CN114364365A - 包含与蛋白聚集的纤维素纳米晶体的微粒以及其化妆品用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供蛋白质纤维素微粒。这些微粒包含纤维素纳米晶体以及一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物，其中所述纳米晶体与所述肽和/或所述蛋白聚集在一起以形成微粒。在实施方案中，微粒包含丝素蛋白，并且有利地，所述丝素蛋白为疏水性和亲脂性的。本发明还提供包含这些微粒的化妆品制品。在有利的实施方案中，这些化妆品制品包含油包水乳液或亲脂性介质。最后，本发明还提供制备所述微粒的方法。

Description

包含与蛋白聚集的纤维素纳米晶体的微粒以及其化妆品用途

相关申请的交叉引用

根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2019年5月10日提交的美国临时申请62/846,281的优先权。

技术领域

本发明涉及蛋白质纤维素微粒。更具体地，本发明涉及包含蛋白和纤维素纳米晶体的微粒，并且其为疏水的，具有提高的吸油率和/或改善的皮肤感觉。

背景技术

关于微珠

微粒在以下方面发挥着重要作用，药物输送、化妆品和皮肤护理、荧光免疫分析、作为生物技术中的微载体、作为粘度调节剂、色谱中的固定相以及作为研磨剂。在这些领域以及其他领域中，微粒通常被称为“微珠”。

化妆品和个人护理产业利用微珠来增强配方中的感官性质，并保护或改善皮肤。在化妆品和护肤品中，微珠用于赋予多种消费者认可的益处，例如但不限于：增稠剂、填充剂、丰盈剂、颜色分散剂、角质剥脱剂、改善的产品调和、改善的皮肤感觉、皮肤药物优点、柔聚(也称为模糊)、产品滑润、吸油率以及干燥结合。柔聚或模糊是微珠的一种性质，因为其具有散射光的能力。吸油率是指微珠从皮肤吸收皮脂的能力。这种性质使化妆品配方设计师能够设计出赋予妆容哑光效果的产品，从而使妆容更自然，持续数小时。

一般来说，微珠可由以下制成，塑料、玻璃、金属氧化物和天然存在的聚合物，如蛋白质和多糖(包括淀粉和纤维素)。在化妆品产业中，微珠通常由塑料制成。

有令人信服的证据表明，由塑料制成的微珠对环境造成危害，包括沿食物链的危害。更多的消费者关注个人健康和环境健康，刺激了有机/天然个人护理产品的增长。传统产品的有效的有机/天然替代品，以及社会生活方式的改变是广泛采用“绿色”个人护理产品以及油墨、颜料、涂料、复合材料和油漆增稠剂的可持续成分的重要动力。对于可持续性，期望使用“绿色化学”以及“绿色工程”的方法，并利用可再生资源来制造微珠。已知使用“绿色化学”以及“绿色工程”的方法，并利用可再生资源来制造可降解的微珠对可持续性有着积极的影响。

在化妆品产业中，使用仅由蛋白质、纤维素、壳聚糖、淀粉或二氧化硅制成的微珠代替塑料微珠并非易事。这是因为这些材料的机械、光学和表面性质与塑料的不同。化妆品产业在塑料微珠上投入了大量的资金、专业知识和研究，以建立化妆品和皮肤护理市场。用环保替代品替代塑料微珠的压力意味着化妆品产业必须使其配方和产品与替代颗粒的性质保持一致。

塑料微珠通常是疏水性/亲脂性的。这使得其有益于用于疏水性或亲脂性配方。然而，在某些情况下期望使用亲水性的塑料微珠。通过在其表面涂覆化合物，例如羧酸盐、硫酸盐、磺酸盐、季铵盐、醇、氨基或酰胺基团，使化合物与极性主流体形成氢键，可使塑料微珠具有亲水性。

另一方面，由蛋白质、淀粉、纤维素、壳聚糖以及二氧化硅制成的微珠通常是亲水性的。最普遍的是，必须对这些类型的微珠进行涂覆以使其具有疏水性/亲脂性，从而使其与亲水性/亲脂性主介质(例如油、蜡和多种石油基溶剂)相容，因此可以替代无处不在的疏水性/亲脂性塑料微珠。

关于亲脂性微珠

亲脂性可以表示为log P，其描述了中性分子在两个基质之间的分配。亲脂性也可以表示为log D，其描述了两个基质之间，分子群中性部分的分配加上分子群的电离部分的分配。亲脂性(表示为log P)是编码静电和疏水分子间作用力以及分子内相互作用的分子参数。

术语“亲脂性”和“疏水性”不是同义词，从有机硅和碳氟化合物可以看出，其为疏水性的但不是亲脂性的。国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)为亲脂性和疏水性提供了不同的定义(Van de Waterbeem,H.；Carter,R.E.；Grassy,G.；Kubinyi,H.；Martin,Y.C.；Tute,M.S.；Willett,P.Pure Appl.Chem.1997,69,1137–1152.)。疏水性是水性环境中非极性基团或分子的缔合，其源于水排斥非极性分子的趋势。亲脂性代表分子或其部分对亲脂性环境的亲和力。

化妆品产业需要亲脂性微珠表面组织处理剂。

通常，微珠表面必须进行改性以使其与化妆品配方相容。为辅助化妆品配方、提供功能性并增强审美体验，纤维素、淀粉和二氧化硅微珠通常要进行各种表面处理。这些处理改变微珠表面能量，从而改善配方和感官体验。

表面处理剂的一个示例为月桂酰赖氨酸，其创造一个疏水性的表面，有利于增强颗粒分散性，改善耐磨性，使化妆品在皮肤上有湿润的感觉。

烷基硅烷涂层源于有机硅烷氧化物与纤维素、淀粉或二氧化硅颗粒的表面水和羟基的反应。固化后，在硅部分之间以及颗粒表面形成共价键。

经有机硅处理的颗粒在环甲基硅氧烷中分散良好。其具有非常低的表面张力，这赋予其优异的疏水性和改善的亲脂性。所述涂层使颗粒易于分散在矿物油、酯类以及有机硅流体中。相比甲基硅氧烷处理的颗粒，烷基硅烷处理的颗粒具有更强的疏水性，在常用的化妆品油中润湿性更好，吸油性更低。

在含水浓缩配方中，烷基硅烷处理可提高润湿性，从而使粉末中的颗粒负载更高。这使得涂抹在皮肤上时有一种“粉状”感觉，同时保持用于热填充的低熔体粘度。分散固体与载体之间相容性的改善有利于棒状产品配方，包括唇膏、眼影和粉底。这些类型的涂料用于制造W/O(油包水)和O/W(水包油)乳液、防水睫毛膏、持久唇膏和唇彩。

甲基硅氧烷是一种聚(甲基氢硅氧烷)。Si-H键与颗粒表面的微量水发生反应，并将Si-H键转化为硅醇(Si-OH)，最终凝结形成共价Si-O颗粒化学键。涂层具有高度疏水性并牢固地结合在表面上，因此涂层可抵抗剪切。以这种方式涂覆的颗粒在油(特别是有机硅油)中润湿良好。皮肤感觉有些干燥，具有增强的滑爽性和扩展性。其为压制粉末配方的首选。所述涂层的一个缺点是由于反应放出氢气，必须使甲基硅氧烷反应完全。甲基硅氧烷涂层颗粒适用于粉底、遮瑕膏、睫毛膏、唇膏、眼影和摩丝。

二甲基硅氧烷是聚合物(二甲基硅氧烷)。其被认为是通过水解、缩合和固化机制与颗粒表面结合，以形成Si-O颗粒链接。用二甲基硅氧烷处理的表面具有相当的疏水性，并具有良好的滑爽性和更多的润滑感。涂有二甲基硅氧烷的颗粒可用于油基系统，可用于无水产品。

上述的涂覆方法需要在制备颗粒后增加几个步骤。

关于蛋白质微珠

化妆品产业对含有氨基酸、肽和/或蛋白的微珠具有需求。即使与其他聚合物混合以试图提高稳定性，由这些蛋白制成的微珠依然具有机械性能差和降解率高的负面特征。例如，当放入水中时，一些与丝素蛋白混合的淀粉微粒的溶解度高达近65％(Y.Baimarcket al.,“Morphology and thermal stability of silk fibroin/starch blendedmicroparticles”,Polymer Letters Vol.4,No.12(2010)781-789；DOI:10.3144/expresspolymlett.2010.94)。当在剪切混合条件下，在含水乳液中配制微珠时，或在含水量高的配方中配制微珠时，这是不期望的。

涉及基于蛋白质的微珠的现有技术关注明胶、丝素蛋白、丝胶和胶原蛋白的使用。明胶是一种可生物降解的天然蛋白质聚合物，其可用于制备微粒。然而，由于明胶微粒的水溶性和有限的机械和热性能，需要进行改进，例如化学交联反应，以便在长期应用中使用。丝素蛋白、丝胶和胶原蛋白会吸收水分，这一性质使他们不适于用于一类重要的化妆品配方，即，称为油包水乳液的化妆品配方。

关于纤维素和纤维素微珠

天然纤维素是一种亲水性半结晶有机聚合物。其为一种在生物圈中天然产生的多糖。其为植物、多种藻类和真菌样卵菌的细胞壁的结构材料。纤维素天然地组织成由醚连接的聚(β-1,4-吡喃葡萄糖)单元的长的线性链。这些链通过分子内和分子间的氢键组装成纳米晶体的高度结晶域—参见图1。无序(无定形)纤维素的区域存在于纤维素纳米纤丝中的这些纳米晶域之间。纤维素聚合物链之间广泛的氢键使纤维素极难溶于水和大多数有机溶剂，甚至许多类型的酸。

纤维素广泛用作食品和药物应用中的无毒赋形剂。在口服药物输送等医疗应用中，药物与纤维素粉末(通常是微晶纤维素粉末)以及其他填充剂混合，并通过挤出和球化进行转化。挤出和球化产生颗粒粉末。多孔微珠可用于制备尺寸排阻色谱的色谱支持固定相，以及作为生物物质(如蛋白质、内毒素以及病毒)的选择性吸附剂。

援引加入本文的国际专利公开号WO 2016\015148A1，教导如何制备结晶纳米纤维素的纳米晶体，然后通过喷雾干燥将这些纳米晶体聚集成大致的球形(球状)的微珠。

发明内容

本发明提供：

1.一种蛋白质纤维素微粒，其包含纤维素纳米晶体以及一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物，其中所述纳米晶体与所述肽和/或所述蛋白聚集在一起以形成所述微粒。

2.第1项的微粒，其中所述微粒的直径为约1μm-约100μm。

3.第1项或第2项的微粒，其中所述微粒的尺寸分布(D₁₀/D₉₀)为：以体积计约5/15μm-约5/25μm。

4.第1项-第3项中任一项的微粒，其中所述微粒为大致的球形或半球形。

5.第1项-第4项中任一项的微粒，其中所述纤维素纳米晶体的长度为约50nm至约500nm，并且宽度为约2-约20nm。

6.第1项-第5项中任一项的微粒，其中所述纤维素纳米晶体的结晶度为至少约50％。

7.第1-6项中任何一项的微粒，其中纤维素纳米晶体是硫酸化纤维素纳米晶体及其盐，羧基化纤维素纳米晶体及其盐，以及他们的衍生物，例如表面还原的羧基化纤维素纳米晶体及其盐，以及用其他官能团化学改性的纤维素纳米晶体，或其组合。

8.第1-7项中任一项的微粒，其中所述纤维素纳米晶体是羧基化纤维素纳米晶体及其盐，优选为羧基化纤维素纳米晶体或纤维素羧酸钠盐，更优选为羧基化纤维素纳米晶体。

9.第1-8项中任一项的微粒，其中所述肽和所述蛋白是水溶性的。

10.第1-9项中任一项的微粒，其中本发明的微粒包括一种或多种蛋白。

11.第1-10项中任一项的微粒，其中所述微粒包含丝素蛋白、丝胶蛋白或明胶，优选丝胶蛋白或丝素蛋白，并且更优选丝素蛋白。

12.第11项的微粒，其包含丝素蛋白。

13.第1-12项中任一项的微粒，其为疏水性的和亲脂性的。

14.第1至13项中任一项的微粒，其中，基于微粒重量，所述微粒包含一种或多种肽和/或一种或多种蛋白，多肽和蛋白的总浓度为约0.1重量％-约50重量％，优选约0.5重量％-约20重量％，更优选约1重量％-约20重量％。

15.第1-14项中任一项的微粒，其中所述微粒是多孔的，并且所述纳米晶体与所述肽和/或蛋白围绕微粒中的空腔配置，从而在所述微粒中限定孔。

16.第1-15项中任一项的微粒，其中所述微粒中的孔的尺寸为约10nm至约2000nm，优选地，尺寸为约50-约100nm。

17.第1-16项中任一项的微粒，其中所述微粒还包含一种或多种功能性分子，其为皮肤带来额外的益处，例如抗紫外线和蓝光的保护、抗氧化性、抗衰老性、保湿作用或颜色。

18.第1-17项中任一项的微粒，其中所述纤维素纳米晶体用电解质层和染料涂覆。

19.一种化妆品制品，其包含第1-18项中任一项的微粒。

20.第19项的化妆品制品，包含油包水乳液或亲脂性介质。

21.一种制备第1-18项中任一项所述的微粒的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供纤维素纳米晶体的悬浮液以及一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物的溶液；

b)将所述悬浮液与所述溶液混合以制备混合物；并且

c)喷雾干燥所述混合物以制备所述微粒。

22.第21项的方法，其中基于溶液的总重量，所述溶液包含一种或多种肽、一种或多种蛋白，其混合物，其浓度为约0.01重量％-约50重量％。

23.第21或22项的方法，其中还包括用醇洗涤微粒的步骤。

24.第21-23项中任一项的方法，其中：

在步骤b)之后，将功能性分子溶于或悬浮于步骤b)的混合物中；

在步骤a)中，将功能性分子溶于或悬浮于纤维素纳米晶体的悬浮液中；或者

在步骤a)中，将功能性分子溶于或悬浮于一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物的溶液中。

25.一种制备第1项-16项中任一项所述的微粒的方法，所述微粒为多孔的，所述方法包括以下步骤：

a)提供：

·纤维素纳米晶体的悬浮液，

·一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物的溶液，以及

·致孔剂的乳液，

其中所述一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物的溶液是所述乳液的一部分或单独存在；

b)将所述悬浮液与所述溶液和所述乳液混合以制备包含连续液相的混合物，其中：

·致孔剂的液滴是分散的，

·纤维素纳米晶体是悬浮的，并且

·一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物是溶解的；

c)喷雾干燥所述混合物以制备所述微粒；并且

d)如果在喷雾干燥过程中，致孔剂没有充分蒸发以在微粒中形成孔，则蒸发所述致孔剂或将所述致孔剂从微粒中浸出。

附图说明

在附图中：

图1是纤维素纤维、原纤维、纳米原纤维(CNF)和纳米晶体(CNC)的示意图。

图2a)示出实施例1获得的粉末，其中向粉末添加水—粉末位于水滴的表面上，而不是被润湿。

图2b)示出比较例8获得的粉末，其中向粉末添加水—粉末被润湿。

图3a)示出实施例1获得的粉末，其中粉末于油包水乳液中混合—未观察到聚集体。

图3b)示出比较例8获得的粉末，其中粉末于油包水乳液中混合—聚集体是可见的。

图4a)是包含2％丝素蛋白的实施例2的微粒的扫描电子显微照片(SEM)图像。

图4b)是包含5％丝素蛋白的实施例2的微粒的SEM图像。

图4c)是包含10％丝素蛋白的实施例2的微粒的SEM图像。

图4d)是包含20％丝素蛋白的实施例2的微粒的SEM图像。

图5是由100％丝素蛋白组成的微粒的SEM图像。

图6示出在微粒暴露于甲醇之前和之后，2％丝素蛋白/CNC微珠中的β-折叠片的百分比。通过样品酰胺拉伸区域的高斯解卷积红外光谱获得百分比贡献。

图7示出含有2％丝素蛋白的混合微粒的X射线光电子光谱。

图8示出在(a)制备时，以及(b)微珠暴露于甲醇后，含有2％丝素蛋白的混合CNC微粒的亚甲蓝染料吸收。

发明内容

现在更详细地讨论本发明，提供蛋白质纤维素微粒、制备其的方法及其用途。

事实上，令人惊讶地发现，通过将蛋白和纤维素纳米晶体(CNC)聚集在一起，将一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物引入纤维素微粒中，赋予微粒令人惊讶的性质。特别地，可以使微粒疏水，可以提高其的吸油率，和/或可以改善其皮肤感觉。

因此，本发明的微粒包含纤维素纳米晶体以及一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物，其中纳米晶体与肽和/或蛋白聚集在一起以形成微粒。

在本发明的微粒中，纳米晶体聚集在一起形成微粒。这意味着微粒的物理结构由聚集的纳米晶体提供。

在实施方案中，微粒通常彼此游离，但他们中的一些可在外围与其他微粒融合。

在实施方案中，微粒是自由流动的粉末形式。

在实施方案中，微粒的直径为约1μm-约100μm，优选约1μm-约25μm，更优选约2μm-约20μm，并且更优选约4μm-约10μm。对于化妆品应用，优选的尺寸为约1μm-约25μm，优选约2μm-约20μm，更优选约4μm-约10μm。

在实施方案中，微粒尺寸分布(D₁₀/D₉₀)为：以体积计约5/15μm-约5/25μm。

在实施方案中，微粒为大致的球形或半球形。在本文中，“椭球体”是通过围绕其主轴之一旋转椭圆而获得的形状。椭球体包括球体(当椭圆为圆形时获得)。在此，“半球体”约为球体的一半。与球体形状的偏差可以通过进行图像分析的仪器(例如Sysmex FPIA-3000)来确定。球度是衡量物体的形状与数学上完整的球体的形状接近程度的量度。颗粒的球度Ψ是球体(与颗粒体积相同)的表面积与颗粒表面积的比值。可以使用以下公式计算：

其中V_p是颗粒的体积，A_p是颗粒的表面积。在实施方案中，本发明的微粒的球度Ψ为约0.85或更高，优选为约0.9或更高，更优选为约0.95或更高。

纤维素纳米晶体

如上所述，本发明的微粒包含纤维素纳米晶体。

在实施方案中，纤维素纳米晶体的长度为约50nm-约500nm，优选约80nm-约250nm，更优选约100nm-约250nm，更优选约100-约150nm。

在更优选的实施方案中，纤维素纳米晶体的宽度为约2-约20nm，优选约2-约10nm，并且更优选约5nm-约10nm。

在实施方案中，纤维素纳米晶体的结晶度为至少约50％，优选至少约65％或更高，更优选至少约70％或更高，最优选至少约80％。

本发明的微粒中的纤维素纳米晶体可以是任何纤维素纳米晶体。

特别地，纳米晶体可以是官能化的(这意味着其表面已经被修饰以在其表面上附着官能团)或未被官能化的(正如其在纤维素中天然存在)。最常用的制备纤维素纳米晶体的方法通常引起纳米晶体表面的至少一些官能化。因此，在实施方案中，纤维素纳米晶体是官能化的纤维素纳米晶体。

在实施方案中，本发明的微粒中的纤维素纳米晶体是硫酸化纤维素纳米晶体及其盐，羧基化纤维素纳米晶体及其盐，以及他们的衍生物，例如表面还原的羧基化纤维素纳米晶体及其盐，以及用其他官能团化学改性的纤维素纳米晶体，或其组合。

硫酸化纤维素纳米晶体和羧基化纤维素纳米晶体的盐的实例包括其钠盐。

如上所述的“其他官能团”的实例包括酯、醚、季铵化烷基铵阳离子、三唑及其衍生物、烯烃以及乙烯基化合物、低聚物、聚合物、环糊精、氨基酸、胺、蛋白质、聚电解质和其他。这些“其他官能团”化学修饰的纤维素纳米晶体是技术人员公知的。这些“其他官能团”用于赋予纤维素纳米晶体一种或多种所需的性质，包括例如荧光性、与有机溶剂和/或用于复合的聚合物的相容性、生物活性、催化功能、乳液的稳定性以及技术人员已知的许多其他性质。

优选地，所述微粒中的纤维素纳米晶体是羧基化纤维素纳米晶体及其盐，优选羧基化纤维素纳米晶体或纤维素羧酸钠盐，更优选羧基化纤维素纳米晶体。

硫酸化纤维素纳米晶体可以通过纤维素与浓硫酸以及另一种酸的水解获得。这种方法是众所周知的，例如在Habibi et al.2010,Chemical Reviews,110,3479-3500中有所描述援引加入本文。

羧基化纤维素纳米晶体可以通过不同的方法制备，例如，TEMPO或高碘酸盐介导的氧化，过硫酸铵的氧化，以及过氧化氢的氧化。更具体地，众所周知的TEMPO氧化可用于氧化纤维素纳米晶体。如WO 2016/015148 A1所述，可以使用过氧化氢水溶液，由纤维素直接制备羧基化纤维素纳米晶体，该专利援引加入本文。由纤维素制备羧基化纤维素纳米晶体的其他方法包括如WO 2011/072365 A1以及WO 2013/000074 A1所描述的那些，两者均援引加入本文。

上述“其他官能团”修饰的纤维素纳米晶体可以通过本领域技术人员公知的硫酸化和/或羧基化CNC(不溶解结晶纤维素)制备。

肽和蛋白

如上所述，本发明的微粒还包含一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物。

肽是由肽(酰胺)键连接的氨基酸短链。蛋白质也是由肽键连接的氨基酸链，但其为包含一个或多个氨基酸长链的较大的分子，也由肽键连接。通常根据尺寸区分肽与蛋白，并且作为任意基准，可以理解为包含约50个或更少的氨基酸。因此，本文中的肽定义为包含2至50个氨基酸，蛋白定义为包含超过50个氨基酸。酶构成蛋白的一个子集，其为生物催化剂，通过降低其活化能来加速化学反应。

优选地，肽包含10至50个氨基酸。

优选地，蛋白包含150个氨基酸或更多，因此具有约22kDa或更大的分子量。最优选地，蛋白是具有100kDa或更大分子量的高分子多肽。

在优选的实施方案中，本发明的微粒包含一种或多种蛋白。在更优选的实施方案中，所述微粒包含一种蛋白。在替代的实施方案中，本发明的微粒包含肽。

本发明的微粒中的肽或蛋白可以是任何肽或蛋白。

肽或蛋白可以是天然的、植物(蔬菜)或动物衍生的肽或蛋白，以及合成肽或蛋白和转基因肽或蛋白。

优选的肽和蛋白包括水溶性肽和蛋白。

肽和蛋白的非限制性的实例包括白蛋白、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、赖氨酸多肽、酪蛋白、过氧化氢酶、胶原蛋白、细胞色素C、脱氧核糖核酸酶、弹性蛋白、纤连蛋白、明胶、小麦醇溶蛋白、葡萄糖氧化酶、糖蛋白、水解胶原蛋白的酯、玉米蛋白、角蛋白、乳铁蛋白、乳球蛋白、乳过氧化物酶、脂肪酶、乳蛋白、乳酸链球菌素、氧化还原酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶、酵母菌多肽、丝胶、血清白蛋白、血清蛋白、丝素蛋白、硬脂酰乳酸钠乳清蛋白、可溶性蛋白多糖、大豆棕榈酸酯、大豆蛋白分离物、卵蛋白、花生蛋白、棉籽蛋白、葵花蛋白、豌豆蛋白、乳清蛋白、鱼蛋白、海鲜蛋白、枯草杆菌蛋白酶、超氧化物歧化酶、舒替兰酶(sutilain)、甜杏仁蛋白、尿素酶、小麦胚芽蛋白、小麦蛋白、乳清蛋白、玉米醇溶蛋白、水解植物蛋白等。

本发明的微粒中优选的肽和蛋白是与纤维素结合而不形成化学键的那些。

优选的肽和蛋白包括以下：

·大豆中存在的主要蛋白是球蛋白以及β-伴大豆球蛋白，其通过氢键吸附在纤维素上。

球蛋白是一种六聚体，分子量为300-380kDa。六个亚基由酸性和碱性多肽组成，多肽通过二硫键连接。球蛋白根据Langmui等温线吸附到纤维素上。

β-伴大豆球蛋白是一种三聚体或六聚体，其包含两个相似的包含半胱氨酸的肽以及一个糖基化的不包含半胱氨酸的β肽。β-伴大豆球蛋白对纤维素的吸附程度较低。

两种蛋白与纤维素结合时都会发生依赖离子强度的构象转化。

·牛血清白蛋白，其不会与带有硫酸盐和/或羧基官能团以及带负电荷的纤维素纳米晶体显著结合。

·明胶，其为胶原蛋白部分水解产生的肽和蛋白的混合物。

·纤维素降解酶(纤维素酶)，其对纤维素表面具有特定的亲和力；可能是由于氢键相互作用，加上酶的构象变化。

·丝胶(SS)，是一种天然亲水性蛋白。

丝胶在丝纤维周围形成胶质涂层并使其粘附。丝胶包含18种不同的氨基酸，其中

32％是丝氨酸。

·丝素蛋白(SF)，是一种由蚕(例如家蚕)产生的天然蛋白聚合物，其可生物降解并且是生物相容的，其通过氢键以及静电相互作用结合天然多糖，而不形成共价化学键。

SF的分子量为400kDa左右。其为一种线性多肽，其主要成分甘氨酸和丙氨酸是非极性氨基酸。所述的H链的疏水结构域包含Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser的重复的六肽序列以及Gly-Ala/Ser/Tyr二肽的重复序列，可以形成稳定的反平行β-折叠微晶。

SF可以以三种分子构象存在：

Silk I是水溶性的，其特征在于主要为无序螺旋的混合物，具有一些α螺旋和β转角的特征。

Silk II的特征在于β-折叠占优势，这导致稳定且不溶于水的丝素蛋白。

Silk III采用α螺旋，并且通常位于水/空气界面。

根据Feng et al.(Facile Preparation of Biocompatible Silk Fibroin/Cellulose Nanocomposite Films with High Mechanical Performance；DOI:10.1021/acssuschemeng.7b01161；ACS Sustainable Chem.Eng.2017,5,6227-6236)的接触角测量表明，纯的SF薄膜是亲水的。这种性质归因于亲水性羟基、氨基和羧基的存在。

SF分子通过弱相互作用或强相互作用吸附到纤维素表面，不形成共价化学键。获得的复合材料可呈现Silk I以及Silk II的结构，或两者的组合。在许多情况下，SF薄膜是亲水的。

在优选的实施方案中，微粒包含丝素蛋白、丝胶蛋白或明胶，优选丝胶蛋白或丝素蛋白，更优选丝素蛋白。丝素蛋白可以将微粒的性质由亲水性调整至疏水性/疏脂性。另一方面，丝胶可以制备具有改善的(更具奶油状)皮肤感觉的微粒。

微粒通常包含一种或多种肽和/或一种或多种蛋白，基于微粒的重量，多肽和蛋白的总浓度为约0.1重量％-约50重量％，优选约0.5重量％-约20重量％，更优选约1重量％-约20重量％。

如以下实施例中所证实的，基于微粒的重量，即使使用的丝素蛋白的浓度低至0.5重量％，也会产生疏水性微粒。因此，在实施方案中，基于微粒上的重量，微粒包含约0.5重量％-约30重量％，优选约1重量％-约30重量％，更优选约2重量％-约30重量％的丝素蛋白。

多孔微粒

在实施方案中，本发明的微粒是多孔的(即，其包含孔)。纳米晶体以及肽和/或蛋白聚集在一起，从而形成微粒，并且围绕微粒中的空腔配置，从而在微粒中限定孔。

在本发明的微粒中，纤维素纳米晶体聚集在一起，形成微粒并限定孔。如以下标题为“制备多孔纤维素微粒的方法”的部分所述，本发明的微粒可以通过如下方法制备，在致孔剂液滴周围，将纤维素纳米晶体与蛋白聚集，然后去除致孔剂，从而在致孔剂液滴曾经存在的地方留下空隙，即，因此在微粒中产生孔。这产生纳米晶体以及一种或多种聚集在一起并形成的微粒本身，并限定(即，标出其边界)微粒中的孔。

在实施方案中，微粒中的孔的尺寸为约10nm-约2000nm，优选尺寸为约50-约100nm。

微粒的孔隙率可以通过不同的方法测量。其中一种方法是美国标准ASTM D281-84中描述的流体饱和度法。在该方法中，测量多孔微粒粉末的吸油率。将p量(以克计)的微粒粉末(约0.1至5g)置于玻璃板或小瓶中，并逐滴加入蓖麻油(或异壬酸异壬酯)。加入4至5滴油后，用刮刀将油引入粉末中。继续加入油直到形成油和粉末的聚集物。此时，一次加入一滴油，然后用刮刀研磨混合物。当获得光滑、坚固的糊状物时停止添加油。当糊状物可以散布在玻璃板上而不会破裂或形成团块时，测量完成。然后记录油的体积Vs(以ml表示)。吸油率对应于比值Vs/p。在实施方案中，本发明的微孔颗粒具有约60ml/100g或更多的蓖麻油吸收量。在优选的实施方案中，蓖麻油吸收率为约65、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约225或约250ml/100g或更多。

微粒的孔隙率也可以通过BET(Brunauer-Emmett-Teller)方法来测量，该方法在Journal of the American Chemical Society,Vol.60,p.309,1938中描述，其援引加入本文。BET方法符合国际标准ISO 5794/1。BET方法产生一个称为表面面积(m²/g)的量。在实施方案中，本发明的微孔颗粒具有约30m²/g或更大的表面面积。在优选实施例中，表面面积为约45、约50、约75、约100、约125或约150m²/g或更高。

微粒中任选存在的成分

除了肽/蛋白，在实施方案中，本发明的微粒还可以包含一种或多种为皮肤带来额外益处的功能性分子。这些益处包括例如抗紫外线和蓝光的保护、抗氧化和抗衰老性、保湿作用以及颜色。

赋予颜色的功能性分子包括天然染料。天然染料的非限制性实例包括金盏花红素、虾青素、红木素、角黄素、β-apo-4-胡萝卜醛、β-apo-8-胡萝卜醛、β-胡萝卜素、β-apo-8-胡萝卜素酸酯(beta-apo-8-carotenoic ester)、叶绿素柠黄质(chlorophylcitraxanthin)、隐黄质、海胆烯酮、番茄红素、叶黄素、链孢红素、红酵母红素、圆酵母素和玉米黄素。

提供抗UVB或UVA光直接保护的功能性分子(即，UV(UVB或UVA)防护剂)包括有机油溶性或水溶性UV防护剂。油溶性UVB防护剂的非限制性实例包括3-苄叉樟脑及其衍生物、4-氨基苯甲酸衍生物、肉桂酸酯、亚苄基丙二酸以及水杨酸、二苯甲酮衍生物以及三嗪衍生物。水溶性UVB保护剂的非限制性实例包括主要是磺酸及其盐的衍生物。实例有2-苄基苯基咪唑-5-磺酸及其盐、3-苄叉樟脑的磺酸及其盐、磺酸及其盐或二苯甲酮。UVA保护剂的非限制性实例是苯甲酰甲烷的衍生物以及二苯甲酮的氨基羟基取代的衍生物。

由于表现出抗氧化性，一些功能性分子为上述紫外线防护剂提供次要的益处。此类抗氧化功能性分子的非限制性实例包括维生素E、辅酶Q10、醌、泛醌以及维生素C(抗坏血酸)。这些抗氧化功能性分子会中断紫外线穿透皮肤时发生的光化学链式反应。

其他作为紫外线防护剂的功能性分子包括无机颜料，例如二氧化钛和氧化锌。这些可以与上述提供直接防护UVB或UVA光的分子结合使用。

抗衰老功能性分子包括例如维生素，例如维生素A醇、醛、酸和酯。这些属于对皮肤具有抗衰老作用的类视黄醇。

其他功能性分子包括例如维生素A、C、E、F，并且优选B组的维生素和维生素原。这些功能性分子中的一些(例如尼克酰胺/烟酰胺、泛醇、泛内酯)是优选的，因为他们有利地赋予微珠保湿和皮肤镇静性能。

进一步优选的功能性分子包括硫辛酸及其盐、酯、糖、核苷、核苷酸、肽以及脂质衍生物。这些提供抗氧化作用。

进一步优选的功能性分子包括脂肪酸，特别是支链饱和脂肪酸以及优选为支链二十烷酸，例如甲基二十烷酸。

功能性分子与纤维素纳米晶体和/或肽/蛋白结合。功能性分子与纤维素和/或蛋白之间的键可以是基于氢键或离子或范德华或疏水相互作用的共价键或非共价键，或非共价相互作用的组合。如下一节所述，当功能性分子用CNC喷雾干燥时，优选形成非共价键。

纳米晶体涂层

可以在制造微粒之前涂覆纤维素纳米晶体。结果，这一涂层的组分将作为涂层保留在微粒中的纳米晶体周围。因此，在实施方案中，涂覆微粒中的纳米晶体。

对于赋予纳米晶体结合作用，以增强微粒，这一操作特别有用。事实上，高度多孔的微粒可能更脆，通常不期望这样的结果，并且通常可以使用粘合剂来抵消这一结果。在实施方案中，所述涂层是聚电解质层或具有交替电荷的聚电解质层的堆叠，优选为一层聚电解质层。

实际上，纳米晶体的表面通常带电。例如，硫酸化纤维素I纳米晶体以及羧基化纤维素I纳米晶体以及他们的盐通常具有带负电荷的表面。该表面因此可以与一种或多种聚阳离子(带正电)反应，所述聚阳离子将自身静电附着到纳米晶体的表面，并在纳米晶体的表面上形成聚阳离子层。相反，表面带正电的纳米晶体可以涂覆聚阴离子层。在这两种情况下，如果需要，可以通过反转所添加的每一层聚电解质的电荷，在先前形成的聚电解质层的基础上类似地形成进一步的聚电解质层。

在实施方案中，聚阴离子带有例如羧酸根以及硫酸根的基团。此类聚阴离子的非限制性实例包括丙烯酰胺与丙烯酸的共聚物以及与具有磺酸盐单体的共聚物，例如2-丙烯酰胺基-2-甲基-丙磺酸的钠盐(由

Corporation销售的

)。

在实施方案中，聚阳离子带有例如季铵中心的基团。通过将丙烯酰胺与不同比例的丙烯酸或甲基丙烯酸酯的氨基衍生物共聚，可以通过与阴离子共聚物相似的方式制备聚阳离子。其他实例包括季铵化的聚-4-乙烯基吡啶以及聚-2-甲基-5-乙烯基吡啶。聚阳离子的非限制性实例包括聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、聚(酰氨基胺)和聚(氨基-共酯)。聚阳离子的其他非限制性实例有聚季铵盐。“聚季铵盐”是几种用于个人护理行业的聚阳离子聚合物的INCI(International Nomenclature for Cosmetic Ingredients)名称。INCI已经批准聚季铵盐名称下的不同聚合物。其区别在于“季铵盐(polyquaternium)””一词后面的数值。聚季铵盐被确定为聚季铵盐-1、-2、-4、-5至-20、-22、-24、-27至-37、-39、-42、-44至-47。优选的聚季铵盐是聚季铵盐-6，其对应于聚(二烯丙基二甲基氯化铵)。

在实施方案中，涂层包含一种或多种染料，其产生有色微粒。这种染料可以直接位于纳米晶体表面或聚电解质层上。

带正电荷染料的非限制性实例包括：红色染料#2GL，浅黄色染料#7GL。

带负电荷染料的非限制性实例包括：D&C红色染料#28、FD&C红色染料#40、FD&C蓝色染料#1FD&C蓝色染料#2、FD&C黄色染料#5、FD&C黄色染料#6、FD&C绿色染料#3、D&C橙色染料#4、D&C紫色染料#2，荧光桃红色B(D&C红色染料#28)和硫黑色#1。优选的染料包括荧光桃红色B(D&C红色染料#28)、FD&C蓝色染料#1和FD&C黄色染料#5。

散布在纳米晶体中和/或沉积在孔壁上的物质

如下文所述，可以使用致孔剂乳液制备本发明的多孔微粒，然后使用喷雾干燥将纳米晶体与一种或多种蛋白聚集在致孔剂液滴周围，然后去除致孔剂。众所周知(并在下面解释)，通常使用乳化剂、表面活性剂、助表面活性剂等稳定乳液，并且这些化合物通常将其自身配置在致孔剂液滴的内部或表面。这些化合物可能会或者可能不会在微粒的制备过程中去除。如果不去除这些化合物，他们将沿着孔壁保留在微粒中，所述孔壁由致孔剂的去除而产生。因此，在实施方案中，有一种或多种物质沉积在微粒的孔壁上。在实施方案中，这些物质是乳化剂、表面活性剂、辅助表面活性剂。在实施方案中，一种或多种蛋白是这些物质中的一种。在优选的实施方案中，明胶沉积在微粒的孔壁上。其他物质包括藻酸盐、白蛋白、麦胶蛋白、支链淀粉以及葡聚糖。

类似地，致孔剂乳液的连续相以及纳米晶体悬浮液的液相都可以包含各种物质，所述物质可能不会在微粒的制备过程中去除。如果不去除这些化合物，他们将保留在微粒中，所述微粒散布在纳米晶体之间。这对于赋予纳米晶体结合效果以增强微粒是有用的。

制备本发明的微粒的方法

在本发明的另一方面，提供一种制备上述纤维素微粒的方法。所述方法包括以下步骤：

a)提供纤维素纳米晶体的悬浮液以及一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物的溶液；

b)将所述悬浮液与所述溶液混合以制备混合物；以及

c)喷雾干燥所述混合物以制备微粒。

在本文中，“悬浮液”是混合物，其包含分散在连续液相中的固体颗粒，在本案中为纤维素纳米晶体。通常，可以剧烈混合纳米晶体与构成液相的液体，以提供这种悬浮液。超声处理可以用于这种混合，也可以应用高压均质器或高速、高剪切旋转混合器。优选的液相是水，优选蒸馏水。

基于悬浮液的总重量，悬浮液可包含浓度为例如约0.1-约10重量％的纤维素纳米晶体。如果悬浮液的粘度高，可将悬浮液稀释以保证良好的分散性。

溶液(与悬浮液混合之前)可以含有一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物，基于溶液的总重量，其浓度为例如约0.01重量％-约50重量％。应当理解，如果存在多于一种肽或蛋白，他们可以在单独的溶液中提供。

悬浮液和溶液在步骤b)混合，其比例对应于所制备的微粒中所需的蛋白与纤维素纳米晶体的比例。

以最小的剪切力将CNC与丝心蛋白溶液混合在一起，直到溶液均匀。

当使用丝心蛋白制备疏水性微粒时，混合后的混合物应立即喷雾干燥。

在喷雾干燥过程中，悬浮液的溶剂与其他任何低沸点组分一起蒸发。悬浮液首先转化为气溶胶，喷入热干燥室，在干燥室中，通过加热去除溶剂(在本案中是水)以及其他低沸点化学品。使用干燥器出口处的旋风分离器或袋式除尘器收集剩余的干燥颗粒或微粒。

在通过喷雾干燥以形成微珠的相分离之前，肽或蛋白与CNC之间的非共价偶联可以溶解或悬浮的状态发生。溶剂优选为水或在水中的纳米乳液。蛋白与CNC的非共价结合发生在喷雾干燥过程中，其中具有从流体到固态的相变。

微粒组装后，可以通过光学和扫描电子显微镜的方法测定其形态。可以通过X射线光电子能谱结合氩离子深度分析，或通过聚焦离子束深度以及空间分析技术结合空间分辨X射线能量色散分析(EDAX)测量肽/蛋白的浓度以及肽/蛋白在微粒中的空间分布。

在实施方案中，特别是那些使用丝素蛋白的实施方案中，在步骤c)之后，可以用醇例如甲醇或乙醇洗涤所述微粒。这倾向于提高微粒的疏水性。

引入任选存在的功能性分子

如上所述，功能性分子与纤维素纳米晶体和/或肽/蛋白结合。功能性分子与纤维素和/或肽/蛋白之间的键可以是基于氢键或离子或范德华或疏水相互作用的共价键或非共价键，或者非共价相互作用的组合。优选功能性分子与蛋白和/或CNC的非共价偶联。

在通过喷雾干燥以形成微珠的相分离之前，功能性分子与肽或蛋白和/或CNC之间的共价或非共价偶联可以溶解或悬浮的状态发生。

溶剂优选为水或在水中的纳米乳液。

为了将功能性分子与蛋白和/或CNC非共价结合，将功能性分子、肽/蛋白和CNC全部溶于或悬浮于相同的溶剂中(即在步骤b)的混合物中)。或者，将功能性分子和肽/蛋白溶解于相同的溶剂中(即在步骤a)的溶液中)，然后将两者的组合加入到CNC的悬浮液中(在步骤b)中)；或将CNC的悬浮液添加到肽/蛋白和功能性分子的组合中。在另一个替代方案中，将功能性分子与CNC溶解或悬浮(即在步骤a)的悬浮液中)，并将该组合加入到肽/蛋白溶液中(在步骤b)的过程中)；或者肽/蛋白溶液被添加到功能性分子与CNC悬浮液的组合中。

在实施方案中，在加入步骤a)的溶液或悬浮液或步骤b)的混合物之前，功能性分子可以首先溶于除水以外的溶剂中，尤其是如果功能性分子是疏水的。或者，功能性分子可以首先溶解在纳米乳液中。

功能性分子与蛋白和/或CNC的非共价结合发生在喷雾干燥过程中，在该过程中具有从流体到固态的相变。

如果功能性分子是染料，则可以通过光度法测定染料浓度，并且可以通过高光谱成像测定表面的染料分布。

由于蛋白通常是带电分子，因此可以通过测量微珠的消光光谱来分析功能性分子，例如带有与蛋白相反电荷的染料。在这种情况下，可以确定蛋白/CNC微珠的电荷密度和电荷效率，其为附着在蛋白/CNC微珠上的功能性染料分子的百分比。

制备多孔微粒

当需要多孔微粒时，这一方法可以稍作修改。所得方法包括以下步骤：

a)提供纤维素纳米晶体的悬浮液，一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物的溶液以及致孔剂的乳液，其中所述一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物的溶液是乳液的一部分或单独存在；

b)将所述悬浮液与所述溶液以及所述乳液混合以制备包含连续液相的混合物，其中

分散有致孔剂液滴，悬浮纤维素纳米晶体，并且溶解一种或多种肽、一种或多种蛋白，其混合物；

c)喷雾干燥混合物以制备微粒；以及

d)如果在喷雾干燥过程中致孔剂没有充分蒸发以在微粒中形成孔，则蒸发致孔剂或将致孔剂从微粒中浸出。

在喷雾干燥过程中，纳米晶体配置在致孔剂液滴的周围。然后，去除致孔剂(在微粒内产生孔。致孔剂的去除可以在喷雾干燥的过程中自发地发生(如果致孔剂具有足够的挥发性)，否则在随后的步骤d)中去除致孔剂。

在本文中，“乳液”是两种或多种不混溶的液体的混合物，其中一种称为分散相的液体以液滴的形式分散在另一种称为连续相的液体中。所有上述类型的乳液均可用于本方法。然而，可用于本方法的粗滴乳液限于这样的乳液，其中分散相的液滴具有至多约5μm的直径。

通常使用一种或多种表面活性剂稳定乳液，有时还使用助表面活性剂和助溶剂，以促进分散相液滴的分散。由于超低表面张力和有利的结构形成能量，微乳液自发形成。微乳液的自发形成是由于表面活性剂、助表面活性剂以及助溶剂的协同相互作用。微乳液是热力学稳定的。其粒度不随时间变化。如果稀释、酸化或加热，微乳液会变得物理不稳定。纳米乳液和粗滴乳液不会自发形成。他们必须通过对油、水和表面活性剂的混合物施加剪切力而形成。纳米乳液和粗滴乳液在动力学上是稳定的，但在热力学上是不稳定的：随着时间的推移，其粒径会通过聚结、絮凝和/或Ostwald熟化而增加。

提供致孔剂乳液的步骤b)包括混合两种彼此不混溶的液体，根据需要，任选地与乳化剂、表面活性剂和/或助表面活性剂一起形成乳液，其中两种不混溶液体之一的液滴将分散在两种不混溶液体中另一种的连续相中。

在本文中，术语“致孔剂”是指分散相的那些组分(不混溶液体、乳化剂、表面活性剂和/或助表面活性剂中的一种，以及任何其他任选存在的添加剂)，其存在于步骤a)和b)中的液滴中，并且在步骤c)和/或d)中，其从微粒中去除，从而在微粒中形成孔。通常，致孔剂包括形成液滴的液体(处于包含在乳液中的两种不混的溶液体中)。致孔剂还可包括乳化剂、表面活性剂和/或助表面活性剂；尽管如上所述，其中一些可能会被遗留下来(即不是致孔剂)。

在步骤c)中，喷雾干燥导致纤维素纳米晶体聚集并捕获致孔剂液滴，并聚集成微粒。此外，如果致孔剂具有足够低的沸点，则喷雾干燥将导致致孔剂液滴蒸发，从而在微粒中产生孔。如果致孔剂没有足够低的沸点，在喷雾干燥步骤c)期间，其将仅部分蒸发或根本不蒸发。在这种情况下，为了形成所需的孔，将在步骤d)期间从微粒中去除致孔剂。因此，步骤d)是任选的。仅当在喷雾干燥过程中，致孔剂没有(或不充分)蒸发时才需要进行。

通常，在喷雾干燥过程中蒸发的致孔剂的示例，即“自提取致孔剂”，包括：

·萜烯，例如柠檬烯和蒎烯、莰烯、3-蒈烯、芳樟醇、石竹烯醇、橙花叔醇以及叶绿醇；

·烷烃，例如庚烷、辛烷、壬烷、癸烷以及十二烷；

·芳烃，例如甲苯、乙苯以及二甲苯；

·氟代烃，例如全氟萘烷、全氟己烷、全氟辛基溴和全氟丁基胺。

步骤d)是蒸发致孔剂，或致孔剂从微粒中浸出。只要保持微粒的完整性，这可以通过任何方法实现。例如，可以通过加热、真空干燥、流化床干燥、冻干或这些技术的任何组合来实现蒸发。可以通过将微粒暴露于液体中来实现浸出，所述液体溶解致孔剂(即其是致孔剂溶剂)，同时作为纤维素I纳米晶体的非溶剂。

使用丝心蛋白作为微粒中的蛋白

用于微粒的丝心蛋白可以是任何丝心蛋白。非限制性的实例包括从胶状(仍含有丝胶)的蚕茧和片材、脱胶丝绸上衣、手帕和砖块以及化妆品级的丝粉获得的丝心蛋白。

从胶状蚕茧和片材中获取丝心蛋白需要两个工艺步骤：脱胶，然后是丝心蛋白溶解。相比之下，从脱胶丝绸上衣、手帕和砖块以及化妆品级丝粉中获得丝心蛋白只需要一个工艺步骤：丝心蛋白溶解。脱胶以及丝心蛋白溶解的方法是技术人员公知的。

如上所述，基于微粒的重量，即使以低至0.5重量％的浓度使用丝心蛋白，也能够制备疏水性微粒。然而，如上所述，在上述方法的步骤b)中获得的混合物应尽快喷雾干燥。事实上，让悬浮液静置3天以上将不会产生疏水性微粒。

本发明微粒的有益效果

在实施方案中，本发明的微粒可具有以下有益效果中的一个或多个。

其结合肽和/或蛋白的优点，同时将其置于可生物降解的基质中，保留微粒的结构完整性。申请人已经发现，通过喷雾干燥过程，将肽和/或蛋白与纤维素纳米晶体(CNC)混合以制备CNC-蛋白质微珠，可以有利地实现这样的技术效果。有利地，这种制备方法需要很少的步骤。

如上所述，在一些实施例中(包括微粒丝素蛋白)，可以将微粒的性质从亲水性调整为疏水性/疏脂性。这一性质是有利的，因为在化妆品工业中需要表现出后者这些性质的微珠。事实上，此类微粒与亲水性或亲脂性主体介质(例如油、蜡和许多石油基聚合物)有利地相容。包含本发明微粒的化妆品配方的更多细节在下一部分中提供。

特别地，申请人惊讶地发现，当一起喷雾干燥时，SF与羧基化或硫酸化CNC的组合产生疏水和亲脂的复合羧基化纤维素/SF或硫酸化纤维素/SF微珠。这一发现令人惊讶，因为关于纤维素/SF复合材料(包括纤维素纳米纤维以及纤维素纳米晶体)的文献表明，SF与纤维素组合是亲水的，并且在某些情况下显示出增强的保湿性。该发现甚至更重要，因为如下所述，SF的引入减少将亲水性微珠转化为亲脂性微珠所需的涂覆步骤的数量和复杂性。

在本发明的微粒中，CNC与肽之间形成的键是非共价键，即优选地没有共价键。由于多种原因，在蛋白和CNC之间形成共价化学键是不期望的。例如，Maillard反应赋予蛋白质-CNC复合材料不期望的深棕色染色。这使得这种复合材料在化妆品中的应用令人不快。

微粒是天然并且可持续来源的，这是有利的。事实上，化妆品以及个人护理产业正向着创造“天然来源”的产品而迈进。这个术语很难定义，而ISO组织通过定义“天然指数”来解决这个问题。天然指数是一个值，其表明化妆品成分符合ISO 16128-1:2016第2条中天然成分定义的程度。该值可以解释为在0至1之间变化，其中1可以解释为100％天然(“有机”来源)。化妆品产业正在向原料供应商施压，在原料生产中使用可持续的制备方法，以确保高天然指数并排除GMO添加剂。因此，需要全部或部分衍生自本发明提供的天然来源的亲脂性/疏水性微珠。

通过在纹理化、易于配制以增强皮肤感觉、理想的光学性质如软聚焦以及皮肤化妆品方面的理想变化，本发明的微粒可为消费者带来新的益处。

在实施方案中，本发明的微粒还可以通过可携带的功能性分子为皮肤带来额外的益处。如上所述，这些益处包括例如抗紫外线和蓝光的保护、抗氧化和抗衰老性、保湿作用以及颜色。

本发明的微粒的用途

本发明的微粒可用于化妆品制品。例如，其可以替代目前用于此类制品的塑料微珠。因此，在本发明的另一方面，提供了一种化妆品制品，其包含上述微粒以及一种或多种化妆品可接受的成分。

化妆品制品中的这些化妆品可接受成分的性质并不重要。技术人员熟知的成分和配方可用于制备所述化妆品制品。

在本文中，“化妆品制品”是一种产品，其旨在摩擦、倾倒、撒或喷洒、引入或以其他方式施用于人体，以用于清洁、美化、提升吸引力或改变外观。化妆品包括但不限于这样的产品，其可应用于：

·面部，例如护肤霜和乳液、清洁剂、爽肤水、面膜、角质剥脱剂、保湿剂、底漆、口红、唇蜜、唇线笔、丰唇剂、润唇膏、唇彩(lip stains)、唇部调理剂、唇部底漆、唇部促进剂、唇油、湿巾、遮瑕膏、粉底、扑面粉、腮红、轮廓粉或霜、高光粉或霜、古铜粉、睫毛膏、眼影、眼线笔、眉笔、面霜、蜡、凝胶或粉末、定型喷雾；

·身体，例如香水以及古龙水、皮肤清洁剂、保湿剂、除臭剂、乳液、粉末、婴

儿用品、沐浴油、泡泡浴、浴盐、润肤露和身体黄油；

·手/指甲，例如指甲油和脚趾甲油，以及洗手液；以及

·头发，例如洗发水和护发素、永久性化学品、染发剂、美发产品(例如发胶和凝胶剂)。

化妆品可以是装饰性产品(即化妆品)、个人护理产品，或同时是两者。事实上，化妆品被非正式地分为：

·“化妆”产品，主要是含有旨在改变用户外表的彩色颜料的产品，以及

·“个人护理”产品，其包括其余的产品，这些产品主要是支持皮肤/身体/头发/手/指甲完整性、增强其外表或吸引力和/或缓解影响这些身体部位的某些状况的产品。

两种类型的化妆品都包含在本发明内。

化妆品的一个子集包括这样的化妆品(主要是个人护理产品)，其也被视为“药物”，因为他们旨在用于疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防，或旨在影响人类或其他动物的身体结构或任何功能。示例包括去头屑洗发水、除臭剂(也是止汗剂)、保湿剂以及化妆品等产品，这些产品具有防晒声明或抗痘声明销售，并进行销售。该化妆品子集也包含在本发明内。

皮肤感觉是化妆品制品的一个极其重要的性质。消费者优选具有良好或优选极好的皮肤感觉的制品。

吸收皮脂的微粒是期望的，因为其使皮肤看起来不那么有光泽，因此更自然(如果微粒是非美白的)—这被称为哑光效果。

化妆品产业需要疏水且同时亲脂的微珠(根据上面给出的定义)。亲脂性化合物具有溶解在脂肪、油、脂类以及非极性有机溶剂(例如己烷或甲苯)中或与之相容的趋势。这样的微珠具有如下有益效果，其更容易在油包水乳液中以及其他主要亲脂性的介质(例如口红)中配制。

由于环境问题，塑料微珠(包括多孔塑料微珠)在世界范围内被禁止或正在被禁止，因此需要使用具有相同益处(可调节吸油率以及哑光效果)但对环境更友好的微粒代替他们。因此，具有改善的吸油率、亲脂性以及改善的皮肤感觉的微粒(例如本文提供的那些)对化妆品产业是有利的。其可以替代塑料微珠，同时保留其优点。

术语定义

在描述本发明的文本中(特别是在以下权利要求的文本中)，术语“一种”、“一个”以及“所述”的使用应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与文本明显矛盾。

除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”以及“含有”应被解释为开放式术语(即，意为“包括但不限于”)。

除非本文另有说明，否则本文对数值范围的引用仅旨在作为单独引用落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且将每个单独值并入说明书中，如同其在本文中单独引用一样。范围内的所有值的子集也被并入到说明书中，如同其在本文中被单独引用一样。

除非本文另有说明或与文本明显矛盾，本文描述所有方法都可以任何合适的顺序进行。

除非另有声明，否则本文提供的任何以及所有示例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。

说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的元素对于本发明的实施是必不可少的。

在本文中，术语“约”具有其普的通含义。在实施方案中，可以表示合格数值的正负10％或正负5％。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。

在阅读以下仅作为示例并参考附图给出的具体实施方案的非限制性描述后，本发明的其他目的、优点以及特征将变得更加明显。

具体实施方式

通过以下非限制性实施例更详细地说明本发明。

各种纤维素纳米晶体(CNC)悬浮液的制备

CNC悬浮液#1–羧基化CNC

以下用作起始材料的纤维素纳米晶体悬浮液通过国际专利公开号WO 2016\015148A1中提供的方法制备。

简而言之，将溶解浆(Temalfa 93)溶解于30％的过氧化氢水溶液中，并在剧烈搅拌下加热回流8小时。所得悬浮液用水稀释，通过渗滤纯化，然后用氢氧化钠水溶液中和。

所得的羧酸钠纳米晶体纤维素(cCNC)的浓缩原液悬浮液通常由4％CNC的蒸馏水溶液组成。该悬浮液按原样使用，或根据需要用蒸馏水稀释以用于以下实施例。

CNC悬浮液#2-硫酸化CNC

根据Revol et al.(Dong,X.；Revol,J.-F.；Gray,D.,Effect ofmicrocrystallite preparation conditions on the formation of colloid crystalsof cellulose.Cellulose 1998,5(1),19-32)的方法制备硫酸化CNC。

实施例1-7-丝心蛋白/纤维素微粒

丝心蛋白溶液#1的制备

在80℃，将1-2g丝素蛋白(来自Ikeda Corporation-化妆品级丝心蛋白粉)加入到5.55g CaCl₂、4.6g乙醇、7.2g蒸馏水(CaCl₂：乙醇：H₂O的摩尔比为1:2:8)中。(注意：Ajisawa溶剂混合物会产生大量热量)。将丝素蛋白压下，使其完全浸入溶剂中。20-30分钟后，丝心蛋白似乎完全溶解，溶液变得透明，呈黄色。

将丝心蛋白溶液移液到纤维素透析管中，并且在3.5L的玻璃烧杯中，用蒸馏水透析。第一天每小时换水一次，之后每半天换一次水。整个透析过程耗时三天。

透析后，透析管中的溶液的丝心蛋白浓度为1.5-2.0重量％。

使用从其他来源获得或使用其他试剂溶解的丝心蛋白

发明人使用由胶状(仍含有丝胶)蚕茧和片材，以及脱胶丝绸上衣、手帕和砖块以及化妆品级蚕丝粉获得的丝心蛋白。可以使用来自印度、老挝、日本和中国的丝绸。这些原料用于通过下述各种方法生产丝心蛋白溶液。在所有情况下，当使用丝心蛋白溶液#1时，获得的丝心蛋白产生具有疏水性的含有丝心蛋白的纤维素微粒，其具有与本文报道的那些微粒相似的疏水性。

从胶状蚕茧以及片材中获取丝心蛋白需要两个工艺步骤：脱胶，然后是丝心蛋白溶解。相比之下，从脱胶丝绸上衣、手帕、砖块以及化妆品级丝粉中获得丝心蛋白只需要一个工艺步骤：丝心蛋白溶解。

脱胶-使用碳酸钠的碱性方法

将碳酸钠的水溶液煮沸，其浓度为2.12g碳酸钠/L水。待水沸腾均匀后，加入丝绸，将溶液煮沸15-30分钟，不时搅拌以确保均匀去除丝胶。随后，从沸腾的液体中取出纤维，并在冷的去离子水中漂洗。拧干多余的水，将纤维加入1L的去离子水中，不时搅拌20分钟。从水中取出纤维，挤掉多余的水。弃去水，再重复该漂洗过程两次以彻底洗掉碳酸钠。最后一次从水中取出丝心蛋白时，挤出多余的水，并将纤维铺在一块干净的铝箔上，让其干燥过夜。然后将这些纤维储存在室温下直至使用。

丝心蛋白溶解

使用多种方法溶解丝心蛋白：

·LiBr法(9.3M LiBr水溶液)，

·Ajisawa法(CaCl₂/EtOH/H₂O)，以及

所有这些都在下面举例说明。通常，丝绸粉末比丝纤维更容易溶解，并且丝心蛋白进入溶液所需的温度更低/时间更短。

为了测试丝心蛋白是否完全溶解，在进行任何纯化步骤之前进行了目视检查(也在以下进行描述)。当没有可见的悬浮颗粒的迹象时，认为丝心蛋白完全溶解。

纯化后，丝心蛋白溶液在冰箱中最多保存10天。

LiBr法

制备9.3M的LiBr溶液，确保LiBr缓慢加入水中，因为这是一个放热过程。将所需量的脱胶丝心蛋白装入可容纳所有成分的最小容器中。以每克脱胶丝心蛋白4mL9.3M LiBr溶液的浓度，将LiBr溶液添加到丝绸的顶部(必须在丝绸之后将LiBr溶液引入到容器中！)。混合物在55-60℃的烘箱中静置4小时，直至其变得非常粘稠，但不再含有任何可见的纤维。将所得的溶液置于透析管中，并用水透析(1L水/12mL丝心蛋白溶液)。在1小时后、4小时后、当晚、第二天早上和第二天晚上以及之后一天早上换水(即，48小时内换水6次)，以获得所需的丝心蛋白溶液。

有时，当丝心蛋白由蚕茧获取时，丝心蛋白溶液中存在固体碎屑。在这种情况下，使用离心机，以9000rpm离心20分钟，优选在4℃(尽管室温也可以)，去除碎屑。

Ajisawa法

制备摩尔比为1:2:8的CaCl₂/EtOH/H₂O溶液。每克丝素蛋白使用8-9g溶液。丝绸被溶液完全润湿，然后将其放入温度为50-100℃的烘箱中，直至所有纤维溶解(通常需要20-120分钟)。

使用以下两种方法之一纯化含有溶解丝心蛋白的溶液：透析或尺寸排阻柱(GEHealthcare的sephadex G-25脱盐树脂)。如果使用尺寸排阻柱，则用水(10g水/1g丝心蛋白)稀释溶液，然后将溶液流过脱盐柱。如果使用透析，则将溶液转移至透析管中，并用水(使用约1L水/1g丝心蛋白)透析。第一天每小时换水一次，之后在48h内每半天换一次水。

测量丝心蛋白/纤维素微粒的疏水反应

疏水反应的简单定性测定是其排斥水的趋势的量度。因此，微粒的疏水反应可以通过以下两种方式中的任一种直观地确定：

·将粉末样品放在显微镜载玻片上并加水，观察水是否润湿粉末或被粉末排斥。

·将粉末样品(～10mg)放入0.5打兰(dram)的小瓶中，然后向其中加入1mL水。

然后将加盖的小瓶摇晃5秒。当混合物沉降时，粉末将漂浮在水的表面(疏水度量)或分散在水中(亲水度量)。

然后在为定性测量目的而设计的油包水乳液中，进行测试以定性测量疏水性。乳液的组成以及步骤如下：

乳液制备如下：

1.在配备有锯齿刀片的Rayneri混合器上，在400rpm的速度下，于75℃下将相1的成分混合5分钟。

2.将相2的成分加入至相1中，并以500rpm混合2x5分钟。

3.在磁力搅拌板上，将相3的成分合并，并以400rpm的速度混合，同时加热至75℃。

4.将相3缓慢加入至相1+2中，同时将搅拌速度由600rpm提高至1200rpm。

5.一旦形成乳液，在75℃加热的同时，速度提高至2500rpm，持续5分钟。

6.使乳液冷却至室温，同时以300rpm的速度缓慢混合。

由于其倾向于水相，具有高亲水性的纤维素微粒在油包水乳液中聚集，并且在这些乳液系统中以离散液滴的形式存在。事实上，当单个微粒进入水相时，其会聚集在水滴中，从而形成团块。因此，亲水性微粒最终会逐渐聚集成更大的颗粒，直到他们很容易被肉眼看到。相比之下，未在油包水乳液中观察到疏水性微粒的聚集。

实施例1-源自羧基化CNC与丝素蛋白的疏水性丝心蛋白/纤维素微粒

CNC悬浮液#1(2.17重量％CNC)与丝心蛋白溶液#1(1.8重量％)混合，使得最终丝心蛋白含量相比CNC含量为2重量％。CNC与丝心蛋白溶液的混合在最小剪切力下进行，确保体积尺寸的有效搅拌。进行搅拌，直到10分钟内溶液达到均匀状态。悬浮液立即喷雾干燥(Techni Process喷雾干燥器，型号SD-1；入口温度190℃，出口温度89-92℃，喷嘴压力2bar，压力差180mm WC)。喷雾干燥后，所得的自由流动的白色粉末可用乙醇等醇类进行洗涤，然后在80℃的烘箱中30分钟，以提高疏水效果。获得的微粒中，丝素蛋白的含量为2重量％。

图2A)示出添加水获得的粉末样品。可以清楚地看到，粉末位于水滴表面上，而不是被润湿。这表明微粒是疏水的。

图3A)示出混合上述油包水乳液所获得的粉末。没有观察到聚集体，表明微粒是疏水的。

实施例2-疏水性丝心蛋白/纤维素微粒，其中丝素蛋白含量相比羧基化CNC含量的范围为0.5重量％-50重量％。

通过与实施例1中所述的相同的方式获得疏水性微粒。

更具体地，在剧烈搅拌下将丝素蛋白溶液(2重量％)添加至CNC悬浮液#1(0.5重量％)中，以分别获得5重量％、10重量％、20重量％以及50重量％的SF溶液。在Büchi MiniSpray Dryer B型-191(入口温度175℃以及出口温度100℃，30％泵速，70％吸气器)上喷雾干燥所得悬浮液。一些样品用甲醇处理，以增加微珠中的β折叠片SF的比例。

获得的粉末是疏水的。

图4示出获得的微粒的SEM图像。

为了进行对比，图5示出仅通过喷雾干燥丝素蛋白(即，没有CNC)获得的微粒。

SF以β折叠片形式的存在，这似乎与疏水作用有关，其中疏水作用是SF与CNC混合制成混合SF/CNC微粒时赋予的。似乎SF的一部分必须集中在混合微珠的表面或接近其亚表面，否则微珠可能被水润湿。

微珠中的β折叠片SF的相对量通过分析SF链构象的百分比来确定，这些构象在酰胺拉伸区域的1580-1720cm^-1区域内贡献红外吸收。使用Bruker ALPHA FTIR光谱仪(BrukerOptics Inc.，Billerica，USA)测量400cm^-1-4000cm^-1光谱范围内的微球粉末的FTIR光谱，以4cm^-1的标称分辨率扫描60次获得。通过使用高斯解卷积(OriginPro 2018b软件(OriginLab，Northampton，USA)的标准曲线拟合确定β折叠片、β转角、α螺旋、无规卷曲以及聚集链的相对贡献。甲醇用于诱导丝素蛋白向不溶性β-折叠状态的构象转变。图6示出用甲醇(无MT)处理之前以及用甲醇(MT)处理后的微珠样品中β折叠片的百分比。该图示出甲醇处理提高了微珠中β折叠片SF的百分比。

X射线光电子能谱(XPS)是一种高度灵敏的表面分析方法，可探测表面的顶部的10nm。当与溅射或蚀刻源结合使用，以在分析周期之间缓慢去除材料而不损坏底层材料时，深度剖面XPS可实现高分辨率化学分析。2％SF/CNC微珠样品中的SF的空间位置可以通过深度分析XPS确定。XPS测量使用Thermo Scientific K-Alpha光谱仪进行。使用能量为500eV并且电流为1.00μA的氩离子枪进行深度剖面分析，进行300秒，循环10次。XPS是在每个蚀刻级别上执行的，同时使用流体枪。X射线发射角相对于试样表面为90度。分析区域的直径为400μm。据估计，10分钟的蚀刻对应1μm的蚀刻深度。光谱解卷积，根据其结合能，所得的曲线归因于不同种类的键。解析曲线的积分能够计算原子氮百分比。图7示出与微珠中2％负载的SF相关的氮1s峰的深度剖面分析。399.7eV时，通过测量作为时间函数的氮的结合能强度峰值来实现深度剖面分析。光谱参考结合能为285.0eV的脂肪族碳的C1s峰。在图中，位置1是指没有Ar+侵蚀的微珠表面。位置2到10是Ar+侵蚀的5分钟增量，因此是微珠内部蛋白含量的量度。该图表明，2％SF/CNC微珠中的SF更集中在表面，然后更均匀地分布在样品中的微珠内部。

水溶性染料分子亚甲蓝(MB)几乎立即被不含SF的CNC微珠吸收。因此，另一种衡量SF/CNC微珠疏水屏障性质的方法是测量MB吸收。在Thermo ScientificTM EvolutionTM260Bio UV-Vis分光光度计(Fisher Scientific Company，Ottawa，Canada)上测量亚甲蓝在SF/CNC微珠上的吸收和释放。亚甲蓝购自Alfa Aesar(Heysham,UK)，甲醇购自FisherChemicals(Fair Lawn,USA)，丙酮购自Anachemica(Mississauga,Canada)。以相同方式对非甲醇处理和甲醇处理的微球进行吸收和释放研究。对于甲醇处理，SF/CNC微球(100mg)在甲醇水溶液(80重量％，100mL)中放置过夜，过滤并用丙酮洗涤。对于吸收监测，SF/CNC微球(5mg)浸入亚甲蓝溶液(10mg/L，3mL)并混合。测量进行16小时，在665nm的波长以及750nm的参考波长下，每10分钟测量一次。对于释放监测，通过将SF/CNC微珠(100mg)浸入亚甲蓝溶液(78mg/L,45mL)过夜、过滤并用丙酮洗涤来制备样品。通过将染色的微珠(5mg)浸入水(3mL)中，混合，并在665nm的波长以及750nm的参考波长下，每小时测量，持续72小时，以完成测量。图8示出使用和未使用甲醇处理的2％SF/CNC微珠对MB的吸收和释放。与不含SF的CNC微珠相比，仅在约200小时(无甲醇处理，无MT)和约250小时(MT)后，SF混合珠才开始吸收MB。MB的释放主要发生在微珠表面。这在几乎瞬时的释放动力学(右侧曲线)和快速平台中很明显。与MT珠相比，无MT珠释放的染料更多，这与无MT样品中较低数量的β折叠片SF一致。

实施例3-源自硫酸化CNC与2％丝纤维蛋白的疏水性丝心蛋白/纤维素微粒

使用丝素蛋白和硫酸化NCC制备疏水性纤维素微珠。

因此，在具有磁力搅拌棒的搅拌板上，以200rpm搅拌70mL 0.68重量％的硫酸化CNC悬浮液#2(0.476g sNCC)的溶液。然后在恒定搅拌下缓慢加入0.464mL 2.05重量％(9.52mg)的丝心蛋白溶液#1。继续搅拌10-15分钟。直至液体均匀。然后将悬浮液喷雾干燥(Buchi喷雾干燥器，型号B191：入口温度165-185℃，泵速30％，吸气器70％，气压600Nl/h)。产生自由流动的白色粉末。

当如上所述进行测试时，发现该粉末是疏水的。

实施例4–多孔疏水性丝心蛋白/纤维素微粒

该实施例表明，当纳米乳液由非挥发性油/表面活性剂系统制备时，可以制备多孔疏水丝心蛋白/纤维素微粒。

400nm的纳米乳液的制备如下：在60℃下，0.021g的Montanov^TM82(SEPPIC)溶解于470ml的蒸馏水中。然后将10g苯甲酸烷基酯倒入Montanov^TM82溶液中，并在60C下以1000rpm搅拌10分钟。然后在冰水浴中，以60％的振幅(

Vibra-Cell)对混合物超声20分钟，以制备平均液滴直径为400nm的纳米乳液。

将300mL的CNC悬浮液#1(1.90重量％)倒入上述乳液中，并以300rpm混合10分钟。将28ml的丝心蛋白溶液#1(1.88重量％)倒入上述混合物中，并在喷雾干燥前以300rpm搅拌10分钟。喷雾干燥机参数设定如下：入口温度185C，出口温度：85C，喷嘴压力1.50bar，压力差180mmWc，喷嘴空气帽70。该过程产生干燥的自由流动的白色粉末。

为了去除嵌入的致孔剂(即苯甲酸烷基酯)，并诱导丝心蛋白β-折叠形成，将2g喷雾干燥的微珠加入40mL的乙醇中，并混合3分钟，然后在1200rpm下离心6分钟。此步骤重复一次，每次弃去上清液。然后将样品分散到20mL的乙醇中。将分散体倒入500mL的蒸发瓶中，并在25mbar(Heidolph旋转蒸发仪；(Basis Hei-Vap ML))真空条件下，以60℃以及70rpm旋转干燥。1小时后形成白色的自由流动的粉末。

当加入水中时，粉末与水不能很好地混合并停留在水的表面，这表明微粒是疏水的。

使用美国标准ASTM D281-84中描述的流体饱和度方法测量吸油率。测得的吸油率为195ml/100g。

实施例5–多孔疏水性丝心蛋白/纤维素微粒

本实施例表明，多孔疏水性丝素蛋白/纤维素微珠可由挥发油和非挥发性表面活性剂体系制备的纳米乳液形成。

900nm的纳米乳液的制备如下：在60C下，0.021g的Montanov^TM82(SEPPIC)溶解于470ml的蒸馏水中。然后将10g苯甲酸烷基酯倒入Montanov^TM82溶液中，并在60C下以1000rpm搅拌10分钟。然后冰水浴中，以60％的振幅(

Vibra-Cell)对混合物超声20分钟，以制备平均液滴直径为900nm的乳液。

将300mL的CNC悬浮液#1(1.90重量％)倒入上述乳液中，并以300rpm混合10分钟。将23ml丝心蛋白溶液#1(1.88重量％)倒入上述混合物中，并在喷雾干燥前以300rpm搅拌10分钟。喷雾干燥机参数设定如下：入口温度210C，出口温度：85C，喷嘴压力1.50bar，压力差180mmWc，喷嘴空气帽70。该过程产生干燥的自由流动的白色粉末。

当加入水中时，粉末与水不能很好地混合并停留在水的表面，表明微粒是疏水的。

使用美国标准ASTM D281-84中描述的流体饱和度方法测量吸油率。测得的吸油率为105ml/100g。

实施例6–多孔亲水性丝心蛋白/纤维素微粒

当与实施例4相比时，本实施例表明纳米乳液相比表面活性剂浓度的比例影响多孔微珠是疏水的还是亲水的。

840nm的纳米乳液的制备如下：在60C下，0.500g的Montanov^TM82(SEPPIC)溶解于350ml的蒸馏水中。然后将20g蒎烯倒入Montanov^TM82溶液中，并在60C下以1000rpm搅拌15分钟。然后在冰水浴中，以60％的振幅(

Vibra-Cell)对混合物超声15分钟，以制备平均液滴直径为840nm的乳液。

将466mL的CNC悬浮液#1(2.16重量％)倒入上述乳液中，并以300rpm混合10分钟。将12.7ml的丝心蛋白溶液#1(1.59重量％)倒入上述混合物中，并在喷雾干燥前以300rpm搅拌10分钟。喷雾干燥机参数设定如下：入口温度210℃，出口温度：85℃，喷嘴压力1.50bar，压力差180mmWc，喷嘴空气帽70。该过程产生干燥的自由流动的白色粉末。

粉末加入水中后迅速沉入水底，表明微粒具有亲水性。

使用美国标准ASTM D281-84中描述的流体饱和度方法测量吸油率。测得的吸油率为185ml/100g。

实施例7–多孔亲水性丝心蛋白/纤维素微粒

与实施例4相比，该实施例表明单独的表面活性剂与CNC相互作用产生亲水性微粒。

在本实施例中，与实施例4相比，不使用包含蒎烯/Montanov^TM 82的乳液，使用简单的Montanov^TM 82溶液。

用蒸馏水稀释440mL的CNC悬浮液#1(2.16重量％)至550mL。将10ml的丝心蛋白溶液#1(1.99重量％)倒入上述悬浮液中，并以300rpm搅拌10分钟。

0.02g的MONTANOV^TM 82(SEPPIC)溶解于50ml的蒸馏水中。将MONTANOV^TM82溶液加入上述混合物中，并在喷雾干燥前以300rpm搅拌3分钟。喷雾干燥机参数设定如下：入口温度185C，出口温度：85C，喷嘴压力1.50bar，压力差180mmWc，喷嘴空气帽70。该过程产生干燥的自由流动的白色粉末。

当加入水中时，粉末与水充分混合，表明微粒是亲水的。

实施例8-丝胶/纤维素微粒

本实施例表明丝胶蛋白可以引入到纤维素微珠中。

将0.0051g的丝胶溶解于蒸馏水(2.3mL)中，使用磁力搅拌棒以500rpm搅拌，直至看不到粉末并且所有粉末似乎都溶解。通过孔径为0.2μm的注射过滤器过滤溶液，并将溶液加入到17mL搅拌的CNC悬浮液#1(3重量％)中。在搅拌的同时，以50％的振幅对所得的混合物超声(

Vibra-Cell)5分钟。在

B191喷雾干燥器上喷雾干燥悬浮液，入口温度为175℃，吸气器为70％，泵速为30％，空气流量为600Nl/h。该产品是一种含有1重量％的丝胶的自由流动的白色粉末。

下表表明，可以获得其他范围的丝胶/纤维素微粒：

丝胶质量(g)	水体积(mL)	3重量％CNC体积(mL)	最终丝胶含量(重量％)
				0.0024	2	17	0.5
0.0051	2	17	1
				0.051	2	17	10
0.306	2	17	30

与不含丝胶的微粒(例如，如比较例9)相比，含丝胶的微粒具有更好的皮肤感觉，即，他们感觉更柔滑。

比较例9–不含蛋白的纤维素微粒

该实施例表明，当喷雾干燥形成微珠时，根据国际专利公开WO 2016\015148A1的方法，由CNC制备的纤维素微粒产生亲水性的微珠。

更具体地，将没有添加任何蛋白的CNC悬浮液#1(4重量％CNC)喷雾干燥。喷雾干燥器参数设定如下：入口温度165-185℃，泵速30％，吸气器70％，气压600Nl/h。

图2B)示出添加水获得的粉末样品。可以清楚地看到粉末被润湿。这表明微粒是亲水的。

图3B)示出混合上述油包水乳液所获得的粉末。观察到聚集体，表明微粒是亲水的。

比较例10–不含蛋白的亲水性多孔纤维素微粒

本实施例表明，当通过纳米乳液方法制备时，没有添加蛋白的多孔纤维素微珠是亲水的。

首先，如国际专利公开号WO 2016\015148A1所述，制备羧酸钠纳米晶纤维素(cCNC)。羧酸钠纳米晶纤维素(cCNC)的浓缩原液悬浮液通过30％的过氧化氢水溶液与溶解浆反应而制备，其由4％的CNC蒸馏水溶液。

用蒸馏水稀释该原液悬浮液。然后用蒸馏水稀释20重量％的PDDA(Mw＝400,000-500,000)溶液，以制备2重量％的溶液，即，制备聚(二烯丙基二甲基氯化铵)溶液。将4％的羧酸钠CNC悬浮液稀释至1重量％。然后，以14％的固体质量比(PDDA/cCNC)，将2重量％的PDDA溶液加入到CNC的羧酸盐(cCNC)悬浮液中。在使用振幅为60％、流动池压力为20-25psi、搅拌速率为1000rpm的流动池进行超声之前，以1000rpm搅拌混合物3分钟。得到的阳离子cCNC+悬浮液通过渗滤(渗滤单元(Spectrum Labs，KrosFlo TFF System))纯化。

为了制备纳米乳液，将52.5mL的PEG-25氢化蓖麻油(Croduret^TM 25)、52.5mL的Tween 80(聚山梨酯80-Lotioncrafter)以及140mL的苯甲酸烷基酯(C12-C15苯甲酸烷基酯，Lotioncrafter EsterAB)倒入3.5L的玻璃烧杯。向混合物中加入蒸馏水，使最终体积为3.5L。将混合物以700rpm的速度搅拌20分钟(VMI Rayneri Turbotest混合器)。然后以60％的振幅(Sonics Vibra Cell)对混合物超声1.0小时，在水浴中冷却以制备纳米乳液。超声后，通过动态光散射(NanoBrook 90Plus，Brookhaven Instruments)测得纳米乳液的尺寸为45-50nm。

然后由上述原液悬浮液制备0.84重量％的cCNC+以及4.53重量％的CNC悬浮液。将2.8L的纳米乳液加入3.9L的cCNC+(0.84重量％)悬浮液，以400rpm混合。5分钟后，加入1.4L的cCNC(4.53重量％)悬浮液，再搅拌5分钟，然后喷雾干燥(参数：入口温度185C，出口温度：85C，进料冲程28％，喷嘴压力1.50bar，压力差180mmWc，喷嘴空气帽70)。

该过程产生干燥的自由流动的白色粉末。

该样品是亲水的，吸水率为236mL/100g粉末。蓖麻油吸收率为252mL/100g粉末。

权利要求的范围不应受到实施例中阐述的优选实施例的限制，而应给出与整个说明书一致的最宽泛的解释。

参考文献

本说明书参考很多文件，其内容整体援引加入本文。这些文件包括但不限于以下：

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Claims (25)

1.一种蛋白质纤维素微粒，其包含

纤维素纳米晶体以及一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物，其中

所述纳米晶体与所述肽和/或所述蛋白聚集在一起以形成所述微粒。

2.权利要求1的微粒，其中

所述微粒的直径为约1μm-约100μm。

3.权利要求1或2的微粒，其中

所述微粒的尺寸分布(D₁₀/D₉₀)为：以体积计约5/15μm-约5/25μm。

4.权利要求1-3中任一项的微粒，其中

所述微粒为大致的球形或半球形。

5.权利要求1-4中任一项的微粒，其中

所述纤维素纳米晶体的长度为约50nm-约500nm，并且

宽度为约2-约20nm。

6.权利要求1-5中任一项的微粒，其中

所述纤维素纳米晶体的结晶度为至少约50％。

7.权利要求1-6中任一项的微粒，其中

所述纤维素纳米晶体是硫酸化纤维素纳米晶体及其盐，羧基化纤维素纳米晶体及其盐，以及他们的其衍生物，例如表面还原的羧基化纤维素纳米晶体及其盐，以及用其他官能团化学改性的纤维素纳米晶体，或其组合。

8.权利要求1-7中任一项的微粒，其中

所述纤维素纳米晶体是羧基化纤维素纳米晶体及其盐，

优选为羧基化纤维素纳米晶体或纤维素羧酸钠盐，并且

更优选为羧基化纤维素纳米晶体。

9.权利要求1-8中任一项的微粒，其中

所述肽和所述蛋白是水溶性的。

10.权利要求1-9中任一项的微粒，其中

本发明的微粒包含一种或多种蛋白。

11.权利要求1-10中任一项的微粒，其中

所述微粒包含丝素蛋白、丝胶蛋白或明胶，

优选丝胶蛋白或丝素蛋白，并且

更优选丝素蛋白。

12.权利要求11的微粒，其包含丝素蛋白。

13.权利要求1-12中任一项的微粒，其为疏水性的以及亲脂性的。

14.权利要求1-13中任一项的微粒，其中，基于微粒重量，

所述微粒包含一种或多种肽和/或一种或多种蛋白，多肽和蛋白的总浓度为约0.1重量％-约50重量％，

优选约0.5重量％-约20重量％，并且

更优选约1重量％-约20重量％。

15.权利要求1-14中任一项的微粒，其中

所述微粒是多孔的，并且所述纳米晶体与所述肽和/或蛋白围绕所述微粒中的空腔配置，从而在所述微粒中限定孔。

16.权利要求1-15中任一项的微粒，其中

所述微粒中的孔的尺寸为约10nm至约2000nm，

优选地，尺寸为约50-约100nm。

17.权利要求1-16中任一项的微粒，其中

所述微粒还包含一种或多种功能性分子，其为皮肤带来额外的益处，例如抗紫外线和蓝光的保护、抗氧化性、抗衰老性、保湿作用或颜色。

18.权利要求1-17中任一项的微粒，其中

所述纤维素纳米晶体用聚电解质层和染料涂覆。

19.一种化妆品制品，其包含权利要求1-18中任一项的微粒。

20.权利要求19的化妆品制品，其包含油包水乳液或亲脂性介质。

21.一种制备权利要求1-18中任一项的微粒的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供纤维素纳米晶体的悬浮液以及一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物的溶液；

b)将所述悬浮液与所述溶液混合以制备混合物；并且

c)喷雾干燥所述混合物以制备所述微粒。

22.权利要求21的方法，其中，基于溶液的总重量，

所述溶液包含一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物，浓度为约0.01重量％-约50重量％。

23.权利要求21或22的方法，还包括用醇洗涤微粒的步骤。

24.权利要求21-23中任一项的方法，其中：

在步骤b)之后，将功能性分子溶于或悬浮于步骤b)的混合物中；

在步骤a)中，将功能性分子溶于或悬浮于纤维素纳米晶体的悬浮液中；或者

在步骤a)中，将功能性分子溶于或悬浮于一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物的溶液中。

25.一种制备权利要求1-16中任一项所述的微粒的方法，所述微粒为多孔的，所述方法包括以下步骤：

a)提供：

·纤维素纳米晶体的悬浮液，

·一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物的溶液，以及

·致孔剂的乳液，

其中所述一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物的溶液是所述乳液的一部分或单独存在；

b)将所述悬浮液与所述溶液和所述乳液混合以制备包含连续液相的混合物，其中：

·致孔剂的液滴是分散的，

·纤维素纳米晶体是悬浮的，并且

·一种或多种肽、一种或多种蛋白，或其混合物是溶解的；

c)喷雾干燥所述混合物以制备所述微粒；并且

d)如果在喷雾干燥过程中，致孔剂没有充分蒸发以在微粒中形成孔，则蒸发所述致孔剂或将所述致孔剂从微粒中浸出。

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