ES2260985A1 - Procedimiento de regulacion de la expresion de proteinas heterologas controladas por derivados salicilicos en microorganismos asociados a organismos superiores. - Google Patents
Procedimiento de regulacion de la expresion de proteinas heterologas controladas por derivados salicilicos en microorganismos asociados a organismos superiores.Info
- Publication number
- ES2260985A1 ES2260985A1 ES200302867A ES200302867A ES2260985A1 ES 2260985 A1 ES2260985 A1 ES 2260985A1 ES 200302867 A ES200302867 A ES 200302867A ES 200302867 A ES200302867 A ES 200302867A ES 2260985 A1 ES2260985 A1 ES 2260985A1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- expression
- salicylate
- cells
- protein
- regulatory
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 86
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 24
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims description 58
- 229960001860 salicylate Drugs 0.000 claims abstract description 54
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M salicylate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C([O-])=O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 53
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 36
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000010415 tropism Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 63
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 24
- 101100186375 Pseudomonas putida nahR gene Proteins 0.000 claims description 18
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 15
- 150000003873 salicylate salts Chemical group 0.000 claims description 13
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 9
- 101000972324 Cynodon dactylon Leaf protein Proteins 0.000 claims description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 101150093896 xylS gene Proteins 0.000 claims description 7
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 6
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 6
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 6
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 3
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 claims description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 claims description 3
- CNJGWCQEGROXEE-UHFFFAOYSA-M 2-carboxy-4,6-dichlorophenolate Chemical compound OC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1C([O-])=O CNJGWCQEGROXEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- DLGBEGBHXSAQOC-UHFFFAOYSA-M 2-carboxy-4-methylphenolate Chemical compound CC1=CC=C(O)C(C([O-])=O)=C1 DLGBEGBHXSAQOC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- WHSXTWFYRGOBGO-UHFFFAOYSA-N 3-methylsalicylic acid Chemical compound CC1=CC=CC(C(O)=O)=C1O WHSXTWFYRGOBGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LWXFCZXRFBUOOR-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-2-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1O LWXFCZXRFBUOOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NJESAXZANHETJV-UHFFFAOYSA-N 4-methylsalicylic acid Chemical compound CC1=CC=C(C(O)=O)C(O)=C1 NJESAXZANHETJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NKBASRXWGAGQDP-UHFFFAOYSA-M 5-chlorosalicylate Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C=C1C([O-])=O NKBASRXWGAGQDP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- IZZIWIAOVZOBLF-UHFFFAOYSA-N 5-methoxysalicylic acid Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 IZZIWIAOVZOBLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ILUJQPXNXACGAN-UHFFFAOYSA-M O-methylsalicylate Chemical compound COC1=CC=CC=C1C([O-])=O ILUJQPXNXACGAN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003527 anti-angiogenesis Effects 0.000 claims description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000010304 firing Methods 0.000 claims description 2
- GPSDUZXPYCFOSQ-UHFFFAOYSA-M m-toluate Chemical compound CC1=CC=CC(C([O-])=O)=C1 GPSDUZXPYCFOSQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 2
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims 3
- GNYWBJRDQHPSJL-UHFFFAOYSA-N 6-acetyl-6-hydroxycyclohexa-2,4-diene-1-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)C1(O)C=CC=CC1C(O)=O GNYWBJRDQHPSJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 18
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 17
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 16
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 9
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 101100541097 Pseudomonas putida xylS2 gene Proteins 0.000 description 5
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 3
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 241000233948 Typha Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 2
- MOMFXATYAINJML-UHFFFAOYSA-N 2-Acetylthiazole Chemical group CC(=O)C1=NC=CS1 MOMFXATYAINJML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-FOQJRBATSA-N 59096-14-9 Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1[14C](O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-FOQJRBATSA-N 0.000 description 1
- 241000607620 Aliivibrio fischeri Species 0.000 description 1
- 101100002068 Bacillus subtilis (strain 168) araR gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101100236334 Escherichia coli (strain K12) lysR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940068372 acetyl salicylate Drugs 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150044616 araC gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- BABWHSBPEIVBBZ-UHFFFAOYSA-N diazete Chemical compound C1=CN=N1 BABWHSBPEIVBBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- -1 other antibiotics Chemical class 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical group OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000031068 symbiosis, encompassing mutualism through parasitism Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002034 xenobiotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Procedimiento de regulación de la producción de proteínas heterólogas controlada por derivados del ácido salicílico en microorganismos asociados a organismos superiores. La presente invención describe un método por el cual se puede controlar la expresión de proteínas heterólogas en microorganismos usando un sistema de expresión controlado por salicilato o derivados. El sistema genético puede usarse en bacterias patógenas atenuadas pudiendo inducirse una vez hospedada por la célula eucariótica por concentraciones dentro del rango de seguridad farmacológica. El tropismo de algunas bacterias por ciertos tejidos u órganos permitirá controlar la producción in situ de biomoléculas para investigación así como sistema de liberación controlada de biofármacos, por ejemplo controlar la expresión de antígenos o proteínas antitumorales.
Description
Procedimiento de regulación de la expresión de
proteínas heterólogas controladas por derivados salicílicos en
microorganismos asociados a organismos superiores.
La presente invención se engloba dentro del campo
de la ingeniería genética. Más concretamente, la presente
invención se relaciona con la manipulación de la expresión génica en
bacterias cuando estas están asociadas a células de organismos
superiores, empleando compuestos químicos como inductores de dicha
expresión de genes heterólogos.
Para las aplicaciones biotecnológicas in
situ de organismos recombinantes vivos, la expresión génica en
los microorganismos ha de estar fuertemente regulada con el fin de
evitar un gran desgaste metabólico innecesario (Glick BR. Biotechnol
Adv. 1995,13-217-61). El ambiente y
la flora intestinal pueden llegar a ejercer una fuerte presión
selectiva en contra de las cepas que expresen constitutivamente
genes heterólogos. Incluso en cultivos puros, los mutantes de baja
expresión son capaces de dominar el cultivo en tan solo unas pocas
docenas de generaciones. La expresión de los genes heterólogos debe
permanecer silenciada hasta que se desee su activación. La señal
inductora debe ser específica especialmente en ambientes complejos,
con el fin de evitar la sobre-expresión en vano de
los genes de interés. Se pueden usar dos alternativas para diseñar
un correcto control de los genes heterólogos: i) Promotores
regulados por condiciones ambientales, donde la señal ambiental
coincide con el lugar de acción. ii) Promotores inducibles
químicamente donde el compuesto es añadido en el momento y lugar
donde se requiera la actividad. Esta última opción es la elegida
preferentemente. Por ejemplo, uno puede manipular un fenotipo de un
organismo dado a través de la adición de un compuesto químico y así
controlar de forma tanto positiva como negativa la aparición de
dicho
fenotipo.
fenotipo.
Para aplicaciones biotecnológicas, un inductor
químico ideal requiere una serie de características: 1) el inductor
debe ser lo suficientemente barato como para ser usado en altas
cantidades. 2) Debe ser compatible con el medio ambiente y/o
biodegradable. 3) El inductor debe ser capaz de atravesar las
diversas membranas celulares si la inducción debe tener lugar en
bacterias endocitadas, o en general, bacterias hospedadas por un
organismo superior.
4) Para bacterias hospedadas en organismos superiores, los posibles efectos farmacológicos sobre el sistema deben ser minimizados, o deben tener efectos toxicológicos relativamente bajos.
4) Para bacterias hospedadas en organismos superiores, los posibles efectos farmacológicos sobre el sistema deben ser minimizados, o deben tener efectos toxicológicos relativamente bajos.
Los sistemas regulatorios predominantes capaces
de controlar efectivamente la expresión génica por inductores
químicos son los sistemas lacI/lac, tanto en células
procariontes como en eucariontes (Gossen M y cols., Trends Biochem
Sci. 1993,18:471-5). Estos sistemas basados en el
operón de la lactosa tienen inductores fisiológicos que pueden ser
rápidamente metabolizados, como por ejemplo lactosa, o no
catabolizables como por ejemplo IPTG, del que se sospecha puede
producir efectos toxicológicos en células de mamífero.
La tetraciclina, al igual que otros antibióticos,
ha sido utilizada como un inductor químico efectivo tanto en
células procariontes como eucariontes. Este sistema consiste en
promotores fuertes que son reprimidos por el regulador sensible a
tetraciclina TetR. Uno de los mayores problemas que se plantean es
el uso de moléculas antibióticas para la inducción.
En Cebolla y cols. (Appl. Environ. Microbiol.
2002, 68: 5034-41 y J. Biol. Chem. 1997, 272:
3986-92), se describieron sistemas regulatorios de
compuestos xenobióticos capaces de ser activados por diversos
derivados de salicilato, incluyendo uno de los mejor conocidos
fármacos del mercado, ácido acetilsalicílico (ASA). ASA es un
inductor que cumpliría con todos los requerimientos para ser un
inductor químico ideal para el control químico in situ de la
expresión génica heteróloga.
Los factores que controlan la ruta de degradación
del naftaleno, la proteína NahR y sus promotores diana Psal
y Pnah, han sido utilizados para expresar diversos genes
heterólogos en distintas estirpes bacterianas, incluyendo E.
coli (Cebolla A y cols., Nucleic Acids Res. 2001,
29:759-66), Bordetella (Suarez A y cols.,
Appl Environ Microbiol. 1997, 63:122-7.) y
Pseudomonas (Cebolla A y cols., Nucleic Acids Res. 2001,
29:759-66). El sistema regulador nahR/Psal
se ha usado también como biosensor, al ser fusionado al operón
lux de Vibrio fischeri (Burlage RS y cols.,
Bacteriol. 1990,172:4749-571), y ha sido de igual
forma usado como sistema de producción de proteínas recombinantes
(de Lorenzo V y cols., Gene. 1993, 130:41-6). Se ha
demostrado que el sistema nahR/Psal está finamente regulado,
mostrando una capacidad de inducción de entre 20 y 100 veces en
respuesta a su inductor natural, el salicilato (Cebolla A y cols.,
J Biol Chem. 1997, 272:3986-92). Existen vectores
para establecer el sistema regulador de nahR/Psal en el
cromosoma de bacterias gram negativas mediante el uso de
minitrasposones. Igualmente se ha usado para expresar la proteína
de membrana externa LamB en la superficie de E. coli y
Pseudomonas putida (de Lorenzo V y cols., Gene 1993,
130:41-6, Cebolla A y cols., Appl Environ Microbiol.
1996, 62:214-2,0). Están disponibles también otros
sistemas de regulación inducibles por compuestos aromáticos, que
pueden ser a su vez activados por el ácido acetil salicílico. Es el
caso de XylS2, una variación mutante del regulador XylS que
reconoce y controla la expresión del operón meta en la ruta
catabólica del tolueno/xileno en Pseudomonas putida. Ésta
variante es capaz de reconocer el ácido acetil salicílico e inducir
la expresión unas 10 veces. La capacidad de regulación del sistema
de expresión nahR/Psal se puede a su vez aumentar de 7 a 20
veces (llegando por tanto a una inducción de 1000 veces) usando un
sistema de regulación en cascada donde se coloque el reguladores
xylS2/Pm aguas debajo de nahR/Psal, puesto que ambos
se activan simultáneamente por salicilato y/o el ácido acetil
salicílico (patente US2001016354).
Otros sistemas reguladores que responden a
salicilato son los sistemas derivados del represor MarR, y sus
promotores diana (Martin RG y Rosner JL, Proc Natl Acad Sci U S A.
1995, 92:5456-60; Sulavik MC y cols., Mol Med. 1995,
1:436-46). Estos promotores se inducen en presencia
de salicilato porque este inhibe la unión al operador. MarR
purificado exhibe una Kd de 0,5 mM hacia el salicilato (Martin RG y
Rosner JL, Proc Natl Acad Sci U S A. 1995,
92:5456-60). Los elementos reguladores de repuesta a
salicilato se han descrito ya en células eucarióticas,
especialmente en plantas donde el salicilato es la molécula
principal en el desencadenamiento de señales que promuevan la
resistencia sistémica adquirida. En plantas se han descrito al
menos 5 factores pueden interaccionar con el salicilato, incluyendo
quinasas, proteínas de unión a salicilato, etc. (Reymond P y cols.,
Curr Opin Plant Biol. 1998, 1:404-11). Parece ser
que derivados del salicilato, y particularmente el ácido acetil
salicílico, pueden usarse como inductores de la señal usando una
gran variedad de factores disponibles o bien modificaciones
artificiales del mismo (Ramos JL y cols., Proc Natl Acad Sci U S A.
1986, 83:8467-71., Cebolla A y cols., J Biol Chem.
1997, 272:3986-92).
Diversos sistemas reguladores han sido utilizados
como sistemas de expresión para la producción de proteínas
recombinantes inducidos por salicilatos o derivados, como por
ejemplo el sistema regulatorio nahR/Psal, otros reguladores de la
familia lysR/nahR, derivados del represor MarR y sus promotores
diana, o el sistema xylS2/Pm o derivados de la familia de
reguladores xylS/araC.
El problema a resolver por la presente invención,
es el proporcionar un método para controlar la expresión de genes
heterólogos en microorganismos que están asociados a células de
organismos superiores, usando un compuesto relativamente bien
tolerado.
La presente invención describe un método para el
control de la expresión de genes heterólogos en microorganismos que
están asociados a células de organismos superiores, incluyendo
humanos.
De modo que la presente invención, proporciona el
uso de secuencias de ADN que codifiquen reguladores que respondan
a salicilato, con el objetivo de controlar la expresión heteróloga
de genes en microbios cuando desarrollen algún tipo de asociación
con un organismo superior. Los compuestos químicos que activan el
sistema pueden ser transportados activa o pasivamente a través de
las membranas biológicas y así activar las cepas manipuladas
genéticamente incluso cuando se encuentran en el interior del
organismo superior. El sistema de control génico aquí descrito está
muy bien regulado mediante un compuesto químico, de forma que se
reduce el gasto metabólico ya que la acción del gen heterólogo es
nula cuando no se ha añadido inductor. Los compuestos químicos
usados en la invención como inductores son tanto el salicilato como
las moléculas derivadas de él, tales como el ácido acetil
salicílico o el benzoato. Estos compuestos se han probado para uso
en humanos y tienen una nivel de toxicidad bajo para aplicaciones
terapéuticas, y tienen parámetros farmacocinéticos y
farmacotoxicológicos bien definidos.
El sistema regulador se puede introducir en un
microorganismo por medio de plásmidos, o preferentemente mediante
el uso de vectores integrativos para asegurar la estabilidad del
genotipo (por ejemplo, Cebolla A y cols., Appl Environ Microbiol.
2002, 68:5034-41).
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, dicho método comprende un sistema regulador que puede
ser controlado por un inductor químico, un microorganismo huésped
que contiene el sistema regulador capaz de interaccionar o
asociarse con células de organismos superiores y uno o varios
compuestos químicos que actúa como inductor, el cual es salicilato
o un derivado de salicilato, el cual puede transportarse a través
del organismo superior asociado y activar o reprimir la expresión
de genes heterológos en el microorganismo huésped modificado.
De acuerdo con otro aspecto más preferido de la
presente invención, el compuesto químico inductor empleado es
salicilato, antranilato, 2-acetil salicilato,
4-cloro-salicilato,
5-cloro-salicilato,
3,5-dicloro-salicilato,
5-metoxi-salicilato, benzoato,
3-metil-benzoato,
2-metoxi-benzoato,
3-methyl-salicilato,
4-metil-salicilato, o
5-metil-salicilato o cualquier otro
derivado del salicilato que mantenga el grupo C-1
carboxílico en el anillo aromático o mezcla de estos.
Las células bacterianas mantendrían su viabilidad
y estado físico al tener silenciado la expresión de los genes
heterólogos. La administración del fármaco permitiría su inducción
cuando se quisiera activar la expresión de los genes heterólogos
por ella presentados incluso en células infectadas.
Según otro aspecto de la presente invención, el
sistema regulador comprende al menos una proteína reguladora que
pertenece a la familia de reguladores LysR/NahR.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, el sistema regulador comprende al menos una proteína
reguladora que pertenece a la familia de reguladores AraC/XylS.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, el sistema regulador comprende al menos una proteína
reguladora que pertenece a la familia de reguladores MarR.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, el sistema regulador comprende la familia de sistemas
reguladores nahR/Psal o mutantes de estos mismos
elementos.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, el sistema regulador comprende la familia de sistemas
reguladores xylS/Pm o mutantes de estos mismos.
Según otro aspecto de la presente invención, el
sistema regulador comprende un circuito genético en cascada que
comprende el regulador transcripcional NahR o una forma mutante de
este y el regulador transcripcional XylS o una forma mutante de
este, donde los reguladores transcripcionales están puestos en un
orden jerárquico tal que el regulador transcripcional NahR o una
forma mutante de este estimule la expresión del regulador
transcripcional XylS o una forma mutante de este y donde el
regulador transcriptional NahR o una forma mutante de este y el
regulador transcripcional XylS o una forma mutante de este
responden al mismo inductor, que en este caso se trata de
salicilato o derivados, y un promotor diana terminal el cual es
sensible de una forma dosis-dependiente al
regulador transcripcional XylS o una forma mutante de este.
Según una forma preferida de realización de la
presente invención, el microorganismo capaz de interaccionar o
asociarse con células de organismos superiores es un
procarionte.
Según una forma aún más preferida de realización
de la presente invención, se emplea células bacterianas
Gram-negativas.
De acuerdo con otra forma de realización más
preferida, el sistema genético se emplea en bacterias patógenas
atenuadas, como por ejemplo en bacterias del género
Salmonella, pudiendo inducirse una vez hospedada por la
célula eucariótica por concentraciones del compuesto químico
inductor dentro del rango de seguridad farmacológica.
De manera más específica, el método de la
presente invención permite controlar la expresión de proteínas
terapéuticas o proteínas de diagnóstico en una bacteria atenuada
asociada a células de organismos superiores.
La expresión de genes heterólogos en
microorganismos que están asociados a células de organismos
superiores, permite controlar la producción in situ de
biomoléculas para investigación así como controlar la liberación de
biofármacos, como por ejemplo controlar la expresión de antígenos o
proteínas antitumorales, gracias al tropismo de algunas bacterias
por ciertos tejidos u órganos, lo cual puede ser usado para
incrementar la concentración local de las proteínas recombinantes.
De modo que, de acuerdo con una realización preferida de la presente
invención, se proporciona un método de control de la expresión de
antígenos heterológos en una bacteria atenuada asociada con células
de organismos superiores para su uso como vacuna recombinante.
Bajo ciertas condiciones, es posible emplear
bacterias que presentan tropismo por células tumorales (Pawelek
et al., Cancer Res. 1997, 57: 4537-44; Low
et al. Nat. Biotechnol. 1999, 17: 3741; Neumunitis et
al., Cancer Gene Ther. 2003, 10: 737-44) para
programar la liberación de proteínas que inhiben el crecimiento de
células tumorales, donde aquellas proteínas pueden ser producidas
bajo el control del inductor químico que puede ser administrado en
intervalos regulares para optimizar la concentración local del
producto recombinante.
Según otro modo de realización preferido de la
presente invención, se proporciona un método de control de la
expresión de proteínas antitumorales heterólogas en una bacteria
atenuada asociada con células de organismos superiores, que
presente cierta afinidad por células tumorales de dicho organismo
superior.
Según otro modo aún más preferido, la proteína
antitumoral heteróloga consiste en una interleuquina, una
citoquina, una toxina, una proteína citotóxica o una proteína
antiangiogénesis.
La capacidad de salicilato y derivados de
atravesar a través de las membranas biológicas permite que el
sistema de expresión de proteínas heterólogas sea inducido por este
en el sitio de acción, que en la práctica es el lugar de
interacción entre la bacteria y la célula del organismo superior
hospedante.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por asociación entre un microorganismo con un organismo
superior a cualquier tipo de interacción del microorganismo con el
organismo superior, incluyendo simbiosis o patogénesis. De modo que
el sistema de control de la expresión génica descrito en la
presente invención, puede establecerse en microorganismos,
preferentemente en bacterias procariontes, y más concretamente en
bacterias Gram-negativas atenuadas, las cuales
pueden hospedarse o infectar células de organismos eucarióticos,
incluyendo
humanos.
humanos.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por derivados del salicilato a sustituciones simples de la
molécula de salicilato, incluyendo al menos una modificación del
esqueleto de salicilato. Se incluyen por ejemplo compuestos tales
como el benzoato (sustitución de -OH por -H) o el ácido acetil
salicílico (-O-COCH_{3} en lugar de -OH).
Vectores con sistemas reguladores que son
fuertemente regulados por salicilato o derivados y que pueden ser
integrados en el cromosoma bacteriano de modo estable han sido
previamente desarrollados (Cebolla et al., Appl. Environ.
Microbiol. 2002, 68: 5034-41).
La fuertemente regulada expresión de proteínas
tóxicas heterólogas por el microorganismo huésped, puede ser
empleada para eliminar selectivamente los organismos recombinantes
usados una vez que estos han realizado la función deseada, con el
fin de alterar la flora indígena lo menos posible. Por lo tanto, de
acuerdo con una realización preferida, las células bacterianas
pueden contener un gen regulatorio sensible a salicilato o
derivados y un promotor diana, el cual controla la expresión de un
gen suicida codificando un producto tóxico para la célula
hospedada, como por ejemplo una enzima de restricción, una toxina,
un péptido antibacteriano, etc. En este grupo de genes suicidas se
incluyen por ejemplo el sistema kis/kid (de la
Cueva-Mendez y cols. EMBO J 2003,
22:246-251), colE3 (Diaz y cols. Mol Microbiol 1994,
13:855-861), etc.
El método de control de la expresión de genes
heterológos en microorganismos que están asociados a células de
organismos superiores de acuerdo con la presente invención, puede
ser empleado para el estudio de los genes involucrados en la
patogénesis usando bacterias con fenotipos condicionales. La acción
del gen se puede encender o apagar en distintos estadios del
proceso biológico. Las necesidades de un gen en particular para un
determinado proceso se puede ensayar controlando la presencia del
inductor en un determinado estadio del proceso de asocia-
ción.
ción.
En otra realización preferida de la presente
invención, la población de un microorganismo dado en biorreactores,
tales como los fermentadores, pueden ser selectivamente eliminados
al añadir ácido acetil salicílico o una molécula equivalente. Éste
sistema puede de igual forma ser usado en terapia génica con el fin
de matar selectivamente células que pudieran ser selectivamente
infectadas con una bacteria o virus que produzca un producto tóxico
o una biomolécula capaz de disparar la apoptosis o cualquier otro
mecanismo de muerte celular, en las células malignas.
De acuerdo con la presente invención, el uso de
sistemas de expresión inducibles por derivados del salicilato para
matar selectivamente organismos recombinantes una vez han realizado
la función deseada, forma parte del ámbito de protección de la
misma. En un ambiente deseado, la muerte selectiva de los
microorganismos manipulados genéticamente sería desencadenada en el
ambiente con el fin de que la flora indígena fuera alterada lo
menos posible. Para lograr esto, las células contendrían un sistema
regulador de respuesta a derivados del salicilato y un promotor
diana, el cual controla la expresión de un gen suicida codificando
para una proteína tóxica (por ejemplo una enzima de restricción,
una toxina, péptido antibacteriano, etc.). Las células y bacterias
y los sistemas reguladores son bien el sistema regulador
nahR/Psal, bien la cascada nahR/Psal-xylS2/Pm.
Se dispone de un gen codificante para una toxina, por ejemplo la
bacteriocina colE3, una enzima de restricción como EcoRI, aguas
abajo de los promotores Psal, Pnah o Pm. Las
construcciones genéticas son introducidas e insertadas en el
cromosoma por recombinación (Datsenko KA Wanner BL, Proc Natl Acad
Sci U S A. 2000, 97:6640-5) o por transposición
usando un transposón mini Tn5 (Herrero M y cols., J Bacterial.
1990, 172:6557-67). Se usan marcadores antibióticos
que son escindibles (Datsenko KA y Wanner BL, Proc Natl Acad Sci U
S A. 2000, 97:6640-5) para seleccionar la inserción
en el cromosoma del sistema de suicidio controlable por derivados
salicílicos, pero dejar luego la cepa susceptible del uso del mismo
marcador de resistencia a kanamicina, pero además haciéndolo más
aceptable para su liberación al medio ambiente. De modo que puede
ser usado para controlar la muerte de vacunas vivas una vez el
tiempo requerido para su acción es
suficiente.
suficiente.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona el uso de una bacteria diseñada que
contiene el sistema regulador seleccionado del grupo consistente en
al menos una proteína reguladora que pertenezca a la familia de
LysR/NahR de reguladores, al menos una proteína reguladora que
pertenezca a la familia del AraC/XylS de reguladores, al menos una
proteína reguladora que pertenezca a la familia de reguladores de
MarR, al menos un sistema regulador nahR/Psal o mutantes de
los mismos elementos, al menos un sistema de expresión de
xylS/Pm o mutantes de los mismos elementos, un circuito
genético en cascada que comprende el regulador transcripcional NahR
o una forma mutante y el regulador del transcripcional XylS o una
forma del mutante, o una combinación de estos, en el método de
control de la expresión de genes heterólogos en dicha bacteria que
se asocia a células de organismos superiores. De modo preferente,
dichos genes heterólogos codifican para una proteína terapéutica o
de diagnóstico. En una realización preferida, dicha proteína
terapéutica es un antígeno, una proteína antitumoral o mezcla de
estos.
Por lo tanto, de acuerdo con una realización
preferida de la presente invención, ésta proporciona el uso de una
sistema regulador de la expresión de genes heterólogos en bacterias
asociadas a células tumorales de un organismo superior, donde dicho
sistema regulador es controlado por salicilato o derivados.
De igual forma, la presente invención va dirigida
también, al uso del sistema regulador de la expresión de genes
heterólogos en bacterias asociadas a células de organismos
superiores, para el control de la expresión de un antígeno
heterólogo como vacuna viva recombinante.
Figura
1
A) Curva dosis-repuesta de SL7207
4S2 portando distintas construcciones con Pm::trp'::'lacZ.
Las inducciones se realizaron en medio Luria Bertany a 30ºC. Tras
4 horas en presencia de distintas concentraciones de salicilato se
determinó la actividad enzimática en unidades Miller (cuadrados
para pWSK-trp'::'lacZ y triángulos para
pCAS-trp'::'lacZ. Los mismos resultados se
obtuvieron tras 6 horas de inducción.
B) Comparación en detalle entre los rangos de
inducción obtenidos tras inducir SL7207 4S2 con salicilato 2 mM
durante 4 horas (n=3, las barras de error representan la desviación
estándar). Aunque la producción total de
\beta-galactosidasa que se obtiene con pCAS-trp'::'lacZ es mayor, los bajos niveles basales de pWSK-trp'::'lacZ le confieren un rango de inducción 10 veces mayor.
\beta-galactosidasa que se obtiene con pCAS-trp'::'lacZ es mayor, los bajos niveles basales de pWSK-trp'::'lacZ le confieren un rango de inducción 10 veces mayor.
Figura
2
SL7207 4S2 infectando células HeLa expresando
\beta-galactosidasa tras la inducción con
salicilato o ácido acetil salicílico (2 mM). En A) podemos observar
los altos niveles basales que presenta SL7207 4S2
pCAS-trp'::'lacZ mientras que en D) los niveles
basales de pWSK-trp'::'lacZ son indetectables. Sin
embargo, se aprecian grandes diferencias en los niveles inducidos
entre ambos vectores, -de alto y bajo número de copias- B, E).
Además, el AAS y el salicilato inducen niveles comparables de
\beta-galactosidasa C, F).
Figura
3
Análisis por FACS de las células F1.A11
infectadas con SL7207 4S2 pWSK (A) o pWSK-GFP (B y
C). Tras la infección, los, cultivos celulares se indujeron con
salicilato 2 mM en el medio de cultivo durante 4 horas (A y C). Los
diagramas representan el número de células seleccionadas frente a
la fluorescencia obtenida por la GFP (FL1).
Figura
4
Análisis por FACS de una suspensión celular del
bazo obtenida de un ratón infectado con SL7207 4S2 pWSK (A) e
inducido intraperitonealmente con 2 mg de salicilato,
pWSK-GFP no inducido (B) o inducido (C). Los
diagramas representan el número de células seleccionadas frente a
la fluorescencia obtenida por la GFP (FL1).
Figura
5
Análisis por citometría de flujo de una
suspensión celular obtenida de los nódulos mesentéricos de ratones
previamente infectados con SL7207 4S2 pWSK (A), e inducidos
intraperitonealmente con 2 mg de salicilato,
pWSK-GFP pero no-inducido (B) o
inducido (C).
Figura
6
Incorporación de timidita tritiada por parte de
células T CD4+ obtenidas del bazo de ratones infectados oralmente
con 5xlOE8 SL7207 4S2 pWSK e inducidos (grupo 3),
pWSK-trp'::'lacZ pero no-inducido
(grupo 2) o pWSK-trp'::'lacZ e inducido (grupo
1).
Figura
7
Análisis por citometría de flujo de suspensiones
celulares de fibrosarcomas producidos subcutáneamente. Los ratones
que desarrollaron los tumores fueron infectados con SL2707 4S2 con
pWSK-GFP y fueron no-inducidos
(curva en gris) o inducidos intraperitonealmete con 2 mg de
salicilato (curva en blanco).
En los siguientes ejemplos prácticos se emplearon
los siguientes vectores pWSK-trp'::'lacZ,
pWSK-GFP, pCAS-trp'::'lacZ y
pCNB4S2, así como las estirpes bacterianas
S17-1\lambdapir, SL7207 y
SL7207-4S2.
El plasmido pCNB4S2, se describe en Cebolla A,
Sousa C, de Lorenzo V. Rational design of a bacterial
transcriptional cascade for amplifying gene expression capacity.
Nucleic Acids Res. 2001; 29(3):759-66.
El plásmido pCAS-trp'::'lacZ es
un derivado del vector pCAS (Active Motif, CA, EE. UU) que contiene
la fusión trp'::'lacZ promotor Pm. Siendo el vector pCAS un vector
de alto número de copias. El plásmido
pCAS-trp'::'lacZ se construye mediante una
inserción en el vector pCAS (Active Motif, CA, EE. UU) de un
fragmento EcoRI-HinDIII del vector
pTPM-lacZ (Cebolla A, Sousa C, de Lorenzo V.
Rational design of a bacterial transcriptional cascade for
amplifying gene expression capacity. Nucleic Acids Res.
2001;29(3):759-66.). Permite expresar la
proteína indicadora R-galactosidasa cuando se
induce con salicilato. Los niveles de expresión una vez inducido el
sistema son muy altos, ya que se trata de un plásmido de alto
número de copias.
Del mismo modo, el plásmido
pWSK-trp'::'lacZ es un vector de expresión basado
en el plásmido pWSK (Wang, R.F., Kushner, S.R. Construction of
versatile low-copy-number vectors
for cloning, sequencing and gene expression in Escherichia coli.
Gene. 100, 195-199 (1991)), sobre el que se
clonó un fragmento Pm-trp'::'lacZ, extraído de
pCAS-trp'::'lacZ mediante digestión con la enzima
NotI. Permite expresar la proteína indicadora
p-galactosidasa cuando se induce con salicilato.
Los niveles de expresión basales son muy bajos, dado que se trata
de un plásmido de bajo número de copias. Este tipo de plásmidos son
muy útiles para expresar proteínas en Salmonella
typhimurium.
\newpage
El plásmido pWSK-gfp es un vector
idéntico a pWSK-trp'::'lacZ pero donde se ha
sustituido el gen indicador trp'::'lacZ por el gen gfp, que hace
posible detectar niveles de expresión mediante la tecnología de
citometría de flujo. En definitiva, se utilizó este plásmido para
monitorizar la expresión de la proteína indicadora en los estudios
in vivo.
Las propiedades de la estirpe
S171-\lambdapir se describen en de Lorenzo V,
Cases I, Herrero M, Timmis KN. Early and late responses of TOL
promoters to pathway inducers: identification of postexponential
promoters in Pseudomonas putida with
lacZ-tet bicistronic reporters. J Bacteriol. 1993
Nov; 175(21):6902-7.
La estirpe atenuada de Salmonella
typhimurium SL7207 ha sido previamente utilizada como portadora
de vacunas en distintos experimentos (Darji A y cols., Cell. 1997,
91:765-75; Paglia P y cols., Blood. 1998,
92:3172-6; y Medina E y cols., Eur J Immunol. 1999,
29:693-9).
La estirpe Salmonella typhimurium
SL7207-4S2 es una variante derivada de SL7207,
resistente espontánea a rifampicina, genéticamente modificada
portando el modulo nahR/P_{sal}-xylS2 ligado a una
resistencia a kanamicina.
En éste ejemplo se usó la estirpe atenuada de
Salmonella typhimurium SL7207, previamente usada como
portadora de vacunas en distintos experimentos (Darji A y cols.,
Cell. 1997, 91:765-75; Paglia P y cols., Blood.
1998, 92:3172-6; y Medina E y cols., Eur J Immunol.
1999, 29:693-9). Se manipuló genéticamente la
estirpe para insertar en su cromosoma el módulo regulador del
circuito de amplificación en cascada descrito anteriormente en la
presente memoria. Éste trabajo muestra un método por el cual se
regula la sobreexpresión heteróloga de genes con ácido acetil
salicílico y salicilato como inductores en una bacteria capaz de
infectar células de mamífero.
Para probar el potencial de amplificación sobre
la expresión génica proporcionada por el circuito en cascada
dependiente de derivados salicílicos, el regulador
nahR/Psal::xylS2 se insertó en el cromosoma de SL7207 tal y
como se describe a continuación. Se uso un mutante espontáneo de
SL7207 resistente a rifampicina, como receptor de la conjugación
con S17-1\lambdapir pCNB4S2. La
conjugación se realizó en LB, citrato sódico 1% durante 3 horas a
30ºC. Los eventos de transposición se aislaron incubándolos una
noche en medio LB con rifampicina 20 \mug/mL, kanamicina 50
\mug/mL. Se tomaron las colonias sensibles a ampicilina (100
\mug/mL). La cepa resultante, SL7207 4S2 fue electroporada con
pCAS-trp'::'lacZ o pWSK-trp'::'lacZ.
Éstos plásmidos contienen la fusión trp'::'lacZ promotor Pm
en un vector de alto y bajo número de copias respectivamente. Se
crecieron cultivos a 37ºC y 150 rpm en LB ampicilina hasta llegar a
una DO660 de aproximadamente 0.3. Entonces se les añadió la
cantidad correspondiente de inductor y se volvieron a incubar a
37ºC hasta que se tomaron las mediadas de unidades Miller. Como se
observa en la figura 1ª, tanto el salicilato como el ácido acetil
salicílico inducen en igual medida el sistema independientemente
del plásmido que se use. Los resultados obtenidos en dos puntos (4
y 6 horas reinducción) fueron idénticos, mostrando que el sistema
estaba totalmente inducido tras las 4 horas.
Al reducir el número de copias del plásmido
marcador (Fig 1b), se obtuvieron niveles basales 10 veces menores
(4.384 + 388 vs 204 + 6 Unidades Miller, n=3) mientras que la
capacidad de inducción se mantuvo en su mayor parte. Una vez
inducido (2 mM salicilato), el efecto de amplificación sinérgica
del sistema de expresión permite al vector basado en pWSK alcanzar
actividades enzimáticas comparables al vector pCAS (36.792 + 798 vs
66.185 + 8.171 respectivamente. El rango de inducción de pWSK
mostró ser 10 veces mayor que el basado en pCAS (180 frente a 15).
Éstos resultados hicieron preferible usar SL7207
pWSK-trp'::'lacZ para los siguientes experimentos.
Dado que además se pudo apreciar inhibición del crecimiento con
concentraciones altas (5 mM) de ácido acetil salicílico, decidimos
usar 2 mM para entrar en detalle en experimentos in vitro
con cultivos celulares.
Las dosis terapéuticas de salicilato medidas en
plasma llegan a ser de 4,6 mM. Dado que podemos alcanzar niveles
de expresión comparables con 2 mM y 5 mM, decidimos usar la dosis
más alta para experimentos in vivo, dado que la vida media
descrita es de 2-4 horas. Así, dando una dosis única
de 5 mM obtendríamos al menos 4 horas de activación.
Éste ejemplo muestra cómo la expresión de la
\beta-galactosidasa puede ser controlada en
células bacterianas que estén infectando células de mamífero, todo
esto añadiendo derivados del salicilato. Se usaron SL4S2 portando
pWSK- trp'::'lacZ y pCAS- trp'::'lacZ para infectar células de
mamífero (Royo JL y cols., sometido) tal y como redescribe en las
siguientes líneas. Tanto células HeLa como los macrófagos J774.A1
se cultivaron en placas de 24 pocillos con medio DMEM, con
L-glutamina y suero fetal caprino al 10%. Los
cultivos celulares se incubaron a 37ºC, 6% CO_{2} hasta una
confluencia de casi el 80%. Los cultivos de Salmonella se
crecieron una noche a 37ºC, 15 m rpm en LB 0.3 M cloruro sódico, y
ampicilina 100 \mug/mL cuando fue necesario. Cada pocillo se
infectó con 10E6 bacterias, provenientes de un cultivo saturado y
fueron incubados a 37ºC y 6% CO_{2} 1 hora (J774A.1) o 2 horas
(HeLa). Las células se lavaron 3 veces con PBS antes de añadir
nuevo DMEM suplementado con gentamicina 50 \mug/mL para matar las
bacterias que quedaran en el exterior y ampicilina para evitar la
pérdida del plásmido. Cuando se requiso, se añadió también
salicilato o ácido acetil salicílico a una dosis final de 2 mM.
Tras 4 horas de incubación (37ºC, 6% CO_{2}), los cultivos
celulares se lavaron con PBS, se fijaron con paraformaldéhido al 2%
durante 20 minutos y se tiñeron con el kit de tinción de
\beta-gal (Roche) de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. La expresión de la
\beta-galactosidasa confirmó que tanto el
salicilato como el ácido acetil salicílico alcanzan el citoplasma
bacteriano. Una vez dentro de la célula, ambos inductores activan
la cascada de señales a niveles comparables (Figura 2b, 2c, 2d y
2f). Los niveles basales de pCAS- trp'::'lacZ se detectaron
fácilmente. Sin embargo, la actividad basal de lacZ producida desde
el vector de bajo número de copia resultó ser indetectable (Figura
2 a y 2d). Éstos experimentos mostraron que ambas moléculas pueden
difundir y llegar al citoplasma bacteriano activando así el sistema
de expresión. Además, el ambiente eucariótico no interfiere
significativamente con la sobreexpresión génica, probablemente
debido a que los componentes del sistema en cascada es activo en un
amplio rango de condiciones metabólicas. Aunque los mismos
resultados se observaron con macrófagos J774A.1, se observó algo de
muerte celular causada por la propia infección.
En este ejemplo se confirma la capacidad de
control de la expresión génica por salicilato y el sistema de
expresión en cascada usando la proteína verde fluorescente como gen
marcador. Para evitar una potencial barrera metabólica, se usó
SL7207 4S2 con pWSK-GFP para monitorizar la
expresión de la GFO in vitro. Se pudo realizar también un
experimento para caracterizar la expresión génica de SL7207 4S2 en
nuestra línea tumoral usada como modelo. F1.A11 es una línea
celular altamente tumorigénica y metastásica derivada de un
fibrosarcoma murino de la estirpe Balb/c. Las metástasis son
fáciles de localizar puesto que F1.A11 expresa y presenta la
\beta-galactosidasa como marcador tumoral (Paglia
P y cols., Blood. 1998, 92:3172-6 y referencias
interiores). Se infectaron con cultivos casi confluentes de
F1.A11.con SL7207 4S2 con pWSK-GFP o su
correspondiente vector vacío. La inducción se realizó tal y como
redescribe a continuación. Tras una inducción de 4 horas con 2 mM
de salicilato las células se recogieron, se lavaron y se analizaron
por citometría de flujo. En la figura 3 se representan eventos
celulares contados frente a la fluorescencia relativa (FL1) de
células infectadas en distintas condiciones. La fluorescencia varió
entre 11,72 (vector vacío) y 12,51 (infectadas con SL7207
pWSK-GFP). Cuando los cultivos fueron observados al
microscopio, no se observó GFP ni en el vector vacío ni en el
pWSK-GFP no inducido. Tras la adición de salicilato
a 2 mM (Figura 3c), la fluorescencia alcanzó 116,7 (10 veces
superior). Tomando los datos en conjunto, se consideró que SL7207
4S2 era un buen candidato para estudios más profundos.
En éste ejemplo, se usaron los circuitos de
respuesta a salicilato para controlar la expresión génica de
microbios infectando animales vivos. Se administró
intraperitonealmente (ip) 10E6 unidades formadoras de colonias (en
150 \mul de PBS) de la Salmonella atenuada y portando el
módulo del circuito en cascada (SL707 4S2 con
pWSK-GFP). 30 minutos tras la infección, se le
inyectaron 2 mg de salicilato bien por vía intravenosa (iv), bien
ip de forma que se alcanzaba 5 mM de salicilato. Tras 4 horas de
incubación, se sacrificaron los animales y se analizaron los
exudados peritoneales, bazos y nódulos linfáticos mesentéricos. Se
encontraron células altamente positivas para GFP en nódulo
mesentéricos (Figura 5) y bazo (Fig 4), cuando se comparó con los
no inducidos, o inducidos pero con el vector vacío. No se vieron
células positivas para GFP en los exudados peritoneales, revelando
bien una migración, bien la apoptosis de los macrófagos
peritoneales. Los resultados obtenidos fueron idénticos tanto si la
inducción fue ip como iv.
En éste ejemplo, se usó una cepa bacteriana
atenuada como vector para presentar antígenos heterólogos al
sistema inmune de ratón, de una forma condicional a la
administración de ácido acetil salicílico. Se puede desencadenar
una respuesta inmune de protección mediante el uso de distintas
estirpes atenuadas derivados de estirpes silvestres patógenas tales
como Salmonella enterica serovar Typha y
typhimurium (S. Typha y S. typhimurium). En
éstos experimentos, se inmunizó a los ratones con 5x10E8 SL7207
4S2 portando el plásmido pWSK o el pWSK-trp'::'lacZ.
12 horas tras la inmunización, se administraron ip 2 mg de
salicilato. Se les dio iguales dosis de salicilato los días 7 y 14
posteriores al desafío. Dos semanas tras la ultima inducción, se
sacrificaron los animales. Se realizaron ensayos de proliferación
con las células de bazo. En la figura 6 se muestra que la
reestipulación in vitro de las células CD4+ T tras la
adición de \beta-galactosidasa pura resultó ser
significativamente distinta entre los ratones inducidos y los lo
inducidos. Éste experimento confirmó que SL7207 4S2 activó los
módulos nahR/Psal y xy1S2/Pm promoviendo así la expresión de
la \beta-galactosidasa. Ésta señal podría por lo
tanto modular la respuesta inmune en ratones de una manera
condicional.
En éste ejemplo, se midió cómo el tropismo de
ciertos microbios hacia los tumores u otro tipo de tejido enfermo
puede ser usado para la liberación de forma controlada de la
expresión proteica. Este ejemplo, muestra la posibilidad de
concentrar la expresión proteica en células donde las proteínas
terapéuticas se pudieran producir tras la administración de ácido
acetil salicílico. Los tumores se generaron mediante una inyección
subcutánea de 10E4 células F1.A11, en el flanco inferior izquierdo
de ratones hembras de la estirpe Balb/c con 9 semanas de edad.
Cuando los tumores fueron palpables (100-200 mg),
se administraron intraparenteral de 10E6 unidades formadoras de
colonia de SL7207 4S2 con pWSK-GFP y su
correspondiente vector vacío. En día +4, los ratones se dividieron
en distintos grupos. Algunos fueron tratados con una dosis de 5 mM
de salicilato iv/ip, y otros se mantuvieron como controles sin
inducir. Cuatro horas tras la inducción se sacrificaron los
animales y se separaron asépticamente tanto bazo, ganglios
mesentéricos como los propios tumores para realizar los análisis.
Las suspensiones celulares de tumores independientes que habían
sido tratados con salicilato, mostraron un fenotipo positivo en FL1
(Fig 7). Las células en una ventana de FL1 > 10E2 pasaron de 11
a 39-48%, mostrando un comportamiento paralelo a
como ocurrían las infecciones in vitro. Otros tumores se
fijaron y tiñeron para ver la presencia de SL7207 4S2. Los órganos
se pesaron, homogeneizaron y resuspendieron en PBS estéril antes
de sembrarse. En algunos ensayos, las relaciones variaban entre 4:1
a 850:1, de acuerdo con lo descrito previamente como tropismo
positivo (Pawelek JM y cols., Cancer Res. 1997 Oct;
57:4537-44; Low KB y cols., Nat Biotechnol. 1999,
17:37-41; y Neumunaitis J y cols., Cancer Gene
Ther. 2003; 10:737-44). Por otro lado, y sin contar
la alta expresión de GFP localizada en el tumor, no se observó
tropismo en varios ratones. Esta observación fue descrita
previamente y puede ser debida a la distinta naturaleza de las
líneas tumorigénicas, el fondo genético de los ratones, la estirpe
de Salmonella usada o simplemente a variaciones estocásticas
atribuidas a fenómeno de progresión tumoral.
Claims (27)
1. Un método para controlar la expresión de genes
heterólogos en microorganismos que están asociados a células de
organismos superiores caracterizado porque comprende:
- a.
- un sistema regulador que puede ser controlado por un efector químico;
- b.
- un microorganismo huésped que contiene el sistema regulador capaz de interaccionar o asociarse con células de organismos superiores;
- c.
- un compuesto químico efector que es salicilato o un derivado de salicilato y que puede transportarse a través del organismo superior asociado y activar o reprimir la expresión del microorganismo huésped modifi- cado.
2. El método según la reivindicación 1
caracterizado porque al menos una de las proteínas
reguladoras es controlada por salicilato, antranilato,
2-acetil-salicilato,
4-cloro-salicilato,
5-cloro-salicilato,
3,5-dicloro-salicilato,
5-metoxi-salicilato, benzoato,
3-metil-benzoato,
2-metoxi-benzoato,
3-metil-salicilato,
4-metil-salicilato, o
5-metil-salicilato, cualquier otro
derivado del salicilato que mantenga el grupo C-1
carboxílico en el anillo aromático o mezcla de
estos.
estos.
3. El método según la reivindicación 2
caracterizado porque el sistema regulador comprende al menos
una proteína reguladora que pertenece a la familia LysR/NahR de
reguladores.
4. El método según la reivindicación 2
caracterizado porque el sistema regulador comprende al menos
un derivado de la familia de reguladores XylS/AraC.
5. El método según la reivindicación 2
caracterizado porque el sistema regulador comprende una
proteína reguladora que pertenece a la familia del MarR de
reguladores.
6. El método según la reivindicación 2
caracterizado porque el sistema regulador consta de un
sistema de expresión de nahR/Psal o mutantes de estos mismos
elementos.
7. El método según la reivindicación 2
caracterizado porque el sistema regulador comprende un
sistema de expresión de xylS/Pm o mutantes de los mismos
elementos capaz de responder a cualquiera de los compuestos
químicos de reivindicación 2.
8. El método según la reivindicación 2
caracterizado porque el sistema regulador comprende un
circuito genético en cascada caracterizado porque
comprende:
- a.
- el regulador transcripcional NahR o una forma mutante de este y el regulador transcripcional XylS o una forma mutante de este;
- donde los reguladores transcripcionales están puestos en un orden jerárquico tal que el regulador transcriptional NahR o una forma mutante de este estimule la expresión del regulador transcripcional XylS o una forma mutante de este y;
- donde el regulador transcriptional NahR o una forma mutante de este y el regulador transcripcional XylS o una forma mutante de este responden al mismo inductor;
- b.
- un promotor diana terminal;
- donde dicho promotor diana terminal está caracterizado porque es sensible de una forma dosis-dependiente al regulador transcripcional XylS o una forma mutante de este.
9. Un método según la reivindicación 1
caracterizado porque la célula capaz asociarse con
organismos superiores y que contiene el sistema regulador de la
expresión de genes heterólogos es una célula procariótica.
10. Un método según la reivindicación 9
caracterizado porque la célula procariótica es una célula
bacteriana Gram-negativa.
11. Un método según la reivindicación 10
caracterizado porque la célula bacteriana
Gram-negativa es una bacteria del genero
Salmonella.
12. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 9 a 11 desarrollado para controlar la
expresión de proteínas terapéuticas o una proteína de diagnóstico
en una bacteria atenuada asociada a células de organismos
superiores.
13. Un método según la reivindicación 12 para
controlar la expresión de un antígeno heterólogo en una bacteria
atenuada asociada con células de organismos superiores, para su uso
como una vacuna viva recombinante.
14. Un método según la reivindicación 12 para
controlar la expresión de por lo menos una proteína antitumoral en
una bacteria atenuada que se asocie con las células de organismos
superiores, la cual presenta cierto tropismo por células tumorales
de dicho organismo superior.
15. El método según la reivindicación 14
caracterizado por que la proteína antitumoral se selecciona
del grupo consistente en una interleuquina, una citoquina, una
toxina, una proteína citotóxica o una proteína antiangio-
génica.
génica.
16. El método según la reivindicación 9
caracterizado porque la bacteria además contiene un sistema
regulador sensible a salicilato o derivados y un promotor diana, el
cual controla la expresión de un gen suicida codificando un
producto tóxico para la célula hospedada.
17. Uso del método de acuerdo con la
reivindicación 9, para el estudio de los genes involucrados en la
patogénesis usando bacterias con fenotipos condicionales.
18. Uso del método de acuerdo con la
reivindicación anterior 16, para la eliminación selectiva de
microorganismos en biorreactores.
19. Uso del método de acuerdo con la
reivindicación anterior 16, para la eliminación selectiva de
células que pudieran ser selectivamente infectadas con una
bacteria o virus que produzca un producto tóxico o una biomolécula
capaz de disparar la apoptosis o cualquier otro mecanismo de muerte
celular en las células malignas.
20. Un método para controlar la expresión de
proteínas terapéuticas heterólogas o proteínas de diagnóstico
heterólogas en microorganismos que están asociados a células de
organismos superiores caracterizado porque
comprende:
comprende:
- a.
- disponer de una célula bacteriana que contiene un sistema regulador que puede ser controlado por salicilato o derivados como efector químico, la cual se asocia de modo específico a células de un organismo superior;
- b.
- inducir la expresión de dichas proteínas terapéuticas heterólogas o proteínas de diagnóstico heterólogas mediante la administración de salicilato o derivados al organismo superior hospedante de la célula modificada.
21. Método de acuerdo con la reivindicación
anterior 20, caracterizado porque el sistema regulador se
selecciona entre el grupo formado por al menos una proteína
reguladora que pertenezca a la familia del LysR/NahR de
reguladores, al menos un derivado de la familia de reguladores
XylS/AraC, al menos una proteína reguladora que pertenezca a la
familia de reguladores de MarR, al menos un sistema regulador
nahR/Psal o mutantes de los mismos elementos, al menos un
sistema de expresión de xylS/Pm o mutantes de los mismos
elementos, un circuito genético en cascada que comprende el
regulador transcripcional NahR o una forma mutante y el regulador
del transcripcional XylS o una forma del mutante, o una combinación
de estos.
22. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 20 a 21, caracterizado porque
dicha proteína terapéutica heteróloga es un antígeno heterólogo,
una proteína antitumoral o mezcla de estos.
23. Uso de un sistema regulador de la expresión
de genes heterólogos en bacterias asociadas a células tumorales de
un organismo superior, el cual es controlado por salicilato o
derivados, para controlar la expresión de por lo menos una proteína
antitumoral.
24. Uso de acuerdo con la reivindicación anterior
23, caracterizado porque la proteína antitumoral expresada
se selecciona del grupo consistente en una interleuquina, una
citoquina, una toxina, una proteína citotóxica o una proteína
antiangiogénesis.
25. Uso de un sistema regulador de la expresión
de genes heterólogos en bacterias asociadas a células de un
organismo superior, el cual es controlado por salicilato o
derivados, para controlar la expresión de un antígeno heterólogo,
para su uso como una vacuna viva recombinante.
26. Uso de un sistema regulador de la expresión
de genes heterólogos en bacterias asociadas a células de un
organismo superior, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 23 a 25, caracterizado porque
dicho sistema regulador se selecciona del grupo consistente en al
menos una proteína reguladora que pertenezca a la familia de
reguladores LysR/NahR, al menos un derivado de la familia de
reguladores XylS/AraC, al menos una proteína reguladora que
pertenezca a la familia de reguladores MarR, al menos un sistema
regulador nahR/Psal o mutantes de los mismos elementos, al
menos un sistema regulador xylS/Pm o mutantes de los mismos
elementos, una cascada circuito genético que comprende el regulador
transcripcional NahR o una forma mutante y el regulador del
transcripcional XylS o una forma del mutante, o una combinación de
estos.
27. Uso de una bacteria modificada que contiene
el sistema regulador seleccionado del grupo consistente en al
menos una proteína reguladora que pertenezca a la familia del
LysR/NahR de reguladores, al menos un derivado de la familia de
reguladores XylS/AraC, al menos una proteína reguladora que
pertenezca a la familia de reguladores de MarR, al menos un sistema
regulador nahR/Psal o mutantes de los mismos elementos, al menos
un sistema de expresión de xylS/Pm o mutantes de los mismos
elementos, una cascada circuito genético que comprende el regulador
transcripcional NahR o una forma mutante y el regulador del
transcripcional XylS o una forma del mutante, o una combinación de
estos, en el método de control de la expresión de genes heterólogos
en microorganismos que se asocian a las células de organismos
superiores según reivindicación 1.
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200302867A ES2260985B1 (es) | 2003-12-04 | 2003-12-04 | Procedimiento de regulacion de la expresion de proteinas heterologas controladas por derivados salicilicos en microorganismos asociados a organismos superiores. |
US10/581,025 US20070264702A1 (en) | 2003-12-04 | 2004-11-26 | Method of Regulating Heterologous Protein Expression Controlled by Salicylic Deratives in Micro-Organisms Associated with Higher Organisms |
EP04805071A EP1693460A1 (en) | 2003-12-04 | 2004-11-26 | Method of regulating heterologous protein expression controlled by salicylic derivatives in micro-organisms associated with higher organisms |
PCT/ES2004/000528 WO2005054477A1 (es) | 2003-12-04 | 2004-11-26 | Procedimento de regulación de la expresión de proteínas heterólogas controlada por derivados salicílicos en microorganismos asociados a organismos superiores |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200302867A ES2260985B1 (es) | 2003-12-04 | 2003-12-04 | Procedimiento de regulacion de la expresion de proteinas heterologas controladas por derivados salicilicos en microorganismos asociados a organismos superiores. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2260985A1 true ES2260985A1 (es) | 2006-11-01 |
ES2260985B1 ES2260985B1 (es) | 2007-11-01 |
Family
ID=34639544
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES200302867A Expired - Fee Related ES2260985B1 (es) | 2003-12-04 | 2003-12-04 | Procedimiento de regulacion de la expresion de proteinas heterologas controladas por derivados salicilicos en microorganismos asociados a organismos superiores. |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070264702A1 (es) |
EP (1) | EP1693460A1 (es) |
ES (1) | ES2260985B1 (es) |
WO (1) | WO2005054477A1 (es) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080124355A1 (en) | 2006-09-22 | 2008-05-29 | David Gordon Bermudes | Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment |
US8241623B1 (en) | 2009-02-09 | 2012-08-14 | David Bermudes | Protease sensitivity expression system |
US9597379B1 (en) | 2010-02-09 | 2017-03-21 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies |
US8524220B1 (en) | 2010-02-09 | 2013-09-03 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria |
US8771669B1 (en) | 2010-02-09 | 2014-07-08 | David Gordon Bermudes | Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria |
US9593339B1 (en) | 2013-02-14 | 2017-03-14 | David Gordon Bermudes | Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment |
US9737592B1 (en) | 2014-02-14 | 2017-08-22 | David Gordon Bermudes | Topical and orally administered protease inhibitors and bacterial vectors for the treatment of disorders and methods of treatment |
US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
US11471497B1 (en) | 2019-03-13 | 2022-10-18 | David Gordon Bermudes | Copper chelation therapeutics |
US10973908B1 (en) | 2020-05-14 | 2021-04-13 | David Gordon Bermudes | Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine |
CN114807204B (zh) * | 2022-04-12 | 2023-08-15 | 湖北大学 | 一种重组载体质粒、水杨酸生物传感器及构建方法和应用 |
CN115895989B (zh) * | 2022-08-05 | 2024-05-10 | 江苏寒武纪生物细胞科学有限公司 | 一株高产丁二酸的大肠杆菌及其制备方法与应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20010016354A1 (en) * | 1999-06-22 | 2001-08-23 | Angel Cebolla Ramirez | Regulated expression of cloned genes using a cascade genetic circuit |
US20030113293A1 (en) * | 1999-08-26 | 2003-06-19 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for delivery of an agent using attenuated Salmonella containing phage |
WO2003063593A1 (en) * | 2002-01-28 | 2003-08-07 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating cancer by administering tumor-targetted bacteria and an immunomodulatory agent |
-
2003
- 2003-12-04 ES ES200302867A patent/ES2260985B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-11-26 EP EP04805071A patent/EP1693460A1/en not_active Withdrawn
- 2004-11-26 US US10/581,025 patent/US20070264702A1/en not_active Abandoned
- 2004-11-26 WO PCT/ES2004/000528 patent/WO2005054477A1/es active Application Filing
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20010016354A1 (en) * | 1999-06-22 | 2001-08-23 | Angel Cebolla Ramirez | Regulated expression of cloned genes using a cascade genetic circuit |
US20030113293A1 (en) * | 1999-08-26 | 2003-06-19 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for delivery of an agent using attenuated Salmonella containing phage |
WO2003063593A1 (en) * | 2002-01-28 | 2003-08-07 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating cancer by administering tumor-targetted bacteria and an immunomodulatory agent |
Non-Patent Citations (10)
Title |
---|
CEBOLLA, A. et al., "Improvement of recombinant protein yield by a combination of transcriptional amplification and stabilization of gene expression.", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., 2002, Vol. 68, No. 10, paginas 5034-5041. Todo el documento. * |
CEBOLLA, A. et al., "Improvement of recombinant protein yield by a combination of transcriptional amplification and stabilization of gene expression.", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., 2002, Vol. 68, No. 10, páginas 5034-5041. Todo el documento. * |
CEBOLLA, A. et al., "Rational design of a bacterial transcriptional cascade for amplifying gene expression capacity.", NUCLEIC ACIDS RES., 2001, Vol. 29, No. 3, paginas 759-766. Todo el documento. * |
CEBOLLA, A. et al., "Rational design of a bacterial transcriptional cascade for amplifying gene expression capacity.", NUCLEIC ACIDS RES., 2001, Vol. 29, No. 3, páginas 759-766. Todo el documento. * |
COHEN, S.P. et al., "Salicylate induction of antibiotic resistance in Escherichia coli: activation of the mar operon and a mar-independent pathway.", J. BACTERIOL., 1993, Vol.175, No. 24, paginas 7856-7862. Todo el documento. * |
COHEN, S.P. et al., "Salicylate induction of antibiotic resistance in Escherichia coli: activation of the mar operon and a mar-independent pathway.", J. BACTERIOL., 1993, Vol.175, No. 24, páginas 7856-7862. Todo el documento. * |
PAWELEK, J.M. et al., "Bacteria as tumour-targeting vectors.", LANCET ONCOL., 2003, Vol. 4, No. 9, pags 548-56. Todo el documento. * |
PAWELEK, J.M. et al., "Bacteria as tumour-targeting vectors.", LANCET ONCOL., 2003, Vol. 4, No. 9, págs 548-56. Todo el documento. * |
SULAVIK, M.C. et al., "The Salmonella typhimurium mar locus: molecular and genetic analyses and assessment of its role in virulence.", J. BACTERIOL., 1997, Vol.179, No. 6, paginas 1857-1866. Todo el documento. * |
SULAVIK, M.C. et al., "The Salmonella typhimurium mar locus: molecular and genetic analyses and assessment of its role in virulence.", J. BACTERIOL., 1997, Vol.179, No. 6, páginas 1857-1866. Todo el documento. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2005054477A1 (es) | 2005-06-16 |
ES2260985B1 (es) | 2007-11-01 |
US20070264702A1 (en) | 2007-11-15 |
EP1693460A1 (en) | 2006-08-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lynch et al. | Emerging strategies for engineering Escherichia coli Nissle 1917-based therapeutics | |
Nallar et al. | Bacteria and genetically modified bacteria as cancer therapeutics: Current advances and challenges | |
US20170306338A1 (en) | Recombinant bacterium to decrease tumor growth | |
Ryan et al. | Bacterial delivery of a novel cytolysin to hypoxic areas of solid tumors | |
US9198950B2 (en) | Recombinant bacterium comprising a toxin/antitoxin system | |
US9127284B2 (en) | Modified bacteria and their uses thereof for the treatment of cancer or tumor | |
ES2260985B1 (es) | Procedimiento de regulacion de la expresion de proteinas heterologas controladas por derivados salicilicos en microorganismos asociados a organismos superiores. | |
Geldart et al. | Chloride-inducible expression vector for delivery of antimicrobial peptides targeting antibiotic-resistant Enterococcus faecium | |
JP2008519002A (ja) | 細菌ベクター | |
Zainuddin et al. | CRISPR‐based curing and analysis of metabolic burden of cryptic plasmids in Escherichia coli Nissle 1917 | |
AU2018328465B2 (en) | Bacteria for targeting tumors and treating cancer | |
Shi et al. | Combined prokaryotic–eukaryotic delivery and expression of therapeutic factors through a primed autocatalytic positive-feedback loop | |
Hoffman | The preclinical discovery of bacterial therapy for the treatment of metastatic cancer with unique advantages | |
Schwan et al. | Temporal regulation of fim genes in uropathogenic Escherichia coli during infection of the murine urinary tract | |
Nguyen et al. | Optimized doxycycline-inducible gene expression system for genetic programming of tumor-targeting bacteria | |
Lim et al. | Targeted delivery of the mitochondrial target domain of noxa to tumor tissue via synthetic secretion system in E. coli | |
AU2020276121A1 (en) | DNA construct for diagnosing and treating cancer | |
KR101685034B1 (ko) | 고형암 조직 타겟팅 박테리아 및 그의 용도 | |
KR101660294B1 (ko) | glmS 기반의 숙주 벡터 시스템 | |
ES2972792T3 (es) | Célula modificada | |
KR102706758B1 (ko) | 암의 예방 및 치료용 살모넬라 균주 및 이의 용도 | |
EP4242314A1 (en) | Salmonella strain for prevention and treatment of cancer and use thereof | |
CN114456992B (zh) | “自体裂解”沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用 | |
US20220228165A1 (en) | DNA Construct for Diagnosing and Treating Cancer | |
Weerakkody et al. | Tumor-Targeting Bacteria: As Vectors, Immunotherapeutic Agents And Tumor-Targeting Probes For Cancer Detection And Therapy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20061101 Kind code of ref document: A1 |
|
FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2260985B1 Country of ref document: ES |
|
FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20231227 |