ES2260985A1 - Procedimiento de regulacion de la expresion de proteinas heterologas controladas por derivados salicilicos en microorganismos asociados a organismos superiores. - Google Patents
Procedimiento de regulacion de la expresion de proteinas heterologas controladas por derivados salicilicos en microorganismos asociados a organismos superiores.Info
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Abstract
Procedimiento de regulación de la producción de proteínas heterólogas controlada por derivados del ácido salicílico en microorganismos asociados a organismos superiores. La presente invención describe un método por el cual se puede controlar la expresión de proteínas heterólogas en microorganismos usando un sistema de expresión controlado por salicilato o derivados. El sistema genético puede usarse en bacterias patógenas atenuadas pudiendo inducirse una vez hospedada por la célula eucariótica por concentraciones dentro del rango de seguridad farmacológica. El tropismo de algunas bacterias por ciertos tejidos u órganos permitirá controlar la producción in situ de biomoléculas para investigación así como sistema de liberación controlada de biofármacos, por ejemplo controlar la expresión de antígenos o proteínas antitumorales.
Description
Procedimiento de regulación de la expresión de
proteínas heterólogas controladas por derivados salicílicos en
microorganismos asociados a organismos superiores.
La presente invención se engloba dentro del campo
de la ingeniería genética. Más concretamente, la presente
invención se relaciona con la manipulación de la expresión génica en
bacterias cuando estas están asociadas a células de organismos
superiores, empleando compuestos químicos como inductores de dicha
expresión de genes heterólogos.
Para las aplicaciones biotecnológicas in
situ de organismos recombinantes vivos, la expresión génica en
los microorganismos ha de estar fuertemente regulada con el fin de
evitar un gran desgaste metabólico innecesario (Glick BR. Biotechnol
Adv. 1995,13-217-61). El ambiente y
la flora intestinal pueden llegar a ejercer una fuerte presión
selectiva en contra de las cepas que expresen constitutivamente
genes heterólogos. Incluso en cultivos puros, los mutantes de baja
expresión son capaces de dominar el cultivo en tan solo unas pocas
docenas de generaciones. La expresión de los genes heterólogos debe
permanecer silenciada hasta que se desee su activación. La señal
inductora debe ser específica especialmente en ambientes complejos,
con el fin de evitar la sobre-expresión en vano de
los genes de interés. Se pueden usar dos alternativas para diseñar
un correcto control de los genes heterólogos: i) Promotores
regulados por condiciones ambientales, donde la señal ambiental
coincide con el lugar de acción. ii) Promotores inducibles
químicamente donde el compuesto es añadido en el momento y lugar
donde se requiera la actividad. Esta última opción es la elegida
preferentemente. Por ejemplo, uno puede manipular un fenotipo de un
organismo dado a través de la adición de un compuesto químico y así
controlar de forma tanto positiva como negativa la aparición de
dicho
fenotipo.
fenotipo.
Para aplicaciones biotecnológicas, un inductor
químico ideal requiere una serie de características: 1) el inductor
debe ser lo suficientemente barato como para ser usado en altas
cantidades. 2) Debe ser compatible con el medio ambiente y/o
biodegradable. 3) El inductor debe ser capaz de atravesar las
diversas membranas celulares si la inducción debe tener lugar en
bacterias endocitadas, o en general, bacterias hospedadas por un
organismo superior.
4) Para bacterias hospedadas en organismos superiores, los posibles efectos farmacológicos sobre el sistema deben ser minimizados, o deben tener efectos toxicológicos relativamente bajos.
4) Para bacterias hospedadas en organismos superiores, los posibles efectos farmacológicos sobre el sistema deben ser minimizados, o deben tener efectos toxicológicos relativamente bajos.
Los sistemas regulatorios predominantes capaces
de controlar efectivamente la expresión génica por inductores
químicos son los sistemas lacI/lac, tanto en células
procariontes como en eucariontes (Gossen M y cols., Trends Biochem
Sci. 1993,18:471-5). Estos sistemas basados en el
operón de la lactosa tienen inductores fisiológicos que pueden ser
rápidamente metabolizados, como por ejemplo lactosa, o no
catabolizables como por ejemplo IPTG, del que se sospecha puede
producir efectos toxicológicos en células de mamífero.
La tetraciclina, al igual que otros antibióticos,
ha sido utilizada como un inductor químico efectivo tanto en
células procariontes como eucariontes. Este sistema consiste en
promotores fuertes que son reprimidos por el regulador sensible a
tetraciclina TetR. Uno de los mayores problemas que se plantean es
el uso de moléculas antibióticas para la inducción.
En Cebolla y cols. (Appl. Environ. Microbiol.
2002, 68: 5034-41 y J. Biol. Chem. 1997, 272:
3986-92), se describieron sistemas regulatorios de
compuestos xenobióticos capaces de ser activados por diversos
derivados de salicilato, incluyendo uno de los mejor conocidos
fármacos del mercado, ácido acetilsalicílico (ASA). ASA es un
inductor que cumpliría con todos los requerimientos para ser un
inductor químico ideal para el control químico in situ de la
expresión génica heteróloga.
Los factores que controlan la ruta de degradación
del naftaleno, la proteína NahR y sus promotores diana Psal
y Pnah, han sido utilizados para expresar diversos genes
heterólogos en distintas estirpes bacterianas, incluyendo E.
coli (Cebolla A y cols., Nucleic Acids Res. 2001,
29:759-66), Bordetella (Suarez A y cols.,
Appl Environ Microbiol. 1997, 63:122-7.) y
Pseudomonas (Cebolla A y cols., Nucleic Acids Res. 2001,
29:759-66). El sistema regulador nahR/Psal
se ha usado también como biosensor, al ser fusionado al operón
lux de Vibrio fischeri (Burlage RS y cols.,
Bacteriol. 1990,172:4749-571), y ha sido de igual
forma usado como sistema de producción de proteínas recombinantes
(de Lorenzo V y cols., Gene. 1993, 130:41-6). Se ha
demostrado que el sistema nahR/Psal está finamente regulado,
mostrando una capacidad de inducción de entre 20 y 100 veces en
respuesta a su inductor natural, el salicilato (Cebolla A y cols.,
J Biol Chem. 1997, 272:3986-92). Existen vectores
para establecer el sistema regulador de nahR/Psal en el
cromosoma de bacterias gram negativas mediante el uso de
minitrasposones. Igualmente se ha usado para expresar la proteína
de membrana externa LamB en la superficie de E. coli y
Pseudomonas putida (de Lorenzo V y cols., Gene 1993,
130:41-6, Cebolla A y cols., Appl Environ Microbiol.
1996, 62:214-2,0). Están disponibles también otros
sistemas de regulación inducibles por compuestos aromáticos, que
pueden ser a su vez activados por el ácido acetil salicílico. Es el
caso de XylS2, una variación mutante del regulador XylS que
reconoce y controla la expresión del operón meta en la ruta
catabólica del tolueno/xileno en Pseudomonas putida. Ésta
variante es capaz de reconocer el ácido acetil salicílico e inducir
la expresión unas 10 veces. La capacidad de regulación del sistema
de expresión nahR/Psal se puede a su vez aumentar de 7 a 20
veces (llegando por tanto a una inducción de 1000 veces) usando un
sistema de regulación en cascada donde se coloque el reguladores
xylS2/Pm aguas debajo de nahR/Psal, puesto que ambos
se activan simultáneamente por salicilato y/o el ácido acetil
salicílico (patente US2001016354).
Otros sistemas reguladores que responden a
salicilato son los sistemas derivados del represor MarR, y sus
promotores diana (Martin RG y Rosner JL, Proc Natl Acad Sci U S A.
1995, 92:5456-60; Sulavik MC y cols., Mol Med. 1995,
1:436-46). Estos promotores se inducen en presencia
de salicilato porque este inhibe la unión al operador. MarR
purificado exhibe una Kd de 0,5 mM hacia el salicilato (Martin RG y
Rosner JL, Proc Natl Acad Sci U S A. 1995,
92:5456-60). Los elementos reguladores de repuesta a
salicilato se han descrito ya en células eucarióticas,
especialmente en plantas donde el salicilato es la molécula
principal en el desencadenamiento de señales que promuevan la
resistencia sistémica adquirida. En plantas se han descrito al
menos 5 factores pueden interaccionar con el salicilato, incluyendo
quinasas, proteínas de unión a salicilato, etc. (Reymond P y cols.,
Curr Opin Plant Biol. 1998, 1:404-11). Parece ser
que derivados del salicilato, y particularmente el ácido acetil
salicílico, pueden usarse como inductores de la señal usando una
gran variedad de factores disponibles o bien modificaciones
artificiales del mismo (Ramos JL y cols., Proc Natl Acad Sci U S A.
1986, 83:8467-71., Cebolla A y cols., J Biol Chem.
1997, 272:3986-92).
Diversos sistemas reguladores han sido utilizados
como sistemas de expresión para la producción de proteínas
recombinantes inducidos por salicilatos o derivados, como por
ejemplo el sistema regulatorio nahR/Psal, otros reguladores de la
familia lysR/nahR, derivados del represor MarR y sus promotores
diana, o el sistema xylS2/Pm o derivados de la familia de
reguladores xylS/araC.
El problema a resolver por la presente invención,
es el proporcionar un método para controlar la expresión de genes
heterólogos en microorganismos que están asociados a células de
organismos superiores, usando un compuesto relativamente bien
tolerado.
La presente invención describe un método para el
control de la expresión de genes heterólogos en microorganismos que
están asociados a células de organismos superiores, incluyendo
humanos.
De modo que la presente invención, proporciona el
uso de secuencias de ADN que codifiquen reguladores que respondan
a salicilato, con el objetivo de controlar la expresión heteróloga
de genes en microbios cuando desarrollen algún tipo de asociación
con un organismo superior. Los compuestos químicos que activan el
sistema pueden ser transportados activa o pasivamente a través de
las membranas biológicas y así activar las cepas manipuladas
genéticamente incluso cuando se encuentran en el interior del
organismo superior. El sistema de control génico aquí descrito está
muy bien regulado mediante un compuesto químico, de forma que se
reduce el gasto metabólico ya que la acción del gen heterólogo es
nula cuando no se ha añadido inductor. Los compuestos químicos
usados en la invención como inductores son tanto el salicilato como
las moléculas derivadas de él, tales como el ácido acetil
salicílico o el benzoato. Estos compuestos se han probado para uso
en humanos y tienen una nivel de toxicidad bajo para aplicaciones
terapéuticas, y tienen parámetros farmacocinéticos y
farmacotoxicológicos bien definidos.
El sistema regulador se puede introducir en un
microorganismo por medio de plásmidos, o preferentemente mediante
el uso de vectores integrativos para asegurar la estabilidad del
genotipo (por ejemplo, Cebolla A y cols., Appl Environ Microbiol.
2002, 68:5034-41).
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, dicho método comprende un sistema regulador que puede
ser controlado por un inductor químico, un microorganismo huésped
que contiene el sistema regulador capaz de interaccionar o
asociarse con células de organismos superiores y uno o varios
compuestos químicos que actúa como inductor, el cual es salicilato
o un derivado de salicilato, el cual puede transportarse a través
del organismo superior asociado y activar o reprimir la expresión
de genes heterológos en el microorganismo huésped modificado.
De acuerdo con otro aspecto más preferido de la
presente invención, el compuesto químico inductor empleado es
salicilato, antranilato, 2-acetil salicilato,
4-cloro-salicilato,
5-cloro-salicilato,
3,5-dicloro-salicilato,
5-metoxi-salicilato, benzoato,
3-metil-benzoato,
2-metoxi-benzoato,
3-methyl-salicilato,
4-metil-salicilato, o
5-metil-salicilato o cualquier otro
derivado del salicilato que mantenga el grupo C-1
carboxílico en el anillo aromático o mezcla de estos.
Las células bacterianas mantendrían su viabilidad
y estado físico al tener silenciado la expresión de los genes
heterólogos. La administración del fármaco permitiría su inducción
cuando se quisiera activar la expresión de los genes heterólogos
por ella presentados incluso en células infectadas.
Según otro aspecto de la presente invención, el
sistema regulador comprende al menos una proteína reguladora que
pertenece a la familia de reguladores LysR/NahR.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, el sistema regulador comprende al menos una proteína
reguladora que pertenece a la familia de reguladores AraC/XylS.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, el sistema regulador comprende al menos una proteína
reguladora que pertenece a la familia de reguladores MarR.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, el sistema regulador comprende la familia de sistemas
reguladores nahR/Psal o mutantes de estos mismos
elementos.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, el sistema regulador comprende la familia de sistemas
reguladores xylS/Pm o mutantes de estos mismos.
Según otro aspecto de la presente invención, el
sistema regulador comprende un circuito genético en cascada que
comprende el regulador transcripcional NahR o una forma mutante de
este y el regulador transcripcional XylS o una forma mutante de
este, donde los reguladores transcripcionales están puestos en un
orden jerárquico tal que el regulador transcripcional NahR o una
forma mutante de este estimule la expresión del regulador
transcripcional XylS o una forma mutante de este y donde el
regulador transcriptional NahR o una forma mutante de este y el
regulador transcripcional XylS o una forma mutante de este
responden al mismo inductor, que en este caso se trata de
salicilato o derivados, y un promotor diana terminal el cual es
sensible de una forma dosis-dependiente al
regulador transcripcional XylS o una forma mutante de este.
Según una forma preferida de realización de la
presente invención, el microorganismo capaz de interaccionar o
asociarse con células de organismos superiores es un
procarionte.
Según una forma aún más preferida de realización
de la presente invención, se emplea células bacterianas
Gram-negativas.
De acuerdo con otra forma de realización más
preferida, el sistema genético se emplea en bacterias patógenas
atenuadas, como por ejemplo en bacterias del género
Salmonella, pudiendo inducirse una vez hospedada por la
célula eucariótica por concentraciones del compuesto químico
inductor dentro del rango de seguridad farmacológica.
De manera más específica, el método de la
presente invención permite controlar la expresión de proteínas
terapéuticas o proteínas de diagnóstico en una bacteria atenuada
asociada a células de organismos superiores.
La expresión de genes heterólogos en
microorganismos que están asociados a células de organismos
superiores, permite controlar la producción in situ de
biomoléculas para investigación así como controlar la liberación de
biofármacos, como por ejemplo controlar la expresión de antígenos o
proteínas antitumorales, gracias al tropismo de algunas bacterias
por ciertos tejidos u órganos, lo cual puede ser usado para
incrementar la concentración local de las proteínas recombinantes.
De modo que, de acuerdo con una realización preferida de la presente
invención, se proporciona un método de control de la expresión de
antígenos heterológos en una bacteria atenuada asociada con células
de organismos superiores para su uso como vacuna recombinante.
Bajo ciertas condiciones, es posible emplear
bacterias que presentan tropismo por células tumorales (Pawelek
et al., Cancer Res. 1997, 57: 4537-44; Low
et al. Nat. Biotechnol. 1999, 17: 3741; Neumunitis et
al., Cancer Gene Ther. 2003, 10: 737-44) para
programar la liberación de proteínas que inhiben el crecimiento de
células tumorales, donde aquellas proteínas pueden ser producidas
bajo el control del inductor químico que puede ser administrado en
intervalos regulares para optimizar la concentración local del
producto recombinante.
Según otro modo de realización preferido de la
presente invención, se proporciona un método de control de la
expresión de proteínas antitumorales heterólogas en una bacteria
atenuada asociada con células de organismos superiores, que
presente cierta afinidad por células tumorales de dicho organismo
superior.
Según otro modo aún más preferido, la proteína
antitumoral heteróloga consiste en una interleuquina, una
citoquina, una toxina, una proteína citotóxica o una proteína
antiangiogénesis.
La capacidad de salicilato y derivados de
atravesar a través de las membranas biológicas permite que el
sistema de expresión de proteínas heterólogas sea inducido por este
en el sitio de acción, que en la práctica es el lugar de
interacción entre la bacteria y la célula del organismo superior
hospedante.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por asociación entre un microorganismo con un organismo
superior a cualquier tipo de interacción del microorganismo con el
organismo superior, incluyendo simbiosis o patogénesis. De modo que
el sistema de control de la expresión génica descrito en la
presente invención, puede establecerse en microorganismos,
preferentemente en bacterias procariontes, y más concretamente en
bacterias Gram-negativas atenuadas, las cuales
pueden hospedarse o infectar células de organismos eucarióticos,
incluyendo
humanos.
humanos.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por derivados del salicilato a sustituciones simples de la
molécula de salicilato, incluyendo al menos una modificación del
esqueleto de salicilato. Se incluyen por ejemplo compuestos tales
como el benzoato (sustitución de -OH por -H) o el ácido acetil
salicílico (-O-COCH_{3} en lugar de -OH).
Vectores con sistemas reguladores que son
fuertemente regulados por salicilato o derivados y que pueden ser
integrados en el cromosoma bacteriano de modo estable han sido
previamente desarrollados (Cebolla et al., Appl. Environ.
Microbiol. 2002, 68: 5034-41).
La fuertemente regulada expresión de proteínas
tóxicas heterólogas por el microorganismo huésped, puede ser
empleada para eliminar selectivamente los organismos recombinantes
usados una vez que estos han realizado la función deseada, con el
fin de alterar la flora indígena lo menos posible. Por lo tanto, de
acuerdo con una realización preferida, las células bacterianas
pueden contener un gen regulatorio sensible a salicilato o
derivados y un promotor diana, el cual controla la expresión de un
gen suicida codificando un producto tóxico para la célula
hospedada, como por ejemplo una enzima de restricción, una toxina,
un péptido antibacteriano, etc. En este grupo de genes suicidas se
incluyen por ejemplo el sistema kis/kid (de la
Cueva-Mendez y cols. EMBO J 2003,
22:246-251), colE3 (Diaz y cols. Mol Microbiol 1994,
13:855-861), etc.
El método de control de la expresión de genes
heterológos en microorganismos que están asociados a células de
organismos superiores de acuerdo con la presente invención, puede
ser empleado para el estudio de los genes involucrados en la
patogénesis usando bacterias con fenotipos condicionales. La acción
del gen se puede encender o apagar en distintos estadios del
proceso biológico. Las necesidades de un gen en particular para un
determinado proceso se puede ensayar controlando la presencia del
inductor en un determinado estadio del proceso de asocia-
ción.
ción.
En otra realización preferida de la presente
invención, la población de un microorganismo dado en biorreactores,
tales como los fermentadores, pueden ser selectivamente eliminados
al añadir ácido acetil salicílico o una molécula equivalente. Éste
sistema puede de igual forma ser usado en terapia génica con el fin
de matar selectivamente células que pudieran ser selectivamente
infectadas con una bacteria o virus que produzca un producto tóxico
o una biomolécula capaz de disparar la apoptosis o cualquier otro
mecanismo de muerte celular, en las células malignas.
De acuerdo con la presente invención, el uso de
sistemas de expresión inducibles por derivados del salicilato para
matar selectivamente organismos recombinantes una vez han realizado
la función deseada, forma parte del ámbito de protección de la
misma. En un ambiente deseado, la muerte selectiva de los
microorganismos manipulados genéticamente sería desencadenada en el
ambiente con el fin de que la flora indígena fuera alterada lo
menos posible. Para lograr esto, las células contendrían un sistema
regulador de respuesta a derivados del salicilato y un promotor
diana, el cual controla la expresión de un gen suicida codificando
para una proteína tóxica (por ejemplo una enzima de restricción,
una toxina, péptido antibacteriano, etc.). Las células y bacterias
y los sistemas reguladores son bien el sistema regulador
nahR/Psal, bien la cascada nahR/Psal-xylS2/Pm.
Se dispone de un gen codificante para una toxina, por ejemplo la
bacteriocina colE3, una enzima de restricción como EcoRI, aguas
abajo de los promotores Psal, Pnah o Pm. Las
construcciones genéticas son introducidas e insertadas en el
cromosoma por recombinación (Datsenko KA Wanner BL, Proc Natl Acad
Sci U S A. 2000, 97:6640-5) o por transposición
usando un transposón mini Tn5 (Herrero M y cols., J Bacterial.
1990, 172:6557-67). Se usan marcadores antibióticos
que son escindibles (Datsenko KA y Wanner BL, Proc Natl Acad Sci U
S A. 2000, 97:6640-5) para seleccionar la inserción
en el cromosoma del sistema de suicidio controlable por derivados
salicílicos, pero dejar luego la cepa susceptible del uso del mismo
marcador de resistencia a kanamicina, pero además haciéndolo más
aceptable para su liberación al medio ambiente. De modo que puede
ser usado para controlar la muerte de vacunas vivas una vez el
tiempo requerido para su acción es
suficiente.
suficiente.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona el uso de una bacteria diseñada que
contiene el sistema regulador seleccionado del grupo consistente en
al menos una proteína reguladora que pertenezca a la familia de
LysR/NahR de reguladores, al menos una proteína reguladora que
pertenezca a la familia del AraC/XylS de reguladores, al menos una
proteína reguladora que pertenezca a la familia de reguladores de
MarR, al menos un sistema regulador nahR/Psal o mutantes de
los mismos elementos, al menos un sistema de expresión de
xylS/Pm o mutantes de los mismos elementos, un circuito
genético en cascada que comprende el regulador transcripcional NahR
o una forma mutante y el regulador del transcripcional XylS o una
forma del mutante, o una combinación de estos, en el método de
control de la expresión de genes heterólogos en dicha bacteria que
se asocia a células de organismos superiores. De modo preferente,
dichos genes heterólogos codifican para una proteína terapéutica o
de diagnóstico. En una realización preferida, dicha proteína
terapéutica es un antígeno, una proteína antitumoral o mezcla de
estos.
Por lo tanto, de acuerdo con una realización
preferida de la presente invención, ésta proporciona el uso de una
sistema regulador de la expresión de genes heterólogos en bacterias
asociadas a células tumorales de un organismo superior, donde dicho
sistema regulador es controlado por salicilato o derivados.
De igual forma, la presente invención va dirigida
también, al uso del sistema regulador de la expresión de genes
heterólogos en bacterias asociadas a células de organismos
superiores, para el control de la expresión de un antígeno
heterólogo como vacuna viva recombinante.
Figura
1
A) Curva dosis-repuesta de SL7207
4S2 portando distintas construcciones con Pm::trp'::'lacZ.
Las inducciones se realizaron en medio Luria Bertany a 30ºC. Tras
4 horas en presencia de distintas concentraciones de salicilato se
determinó la actividad enzimática en unidades Miller (cuadrados
para pWSK-trp'::'lacZ y triángulos para
pCAS-trp'::'lacZ. Los mismos resultados se
obtuvieron tras 6 horas de inducción.
B) Comparación en detalle entre los rangos de
inducción obtenidos tras inducir SL7207 4S2 con salicilato 2 mM
durante 4 horas (n=3, las barras de error representan la desviación
estándar). Aunque la producción total de
\beta-galactosidasa que se obtiene con pCAS-trp'::'lacZ es mayor, los bajos niveles basales de pWSK-trp'::'lacZ le confieren un rango de inducción 10 veces mayor.
\beta-galactosidasa que se obtiene con pCAS-trp'::'lacZ es mayor, los bajos niveles basales de pWSK-trp'::'lacZ le confieren un rango de inducción 10 veces mayor.
Figura
2
SL7207 4S2 infectando células HeLa expresando
\beta-galactosidasa tras la inducción con
salicilato o ácido acetil salicílico (2 mM). En A) podemos observar
los altos niveles basales que presenta SL7207 4S2
pCAS-trp'::'lacZ mientras que en D) los niveles
basales de pWSK-trp'::'lacZ son indetectables. Sin
embargo, se aprecian grandes diferencias en los niveles inducidos
entre ambos vectores, -de alto y bajo número de copias- B, E).
Además, el AAS y el salicilato inducen niveles comparables de
\beta-galactosidasa C, F).
Figura
3
Análisis por FACS de las células F1.A11
infectadas con SL7207 4S2 pWSK (A) o pWSK-GFP (B y
C). Tras la infección, los, cultivos celulares se indujeron con
salicilato 2 mM en el medio de cultivo durante 4 horas (A y C). Los
diagramas representan el número de células seleccionadas frente a
la fluorescencia obtenida por la GFP (FL1).
Figura
4
Análisis por FACS de una suspensión celular del
bazo obtenida de un ratón infectado con SL7207 4S2 pWSK (A) e
inducido intraperitonealmente con 2 mg de salicilato,
pWSK-GFP no inducido (B) o inducido (C). Los
diagramas representan el número de células seleccionadas frente a
la fluorescencia obtenida por la GFP (FL1).
Figura
5
Análisis por citometría de flujo de una
suspensión celular obtenida de los nódulos mesentéricos de ratones
previamente infectados con SL7207 4S2 pWSK (A), e inducidos
intraperitonealmente con 2 mg de salicilato,
pWSK-GFP pero no-inducido (B) o
inducido (C).
Figura
6
Incorporación de timidita tritiada por parte de
células T CD4+ obtenidas del bazo de ratones infectados oralmente
con 5xlOE8 SL7207 4S2 pWSK e inducidos (grupo 3),
pWSK-trp'::'lacZ pero no-inducido
(grupo 2) o pWSK-trp'::'lacZ e inducido (grupo
1).
Figura
7
Análisis por citometría de flujo de suspensiones
celulares de fibrosarcomas producidos subcutáneamente. Los ratones
que desarrollaron los tumores fueron infectados con SL2707 4S2 con
pWSK-GFP y fueron no-inducidos
(curva en gris) o inducidos intraperitonealmete con 2 mg de
salicilato (curva en blanco).
En los siguientes ejemplos prácticos se emplearon
los siguientes vectores pWSK-trp'::'lacZ,
pWSK-GFP, pCAS-trp'::'lacZ y
pCNB4S2, así como las estirpes bacterianas
S17-1\lambdapir, SL7207 y
SL7207-4S2.
El plasmido pCNB4S2, se describe en Cebolla A,
Sousa C, de Lorenzo V. Rational design of a bacterial
transcriptional cascade for amplifying gene expression capacity.
Nucleic Acids Res. 2001; 29(3):759-66.
El plásmido pCAS-trp'::'lacZ es
un derivado del vector pCAS (Active Motif, CA, EE. UU) que contiene
la fusión trp'::'lacZ promotor Pm. Siendo el vector pCAS un vector
de alto número de copias. El plásmido
pCAS-trp'::'lacZ se construye mediante una
inserción en el vector pCAS (Active Motif, CA, EE. UU) de un
fragmento EcoRI-HinDIII del vector
pTPM-lacZ (Cebolla A, Sousa C, de Lorenzo V.
Rational design of a bacterial transcriptional cascade for
amplifying gene expression capacity. Nucleic Acids Res.
2001;29(3):759-66.). Permite expresar la
proteína indicadora R-galactosidasa cuando se
induce con salicilato. Los niveles de expresión una vez inducido el
sistema son muy altos, ya que se trata de un plásmido de alto
número de copias.
Del mismo modo, el plásmido
pWSK-trp'::'lacZ es un vector de expresión basado
en el plásmido pWSK (Wang, R.F., Kushner, S.R. Construction of
versatile low-copy-number vectors
for cloning, sequencing and gene expression in Escherichia coli.
Gene. 100, 195-199 (1991)), sobre el que se
clonó un fragmento Pm-trp'::'lacZ, extraído de
pCAS-trp'::'lacZ mediante digestión con la enzima
NotI. Permite expresar la proteína indicadora
p-galactosidasa cuando se induce con salicilato.
Los niveles de expresión basales son muy bajos, dado que se trata
de un plásmido de bajo número de copias. Este tipo de plásmidos son
muy útiles para expresar proteínas en Salmonella
typhimurium.
\newpage
El plásmido pWSK-gfp es un vector
idéntico a pWSK-trp'::'lacZ pero donde se ha
sustituido el gen indicador trp'::'lacZ por el gen gfp, que hace
posible detectar niveles de expresión mediante la tecnología de
citometría de flujo. En definitiva, se utilizó este plásmido para
monitorizar la expresión de la proteína indicadora en los estudios
in vivo.
Las propiedades de la estirpe
S171-\lambdapir se describen en de Lorenzo V,
Cases I, Herrero M, Timmis KN. Early and late responses of TOL
promoters to pathway inducers: identification of postexponential
promoters in Pseudomonas putida with
lacZ-tet bicistronic reporters. J Bacteriol. 1993
Nov; 175(21):6902-7.
La estirpe atenuada de Salmonella
typhimurium SL7207 ha sido previamente utilizada como portadora
de vacunas en distintos experimentos (Darji A y cols., Cell. 1997,
91:765-75; Paglia P y cols., Blood. 1998,
92:3172-6; y Medina E y cols., Eur J Immunol. 1999,
29:693-9).
La estirpe Salmonella typhimurium
SL7207-4S2 es una variante derivada de SL7207,
resistente espontánea a rifampicina, genéticamente modificada
portando el modulo nahR/P_{sal}-xylS2 ligado a una
resistencia a kanamicina.
En éste ejemplo se usó la estirpe atenuada de
Salmonella typhimurium SL7207, previamente usada como
portadora de vacunas en distintos experimentos (Darji A y cols.,
Cell. 1997, 91:765-75; Paglia P y cols., Blood.
1998, 92:3172-6; y Medina E y cols., Eur J Immunol.
1999, 29:693-9). Se manipuló genéticamente la
estirpe para insertar en su cromosoma el módulo regulador del
circuito de amplificación en cascada descrito anteriormente en la
presente memoria. Éste trabajo muestra un método por el cual se
regula la sobreexpresión heteróloga de genes con ácido acetil
salicílico y salicilato como inductores en una bacteria capaz de
infectar células de mamífero.
Para probar el potencial de amplificación sobre
la expresión génica proporcionada por el circuito en cascada
dependiente de derivados salicílicos, el regulador
nahR/Psal::xylS2 se insertó en el cromosoma de SL7207 tal y
como se describe a continuación. Se uso un mutante espontáneo de
SL7207 resistente a rifampicina, como receptor de la conjugación
con S17-1\lambdapir pCNB4S2. La
conjugación se realizó en LB, citrato sódico 1% durante 3 horas a
30ºC. Los eventos de transposición se aislaron incubándolos una
noche en medio LB con rifampicina 20 \mug/mL, kanamicina 50
\mug/mL. Se tomaron las colonias sensibles a ampicilina (100
\mug/mL). La cepa resultante, SL7207 4S2 fue electroporada con
pCAS-trp'::'lacZ o pWSK-trp'::'lacZ.
Éstos plásmidos contienen la fusión trp'::'lacZ promotor Pm
en un vector de alto y bajo número de copias respectivamente. Se
crecieron cultivos a 37ºC y 150 rpm en LB ampicilina hasta llegar a
una DO660 de aproximadamente 0.3. Entonces se les añadió la
cantidad correspondiente de inductor y se volvieron a incubar a
37ºC hasta que se tomaron las mediadas de unidades Miller. Como se
observa en la figura 1ª, tanto el salicilato como el ácido acetil
salicílico inducen en igual medida el sistema independientemente
del plásmido que se use. Los resultados obtenidos en dos puntos (4
y 6 horas reinducción) fueron idénticos, mostrando que el sistema
estaba totalmente inducido tras las 4 horas.
Al reducir el número de copias del plásmido
marcador (Fig 1b), se obtuvieron niveles basales 10 veces menores
(4.384 + 388 vs 204 + 6 Unidades Miller, n=3) mientras que la
capacidad de inducción se mantuvo en su mayor parte. Una vez
inducido (2 mM salicilato), el efecto de amplificación sinérgica
del sistema de expresión permite al vector basado en pWSK alcanzar
actividades enzimáticas comparables al vector pCAS (36.792 + 798 vs
66.185 + 8.171 respectivamente. El rango de inducción de pWSK
mostró ser 10 veces mayor que el basado en pCAS (180 frente a 15).
Éstos resultados hicieron preferible usar SL7207
pWSK-trp'::'lacZ para los siguientes experimentos.
Dado que además se pudo apreciar inhibición del crecimiento con
concentraciones altas (5 mM) de ácido acetil salicílico, decidimos
usar 2 mM para entrar en detalle en experimentos in vitro
con cultivos celulares.
Las dosis terapéuticas de salicilato medidas en
plasma llegan a ser de 4,6 mM. Dado que podemos alcanzar niveles
de expresión comparables con 2 mM y 5 mM, decidimos usar la dosis
más alta para experimentos in vivo, dado que la vida media
descrita es de 2-4 horas. Así, dando una dosis única
de 5 mM obtendríamos al menos 4 horas de activación.
Éste ejemplo muestra cómo la expresión de la
\beta-galactosidasa puede ser controlada en
células bacterianas que estén infectando células de mamífero, todo
esto añadiendo derivados del salicilato. Se usaron SL4S2 portando
pWSK- trp'::'lacZ y pCAS- trp'::'lacZ para infectar células de
mamífero (Royo JL y cols., sometido) tal y como redescribe en las
siguientes líneas. Tanto células HeLa como los macrófagos J774.A1
se cultivaron en placas de 24 pocillos con medio DMEM, con
L-glutamina y suero fetal caprino al 10%. Los
cultivos celulares se incubaron a 37ºC, 6% CO_{2} hasta una
confluencia de casi el 80%. Los cultivos de Salmonella se
crecieron una noche a 37ºC, 15 m rpm en LB 0.3 M cloruro sódico, y
ampicilina 100 \mug/mL cuando fue necesario. Cada pocillo se
infectó con 10E6 bacterias, provenientes de un cultivo saturado y
fueron incubados a 37ºC y 6% CO_{2} 1 hora (J774A.1) o 2 horas
(HeLa). Las células se lavaron 3 veces con PBS antes de añadir
nuevo DMEM suplementado con gentamicina 50 \mug/mL para matar las
bacterias que quedaran en el exterior y ampicilina para evitar la
pérdida del plásmido. Cuando se requiso, se añadió también
salicilato o ácido acetil salicílico a una dosis final de 2 mM.
Tras 4 horas de incubación (37ºC, 6% CO_{2}), los cultivos
celulares se lavaron con PBS, se fijaron con paraformaldéhido al 2%
durante 20 minutos y se tiñeron con el kit de tinción de
\beta-gal (Roche) de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. La expresión de la
\beta-galactosidasa confirmó que tanto el
salicilato como el ácido acetil salicílico alcanzan el citoplasma
bacteriano. Una vez dentro de la célula, ambos inductores activan
la cascada de señales a niveles comparables (Figura 2b, 2c, 2d y
2f). Los niveles basales de pCAS- trp'::'lacZ se detectaron
fácilmente. Sin embargo, la actividad basal de lacZ producida desde
el vector de bajo número de copia resultó ser indetectable (Figura
2 a y 2d). Éstos experimentos mostraron que ambas moléculas pueden
difundir y llegar al citoplasma bacteriano activando así el sistema
de expresión. Además, el ambiente eucariótico no interfiere
significativamente con la sobreexpresión génica, probablemente
debido a que los componentes del sistema en cascada es activo en un
amplio rango de condiciones metabólicas. Aunque los mismos
resultados se observaron con macrófagos J774A.1, se observó algo de
muerte celular causada por la propia infección.
En este ejemplo se confirma la capacidad de
control de la expresión génica por salicilato y el sistema de
expresión en cascada usando la proteína verde fluorescente como gen
marcador. Para evitar una potencial barrera metabólica, se usó
SL7207 4S2 con pWSK-GFP para monitorizar la
expresión de la GFO in vitro. Se pudo realizar también un
experimento para caracterizar la expresión génica de SL7207 4S2 en
nuestra línea tumoral usada como modelo. F1.A11 es una línea
celular altamente tumorigénica y metastásica derivada de un
fibrosarcoma murino de la estirpe Balb/c. Las metástasis son
fáciles de localizar puesto que F1.A11 expresa y presenta la
\beta-galactosidasa como marcador tumoral (Paglia
P y cols., Blood. 1998, 92:3172-6 y referencias
interiores). Se infectaron con cultivos casi confluentes de
F1.A11.con SL7207 4S2 con pWSK-GFP o su
correspondiente vector vacío. La inducción se realizó tal y como
redescribe a continuación. Tras una inducción de 4 horas con 2 mM
de salicilato las células se recogieron, se lavaron y se analizaron
por citometría de flujo. En la figura 3 se representan eventos
celulares contados frente a la fluorescencia relativa (FL1) de
células infectadas en distintas condiciones. La fluorescencia varió
entre 11,72 (vector vacío) y 12,51 (infectadas con SL7207
pWSK-GFP). Cuando los cultivos fueron observados al
microscopio, no se observó GFP ni en el vector vacío ni en el
pWSK-GFP no inducido. Tras la adición de salicilato
a 2 mM (Figura 3c), la fluorescencia alcanzó 116,7 (10 veces
superior). Tomando los datos en conjunto, se consideró que SL7207
4S2 era un buen candidato para estudios más profundos.
En éste ejemplo, se usaron los circuitos de
respuesta a salicilato para controlar la expresión génica de
microbios infectando animales vivos. Se administró
intraperitonealmente (ip) 10E6 unidades formadoras de colonias (en
150 \mul de PBS) de la Salmonella atenuada y portando el
módulo del circuito en cascada (SL707 4S2 con
pWSK-GFP). 30 minutos tras la infección, se le
inyectaron 2 mg de salicilato bien por vía intravenosa (iv), bien
ip de forma que se alcanzaba 5 mM de salicilato. Tras 4 horas de
incubación, se sacrificaron los animales y se analizaron los
exudados peritoneales, bazos y nódulos linfáticos mesentéricos. Se
encontraron células altamente positivas para GFP en nódulo
mesentéricos (Figura 5) y bazo (Fig 4), cuando se comparó con los
no inducidos, o inducidos pero con el vector vacío. No se vieron
células positivas para GFP en los exudados peritoneales, revelando
bien una migración, bien la apoptosis de los macrófagos
peritoneales. Los resultados obtenidos fueron idénticos tanto si la
inducción fue ip como iv.
En éste ejemplo, se usó una cepa bacteriana
atenuada como vector para presentar antígenos heterólogos al
sistema inmune de ratón, de una forma condicional a la
administración de ácido acetil salicílico. Se puede desencadenar
una respuesta inmune de protección mediante el uso de distintas
estirpes atenuadas derivados de estirpes silvestres patógenas tales
como Salmonella enterica serovar Typha y
typhimurium (S. Typha y S. typhimurium). En
éstos experimentos, se inmunizó a los ratones con 5x10E8 SL7207
4S2 portando el plásmido pWSK o el pWSK-trp'::'lacZ.
12 horas tras la inmunización, se administraron ip 2 mg de
salicilato. Se les dio iguales dosis de salicilato los días 7 y 14
posteriores al desafío. Dos semanas tras la ultima inducción, se
sacrificaron los animales. Se realizaron ensayos de proliferación
con las células de bazo. En la figura 6 se muestra que la
reestipulación in vitro de las células CD4+ T tras la
adición de \beta-galactosidasa pura resultó ser
significativamente distinta entre los ratones inducidos y los lo
inducidos. Éste experimento confirmó que SL7207 4S2 activó los
módulos nahR/Psal y xy1S2/Pm promoviendo así la expresión de
la \beta-galactosidasa. Ésta señal podría por lo
tanto modular la respuesta inmune en ratones de una manera
condicional.
En éste ejemplo, se midió cómo el tropismo de
ciertos microbios hacia los tumores u otro tipo de tejido enfermo
puede ser usado para la liberación de forma controlada de la
expresión proteica. Este ejemplo, muestra la posibilidad de
concentrar la expresión proteica en células donde las proteínas
terapéuticas se pudieran producir tras la administración de ácido
acetil salicílico. Los tumores se generaron mediante una inyección
subcutánea de 10E4 células F1.A11, en el flanco inferior izquierdo
de ratones hembras de la estirpe Balb/c con 9 semanas de edad.
Cuando los tumores fueron palpables (100-200 mg),
se administraron intraparenteral de 10E6 unidades formadoras de
colonia de SL7207 4S2 con pWSK-GFP y su
correspondiente vector vacío. En día +4, los ratones se dividieron
en distintos grupos. Algunos fueron tratados con una dosis de 5 mM
de salicilato iv/ip, y otros se mantuvieron como controles sin
inducir. Cuatro horas tras la inducción se sacrificaron los
animales y se separaron asépticamente tanto bazo, ganglios
mesentéricos como los propios tumores para realizar los análisis.
Las suspensiones celulares de tumores independientes que habían
sido tratados con salicilato, mostraron un fenotipo positivo en FL1
(Fig 7). Las células en una ventana de FL1 > 10E2 pasaron de 11
a 39-48%, mostrando un comportamiento paralelo a
como ocurrían las infecciones in vitro. Otros tumores se
fijaron y tiñeron para ver la presencia de SL7207 4S2. Los órganos
se pesaron, homogeneizaron y resuspendieron en PBS estéril antes
de sembrarse. En algunos ensayos, las relaciones variaban entre 4:1
a 850:1, de acuerdo con lo descrito previamente como tropismo
positivo (Pawelek JM y cols., Cancer Res. 1997 Oct;
57:4537-44; Low KB y cols., Nat Biotechnol. 1999,
17:37-41; y Neumunaitis J y cols., Cancer Gene
Ther. 2003; 10:737-44). Por otro lado, y sin contar
la alta expresión de GFP localizada en el tumor, no se observó
tropismo en varios ratones. Esta observación fue descrita
previamente y puede ser debida a la distinta naturaleza de las
líneas tumorigénicas, el fondo genético de los ratones, la estirpe
de Salmonella usada o simplemente a variaciones estocásticas
atribuidas a fenómeno de progresión tumoral.
Claims (27)
1. Un método para controlar la expresión de genes
heterólogos en microorganismos que están asociados a células de
organismos superiores caracterizado porque comprende:
- a.
- un sistema regulador que puede ser controlado por un efector químico;
- b.
- un microorganismo huésped que contiene el sistema regulador capaz de interaccionar o asociarse con células de organismos superiores;
- c.
- un compuesto químico efector que es salicilato o un derivado de salicilato y que puede transportarse a través del organismo superior asociado y activar o reprimir la expresión del microorganismo huésped modifi- cado.
2. El método según la reivindicación 1
caracterizado porque al menos una de las proteínas
reguladoras es controlada por salicilato, antranilato,
2-acetil-salicilato,
4-cloro-salicilato,
5-cloro-salicilato,
3,5-dicloro-salicilato,
5-metoxi-salicilato, benzoato,
3-metil-benzoato,
2-metoxi-benzoato,
3-metil-salicilato,
4-metil-salicilato, o
5-metil-salicilato, cualquier otro
derivado del salicilato que mantenga el grupo C-1
carboxílico en el anillo aromático o mezcla de
estos.
estos.
3. El método según la reivindicación 2
caracterizado porque el sistema regulador comprende al menos
una proteína reguladora que pertenece a la familia LysR/NahR de
reguladores.
4. El método según la reivindicación 2
caracterizado porque el sistema regulador comprende al menos
un derivado de la familia de reguladores XylS/AraC.
5. El método según la reivindicación 2
caracterizado porque el sistema regulador comprende una
proteína reguladora que pertenece a la familia del MarR de
reguladores.
6. El método según la reivindicación 2
caracterizado porque el sistema regulador consta de un
sistema de expresión de nahR/Psal o mutantes de estos mismos
elementos.
7. El método según la reivindicación 2
caracterizado porque el sistema regulador comprende un
sistema de expresión de xylS/Pm o mutantes de los mismos
elementos capaz de responder a cualquiera de los compuestos
químicos de reivindicación 2.
8. El método según la reivindicación 2
caracterizado porque el sistema regulador comprende un
circuito genético en cascada caracterizado porque
comprende:
- a.
- el regulador transcripcional NahR o una forma mutante de este y el regulador transcripcional XylS o una forma mutante de este;
- donde los reguladores transcripcionales están puestos en un orden jerárquico tal que el regulador transcriptional NahR o una forma mutante de este estimule la expresión del regulador transcripcional XylS o una forma mutante de este y;
- donde el regulador transcriptional NahR o una forma mutante de este y el regulador transcripcional XylS o una forma mutante de este responden al mismo inductor;
- b.
- un promotor diana terminal;
- donde dicho promotor diana terminal está caracterizado porque es sensible de una forma dosis-dependiente al regulador transcripcional XylS o una forma mutante de este.
9. Un método según la reivindicación 1
caracterizado porque la célula capaz asociarse con
organismos superiores y que contiene el sistema regulador de la
expresión de genes heterólogos es una célula procariótica.
10. Un método según la reivindicación 9
caracterizado porque la célula procariótica es una célula
bacteriana Gram-negativa.
11. Un método según la reivindicación 10
caracterizado porque la célula bacteriana
Gram-negativa es una bacteria del genero
Salmonella.
12. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 9 a 11 desarrollado para controlar la
expresión de proteínas terapéuticas o una proteína de diagnóstico
en una bacteria atenuada asociada a células de organismos
superiores.
13. Un método según la reivindicación 12 para
controlar la expresión de un antígeno heterólogo en una bacteria
atenuada asociada con células de organismos superiores, para su uso
como una vacuna viva recombinante.
14. Un método según la reivindicación 12 para
controlar la expresión de por lo menos una proteína antitumoral en
una bacteria atenuada que se asocie con las células de organismos
superiores, la cual presenta cierto tropismo por células tumorales
de dicho organismo superior.
15. El método según la reivindicación 14
caracterizado por que la proteína antitumoral se selecciona
del grupo consistente en una interleuquina, una citoquina, una
toxina, una proteína citotóxica o una proteína antiangio-
génica.
génica.
16. El método según la reivindicación 9
caracterizado porque la bacteria además contiene un sistema
regulador sensible a salicilato o derivados y un promotor diana, el
cual controla la expresión de un gen suicida codificando un
producto tóxico para la célula hospedada.
17. Uso del método de acuerdo con la
reivindicación 9, para el estudio de los genes involucrados en la
patogénesis usando bacterias con fenotipos condicionales.
18. Uso del método de acuerdo con la
reivindicación anterior 16, para la eliminación selectiva de
microorganismos en biorreactores.
19. Uso del método de acuerdo con la
reivindicación anterior 16, para la eliminación selectiva de
células que pudieran ser selectivamente infectadas con una
bacteria o virus que produzca un producto tóxico o una biomolécula
capaz de disparar la apoptosis o cualquier otro mecanismo de muerte
celular en las células malignas.
20. Un método para controlar la expresión de
proteínas terapéuticas heterólogas o proteínas de diagnóstico
heterólogas en microorganismos que están asociados a células de
organismos superiores caracterizado porque
comprende:
comprende:
- a.
- disponer de una célula bacteriana que contiene un sistema regulador que puede ser controlado por salicilato o derivados como efector químico, la cual se asocia de modo específico a células de un organismo superior;
- b.
- inducir la expresión de dichas proteínas terapéuticas heterólogas o proteínas de diagnóstico heterólogas mediante la administración de salicilato o derivados al organismo superior hospedante de la célula modificada.
21. Método de acuerdo con la reivindicación
anterior 20, caracterizado porque el sistema regulador se
selecciona entre el grupo formado por al menos una proteína
reguladora que pertenezca a la familia del LysR/NahR de
reguladores, al menos un derivado de la familia de reguladores
XylS/AraC, al menos una proteína reguladora que pertenezca a la
familia de reguladores de MarR, al menos un sistema regulador
nahR/Psal o mutantes de los mismos elementos, al menos un
sistema de expresión de xylS/Pm o mutantes de los mismos
elementos, un circuito genético en cascada que comprende el
regulador transcripcional NahR o una forma mutante y el regulador
del transcripcional XylS o una forma del mutante, o una combinación
de estos.
22. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 20 a 21, caracterizado porque
dicha proteína terapéutica heteróloga es un antígeno heterólogo,
una proteína antitumoral o mezcla de estos.
23. Uso de un sistema regulador de la expresión
de genes heterólogos en bacterias asociadas a células tumorales de
un organismo superior, el cual es controlado por salicilato o
derivados, para controlar la expresión de por lo menos una proteína
antitumoral.
24. Uso de acuerdo con la reivindicación anterior
23, caracterizado porque la proteína antitumoral expresada
se selecciona del grupo consistente en una interleuquina, una
citoquina, una toxina, una proteína citotóxica o una proteína
antiangiogénesis.
25. Uso de un sistema regulador de la expresión
de genes heterólogos en bacterias asociadas a células de un
organismo superior, el cual es controlado por salicilato o
derivados, para controlar la expresión de un antígeno heterólogo,
para su uso como una vacuna viva recombinante.
26. Uso de un sistema regulador de la expresión
de genes heterólogos en bacterias asociadas a células de un
organismo superior, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 23 a 25, caracterizado porque
dicho sistema regulador se selecciona del grupo consistente en al
menos una proteína reguladora que pertenezca a la familia de
reguladores LysR/NahR, al menos un derivado de la familia de
reguladores XylS/AraC, al menos una proteína reguladora que
pertenezca a la familia de reguladores MarR, al menos un sistema
regulador nahR/Psal o mutantes de los mismos elementos, al
menos un sistema regulador xylS/Pm o mutantes de los mismos
elementos, una cascada circuito genético que comprende el regulador
transcripcional NahR o una forma mutante y el regulador del
transcripcional XylS o una forma del mutante, o una combinación de
estos.
27. Uso de una bacteria modificada que contiene
el sistema regulador seleccionado del grupo consistente en al
menos una proteína reguladora que pertenezca a la familia del
LysR/NahR de reguladores, al menos un derivado de la familia de
reguladores XylS/AraC, al menos una proteína reguladora que
pertenezca a la familia de reguladores de MarR, al menos un sistema
regulador nahR/Psal o mutantes de los mismos elementos, al menos
un sistema de expresión de xylS/Pm o mutantes de los mismos
elementos, una cascada circuito genético que comprende el regulador
transcripcional NahR o una forma mutante y el regulador del
transcripcional XylS o una forma del mutante, o una combinación de
estos, en el método de control de la expresión de genes heterólogos
en microorganismos que se asocian a las células de organismos
superiores según reivindicación 1.
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| ES200302867A ES2260985B1 (es) | 2003-12-04 | 2003-12-04 | Procedimiento de regulacion de la expresion de proteinas heterologas controladas por derivados salicilicos en microorganismos asociados a organismos superiores. |
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