ１＝配列番号８６；ＡｔＬＥＧγ＝配列番号８７）。 非共有結合親和性結合または共有結合付着による、ＰＡＬ、ブテラーゼ－１およびＶｙＰＡＬ２の固定化を示す図。（Ａ）ＣｏｎＡ－ＰＡＬ １およびＣｏｎＡ－Ｖｙ２ ２を与えるグリコシル化ＰＡＬとコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）アガロースビーズとの親和性結合。（Ｂ）ＮＡ－Ｂｕ１（ｂ） ３およびＮＡ－Ｖｙ２（ｂ） ４を与えるビオチン化ＰＡＬとＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎアガロースビーズとの親和性結合。スクシンイミジル－６－（ビオチンアミド）ヘキサノエート（ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン）をＰＡＬのアミノ基にカップリングすることによって、ビオチン化ＰＡＬを調製した。（Ｃ）アガロース－Ｂｕ１ ５およびアガロース－Ｖｙ２ ６を与えるＰＡＬとアガロースビーズ上の活性ＮＨＳ－エステルの共有結合付着。酵素とアガロースビーズとの間の距離は、スペーサー部分およびプレカップリング親和性結合リガンドのサイズによって計算される。 固定化ＰＡＬビーズによるペプチド大環状化を示す図。各反応について、タンパク質負荷に基づいて計算した１μＭの固定化ＰＡＬを０．２ｍＭ ＫＮ１４－ＧＬ（配列番号５１）と混合した。反応を、穏やかに揺動しながら、ｐＨ６．５、室温で５分間実施した。生成物をスピンカラムから溶出し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで分析した。ＫＮ１４－ＧＬ ７（計算質量１６５９．４Ｄａ、実測質量１６６０．０Ｄａ）。ｃＫＮ１４ ８（計算質量１４７１．３Ｄａ、実測質量１４７１．９Ｄａ）。 その可溶性形態の標準活性曲線と比較することによる、固定化ブテラーゼ－１およびＶｙＰＡＬ２の効率の決定を示す図。使用した遊離酵素濃度は１～８ｎＭの範囲とした。反応速度（Ｖ）は、生成物ｃＫＮ１４の量（１秒当たり）によって計算した。規定反応緩衝液は、１ｍＭ ＤＴＴおよび０．１Ｍ ＮａＣｌを含有する、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を指す。ＣｏｎＡ反応緩衝液は、追加の５ｍＭ ＣａＣｌ_２および５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む反応緩衝液を指す。 固定化ＰＡＬの動作安定性を示す図。（Ａ）１００回の反復反応における、５種の固定化ＰＡＬ １、３～６によるＫＮ１４－ＧＬのｃＫＮ１４への環化のＲＰ－ＨＰＬＣ監視。各実験について、０．１ｍＭ ＫＮ１４－ＧＬ（配列番号５１）を含有する１００μＬの反応混合物（ｐＨ６．５）を与えた。使用するビーズの量を各タイプの有効濃度に従って調整して、有効な酵素：基質のモル比＝１：３５０～１：６００を与えた。反応を室温で３～５分間行った。（Ｂ）固定化ＰＡＬ １、３～６の動作安定性の要約。 ４℃で１日間、２９日間および６４日間貯蔵した後の５種の固定化ＰＡＬ １、３～６、ブテラーゼ－１およびＶｙＰＡＬ２の安定性を示す図。 穏やかに振盪しながら、ｐＨ６．５、室温で１０分間のＮＡ－Ｂｕ１（ｂ） ３によるペプチドおよびタンパク質の大環状化を示す図。（Ａ）ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによって決定された９５％の粗収率（^＊）の環状ＳＦＴＩ（Ｄ／Ｎ） １３を与える、ＮＡ－Ｂｕ１（ｂ） ３による、ＳＦＴＩ（Ｄ／Ｎ）－ＨＶ（配列番号５４） １２（０．１ｍＭ、計算質量１７６７．９Ｄａ、実測質量１７６７．９Ｄａ）のＳＦＴＩ（Ｄ／Ｎ） １３（計算質量１５１３．８Ｄａ、実測質量１５１３．３Ｄａ）への環化。（Ｂ）ＵＨＰＬＣによって決定された収率８３％の環状ＡＳ－４８ １５（計算質量７１４５．１Ｄａ、実測質量７１４８．１Ｄａ）を与える、ＮＡ－Ｂｕ１（ｂ） ３による、折り畳まれた直鎖バクテリオシン前駆体ＡＳ－４８Ｋ １４（５０μＭ、計算質量７７８３．５Ｄａ、実測質量７７７９．１Ｄａ）の環化。 ４０分で８５％シクロダイマー（ｃｙｃｌｏｄｉｍｅｒ）ｃ１７（計算質量１４０４．８Ｄａ、実測質量１４０５．９Ｄａ）および８％シクロトリマー（ｃｙｃｌｏｔｒｉｍｅｒ）ｃ１８（計算質量２１０７．２Ｄａ、実測質量２１０９．３Ｄａ）を与える、ＮＡ－Ｂｕ１（ｂ） ３による、ペプチドＲＶ７ １６（配列番号５５；０．２ｍＭ、計算質量９５６．５Ｄａ、実測質量９５７．７Ｄａ）のシクロオリゴマー化（ｃｙｃｌｏｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を示す図。 ＮＡ－Ｖｙ２（ｂ） ４による連続フローペプチドおよびタンパク質ライゲーションを示す図。（Ａ）ライゲーション生成物Ａｃ－ＲＹＡＮＧＬＡＫ（ＦＡＭ）ＲＧ ２１（計算質量１５０６．０Ｄａ、実測質量１５０７．０Ｄａ；配列番号５８）をもたらす、ＮＡ－Ｖｙ２（ｂ） ４による、１：１０モル比のＡｃＲＹＡＮＧＩ １９（計算質量７３５．４Ｄａ、実測質量７３４．３Ｄａ；配列番号５６）およびＧＬＡＫ（ＦＡＭ）ＲＧ ２０（計算質量９５８．７Ｄａ、実測質量９５９．６Ｄａ；配列番号５７）のライゲーション。（Ｂ）蛍光タンパク質ＤＡＲＰｉｎ９＿２６－ＮＧＬＡＫ（ＦＡＭ）ＲＧ ２３（計算質量２０７２８Ｄａ、実測質量２０７０３Ｄａ）を与える、１：５モル比の組換えタンパク質ＤＡＲＰｉｎ９＿２６－ＮＧＬ ２２（計算質量１９９６８Ｄａ、実測質量１９９５０Ｄａ；配列番号４９）のＧＬＡＫ（ＦＡＭ）ＲＧ ２０（配列番号５７）によるＣ末端蛍光標識。反応生成物を陽イオン線形モードでＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによって分析し、粗収率をピーク面積によって計算した。

本発明は、ノジスミレ（Ｖｉｏｌａ ｙｅｄｏｅｎｓｉｓ）およびヴィオラ・カナデンシス（Ｖｉｏｌａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）から単離されたペプチドリガーゼ／シクラーゼ活性を有する新規な酵素の本発明者らの同定に基づく。具体的には、本発明者らは、既知の酵素ブテラーゼ－１（国際公開第２０１５／１６３８１８号）などのリガーゼ活性能力を有する酵素との相同性を使用して、スミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）の植物由来の新規なリガーゼを同定した。これらの酵素は、その特異的トランスペプチダーゼ活性を強調するとともにＡＥＰと区別するために、ペプチドアスパラギンリガーゼ（ＰＡＬ）と命名された。対応する組換え酵素の精製および試験によって、ＶｙＰＡＬ２のみが４．５～８．０の範囲のｐＨ値という広範囲でリガーゼ活性を有し、ブテラーゼ１よりもわずか３．５倍低い効率である最大触媒速度をｐＨ６．５～７．０で有し、酸性ｐＨ（４．５）でのみ最小ヒドロラーゼ活性を表し、このことにより、この酵素が生物工学適用にとって価値ある組換えＰＡＬであることが分かった。ＶｙＰＡＬ１は、優れたリガーゼであるにもかかわらず、酸性ｐＨでいくらかの加水分解による乱雑な活性を示した。ＶｙＰＡＬ３は、低ｐＨで支配的な加水分解活性と共に全体的に低い触媒効率を特徴とした。その上、ＶｙＡＥＰ１タンパク質は、配列相同性に基づいてプロテアーゼであると予測されるが、実際、低ｐＨでプロテアーゼであることが分かった（図１）。これらの酵素間の活性の差異についての分子基礎を明らかにするために、ＶｙＰＡＬ２の結晶構造を得て、鋳型として使用してＶｙＰＡＬタンパク質アイソフォームの構造をモデル化した。これらの比較は、ＡＥＰとＰＡＬとの間の微妙であるが、重大な変動を示す、Ｓ１活性部位ポケットを囲む２つの領域：Ｓ２およびＳ１’ポケットを指し示した。

Ｓ２ポケットに位置するＯａＡＥＰ１ｂの１つの残基は、酵素効率の制御において重要な役割を果たすことが分かったので、「ゲートキーパー（ｇａｔｅ－ｋｅｅｐｅｒ）」であると以前報告された（ヤンら（Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．）（２０１７）ＪＡＣＳ．Ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａｃｓ．６ｂ１２６３７）。本発明者らは、この残基が通例、グリシンであるが、ＰＡＬでは疎水性残基または嵩高い残基、例えばブテラーゼ－１ではバリンおよびＯａＡＥＰ１ｂではシステインであるようであることを見出した。しかしながら、唯一の基準として「ゲートキーパー」残基の性質を使用することは、ＶｙＰＡＬ１～３アイソフォームで観察される活性の範囲を説明するのに不十分である：極めて効率的なＰＡＬであるＶｙＰＡＬ２および極めて不十分な酵素であるＶｙＰＡＬ３が共に、類似のゲートキーパー残基、例えばそれぞれＩおよびＶを有する（図６Ａ）。さらに、ゲートキーパー残基としてＶａｌを有するＶｃＡＥＰ（ブテラーゼ１など）はプロテアーゼである（図５Ａ）。本発明者らは、リガーゼ活性決定因子（ＬＡＤ）として作用するＶｙＰＡＬ１～３の２つの領域：（ｉ）ＶｙＰＡＬ２の残基Ｗ２４３、Ｉ２４４（ゲートキーパー）およびＴ２４５を含むＳ２ポケット（ＬＡＤ１）、ならびに（ｉｉ）残基Ａ１７４およびＰ１７５を含むＳ２’ポケットにおける配列変動を同定した（図６）。ＶｙＰＡＬ１およびＶｙＰＡＬ２のＬＡＤ２領域は同一であるが、それらのゲートキーパー領域（ＬＡＤ１）は２つの変動を持つ（図６）：Ｔ２４５Ａ置換は、残基２４５の側鎖が基質結合領域の反対に配向しているので、わずかな効果しか有さないと仮定された。そのため、ＶｙＰＡＬ１とＶｙＰＡＬ２との間で観察される活性の差異は、酵素を加水分解にとって「より漏出性」にし、より低いｐＨでヒドロラーゼに向かうＶｙＰＡＬ１のわずかなシフトを説明する他のＷ２４３Ｌ置換によるものであると結論付けられた。

ＶｙＰＡＬ１およびＶｙＰＡＬ２リガーゼと比較して、ＶｙＰＡＬ３は、ＬＡＤ１とＬＡＤ２の両方において変動を有する。しかしながら、ＬＡＤ１での保存的置換：Ｉｌｅゲートキーパー残基の代わりのＶ２４５およびＴｈｒ（ＶｙＰＡＬ２）の代わりのＶ２４６は、観察された活性の劇的な変化を説明する見込みはない（図１Ｃ）。むしろ、ＬＡＤ２における活性部位の反対側で、ＶｙＰＡＬ１およびＶｙＰＡＬ２に存在するＡＰジペプチドがより嵩高いＹＡジペプチドによって置き換えられている。この位置の嵩高いＴｙｒ残基がペプチジル求核剤のアシル酵素中間体へのアクセスを妨害し得るので、この変動が、ＶｙＰＡＬ１およびＶｙＰＡＬ２と比較してＶｙＰＡＬ３で観察される低いリガーゼ活性を担うことが分かった。これを確認して、本発明者らは、ＬＡＤ２リガーゼの第１の位置にＧｌｙ（またはＡｌａ）などのより小さい疎水性側鎖を挿入することによって、対応するＶｙＰＡＬ３単一Ｙ１７５Ｇ変異体で見られるように、効率を有意に増加させることができることを見出した（図４）。重要なことに、本発明者らは、等価な変異をヴィオラ・カナデンシス（Ｖｉｏｌａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）由来のＶｃＡＥＰに導入することによって、リガーゼ活性の制御へのＬＡＤ２領域の関与を確認することができた（図５Ａと図５Ｂを比較）。ＶｃＡＥＰのこの位置でＹによって占められる体積は、脱離基の解離の加速および入ってくるペプチドの結合の減速などの有害な効果を引き起こす可能性があり、これらは触媒水分子を移動させるのに必須の工程であり、よって、加水分解よりもライゲーションを好む。これは、早すぎるチオエステル加水分解を防ぐことによって環化を好む以前提案されたプライム側での相互作用の重要性と一致する。他方、Ｔｙｒ１７５の側鎖は、推定上の触媒水分子を乱さない。この水分子は、ＶｙＰａｌ３のＧｌｙ１７４、すなわち、ＡｔＬＥＧ－ガンマおよび他のレグマインの場合に観察される触媒Ｈｉｓ－の直後において厳密に保存された残基、の直ぐ上におそらく位置する（ツァウナーら（Ｚａｕｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．）（２０１８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１７．８１７０３１）。

本発明者らは、ＡＥＰおよびＰＡＬの機構を２つの工程：（ｉ）おそらく速度制限工程であるアシル－酵素チオエステル中間体形成、および（ｉｉ）アシル－酵素中間体上の水分子（加水分解）または求核ペプチド（ライゲーション）による求核攻撃に分解することができることを見出した。ＯａＡＥＰ１ｂで実施されたゲートキーパー変異誘発についての既知の情報（ヤン（Ｙａｎｇ）、上記）と合わせて、実施例に記載の得られる結果は、この中心位置のＶａｌ／Ｉｌｅ／Ｃｙｓ／Ａｌａなどの疎水性残基がライゲーションを好み、Ｇｌｙの存在がタンパク質分解を好むことを示す（図１および図６）。Ｓ２ポケットのＬＡＤ１は、おそらく基質でいくらかの特異的コンフォメーションひずみを誘導することによって、基質位置決めに影響を及ぼし、酵素活性に対する影響を与え得る。ゲートキーパーでの変化は、主に基質結合および位置決めに影響を及ぼすので、中間体形成、よって、全体的な反応速度に直接的影響を与えるであろう。逆に、ＬＡＤ２の変化は、求核剤の性質およびアクセス性に影響を及ぼし、結果として、触媒される全体的な反応の性質に決定的となるであろう。

ＬＡＤ２は、ＶｙＰＡＬおよびＶｃＡＥＰによって触媒される活性の性質にとっての重大な決定因子であることが分かった：ＶｙＰＡＬ３のＹＡジペプチドおよびＶｃＡＥＰのＹＰの第１の位置のＴｙｒなどの活性部位のこの側の嵩高い残基は、切断されたペプチド基の離脱を促進し、よって、これが触媒水の動員をもたらし、アシル－酵素チオエステルを求核水分子に対して露出する。この機構は、Ｓ１’およびＳ２’ポケットに残っている切断されたペプチド基が求核水分子を移動させ、よって、加水分解よりもライゲーションを好むことを示した以前の研究と一致している。その上、入ってくる求核ペプチドが結合する方向に配向している嵩高い残基が、アセチル－酵素中間体へのアクセスを妨害し、よって、ライゲーションの速度を厳しく減少させる。逆に、ＬＡＤ２中のＧＡ／ＡＡ／ＡＰなどの小さい疎水性ジペプチドは、別のペプチドが求核剤として作用するまで、離脱基を保持し（チオエステル結合へのアクセスを遮断する）、リガーゼ活性につながる。しかしながら、ＡＥＰを操作するためのＶｙＰＡＬ２の両部位の変異が、プロテアーゼ、例えばＯａＡＥＰ２またはブテラーゼ２への効率的で劇的な変換をもたらさないことも分かり、ＬＡＤ１およびＬＡＤ２以外の、タンパク質分解のための他の決定因子の存在を示唆した（データは示さない）。１つの魅力的な可能性は、ＬＡＤ１（ゲートキーパー）、ＬＡＤ２（この研究）およびＭＬＡ内の残基が協同してプロテアーゼ活性対リガーゼ活性を決定するというものである。この点について、切断型ＭＬＡを所有するＶｃＡＥＰ（図６）は主にプロテアーゼ活性を表す（図５）ので、切断型ＭＬＡ単独の存在（チェンら（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４４１（３）：３６１－５）が、リガーゼ活性を必ずしも暗示しないことが分かった。

要約すると、本発明者らは、アスパラギニルエンドペプチダーゼおよびリガーゼ活性を支配する分子決定因子が、Ｓ１ポケットの側方の基質結合溝、特にそれぞれＳ２およびＳ１’ポケットを中心にしたＬＡＤ１およびＬＡＤ２のアミノ酸組成に主として見出されることを発見した。構造分析と変異誘発試験を組み合わせて、効率的なペプチドアスパラギニルリガーゼのために、ＬＡＤ１の第１の位置が、好ましくはＷ／Ｙなどの、嵩高い芳香族であり、第２の位置が、Ｖ／Ｉ／Ｃ／Ａなどの疎水性であるがＧではないことが明らかにされた。ＬＡＤ２については、ＧＡ／ＡＡ／ＡＰジペプチドが好まれることが分かった。Ｙなどの嵩高い残基は、基質の結合親和性に影響を及ぼし、水分子のアクセス性を制御することによって、およびＮ／Ｄ残基後の切断されたペプチドテールの解離速度を増加させることによって、アシル－酵素中間体を不安定化する可能性があるので、ＬＡＤ２の第１の位置で不利である。そのため、リガーゼ活性にとっていつも十分な条件であるとは限らないが、このジペプチドの第１の位置にＧまたはＡなどの小さい残基が必要である。この条件が満たされる限り、天然ＡＥＰは、ＬＡＤ１（ゲートキーパー）またはより離れた領域、例えばＭＬＡなどの他の位置での変異または変化を通してＰＡＬになるよう修正可能である。

上記知見に基づいて、本発明は、第１の態様で、単離形態のペプチドアスパラギニルリガーゼ（ＰＡＬ）活性を有するポリペプチドを網羅し、より具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる単離ポリペプチドに向けられる。配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、本明細書で、「ＶｙＰＡＬ２」または「ＶｙＰＡＬ２活性形態／ドメイン」とも呼ばれる。本明細書で使用される「単離された」は、天然に生じ得るか、または会合し得る他の細胞成分から少なくとも部分的に分離されている形態のポリペプチドに関する。ポリペプチドは、組換えポリペプチド、すなわち、前記ポリペプチドを天然には生成しない遺伝子操作された生物で生成されたポリペプチドであり得る。天然ポリペプチドと組換えポリペプチドの両方が、Ｎ結合グリコシル化によって翻訳後修飾される。

本発明によるポリペプチドは、タンパク質ライゲーション活性を示す、すなわち、２つのアミノ酸残基の間でペプチド結合を形成することができ、これらの２つのアミノ酸残基は同じまたは異なるペプチドまたはタンパク質上に、好ましくは前記ライゲーション活性が前記ペプチドまたはタンパク質を環化するように同じペプチドまたはタンパク質上に位置する。したがって、種々の実施形態では、本発明のポリペプチドがシクラーゼ活性を有する。種々の実施形態では、このタンパク質ライゲーションまたはシクラーゼ活性がエンドペプチダーゼ活性を含む、すなわち、ポリペプチドが、既存のペプチド結合の切断後に２つのアミノ酸残基の間でペプチド結合を形成する。これは、環化が所与のペプチドの末端間で起こる必要はなく、内部アミノ酸残基間で起こることもでき、環化に使用されるアミノ酸に対してＣ末端またはＮ末端のアミノ酸が切断されることを意味する。好ましい実施形態では、Ｎ末端を内部アミノ酸にライゲーションし、残っているＣ末端アミノ酸を切断することによって、ポリペプチドが環化ペプチドを形成する。

本明細書に開示されるポリペプチドは、ライゲーションが起こるアミノ酸Ｃ末端、すなわち、ライゲーションされるペプチドのＣ末端がアスパラギン（ＡｓｎもしくはＮ）またはアスパラギン酸（ＡｓｐもしくはＤ）のいずれか、好ましくはアスパラギンであるという点で「Ａｓｘ特異的」である。

本明細書で使用される「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって接続されたアミノ酸から作られるポリマーに関する。本明細書で定義されるポリペプチドは、５０個以上のアミノ酸、好ましくは１００個以上のアミノ酸を含むことができる。本明細書で使用される「ペプチド」は、ペプチド結合によって接続されたアミノ酸から作られるポリマーに関する。本明細書で定義されるペプチドは、２個以上のアミノ酸、好ましくは５個以上のアミノ酸、より好ましくは１０個以上のアミノ酸、例えば１０～５０個のアミノ酸を含むことができる。

種々の実施形態では、ポリペプチドが、その全長にわたって配列番号１に記載のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９０．５％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．２５％または９９．５％同一または相同であるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、その全長にわたって配列番号１に記載のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するか、またはその全長にわたって配列番号１に記載のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する。

種々の実施形態では、ポリペプチドが、成熟酵素の前駆体であり得る。このような実施形態では、ポリペプチドが、配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み得るか、またはからなり得る。配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９０．５％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．２５％または９９．５％同一または相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。

核酸配列またはアミノ酸配列の同一性は、一般的に、配列比較によって決定される。この配列比較は、既存の分野で確立され、通例使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、アルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．）（１９９０）「基本的なローカルアラインメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０およびアルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．）（１９９７）：「ギャップ付きＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース検索プログラム（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ）」；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５、３３８９－３４０２頁参照）に基づき、原則として、核酸配列およびアミノ酸配列のそれぞれにおいて、類似の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸を相互に関連付けることによって行われる。関連のある位置の表の関連付けは「アラインメント」と呼ばれる。配列比較（アラインメント）、特に複数の配列比較は、通例、当業者に入手可能であり、知られているコンピュータプログラムを使用して調製される。

この種の比較はまた、比較されている配列の互いに対する類似性に関する陳述を可能にする。これは通常、同一性％、すなわち、アラインメント中の同じ位置または互いに対応する位置で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合として示される。アミノ酸配列の文脈における、より広義に解釈される「相同性」という用語はまた、保存されたアミノ酸交換、すなわち、類似の化学活性を有するアミノ酸（これらは通常、タンパク質内で類似の化学活性を実施するので）の考慮を組み込む。そのため、比較される配列の類似性はまた、「相同性％」または「類似性％」として示すこともできる。同一性および／または相同性を示すことは、ポリペプチドもしくは遺伝子全体にわたって、または個々の領域にわたってのみ遭遇することができる。そのため、種々の核酸配列またはアミノ酸配列の相同領域および同一領域は、配列における一致として定義される。このような領域はしばしば、同一の機能を示す。これらは小さくてよく、ごく少数のヌクレオチドまたはアミノ酸を包含することができる。この種の小さい領域はしばしば、タンパク質の全体的な活性に必須の機能を実施する。そのため、個々の領域、および任意選択で小さい領域に対する配列一致のみを指すことが有用となり得る。しかしながら、特に示さない限り、本明細書において同一性および相同性を示すことは、それぞれ示される核酸配列またはアミノ酸配列の完全長を指す。

種々の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドが、配列番号１の１９位に対応する位置にアミノ酸残基Ｎ；および／または配列番号１の１２４位に対応する位置にアミノ酸残基Ｈ；および／または配列番号１の１６６位に対応する位置にアミノ酸残基Ｃを含む。種々の実施形態では、少なくとも配列番号１の１２４位に対応する位置のアミノ酸残基Ｈ；および／または配列番号１の１６６位に対応する位置のアミノ酸残基Ｃによって形成される触媒二残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｙａｄ）が、好ましくは配列番号１の１９位に対応する位置のアミノ酸残基Ｎと組み合わせて存在し、よって、完全な触媒三残基を形成する。これらのアミノ酸残基が、ポリペプチドの触媒活性（リガーゼ／シクラーゼ／エンドペプチダーゼ活性）に必要であることが分かった。よって、好ましい実施形態では、ポリペプチドが、所与のまたは対応する位置に、上に示される残基のうちの少なくとも２つ、より好ましくは３つ全てを含む。

全てのアミノ酸残基は、一般に、本明細書において、その１文字表記、およびいくつかの例では、その３文字表記への言及によって呼ばれる。この命名法は当業者に周知であり、本明細書においては、当分野で理解されているものとして使用される。

種々の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドが、１２６位に対応する位置にアミノ酸残基Ａを含む。種々の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドが、配列番号１の１２７位に対応する位置にアミノ酸残基ＡまたはＰ、好ましくはＰを含む。あるいは、配列番号１の１２６位に対応する位置のアミノ酸残基がＧであり得る。これらの実施形態では、配列番号１の１２７位に対応する位置のアミノ酸残基が好ましくはＡである。これらのモチーフＡＰ、ＡＡおよびＧＡはまた、リガーゼ活性の決定的な決定因子であり、これらの位置の他のアミノ酸のこれらのモチーフへの変異は、その優勢な酵素活性が切り替えられるという点でエンドペプチダーゼ酵素をリガーゼ酵素に変換し得るので、本明細書において、リガーゼ活性決定因子２（ＬＡＤ２）とも呼ばれる。種々の実施形態では、配列番号１の１２６位および１２７位に対応する位置のモチーフがＧＰではなく、ＡＰ、ＡＡまたはＧＡのいずれかである。

種々の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドが、配列番号１の１９５位に対応する位置にアミノ酸残基ＷまたはＹ、配列番号１の１９６位に対応する位置にアミノ酸残基ＩまたはＶ、および配列番号１の１９７位に対応する位置にアミノ酸残基Ｔ、ＡまたはＶを含む。このモチーフＷ－Ｉ／Ｖ－Ｔ／Ａ／Ｖもまた、本明細書においてリガーゼ活性決定因子１（ＬＡＤ１）とも呼ばれ、リガーゼ活性の決定的な決定因子であることが分かった。配列番号１の１９６位に対応する既知のゲートキーパー位置に加えて、１９５位および１９７位、特に１９５位もリガーゼ／エンドペプチダーゼ活性の決定に関連していることが分かった。また、これらの位置の他のアミノ酸のこれらのモチーフへの変異は、その優勢な酵素活性が切り替えられるか、または混合リガーゼ／エンドペプチダーゼのリガーゼ活性を増加させるという点でエンドペプチダーゼ酵素をリガーゼ酵素に変換し得る。

種々の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドが、配列番号１の２１位に対応する位置にアミノ酸残基Ｒ、配列番号１の２２位に対応する位置にアミノ酸残基Ｈ、配列番号１の１２３位に対応する位置にアミノ酸残基Ｄ、配列番号１の１６４位に対応する位置にアミノ酸残基Ｅ、配列番号１の１９４位に対応する位置にアミノ酸残基Ｓ、および配列番号１の２１５位に対応する位置にアミノ酸残基Ｄを含む。これらのアミノ酸残基は、本明細書において、「Ｓ１ポケット」とも呼ばれる。

種々の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドが、配列番号１の１９９位および２１２位に対応する位置にアミノ酸残基Ｃを含む。これらの２つの残基は、典型的には成熟ポリペプチドのジスルフィド架橋を形成する。

種々の実施形態では、本発明のポリペプチドが、ポリＰｒｏループ（ＰＰＬ）などのさらなるいくぶん不変の配列要素を含み得る。前記ループは、コンセンサス配列Ｐ／Ａ－Ｇ／Ｔ／Ｓ－Ｘ－Ｘ－Ｐ／Ｅ－Ｇ／Ｄ／Ｐ－Ｖ／Ｆ／Ａ／Ｐ－Ｐ－Ｌ／Ｐ／Ａ／Ｅ－Ｅを有し、少なくとも２つ、および最大５つのプロリン残基を含む。示される位置の２つ、３つ、４つまたは４つのプロリン残基が典型的である。ＰＰＬは、配列番号１の２００～２０８位を占める。

本発明のポリペプチドに存在し得る別のモチーフは、配列番号１の残基２４４～２４９にわたるいわゆるＭＬＡモチーフである。これは、配列ＫＫＩＡＹＡまたはＮＫＩＡＹＡ（配列番号１５および１６）を有し得る。

種々の実施形態では、本発明のポリペプチドが、上記のＬＡＤ１およびＬＡＤ２モチーフを含む。さらなる実施形態では、これらが、上に定義されるＳ１ポケット、ＳＳ架橋、ＰＰＬおよびＭＬＡモチーフのうちの１つ、２つ、３つまたは４つ全てを加えて含む。

種々の実施形態では、本発明の単離ポリペプチドが、ｐＨ５．０以下、好ましくは４．５以下での酸処理によって活性化され得る。これは、Ｃ末端キャップ配列または活性化ドメインを含むポリペプチドにも当てはまる。このようなＣ末端ドメインは、例えば、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに存在する。そこで使用される具体的な配列（配列番号１７）は、ＶｙＰＡＬ１（配列番号５）のキャップ配列に由来している。

本発明の単離ポリペプチドは、好ましくは酵素活性、特にタンパク質リガーゼ活性、好ましくはシクラーゼ活性を有する。種々の実施形態では、これが、これらのペプチドが所与のペプチドを６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上の効率でライゲーションすることができることを意味する。効率は、前記ペプチド／ポリペプチドの総量に対する環化された所与のペプチド／ポリペプチドの量（％）として決定される。

本発明のポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素のタンパク質リガーゼ活性の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも９０％を有することが好ましい。

種々の実施形態では、本発明の単離ポリペプチドが、好ましくはｐＨ５．５以上で、所与のポリペプチドを６０％以上、好ましくは８０％以上の効率で環化することができる。環化活性は、ｐＨ値６．０、６．５、７．０、７．５またはそれ以上で決定することもできる。ｐＨ５未満などの低いｐＨ条件では、多くのリガーゼが一定程度のエンドペプチダーゼ活性を示し得るので、これは妥当である。

種々の実施形態では、本発明のポリペプチドが、所与のペプチドを２０％以下、好ましくは５％以下の効率で加水分解する。この効率は、前記ペプチド／ポリペプチドの総量に対して加水分解された所与のペプチド／ポリペプチドの量（％）として決定される。また、ｐＨが活性に影響し得るので、加水分解活性は、好ましくはｐＨ５．５以上、例えばｐＨ値６．０、６．５、７．０、７．５またはそれ以上で決定される。

上記改変に加えて、本明細書に記載される実施形態によるポリペプチドは、アミノ酸改変、特にアミノ酸置換、挿入または欠失を含むことができる。このようなポリペプチドは、例えば、標的化遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって、すなわち、変異誘発法を通してさらに開発され、具体的な目的のためにまたは特別な特性に関して（例えば、その触媒活性、安定性等に関して）最適化される。このような追加改変を本発明のポリペプチドに導入する場合、これらは、好ましくは上に詳述される配列モチーフ、すなわち触媒残基、ＬＡＤ１およびＬＡＤ２モチーフに影響を及ぼすこともなく、これを変更することもなく、これを逆転させることもない。これは、これらの残基／モチーフの上に定義される特徴が、上に定義されるものを超えてこれらの追加の変異によって変化しないことを意味する。加えて、Ｓ１ポケット、ＳＳ架橋、ＰＰＬおよびＭＬＡモチーフのうちの１つ、２つ、３つまたは４つ全てが追加の改変、すなわち上に詳述されるものを超える改変なしに保持されることがさらに好ましくなり得る。加えて、本明細書で企図される核酸を、組換え配合物に導入し、それによって、これらを使用して完全に新規なタンパク質リガーゼ、シクラーゼまたは他のポリペプチドを生み出すことができる。

種々の実施形態では、リガーゼ／シクラーゼ活性を有するポリペプチドが、翻訳後修飾され得る、例えばグリコシル化され得る。このような修飾は、組換え手段によって、すなわち、生成時に宿主細胞で直接行われ得るか、または例えばインビトロにおいてポリペプチドの合成後に化学的もしくは酵素的に達成され得る。

例えば、既知のＰＡＬブテラーゼ－１（配列番号１８）は、嵩高い異種グリカンによりＮ９４およびＮ２８６でグリコシル化され、これにより約６ｋＤａの追加の質量の増加が得られる。組換えＶｙＰＡＬ２（配列番号１～３）は、小さいグリカンにより、配列番号２のナンバリングを使用してＮ１０２、Ｎ１４５およびＮ２３７位でグリコシル化され、これにより約３ｋＤａの追加の増加質量が得られる。よって、本発明のポリペプチドは、嵩高い異種グリカンにより、例えば配列番号１８のＮ９４位およびＮ２８６位に対応する位置で、または小さいグリカンにより、配列番号２のＮ１０２位、Ｎ１４５位およびＮ２３７位に対応する位置でグリコシル化され得る。

記載される改変の目的は、例えば、基質特異性を変更するため、および／または触媒活性を改善するために、置換、挿入または欠失などの標的化変異を既知の分子に導入することであり得る。この目的のために、特に、分子の表面電荷および／または等電点、ならびにそれによって、基質とのその相互作用を修飾することができる。あるいはまたは加えて、ポリペプチドの安定性を、１つまたは複数の対応する変異、およびそれによって改善されるその触媒性能を通して増強することができる。個々の変異、例えば個々の置換の有利な特性は互いを補うことができる。

種々の実施形態では、ポリペプチドが、単一または複数の保存的アミノ酸置換によって、初期分子として上に記載されるポリペプチドから得ることができることを特徴とし得る。「保存的アミノ酸置換」という用語は、あるアミノ酸残基と別のアミノ酸残基の交換（置換）であって、このような交換が交換されたアミノ酸の位置での極性の変化にも電荷の変化にもつながらないもの、例えば、非極性アミノ酸残基と別の非極性アミノ酸残基の交換を意味する。本発明の文脈における保存的アミノ酸置換は、例えば、Ｇ＝Ａ＝Ｓ、Ｉ＝Ｖ＝Ｌ＝Ｍ、Ｄ＝Ｅ、Ｎ＝Ｑ、Ｋ＝Ｒ、Ｙ＝Ｆ、Ｓ＝Ｔ、Ｇ＝Ａ＝Ｉ＝Ｖ＝Ｌ＝Ｍ＝Ｙ＝Ｆ＝Ｗ＝Ｐ＝Ｓ＝Ｔを包含する。

あるいはまたは加えて、ポリペプチドは、断片化によって、または欠失、挿入もしくは置換変異誘発によって、初期分子として本明細書で企図されるポリペプチドから得ることができることを特徴とし得、少なくとも１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０または２６５個の連続的に接続されたアミノ酸の長さにわたって配列番号１～１４に記載の初期分子と一致するアミノ酸配列を包含する。このような実施形態では、初期分子に含有されるアミノ酸Ｎ１９、Ｈ１２４およびＣ１６６、ならびに上に定義されるＬＡＤ１、ＬＡＤ２、ならびに任意選択でＳ１ポケット、ＰＰＬ、ＭＬＡモチーフおよびジスルフィド架橋のうちのいずれか１つまたは複数も依然として存在することが好ましい。

よって、種々の実施形態では、本発明はまた、本明細書に記載されるポリペプチドの断片であって、酵素活性を保持する断片に関する。これらが、初期分子の、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドのタンパク質リガーゼおよび／またはシクラーゼ活性の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも９０％を有することが好ましい。これらの断片は、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２００または２５０である。これらの断片が、初期分子に含有される配列番号１の１９位、１２４位および１６６位に対応する位置のアミノ酸Ｎ、ＨおよびＣ、ならびに上に定義されるＬＡＤ１、ＬＡＤ２、ならびに任意選択でＳ１ポケット、ＰＰＬ、ＭＬＡモチーフおよびジスルフィド架橋のうちのいずれか１つまたは複数も含むことがさらに好ましい。そのため、好ましい断片は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸１９～１９７、より好ましくは１９～２１２、最も好ましくは１９～２４９を含む。

本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにこのような核酸を含有するベクター、特にコピーベクターまたは発現ベクターも本発明の一部を形成する。
これらはＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。これらは、個々の鎖として、前記個々の鎖に相補的な個々の鎖として、または二本鎖として存在することができる。ＤＮＡ分子では特に、３つの可能なリーディングフレーム全ての両相補鎖の配列が各場合で考慮されるべきである。異なるコドン、すなわち塩基トリプレットが、同じアミノ酸をコードすることができ、結果として特定のアミノ酸配列が複数の異なる核酸によってコードされ得るという事実も考慮されるべきである。遺伝暗号のこの縮重の結果として、上記ポリペプチドの１つをコードすることができる全ての核酸配列が本発明のこの主題に含まれる。遺伝暗号の縮重にもかかわらず、定義されるアミノ酸は個々のコドンに関連付けられるはずなので、当業者であれば、これらの核酸配列を疑いの余地なく決定することができる。そのため、当業者であれば、アミノ酸配列から進んで、そのアミノ酸配列をコードする核酸を容易に確かめることができる。加えて、本発明による核酸の文脈では、１つまたは複数のコドンが同義のコドンによって置き換えられ得る。この態様は、特に、本明細書で企図される酵素の異種発現を指す。例えば、全ての生物、例えば生成株の宿主細胞が、特異的コドン使用頻度を所有する。「コドン使用頻度」は、それぞれの生物による遺伝暗号のアミノ酸への翻訳として理解される。核酸上に位置するコドンが、生物において、比較的少数の負荷ｔＲＮＡ分子に直面している場合、タンパク質生合成におけるボトルネックが生じ得る。また、これは同じアミノ酸をコードし、あるコドンが同じアミノ酸をコードする同義のコドンよりもあまり効率的でなく生物で翻訳されるという結果になる。同義のコドンのためのより多数のｔＲＮＡ分子の存在のために、後者が生物でより効率的に翻訳され得る。

分子生物学またはタンパク質化学の標準的な方法と組み合わせた、例えば、化学合成またはポリメラーゼ連鎖反応などの今日一般的に知られている方法を通して、当業者は、既知のＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列に基づいて、遺伝子を完成させるまでずっと対応する核酸を製造する能力を有する。このような方法は、例えば、サムブルック・ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチュ・イーエフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス・ティー（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ）２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第３版、コールドスプリングラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）から知られている。

「ベクター」は、本明細書の目的のために、特徴付ける核酸領域として本明細書で企図される核酸を含有する、核酸で構成される要素として理解される。ベクターは、前記核酸が、複数の世代または細胞分裂にわたって、種または細胞株において安定な遺伝要素として確立されることを可能にする。特に、細菌で使用される場合、ベクターは特別なプラスミド、すなわち、環状遺伝要素である。本明細書の文脈では、本明細書で企図される核酸がベクターにクローニングされる。例えば、その起源が細菌プラスミド、ウイルスもしくはバクテリオファージであるもの、または広く異なる誘導物の要素を有する主に合成のベクターもしくはプラスミドがベクターの中に含まれる。各場合で存在するさらなる遺伝要素を使用すると、ベクターは、複数の世代にわたって、関連している宿主細胞において自身を安定な単位として確立することができる。これらは、別個の単位として染色体外に存在することができるか、またはそれぞれ染色体の染色体ＤＮＡに組み込むことができる。

発現ベクターは、発現ベクターを含有する宿主細胞、好んで微生物、特に好ましくは細菌中で複製し、その中で、含有される核酸を発現することができる核酸配列を包含する。よって、種々の実施形態では、本明細書に記載されるベクターはまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸の発現を制御する調節エレメントを含有する。発現は、特に、転写を調節するプロモーターによって影響される。発現は、原則として、発現される核酸の前に元々位置する天然プロモーターによって起こり得るが、発現ベクターに備え付けられた宿主細胞プロモーターによっても、または別の生物もしくは別の宿主細胞の修飾された、もしくは完全に異なるプロモーターによっても起こり得る。本ケースでは、本明細書で企図される核酸を発現するための少なくとも１つのプロモーターが、その発現のために利用可能になり、使用される。発現ベクターはさらに、例えば培養条件の変化を通して、またはそれらを含有する宿主細胞が特定の細胞密度に達した場合に、または特定の物質、特に遺伝子発現の活性化因子の添加によって調節され得る。このような物質の一例は、ガラクトース誘導体、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）であり、これは細菌ラクトースオペロン（ｌａｃオペロン）の活性化因子として使用される。発現ベクターと対照的に、含有される核酸はクローニングベクターでは発現されない。

さらなる態様では、本発明はまた、本明細書で企図される核酸または本明細書で企図されるベクターを含有する宿主細胞、好ましくは非ヒト宿主細胞に向けられる。本明細書で企図される核酸または前記核酸を含有するベクターは、好ましくは微生物に形質転換され、次いで、これが実施形態による宿主細胞となる。細胞を形質転換する方法は、既存の分野で確立されており、当業者に十分に知られている。原則として、全ての細胞、すなわち原核細胞または真核細胞が宿主細胞として適している。遺伝子的に有利な様式で、例えば形質転換に関して、核酸またはベクターおよびその安定な確立を使用して操作することができる宿主細胞、例えば単細胞真菌または細菌が好ましい。加えて、好ましい宿主細胞は、微生物学的および生物工学的条件で容易に操作されることで顕著である。これは、例えば、容易な培養能、高い増殖率、発酵培地の点から低い要求、ならびに外来タンパク質についての優れた生成および分泌速度を指す。ポリペプチドはさらに、その製造後に、それらを生成する細胞によって、例えば糖分子の付加、ホルミル化、アミノ化等によって修飾することができる。この種の翻訳後修飾は、ポリペプチドに機能的に影響し得る。

さらなる実施形態は、その活性が、例えばベクター上で利用可能にされる遺伝子調節エレメントであるが、宿主細胞中に先天的に存在してもよい遺伝子調節エレメントに基づいて調節され得る宿主細胞によって表される。これらは、例えば、活性化因子として働く化学化合物の制御された添加によって、培養条件の修飾によって、または特定の細胞密度に到達させた場合に、発現へと刺激され得る。これにより、本明細書で企図されるタンパク質の経済的生成が可能になる。このような化合物の一例は、前に記載されるＩＰＴＧである。

好ましい宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの、原核細胞または細菌細胞である。細菌は、短い世代時間および培養条件の点から少ない要求で顕著である。結果として、それぞれの経済的培養方法である製造方法を確立することができる。加えて、当業者であれば、発酵技術における細菌の文脈での豊富な経験を有する。栄養源、生成物発酵速度、時間要求等などの個々のケースで実験的に確かめられる多種多様な理由のために、グラム陰性菌またはグラム陽性菌が、具体的な生成例に適し得る。種々の実施形態では、宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞であり得る。

本明細書で企図される宿主細胞は、培養条件の要求の点で改変することができるか、または他のもしくは追加の選択マーカーを含むことができるか、または他のもしくは追加のタンパク質を発現することもできる。これらは、特に、複数のタンパク質または酵素を遺伝子導入で発現する宿主細胞であることができる。

しかしながら、宿主細胞はまた、細胞核を所有することを特徴とする真核細胞であることもできる。そのため、さらなる実施形態は、細胞核を所有することを特徴とする宿主細胞によって表される。原核細胞と対照的に、真核細胞は、形成されるタンパク質を翻訳後修飾することができる。その例は、放線菌類（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）などの真菌、またはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）もしくはクリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）などの酵母、またはＳｆ９細胞などの昆虫細胞である。これは、例えば、タンパク質が、その合成に関連して、このような系によって可能になる特定の修飾を経験することを意図している場合に、特に有利となり得る。特にタンパク質合成と合わせて真核生物系が行う修飾の中には、例えば、膜アンカーまたはオリゴ糖などの低分子量化合物の結合がある。よって、種々の実施形態では、宿主細胞が、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞などの真核細胞である。

本明細書で企図される宿主細胞は、通常の方法で、例えば不連続系または連続系で培養および発酵される。前者のケースでは、適切な栄養培地に宿主細胞が接種され、生成物が実験的に確かめられる一定期間後に収穫される。連続発酵は、比較的長期間にわたって、細胞が部分的に死に絶えるが、部分的に更新もされ、形成されたタンパク質を同時に培地から除去することができるフロー平衡の達成で顕著である。

本明細書で企図される宿主細胞は、好ましくは本明細書に記載されるポリペプチドを製造するために使用される。
そのため、本発明のさらなる態様は、本明細書で企図される宿主細胞を培養する工程と；培養培地または宿主細胞からポリペプチドを単離する工程とを備える、本明細書に記載されるポリペプチドを製造する方法である。培養条件および培地は、当技術分野で知られている一般知識および技術に頼ることによって、使用される宿主生物に基づいて、当業者によって選択され得る。

なおさらなる態様では、本発明は、タンパク質ライゲーションのための、特に１つまたは複数のペプチドを環化するための上記ポリペプチドの使用に関する。
本明細書に記載される酵素の使用は、ペプチド基質に言及することによって以下に記載されるが、これらを対応するポリペプチドまたはタンパク質にも同様に使用することができることが理解される。よって、本発明はまた、ポリペプチドまたはタンパク質が基質として使用される実施形態を網羅する。これらのポリペプチドまたはタンパク質は、ペプチド基質の文脈で以下に記載される構造モチーフを含むことができる。機能性を保持するヒトペプチドホルモンの断片などのペプチド断片、または例えばチオデプシペプチドを含む（骨格）修飾ペプチドなどのペプチド誘導体が利用される実施形態も包含される。したがって、本発明はまた、本明細書に開示されるペプチド基質の断片および誘導体を網羅する。

種々の実施形態では、ライゲーションまたは環化されるペプチドが、リガーゼ／シクラーゼによって認識、結合およびライゲーションされる認識配列およびライゲーション配列を含有する限り、典型的には少なくとも１０アミノ酸長の任意のペプチドであることができる。ライゲーションまたは環化されるペプチドのこのアミノ酸配列は、アミノ酸残基ＮまたはＤ、好ましくはＮを含み得る。種々の実施形態では、環化またはライゲーションされるペプチドが、アミノ酸配列（Ｘ）_ｏＮ／Ｄ（Ｘ）_ｐ（Ｘは任意のアミノ酸であり、ｏは１以上、好ましくは２以上の整数であり、ｐは１以上、好ましくは２以上の整数である）を含む。好ましい実施形態では、（Ｘ）_ｐがＸ^３Ｘ^４（Ｘ）_ｒ、Ｈ（Ｘ）_ｒまたはＨＶ（Ｘ）_ｒ（Ｘ^３はＰを除く任意のアミノ酸、好ましくはＨ、ＧまたはＳであり、Ｘ^４は、好ましくはＬ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｃ、Ｗ、ＹおよびＭから選択される、疎水性または芳香族アミノ酸であり、ｒは０または１以上の整数である）である。種々の実施形態では、ペプチドがアミノ酸配列（Ｘ）_ｏＮＨまたは（Ｘ）_ｏＮＨＶまたは（Ｘ）_ｏＮＧＬまたは（Ｘ）_ｏＮＳＬを含む。ライゲーション／環化中にＮに対してＣ末端の全てのアミノ酸が切断されるので、前記アミノ酸配列は、好ましくはライゲーションまたは環化されるペプチドのＣ末端またはＣ末端付近に位置する。したがって、全ての上記実施形態では、ｐまたはｒが、好ましくは最大２０、好ましくは最大５の整数である。ｐが２であり、（Ｘ）_ｐが好ましくは上に定義されるＸ^３Ｘ^４（Ｘ）_ｒであり、ｒが任意選択で０である実施形態が特に好ましい。

代替実施形態では、ライゲーションまたは環化されるペプチドが、アミノ酸配列（Ｘ）_ｏＮ^＊／Ｄ^＊（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｏは少なくとも２の整数であり、Ｃ末端カルボキシ基（ＮまたはＤ残基の）は式－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ’）_２の基（Ｒ’は例えばアルキルなどの任意の残基である）によって置き換えられている）を含み得る。このような実施形態では、ＮまたはＤ残基の末端－Ｃ（Ｏ）ＯＨ基、好ましくはＤの場合はアルファ－カルボキシ基が、基－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ’）_２を形成するように修飾される。これらのＣ末端アミド化ＤまたはＮ残基は、本明細書において、それぞれＤ^＊およびＮ^＊によって示される。本明細書に開示される酵素は、アミド基を切断し、前記ＮまたはＤ残基を目的の別のペプチドのＮ末端またはＮもしくはＤ残基を含む同じペプチドのＮ末端にライゲーションすることができる。

ライゲーションされるペプチドのＮ末端部分は、好ましくはアミノ酸配列Ｘ^１Ｘ^２（Ｘ）_ｑ（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得；Ｘ^１はＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり得；Ｘ^２は任意のアミノ酸であり得るが、好ましくはＶａｌ、ＩｌｅもしくはＬｅｕなどの疎水性アミノ酸、またはＣｙｓであり；ｑは０または１以上の整数である）を含む。Ｘ^１位は、以下の順序で好ましい：Ｇ＝Ｈ＞Ｍ＝Ｗ＝Ｆ＝Ｒ＝Ａ＝Ｉ＝Ｋ＝Ｌ＝Ｎ＝Ｓ＝Ｑ＝Ｃ＞Ｔ＝Ｖ＝Ｙ＞Ｄ＝Ｅ。「＝」はそれぞれのアミノ酸が同様に好ましいことを示し、「＞」はこの記号の後に列挙されるアミノ酸よりもこの記号の前に列挙されるアミノ酸が好ましいことを示す。Ｘ^２位は、以下の順序で好ましい：Ｌ＞Ｖ＞Ｉ＞Ｃ＞Ｔ＞Ｗ＞Ａ＝Ｆ＞Ｙ＞Ｍ＞Ｑ＞Ｓ。Ｘ^２位であまり好ましくないのはＰ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、ＮおよびＨである。Ｘ^１位で特に好ましいのはＧおよびＨであり、Ｘ^２位で特に好ましいのはＬ、Ｖ、ＩおよびＣであり、例えばジペプチド配列ＧＬ、ＧＶ、ＧＩ、ＧＣ、ＨＬ、ＨＶ、ＨＩおよびＨＣである。

よって、好ましい実施形態では、ライゲーションまたは環化されるペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向で、アミノ酸配列Ｘ^１Ｘ^２（Ｘ）_ｑ（Ｘ）_ｏＮ／Ｄ（Ｘ）_ｐ（式中、Ｘ、Ｘ^１、Ｘ^２、ｏ、ｐおよびｑは上に定義される通りであり、ｏは好ましくは少なくとも７である）を含む。種々の実施形態では、（１）ｑが０であり、ｏが少なくとも７の整数であり；および／または（２）Ｘ^１がＧまたはＨであり；および／または（３）Ｘ^２がＬ、Ｖ、ＩまたはＣであり；および／または（４）ｐが少なくとも２であるが、２２以下、好ましくは２～７であり、より好ましくはＨ（Ｘ）_ｒまたはＨＶ（Ｘ）_ｒ、最も好ましくはＨＸまたはＨＶである。種々の実施形態では、（１）ｑが０であり、ｏが少なくとも７の整数であり；（２）Ｘ^１がＧまたはＨであり；（３）Ｘ^２がＬ、Ｖ、ＩまたはＣであり；（４）ｐが少なくとも２であるが、２２以下、好ましくは２～７であり、より好ましくは（Ｘ）_ｐがＸ^３Ｘ^４（Ｘ）_ｒ、Ｈ（Ｘ）_ｒまたはＨＶ（Ｘ）_ｒ、最も好ましくはＨＸまたはＨＶまたはＸＬまたはＧＬまたはＸＳまたはＬＳである。

種々の実施形態では、環化されるペプチドが、環状システインノットポリペプチド、特にシクロチドの直鎖前駆体形態である。シクロチドは、並外れて安定な植物タンパク質のトポロジー的に特有のファミリーである。これらは、６個の保存されたシステイン残基と会合したシステインノットモチーフによって加えて拘束されるヘッドトゥーテールの環化ペプチド骨格に配置された約３０個のアミノ酸を含む。システインノットは、２つのジスルフィド結合およびそれらの接続する骨格セグメントから構築され、第３のジスルフィド結合によってつながれた構造中の内部環を形成して、連動および筋交い構造を形成する。このシステインノットコアモチーフに重ね合わされるのが、十分に定義されているβシートおよび短い表面露出ループを表す一連のターンである。

シクロチドは、その骨格ループ内で多様なペプチド配列を表し、広範囲の生物活性を有する。よって、これらは、製薬用途にとって大いに興味深いものである。これらが由来しているいくつかの植物は伝統医学で使用されており、プロトタイプシクロチドカラタＢ１（ｋＢ１）を含有する、アフリカで出産を促進するために使用されている植物オルデンランディア・アフィニス（Ｏｌｄｅｎｌａｎｄｉａ ａｆｆｉｎｉｓ）由来の茶であるカラタ－カラタ（ｋａｌａｔａ－ｋａｌａｔａ）を含む。その並外れた安定性は、これらがペプチドに基づく薬物設計用途で潜在的な鋳型として魅力的であることを意味する。特に、生理活性ペプチド配列をシクロチドフレームワークにグラフトすることによって、ペプチドに基づく治療薬を安定化するための新たなアプローチの見込みが提供され、それによって、薬物としてのペプチドの使用に対する主な制限の１つが克服される。

よって、種々の実施形態では、環化されるペプチドが、１０以上のアミノ酸長、好ましくは最大５０アミノ酸長、いくつかの実施形態では、約２５～３５アミノ酸長である。環化されるペプチドは、配列番号２０に記載のオルデンランディア・アフィニス（Ｏｌｄｅｎｌａｎｄｉａ ａｆｆｉｎｉｓ）由来のシクロチドカラタＢ１の前駆体のアミノ酸を含み得るか、またはからなり得る。

種々の実施形態では、環化されるペプチドが、アミノ酸配列（Ｘ）_ｎＣ（Ｘ）_ｎＣ（Ｘ）_ｎＣ（Ｘ）_ｎＣ（Ｘ）_ｎＣ（Ｘ）_ｎＣ（Ｘ）_ｎＮＨＶ（Ｘ）_ｎ（式中、各ｎは１～６から独立して選択される整数であり、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）を含むか、またはからなる。このようなペプチドは、上記の６個のシステイン残基間でシステイン結合を形成する環状システインノットポリペプチドの前駆体であり、Ｃ末端ＨＶ（Ｘ）_ｎ配列を切断し、（次いで、Ｃ末端）Ｎ残基をＮ末端残基にライゲーションすることによって、本明細書に記載される酵素によって環化され得る。

種々の実施形態では、環化されるペプチドが、米国特許出願公開第２０１２／０２４４５７５号明細書に開示される直鎖前駆体を含み得る。この文献は、この目的のために、全体を本願明細書に援用する。

種々の追加の実施形態では、環化されるペプチドが、それだけに限らないが、バクテリオシンＡＳ－４８（配列番号１９）などのバクテリオシン、コノトキシン、タナチン（昆虫抗菌ペプチド）およびヒスタチン（ヒト唾液抗菌ペプチド）などの、ペプチド毒素および抗菌ペプチドの直鎖前駆体を含む。環化され得る他のペプチドは、それだけに限らないが、ニューロメジン、サリューシンアルファ、アペリンおよびガラニンを含む環状ヒトまたは動物ペプチドホルモンの前駆体である。例示的なペプチドは、配列番号２１～３１に記載のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むか、またはからなる。

本明細書に開示される酵素および方法を使用してライゲーションまたは環化することができるさらなるペプチドは、限定されないが、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、アドレノメデュリン、インターメジン、プロアドレノメデュリン、アドロピン、アゲレニン、ＡＧＲＰ、アラリン、インスリン様成長因子－結合タンパク質５、アミリン、アミロイドｂ－タンパク質、両親媒性ペプチド抗生物質、ＬＡＨ４、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、Ａ型（心房性）ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、アパミン、アペリン、ビバリルジン、ボンベシン、リシル－ブラジキニン、Ｂ型（脳性）ナトリウム利尿ペプチド、Ｃ－ペプチド（インスリン前駆体）、カルシトニン、コカインおよびアンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）－３３、サイトカイン誘導好中球走化性因子－１／増殖関連癌遺伝子（ＣＩＮＣ）、コリベリン、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）、コルチスタチン、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、デコルシン、ヒト好中球ペプチド－１（ＨＮＰ－１）、ＨＮＰ－２、ＨＮＰ－３、ＨＮＰ－４、ヒトデフェンシンＨＤ５、ＨＤ６、ヒトベータデフェンシン－１（ｈｂｄ１）、ｈｂｄ２、ｈｂｄ３、ｈｂｄ４、デルタ睡眠誘発ペプチド（ＤＳＩＰ）、ダームシジン（Ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ）－１Ｌ、ダイノルフィンＡ、エラフィン、エンドキニンＣ、エンドキニンＤ、ｂ－リポトロピン、ｇ－エンドルフィン、エンドセリン－１、エンドセリン－２、エンドセリン－３、ビッグエンドセリン－１、ビッグエンドセリン－２、ビッグエンドセリン－３、エンフビルチド（Ｅｎｆｕｖｉｒｉｔｉｄｅ）、エキセンジン－４、ＭＢＰ、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ＧｌｕフィブリノペプチドＢ、ガラニン、ガラニン様ペプチド、ビッグガストリン（ヒト）、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、ガストリン放出ペプチド、グレリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、ＧＬＰ－２、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ、ＧＨＲＦ）、グアニリン、ウログアニリン、ウログアニリン異性体Ａ、ウログアニリン異性体Ｂ、ヘプシジン、肝臓発現抗菌ペプチド（ＬＥＡＰ－２）、ヒューマニン、連結ペプチド（ｒＪＰ）、キスペプチン－１０、キスペプチン－５４、リラグルチド、ＬＬ－３７（ヒトカテリシジン）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、マガイニン１、マストパラン、アルファ－接合因子、肥満細胞脱顆粒（ＭＣＤ）ペプチド、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）、アルファ－メラニン細胞刺激ホルモン（アルファ－ＭＳＨ）、ミッドカイン、モチリン、神経内分泌調節ペプチド１（ＮＥＲＰ１）、ＮＥＲＰ２、ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、ニューロメジンＢ、ニューロメジンＣ、ニューロメジンＳ、ニューロメジンＵ８、ニューロスタチン－１３、神経ペプチドＢ－２９、神経ペプチドＳ（ＮＰＳ）、神経ペプチドＷ－３０、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、ニューロテンシン、ノシセプチン、ノシスタチン、オベスタチン、オレキシン－Ａ、オステオカルシン、オキシトシン、カテスタチン、クロモグラニンＡ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ペプチドＹＹ、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド３８（ＰＡＣＡＰ－３８）、血小板因子－４、プレクタシン、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）、プロラクチン放出ペプチド、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）、ＲＦアミド関連ペプチド－１、セクレチン、血清胸腺因子（ＦＴＳ）、ナトリウムカリウムＡＴＰアーゼ阻害剤－１（ＳＰＡＩ－１）、ソマトスタチン、ソマトスタチン－２８、ストレススコピン（Ｓｔｒｅｓｓｃｏｐｉｎ）、ウロコルチン、サブスタンスＰ、エキスタチン、エンテロトキシンＳＴｐ、ガンギシトキシン－１Ｅ（Ｇｕａｎｇｘｉｔｏｘｉｎ－１Ｅ）、ウロテンシンＩＩ、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）およびバソプレシン、ならびにこれらの断片および誘導体を含む。上記ペプチドは、ヒト、またはラット、マウス、ブタなどの動物起源のものであり得る。これらのうちの全てが当業者に周知であり、そのアミノ酸配列は容易に入手可能である。

種々の他の実施形態では、５０アミノ酸長超のポリペプチドまたはタンパク質が、環化基質として使用される。このような反応では、ポリペプチド／タンパク質が、そのＣ末端をそのＮ末端にライゲーションすることによって環化され得る。

種々の実施形態では、２つ以上のペプチドが本発明の酵素によってライゲーションされる。これは、２つ以上のペプチドからなる大環状分子の形成を含み得、好ましくは大環状ダイマーである。ライゲーションされるペプチドは、これらのうちの少なくとも１つがリガーゼ／シクラーゼによって認識、結合およびライゲーションされる認識配列およびライゲーション配列を含有する限り、任意のペプチドであることができる。適切なペプチドは、環化戦略に関連して上に記載されている。同じペプチドを、同じであっても異なっていてもよい別のペプチドへのライゲーションに使用することもできる。ライゲーションされるペプチドの１つは、例えば酵素活性または別の生物学的機能を有するポリペプチドであり得る。ライゲーションされるペプチドはまた、マーカーペプチド、または蛍光マーカーもしくはビオチンなどの検出可能なマーカーを含むペプチドを含み得る。このような実施形態によると、生理活性を有するポリペプチドを検出可能なマーカーに融合することができる。種々の実施形態では、ライゲーションされるペプチドの少なくとも１つが、２５アミノ酸以上、好ましくは５０アミノ酸以上の長さを有する（よって、本発明の意味では、「ポリペプチド」であり得る）。

ライゲーションされるペプチドは、配列番号３２～４２に記載のアミノ酸配列のいずれかを含むことができるか、またはからなることができる。ライゲーションされて（大環状）ダイマーを形成する好ましいペプチドは、配列番号３２～３６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。（１つのＣ末端ペプチドと）ライゲーションされて直鎖融合ペプチドを形成する好ましいＮ末端ペプチドは、配列番号２２、２５および３２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。（１つのＮ末端ペプチドと）ライゲーションされて直鎖融合ペプチドを形成する好ましいＣ末端ペプチドは、配列番号２３、２４および２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。

ライゲーションまたは環化されるペプチドはまた、Ａｓｘ含有タグがライゲーションまたは融合される目的のペプチドにＣ末端融合している融合ペプチドまたはポリペプチドであることができる。Ａｓｘ含有タグは、好ましくは種々の実施形態を含む、上に定義されるアミノ酸配列Ｎ／Ｄ（Ｘ）_ｐを有する。あるいは、アミド化ＮまたはＤ（上に定義されるＮ^＊またはＤ^＊）が、ライゲーションまたは融合されるペプチドまたはポリペプチドのＣ末端に融合され得る。この融合ペプチドまたはポリペプチドがライゲーションされる他のペプチドは上に定義される通りであり得る。あるいは、融合ペプチドまたはポリペプチドは、そのＣ末端とＮ末端との間で結合を形成することによって環化され得る。一実施形態では、融合ペプチドまたはポリペプチドが、アミノ酸配列ＮＨＶ（配列番号４３）のＣ末端タグに融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり得、ライゲーションされたペプチドが、アミノ酸配列ＧＩＧＫ（ビオチン化）Ｒ（配列番号４４）のビオチン化ペプチドであり得る。一般的に、シグナル化部分もしくは検出可能な部分を持つペプチドなどのペプチドにライゲーションされ得るか、または本明細書に記載される方法および使用を使用して環化され得るポリペプチドおよびタンパク質は、限定されないが、抗体、抗体断片、抗体様分子、抗体模倣物、ペプチドアプタマー、ホルモン、種々の治療用タンパク質などを含む。

種々の実施形態では、リガーゼ活性が、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などのフルオレセイン、または７－アミノ－４－メチルクマリンなどのクマリンを含む蛍光基などの検出可能な部分を持つペプチドを、上記のものなどのポリペプチドまたはタンパク質に融合させるために使用される。種々の実施形態では、タンパク質が、例えば配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有する、ヒト抗ＡＢＬ ｓｃＦｖなどの抗体断片、またはｄａｒｐｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）、例えば配列番号４６に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトＥＲＫに特異的なｄａｒｐｉｎなどの抗体模倣物であることができる。

フルオレセインもしくはその誘導体などの検出可能なマーカー、および／または元素Ｉ－１２５もしくはＩ－１３１で容易に放射標識され得るペプチドの使用、これにより、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ、引き続いて臓器選択または生検での蛍光検出を使用して、インビボで腫瘍の単一試薬イメージングを使用することが可能になる。

なお別の態様では、本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を、前記ペプチドの環化を可能にする条件下で、本発明の使用に関連して上に記載されるリガーゼ／シクラーゼ活性を有するポリペプチドとインキュベーションする工程を備える、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を環化する方法に関する。

なおさらなる態様では、本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を、前記ペプチドのライゲーションを可能にする条件下で、本発明の使用に関連して上に記載されるポリペプチドとインキュベーションする工程を備える、少なくとも２つのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をライゲーションする方法に関する。

種々の実施形態では、これらの方法により環化またはライゲーションされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、上記使用により環化またはライゲーションされるペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質と同様に定義される。

本明細書に記載される方法および使用では、酵素および基質が、モル比１：１００以上、好ましくは１：４００以上、より好ましくは少なくとも１：１０００で使用され得る。
反応は、典型的には最適な酵素活性を可能にする温度、通常は周囲（２０℃）～４０℃の間の温度で、適切な緩衝系中で行われる。

固体支持体上への酵素の固定化は、同じバッチの酵素を反復して使用することによって酵素消費を低下させるという第一目標があり、長い歴史を有する。加えて、固相固定化の部位分離が、凝集を減少させ、生体触媒の安定性および活性の増加につながり、酵素による生成物の汚染を回避することによって精製を単純化する。結果として、食品業界の固定化ラクターゼおよびバイオディーゼル生成の固定化リパーゼなどの固定化生体触媒が、工業的使用のために１０億規模の市場まで開発されてきた。化学触媒を使用する従来の工業プロセスと比較して、固定化酵素は経済的に魅力的であり、環境に優しい。

いずれかの担体への付着、または非共有結合的物理的捕捉、および自己架橋を含む３つの主流固定化技術がある。生体分子に基づく基質のための露出した基質結合表面を有するＰＡＬなどの生体触媒については、共有結合法および親和性結合法のいずれかによる親水性多孔質樹脂への付着に基づく戦略が、水性条件でのその性能を促進するために直接的で、簡便で実行可能である。

こうして固定化されたペプチドリガーゼは、大環状化および部位特異的ライゲーション反応の媒介において安定であり、再使用可能であり、大いに効率的である。
本発明者らは、天然ブテラーゼ－１を固定化する異なる方法を比較し、アスパラギニルリガーゼＶｙＰＡＬ２を組換え的に発現させた。驚くべきことに、ＰＡＬの固定化が、中性ｐＨ付近で極めて遅い速度ではあるが凝集および低活性形態への自己分解を含む可溶性酵素の限界を克服することが分かった。固体支持体上への固定化の主な利点は、部位分離および偽希釈（ｐｓｅｕｄｏ－ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を提供して、トランス自己分解を防ぎ、安定性を増強する。本発明者らは、固定化リガーゼのこれらの主な利点：低下しない酵素活性で再利用可能な１００回超の実行、安定性の増強および長期貯蔵寿命、ならびにより単純な下流精製プロセスを確認した。より重要なことに、固定化酵素の部位分離が、ワンポット条件下または連続フロー反応器中で、高い酵素濃度の使用を可能にして、ライゲーション反応を加速し、分単位で、環化、シクロオリゴマー化およびライゲーション反応などを完了させることが分かった。これらの利点は、リガーゼの量の減少、工業規模のためのスケールアップ使用およびナノデバイスへの適合において幸先の良いものである。

したがって、本発明の一態様では、上記方法および使用において、リガーゼ／シクラーゼ活性を有するポリペプチドが、適切な支持体材料上に固定化され得る。適切な支持体材料は、クロマトグラフィーカラムなどで使用される種々の樹脂およびポリマーを含む。支持体は、ビーズの形態を有し得るか、またはマイクロタイタープレートなどのより大きな構造の表面であり得る。固定化は、基質との極めて容易で単純な接触、ならびに合成後の酵素と基質の容易な分離を可能にする。酵素機能を有するポリペプチドが固体カラム材料上に固定化される場合、ライゲーション／環化が連続プロセスであり得る、および／または基質／生成物溶液がカラムを循環させられ得る。

したがって、本発明はまた、一態様では、その上に固定化された本発明による単離ポリペプチドを含む固体支持体材料を網羅する。固体支持体材料は、上記のものなどの、ポリマー樹脂、好ましくは微粒子形態のポリマー樹脂を含み得る。単離ポリペプチドは、共有結合または非共有結合相互作用によって、固体支持体材料上に固定化され得る。固体支持体は、例えば、アガロースビーズであり得る。

例示的な実施形態では、リガーゼ／シクラーゼ活性を有するポリペプチドがグリコシル化され、カナバリア・エンシフォルミス（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）（タチナタマメ）から単離されるレクチン（炭水化物結合タンパク質）であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）によって固定化され得る。これは、糖タンパク質および糖脂質を含む、α－Ｄ－マンノースおよびα－Ｄ－グルコース含有生体分子に特異的に結合する。前記ＣｏｎＡタンパク質は、糖タンパク質および糖脂質を固定化するために親和性カラム上に固定化された形態で使用される。したがって、種々の実施形態では、リガーゼ／シクラーゼ活性を有する単離ポリペプチドが、グリコシル化され、固体支持体材料表面にカップリングされた炭水化物結合部分、好ましくはコンカナバリンＡに非共有結合的に結合される。本発明のグリコシル化ポリペプチドの実施形態は上に記載されている。

上記の固体支持体材料は、少なくとも１つの基質ペプチドのオンカラム環化および／またはライゲーションに、あるいは少なくとも１つの基質を含む溶液を、少なくとも１つの基質ペプチドの環化および／またはライゲーションを可能にする条件下で、上記の固体支持体材料と接触させる工程を備える、少なくとも１つの基質ペプチドを環化またはライゲーションする方法に使用することができる。基質ペプチドは上記のものであり、上記ポリペプチド基質も含む。

種々の実施形態では、リガーゼまたはシクラーゼ活性を有するポリペプチドがグリコシル化され、固定化が、固体支持体に共有結合的に連結された炭水化物結合部分、好ましくはコンカナバリンＡ部分またはそのバリアントとの相互作用によって促進される。このような実施形態では、本発明のポリペプチドがブテラーゼ－１（配列番号１８（活性断片）または配列番号８８（完全長配列）のアミノ酸配列を含む）であり得、固体支持体がアガロースビーズであり得る。

種々の他の実施形態では、リガーゼまたはシクラーゼ活性を有するポリペプチドがビオチン化され、固定化が、固体支持体に共有結合的に連結されたビオチン結合部分、好ましくはストレプトアビジン、アビジンもしくはニュートラアビジンまたはこれらのバリアントとの相互作用によって促進される。ポリペプチドのビオチンによる機能化は、スクシンイミジル－６－（ビオチンアミド）ヘキサノエートなどのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いたビオチンエステルによる機能化などの当技術分野で知られている方法を使用して達成され得る。このような実施形態では、ポリペプチドが、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を有するＶｙＰＡＬ２または本明細書に定義されるこれらのバリアントであり得る。固体支持体はアガロースビーズであり得、ビオチン結合部分はニュートラアビジン（脱グリコシル化アビジン）などのアビジンバリアントであり得る。

種々の他の実施形態では、リガーゼまたはシクラーゼ活性を有するポリペプチドが、ポリペプチド中の、例えばリジン側鎖からの遊離アミノ基と固体支持体の表面上のＮ－ヒドロキシスクシンイミド官能基との反応によって、固体支持体上に固定化される。固体支持体はアガロースビーズであり得、ポリペプチドは、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を有するＶｙＰＡＬ２または本明細書に定義されるこれらのバリアントであり得る。

種々のさらなる態様では、本発明はまた、アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）活性を有するポリペプチドのタンパク質リガーゼ活性を増加させる方法であって、配列番号１の１２６位に対応する位置のアミノ酸残基を小さい疎水性残基またはＧ残基のいずれか、好ましくはＡまたはＧ残基で置換する工程を備える方法を特徴とする。種々の実施形態では、特に配列番号１の１２６位に対応する位置がＧである場合、配列番号１の１２７位に対応する位置のアミノ酸残基がＡである。種々の実施形態では、配列番号１の１２６位に対応する位置がＡである場合、配列番号１の１２７位に対応する位置のアミノ酸残基がＰである。種々の実施形態では、配列番号１の１２６位および１２７位に対応する位置のモチーフが、ＧＰではなく、ＡＰ、ＡＡまたはＧＡのいずれかである。配列番号１の１２７位に対応する位置のアミノ酸が、モチーフＡＰ、ＡＡまたはＧＡが得られるようなものではない場合、これを置換してもよい。上記のように、ＬＡＤ２モチーフ内の前記位置が、酵素方向性の決定的な決定因子であり、ＧＡおよびＧＰが一般的に優勢にまたは排他的にリガーゼ機能性を有する酵素をもたらすことが分かった。

種々の実施形態では、前記方法がまた、タンパク質リガーゼ活性を有するポリペプチドを生成する方法であって、
（ｉ）アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）活性を有するポリペプチドを提供する工程と；
（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸置換を、アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）活性を有するポリペプチドに導入する工程であって、前記置換は、配列番号１の１２６／１２７位に対応する位置のアミノ酸配列がＧＡ、ＡＡまたはＡＰ、好ましくはＧＡまたはＡＰのいずれかとなるように、配列番号１の１２６位に対応する位置のアミノ酸残基をＡまたはＧ残基で置換すること、および任意選択で配列番号１の１２７位に対応する位置のアミノ酸残基をＰまたはＡのいずれかの残基で置換することを含む、工程と
を備える、方法であり得る。

また、このような方法では、特に配列番号１の１２６位に対応する位置がＧである場合、配列番号１の１２６位に対応する位置のアミノ酸残基がＡであるか、または配列番号１の１２６位に対応する位置がＡである場合、配列番号１の１２７位に対応する位置のアミノ酸残基がＰであり、配列番号１の１２６位および１２７位に対応する位置のモチーフがＧＰではなく、好ましくはＡＰ、ＡＡまたはＧＡのいずれかである。配列番号１の１２７位置に対応する位置のアミノ酸が、モチーフＡＰ、ＡＡまたはＧＡが得られるようなものではない場合、本方法が、工程（ｉｉ）で前記位置を置換することを含んでもよい。

そのリガーゼ／シクラーゼ活性を増加させるために前記方法に供されるポリペプチドは、アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）であり得、種々の実施形態では、その全長にわたって配列番号１０～１４（ＶｙＡＥＰ１～４；ＶｃＡＥＰ）のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、またはからなり得る。種々の実施形態では、変異されるポリペプチドが、配列番号１の１２６位および１２７位に対応する位置が配列モチーフＧＡもＡＰも有さないように、ＧでもＡでもない配列番号１の１２６位に対応する位置のアミノ酸残基を有する。しかしながら、これがモチーフＧＰを有してもよく、その場合、これを記載される方法で、ＧＡ、ＡＡまたはＡＰによって置換することができる。

本発明はまた、本明細書に記載されるタンパク質リガーゼおよび／またはシクラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む植物などのトランスジェニック生物を包含する。ポリペプチドは、好ましくは前記宿主生物にも宿主植物にも天然に存在しない。したがって、本発明はまた、本発明による異種ポリペプチドを発現する、ヒトを除く、トランスジェニック生物／植物を特徴とする。

種々の実施形態では、このようなトランスジェニック生物／植物が、１つもしくは複数の環化されるペプチドまたは１つもしくは複数のライゲーションされるペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子をさらに含み得る。これらは、本発明の使用および方法に関連して上に定義されるペプチドであり得る。一実施形態では、環化されるペプチドが、環状システインノットポリペプチド、例えば上に定義されるものなどの直鎖前駆体である。環化されるペプチドまたはポリペプチドのこれらの前駆体は、前記生物／植物に天然に存在し得るが、好ましくは人工的に導入される、すなわち、これらをコードする核酸が異種である。

そのため、このようなトランスジェニック生物／植物は、酵素およびその基質の同時発現により、目的の環化ペプチドを直接生成し得る。
ポリペプチドおよび核酸に関して本明細書に開示される全ての実施形態が、本明細書に記載される使用および方法に同様に適用可能であり、逆もまた同様である。

本発明は、以下の非限定的な実施例および添付の特許請求の範囲によってさらに例示される。

材料および方法
ＲＮＡ抽出およびＶｙトランスクリプトームの構築およびＡＥＰアナログの検索
９月初旬に収穫した新鮮なノジスミレ（Ｖｉｏｌａ ｙｅｄｏｅｎｓｉｓ）を、Ｔｒｉｚｏｌ法によるＲＮＡ抽出に供し、ＲＮＡ試料をＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑシーケンシング（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供されるサービス）に供した。配列データベースは、アクセッション番号ＰＲＪＮＡ４９４９７４でＮＣＢＩ ＳＲＡデータベースに保存（ｄｅｐｏｓｉｔ）されている。Ｔｒｉｎｉｔｙを使用したアセンブリー後、８６６７４個のＵｎｉｇｅｎｅを与える、１４．６９ＧＢ塩基を含有するデータが生成された。ｂｌａｓｔｐサーバーを使用した相同性検索のためのブテラーゼ１プロ酵素アミノ酸配列、開始コドンおよび終止コドンを含有する６つの完全配列、完全機能的コアドメインおよびＮ－またはＣ末端欠損配列を有する３つの部分配列、および不完全コアドメインを有する２つの切断配列を含む、１ｅ^－１０３未満のＥ値を有する１１個のＡＥＰ様ｍＲＮＡ配列を同定した。ＢｉｏＥｄｉｔでＣｌｕｓｔａｌＷを使用して配列アラインメントを実施した。ブテラーゼ１プロ酵素配列を使用した検索により、６０％超の配列同一性および９０％超の配列包括度で５００を超えるヒットが得られた。

細菌におけるＶｙＡＥＰ／ＰＡＬおよびＶｃＡＥＰのクローニング、組換え発現および精製
予測されたシグナルペプチドを含まないＶｙＡＥＰ１（Ｖｙ＝ノジスミレ（Ｖｉｏｌａ ｙｅｄｏｅｎｓｉｓ））、ＶｙＰＡＬ１～３およびＶｃＡＥＰ（Ｖｃ＝ヴィオラ・カナデンシス（Ｖｉｏｌａ Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ））ｃＤＮＡ配列を合成し、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグとインフレームでＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限酵素を用いてｐＥＴ２８ａ（＋）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、北京、中国）にクローニングした（ヘームーら（Ｈｅｍｕ ｅｔ ａｌ．）（２０１９）ＰＮＡＳ、２０１９年６月１１日、第１１６巻、第２４号、１１７３７－１１７４６）。Ｑ５変異誘発キット（ＮＥＢ）を使用して、点突然変異を構築した。プラスミドを、ＤｓｂＣを構成的に発現するとともにＥｒｖ１ｐ発現プラスミドｐＭＪＳ９でプレ形質転換されたＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。ＯＤ_６００＝０．４の形質転換細胞の新鮮な培養物を０．１％アラビノースで１時間処理して、Ｅｒｖ１ｐの生成を誘導し、引き続いて１６℃で１８～２４時間の０．１ｍＭ ＩＰＴＧ処理をして、標的タンパク質の発現を誘導した。１Ｌ体積の誘導細胞培養物からの細菌細胞を、６０００ｇで１５分間の遠心分離によって収穫した。１０ｍＬ体積の溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｎａ ＨＥＰＥＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β－メルカプト－エタノール、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ ｐＨ７．５）を添加していずれも１ｇの細胞ペレットを再懸濁した。氷上で２０分間、５秒／５秒パルスで５０％振幅での超音波処理によって細胞溶解を行った。可溶性タンパク質を含有する清澄化細胞溶解物を、冷結合緩衝液（５０ｍＭ Ｎａ ＨＥＰＥＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β－ＭＥ、ｐＨ７．５）で前平衡化した１ｍＬ ＣＯｍｐｌｅｔｅニッケルビーズ（Ｒｏｃｈｅ）を含有するセルフパックカラムに充填した。２０ｍＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭイミダゾール、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β－ＭＥ、ｐＨ７．５）で洗浄した後、Ｈｉｓ６－タンパク質を、４×２ｍＬの溶出緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭイミダゾール、０，１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β－メルカプト－エタノール、ｐＨ７．５）で溶出した。溶出タンパク質の１０倍希釈物を、イオン交換（ＩＥＸ）緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプト－エタノール）で平衡化したＧＥ ＨｉＴｒａｐ Ｑ ５ｍＬカラム（ＧＥ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に充填した。タンパク質を、ＩＥＸ緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β－メルカプト－エタノール）の勾配で溶出した。次いで、標的タンパク質を含有する画分を４回濃縮した後、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β－メルカプト－エタノール中で平衡化したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（Ｓ７５ １６／６０）に注入した。次いで、タンパク質を約１ｍｇ／ｍＬ（２０μＭに相当する）に濃縮し、２０％スクロースおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を添加した後、４℃または－８０℃で貯蔵した。

昆虫細胞におけるＶｙＡＥＰ／ＰＡＬのクローニング、組換え発現および精製
ｃＤＮＡを、Ｎ末端Ｈｉｓ６－ＴＥＶタグとインフレームにｐＦＢ－Ｓｅｃ－ＮＨ（Ａｍｐ^＋）ドナーベクターにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した（シュレスタ・ベットら（Ｓｈｒｅｓｔｈａ Ｂｅｔ ａｌ．）（２００８）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、２６９－２８９頁）。Ｘ－ｇａｌ青／白選択（３７℃、４８時間）後の白色コロニーを、Ｍ１３／ＦＢＡＣ２プライマーミックスを使用したコロニーＰＣＲおよび配列決定のために選抜した。ＱＩＡｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）の再懸濁、溶解および中和緩衝液を使用したバクミド生成、引き続いてイソプロパノール沈殿のために陽性コロニーを増幅させた。抽出したバクミドを、ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎおよびグレース昆虫培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ウイルスパッケージング用のＳｆ９（ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））昆虫細胞にトランスフェクトした。７２時間後、Ｐ０ウイルスを含有する上清を感染のために収穫した。３ラウンドのウイルスの感染および増幅後、２．５×１０^６細胞／ｍＬの濃度の１ＬのＳＦ９昆虫細胞を、２５ｍＬのＰ３ウイルスで感染させ、２７℃、１２０ｒｐｍで７２時間培養した。分泌タンパク質を含有する培地を、４０００ｇで２０分間の遠心分離によって回収した。次いで、上清のｐＨを７．５に設定した後、ＧＥ ｅｘｃｅｌ親和性精製カラム（ＧＥ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に注入した。結合後、緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｎａ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ β－メルカプト－エタノール）を使用してビーズを洗浄した。５００ｍＭイミダゾールを補充した緩衝液Ａを用いて標的タンパク質の溶出を達成し、タンパク質を含有する画分を１０回希釈し、上記のＩＥＸおよびＳＥＣ精製に供した。

酸誘導自己活性化
０．５間隔の４～７の範囲のｐＨ緩衝液、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液または５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡおよび５ｍＭ β－メルカプト－エタノールを含む）、４種の温度（４℃、１６℃、２５℃および３７℃）、時間（１５分間～１６時間）で、いくつかの界面活性剤添加剤（Ｔｗｅｅｎ－２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｎ－ラウロイルサルコシンおよびＢｒｉｊ３５、０．０５ｍＭ～１ｍＭの濃度）を使用した様々な条件下で活性化を実施した。活性化試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと活性試験（５０ｎＭプロ酵素に相当する量の活性化酵素溶液、２０μＭ ＧＮ１４－ＳＬ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡを３７℃で５分間インキュベーションし、引き続いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により生成物形成）の両方で分析した。これにより、最適活性化条件が、ｐＨ４．５（５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮａＣｌ）、４℃で１２～１６時間、０．５ｍＭ Ｎ－ラウロイルサルコシンを用いた酸性化であることを決定することが可能であった。その後、活性酵素を、ＳＥＣ緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β－メルカプト－エタノール、５％グリセロール、０．１Ｍ ＮａＣｌ）中ｐＨ４．０で前平衡化されたサイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓ１００ １６／６０）で精製した。標的タンパク質を含有する画分を溶出後にｐＨ５．０～６．５に中和し、さらに使用するまで、２０％スクロースを添加した後、４℃または－８０℃で貯蔵した。

自己活性化部位の決定
活性化酵素をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、活性タンパク質を含有するゲルバンド（３３～３５ｋＤａ周りに移動）をゲル内消化のために薄切片に切断した。ジスルフィド結合の還元およびアルキル化を、ｐＨ８．６の１Ｍトリス－ＨＣｌを含有する緩衝液中５ｍＭ ＤＴＴおよび１０ｍＭブロモエチルアミンを添加することによって、５５℃で３０分間加熱することによってワンポットで実施した。トリプシン消化を、ｐＨ７．８、３７℃で一晩、１０μｇ／ｍＬの量のトリプシン（Ｐｉｅｒｃｅ、ＭＳグレード、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施し、これにより主にＡｒｇ、ＬｙｓおよびＣｙｓ－エチレンアミンの後のペプチド結合切断が得られた。消化されたペプチドを、５０％アセトニトリル（０．１％ギ酸）でゲル片から抽出し、溶媒をＳｐｅｅｄｖａｃによって除去した。消化されたペプチドを１％ギ酸に再溶解し、前に記載されるように（ヘームー・エックスら（Ｈｅｍｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．）（２０１８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１８；１７１９：３７９－３９３；セラ・エーら（Ｓｅｒｒａ Ａ，ｅｔ ａｌ．）（２０１６）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６（１）：２３００５）、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ブレーメン、ドイツ）と連結したＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ブレーメン、ドイツ）でのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ配列決定に供した。高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を使用してペプチドを断片化した。トリプシン消化から得られたスペクトルを、１０ｐｐｍ ＭＳおよび０．０５Ｄａ ＭＳ／ＭＳ許容誤差を適用したＰＥＡＫＳ ｓｔｕｄｉｏ（バージョン７．５、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ワーテルロー、カナダ）を使用して分析した。ペプチドスペクトルの品質を手動で評価した。

種々のｐＨ値での酵素活性の特性評価
Ａ^{２８０ｎｍ}吸光度（ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定されるタンパク質濃度を有する精製された活性酵素を使用して酵素活性を調べた。４．５～８．０の範囲のｐＨ値を有する反応緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液または２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β－メルカプト－エタノールを含む）中に４０ｎＭ活性酵素、２０μＭ基質ＧＮ１４－ＳＬを含有する反応混合物を３７℃で１０分間インキュベーションし、１０倍体積の０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加してｐＨを２未満の値に減少させることによって反応をクエンチした。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析を使用して反応結果を予備的にチェックし、Ｃ４分析カラム（Ａｒｉｅｓ ｗｉｄｅｐｏｒｅ １５０×４．６ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）でのＲＰ－ＨＰＬＣによって反応生成物を定量化した。ピーク面積をＬＣソリューションポストラン分析ソフトウェア（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）で得た。

基質特異性および酵素速度論
ペプチドライブラリー１は、そのＸ_（ｎ）（ｎ＝０～４残基）がスミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）およびマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）種由来の天然シクロチド前駆体に由来する、合成ペプチドＧＮ１４－Ｘ_（ｎ）およびＧＤ１４－Ｘ_（ｎ）（ＧＮ１４＝配列番号４８）を含有する。ペプチドライブラリー２は２０個の合成ペプチドＧＮ１２－ＸＬ（ＧＮ１２＝ＧＬＹＲＲＧＲＬＹＲＲＮ；配列番号４７）を含有し、ペプチドライブラリー３は２０個の合成ペプチドＧＮ１２－ＧＸ（Ｘは２０個の天然アミノ酸のそれぞれ）を含有する。ＶｙＰＡＬ２媒介環化反応を、ｐＨ６．５、３７℃で１０分間、一定のモル比の活性酵素：基質（１：５００）を用いて実施し、反応を０．２％ＴＦＡでクエンチした。各基質を３連で試験し、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して定量的に分析した。

速度論試験のために、環化反応を、ｐＨ６．５、３７℃で、一定濃度の活性酵素（１０ｎＭ）および種々の濃度（２～２０μＭ）の基質ＧＮ１４－ＳＬＡＮ（配列番号４８＋ＳＬＡＮ）を用いて行った。環化生成物ｃＧＮ１４の収率を２０秒毎の間隔でＲＰ－ＨＰＬＣによって定量化し、各酵素の速度論パラメータ（ｋ_ｃａｔおよびＫ_Ｍ）を分析するために、初期速度Ｖ_０（μＭ／秒）を基質濃度［Ｓ］（μＭ）に対してプロットして、ミカエル－メンテン曲線を得た（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。

ＶｙＰＡＬ２の結晶化、データ収集および構造決定
濃度１０ｍｇ／ｍｌのＶｙＰＡＬ２を結晶化についてスクリーニングした。Ｘ線結晶構造解析に適した結晶は、２０％ＰＥＧ３３５０および０．２Ｍギ酸マグネシウム二水和物中で３～７日後に現れた。次いで、結晶をｃｒｙｏ－ｌｏｏｐにマウントし、液体窒素中で急速凍結した。回折データを、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ＳｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎにおいてＭＸ２ Ｂｅａｍｌｉｎｅで、１７３℃（１００Ｋ）で収集した。ＸＤＳソフトウェア（カブシュ・ダブリュー（Ｋａｂｓｃｈ Ｗ）（２０１０）Ｘｄｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｓｅｃｔ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６（２）：１２５－１３２）を使用してデータ処理を実施した。データ収集統計を以下の表Ｓ１に示す。ＯａＡＥＰ－Ｃ２４７Ａ（ＰＤＢアクセスコード：５Ｈ０Ｉ（ヤン・アールら（Ｙａｎｇ Ｒ，ｅｔ ａｌ．）（２０１７）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３９（１５）：５３５１－５３５８）モノマー構造を検索プローブとして使用して、分子置換法によって構造を解明した。プログラムＭｏｌｒｅｐ（ＣＣＰ４スイートのプログラムから）を使用して、非対称単位の２つの独立した分子を含有する明確なソリューションを得た。Ｂｕｓｔｅｒ／ＴＮＴ（ＧｌｏｂａＰｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄ）を使用して精密化を実施し、Ｃｏｏｔ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｐｈｉｃｓ（ＣＣＰ４）を使用してモデルの手動補正を実施した。ＰｙＭｏｌ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）を使用して構造分析および図の作成を実現した。精密化統計を表Ｓ１に提示する。

分子動力学（ＭＤ）シミュレーション
ＶｙＰＡＬ２に結合したモデル化ペプチド基質の平衡化位置を得るために、参考文献（シェクター・アイ（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ Ｉ）、バーガー・エイ（Ｂｅｒｇｅｒ Ａ）（１９６７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２７（２）：１５７－１６２）からモデル化された初期ＶｙＰＡＬ２－ペプチド複合体を、ＮＡＭＤ２．１２を使用した全原子、溶媒明示分子動力学シミュレーションに供した（フィリップス・ジェイシーら（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ ２６（１６）：１７８１－１８０２）。ＶｙＰＡＬ２の環化アスパラギン酸を通常のアスパラギン酸で置き換えた。複合体を水ボックス（ｗａｔｅｒ ｂｏｘ）でシミュレーションし、溶質とボックス境界との間の最小距離は３軸全てに沿って１０Åとした。溶媒和系の電荷を対イオンで中和し、溶媒のイオン強度を、ＶＭＤを使用して１５０ｍＭ ＮａＣｌに設定した（ハンフリー・ダブリュー（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ Ｗ）、ダールケ・エイ（Ｄａｌｋｅ Ａ）、シュルテン・ケイ（Ｓｃｈｕｌｔｅｎ Ｋ）（１９９６）Ｊ Ｍｏｌ Ｇｒａｐｈ １４（１）：３３－８、２７－８）。完全溶媒和系を１００００工程にわたってコンジュゲート－勾配最小化に供し、その後、５ｐｓの工程で３７℃（３１０Ｋ）に加熱した。系を、合計２０ｎｓの間、タンパク質リガーゼの骨格原子、ならびに制約されたペプチドのＮ３４３のＣα原子を用いて、Ｕ（ｘ）＝ｋ（ｘ－ｘ_ｒｅｆ）^２（式中、ｋは４１８４ｋｇ・ｍ^２・秒^－２ｍｏｌ^－１Å^－２（１ｋｃａｌ ｍｏｌ^－１Å^－２）であり、ｘ_ｒｅｆは初期原子座標である）の形態の調和ポテンシャルを使用してシミュレーションした。このような制約によって、ＶｙＰＡＬ２の側鎖およびペプチド基質の残りが自由に移動することが可能になる。タンパク質についてはＣＨＡＲＭＭ３６力場を仮定し（ベスト・アールビーら（Ｂｅｓｔ ＲＢ，ｅｔ ａｌ．）（２０１２）Ｊ Ｃｈｅｍ Ｔｈｅｏｒｙ Ｃｏｍｐｕｔ ８（９）：３２５７－３２７３）、水分子についてはＴＩＰ３Ｐモデルを仮定して、ＮＰＴアンサンブル下で全てのシミュレーションを実施した。

酵素、ビーズおよび基質
ブテラーゼ－１を、地元のハーブ園で栽培されたクリトリア・テルナテア（Ｃｌｉｔｏｒｉａ ｔｅｒｎａｔｅａ）の植物材料から抽出した。以前のプロトコル（グエンら（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２０１６、１１（１０）、１９７７－１９８８）に記載される数ラウンドのＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）でのサイズ排除および陰イオン交換クロマトグラフィー後、精製されたブテラーゼ－１を得て、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ β－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）および２０％スクロースを含有するｐＨ６．０緩衝液中、４℃または－８０℃で貯蔵した（ｓｔｏｒｅ）。前に記載されるように（ヘームーら（Ｈｅｍｕ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１９、１１６（２４）、１１７３７－１１７４６）、Ｎ末端ＧＰ６４シグナルペプチドによって支配される分泌経路を介して、Ｓｆ９昆虫細胞中でＢａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ（登録商標）バキュロウイルス系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して組換えＶｙＰＡＬ２を発現させた。発現したプレ酵素を、ＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのニッケル親和性結合、ＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのイオン交換クロマトグラフィー、およびＮＧＣ－ＦＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。酸誘導自己活性化を、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）および０．５ｍＭ Ｎ－ラウロイルサルコシンの存在下、ｐＨ４．５、４℃で一晩実施した。分子量約３５ｋＤａの活性化酵素を、ｐＨ４．０クエン酸緩衝液を用いてサイズ排除クロマトグラフィーによって再度精製した。精製した活性酵素を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ β－ＭＥおよび２０％スクロースを含有するｐＨ６．５緩衝液中、４℃または－８０℃で貯蔵した。

全てのビーズは商業的供給源からのものである。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＮＨＳ－活性化アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、１～２０ｍｇタンパク質／ｍＬのタンパク質負荷を有する。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、８ｍｇ超のビオチン化タンパク質／ｍＬのタンパク質負荷を有する。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）アガロースビーズ（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、１５～３０ｍｇのＣｏｎＡ／ｍＬのタンパク質負荷を有する。

ＫＮ１４－ＧＬ、ＧＮ１４－ＨＶ、ＧＮ１４－ＧＬ、ＧＮ１４－ＳＬＡＮ、ＳＴＦＩ（Ｄ／Ｎ）－ＨＶ、ＲＶ７およびＧＬＡＫ（ＦＡＭ）ＲＧ（ＦＡＭ、フルオレセインアミダイト）を含む、活性アッセイで使用される全てのペプチド基質は、前に記載されるプロトコル（ヘームー・エックス（Ｈｅｍｕ，Ｘ．）；チャン・エックス（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．）；タム・ジェイピー（Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．）、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１９）を使用して、Ｌｉｂｅｒｔｙ－１マイクロ波合成装置（ＣＥＭ）でＦｍｏｃ化学によって合成した。タンパク質基質ＡＳ－４８Ｋ（配列番号１９）も化学的に合成した。精製したＡＳ－４８Ｋを８Ｍ尿素に溶解し、透析による再折り畳みを受けさせた（ヘームーら（Ｈｅｍｕ ｅｔ ａｌ．）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｏｍｍ．２０１６、１３８（２２）、６９６８－７１）。タンパク質基質ＤＡＲＰｉｎ９＿２６－ＮＧＬを、Ｎ末端Ｈｉｓ６－ＴＥＶ－ＧＬＧＳＧ配列およびＣ末端ＧＳＧＳＮＧＬテール（配列番号４９）とｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターにクローニングした。組換え発現を、１６℃で０．１ｍＭ ＩＰＴＧによる２４時間の誘導後、Ｓｈｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で行った。可溶性タンパク質を細胞溶解物から抽出し、ＮＧＣ－ＦＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ ５ｍＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのＮｉ－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーおよびＨｉＴｒａｐ Ｑ ５ｍＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。

ＰＡＬの熱安定性
１μｇの酵素を、８×ＳＹＰＲＯ橙色蛍光色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、９６ウェルプレート中で５～８の範囲のｐＨの一連の緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ β－ＭＥ）を用いて最終体積２５μＬに希釈した。ｐＨ緩衝液。ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ Ａｓｓａｙを、温度を２５℃から８５℃まで増加させて、リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で行った。ＲＦＵ／℃の変化を温度に対してプロットすることによって、融解温度を計算した。

可溶性ＰＡＬおよび固定化ＰＡＬによって媒介される反応
そのＣｏｎＡ－反応緩衝液が追加の５ｍＭ ＣａＣｌ_２および５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有するＣｏｎＡ－Ｂｕ１を除いて、リン酸反応緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）を使用して、可溶性ＰＡＬまたは固定化ＰＡＬによる全ての反応を行った。反応ｐＨを６．５で維持して、酵素活性を最大化した。使用前に還元試薬ＤＴＴを新たに添加した。反応を、加熱することなく室温で実施して、還元酵素の分解を防いだ。反応混合物を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析または逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣによって分析した。

ＮＨＳ活性化アガロースビーズ上への固定化
酵素溶液を、冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて１０μＭの濃度に調製し、ＮＨＳ活性化アガロース乾燥樹脂（７５ｍｇは１ｍＬ溶液を要する）に添加し、調製物を４℃で３時間ゆっくり振盪した。次いで、混合物を冷スピンカラムに充填し、フロースルーを回収した。ビーズを、ビーズ体積の２倍の洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール、ｐＨ６．０または６．５）で洗浄し、結合および洗浄後にフロースルーを回収した。穏やかに振盪しながら、４℃で１時間、ビーズをクエンチ緩衝液（１Ｍトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に浸漬することによって、過剰なＮＨＳ基をブロッキングした。ビーズを反応緩衝液で再度洗浄し、引き続いて２０％エタノールを含むビーズ体積の２倍の反応緩衝液を添加し、スラリーを４℃で維持した。

ビオチン化およびＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎアガロースビーズ上への固定化
酵素溶液を５ｍＭ β－ＭＥを含有する冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて１０μＭの濃度に調製し、ＤＭＦ（ストック濃度１０ｍＭ）に溶解した２０倍モル当量のＥｚｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン（スクシンイミジル－６－（ビオチンアミド）ヘキサノエート、スペーサー長約２．２ｎｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合した。ビオチン化を４℃で一晩行った。Ｖｉｖａｓｐｉｎ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心分離濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ）を使用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）との緩衝液交換によって、過剰なＮＨＳ－ＬＣ－ビオチンを除去した。緩衝液交換後、ビオチン化酵素の活性を未処理酵素と比較したところ活性喪失を示さなかった。ＮＡアガロースビーズをｐＨ６．５反応緩衝液で平衡化した。０．２ｍＬの平衡化ビーズと１ｍＬのビオチン化酵素（５μＭ）の混合物を、４℃で３時間穏やかに振盪することによって調製し、引き続いて冷スピンカラムに充填し、フロースルーを回収した。ビーズをビーズ体積の２０倍の反応緩衝液で洗浄し、５ｍＭ β－ＭＥおよび２０％エタノールを含むビーズ体積の２倍の反応緩衝液の存在下、４℃でスラリーとして維持した。

コンカナバリンＡアガロースビーズ上への固定化
ＣｏｎＡビーズを、ビーズ体積の１０倍の冷平衡化緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．２、Ｍｇイオンをここで使用してＭｎイオンを置換した）で平衡化した（ヤング・エヌエム（Ｙｏｕｎｇ，Ｎ．Ｍ．）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ １９８３、１６１、２４７－２５０）。酵素溶液を、ＣｏｎＡ反応緩衝液を用いて５μＭの濃度に調製した。１ミリリットルの酵素溶液を、４℃で３時間ゆっくり振盪しながら、１ｍＬの平衡化ＣｏｎＡビーズと混合した。混合物を冷スピンカラムに充填し、フロースルーを回収した。ビーズを、ビーズ体積の２０倍のＣｏｎＡ反応緩衝液で洗浄し、２０％エタノールを含むビーズ体積の２倍のＣｏｎＡ反応緩衝液中、４℃でスラリーとして維持した。エタノールを用いてまたは用いないで貯蔵した固定化酵素の活性は有意な差異を示さなかった。

固定化収率の決定
２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光高度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、結合および洗浄後のフロースルー中の未結合タンパク質の濃度を決定した。洗浄後のフロースルーのために、遠心濾過器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用した濃縮工程を実施して、２８０ｎｍで０．００８の感度閾値を有する分光計によって読み取り可能なタンパク質濃度をもたらした。

固定化ＰＡＬの活性の決定
遊離ブテラーゼ－１（配列番号１８）およびＶｙＰＡＬ２（配列番号２）を、１～８μＭの範囲のストック濃度で調製した。各反応で、１μＬの酵素ストックを、最終酵素濃度が１０～８０ｎＭの範囲になるように、１００μＬの０．２ｍＭ ＫＮ１４－ＧＬに添加した。室温で５分間のインキュベーション後、０．５％ＴＦＡを添加してｐＨを２に下げることによって反応をクエンチし、全ての反応溶液を分析ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ａｒｉｅｓ－Ｃ１８、１５０×４．６ｍｍ、３ｕ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）に注入した。ｃＫＮ１４の量を、ＨＰＬＣプロファイルにおける２２０ｎｍでのピーク面積によって計算した。次いで、初期反応速度Ｖを、ｃＫＮ１４濃度／秒の増加によって計算した。酵素濃度に対する反応速度の標準曲線を各ＰＡＬについてプロットし、これは試験した系における遊離酵素の代謝回転速度を反映する。計算の容易さのために、酵素濃度および対応する反応速度の単位を、遊離酵素のストック濃度に基づいて、それぞれ（μＭ）および（μＭ／秒）として変換した。同じ実験設定で、１ｍＬ系において、１０μＬのビーズを使用して、固定化ＰＡＬの活性を調べた。１ｍＬの反応溶液のうちの１００μＬを、生成物定量化のためにＲＰ－ＨＰＬＣに注入した。各固定化ＰＡＬの反応速度も（μＭ／秒）に変換し、標準曲線と比較して、実際の有効濃度を計算した。可溶性ＰＡＬの速度に対する固定化ＰＡＬの速度によって活性比を計算した。

アクセッションコード。ブテラーゼ１のヌクレオチド配列は、アクセッション番号ＫＦ９１８３４５でＧｅｎＢａｎｋデータベースに保存されている。
実施例１：スミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）トランスクリプトームにおけるＡＥＰのマイニングおよび「ゲートキーパー」残基を使用した初期分類
スミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）は主なシクロチド産生植物科の１つであり、それらのゲノム中のＰＡＬの存在を示唆する。ＰＡＬを同定する希望を抱いて、この科の２種の植物、ノジスミレ（Ｖｉｏｌａ ｙｅｄｏｅｎｓｉｓ）（Ｖｙ）またはヴィオラ・カナデンシス（Ｖｉｏｌａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）（Ｖｃ）でのデータマイニングを実施した。

ノジスミレ（Ｖ．ｙｅｄｏｅｎｓｉｓ）のトランスクリプトームを得るために、全ＲＮＡを新鮮な果実から抽出し、配列決定し、引き続いてデータベース（ＮＣＢＩ ＳＲＡアクセッション番号ＰＲＪＮＡ４９４９７４）をアセンブリーした。ブテラーゼ１およびＯａＡＥＰ１ｂの前駆体配列を使用して、ＡＥＰと相同な配列を検索した。６種の完全配列、インタクトなコアドメインを含有する３種の部分配列および捨てられた不完全コアドメインを有する２種の切断配列を含む合計１１種のＡＥＰ前駆体がノジスミレ（Ｖ．ｙｅｄｏｅｎｓｉｓ）から見出された。Ｖｃのトランスクリプトームは１ＫＰデータベースで容易に入手可能であり、ブテラーゼ１配列を使用したＢＬＡＳＴｐによって、ＶｃＡＥＰと命名されたＡＥＰホモログ（ＮＪＬＦ－２００６００２）が得られた。９種のＶｙ配列およびＶｃＡＥＰをクラスター化するために、ゲートキーパー残基の性質を基準として使用することを選択した：ＯａＡＥＰ１ｂ（ＰＤＢアクセスコード：５Ｈ０Ｉ）の活性部位付近のＣｙｓ残基（Ｃｙｓ－２４７）のより大きなアミノ酸（Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）への変異によってライゲーション触媒効率が減少するが、Ａｌａなどのより小さい残基への変異によって、１００倍超改善されたライゲーション効率が得られることが以前観察された（ヤン・アールら（Ｙａｎｇ Ｒ，ｅｔ ａｌ．）（２０１７）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３９（１５）：５３５１－５３５８）。さらに、この「ゲートキーパー」残基のＧｌｙへの変異によって、増加した量の加水分解生成物が得られ、Ｓ２基質結合ポケットに位置する、この部位が、酵素機能の調節において重要な役割を果たすことを示唆している。ＮＣＢＩデータバンクで相同体について検索するためにブテラーゼ１アミノ酸配列を使用すると、９０％の配列包括度で、６０％を超える配列同一性を有する５００超のヒットを与えた。その中でも、プロテアーゼと「二重機能性」リガーゼの両方を含む、９５％超の配列が、ゲートキーパー部位にＧｌｙを保有し、ＰＡＬが植物ＡＥＰでまれであるという事実と一致していた。

この基準を使用して、４種のノジスミレ（Ｖ．ｙｅｄｏｅｎｓｉｓ）配列を、ゲートキーパーとしてのＧｌｙの存在により推定上のＶｙＡＥＰとして分類し、ＶｙＡＥＰ１～４（配列番号１０～１３）と指定した。他の５種の指定されたＶｙＰＡＬ１～５（配列番号５～９）ならびにＶ．カナデンシス（Ｖ．Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）由来のＶｃＡＥＰ（配列番号１４）を、ゲートキーパー残基としてＶａｌ（例えばブテラーゼ１）またはＩｌｅを含有するので、推定上のＶｙＰＡＬとして分類した。

実施例２：活性組換えＶｙＡＥＰおよびＶｙＰＡＬの生成
配列同一性に基づいて、これらの推定上のＡＥＰおよびＰＡＬを、４つのグループに分割することができた：ＶｙＡＥＰ１および２（９８．９％）、ＶｙＡＥＰ３および４（９６．２％）、ＶｙＰＡＬ１、２、４および５（９９％超）、ならびにＶｙＰＡＬ３。ＶｙＰＡＬ３のみが、他の推定上のＶｙＰＡＬと７０％未満のコア配列同一性を有するが、ＶｃＡＥＰと９４％同一である。ＶｙＡＥＰ１、ＶｙＰＡＬ１～３およびＶｃＡＥＰをさらなる試験のために発現させた。組換え発現を、細菌細胞系と昆虫細胞系の両方を使用して実施し、完全アミノ酸配列をコードする遺伝子を、親和性精製のために単一ペプチドをＨｉｓタグによって置換して、発現ベクターにクローニングした。金属親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（方法参照）後、細菌細胞系および昆虫細胞系は、それぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬおよび１０～２０ｍｇ／ｍＬの推定上のプロ酵素をもたらした。

精製後、プロ酵素を、０．５ｍＭ Ｎ－ラウロイルサルコシン、５ｍＭ β－メルカプトエタノールおよび１ｍＭ ＥＤＴＡの存在下、４℃、ｐＨ４．５で１２～１６時間の活性化に供した。このような穏やかであるが、長期の処理はキャップドメインの切断および分解を可能にし、キャップドメインの再ライゲーションを防ぐ。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、活性化酵素をさらに精製した。精製した活性ＶｙＰＡＬ２の自己活性化部位をトリプシン消化活性化形態のＬＣ－ＭＳ／ＭＳシーケンシングによって決定した。コアドメインの両端のＡｓｎ／Ａｓｐ切断部位は、Ｎ末端プロドメイン領域でＮ４３／Ｎ４６／Ｄ４８であり、リンカー領域でＤ３２０／Ｎ３３３であることが分かった。これにより、複数の部位でのタンパク質プロセシングを通した抑制性キャップドメインの完全な除去および活性形態を含有する混合物の生成が確認された。

実施例３：ＶｙＡＥＰ１およびＶｙＰＡＬ１～３のリガーゼ活性対プロテアーゼ活性
ＶｙＡＥＰ／ＰＡＬの活性を決定するために、１７３３ＤａのＭＷを有する「ＧＮ１４－ＳＬ」と呼ばれるモデルペプチド基質ＧＩＳＴＫＳＩＰＰＩＳＹＲＮＳＬ（配列番号５９）を調製した。ＧＮ１４－ＳＬは、Ｖｙシクロチドの前駆体に由来するＣ末端のトリペプチド認識モチーフ「ＮＳＬ」およびＳＦＴＩ－１のアナログを含有する（図１Ａ）。一定の酵素：基質モル比（１：５００）を全てのライゲーション反応で使用し、これらの反応を、４．５～８．０（０．５間隔）の範囲のｐＨ値で、３７℃で１０分間実施した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析を使用して、ＧＮ１４－ＳＬの環化を監視した。ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して、環状生成物ｃＧＮ１４（ＭＷ：１５１５Ｄａ）および直鎖生成物ＧＮ１４（ＭＷ：１５３３Ｄａ）の収率を定量化した（図１Ｂ）。

試験した４種のＰＡＬ酵素の中で、ＶｙＰＡＬ２が最良のリガーゼ活性を示したが、ｐＨ５．５～８．０でいずれの加水分解生成物も生成しなかった。６．５の最適ｐＨで、８０％を超える環化収率が観察された（図１Ｃ）。ＶｙＰＡＬ１もｐＨ６～８で純粋な環化をもたらし、７．０の最適ｐＨで、約８０％の環化収率が得られる。ＶｙＰＡＬ３は、ｐＨ４．５～５．５で支配的な加水分解活性を表示し、ｐＨ６．０～７．０で支配的なリガーゼ活性を表示した。１０分でわずか２０％の基質しか最適ｐＨ７．０で環化生成物に変換されなかったので、その触媒効率は、３種の推定上のＶｙＰＡＬの中で最低であった。期待されるように、推定上のプロテアーゼＶｙＡＥＰ１は、試験した４．５～８のｐＨ範囲で加水分解活性を表示したが、６．５～８の中性付近および塩基性ｐＨでは、環化が目立つようになった。４種の酵素全てが、５．０未満のｐＨでは様々な程度（２～４０％、図１Ｃ）のプロテアーゼ活性を表示し、酸誘導自己活性化に必要とされる固有のタンパク質分解活性を反映している。

次に、ペプチドライブラリーの３つのセット（図２）を使用して、ＶｙＰＡＬ２の基質特異性を試験した。効率的な環化は、Ｃ末端認識シグナルとして最低限３個の残基Ａｓｎ－Ｐ１’－Ｐ２’（シェクター（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ）およびバーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）命名法（４９）を使用）を要した。Ｐ１’では、小さいアミノ酸、特にＧｌｙおよびＳｅｒが好まれるが、Ｐｒｏは好まれない。Ｐ２’位は、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｐｈｅなどの疎水性または芳香族残基の存在を好む。ＶｙＰＡＬ２の触媒効率を、基質ＧＮ１４－ＳＬＡＮ

を使用して調べたところ、ｐＨ６．５、３７℃で実施した場合、２７４，３２５Ｍ^－１秒^－１（２７４，３２５Ｍ^－１ｓ^－１）が得られ、これはブテラーゼ１（９７１，９３６Ｍ^－１秒^－１）より３．５倍低かった（図３）。

実施例４：ＶｙＰＡＬ２の結晶構造
ここで同定されたＰＡＬとＡＥＰとの間の性質および効率における差異を担う分子機構を理解するために、２．４Åでの解像度でのＶｙＰＡＬ２プロ酵素の結晶構造を得た。予想通り、構造は、Ｎ末端の活性ドメイン（残基５１～３２０）およびＣ末端のキャップドメイン（残基３４４～４８３）でのプロレグマイン折り畳みを表す。これらの２つのドメインはフレキシブルリンカー（残基３２１～３４３）によって接続されている。非対称単位がＶｙＰＡＬ２の２つのモノマーを含有し、ホモダイマーを形成する。溶液中では、ゲル濾過結果から推測されるように、ＶｙＰＡＬのこのオリゴマー形態が高いタンパク質濃度（５ｍｇ／ｍＬ超）でのみ存在する。タンパク質を昆虫細胞で発現させたので、タンパク質の表面上のいくつかのアスパラギン残基は、Ａｓｎ１０２、Ａｓｎ１４５およびＡｓｎ２３７上でそれぞれ１～３個のＮ結合糖（１個のＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）、２個のＧｌｃＮａｃまたは２個のＧｌｃＮａｃおよび１個のフコース）でグリコシル化される。Ｃ１３サブファミリーのメンバーは、保存されたα－β－αサンドイッチ構造および十分に定義されたオキシアニオンホールに位置するＨｉｓ１７２－Ｃｙｓ２１４触媒二残基を有する。ペプチド結合切断はＣｙｓチオールによって触媒され、これがＮからＳへのアシルの移動を媒介してＡｓｎ－（Ｓ）－Ｃｙｓチオエステル中間体を与える。Ｈｉｓのイミダゾール環は一般的な塩基として作用して、触媒Ｃｙｓからプロトンを受容する。

構造はＯａＡＥＰ１ｂ（ＰＤＢコード：５Ｈ０Ｉ）、ＡｔＬＥＧγ（５ＮＩＪ、５ＯＢＴ）、ＨａＡＥＰ１（６ＡＺＴ）、またはブテラーゼ１（６ＤＨＩ）などの他のＰＡＬおよびＡＥＰと類似であり、原子配置の平均二乗偏差（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）が１．０Åである。さらに、活性ドメインのみを比較すると、ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．値が平均０．７Åの近くに戻り、コアドメイン構造が強力に保存されていることを示す。これはさらに、酵素特異性が、Ｓ－アシル中間体の安定性および触媒水分子のアクセス性に影響する基質結合ポケットの微妙な変動によることを示す。本プロ酵素形態では、ヘリックスα６（キャップドメインの第１のヘリックス）が、リンカーペプチドと約９０°の角度を作る。リンカー領域とα６ヘリックスとの間の接合点では、Ｇｌｎ３４３がオキシアニオンホール（またはＳ１ポケット）の内側に固定される。ＨａＡＥＰ１およびＡｔＬＥＧγの活性形態の最近の構造では、結合した基質または阻害剤が、リンカー領域と比較して約２．５Åの距離だけシフトしており、チオエステル結合を介して触媒システインに共有結合的に連結している。

実施例５：エネルギー最小化を使用した基質－酵素相互作用のモデル化
ＨａＡＥＰ１（ＰＤＢアクセスコード：５ＯＢＴ）とＡｔＬＥＧγ（６ＡＺＴ）の両方のリガンド結合活性形態の構造は、タンパク質の活性化およびキャップ放出後にごく小さいコンフォメーション変化が生じることを示した。そのため、ＶｙＰＡＬ２の本結晶構造を使用したＶｙＰＡＬ２リガーゼの活性形態をモデル化し、電子密度においてはっきりと見える残基Ｇｌｙ５２～Ａｓｎ３２６を含めた。これはまた、ＬＣ－ＭＳを使用して決定されたＶｙＰＡＬ２活性形態の境界、すなわちＮ４３／Ｎ４６／Ｄ４６およびＤ３２０／Ｎ３３３と一致する。ＶｙＰＡＬ２の活性形態に結合したペプチド基質の初期モデルを得るために、ＡｔＬＥＧγと配列ＮＨ_２－ＬＫＶＩＨ－ＮＳＬ－ＣＯＯＨ（配列番号５０）を有するペプチド阻害剤（ツァウナーら（Ｚａｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）（２０１８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９３（２３）：８９３４－８９４６）との間の複合体の構造を使用した。このペプチドのＮ末端配列は元のリンカーの配列に対応し、Ｃ末端ジペプチドは図２に提示される基質特異性試験に基づく。次いで、活性タンパク質のＣα原子のみを制約して、得られたペプチドとの複合体のエネルギー最小化を実施した。Ｐ１ Ａｓｎ残基のアルファ－炭素原子を、ＡｔＬＥＧγで見られる位置に固定し、アンカーとして使用してＳ１ポケット中に基質を維持した。２０ｎｓ間の系のＭＤ平衡化で、基質のＮ末端部分「ＬＫＶＩＨＮ」（配列番号５０の一部）が、ＶｙＰＡＬ２由来のＩ２４４と基質との間の反発によりシフトした。結果として、基質Ｐ３位のＩｌｅのアルファ－炭素原子が３Åだけ移動する。他方、Ｃ末端「ＳＬ」ジペプチドはより伸長し、ペプチドの基質結合ポケットへのより優れた適合につながる。モデル化基質についてのこのより安定なエネルギー的に好ましい位置を使用して、プロテアーゼ活性とリガーゼ活性の両方のための認識モチーフを定義するＳ１’およびＳ２’ポケットをマッピングした。モデル基質との界面を分析することによって、Ｓ４－Ｓ２’ポケットを裏打ちしている、ＶｙＰＡＬ２の活性形態の残基を定義した。Ｓ４の組成はＡｔＬＥＧγについての前の研究と一致し、カスパーゼ－１のｃ３４１ループに相当するジスルフィドクランプポリＰｒｏループ（ＰＰＬ）とＭＬＡ領域（カスパーゼ－１のｃ３８１ループに相当する）の両方からの残基を伴っていた。Ｓ１ポケットの反対側では、Ｓ１’ポケットがＨ１７２、Ｇ１７３およびＡ１７４のアミド基によって形成され、ペプチドのＰ１’およびＰ２’残基の骨格原子を収容する。Ｓ２’ポケットは、Ｙ１８５、ならびにＧ１７９およびＭ１８０の骨格原子によって裏打ちされ、Ｐ２’位の疎水性残基の結合を好む。ＭＤシミュレーションは、ペプチドの疎水性Ｌｅｕ側鎖とＹ１８５のフェノール環との間の相互作用が好まれることを示し、これは特異性試験で観察されたＰ２’のＩｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅについての選好と一致している（図２Ｃ）。

実施例６：Ｓ２およびＳ１’ポケットにおけるリガーゼ活性決定因子の同定
ＶｙＰＡＬ１～３は、ＰＡＬとして分類および確認されているが、環化／加水分解比と触媒効率の両方の点から種々のレベルのリガーゼ活性を表示した。よって、ＶｙＰＡＬ２の実験結晶構造を鋳型として使用して、ＶｙＰＡＬ１およびＶｙＰＡＬ３の構造をモデル化した。これらの３つのタンパク質の間の配列同一性を考えると、得られたモデルは正確である可能性が高い。ＶｙＰＡＬ１～３構造上の多型残基のマッピングは、Ｓ２およびＳ１’ポケットに位置する基質相互作用表面の変動を示す。１つの変動はＳ２の第１の残基にある：ＶｙＰＡＬ２とＶｙＰＡＬ３の両方に存在する芳香族の嵩高いＴｒｐの代わりにＶｙＰＡＬ１に存在するＬｅｕ２４３。同じ領域において、ＶｙＰＡＬ２の２４４位はＩｌｅまたはＶａｌのいずれかであり、局所的疎水性にわずかな変動を導入する。最後に、２４５位の残基の側鎖は、Ｓ１ポケットと反対の方向を向いており（ＶｙＰＡＬ１～３の骨格原子は完全に重複している）、この残基が触媒作用にわずかな影響しか与えないことを示唆している。しかしながら、Ｓ１ポケットの反対側では、より劇的な差異がＳ’１およびＳ’２の近くで観察される：ＶｙＰＡＬ１とＶｙＰＡＬ２の両方におけるＡｌａ１７４－Ｐｒｏ１７５が、ＶｙＰＡＬ３ではＴｙｒ１７５－Ａｌａ１７６によって置き換えられている。

実施例７：ＶｙＰＡＬ３およびＶｃＡＥＰのリガーゼ活性の選択的改善
これらの構造的知見を実験的に検証するために、ＶｙＰＡＬ３を最初に標的化した：Ｓ１’領域の「ＹＡ」ジペプチドを、ブテラーゼ１配列で見られるように「ＧＡ」に変異させた。期待されるように、このＹ１７５Ｇ点突然変異は、野生型ＶｙＰＡＬ３と比較すると、より低いｐＨ（４．５～６）で観察されるライゲーション活性の強力で選択的な増加をもたらした（図４）。加えて、触媒効率も有意に改善され、最大環化収率が２０％から８０％まで増加した（図４Ｃと図１Ｃを比較）。

リガーゼ活性の決定におけるＳ１’領域の重大な役割についての仮説をさらに検証するために、優勢にプロテアーゼ活性を有し、事実上リガーゼ活性が存在しないＶｃＡＥＰを標的化した（図５Ａ）。Ｓ１’領域における変異Ｙ１６８Ｐ１６９→Ａ１６８Ｐ１６９（ＶｙＰＡＬ３におけるＹ１７５Ａ１７６に相当する）を導入した。Ｙ１６８Ａ変異は、ＧＮ１４－ＳＬＤＩ基質に対する酵素活性のタイプと触媒効率の両方に影響を及ぼした（図５Ｂ）。野生型ＶｃＡＥＰとの反応を、酵素とＧＮ１４－ＳＬＤＩのモル比１：２００を使用して、５時間実施した。対照的に、ＶｃＡＥＰ－Ｙ１６８Ａについては、比は１：２０００とし、反応を３７℃で２分のインキュベーション後にクエンチした。中性ｐＨ付近で、ＶｃＡＥＰ－Ｙ１６８Ａは、６０％を超える基質をその環状形態に変換することができ、形成された加水分解生成物は５％未満であった（図５Ｂ）。

実施例８：活性ブテラーゼ－１およびＶｙＰＡＬ２の調製
植物から単離された天然活性化ブテラーゼ－１（グエンら（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１４、１０（９）、７３２－７３８）および活性化されるために酸誘導工程を要する昆虫細胞で発現されるＶｙＰＡＬ２酵素原（ヘームーら（Ｈｅｍｕ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１９、１１６（２４）、１１７３７－１１７４６）の２つの異なる供給源のＰＡＬを使用した。この試験で使用したブテラーゼ－１は、クリトリア・テルナテア（Ｃｌｉｔｏｒｉａ ｔｅｒｎａｅａ）の新鮮な植物組織から抽出し、前に記載されるように（グエンら（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２０１６、１１（１０）、１０７７－１９８８）、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製した。組換えＶｙＰＡＬ２を、昆虫細胞を使用した分泌経路（ヘームーら（Ｈｅｍｕ ｅｔ ａｌ．）、上記）で、バキュロウイルス発現系（シュレスタら（Ｓｈｒｅｓｔｈａ ｅｔ ａｌ．）Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、スターキー・エム（Ｓｔａｒｋｅｙ，Ｍ．）；エラスワラプ・アール（Ｅｌａｓｗａｒａｐｕ，Ｒ．）編 ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）：Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００８；２６９－２８９頁）によってプロ酵素形態で発現させた。ＶｙＰＡＬ２の活性化形態を、ｐＨ４．５での酸誘導自己活性化によって得て、ｐＨ４のクエン酸ナトリウム緩衝液を使用してサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ブテラーゼ－１と発現されたＶｙＰＡＬ２酵素原の両方がグリコシル化され、それらのグリコシル化形態は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて、計算されたタンパク質重量よりも大きな太いバンドとして現れる（データは示さない）。

実施例９：活性ＰＡＬの非共有結合的固定化
ブテラーゼ－１は、以前の試験に基づいて嵩高い異種グリカンによりＮ９４およびＮ２８６でグリコシル化され、約６ｋＤａの追加の質量の増加をもたらす。組換えＶｙＰＡＬ２は、小さいグリカンによりＮ１０２、Ｎ１４５およびＮ２３７でグリコシル化され、これにより、約３ｋＤａの追加の質量増加がもたらされる（データは示さない）。よって、レクチンビーズは明らかな第１選択であり、親和性付着を介してこれらの２つのグリコシル化ＰＡＬを固定化するための最も直接的な方法であった。ＣｏｎＡは、最も通例かつ広く使用される植物レクチンの１つである（サレームディン（Ｓａｌｅｅｍｕｄｄｉｎ）＆フセイン（Ｆｕｓａｉｎ） Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９１、１３（４）、２９０－２９５；リュディガー（Ｒｕｄｉｇｅｒ）＆ガビウス（Ｇａｂｉｕｓ） Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ） Ｊ．２００１、１８、５８９－６１３）。ＣｏｎＡ付着は可逆的であり、マンノシルおよびグルコシル単糖を含有する溶出緩衝液を使用した糖酵素の回収を可能にする（デュラニー（Ｄｕｌａｎｅｙ） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７８、２１（１）、４３－６３）（図１Ａ）。不溶性支持体については、大いに多孔質で、親水性で、安定で、化学修飾および物理修飾に対して不活性であり、その比較的大きな孔径が４０００ｋＤａ未満の化合物の自由な拡散を可能にするので、６％架橋アガロースビーズを使用した（ズッカら（Ｚｕｃｃａ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１６、２１（１１））。

１ｍｇの新たに調製したリガーゼとｐＨ６．５ ＣｏｎＡ反応緩衝液で前平衡化した１ｍＬのビーズを混合することによって、糖酵素とＣｏｎＡビーズの親和性結合を実施し、４℃で３時間穏やかに振盪した。１ｍｇ／ｍＬ（約２７μｍのリガーゼに相当する）の低い酵素負荷および穏やかな振盪によって、溶質の拡散を促進することができた。結合後、ビーズをＣｏｎＡ反応緩衝液で洗浄した。ＣｏｎＡ－ビーズ上に固定化されたブテラーゼ－１は、酵素の６１％が溶液中に残っていたので、３９％収率でＣｏｎＡ－Ｂｕ１ １を与えた。対照的に、ＣｏｎＡ結合ＶｙＰＡＬ２は、数ラウンドの洗浄直後に、ビーズから解離した。結果として、ＣｏｎＡ－Ｖｙ２ ２をその後の全ての実験で除外した。

ブテラーゼ－１およびＶｙＰＡＬ２に対するＣｏｎＡの親和性の観察される差異は、それらのグリコシル化形態に起因し得る。植物由来ブテラーゼ－１は、高い親和性でＣｏｎＡに結合する複雑な高マンノースＮ－グリカンを含有する（ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００２、１２（４）、５６９－５７７；シュトラッサー（Ｓｔｒａｓｓｅｒ） Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ２０１４、５、３６３）。対照的に、昆虫細胞によって発現されるＶｙＰＡＬ２は、低い親和性でＣｏｎＡに結合する単純なＮ－グリカンを含有する（シー（Ｓｈｉ）＆ジャーヴィス（Ｊａｒｖｉｓ）、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．２００７、８（１０）、１１１６－１１２５）。ＶｙＰＡＬ２の結晶構造において、確認されたグリカンは、三糖よりも大きくない。加えて、ＣｏｎＡ固定化ＰＡＬは、ＣｏｎＡに結合し、固定化ＰＡＬと交換し得る可溶性糖または糖タンパク質のいずれかを含有する反応を触媒するのに適していない。

比較のために、ビオチンとアビジンとの間の並外れた高い結合を活用することによって、第２の非共有結合的固定化を実験的に試験した。アビジン－ビオチン結合は、１０^－１５Ｍの範囲の解離定数を有し、実際には不可逆と考えられる。非特異的レクチン結合を排除するために、グリコシル化アビジンとしてアミン連結ビオチンの強力な親和性結合を保持する、アビジンの脱グリコシル化形態、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（ＮＡ）を使用した（図７Ｂ）。この方法は、ビオチンによるＰＡＬの第一級アミンの一部の修飾を要した。活性ブテラーゼ－１とＶｙＰＡＬ２の両方の配列が複数のＬｙｓ残基を含有し、これらは触媒部位の近くにも基質結合表面の近くにも位置しない。よって、Ｌｙｓ－ＮＨ_２を伴うＰＡＬの固定化は、ＰＡＬの触媒部位を妨げないと予想された。

リジン側鎖をビオチン化するために、スクシンイミジル－６－（ビオチンアミド）ヘキサノエート（ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン）を、活性ブテラーゼ－１およびＶｙＰＡＬ２のビオチン化に使用した。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ－エステル）のリガーゼ上の第一級アミンへのカップリング反応を、一般的に７．２～９．０の範囲のｐＨの塩基性条件で実施する。活性ＰＡＬは、これらが植物で生成されたものであるか、昆虫細胞で発現されたものであるかにかかわらず、塩基性条件であまり熱的に安定でないので、本発明者らはｐＨ７．４、４℃でビオチン化を実施して、リガーゼの分解を最小化した。ビオチン化酵素が活性喪失を示さないことが実験的に確認された。ビオチン化ブテラーゼ－１、Ｂｕ１（ｂ）、およびビオチン化ＶｙＰＡＬ２、Ｖｙ２（ｂ）とＮＡビーズの親和性結合を、ｐＨ６．５、４℃で３時間実施した。固定化後、ビーズを冷ｐＨ６．５反応緩衝液で洗浄した。この方法は４９％および４５％の固定化収率をもたらし、それぞれＮＡ－Ｂｕ１（ｂ） ３およびＮＡ－Ｖｙ２（ｂ） ４を与えた。

実施例１０：直接カップリングによる活性ＰＡＬの共有結合的固定化
共有結合アプローチは、不可逆的な安定な固定化を与える。本発明者らは、ＰＡＬのＮ末端またはＬｙｓ側鎖上の第一級アミンをＮＨＳエステルにカップリングすることによる十分に確立された共有結合的固定化法を選択した（図７Ｃ；アンダーソンら（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １９６４、８６（９）、１８３９－１８４２；クアトレカサス（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）＆パリーク（Ｐａｒｉｋｈ） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７２、１１（１２）、２２９１－２２９９）。前に記載されるＮＨＳ－ＬＣ－ビオチンによるリガーゼのビオチン化と同様に、ＮＨＳ活性化アガロースビーズ上への直接固定化をｐＨ７．４、４℃で一晩実施して、アガロース－Ｂｕ１ ５およびアガロース－Ｖｙ２ ６を得た。次いで、ビーズを冷ｐＨ６．５反応緩衝液で洗浄した。結果は、この方法が、活性ブテラーゼ－１およびＶｙＰＡＬ２をそれぞれ８３％および８１％の収率で直接固定化することを示した。

実施例１１：固定化ＰＡＬの活性
固定化ＰＡＬによって触媒される初期反応速度をその可溶性対応物によって触媒される速度と比較することによって、固定化ＰＡＬの活性を決定した。Ｃ末端ＰＡＬ認識シグナルトリペプチドＮＧＬを有する天然システインリッチペプチドブレオゲン（ｂｌｅｏｇｅｎ）ｐＢ１^４４に由来する配列である、モデルペプチド基質ＫＮ１４－ＧＬ（ＫＬＧＴＳＰＧＲＬＲＹＡＧＮ－ＧＬ；配列番号５１）７を大環状化して、末端と末端をつないだ環状生成物ｃＫＮ１４ ８を得ることによって、遊離ブテラーゼ－１またはＶｙＰＡＬ２のリガーゼ活性を測定した（図８）。本発明者らは、基質濃度０．２ｍＭがブテラーゼ－１およびＶｙＰＡＬ２の既知のミカエリス定数Ｋ_Ｍよりもはるかに高いので、この濃度を使用して反応速度を最大化した。５分後に反応をクエンチし、各反応で生成されたｃＫＮ１４の量をＲＰ－ＨＰＬＣによって測定した。遊離酵素の濃度に対する反応速度の標準曲線をプロットして、代謝回転速度を計算した（図９）。固定化ＰＡＬの測定された反応速度を標準曲線に内挿することによって、固定化ＰＡＬの有効濃度を決定した。

表２は、ＣｏｎＡ－Ｂｕ１ １ならびにＮＡ連結ビオチン化酵素ＮＡ－Ｂｕ１（ｂ） ３およびＮＡ－Ｖｙ２（ｂ） ４の非共有結合付着が、それぞれその可溶性酵素の５０％および２０～３０％の活性を保持したことを示す結果を要約する。アガロース－Ｂｕ１ ５およびアガロース－Ｖｙ２ ６の共有結合付着は、その可溶性酵素の約５％の活性を保持した。アガロース－Ｂｕ１およびアガロース－Ｖｙ２においてのみ約１ｎｍであると計算されたテトラノイック（ｔｅｔｒａｎｏｉｃ）スペーサーを介したアガロースビーズへの直接付着は多分短すぎる（図７）。対照的に、ＣｏｎＡ－Ｂｕ１は８ｎｍより長いスペーサーを有し（ＣｏｎＡテトラマー＋グリカン）（ベッカーら（Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ １９７５、２５０（４）、１５１３－１５２４）、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ固定化ＮＡ連結ビオチン化酵素はおよそ８ｎｍ長のスペーサーを有する（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎテトラマー＋ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン）（リブナーら（Ｌｉｖｎａｈ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９３、９０、５０７６－５０８０）。固定化ＰＡＬの活性と、酵素と固体支持体との間の距離との間の相関は、より短いスペーサーが酵素の可動性および基質のアクセス性を減少させ得ることを示唆した。直接付着法を介した固定化酵素の活性を改善するためには、より長いスペーサーを活用する必要がある。

実施例１２：固定化ＰＡＬは高い動作安定性および長期貯蔵安定性を表す
ＰＡＬの固相固定化は、自己凝集および自己タンパク質分解を最小化し、今度は安定性を増強するであろう。動作安定性および再使用可能性を示すために、各固定化ＰＡＬを１００回再使用し、直鎖ペプチドＫＮ１４－ＧＬ ７の環化におけるそれらの有効性を分析した。各実行で、同じバッチの固定化ＰＡＬアガロースビーズを使用し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣを使用して反応混合物を分析した（図１０Ａ）。図１０Ｂは５種の固定化ＰＡＬの生成物分析を要約しており、これらのうちの全てが、１００回実行後に９０％超の触媒活性が保持されることを示した。

４℃で貯蔵した固定化ＰＡＬの長期貯蔵寿命を示すために、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって、ペプチド基質ＧＮ１４－ＨＶ（配列番号５２；ＧＩＳＴＫＳＩＰＰＩＳＹＲＮ－ＨＶ、９）またはＧＮ１４－ＳＬＡＮ（配列番号５３；ＧＩＳＴＫＳＩＰＰＩＳＹＲＮ－ＳＬＡＮ、１０）を環化してｃＧＮ１４ １１をもたらすことにおいて、リガーゼ活性を２ヶ月の期間にわたって毎週監視した。図１１は、固定化ＰＡＬが、長期貯蔵においてそれらの可溶性対応物よりも安定であることを示す。５種全ての固定化ＰＡＬが、９週間後に９０％超の活性を保持した。対照的に、ブテラーゼ－１またはＶｙＰＡＬ２は、同じ貯蔵条件下で２ヶ月の貯蔵後に約３０％の活性を喪失した。

トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはβ－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）などの還元剤の添加が、活性ＰＡＬの触媒Ｃｙｓを還元形態に維持するのに重大であることが分かった。非還元緩衝液中で貯蔵した可溶性ＰＡＬと固定化ＰＡＬの両方が、触媒システイニルスルフヒドリルの酸化により、２週間で活性を喪失した。いったんスルフヒドリルが酸化されて不活性化につながると、必ずしもそうではないが、時々、１種または複数の還元試薬を含有する緩衝液による処理後に、リガーゼ活性を回復することができる。固定化ブテラーゼ－１が固定化ＶｙＰＡＬ２よりもわずかに安定であることも観察され、植物由来ＰＡＬが、タンパク質分解からの分子安定性を増強するより高レベルのグリコシル化から利益を得ることができることを示唆している。

実施例１３：ライゲーション反応のための固定化ＰＡＬの適用
固定化ＰＡＬの再使用可能性は、それらの可溶性対応物よりもはるかに高い酵素濃度を使用して、触媒ライゲーション反応を加速させることを可能にする。以下の５つの例で、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ固定化ＮＡ－Ｂｕ１（ｂ） ３およびＮＡ－Ｖｙ２（ｂ） ４を使用して、環化およびライゲーションに関する固定化ＰＡＬのこの利点、ならびに連続フロー系におけるそれらの使用を披露した。

第１の例は、Ｐ２位に立体障害Ｐｒｏを含有するＳＦＴＩ基質の環化反応であり、これは同じＰ２位を占めるあまり障害性でないアミノ酸を含む基質よりも遅いライゲーション反応を引き起こす。図１２Ａは、１４残基ジスルフィド含有ペプチドＳＦＴＩアナログ、ＧＲＣＴＫＳＩＰＰＩＣＦＰＮ－ＨＶ １２（配列番号５４）のブテラーゼ－１媒介環化が、３０分後に５０％完了して、環状ＳＦＴＩ １３をもたらすことを示す。対照的に、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ固定化ブテラーゼ－１ ＮＡ－Ｂｕ１（ｂ） ３の有効濃度を５倍増加させると、環化ライゲーションを加速し、１０分以内に完了した。

第２の例では、可溶性ブテラーゼ１およびＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ固定化ブテラーゼ１を、７０残基タンパク質、環状バクテリオシンＡＳ－４８の環化について比較した。この環状バクテリオシンは、広いスペクトルの微生物を殺傷する能力のために大いに人気がある、乳酸菌によって生成される食品保存剤である。ＡＳ－４８は、２番目に大きな既知の天然のヘッドトゥーテールの大環状である。遊離ブテラーゼ－１を使用して、ブテラーゼ－１認識のためのＮ末端ジペプチドおよびＣ末端ヘキサペプチド配列を含有する折り畳まれたＡＳ－４８Ｋ １４（配列番号１９）を環化した。３７℃で酵素：基質比１：１００を使用すると、反応が１時間で完了したが、ＮＡ－Ｂｕ１（ｂ）の有効濃度を遊離ブテラーゼ－１の５倍増加させると、環化の完了を加速して１０分にし、環状ＡＳ－４８ １５の単離収率が８３％となった（図１２Ｂ）。

第３の例は、ペプチドのＰＡＬ媒介シクロオリゴマー化であった。この反応は、オリゴマー化と、新生オリゴマーのヘッドトゥーテールの環化の両方を伴う。このアプローチを使用して、単純なペプチジルモノマーを構築ブロックとして使用した生理活性シクロオリゴマーペプチドの形成を実証した。酵素：基質比１：１００でＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ固定化ブテラーゼＮＡ－Ｂｕ１（ｂ）を使用したＲＶ７（ＲＬＹＲＮＨＶ、１６；配列番号５５）のシクロオリゴマー化は４０分以内に完了して、ＲＬＹＲＮの８３％のシクロダイマーｃ１７および８％のシクロトリマーｃ１８をもたらした（図１３）。対照的に、可溶性形態の有効濃度が固定化形態より５倍低い、酵素：基質比１：５００でブテラーゼ－１を使用した反応は、４時間後に完了しなかった（データは示さない）。

最後の２つの例では、ＰＡＬ媒介分子内ライゲーションを連続フロー系で使用した。高い有効濃度の利点を有する環化反応とは異なり、分子内ライゲーションは、高濃度の基質と酵素の両方を要し、よって、固定化ＰＡＬを高濃度で再使用して、この制限を克服することができる。ＮＡ－Ｖｙ２（ｂ） ４ビーズを含むセルフパックカラム（内径４ｍｍ）を使用して、０．０５～０．５ｍＬ／分の異なる流量下、合成蛍光ペプチドＧＬＡＫ（ＦＡＭ）ＲＧ ２０（１００μＭ；配列番号５７）を用いてＡｃ－ＲＹＡＮＧＩ １９（１０μＭ；配列番号５６）のペプチドライゲーションを実施した（図１４Ａ）。０．０５ｍＬ／分の流量で、本発明者らは、ライゲーション反応が完了してＡｃ－ＲＹＡＮＧＬＡＫ（ＦＡＭ）ＲＧ ２１（配列番号５８）をもたらすことを観察した。最後に、本発明者らは、ＮＡ－Ｖｙ２（ｂ）のこの充填床カラムを使用して、ＧＬＡＫ（ＦＡＭ）ＲＧ ２０で１９３残基組換えタンパク質、抗Ｈｅｒ２ ＤＡＲＰｉｎ９＿２６－ＮＧＬ２２（配列番号４９）を標識した。１μＭ ＤＡＲＰｉｎ９＿２６－ＮＧＬおよび５μＭ ＧＬＡＫ（ＦＡＭ）ＲＧを含有する反応は、２０μＬ／分の流量で７８％収率のＤＡＲＰｉｎ９＿２６－ＮＧＬＡＫ（ＦＡＭ）ＲＧ ２３を与えた（図１４Ｂ）。未反応ペプチドは、透析または分子量カットオフ３ｋＤａ超の遠心濾過器によってライゲーション生成物から容易に除去した。

Claims (35)

1. タンパク質リガーゼ活性、好ましくはシクラーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、
   （ｖ）配列番号１（ＶｙＰＡＬ２）に記載のアミノ酸配列；
   （ｖｉ）配列番号１に記載の前記アミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
   （ｖｉｉ）配列番号１に記載の前記アミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列；または
   （ｖｉｉｉ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つの断片
   を含むか、またはからなる、単離ポリペプチド。
2. （ｉ）配列番号２（ＶｙＰＡＬ２＋Ｎ末端＋Ｃａｐ残部）または配列番号３（ＶｙＰＡＬ２プロ酵素）に記載のアミノ酸配列；
   （ｉｉ）配列番号２または３に記載の前記アミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
   （ｉｉｉ）配列番号２または３に記載の前記アミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列；または
   （ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つの断片
   を含むか、またはからなる、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
3. （ｉ）配列番号１の１９位に対応する位置にアミノ酸残基Ｎ；および／または
   （ｉｉ）配列番号１の１２４位に対応する位置にアミノ酸残基Ｈ；および／または
   （ｉｉｉ）配列番号１の１６６位に対応する位置にアミノ酸残基Ｃ
   を含む、請求項１または２に記載の単離ポリペプチド。
4. （ｉ）配列番号１の１２６位に対応する位置にアミノ酸残基Ａ、および任意選択で、配列番号１の１２７位に対応する位置にアミノ酸残基ＡまたはＰ、好ましくはＰ（ＬＡＤ２）；および／または
   （ｉｉ）配列番号１の１２６位に対応する位置にアミノ酸残基Ｇおよび配列番号１の１２７位に対応する位置にアミノ酸Ａ（ＬＡＤ２）；
   （ｉｉｉ）配列番号１の１９５位に対応する位置にアミノ酸残基ＷまたはＹ、配列番号１の１９６位に対応する位置にアミノ酸残基ＩまたはＶ、および配列番号１の１９７位に対応する位置にアミノ酸残基Ｔ、ＡまたはＶ（ＬＡＤ１）；
   （ｉｖ）配列番号１の２１位に対応する位置にアミノ酸残基Ｒ、配列番号１の２２位に対応する位置にアミノ酸残基Ｈ、配列番号１の１２３位に対応する位置にアミノ酸残基Ｄ、配列番号１の１６４位に対応する位置にアミノ酸残基Ｅ、配列番号１の１９４位に対応する位置にアミノ酸残基Ｓ、配列番号１の２１５位に対応する位置にアミノ酸残基Ｄ（Ｓ１ポケット）；および／または
   （ｖ）配列番号１の１９９位および２１２位に対応する位置にアミノ酸残基Ｃ（ジスルフィド架橋）
   を含む、請求項１または２に記載の単離ポリペプチド。
5. ｐＨ５．０以下、好ましくは４．０以下での酸処理によって活性化され得る、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
6. （ｉ）好ましくはｐＨ５．５以上で、６０％以上、好ましくは８０％以上の効率で所与のペプチドを環化することができる；および／または
   （ｉｉ）好ましくはｐＨ５．５以上で、２０％以下、好ましくは５％以下の効率で所与のペプチドを加水分解することができる、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
7. グリコシル化されている、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
8. 請求項１～６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
9. ベクターに含まれる、請求項８に記載の核酸分子。
10. 前記ベクターが、前記核酸分子の発現を制御するための調節エレメントをさらに含む、請求項９に記載の核酸分子。
11. 好ましくは昆虫細胞、より好ましくはＳｆ９細胞である、請求項８～１０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
12. 請求項１～６のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成する方法であって、請求項１１に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する工程と、前記ポリペプチドを前記宿主細胞または培養培地から単離する工程とを備える、方法。
13. 少なくとも２つのペプチドをライゲーションするか、またはペプチドを環化するための、リガーゼまたはシクラーゼ活性を有するポリペプチドの使用であって、前記シクラーゼ活性を有するポリペプチドが、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドである、使用。
14. 前記環化されるペプチドまたは前記ライゲーションされるペプチドの少なくとも１つが、
    （ｉ）好ましくはＣ末端のアミノ酸配列（Ｘ）_ｏＮ／Ｄ（Ｘ）_ｐ（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｏおよびｐは互いに独立に、少なくとも２の整数である）、好ましくはアミノ酸配列（Ｘ）_ｏＮＸ^３Ｘ^４（Ｘ）_ｒ（式中、Ｘ^３はＰを除く任意のアミノ酸、好ましくはＨ、ＧまたはＳであり、Ｘ^４は、好ましくはＬ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｃ、Ｗ、ＹおよびＭから選択される、疎水性または芳香族アミノ酸であり、ｒは０または１以上の整数である）；または
    （ｉｉ）Ｃ末端アミノ酸配列（Ｘ）_ｏＮ^＊／Ｄ^＊（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｏは少なくとも２の整数であり、Ｃ末端Ｎ／Ｄ残基は、Ｃ末端カルボキシ基、好ましくはＤの場合はα－カルボキシ基が、式－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ’）_２（Ｒ’は任意の残基である）のアミド基によって置き換えられているという点で、アミド化されている）
    を含む、請求項１３に記載の使用。
15. 前記環化されるペプチドまたは前記ライゲーションされるペプチドの少なくとも１つが、Ｎ末端アミノ酸配列Ｘ^１Ｘ^２（Ｘ）_ｑ（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得；Ｘ^１はＰを除く任意のアミノ酸であり得；Ｘ^２は任意のアミノ酸であり得るが、好ましくは疎水性アミノ酸、より好ましくはＶ、ＩまたはＬであり；ｑは０または１以上の整数である）を含む、請求項１３または１４に記載の使用。
16. 前記環化されるペプチドが、環状システインノットポリペプチド、環状ペプチド毒素、環状抗菌ペプチド、環状ヒスタチン、またはヒトもしくは動物環状ペプチドホルモンの直鎖前駆体形態である、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の使用。
17. （ｉ）前記環化されるペプチドが１０アミノ酸長以上であるか；または
    （ｉｉ）前記ライゲーションされるペプチドの少なくとも１つが２５アミノ酸長以上、好ましくは５０アミノ酸長以上である、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の使用。
18. 前記環化されるペプチドが、
    （ｉ）配列番号１９および２１～４２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；または
    （ｉｉ）アミノ酸配列（Ｘ）_ｎＣ（Ｘ）_ｎＣ（Ｘ）_ｎＣ（Ｘ）_ｎＣ（Ｘ）_ｎＣ（Ｘ）_ｎＣ（Ｘ）_ｎＮＨＶ（Ｘ）_ｎ（式中、各ｎは１～６から独立して選択される整数であり、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）
    を含むか、またはからなる、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の使用。
19. 前記ライゲーションされるペプチドの少なくとも１つが、検出可能なマーカー、好ましくは蛍光マーカーまたはビオチンを含む、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の使用。
20. ペプチドを環化する方法であって、ペプチドを、前記ペプチドの環化を可能にする条件下で、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドとインキュベーションする工程を備える、方法。
21. 少なくとも２つのペプチドをライゲーションする方法であって、少なくとも２つのペプチドを、前記ペプチドのライゲーションを可能にする条件下で、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドとインキュベーションする工程を備える、方法。
22. 前記環化されるペプチドまたは少なくとも１つのライゲーションされるペプチドが、
    （ｉ）好ましくはＣ末端のアミノ酸配列（Ｘ）_ｏＮ／Ｄ（Ｘ）_ｐ（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｏおよびｐは互いに独立に、少なくとも２の整数である）、好ましくはアミノ酸配列（Ｘ）_ｏＮＸ^３Ｘ^４（Ｘ）_ｒ（式中、Ｘ^３はＰを除く任意のアミノ酸、好ましくはＨ、ＧまたはＳであり、Ｘ^４は、好ましくはＬ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｃ、Ｗ、ＹおよびＭから選択される、疎水性または芳香族アミノ酸であり、ｒは０または１以上の整数である）；または
    （ｉｉ）Ｃ末端アミノ酸配列（Ｘ）_ｏＮ^＊／Ｄ^＊（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｏは少なくとも２の整数であり、Ｃ末端Ｎ／Ｄ残基は、Ｃ末端カルボキシ基、好ましくはＤの場合はα－カルボキシ基が、式－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ’）_２（Ｒ’は任意の残基である）のアミド基によって置き換えられているという点で、アミド化されている）
    を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 前記環化されるペプチドまたは前記少なくとも１つのライゲーションされるペプチドが、アミノ酸配列Ｎ／Ｄ（Ｘ）_ｐ、好ましくはアミノ酸配列（Ｘ）_ｏＮＸ^３Ｘ^４（Ｘ）_ｒ（式中、Ｘ^３はＰを除く任意のアミノ酸、好ましくはＨ、ＧまたはＳであり、Ｘ^４は、好ましくはＬ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｃ、Ｗ、ＹおよびＭから選択される、疎水性または芳香族アミノ酸であり、ｒは０または１以上の整数である）とＮ末端融合した目的のペプチドの融合ペプチドである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記環化されるペプチドまたは少なくとも１つのライゲーションされるペプチドが、Ｎ末端アミノ酸配列Ｘ^１Ｘ^２（Ｘ）_ｑ（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得；Ｘ^１はＰを除く任意のアミノ酸であり得；Ｘ^２は任意のアミノ酸であり得るが、好ましくは疎水性アミノ酸、より好ましくはＶ、ＩまたはＬであり；ｑは０または１以上の整数である）を含む、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. リガーゼまたはシクラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが固体支持体上に固定化される、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の使用または請求項２０～２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記固定化が、前記固体支持体への非共有結合または共有結合による、請求項２５に記載の使用または方法。
27. （ｉ）リガーゼまたはシクラーゼ活性を有する前記ポリペプチドがグリコシル化され、前記固定化が、前記固体支持体に共有結合的に連結された、炭水化物結合部分、好ましくはコンカナバリンＡ部分またはそのバリアントとの相互作用によって促進されるか；
    （ｉｉ）リガーゼまたはシクラーゼ活性を有する前記ポリペプチドがビオチン化され、前記固定化が、前記固体支持体に共有結合的に連結された、ビオチン結合部分、好ましくはストレプトアビジン、アビジンもしくはニュートラアビジンまたはそのバリアントとの相互作用によって促進されるか；または
    （ｉｉｉ）リガーゼまたはシクラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、前記固体支持体の表面上のＮ－ヒドロキシスクシンイミド官能基との反応によって前記固体支持体上に固定化される、請求項２６に記載の使用または方法。
28. 固体支持体材料であって、前記固体支持体材料上に固定化された請求項１～６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドを含む固体支持体材料。
29. ポリマー樹脂、好ましくは微粒子形態のポリマー樹脂、例えばアガロースを含む、請求項２８に記載の固体支持体材料。
30. 前記単離ポリペプチドが、共有結合または非共有結合相互作用によって固体支持体材料上に固定化される、請求項２８または２９に記載の固体支持体材料。
31. クロマトグラフィーカラム用の微粒子樹脂材料である、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の固体支持体材料。
32. （ｉ）リガーゼまたはシクラーゼ活性を有する前記ポリペプチドがグリコシル化され、前記固定化が、前記固体支持体に共有結合的に連結された、炭水化物結合部分、好ましくはコンカナバリンＡ部分またはそのバリアントとの相互作用によって促進されるか；
    （ｉｉ）リガーゼまたはシクラーゼ活性を有する前記ポリペプチドがビオチン化され、前記固定化が、前記固体支持体に共有結合的に連結された、ビオチン結合部分、好ましくはストレプトアビジン、アビジンもしくはニュートラアビジンまたはそのバリアントとの相互作用によって促進されるか；または
    （ｉｉｉ）リガーゼまたはシクラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、前記固体支持体の表面上のＮ－ヒドロキシスクシンイミド官能基との反応によって前記固体支持体上に固定化される、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の固体支持体材料。
33. アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）活性を有するポリペプチドのタンパク質リガーゼ活性を増加させる方法であって、配列番号１の１２６位に対応する位置のアミノ酸残基を小さい疎水性残基またはＧ残基のいずれか、好ましくはＡまたはＧ残基で置換する工程を備える、方法。
34. タンパク質リガーゼ活性を有するポリペプチドを生成する方法であって、
    （ｉｉｉ）アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）活性を有するポリペプチドを提供する工程と；
    （ｉｖ）１つまたは複数のアミノ酸置換を前記アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）活性を有するポリペプチドに導入する工程であって、前記置換は、配列番号１の１２６／１２７位に対応する位置のアミノ酸配列がＧＡ、ＡＡまたはＡＰ、好ましくはＧＡまたはＡＰのいずれかとなるように、配列番号１の１２６位に対応する位置のアミノ酸残基をＡまたはＧのいずれかの残基で置換すること、および任意選択で配列番号１の１２７位に対応する位置のアミノ酸残基をＰまたはＡのいずれかの残基で置換することを含む、工程と
    を備える、方法。
35. 前記アスパラギニルエンドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドが、
    （ｉ）その全長にわたって配列番号１０～１４（ＶｙＡＥＰ１～４；ＶｃＡＥＰ）のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列；および／または
    （ｉｉ）ＧでもＡでもない配列番号１の１２６位に対応する位置のアミノ酸残基
    を含む、請求項３３または３４に記載の方法。

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