JP2022531941A - タンパク質が凝集したセルロースナノクリスタルを含む微小粒子およびその化粧品用途 - Google Patents

Abstract

タンパク質性セルロース微小粒子が提供される。これらの微小粒子は、セルロースナノクリスタルおよび１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物を含み、ナノクリスタルならびにペプチドおよび／またはタンパク質が一緒に凝集して、微小粒子を形成する。実施形態では、微小粒子は、シルクフィブロインを含み、有利に疎水性および親油性である。これらの微小粒子を含む化粧品用調製物もまた提供される。有利な実施形態では、これらの化粧品用調製物は、油中水型エマルションまたは親油性媒体を含む。最後に、微小粒子の生成方法もまた提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月１０日に出願された米国仮出願第６２／８４６，２８１号の米国法典第３５巻第１１９条（ｅ）項に基づく利益を主張する。

本発明は、タンパク質性セルロース微小粒子に関する。より具体的には、本発明は、タンパク質およびセルロースナノクリスタルを含み、疎水性であり、油取り込みが増加し、および／または皮膚感触が改善された微小粒子に関する。

マイクロビーズ
微小粒子は、薬物送達、化粧品、およびスキンケアで、蛍光イムノアッセイで、バイオテクノロジーにおけるマイクロキャリアとして、粘度調整剤、クロマトグラフィーにおける静止相として、および研磨剤として重要な役割を果たす。これらの分野では、他の分野と同様に、微小粒子はしばしば「マイクロビーズ」と称される。

化粧品およびパーソナルケア産業は、マイクロビーズを利用して、配合物中の官能特性を強化し、皮膚に保護または改善を提供する。化粧品およびスキンケアにおいて、マイクロビーズは、これらに限定されないが、増粘剤、充填剤、増量剤、色分散剤、剥離剤、改良された生成物ブレンド、改善された皮膚感触、皮膚科学的利点、ソフトフォーカス（ぼかしとしても知られる）、製品の滑り性、油取り込み、および乾燥結合などの様々な消費者に認識される利益を付与するために使用される。ソフトフォーカスまたはぼかしは、光を散乱するそれらの能力に起因するマイクロビーズの特性である。油取り込みは、マイクロビーズが皮脂を吸収して皮膚を形成する能力を指す。この特性により、化粧品フォーミュレーターは、より自然な外観が何時間もの使用の期間に及ぶように、化粧にマット効果を与える製品を設計することが可能である。

一般に、マイクロビーズは、プラスチック、ガラス、金属酸化物、および天然発生型ポリマー、例えば、デンプンおよびセルロースを含むタンパク質および多糖類などから生成することができる。化粧品産業では、マイクロビーズは従来、プラスチックから作製されている。

プラスチックから作製されたマイクロビーズは、食物連鎖に沿った損傷を含む環境への害を引き起こすという説得力のある証拠がある。個人の健康および環境の健康に関する消費者の懸念の増加は、オーガニック／ナチュラルパーソナルケア製品の成長を刺激してきた。社会的なライフスタイルの変化に沿った伝統的な製品の効果的なオーガニック／ナチュラルな代わりのものは、「グリーン」パーソナルケア製品だけでなく、インク、顔料、コーティング、複合材、および塗料の増粘剤の持続可能な成分もまた広く採用するための重要な動機である。持続可能性については、再生可能資源を使用してマイクロビーズを作製する「グリーンケミストリー」および「グリーンエンジニアリング」方法を使用することが望ましい。再生可能資源を使用して、劣化するように設計されたマイクロビーズを作製する「グリーンケミストリー」および「グリーンエンジニアリング」方法の使用は、持続可能性にプラスの影響を与えることが知られている。

化粧品産業では、プラスチックマイクロビーズを、タンパク質、セルロース、キトサン、デンプン、またはシリカのみから作製されるマイクロビーズに置き換えることは簡単ではない。これは、これらの材料の機械的、光学的、および表面の特性がプラスチックのものと異なるためである。化粧品産業は、プラスチックマイクロビーズに多額の資本、ノウハウ、および研究を投資し、化粧品およびスキンケアの市場を構築してきた。プラスチックマイクロビーズを、環境に優しい代替品に置き換える圧力は、化粧品産業がその配合物および製品を代わりの粒子の特性に合わせなければならないことを意味する。

プラスチックマイクロビーズは、一般に疎水性／親油性である。これにより、それらは疎水性または親油性配合物における使用に有利となる。しかしながら、場合によっては、親水性であるプラスチックマイクロビーズを使用することが望ましい。プラスチックマイクロビーズは、極性宿主流体と水素結合を作るカルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、四級アンモニウム、アルコール、アミノ、またはアミド基などの化合物でそれらの表面をコーティングすることによって親水性にすることができる。

一方で、タンパク質、デンプン、セルロース、キトサン、およびシリカから作製されるマイクロビーズは、一般に親水性である。最も一般的に、これらのタイプのマイクロビーズは、それらが油、ワックス、および多くの石油系溶媒などの親水性／親油性宿主媒体と適合性となるように、それらを疎水性／親油性にするようにコーティングされなければならず、したがって、広範な疎水性／親油性プラスチックマイクロビーズを置き換えることができる。

親油性マイクロビーズ
親油性は、２つのマトリックス間の中性分子の分割を記述するｌｏｇＰとして表され得る。親油性はまた、分子集団の中性画分の分割に加えて、２つのマトリックス間の分子集団のイオン化画分の分割を記述するｌｏｇＤとして表され得る。親油性（ｌｏｇＰとして表される）は、静電的および疎水性分子間力、ならびに分子内相互作用の両方をコードする分子パラメータである。

「親油性」および「疎水性」という用語は、疎水性であるが親油性ではないシリコーンおよびフッ素炭素で見られるように、同義ではない。国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）は、親油性および疎水性の異なる定義を提供する（Ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒｂｅｅｍ，Ｈ．；Ｃａｒｔｅｒ，Ｒ．Ｅ．；Ｇｒａｓｓｙ，Ｇ．；Ｋｕｂｉｎｙｉ，Ｈ．；Ｍａｒｔｉｎ，Ｙ．Ｃ．；Ｔｕｔｅ，Ｍ．Ｓ．；Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｐ．Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，６９，１１３７－１１５２）。疎水性は、非極性分子を除外する水の傾向から生じる、水性環境における非極性基または分子の会合である。親油性は、親油性環境に対する分子または部分の親和性を表す。

化粧品産業において、親油性マイクロビーズテクスチャリング剤の必要性が存在する。

一般に、マイクロビーズの表面は、化粧品配合物と適合性にするために修飾されなければならない。化粧品配合物を補助し、機能的特性を提供し、美的経験を高めるために、セルロース、デンプン、およびシリカのマイクロビーズは、通常、様々な種類の表面処理が施される。これらの処理は、配合および感覚的経験を改善する方法でマイクロビーズの表面エネルギーを変化させる。

ラウロイルリシンは、強化された粒子分散、改善された使用特性、および皮膚の湿潤感触を伴う化粧を支持する疎水性表面を作り出す表面処理剤の一例である。

アルキルシランコーティングは、有機ケイ素アルコキシドと、セルロース、デンプン、またはシリカ粒子上の表面水およびヒドロキシル基との反応からもたらされる。共有結合は、シリコン部分の間で、硬化後に粒子表面とともに形成される。

シクロメチコン中にシリコーン処理粒子が良好に分散する。それらは非常に低い表面張力を有し、優れた疎水性および改善された親油性が得られる。コーティングにより、鉱物油、エステル、およびシリコーン流体中で粒子が容易に分散性となる。アルキルシランで処理された粒子は、メチコンで処理された粒子よりも疎水性が高く、一般的に利用される化粧品用油において湿潤性がより高く、油の吸収がより遅い。

水性緻密配合物において、アルキルシラン処理は、粉末中の高い粒子負荷を可能にするための改善された湿潤を付与する。これは、ホットフィリングのための低い溶融粘度を維持しながら、皮膚への塗布時に「粉状」の感覚を与える。分散固形分とビヒクルとの間の適合性の改善は、口紅、アイシャドウ、およびファンデーションを含むスティック製品の配合物における利益である。これらのタイプのコーティングは、Ｗ／Ｏ（油中水型）およびＯ／Ｗ（水中油型）エマルション、ウォータープルーフマスカラ、持続性のある口紅およびリップグロスを作製するために使用される。

メチコンは、ポリ（メチルヒドロシロキサン）である。Ｓｉ－Ｈ結合は、粒子表面からの微量の水と反応し、Ｓｉ－Ｈ結合をシラノール（Ｓｉ－ＯＨ）に変換し、それは最終的に縮合して、共有Ｓｉ－Ｏ粒子化学結合を作る。コーティングは、非常に疎水性であり、コーティングが剪断に抵抗するように表面に粘着的に結合されている。このようにしてコーティングされた粒子は、油、特にシリコーン油中で良好に湿潤性である。滑り性および広がりが強化された肌感触は、やや乾燥しているように感じられる。それは圧縮粉末配合物に好ましい。コーティングの欠点は、反応が水素ガスを進化させるため、メチコン反応を完了させなければならないことである。メチコンコーティング粒子は、ファンデーション、コンシーラー、マスカラ、口紅、アイシャドウ、およびムースに好適である。

ジメチコンは、ポリマー、ポリ（ジメチルシロキサン）である。これは、加水分解、縮合、および硬化の機構を介して粒子表面に結合し、Ｓｉ－Ｏ粒子結合を作り出すと考えられる。ジメチコンで処理された表面は、かなり疎水性であり、良好な滑り性およびより潤滑感を有する。ジメチコンでコーティングされた粒子は、無水生成物に使用され得る油性系において有用である。

上に記載されるコーティング方法は、粒子の生成後にいくつかのステップの追加を必要とする。

タンパク質マイクロビーズ
化粧品産業では、アミノ酸、ペプチド、および／またはタンパク質含有マイクロビーズの需要がある。これらのタンパク質から作製されたマイクロビーズは、安定性を改善させようとするために他のポリマーとブレンドされた場合でも、機械的特性が乏しく、分解速度が高いという負の特徴を有する。例えば、シルクフィブロインとのデンプンブレンドのいくつかの微小粒子は、水中に置かれると、最大で６５％近くまで溶解する（Ｙ．Ｂａｉｍａｒｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ／ｓｔａｒｃｈ ｂｌｅｎｄｅｄ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．１２（２０１０）７８１－７８９；ＤＯＩ：１０．３１４４／ｅｘｐｒｅｓｓｐｏｌｙｍｌｅｔｔ．２０１０．９４）。これは、剪断混合の条件下で水を含むエマルション中で、または水含有量の高い配合物中で、マイクロビーズを配合する場合には望ましくない。

タンパク質ベースのマイクロビーズに関する従来技術は、ゼラチン、シルクフィブロイン、セリシン、およびコラーゲンの使用に焦点を当てている。ゼラチンは、微小粒子を生成するために使用することができる生分解性天然タンパク質ポリマーである。しかしながら、ゼラチン微小粒子の水溶性ならびに限定された機械的および熱的特性に起因して、長期的な用途での使用を提供するために、化学的架橋反応などの改善が必要である。シルクフィブロイン、セリシン、およびコラーゲンは、油中水型エマルションと呼ばれる重要なクラスの化粧品配合物に好適ではないようにする特性の水を吸収する。

セルロースおよびセルロースマイクロビーズ
天然セルロースは、親水性半結晶性有機ポリマーである。それは生物圏で天然に生成される多糖類である。それは植物、多くの藻類、および菌類のような卵菌類の細胞壁の構造物質である。セルロースは、エーテル結合ポリ（β－１，４－グルコピラノース）単位の長い直鎖に天然に組織化される。これらの鎖は、分子内および分子間水素結合によって、ナノクリスタルの高度に結晶化したドメインにアセンブリする（図１を参照されたい）。不規則（非晶質）セルロースの領域は、セルロースナノ原線維におけるこれらのナノクリスタルドメインの間に存在する。セルロースポリマー鎖間の広範な水素結合により、セルロースは、水およびほとんどの有機溶媒、さらには多くのタイプの酸への溶解に非常に耐性となる。

セルロースは、食品および薬学的用途において無毒性の賦形剤として広く使用されている。経口薬物送達のような医療用途では、薬物は、セルロース粉末（通常は微結晶セルロース粉末）および他の充填剤と混合され、押出および球状化によって変換される。押出および球状化により、顆粒状粉が得られる。多孔質マイクロビーズを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーのためのクロマトグラフィー支持体固定相を作製し、タンパク質、エンドトキシン、およびウイルスなどの生物学的物質の選択的吸着剤として使用することができる。

参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６＼０１５１４８Ａ１は、結晶性ナノセルロースのナノクリスタルを生成し、次いで、噴霧乾燥によってこれらのナノクリスタルをおおよそ球状（球形）のマイクロビーズに凝集させる方法を教示する。

本発明によれば、以下が提供される。

１．セルロースナノクリスタルおよび１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物を含むタンパク質性セルロース微小粒子であって、ナノクリスタルならびにペプチドおよび／またはタンパク質が一緒に凝集して、微小粒子を形成する、タンパク質性セルロース微小粒子
２．微小粒子が、直径約１μｍ～約１００μｍである、項目１の微小粒子。

３．微小粒子が、体積で約５／１５μｍ～約５／２５μｍのサイズ分布（Ｄ_１０／Ｄ_９０）を有する、項目１または２の微小粒子。

４．微小粒子が、おおよそ回転楕円体または半回転楕円体である、項目１～３のいずれか１つの微小粒子。

５．セルロースナノクリスタルが、長さ約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、および幅約２～約２０ｎｍである、項目１～４のいずれか１つの微小粒子。

６．セルロースナノクリスタルが、少なくとも約５０％の結晶性を有する、項目１～５のいずれか１つの微小粒子。

７．セルロースナノクリスタルが、硫酸化セルロースナノクリスタルおよびそれらの塩、カルボキシル化セルロースナノクリスタルおよびそれらの塩、ならびに表面還元カルボキシル化セルロースナノクリスタルおよびそれらの塩、ならびに他の官能基で化学修飾されたセルロースナノクリスタルなどのそれらの誘導体、またはそれらの組み合わせである、項目１～６のいずれか１つの微小粒子。

８．セルロースナノクリスタルが、カルボキシル化セルロースナノクリスタルおよびそれらの塩、好ましくはカルボキシル化セルロースナノクリスタルまたはカルボン酸セルロースナトリウム塩、およびより好ましくはカルボキシル化セルロースナノクリスタルである、項目１～７のいずれか１つの微小粒子。

９．ペプチドおよびタンパク質が、水溶性である、項目１～８のいずれか１つの微小粒子。

１０．本発明の微小粒子が、１つ以上のタンパク質を含む、項目１～９のいずれか１つの微小粒子。

１１．微小粒子が、シルクフィブロイン、セリシン、またはゼラチン、好ましくはセリシンまたはシルクフィブロイン、およびより好ましくはシルクフィブロインを含む、項目１～１０のいずれか１つの微小粒子。

１２．シルクフィブロインを含む、項目１１の微小粒子。

１３．疎水性および親油性である、項目１～１２のいずれか１つの微小粒子
１４．微小粒子が、微小粒子上の重量に基づいて、約０．１重量％～約５０重量％、好ましくは約０．５重量％～約２０重量％、およびより好ましくは約１重量％～約２０重量％の総ペプチドおよびタンパク質濃度で、１つ以上のペプチドおよび／または１つ以上のタンパク質を含む、項目１～１３のいずれか１つの微小粒子
１５．微小粒子が、多孔質であり、ナノクリスタルならびにペプチドおよび／またはタンパク質が、微小粒子中の空洞の周りに配置され、したがって微小粒子中の細孔を画定する、項目１～１４のいずれか１つの微小粒子。

１６．微小粒子中の細孔が、約１０ｎｍ～約２０００ｎｍのサイズ、好ましくは約５０～約１００ｎｍのサイズである、項目１～１５のいずれか１つの微小粒子
１７．微小粒子が、紫外線光および青色光に対する保護、抗酸化特性、抗老化特性、保湿効果、または色など、皮膚にさらなる利益をもたらす１つ以上の機能分子をさらに含む、項目１～１６のいずれか１つの微小粒子。

１８．セルロースナノクリスタルが、ポリ電解質層および染料でコーティングされる、項目１～１７のいずれか１つの微小粒子。

１９．項目１～１８のいずれか１つの微小粒子を含む、化粧品用調製物。

２０．油中水型エマルションまたは親油性媒体を含む、項目１９の化粧品用調製物。

２１．項目１～１８のいずれか１つの微小粒子を生成するための方法であって、
ａ）セルロースナノクリスタルの懸濁液および１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物の溶液を提供するステップと、
ｂ）懸濁液を溶液と混合して、混合物を生成するステップと、
ｃ）混合物を噴霧乾燥させて、微小粒子を生成するステップと、を含む、方法。

２２．溶液が、溶液の総重量に基づいて、約０．０１重量％～約５０重量％の濃度で、１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物を含む、項目２１の方法。

２３．微小粒子をアルコールで洗浄するステップをさらに含む、項目２１または２２の方法。

２４．
ステップｂ）の後、機能分子が、ステップｂ）の混合物中に溶解もしくは懸濁されるか、
ステップａ）の間に、機能分子が、セルロースナノクリスタルの懸濁液中に溶解もしくは懸濁されるか、または
ステップａ）の間に、機能分子が、１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、もしくはそれらの混合物の溶液中に溶解もしくは懸濁される、項目２１～２３のいずれか１つの方法。

２５．多孔質である、項目１～１６のいずれか１つの微小粒子を生成するための方法であって、
ａ）
●セルロースナノクリスタルの懸濁液、
●１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物の溶液、および
●ポロゲンのエマルションを提供するステップであって、
１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物のいずれかの溶液が、エマルションの一部であるか、または単独である、提供するステップと、
ｂ）懸濁液を溶液およびエマルションと混合して、
●ポロゲンの液滴が分散され、
●セルロースナノクリスタルが懸濁され、
●１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物が溶解される連続液相を含む混合物を生成するステップと、
ｃ）混合物を噴霧乾燥させて、微小粒子を生成するステップと、
ｄ）微小粒子中で細孔を形成するための噴霧乾燥中にポロゲンが十分に蒸発していない場合、ポロゲンを蒸発させるか、またはポロゲンを微小粒子から浸出させるステップと、を含む、方法。

添付図面は、以下の通りである。
セルロース繊維、原線維、ナノ原線維（ＣＮＦ）、およびナノクリスタル（ＣＮＣ）の概略図である。 水が添加された実施例１で得られた粉末を示し、粉末は湿潤しているのではなく、水滴の表面上に位置する。 水が添加された比較実施例８で得られた粉末を示し、粉末は湿潤であった。 油中水型エマルション中で混合した実施例１で得られた粉末を示し、凝集体は観察することができない。 油中水型エマルション中で混合した比較実施例８で得られた粉末を示し、凝集体が見られる。 ２％のシルクフィブロインを含む実施例２の微小粒子の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）画像である。 ５％のシルクフィブロインを含む実施例２の微小粒子のＳＥＭ画像である。 １０％のシルクフィブロインを含む実施例２の微小粒子のＳＥＭ画像である。 ２０％のシルクフィブロインを含む実施例２の微小粒子のＳＥＭ画像である。 １００％シルクフィブロインからなる微小粒子のＳＥＭ画像である。 微小粒子のメタノールへの曝露の前後の、２％のシルクフィブロイン／ＣＮＣマイクロビーズ中のβプリーツシートのパーセンテージを示す。寄与パーセントは、試料のアミド延伸領域のガウスデコンボリューション赤外スペクトルによって得られた。 ２％のシルクフィブロインを含むハイブリッド微小粒子のＸ線光電子スペクトルを示す。 調製した（ａ）、および（ｂ）マイクロビーズをメタノールに曝露した後の、２％のシルクフィブロインを含むハイブリッドＣＮＣ微小粒子のメチレンブルー色素の取り込みを示す。

次に、より詳細に本発明を見ると、タンパク質性セルロース微小粒子、それらの作製方法、およびそれらの使用が提供される。

実際、タンパク質およびセルロースナノクリスタル（ＣＮＣ）を一緒に凝集することによる、セルロース微小粒子中での１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物の組み込みが、微粒子に驚くべき特性が付与されることが驚くべきことに見出されている。特に、微小粒子を疎水性にすることができ、それらの油取り込みを増加させることができ、および／またはそれらの皮膚感触を改善することができる。

したがって、本発明の微小粒子は、セルロースナノクリスタルおよび１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物を含み、ナノクリスタルならびにペプチドおよび／またはタンパク質が一緒に凝集して、微小粒子を形成する。

本発明の微粒子では、ナノクリスタルは一緒に凝集して、微小粒子を形成する。これは、微小粒子の物理的構造が、集塊したナノクリスタルによって提供されることを意味する。

実施形態では、微小粒子は、典型的には互いに遊離しているが、それらの一部は、他の微小粒子と末梢的に融合していてもよい。

実施形態では、微小粒子は、自由流動性粉末の形態である。

実施形態では、微小粒子は、直径約１μｍ～約１００μｍ、好ましくは約１μｍ～約２５μｍ、より好ましくは約２μｍ～約２０μｍ、およびさらにより好ましくは約４μｍ～約１０μｍである。化粧品用途では、好ましいサイズは、約１μｍ～約２５μｍ、好ましくは約２μｍ～約２０μｍ、およびより好ましくは約４μｍ～約１０μｍである。

実施形態では、微小粒子は、体積で約５／１５μｍ～約５／２５μｍのサイズ分布（Ｄ_１０／Ｄ_９０）を有する。

実施形態では、微小粒子は、おおよそ回転楕円体または半回転楕円体である。本明細書では、「球状」とは、楕円をその主軸の１つの周りに回転させることによって得られる形状である。回転楕円体には球体が含まれる（楕円が円のときに得られる）。本明細書では、「半回転楕円体」は、回転楕円体の約半分である。球体の形状とのずれは、Ｓｙｓｍｅｘ ＦＰＩＡ－３０００などの画像解析を行う機器により判定することができる。球形性は、物体の形状が数学的に完全な球体の形状にどれだけ近づいているかの尺度である。粒子の球面度Ψは、球体（粒子と同じ体積を有する）の表面積と粒子の表面積の比率である。以下の式を使用して計算することができる。

式中、Ｖ_ｐは、粒子の体積であり、Ａ_ｐは、粒子の表面積である。実施形態では、本発明の微小粒子の球形度Ψは、約０．８５以上、好ましくは約０．９以上、およびより好ましくは約０．９５以上である。

セルロースナノクリスタル
上述のように、本発明の微小粒子は、セルロースナノクリスタルを含む。

実施形態では、セルロースナノクリスタルは、長さ約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、好ましくは約８０ｎｍ～約２５０ｎｍ、より好ましくは約１００ｎｍ～約２５０ｎｍ、およびさらにより好ましくは約１００～約１５０ｎｍである。

より好ましい実施形態では、セルロースナノクリスタルは、幅約２～約２０ｎｍ、好ましくは約２～約１０ｎｍ、およびより好ましくは幅約５ｎｍ～約１０ｎｍである。

実施形態では、セルロースナノクリスタルは、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６５％以上、さらにより好ましくは少なくとも約７０％以上、および最も好ましくは少なくとも約８０％の結晶性を有する。

本発明の微小粒子中のセルロースナノクリスタルは、任意のセルロースナノクリスタルであり得る。

特に、ナノクリスタルは官能化（これは、それらの表面がその上に結合した官能基に修飾されていることを意味する）、または（それらがセルロース中で天然に存在するため）非官能化され得る。セルロースナノクリスタルを製造する最も一般的な方法は、典型的には、ナノクリスタル表面の少なくとも一部の官能化を引き起こす。したがって、実施形態では、セルロースナノクリスタルは、官能化セルロースナノクリスタルである。

実施形態では、本発明の微小粒子中のセルロースナノクリスタルは、硫酸化セルロースナノクリスタルおよびそれらの塩、カルボキシル化セルロースナノクリスタルおよびそれらの塩、ならびに表面還元カルボキシル化セルロースナノクリスタルおよびそれらの塩、ならびに他の官能基で化学修飾されたセルロースナノクリスタルなどのそれらの誘導体、またはそれらの組み合わせである。

硫酸化セルロースナノクリスタルおよびカルボキシル化セルロースナノクリスタルの塩の例としては、そのナトリウム塩が挙げられる。

上記の「他の官能基」の例としては、エステル、エーテル、四級化アルキルアンモニウムカチオン、トリアゾールおよびそれらの誘導体、オレフィンおよびビニル化合物、オリゴマー、ポリマー、シクロデキストリン、アミノ酸、アミン、タンパク質、ポリ電解質、ならびに他のものが挙げられる。これらの「他の官能基」で化学修飾されたセルロースナノクリスタルは、当業者に周知である。これらの「他の官能基」は、例えば、蛍光、配合のための有機溶媒および／またはポリマーとの適合性、生物活性、触媒機能、エマルションの安定化、ならびに当業者に既知の多くの他の特徴を含む１つ以上の所望の特性をセルロースナノクリスタルに付与するために使用される。

好ましくは、微小粒子中のセルロースナノクリスタルは、カルボキシル化セルロースナノクリスタルおよびそれらの塩、好ましくはカルボキシル化セルロースナノクリスタルまたはカルボン酸セルロースナトリウム塩、およびより好ましくはカルボキシル化セルロースナノクリスタルである。

硫酸化セルロースナノクリスタルは、濃硫酸および別の酸によるセルロースの加水分解によって得ることができる。この方法は周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨａｂｉｂｉ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１１０，３４７９－３５００に記載されている。

カルボキシル化セルロースナノクリスタルは、異なる方法、例えば、ＴＥＭＰＯまたは過ヨウ素酸塩媒介酸化、過硫酸アンモニウムでの酸化、および過酸化水素での酸化によって生成され得る。より具体的には、周知のＴＥＭＰＯ酸化を使用して、セルロースナノクリスタルを酸化することができる。カルボキシル化セルロースナノクリスタルは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０１５１４８Ａ１に記載される過酸化水素水溶液を使用して、セルロースから直接生成することができる。セルロースからカルボキシル化セルロースナノクリスタルを生成する他の方法としては、いずれも参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０７２３６５Ａ１およびＷＯ２０１３／００００７４Ａ１に記載される方法が挙げられる。

上記の「他の官能基」で修飾されたセルロースナノクリスタルは、当業者に周知であるように、硫酸化および／またはカルボキシル化ＣＮＣ（結晶セルロースを溶解することなく）から生成することができる。

ペプチドおよびタンパク質
上述のように、本発明の微小粒子はまた、１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物も含む。

ペプチドは、ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸の短鎖である。タンパク質はまた、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の鎖であるが、それらは、またペプチド結合によって連結されたアミノ酸の１つ以上の長鎖を含むより大きな分子である。ペプチドは、概して、サイズに基づいてタンパク質から区別され、任意のベンチマークとして、約５０以下のアミノ酸を含むことが理解され得る。したがって、本明細書では、ペプチドは、２～５０のアミノ酸を含むと定義され、タンパク質は、５０を超えるアミノ酸を含むと定義される。酵素は、活性化エネルギーを低下させることによって化学反応を加速する生物学的触媒であるタンパク質のサブセットを構成する。

好ましくは、ペプチドは、１０～５０のアミノ酸を含む。

好ましくは、タンパク質は、１５０以上のアミノ酸を含むため、約２２ｋＤａ以上の分子量を有する。最も好ましくは、タンパク質は、１００ｋＤａ以上の分子量を有する高分子量ポリペプチドである。

好ましい実施形態では、本発明の微小粒子は、１つ以上のタンパク質を含む。より好ましい実施形態では、微小粒子は、１つのタンパク質を含む。代替的実施形態では、本発明の微小粒子は、ペプチドを含む。

本発明の微小粒子中のペプチドまたはタンパク質は、任意のペプチドまたはタンパク質であり得る。

ペプチドまたはタンパク質は、天然、植物（野菜）、または動物由来のペプチドもしくはタンパク質、ならびに合成ペプチドまたはタンパク質およびトランスジェニックペプチドまたはタンパク質であり得る。

好ましいペプチドおよびタンパク質としては、水溶性ペプチドおよびタンパク質が挙げられる。

ペプチドおよびタンパク質の非限定的な例としては、アルブミン、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、リシンポリペプチド、カゼイン、カタラーゼ、コラーゲン、シトクロムＣ、デオキシリボヌクレアーゼ、エラスチン、フィブロネクチン、ゼラチン、グリアジン、グルコースオキシダーゼ、糖タンパク質、加水分解コラーゲンのエステル、トウモロコシタンパク質、ケラチン、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、ラクトペルオキシダーゼ、リパーゼ、乳タンパク質、ニシン、オキシドレダクターゼ、パピン、ペプシン、プロテアーゼ、サッカロミセスポリペプチド、セリシン、血清アルブミン、血清タンパク質、シルクフィブロイン、ステアロイルラクタルブミンナトリウム、可溶性プロテオグリカン、ダイズパルミチン酸、ダイズタンパク質分離物、卵タンパク質、ラッカセイタンパク質、綿実タンパク質、ヒマワリタンパク質、エンドウマメタンパク質、乳清タンパク質、魚タンパク質、魚介類タンパク質、サブチリシン、スーパーオキシドディスムターゼ、スチレイン、スイートアーモンドタンパク質、ウレアーゼ、コムギ胚芽タンパク質、コムギタンパク質、乳清タンパク質、ゼイン、加水分解野菜タンパク質などが挙げられる。

本発明の微小粒子中の好ましいペプチドおよびタンパク質は、化学結合を形成せずにセルロースに結合するものである。

好ましいペプチドおよびタンパク質としては、以下が挙げられる。

●ダイズに存在する主要なタンパク質であり、水素結合によってセルロースに吸着する、グリシニンおよびβ－コングリシニン。

グリシニンは、３００～３８０ｋＤａの分子量を有するヘキサマーである。６つのサブユニットは、ジスルフィド結合を介して連結された酸性および塩基性ポリペプチドからなる。グリシニンは、ラングミュア等温線に従ってセルロースに吸着する。

β－コングリシニンは、２つの類似したシステイン含有ペプチド、およびグリコシル化非システイン含有βペプチドからなるトリマーまたはヘキサマーである。β－コングリシニンは、セルロースにより低い程度で吸着する。

両方のタンパク質は、セルロースと結合すると、イオン強度依存性立体配座転移を受ける。

●硫酸塩および／またはカルボン酸官能基を有する負に荷電されたセルロースナノクリスタルに有意に結合しない、ウシ血清アルブミンタンパク質。

コラーゲンの部分的加水分解によって生成されたペプチドおよびタンパク質の混合物である、ゼラチン。

●セルロース表面に対して特異的な親和性を有し、おそらく水素結合相互作用に起因して、酵素に対する立体配座転変化と結合する、セルロース分解酵素（セルラーゼ）。

●天然親水性タンパク質である、シルクセリシン（ＳＳ）。

セリシンは、シルク繊維の周りにガムコーティングを形成し、それらが付着することを可能にする。セリシンは、１８の異なるアミノ酸から構成されており、そのうちの３２％はセリンである。

●共有化学結合を形成することなく、水素結合および静電相互作用を介して天然多糖類を結合する、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉカイコなどのカイコによって生成される生分解性および生体適合性の天然タンパク質ポリマーである、シルクフィブロイン（ＳＦ）。

ＳＦは、約４００ｋＤａの分子質量を有する。それは、主要な構成成分であるグリシンおよびアラニンが非極性アミノ酸である、直鎖状ポリペプチドである。いわゆるＨ鎖の疎水性ドメインは、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒの繰り返しヘキサペプチド配列およびＧｌｙ－Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｔｙｒジペプチドの繰り返しを含み、これらは安定した反平行βシート微結晶を形成することができる。

ＳＦは、以下の３つの分子立体配座で存在することができる。

シルクＩは、水溶性であり、いくつかのαヘリックスおよびβターン特徴を有する、主にランダムコイルの混合物によって特徴付けられる。

シルクＩＩは、安定した水不溶性フィブロインをもたらすβシートが優勢であることにより特徴付けられる。

シルクＩＩＩは、αヘリックスを採用しており、通常、水／空気界面で見られる。

Ｆｅｎｇら（Ｆａｃｉｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｓｉｌｋ Ｆｉｂｒｏｉｎ／Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｆｉｌｍｓ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｕｓｃｈｅｍｅｎｇ．７ｂ０１１６１；ＡＣＳ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．２０１７，５，６２２７－６２３６）によると、接触角の測定により、純粋なＳＦフィルムが親水性であることが明らかになる。この特性は、親水性ヒドロキシル基、アミノ基、およびカルボキシル基の存在に起因する。

ＳＦ分子は、共有化学結合を形成することなく、弱い相互作用または強い相互作用のいずれかを介してセルロース表面に吸着する。得られた複合体は、シルクＩおよびシルクＩＩ構造、または両方の組み合わせを呈し得る。多くの場合、ＳＦのフィルムは親水性である。

好ましい実施形態では、微小粒子は、シルクフィブロイン、セリシン、またはゼラチン、好ましくはセリシンまたはシルクフィブロイン、およびより好ましくはシルクフィブロインを含む。シルクフィブロインは、微小粒子の特性を親水性から疎水性／疎油性にすることを可能にする。一方で、セリシンは、改善された（よりクリーミーな）皮膚感触の微小粒子の生成を可能にした。

微小粒子は、典型的には、微小粒子上の重量に基づいて、約０．１重量％～約５０重量％、好ましくは約０．５重量％～約２０重量％、およびより好ましくは約１重量％～約２０重量％の総ペプチドおよびタンパク質濃度で、１つ以上のペプチドおよび／または１つ以上のタンパク質を含む。

以下の実施例で実証されるように、シルクフィブロインは、微小粒子上の重量に基づいて、０．５重量％の低い濃度で使用しても、疎水性微小粒子を生成した。したがって、実施形態では、微小粒子は、微粒子上の重量に基づいて、約０．５重量％～約３０重量％、好ましくは約１重量％～約３０重量％、およびより好ましくは約２重量％～約３０重量％のシルクフィブロインを含む。

多孔質微小粒子
実施形態では、本発明の微小粒子は、多孔質である（すなわち、それらは細孔を含む）。ナノクリスタルならびにペプチドおよび／またはタンパク質は一緒に凝集することにより、微小粒子を形成し、微小粒子中の空洞の周りに配置され、したがって微小粒子中の細孔を画定する。

本発明の微小粒子では、セルロースナノクリスタルは一緒に凝集して、微小粒子を形成し、細孔を画定する。以下に「多孔質セルロース微小粒子の生成方法」と題するセクションで説明されるように、本発明の微小粒子は、セルロースナノクリスタルおよびタンパク質をポロゲンの液滴の周りに凝集させ、次いで、ポロゲンを除去することによって生成することができ、したがって、ポロゲンの液滴がかつて存在した空隙を残し、すなわち、それにより微小粒子中に細孔を作り出す。これにより、ナノクリスタルおよび１つ以上が一緒に凝集され、微小粒子自体を形成するとともに、微小粒子中の細孔を画定する（すなわち、細孔の境界をマークする）。

実施形態では、微小粒子中の細孔は、約１０ｎｍ～約２０００ｎｍのサイズ、好ましくは約５０～約１００ｎｍのサイズである。

微小粒子の多孔性は、異なる方法によって測定することができる。そのような方法の１つは、米国標準ＡＳＴＭ Ｄ２８１－８４に記載されているような流体飽和方法である。この方法において、多孔質微小粒子粉末の油取り込みを測定する。微小粒子粉末の量ｐ（グラム単位）（約０．１～５ｇ）をガラス板上または小さなバイアル中に配置し、ヒマシ油（またはイソノニルイソノナノエート）を滴下で添加する。４～５滴の油を添加した後、油をスパチュラで粉末に取り込む。油および粉末の集合体が形成されるまで、油の添加を継続する。この時点で、油を１滴ずつ添加し、次いで、混合物をスパチュラで粉砕する。滑らかでしっかりとしたペーストが得られると、オイルの添加を停止する。ペーストがガラス板に亀裂または塊を形成せずに広げることができる場合には、測定を完了する。次いで、オイルの体積Ｖｓ（ｍｌで表される）を記録する。油取り込みは、Ｖｓ／ｐの比率に対応する。実施形態では、本発明の微孔性粒子は、約６０ｍＬ／１００ｇ以上のヒマシ油の取り込みを有する。好ましい実施形態では、ヒマシ油の取り込みは、約６５、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、または約２５０ｍｌ／１００ｇ以上である。

微小粒子の多孔性はまた、参照により本明細書に組み込まれるＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｖｏｌ．６０，ｐ．３０９，１９３８に記載されるＢＥＴ（Ｂｒｕｎａｕｅｒ－Ｅｍｍｅｔｔ－Ｔｅｌｌｅｒ）法によって測定することもできる。ＢＥＴ法は、国際規格ＩＳＯ５７９４／１に準拠する。ＢＥＴ法では、表面積（ｍ^２／ｇ）と呼ばれる量が得られる。実施形態では、本発明の微孔性粒子は、約３０ｍ^２／ｇ以上の表面積を有する。好ましい実施形態では、表面積は、約４５、約５０、約７５、約１００、約１２５、または約１５０ｍ^２／ｇ以上である。

微小粒子中の任意の構成成分
ペプチド／タンパク質に加えて、実施形態では、本発明の微小粒子はまた、皮膚にさらなる利益をもたらす１つ以上の機能分子を含み得る。これらの利益には、例えば、紫外線光および青色光に対する保護、抗酸化および抗老化特性、保湿効果、ならびに色が含まれる。

色を付与する機能分子としては、天然色素が挙げられる。天然色素の非限定的な例としては、アドニルビン、アスタキサンチン、ビキシン、カンタキサチン、β－アポ－４－カロテナール、β－アポ－８－カロテナール、β－カロテン、β－アポ－８－カロテン酸エステル、クロロフィルシトラキサンチン、クリプトキサンチン、エキネノン、リコペン、ルテイン、ニューロスポレン、トルラロジン、トルレン、およびゼアキサンチンが挙げられる。

ＵＶＢまたはＵＶＡ光（すなわち、ＵＶ（ＵＶＢまたはＵＶＡ）プロテクター）に対する直接的な保護を提供する機能分子は、有機油溶性または水溶性ＵＶプロテクターを含む。油溶性ＵＶＢプロテクターの非限定的な例としては、３－ベンジリデンカンファーおよびその誘導体、４－アミノ安息香酸誘導体、桂皮酸、ベンザルマロン酸、およびサリチル酸のエステル、ベンゾフェノンの誘導体、ならびにトリアジンの誘導体が挙げられる。水溶性ＵＶＢプロテクターの非限定的な例としては、主にスルホン酸の誘導体およびその塩が挙げられる。例としては、２－ベンジルフェニルイミダゾール－５－スルホン酸およびその塩、３－ベンジリデンカンファーのスルホン酸およびその塩、スルホン酸およびその塩、またはベンゾフェノンが挙げられる。ＵＶＡプロテクターの非限定的な例は、ベンゾイルメタンの誘導体およびベンゾフェノンのアミノヒドロキシ置換誘導体である。

一部の機能分子は、抗酸化特性を呈するため、上記のＵＶプロテクターに二次的な利益を提供する。そのような抗酸化機能分子の非限定的な例としては、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、キノン、ユビキノン、およびビタミンＣ（アスコルビン酸）が挙げられる。これらの抗酸化機能分子は、紫外線光が皮膚に透過するときに生じる光化学連鎖反応を妨害する。

ＵＶプロテクターである他の機能分子には、二酸化チタンおよび酸化亜鉛のような無機顔料が含まれる。これらは、上で議論されるＵＶＢまたはＵＶＡ光に対する直接的な保護を提供する分子と組み合わせることができる。

抗老化機能分子としては、例えば、ビタミン、例えば、ビタミンＡアルコール、アルデヒド、酸、およびエステルが挙げられる。これらは、皮膚への抗老化効果の利益を有するレチノイドのクラスに属している。

他の機能分子としては、例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、ならびに好ましくはＢ群のビタミンおよびプロビタミンが挙げられる。ニコチンアミド／ナイアシンアミド、パンテノール、パントラクトンなどのこれらの機能分子のうちのいくつかは、それらがマイクロビーズに有利に保湿および皮膚鎮静特性を付与するため好ましい。

さらなる好ましい機能分子としては、リポ酸、およびその塩、エステル、糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ペプチド、および脂質誘導体が挙げられる。これらは抗酸化作用を提供する。

さらなる好ましい機能分子には、脂肪酸、特に分岐状飽和脂肪酸、および好ましくはメチルイコサン酸のような分岐状エイコサン酸が含まれる。

機能分子は、セルロースナノクリスタルおよび／またはペプチド／タンパク質に連結される。機能分子とセルロースおよび／またはタンパク質との間の結合は、水素結合もしくはイオン性もしくはファンデルワールスもしくは疎水性相互作用、または非共有相互作用の組み合わせに基づく、共有結合または非共有結合のいずれかであり得る。好ましくは、機能分子を次のセクションで記載されるようにＣＮＣで噴霧乾燥するときに非共有結合を形成することが好ましい。

ナノクリスタルコーティング
セルロースナノクリスタルは、微小粒子を製造する前にコーティングされ得る。結果として、このコーティングの構成成分は、微小粒子中のコーティングとしてナノクリスタルの周りに残る。したがって、実施形態では、微小粒子中のナノクリスタルはコーティングされる。

これは、微小粒子を強化するためにナノクリスタルに結合効果を付与するために特に有用である。実際に、非常に多孔質な微小粒子は、より脆くてもよく、これは一般に望ましくなく、結合剤を使用して対抗することができる。実施形態では、このコーティングは、ポリ電解質層、または交流電荷を有するポリ電解質層の積層、好ましくは１つのポリ電解質層である。

実際に、ナノクリスタルの表面は、典型的には荷電されている。例えば、硫酸化セルロースＩナノクリスタルおよびカルボキシル化セルロースＩナノクリスタルならびにそれらの塩は、典型的には、負に荷電された表面を有する。したがって、この表面は、それ自体がナノクリスタルの表面に静電的に結合し、ナノクリスタルの表面にポリカチオン層を形成する１つ以上のポリカチオン（正に荷電された）と反応することができる。逆に、正に荷電された表面を有するナノクリスタルは、ポリアニオン層でコーティングされ得る。両方の場合において、所望される場合、追加された各層についてポリ電解質の電荷を逆転させることによって、さらなるポリ電解質層を以前に形成されたポリ電解質層の上部に同様に形成することができる。

実施形態では、ポリアニオンは、カルボキシレートおよび硫酸塩などの基を有する。そのようなポリアニオンの非限定的な例としては、２－アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって販売されるＡＭＰＳ（登録商標））のナトリウム塩などの、アクリルアミドとアクリル酸とのコポリマーおよびスルホネート含有モノマーとのコポリマーが挙げられる。

実施形態では、ポリカチオンは、四級アンモニウム中心などの基を有する。ポリカチオンは、様々な割合のアクリル酸またはメタクリル酸エステルのアミノ誘導体でアクリルアミドを共重合することによって、アニオン性コポリマーと同様の様式で生成することができる。他の例として、四級化ポリ－４－ビニルピリジンおよびポリ－２－メチル－５－ビニルピリジンが挙げられる。ポリカチオンの非限定的な例としては、ポリ（エチレンイミン）、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ（アミドアミン）、およびポリ（アミノ－コ－エステル）が挙げられる。ポリカチオンの他の非限定的な例は、ポリクオタニウムである。「ポリクオタニウム」は、パーソナルケア産業で使用されるいくつかのポリカチオン性ポリマーの化粧品成分の国際命名法（ＩＮＣＩ）の名称である。ＩＮＣＩは、ポリクオタニウムの名称で異なるポリマーを承認している。これらは、「ポリクオタニウム」という用語に続く数値によって区別される。ポリクオタニウムは、ポリクオタニウム－１、－２、－４、－５～－２０、－２２、－２４、－２７～－３７、－３９、－４２、－４４～－４７として同定される。好ましいポリクオタニウムは、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）に対応するポリクオタニウム－６である。

実施形態では、コーティングは、着色された微小粒子を生じる１つ以上の染料を含む。この染料は、ナノクリスタルの表面上またはポリ電解質層上に直接配置することができる。

正に荷電された染料の非限定的な例としては、赤色染料＃２ＧＬ、薄黄色染料＃７ＧＬが挙げられる。

負に荷電された染料の非限定的な例としては、Ｄ＆Ｃ赤色染料＃２８、ＦＤ＆Ｃ赤色染料＃４０、ＦＤ＆Ｃ青色染料＃１、ＦＤ＆Ｃ青色染料＃２、ＦＤ＆Ｃ黄色染料＃５、ＦＤ＆Ｃ黄色染料＃６、ＦＤ＆Ｃ緑色染料＃３、Ｄ＆Ｃオレンジ色染料＃４、Ｄ＆Ｃ紫色染料＃２、フロキシンＢ（Ｄ＆Ｃ赤色染料＃２８）、およびサルファーブラック＃１が挙げられる。好ましい染料としては、フロキシンＢ（Ｄ＆Ｃ赤色染料＃２８）、ＦＤ＆Ｃ青色染料＃１、およびＦＤ＆Ｃ黄色染料＃５が挙げられる。

ナノクリスタルの間に散在する物質および／または孔壁に沈着した物質
以下に説明されるように、本発明の多孔質微小粒子は、ポロゲンエマルションを使用し、次いで、噴霧乾燥を使用して生成され、ポロゲンの液滴の周りにナノクリスタルおよび１つ以上のタンパク質を一緒に凝集させ、次いで、ポロゲンを除去することができる。エマルションは、典型的には、乳化剤、界面活性剤、補助界面活性剤などを使用して安定化され、そのような化合物は、典型的には、ポロゲン液滴内またはポロゲン液滴の表面に自ら配置することが周知である（かつ以下に説明される）。これらの化合物は、微小粒子の製造中に除去されても、されなくてもよい。これらの化合物が除去されない場合、それらはポロゲン除去によって作り出された細孔の壁に沿って微小粒子中に残る。したがって、実施形態では、微小粒子中の細孔壁上に堆積される１つ以上の物質が存在する。実施形態では、これらの物質は、乳化剤、界面活性剤、補助界面活性剤である。実施形態では、１つ以上のタンパク質は、これらの物質のうちの１つである。好ましい実施形態では、ゼラチンは、微小粒子中の細孔壁上に堆積される。他の物質には、アルギン酸塩、アルブミン、グリアジン、プルラン、およびデキストランが含まれる。

同様に、ポロゲンエマルションの連続相およびナノクリスタル懸濁液の液相の両方は、微小粒子の製造中に除去されない場合がある様々な物質を含み得る。これらの化合物が除去されない場合、それらはナノクリスタルの間に散在する微小粒子中に残る。これは、微小粒子を強化するためにナノクリスタルに結合効果を付与するために有用である。

本発明の微小粒子の製造方法
本発明の別の態様では、上記のセルロース微小粒子を生成するための方法が提供される。この方法は、
ａ）セルロースナノクリスタルの懸濁液および１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物の溶液を提供するステップと、
ｂ）懸濁液を溶液と混合して、混合物を生成するステップと、
ｃ）混合物を噴霧乾燥させて、微小粒子を生成するステップと、を含む。

本明細書では、「懸濁液」は、連続液相中に分散した固体粒子、本発明ではセルロースナノクリスタルを含む混合物である。典型的には、そのような懸濁液は、ナノクリスタルを、液相を構成する液体と激しく混合することによって提供され得る。この混合には、高圧ホモジナイザーまたは高速、高剪断ロータリーミキサーの適用と同様に超音波処理が使用され得る。好ましい液相は、水、好ましくは蒸留水である。

懸濁液は、懸濁液の総重量に基づいて、例えば、約０．１～約１０重量％の濃度でセルロースナノクリスタルを含み得る。懸濁液の粘度が高い場合、懸濁液を希釈して良好な分散を確実にすることができる。

溶液（懸濁液と混合する前）は、溶液の総重量に基づいて、例えば、約０．０１重量％～約５０重量％の濃度で、１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物を含み得る。２つ以上のペプチドまたはタンパク質が存在する場合、それらが別々の溶液中に提供され得ることが理解されるであろう。

懸濁液および溶液は、生成される微小粒子において所望のタンパク質対セルロースナノクリスタルの比率に対応する比率でステップｂ）において一緒に混合される。

ＣＮＣおよびフィブロイン溶液の混合は、溶液が均質になるまで、最小限の剪断力で行われる。

疎水性微小粒子を生成するためにフィブロインを使用するとき、混合物は、混合後直ちに噴霧乾燥されるべきである。

噴霧乾燥中、懸濁液の溶媒は、任意の他の低沸点成分とともに蒸発する。懸濁液はまず、溶媒（この場合は水）および他の低沸点化学物質が熱により除去される高温乾燥チャンバーに噴霧されるエアロゾルに変換される。残りの乾燥微粒子または微小粒子は、乾燥機の出口でサイクロンまたはバッグハウスを使用して収集される。

ペプチドまたはタンパク質とＣＮＣとの間の非共有結合は、噴霧乾燥によってマイクロビーズを形成するために、相分離前に溶解状態または懸濁状態で行われ得る。溶媒は、水または水中のナノエマルションであることが好ましい。タンパク質のＣＮＣへの非共有結合は、流体から固体状態への相の変化がある噴霧乾燥のプロセス中に行われる。

微小粒子のアセンブリ後、その形態は、光および走査型電子顕微鏡法によって決定することができる。微小粒子中のペプチド／タンパク質の濃度およびペプチド／タンパク質の空間分布は、アルゴンイオン深度プロファイリングを備えたＸ線光電子分光法によって、またはＸ線による空間分解エネルギー分散型分析（ＥＤＡＸ）を備えた集束イオンビーム深度および空間プロファイリングの技術によって測定され得る。

実施形態では、特にシルクフィブロインを使用するものでは、ステップｃ）の後、微小粒子は、例えば、メタノールまたはエタノールなどのアルコールで洗浄することができる。これは微小粒子の疎水性を増加させる傾向がある。

任意の機能分子の組み込み
上述のように、機能分子は、セルロースナノクリスタルおよび／またはペプチド／タンパク質に連結される。機能分子とセルロースおよび／またはペプチド／タンパク質との間の結合は、水素結合もしくはイオン性もしくはファンデルワールスもしくは疎水性相互作用、または非共有相互作用の組み合わせに基づく、共有結合または非共有結合のいずれかであり得る。機能分子とタンパク質および／またはＣＮＣとの非共有結合が好ましい。

機能分子とペプチドもしくはタンパク質および／またはＣＮＣとの間の共有結合または非共有結合は、噴霧乾燥によってマイクロビーズを形成するために、相分離前に溶解状態または懸濁状態で行われ得る。

溶媒は、水または水中のナノエマルションであることが好ましい。

機能分子をタンパク質および／またはＣＮＣに非共有結合させるために、機能分子、ペプチド／タンパク質、およびＣＮＣはすべて、同じ溶媒中（すなわち、ステップｂ）の混合物中）に溶解または懸濁される。あるいは、機能分子およびペプチド／タンパク質は、同じ溶媒中に（すなわち、ステップａ）の溶液中）に溶解され、次いで、両方の組み合わせがＣＮＣの懸濁液（ステップｂ））に添加されるか、またはＣＮＣの懸濁液は、ペプチド／タンパク質および機能分子の組み合わせに添加される。別の代替として、機能分子は、ＣＮＣと溶解または懸濁され（すなわち、ステップａ）の懸濁液中）、この組み合わせは、ペプチド／タンパク質溶液に添加されるか（ステップｂ）の間）、またはペプチド／タンパク質溶液は、機能分子およびＣＮＣ懸濁液の組み合わせに添加される。

実施形態では、ステップａ）の溶液もしくは懸濁液、またはステップｂ）の混合物に添加される前に、機能分子はまず、特に機能分子が疎水性である場合、水以外の溶媒中に溶解され得る。あるいは、機能分子はまず、ナノエマルション中に溶解され得る。

タンパク質および／またはＣＮＣへの機能分子の非共有結合は、流体から固体状態への相の変化がある噴霧乾燥のプロセス中に行われる。

機能分子が染料である場合、染料濃度は、光度的に決定することができ、表面における染料分布は、ハイパースペクトルイメージングによって決定することができる。

タンパク質は、典型的には荷電された分子であるため、タンパク質とは反対の電荷を担持する色素などの機能分子は、マイクロビーズの消滅スペクトルを測定することによってアッセイすることができる。この場合、タンパク質／ＣＮＣマイクロビーズの電荷密度および電荷効率、すなわち、タンパク質／ＣＮＣマイクロビーズに結合した機能染料分子の百分率を決定することが可能である。

多孔質微小粒子の製造
多孔質微小粒子が所望される場合、この方法をわずかに修正することができる。得られる方法は、
ａ）セルロースナノクリスタルの懸濁液、１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物の溶液、およびポロゲンのエマルションを提供することであって、１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物のいずれかの溶液が、エマルションの一部であるか、または単独である、提供するステップと、
ｂ）懸濁液を溶液およびエマルションと混合して、ポロゲンの液滴が分散され、セルロースナノクリスタルが懸濁され、１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物が溶解される連続液相を含む混合物を生成するステップと、
ｃ）混合物を噴霧乾燥させて、微小粒子を生成するステップと、
ｄ）微小粒子中で細孔を形成するための噴霧乾燥中にポロゲンが十分に蒸発していない場合、ポロゲンを蒸発させるか、またはポロゲンを微小粒子から浸出させるステップと、を含む。

噴霧乾燥中、ナノクリスタルは、ポロゲン液滴の周りに自ら配置する。次いで、ポロゲンは除去される（微小粒子内に細孔を作り出す）。ポロゲン除去は、噴霧乾燥中に（ポロゲンが十分に揮発性である場合）自然に起こり得るか、またはそれ以外の場合にはポロゲンはその後のステップｄ）で除去される。

本明細書では、「エマルション」は、分散相と呼ばれる１つの液体が、連続相と呼ばれる他の液体中の液滴の形態で分散される、不混和である２つ以上の液体の混合物である。上記のすべてのタイプのエマルションを本方法で使用することができる。しかしながら、本方法で使用され得るマクロエマルションは、分散相の液滴が最大でも約５μｍの直径を有するマクロエマルションに限定される。

エマルションは、典型的には、分散相液滴の分散を促進する１つ以上の界面活性剤、ならびに場合によっては補助界面活性剤および補助溶媒を使用して安定化される。マイクロエマルションは、超低表面張力と構造形成の好ましいエネルギーの結果として自然に形成される。マイクロエマルションの自然形成は、界面活性剤、補助界面活性剤、および補助溶媒の相乗的相互作用に起因する。マイクロエマルションは、熱力学的に安定である。それらの粒子サイズは、経時的に変化しない。マイクロエマルションは、希釈、酸性化、または加熱されると、物理的に不安定になり得る。ナノエマルションおよびマクロエマルションは、自然には形成されない。それらは、油、水、および界面活性剤の混合物に剪断を加えることによって形成されなければならない。ナノエマルションおよびマクロエマルションは、動力学的には安定しているが、熱力学的には不安定であり、それらの粒子サイズは、合体、軟凝集、および／またはオストワルド熱成を介して経時的に増加する。

ポロゲンのエマルションを提供するステップｂ）は、互いに不混和である２つの液体を、必要な場合に乳化剤、界面活性剤、および／または補助界面活性剤と任意に一緒に混合して、２つの不混和液体のうちの一方の液滴が、２つの不混和液体のうちの他方の連続相で分散されるエマルションを形成することを含む。

本明細書では、「ポロゲン」という用語は、ステップａ）およびｂ）で液滴中に存在し、かつステップｃ）および／またはｄ）で微小粒子から除去され、したがって微小粒子中に細孔を形成する、分散相（不混和液体、乳化剤、界面活性剤、および／または補助界面活性剤、ならびにいずれかの他の任意の添加剤のうちの１つ）の構成成分である。典型的には、ポロゲンは、液滴を形成する液体（エマルションに含まれる２つの不混和液体のうちの）を含む。ポロゲンはまた、乳化剤、界面活性剤、および／または補助界面活性剤を含んでもよいが、これらのうちのいくつかは、上で説明されるように残されてもよい（すなわち、ポロゲンではない）。

ステップｃ）において、噴霧乾燥は、セルロースナノクリスタルをポロゲン液適の周りにアセンブリさせ、ポロゲン液滴を閉じ込め、微小粒子に凝集させる。さらに、ポロゲンが十分に低い沸点を有する場合、噴霧乾燥は、微小粒子中に細孔を作り出すポロゲン液滴の蒸発を引き起こす。ポロゲンが十分に低い沸点を有していない場合、噴霧乾燥ステップｃ）の間、ポロゲンは部分的にしか蒸発しないか、または全く蒸発しない。そのような場合、所望の細孔を形成するために、ステップｄ）の間に微小粒子からポロゲンが除去される。したがって、ステップｄ）は、任意である。これは、噴霧乾燥中にポロゲンが蒸発していない（または十分に蒸発していない）場合にのみ実行する必要がある。

噴霧乾燥中に典型的に蒸発するポロゲンの例、すなわち、「自己抽出ポロゲン」には、以下が挙げられる。

●リモネンおよびピネン、カンフェン、３－カレン、リナロール、カリオフィレン、ネロリドール、ならびにフィトールなどのテルペン、
●ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、およびドデカンなどのアルカン、
●トルエン、エチルベンゼン、およびキシレンなどの芳香族炭化水素、
●ペルフルオロデカリン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロオクチルブロミド、およびペルフルオロブチルアミンなどのフッ素化炭化水素。

ステップｄ）は、ポロゲンの蒸発または微小粒子からのポロゲンの浸出である。これは、微小粒子の完全性が維持される限り、任意の方法によって達成することができる。例えば、蒸発は、加熱、真空乾燥、流動床乾燥、凍結乾燥、またはこれらの技術の任意の組み合わせによって達成することができる。浸出は、微小粒子を、セルロースＩナノクリスタルの非溶媒でありながらポロゲンを溶解する（すなわち、それはポロゲン溶媒である）液体に曝露することによって達成することができる。

微小粒子中のタンパク質としてのフィブロインの使用
微小粒子中で使用されるフィブロインは、任意のフィブロインであってもよい。非限定的な例としては、ガム性の（依然としてセリシンを含む）シルク繭およびシート、ならびに脱ガムされたシルクトップス、ハンカチ、およびブリック、ならびに化粧用グレードのシルク粉末から得られるフィブロインが挙げられる。

ガム性のおよびシートからフィブロインを得るには、脱ガム、続いてフィブロイン溶解という２つのプロセスステップが必要であった。対照的に、脱ガムされたシルクトップス、ハンカチ、およびブリックならびに化粧品グレードのシルク粉末からフィブロインを得るには、フィブロイン溶解という１つのプロセスステップのみが必要であった。脱ガムおよびフィブロイン溶解の方法は、当業者に周知である。

上記のように、フィブロインは、微小粒子上の重量に基づいて、０．５重量％の低い濃度で使用しても、疎水性微小粒子を生成することを可能にする。しかしながら、上記にもあるように、上記の方法のステップｂ）で得られた混合物は、できるだけ早く噴霧乾燥させる必要がある。実際に、懸濁液を３日間を超えて放置しても、疎水性微小粒子は生じない。

本発明の微小粒子の利点
実施形態では、本発明の微小粒子は、以下の利点のうちの１つ以上を有し得る。

それらは、ペプチドおよび／またはタンパク質の利益を組み合わせると同時に、微小粒子の構造的完全性を保持する生分解性マトリックス内でそれらを宿主化する。出願者らは、これが、ＣＮＣタンパク質マイクロビーズを作製するための噴霧乾燥のプロセスによって、ペプチドおよび／またはタンパク質をセルロースナノクリスタル（ＣＮＣ）とブレンドすることによって、有利に達成され得ることを発見した。この製造方法は、有利には、少ないステップを必要とする。

上記のように、いくつかの実施形態（微小粒子シルクフィブロインを含む）では、微小粒子の特性を親水性から疎水性／疎油性にすることが可能である。これは、化粧品産業において、これらの後者の特性を呈するマイクロビーズの必要性が存在するために有利である。実際に、そのような微小粒子は、油、ワックス、および多くの石油系ポリマーなどの親水性または親油性宿主培地と有益に適合性である。さらなる詳細は、本発明の微小粒子を含む化粧品用調製物であり、次のセクションで提供される。

特に、出願者は、ＳＦとカルボキシル化または硫酸化ＣＮＣとの組み合わせが、一緒に噴霧乾燥すると、疎水性および親油性である複合カルボキシル化セルロース／ＳＦまたは硫酸化セルロース／ＳＦマイクロビーズが得られることを驚くべきことに発見した。この発見は、セルロースナノファイバーおよびセルロースナノクリスタルを含むセルロース／ＳＦ複合体に関する文献が、セルロースと組み合わせたＳＦが親水性であり、場合によっては水分保持の向上を示すことを示しているため、驚くべきことである。以下に記載されるようなＳＦの組み込みが、親水性マイクロビーズを親油性マイクロビーズに変換するために必要なコーティングステップの数および複雑性を低減させるため、この発見はさらに重要である。

本発明の微小粒子では、ＣＮＣとペプチドとの間に形成される結合は、非共有結合であり、すなわち、共有結合が存在しないことが好ましい。タンパク質とＣＮＣとの間の共有化学結合の形成は、いくつかの理由から望ましくない。例えば、メイラード反応は、タンパク質－ＣＮＣ複合体に望ましくない焦げ茶色の着色を付与する。これにより、そのような複合体は化粧品における用途に好ましくなくなる。

微小粒子が天然かつ持続可能に供給されることは有利である。実際に、化粧品およびパーソナルケア産業は、「自然に供給される」生成物の創出に向けて動いている。この用語は定義することが難しく、ＩＳＯグループは「自然由来指数」を定義することにより問題にアプローチしてきた。自然由来指数は、化粧品成分がＩＳＯ １６１２８－１：２０１６第２項の自然成分の定義を満たす程度を示す値である。この値は、０～１の間で変化すると解釈することができ、１は、１００％自然（「オーガニック」起源の）と解釈することができる。化粧品産業は、成分の生成に持続可能な製造方法を使用し、高い自然由来指数を確実にし、ＧＭＯ添加物を除外するよう、成分の供給業者に圧力をかけている。したがって、本発明が提供する天然源に全体的または部分的に由来する親油性／疎水性マイクロビーズの必要性が存在する。

本発明の微小粒子は、質感の望ましい変化、皮膚感触の向上のための配合の容易さ、ソフトフォーカスなどの望ましい光学特性のために、および皮膚化粧品（ｄｅｒｍｏｃｏｓｍｅｔｉｃ）のために、消費者に新たな利益をもたらすことができる。

実施形態では、本発明の微小粒子はまた、担持され得る機能分子によって皮膚にさらなる利益をもたらすことができる。上記のように、これらの利益には、例えば、紫外線光および青色光に対する保護、抗酸化および抗老化特性、保湿効果、ならびに色が含まれる。

本発明の微小粒子の使用
本発明の微小粒子は、化粧品用調製物において使用することができる。例えば、それらは、そのような調製物において現在使用されているプラスチックマイクロビーズを置き換えることができる。したがって、本発明の別の態様では、上記の微小粒子および１つ以上の化粧品用に許容される成分を含む化粧品用調製物が提供される。

化粧品用調製物におけるこれらの化粧品用に許容される成分の性質は、重要ではない。化粧品用調製物を生成するために、当業者に周知の成分および配合を使用してもよい。

本明細書では、「化粧品用調製物」は、クレンジング、美化、魅力の促進、または外観の変化のために、人体に擦り付ける、注ぐ、ふりかける、もしくは噴霧する、導入する、またはそれ以外の方法で適用することを意図した製品である。化粧品には、以下に適用され得る製品が含まれるが、これらに限定されない。

●顔、例えば、スキンケアクリームおよびローション、クレンザー、トナー、マスク、角質除去剤、保湿剤、プライマー、口紅、リップグロス、リップライナー、リッププランパー、リップバーム、リップステイン、リップコンディショナー、リッププライマー、リップブースター、リップバター、タオレット、コンシーラー、ファンデーション、フェイスパウダー、ブラッシュ、コントゥアパウダーもしくはクリーム、ハイライトパウダーもしくはクリーム、ブロンザー、マスカラ、アイシャドウ、アイライナー、アイブロウペンシル、クリーム、ワックス、ジェル、または粉末、セッティングスプレーなど；
●体、例えば、香水およびコロン、スキンクレンザー、保湿剤、デオドラント、ローション、粉末、ベビー用品、バスオイル、バブルバス、バスソルト、ボディローション、ならびにボディバターなど；
●手／爪、例えば、指の爪および足の爪の研磨剤と、手指消毒剤など；ならびに
●髪、例えば、シャンプーおよびコンディショナー、永久化学物質、ヘアカラー、ヘアスタイリング製品（例えば、ヘアスプレーおよびジェル）など。

化粧品は、装飾品（すなわち、化粧品）、パーソナルケア製品、または同時にそれらの両方であり得る。実際に、化粧品は、非公式に次のように分けられる。

●主に使用者の外観を変化させることを意図する着色顔料を含む製品である、「化粧」製品、ならびに
●主に皮膚／身体／髪／手／爪の完全性を補助し、その外観もしくは魅力を向上させ、かつ／またはこれらの身体部分に影響を与えるいくつかの状態を緩和する製品である、残りの製品を包含する「パーソナルケア」製品。

両方のタイプの化粧品が本発明に包含される。

化粧品のサブセットには、それらが疾患の診断、治癒、緩和、治療、もしくは予防における使用のためを意図しているため、または人もしくは他の動物の身体の構造もしくは任意の機能に影響を与えることを意図しているため、「薬物」ともみなされる化粧品（主にパーソナルケア製品）が含まれる。例としては、ふけ防止シャンプー、制汗剤でもあるデオドラント、日焼け止めクレームまたは抗アクネクレームで市販されている保湿剤および化粧品などの製品が挙げられる。化粧品のこのサブセットもまた本発明に包含される。

皮膚感触は、化粧品用調製物の非常に重要な特性である。良好な、または好ましくは優れた皮膚感触を有する調製物は、客に好まれる。

皮脂を吸収する微小粒子は、皮膚をより光沢がなく、したがってより自然に見えるようにするため、望ましく（微小粒子が白色でない場合）、これは、マット効果と称される。

化粧品産業では、（上記の定義に従って）疎水性であり同時に親油性であるマイクロビーズの必要性が存在する。親油性化合物は、脂肪、油、脂質、およびヘキサンもしくはトルエンのような非極性有機溶媒中に溶解するか、またはそれと適合性である傾向を有する。このようなマイクロビーズは、油中水型エマルション、および他のほとんど親油性の媒体（口紅のような）においてより容易に配合されるという利点を有する。

環境上の懸念から、多孔質プラスチックマイクロビーズを含むプラスチックマイクロビーズは、世界中で禁止されるか、または禁止されているため、同じ利点（調整可能な油の取り込みおよびマット効果）をもたらすが、より環境に優しい微小粒子にそれらを置き換える必要がある。したがって、本明細書で提供されるものなどの、油取り込みが改善され、親油性であり、皮膚感触が改善された微小粒子は、化粧品産業に有利である。それらは、その利益を維持しながら、プラスチックマイクロビーズを置き換えることができる。

定義
本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）における用語「ａ」および「ａｎ」ならびに「ｔｈｅ」および同様の指示対象の使用は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別段の記載がない限り、非限定的な用語として解釈されるべきである（すなわち、「含むが、これらに限定されない」を意味する）。

本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、その範囲内に収まる各々の別個の値を個別に指す速記法としての役割を果たすことを意図するに過ぎず、各々の別個の値は、本明細書に個別に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。また、範囲内の値のすべてのサブセットは、本明細書で個別に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行われ得る。

本明細書で提供される任意の例およびすべての例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良く示すことを意図しているに過ぎず、別段の主張がない限り、本発明の範囲に制限を与えるものではない。

本明細書中の言語は、本発明の実施に不可欠であると主張されていないあらゆる要素を示すものとして解釈されるべきではない。

本明細書では、「約」という用語はその通常の意味を有する。実施形態では、それは、適格な数値のプラスもしくはマイナス１０％またはプラスもしくはマイナス５％を意味し得る。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

本発明の他の目的、利点、および特徴は、添付の図面を参照してのみ例として与えられる、以下の特定の実施形態の非制限的な説明を読むとより明白になるであろう。

例示的な実施形態の説明
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に例示される。

様々なセルロースナノクリスタル（ＣＮＣ）懸濁液の調製
ＣＮＣ懸濁液＃１－カルボキシル化ＣＮＣ
以下の出発物質として使用されるセルロースナノクリスタル懸濁液は、ＷＯ２０１６＼０１５１４８Ａ１に提供される方法を使用して生成される。

簡単には、溶解パルプ（Ｔｅｍａｌｆａ ９３）を、３０％過酸化水素水溶液に溶解し、８時間の期間にわたって激しく撹拌しながら還流するまで加熱した。得られた懸濁液を水で希釈し、ダイアフィルトレーションにより精製し、次いで、水酸化ナトリウム水溶液で中和した。

カルボン酸ナトリウムナノクリスタルセルロース（ｃＣＮＣ）の得られた濃縮ストック懸濁液は、典型的には、蒸留水中の４％のＣＮＣから構成された。この懸濁液をそのまま使用するか、または以下の実施例で使用するために必要に応じて蒸留水で希釈した。

ｓＣＮＣ懸濁液＃２－硫酸化ＣＮＣ
硫酸化ＣＮＣを、Ｒｅｖｏｌら（Ｄｏｎｇ，Ｘ．；Ｒｅｖｏｌ，Ｊ．－Ｆ．；Ｇｒａｙ，Ｄ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｔｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌｏｉｄ ｃｒｙｓｔａｌｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ １９９８，５（１），１９－３２）の方法に従って調製した
実施例１～７－フィブロイン／セルロース微小粒子
フィブロイン溶液＃１の調製
１～２ｇのシルクフィブロイン（池田株式会社製－化粧品グレードのフィブロイン粉末）を、５．５５ｇのＣａＣｌ_２、４．６ｇのエタノール、７．２ｇの蒸留水（ＣａＣｌ_２：エタノール：Ｈ_２Ｏのモル比は１：２：８である）に８０℃で添加した。（注意：アジサワ溶剤混合物は熱が多く発生する。）シルクフィブロインを押し下げると、溶媒中に完全に浸漬した。２０～３０分後、フィブロインは完全に溶解したように見え、溶液は黄色の色合で透明になった。

フィブロイン溶液をセルロース透析チューブにピペッティングし、３．５Ｌのガラスビーカー内で蒸留水に対して透析した。初日は１時間毎に水を交換し、次いで、半日毎に交換した。透析の全プロセスには３日かかった。

透析後の透析チューブ中の溶液のフィブロイン濃度は、１．５～２．０重量％であった。

他の供給源から得られたフィブロインの使用、または他の試薬を使用して溶解されたフィブロインの使用
本発明者らは、ガム性の（依然としてセリシンを含む）シルク繭およびシート、ならびに脱ガムされたシルクトップス、ハンカチ、およびブリック、ならびに化粧用グレードのシルク粉末から得られるフィブロインを使用した。インド、ラオス、日本、および中国のシルクが使用され得る。これらの出発物質を使用して、以下に記載される様々な方法によってフィブロイン溶液を生成した。すべての場合において、得られたフィブロインは、フィブロイン溶液＃１を使用する場合に、本明細書に報告されるものと同様の疎水性を有する疎水性フィブロイン含有セルロース微小粒子を生成した。

ガム性の繭およびシートからフィブロインを得るには、脱ガム、続いてフィブロイン溶解という２つのプロセスステップが必要であった。対照的に、脱ガムされたシルクトップス、ハンカチ、およびブリックならびに化粧品グレードのシルク粉末からフィブロインを得るには、フィブロイン溶解という１つのプロセスステップのみが必要であった。

脱ガム－炭酸ナトリウムを使用したアルカリ性方法
水中２．１２ｇの炭酸ナトリウム／Ｌの濃度の炭酸ナトリウムを含む水溶液を沸騰させた。水が沸騰し均質になると、シルクを添加し、溶液を１５～３０分間沸騰させ、時折撹拌してセリシンの均一な除去を確実にした。次いで、繊維を沸騰している液体から取り出し、冷たい脱イオン水ですすいだ。過剰な水を絞り出し、繊維を１Ｌの脱イオン水に添加し、２０分間時折撹拌した。繊維を水から取り出し、過剰な水を絞り出した。水を廃棄し、このすすぎプロセスをさらに２回繰り返して、炭酸ナトリウムを完全に洗い流した。最後にフィブロインを水から取り出したとき、いかなる過剰な水も絞り出し、繊維をきれいな一枚のアルミホイルに広げ、一晩乾燥させた。次いで、これらの繊維を使用するまで室温で保存した。

フィブロイン溶解
いくつかの方法がフィブロインを溶解するために使用されており、
●ＬｉＢｒ法（９．３ＭのＬｉＢｒ水溶液）
●アジサワ法（ＣａＣｌ_２／ＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏ）
これらのすべてを以下に例示する。典型的には、シルク粉末は、シルク繊維よりも容易に溶解し、フィブロインが溶液中に入るのにより低い温度／より少ない時間が必要とされた。

フィブロインが完全に溶解したかどうかを試験するために、任意の精製ステップ（以下にも記載される）に進む前に目視検査を行った。フィブロインは、懸濁した粒子の目に見える兆候がなかったときに完全に溶解したとみなした。

精製後、フィブロイン溶液を冷蔵庫で最大１０日間保存した。

ＬｉＢｒ法
９．３ＭのＬｉＢｒ溶液を調製し、これは発熱プロセスであるため、ＬｉＢｒを水にゆっくりと添加することを確認した。必要量の脱ガムされたフィブロインを、すべての構成要素に適合することができる最小の容器に詰めた。ＬｉＢｒ溶液を、脱ガムされたフィブロイン１ｇ当たり４ｍＬの９．３ＭのＬｉＢｒ溶液の濃度で、シルクの上に添加した（ＬｉＢｒ溶液は、シルクの後に容器に導入しなければならない）。混合物を、高度に粘性になるまで５５～６０℃のオーブンに４時間放置したが、目に見える繊維はそれ以上含まれなかった。得られた溶液を透析チューブに入れ、水（１Ｌの水／１２ｍＬのフィブロイン溶液）に対して透析した。水を１時間、４時間、その夕方、翌朝、および翌日の夜、ならびに翌日の朝の後に置き換え（すなわち、４８時間以内に６回の水の交換）、所望のフィブロイン溶液を得た。

時に、繭からフィブロインを得た場合、固体破片がフィブロイン溶液中に存在していた。そのような場合、破片を、９０００ｒｐｍで２０分間、好ましくは４℃で（ただし、室温も使用した）遠心分離機を使用して除去した。

アジサワ法
１：２：８のモル比のＣａＣｌ_２／ＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏの溶液を調製した。シルクフィブロイン１ｇ当たり８～９ｇの溶液を使用した。シルクを溶液によって完全に湿潤させ、次いで、すべての繊維が溶解するまで（典型的には、２０～１２０分かかった）、５０～１００℃の温度でオーブンに入れた。

溶解したフィブロインを含む溶液を、透析またはサイズ除外カラム（ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのセファデックスＧ－２５脱塩樹脂）のいずれかの２つの方法のうちの１つを使用して精製した。サイズ除外カラムを使用する場合、溶液を水（１０ｇの水／１ｇのフィブロイン）で希釈した、次いで、溶液を脱塩カラムに通した。透析を使用する場合、溶液を透析チューブに移し、水に対して透析した（約１Ｌの水／１ｇのフィブロインを使用した）。初日は１時間毎に、次いで、４８時間にわたって半日毎に水を置き換えた。

フィブロイン／セルロース微小粒子の疎水性応答の測定
疎水性応答の単純な定性的決定は、水をはじくその傾向の尺度である。したがって、微小粒子の疎水性応答は、以下の２つの方法のいずれかで視覚的に決定することができる。

●ガラス顕微鏡スライドに粉末の試料を配置し、水を添加することによって、水が粉末を湿潤させるか、粉末によってはじかれるかを確認する。

●粉末（約１０ｍｇ）の試料を０．５ドラムバイアルに入れ、次いで、１ｍＬの水をそれに添加する。次いで、キャップをしたバイアルを５秒間振盪する。混合物が沈降すると、粉末は水面上に浮かぶか（疎水性基準）、または水中に分散する（親水性基準）かのいずれかである。

次いで、疎水性の定性的尺度もまた、この目的のために設計された油中水型エマルションで試験される。エマルション組成物および手順は以下の通りである。

以下のようにエマルションを調製した。

１．相１の成分を、４００ｒｐｍで、ノコギリ歯の刃を備えたＲａｙｎｅｒｉミキサー上で５分間、７５℃で混合した。

２．相２の成分を相１に添加し、５００ｒｐｍで２×５分間混合した。

３．相３の成分を合わせて、７５℃まで加熱しながら、４００ｒｐｍで、磁気撹拌プレート上で混合した。

４．相３を、６００ｒｐｍから１２００ｒｐｍまで撹拌速度を増加させながら、相１＋２にゆっくりと添加した。

５．エマルションが形成されると、７５℃で加熱しながら、速度を５分間２５００ｒｐｍに増加した。

６．エマルションを、３００ｒｐｍでゆっくり混合しながら、室温に冷却した
親水性が高いセルロース微小粒子は、水相を好むため油中水型エマルション中に集塊し、これはこれらのエマルション系において分散した液滴として存在する。実際に、個々の微小粒子が水相に移動すると、それらは水滴中に凝集して集塊がもたらされる。したがって、親水性微小粒子は、それらが容易に視覚的に見えるまで、最終的に漸進的に大きな粒子に集塊する。対照的に、油中水型エマルション中の凝集は、疎水性微小粒子については観察されない。

実施例１－シルクフィブロインを有するカルボキシル化ＣＮＣからの疎水性フィブロイン／セルロース微小粒子
ＣＮＣ懸濁液＃１（２．１７重量％のＣＮＣ）を、ＣＮＣ含有量に対する最終的なフィブロイン含有量が２重量％となるように、フィブロイン溶液＃１（１．８重量％）と混合した。ＣＮＣおよびフィブロイン溶液を、体積サイズの効率的な撹拌を確実にする最小限の剪断力で一緒に混合した。溶液が１０分以内に均質になるまで混合を行った。懸濁液を直ちに噴霧乾燥した（Ｔｅｃｈｎｉ Ｐｒｏｃｅｓｓ噴霧乾燥機モデルＳＤ－１；入口温度１９０℃、出口温度８９～９２℃、ノズル圧力２バール、差圧１８０ｍｍ ＷＣ）。噴霧乾燥後、得られた自由流動性粉末白色粉末をエタノールのようなアルコールで洗浄し、続いて８０℃のオーブンで３０分間おき、疎水性効果を増加させてもよい。得られた微小粒子は、２重量％のシルクフィブロイン含有量を有した。

図２Ａ）は、水を添加した得られた粉末の試料を示す。粉末が湿潤しているのではなく、水滴の表面上にあることが明らかに見られる。これは、微小粒子が疎水性であることを示す。

図３Ａ）は、上記の油中水型エマルションを混合して得られた粉末を示す。微小粒子が疎水性であることを示す凝集体は観察することができない。

実施例２－０．５重量％～５０重量％の範囲のシルクフィブロイン含有量～カルボキシル化ＣＮＣ含有量を有する疎水性フィブロイン／セルロース微小粒子。

疎水性微小粒子を実施例１に記載されるものと同じ方法で得た。

より具体的には、シルクフィブロイン溶液（２重量％）を、ＣＮＣ懸濁液＃１（０．５重量％）に激しく撹拌しながら添加し、それぞれ５重量％、１０重量％、２０重量％、および５０重量％ＳＦの溶液を得た。得られた懸濁液を、Ｂｕｃｈｉ Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ ＤｒｙｅｒモデルＢ－１９１上で噴霧乾燥させた（入口温度１７５℃および出口温度１００℃、ポンプ速度３０％、吸引器７０％）。いくつかの試料をメタノールで処理して、マイクロビーズ中のβプリーツシートＳＦの割合を増加させた。

得られた粉末は疎水性であった。

図４は、得られた微小粒子のＳＥＭ画像を示す。

比較のために、図５は、シルクフィブロインのみを噴霧乾燥することによって得られた微小粒子を示す（すなわち、ＣＮＣを含まない）。

βプリーツシート形態におけるＳＦの存在は、ＳＦをＣＮＣと混合してハイブリッドＳＦ／ＣＮＣ微小粒子を作製するときに付与される疎水性効果に関連しているように思われる。ＳＦの一部は、ハイブリッドマイクロビーズの表面または表面下付近に濃縮されなければならないように思われ、そうでない場合、マイクロビーズは水によって湿潤され得る。

マイクロビーズ中のβプリーツシートＳＦの相対量を、アミド延伸領域の領域１５８０～１７２０ｃｍ^－１における赤外線吸収に寄与するＳＦ鎖立体配座のパーセンテージを分析することによって決定した。ＦＴＩＲスペクトルを、４００ｃｍ^－１～４０００ｃｍ^－１のスペクトル領域内のミクロスフェア粉末についてＢｒｕｋｅｒ ＡＬＰＨＡ ＦＴＩＲ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＵＳＡ）で測定し、４ｃｍ^－１の公称分解能で、６０回のスキャンで取得した。βプリーツシート、βターン、αヘリックス、ランダムコイル、および凝集鎖の相対的寄与を、ガウスデコンボリューションでの標準曲線適合によって決定した（ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ２０１８ｂソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＳＡ））。メタノールを使用して、シルクフィブロインの不溶性βシート状態への立体配座転移を誘導した。図６は、メタノール（ＭＴなし）で処理する前およびメタノール（ＭＴ）で処理した後のマイクロビーズの試料中のβプリーツシートのパーセンテージを示す。図は、メタノール処理が、マイクロビーズ中のβプリーツシートＳＦのパーセンテージを増加させることを示す。

Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）は、表面の上部１０ｎｍをプローブする高感度表面分析法である。スパッタリングまたはエッチングソースと組み合わせて、基礎物質を損傷することなく、分析サイクルの間に物質をゆっくりと除去すると、深度プロファイリングＸＰＳは、高解像度の化学分析を可能にする。２％ＳＦ／ＣＮＣマイクロビーズ試料中のＳＦの空間的位置は、深度プロファイリングＸＰＳによって決定することができる。ＸＰＳ測定は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ－Ａｌｐｈａ分光計を用いて行った。５００ｅＶおよび１．００μＡの電流のエネルギーを有するアルゴンイオンガンを、１０サイクルで３００秒間行った深度プロファイリングに使用した。フラッドガンをオンにして、各エッチングレベルでＸＰＳを行った。Ｘ線の放出角は標本表面に対して９０度であった。分析された領域の直径は４００μｍであった。１０分間のエッチングは、１μｍのエッチング深さに相当したと推定された。スペクトルをデコンボリューションし、得られた曲線はそれらの結合エネルギーに従って異なる種類の結合に起因した。分解曲線の積分は、原子窒素パーセンテージの計算を可能にした。図７は、マイクロビーズにおける２％の負荷でのＳＦに関連する窒素１ｓピークの深度プロファイルを示す。時間の関数として、窒素について３９９．７ｅＶでピークに達した結合エネルギー強度を測定することによって、深度プロファイリングを達成した。スペクトルを、２８５．０ｅＶの結合エネルギーでの脂肪族炭素のＣ１ｓピークに参照した。図において、位置１は、Ａｒ＋侵食のないマイクロビーズの表面を指す。位置２～１０は、５分単位のＡｒ＋侵食であり、したがって、マイクロビーズの内部のタンパク質含有量の尺度である。図は、２％ＳＦ／ＣＮＣマイクロビーズ中のＳＦが表面でより濃縮され、次いで、試料中のマイクロビーズの内部でより均一に分布していることを示す。

水溶性色素分子であるメチレンブルー（ＭＢ）は、ＳＦを含まないＣＮＣマイクロビーズによってほぼ瞬時に取り込まれる。したがって、ＳＦ／ＣＮＣマイクロビーズの疎水性バリア特性の別の尺度は、ＭＢ取り込みを測定することである。ＳＦ／ＣＮＣマイクロビーズ上のメチレンブルー取り込みおよび放出を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（商標）２６０ Ｂｉｏ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）で測定した。メチレンブルーをＡｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｈｅｙｓｈａｍ，ＵＫ）から入手し、メタノールをＦｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ，ＵＳＡ）から入手し、アセトンをＡｎａｃｈｅｍｉｃａ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。取り込みおよび放出試験を、メタノールで処理していないミクロスフェアおよびメタノールで処理したミクロスフェアで同じように行った。メタノール処理のために、ＳＦ／ＣＮＣミクロスフェア（１００ｍｇ）を、メタノール水溶液（８０重量％、１００ｍＬ）中で一晩放置し、濾過し、アセトンで洗浄した。取り込みのモニタリングのために、ＳＦ／ＣＮＣミクロスフェア（５ｍｇ）を、メチレンブルー溶液（１０ｍｇ／Ｌ、３ｍＬ）に浸漬し、混合した。測定を１６時間行い、６６５ｎｍの波長および７５０ｎｍの基準波長で、１０分毎に測定した。放出のモニタリングのために、試料を、ＳＦ／ＣＮＣマイクロビーズ（１００ｍｇ）をメチレンブルー溶液（７８ｍｇ／Ｌ、４５ｍＬ）中に一晩浸漬し、濾過し、アセトンで洗浄することによって調製した。測定は、染色したマイクロビーズ（５ｍｇ）を水（３ｍＬ）中に浸漬し、混合し、６６５ｎｍの波長および７５０ｎｍの基準波長で７２時間、１時間毎に測定することによって行った。図８は、メタノールによる処理ありおよびなしの、２％ＳＦ／ＣＮＣマイクロビーズによるＭＢの取り込みおよび放出を示す。ＳＦを含まないＣＮＣマイクロビーズと比較して、ＭＢは、約２００時間後（メタノール処理なし、ＭＴなし）および約２５０時間後（ＭＴ）にのみＳＦハイブリッドビーズによって取り込まれ始める。ＭＢの放出は、主にマイクロビーズの表面から生じる。これは、ほぼ瞬間的な放出動態（右側の曲線）および急速なプラトーで顕著である。ＭＴビーズよりもＭＴなしのビーズからより多くの色素が放出され、ＭＴなしの試料中のβプリーツシートＳＦの量が少ないことと一致する。

実施例３－２％シルクフィブロインを有する硫酸化ＣＮＣからの疎水性フィブロイン／セルロース微小粒子
疎水性セルロースマイクロビーズを、シルクフィブロインおよび硫酸化ＮＣＣを使用して調製した。

したがって、硫酸化ＣＮＣ懸濁液＃２（０．４７６ｇ ｓＮＣＣ）の７０ｍＬの０．６８重量％溶液を、磁気撹拌バーを備えた撹拌プレート上で、２００ｒｐｍで撹拌した。次いで、０．４６４ｍＬの２．０５重量％（９．５２ｍｇ）のフィブロイン溶液＃１を、一定に撹拌しながらゆっくりと添加した。流体が均質になるまで１０～１５分間撹拌を続けた。次いで、懸濁液を噴霧乾燥させた（Ｂｕｃｈｉ噴霧乾燥機モデルＢ１９１：入口温度１６５～１８５℃、ポンプ速度３０％、吸引器７０％、空気圧６００Ｎｌ／時間）。自由流動性白色粉末を生成した。

上に記載されるように試験すると、粉末は疎水性であることが判明した。

実施例４－多孔質疎水性フィブロイン／セルロース微小粒子
この実施例は、ナノエマルションが不揮発性油／界面活性剤系から調製されるときに、多孔質疎水性フィブロイン／セルロース微小粒子が生成され得ることを示す。

以下のように４００ｎｍのナノエマルションを調製した。０．０２１ｇのＭｏｎｔａｎｏｖ（商標）８２（ＳＥＰＰＩＣ）を、６０℃で４７０ｍｌの蒸留水に溶解した。次いで、１０ｇの安息香酸アルキルを、Ｍｏｎｔａｎｏｖ（商標）８２溶液に注ぎ入れ、１０００ｒｐｍで、６０Ｃで１０分間撹拌した。次いで、混合物を、氷水浴中で２０分間、６０％振幅で超音波処理（Ｓｏｎｉｃｓ（登録商標）Ｖｉｂｒａ－Ｃｅｌｌ）し、平均液滴直径が４００ｎｍのナノエマルションを生成した。

上記エマルションに３００ｍＬのＣＮＣ懸濁液＃１（１．９０重量％）を注ぎ入れ、３００ｒｐｍで１０分間混合した。２８ｍｌのフィブロイン溶液＃１（１．８８重量％）を、上記の混合物に注ぎ入れ、３００ｒｐｍで１０分間撹拌した後、噴霧乾燥させた。噴霧乾燥機のパラメータを以下のように設定した：入口温度１８５Ｃ、出口温度：８５Ｃ、ノズル圧力１．５０バール、差圧１８０ｍｍＷｃ、およびノズルエアキャップ７０。このプロセスにより、乾燥した自由流動性白色粉末が得られた。

埋め込まれたポロゲン（すなわち、安息香酸アルキル）を除去し、フィブロインβシート形成を誘導するために、２ｇのロットの噴霧乾燥されたマイクロビーズを、４０ｍＬのエタノールに添加し、３分間混合した後、１２００ｒｐｍで６分間遠心分離した。このステップを１回繰り返し、毎回上清液を廃棄した。次いで、試料を２０ｍＬのエタノール中に分散させた。分散液を５００ｍＬの蒸発フラスコに注ぎ入れ、２５ミリバール（Ｈｅｉｄｏｌｐｈロータリーエバポレーター；（Ｂａｓｉｓ Ｈｅｉ－Ｖａｐ ＭＬ））の真空中、６０℃で、７０ｒｐｍで回転しながら乾燥させた。１時間後に白色の自由流動性粉末が形成された。

粉末は水とうまく混合せず、水に添加したときに水面に留まり、微小粒子が疎水性であることを示した。

油取り込みは、米国標準ＡＳＴＭ Ｄ２８１－８４に記載されるように、流体飽和方法を使用して測定した。油取り込み量は、１９５ｍＬ／１００ｇであると測定された。

実施例５－多孔質疎水性フィブロイン／セルロース微小粒子
この実施例は、多孔質疎水性シルクフィブロイン／セルロースマイクロビーズが、揮発性油および不揮発性界面活性剤系から調製されたナノエマルションから形成され得ることを示す。

以下のように９００ｎｍのナノエマルションを調製した。０．０２１ｇのＭｏｎｔａｎｏｖ（商標）８２（ＳＥＰＰＩＣ）を、６０Ｃで４７０ｍｌの蒸留水に溶解した。次いで、１０ｇのピネンを、Ｍｏｎｔａｎｏｖ（商標）８２溶液に注ぎ入れ、１０００ｒｐｍで、６０Ｃで１０分間撹拌した。次いで、混合物を、氷水浴中で２０分間、６０％振幅で超音波処理（Ｓｏｎｉｃｓ（登録商標）Ｖｉｂｒａ－Ｃｅｌｌ）し、平均液滴直径が９００ｎｍのエマルションを生成した。

上記エマルションに３００ｍＬのＣＮＣ懸濁液＃１（１．９０重量％）を注ぎ入れ、３００ｒｐｍで１０分間混合した。２３ｍｌのフィブロイン溶液＃１（１．８８重量％）を、上記の混合物に注ぎ入れ、３００ｒｐｍで１０分間撹拌した後、噴霧乾燥させた。噴霧乾燥機のパラメータを以下のように設定した：入口温度２１０Ｃ、出口温度：８５Ｃ、ノズル圧力１．５０バール、差圧１８０ｍｍＷｃ、およびノズルエアキャップ７０。このプロセスにより、乾燥した自由流動性白色粉末が得られた。

粉末は水とうまく混合せず、水に添加したときに水面に留まり、微小粒子が疎水性であることを示した。

油取り込みは、米国標準ＡＳＴＭ Ｄ２８１－８４に記載されるように、流体飽和方法を使用して測定した。油取り込み量は、１０５ｍＬ／１００ｇであると測定された。

実施例６－多孔質親水性フィブロイン／セルロース微小粒子
実施例４と比較した場合、この実施例は、多孔質マイクロビーズが疎水性または親水性であるかに影響を及ぼす、ナノエマルション対界面活性剤の濃度の比率を示す。

以下のように８４０ｎｍのナノエマルションを調製した。０．５００ｇのＭｏｎｔａｎｏｖ（商標）８２（ＳＥＰＰＩＣ）を、６０Ｃで３５０ｍｌの蒸留水に溶解した。次いで、２０ｇのピネンを、Ｍｏｎｔａｎｏｖ（商標）８２溶液に注ぎ入れ、１０００ｒｐｍで、６０Ｃで１５分間撹拌した。次いで、混合物を、氷水浴中で１５分間、６０％振幅で超音波処理（Ｓｏｎｉｃｓ（登録商標）Ｖｉｂｒａ－Ｃｅｌｌ）し、平均液滴直径が８４０ｎｍのエマルションを生成した。

上記エマルションに４６６ｍＬのＣＮＣ懸濁液＃１（２．１６重量％）を注ぎ入れ、３００ｒｐｍで１０分間混合した。１２．７ｍｌのフィブロイン溶液＃１（１．５９重量％）を、上記の混合物に注ぎ入れ、３００ｒｐｍで１０分間撹拌した後、噴霧乾燥させた。噴霧乾燥機のパラメータを以下のように設定した：入口温度２１０℃、出口温度：８５℃、ノズル圧力１．５０バール、差圧１８０ｍｍＷｃ、およびノズルエアキャップ７０。このプロセスにより、乾燥した自由流動性白色粉末が得られた。

粉末は一旦水に添加されるとすぐに水底に沈み、微小粒子が親水性であることを示した。

油取り込みは、米国標準ＡＳＴＭ Ｄ２８１－８４に記載されるように、流体飽和方法を使用して測定した。油取り込み量は、１８５ｍＬ／１００ｇであると測定された。

実施例７－多孔質親水性フィブロイン／セルロース微小粒子
実施例４と比較して、この実施例は、界面活性剤単独で、ＣＮＣと相互作用することにより、親水性微小粒子が得られることを示す。

この実施例では、実施例４と比較して、ピネン／Ｍｏｎｔａｎｏｖ（商標）８２を含むエマルションを使用するのではなく、単純なＭｏｎｔａｎｏｖ（商標）８２溶液を使用した。

４４０ｍＬのＣＮＣ懸濁液＃１（２．１６重量％）を蒸留水で５５０ｍＬに希釈した。１０ｍｌのフィブロイン溶液＃１（１．９９重量％）を上記の懸濁液に注ぎ入れ、３００ｒｐｍで１０分間撹拌した。

０．０２ｇのＭＯＮＴＡＮＯＶ（商標）８２（ＳＥＰＰＩＣ）を、５０ｍＬの蒸留水に溶解した。ＭＯＮＴＡＮＯＶ（商標）８２溶液を上記の混合物に添加し、３００ｒｐｍで３分間撹拌した後、噴霧乾燥させた。噴霧乾燥機のパラメータを以下のように設定した：入口温度１８５Ｃ、出口温度：８５Ｃ、ノズル圧力１．５０バール、差圧１８０ｍｍＷｃ、ノズルエアキャップ７０。このプロセスにより、乾燥した自由流動性白色粉末が得られた。

粉末は水に添加されると水とうまく混合し、微小粒子が親水性であることを示した。

実施例８－セリシン／セルロース微小粒子
この実施例は、タンパク質セリシンがセルロースマイクロビーズに組み込まれ得ることを示す。

０．００５１ｇのセリシンを蒸留水（２．３ｍＬ）中に溶解し、磁気撹拌バーを使用して５００ｒｐｍで、粉末が見えなくなり、すべて溶解したように見えるまで撹拌した。溶液をシリンジフィルター０．２μｍの孔径で濾過し、１７ｍＬの撹拌ＣＮＣ懸濁液＃１（３重量％）に添加した。得られた混合物を、撹拌しながら５分間、５０％振幅で超音波処理した（Ｓｏｎｉｃｓ（登録商標）Ｖｉｂｒａ－Ｃｅｌｌ）。懸濁液を、１７５℃の入口温度、吸引器７０％、ポンプ速度３０％、気流６００Ｎｌ／時間を使用して、Ｂｕｃｈｉ（登録商標）Ｂ１９１噴霧乾燥機で噴霧乾燥させた。生成物は、１重量％のセリシンを含んだ自由流動性白色粉末であった。

以下の表は、他の範囲のセリシン／セルロース微小粒子を得ることができることを示す。

セリシンを含まない微小粒子（比較実施例９など）と比較して、セリシンを含む微小粒子は、より良好な皮膚感触を有し、すなわち、よりクリーム感を有した。

比較実施例９－タンパク質を含まないセルロース微小粒子
この実施例は、ＷＯ２０１６＼０１５１４８Ａ１の方法に従ってＣＮＣから調製されたセルロース微小粒子は、噴霧乾燥されてマイクロビーズを形成すると、親水性であるマイクロビーズが得られることを示す。

より具体的には、タンパク質を添加しないＣＮＣ懸濁液＃１（４重量％のＣＮＣ）を噴霧乾燥させた。噴霧乾燥機のパラメータは以下のように設定した：入口温度１６５～１８５℃、ポンプ速度３０％、吸引器７０％、空気圧６００Ｎｌ／時間。

図２Ｂ）は、水を添加した得られた粉末の試料を示す。粉末が湿潤していたことが明らかに見られる。これは、微小粒子が親水性であることを示す。

図３Ｂ）は、上記の油中水型エマルションを混合して得られた粉末を示す。凝集体が観察され、微小粒子が親水性であることを示した。

比較実施例１０－タンパク質を含まない親水性多孔質セルロース微小粒子
この実施例は、タンパク質を添加しない多孔質セルロースマイクロビーズが、ナノエマルション法によって調製された場合、親水性であることを示す。

まず、カルボン酸ナトリウムナノクリスタルセルロース（ｃＣＮＣ）を、ＷＯ２０１６＼０１５１４８Ａ１に記載されるように生成した。３０％過酸化水素水溶液と溶解パルプとの反応から生成されるように、カルボン酸ナトリウムナノクリスタルセルロース（ｃＣＮＣ）の濃縮ストック懸濁液は、蒸留水中４％のＣＮＣから構成された。

このストック懸濁液を蒸留水で希釈した。次いで、２０重量％のＰＤＤＡ溶液（Ｍｗ＝４００，０００～５００，０００）を蒸留水で希釈して、２重量％の溶液を調製することにより、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）溶液を調製した。４％のカルボン酸ナトリウムＣＮＣ懸濁液を１重量％に希釈した。次いで、２重量％のＰＤＤＡ溶液を、１４％の固体質量比（ＰＤＤＡ／ｃＣＮＣ）でＣＮＣ（ｃＣＮＣ）懸濁液のカルボン酸塩に添加した。振幅６０％、２０～２５ｐｓｉのフローセル圧力、１０００ｒｐｍの撹拌速度でのフローセルを使用する超音波処理前に、混合物を１０００ｒｐｍで３分間撹拌した。得られたカチオン性ｃＣＮＣ＋懸濁液を、ダイアフィルトレーション（ダイアフィルトレーションユニット（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ、ＫｒｏｓＦｌｏ ＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ））によって精製した。

ナノエマルションを調製するために、５２．５ｍＬのＰＥＧ－２５水素化ヒマシ油（Ｃｒｏｄｕｒｅｔ（商標）２５）、５２．５ｍＬのＴｗｅｅｎ ８０（ポリソルベート８０－Ｌｏｔｉｏｎｃｒａｆｔｅｒ）、および１４０ｍＬの安息香酸アルキル（Ｃ１２－Ｃ１５安息香酸アルキル、Ｌｏｔｉｏｎｃｒａｆｔｅｒ Ｅｓｔｅｒ ＡＢ）を、３．５Ｌのガラスビーカーに注ぎ入れた。蒸留水を混合物に添加して、最終体積を３．５Ｌにした。混合物を７００ｒｐｍで２０分間撹拌した（ＶＭＩ Ｒａｙｎｅｒｉ Ｔｕｒｂｏｔｅｓｔミキサー）。次いで、混合物を６０％振幅で１．０時間超音波処理し（Ｓｏｎｉｃｓ Ｖｉｂｒａ Ｃｅｌｌ）、水浴中で冷却して、ナノエマルションを生成した。超音波処理後、ナノエマルションサイズを、動的光散乱法によって４５～５０ｎｍであると測定した（ＮａｎｏＢｒｏｏｋ ９０ Ｐｌｕｓ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。

次いで、０．８４重量％のｃＣＮＣ＋および４．５３重量％のＣＮＣ懸濁液を、上記のストック懸濁液から調製した。２．８Ｌのナノエマルションを、４００ｒｐｍで混合しながら、３．９ＬのｃＣＮＣ＋（０．８４重量％）懸濁液に添加した。５分後、１．４ＬのｃＣＮＣ（４．５３重量％）懸濁液を添加し、混合物をさらに５分間撹拌した後、噴霧乾燥させた（パラメータ：入口温度１８５Ｃ、出口温度：８５Ｃ、フィードストローク２８％、ノズル圧力１．５０バール、差圧１８０ｍｍＷｃ、ノズルエアキャップ７０）。

このプロセスにより、乾燥した自由流動性白色粉末が得られた。

試料は親水性であり、２３６ｍＬ／１００ｇの粉末の水取り込みを呈した。ヒマシ油の取り込みは、２５２ｍＬ／１００ｇの粉末であった。

特許請求の範囲の範囲は、実施例に記載される好ましい実施形態によって限定されるべきではなく、全体として説明と一致する最も広範な解釈を与えるべきである。

参考文献
本説明は、いくつかの文書を指し、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの文書には、以下が含まれるが、これらに限定されない。

●国際特許公開第２０１１／０７２３６５Ａ１号；
●国際特許公開第２０１３／００００７４Ａ１号；
●国際特許公開第２０１６／０１５１４８Ａ１号；
●国際特許公開第２０１７／０９１８９３Ａ１号；
●Ｈａｂｉｂｉ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１１０，３４７９－３５００；
●Ｙ．Ｂａｉｍａｒｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ／ｓｔａｒｃｈ ｂｌｅｎｄｅｄ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．１２（２０１０）７８１－７８９；ＤＯＩ：１０．３１４４／ｅｘｐｒｅｓｓｐｏｌｙｍｌｅｔｔ．２０１０．９４
●Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ ｉｎ “Ａ Ｆｕｌｌｙ Ｂｉｏｂａｓｅｄ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｏｆ Ｓｏｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ ｆｏｒ Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｅｎｓｉｎｇ”，ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｕｓｃｈｅｍｅｎｇ．７ｂ０１２６，ＡＣＳ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．２０１７，５，７０６３－７０７０
●Ｓａｌａｓ ｅｔ ａｌ．“Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｙｃｉｎｉｎ ａｎｄ β－Ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ ｏｎ Ｓｉｌｉｃａ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ，ｐＨ，ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ”（ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｂｍ２０１４１５３；Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１２，１３，３８７－３９６
●Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｎａｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ／Ｇｅｌａｔｉｎ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｃｒｙｏｇｅｌｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｒｅｌｅａｓｅ”（ＡＣＳ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．２０１９，７，６３８１－６３８９；ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｕｓｃｈｅｍｅｎｇ．９ｂ００１６）
●Ｊ．Ｓ．Ａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ ａｎｄ ｇｅｌａｔｉｎ ｉｎ ｃｏｒｎ ｓｔａｒｃｈ ｐｌａｓｔｉｃｉｚｅｄ ｆｉｌｍｓ”，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ １１５（２０１５）２１５－２２２；ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃａｒｂｐｏｌ．２０１４．０８．０５７
●Ｈ．Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｆａｃｉｌｅ ａｎｄ ｇｒｅｅｎ ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｌｋ ｓｅｒｉｃｉｎ ｆｉｌｍｓ ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ ｗｉｔｈ ｂａｍｂｏｏ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｎａｎｏｆｉｂｒｉｌｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｅａｎｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２００（２０１８）１０３４ｅ１０４２；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｃｌｅｐｒｏ．２０１８．０７．２８９
●Ｓｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ９３（２０１３）５６１－５７３；ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃａｒｂｐｏｌ．２０１２．１２．０３８
●Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｆａｃｉｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｓｉｌｋ Ｆｉｂｒｏｉｎ／Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｆｉｌｍｓ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｕｓｃｈｅｍｅｎｇ．７ｂ０１１６１；ＡＣＳ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．２０１７，５，６２２７－６２３６
●Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｅｍｐｌａｔｅ－Ｇｕｉｄｅｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｓｉｌｋ Ｆｉｂｒｏｉｎ ｏｎ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ ｆｏｒ Ｒｏｂｕｓｔ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｉｔｈ Ｕｌｔｒａｆａｓｔ Ｗａｔｅｒ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ”（ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｎａｎｏ．７ｂ０４２３５，ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１７，１１，１２００８－１２０１９
●Ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒｂｅｅｍ，ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，６９，１１３７－１１５２
●Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｎｔａｃｔ Ａｎｇｌｅ ｆｏｒ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｐｏｗｄｅｒｓ Ｕｓｉｎｇ Ｈｅａｔ ｏｆ Ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ Ｄａｔａ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９９６，１００，６６２６－６６３０）．
●Ｄｏｎｇ，Ｘ．；Ｒｅｖｏｌ，Ｊ．－Ｆ．；Ｇｒａｙ，Ｄ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｔｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌｏｉｄ ｃｒｙｓｔａｌｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ １９９８，５（１），１９－３２．
●Ｉ．Ｐｅｚｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔａｃｔ Ａｎｇｌｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｓｉｌｉｃａ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｒｙ Ｗａｔｅｒ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０１０，２６（４），２３３３－２３３８；ＤＯＩ：１０．１０２１／ｌａ９０２７５９ｓ
●ＩＵＰＡＣ．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．（ｔｈｅ“Ｇｏｌｄ Ｂｏｏｋ”）。Ａ．Ｄ．ＭｃＮａｕｇｈｔ ａｎｄ Ａ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９７）によって編集。Ｍ．Ｎｉｃ，Ｊ．Ｊｉｒａｔ，Ｂ．Ｋｏｓａｔａによって作成されたＸＭＬオンライン修正版：ｈｔｔｐ：／／ｇｏｌｄｂｏｏｋ．ｉｕｐａｃ．ｏｒｇ（２００６－）；Ａ．Ｊｅｎｋｉｎｓによって編集された更新版。ＩＳＢＮ ０－９６７８５５０－９－８。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３５１／ｇｏｌｄｂｏｏｋ

Claims (25)

1. セルロースナノクリスタルおよび１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物を含むタンパク質性セルロース微小粒子であって、前記ナノクリスタルならびに前記ペプチドおよび／またはタンパク質が一緒に凝集して、前記微小粒子を形成する、タンパク質性セルロース微小粒子
2. 前記微小粒子が、直径約１μｍ～約１００μｍである、請求項１に記載の微小粒子。
3. 前記微小粒子が、体積で約５／１５μｍ～約５／２５μｍのサイズ分布（Ｄ_１０／Ｄ_９０）を有する、請求項１または２に記載の微小粒子。
4. 前記微小粒子が、おおよそ回転楕円体または半回転楕円体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の微小粒子。
5. 前記セルロースナノクリスタルが、長さ約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、および幅約２～約２０ｎｍである、請求項１～４のいずれか一項に記載の微小粒子。
6. 前記セルロースナノクリスタルが、少なくとも約５０％の結晶性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の微小粒子。
7. 前記セルロースナノクリスタルが、硫酸化セルロースナノクリスタルおよびそれらの塩、カルボキシル化セルロースナノクリスタルおよびそれらの塩、ならびに表面還元カルボキシル化セルロースナノクリスタルおよびそれらの塩、ならびに他の官能基で化学修飾されたセルロースナノクリスタルなどのそれらの誘導体、またはそれらの組み合わせである、請求項１～６のいずれか一項に記載の微小粒子。
8. 前記セルロースナノクリスタルが、カルボキシル化セルロースナノクリスタルおよびそれらの塩、好ましくはカルボキシル化セルロースナノクリスタルまたはカルボン酸セルロースナトリウム塩、およびより好ましくはカルボキシル化セルロースナノクリスタルである、請求項１～７のいずれか一項に記載の微小粒子。
9. 前記ペプチドおよび前記タンパク質が、水溶性である、請求項１～８のいずれか一項に記載の微小粒子。
10. 本発明の前記微小粒子が、１つ以上のタンパク質を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の微小粒子。
11. 前記微小粒子が、シルクフィブロイン、セリシン、またはゼラチン、好ましくはセリシンまたはシルクフィブロイン、およびより好ましくはシルクフィブロインを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の微小粒子。
12. シルクフィブロインを含む、請求項１１に記載の微小粒子。
13. 疎水性および親油性である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の微小粒子
14. 前記微小粒子が、前記微小粒子上の重量に基づいて、約０．１重量％～約５０重量％、好ましくは約０．５重量％～約２０重量％、およびより好ましくは約１重量％～約２０重量％の総ペプチドおよびタンパク質濃度で、前記１つ以上のペプチドおよび／または前記１つ以上のタンパク質を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の微小粒子
15. 前記微小粒子が、多孔質であり、前記ナノクリスタルならびに前記ペプチドおよび／またはタンパク質が、前記微小粒子中の空洞の周りに配置され、したがって前記微小粒子の細孔を画定する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の微小粒子。
16. 前記微小粒子中の前記細孔が、約１０ｎｍ～約２０００ｎｍのサイズ、好ましくは約５０～約１００ｎｍのサイズである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の微小粒子
17. 前記微小粒子が、紫外線光および青色光に対する保護、抗酸化特性、抗老化特性、保湿効果、または色など、皮膚にさらなる利益をもたらす１つ以上の機能分子をさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の微小粒子。
18. 前記セルロースナノクリスタルが、ポリ電解質層および染料でコーティングされる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の微小粒子。
19. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の微小粒子を含む、化粧品用調製物。
20. 油中水型エマルションまたは親油性媒体を含む、請求項１９に記載の化粧品用調製物。
21. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の微小粒子を生成するための方法であって、
    ａ）セルロースナノクリスタルの懸濁液および前記１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物の溶液を提供するステップと、
    ｂ）前記懸濁液を前記溶液と混合して、混合物を生成するステップと、
    ｃ）前記混合物を噴霧乾燥させて、前記微小粒子を生成するステップと、を含む、方法。
22. 前記溶液が、前記溶液の総重量に基づいて、約０．０１重量％～約５０重量％の濃度で、前記１つ以上のペプチド、前記１つ以上のタンパク質、または前記それらの混合物を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記微小粒子をアルコールで洗浄するステップをさらに含む、請求項２１または２２に記載の方法。
24. ステップｂ）の後、機能分子が、ステップｂ）の前記混合物中に溶解もしくは懸濁されるか、
    ステップａ）の間に、機能分子が、前記セルロースナノクリスタルの前記懸濁液中に溶解もしくは懸濁されるか、または
    ステップａ）の間に、機能分子が、前記１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、もしくはそれらの混合物の前記溶液中に溶解もしくは懸濁される、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 多孔質である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の微小粒子を生成するための方法であって、
    ａ）
    ●セルロースナノクリスタルの懸濁液、
    ●前記１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物の溶液、および
    ●ポロゲンのエマルションを提供するステップであって、
    前記１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物のいずれかの前記溶液が、前記エマルションの一部であるか、または単独である、提供するステップと、
    ｂ）前記懸濁液を前記溶液および前記エマルションと混合して、
    ●前記ポロゲンの液滴が分散され、
    ●前記セルロースナノクリスタルが懸濁され、
    ●前記１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質、またはそれらの混合物が溶解される連続液相を含む混合物を生成するステップと、
    ｃ）前記混合物を噴霧乾燥させて、微小粒子を生成するステップと、
    ｄ）前記微小粒子中で細孔を形成するための噴霧乾燥中に前記ポロゲンが十分に蒸発していない場合、前記ポロゲンを蒸発させるか、または前記ポロゲンを前記微小粒子から浸出させるステップと、を含む、方法。

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