JP2022530773A - 抗原特異的ｃｄ１９標的化ｃａｒ－ｔ細胞 - Google Patents

Abstract

血液がん等のがんの標的化処置のための組成物及び方法が開示される。特に、抗原逃避が低減したがん細胞を標的とし殺傷する、養子細胞移入と共に使用することができるキメラ抗原受容体(CAR)T細胞が開示される。したがって、開示されるCAR T細胞の養子移入を伴う、血液がんを有する対象に抗腫瘍免疫をもたらす方法もまた開示される。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、その全体が参照により組み込まれる、2019年4月30日に出願された米国仮特許出願第62/840,774号に対する優先権の利益を主張する。

血液学的悪性腫瘍は、小児と成人の両方で生じる最も一般的ながんの一部である。例えば、米国では毎年およそ4,000の侵襲性B細胞系統悪性腫瘍であるB細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)の新規症例が診断され、小児の最も一般的な悪性腫瘍となっている。正常なリンパ球成熟の異常な停止、アポトーシスの回避、及び制御されない細胞増殖を誘導する遺伝子変異は、B細胞リンパ芽球の過剰産生をもたらす。成人では、6000を超える急性リンパ芽球性白血病(ALL)の新規発症例が毎年生じている。(Hanahan, D.及びWeinberg, R. (2000) The hallmarks of cancer. Cell 100: 57～70ページ、Teitell, M.及びPandolfi, P. (2009) Molecular genetics of acute lymphoblastic leukemia. Annu Rev Pathol 4: 175～198ページ)さらに、リンパ腫(例えばリンパ系組織の新生物)は、米国におけるがんの全症例のおよそ5%を占める。主要なクラスは、リンパと血液の両方に存在する細胞型であるリンパ球の悪性新生物(すなわち、がん)である。この点で、リンパ腫及び白血病は、いずれも造血及びリンパ組織の悪性腫瘍(例えば腫瘍)である。リンパ増殖性障害として、リンパ腫及びリンパ性白血病は、それらの一部がどちらかの名称で呼ばれる(例えば成人T細胞白血病/リンパ腫)ほど密接に関連している。

前臨床及び臨床研究の取り組みは、高リスクがんのための抗体に基づく治療及び/又は養子細胞治療を含む免疫療法モダリティを検討することに焦点を当てている。そのような戦略は、がん性細胞及び少数の非がん性細胞の特異的標的化(すなわち、オンターゲット/オフ腫瘍又はバイスタンダー効果)を可能にする腫瘍関連抗原に依存する。細胞表面に発現する腫瘍関連抗原を主要組織適合遺伝子複合体(MHC)抗原非依存的に標的とする合成キメラ抗原受容体(CAR)を用いる、ヒト免疫エフェクター細胞の遺伝子操作を伴う養子免疫療法手法に特定の関心が払われている。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、T細胞に発現するCARとがん関連抗原との結合は、T細胞共刺激ドメインを介した細胞内シグナル伝達及びその後のCAR T細胞の増大をもたらし、さらなるがん細胞殺傷を誘導する。しかしながら、早期試験からの良い結果にもかかわらず、CD19 CAR T細胞の患者への注入は、依然として、様々な重症度のいくつかの「オンターゲット/オン腫瘍」及び「オンターゲット/オフ腫瘍」副作用、例えば、腫瘍崩壊症候群(TLS)、サイトカイン放出症候群(CRS)及びマクロファージ活性化症候群、CNS輸送、遷延性B細胞形成不全、並びに免疫逃避をもたらす。したがって、本明細書に記載される長い間望まれているが満たされていない必要性を考慮すると、血液学的悪性腫瘍のための療法の改善が必要とされる。

本発明は、Bリンパ球抗原、例えばCD19(Bリンパ球抗原CD19)が血液がん(すなわち、造血及びリンパ組織のがん)の標的化処置のために使用され得るという発見に、少なくとも部分的に基づいている。一部の態様では、B系統細胞及びそこから生じるがん細胞を標的とするキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドを発現する免疫細胞が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、本明細書に開示されるCARは、Bリンパ球抗原標的ドメイン、例えば、CD19、CD20、及び/又はCD22結合ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の好ましい実施形態では、Bリンパ球抗原結合ドメインは、野生型及び/又は変異型CD19抗原を標的とする。

ある特定の態様では、Bリンパ球抗原(例えば、血液学的悪性腫瘍、例えば白血病及び/又はリンパ腫と関連するCD19、CD20、及び/又はCD22抗原)と選択的に結合する標的ドメインを含むCARポリペプチド、及び別の異なる腫瘍関連抗原に選択的に結合する標的ドメインを含むCARポリペプチドを発現する、二重特異性キメラ抗原受容体(CAR)T細胞が、本明細書において提供される。一部のそのような実施形態では、キメラ抗原受容体の標的ドメイン(例えば、CD19抗原結合ドメイン及び/又は他の異なる腫瘍関連抗原結合ドメイン)は、機能的抗体断片を含む。好ましくは、キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインは一本鎖可変断片(scFv)を含む。最も好ましい実施形態では、機能的抗体断片(例えばscFv)は、モノクローナル抗体FMC63に由来する。

一部の実施形態では、本明細書に開示されるCARの膜貫通ドメインは、CD28、41BB、それらの変異体、又はそれらの任意の組合せのうちのいずれかの膜貫通ドメインを少なくとも1つ含む。一部の好ましい実施形態では、本明細書に開示されるCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζ、その変異体、又はそれらの任意の組合せのシグナル伝達ドメインを少なくとも1つ含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるCARは、少なくとも1つの共刺激シグナル伝達領域、例えば、CD28若しくはその変異体、CD137(41BB)若しくはその変異体、又はそれらの任意の組合せのうちのいずれか1つのシグナル伝達ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達領域は、1つ以上の細胞内シグナル伝達及び/又は共刺激分子の1、2、3、又は4つの細胞質ドメインを含有する。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達領域は、CD28及び/又は4-1BBの細胞質ドメインに、シグナル伝達を減弱するか又は好ましくは増強する1つ以上の変異を含有する。ある特定の実施形態では、CAR発現免疫細胞は、1つ以上の免疫チェックポイント分子をもはや発現しない。一部のそのような実施形態では、免疫チェックポイント分子は、当技術分野で公知の方法によって遮断及び/又は抑制される。

一部の実施形態では、CARポリペプチドは、不完全な内部ドメインを含有する。例えば、CARポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメイン又は共刺激ドメインのいずれかを含有し得るが、両方を含有することはない。これらの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞と欠損ドメインを含有する第2のCARポリペプチド(又は内因性T細胞受容体)との両方がそれぞれの抗原と結合しない限り活性化しない。したがって、一部の実施形態では、CARポリペプチドは、CD3ゼータ(CD3ζ)シグナル伝達ドメインを含有するが、共刺激シグナル伝達領域(CSR)を含有しない。他の実施形態では、CARポリペプチドは、CD28、4-1BB、又はそれらの組合せの細胞質ドメインを含有するが、CD3ζシグナル伝達ドメイン(SD)を含有しない。

一部の態様では、対象におけるBリンパ球抗原(例えばCD19)関連がん(例えば白血病及びリンパ腫を含む血液がん)を処置する方法であって、本明細書に開示されるCAR発現細胞を含む有効量の養子免疫療法組成物を投与することを含む方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、養子免疫療法組成物のCAR発現細胞は、対象に由来する(例えば自家)。好ましくは、養子免疫療法組成物のCAR発現細胞は、ドナー試料、又は対象に由来しない(例えば同種)免疫細胞を含むバンク若しくはライブラリーに由来する。例えば、本明細書に開示される方法は、同種T細胞(例えば、PBMC試料、CD4⁺T細胞、及び/又はCD8⁺T細胞、例えばCTL)を、細胞バンク(例えば事前生成第三者ドナー由来エピトープ特異的CTLバンク)から選択することを含む。一部の実施形態では、方法は、少なくとも1種の免疫チェックポイント阻害薬を投与することをさらに含む。

一部の態様では、開示されるCARポリペプチドをコードする単離核酸、及び発現制御配列と作動可能に連結した前記単離核酸を含有する核酸ベクターが、本明細書に開示される。加えて、これらのベクターをトランスフェクトされるか、又はそうでなければ開示される核酸を含む細胞、並びに開示されるCARポリペプチドを発現及び/又は産生するためのこれらの細胞の使用が、本明細書に開示される。網羅的なリストであることを意図するものではないが、細胞は、免疫エフェクター細胞、例えば、αβT細胞、γδT細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、B細胞、自然リンパ球(ILC)、サイトカイン誘導キラー(CIK)細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞、又は制御性T細胞であり得る。一部の実施形態では、CARの抗原結合ドメインがBリンパ球抗原、例えばCD19、CD20、及び/又はCD22に結合する場合、細胞は、抗腫瘍免疫を呈する(例えば腫瘍に対する免疫応答を開始する)。

本発明のさらなる態様では、本明細書に開示される分子を、薬学的に許容される担体に含む医薬組成物が、本明細書に開示される。また、本明細書に開示される治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを伴う、対象におけるがんを処置する方法も、本明細書に開示される。一部の実施形態では、がんは、例えば、任意のBリンパ球抗原発現悪性腫瘍であり得る(例えば、CD19、CD20、及び/又はCD22を発現する。

一部の実施形態では、本明細書に開示されるBリンパ球抗原結合剤は、Bリンパ球表面ペプチド、例えば、CD19、CD20、及び/又はCD22と特異的に結合する抗体断片を含む。例えば、限定されないが、抗原結合ドメインはCD19、CD20、及び/又はCD22と特異的に結合する抗体のFab又は一本鎖可変断片(scFv)であり得る。一部のそのような実施形態では、抗原結合剤は、Bリンパ球抗原、例えば、CD19、CD20、及び/又はCD22と特異的に結合するアプタマーである。例えば、ある特定の実施形態では、抗原結合剤は、Bリンパ球抗原、例えば、CD19、CD20、及び/又はCD22と結合する能力に基づいてランダム配列プールから選択されるペプチドアプタマーであるか、又はそうでなければそれを含む。一部の実施形態では、Bリンパ球抗原結合剤は、Bリンパ球抗原と結合することができる天然リガンド又はそのバリアント及び/若しくは断片も含み得る。

本明細書に開示されるCAR(又はCAR関連)ポリペプチドは、免疫エフェクター細胞を活性化することができる膜貫通ドメイン及び内部ドメインも含有することができる。例えば、内部ドメインは、シグナル伝達ドメイン及び1つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含有することができる。

本発明の1つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面並びに特許請求の範囲から明らかとなるだろう。

ドナー由来標的BLCLにおけるCD19タンパク質発現の特徴付けを示す図である。 適合(自家)又は非適合標的BLCLと共培養した場合の、ドナー由来EBV感作抗CD19 CAR-T細胞によって誘導された標的化細胞傷害性及びアロ反応性を評価する電気インピーダンスアッセイからのデータを示すグラフである。細胞溶解活性は、非形質導入(NTD)EBV-CTLとCAR発現EBV-CTLの両方によって誘導される(上段)。しかしながら、CAR EBV-CTLは非適合標的BLCLに接触することに応答してCD19標的化TCR非依存性細胞溶解活性を誘導することができるのに対し、NTD EBV-CTLは、限定的なEBV特異的TCR指向性細胞溶解活性を呈する。 ルシフェラーゼアッセイに使用した各標的細胞株におけるCD19発現の特徴付けを示す図である。K562細胞株はCD19抗原もEBV抗原も発現せず、二重陰性対照として作用することが理解されるべきである。 EBV-CAR-T細胞によって誘導される標的化細胞溶解活性を実証するルシフェラーゼアッセイデータを示すグラフである。EBV-CAR-T細胞は、CD19発現細胞株のNALM6及びRAJI、並びにCD19を発現するように操作されたK562細胞のCAR指向性細胞溶解を呈した。最小の細胞溶解活性は、対照K562細胞において観察された。 非形質導入エフェクター細胞によって誘導された非特異的細胞溶解のドナー間でのばらつきを示すグラフである。 複数の標的細胞株の例示的なサイトカイン放出データを示すグラフである。 複数の標的細胞株のTH1炎症促進性サイトカイン放出データを示すグラフである。 複数の標的細胞株のTH2炎症促進性サイトカイン放出データを示すグラフである。 複数の標的細胞株のTH17炎症促進性サイトカイン放出データを示すグラフである。 複数の標的細胞株の制御性炎症性サイトカイン放出データ及び細胞溶解性サイトカイン放出データを示すグラフである。 複数の標的細胞株の化学誘因性サイトカイン(chemoattractive cytokine)放出データを示すグラフである。 複数の標的細胞株の活性化サイトカイン放出データを示すグラフである。 ドナー014-18から生成したエフェクターT細胞及び標的K562-CD19細胞に関する、種々のE:T比におけるサイトカイン放出ヒートマップである。 ドナー023-18から生成したエフェクターT細胞及び標的K562-CD19細胞に関する、種々のE:T比におけるサイトカイン放出ヒートマップである。 ドナー009-19から生成したエフェクターT細胞及び標的K562-CD19細胞に関する、種々のE:T比におけるサイトカイン放出ヒートマップである。 全身Nalm6誘導マウスモデルにおけるEBV感作抗CD19 CAR発現T細胞の安全性及び有効性評価のための研究設計を例示する図である。

詳細
本明細書に開示されるように、本発明は、がん関連Bリンパ球抗原を標的とするキメラ抗原受容体(CAR)を組換え発現する免疫細胞に少なくとも部分的に関する。そのようなBリンパ球抗原としては、これらに限定されないが、CD19、CD20、及びCD22が挙げられる。一部のそのような実施形態では、抗原はCD19であり、血液学的悪性腫瘍、例えば白血病及びリンパ腫と関連する。好ましい実施形態では、CD19は、CD19と選択的に結合するキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドを発現するように操作される免疫エフェクター細胞(すなわち、T細胞又はナチュラルキラー(NK)細胞)によって標的とされる。

T細胞療法の大きな進歩は、キメラ抗原受容体(CAR)の開発であった。第1世代CARは、T細胞によって発現する場合に、T細胞の標的を所定の疾患関連抗原(例えば腫瘍関連抗原)に変更することができる人工受容体として開発された。そのようなCARは、典型的には、T細胞受容体(TCR)由来のシグナル伝達ドメイン、例えばCD3ζと融合した、標的特異的抗体に由来する一本鎖可変断片(scFv)を含む。抗原と結合すると、CARは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)のリン酸化を惹起し、内因性抗原処理経路及びMHC拘束性を回避する細胞溶解、サイトカイン分泌、及び増殖に必要とされるシグナルカスケードを開始する。第2世代CAR設計には、活性化及び共刺激を増強するシグナル伝達ドメイン、例えばCD28及び/又は4-1BBがさらに含まれる。第2世代CARは、それ以前の対応物と比較して、より多くのIL-2分泌を誘導し、T細胞増殖及び持続性を高め、より大きな腫瘍拒絶を媒介し、T細胞生存期間を延長することが観察された。第3世代CARは、より強力なサイトカイン産生及び殺傷能に関する効力を増大するために複数のシグナル伝達ドメインを、例えばCD3ζ-CD28-OC40又はCD3ζ-CD28-41BBのように組み合わせることによって作製される。

一部の実施形態では、本明細書に記載されるCAR T細胞は、例えば、限定されないが、PD-1シグナル伝達を抑制又は阻害することによって、悪性細胞微小環境(例えば腫瘍微小環境)の任意の寛容原性効果に対抗するように操作される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるCARは、ウイルス又は非ウイルス抗原に感作されても、それを選択的に標的としてもよい。理想的な標的は、いかなる正常組織/臓器、又は少なくとも生命維持に必要な正常組織(心臓、肝臓、CNS、肺、及び一過性損傷に特に感受性であり得る他の組織)にも、密接に関連する正常細胞対応物、例えば幹及び/若しくは前駆細胞にも発現せず、副作用(例えばオンターゲット/オフ腫瘍又はバイスタンダー効果)を最小限にする。また、Bリンパ球抗原(例えば野生型及び/又は変異型CD19)と選択的に結合するキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドを発現するように操作される免疫エフェクター細胞、例えばT細胞又はナチュラルキラー(NK)細胞も、本明細書に開示される。したがって、開示されるCARポリペプチドを発現するように操作された開示される免疫エフェクター細胞の養子移入を伴う、血液学的悪性腫瘍を有する対象に標的化免疫(例えば抗腫瘍免疫)をもたらす方法もまた開示される。

腫瘍微小環境において、がん細胞及び宿主免疫細胞は相互作用し、がん進行の促進又は阻害を生じ得る。理想的には、免疫系はがん細胞を同定し、免疫応答を動員してがんを排除する。残念なことに、T細胞レベルでは、阻害性受容体、例えばPD-1及びTim-3の上方制御は、T細胞機能不全と相関する。これは、慢性C型肝炎ウイルス(HCV)感染症を有する患者の循環及び肝臓のHCV特異的CD8⁺T細胞とHCV非特異的CD8⁺T細胞の両方において観察されている。T細胞増殖及びIFN-γ分泌の部分的回復は、ex vivoにおいて、PD-1及びTim-3とそれらのそれぞれのリガンド(すなわち、PD-L1としても公知のB7-H1及びガレクチン-9)との結合を阻害することによって達成することができる。さらに、近年の報告では、持続性HCV感染症の標準療法であるIFN-αの長期投与が、ナイーブT細胞においてテロメア喪失を促進したことが実証されている。T細胞テロメアの短縮と最終分化(増殖可能性の低下を特徴とする)との間の相関性を考慮すると、IFN-αによって誘導されるT細胞「疲弊」は、HCV感染患者において免疫療法の重大な障壁となる可能性が高い。本明細書に開示されるある特定の態様では、本発明は、チェックポイント阻害戦略を用いる。チェックポイント阻害療法は、免疫応答を刺激又は阻害する免疫系の重要な調節因子を標的とする。そのような免疫チェックポイントは、がん疾患状態において(例えば腫瘍によって)、免疫系による攻撃を回避するために活用され得る。チェックポイント阻害研究は、PD-1阻害療法の活性に注目しており(El-Khoueiryら、(2017).「Nivolumab in patients with advanced hepatocellular carcinoma (CheckMate 040): an open-label, non-comparative, phase 1/2 dose escalation and expansion trial.」Lancet 389 (10088): 2492～2502ページ)、FDAは、奏効率20%のHCCの第二選択処置として、ニボルマブを承認している。

定義
「抗体」という用語は、免疫グロブリン、特異的結合能を維持するその誘導体、及び免疫グロブリン結合ドメインと相同又は大部分相同である結合ドメインを有するタンパク質を指す。これらのタンパク質は、天然供給源に由来しても、部分又は全体が合成によって製造されてもよい。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。抗体は、任意の種由来の任意の免疫グロブリンクラス、例えばヒトクラス:IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEのいずれかのメンバーであってもよい。例示的な実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物と共に使用される抗体は、IgGクラスの誘導体、例えば抗CD19抗体であるクローンFMC63である。完全免疫グロブリン分子に加えて、免疫グロブリン分子のキメラ、断片、又はポリマー、及び標的抗原と選択的に結合する免疫グロブリン分子のヒト又はヒト化バージョンもまた、「抗体」という用語に含まれる。

「抗体断片」という用語は、全長未満の抗体の任意の誘導体を指す。例示的な実施形態では、抗体断片は、全長抗体の特異的結合能の重大な部分を少なくとも保持する。抗体断片の例としては、これらに限定されないが、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、ダイアボディ、Fc、及びFd断片が挙げられる。抗体断片はいかなる手段によって製造してもよい。例えば、抗体断片は、完全抗体の断片化によって酵素的又は化学的に製造されても、部分的抗体配列をコードする遺伝子から組換えによって製造されても、全体又は部分が合成によって製造されてもよい。任意選択で、抗体断片は一本鎖抗体断片であってもよい。或いは、断片は、例えばジスルフィド連結によって一緒に連結する複数の鎖を含んでもよい。任意選択で、断片はまた、多分子複合体であってもよい。機能的抗体断片は、典型的には少なくとも約50アミノ酸を含み、より典型的には少なくとも約200アミノ酸を含む。

「抗原結合部位」という用語は、抗原のエピトープと特異的に結合する抗体の領域を指す。

「アプタマー」という用語は、具体的な標的分子に結合するオリゴ核酸又はペプチド分子を指す。これらの分子は、一般的に、ランダム配列プールから選択される。選択されるアプタマーは、特有の三次構造を適応させ、高い親和性及び特異性で標的分子を認識することができる。「核酸アプタマー」とは、その立体構造を介して標的分子に結合し、それによってそのような分子の機能を阻害又は抑制するDNA又はRNAオリゴ核酸である。核酸アプタマーは、DNA、RNA、又はそれらの組合せによって構成され得る。「ペプチドアプタマー」とは、可変ペプチド配列が定常足場タンパク質に挿入されている組合せタンパク質分子である。ペプチドアプタマーの同定は、典型的には、選択されるペプチドアプタマーが細胞内の文脈において安定に発現して正確に折り畳まれる確率を高める酵母ツーハイブリッド(yeast dihybrid)のストリンジェントな条件下で実施される。

「担体」という用語は、化合物又は組成物と組み合わせた場合に、化合物の調製、保存、投与、送達、効能、選択性、若しくは任意の他の特徴、又は有効成分の任意の分解を補助するか又は容易にし、対象における任意の有害な副作用を最小限にする化合物、組成物、物質、又は構造体を意味する。

「キメラ分子」という用語は、天然状態において別々に存在する2つ以上の分子を接合することによって作出される単一分子を指す。単一キメラ分子は、その全ての構成分子の所望の機能性を有する。キメラ分子の1つの種類は、融合タンパク質である。

「操作された抗体」という用語は、抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変ドメインに由来する抗原結合部位を含む抗体断片を少なくとも含み、任意選択でIgクラスのいずれか(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、及びIgY)由来の抗体の可変及び/又は定常ドメインの全体又は部分を含む組換え分子を指す。

「エピトープ」という用語は、抗体が優先的且つ特異的に結合する抗原の領域を指す。モノクローナル抗体は、分子的に定義することができる分子の単一の具体的なエピトープに優先的に結合する。本発明では、複数のエピトープは、多重特異性抗体によって認識され得る。

「融合タンパク質」という用語は、1つのポリペプチドのアミノ末端と別のポリペプチドのカルボキシル末端との間に形成されるペプチド結合を介した2つ以上のポリペプチドの接合によって形成されるポリペプチドを指す。融合タンパク質は、構成ポリペプチドの化学結合によって形成され得るか、又は単一の連続する融合タンパク質をコードする核酸配列由来の単一ポリペプチドとして発現し得る。一本鎖融合タンパク質とは、単一の連続するポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、分子生物学における従来の技法を使用して、2つの遺伝子をインフレームで接合して単一の核酸にし、次いで核酸を、融合タンパク質が産生する条件下で適切な宿主細胞において発現させることによって調製することができる。

「Fab断片」という用語は、酵素パパインを用いた抗体の切断によって生成される抗原結合部位を含む抗体の断片を指し、パパインは、ヒンジ領域のH鎖内ジスルフィド結合のN末端側で切断して、1つの抗体分子から2つのFab断片を生成する。

「F(ab')2断片」という用語は、酵素ペプシンを用いた抗体分子の切断によって生成される2つの抗原結合部位を含有する抗体の断片を指し、ペプシンは、ヒンジ領域のH鎖内ジスルフィド結合のC末端側で切断する。

「Fc断片」という用語は、抗体の重鎖の定常ドメインを含む抗体の断片を指す。

「Fv断片」という用語は、抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む抗体の断片を指す。

「遺伝子構築物」とは、ポリペプチドの「コード配列」を含むか又はそうでなければ生物学的に活性なRNA(例えば、アンチセンス、デコイ、リボザイム等)に転写可能であり、細胞、例えば哺乳動物細胞にトランスフェクトすることができ、構築物をトランスフェクトした細胞においてコード配列の発現を引き起こすことができる核酸、例えば、ベクター、プラスミド、ウイルスゲノム等を指す。遺伝子構築物は、コード配列と作動可能に連結する1つ以上の調節エレメント、及びイントロン配列、ポリアデニル化部位、複製起点、マーカー遺伝子等を含んでもよい。

「リンカー」という用語は、当技術分野において認識されており、2つの化合物、例えば2つのポリペプチドを接続する分子又は分子群を指す。リンカーは、単一の連結分子で構成されても、連結分子と、連結分子及び化合物を特定の距離だけ隔てることが意図されたスペーサー分子とを含んでもよい。

「多価抗体」という用語は、2つ以上の抗原認識部位を含む抗体又は操作された抗体を指す。例えば、「二価」抗体は2つの抗原認識部位を有し、「四価」抗体は4つの抗原認識部位を有する。「単一特異性」、「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」等の用語は、多価抗体に存在する異なる抗原認識部位特異性の数(抗原認識部位の数とは異なる)を指す。例えば、「単一特異性」抗体の抗原認識部位は、全て同じエピトープと結合する。「二重特異性」抗体は、第1のエピトープと結合する少なくとも1つの抗原認識部位、及び第1のエピトープと異なる第2のエピトープと結合する少なくとも1つの抗原認識部位を有する。「多価単一特異性」抗体は、全てが同じエピトープと結合する複数の抗原認識部位を有する。「多価二重特異性」抗体は複数の抗原認識部位を有し、そのうちのいくつかは第1のエピトープと結合し、いくつかは、第1のエピトープと異なる第2のエピトープと結合する。

「核酸」という用語は、単一ヌクレオチド、又は1つのヌクレオチドの3'位と別のヌクレオチドの5'末端とがリン酸基によって連結した2つ以上のヌクレオチドを含む天然又は合成分子を指す。核酸は長さによって限定されず、したがって、核酸にはデオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)が含まれ得る。

「と作動可能に連結」という用語は、核酸と別の核酸配列との機能的関係を指す。プロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳終止部位、並びに他のシグナル配列は、他の配列と作動可能に連結する核酸配列の例である。例えば、DNAと転写制御エレメントとの作動可能な連結とは、そのようなDNAの転写がDNAを特異的に認識、結合、及び転写するRNAポリメラーゼによってプロモーターから開始されるような、DNAとプロモーターとの物理的及び機能的関係を指す。

「薬学的に許容される」という用語は、適切な医学的判断の範囲内において、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適で、過剰な毒性も、刺激も、アレルギー応答も、他の問題若しくは合併症も伴わない、合理的なベネフィット/リスク比に見合う化合物、材料、組成物、及び/又は剤形を指す。

「ポリペプチド断片」又は「断片」という用語は、特定のポリペプチドに関して使用する場合、アミノ酸残基が参照ポリペプチドそれ自体と比較して欠失しているが、残りのアミノ酸配列は参照ポリペプチドのアミノ酸配列と通例同一であるポリペプチドを指す。そのような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端若しくはカルボキシ末端、又はその両方で生じ得る。断片は、典型的には、少なくとも約5、6、8、若しくは10アミノ酸長、少なくとも約14アミノ酸長、少なくとも約20、30、40、若しくは50アミノ酸長、少なくとも約75アミノ酸長、又は少なくとも約100、150、200、300、500、若しくはそれ以上のアミノ酸長である。断片は、参照ポリペプチドの生物活性を1つ以上保持することができる。様々な実施形態では、断片は、参照ポリペプチドの酵素活性及び/又は相互作用部位を含み得る。他の実施形態では、断片は免疫原性特性を有し得る。

「一本鎖可変断片」又は「scFv」という用語は、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとが連結しているFv断片を指す。1つ以上のscFv断片は、他の抗体断片(例えば重鎖又は軽鎖の定常ドメイン)と連結して、1つ以上の抗原認識部位を有する抗体構築物を形成してもよい。

「スペーサー」とは、本明細書で使用する場合、融合タンパク質を含むタンパク質を接合するペプチドを指す。全般的に、スペーサーは、タンパク質を接合すること、又はタンパク質との間のある最小距離若しくは他の空間的関係を保存すること以外の特定の生物活性を有しない。しかしながら、スペーサーの構成アミノ酸は、分子のある特性、例えば分子の折り畳み、正味電荷、又は疎水性に影響を及ぼすように選択されてもよい。

本明細書で使用する「特異的に結合する」又は「特異的結合」という用語は、ポリペプチド(抗体を含む)又は受容体に言及している場合、タンパク質及び他の生物製剤の異種集団におけるタンパク質又はポリペプチド又は受容体の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定された条件(例えば抗体の場合は免疫アッセイ条件)下において、指定のリガンド又は抗体は、試料に存在する他のタンパク質にも、リガンド又は抗体が生物中で接触し得る他のタンパク質にも著しい量では結合しない場合、その特定の「標的」に「特異的に結合する」(例えば抗体は内皮抗原に特異的に結合する)。全般的に、第2の分子と「特異的に結合する」第1の分子は、第2の分子に対して約10⁵M^-1超(例えば、10⁶M^-1、10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1、及び10¹²M^-1以上)の親和定数(Ka)を有する。例えば、MHC(例えばクラスI MHC又はクラスII MHC)に提示されるペプチドに結合するTCRの能力の場合、典型的には、TCRは、少なくとも約10-4M以下のKDの親和性でそのペプチド/MHCに特異的に結合し、非特異的及び非関連ペプチド/MHC複合体(例えばBSAペプチド又はカゼインペプチドを含む複合体)との結合に関する親和性の10分の1以下、100分の1以下、又は1000分の1以下の親和性(KDによって表される)で所定の抗原/結合パートナーに結合する。

「対象」という用語は、投与又は処置の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば哺乳動物であり得る。したがって、対象はヒト又は獣医学上の患者であり得る。「患者」という用語は、臨床医、例えば内科医の処置下にある対象を指す。

ある特定の実施形態では、本発明の薬剤は、単独で使用されても別の種類の治療剤と併用投与されてもよい。本明細書で使用する場合、「併用投与」又は「併用投与される」という語句は、以前に投与された治療剤が依然として体内で効果的である間に第2の薬剤が投与されるような(例えば2種類の薬剤が対象において同時に効果的であり、2種類の薬剤の相乗効果を含んでもよい)、2種類以上の異なる治療剤(例えば本明細書に開示されるCAR Tを含む組成物及び免疫チェックポイントの阻害薬)の任意の形態の投与を指す。例えば、異なる治療剤は、同じ製剤又は別々の製剤において同時に又は逐次に投与することができる。一部の好ましい実施形態では、CAR T細胞は、さらなる治療剤を発現する(例えば細胞表面に存在するか又は分泌する)。ある特定の実施形態では、異なる治療剤(例えばCAR T細胞及び免疫チェックポイント遮断分子)は、互いに約1時間、約12時間、約24時間、約36時間、約48時間、約72時間、又は約1週間以内に投与することができる。したがって、そのような処置を受ける対象は、異なる治療剤の組み合わされた効果から恩恵を受けることができる。

「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、核酸、例えば発現ベクターのレシピエント細胞への導入、例えば核酸の前記細胞の染色体DNAへの導入を意味する。

本明細書で使用する場合、「処置」という用語は、臨床病態の経過中に、処置される個体の自然経過を変更するように設計された臨床介入を指す。処置の望ましい効果としては、進行の速度の低下、病的状態の改善又は緩和、及び特定の疾患、障害、又は状態の寛解又は予後の改善が挙げられる。例えば、特定の疾患、障害、又は状態と関連する1つ以上の症状が軽減又は排除される場合、個体は成功裏に「処置される」。

「バリアント」という用語は、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換(例えば縮重バリアント)、アミノ酸をコードする各コドン(例えばDNA及びRNA)のゆらぎ位置内の置換、ペプチドのC末端に付加されるアミノ酸、又は参照配列と60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有するペプチドを有するアミノ酸又はペプチド配列を指す。

「ベクター」という用語は、ベクター配列が連結している別の核酸を細胞に輸送することができる核酸配列を指す。「発現ベクター」という用語には、細胞による発現に好適な形態の(例えば転写制御エレメントと連結した)遺伝子構築物を含有する任意のベクター(例えば、プラスミド、コスミド、又はファージ染色体)が含まれる。

「Bリンパ球抗原」及び特に「CD19」という用語は、抗原分子、例えばCD19分子の断片、バリアント(例えばアレルバリアント)、及び誘導体を含むことが意図される。例えば、限定されないが、一部の実施形態では、CD19は、野生型CD19又は変異型CD19である。一部のそのような実施形態では、Bリンパ球抗原は、細胞表面(例えば前がん性又は悪性細胞の表面)に発現する。

CD19と結合するのに好適な抗CD19抗体(及びそのscFvフォーマット)は当技術分野で周知であり、例えば、限定されないが、抗体FMC63、SJ25C1(JCAR015)、及びHD37(ブリナツモマブ)が含まれる。

キメラ抗原受容体(CAR)
免疫エフェクター細胞において発現して、特定の標的に対する活性(例えば血液がんに対する抗腫瘍活性)を増強することができるキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドが、本明細書に開示される。

一部の態様では、本明細書に開示されるCARは、3つのドメイン:外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び内部ドメインから構成される。

ある特定の実施形態では、外部ドメインは、Bリンパ球抗原結合領域、例えばCD19結合領域を含み、抗原認識を担う。CD19は、野生型CD19であっても変異型CD19であってもよい。外部ドメインは、任意選択で、CARがグリコシル化され免疫エフェクター細胞の細胞膜にアンカーされ得るように、シグナルペプチド(SP)も含有する。

一部の実施形態では、膜貫通ドメイン(TD)は、外部ドメイン(すなわち、細胞外ドメイン)を内部ドメイン(すなわち、細胞内ドメイン)に接続し、細胞によって発現する場合、細胞膜内に存在する。

一部の実施形態では、内部ドメインは、抗原認識後に活性化シグナルを免疫エフェクター細胞に伝達する。一部のそのような実施形態では、内部ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメイン(ISD)、及び任意選択で、共刺激シグナル伝達領域(CSR)を含有することができる。「シグナル伝達ドメイン(SD)」、例えばISDは、全般的に、リン酸化した場合にシグナル伝達カスケードを活性化する免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を含有する。「共刺激シグナル伝達領域(CSR)」という用語は、T細胞受容体によるT細胞活性化を増強することができる共刺激タンパク質受容体、例えば、CD28、41BB、及びICOS由来の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。

一部の実施形態では、内部ドメインは、SD又はCSRを含有するが、両方を含有することはない。これらの実施形態では、開示されるCARを含有する免疫エフェクター細胞は、欠損ドメインを含有する別のCAR(又はT細胞受容体)もまたそれぞれの抗原と結合する場合にのみ活性化する。

一部の実施形態では、開示されるCARは、式:
SP-BCA-HG-TM-CSR-SD、又は
SP-BCA-HG-TM-SD-CSR
(式中、「SP」は任意選択のシグナルペプチド(例えばCD8αリーダー配列に由来する)を表し、
「BCA」はBリンパ球抗原結合領域(例えばFMC63及びその誘導体)を表し、
「HG」は任意選択のヒンジドメイン(スペーサードメイン;例えばCD28に由来する)を表し、
「TM」は膜貫通ドメイン(例えばCD28に由来する)を表し、
「CSR」は1つ以上の共刺激シグナル伝達領域(例えばCD28に由来する)を表し、
「SD」はシグナル伝達ドメイン(例えばCD3ζ及びその変異体に由来する)を表し、
「-」はペプチド結合又はリンカーを表す)
によって定義される。

さらなるCAR構築物は、例えばFresnakら、Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2016年8月23日;16(9):566～81ページに記載されており、その全体はこれらのCARモデルの教示について参照により組み込まれる。

ある特定の実施形態では、CARは、例えば(限定されないが)、TRUCK、汎用CAR、自己駆動CAR、装甲CAR、自己破壊CAR、条件付きCAR、標識CAR、TenCAR、二重CAR、又はsCARであり得る。

TRUCK(全体的なサイトカイン殺傷のために再指向されたT細胞(T cells redirected for universal cytokine killing))は、キメラ抗原受容体(CAR)及び抗腫瘍サイトカインを共発現する。サイトカイン発現は、恒常的であってもT細胞活性化によって誘導されてもよい。CAR特異性によって標的化されると、炎症促進性サイトカインの局在化した産生により、内因性免疫細胞が腫瘍部位に動員され、抗腫瘍応答が増強し得る。

汎用同種CAR T細胞は、内因性T細胞受容体(TCR)及び/又は主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子をもはや発現しないように操作され、それによって移植片対宿主病(GVHD)又は拒絶をそれぞれ防止する。

自己駆動CARは、CAR及びケモカイン受容体を共発現し、腫瘍リガンドに結合し、それによって腫瘍ホーミングを増強する。

免疫抑制に抵抗性となるように操作されたCAR T細胞(装甲CAR)は、様々な免疫チェックポイント分子(例えば細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA4)又はプログラム細胞死タンパク質1(PD-1))をもはや発現しないように遺伝子改変されていてもよい。例示的な「ノックダウン」及び「ノックアウト」技法としては、これらに限定されないが、RNA干渉(RNAi)(例えば、asRNA、miRNA、shRNA、siRNA等)及びCRISPR干渉(CRISPRi)(例えばCRISPR-Cas9)が挙げられる。ある特定の実施形態では、CAR T細胞は、ドミナントネガティブ型のチェックポイント分子を発現するように操作される。一部のそのような実施形態では、免疫チェックポイント分子の細胞外リガンド結合ドメイン(すなわち、外部ドメイン)は、膜貫通膜と融合してリガンド結合に関して競合する。例えば、PD-1の細胞外リガンド結合ドメインはCD8膜貫通ドメインと融合し、したがって、標的細胞由来のPD-1リガンドに関して競合し得る。一部の実施形態では、CAR T細胞は、標的細胞に存在する阻害性免疫チェックポイントリガンドを活用する免疫チェックポイントスイッチ受容体を発現するように操作される。そのような実施形態では、免疫チェックポイント分子の細胞外リガンド結合ドメインは、シグナル伝達、刺激、及び/又は共刺激ドメインと融合する。例えば、PD-1の細胞外リガンド結合ドメインはCD28ドメインと融合し、したがって、PD-1シグナル伝達を遮断すると同時にCD28共刺激を実現する。さらなる実施形態では、CAR T細胞は、免疫チェックポイントシグナル伝達を遮断するアプタマー又はモノクローナル抗体と共に投与され得る。一部のそのような実施形態では、CAR T細胞(例えばCAR T細胞療法)は、PD-1遮断法、例えばPD-1/PD-L1アンタゴニストアプタマー又は抗PD-1/PD-L1抗体を用いた投与と組み合わされる。好ましい実施形態では、CAR T細胞及びPD-1経路遮断抗体は併用投与される。さらなる実施形態では、CAR T細胞は、免疫チェックポイント遮断抗体、例えば抗PD-1若しくは抗PD-L1、又はその断片を発現するか又は発現及び分泌するように操作される。さらなる実施形態では、CAR T細胞は、本明細書に記載される免疫チェックポイント遮断分子を発現するベクター(例えば操作されたウイルス)と共に投与される。

自己破壊CARは、電気穿孔法によって送達される、CARをコードするRNAを使用して設計することができる。或いは、T細胞の誘導性アポトーシスは、遺伝子改変リンパ球におけるチミジンキナーゼに結合するガンシクロビル、又はより近年に記載された低分子二量体化剤(dimerizer)によるヒトカスパーゼ9の活性化のシステムに基づいて達成することができる。

条件付きCAR T細胞は、初期状態では、シグナル1とシグナル2の両方の完全な形質導入を可能とする「回路」(例えば分子経路)を完成させる低分子の添加によってCAR T細胞を活性化するまで、不応性であるか又はスイッチが「オフ」になっている。或いは、T細胞は、その後投与される標的抗原を対象とする二次抗体に関する親和性を有するアダプター特異的受容体を発現するように操作され得る。

標識CAR T細胞は、CARと、既存のモノクローナル抗体剤が結合する腫瘍エピトープとを発現する。忍容不能な有害作用の状況において、モノクローナル抗体の投与はCAR T細胞を取り除き、追加のオフ腫瘍効果を伴わずに症状を和らげる。

タンデムCAR(TanCAR)T細胞は、細胞内共刺激ドメイン及びCD3ζドメインと融合した異なる親和性を有する2つの連結した一本鎖可変断片(scFv)からなる単一CARを発現する。TanCAR T細胞活性化は、標的細胞が両方の標的を共発現する場合にのみ達成される。

二重CAR T細胞は、異なるリガンド結合標的を有する2つの別々のCARを発現する。非限定的な例として、一方のCARがCD3ζドメインのみを含み、他方のCARが共刺激ドメインのみを含むことができる。一部のそのような実施形態では、二重CAR T細胞は、両方の標的が腫瘍に発現する場合に活性化する。

安全性CAR(sCAR)は、細胞内阻害ドメインと融合した細胞外scFvからなる。標準CARを共発現するsCAR T細胞は、標準CAR標的を有するがsCAR標的を欠く標的細胞と遭遇する場合にのみ活性化する。

一部の実施形態では、開示されるCARの抗原認識ドメインはscFvである。さらなる実施形態では、抗原認識ドメインは、本明細書に記載されている天然T細胞受容体(TCR)α及びβ一本鎖由来である。好ましくは、そのような抗原認識ドメインは、単純な外部ドメイン(例えばHIV感染細胞を認識するCD4外部ドメイン)を有する。或いは、そのような抗原認識ドメインは、外来性の認識成分、例えば連結したサイトカイン(サイトカイン受容体を保有する細胞の認識をもたらし得る)を含む。全般的に、本明細書に開示される方法に関して、所与の標的と高い親和性で結合するほぼ全てのものが、抗原認識領域として使用することができる。

細胞内部ドメインは、抗原認識後に、CARを発現する免疫エフェクター細胞にシグナルを伝達し、前記免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1つを活性化する。ある特定の実施形態では、T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、内部ドメインは、T細胞受容体(TCR)の「細胞内シグナル伝達ドメイン」及び任意選択の共役受容体を含み得る。通例では細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合では鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分が使用される範囲において、そのような短縮された部分は、エフェクター機能シグナルを形質導入する限り、完全鎖の代わりに使用することができる。

TCR複合体の一次活性化を制御し、刺激的に作用する細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)として公知のシグナル伝達モチーフを含有してもよい。ITAM含有細胞質シグナル伝達配列の例としては、CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD32(FcγRIIA)、DAP10、DAP12、CD79a、CD79b、FcγRIγ、FcγRIIIγ、FcεRIβ(FCERIB)、及びFcεRIγ(FCERIG)に由来するものが挙げられる。

特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ(CD3ζ、例えばTCRゼータ、GenBank受託番号BAG36664.1)に由来する。T細胞受容体T3ゼータ鎖又はCD247(分化抗原群247)としても公知のT細胞表面糖タンパク質CD3ζ鎖は、ヒトにおいてCD247遺伝子によってコードされるタンパク質である。CD3分子の細胞内尾部は、TCRのシグナル伝達能に不可欠な単一のITAMを含有する。ζ鎖(CD3ζ)の細胞内尾部は3つのITAMを含有する。一部の実施形態では、ζ鎖は変異型ζ鎖である。例えば、変異型ζ鎖は、少なくとも1つのITAMに前記ITAMを非機能的にするような変異、例えば点変異を含む。一部のそのような実施形態では、膜近位ITAM(ITAM1)、膜遠位ITAM(C末端の第3のITAM、ITAM3)、又はその両方が非機能的である。さらなる実施形態では、2つの膜近位ITAM(ITAM1及びITAM2)又は2つの膜遠位ITAM(ITAM2及びITAM3)が非機能的である。さらなる実施形態では、ITAM2のみが非機能的である。一部の実施形態では、変異型ζ鎖は、少なくとも1つのITAMが欠損しているような欠失(例えば短縮)変異を含む。一部のそのような実施形態では、ζ鎖は膜近位ITAM(ITAM1)、膜遠位ITAM(ITAM3)、又はその両方を欠損している。他の実施形態では、ζ鎖は、2つの膜近位ITAM(ITAM1及びITAM2)又は2つの膜遠位ITAM(ITAM2及びITAM3)を欠損している。さらなる実施形態では、ζ鎖はITAM2を欠損している。変異型CD3ζを産生する方法は、当業者に公知である(Bridgeman JSら、Clin Exp Immunol. 2014年2月; 175(2):258～67ページ)。導入されたCARから少なくとも1つのITAMを除去することは、CD3ζ媒介アポトーシスを減少し得る。或いは、導入されたCARから少なくとも1つのITAMを除去することは、機能の喪失を伴わずにCARのサイズを縮小することができる。そのような変更されたCD3ζドメインを含むCARは、本発明によって企図される。

また、特有な機能特性をCARに付与する変更されたCD28ドメインを含むCARも企図される。この点において、天然CD28ドメインは、刺激後のシグナル伝達経路を制御するアミノ酸配列YMNM、PRRP、及びPYAPからなる3つの細胞内サブドメインを含む(例えばこの教示について参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2019/010383号を参照のこと)。本明細書に記載されるCAR構築物は、YMNM、PRRP、及び/又はPYAPサブドメインのうちの1つ以上が前記サブドメインを増幅、減衰、又は不活性化するように変異又は欠失しており、それによってCAR-T機能をモジュレートする改変CD28ドメインを含んでもよい。

第1世代CARは、典型的には、内因性TCRからのシグナルの一次伝達物質であるCD3ζ鎖由来の細胞内ドメインを有した。第2世代CARは、様々な共刺激タンパク質受容体(例えば、CD28、41BB、ICOS)由来の細胞内シグナル伝達ドメインをCARの内部ドメインに付加して、追加のシグナルをT細胞に提供する。例えば、標的特異的ScFvは、共刺激受容体CD28の細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメイン並びにT細胞受容体関連CD3ζ鎖の細胞質シグナル伝達ドメインと融合した。前臨床研究は、第2世代のCAR設計がT細胞の抗腫瘍活性を改善することを示している。より近年の第3世代CARは、効力をさらに増大するために複数のシグナル伝達ドメインを組み合わせる。これらのCARを移植したT細胞は、共刺激受容体/リガンド相互作用に依存しない増大、活性化、持続性、及び腫瘍根絶効率の改善を実証している(Imai Cら、Leukemia 2004 18:676～84ページ、Maher Jら、Nat Biotechnol 2002 20:70～5ページ)。

例えば、CARの内部ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインを単独で含むように設計することも、本発明のCARの文脈において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせることもできる。例えば、CARの細胞質ドメインは、CD3ζ鎖部分及び共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むCARの部分を指す。共刺激分子とは、リンパ球の抗原に対する効率的な応答に必要とされる、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、並びにCD83、CD8、CD4、b2c、CD80、CD86、DAP10、DAP12、MyD88、BTNL3、NKG2D、及びそれらの変異体と特異的に結合するリガンドが挙げられる。したがって、CARが、共刺激シグナル伝達要素としてのCD28と共に主に例示されるが、他の共刺激要素が単独で又は他の共刺激シグナル伝達要素と組み合わせて使用されてもよい。

一部の実施形態では、CARはヒンジ配列を含む。ヒンジ配列とは、抗体の柔軟性を高める短いアミノ酸配列である(例えばWoofら、Nat. Rev. Immunol.、4(2): 89～99ページ(2004)を参照のこと)。ヒンジ配列は、抗原認識部分(例えば、抗CD19、抗CD20、抗CD22、又はscFv)と膜貫通ドメインとの間に位置し得る。ヒンジ配列は、任意の好適な分子に由来するか又はそれから取得される任意の好適な配列であり得る。一部の実施形態では、例えば、ヒンジ配列はCD8a分子又はCD28分子に由来する。

膜貫通ドメインは、天然供給源に由来しても合成供給源に由来してもよい。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通領域は、少なくともT細胞受容体のアルファ(α)、ベータ(β)、若しくはゼータ(ζ)鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例えば、CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、又はCD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、及びPAG/Cbpの膜貫通領域に由来し得る(すなわち、含み得る)。或いは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、膜貫通ドメインは、主に疎水性の残基、例えばロイシン及びバリンを含む。一部の実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端に見出され得る。短い、例えば2～10アミノ酸長のオリゴ又はポリペプチドリンカーは、CARの膜貫通ドメインと細胞質内(endoplasmic)ドメインとの連結を形成し得る。

したがって、本明細書に開示される本発明の好ましい実施形態では、CARは、式:
SP-BCA-HG-TM-CSR-SD
(式中、任意選択のシグナルペプチド/リーダー配列はCD8αリーダー配列に由来し、
Bリンパ球抗原結合領域は抗CD19抗体クローンFMC63に由来するscFvであり、
ヒンジドメインはヒトCD28に由来し(例えば配列番号12)、
膜貫通ドメインはヒトCD28に由来し(例えば配列番号13)、
共刺激シグナル伝達領域はヒトCD28に由来し(例えば配列番号14)、
シグナル伝達ドメインは膜近位ITAM(ITAM1)のみが機能的であるCD3ζ鎖(例えば配列番号11)を含む)によって定義される。任意選択で、CARは、当技術分野で公知の少なくとも1つの分子タグをさらに含んでもよい。例えば、限定されないが、CARは、標識リガンド、例えば¹²⁴I-NGFと結合するタグとして低親和性神経成長因子受容体(LNGFR)を含んでもよく、そのような相互作用、例えば¹²⁴I-NGF/LNGFRは、好ましくは非侵襲的に(例えば陽電子放射断層撮影によって)モニタリングすることができる。

一部の実施形態では、CARは2つ以上の膜貫通ドメインを有し、それらは、同じ膜貫通ドメインの繰り返しであっても異なる膜貫通ドメインであってもよい。

一部の実施形態では、CARは、この教示について参照により組み込まれる国際公開第2015/039523号に記載されているような複数鎖CARである。複数鎖CARは、異なる膜貫通ポリペプチドに別々の細胞外リガンド結合及びシグナル伝達ドメインを含むことができる。シグナル伝達ドメインは、膜近傍位置に集合するように設計することができ、これにより天然受容体により近い、最適なシグナル伝達を付与する柔軟な構造体が形成される。例えば、複数鎖CARは、FcεRIα鎖の一部及びFcεRIβ鎖の一部を、これらのFcεRI鎖が自然と一緒に二量体化してCARを形成するように含むことができる。

一部の実施形態では、CARは1つのシグナル伝達ドメインを含有する。他の実施形態では、CARは1つ以上のシグナル伝達ドメイン(共刺激シグナル伝達ドメイン)を含有する。1つ以上のシグナル伝達ドメインは、CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、FcγRI-γ、FcγRIII-γ、FcεRIβ、FcεRIγ、DAP10、DAP12、CD32、CD79a、CD79b、CD28、CD3C、CD4、b2c、CD137(41BB)、ICOS、CD27、CD28δ、CD80、NKp30、OX40、及びそれらの変異体から選択されるポリペプチドであり得る。

以下の表1、2、及び3は、標的結合ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインの一部の例示的な組合せを提供する。そのような例は、例示を目的としており、本明細書に開示されるCARに生じ得る組合せの網羅的なリストであることを意図するものではない。

一部の実施形態では、抗Bリンパ球抗原結合剤は、一本鎖可変断片(scFv)抗体である。好ましくは、そのような抗Bリンパ球抗原結合剤は、一本鎖可変断片(scFv)抗CD19抗体である。抗CD19 scFvの親和性/特異性は、大部分が重(V_H)及び軽(V_L)鎖の相補性決定領域(CDR)内の特定の配列によって駆動される。各V_H及びV_L配列は、3つのCDR(CDR1、CDR2、CDR3)を有する。

一部の実施形態では、抗CD19結合剤は、天然抗体、例えばモノクローナル抗体に由来する。場合によっては、抗体はヒト抗体である。場合によっては、抗体は、ヒトに投与される場合に、より低い免疫原性となるような変更を受けている。例えば、変更は、キメラ化、ヒト化、CDR移植、脱免疫化、及び最も類似したヒト生殖細胞系列配列に対応するフレームワークアミノ酸の変異から選択される1つ以上の技法を含む。好ましくは、抗体はFMC63である。

好ましい実施形態では、抗CD19結合剤は、抗体FMC63に由来する一本鎖可変断片(scFv)抗体である。

また、抗Bリンパ球抗原、例えばCD19、及び少なくとも1つの追加のがん関連抗原(例えば腫瘍抗原)を標的とする二重特異性CARも開示される。また、異なる抗原、例えば別のがん関連抗原と結合する別のCARと組み合わせた場合にのみ働くように設計されたCARも開示される。例えば、これらの実施形態では、開示されるCARの内部ドメインは、シグナル伝達ドメイン(SD)又は共刺激シグナル伝達領域(CSR)のみを含有することができ、両方を含有することはできない。第2のCAR(又は内因性T細胞)は、活性化する場合、欠損シグナルを提供する。例えば、開示されるCARがSDを含有するがCSRを含有しない場合、このCARを含有する免疫エフェクター細胞は、CSRを含有する別のCAR(又はT細胞)がそれぞれの抗原と結合する場合にのみ活性化する。同様に、開示されるCARがCSRを含有するがSDを含有しない場合、このCARを含有する免疫エフェクター細胞は、SDを含有する別のCAR(又はT細胞)がそれぞれの抗原と結合する場合にのみ活性化する。

前記腫瘍抗原は、免疫応答、特にT細胞媒介免疫応答を誘発する、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質を含む。追加の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原の抗体又は天然リガンドであり得る。追加の抗原結合ドメインの選択は、処置される特定の種類のがんに依存することになる。腫瘍抗原は当技術分野で周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、EGFRvIII、IL-11Ra、IL-13Ra、EGFR、FAP、B7H3、Kit、CA LX、CS-1、MUC1、BCMA、bcr-abl、HER2、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α-フェトプロテイン(AFP)、ALK、代替的及び/又は特異的CD19エピトープ、TIM3、サイクリンBl、レクチン反応性AFP、Fos関連抗原1、ADRB3、サイログロブリン、EphA2、RAGE-1、RUl、RU2、SSX2、AKAP-4、LCK、OY-TESl、PAX5、SART3、CLL-1、フコシルGM1、GloboH、MN-CA IX、EPCAM、EVT6-AML、TGS5、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ポリシアル酸(physialic acid)、PLAC1、RUl、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、ルイスY、sLe、LY6K、HSP70、HSP27、mut hsp70-2、M-CSF、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIBI、BORIS、プロスターゼ、前立腺特異的抗原(PSA)、PAX3、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、LMP2、NCAM、p53、p53変異体、Ras変異体、gplOO、プロステイン、OR51E2、PANX3、PSMA、PSCA、Her2/neu、hTERT、HMWMAA、HAVCR1、VEGFR2、PDGFR-β、サバイビン及びテロメラーゼ、レグマイン、HPV E6,E7、精子タンパク質17、SSEA-4、チロシナーゼ、TARP、WT1、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、ML-IAP、MAGE、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-C1、MAGE-C2、アネキシン-A2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、メランA/MART1、XAGE1、ELF2M、ERG(TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、好中球エラスターゼ、肉腫転座切断点、NY-BR-1、ephnnB2、CD20、CD22、CD24、CD30、TIM3、CD38、CD44v6、CD97、CD171、CD179a、アンドロゲン受容体、FAP、インスリン成長因子(IGF)-I、IGFII、IGF-I受容体、GD2、o-アセチルGD2、GD3、GM3、GPRC5D、GPR20、CXORF61、葉酸受容体(FRa)、葉酸受容体β、ROR1、Flt3、TAG72、TN Ag、Tie2、TEM1、TEM7R、CLDN6、TSHR、UPK2、並びにメソテリンが挙げられる。ある特定の好ましい実施形態では、腫瘍抗原は、葉酸受容体(FRa)、メソテリン、EGFRvIII、IL-13Ra、CD123、CD19、TIM3、BCMA、GD2、CLL-1、CA-IX、MUCl、HER2、及びそれらの任意の組合せから選択される。

腫瘍抗原のさらなる非限定的な例としては、以下のものが挙げられる:分化抗原、例えば、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、及び腫瘍特異的多系統抗原、例えば、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pi5;過剰発現胎児抗原、例えばCEA;過剰発現癌遺伝子及び変異した腫瘍抑制遺伝子、例えば、p53、Ras、HER-2/neu;染色体転座の結果として生じる特有な腫瘍抗原;例えば、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR;並びにウイルス抗原、例えば、エプスタインバーウイルス抗原EBVA及びヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6及びE7。他のタンパク質に基づく大きな抗原としては、SCCA、GP73、FC-GP73、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3＼CA27.29＼BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68＼P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733＼EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCASl、SDCCAG1 6、TA-90＼Mac-2結合タンパク質＼シクロフィリン(cyclophilm)C関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、GPC3、MUC16、TAG-72、LMP1、EBMA-1、BARF-1、CS1、CD319、HER1、B7H6、L1CAM、IL6、及びMETが挙げられる。

CARリガンド結合ドメイン
本明細書に開示されるCARの細胞外ドメインは、全般的に、標的抗原と結合する抗原認識ドメインを含む。そのような抗原特異的結合ドメインは、典型的には、抗体に由来する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、機能的抗体断片又はその誘導体(例えば、scFv若しくはFab、又は抗体の任意の好適な抗原結合断片)である。好ましい実施形態では、抗原結合ドメインは一本鎖可変断片(scFv)である。一部のそのような実施形態では、scFvはモノクローナル抗体(mAb)由来である。ある特定の好ましい実施形態では、抗原特異的結合ドメイン(例えばscFv)は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるSadelainら、Nat Rev Cancer 2003 3:35～45ページに開示されているリンパ球活性化に関与する膜貫通及び/又はシグナル伝達モチーフと融合する。

抗Bリンパ球抗原scFv
一部の実施形態では、抗Bリンパ球抗原scFvは、CDR1、CDR2、及びCDR3配列を有する重鎖可変(V_H)ドメイン、並びにCDR1、CDR2、及びCDR3配列を有する軽鎖可変(V_L)ドメインを含むことができる。好ましい実施形態では、抗Bリンパ球抗原scFvは、抗CD19、抗CD20、又は抗CD22 scFvである。最も好ましくは、scFvは抗CD19 scFvである。

一部のそのような抗体は、例えば、Zolaら、「Preparation and characterization of a chimeric CD19 monoclonal antibody.」Immunology and Cell Biology 1991、69、411～422ページ、及びNicholsonら、「Construction and Characterization of a Functional CD19 Specific Single Chain Fv Fragment For Immunotherapy of B Lineage Leukemia AND Lymphoma.」Molecular Immunology 1997、(34)16-17、1147～1165ページに記載されている。これらの刊行物は、特にそれらに記載されている抗体のために、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

核酸及びベクター
また、開示される免疫エフェクター細胞においてBリンパ球抗原特異的CARの発現を可能にする、開示されるBリンパ球抗原特異的CARをコードするポリヌクレオチド及びポリヌクレオチドベクターも開示される。

開示されるCARをコードする核酸配列及びその領域は、当技術分野で公知の組換え法を使用することによって、例えば、標準技法を使用して、その遺伝子を発現する細胞由来のライブラリーをスクリーニングすること、それを含むことが公知のベクターから遺伝子を得ること、又はそれを含有する細胞及び組織から直接単離すること等によって取得することができる。或いは、目的の遺伝子は、クローニングされるのではなく合成によって産生することができる。例示的な核酸配列は、CD8リーダー配列、FMC63 scFv標的ドメイン、CD28ドメイン、変異型CD3ζドメイン(例えば、2つのC末端ITAMドメイン、すなわち、ITAM2及びITAM3における機能性を欠くCD3ζドメイン)、又はそれらの任意の組合せのそれぞれを含むCARをコードし得る。好ましくは、そのようなCARは、配列番号1に示される配列を含む核酸配列によってコードされ得る。

CARをコードする核酸の発現は、典型的には、CARポリペプチドをコードする核酸をプロモーターと作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写及び翻訳終結因子、開始配列、並びにプロモーターを含有する。

開示される核酸は、いくつかの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特定の目的のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。

さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えば、Sambrookら(2001、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York)並びに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられる。全般に、好適なベクターは、少なくとも1つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1つ以上の選択マーカーを含有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドベクターは、レンチウイルス又はレトロウイルスベクターである。

ウイルスに基づくいくつかの系は、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための簡便なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当技術分野で公知の技法を使用してベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスは単離され、in vivo又はex vivoにおいて対象の細胞に送達することができる。

好適なプロモーターの一例は、最初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それと作動的に連結した任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長成長因子-1α(EF-1α)である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列、例えば、これらに限定されないが、シミアンウイルス40(SV40)初期プロモーター、MND(骨髄増殖性肉腫ウイルス)プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)長鎖末端反復配列(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター、例えば、これらに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターもまた使用することができる。或いは、プロモーターは誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターの例としては、これらに限定されないが、メタロチオネイン(metallothionine)プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。

追加のプロモーターエレメント、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。典型的には、これらは開始部位の30～110bp上流の領域に位置するが、近年では、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも機能エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は多くの場合柔軟であり、そのためプロモーター機能は、エレメントが互いに対して反転又は移動した場合であっても保存される。

CARポリペプチド又はその部分の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、選択マーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか又はその両方を含有して、ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染させる試みがなされた細胞の集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にすることもできる。他の態様では、選択マーカーは、DNAの別々の小片に保有され、同時トランスフェクション手順に使用されてもよい。選択マーカーとレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞での発現を可能にする適切な調節配列と隣接していてもよい。有用な選択マーカーとしては、例えば抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。

レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定するため、及び調節配列の機能性を評価するために使用される。全般に、レポーター遺伝子とは、レシピエント生物又は組織に存在することもそれによって発現することもない遺伝子であって、ある容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性、蛍光、検出可能リガンドへの特異的結合によって発現が示されるポリペプチドをコードする、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞に導入された後の好適な時間にアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる。例えば、一部の実施形態では、本明細書に開示されるCAR、及び/又は前記CARをコードする核酸配列は、当技術分野で公知の少なくとも1つの分子タグをさらに含み得る。いかなる1つの特定の理論にも戦略にも拘束されることを望むものではないが、タグは、標識リガンド¹²⁴I-NGFと結合する形質導入タグとして低親和性神経成長因子受容体(LNGFR)を含んでもよい。¹²⁴I-NGF/LNGFR相互作用は、非侵襲的に(例えば陽電子放射断層撮影によって)モニタリングすることができる。一部のそのような実施形態では、本明細書に記載されるCARをコードするベクターの核酸配列は、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列、例えば2Aペプチドをコードする配列を含み得る。ピコルナウイルスの口蹄疫ウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、あるコドンからその次のコドンまで、それらのコドンによってコードされる2つのアミノ酸の間のペプチド結合の形成を行わないリボソーム「スキップ」を引き起こす。したがって、2つのポリペプチドは、インフレームの2Aオリゴペプチド配列によって分離されている場合(例えば、CAR及びレポーター遺伝子、例えば分子タグが2Aオリゴペプチド配列によって分離されている場合)、mRNA内の単一の連続するオープンリーディングフレームから合成することができる。そのようなリボソーム「スキップ」又は「自己切断」機構は当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされるいくつかのタンパク質の発現のためにいくつかのベクターによって使用されることが公知である。

ポリペプチド(例えば、分泌型、膜貫通、及び/又は細胞表面ポリペプチド)を宿主細胞の分泌経路に導くために、分泌シグナル配列(単にシグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても公知)が、ポリヌクレオチド配列又はベクター配列に提供される。分泌シグナル配列は、目的のポリペプチド(例えばCAR)をコードする核酸配列と作動可能に連結する。2つの配列は正しい読み枠で接合し、新規に合成されるポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くように位置する。そのような分泌シグナル配列は、典型的には、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の5'に位置するが、ある特定の分泌シグナル配列は、目的の核酸配列の他の場所に位置することがある。したがって、好ましい実施形態では、本明細書に開示されるCAR、及び/又は前記CARをコードする核酸配列は、シグナル配列をさらに含み得る。最も好ましくは、シグナル配列は、CD8αリーダー配列又はその断片を含む。翻訳後修飾により細胞表面に提示されたCARポリペプチド(すなわち、成熟CARポリペプチド)からそのようなリーダー配列を除去できることは、当業者によって理解されるだろう。

好適な発現系は周知であり、公知の技法を使用して調製しても、商業的に取得してもよい。全般に、レポーター遺伝子の最も高いレベルの発現を示す最小の5'隣接領域を有する構築物は、プロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子と連結され、プロモーター駆動転写をモジュレートする能力に関して薬剤を評価するために使用することができる。遺伝子を細胞に導入し発現させる方法は、当技術分野で公知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当技術分野のいかなる方法によっても宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、電気穿孔法等が挙げられる。ベクター及び/又は外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当技術分野で周知である。例えばSambrookら(2001、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York)を参照のこと。

目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法としては、DNA及びRNAベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、とりわけレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えばヒト細胞に挿入するための最も広く使用される方法になっている。

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段としては、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、並びに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質に基づく系が挙げられる。in vitro及びin vivoにおいて送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば人工膜小胞)である。

非ウイルス送達システムが利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。別の態様では、核酸は、脂質と会合してもよい。脂質と会合する核酸は、リポソームの水性内部に封入され得るか、リポソームの脂質二重層内に散在し得るか、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と会合する連結分子を介してリポソームに結合し得るか、リポソームに捕捉され得るか、リポソームと複合体を形成し得るか、脂質を含有する溶液に分散され得るか、脂質と混合され得るか、脂質と組み合わされ得るか、懸濁液として脂質に含有され得るか、ミセルに含有される若しくはミセルと複合体を形成し得るか、又はそうでなければ脂質と会合し得る。脂質、脂質/DNA、又は脂質/発現ベクター会合組成物は、溶液においていかなる特定の構造にも限定されない。例えば、それらは二重層構造に存在しても、ミセルとして存在しても、構造が「崩壊」していてもよい。また、単に溶液中に散在し、場合によりサイズの点でも形状の点でも均一でない凝集体を形成してもよい。脂質は、天然に存在する脂質でも合成脂質でもよい脂肪物質である。例えば、脂質としては、細胞質に天然に存在する脂肪滴、並びに長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含有する化合物のクラス、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドが挙げられる。使用に好適な脂質は、商業的供給源から取得することができる。例えば、ジミリストイル(dimyristyl)ホスファチジルコリン(「DMPC」)はSigma、St. Louis、Mo.から取得することができ、リン酸ジセチル(「DCP」)はK & K Laboratories(Plainview、N.Y.)から取得することができ、コレステロール(「Choi」)はCalbiochem-Behringから取得することができ、ジミリストイル(dimyristyl)ホスファチジルグリセロール(「DMPG」)及び他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc(Birmingham、Ala.)から取得され得る。

免疫エフェクター細胞
また、開示されるCARを発現するように操作される免疫エフェクター細胞(本明細書では「CAR-T細胞」とも称される)も開示される。これらの細胞は、好ましくは、処置される対象から取得される(すなわち、自家である)。しかしながら、一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞株又はドナーエフェクター細胞(同種)が使用される。免疫エフェクター細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含むいくつかの供給源から取得することができる。免疫エフェクター細胞は、当業者に公知の多くの技法、例えばFicoll(商標)分離を使用して対象から採取される血液から取得することができる。例えば、個体の循環血由来の細胞は、アフェレーシスによって取得され得る。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、赤血球細胞を溶解し単球を枯渇させることによって、例えばPERCOLL(商標)勾配を介した遠心分離又は対向流遠心溶出によって、末梢血リンパ球から単離される。免疫エフェクター細胞の具体的な亜集団は、ポジティブ又はネガティブセレクション技法によってさらに単離することができる。例えば、免疫エフェクター細胞は、ポジティブセレクションを受ける細胞に特有な表面マーカーを対象とする抗体の組合せを使用して、例えば、所望の免疫エフェクター細胞のポジティブセレクションに十分な時間の抗体コンジュゲートビーズとのインキュベーションによって、単離することができる。或いは、免疫エフェクター細胞集団の濃縮は、ネガティブセレクションを受ける細胞に特有な表面マーカーを対象とする抗体の組合せを使用するネガティブセレクションによって遂行することができる。

一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、感染性疾患及び外来物質から身体を防御することに関与する任意の白血球を含む。例えば、免疫エフェクター細胞は、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、又はそれらの任意の組合せを含み得る。例えば、免疫エフェクター細胞は、Tリンパ球、好ましくは細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を含み得る。

T細胞又はTリンパ球は、細胞表面のT細胞受容体(TCR)の存在によって、他のリンパ球、例えばB細胞及びナチュラルキラー細胞(NK細胞)から区別することができる。それらは、胸腺において成熟するためにT細胞と称される(だが、一部は扁桃においても成熟する)。T細胞のサブセットはいくつか存在し、それぞれが別個の機能を有する。

ヘルパーT細胞(T_H細胞)は、B細胞の形質細胞及びメモリーB細胞への成熟、並びに細胞傷害性T細胞及びマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて、他の白血球細胞を補助する。ヘルパーT細胞は、表面にCD4糖タンパク質を発現するため、CD4⁺T細胞としても公知である。ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞(APC)の表面に発現するMHCクラスII分子によってペプチド抗原を提示される場合に活性化する。活性化すると、ヘルパーT細胞は急速に分裂し、能動免疫応答を制御又は補助するサイトカインと称される低分子タンパク質を分泌する。ヘルパーT細胞は、異なるサイトカインを分泌して異なる種類の免疫応答を容易にするT_H1、T_H2、T_H3、T_H17、T_H9、又はT_FHを含むいくつかの亜型のうちの1つに分化することができる。

細胞傷害性T細胞(T_C細胞又はCTL)は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関係する。細胞傷害性T細胞は、表面にCD8糖タンパク質を発現するため、CD8⁺T細胞としても公知である。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面に存在するMHCクラスI分子と会合した抗原に結合することによって、標的を認識する。IL-10、アデノシン、及び制御性T細胞によって分泌される他の分子を介して、CD8⁺細胞は、不活性化させてアネルギー状態にすることができ、これにより自己免疫疾患を防止する。

メモリーT細胞とは、感染が回復した後長期間持続する抗原特異的T細胞のサブセットである。メモリーT細胞は、同種抗原に再曝露されると短時間で多数のエフェクターT細胞に増大し、したがって、免疫系に過去の感染の「メモリー」を提供する。メモリー細胞はCD4⁺又はCD8⁺のいずれかであり得る。メモリーT細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質CD45ROを発現する。

以前は抑制性T細胞として公知であった制御性T細胞(T_reg細胞)は、免疫学的寛容の維持に非常に重要である。その主な役割は、免疫反応の終盤にT細胞媒介免疫を停止すること、及び胸腺におけるネガティブセレクションのプロセスを回避した自己反応性T細胞を抑制することである。CD4⁺T_reg細胞の2つの主なクラス-天然に存在するT_reg細胞及び適応T_reg細胞-が記載されている。

ナチュラルキラーT(NKT)細胞(ナチュラルキラー(NK)細胞と混同されるべきではない)は、獲得免疫系と自然免疫系との橋渡しをする。主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子によって提示されるペプチド抗原を認識する従来のT細胞と異なり、NKT細胞は、CD1dと称される分子によって提示される糖脂質抗原を認識する。

一部の実施形態では、T細胞はCD4⁺細胞の混合物を含む。他の実施形態では、T細胞は、細胞表面発現に基づいて1つ以上のサブセットに関して濃縮される。例えば、場合によっては、T細胞は、細胞傷害性CD8⁺Tリンパ球である。一部の実施形態では、T細胞は、α及びβ鎖の代わりに1本のγ鎖及び1本のδ鎖を有する別個のT細胞受容体(TCR)を有するγδT細胞を含む。

ナチュラルキラー(NK)細胞は、ウイルス感染及び形質転換細胞を殺傷することができるCD56⁺CD3^-大顆粒リンパ球であり、自然免疫系の決定的な細胞サブセットを構成する(Godfrey Jら、Leuk Lymphoma 2012 53:1666～1676ページ)。細胞傷害性CD8⁺Tリンパ球と異なり、NK細胞は、事前の感作を必要とせずに腫瘍細胞に対する細胞傷害を開始し、MHC-I陰性細胞を根絶することもできる(Narni-Mancinelli Eら、Int Immunol 2011 23:427～431ページ)。NK細胞は、サイトカインストーム(Morgan RAら、Mol Ther 2010 18:843～851ページ)、腫瘍崩壊症候群(Porter DLら、N Engl J Med 2011 365:725～733ページ)、及びオンターゲット、オフ腫瘍効果に関する潜在的に致死的な合併症を回避し得るため、より安全なエフェクター細胞である。NK細胞は、がん細胞の殺し屋として周知の役割を有し、NK細胞の障害は、多発性骨髄腫(MM)の進行に非常に重要であることが十分に裏付けられているが(Godfrey Jら、Leuk Lymphoma 2012 53:1666～1676ページ、Fauriat Cら、Leukemia 2006 20:732～733ページ)、NK細胞媒介抗MM活性を増強し得る手段は、開示されるCAR以前は十分に探索されてはいなかった。

エプスタインバーウイルス(EBV)誘導リンパ増殖性疾患(EBV-LPD)及び他のEBV関連がんは、同種造血細胞移植(HCT)又は固形臓器移植(SOT)のレシピエント、特に移植片対宿主病(GVHD)を防止又は処置するためにある特定のT細胞反応性Abを受けたレシピエントの罹患及び死亡の重大な原因である。自家又は同種EBV特異的細胞傷害性T細胞の養子移入による予防及び処置並びにその後のEBV関連リンパ増殖に対する免疫の長期回復は、同種組織移入に関するこれらの一様に致死的な合併症の管理において良い転帰をもたらしている。したがって、一部の実施形態では、本発明の1つ以上のCARポリペプチドを含む開示される免疫エフェクター細胞は、同種又は自家EBV特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)である。例えば、EBV特異的細胞傷害性T細胞の生成は、EBV血清陽性自家又は同種ドナー由来のPBMCを単離すること、並びにそれらを単球及びNK細胞の枯渇によってT細胞に関して濃縮することを伴い得る。EBV特異的細胞傷害性T細胞はまた、ドナーPBMC又は精製ドナーT細胞を、1つ以上のEBV抗原を発現し、そのEBV抗原を非刺激T細胞に提示し、それによってEBV特異的CTLの刺激及び増大を引き起こす「刺激」細胞と接触させることによって、産生され得る。EBV抗原としては、例えば、潜伏膜タンパク質(LMP)及びEBV核抗原(EBNA)タンパク質、例えばLMP-1、LMP-2A、及びLMP-2B、並びにEBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、及びEBNA-LPが挙げられる。1つ以上のEBV特異的抗原を認識するT細胞受容体を含む細胞傷害性T細胞は、そのEBV抗原に「感作」されていると考えられ、したがって、本明細書では「EBV感作細胞傷害性T細胞」と称す。本発明の1つ以上のCARポリペプチドを含み得る同種又は自家EBV特異的細胞傷害性T細胞集団を生成する公知の方法は、例えば、Barkerら、Blood 2010 116(23):5045～49ページ、Doubrovinaら、Blood 2012 119(11):2644～56ページ、Koehneら、Blood 2002 99(5):1730～40ページ、及びSmithら、Cancer Res 2012 72(5):1116～25ページに記載されており、これらはこれらの教示について参照により組み込まれる。同様に、細胞傷害性T細胞は、サイトメガロウイルス(CMV)、パピローマウイルス(例えばHPV)、アデノウイルス、ポリオーマウイルス(例えば、BKV、JCV、及びメルケル細胞ウイルス)、レトロウイルス(例えば、レンチウイルス、例えばHIVも含むHTLV-I)、ピコルナウイルス(例えばA型肝炎ウイルス)、ヘパドナウイルス(例えばB型肝炎ウイルス)、ヘパシウイルス(例えばC型肝炎ウイルス)、デルタウイルス(例えばD型肝炎ウイルス)、ヘペウイルス(例えばE型肝炎ウイルス)等を含む他のウイルス抗原に「感作」されてもよい。一部の好ましい実施形態では、標的抗原は腫瘍ウイルス由来である。一部のそのような実施形態では、本発明のCAR-T細胞を生成するために使用されるT細胞は、多機能性T細胞、すなわち、複数の免疫エフェクター機能を誘導することができ、例えば単一の免疫エフェクター(例えば単一のバイオマーカー、例えばサイトカイン又はCD107a)のみを産生する細胞よりも効果的な病原体に対する免疫応答を実現するT細胞である。より少ない機能のT細胞、単一機能性T細胞、又はさらには「疲弊」T細胞は、慢性感染症の間、免疫応答を支配することがあり、したがって、ウイルス関連合併症からの保護に悪影響をもたらす。さらに好ましい実施形態では、本発明のCAR-T細胞は多機能性である。ある特定の実施形態では、本発明のCAR-T細胞を生成するために使用される少なくとも50%のT細胞は、CD4⁺T細胞である。一部のそのような実施形態では、前記T細胞は、50%未満がCD4⁺T細胞である。さらなる実施形態では、前記T細胞は大部分がCD4⁺T細胞である。一部の実施形態では、本発明のCAR-T細胞を生成するために使用される少なくとも50%のT細胞は、CD8⁺T細胞である。一部のそのような実施形態では、前記T細胞は、50%未満がCD8⁺T細胞である。さらなる実施形態では、前記T細胞は大部分がCD8⁺T細胞である。一部の実施形態では、T細胞(例えば本明細書に記載される感作T細胞及び/又はCAR-T細胞)は、対象に投与される前、細胞ライブラリー又はバンクに保存される。本明細書に開示される方法(例えば本発明のCAR-T細胞を含む本明細書に開示される免疫エフェクター細胞の選択及び/又は調製)は、細胞バンク、例えば事前生成第三者ドナー由来細胞バンク由来の同種免疫エフェクター細胞(例えば、PBMC、CD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞、及び/又はCAR-T細胞)の選択及び/又は改変を含む。
そのような細胞バンクはドナーPBMC試料を含み得る。好ましくは、細胞バンクは、免疫エフェクター細胞が濃縮されているドナー試料を含む。最も好ましくは、バンクはドナーCD4⁺及び/又はCD8⁺T細胞を含む。一部のそのような実施形態では、ドナー由来細胞バンクは、抗原特異的免疫エフェクター細胞(例えば本明細書に記載される感作T細胞及び/又はCAR-T細胞)を含む。好ましい実施形態では、本明細書に記載されるドナー由来細胞のHLA型は公知である。したがって、同種免疫エフェクター細胞は、対象に存在するHLAアレルによってコードされるクラスI MHCに拘束されるTCRを発現するため、本明細書に開示される方法は、同種免疫エフェクター細胞(例えば本明細書に記載されるT細胞及び/又はCAR-T細胞)を選択することをさらに含む。例えば、同種T細胞(例えば、本明細書に記載されるCD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞、及び/又はCAR-T細胞)は、前記T細胞及びレシピエント(例えば処置を必要とする対象)が少なくとも2つ(例えば、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ)のHLAアレルを共有し、細胞が、共有されるHLAアレルにより拘束される場合に、選択される。好ましくは、そのような方法は、当技術分野で公知の手段、例えば、フローサイトメトリー、テトラマーアッセイ、ELISAアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、蛍光顕微鏡検査、エドマン分解アッセイ、及び/又は質量分析アッセイ(例えばタンパク質配列決定)によって、事前生成第三者ドナー由来エピトープ特異的T細胞(すなわち、同種T細胞及び/又はCAR-T細胞)のTCRレパートリーを試験することを含む。一部の実施形態では、TCRレパートリーは、核酸プローブ、核酸増幅アッセイ、及び/又は配列決定アッセイを使用して分析される。

一部の実施形態では、開示されるCARを発現する操作されたCAR-T細胞は、免疫チェックポイント遮断をもたらすドミナントネガティブ変異をさらに発現する(例えばドミナントネガティブ型の免疫チェックポイント分子、例えばPD-1を発現する)。網羅的なリストであることを意図するものではないが、免疫チェックポイント分子は、プログラム死1(PD-1)、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA-4)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、T細胞免疫グロブリンムチン-3(TIM-3)、リンパ球活性化タンパク質3(LAG-3)、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)、白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1)、ナチュラルキラー細胞受容体2B4(2B4)、並びにCD160から選択される。免疫チェックポイント分子は、形質転換成長因子β(TGF-β)受容体である場合もある。好ましくは、免疫チェックポイント分子はCTLA-4である。最も好ましくは、免疫チェックポイント分子はPD-1である。

PCT出願の国際公開第2017/040945号は、ドミナントネガティブ型の細胞媒介免疫応答阻害因子を発現するCAR-T細胞を操作する方法を記載している。国際公開第2017/040945号出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

治療方法
開示されるCARを発現する免疫エフェクター細胞は、Bリンパ球抗原発現がん細胞(例えばCD19関連がん)に対して治療的に有益な免疫応答を誘発することができる。例えば、開示されるCAR改変免疫エフェクター細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動免疫応答であっても受動免疫応答であってもよい。加えて、CAR媒介免疫応答は、CAR改変免疫エフェクター細胞がBリンパ球抗原、例えばCD19に特異的な免疫応答を誘導する養子免疫療法手法の一部であってもよい。

キメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞の養子移入は、有望な抗がん治療である。患者の免疫エフェクター細胞の採取後、細胞は、開示されるBリンパ球抗原特異的CARを発現するように遺伝子操作され、次いで患者に戻し注入され得る。さらに、患者以外のドナーから取得した免疫エフェクター細胞(すなわち、患者と同種)が、開示されるBリンパ球抗原特異的CARを発現するように遺伝子操作され、次いでCAR含有細胞が患者に注入されてもよい。ある特定の具体的な実施形態では、抗Bリンパ球抗原CARポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞は、同種EBV特異的細胞傷害性T細胞である。

開示されるCAR改変免疫エフェクター細胞は、単独で投与されても、希釈剤及び/又は他の成分、例えば、IL-2、IL-15、若しくは他のサイトカイン、若しくは細胞集団と組み合わせた医薬組成物として投与されてもよい。簡潔に述べると、医薬組成物は、本明細書に記載される標的細胞集団を、1種以上の薬学的又は生理学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わせて含むことができる。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等;炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトール;タンパク質;ポリペプチド又はアミノ酸、例えばグリシン;抗酸化剤;キレート剤、例えばEDTA又はグルタチオン;アジュバント(例えば水酸化アルミニウム);及び保存剤を含んでもよい。一部の実施形態では、開示される方法における使用のための組成物は、静脈内投与のために製剤化される。医薬組成物は、MMを処置するのに適切な任意の方法で投与することができる。投与の分量及び回数は、患者の状態及び患者の疾患の重症度のような因子によって決定されるが、適切な投薬量は、治験によって決定されてもよい。

「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、又は「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者(対象)の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度、及び状態における個々の差を考慮して内科医によって決定することができる。全般的に、本明細書に記載されるT細胞を含む医薬組成物は、範囲内の全ての整数値を含む細胞10⁴～10⁹個/kg体重、例えば細胞10⁵～10⁶個/kg体重の投薬量で投与され得る、と言うことができる。T細胞組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与されてもよい。細胞は、免疫療法において一般的に公知の注入技法を使用することによって投与することができる(例えばRosenbergら、New Eng. J. of Med. 319:1676ページ、1988を参照のこと)。特定の患者に最適な投薬量及び処置計画は、医学の技術分野の当業者によって、疾患の徴候に関して患者をモニタリングし、それに応じて処置を調整することによって容易に決定することができる。

ある特定の実施形態では、活性化T細胞を対象に投与し、次いでその後再び採血し(又はアフェレーシスを実施し)、そこからのT細胞を、開示される方法に従って活性化し、これらの活性化及び増大したT細胞を患者に再注入することが所望され得る。このプロセスは、数週間ごとに複数回実行することができる。ある特定の実施形態では、T細胞は、10cc～400ccの採血から活性化することができる。ある特定の実施形態では、T細胞は、20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、又は100ccの採血から活性化される。この複数回採血/複数回再注入プロトコルを使用することは、T細胞のある特定の集団を選抜することに役立ち得る。

開示される組成物の投与は、任意の簡便な方法、例えば注射、輸注、又は植込によって実行することができる。本明細書に記載される組成物は、患者に皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内(i.v.)注射によって、又は腹腔内投与することができる。一部の実施形態では、開示される組成物は、皮内又は皮下注射によって患者に投与される。一部の実施形態では、開示される組成物はi.v.注射によって投与される。組成物はまた、腫瘍、リンパ節、又は感染部位に直接注射されてもよい。

ある特定の実施形態では、開示されるCAR改変免疫エフェクター細胞は、サリドマイド、デキサメタゾン、ボルテゾミブ、及びレナリドミドを含むがこれらに限定されない多くの関連する処置モダリティと共に(例えば、その前、同時、又は後に)患者に投与される。さらなる実施形態では、CAR改変免疫エフェクター細胞は、化学療法、放射線照射、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレート、及びFK506、抗体、又は他の免疫除去剤、例えばCAMPATH、抗CD3抗体又は他の抗体療法、シトキサン(cytoxin)、フルダラビン(fludaribine)、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、並びに照射法と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、CAR改変免疫エフェクター細胞は、骨髄移植、化学療法剤、例えばフルダラビン、体外照射療法(XRT)、シクロホスファミド、又は抗体、例えばOKT3若しくはCAMPATHを使用するT細胞除去療法と共に(例えば、その前、同時、又は後に)患者に投与される。他の実施形態では、本発明の細胞組成物は、B細胞除去療法、例えばCD20と反応する薬剤、例えばRituxanの後に投与される。例えば、一部の実施形態では、対象は、高用量化学療法とそれに続く末梢血幹細胞移植とを伴う標準処置を経験し得る。ある特定の実施形態では、移植後、対象は、本発明の増大した免疫細胞の注入を受ける。追加の実施形態では、増大した細胞、は外科的処置の前又は後に投与される。

開示される方法のがんは、制御されない成長、浸潤、又は転移を経験している対象における、任意のBリンパ球抗原発現細胞(例えば任意のCD19発現細胞)であり得る。Bリンパ球抗原(例えばCD19)を発現するがんとしては、白血病及びリンパ腫、例えば、急性白血病、慢性白血病、リンパ球性白血病、骨髄性白血病、前白血病状態、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、EBV関連リンパ増殖性疾患、成熟B細胞新生物、成熟T細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞新生物、前駆リンパ系新生物、並びに免疫不全関連リンパ増殖性障害が挙げられる。

一部の実施形態では、がんは、造血及び/又はリンパ系組織の任意の新生物又は腫瘍であり得る。したがって、がんは、血液、骨髄、リンパ、及び/又はリンパ系に影響を与える任意の悪性腫瘍、並びに制御されない骨髄増殖及び/又はリンパ増殖をもたらす任意のそのような疾患であり得る。開示される組成物を処置のために使用することができる、代表的だが非限定的ながんのリストとしては、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、前駆B急性リンパ芽球性白血病、前駆T急性リンパ芽球性白血病、バーキット白血病、急性混合性白血病、慢性リンパ球性白血病(CLL)、B細胞前リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病(AML)、急性前骨髄球性白血病(PML)、急性骨髄芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病、有毛細胞白血病(HCL)、T細胞前リンパ球性白血病(T-PLL)、大顆粒リンパ球性白血病、成人T細胞白血病、クローン性好酸球増多症、B細胞慢性リンパ球性白血病/小細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫(例えばワルデンシュトレームマクログロブリン血症)、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞新生物、例えば、形質細胞骨髄腫(多発性骨髄腫)、形質細胞腫、単クローン性免疫グロブリン沈着症、重鎖病、節外性辺縁帯B細胞リンパ腫(MALTリンパ腫)、節性辺縁帯B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(慢性炎症を伴う又は伴わない)、高齢者エプスタインバーウイルス陽性DLBCL、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔(胸腺)大細胞型B細胞リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、ALK⁺大細胞型B細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、HHV8関連多中心性キャッスルマン病において生じる大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫/白血病、T細胞前リンパ球性白血病、T細胞大顆粒リンパ球白血病、侵襲性NK細胞白血病、成人T細胞白血病/リンパ腫、節外性NK/T細胞リンパ腫、腸症関連T細胞リンパ腫、肝脾T細胞リンパ腫、芽球性NK細胞リンパ腫、菌状息肉症/セザリー症候群、原発性皮膚CD30陽性T細胞リンパ増殖性障害、末梢T細胞リンパ腫、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、他に特定されないBリンパ芽球性白血病/リンパ腫、反復性遺伝子異常を伴うBリンパ芽球性白血病/リンパ腫、Tリンパ芽球性白血病/リンパ腫;古典的ホジキンリンパ腫、例えば、結節硬化型、混合細胞型ホジキンリンパ腫、リンパ球豊富型ホジキンリンパ腫、リンパ球減少型又は非減少型ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫;並びに原発性免疫障害と関連する、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)と関連する、メトトレキセート療法、移植後、及び原発性中枢神経系リンパ腫と関連する免疫不全関連リンパ増殖性障害が挙げられる。

開示されるCARは、細胞傷害性又は細胞増殖抑制効果を有する任意の化合物、部分、又は基と組み合わせて使用することができる。薬物部分としては、マイクロチューブリン阻害薬、有糸分裂阻害薬、トポイソメラーゼ阻害薬、又はDNAインターカレーターとして機能し得る化学療法剤、特にがん療法のために使用される化学療法剤が挙げられる。

開示されるCARは、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて使用することができる。2つの公知の免疫チェックポイント経路は、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA-4)及びプログラム死1(PD-1)受容体を介したシグナル伝達を伴う。これらのタンパク質は、T細胞機能の全ての段階にわたって重要な役割を果たす共シグナル伝達分子のCD28-B7ファミリーのメンバーである。PD-1受容体(CD279としても公知)は、活性化T細胞の表面に発現する。そのリガンドであるPD-L1(B7-H1、CD274)及びPD-L2(B7-DC、CD273)は、APC、例えば樹状細胞又はマクロファージの表面に発現する。PD-L1は支配的なリガンドであり、PD-L2は、それよりもはるかに制限された発現パターンを有する。リガンドがPD-1に結合する場合、阻害シグナルがT細胞に伝達され、サイトカイン産生を低下し、T細胞増殖を抑制する。チェックポイント阻害薬としては、これらに限定されないが、PD-1(ニボルマブ(BMS-936558又はMDX1106)、CT-011、MK-3475)、PD-L1(MDX-1105(BMS-936559)、MPDL3280A、MSB0010718C)、PD-L2(rHIgM12B7)、CTLA-4(イピリムマブ(MDX-010)、トレメリムマブ(CP-675,206))、IDO、B7-H3(MGA271)、B7-H4、TIM3、LAG-3(BMS-986016)を遮断するアプタマー及び抗体が挙げられる。免疫エフェクター細胞においてCARをチェックポイント阻害薬と組み合わせる技法及び様々な障害の処置のためのその使用は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2017/040945号に記載されている。

プログラム死1(PD-1)に対するヒトモノクローナル抗体、及び抗PD-1抗体を単独で又は他の免疫治療薬と組み合わせて使用するがんを処置する方法は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第8,008,449号に記載されている。抗PD-L1抗体及びその使用は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第8,552,154号に記載されている。抗PD-1抗体又は抗PD-L1抗体を含む抗がん剤は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第8,617,546号に記載されている。

一部の実施形態では、PDL1阻害薬は、PDL1と特異的に結合する抗体、例えばBMS-936559(Bristol-Myers Squibb)又はMPDL3280A(Roche)を含む。一部の実施形態では、PD-1阻害薬は、PD-1と特異的に結合する抗体、例えば、ラムブロリズマブ(Merck)、ニボルマブ(Bristol-Myers Squibb)、又はMEDI4736(AstraZeneca)を含む。PD-1に対するヒトモノクローナル抗体、及び抗PD-1抗体を単独で又は他の免疫治療薬と組み合わせて使用するがんを処置する方法は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第8,008,449号に記載されている。抗PD-L1抗体及びその使用は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第8,552,154号に記載されている。抗PD-1抗体又は抗PD-L1抗体を含む抗がん剤は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第8,617,546号に記載されている。

開示されるCARは、他のがん免疫療法と組み合わせて使用することができる。2つの別個の種類の免疫療法が存在し、受動免疫療法は、免疫系の成分を使用してがん細胞に対する標的化細胞傷害活性を導き、患者における免疫応答を必ずしも開始しないが、能動免疫療法は、内因性免疫応答を積極的に惹起する。受動的戦略は、具体的な抗原に応答したB細胞によって産生されるモノクローナル抗体(mAb)の使用を含む。1970年代におけるハイブリドーマ技術の開発及び腫瘍特異的抗原の同定により、免疫系による破壊のための腫瘍細胞を特異的に標的とすることができるmAbの医薬としての開発が可能になった。それらのmAbには、B細胞悪性腫瘍、例えば非ホジキンリンパ腫(NHL)の表面に高度に発現するCD20タンパク質に結合するリツキシマブ(Rituxan、Genentech)がある。リツキシマブは、化学療法と組み合わせたNHL及び慢性リンパ球性白血病(CLL)の処置に関してFDAによって承認されている。別の重要なmAbは、HER2(ヒト上皮成長因子受容体2)の発現を標的とすることによって、HER2陽性乳がんの処置に大きな変革をもたらしたトラスツズマブ(Herceptin、Genentech)である。

最適な「キラー」CD8 T細胞応答を生み出すことは、T細胞受容体活性化及び共刺激も必要とし、OX40(CD134)及び4-1BB(CD137)を含む腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバーのライゲーションによって実現することができる。OX40は、活性化(アゴニスト)抗OX40 mAbを用いた処置がT細胞分化及び細胞溶解機能を増大し、様々な腫瘍に対する抗腫瘍免疫の増強をもたらすため、特に興味深い。

一部の実施形態では、そのような追加の治療剤は、代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、デカルバジン(decarbazine)、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、又はクラドリビンから選択することができる。

一部の実施形態では、そのような追加の治療剤は、アルキル化剤、例えば、メクロレタミン、チオテパ(thioepa)、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)、ロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン(DTIC)、プロカルバジン、マイトマイシンC、シスプラチン、及び他のプラチナ誘導体、例えばカルボプラチンから選択することができる。

一部の実施形態では、そのような追加の治療剤は、抗有糸分裂剤、例えば、タキサン、例えばドセタキセル及びパクリタキセル、並びにビンカアルカロイド、例えば、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びビノレルビンから選択することができる。

一部の実施形態では、そのような追加の治療剤は、トポイソメラーゼ阻害薬、例えばトポテカン若しくはイリノテカン、又は細胞増殖抑制薬、例えばエトポシド及びテニポシドから選択することができる。

一部の実施形態では、そのような追加の治療剤は、成長因子阻害薬、例えば、ErbBl(EGFR)の阻害薬(例えばEGFR抗体、例えば、ザルツムマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、若しくはニモツズマブ、又は他のEGFR阻害薬、例えばゲフィチニブ若しくはエルロチニブ)、ErbB2(HER2/neu)の別の阻害薬(例えばHER2抗体、例えば、トラスツズマブ、トラスツズマブ-DM l、又はペルツズマブ)、又はEGFRとHER2の両方の阻害薬、例えばラパチニブ)から選択することができる。

一部の実施形態では、そのような追加の治療剤は、チロシンキナーゼ阻害薬、例えばイマチニブ(Glivec、Gleevec STI571)又はラパチニブから選択することができる。

したがって、一部の実施形態では、開示される抗体は、オファツムマブ、ザノリムマブ、ダラツムマブ、ラニビズマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、hu806、ダクリズマブ(Zenapax)、バシリキシマブ(Simulect)、インフリキシマブ(Remicade)、アダリムマブ(Humira)、ナタリズマブ(Tysabri)、オマリズマブ(Xolair)、エファリズマブ(Raptiva)、及び/又はリツキシマブと組み合わせて使用される。

一部の実施形態では、上に記載したような障害を処置するためのCARと組み合わせて使用するための治療剤は、抗がんサイトカイン、ケモカイン、又はそれらの組合せであり得る。好適なサイトカイン及び成長因子の例としては、IFNy、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、IL-24、IL-27、IL-28a、IL-28b、IL-29、KGF、IFNa(例えばINFa2b)、IFN、GM-CSF、CD40L、Flt3リガンド、幹細胞因子、アンセスチム、及びTNFaが挙げられる。好適なケモカインとしては、ヒトCXC及びC-Cケモカインファミリー由来のGlu-Leu-Arg(ELR)陰性ケモカイン、例えば、IP-10、MCP-3、MIG、及びSDF-laを挙げることができる。好適なサイトカインには、サイトカイン誘導体、サイトカインバリアント、サイトカイン断片、及びサイトカイン融合タンパク質が含まれる。

一部の実施形態では、上に記載したような障害を処置するためのCARと組み合わせて使用するための治療剤は、細胞周期制御/アポトーシス調節因子(又は「調節剤」)であり得る。細胞周期制御/アポトーシス調節因子は、細胞周期制御/アポトーシス調節因子を標的としモジュレートする分子、例えば、(i)cdc-25(例えばNSC663284)、(ii)細胞周期を過剰に刺激するサイクリン依存性キナーゼ(例えば、フラボピリドール(L868275、HMR1275)、7-ヒドロキシスタウロスポリン(UCN-01、KW-2401)、及びロスコビチン(R-ロスコビチン、CYC202))、並びに(iii)テロメラーゼモジュレーター(例えば、BIBR1532、SOT-095、GRN163、並びに例えば米国特許第6,440,735号及び同第6,713,055号に記載されている組成物)を含み得る。アポトーシス経路に干渉する分子の非限定的な例としては、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)/アポトーシス-2リガンド(Apo-2L)、TRAIL受容体を活性化する抗体、IFN、及びアンチセンスBcl-2が挙げられる。

一部の実施形態では、上に記載したような障害を処置するためのCARと組み合わせて使用するための治療剤は、ホルモン調節剤、例えば抗アンドロゲン及び抗エストロゲン療法に有用な薬剤であり得る。そのようなホルモン調節剤の例は、タモキシフェン、イドキシフェン、フルベストラント、ドロロキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール/estinyl、抗アンドロゲン(例えばフルタミド(flutaminde)/eulexin)、プロゲスチン(例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン/provera、酢酸メゲストロール(megestrol acepate))/megace)、副腎皮質ステロイド(例えば、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン)、黄体形成ホルモン放出ホルモン(及びその類似体並びに他のLHRHアゴニスト、例えばブセレリン及びゴセレリン)、アロマターゼ阻害薬(例えば、アナストラゾール/arimidex、アミノグルテチミド/cytraden、エキセメスタン)、又はホルモン阻害薬(例えばオクトレオチド/sandostatin)である。

一部の実施形態では、上に記載したような障害を処置するためのCARと組み合わせて使用するための治療剤は、抗がん核酸又は抗がん阻害性RNA分子であり得る。

上に記載したように、組合せ投与は、同時、別々、又は逐次であり得る。同時投与の場合、薬剤は、適宜、1つの組成物又は別々の組成物として投与され得る。

一部の実施形態では、開示されるCARは、放射線療法と組み合わせて投与される。放射線療法は、放射線照射を含み得るか、又は放射性医薬品の患者への関連投与が提供される。放射線供給源は、処置される患者の外部又は内部であり得る(放射線処置は、例えば、体外照射療法(EBRT)又は近接照射療法(BT)の形態であり得る)。そのような方法を実施する場合に使用され得る放射性元素としては、例えば、ラジウム、セシウム-137、イリジウム-192、アメリシウム-241、金-198、コバルト-57、銅-67、テクネチウム-99、ヨウ化物-123、ヨウ化物-131、及びインジウム-111が挙げられる。

一部の実施形態では、開示されるCARは、外科的処置と組み合わせて投与される。

腫瘍細胞傷害性及び特異性を増強し、腫瘍免疫抑制を逃れ、宿主拒絶を回避し、治療半減期を延長するCAR-T細胞は、いくつかの方法で設計され得る。TRUCK(全体的なサイトカイン殺傷のために再指向されたT細胞)T細胞は、例えば、CARを有するが、腫瘍殺傷を促進するサイトカイン、例えばIL-12を放出するように操作されてもいる。これらのCAR-T細胞は、腫瘍環境に局在化すると、CARの活性化と同時に分子ペイロードを放出するように設計されているため、「装甲CAR」と称される場合もある。いくつかのサイトカインは、がん療法として前臨床的にも臨床的にも検討されており、これらもまた、CAR-T療法のTRUCK形態に同様に組み込まれる場合に有用であると判明する可能性がある。これらのサイトカインには、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、M-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TRAIL、FLT3リガンド、リンホタクチン、及びTGF-βが含まれる(Dranoff、(2004).「Cytokines in Cancer Pathogenesis and Cancer Therapy.」Nat Rev Cancer、1月、4(1):11～22ページ)。「自己駆動」又は「ホーミング」CAR-T細胞は、それらのCARに加えてケモカイン受容体を発現するように操作されている。ある特定のケモカインは腫瘍において上方制御し得るため、ケモカイン受容体の組込みは、養子T細胞への腫瘍輸送及び養子T細胞による浸潤を補助し、それによってCAR-Tの特異性と機能性の両方を増強する(Moon(2011).「Expression of a functional CCR2 receptor enhances tumor localization and tumor eradication by retargeted human T cells expressing a mesothelin-specific chimeric antibody receptor.」Clin Cancer Res. 2011年7月15日; 17(14):4719～30ページ)。汎用CAR-T細胞もまた、CARを有するが、内因性TCR(T細胞受容体)タンパク質もMHC(主要組織適合遺伝子複合体)タンパク質も発現しないように操作されている。これらの2種類のタンパク質の養子T細胞療法のシグナル伝達レパートリーからの除去は、それぞれ、移植片対宿主病及び拒絶を防止する。装甲CAR-T細胞は、さらに、腫瘍免疫抑制及び腫瘍誘導CAR-T機能低下を逃れる能力のためにそのように命名されている。これらの特定のCAR-TはCARを有し、チェックポイント阻害因子を発現しないように操作され得る。或いは、これらのCAR-Tは、チェックポイントシグナル伝達を遮断するモノクローナル抗体(mAb)と同時投与することができる。抗PDL1抗体の投与は、CAR TIL(腫瘍浸潤リンパ球)の殺傷能を有意に回復した。PD-1-PD-L1及びCTLA-4-CD80/CD86シグナル伝達経路が検討されているが、装甲CAR-Tの設計においてLAG-3、Tim-3、IDO-1、2B4、及びKIRを含む他の免疫チェックポイントシグナル伝達分子を標的とすることは可能である。TILの他の細胞内阻害因子としては、ホスファターゼ(SHP1)、ユビキチンリガーゼ(すなわち、cbl-b)、及びキナーゼ(すなわち、ジアシルグリセロールキナーゼ)が挙げられる。装甲CAR-Tはまた、装甲CAR-Tを腫瘍分泌サイトカインの効果から保護するか又はその効果に対して抵抗性にするタンパク質又は受容体を発現するように操作されてもよい。例えば、二重陰性形態のTGF-β受容体を形質導入したCTL(細胞傷害性Tリンパ球)は、リンパ腫分泌TGF-βによる免疫抑制に抵抗性である。これらの形質導入細胞は、その対照対応物と比較した場合、in vivoにおいて著しく増加した抗腫瘍活性を示した。

タンデム及び二重CAR-T細胞は、2つの別個の抗原結合ドメインを有するという点で特有である。タンデムCARは、細胞内共刺激及び刺激ドメインに接続した、細胞外環境に面した2つの連続した抗原結合ドメインを含有する。二重CARは、1つの細胞外抗原結合ドメインが細胞内共刺激ドメインに接続し、第2の別個の細胞外抗原結合ドメインが細胞内刺激ドメインに接続するように操作されている。刺激ドメインと共刺激ドメインは2つの別々の抗原結合ドメインの間で分割されるため、二重CARは「分割CAR」とも称される。タンデムCAR設計においても二重CAR設計においても、両方の抗原結合ドメインの結合は、T細胞におけるCAR回路のシグナル伝達を可能にするために必要である。これらの2つのCAR設計は、異なる別個の抗原に関する結合親和性を有するため、「二重特異性」CARとも称される。

「生きている治療薬」の形態としてのCAR-T細胞に関する1つの主要な懸念事項は、そのin vivoでの操作可能性及び潜在的な免疫刺激副作用である。CAR-T療法をより良好に制御し、望まない副作用を防止するために、オフスイッチ、安全性機構、及び条件付き制御機構を含む様々な特徴が設計されている。例えば、自己破壊CAR-T細胞と標識/タグCAR-T細胞の両方は、CAR発現T細胞のクリアランスを促進する「オフスイッチ」を有するように操作される。自己破壊CAR-Tは、CARを含有するが、外因性分子の投与時に誘導性となるアポトーシス促進性自殺遺伝子又は「排除遺伝子」を発現するように操作されてもいる。HSV-TK(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)、Fas、iCasp9(誘導性カスパーゼ9)、CD20、MYC TAG、及び短縮型EGFR(内皮成長因子受容体)を含む様々な自殺遺伝子がこの目的のために用いられ得る。例えば、HSKは、プロドラッグのガンシクロビル(GCV)を、複製DNAに組み込まれて最終的に細胞死を引き起こすGCV三リン酸に変換することができる。iCasp9は、カスパーゼ9二量体化及びアポトーシスを引き起こす低分子AP1903と結合するFK506結合タンパク質の成分を含有するキメラタンパク質である。しかしながら、標識/タグCAR-T細胞は、CARを有するが、選択マーカーを発現するように操作されてもいる細胞である。この選択マーカーに対するmAbの投与は、CAR-T細胞のクリアランスを促進することになる。短縮型EGFRは抗EGFR mAbによって標的化可能なそのような抗原のうちの1つであり、セツキシマブの投与は、CAR-T細胞の排除を促進するように働く。これらの特徴を有するように作出されたCARは、「切り替え可能なCAR」に対してはsCAR、及び「制御可能なCAR」に対してはRCARとも称される。「阻害性CAR」(iCAR)としても公知の「安全性CAR」は、2つの抗原結合ドメインを発現するように操作されている。これらの外部ドメインのうちの1つは腫瘍に関連する抗原に対するものであり、細胞内共刺激及び刺激ドメインに結合する。しかしながら、第2の細胞外抗原結合ドメインは正常組織に特異的であり、細胞内チェックポイントドメイン、例えば、CTLA4、PD-1、又はCD45に結合す
る。iCARへの複数の細胞内阻害ドメインの組込みも可能である。これらの阻害ドメインを提供し得る一部の阻害分子としては、B7-H1、B7-1、CD160、PIH、2B4、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3、及び/又はCEACAM-5)、LAG-3、TIGIT、BTLA、LAIR1、並びにTGFβ-Rが挙げられる。正常組織の存在下では、この第2の抗原結合ドメインの刺激が働いてCARを阻害することになる。この二重抗原特異性のために、iCARが二重特異性CAR-T細胞の形態でもあることは注意されるべきである。安全性CAR-T操作は、CAR-T細胞の腫瘍組織に対する特異性を増強し、ある特定の正常組織が、標準CARの場合にオフターゲット効果をもたらし得る非常に低いレベルの腫瘍関連抗原を発現することが、ある状況において好都合である(Morgan(2010).「Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2.」Molecular Therapy 2010;18(4):843～851ページ)。条件付きCAR-T細胞は、細胞内共刺激ドメイン及び別々の細胞内共刺激因子に接続した細胞外抗原結合ドメインを発現する。共刺激及び刺激ドメイン配列は、外因性分子の投与時に結果として生じる複数のタンパク質が一緒に細胞内に入り、CAR回路を完成させるように操作されている。この点で、CAR-T活性化はモジュレートすることができ、場合によっては、特定の患者に合わせて「微調整」するか又は患者専用とすることさえ可能である。二重CAR設計と同様、刺激ドメインと共刺激ドメインは、条件付きCARにおいて不活性である場合は物理的に離れており、このため、これらもまた「分割CAR」とも称される。

一部の実施形態では、これらの設計された特徴のうちの2つ以上を組み合わせて、増強した多機能CAR-Tを作出してもよい。例えば、二重CAR設計又は条件付きCAR設計のいずれかを有し、TRUCKのようにサイトカインも放出するCAR-T細胞を作出することができる。一部の実施形態では、二重-条件付きCAR-T細胞は、それぞれがそれぞれの共刺激ドメインに結合する、2つの別個のがん抗原に対する2つの別々の抗原結合ドメインを有する2つのCARを発現するように作製することができる。共刺激ドメインは、活性化分子が投与された後にのみ、刺激ドメインと共に機能的となり得る。このCAR-T細胞が効果的となるためには、がんが両方のがん抗原を発現していなければならず、且つ活性化分子が患者に投与されなければならない。この設計は、それによって二重CAR-T細胞と条件付きCAR-T細胞の両方の特徴を組み込む。

典型的には、CAR-T細胞はα-βT細胞を使用して作出されるが、γ-δT細胞もまた使用することができる。一部の実施形態では、CAR-T細胞を生成するために使用される、記載されたCAR構築物、ドメイン、及び操作された特徴は、NK(ナチュラルキラー)細胞、B細胞、肥満細胞、骨髄由来食細胞、及びNKT細胞を含む他の種類のCAR発現免疫細胞の生成において同様に用いることができる。或いは、CAR発現細胞は、T細胞とNK細胞の両方の特性を有するように作出することができる。追加の実施形態では、CARを形質導入した細胞は、それらが投与される患者と自家又は同種であり得る。

レトロウイルス形質導入(γ-レトロウイルスを含む)、レンチウイルス形質導入、トランスポゾン/トランスポザーゼ(Sleeping Beauty及びPiggyBacシステム)、並びにメッセンジャーRNA移入媒介遺伝子発現を含むCAR発現のためのいくつかの異なる方法が使用され得る。遺伝子編集(遺伝子挿入又は遺伝子欠失/破壊)もまた、CAR-T細胞を操作する可能性に関してますます重要になっている。CRISPR-Cas9、ZFN(ジンクフィンガーヌクレアーゼ)、及びTALEN(転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ)システムは、CAR-T細胞を生成し得る3つの潜在的な方法である。

[実施例]
[実施例1]
CD19-CAR設計
EBV抗原に感作された細胞傷害性T細胞(CTL)を使用して、少なくとも1つのがん関連CD19エピトープを選択的に標的とするCAR T細胞を操作した。対象におけるCAR T細胞疲弊を低減し、CAR T細胞持続性を増強するように、CARポリペプチドを特異的に設計した。簡潔に述べると、発現したCARポリペプチドは、CD19標的ドメイン(すなわち、配列番号9に示されるFMC63 scFvアミノ酸配列)のN末端であるリーダー配列(すなわち、配列番号8に示されるアミノ酸配列)を含んだ。当業者は、CARが、細胞、例えばEBV感作CTLの内部で発現する場合、新生タンパク質(すなわち、配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質)がプロセシングされ、これにはリーダー配列の除去が含まれることを理解するだろう。結果として得られる成熟ポリペプチド(すなわち、配列番号7に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド)は、細胞表面に移行する。さらに、CARドメインを、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び共刺激ドメインを含む細胞内ドメインの組合せ(すなわち、配列番号12、13、及び14に示されるCD28ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、配列番号10に示されるアミノ酸配列)、並びにシグナル伝達ドメイン変異体(すなわち、配列番号11に示されるアミノ酸配列のような、CD3ζドメインが2つのC末端ITAMドメインにおける機能性を欠く1XX CD3ζ変異体)により最適化した。

或いは、CARは、検出可能なリガンド、例えば¹²⁴I-NGFと結合することができる、したがって、分子タグとして作用することができるLNGFRドメインをさらに含んでもよい。

任意選択で、CAR T細胞は、免疫チェックポイント分子の阻害因子(すなわち、ドミナントネガティブPD-1ポリペプチド)を発現することができ、したがって、多くの腫瘍に見出される免疫抑制性微小環境を克服することができる。

[実施例2]
標的化細胞傷害性及びアロ反応性に関する電気インピーダンスアッセイ
標的化細胞による電気インピーダンスを使用して、EBV感作抗CD19CAR-T細胞(EBV-CAR-T)によって誘導された特異的細胞傷害性(cytoxicity)を評価した。簡潔に述べると、CD-19発現が特徴付けられたドナー由来Bリンパ球(BLCL)標的細胞(図1を参照のこと)を抗CD40コーティング96ウェルインピーダンスプレートにプレーティングし、こうして分析のための細胞の単層を効果的に形成した。エフェクター細胞(例えばEBV-CAR-T)の添加に応答した、抗体結合細胞単層に印加された電圧に対する電気インピーダンスの変化を測定し、こうして細胞傷害性及び/又はアロ反応性の測定を可能にした。

結果
ドナー適合(自家)BLCLは、EBV-CAR-T細胞の存在下と非形質導入EBV感作T細胞(NTD-EBV-T)の存在下の両方において溶解を呈する。(図2、上段を参照のこと)対照的に、非適合ドナー標的細胞では、非適合標的細胞に対して限定的なEBV-TCR指向性細胞溶解活性のみが可能であるNTD-EBV-T細胞に対し、EBV-CAR-T細胞はCD19抗原標的化細胞溶解活性が可能である。(図2、下段を参照のこと)

[実施例3]
標的化細胞溶解活性に関するルシフェラーゼアッセイ
抗CD19 CARを形質導入した抗原特異的T細胞(すなわち、EBV-CAR-T細胞)の細胞溶解(cytotlytic)活性もまた、ルシフェラーゼに基づく標準アッセイによって決定した。CD19を内因性に発現する細胞株、及びK562対照細胞(CD19発現構築物を形質導入していない及び形質導入した)を、ルシフェラーゼを発現するように操作し、表7及び図3に要約される標的細胞として役立てた。

エフェクター及び腫瘍標的細胞を、ウェル1つ当たり100μlの総容量の5×10⁴個の標的細胞を有する黒壁96ウェルプレートを使用して、種々のエフェクター:標的比(1:4、1:2、1:1、2:1、及び4:1)で共培養した。標的細胞のみを同じ細胞密度でプレーティングして、最大ルシフェラーゼ発現(相対発光量(RLU))を決定した。24時間及び48時間後、100μlのルシフェラーゼ基質を各ウェルに直接添加した。発光を発光プレートリーダーにおいて検出した。溶解は全般的に(1-(RLU試料/RLUmax))×100として決定する。

簡潔に述べると、ルシフェラーゼ発現標的細胞、及びエフェクター模擬形質導入又はEBV-CAR-T細胞を上に記載した所望のエフェクター対標的(E:T)比でプレーティングした。同じドナーの非形質導入細胞を使用して、T細胞を含有する全てのウェルが同じ総細胞数を有するように全てのウェルの総細胞数を正規化した。共培養プレートを37℃及び5%CO₂のインキュベーターに一晩入れた。24時間時点で50μlの上清を、マルチプレックスサイトカイン検出アッセイにおける使用のために共培養から除去した。エフェクター細胞の細胞傷害活性を測定するために、50μlの培養培地を各ウェルに添加して、サイトカイン/ケモカイン分析のために取り出した容量を補った。D-ルシフェリン(ルシフェラーゼ基質)を各ウェルに添加して、プレートを室温で10分間インキュベートした。次いで、プレートを読み取り、RLUを記録し、特異的溶解を算出した。24時間のルシフェラーゼ読取り後、細胞をインキュベーターに一晩戻し、48時間時点の第2の時間に関して再び読み取った。腫瘍溶解の百分率を以下の式によって算出した:
腫瘍溶解%=(1-(RLU_{腫瘍細胞+T細胞}/RLU_腫瘍細胞))×100

結果
EBV-CAR-T細胞は、CD19発現細胞株(すなわち、NALM6、K562-CD19、及びRAJI)のCAR指向性細胞溶解を呈する。(図4を参照のこと)注目すべきことに、細胞溶解はNALM6細胞株(CD19陽性、EBNA陰性)において最も効率的であり、K562-CD19がそれに続いた。RAJI細胞(CD19陽性、EBNA陽性)は、指向性細胞溶解に対してより高い抵抗性を呈した。

最小の非特異的細胞溶解は抗原陰性細胞株(K562)において観察され、ドナー001-19 EBV-CAR-T細胞(001-19X)のE:T比を増加した場合に、ある程度の細胞溶解が観察された。しかしながら、エフェクター細胞は非特異的細胞溶解のドナー間でのばらつきを呈し、用量依存的殺傷の証拠がないことが示された。ドナー001-19はその他2名のドナーと比較して最も高いレベルの非特異的細胞溶解を呈した。(図5を参照のこと)その後のアッセイでは、ドナー001-19は最も高い基礎サイトカイン放出を呈しており、陽性標的対照と比較してはるかに低い溶解を有する。

[実施例4]
EBV-CD19CAR-T細胞のサイトカイン放出プロファイル
抗CD19 CARを形質導入した抗原特異的T細胞(すなわち、EBV-CAR-T細胞)のサイトカイン分泌を、ビーズに基づくマルチプレックスサイトカイン検出アッセイ(例えば、Luminex(登録商標)技術マルチプレックスアッセイ、ThermoFisher Scientific、U.S.A.)を使用して決定した。以前に記載した共培養(すなわち、実施例3の共培養)からの上清を使用してサイトカインプロファイリングを行った。

簡潔に述べると、上に示したように、上述したルシフェラーゼアッセイの共培養からの上清を使用してサイトカインプロファイリングを行った。各ウェル(24時間又は48時間共培養)からの上清(50μL)を、剥離可能な箔シールで封止した96ウェル保存プレートに移し、使用まで-80℃で保存した。事前に構成した標的特異的ビーズの混合物における27プレックスサイトカインパネルを、選択サイトカインの定量分析のために使用した。(表8を参照のこと)全ての試験品及び非形質導入対照に関して、解凍した試料、並びにT細胞単独、共培養、及び標的細胞株単独をマルチプレックスパネルプレートに添加した。試料をマイクロプレートリーダーにおいて測定して読み取った。

結果
1:1のE:T比での48時間共培養からの上清の分析は、EBV-CAR-T細胞がNTD対照T細胞及び標的細胞株単独と比較して上昇したサイトカインレベルを誘導したことを示した。(表9及び図6～18を参照のこと)

EBV-CAR-T細胞はCD19発現細胞株の存在下において高度の多機能性を呈するが、サイトカイン放出プロファイルは、部分的には、上記の細胞溶解アッセイにおいて観察されたような使用される細胞株の固有の特性によって決定されていてもよい。注目すべきことに、K562-CD19細胞は、RAJI又はNALM6と比較して最大量の抗原誘導サイトカイン放出を実現する。(図6～12を参照のこと)

各T細胞ドナー(001-19、014-18、023-18)に関する、T細胞単独、(E:F)2:1、1:1、1:2、1:4、及び標的単独を含むK562-CD19細胞における分析もまた実施した。ドナー014-18に由来するT細胞(例えばEBV-T細胞及びEBV-CAR-T細胞)の例示的なデータを表10～13に提供する。

全てのドナーに由来するEBV-CAR-T細胞(すなわち、^EBVCAR-T細胞及び^EBVCAR_LNGFR-T細胞)は、全てのE:F比にわたって、NTD対照及びT細胞単独と比較して上昇したサイトカインレベル(例えば、IFNγ、グランザイムB、IL6、TNFα、MCP-1)を産生した。(表10～13及び図13～15を参照のこと)

[実施例5]
EBV-CAR-T細胞のin vivo安全性及び有効性評価
操作されたEBV特異的抗CD19-CAR発現T細胞の有効性を、NALM6誘導全身性B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)マウスモデルにおいて評価した。本研究は、2～3回用量のヒトドナー由来EBV-CAR-T細胞(マウスにおける1用量当たり0.6×10⁶個以上の細胞=少なくとも細胞2×10⁶個/kgのヒト等量)を用いた処置後の腫瘍量の段階分けを含む。

簡潔に述べると、ルシフェラーゼ発現NALM6細胞を免疫欠損マウスに注射し(-3日目に0.5×10⁶/マウス)、腫瘍成長を3日間進行させる。腫瘍段階分けを生物発光イメージングによって0日目に実施し、処置を静脈内又は腹腔内投与する。動物を表14に記載される処置群(群1つ当たり8匹)に分ける。組換えヒトIL-2(rhIL-2)を処置用量の直後に投与し(2000IU)、追加用量のrhIL-2を1及び2日目に投与する(それぞれ2000IU)。処置の48時間後、及びその後は毎週(例えば、2、10、16、及び24日目)、血液試料を採取する。腫瘍量を生物発光イメージングによって週2回(例えば、4、7、10、13、16、18、21、及び24日目)測定する。臨床症状及び体重を週2回(例えば、2、4、7、10、13、16、18、21、及び24日目)評価する。24日目に動物を屠殺し、剖検後に組織試料を採取する(例えば、肝臓、骨髄、及び脾臓)。(図16を参照のこと)

結果
EBV-CAR-T細胞を受ける動物は、腫瘍量の減少及び生存期間の増加を含む臨床症状の統計的に有意な減少を呈する。追加の分析は、EBV-CAR-T細胞がマウスにおいて本研究の過程にわたり持続し、急性毒性を回避すると同時に最小の有害作用で多機能性サイトカインプロファイルを呈することを実証する。

[実施例6]
再発性/難治性中悪性度B細胞非ホジキンリンパ腫のためのEBV-CAR-T細胞療法の安全性
本研究は、同種(既製品)EBV-CAR-T細胞を用いて処置したヒト対象における(a)用量漸増と、それに続く(b)安全性、忍容性、及び予備臨床転帰をさらに定義するための生物学的に活性な最大耐用量の用量拡大とからなる単群オープンラベル多施設研究である。

簡潔に述べると、研究群には、
・他に特定されないびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、例えば
・形質転換低悪性度非ホジキンリンパ腫(NHL、
・グレード3Bの濾胞性リンパ腫、
・T細胞/組織球豊富型大細胞型B細胞リンパ腫、
・他に特定されないEBV陽性DLBCL、
・原発性縦隔(胸腺)大細胞型B細胞リンパ腫、又は
・DLBCL組織学と共にMYC並びにBCL2及び/若しくはBCL6再編成を有する高悪性度B細胞リンパ腫(ダブル/トリプルヒットリンパ腫)、
・再発したか、又は研究中の疾患のための全身療法に関する少なくとも2つのこれまでの方針に難治性でなければならない
として定義される、組織学的に確認された中悪性度B細胞NHLを有する成人対象(18歳以上)が含まれる。

これまでの療法にCD20標的化剤及びアントラサイクリンが含まれていなければならない。自家抗CD19-CAR-T療法を用いて処置される対象は認められるが、CD19⁺でなければならない。

探索される用量レベルには、
・低用量:細胞1×10⁶個/kg
・中用量:細胞3×10⁶個/kg
・高用量:細胞6×10⁶個/kg
が含まれる。

各用量漸増は、用量レベル1つ当たり少なくとも3名の用量制限毒性(DLT)評価可能対象の試料サイズを使用する。用量拡大コホートは、DLT期間を完了した少なくとも6名のDLT評価可能対象によって安全であることが示されている用量レベルから開始される。用量漸増及び用量拡大の全ての対象を、疾患状況及び処置関連有害事象に関して、EBV-CAR-T細胞注入後24か月間追跡する。

さらなる目的には、
・1、3、6、12、及び24か月時点での全奏効率、及び全奏効率とHLA非適合との関係性の程度、並びに
・HLA非適合に関する安全性、及び安全性とサイトカイン放出症候群(CRS)、神経毒性、及び移植片対宿主病(GVHD)との関係性
が含まれる。

結果
EBV-CAR-T細胞の開示される用量は、最小の有害作用で無憎悪生存期間を誘導及び/又は増加することができる。EBV-CAR-T細胞はヒ、ト対象において増大と持続性の両方が可能であり、多機能性サイトカインプロファイルを呈し、CAR-T疲弊を回避する。

本発明のいくつかの実施形態を記載した。にもかかわらず、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができることが理解されるだろう。したがって、他の実施形態は以下の特許請求の範囲の範囲内である。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、開示される発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に引用した刊行物及びそれらが引用される目的としての材料は、参照により明確に組み込まれる。

当業者は、単に慣例的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識することになり、又は確かめることができるだろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

Claims (82)

1. Bリンパ球抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチド。
2. Bリンパ球抗原が、CD19抗原、CD20抗原、又はCD22抗原である、請求項1に記載のCARポリペプチド。
3. Bリンパ球抗原結合ドメインが抗CD19機能的抗体断片である、請求項1又は2に記載のCARポリペプチド。
4. Bリンパ球抗原結合ドメインが抗CD19一本鎖可変断片(scFv)である、請求項1から3のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
5. Bリンパ球抗原結合ドメインが、配列番号9に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
6. 膜貫通ドメインが膜貫通又は膜結合ポリペプチドに由来する、請求項1から5のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
7. 膜貫通ドメインが、ポリペプチドCD28、NKp30、CDS、DAP10、41BB、DAP12、CD3C、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、それらの変異体、又はそれらの任意の組合せのうちのいずれか1つの膜貫通ドメインを少なくとも1つ含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
8. 膜貫通ドメインがCD28及び/又は41BBの膜貫通ドメインを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
9. シグナル伝達ドメインが、ポリペプチドCD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、FcγRI-γ、FcγRIII-γ、FcεRIβ、FcεRIγ、DAP10、DAP12、CD32、CD79a、CD79b、CD28、CD3C、CD4、b2c、CD137(41BB)、ICOS、CD27、CD28δ、CD80、NKp30、OX40、それらの変異体、又はそれらの任意の組合せのうちのいずれか1つのシグナル伝達ドメインを少なくとも1つ含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
10. 少なくとも1つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
11. 共刺激シグナル伝達領域が、ポリペプチドCD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、FcγRI-γ、FcγRIII-γ、FcεRIβ、FcεRIγ、DAP10、DAP12、CD32、CD79a、CD79b、CD28、CD3C、CD4、b2c、CD137(41BB)、ICOS、CD27、CD28δ、CD80、NKp30、OX40、それらの変異体、又はそれらの任意の組合せのうちのいずれか1つのシグナル伝達ドメインを含む、請求項10に記載のCARポリペプチド。
12. 共刺激シグナル伝達領域が、CD28又はその変異体のシグナル伝達ドメインを含む、請求項10に記載のCARポリペプチド。
13. CD28シグナル伝達ドメインが、サブドメインYMNM、PRRP、PYAP、又はそれらの任意の組合せのうちのいずれか1つに少なくとも1つ以上の変異を含む、請求項12に記載のCARポリペプチド。
14. CD28シグナル伝達ドメインが、サブドメインYMNM、PRRP、PYAPのうちのいずれか1つを欠く、請求項12又は13に記載のCARポリペプチド。
15. CD28シグナル伝達ドメインが、YMNM、PRRP、又はPYAPから選択されるサブドメインのうちのいずれか2つを欠く、請求項12から14のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
16. 共刺激シグナル伝達領域が、CD137(41BB)又はその変異体のシグナル伝達ドメインを含む、請求項10又は11に記載のCARポリペプチド。
17. 少なくとも1つのシグナル伝達ドメインが、天然CD3ζ又はその変異体を含む、請求項1から16のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
18. 変異型CD3ζが、C末端免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を欠く、請求項17に記載のCARポリペプチド。
19. 変異型CD3ζが、2つのC末端免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を欠く、請求項17に記載のCARポリペプチド。
20. 変異型CD3ζが、1つのみの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を含む、請求項17に記載のCARポリペプチド。
21. 変異型CD3ζが、配列番号11に示されるアミノ酸配列を含む、請求項17から20のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
22. ヒンジ配列をさらに含む、請求項1から21のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
23. ヒンジ配列がCD8α分子又はCD28分子に由来する、請求項22に記載のCARポリペプチド。
24. シグナルペプチドをさらに含む、請求項1から23のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
25. シグナルペプチドがCD8αリーダー配列に由来する、請求項24に記載のCARポリペプチド。
26. 配列番号6～11に示されるアミノ酸配列、それらの任意の断片、又はそれらの任意の組合せのうちのいずれか1つを含む、請求項1から25のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
27. 配列番号7に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1から25のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
28. 請求項1から27のいずれか一項に記載のCARポリペプチドをコードする核酸。
29. 配列番号1～5に示されるヌクレオチド配列、それらの断片、又はそれらの任意の組合せのうちのいずれか1つを含む、請求項28に記載の核酸。
30. 配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項28に記載の核酸。
31. 請求項28から30のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
32. 請求項31に記載の核酸を含む免疫細胞。
33. 請求項32に記載のベクターを含む免疫細胞。
34. 請求項1から27のいずれか一項に記載のCARポリペプチドを発現する免疫細胞。
35. 白血球である、請求項32から34のいずれか一項に記載の免疫細胞。
36. リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、又は好酸球である、請求項32から35のいずれか一項に記載の免疫細胞。
37. αβT細胞、γδT細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、B細胞、自然リンパ球(ILC)、サイトカイン誘導キラー(CIK)細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞、制御性T細胞、又はそれらの任意の組合せから選択されるリンパ球である、請求項32から36のいずれか一項に記載の免疫細胞。
38. 細胞傷害性Tリンパ球(CTL)である、請求項37に記載の免疫細胞。
39. ウイルス抗原感作CTLである、請求項37又は38に記載の免疫細胞。
40. エプスタインバーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、B.K.ウイルス(BKV)、ジョンカニンガムウイルス(JCV)、ピコルナウイルス(例えばA型肝炎ウイルス)、ヘパドナウイルス(例えばB型肝炎ウイルス)、ヘパシウイルス(例えばC型肝炎ウイルス)、デルタウイルス(例えばD型肝炎ウイルス)、ヘペウイルス(例えばE型肝炎ウイルス)、又はそれらの任意の組合せのうちのいずれか1つに由来するウイルス抗原に感作されたCTLである、請求項37から39のいずれか一項に記載の免疫細胞。
41. EBV感作CTLである、請求項37から40のいずれか一項に記載の免疫細胞。
42. (a)Bリンパ球抗原と選択的に結合するCARポリペプチド、及び
    (b)腫瘍関連抗原と選択的に結合するCARポリペプチド
    を発現する、二重特異性キメラ抗原受容体(CAR)T細胞。
43. Bリンパ球抗原が、CD19抗原、CD20抗原、又はCD22抗原である、請求項42に記載の二重特異性キメラCAR T細胞。
44. 腫瘍関連抗原が、GPC3、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-C2、SSX-2、Ny-ESO-1、hTERT、又はウイルス性肝炎抗原である、請求項39又は40に記載の二重特異性CAR T細胞。
45. キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインがそれぞれ機能的抗体断片を含む、請求項42から44のいずれか一項に記載の二重特異性CAR T細胞。
46. キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインがそれぞれ一本鎖可変断片(scFv)を含む、請求項42から45のいずれか一項に記載の二重特異性CAR T細胞。
47. キメラ抗原受容体の膜貫通ドメインがそれぞれ、CD28、41BB、それらの変異体、又はそれらの任意の組合せのうちのいずれかの膜貫通ドメインを少なくとも1つ含む、請求項42から46のいずれか一項に記載の二重特異性CAR T細胞。
48. 少なくとも1つのキメラ抗原受容体のシグナル伝達ドメインが、CD3ζ、その変異体、又はそれらの任意の組合せのシグナル伝達ドメインを少なくとも1つ含む、請求項42から47のいずれか一項に記載の二重特異性CAR T細胞。
49. キメラ抗原受容体のシグナル伝達ドメインがそれぞれ、CD3ζ、その変異体、又はそれらの任意の組合せのシグナル伝達ドメインを含む、請求項42から47のいずれか一項に記載の二重特異性CAR T細胞。
50. 変異型CD3ζが、C末端免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を欠く、請求項48又は49に記載の二重特異性CAR T細胞。
51. 変異型CD3ζが、2つのC末端免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を欠く、請求項48又は49に記載の二重特異性CAR T細胞。
52. 変異型CD3ζが、1つのみの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を含む、請求項48又は49に記載の二重特異性CAR T細胞。
53. キメラ抗原受容体の少なくとも1つが、少なくとも1つの共刺激シグナル伝達領域を含む、請求項42から52のいずれか一項に記載の二重特異性CAR T細胞。
54. 各キメラ抗原受容体が、少なくとも1つの共刺激シグナル伝達領域を含む、請求項42から52のいずれか一項に記載の二重特異性CAR T細胞。
55. 共刺激シグナル伝達領域が、CD28若しくはその変異体、CD137(41BB)若しくはその変異体、又はそれらの任意の組合せのうちのいずれか1つのシグナル伝達ドメインを含む、請求項53又は54に記載の二重特異性CAR T細胞。
56. CD28シグナル伝達ドメインが、サブドメインYMNM、PRRP、PYAP、又はそれらの任意の組合せのうちのいずれか1つに少なくとも1つ以上の変異を含む、請求項55に記載のCARポリペプチド。
57. CD28シグナル伝達ドメインが、YMNM、PRRP、又はPYAPから選択される少なくとも1つのサブドメインの機能を欠く、請求項55又は56に記載のCARポリペプチド。
58. CD28シグナル伝達ドメインが、YMNM、PRRP、又はPYAPから選択されるサブドメインのうちのいずれか2つの機能を欠く、請求項55から57のいずれか一項に記載のCARポリペプチド。
59. CD8a又はCD28に由来するヒンジ配列をさらに含む、請求項42から58のいずれか一項に記載の二重特異性CAR T細胞。
60. 1つ以上の免疫チェックポイント分子をもはや発現しないように遺伝子改変されている、請求項34から59のいずれか一項に記載のCAR発現細胞。
61. ドミナントネガティブ型の1つ以上の免疫チェックポイント分子の発現をさらに含む、請求項34から59のいずれか一項に記載のCAR発現細胞。
62. 1つ以上の免疫チェックポイント分子に特異的なスイッチ受容体の発現をさらに含む、請求項34から59のいずれか一項に記載のCAR発現細胞。
63. 1つ以上のチェックポイント分子によるシグナル伝達を遮断することができる抗体又はその機能的断片の発現をさらに含む、請求項34から59のいずれか一項に記載のCAR発現細胞。
64. 免疫チェックポイント分子が、プログラム死1(PD-1)、プログラム死-リガンド1(PD-L1)、プログラム死-リガンド2(PD-L2)、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA-4)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、T細胞免疫グロブリンムチン-3(TIM-3)、リンパ球活性化タンパク質3(LAG-3)、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)、白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1)、ナチュラルキラー細胞受容体2B4(2B4)、CD160、並びに形質転換成長因子β(TGF-β)受容体から選択される、請求項60から63のいずれか一項に記載のCAR発現細胞。
65. 免疫チェックポイント分子が、PD-1及び/又はCTLA-4である、請求項60から64のいずれか一項に記載の免疫細胞。
66. 対象におけるBリンパ球抗原関連がんを処置する方法であって、請求項32から65のいずれか一項に記載のCAR発現細胞を含む有効量の養子免疫療法組成物を投与することを含む、方法。
67. Bリンパ球抗原関連がんが、急性白血病、慢性白血病、リンパ球性白血病、骨髄性白血病、前白血病状態、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、EBV関連リンパ増殖性疾患、成熟B細胞新生物、成熟T細胞及び/又はナチュラルキラー(NK)細胞新生物、前駆リンパ系新生物、並びに免疫不全関連リンパ増殖性障害から選択される血液がんである、請求項66に記載の方法。
68. Bリンパ球抗原関連がんがEBV関連リンパ増殖性疾患である、請求項66又は67に記載の方法。
69. 対象が、追加の抗がん療法を受けたことがあるか、受けているか、又は受ける予定である、請求項66から68のいずれか一項に記載の方法。
70. 追加の抗がん療法が、外科的処置、放射線照射、化学療法、免疫療法、又はホルモン療法を含む、請求項69に記載の方法。
71. 養子免疫療法組成物が、胸腔内に、静脈内に、皮下に、結節内に、腫瘍内に、髄腔内に、腹腔内に、頭蓋内に、又は臓器への直接投与によって投与される、請求項66から70のいずれか一項に記載の方法。
72. 対象がヒトである、請求項66から71のいずれか一項に記載の方法。
73. 養子免疫療法組成物のCAR発現細胞が、対象に由来する、請求項72に記載の方法。
74. 養子免疫療法組成物のCAR発現細胞が、ドナー試料、又はドナー試料のバンク若しくはライブラリーに由来する、請求項73に記載の方法。
75. 少なくとも1種の免疫チェックポイント阻害薬を投与することをさらに含む、請求項66から74のいずれか一項に記載の方法。
76. 免疫チェックポイント阻害薬が、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、又はそれらの組合せを含む、請求項75に記載の方法。
77. 免疫チェックポイント阻害薬が、アンチセンスRNA分子(asRNA)、マイクロRNA分子(miRNA)、短鎖ヘアピンRNA分子(shRNA)、又は低分子干渉RNA分子(siRNA)等のRNAi分子を含む、請求項75に記載の方法。
78. 免疫チェックポイント阻害薬がCRISPR RNA(crRNA)分子を含む、請求項75に記載の方法。
79. 免疫チェックポイント阻害薬がドミナントネガティブ型の免疫チェックポイント分子を含む、請求項75に記載の方法。
80. 免疫チェックポイント阻害薬が組換えスイッチ受容体を含む、請求項75に記載の方法。
81. 免疫チェックポイント阻害薬が、免疫チェックポイント阻害薬をコードする核酸分子を含むベクターによって発現し、ベクターが、DNAベクター、RNAベクター、プラスミド、又はウイルスベクターから選択される、請求項75から80のいずれか一項に記載の方法。
82. 免疫チェックポイント阻害薬をコードする核酸分子を含むベクターが、養子免疫療法組成物のCAR発現細胞において発現する、請求項81に記載の方法。

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