JP2022529257A - Bcl2ファミリータンパク質標的薬物に対する反応性予測方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)試料内の第1タンパク質および前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質の間の相互作用を測定する段階として、前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質は外部から供給されたタンパク質である段階(第1タンパク質-タンパク質相互作用の測定段階);
(ii)試料内の第1タンパク質および前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質の間の相互作用を測定する段階として、前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質は試料内に存在するタンパク質である段階(第2タンパク質-タンパク質相互作用の測定段階);および
(iii)第1タンパク質、前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質、またはこれらすべての試料内の水準を測定する段階。
(i-1)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBADタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-2)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-3)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-4)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-5)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBADタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-6)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-7)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-8)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-9)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたNOXAタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-10)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-11)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;および
(i-12)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階。
(1)第1タンパク質の結合物質が含まれた基板に前記試料を供給して第1タンパク質を基板に固定させる段階;
(2-1)前記基板に、標識物質が付着した第1タンパク質相互作用タンパク質を外部から供給して基板上の第1タンパク質と反応させる段階;および
(3)基板表面上の近接場領域内で前記標識物質が発生させる信号をTIRF顕微鏡(total internal reflection fluorescence microscope)を用いて測定する段階
により行われた前記段階を含み得る。
(ii-1)試料内のBCL2タンパク質および試料内のBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用(例、形成された複合体水準)を測定する段階;
(ii-2)試料内のBCL2タンパク質および試料内のBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用(例、形成された複合体水準)を測定する段階;
(ii-3)試料内のBCL2タンパク質および試料内のBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用(例、形成された複合体水準)を測定する段階;
(ii-4)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBADタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用(例、形成された複合体水準)を測定する段階;
(ii-5)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用(例、形成された複合体水準)を測定する段階;
(ii-6)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用(例、形成された複合体水準)を測定する段階;
(ii-7)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用(例、形成された複合体水準)を測定する段階;
(ii-8)試料内のMCL1タンパク質および試料内のNOXAタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(ii-9)試料内のMCL1タンパク質および試料内のBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用(例、形成された複合体水準)を測定する段階;
(ii-10)試料内のMCL1タンパク質および試料内のBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用(例、形成された複合体水準)を測定する段階;および
(ii-11)試料内のMCL1タンパク質および試料内のBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用(例、形成された複合体水準)を測定する段階。
(1)第1タンパク質の結合物質が含まれた基板に試料を供給(投入)して第1タンパク質を基板に固定させる段階;
(2-2)標識物質が付着した第1タンパク質相互作用タンパク質の結合物質を前記基板に供給し、第1タンパク質(試料内のタンパク質)と第1タンパク質相互作用タンパク質(試料内のタンパク質)の間に形成された複合体(complex)のうち第1タンパク質相互作用タンパク質と反応させる段階;および
(3)基板表面上の近接場領域内で前記標識物質から発生する信号をTIRF顕微鏡(total internal reflection fluorescence microscope)を用いて測定する段階
により行われた前記段階を含み得る。
(1)第1タンパク質相互作用タンパク質の結合物質が含まれた基板に試料を供給(投入)して第1タンパク質相互作用タンパク質を基板に固定させる段階;
(2-2)標識物質が付着した第1タンパク質の結合物質を前記基板に供給し、第1タンパク質(試料内のタンパク質)と第1タンパク質相互作用タンパク質(試料内のタンパク質)の間に形成された複合体(complex)のうち第1タンパク質と反応させる段階;および
(3)基板表面上の近接場領域内で前記標識物質から発生する信号をTIRF顕微鏡(total internal reflection fluorescence microscope)を用いて測定する段階
により行われた前記段階を含み得る。
(iii-1)試料内のBCL2タンパク質の水準を測定する段階;
(iii-2)試料内のBCLxlタンパク質の水準を測定する段階;
(iii-3)試料内のMCL1タンパク質の水準を測定する段階;
(iii-4)試料内のBAXタンパク質の水準を測定する段階;および
(iii-5)試料内のBAKタンパク質の水準を測定する段階。
-第1タンパク質の結合物質(第1タンパク質の基板固定のための捕獲物質)、第1タンパク質相互作用タンパク質の結合物質(第1タンパク質相互作用タンパク質の固定のための捕獲物質)、またはこれらすべてが含まれた基板に試料を供給し、前記第1タンパク質、第1タンパク質相互作用タンパク質、またはこれらすべてを基板に固定化させる段階;
-標識物質が付着した第1タンパク質の結合物質(基板に第1タンパク質が固定化された場合、第1タンパク質検出のための検出物質)、標識物質が付着した第1タンパク質相互作用タンパク質の結合物質(基板に第1タンパク質相互作用タンパク質が固定化された場合、第1タンパク質相互作用タンパク質検出のための検出物質)、またはこれらすべて(基板に第1タンパク質および第1タンパク質相互作用タンパク質が固定化された場合)を前記基板に供給して反応させる段階;および
により行われたり前記段階を含み得る。
BCL2:ab32124、ab182858、ab238041、ab692(以上、Abcam)、3498S、15071S、#4223(以上、CST)、BSM-52304R、BSM-10846M、BSM-33411M、BSM-52022M(以上、Bioss)、NB100-56098(Novus)、12789-1-AP(Proteintech)、LS-C159170-400(LSBio)、13-8800(Thermo Fisher Scientific)、610538(BD)、sc-509、sc-23960、sc-7382(以上、Santa cruz)、TA806591、CF806589、UM800117、CF806639(以上、OriGene)など;
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(b)前記段階(a1)で測定されたBCL2ファミリータンパク質の間の相互作用および/または段階(a2)で測定された試料内のBCL2ファミリータンパク質水準を基準値と比較する段階(b1)、および/または前記試料または前記試料が分離された個体が前記BCL2ファミリータンパク質標的薬物に対して反応性を有する患者であることおよび/または前記BCL2ファミリータンパク質標的薬物が前記試料または前記試料が分離された個体で効果を発揮できるものであることを確認(または決定、判断)する段階、および/または、前記個体を、BCL2ファミリータンパク質標的薬物を適用するのに適した対象として選択(または確認、決定、判断)する段階(b2)をさらに含み得る。
(a1’)試料内の比較タンパク質および前記比較タンパク質と相互作用するタンパク質の間の相互作用を測定する段階および/または(a2’)試料内の比較タンパク質および/または比較タンパク質相互作用タンパク質の水準を測定する段階。
個体から得られた(分離した)試料内のBCL2ファミリータンパク質の間の相互作用(例えば、段階(a1)の(i)および/または(ii)によって測定される)および/または試料内のBCL2ファミリータンパク質水準(例えば、段階(a2)で測定される)が、前記基準値(例えば、効果群から得られた基準値)と類似の範囲または前記基準値を超える個体(例えば、本明細書で提供されるBCL2ファミリータンパク質標的薬物に対する反応性予測および/または前記薬物の効能予測方法によって前記BCL2ファミリータンパク質標的薬物に対して反応性を有するか前記薬物が効能を発揮するものと確認された個体、および/または前記BCL2ファミリータンパク質標的薬物の投与またはそれを用いた治療に適した対象の選択方法によって前記BCL2ファミリータンパク質標的薬物の投与またはBCL2ファミリータンパク質標的薬物を用いる治療に適した対象に選ばれた個体)。
先立って説明した通り、本明細書において、遺伝子的特徴としては観測できないBCL2ファミリータンパク質のアポトーシス抑制能力を、単分子タンパク質相互作用の測定方法により定量的に把握し、これを血液癌患者の診断方法として活用することを提案する。これのために核心的な技術は次のとおりである:(1)タンパク質相互作用の観測が、細胞内に存在するBCL2ファミリータンパク質の多様な状態を反映、(2)多角的タンパク質相互作用の観測およびタンパク質水準の観測の定量的な比較により、BCL2ファミリータンパク質標的薬物(一例としてベネトクラクス(Venetoclax)、AMG 176、またはAZD5991など)に敏感な細胞株および患者を選別可能。
本明細書では、細胞内に存在するBCL2ファミリータンパク質の状態が保持された状態で基板に捕獲されるかどうかを確認した。
本明細書で、細胞内に存在するBCL2ファミリータンパク質の状態変化がタンパク質相互作用(PPI)の測定に反映されることを確認した。
本明細書では、細胞や患者検体のアポトーシス誘導タンパク質とアポトーシス抑制タンパク質が細胞死に及ぼす影響を、試料内タンパク質と外来タンパク質の間の相互作用の測定(第1タンパク質-タンパク質相互作用の測定)、試料内タンパク質間の相互作用の測定(第2タンパク質-タンパク質相互作用の測定)、および/またはタンパク質発現量の測定などをそれぞれ定量的に行い、細胞死信号を複合的に分析し、これを用いてBCL2ファミリータンパク質標的薬物(一例としてベネトクラクス(Venetoclax))に対する敏感度を確認した。
前記段階(1)は、第1タンパク質または第1タンパク質を含む試験試料を、表面に前記第1タンパク質に特異的に結合する物質を含む基板に加えて、第1タンパク質が固定された基板を準備する段階である。
前記段階(2)では、下記段階(2-1)および/または(2-2)を実施することができる。
前記段階(2-1)は、前記第1タンパク質(試料内のタンパク質)が固定された基板(例えば、前記段階(1)で準備される)に、標識物質で標識された(標識物質が付着した)第1タンパク質相互作用タンパク質(試料外のタンパク質)を添加して前記第1タンパク質と反応させる段階である。前記標識物質から生成された信号を測定することによって、試料内のタンパク質と試料外のタンパク質の間の複合体形成水準を確認することができ、これにより試料内のタンパク質と試料外のタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用水準を測定することができる。
前記段階(2-2)は、前記第1タンパク質が固定された基板(例えば、前記段階(1)で準備される)に、第1タンパク質相互作用タンパク質の結合物質(前記結合物質は標識物質が付着する)を供給し、第1タンパク質(試料内)と第1タンパク質相互作用タンパク質(試料内)の間に形成された複合体(complex)のうち第1タンパク質相互作用タンパク質と反応させる段階である。前記標識物質から生成された信号を測定することによって試料内のタンパク質複合体形成水準を確認することができ、これにより試料内のタンパク質-タンパク質相互作用の水準を測定することができる。
前記段階(3)は、前記段階(2)(すなわち、(2-1)および/または(2-2))で得られた反応物から信号を測定する段階である。前記信号測定は、段階(2)で使用された標識信号(例えば、酵素反応、蛍光、発光、または放射線検出などの通常の方法により測定可能な信号)を検出(または測定または確認)できるあらゆる手段を用いて行われ得る。
(i)前記段階(2)の反応物に光源を供給する段階;および
(ii)前記供給された光源によって発生した蛍光信号を検出する段階
を含み得る。
段階(4)は、前記段階(3)で得られた結果(タンパク質-タンパク質相互作用の水準)を、第1比較タンパク質と第1比較タンパク質相互作用タンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用水準と比較したり基準値と比較する段階である。前記第1比較タンパク質と第1比較タンパク質相互作用タンパク質、および基準値は先立って説明したとおりである。
第1タンパク質に特異的に結合する第1タンパク質の捕獲用物質または第1タンパク質を含む反応部を含むか、
これに加えて、第1タンパク質相互作用タンパク質検出用製剤および/または信号検出手段をさらに含むものであり得る。前記第1タンパク質相互作用タンパク質検出用製剤および第1タンパク質相互作用タンパク質に(特異的に)結合する結合物質を含むものとして、前記結合物質は、第1タンパク質相互作用タンパク質が第1タンパク質と相互作用(結合)する部位と相違する部位に結合する物質(例えば、抗体、抗原結合断片、抗体類似体、アプタマー、小分子化合物など)であり得、標識物質で標識されたものであり得る。
慢性リンパ球性白血病(CLL)および急性骨髄性白血病など多様な血液癌患者から得られた骨髄サンプルから、Ficolle gradientのprotocol(GE healthcare Ficoll-paque plus 17-1440-03)を用いてBuffy coatのみを選別的に収集した。
標識物質で標識された第1タンパク質相互作用タンパク質(マーカー(probe)タンパク質)は一時的トランスフェクションにより生産した。より具体的には、pEGFP-C1(Addgene:PT3028-5)に制限酵素処理後、各タンパク質遺伝子BIM(Sino biological:HG13819-G)、NOXA(Sino biological:HG16548-U)、BAD(Sino biological:HG10020-M)を挿入して、GFP発現タンパク質ベクターを製造した。製造された発現ベクターを、Polyethylenimineを用いてHEK293T細胞(ATCC;CRL-3216)に一時的トランスフェクションして、過発現されたGFP-標識(GFP-labeled)タンパク質を取得した。
45mm*60mm Glass cover slipを、biotin PEG:mPEGの比率を3:100(w:w)にしてコートした。
前記実施例1.2で準備された、標識物質が付着した第1タンパク質相互作用タンパク質を含む細胞溶解物を、実施例1.3で準備された基板に供給した。より具体的には、前記実施例1.2の細胞溶解物をウェルに10ulずつ入れて室温で15分間反応させた後、Washing buffer(Hepes 50mM Nacl 150mM Glycerol 1% GDN 0.03%)で残余物を洗浄した。その後、次のようにタンパク質相互作用(PPI)を測定した:
本実施例では、同じ試料内第1タンパク質と第1相互作用タンパク質の間の相互作用測定を行った。具体的には、前記相互作用は、分析溶解液内で第1タンパク質と第1タンパク質相互作用タンパク質が結合された状態で存在する第1タンパク質-第1タンパク質相互作用タンパク質複合体を検出して測定した。本実施例で測定された第1タンパク質-第1タンパク質相互作用タンパク質の間複合体を下記の表3に例示した:
本実施例では、分析溶解液内に存在する特定タンパク質の量を定量的に測定した。前記特定タンパク質はBCL2、BCL-XL、MCL1、BAX、およびBAKである。
本実施例は、タンパク質折り畳み形態によって特異的に認知できる抗体または結合物質を用いて、検体内に存在する特定折り畳み形態(conformation)のタンパク質を検出する方法に適用することができる。一実施形態でタンパク質折り畳み形態の特異的検出はBAX、BAKを含む。
本実施例は、BCL2ファミリータンパク質の標的阻害剤処理による細胞内の信号伝達変化を測定できる方法を提供する。より具体的にはBCL2標的阻害剤であるベネトクラクス(Venetoclax)、またはMCL1標的阻害剤であるAZD5991で処理しながら、細胞内に存在する多様なBCL2ファミリータンパク質(例えば、BCL2、BCL-XL、MCL1)の試料間のタンパク質相互作用の強度、試料内のタンパク質相互作用の強度(複合体測定)、タンパク質発現量の変化を包括的に分析できる方法を提供する。
BIM*は、BIMのうちBH3ドメインのみを切り出したタンパク質にGFPマーカーが備えられた形態であり、
第1タンパク質は、分析溶解液に含まれたタンパク質であり、基板表面に結合されるタンパク質である)
本実施例で例示する方法は、患者(例えば急性骨髄性白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)または乳癌)から由来した検体でBCL2ファミリータンパク質の特性を測定することである。
本実施例で提案する二つの方法、第1タンパク質相互作用タンパク質を用いるPPI強度測定(実施例1)と第1タンパク質結合タンパク質との複合体形成測定(実施例2)は互いに異なる情報を提供することができる。
本実施例で提案する方法により、患者の分子的状態を時系列で追跡する方法を提供することができる。より具体的には、血液癌患者の骨髄または血液検体を時間に応じて採集して、相互作用分析によりBCL2ファミリータンパク質の依存程度および該当標的抗癌剤処方の有無を決定するのに役に立つ情報を提供することができる。これを実現するために、患者1において、i)診断当時の骨髄を抽出してBCL2、MCL1、BCL-XLとBIM-GFPの間の相互作用(PPI)分析、ii)FLT3標的抗癌剤であるquizartinib処方後骨髄を再抽出して同じ分析、iii)前記ii)段階で取得された相互作用(PPI)情報に基づいて、venetoclaxとLow-dose cytarabine(LDAC)を処方した後取得した全血検体で同じ分析を行った(図34)。診断当時患者のBCL2-BIMPPIは低いためvenetoclax処方根拠が不足したが、FLT3標的阻害剤であるquizartinib処方以後、BCL2-BIMPPIが急激に高まる信号伝達経路再設定(signal rewiring)が発生し、これに基づいてvenetoclaxとLDACを併用処方してBCL2-BIMPPIが再び低くなることを確認した。また、臨床的所見としてはquizartinib処方以後に急激な白血球(WBC)数値上昇が発生したが、venetoclax+LDACの併用処方以後に再び安定した白血球数値を示して、venetoclaxの薬効を臨床的レベルでも確認することができた。以後、臍帯血抽出幹細胞移植(Cord blood stem cell transplantation)により、当該患者は完全寛解(complete remission)を達成することができた。
本実施例で提案される方法により、急性骨髄性白血病(Acute myeloid leukemia)患者の、BCL2標的阻害剤ベネトクラクス(venetoclax)に対する感受性を予測することができる。
実施例9で行ったものと同様に、MCL1標的阻害剤に対する反応性予測方法が提供され得る。一例としてMCL1標的阻害剤はAZD5991を用いたが、類似の薬物作用機構(mechanism of action)を有する標的阻害剤であれば同等に使用され得る。使用された薬物の種類は本発明の範囲を制限しない。
Claims (16)
- 次の中から選ばれた一つ以上を含む、個体のBCL2ファミリータンパク質標的薬物に対する反応性予測のために情報を提供する方法:
(i)試料内の第1タンパク質および前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質の間の相互作用を測定する段階であって、前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質は外部から供給されたタンパク質である、段階;
(ii)試料内の第1タンパク質および前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質の間の相互作用を測定する段階であって、前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質は試料内に存在するタンパク質である、段階;および
(iii)第1タンパク質、前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質、またはこれらすべての試料内のレベルを測定する段階、
ここで、前記第1タンパク質はBCL2ファミリータンパク質のうちアポトーシス抑制(anti-apoptotic)タンパク質より選ばれた1種以上であり、前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質はBCL2ファミリータンパク質のうちアポトーシス誘導(pro-apoptotic)タンパク質からなる群より選ばれた1種以上であるか、または、前記第1タンパク質はBCL2ファミリータンパク質のうちアポトーシス誘導タンパク質より選ばれた1種以上であり、前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質はBCL2ファミリータンパク質のうちアポトーシス抑制タンパク質からなる群より選ばれた1種以上であり、
前記試料は前記個体から分離された細胞または細胞溶解物を含む。 - 前記第1タンパク質はBCL2、BCLxL、BCLw、BFL1およびMCL1からなる群より選ばれた1種以上であり、前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質はBAD、BIM、NOXA、PUMA、BMF、tBID、BIK、HRK、BAX、BAKおよびBOKからなる群より選ばれた1種以上であるか、または
前記第1タンパク質はBAD、BIM、NOXA、PUMA、BMF、tBID、BIK、HRK、BAX、BAKおよびBOKからなる群より選ばれた1種以上であり、前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質はBCL2、BCLxL、BCLw、BFL1およびMCL1からなる群より選ばれた1種以上である、
請求項1に記載の方法。 - 前記段階(i)は、基板に固定された第1タンパク質に、外部から供給されて標識物質で標識された前記第1タンパク質と相互作用するタンパク質(第1タンパク質相互作用タンパク質)を接触させ、前記試料内の第1タンパク質および外部から供給された第1タンパク質相互作用タンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階を含み;
前記段階(ii)は、表面に前記第1タンパク質と結合する結合物質を含む基板に、試料を接触させ、試料内の第1タンパク質および試料内の第1タンパク質相互作用タンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階を含み;
前記段階(iii)は、試料内の第1タンパク質、試料内の第1タンパク質相互作用タンパク質、またはこれらすべてのレベルを測定する段階を含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記段階(i)のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階は、
(1)第1タンパク質の結合物質が含まれた基板に試料を供給して第1タンパク質を基板に固定させる段階;
(2-1)前記基板に、標識物質が付着した第1タンパク質相互作用タンパク質を外部から供給して、基板上の第1タンパク質と反応させる段階;および
(3)基板表面上の近接場領域内で前記標識物質が発生させる信号をTIRF顕微鏡(total internal reflection fluorescence microscope)を用いて測定する段階
を含む、請求項3に記載の方法。 - 前記段階(i)は、次の中から選ばれた一つ以上を含む、請求項2に記載の方法:
(i-1)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBADタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-2)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-3)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-4)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-5)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBADタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-6)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-7)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-8)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-9)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたNOXAタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-10)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-11)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;および
(i-12)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階。 - 前記段階(ii)のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階は、
(1)第1タンパク質の結合物質が含まれた基板に試料を供給して第1タンパク質を基板に固定させる段階;
(2-2)標識物質が付着した第1タンパク質相互作用タンパク質の結合物質を前記基板に供給し、試料内の第1タンパク質と試料内の第1タンパク質相互作用タンパク質の間に形成された複合体中の、第1タンパク質相互作用タンパク質と反応させる段階;および
(3)基板表面上の近接場領域内で前記標識物質から発生する信号をTIRF顕微鏡(total internal reflection fluorescence microscope)を用いて測定する段階を含むか、または
(1’)第1タンパク質相互作用タンパク質の結合物質が含まれた基板に試料を供給して第1タンパク質相互作用タンパク質を基板に固定させる段階;
(2’-2)標識物質が付着した第1タンパク質結合物質を前記基板に供給し、試料内の第1タンパク質と試料内の第1タンパク質相互作用タンパク質の間に形成された複合体中の、第1タンパク質と反応させる段階;および
(3’)基板表面上の近接場領域内で前記標識物質から発生する信号をTIRF顕微鏡(total internal reflection fluorescence microscope)を用いて測定する段階を含む、
請求項3に記載の方法。 - 前記段階(ii)は次の中から選ばれた一つ以上を含む、請求項2に記載の方法:
(ii-1)試料内のBCL2タンパク質および試料内のBIMタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-2)試料内のBCL2タンパク質および試料内のBAXタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-3)試料内のBCL2タンパク質および試料内のBAKタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-4)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBADタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-5)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBIMタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-6)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBAXタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-7)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBAKタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-8)試料内のMCL1タンパク質および試料内のNOXAタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-9)試料内のMCL1タンパク質および試料内のBIMタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-10)試料内のMCL1タンパク質および試料内のBAXタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;および
(ii-11)試料内のMCL1タンパク質および試料内のBAKタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階。 - 前記段階(iii)のタンパク質のレベルを測定する段階は、
第1タンパク質の捕獲物質、第1タンパク質相互作用タンパク質の捕獲物質、またはこれらすべてが含まれた基板に試料を供給し、前記第1タンパク質、第1タンパク質相互作用タンパク質、またはこれらすべてを基板に固定化させる段階;
標識物質が付着した第1タンパク質の検出物質、標識物質が付着した第1タンパク質相互作用タンパク質の検出物質、またはこれらすべてを前記基板に供給して反応させる段階;および
基板表面上の近接場領域内で前記マーカーが発現する信号をTIRF顕微鏡(total internal reflection fluorescence microscope)を用いて測定する段階
を含む、請求項3に記載の方法。 - 前記段階(iii)は次の中から選ばれた一つ以上を含む、請求項2に記載の方法:
(iii-1)試料内のBCL2タンパク質のレベルを測定する段階;
(iii-2)試料内のBCLxlタンパク質のレベルを測定する段階;
(iii-3)試料内のMCL1タンパク質のレベルを測定する段階;
(iii-4)試料内のBAXタンパク質のレベルを測定する段階;および
(iii-5)試料内のBAKタンパク質のレベルを測定する段階。 - 次の中から選ばれた一つ以上を含む、請求項2に記載の方法:
(i-1)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBADタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-2)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-3)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-4)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-5)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBADタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-6)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-7)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-8)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-9)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたNOXAタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-10)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-11)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-12)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(ii-1)試料内のBCL2タンパク質および試料内のBIMタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-2)試料内のBCL2タンパク質および試料内のBAXタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-3)試料内のBCL2タンパク質および試料内のBAKタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-4)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBADタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階; (ii-5)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBIMタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-6)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBAXタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-7)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBAKタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-8)試料内のMCL1タンパク質および試料内のNOXAタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-9)試料内のMCL1タンパク質および試料内のBIMタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-10)試料内のMCL1タンパク質および試料内のBAXタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-11)試料内のMCL1タンパク質および試料内のBAKタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(iii-1)試料内のBCL2タンパク質のレベルを測定する段階;
(iii-2)試料内のBCLxlタンパク質のレベルを測定する段階;
(iii-3)試料内のMCL1タンパク質のレベルを測定する段階;
(iii-4)試料内のBAXタンパク質のレベルを測定する段階;および
(iii-5)試料内のBAKタンパク質のレベルを測定する段階。 - 次の段階(i-1)~(i-12)より選ばれた一つ以上および段階(ii-1)~(ii-11)より選ばれた一つ以上を含むか、段階(i-1)~(i-12)より選ばれた一つ以上および段階(iii-1)~(iii-5)より選ばれた一つ以上を含むか、段階(ii-1)~(ii-11)より選ばれた一つ以上および段階(iii-1)~(iii-5)より選ばれた一つ以上を含むか、段階(i-1)~(i-12)より選ばれた一つ以上、段階(ii-1)~(ii-11)より選ばれた一つ以上、および段階(iii-1)~(iii-5)より選ばれた一つ以上を含む、請求項10に記載の方法:
(i-1)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBADタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-2)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-3)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-4)試料内のBCL2タンパク質および外部から供給されたBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-5)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBADタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-6)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-7)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-8)試料内のBCLxlタンパク質および外部から供給されたBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-9)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたNOXAタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-10)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたBIMタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-11)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたBAXタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(i-12)試料内のMCL1タンパク質および外部から供給されたBAKタンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を測定する段階;
(ii-1)試料内のBCL2タンパク質および試料内のBIMタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-2)試料内のBCL2タンパク質および試料内のBAXタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-3)試料内のBCL2タンパク質および試料内のBAKタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-4)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBADタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-5)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBIMタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-6)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBAXタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-7)試料内のBCLxlタンパク質および試料内のBAKタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-8)試料内のMCL1タンパク質および試料内のNOXAタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-9)試料内のMCL1タンパク質および試料内のBIMタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-10)試料内のMCL1タンパク質および試料内のBAXタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(ii-11)試料内のMCL1タンパク質および試料内のBAKタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階;
(iii-1)試料内のBCL2タンパク質のレベルを測定する段階;
(iii-2)試料内のBCLxlタンパク質のレベルを測定する段階;
(iii-3)試料内のMCL1タンパク質のレベルを測定する段階;
(iii-4)試料内のBAXタンパク質のレベルを測定する段階;
(iii-5)試料内のBAKタンパク質のレベルを測定する段階。 - 前記BCL2ファミリータンパク質標的薬物はベネトクラクス(Venetoclax)、ABT737、および抗BCL2抗体からなる群より選ばれたBCL2阻害剤である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記BCL2ファミリータンパク質標的薬物は抗MCL-1抗体、AMG-176、AZD5991、およびマリトクラックス(Maritoclax)からなる群より選ばれたMCL1阻害剤である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記BCL2ファミリータンパク質標的薬物は抗BCLxL抗体およびABT263からなる群より選ばれたBCLxL阻害剤である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個体は癌患者であり、前記細胞は前記個体から分離された癌細胞である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌は血液癌である、請求項15に記載の方法。
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