JP2022531777A - 癌の診断および治療用dnaコンストラクト - Google Patents
癌の診断および治療用dnaコンストラクト Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022531777A JP2022531777A JP2021565714A JP2021565714A JP2022531777A JP 2022531777 A JP2022531777 A JP 2022531777A JP 2021565714 A JP2021565714 A JP 2021565714A JP 2021565714 A JP2021565714 A JP 2021565714A JP 2022531777 A JP2022531777 A JP 2022531777A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cancer
- protein
- promoter
- dna construct
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 142
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 106
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title abstract description 17
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 206
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 141
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 62
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 31
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims abstract description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 35
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 35
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 29
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 29
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 claims description 29
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 claims description 29
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 claims description 29
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 22
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 13
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 11
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 10
- -1 Debouganin Proteins 0.000 claims description 10
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 10
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 9
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 8
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 8
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 7
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 7
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 claims description 7
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 claims description 7
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 7
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 claims description 7
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 7
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 7
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 6
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims description 6
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 6
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 6
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 claims description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 5
- 102100038152 RNA-binding protein 5 Human genes 0.000 claims description 5
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 5
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 5
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 102000015554 Dopamine receptor Human genes 0.000 claims description 4
- 108050004812 Dopamine receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 206010061825 Duodenal neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 101710133259 RNA-binding protein 5 Proteins 0.000 claims description 4
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010054184 Small intestine carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 4
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000006593 Urologic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 4
- 201000009036 biliary tract cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020790 biliary tract neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000000312 duodenum cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 238000009206 nuclear medicine Methods 0.000 claims description 4
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 230000003584 silencer Effects 0.000 claims description 4
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 3
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 claims description 3
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims description 3
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 3
- 102000004459 Nitroreductase Human genes 0.000 claims description 3
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 claims description 3
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 108050001286 Somatostatin Receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000011096 Somatostatin receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 claims description 3
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 3
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 claims description 3
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 3
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 108020001162 nitroreductase Proteins 0.000 claims description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 claims description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 claims description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 claims description 2
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 claims description 2
- 102100031162 Collagen alpha-1(XVIII) chain Human genes 0.000 claims description 2
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 claims description 2
- 101150089023 FASLG gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108700004714 Gelonium multiflorum GEL Proteins 0.000 claims description 2
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 108091006975 Iron transporters Proteins 0.000 claims description 2
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 claims description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims description 2
- 101710101148 Probable 6-oxopurine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 claims description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 2
- 102000030764 Purine-nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 claims description 2
- 108050002653 Retinoblastoma protein Proteins 0.000 claims description 2
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010084592 Saporins Proteins 0.000 claims description 2
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010071930 chromate reductase Proteins 0.000 claims description 2
- 208000029664 classic familial adenomatous polyposis Diseases 0.000 claims description 2
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 2
- 108010046015 ferritin receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000009562 momordin Substances 0.000 claims description 2
- 229940083599 sodium iodide Drugs 0.000 claims description 2
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000225 tumor suppressor protein Substances 0.000 claims description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 claims 4
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 claims 4
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims 2
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims 2
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims 2
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims 2
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 claims 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims 2
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 claims 2
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 claims 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 claims 2
- XUHRVZXFBWDCFB-QRTDKPMLSA-N (3R)-4-[[(3S,6S,9S,12R,15S,18R,21R,24R,27R,28R)-12-(3-amino-3-oxopropyl)-6-[(2S)-butan-2-yl]-3-(2-carboxyethyl)-18-(hydroxymethyl)-28-methyl-9,15,21,24-tetrakis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20,23,26-nonaoxo-1-oxa-4,7,10,13,16,19,22,25-octazacyclooctacos-27-yl]amino]-3-[[(2R)-2-[[(3S)-3-hydroxydecanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CCCCCCC[C@H](O)CC(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]1[C@@H](C)OC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CO)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC1=O)[C@@H](C)CC XUHRVZXFBWDCFB-QRTDKPMLSA-N 0.000 claims 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 claims 1
- 102000030431 Asparaginyl endopeptidase Human genes 0.000 claims 1
- 108010009392 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p16 Proteins 0.000 claims 1
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 claims 1
- 101710152377 L-asparaginase Proteins 0.000 claims 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims 1
- 101710129862 Probable L-asparaginase Proteins 0.000 claims 1
- 102100024547 Tensin-1 Human genes 0.000 claims 1
- 108010088950 Tensins Proteins 0.000 claims 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 claims 1
- 108010055066 asparaginylendopeptidase Proteins 0.000 claims 1
- 108010062699 gamma-Glutamyl Hydrolase Proteins 0.000 claims 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 abstract description 16
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 abstract 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 60
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 44
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 40
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 17
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- 230000034994 death Effects 0.000 description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 108020004422 Riboswitch Proteins 0.000 description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 5
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 5
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 4
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 4
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 108090000951 RNA polymerase sigma 70 Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108091005941 EBFP Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150040872 aroE gene Proteins 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 206010006007 bone sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 2
- CDVZCUKHEYPEQS-AZIZVCISSA-N (2r,3s,4s)-2,3,4,5-tetrahydroxypentanal Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O CDVZCUKHEYPEQS-AZIZVCISSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 101100163490 Alkalihalobacillus halodurans (strain ATCC BAA-125 / DSM 18197 / FERM 7344 / JCM 9153 / C-125) aroA1 gene Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101001073212 Arabidopsis thaliana Peroxidase 33 Proteins 0.000 description 1
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 1
- 101100099097 Aspergillus terreus (strain NIH 2624 / FGSC A1156) terR gene Proteins 0.000 description 1
- 101100002068 Bacillus subtilis (strain 168) araR gene Proteins 0.000 description 1
- 101100216993 Bacillus subtilis (strain 168) aroD gene Proteins 0.000 description 1
- 101100290087 Bacillus subtilis (strain 168) yvyI gene Proteins 0.000 description 1
- 101100011678 Bacteroides fragilis (strain YCH46) eno gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 description 1
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100028990 C-X-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 101100075747 Drosophila melanogaster Lztr1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100001013 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aah1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 101100070607 Haemophilus ducreyi (strain 35000HP / ATCC 700724) hgbA gene Proteins 0.000 description 1
- 101000916050 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001123325 Homo sapiens Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-beta Proteins 0.000 description 1
- 101000743272 Homo sapiens RNA-binding protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 101100346221 Mus musculus Mpi gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101001087092 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) Phosphate-binding protein PstS 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010079855 Peptide Aptamers Proteins 0.000 description 1
- 102100028961 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-beta Human genes 0.000 description 1
- 241000435574 Popa Species 0.000 description 1
- 101100108623 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) algA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 241001468001 Salmonella virus SP6 Species 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000035868 Vascular inflammations Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVBXXVAFSPEIJQ-CVIPOMFBSA-N [(2r)-3-[[(2r)-1-[[(2s,5r,8r,11r,12s,15s,18s,21s)-15-[3-(diaminomethylideneamino)propyl]-21-hydroxy-5-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-4,11-dimethyl-2-(2-methylpropyl)-3,6,9,13,16,22-hexaoxo-8-propan-2-yl-10-oxa-1,4,7,14,17-pentazabicyclo[16.3.1]docosan-12-yl]am Chemical compound C([C@@H]1C(=O)N[C@@H](C(=O)O[C@H](C)[C@@H](C(N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@H]2CC[C@H](O)N(C2=O)[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1C)=O)NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](O)COS(O)(=O)=O)CC(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 VVBXXVAFSPEIJQ-CVIPOMFBSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUFLLCUFNHESEH-UHFFFAOYSA-N [5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-4-hydroxy-2-[[hydroxy(phosphonooxy)phosphoryl]oxymethyl]oxolan-3-yl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C1O BUFLLCUFNHESEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002744 anti-aggregatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 101150044616 araC gene Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150042732 aroC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150102858 aroD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150108612 aroQ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001465 calcium Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N chromate(2-) Chemical compound [O-][Cr]([O-])(=O)=O ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150036359 clpB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150074451 clpP gene Proteins 0.000 description 1
- 101150043719 clpP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150102296 clpP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150096566 clpX gene Proteins 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 101150019250 dksA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010429 evolutionary process Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 101150002054 galE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150041954 galU gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 101150117187 glmS gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 101150096208 gtaB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 101150112623 hemA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 101150059304 hup gene Proteins 0.000 description 1
- 101150043071 hupA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150081485 hypA gene Proteins 0.000 description 1
- 229940124644 immune regulator Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007919 intrasynovial administration Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 101150026430 manA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 101150052523 nadA gene Proteins 0.000 description 1
- MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N nebularine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 101150110245 ompC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073640 ompF gene Proteins 0.000 description 1
- 101150091444 ompR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 101150028857 phoP gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 101150082349 pmi gene Proteins 0.000 description 1
- 101150087106 pncB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 101150033672 rfaY gene Proteins 0.000 description 1
- 101150012103 rfc gene Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091069025 single-strand RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000007940 sugar coated tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000011521 systemic chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 230000004222 uncontrolled growth Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 101150075472 ycf27 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
- C12N2830/003—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor tet inducible
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、DNAコンストラクトおよび前記DNAコンストラクトを含む組換えベクターが導入された菌株に関し、本発明によるDNAコンストラクトは、宿主菌株または細胞内で第1プロモーターと第2プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子の発現レベルが均衡をなすようにして、癌の治療と診断を同時に行うことができる。また、本発明の前記DNAコンストラクトは、ドキシサイクリンが不在の場合、前記抗癌タンパク質およびレポータータンパク質を全く発現させることができないため、ドキシサイクリンの処理の有無を調節することにより、適切な癌治療のための用量で抗癌タンパク質を発現させると同時に、レポータータンパク質の発現レベルによって癌の大きさをリアルタイムにモニタリングすることができる。【選択図】図1
Description
本発明は、癌の診断および治療用DNAコンストラクトおよび前記DNAコンストラクトを含む組換えベクターが導入された菌株に関する。
今のところ、大部分の癌は外科的手術、放射線治療および化学療法に相当するそれぞれの個別的方法またはこれらの組み合わせによって治療されているのが現状である。癌組織を大部分除去する外科的手術は、特定部位、例えば、乳房、結腸および皮膚に位置した癌組織を除去するには非常に効果的であり得るが、脊椎のような一部区域にある癌組織を治療するには使用が困難である。また、乳癌、肺癌および精巣癌によく使用される全身性化学療法の場合、正常細胞の複製または代謝過程を崩壊させる副作用が誘発されることがあり、患者から発生する化学療法に使用される治療剤への耐性が発生しかねない。
一方、個体で癌が発生する時、血管形成と細胞成長が体内で非常に速い速度で進行するため、癌組織の内部は血管形成が不完全で酸素の欠乏した環境が作られて、サルモネラ属菌株または大腸菌のような嫌気性バクテリアが増殖するのに非常に適合しうる。これにより、現在サルモネラ(Salmonella)属菌株とクロストリジウム(Clostridium)属菌株のような癌を標的できるバクテリアを用いた癌治療は、固形腫瘍を標的にし、腫瘍内で増殖できる特定バクテリアの機能に依存するが、腫瘍溶解タンパク質またはレポータータンパク質を前記バクテリアに導入し、このように形質転換されたバクテリアを個体に投与する場合、癌組織を特異的に確認するか、正常細胞に対して毒性を示す副作用を最小化して癌を治療することができる。
自然界に存在する多様なバクテリア病原体から分泌される毒素によって人間に疾病が誘発される。このように疾病が誘発できるようにする多様なバクテリア病原体のうち、我々の食生活と密接な関係があるサルモネラエンテリカ(Salmonella enterica)などはヒトを含む霊長類の腸管内に生息する腸内細菌科として知られており、外毒素として知られたサイトリシン(cytolysin)を分泌する。このように分泌されるサイトリシンは、約34kDaの分子量を有する細胞毒性タンパク質であって、ヒトを含む霊長類の腸内で赤血球を破壊する溶血作用および正常細胞の膜に気孔を形成させて細胞の溶解を誘発させて深刻な血管炎症と局所組織の壊死によって死亡にまで至らせることが知られている。しかし、最近の研究結果では、サルモネラエンテリカから分離および精製されたサイトリシンが体内腸管に存在する癌組織に特異的に反応して癌組織の死滅を誘導し、次世代抗癌治療剤として注目されている。したがって、細胞毒性物質であるサイトリシンを分泌する遺伝子が形質転換されたバクテリアは、癌組織標的用抗癌治療剤としての活用の可能性が非常に高い。
このようにバクテリアを用いた癌の診断または治療が可能であるにもかかわらず、診断および治療に適したタンパク質が癌組織で特異的に発現できるようにする発現ベクターに関する研究はほとんどなされているのが現状である。バクテリアが生体内に注入された後は、最初の3日間、肝および脾臓のような網状内皮系で掃除(Clearance)が行われ、以後一定期間の後に癌組織で急増するので、安定性の面から一定期間経過後に治療タンパク質が発現できるようにすることが要求される。そこで、治療タンパク質の発現のために誘導性プロモーター(Inducible promoter)の使用が薦められるが、現在実験段階で用いられるPBADプロモーターのような誘導性プロモーターは、人体使用が許容されないL-アラビノース(L-arabinose)が誘導物質として使用されなければならないため、臨床適用のハードルが高い。人体使用が許容された抗生剤であるドキシサイクリン(Doxycycline)を使用するPtetプロモーターは、相対的に臨床的に使用が容易であり、TetAプロモーターとTetRプロモーターを用いて2つの遺伝子の双方向転写が可能であるという利点があるが、TetAプロモーターとTetRプロモーターとの間のタンパク質の発現率が100:1以上の差を示し、この部分の均衡を合わせてこそ活用度を高められる。このように臨床適用が可能な形態の発現システムを有し、タンパク質の発現レベルが均衡をなし得るように形質転換されたバクテリアに対する新たな技術の開発が必要なのが現状である。
本発明の一つの目的は、DNAコンストラクトを提供することである。
本発明の他の目的は、前記DNAコンストラクトを含む組換えベクターを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記組換えベクターが導入された菌株;およびこれを含む癌の診断用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記菌株を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記菌株を処理するステップを含む癌の診断のための情報提供方法を提供することである。
しかし、本発明がなそうとする技術的課題は以上に述べた課題に制限されず、述べていないさらに他の課題は以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
本発明の一実施形態では、DNAコンストラクトを提供する。
本発明の前記DNAコンストラクトは、調節タンパク質を暗号化する遺伝子;および前記調節タンパク質によって誘導される第1プロモーターおよび第2プロモーターを含む。
本発明の前記第1プロモーターおよび第2プロモーターの下流に抗癌タンパク質を暗号化する遺伝子;サイトカイン(Cytokine)を暗号化する遺伝子;ケモカイン(Chemokine)を暗号化する遺伝子;免疫調節子(Immune modulator)を暗号化する遺伝子;癌抗原に特異的なオリゴヌクレオチド;およびレポータータンパク質を暗号化する遺伝子からなる群より選択されるいずれか1つが作動可能に連結される。
本発明の前記第1プロモーターおよび第2プロモーターは、別のプロモーターによって発現する一つの調節タンパク質によって同時に誘導できるため、第2プロモーターの下流に調節タンパク質を暗号化する遺伝子が作動可能に連結された場合と比較して、宿主細胞;または宿主細胞内で第1プロモーターおよび第2プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子によって暗号化されるタンパク質間の発現レベルが均衡をなすことができる。このように本発明によるDNAコンストラクトを用いる場合には、診断と治療が同時に行われる。
本発明の前記「DNAコンストラクト」は、宿主菌株または細胞に形質転換により導入される場合、目的とするタンパク質などが発現できるようにする構造体であって、目的とするタンパク質を暗号化する遺伝子だけでなく、前記遺伝子が発現できるように作動可能に連結された必須な調節要素であるプロモーターに相当する塩基配列などを含むことを意味する。
本発明の前記「プロモーター」とは、宿主菌株または細胞で作動可能に連結された遺伝子の上流領域に存在する塩基配列であって、転写が開始されるようにするためにRNAポリメラーゼ(RNA Polymerase)が結合できる前記DNAコンストラクトの特定部位の塩基配列を意味する。
本発明の前記調節タンパク質の発現の調節は、シス-作用因子(cis-acting element、Cis-regulatory elements;CRE)またはトランス-作用因子(trans-acting element、Trans-regulatory elements;TRE)によることができる。
本発明において、前記「調節」乃至「発現調節」は、特定遺伝子の転写および翻訳が活性化または抑制されることを意味することができる。
本発明の前記シス-作用因子は、隣接遺伝子の転写を調節する非-コーディングDNAの領域で、遺伝子調節ネットワークの必須構成要素であり、遺伝子発現を制御する。前記シス-作用因子は、リボソーム結合部位(ribosome binding site;RBS)、5’-非翻訳領域(5’-Untranslated Region;5’-UTR)、転写因子結合部位(transcription factor binding site)および終結子(terminators)からなる群より選択される少なくとも1つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記リボソーム結合部位(ribosome binding site;RBS)は、シャイン・ダルガノ配列(Shine-Dalgarno sequence;SD sequence)ともいい、DNAに組み込まれている遺伝情報がメッセンジャーRNA(mRNA)に転写された後、翻訳(translation)が起こるためには、このmRNAにリボソーム(ribosome)が結合しなければならないが、この時、リボソームが効果的に結合できるようにmRNA上に存在する短い配列を意味する。
本発明において、前記5’-非翻訳領域(5’-Untranslated Region;5’-UTR)は、5’領域でmRNAのアミノ酸に翻訳される部分であるコーディング部分(coding region)の両側に位置する翻訳がされない部分で、進化過程で不要と捨てられる部分(junk)と考えられていたが、遺伝子発現の調節に大きな役割を果たすことが知られている。
本発明において、前記転写因子結合部位(transcription factor binding site)は、近傍の特定遺伝子をオンオフする役割を果たすDNA部位である。前記転写因子結合部位は、前記調節タンパク質を暗号化する遺伝子のプロモーター、エンハンサー(enhancer)およびサイレンサー(silencer)からなる群より選択される少なくとも1つであってもよいが、これに限定されない。
本発明の前記調節タンパク質を暗号化する遺伝子のプロモーターは、大部分の宿主菌株または細胞の環境条件および発達状態などで活性誘導できるプロモーターであればすべて含まれてもよく、好ましくは、弱いプロモーター(Weak promoter)であってもよい。
本発明の前記「弱いプロモーター」とは、下流に作動可能に連結された遺伝子から転写された転写体(Transcript)の発現レベルが1×10-2以下、好ましくは1×10-3以下に発現するように誘導するプロモーターであって、このように転写体の発現レベルを1×10-3以下に発現させるプロモーターであればすべて含まれてもよく、例えば、E.coli σ70プロモーター;E.coli σSプロモーター;E.coli σ32プロモーター;B.subtilis σAプロモーター;B.subtilis σBプロモーター;サルモネラ由来プロモーターであるK112706またはK112707;バクテリオファージT7プロモーター;バクテリオファージSP6プロモーター;酵母(yeast)由来プロモーター;真核細胞由来プロモーターであるI712004またはK076017;OXB1プロモーターおよび植物由来プロモーターから構成された群より選択される少なくとも1つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記E.coli σ70プロモーターは、I14018、I14033、I14034、I732021、I742126、J01006、J23103、J23109、J23112、J23113、J23117、J23119、J23150、J23151、J44002、J48104、J56015、J64951、K088007、K119000、K119001、K1330002、K137029、K137030、K137031、K137032、K137085、K137086、K137087、K137088、K137089、K137090、K137091、K1585100、K1585101、K1585102、K1585103、K1585104、K1585105、K1585106、K1585110、K1585113、K1585115、K1585116、K1585117、K1585118、K1585119、K2486171、K256002、K256018、K256020、K256033、K292000、K823007、K823010、K823013、M13101、M13102、M13103、M13104、M13105、M13106、M13108、M13110、M31519、R1074、R1075およびS03331から構成された群より選択される少なくとも1つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記E.coli σSプロモーターは、J45992またはJ45993であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記E.coli σ32プロモーターは、J45504、K1895002またはK1895003であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記B.subtilis σAプロモーターは、K143012、K143013、K823000、K823002およびK823003から構成された群より選択される少なくとも1つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記B.subtilis σBプロモーターは、K143010、K143011またはK143013であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記バクテリオファージT7プロモーターは、I719005、J34814、J64997、K113010、K113011、K113012、K1614000、R0085、R0180、R0181、R0182、R0183、Z0251、Z0252およびZ0253から構成された群より選択される少なくとも1つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記バクテリオファージSP6プロモーターは、J64998であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記酵母由来プロモーターは、I766557、J63005、K105027、K105028、K105029、K105030、K105031、K122000、K124000、K124002、K319005、M31201、K2365040、K2365036、K2365041、K2365042、K2365032、K2365051、K2365514、K2365515およびK2365516から構成された群より選択される少なくとも1つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記弱いプロモーターは、配列番号16で表されるOXB1プロモーターであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記植物由来プロモーターは、PLPR0203、PLPR0210、PLPR0177、PLPR0193、PLPR0507、PLPR0422、PLPR0228、PLPR0226、PLPR0223、PLPR0040、PLPR0465、PLPR0232、PLPR0205、PLPR0247、PLPR0328、PLPR0525、AtREG383、AtREG415、AtREG416、OsREG438、OsREG443、OsREG501、PpREG186、PpREG194およびPpREG197から構成された群より選択される少なくとも1つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の目的上、前記弱いプロモーターの下流に調節タンパク質を暗号化する遺伝子が作動可能に連結される場合には、前記第1プロモーターまたは第2プロモーターの下流に作動可能に連結された場合と比較して、調節タンパク質を抑制する物質を投与した時にのみ特異的に前記第1および第2プロモーターの下流に存在する遺伝子の転写が起こるように調節することができる。
本発明の前記調節タンパク質を暗号化する遺伝子のプロモーターは、調節タンパク質を暗号化する遺伝子を基準として、-35部位の塩基配列は配列番号8であり、-10部位の塩基配列は配列番号9であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記エンハンサーは、原核および真核生物ともに発見される配列で、一般的に50~1500bpの領域を有し、前記近傍遺伝子の出発地から上流または下流に位置して前記転写因子の結合を誘導する。
本発明の前記サイレンサーは、エンハンサーと同一のメカニズムを維持し、エンハンサーの拮抗作用をする。前記サイレンサーに結合する転写因子は、リプレッサー(repressor)である。前記エンハンサーと前記サイレンサーは、互いに近接した領域に存在するものであるか、同一領域に転写因子が異なる領域のものであってもよい。
本発明の前記終結子(terminators)は、転写終結子(transcription terminator)ともいい、遺伝体で遺伝子またはオペロンの転写の終結を媒介し、原核生物では、Rho-依存的終結子とRho-非依存的終結子とがある。
本発明の前記トランス-作用因子は、トランス活性化因子乃至トランス作用転写因子ともいい、遺伝子の転写をトランスに活性化する因子である。前記トランス-作用因子は、前記転写因子、アプタマー(aptamer)、sRNA、アンチセンスRNA(antisense RNA;asRNA)からなる群より選択される少なくとも1つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記転写因子は、前記転写因子結合部位と結合して特定遺伝子をオンオフするのに役立つタンパク質である。
本発明において、前記アプタマー(aptamer)は、リボスイッチ(riboswitch)の一部分で、特定標的分子に結合できるオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)あるいはペプチド(Peptide)物質の通称で、前記アプタマーは、ペプチドアプタマーまたは核酸アプタマーであってもよい。前記リボスイッチは、遺伝子の発現を調節するmRNAの一種で、glmSリボスイッチ、FMNリボスイッチ、Cobalaminリボスイッチなどがあり得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記sRNA、アンチセンスRNA(antisense RNA;asRNA)は、特定RNAに相補的に結合できる一本鎖RNA(single-stranded RNA)を意味する。特定タンパク質を表現するメッセンジャーRNA(messenger RNA;mRNA)であるsense RNAに相補的に結合して、結局、当該タンパク質の発現を調節する。
本発明の前記第1プロモーターおよび第2プロモーターは、前記調節タンパク質によって誘導される誘導性プロモーターであってもよい。
本発明の前記「誘導性プロモーター」とは、特定の化学的または物理的条件下でのみ特異的に下流に連結された遺伝子が発現できるように転写するプロモーターであって、例えば、IPTG(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside)のようなガラクトースの存在下で発現するLacZ遺伝子のプロモーター、L-アラビノースの存在下でのみ発現するアラビノースオペロンaraBADプロモーター、テトラサイクリンによって発現調節されるtetプロモーターであってもよく、好ましくは、前記第1プロモーターおよび第2プロモーターはtetプロモーターであってもよく、さらに好ましくは、前記第1プロモーターはtetAプロモーター、前記第2プロモーターはtetRプロモーターであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記調節タンパク質を暗号化する遺伝子は、第1プロモーターおよび第2プロモーターに結合してRNAポリメラーゼが結合できないように調節するタンパク質であって、本発明の目的上、前記第1プロモーターおよび第2プロモーターがtetプロモーターの場合、前記tetプロモーターの調節部位に結合してtetプロモーターの活性を抑制できるTetRタンパク質であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「作動可能に連結(Operably linked)」とは、目的とする1つの核酸断片が他の核酸断片と機能的に連結されることにより、目的とする1つの核酸断片の機能または発現が他の核酸断片によって影響を受けることを意味する。
本発明の前記「レポータータンパク質」とは、視覚的に癌が診断できるようにする機能を行うタンパク質であって、例えば、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ(Luciferase)および核医学またはMRI映像撮影に使用されるタンパク質からなる群より選択される少なくとも1つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「蛍光タンパク質」は、癌が視覚的に診断できるように自ら蛍光を呈するタンパク質であって、例えば、緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein;GFP)、変形された緑色蛍光タンパク質(Modified Green Fluorescent Protein;MGFP)、増強された緑色蛍光タンパク質(Enhanced Green Fluorescent Protein;EGFP)、赤色蛍光タンパク質(Red Fluorescent Protein;RFP)、増強された赤色蛍光タンパク質(Enhanced Red Fluorescent Protein;ERFP)、青色蛍光タンパク質(Blue Fluorescent Protein;BFP)、増強された青色蛍光タンパク質(Enhanced Blue Fluorescent Protein;EBFP)、黄色蛍光タンパク質(Yellow Fluorescent Protein;YFP)および増強された黄色蛍光タンパク質(Enhanced Yellow Fluorescent Protein;EYFP)から構成された群より選択される少なくとも1つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記核医学またはMRI映像撮影に使用されるタンパク質は、例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンリン酸酵素(Herpes simplex virus thymidine kinsease) 、ドーパミン受容体(Dopamine receptor)、ソマトスタチン受容体(Somatostatin receptor)、ソジウム-ヨード輸送体(Sodium-iodide transporter)、鉄受容体、トランスフェリン受容体(Transferrin receptor)、フェリチン(Ferritin)および鉄輸送体(magA)からなる群より選択される少なくとも1つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「サイトカイン」とは、免疫細胞が分泌されるタンパク質であって、本発明の前記サイトカインは、宿主免疫反応を調節して、疾患に関連する細胞、例えば、癌細胞の死滅を誘導できる癌免疫療法に使用できるものであればすべて含まれてもよく、好ましくは、IFN-α2、IL-2、IL-15、IL-21およびIL-12であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「ケモカイン」とは、組織間の細胞移動と組織内の細胞の位置および相互作用を調節する役割を果たすものであって、白血球を腫瘍微細環境に誘導して、疾患、例えば、癌に対する宿主反応を仲栽できるものであればすべて含まれてもよく、好ましくは、CXCR3、CCR5などであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「免疫調節子」とは、個体が有している固有の免疫体系を活用して多様な治療を可能にするものであって、免疫細胞を活性化させて、疾患に関連する細胞、例えば、癌細胞の死滅を誘導できるものであればすべて含まれてもよい。
本発明の前記「抗癌タンパク質」とは、癌細胞の死滅を直間接的に誘導できる機能を有するペプチドであって、例えば、毒素タンパク質、癌抗原に特異的な抗体または前記抗体の断片、腫瘍抑制タンパク質(Tumor suppressor protein)、血管新生抑制剤、癌抗原、前駆薬物転換酵素(Prodrug-converting enzymes)および全細胞死滅タンパク質(pro-apoptotic protein)から構成された群より選択される少なくとも1つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「毒素タンパク質」とは、癌細胞の死滅を直間接的に誘導できる機能を有するタンパク質であって、例えば、リシン(Ricin)、サポリン(Saporin)、ゲロニン(Gelonin)、モモルジン(Momordin)、デブーガニン(Debouganin)、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素(Pseudomonas toxin)、ヘモリシン(HlyA)、FASリガンド(FAS ligand;FASL)、腫瘍壊死因子-α(Tumour necrosis factor-α;TNF-α)、TNF-関連細胞死滅-誘発リガンド(TNF-related apoptosis-inducing ligand;TRAIL)およびサイトリシンA(Cytolysin A、ClyA)からなる群より選択される少なくとも1つであってもよく、さらに好ましくは、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるサイトリシンAであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「腫瘍抑制タンパク質」とは、正常細胞に存在しながら機能を維持するが、その機能が失われた場合には、正常細胞が無分別な細胞の分裂および成長が誘導されて癌細胞に転換されるようにする機能をする遺伝子であって、例えば、RB(Retinoblastoma protein)タンパク質、p53タンパク質、APC(Adenomatous polyposis coli)タンパク質、PTEN(Phosphatase and tensin homologue)タンパク質、CDKN2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A)タンパク質などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の前記癌抗原に特異的な抗体または前記抗体の断片は、癌細胞の表面または細胞質に特異的に発現レベルの高いタンパク質である抗原に特異的に結合できる抗体であって、例えば、乳癌または胃癌細胞に特異的に発現レベルの高いHER2などに特異的な抗体といったものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記抗体は、タンパク質またはペプチド分子の抗原性部位に特異的に結合できるタンパク質分子を意味する。前記抗体の形態は特に限定されず、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体または抗原結合性を有するものであれば、抗体の一部の場合でも含まれてよく、すべての種類の免疫グロブリン抗体が含まれてもよい。また、ヒト化抗体などの特殊抗体が含まれてもよく、前記抗体は、2個の全長の軽鎖および2個の全長の重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fvなどになってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の前記「抗体」とは、本発明の前記癌抗原を暗号化する遺伝子を通常の方法により発現ベクターにクローニングして前記遺伝子によって暗号化されるタンパク質を得た後に、通常の方法により製造できる。
本発明の前記「血管新生抑制剤」とは、癌細胞の周辺で新しい血管が生成されることを抑制して癌細胞の死滅を直接または間接的に誘導できる機能を有するタンパク質または化合物を意味する。好ましくは、前記血管新生抑制剤は、アンギオスタチン(angiostatin)、エンドスタチン(endostatin)、トロンボスポンジン(Thrombospondin)、および蛋白分解酵素抑制タンパク質などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の前記「癌抗原」とは、癌細胞では発現するものの、正常細胞ではほとんど発現しないタンパク質を抗原とし、これを通して抗腫瘍免疫反応を誘導することで癌細胞の直接または間接的死滅を誘導できるタンパク質を意味する。本発明の前記癌抗原は、好ましくは、アルファ-フェトプロテイン(α-fetoprotein;AFP)、血管内皮成長因子受容体2(Vascular endothelial growth factor receptor2;VEGFR2)、サバイビン(Survivin)、レグマイン(Legumain)、前立腺癌特異的抗原(Prostate cancer specific antigen;PCSA)などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の前記「前駆薬物転換酵素」とは、不活性薬物を酵素反応による代謝を通して活性薬物に転換されるようにする機能を有するタンパク質であって、このような前駆薬物転換酵素を用いる場合、不活性薬物が代謝されて癌細胞の死滅を直接または間接的に誘導できる活性薬物に転換されるようにして、癌の予防または治療に非常に有用に使用可能である。本発明の前記前駆薬物転換酵素は、好ましくは、チミジンキナーゼ(Thymidine kinase)、シトシンデアミナーゼ(cytosine deaminase)、ニトロレダクターゼ(nitroreductase)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(purine nucleoside phosphorylase)、カルボキシペプチダーゼG2(carboxypeptidase G2)、クロメートレダクターゼYieF(chromate reductase YieF)、ヘルペスシンプレックスウイルスI型チミジンキナーゼ/ガンシクロビル(herpes simplex virus type I thymidine kinase/ganciclovir;HSV1-TK/GCV)、β-グルクロニダーゼ(β-glucuronidase)などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の前記「全細胞死滅タンパク質」とは、癌細胞が成長または維持されるのに必須な因子(タンパク質、営養分、オリゴヌクレオチドなど)を欠乏させることで、癌細胞の直接または間接的な死滅を誘導するタンパク質を意味する。本発明の前記全細胞死滅タンパク質は、好ましくは、L-アスナーゼ(L-ASNase)、RNA-結合モチーフタンパク質5(RNA-binding motif protein5;RBM5)などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の前記癌抗原に特異的なオリゴヌクレオチドは、癌抗原の遺伝子またはmRNAに相補的に結合することで癌抗原の発現またはその機能を抑制できるヌクレオチドであって、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー(aptamer)、siRNAおよびshRNAから構成された群より選択されるいずれか1つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、特定mRNAの配列に相補的な核酸配列を含んでいるDNA、RNAまたはこれらの誘導体を意味するものであって、mRNA内の相補的な配列に結合してmRNAのタンパク質への翻訳を阻害することができる。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、RNAポリメラーゼIなどを用いる通常の方法を利用して試験管内で合成した後、生体内に投与するか、または、認識部位(MCS)の起源が反対方向にあるベクターを使用する方法などにより生体内で合成されるようにしてもよい。
本発明の前記「アプタマー」とは、高い親和性でターゲット物質を特異的に認知できる小さい一本鎖オリゴ核酸を意味する。本発明の目的上、前記ターゲット物質は、癌抗原の遺伝子またはmRNAであってもよい。
本発明の前記「siRNA」とは、特定mRNAの切断(cleavage)によりRNA干渉(RNA interference;RNAi)現象を誘導できる短い二本鎖RNAを意味する。標的遺伝子のmRNAと相同な配列を有するセンスRNA鎖とこれと相補的な配列を有するアンチセンスRNA鎖とから構成され、本発明の目的上、前記siRNAは、癌抗原を暗号化する遺伝子から転写されたmRNAに特異的に結合して、このような遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。
本発明の前記「shRNA」とは、短ヘアピンRNA(short hairpin RNA)であって、siRNAに比べて細胞形質感染率が高く、RNA干渉が長期間維持できるというメリットが存在し、RNA重合酵素IIIのプロモーターからアデノウイルス、レンチウイルスおよびプラスミド発現ベクターシステムなどを細胞内に形質転換した後、発現させる過程によりRNA干渉を誘導することができるが、これに限定されるものではない。本発明の目的上、前記shRNAは、癌抗原を暗号化する遺伝子から転写されたmRNAに特異的に結合して、このような遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。
本発明の他の実施形態では、本発明の前記DNAコンストラクトを含む組換えベクターを提供する。
本発明の前記組換えベクターは、本発明の前記DNAコンストラクトを含み、調節タンパク質が別のプロモーターによって発現することにより、調節タンパク質を抑制する物質が外部から投与される時にのみ特異的に第1プロモーターおよび第2プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子が均衡的に発現できるようにする。
本発明の前記組換えベクターにおいて、前記DNAコンストラクト、抗癌タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節子、癌抗原に特異的なオリゴヌクレオチド、レポータータンパク質およびプロモーターなどに関する内容は、前記DNAコンストラクトに記載されたものと同一であるので、本明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。
本発明の前記組換えベクターは、細胞内に導入されてタンパク質を発現させるための手段であって、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターなど公知の組換えベクターを使用することができ、前記組換えベクターは、DNA組換え技術を利用した任意の公知の方法により当業者によって容易に製造できる。
本発明において、前記組換えベクターの具体的な例としては、商業的に広く使用されるpCDNAベクター、F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Tiベクター、コスミド、ラムダ、ラムド状(lambdoid)、M13、Mu、p1 P22、Qμ、T-even、T2、T3、T7などのファージ、植物ウイルスからなる群より選択されてもよいが、これに限定されるものではない。本発明の目的上、宿主細胞の性質によって好適な組換えベクターを選択することができる。
本発明のさらに他の実施形態では、本発明の前記DNAコンストラクトを含む組換えベクターが導入された宿主細胞;または菌株を提供する。
本発明の前記宿主細胞としては、哺乳動物、植物、昆虫、菌類または細胞性起源の細胞が含まれ、例えば、大腸菌、ストレプトミセスまたはサルモネラ(Salmonella)属菌株などのバクテリア細胞、酵母細胞、ピキアパストリスなどの菌類細胞;ドロソフィラ、スポドプテラSf9細胞などの昆虫細胞、CHO(チャイニーズハムスター卵巣細胞、Chinese hamster ovary cells)、SP2/0(マウス骨髄腫)、ヒトリンパ芽球(Human lymphoblastoid)、COS、NSO(マウス骨髄腫)、293T細胞、ボウズメラノーマ細胞、HT-1080細胞、BHK細胞(ベビーハムスター腎臓細胞、Baby Hamster Kidney cells)、HEK細胞(ヒト胚腎臓細胞、Human Embryonic Kidney cells)またはPERC.6細胞(ヒト網膜細胞)のような動物細胞、および植物細胞から構成された群より選択される少なくとも1つであってもよいが、これに限定されるものではない。本発明の目的上、前記菌株は、嫌気性菌株、例えば、サルモネラ属菌株、クロストリジウム(Clostridium)属菌株、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属菌株および大腸菌属菌株から構成された群より選択される少なくとも1つであってもよく、好ましくは、サルモネラティフィムリウム(Salmonella typhimurium)、サルモネラコレラスイス(Salmonella choleraesuis)およびサルモネラエンテリティディス(Salmonella enteritidis)から構成された群より選択される少なくとも1つであってもよく、さらに好ましくは、サルモネラティフィムリウムであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記菌株は、弱毒化されたものであってもよい。
本発明の前記「弱毒化」は、微生物を患者に投与する場合、毒性および他の副作用などを減少させることができるように遺伝子などに変形を加えたことを意味する。本発明の目的上、前記菌株がサルモネラ属菌株の場合には、弱毒化のために、aroA、aroC、aroD、aroE、Rpur、htrA、ompR、ompF、ompC、galE、cya、crp、cyp、phoP、phoQ、rfaY、dksA、hupA、sipC、clpB、clpP、clpX、pab、nadA、pncB、pmi、rpsL、hemA、rfc、poxA、galU、cdt、pur、ssa、guaA、guaB、fliD、flgK、flgL、relAおよびspoAから構成された群より選択される少なくとも1つの遺伝子に変形を加えたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記遺伝子に変形を加える方法は、当業界にて公知の多様な遺伝子の欠失または破壊する方法により行われ、例えば、前記欠失および破壊方法は、相同性組換え、化学的変異誘発、照射変異誘発またはトランスポゾン変異誘発などのような方法により行われる。
本発明において、前記菌株は、嫌気性菌株が増殖するのに非常に適した血管形成が不完全で酸素の欠乏した環境である癌組織の内部を標的とするため、このような菌株内にリアルタイムにイメージング可能なレポータータンパク質と抗癌タンパク質が同時に均衡的に発現できる組換えベクターが導入されている場合、癌を非常に効果的に診断および同時に治療することができる。
本発明の前記菌株において、前記DNAコンストラクト、抗癌タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節子、癌抗原に特異的なオリゴヌクレオチド、レポータータンパク質、プロモーターおよび組換えベクターなどに関する内容は、前記DNAコンストラクトおよび組換えベクターに記載されたものと同一であるので、本明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。
本発明の前記組換えベクターは、形質転換(または形質感染)により宿主細胞;または菌株内に導入できるが、本発明で使用される形質転換方法は、任意の形質転換方法が使用可能であり、当業界における通常の方法により容易に行われる。具体的には、通常使用できる前記サルモネラ属菌株のようなバクテリアの形質転換方法、CaCl2沈殿法、CaCl2方法に還元物質であるDMSO(Dimethyl sulfoxide)を使用することで効率を高めたHanahan方法、電気穿孔法(Electroporation)、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を用いた撹拌法、アグロバクテリア媒介形質転換法、PEGを用いた形質転換法、デキストランスルフェート、リポフェクタミンおよび乾燥/抑制媒介形質転換方法などを利用して前記菌株に組換えベクターを導入することができるが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の実施形態では、癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
本発明の前記薬学組成物は、本発明の前記菌株を有効成分として含む。
本発明の前記菌株は、本発明による前記DNAコンストラクトが形質転換されて、個体内で癌を標的とした後に、調節タンパク質を抑制する物質が投与される場合、このような菌株内にリアルタイムにイメージング可能なレポータータンパク質と抗癌タンパク質が同時に均衡的に発現するため、癌を非常に効果的に予防または治療することができ、これと同時に、リアルタイムに癌を診断することができる。
本発明の前記「癌」は、変種細胞の迅速かつ制御されない成長を特徴とする疾病であって、黒色腫、卵管癌、脳癌、小腸癌、食道癌、リンパ腺癌、胆嚢癌、血液癌、甲状腺癌、内分泌腺癌、口腔癌、肝癌、胆道癌、大腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌、十二支腸癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、甲状腺未分化癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、尿管癌、膵臓癌、骨/軟部組織肉腫、皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髓性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髓性白血病および孤立性骨髄腫から構成される群より選択される少なくとも1つであってもよく、好ましくは、肝癌、胆道癌、大腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌、十二支腸癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、甲状腺未分化癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、尿管癌、膵臓癌、骨/軟部組織肉腫および皮膚癌から構成される群より選択される少なくとも1つであってもよく、さらに好ましくは、結腸癌であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「予防」とは、本発明の前記有効成分を用いて癌によって発生した症状を遮断するか、その症状を抑制または遅延させる行為であれば制限なくすべて含まれてもよい。
本発明の前記「治療」とは、本発明の前記有効成分を用いて癌によって発生した症状が好転するか、個体が有利になるすべての行為を意味し、臨床的結果を含む有用な結果または望ましい結果を得るための試みを意味する。有用なまたは望ましい臨床的結果は、検出可能であるか、可能でなくても、1つ以上の症状または状態の緩和または改善、疾病範囲の縮小、疾病状態の安定化、疾病発生の抑制、疾病拡散の抑制、疾病進行の遅延または先延ばし、疾病発病の遅延または先延ばし、疾病状態の改善または軽減、および減退(部分または全体)を含むことができ、必ずしもこれに限定されるものではない。また、「治療」は、治療の不在から予測されること以上に患者の生存が延長されることを意味することができる。さらに、「治療」は、疾病進行の抑制、一時的な疾病進行の先延ばしを意味することができ、さらに好ましくは、疾病の進行を永遠に停止させることと関係がある。当業者によって理解されているように、特定疾病の状態を向上させる間、治療が施された患者から反対の結果、すなわち治療によって影響を受けるすべての利点より大きい結果をもたらしたならば、結果は、有益でなかったり、望ましくないこともある。
本発明の前記薬学組成物において、前記DNAコンストラクト、抗癌タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節子、癌抗原に特異的なオリゴヌクレオチド、レポータータンパク質、プロモーター組換えベクター、菌株および形質転換などに関する内容は、前記DNAコンストラクト、組換えベクターおよび菌株に記載したものと同一であるので、本明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。
本発明の前記薬学組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲料形態であることを特徴とし、前記薬学組成物は、ヒトを対象にすることを特徴とすることができる。
本発明の前記薬学組成物は、これらに限定されるものではないが、それぞれ通常の方法により散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射溶液の形態に剤形化されて使用できる。本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などが使用可能であり、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などが混合されて使用可能であり、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などが使用可能である。本発明の薬学組成物の剤形は、上述のような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造可能である。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル(elixir)、サスペンション、シロップ、ウエハなどの形態に製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。
一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などを追加的に含むことができる。
本発明の前記薬学組成物の投与経路はこれらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髓内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投下が好ましい。
本発明の前記「非経口」とは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学組成物はさらに、直腸投与のための坐剤の形態で投与される。
本発明の前記薬学組成物は、使用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、定式、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症を含む様々な要因によって多様に変化可能であり、前記薬学組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適宜選択可能であり、1日0.0001~50mg/kgまたは0.001~50mg/kgで投与することができる。投与は、1日に1回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するわけではない。本発明による医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化される。
本発明のさらに他の実施形態では、癌の診断用組成物を提供する。
本発明の前記診断用組成物は、本発明による前記菌株を有効成分として含む。
本発明の前記菌株は、本発明による前記DNAコンストラクトが形質転換されて、個体内で癌細胞を標的とした後に、調節タンパク質を抑制する物質が投与される場合、このような菌株内にリアルタイムにイメージング可能なレポータータンパク質と抗癌タンパク質が同時に均衡的に発現するため、癌を非常に効果的に予防または治療することができ、これと同時に、リアルタイムに癌を診断することができる。
本発明の前記「診断」とは、本発明の前記菌株が癌を標的として位置する時、前記菌株に導入されたDNAコンストラクトから発現したレポータータンパク質によってリアルタイムに癌の存在の有無をモニタリングできることを含む生体内癌組織を確認するすべての行為を意味する。
本発明の前記診断用組成物において、前記DNAコンストラクト、抗癌タンパク質、レポータータンパク質、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組換えベクター、サルモネラ属菌株、形質転換、癌などに関する内容は、前記DNAコンストラクト、組換えベクター、菌株および薬学組成物に記載したものと同一であるので、本明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。
本発明のさらに他の実施形態では、癌の診断のための情報を提供する方法を提供する。
本発明の前記方法は、目的とする個体から分離された生物学的試料に、本発明による前記組換えベクターが導入された菌株を処理するステップを含む。
本発明の前記癌の診断のための情報を提供する方法は、前記菌株からレポータータンパク質が発現する場合、癌として診断するステップをさらに含むことができる。
本発明の前記「生物学的試料」とは、個体から得られるか、個体に由来する任意の物質、組織または細胞を意味するもので、例えば、組織、細胞(cell)、または細胞抽出物(cell extract)を含むことができるが、これに限定されるものではない。
本発明の前記診断のための情報提供方法において、前記DNAコンストラクト、抗癌タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節子、癌抗原に特異的なオリゴヌクレオチド、レポータータンパク質、プロモーター、組換えベクター、菌株、形質転換、癌、診断などに関する内容は、前記DNAコンストラクト、組換えベクター、菌株、薬学組成物および診断用組成物に記載したものと同一であるので、本明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。
本発明のさらに他の実施形態では、本発明による前記菌株を薬学的有効量で個体に投与するステップを含む、癌の診断、予防または治療方法に関する。
本発明において、前記「個体」とは、癌の予防または治療が必要な個体であって、霊長類、例えば、ヒトだけでなく、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、イヌ、ネコなどの哺乳動物をすべて含むことができるが、これに限定されるものではない。
本発明によるDNAコンストラクトは、宿主菌株または細胞内で第1プロモーターと第2プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子の発現レベルが均衡をなすようにして、癌の治療と診断を同時に行うことができる。
また、本発明の前記DNAコンストラクトは、ドキシサイクリンが不在の場合、前記抗癌タンパク質およびレポータータンパク質を全く発現させることができないため、ドキシサイクリンの処理の有無を調節することにより、適切な癌治療のための用量で抗癌タンパク質を発現させると同時に、レポータータンパク質の発現レベルによって癌の大きさをリアルタイムにモニタリングすることができる。
本発明の一実施形態では、DNAコンストラクトを提供する。
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨により、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例
[準備例1]ドキシサイクリン(Doxycycline)によって調節可能なDNAコンストラクトの作製
[1-1]OXB1プロモーターを含むDNAコンストラクトの作製
pJL39プラスミド(Mol Ther.、21(11)、p.1985-1995、(2013))を鋳型鎖として(図1)、制限酵素EcoRI部位を含むように作製された正方向プライマー(5’-CGGAATTCACCATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAG-3’;配列番号2)および制限酵素PvuII-XbaI部位を含むように作製された逆方向プライマー(5’-GCTCTAGACAGCTGTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCT-3’;配列番号3)を用いてtetR遺伝子を増幅した。以後、前記増幅産物に制限酵素EcoRIおよびXbaIを入れて切断し、これを精製して、tetR遺伝子増幅産物を得た後に、これをpBAD24(カタログ番号.ATCC○R 87399TM、ATCC、米国)プラスミドに導入する過程によりpBAD-TetRプラスミドを作製した。
[準備例1]ドキシサイクリン(Doxycycline)によって調節可能なDNAコンストラクトの作製
[1-1]OXB1プロモーターを含むDNAコンストラクトの作製
pJL39プラスミド(Mol Ther.、21(11)、p.1985-1995、(2013))を鋳型鎖として(図1)、制限酵素EcoRI部位を含むように作製された正方向プライマー(5’-CGGAATTCACCATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAG-3’;配列番号2)および制限酵素PvuII-XbaI部位を含むように作製された逆方向プライマー(5’-GCTCTAGACAGCTGTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCT-3’;配列番号3)を用いてtetR遺伝子を増幅した。以後、前記増幅産物に制限酵素EcoRIおよびXbaIを入れて切断し、これを精製して、tetR遺伝子増幅産物を得た後に、これをpBAD24(カタログ番号.ATCC○R 87399TM、ATCC、米国)プラスミドに導入する過程によりpBAD-TetRプラスミドを作製した。
その後、前記pJL39プラスミドのPvuIIおよびHindIII断片により、多重クローニングサイトを含むダイバージェント(Divergent)プロモーター領域を前記pBAD-TetRプラスミドに導入してpTetR-BADプラスミドを作製した。NheIおよびPcil制限酵素を用いて前記pTetR-BADプラスミドからaraCおよびaraBADプロモーターを除去して、pTetIIプラスミドを作製した。
pSF-OXB1(Oxford Genetics、England)を鋳型として、正方向プライマー(5’-CTACTCCGTCAAGCCGTCAAGCTGTTGTGACCGCTTGCT-3’;配列番号4)および逆方向プライマー(5’-TGAATTCCTCCTGCTAGCTAGTTGGTAACGAATCAGACGCCGGGTAATACCGGATAG-3’;配列番号5)で増幅された構成的プロモーターであるOXB1(配列番号16)を、ギブソンアセンブリ方式を用いて、前記pTetIIプラスミドに導入することにより、最終的にOXB1、tetAおよびtetRプロモーターを含むpJH18プラスミドを作製した。
前記pJH18プラスミドをバックボーンとして、tetR、Rluc8およびサイトリシンA(Cytolysin A、ClyA)を暗号化する遺伝子を前記プロモーターの下流に下記表1のような組み合わせで導入する過程によりpJH18-RR、pJH18-ARおよびpJH18-CRプラスミドを作製した(図2)。
[1-2]OXB11、13および20プロモーターを含むDNAコンストラクトの作製
前記準備例[1-1]と同様の方式により、pSF-OXB11、pSF-OXB13またはpSF-OXB20を鋳型として、正方向プライマー(5’-TGCTACTCCGTCAAGCCGTCAAGCTGTTGTGACCGCTTG-3’:配列番号6)および逆方向プライマー(5’-AGCTTGGTAACGAATCAGACGCCGGGTAATACCGGATAG-3’:配列番号7)で増幅された構成的プロモーターであるOXB11、OXB13およびOBX20を、ギブソンアセンブリ方式を用いて、前記準備例[1-1]で作製されたpJH18プラスミドに導入した(pTetOXB11-AR、pTetOXB11-RR、pTetOXB13-AR、pTetOXB13-RR、pTetOXB20-AR、pTetOXB20-RR)。ここで、前記プラスミドによるタンパク質の発現効率はOXB11、OXB13およびOXB20の順に高く、OXB1の場合、最も弱いタンパク質の発現効率を示す。
前記準備例[1-1]と同様の方式により、pSF-OXB11、pSF-OXB13またはpSF-OXB20を鋳型として、正方向プライマー(5’-TGCTACTCCGTCAAGCCGTCAAGCTGTTGTGACCGCTTG-3’:配列番号6)および逆方向プライマー(5’-AGCTTGGTAACGAATCAGACGCCGGGTAATACCGGATAG-3’:配列番号7)で増幅された構成的プロモーターであるOXB11、OXB13およびOBX20を、ギブソンアセンブリ方式を用いて、前記準備例[1-1]で作製されたpJH18プラスミドに導入した(pTetOXB11-AR、pTetOXB11-RR、pTetOXB13-AR、pTetOXB13-RR、pTetOXB20-AR、pTetOXB20-RR)。ここで、前記プラスミドによるタンパク質の発現効率はOXB11、OXB13およびOXB20の順に高く、OXB1の場合、最も弱いタンパク質の発現効率を示す。
[1-3]Tacプロモーターを含むDNAコンストラクトの作製
前記準備例[1-1]で作製されたpJH18プラスミドに構成的プロモーターであるTacを導入した。具体的には、Tac正方向プライマー(5’-CCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTCTGATTCGTTACCAAGCT-3’:配列番号10)および逆方向プライマー(5’-AGCTTGGTAACGAATCAGACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAATTGACGGCTTGACGGAGTAGCATAGGG-3’:配列番号11)で構成的プロモーターであるTacプロモーター配列を増幅した後、ギブソンアセンブリ方式を用いて、pJH18プラスミドにTacプロモーターを導入してpTetTac-RRプラスミドを作製した。
前記準備例[1-1]で作製されたpJH18プラスミドに構成的プロモーターであるTacを導入した。具体的には、Tac正方向プライマー(5’-CCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTCTGATTCGTTACCAAGCT-3’:配列番号10)および逆方向プライマー(5’-AGCTTGGTAACGAATCAGACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAATTGACGGCTTGACGGAGTAGCATAGGG-3’:配列番号11)で構成的プロモーターであるTacプロモーター配列を増幅した後、ギブソンアセンブリ方式を用いて、pJH18プラスミドにTacプロモーターを導入してpTetTac-RRプラスミドを作製した。
[1-4]J23101プロモーターを含むDNAコンストラクトの作製
同様に、前記準備例[1-1]で作製されたpJH18プラスミドに構成的プロモーターであるJ23101を導入した。具体的には、J23101正方向プライマー(5’-TGCTACTCCGTCAAGCCGTCTTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCAATTGTCTGATTCGTTACC-3’:配列番号12)および逆方向プライマー(5’-GGTAACGAATCAGACAATTGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTAAAGACGGCTTGACGGAGTAGCA-3’:配列番号13)で構成的プロモーターであるJ23101プロモーター配列を増幅した後、ギブソンアセンブリ方式を用いて、pJH18プラスミドにJ23101プロモーターを導入してpTetJ23101-RRプラスミドを作製した。
同様に、前記準備例[1-1]で作製されたpJH18プラスミドに構成的プロモーターであるJ23101を導入した。具体的には、J23101正方向プライマー(5’-TGCTACTCCGTCAAGCCGTCTTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCAATTGTCTGATTCGTTACC-3’:配列番号12)および逆方向プライマー(5’-GGTAACGAATCAGACAATTGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTAAAGACGGCTTGACGGAGTAGCA-3’:配列番号13)で構成的プロモーターであるJ23101プロモーター配列を増幅した後、ギブソンアセンブリ方式を用いて、pJH18プラスミドにJ23101プロモーターを導入してpTetJ23101-RRプラスミドを作製した。
[1-5]J23119プロモーターを含むDNAコンストラクトの作製
同様に、前記準備例[1-1]で作製されたpJH18プラスミドに構成的プロモーターであるJ23119を導入した。具体的には、J23119正方向プライマー(5’-TGCTACTCCGTCAAGCCGTCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCAATTGTCTGATTCGTTACC-3’:配列番号14)および逆方向プライマー(5’-GGTAACGAATCAGACAATTGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAGACGGCTTGACGGAGTAGCA-3’:配列番号15)で構成的プロモーターであるJ23119プロモーター配列を増幅した後、ギブソンアセンブリ方式を用いて、pJH18プラスミドにJ23119プロモーターを導入してpTetJ23119-RRプラスミドを作製した。
同様に、前記準備例[1-1]で作製されたpJH18プラスミドに構成的プロモーターであるJ23119を導入した。具体的には、J23119正方向プライマー(5’-TGCTACTCCGTCAAGCCGTCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCAATTGTCTGATTCGTTACC-3’:配列番号14)および逆方向プライマー(5’-GGTAACGAATCAGACAATTGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAGACGGCTTGACGGAGTAGCA-3’:配列番号15)で構成的プロモーターであるJ23119プロモーター配列を増幅した後、ギブソンアセンブリ方式を用いて、pJH18プラスミドにJ23119プロモーターを導入してpTetJ23119-RRプラスミドを作製した。
[準備例2]癌細胞株および培養条件
CT26結腸癌細胞株であるCRL-2638およびHB-8064(ATCC、米国)とマウスの大腸腺癌腫細胞株であるMC38(Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School、米国、および全南大学、韓国)を実験に使用した。
CT26結腸癌細胞株であるCRL-2638およびHB-8064(ATCC、米国)とマウスの大腸腺癌腫細胞株であるMC38(Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School、米国、および全南大学、韓国)を実験に使用した。
10%ウシ胎児血清(Fetal bovine serum;FBS)および1%のペニシリン-ストレプトマイシンが含まれた高ブドウ糖DMEM(Dulbecco’s Modified Eagles Medium)培地(カタログ番号:#LM001-05、ウェルジン、韓国)を用いて、5%CO2培養器で37℃の条件で前記細胞を培養した。
[準備例3]プラスミドが導入されたサルモネラ菌株の作製
サルモネラ菌株はppGppの欠乏しているサルモネラティフィムリウム(Salmonella typhimurium;S.typhimurium)であるSHJ2037(relA::cat、spoT::kan)を使用した。
サルモネラ菌株はppGppの欠乏しているサルモネラティフィムリウム(Salmonella typhimurium;S.typhimurium)であるSHJ2037(relA::cat、spoT::kan)を使用した。
サルモネラ菌株に、前記準備例1で作製したプラスミドを電気穿孔法(Electroporation)を用いて形質転換した後、100μg/mlのアンピシリン(Ampicillin)が含まれたLB培地を用いて、前記形質転換されたそれぞれの菌株を一晩培養した。その後、前記培養液をアンピシリンが含まれた新たなLB培地を用いて1:100の比率で希釈し、追加培養によりOD600値が0.5~0.7に到達した時、前記培養液に最終濃度が0、10、50、100、300、500ng/mlとなるようにエタノールで希釈したドキシサイクリンを添加し、200rpmおよび37℃の条件で振盪培養器で培養した。
[準備例4]実験動物モデルの用意
20~30gの重量に相当する5~6週齢のC57BL/6およびBALB/Cマウス(オリエントカンパニー、韓国)を使用した。前記準備例2のMC38またはCT26を前記マウスの脇腹に皮下注射して、腫瘍動物モデルを構築した。
20~30gの重量に相当する5~6週齢のC57BL/6およびBALB/Cマウス(オリエントカンパニー、韓国)を使用した。前記準備例2のMC38またはCT26を前記マウスの脇腹に皮下注射して、腫瘍動物モデルを構築した。
前記腫瘍動物モデルの映像化および腫瘍の大きさの評価のために、痲酔のためには2%イソフルラン(Isoflurane)を使用し、手術時には200mg/kgのケタミン(Ketamine)および10mg/kgのキシラジン(Xylasine)を使用した。
前記腫瘍の大きさ(mm3)の評価は(長さ×高さ×幅)/2を用いて計算されるようにし、動物モデルの腫瘍の大きさが1500mm3以上の場合には、動物モデルを安楽死させた。
[実施例1]pTetIIプラスミドのtetRプロモーターの予測
前記準備例[1-1]で中間産物として作製されたpTetIIプラスミドで、tetRタンパク質の発現を調節できるプロモーターの配列をBPROM(Bacterial sigma 70 promoter prediction program)を用いて予測し、その結果を図3に示した。
前記準備例[1-1]で中間産物として作製されたpTetIIプラスミドで、tetRタンパク質の発現を調節できるプロモーターの配列をBPROM(Bacterial sigma 70 promoter prediction program)を用いて予測し、その結果を図3に示した。
図3に示すように、pTetIIプラスミドのtetRタンパク質を基準として、-35部位に配列番号6の塩基配列が予測され、-10部位に配列番号7の塩基配列が予測された。
前記結果を通して、本発明によるpTetIIプラスミドは、別のOXB1のようなプロモーターを含まない場合にも、-35および-10部位に配列番号6および7がそれぞれ位置できる場合には、tetRタンパク質が自然に発現できることが分かる。
[実施例2]pJH18-RRおよびpJH18-ARプラスミドが導入された菌株におけるタンパク質の発現レベルおよびルシフェラーゼの活性程度の比較
[2-1]ウェスタンブロット分析およびクマシーブルー(Coomassie Blue)染色によるタンパク質の発現レベルの比較
前記準備例[1-1]で作製されたプラスミドで、tetAおよびtetRプロモーターの下流に導入された遺伝子間の発現レベルが均衡をなすか否かを確認するために、前記準備例[1-1]で作製されたプラスミドがそれぞれ導入されている前記準備例3の菌株から発現したRluc8タンパク質をクマシーブルー染色薬により染色するか、前記タンパク質に特異的な抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。
[2-1]ウェスタンブロット分析およびクマシーブルー(Coomassie Blue)染色によるタンパク質の発現レベルの比較
前記準備例[1-1]で作製されたプラスミドで、tetAおよびtetRプロモーターの下流に導入された遺伝子間の発現レベルが均衡をなすか否かを確認するために、前記準備例[1-1]で作製されたプラスミドがそれぞれ導入されている前記準備例3の菌株から発現したRluc8タンパク質をクマシーブルー染色薬により染色するか、前記タンパク質に特異的な抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。
具体的には、前記準備例3の菌株の培養液を4×107CFU/mlとなるようにPBSを用いて希釈し、13,000rpmで5分間遠心分離してペレットを収集した。前記ペレット分画をPBSを用いて洗浄し、0.2%β-メルカプトエタノール(β-mercaptoethanol)(カタログ番号:EBA-1052、ELPIS BIOTECH)が含まれたSDSサンプル緩衝液と混合して菌株溶解物を得た。その後、15%SDS-PAGEで前記菌株溶解物を電気泳動し、前記ゲルをクマシーブルー染色薬により染色するか、前記ゲルからニトロセルロース膜にタンパク質を移した後、5%脱脂乳を用いて常温でブロッキングした。以後、Rluc8抗体(カタログ番号:AB3256、ミリポア、米国)を用いてRluc8タンパク質の発現レベルを確認し、その結果を図4に示した。
図4に示すように、tetAプロモーターからのRLuc8タンパク質の発現レベルは、tetRプロモーターから発現したタンパク質のレベルより2~6倍さらに高く、ドキシサイクリン(10ng/ml)の最低濃度でも飽和した誘導剤の濃度に非常に敏感に反応した。
[2-2]ルシフェラーゼ活性の分析によるタンパク質の機能的発現レベルの比較
前記準備例[1-1]で作製されたプラスミドがそれぞれ導入されている前記準備例3の菌株におけるルシフェラーゼ活性の測定のために、前記菌株を1mlのPBSに再懸濁させた。その後、前記再懸濁された菌株に、基質であるエタノールで希釈した1μg/mlのコエレンテラジン(Coelenterazine)を添加した後、NightOWL II LB 983 In Vivo イメージングシステム(Berthold technologies、GmbH&Co.KG、ドイツ)またはバイオラッドイメージャーChemoDocTM XRS+システムを用いて、1秒露出時間の条件でルシフェラーゼ活性値を測定した。このように測定された値は、各菌株のCFUによる標準化を行い、Rluc8が含まれていない対照群プラスミドが含まれている値を用いて正規化された値である相対的発光ユニット(Relative luminescence units;RLU)で計算して、その結果を図5および6に示した。
前記準備例[1-1]で作製されたプラスミドがそれぞれ導入されている前記準備例3の菌株におけるルシフェラーゼ活性の測定のために、前記菌株を1mlのPBSに再懸濁させた。その後、前記再懸濁された菌株に、基質であるエタノールで希釈した1μg/mlのコエレンテラジン(Coelenterazine)を添加した後、NightOWL II LB 983 In Vivo イメージングシステム(Berthold technologies、GmbH&Co.KG、ドイツ)またはバイオラッドイメージャーChemoDocTM XRS+システムを用いて、1秒露出時間の条件でルシフェラーゼ活性値を測定した。このように測定された値は、各菌株のCFUによる標準化を行い、Rluc8が含まれていない対照群プラスミドが含まれている値を用いて正規化された値である相対的発光ユニット(Relative luminescence units;RLU)で計算して、その結果を図5および6に示した。
図5および6に示すように、ルシフェラーゼ活性値は、ドキシサイクリンが存在する場合にのみ確認され(図5)、tetAおよびtetRプロモーターによって調節されるタンパク質の活性レベルは、tetAプロモーターがtetRプロモーターに比べて3倍程度と高くなることを確認した(図6)。
前記結果を通して、tetAプロモーターおよびtetRプロモーターを抑制できる調節タンパク質であるtetRタンパク質が別のプロモーターによって継続して発現する場合には、tetRタンパク質の抑制剤が存在する場合にのみ、tetAプロモーターおよびtetRプロモーターを同時に誘導できることが分かる。
[2-3]pTetIIプラスミドとpJH18-CRプラスミドとの間のルシフェラーゼ活性の比較
前記準備例[1-1]で中間産物として作製されたpTetIIプラスミドとpJH18-CRプラスミドをそれぞれ前記準備例3と同様の方法で菌株に導入した後、前記菌株間のルシフェラーゼ活性を前記実施例[2-2]と同様の方法で測定し、その結果を図7および8に示した。
前記準備例[1-1]で中間産物として作製されたpTetIIプラスミドとpJH18-CRプラスミドをそれぞれ前記準備例3と同様の方法で菌株に導入した後、前記菌株間のルシフェラーゼ活性を前記実施例[2-2]と同様の方法で測定し、その結果を図7および8に示した。
図7および8に示すように、ルシフェラーゼ活性値は、OXB1プロモーターが存在する場合(pJH18-CR)でのみならず、-35部位および-10部位にそれぞれ配列番号8および配列番号9で表される塩基配列が位置する場合にも、同様にルシフェラーゼ活性濃度がドキシサイクリンの濃度に依存的に増加することを確認した。
前記結果を通して、本発明によるDNAコンストラクトが含まれたプラスミドの場合、プラスミドに内在されている塩基配列がプロモーターとして作用して調節タンパク質の発現が誘導できるため、調節タンパク質の上流に別のプロモーターを人為的に導入しなくても、調節タンパク質を継続して発現させることができることが分かる。
[2-4]OXB1とOXB11プロモーターが含まれたDNAコンストラクト間のルシフェラーゼ活性の比較
前記準備例[1-2]で作製されたpTetOXB11プラスミドとpJH18プラスミドをそれぞれ前記準備例3と同様の方法で菌株に導入した後、前記菌株間のルシフェラーゼ活性を前記実施例[2-2]と同様の方法で測定し、その結果を図9および10に示した。
前記準備例[1-2]で作製されたpTetOXB11プラスミドとpJH18プラスミドをそれぞれ前記準備例3と同様の方法で菌株に導入した後、前記菌株間のルシフェラーゼ活性を前記実施例[2-2]と同様の方法で測定し、その結果を図9および10に示した。
図9および10に示すように、OXB11プロモーターが存在する場合(pTetOXB11)より、弱いプロモーターであるOXB1プロモーターが存在する場合(pJH18)にてルシフェラーゼ活性がより高いことを確認した。
前記結果を通して、中間プロモーターが含まれたプラスミドと比較して、弱いプロモーターが含まれたプラスミドの場合、そのプロモーターの下流に存在する調節タンパク質の発現を低いレベルに発現させることで、ドキシサイクリンの濃度に敏感に反応するようにして目的タンパク質の発現レベルを効果的に増加させ、究極的にtetAおよびtetRプロモーターの下流に存在する遺伝子の発現レベルが均衡をなすようにすることが分かる。
[実施例3]pJH18-CRプラスミドが導入された菌株におけるタンパク質の発現および活性レベルの比較
[3-1]タンパク質の発現および活性レベルの比較
前記実施例[2-1]および[2-2]に記載のウェスタンブロット分析、クマシーブルー染色およびルシフェラーゼ活性の分析方法と同様の方法により、前記準備例[1-1]のpJH18-CR(POXB1::tetR、PtetA::ClyAおよびPtetR::Rluc8)が、準備例3に記載の方法により導入された菌株でタンパク質発現レベルの分析を行って、その結果を図11および12に示した。
[3-1]タンパク質の発現および活性レベルの比較
前記実施例[2-1]および[2-2]に記載のウェスタンブロット分析、クマシーブルー染色およびルシフェラーゼ活性の分析方法と同様の方法により、前記準備例[1-1]のpJH18-CR(POXB1::tetR、PtetA::ClyAおよびPtetR::Rluc8)が、準備例3に記載の方法により導入された菌株でタンパク質発現レベルの分析を行って、その結果を図11および12に示した。
図11および12に示すように、pJH18-CRが導入された菌株にドキシサイクリンが処理された場合、サイトリシンAタンパク質の発現レベルとRluc8タンパク質の発現レベルがほぼ同等に均衡的に発現することを確認した。
[3-2]溶血活性の確認
PBSで希釈した前記準備例[1-1]のpJH18-CRが、準備例3に記載の方法により導入された菌株を、0または20ng/mlのドキシサイクリンが含まれた血液寒天プレートに塗抹し、37℃で一晩培養した後、プレートの写真を撮影して、その結果を図13に示した。
PBSで希釈した前記準備例[1-1]のpJH18-CRが、準備例3に記載の方法により導入された菌株を、0または20ng/mlのドキシサイクリンが含まれた血液寒天プレートに塗抹し、37℃で一晩培養した後、プレートの写真を撮影して、その結果を図13に示した。
図13に示すように、菌株の血液寒天の溶血活性は、サイトリシンAを暗号化する遺伝子の上流に存在するプロモーターの種類に関係なくドキシサイクリンが含まれた場合(+)にのみ現れることを確認した。
前記結果を通して、本発明によるプラスミドのtetAおよびtetRプロモーターがドキシサイクリンによってのみ活性誘導されることにより、同時にタンパク質の発現レベルを効果的に調節すできることが分かる。
[実施例4]pJH87およびpJH18-CRプラスミドが導入された菌株におけるタンパク質の発現レベルの比較
前記実施例[2-1]および[2-2]に記載のウェスタンブロット分析、クマシーブルー染色およびルシフェラーゼ活性の分析方法と同様の方法により、前記pJH87(PtetA::ClyAおよびPtetR::TetR::Rluc8)およびpJH18-CR(POXB1::tetR、PtetA::ClyAおよびPtetR::Rluc8)が準備例3に記載の方法により導入された菌株でドキシサイクリンの濃度が20ng/ml以上投与されることにより、サイトリシンAタンパク質の発現レベルが飽和するように誘導した状態でタンパク質発現レベルの分析を行って、その結果を図14~16に示した。
前記実施例[2-1]および[2-2]に記載のウェスタンブロット分析、クマシーブルー染色およびルシフェラーゼ活性の分析方法と同様の方法により、前記pJH87(PtetA::ClyAおよびPtetR::TetR::Rluc8)およびpJH18-CR(POXB1::tetR、PtetA::ClyAおよびPtetR::Rluc8)が準備例3に記載の方法により導入された菌株でドキシサイクリンの濃度が20ng/ml以上投与されることにより、サイトリシンAタンパク質の発現レベルが飽和するように誘導した状態でタンパク質発現レベルの分析を行って、その結果を図14~16に示した。
図14~16に示すように、pJH18-CRプラスミドが導入された菌株でサイトリシンAタンパク質の発現レベルが、pJH87プラスミドが導入された菌株に比べて5倍程度高く現れることを確認した。さらに、Rluc8タンパク質の活性レベルは、pJH87プラスミドが導入された菌株に比べて、pJH18-CRプラスミドが導入された菌株で約80倍程度より高くなることを確認した。
前記結果を通して、tetRを暗号化する遺伝子がtetRプロモーターの下流に存在するように構成されたプラスミドに比べて、本発明のように、tetRを暗号化する遺伝子が別のプロモーター、特に弱いプロモーターによって調節できるようにする場合には、1つの調節因子によって活性誘導できるtetAおよびtetRプロモーターによって抗癌タンパク質およびレポーター遺伝子が同時に高いレベルに発現および活性誘導できるだけでなく、その発現および活性比率が比較的均衡をなし得ることが分かる。
[実施例5]癌を発生させた腫瘍動物モデルにおける組換え菌株の腫瘍抑制能力および映像化分析
前記準備例3に記載の方式を利用して、pJH18-CRまたはpJH18が導入されたサルモネラ菌株を、前記準備例4で構築された腫瘍動物モデルの尾静脈に注入した。その後、前記実施例[2-1]および[2-2]に記載のルシフェラーゼ活性の分析方法およびウェスタンブロット分析方法により、腫瘍動物モデル内の菌株の映像化とサイトリシンAタンパク質発現レベルの分析を行って、その結果を図17~19に示した。
前記準備例3に記載の方式を利用して、pJH18-CRまたはpJH18が導入されたサルモネラ菌株を、前記準備例4で構築された腫瘍動物モデルの尾静脈に注入した。その後、前記実施例[2-1]および[2-2]に記載のルシフェラーゼ活性の分析方法およびウェスタンブロット分析方法により、腫瘍動物モデル内の菌株の映像化とサイトリシンAタンパク質発現レベルの分析を行って、その結果を図17~19に示した。
また、前記腫瘍動物モデルにおいて、前記準備例4のように0~34日間腫瘍の大きさを測定し、50日間前記腫瘍動物モデルの生存率を測定して、その結果を図20および21に示した。ここで、対照群として前記腫瘍動物モデルの尾静脈にPBSのみを注入した。
図17~18に示すように、対照群と比較して、pJH18-CRが導入されたサルモネラ菌株が注入された腫瘍動物モデルの腫瘍組織でのみルシフェラーゼ活性が測定されることを確認した。さらに、前記pJH18-CRが導入されたサルモネラ菌株が注入された腫瘍動物モデルの腫瘍組織を摘出した場合にも、ルシフェラーゼの活性が測定されることを確認した。また、図19に示すように、pJH18-CRが導入されたサルモネラ菌株の場合、ドキシサイクリンが存在する場合、(Dox+)にのみ特異的にサイトリシンAタンパク質が発現することを確認した。
図20および21に示すように、PBSおよびpJH18が注入された場合と比較して、pJH18-CRが導入されたサルモネラ菌株からサイトリシンAタンパク質が発現した腫瘍動物モデルで腫瘍の大きさが著しく減少し、生存率が増加することを確認した。
前記結果を通して、本発明によるpJH18-CRが導入されたサルモネラ菌株の場合、1つの調節因子によって映像化可能なタンパク質および抗癌タンパク質の発現を調節するプロモーターを活性化することにより、腫瘍が発生した個体で腫瘍の位置を正確に映像化できると同時に、腫瘍の成長を抑制して癌が発生した個体の生存率を著しく改善できることが分かる。
[実施例6]プロモーターが含まれたDNAコンストラクト間のルシフェラーゼ活性の比較
前記準備例[1-3]~[1-5]で作製されたpTetTac-RR、pTetJ23101-RR、およびpTetJ23119-RRプラスミドをそれぞれ前記準備例3と同様の方法で菌株に導入した後、前記菌株間のルシフェラーゼ活性を前記実施例[2-2]と同様の方法で測定し、その結果を図22および23に示した。
前記準備例[1-3]~[1-5]で作製されたpTetTac-RR、pTetJ23101-RR、およびpTetJ23119-RRプラスミドをそれぞれ前記準備例3と同様の方法で菌株に導入した後、前記菌株間のルシフェラーゼ活性を前記実施例[2-2]と同様の方法で測定し、その結果を図22および23に示した。
図22および23に示すように、Tac、J23101およびJ23119プロモーターが存在するプラスミドの場合(pTetTac-RR、pTetJ23101-RR、pTetJ23119-RR)より、OXB1プロモーターが存在するプラスミドの場合(pJH18)でドキシサイクリンに対する敏感性とルシフェラーゼ活性がより高いことを確認した。
前記結果を通して、公開された構成的プロモーターが含まれたプラスミドと比較して、本発明の弱いプロモーターが含まれたプラスミドの場合、そのプロモーターの下流に存在する調節タンパク質の発現を低いレベルに発現させることにより、ドキシサイクリンの濃度に敏感に反応するようにして目的タンパク質の発現レベルを効果的に増加させ、究極的にtetAおよびtetRプロモーターの下流に存在する遺伝子の発現レベルが均衡をなすようにすることが分かる。
以上、本発明の特定の部分を詳細に述べたが、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、よって、本発明の範囲が制限されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物によって定義される。
本発明は、癌の診断および治療用DNAコンストラクトおよび前記DNAコンストラクトを含む組換えベクターが導入された菌株に関する。
配列リストフリーテキスト
配列番号1: サイトリシンAのアミノ酸配列
10 20 30 40 50
MIMTGIFAEQ TVEVVKSAIE TADGALDLYN KYLDQVIPWK TFDETIKELS
60 70 80 90 100
RFKQEYSQEA SVLVGDIKVL LMDSQDKYFE ATQTVYEWCG VVTQLLSAYI
110 120 130 140 150
LLFDEYNEKK ASAQKDILIR ILDDGVKKLN EAQKSLLTSS QSFNNASGKL
160 170 180 190 200
LALDSQLTND FSEKSSYFQS QVDRIRKEAY AGAAAGIVAG PFGLIISYSI
210 220 230 240 250
AAGVIEGKLI PELNNRLKTV QNFFTSLSAT VKQANKDIDA AKLKLATEIA
260 270 280 290 300
AIGEIKTETE TTRFYVDYDD LMLSLLKGAA KKMINTCNEY QQRHGKKTLF
EVPDV
配列番号1: サイトリシンAのアミノ酸配列
10 20 30 40 50
MIMTGIFAEQ TVEVVKSAIE TADGALDLYN KYLDQVIPWK TFDETIKELS
60 70 80 90 100
RFKQEYSQEA SVLVGDIKVL LMDSQDKYFE ATQTVYEWCG VVTQLLSAYI
110 120 130 140 150
LLFDEYNEKK ASAQKDILIR ILDDGVKKLN EAQKSLLTSS QSFNNASGKL
160 170 180 190 200
LALDSQLTND FSEKSSYFQS QVDRIRKEAY AGAAAGIVAG PFGLIISYSI
210 220 230 240 250
AAGVIEGKLI PELNNRLKTV QNFFTSLSAT VKQANKDIDA AKLKLATEIA
260 270 280 290 300
AIGEIKTETE TTRFYVDYDD LMLSLLKGAA KKMINTCNEY QQRHGKKTLF
EVPDV
配列番号2: Forward primer
5’-CGGAATTCACCATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAG-3’
5’-CGGAATTCACCATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAG-3’
配列番号3: Reverse primer
5’-GCTCTAGACAGCTGTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCT-3’
5’-GCTCTAGACAGCTGTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCT-3’
配列番号4: Forward primer
5’-CTACTCCGTCAAGCCGTCAAGCTGTTGTGACCGCTTGCT-3’
5’-CTACTCCGTCAAGCCGTCAAGCTGTTGTGACCGCTTGCT-3’
配列番号5: Reverse primer
5’-TGAATTCCTCCTGCTAGCTAGTTGGTAACGAATCAGACGCCGGGTAATACCGGATAG-3’
5’-TGAATTCCTCCTGCTAGCTAGTTGGTAACGAATCAGACGCCGGGTAATACCGGATAG-3’
配列番号6: Forward primer
5’-TGCTACTCCGTCAAGCCGTCAAGCTGTTGTGACCGCTTG-3’
5’-TGCTACTCCGTCAAGCCGTCAAGCTGTTGTGACCGCTTG-3’
配列番号7: Reverse primer
5’-AGCTTGGTAACGAATCAGACGCCGGGTAATACCGGATAG-3’
5’-AGCTTGGTAACGAATCAGACGCCGGGTAATACCGGATAG-3’
配列番号8: -35 promoter
TTCGCG
TTCGCG
配列番号9: -10 promoter
ATGCATAAT
ATGCATAAT
配列番号10: Forward primer
5’-CCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTCTGATTCGTTACCAAGCT-3’
5’-CCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTCTGATTCGTTACCAAGCT-3’
配列番号11: Reverse primer
5’-AGCTTGGTAACGAATCAGACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAATTGACGGCTTGACGGAGTAGCATAGGG-3’
5’-AGCTTGGTAACGAATCAGACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAATTGACGGCTTGACGGAGTAGCATAGGG-3’
配列番号12: Forward primer
5’-TGCTACTCCGTCAAGCCGTCTTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCAATTGTCTGATTCGTTACC-3’
5’-TGCTACTCCGTCAAGCCGTCTTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCAATTGTCTGATTCGTTACC-3’
配列番号13: Reverse primer
5’- GGTAACGAATCAGACAATTGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTAAAGACGGCTTGACGGAGTAGCA-3’
5’- GGTAACGAATCAGACAATTGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTAAAGACGGCTTGACGGAGTAGCA-3’
配列番号14: Forward primer
5’- TGCTACTCCGTCAAGCCGTCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCAATTGTCTGATTCGTTACC-3’
5’- TGCTACTCCGTCAAGCCGTCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCAATTGTCTGATTCGTTACC-3’
配列番号15: Reverse primer
5’- GGTAACGAATCAGACAATTGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAGACGGCTTGACGGAGTAGCA-3’
5’- GGTAACGAATCAGACAATTGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAGACGGCTTGACGGAGTAGCA-3’
配列番号16: OXB1 promoter
5’- AAGCTGTTGTGACCGCTTGCTCTAGCCAGCTATCGAGTTGTGAACCGATCCATCTAGCAATTGGTCTCGATCTAGCGATAGGCTTCGATCTAGCTATGTAGAAACGCCGTGTGCTCGATCGCCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTGCTTCAACAGAACATATTGACTATCCGGTATTACCCGGC-3’
5’- AAGCTGTTGTGACCGCTTGCTCTAGCCAGCTATCGAGTTGTGAACCGATCCATCTAGCAATTGGTCTCGATCTAGCGATAGGCTTCGATCTAGCTATGTAGAAACGCCGTGTGCTCGATCGCCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTGCTTCAACAGAACATATTGACTATCCGGTATTACCCGGC-3’
Claims (31)
- 調節タンパク質を暗号化する遺伝子;および
前記調節タンパク質によって誘導される第1プロモーターおよび第2プロモーターを含む、DNAコンストラクト。 - 前記第1プロモーターは、tetAプロモーターであり、
前記第2プロモーターは、tetRプロモーターである、請求項1に記載のDNAコンストラクト。 - 前記調節タンパク質は、TetRタンパク質である、請求項1に記載のDNAコンストラクト。
- シス-作用因子(cis-acting element)またはトランス-作用因子(trans-acting element)によって前記調節タンパク質の発現が調節される、請求項1に記載のDNAコンストラクト。
- 前記シス-作用因子は、リボソーム結合部位(ribosome binding site;RBS)、5’-非翻訳領域(5’-Untranslated Region;5’-UTR)、転写因子結合部位(transcription factor binding site)および終結子(terminators)からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項4に記載のDNAコンストラクト。
- 前記転写因子結合部位は、前記調節タンパク質を暗号化する遺伝子のプロモーター;エンハンサー(enhancer);およびサイレンサー(silencer);からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項5に記載のDNAコンストラクト。
- 前記調節タンパク質を暗号化する遺伝子のプロモーターは、弱いプロモーター(weak promoter)である、請求項6に記載のDNAコンストラクト。
- 前記弱いプロモーターは、前記プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子から転写された転写体(Transcript)の発現レベルが1×10-2以下である、請求項7に記載のDNAコンストラクト。
- 前記トランス-作用因子は、転写因子、アプタマー(aptamer)、sRNA、アンチセンスRNA(antisense RNA;asRNA)からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項4に記載のDNAコンストラクト。
- 前記第1プロモーターおよび第2プロモーターの下流に抗癌タンパク質を暗号化する遺伝子;サイトカインを暗号化する遺伝子;ケモカインを暗号化する遺伝子;免疫調節子(Immune modulator)を暗号化する遺伝子;癌抗原に特異的なオリゴヌクレオチド;およびレポータータンパク質を暗号化する遺伝子からなる群より選択されるいずれか1つが作動可能に連結されたものである、請求項1に記載のDNAコンストラクト。
- 前記抗癌タンパク質は、毒素タンパク質、癌抗原に特異的な抗体または前記抗体の断片、腫瘍抑制タンパク質(Tumor suppressor protein)、血管新生抑制剤、癌抗原、前駆薬物転換酵素(Prodrug-converting enzymes)、および全細胞死滅タンパク質(pro-apoptotic protein)から構成された群より選択される少なくとも1つである、請求項10に記載のDNAコンストラクト。
- 前記毒素タンパク質は、リシン(Ricin)、サポリン(Saporin)、ゲロニン(Gelonin)、モモルジン(Momordin)、デブーガニン(Debouganin)、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素(Pseudomonas toxin)、ヘモリシン(HlyA)、FASリガンド(FAS ligand;FASL)、腫瘍壊死因子-α(Tumour necrosis factor-α;TNF-α)、TNF-関連細胞死滅-誘発リガンド(TNF-related apoptosis-inducing ligand;TRAIL)およびサイトリシンA(Cytolysin A、ClyA)からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項11に記載のDNAコンストラクト。
- 前記腫瘍抑制タンパク質は、RB(Retinoblastoma protein)タンパク質、p53タンパク質、APC(Adenomatous polyposis coli)タンパク質、PTEN(Phosphatase and tensin homologue)タンパク質およびCDKN2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A)タンパク質から構成された群より選択される少なくとも1つである、請求項11に記載のDNAコンストラクト。
- 前記血管新生抑制剤は、アンギオスタチン(angiostatin)、エンドスタチン(endostatin)、トロンボスポンジン(Thrombospondin)および蛋白分解酵素抑制タンパク質から構成された群より選択される少なくとも1つである、請求項11に記載のDNAコンストラクト。
- 前記癌抗原は、アルファ-フェトプロテイン(α-fetoprotein;AFP)、血管内皮成長因子受容体2(Vascular endothelial growth factor receptor2;VEGFR2)、サバイビン(Survivin)、レグマイン(Legumain)および前立腺癌特異的抗原(Prostate cancer specific antigen;PCSA)からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項11に記載のDNAコンストラクト。
- 前記前駆薬物転換酵素は、チミジンキナーゼ(Thymidine kinase)、シトシンデアミナーゼ(cytosine deaminase)、ニトロレダクターゼ(nitroreductase)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(purine nucleoside phosphorylase)、カルボキシペプチダーゼG2(carboxypeptidase G2)、クロメートレダクターゼYieF(chromate reductase YieF)、ヘルペスシンプレックスウイルスI型チミジンキナーゼ/ガンシクロビル(herpes simplex virus type I thymidine kinase/ganciclovir;HSV1-TK/GCV)およびβ-グルクロニダーゼ(β-glucuronidase)からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項11に記載のDNAコンストラクト。
- 前記全細胞死滅タンパク質は、L-アスナーゼ(L-ASNase)またはRNA-結合モチーフタンパク質5(RNA-binding motif protein5;RBM5)である、請求項11に記載のDNAコンストラクト。
- 前記癌抗原に特異的なオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー(aptamer)、siRNAおよびshRNAからなる群より選択される少なくとも1つを暗号化する塩基配列である、請求項10に記載のDNAコンストラクト。
- 前記レポータータンパク質は、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ(Luciferase)および核医学またはMRI映像撮影に使用されるタンパク質からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項10に記載のDNAコンストラクト。
- 前記蛍光タンパク質は、緑色レポータータンパク質(Green Fluorescent Protein;GFP)、変形された緑色レポータータンパク質(Modified Green Fluorescent Protein;MGFP)、増強された緑色レポータータンパク質(Enhanced Green Fluorescent Protein;EGFP)、赤色レポータータンパク質(Red Fluorescent Protein;RFP)、増強された赤色レポータータンパク質(Enhanced Red Fluorescent Protein;ERFP)、青色レポータータンパク質(Blue Fluorescent Protein;BFP)、増強された青色レポータータンパク質(Enhanced Blue Fluorescent Protein;EBFP)、黄色レポータータンパク質(Yellow Fluorescent Protein;YFP)および増強された黄色レポータータンパク質(Enhanced Yellow Fluorescent Protein;EYFP)から構成された群より選択される少なくとも1つである、請求項19に記載のDNAコンストラクト。
- 前記核医学またはMRI映像撮影に使用されるタンパク質は、単純ヘルペスウイルスのチミジンリン酸酵素(Herpes simplex virus thymidine kinsease) 、ドーパミン受容体(Dopamine receptor)、ソマトスタチン受容体(Somatostatin receptor)、ソジウム-ヨード輸送体(Sodium-iodide transporter)、鉄受容体、トランスフェリン受容体(Transferrin receptor)、フェリチン(Ferritin)および鉄輸送体(magA)からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項19に記載のDNAコンストラクト。
- 請求項1~21のいずれか1項に記載のDNAコンストラクトを含む組換えベクター。
- 請求項22に記載の組換えベクターが導入された菌株。
- 前記菌株は、サルモネラ属菌株、クロストリジウム(Clostridium)属菌株、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属菌株および大腸菌属菌株からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項23に記載の菌株。
- 請求項23に記載の菌株を有効成分として含む癌の診断、予防または治療用薬学組成物。
- 前記癌は、黒色腫、卵管癌、脳癌、小腸癌、食道癌、リンパ腺癌、胆嚢癌、血液癌、甲状腺癌、内分泌腺癌、口腔癌、肝癌、胆道癌、大腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌、十二支腸癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、甲状腺未分化癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、尿管癌、膵臓癌、骨/軟部組織肉腫、皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髓性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髓性白血病および孤立性骨髄腫から構成される群より選択される少なくとも1つである、請求項25に記載の薬学組成物。
- 請求項23に記載の菌株を有効成分として含む癌の診断用組成物。
- 目的とする個体から分離された生物学的試料に、請求項23に記載の菌株を処理するステップを含む癌の診断のための情報提供方法。
- 前記菌株からレポータータンパク質が発現する場合、癌として診断するステップをさらに含む、請求項28に記載の癌の診断のための情報提供方法。
- 請求項23に記載の菌株を薬学的有効量で個体に投与するステップを含む、癌の診断、予防または治療方法。
- 前記癌は、黒色腫、卵管癌、脳癌、小腸癌、食道癌、リンパ腺癌、胆嚢癌、血液癌、甲状腺癌、内分泌腺癌、口腔癌、肝癌、胆道癌、大腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌、十二支腸癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、甲状腺未分化癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、尿管癌、膵臓癌、骨/軟部組織肉腫、皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髓性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髓性白血病および孤立性骨髄腫から構成される群より選択される少なくとも1つである、請求項30に記載の癌の診断、予防または治療方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20190055063 | 2019-05-10 | ||
KR10-2019-0055063 | 2019-05-10 | ||
KR1020200056115A KR102252939B1 (ko) | 2019-05-10 | 2020-05-11 | 암의 진단 및 치료용 dna 컨스트럭트 |
PCT/KR2020/006197 WO2020231137A1 (ko) | 2019-05-10 | 2020-05-11 | 암의 진단 및 치료용 dna 컨스트럭트 |
KR10-2020-0056115 | 2020-05-11 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022531777A true JP2022531777A (ja) | 2022-07-11 |
Family
ID=73290251
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021565714A Pending JP2022531777A (ja) | 2019-05-10 | 2020-05-11 | 癌の診断および治療用dnaコンストラクト |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220228165A1 (ja) |
JP (1) | JP2022531777A (ja) |
CA (1) | CA3136574A1 (ja) |
WO (1) | WO2020231137A1 (ja) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1135461A4 (en) * | 1998-12-02 | 2003-03-26 | Univ Boston | GENE NETWORKS FOR CONTROLLING GENE EXPRESSION |
CA2447933A1 (en) * | 2001-05-23 | 2002-11-28 | Abdelali Hannoufa | A repressor-mediated regulation system for control of gene expression in plants |
WO2010040134A2 (en) * | 2008-10-04 | 2010-04-08 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Independently inducible system of gene expression |
ES2931180T3 (es) * | 2011-05-19 | 2022-12-27 | Fund Publica Andaluza Progreso Y Salud | Sistema de tipo Tet-on lentivírico de promotor dual muy inducible |
-
2020
- 2020-05-11 JP JP2021565714A patent/JP2022531777A/ja active Pending
- 2020-05-11 WO PCT/KR2020/006197 patent/WO2020231137A1/ko unknown
- 2020-05-11 CA CA3136574A patent/CA3136574A1/en active Pending
- 2020-05-11 US US17/610,086 patent/US20220228165A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20220228165A1 (en) | 2022-07-21 |
WO2020231137A1 (ko) | 2020-11-19 |
CA3136574A1 (en) | 2020-11-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Yu et al. | Explicit hypoxia targeting with tumor suppression by creating an “obligate” anaerobic Salmonella Typhimurium strain | |
Flentie et al. | A bioluminescent transposon reporter-trap identifies tumor-specific microenvironment-induced promoters in Salmonella for conditional bacterial-based tumor therapy | |
KR102604398B1 (ko) | 암의 진단 및 치료용 dna 컨스트럭트 | |
KR101711399B1 (ko) | 선택적 경색 조직 타겟팅 박테리아 및 그의 용도 | |
ES2260985B1 (es) | Procedimiento de regulacion de la expresion de proteinas heterologas controladas por derivados salicilicos en microorganismos asociados a organismos superiores. | |
EP2182068A1 (en) | Use of bacteria for the sensing and killing of cancer cells | |
JP2022531777A (ja) | 癌の診断および治療用dnaコンストラクト | |
KR101421575B1 (ko) | 개선된 유전자 발현 유도능을 갖는 살모넬라 및 그의 용도 | |
EP4242314A1 (en) | Salmonella strain for prevention and treatment of cancer and use thereof | |
Heisig et al. | Specific antibody-receptor interactions trigger InlAB-independent uptake of listeria monocytogenes into tumor cell lines | |
KR101708424B1 (ko) | 코리네박테리움 속 박테리아 및 이로부터 유래된 미니셀 그리고 이의 용도 | |
EP4170037A1 (en) | Salmonella strain for treating cancer and use thereof | |
KR20230066249A (ko) | 살모넬라 균주 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물 | |
KR20240081501A (ko) | 암의 치료용 면역증강 살모넬라 균주 및 이의 용도 | |
KR20240015030A (ko) | E5의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된약독화 살모넬라 균주 | |
Zhang et al. | Engineering Proteus mirabilis improves antitumor efficacy via enhancing cytotoxic T cell responses | |
KR20240013956A (ko) | 코난토킨-g의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주 | |
Buck | Expression of Wild Type and Chimeric E. Coli Cytotoxic Necrotizing Factor 1 by Tumor-targeted Salmonella | |
KR20230023731A (ko) | 암 요법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230427 |