JP2022528742A - 新規なリッサウイルスリン酸化タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、リン酸化タンパク質（Ｐタンパク質）のシグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）相互作用表面に１つ以上のアミノ酸置換を含む、単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り １．２０１８年８月２７日 ｈｔｔｐｓ：／／ｍｉｎｅｒｖａａｃｃｅｓｓ．ｕｎｉｍｅｌｂ．ｅｄｕ．ａｕ／ｈａｎｄｌｅ／１１３４３／２１５９０９？ｓｈｏｗ＝ｆｕｌｌにて発表

この出願は、2019年4月3日に出願されたオーストラリア仮特許出願第2019901137号の優先権を主張し、その仮特許出願の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は、一般的に、リッサウイルスポリペプチド、ビリオン、免疫刺激組成物を含む、毒性が改変されたリッサウイルス、及びそれらを作製し、使用する方法、並びに、狂犬病ウイルス感染を含む、リッサウイルス感染を治療し、及び／又は防止する方法に関する。

技術背景

狂犬病は、ワクチン接種していない個体では、ほぼ１００％の致死率を有するヒトの治療不可能な疾患である。狂犬病の病原因子は、ほとんど地球規模で分布しているリッサウイルス属のウイルスで、そのうち最もよく解明されているのは、多様な哺乳動物に感染する狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）であり、ヒトへの伝染は、最も一般的には感染したイヌからの咬傷を通してである。

ラブドウイルス科はリッサウイルス属を含み、リッサウイルス属は、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス（Lagos bat virus）（ＬＢＶ）、モコラウイルス（Mokola virus）（ＭＯＫＶ）、ドゥーベンハーゲウイルス（Duvenhage virus）（ＤＵＶＶ）、ヨーロッパコウモリリッサウイルス１（European bat lyssavirus-1）（ＥＢＬＶ－１）、ヨーロッパコウモリリッサウイルス２（European bat lyssavirus-2）（ＥＢＬＶ－２）、オーストラリアコウモリリッサウイルス（Australian bat lyssavirus）（ＡＢＬＶ）、アラバンウイルス（Aravan virus）（ＡＲＡＶ）、クージャンウイルス（Khujand virus）（ＫＨＵＶ）、イルクーツクウイルス（Irkut virus）（ＩＲＫＶ）、西コーカサスコウモリウイルス（West Caucasian bat virus）（ＷＣＢＶ）及びシモニコウモリウイルス（Shimoni bat virus）を含む。

新規で改善されたワクチンの開発は、特に動物集団において、狂犬病及び他のリッサウイルスをコントロールする際の優先事項であり、ヒトで疾患を防止するための非常に効果的なアプローチとして認識されている。

細胞培養から調製された不活化狂犬病ワクチンは安全で耐容性が良好であるが、多くの欠点がある。それは、製造することが難しく、貯蔵するのが難しく、免疫原性が低く、複数回の注射を必要とする。さらに、それは高価で、したがって、ワクチンの使用を必要とする人々、たとえば発展途上国のほとんどの人々にとって手が届かない。加えて、これらの不活化ワクチンは、通常、副作用を引き起こす可能性があるアジュバントを含む。

ヒトの狂犬病は人獣共通感染症であることから、野良犬の捕獲や非経口でのワクチン接種といった、その病気に罹っている動物の管理に依存している。経口ワクチンを含む餌が野生動物に有効であることが実証されているが、効果的な削減キャンペーンを妨げる、イヌに対する弱毒化経口ワクチンに関する安全性及び効力の問題がある。したがって、より安全で、より安価で、より効力の高いワクチンが必要とされている。

ウイルス感染に対する主要な宿主細胞応答は、自然免疫応答の活性化であり、リッサウイルス、たとえば狂犬病ウイルスは、これらの自然免疫応答に反撃することができる。

効果的な免疫刺激リッサウイルスワクチンを開発する必要性が依然として存在する。

本発明者らは、リッサウイルスＰタンパク質のシグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）相互作用表面を解明した。したがって、一つの側面において、本発明は、リン酸化タンパク質（Ｐタンパク質）のＳＴＡＴ１相互作用表面に１つ以上のアミノ酸置換を含む、単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

本発明者らは、Ｐタンパク質のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）内にあるＳＴＡＴ１相互作用表面を解明した。したがって、一つの態様において、本発明は、ＳＴＡＴ１相互作用表面がＰタンパク質のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）内にある、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。別の態様において、上記相互作用表面は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の残基１８６～２９７に対応する領域内にある。

一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が、たとえば図１に示されているように、Ｐタンパク質のＣ末端ドメインのαヘリックス１、αヘリックス２及び／又はαヘリックス５内にあるか、隣接する、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換がＰタンパク質のＳＴＡＴ１との相互作用に干渉する、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

重要なことには、本発明者らは、１つ以上のアミノ酸置換が、Ｐタンパク質のＩＦＮアンタゴニスト活性を調節し得ることを実証した。したがって、一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換がＰタンパク質のＩＦＮアンタゴニスト活性を調節する、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

一つの側面において、本発明は、Ｐタンパク質がＰタンパク質のＷホールにアミノ酸置換を含まない、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が、ポリメラーゼ補因子機能を無効にしない、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。別の好ましい態様において、１つ以上のアミノ酸置換は、ウイルス転写を可能にし、ウイルス複製を可能にし、及び／又はＮタンパク質との結合を可能にする。

一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換がＮタンパク質相互作用表面内にない、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

別の側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０３～２７７に対応する領域内にある、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

別の側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０３、２０４、２０６、２０７、２０９、２３４、２３５、２３６、２３９及び／又は２７７に対応するアミノ酸残基にある、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

別の側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０３、２０４、２０６、２０７、２０９、２３４、２３５、２３６、２３９及び／又は２７７に対応するアミノ酸残基にあり、上記置換が２０３Ａ、２０６Ｇ、２０７Ａ、２０９Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｋ、２３６Ａ、２３９Ａ及び／又は２７７Ａである、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

別の側面において、本発明は、Ｐタンパク質が少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

別の側面において、本発明は、少なくとも２つのアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０６、２０９及び２３５に対応するアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基にある、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。別の態様において、本発明は、２つのアミノ酸置換が、Ｆ２０９Ａ、Ｄ２３５Ａ、Ａ２０６Ｅ、Ｄ２３５Ｋ及びＤ２３６Ａ又は等価の保存位置からなる群から選択される、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

別の側面において、本発明は、Ｐタンパク質のＷホールに１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

別の側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６５及び／又は２８７に対応するアミノ酸残基にある、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

別の側面において、本発明は、アミノ酸置換が２６５Ｇ若しくは２８７Ｖ又は等価の保存位置である、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

別の側面において、本発明は、リッサウイルスが、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、ドゥーベンハーゲウイルス、ヨーロッパコウモリリッサウイルス１及び２、イルクーツクウイルス、西コーカサスコウモリウイルス並びにオーストラリアコウモリリッサウイルスからなる群から選択される、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

一つの側面において、本発明は、本明細書に記載のＰタンパク質をコードする単離された核酸又はその相補体を提供する。

別の側面において、本発明は、本明細書に記載の核酸を含む細胞又はベクターを提供する。

別の側面において、本発明は、リッサウイルスゲノムの相補体が本明細書に記載のＰタンパク質をコードする、リッサウイルスゲノムを提供する。

別の側面において、本発明は、本明細書に記載のリッサウイルスゲノムを含むリッサウイルスビリオンを提供する。好ましい態様において、本発明は、リッサウイルスが弱毒化されている、本明細書に記載のリッサウイルスゲノムを含むリッサウイルスビリオンを提供する。別の好ましい態様において、本発明は、リッサウイルスが複製することができる、本明細書に記載のリッサウイルスゲノムを含むリッサウイルスビリオンを提供する。

別の側面において、本発明は、本明細書に記載のリッサウイルスビリオン及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。

別の側面において、本発明は、対象においてリッサウイルス感染を治療及び／又は防止するための薬剤の製造における本明細書に記載のリッサウイルスビリオンの使用を提供する。

別の側面において、本発明は、対象においてリッサウイルス感染を治療及び／又は防止する方法であって、前記方法が、本明細書に記載のビリオン又は本明細書に記載の薬学的組成物の治療有効量を上記対象に投与することを含む方法を提供する。

Ｐタンパク質のシグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）相互作用表面の解明。（ａ）照射を行った場合及び行わなかった場合のＮｉＰ-ＣＴＤの^１５Ｎ，^１Ｈ ＴＲＯＳＹで観察されるアミドプロトン共鳴の強度比の、残基番号及び二次構造に対するプロット。黒色の線（丸）で示された強度比はＮｉＰ-ＣＴＤのアポ型（ＳＴＡＴ１なし）についてで、薄い灰色の線（四角）及び濃い灰色の線（菱形）は、それぞれ、ＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤ及びＧＢ１－ＳＴＡＴ１の存在下である。完全長ＧＢ１－ＳＴＡＴ１の存在下において、Ｈ２０３、Ｉ２０５、Ａ２０６、Ｅ２０７及びＤ２３５の強度は＜０．５に低下し（実線）、一方、Ｉ２０１、Ｑ２０４、Ｆ２０９、Ｄ２３６、Ｉ２３７、Ｌ２７６及びＬ２７７の強度の低下は０．６～０．５である（点線）。相互作用に寄与する残基は、ＮｉＰ-ＣＴＤのヘリックス１、ヘリックス２及びヘリックス５に対応する３つの領域：領域Ａ（Ｇｌｕ２００～Ｓｅｒ２１０）、領域Ｂ（Ｌｅｕ２３４～Ｌｙｓ２３９）及び領域Ｃ（Ｇｌｎ２７５～Ｖａｌ２７８）内にある。ＷホールのＷ２６５及びＭ２８７も示されている。（ｂ）完全長ＧＢ１－ＳＴＡＴ１との転移交差飽和において著しく減弱された（強度比＜０．６）残基の表面表示が、ＣＶＳ株由来のＰタンパク質のＣＴＤの結晶構造（ｐｄｂ：１ｖｙｉ）上へマッピングされている。強度＜０．５に損失した残基のＮＨを二重の円で示し、強度が０．６～０．５のものを点線の円で示す。全ての大幅に影響された残基は、タンパク質の弯曲した面上に存在するようである（左パネル）。対照的に、完全な円で示されたＷ２６５及びＭ２８７は、ＮｉＰ-ＣＴＤの平面上に存在する（右パネル）。 リッサウイルスＰタンパク質の複数配列アラインメント。ＲＡＢＶ（Ｐ：Ｑ９ＩＰＪ８）、ＡＢＬＶ（Ｐ：Ｑ８ＪＴＨ２）、ＥＢＬＶ１（Ｐ：Ａ４ＵＨＰ９）、ＥＢＬＶ２（Ｐ：Ａ４ＵＨＱ４）、ＤＵＶＶ（Ｐ：Ｏ５６７７４）、ＩＲＫＶ（Ｐ：Ｑ５ＶＫＰ５）、ＡＲＡＶ（Ｐ：Ｑ６Ｘ１Ｄ７）、ＫＨＵＶ（Ｐ：Ｑ６Ｘ１Ｄ３）、ＭＯＫＶ（Ｐ：Ｐ０Ｃ５６９）、ＬＢＶ（Ｐ：Ｏ５６７７３）及びＷＢＣＶ（Ｐ：Ｑ５ＶＫＰ１）のCLUSTAL W 2.1配列アラインメントを示す。「^＊」は単一で且つ完全に保存された残基の位置を示し、「：」はＰＡＭ２５０マトリックス上で０．５より高いスコアを有する強く類似した性質の残基間の保存を示し、「．」はＰＡＭ２５０マトリックス上で０．５以下のスコアを有する弱く類似した性質の残基間の保存を示す。 Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換はＮタンパク質との結合を無効にしない。（Ａ）及び（Ｂ）：^１５Ｎ－標識Ｎペプチド（残基３６３～４１４；Ｓ３８９Ｅ）の野生型、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ及びＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ ＮｉＰ-ＣＴＤでの滴定。（Ａ）は、Ｎペプチド：野生型（黒色）、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ（薄い灰色）及びＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ（濃い灰色）のＮｉＰ-ＣＴＤの、１：０．５における化学シフト差を示す。（Ｂ）野生型の８つの等価物（上部）及びＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ ＮｉＰ-ＣＴＤの８つの等価物（中央）又はＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ ＮｉＰ-ＣＴＤの４つの等価物（下部）での^１５Ｎ－標識Ｎペプチドの滴定（後者の滴定はＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖの溶解性のせいで制限された）後の、Ｇｌｙ３８５（四角）及びＡｓｐ３８８（丸）の平均^１Ｈ及び^１５Ｎ化学シフトの変化にフィッティングされた単一部位飽和結合曲線の例。これらの実験から導かれたＫＤ：８８±４μＭ（ＷＴ）；１２２±１１μＭ（Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ）及び２４９±２９μＭ（Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ）。（Ｃ）トランスフェクションされたＨＥＫ-２９３Ｔ細胞における、ＧＦＰ融合ＷＴ、ＦＤ、若しくはＷＭ Ｎｉ-Ｐの機能、又は空ｐＵＣベクターについてのルシフェラーゼレポーターミニゲノムアッセイ（平均正規化ルシフェラーゼ活性±ＳＤ、ｎ＝３）。（Ｄ）トランスフェクションされたＨＥＫ-２９３-Ｔ細胞を用い、示されたＧＦＰ融合Ｐタンパク質又はｐＵＣをＲＩＧ-Ｉフラグとともに又は無しで発現させ、トランスフェクションされた総ＤＮＡで正規化した、ＩＦＮ誘導ルシフェラーゼレポーターアッセイ（相対的ルシフェラーゼ活性±ＳＤ、ｎ＝３；^＊＊、ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。 Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換：Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ及びＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ ＮｉＰ-ＣＴＤのＮＭＲは、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ ＮｉＰ-ＣＴＤについての極小の構造変化を示す。（ａ）ＷＴ（丸）、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ（四角）及びＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ（三角） ＮｉＰ-ＣＴＤの^１３Ｃαβ化学シフトで評価した二次構造の比較。測定された^１３Ｃα／^１３Ｃβ化学シフトのランダムコイルからのずれを各バリアントについて測定した。正及び負のずれは、それぞれ、α-ヘリックス及びβ-ストランドの存在を示している。ＣＶＳ由来のＰタンパク質のＣＴＤの構造（ｐｄｂ：１ｖｙｉ）に基づいたＮｉＰ-ＣＴＤの予想される二次構造の概略図が示されている。（ｂ）野生型とＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖの間、及び（ｃ）野生型とＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａの間の平均化学シフト差（^１Ｈ，^１５Ｎ）の測定。差＞０．１ｐｐｍが、濃い灰色（Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ）及び薄い灰色（Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ）として色づけされ、ＣＶＳ由来のＰタンパク質のＣＴＤの構造上へマッピングされている。変異部位を矢印で示す。Ｗ２６５Ｇ部位の化学シフト差は２．４ｐｐｍで、プロット（ｂ）には示していない。 Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換がＳＴＡＴ１アンタゴニスト機能を無効にする。（Ａ及びＢ）：ＩＦＮシグナル伝達のＰタンパク質媒介性アンタゴニズムを阻害する能力についてのＰタンパク質の変異の効果を試験するアッセイからの最初のデータであり、高阻害性としてＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ（Ａ）及びＡ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋ（Ｂ）を同定している。ＩＦＮシグナル伝達を、デュアルルシフェラーゼアッセイを用いて測定した：ＨＥＫ-２９３-Ｔ細胞をｐＩＳＲＥ－Ｌｕｃ及びｐＲＬ－ＴＫプラスミドと共にトランスフェクションし、示されたＮｉ-Ｐタンパク質（ＷＴ 野生型；単一及び二重変異体）又は対照（ＣＶＳ-Ｄ３０（又はΔ３０）、ＣＶＳ-ｗｔ）を発現させた。ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性の測定前に、ＩＦＮシグナル伝達経路を活性化するために、細胞をＩＦＮαの存在下又は非存在下で処理した（１６時間）；ヒストグラムは、ＣＶＳＤ３０＋ＩＦＮ（陽性対照）で得られたルシフェラーゼ活性と比べて計算された正規化ルシフェラーゼ活性を示す。 （Ｃ）：ＩＦＮの存在下（＋）又は非存在下（－）で処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現した、示されたＰタンパク質のアンタゴニスト機能を評価するためのＩＦＮ依存性ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いた複数のスクリーニングの結果。データは複数のスクリーニングからのもので、正規化ルシフェラーゼ活性は、各アッセイについて内部陽性対照（ＩＦＮα処理されたＰ-ΔＣ３０発現細胞）に占める割合として示している。個々のアッセイからのデータは、三連の平均値である；複数のアッセイを行った。ｎ値（括弧内）は、平均±ＳＤを計算するために用いられたアッセイの数を示す。 ＳＴＡＴ１の発現及び精製。ｐＧＥＸ６ｐ３及びｐＧＥＶ２ベクターから発現したＳＴＡＴ１の収量の比較。ＳＥＣトレースは、ＧＳＴ融合体として発現し、親和性精製後切断された完全長ＳＴＡＴ１（点線）；並びにＧＢ１融合体として発現し、親和性精製及びＨｉｓ６タグの切断後の完全長ＳＴＡＴ１（実線）を示す。 ＣＤ分光法によるＧＢ１－ＳＴＡＴ１構築物の二次構造の解析。（Ａ）融合ＧＢ１－ＳＴＡＴ１のドメイン構造：Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）、コイルドコイルドメイン（ＣＣＤ）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、リンカー（ＬＫ）、ＳＨ２ドメイン（ＳＨ２）及びトランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）。（Ｂ）完全長ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤに融合したＧＢ１のＣＤスペクトル。データは、０．１～０．２ｍｇ／ｍＬの精製されたタンパク質を用い、ｐＨ６．８、２５℃で収集した。（Ｃ）DichroWebを用いて決定した二次構造の割合。括弧内は、ＳＴＡＴ１（ｐｄｂ：１ｖｙｌ）及びＧＢ１（ｐｄｂ：２ｑｍｔ）の結晶構造のドメインに基づいた二次構造の計算値である。ＳＴＡＴ１の結晶構造は最後のＣ末端５７残基を欠いており、したがって、その値は残基１～６８３を反映している。 ＳＴＡＴ１及びそのＰタンパク質（ＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤ）との相互作用の沈降速度分析超遠心（ＳＶ－ＡＵＣ）分析。２８０ｎｍでモニターした（ａ）ＧＢ１－ＳＴＡＴ１及び（ｂ）ＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤについて計算された連続的な沈降係数分布。約６．５Ｓの主要種（ＧＢ１－ＳＴＡＴ１二量体）並びに約３．７（単量体）及び約９．５Ｓ（多量体）の少数種に関するＧＢ－ＳＴＡＴ１沈降；約２．９ＳのＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤ沈降（単量体型）。異なる濃度の（ｃ）ＧＢ１－ＳＴＡＴ１及び（ｄ）ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤとの１０μＭ ＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤのＦＤＳ－ＡＵＣ。ＧＢ１－ＳＴＡＴ１は、約２．９ＳのＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤとは異なる、約７．２ＳのＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤとの複合体を形成する（ｃの挿入図）；ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤは、約４ＳのＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤとの複合体を形成する。ＡＵＣ実験は、５０，０００ｒｐｍ、２０℃で行われた。 ＧＢ１－ＳＴＡＴ１の沈降速度。上部パネル：３０μＭ、５０μＭ及び８０μＭ、それぞれにおけるＵＶ吸光度でモニターしたラジアルスキャン（黒丸）で、ｃ（ｓ）沈降モデルへの最良フィットがオーバーレイされている（実線）。中央パネル：フィットに対する残差。下部パネル：ラジアルスキャンのｃ（ｓ）沈降モデルへの最良フィットにより計算されたサイズ分布プロット。 ＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤの沈降速度。上部パネル：１０及び２０μＭにおけるＵＶ吸光度でモニターしたラジアルスキャン（黒丸）で、ｃ（ｓ）沈降モデルへの最良フィットがオーバーレイされている（実線）。中央パネル：フィットに対する残差。下部パネル：ラジアルスキャンのｃ（ｓ）沈降モデルへの最良フィットにより計算されたサイズ分布プロット。 ＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤとの複合体におけるＧＢ１－ＳＴＡＴ１の沈降速度。上部パネル：１０μＭ ＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤ及びＧＢ１－ＳＴＡＴ１の濃度を変化させる（５～２０μＭ）ことに関する、蛍光でモニターしたラジアルスキャン（黒丸）で、ｃ（ｓ）沈降モデルへの最良フィットがオーバーレイされている（実線）。中央パネル：フィットに対する残差。下部パネル：ラジアルスキャンのｃ（ｓ）沈降モデルへの最良フィットにより計算されたサイズ分布プロット。 ＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤとの複合体におけるＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤの沈降速度。上部パネル：５μＭ ＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤ及びＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤの濃度を変化させる（５～４０μＭ）ことに関する、蛍光でモニターしたラジアルスキャン（黒丸）で、ｃ（ｓ）沈降モデルへの最良フィットがオーバーレイされている（実線）。中央パネル：フィットに対する残差。下部パネル：ラジアルスキャンのｃ（ｓ）沈降モデルへの最良フィットにより計算されたサイズ分布プロット。 Ｐタンパク質のシグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）相互作用表面の解明。（ａ）照射無し（－５０ｐｐｍ）及び（ｂ）照射有り（０．９ｐｐｍ）における、完全長ＧＢ１－ＳＴＡＴ１の存在下での均一標識^２Ｈ－^１５Ｎ ＮｉＰ-ＣＴＤからの２Ｄ ^１５Ｎ，^１Ｈ ＴＲＯＳＹ交差ピークの強度。（ｃ）照射無し（－５０ｐｐｍ）及び（ｄ）照射有り（０．９ｐｐｍ）における、ＧＢ１－ＳＴＡＴ１の非存在下でのＮｉＰ-ＣＴＤの共鳴についての強度。濃い灰色ボックス及び薄い灰色ボックスにより示されたピークは、ＧＢ１－ＳＴＡＴ１の存在下で、それぞれ、＞０．５に低下している強度及び０．６～０．５の範囲内である強度である。（ａ）及び（ｂ）における挿入図は、減弱していないＴｒｐ２６５のインドールＮＨを示す。 Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換はＰタンパク質のＳＴＡＴ１との相互作用に干渉する。（ａ）野生型、（ｂ）Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ及び（ｃ）Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ変異型の^１５Ｎ－標識ＮｉＰ-ＣＴＤタンパク質（３０μＭ）を、等モル濃度の精製されたＧＢ１－ＳＴＡＴ１で滴定した；強度差をヒストグラムで示す（左のパネル）。３０μＭのＧＢ１－ＳＴＡＴ１有り（灰色の複数の曲線）及び無し（黒色の単一曲線）との、さまざまなＮｉＰ-ＣＴＤタンパク質についての２Ｄ ^１Ｈ－^１５Ｎ ＨＳＱＣ実験の部分を右のパネルに示す。スペクトルは同じレベルでプロットされ、ｐＨ６．８、２５℃において収集した。 Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面又はＰタンパク質のＷホールにおけるアミノ酸置換を有するＰタンパク質の構造解析。野生型及びＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ ＮｉＰ-ＣＴＤは二状態アンフォールディングを示すが、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖは示さない。（ａ）ｐＨ６．８、２５℃で０．１～０．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質について得たＷＴ、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ及びＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ ＮｉＰ-ＣＴＤの円二色性（ＣＤ）スペクトル。ＷＴ及びＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａのスペクトルは類似しているが、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖの最小値は著しく小さい。二次構造の解析は、ＷＴ ５９％ヘリックス、２０％ストランド；Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ ４９％ヘリックス、２６％ストランド、及びＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ ４４％ヘリックス、２９％ストランドを示す。（ｂ）ＷＴ、（ｃ）Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ、（ｄ）Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ ＮｉＰ-ＣＴＤの熱安定性を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８中に溶解した０．１～０．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質を用いた２２２ｎｍにおけるＣＤで評価した。 ＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換を有するＰタンパク質の解明：Ａ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋ ＮｉＰ-ＣＴＤのＮＭＲ。（ａ）野生型とＡ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋの間の平均化学シフト差（^１Ｈ，^１５Ｎ）の測定。差＞０．１ｐｐｍがＣＶＳ由来のＰタンパク質のＣＴＤの構造にマッピングされている。 ＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換を有するＰタンパク質の熱安定性。Ａ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋ ＮｉＰ-ＣＴＤの熱安定性を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８中に溶解した０．１～０．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質を用いた２２２ｎｍにおけるＣＤで、（ＷＴの５７℃におけるＴ_ｍと比較して）評価した。 ＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換を有するＰタンパク質は、活性化ＳＴＡＴ１との結合及びＳＴＡＴ１－ＤＮＡ結合の阻止について欠損している。（Ａ）示されたＧＦＰ融合ＷＴ若しくは変異体Ｎｉ-Ｐタンパク質（ＦＤ、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ；ＷＭ、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ）又はＣＶＳ-ＰΔ３０を発現するＣＯＳ-７細胞を、ＧＦＰ－Ｔｒａｐを用いるｃｏ-ＩＰにおける溶解の前に、示された時間、ＩＦＮαで処理した。可溶化液及びｃｏ-ＩＰ試料を、示された抗体を用いるイムノブロッティング（ＩＢ）で分析した。（Ｂ）ゲル電気泳動の前に、ＧＡＳ配列を含有するＤＮＡ断片を、ＷＴ、ＦＤ若しくはＷＭ Ｐ-ＣＴＤ無し（ウェル５）で、若しくはＷＴ、ＦＤ若しくはＷＭ Ｐ-ＣＴＤ有り（ウェル３～４）でインキュベートし、又は、リン酸化（ｐＹ）ＳＴＡＴ１とプレインキュベーションした後、示されたＰ-ＣＴＤ無し（ウェル６～８）若しくは示されたＰ-ＣＴＤ無し有り（ウェル９～２０）でインキュベートした。タンパク質の量をゲルの上に示す；レーン１は2-log ＤＮＡラダー；ウェル内のＤＮＡ断片の停止をボックスで囲むことにより強調。

発明の詳細な説明

本発明者らは、リッサウイルスＰタンパク質のシグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）相互作用表面を解明した。

本発明者らは、短縮型及び完全長ＳＴＡＴ１を用いた転移交差飽和ＮＭＲ実験を用いて、Ｐタンパク質（たとえば、「ＮｉＰ-ＣＴＤ」、ここで、ＣＴＤがＰタンパク質のＣ末端ドメインであり、Ｎｉがニシガハラ（Nishigahara）株を指す）がＳＴＡＴ１の複数のドメインと接触することを示した。リッサウイルスＰタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面は、ＮｉＰ-ＣＴＤの弯曲した面にほぼ局在し（図１ｂ）、推定Ｎタンパク質結合部位とは重なってないものの、その近くにある。重要なことには、この界面は、小さい間隙である、変異誘発により潜在的ＳＴＡＴ１結合部位として以前、関係づけられたＷホールとは対照的である。したがって、ＳＴＡＴ１相互作用表面は、Ｗホールを除外する。本明細書に記載されているように、Ｗホールは、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＬ２４４、Ｐ２４５、Ｃ２６１、Ｗ２６５及びＭ２８７に等価の残基、又は配列番号９で示されるアミノ酸配列の少なくともＣ２６２、Ｆ２６６及びＩ２８８に等価の残基に広く対応する。配列番号１で示されるアミノ酸配列の少なくともＴｒｐ２６５及びＭｅｔ２８７はＷホール内にある。

Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）系は、ウイルス感染に対する宿主細胞の最も早い免疫応答を含む。感染の検出後、Ｉ型ＩＦＮ受容体と結合して、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）ファミリーのメンバー、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ２によるシグナル伝達を活性化するＩＦＮを、宿主細胞が放出する。これは、結果として、ＳＴＡＴの核への移入、並びに抗ウイルス性及び免疫調節性タンパク質をコードする遺伝子を含む数百個のＩＦＮ活性化遺伝子（ＩＳＧ：IFN-stimulated gene）の転写活性化を生じて、抗ウイルス状態を確立し、適応応答の発生を促進する。

休止細胞において、ＳＴＡＴは、一般的に、非リン酸化（Ｕ－ＳＴＡＴ）逆平行二量体であるが、受容体会合後、ヤヌスキナーゼがＳＴＡＴ１／２における保存チロシンをリン酸化し（ｐＹ－ＳＴＡＴ１／２）、核へ移行して、ＩＳＧを活性化する平行二量体の形成を生じる。Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の主要なメディエーターはｐＹ－ＳＴＡＴ１／２であるが、ｐＹ－ＳＴＡＴ１ホモ二量体も、重複する及び異なるＩＳＧサブセットを活性化するのに寄与する。核において、ｐＹ－ＳＴＡＴ１／２ヘテロ二量体は、ＩＦＮ制御因子９（ＩＲＦ９）と共に、ＩＦＮ活性化遺伝子因子３（ＩＳＧＦ３）を形成し、それは、遺伝子プロモーター内のＩＦＮ活性化応答エレメント（ＩＳＲＥ）と結合して、ＩＳＧ発現を刺激する。非リン酸化ＳＴＡＴ（Ｕ－ＳＴＡＴ）はまた、機能性複合体を形成し、かつ免疫、細胞増殖及びがんを含む過程に関連した遺伝子の転写を媒介することが知られている。

ウイルスは、主にウイルスＩＦＮアンタゴニストタンパク質により媒介される、ＩＦＮ応答に打ち勝つための多数のストラテジーを進化させてきた。ＩＦＮ及び他のサイトカインに対する応答へのＳＴＡＴの中心的役割を考えると、多くのＩＦＮアンタゴニストが、ＳＴＡＴのプロテアソーム分解、脱リン酸化、又はリン酸化若しくは核輸送の阻害を含む機構により、ＳＴＡＴ、特にＳＴＡＴ１に干渉することは驚くべきことではない。感染の制御におけるＩＦＮ応答の重要性により、ＩＦＮアンタゴニズムの機構が病原性に重要な役割を果たすことが広く想定されてきた。しかし、ＩＦＮアンタゴニズムの特定の機構に欠陥がある組換えウイルスの病原性を調べる研究は限られている。

Ｐタンパク質は、ＲＡＢＶを含み且つおよそ１００％致死率（およそ６０，０００人のヒト死亡／年）である狂犬病を引き起こす高病原性ウイルスの属を含むリッサウイルスの主要なＩＦＮアンタゴニストである。多くの他のＩＦＮアンタゴニストと共通して、Ｐタンパク質は、ＩＦＮ応答の複数の段階をターゲットし、これには誘導及びシグナル伝達が含まれる。後者は、ＳＴＡＴ１との直接的相互作用を含み、それは、Ｐタンパク質アイソフォームの核外輸送及び細胞骨格会合により、核外へのＳＴＡＴ１の誤った局在化を引き起こす。Ｐタンパク質に変異を有する組換え狂犬病ウイルスを用い、これらのＳＴＡＴ１アンタゴニズムの機構が、病原性と相互に関連づけられている。Ｐタンパク質はまた、ゲノムＲＮＡに会合したヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質（Ｎ-ＲＮＡ）との相互作用による、複製における必須補因子であり、ウイルスポリメラーゼ（Ｌタンパク質）機能が、モノネガウイルス目のＰ遺伝子産物にわたって保存されている。したがって、Ｐタンパク質は複雑な多機能タンパク質である。

したがって、一つの態様において、本発明は、リン酸化タンパク質（Ｐタンパク質）のＳＴＡＴ１相互作用表面に１つ以上のアミノ酸置換を含む、単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

本明細書では、用語「Ｐタンパク質」、「リン酸化タンパク質」又は「Ｐタンパク質ポリペプチド」は、Ｐ-遺伝子によりコードされるＰタンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。その用語は、Ｐタンパク質の領域又は断片を含み得る。その用語は、ＲＮＡウイルスのリッサウイルス属の任意のメンバー由来の任意のリン酸化タンパク質を含む。

代表的なＰタンパク質の配列を図２に示す。

狂犬病ウイルス（ニシガハラ（Nishigahara）ＲＣＥＨ株）（ＲＡＢＶ）のＰタンパク質のアミノ配列（UNIPROT ACCESSION NUMBER:Q9IPJ8）（配列番号１）は以下のとおり：
MSKIFVNPSAIRAGLADLEMAEETVDLINRNIEDNQAHLQGEPIEVDSLPEDMSRLHLDDGKLPDLGRMSKAGEGRHQEDFQMDEGEDPSLLFQSYLDNVGVQIVRQMRSGERFLKIWSQTVEEIISYVTVNFPNPSGRSSEDKSTQTTSQEPKKETTSTPSQRKSQSLKSRTMAQTASGPPSLEWSATNEEDDLSVEAEIAHQIAESFSKKYKFPSRSSGIFLYNFEQLKMNLDDIVKEAKNVPGVTRLAHDGSKLPLRCVLGWVALANSKKFQLLVEANKLNKIMQDDLNRYASC

オーストラリアコウモリリッサウイルス（単離Human/AUS/1998）（ＡＢＬＶ）のＰタンパク質のアミノ配列（UNIPROT ACCESSION NUMBER:Q8JTH2）（配列番号２）は以下のとおり：
MSKIFVNPSAIRAGMADLEMAEETVDLINRNIEDNQAHLQGEPIEVDSLPEDIKKLDISEGRSKSLVDNPQDVECRMSEDFQMDEVEDPNIQFQSYLDNIGIQIVRKMRTGERFFKIWSQTVEEIISYVGVNFPSQSGKTTENKSTQTTPKKVKTEPSSTPAKRSDQLSKTEMAAKTASGPPALEWSTTNDEDDVSVEAEIAHQIAESFSKKYKFPSRSSGIFLYNFEQLKMNLDDIVKEAKSVPGVTSLARDGLRLPLRCILGWVGSSHSKKFQLLVGSEKLNKIMQDDLNRYMSC

ヨーロッパコウモリリッサウイルス１（Bat/Germany/RV9/1968株）（ＥＢＬＶ１）のＰタンパク質のアミノ配列（UNIPROT ACCESSION NUMBER:A4UHP9）（配列番号３）は以下のとおり：
MSKIFVNPSALRSGLADLEMAEETVDLVNKNMEDSQAHLQGIPIDVETLPEDIKRLRIADYKQGQQEEDASRQEEGEDEDFYMTESENSYVPLQSYLDAVGMQIVRKMKTGDGFFKIWAQAVEDIVSYVATNFPAPVNKLQADKSTRTTLEKVKQAASSSAPSKREGPSSNMNLDSQESSGPPGLDWAASNDEDDGSIEAEIAHQIAESFSKKYKFPSRSSGIFLWNFEQLKMNLDDIVREVKGIPGVTRMARDGMKLPLRCMLGSVASNHSKRFQILVNSAKLGKLMQDDLNRYLAY

ヨーロッパコウモリリッサウイルス２（Human/Scotland/RV1333/2002株）（ＥＢＬＶ２）のＰタンパク質のアミノ配列（UNIPROT ACCESSION NUMBER:A4UHQ4）（配列番号４）は以下のとおり：
MSKIFVNPSAIRAGLADLEMAEETVDLVNKNIEDNQAHLQGEPIEVDALPEDMSKLQISERRPAQFTDNTGGKEEGSDEDFYMAESEDPYIPLQSYLEGVGIQLVRQMKTGERFFKIWSQAVEEIISYVTVHFPMPLGKSTEDKSTQTPEEKFKPSPQQAVTKKESQSSKIKTISQESSGPPALEWSTTNDEENASVEAEIAHQIAESFSKKYKFPSRSSGIFLFNFEQLKMNLDDIVKEAKKIPGVVRLAQDGFRLPLRCILGGVGSVNSKKFQLLVNSDKLGKIMQDDLNRYLAY

ドゥーベンハーゲウイルス（ＤＵＶＶ）のＰタンパク質のアミノ配列（UNIPROT ACCESSION NUMBER:O56774）（配列番号５）は以下のとおり：
MSKIFINPSDIRSGLADLEMAEETVELVNRNMEDSQAHLQGVPIDVETLPEDIQRLHITDPQASLRQDMVDEQKHQEDEDFYLTGRENPLSPFQTHLDAIGLRIVRKMKTGEGFFKIWSQAVEDIVSYVALNFSIPVNKLFEDKSTQTVTEKSQQASASSAPNRHEKSSQNARVNSKDASGPAALDWTASNEADDESVEAEIAHQIAESFSKKYKFPSRSSGIFLWNFEQLKMNLDEIVREVKEIPGVIKMAKDGMKLPLRCMLGGVASTHSRRFQILVNPEKLGKVMQEDLDKYLTY

イルクーツクウイルス（ＩＲＫＶ）のＰタンパク質のアミノ配列（UNIPROT ACCESSION NUMBER:Q5VKP）（配列番号６）は以下のとおり：
MSKIFVNPSAIRAGLADLEMAEETIDLINRTIEDNQAHLQGVPIEVEALPEDMKKLQISDHQQGQPSGGATGQDGSEEEDFYMTESENPYIPFQSYLDAVGIQLVRKMKTGEGFLKIWSQAAEEIVSYVAINFPLPADKESAEKSTQTVGEPLKSNSASNTPNKRSKPSTSTDLKAQEASGPHGIDWAASNDEDDASVEAEIAHQIAESFSKKYKFPSRSSGIFLWNFEQLKMNLDDIVGGAKEIPGVIRMAKEGNKLPLRCILGGVALTHSKRFQVLVNSEKLGRIMQEDLNKYLAN

アラバンウイルス（ＡＲＡＶ）のＰタンパク質のアミノ配列（UNIPROT ACCESSION NUMBER:Q6X1D7）（配列番号７）は以下のとおり：
MSKIFVNPSAIRAGLADLEMAEETVDLVNKNVEESQAHLQAEPIEVDALPEDMKRLQISEPKPCQLPDGTCMKEEGGDEDFYMAESGDPYIPLQSYLDTMGIQIVRKMKTGERFFKIWSQSVEEIISYVAVNFPVPPGKSLADKSTQTSVEKSKPASQPTQPKKEDQLSKVNIDSQESSGPPALDWAATNDDDDASVEAEIAHQIAESFSKKYKFPSRSSGIFLYNFEQLKMNLDDIVREAKGIPGVTRRAGDGVRLPLRCILGWVASTHSRRFQLLVNSDKLNKVMQDDINRYLAY

クージャンウイルス（ＫＨＵＶ）のＰタンパク質のアミノ配列（UNIPROT ACCESSION NUMBER:Q6X1D3）（配列番号８）は以下のとおり：
MSKIFVNPSAIRAGLADLEMAEETVDLINRNVEDNQAHLQGEPIEVEALPEDMRRLHISEQKHSQLSDSACGKEEGSDDDFYMADSEDPYVPMQSYLDNVGIQIVKKMKTGERFFKIWSQAVEEIISYVTVNFPLPSGKSTDDKSTQTVSERSRQNPQPSSVKKEDQLSKTKVVSQEASGPPALEWSATNDEDDASVEAEIAHQIAESFSKKYKFPSRSSGIFLYNFEQLKTNLDDIVREAKRIPGVMRLAQDGLRLPLRCILGWVASTHSKRFQILVDSDKLSKIMQDDINRYLAY

モコラウイルス（ＭＯＫＶ）のＰタンパク質のアミノ配列（UNIPROT ACCESSION NUMBER:P0C569）（配列番号９）は以下のとおり：
MSKDLVHPSLIRAGIVELEMAEETTDLINRTIESNQAHLQGEPLYVDSLPEDMSRLRIEDKSRRTKTEEEERDEGSSEEDNYLSEGQDPLIPFQNFLDEIGARAVKRLKTGEGFFRVWSALSDDIKGYVSTNIMTSGERDTKSIQIQTEPTASVSSGNESRHDSESMHDPNDKKDHTPDHDVVPDIESSTDKGEIRDIEGEVAHQVAESFSKKYKFPSRSSGIFLWNFEQLKMNLDDIVKAAMNVPGVERIAEKGGKLPLRCILGFVALDSSKRFRLLADNDKVARLIQEDINSYMARLEEAE

ラゴスコウモリウイルス（ＬＢＶ）のＰタンパク質のアミノ配列（UNIPROT ACCESSION NUMBER:O56773）（配列番号１０）は以下のとおり：
MSKGLIHPSAIRSGLVDLEMAEETVDLVHKNLADSQAHLQGEPLNVDSLPEDMRKMRLTNAPSEREIIEEDEEEYSSEDEYYLSQGQDPMVPFQNFLDELGTQIVRRMKSGDGFFKIWSAASEDIKGYVLSTFMKPETQATVSKPTQTDSLSVPRPSQGYTSVPRDKPSNSESQGGGVKPKKVQKSEWTRDTDEISDIEGEVAHQVAESFSKKYKFPSRSSGIFLWNFEQLKMNLDDIVKTSMNVPGVDKIAEKGGKLPLRCILGFVSLDSSKRFRLLADTDKVARLMQDDIHNYMTRIEEIDHN

コーカサスコウモリウイルス（ＷＢＣＶ）のＰタンパク質のアミノ配列（UNIPROT ACCESSION NUMBER:Q5VKP1）（配列番号１１）は以下のとおり：
MSKSLIHPSDLRAGLADIEMADETVDLVYKNLSEGQAHLQGEPFDIKDLPEGVSKLQISDNVRSDTSPNEYSDEDDEEGEDEYEEVYDPVSAFQDFLDETGSYLISKLKKGEKIKKTWSEVSRVIYSYVMSNFPPRPPKPTTKDIAVQADLKKPNEIQKISEHKSKSEPSPREPVVEMHKHATLENPEDDEGALESEIAHQVAESYSKKYKFPSKSSGIFLWNFEQLKMNLDDIVQVARGVPGISQIVERGGKLPLRCMLGYVGLETSKRFRSLVNQDKLCKLMQEDLNAYSVSSNN

一つの態様において、置換は、参照Ｐタンパク質配列、たとえば上記で例示された配列と比べてである。本発明者らは、参照又は「野生型」Ｐタンパク質配列を、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を変化させることにより少なくとも１個のアミノ酸残基を置換することによって変化させることが、明細書に記載された表現型を生じ得ることを実証した。

本発明者らはまた、驚くべきことに、ＳＴＡＴ１相互作用表面が、全ての野生型リッサウイルスにわたって厳密には保存されていないアミノ酸残基を含むこと（たとえば、図２及び示していないデータ）、そして、驚くべきことに、そのような非保存アミノ酸を置換することが結果として、明細書に記載された表現型を生じ得ることを実証した。たとえば、本明細書に記載されているように（たとえば図２に示されているように）、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０９、２３６、２３９に対応するアミノ酸残基が、参照Ｐタンパク質配列、たとえば野生型分離株（たとえば、明細書に記載された参照配列を含む）によって異なり得る。

重要なことには、本発明者らはまた、いくつかの残基になされた置換が、たとえば、全体的なタンパク質構造及び機能を損なう、ＮｉＰ-ＣＴＤの構造への全体的な不安定化効果により、ＳＴＡＴ１相互作用表面の立体構造に間接的に影響し得るが、他の置換は、タンパク質構造及び機能へ全体的な不安定化効果（たとえば、溶解度により測定されるような）を生じることなく、ＳＴＡＴ１相互作用表面のＳＴＡＴ１相互作用機能に直接的に影響し得ることを実証した。したがって、本発明は、異なる分離株のＰタンパク質において、それらのＰタンパク質及びそれらのＰタンパク質をコードするリッサウイルスのタンパク質構造及び機能へ全体的な不安定化効果を生じることなく、本明細書に記載されたものと等価の残基に対して行うことができるアミノ酸置換を提供する。

たとえば、本発明者らは、アミノ酸置換が、Ｐタンパク質の領域及び残基において、１つ以上の置換を含まない参照Ｐタンパク質の溶解度と比べてＰタンパク質の溶解度を著しく変化させることなく、実行できるることを本明細書で実証した。

したがって、一つの態様において、本発明は、Ｐタンパク質の溶解度が、１つ以上の置換を含まない参照Ｐタンパク質と比べて大幅に変化していない、本明細書に記載のＰタンパク質又はＰタンパク質をコードするリッサウイルスを提供する。

別の態様において、本発明は、Ｐタンパク質の溶解度が、１つ以上の置換を含まない参照Ｐタンパク質と比べて２５％以下、２０％以下、１５％以下又は１０％以下、低下している、本明細書に記載のＰタンパク質又はＰタンパク質をコードするリッサウイルスを提供する。

本明細書では、用語「リッサウイルス」は、ラブドウイルス科におけるＲＮＡウイルスの属を指す。この属のメンバーは、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス（ＬＢＶ）、モコラウイルス（ＭＯＫＶ）、ドゥーベンハーゲウイルス（ＤＵＶＶ）、ヨーロッパコウモリリッサウイルス１（ＥＢＬＶ－１）、ヨーロッパコウモリリッサウイルス２（ＥＢＬＶ－２）、オーストラリアコウモリリッサウイルス（ＡＢＬＶ）、アラバンウイルス（ＡＲＡＶ）、クージャンウイルス（ＫＨＵＶ）、イルクーツクウイルス（ＩＲＫＶ）、西コーカサスコウモリウイルス（ＷＣＢＶ）及びシモニコウモリウイルスを含む。好ましくは、ウイルスは、狂犬病ウイルス、又はヒトにおいて狂犬病を引き起こすと報告されているウイルス、たとえば、モコラウイルス、ドゥーベンハーゲウイルス及びオーストラリアコウモリリッサウイルスである。

本明細書では、用語「アミノ酸置換」は、ポリペプチド配列（たとえば、参照Ｐタンパク質配列、たとえば野生型Ｐタンパク質配列）における１個のアミノ酸残基を、ポリペプチド配列における異なるアミノ酸残基へと置換することを含む。アミノ酸置換は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を変化させること、たとえば、リッサウイルスＰタンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列を変化させることにより、なされ得る。たとえば、参照Ｐタンパク質配列、たとえば上記で例示された配列が、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を変化させることによる１個以上のアミノ酸残基を置換することにより、変化する。一つの態様において、参照タンパク質配列は野生型タンパク質配列である。本明細書では、野生型タンパク質配列は、タンパク質及び／若しくはリッサウイルスの１つ以上の表現型を変化させるように能動的に置換されていない天然に存在する分離株（たとえば、動物又は対象から単離された株）で生じる配列、又は実験室適応株で生じる配列（たとえば、アミノ酸置換を生じるように変異誘発アプローチに供されていない、適応／固定株におけるタンパク質の配列）である。そのような変化は、所定のコドンの１個以上のヌクレオチドを変化させることによりなされてもよい。

本発明者らは、単一置換を有するＰタンパク質と比べて、図５に示されているように、ＳＴＡＴ１相互作用表面における１つより多い置換が、驚くべきことに、単一置換と比べて、相乗効果を生じ得ることも実証した。重要なことには、本発明者らはまた、ＳＴＡＴ１相互作用（たとえば、結合）表面における１つより多い置換が、全体的な不安定化効果を生じることなく（たとえば、溶解度又は別の方法、たとえば、本明細書に記載された生物物理学的特性により測定される場合）、それらのＰタンパク質及びそれらのＰタンパク質をコードするリッサウイルスのタンパク質構造及び機能へなされ得ることを実証した。したがって、一つの態様において、本明細書に記載されたタンパク質は、１つ以上のアミノ酸置換を含む。

一般的にタンパク質性質に最も大きい変化を生じることが予想されるアミノ酸置換は、非保存性であり、例として、（ａ）親水性残基、たとえば、セリル若しくはスレオニルが、疎水性残基、たとえば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル若しくはアラニルの代わりに（若しくは、により）置換され；（ｂ）システイン若しくはプロリンが、任意の他の残基の代わりに（若しくは、により）置換され；（ｃ）正電荷側鎖を有する残基、たとえば、リシル、アルギニル若しくはヒスチジルが、負電荷残基、たとえば、グルタミル若しくはアスパルチルの代わりに（若しくは、により）置換され；又は（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基、たとえば、フェニルアラニンが、側鎖を有しない残基、たとえば、グリシンの代わりに（若しくは、により）置換され；又は（ｅ）任意の残基が、小さい側鎖を有する残基、たとえば、アラニルの代わりに（若しくは、により）置換されている変化である。

本発明の関連において、少なくとも１つのアミノ酸置換がＰタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面へ導入されることになっている場合、アミノ酸変異が、天然に存在するコドンの少なくとも２個のヌクレオチドを変化させることにより導入されることが好ましい。理論に拘束されるものではないが、これは、タンパク質がワクチンに利用される場合、野生型への自発的復帰変異からのより大きい安全域を達成するのに役立つ。アミノ酸置換はまた、単一のヌクレオチド変化によって導入することもできる。

本明細書では、用語「ＳＴＡＴ１相互作用表面」は、たとえば、非共有結合性相互作用、たとえば、アミノ酸における反対電荷の引力のようなイオン性相互作用、水素結合又は疎水性相互作用により、ＳＴＡＴ１と相互作用／結合するＰタンパク質の領域を指す。ＳＴＡＴ１相互作用表面は、たとえば、非共有結合性相互作用、たとえば、アミノ酸における反対電荷の引力のようなイオン性相互作用、水素結合又は疎水性相互作用による相互作用／結合に関与するアミノ酸残基、及びＰタンパク質のＳＴＡＴ１結合面にあるそのようなアミノ酸に隣接したアミノ酸を含む。ＳＴＡＴ１相互作用表面を決定するための方法は、本明細書、たとえば実施例に記載されている。重要なことには、本明細書（たとえば、例３）で実証されているように、ＳＴＡＴ１相互作用表面はＷホールを除外する。本明細書に記載されているように、Ｗホールは、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＬ２４４、Ｐ２４５、Ｃ２６１、Ｗ２６５及びＭ２８７と等価、又は配列番号９で示されるアミノ酸配列の少なくともＣ２６２、Ｆ２６６及びＩ２８８と等価の残基に広く対応する。配列番号１で示されるアミノ酸配列の少なくともＴｒｐ２６５及びＭｅｔ２８７はＷホール内にある。本発明者らは、ＳＴＡＴ１結合にはＷホールが直接的には関与しないことを実証した。

重要なことには、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面の多くの残基は、リッサウイルス属の間で高度に保存されており、本出願に示されているようにＳＴＡＴ１相互作用表面の残基が野生型分離株のＰタンパク質によって異なり得るが、ＩＦＮ媒介性ＳＴＡＴ１活性化をアンタゴナイズするための共有機構を示唆している。ＩＦＮのよる活性化有り又は無しの哺乳動物細胞におけるＮＭＲ及びアッセイにより解明されたＰタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面は、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面が、非リン酸化ＳＴＡＴ１（Ｕ－ＳＴＡＴ１）とリン酸化（ｐＹ）－ＳＴＡＴ１に共通であることを示している。特に、図５Ａは、それぞれ、Ｐタンパク質の解明されたＳＴＡＴ１相互作用表面の２つの主要な領域内での２個の残基で構成された、Ｎｉ-Ｐ Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ及びＡ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋが、構造化ＣＴＤを欠損する対照タンパク質ＰΔ３０と同程度に強力であることを示し、これらの残基の重要な役割を確認している。図５Ｃも、同様に、これらの残基の重要な役割を示している。

上記で論じられているように、一つの側面において、本発明は、リン酸化タンパク質（Ｐタンパク質）のシグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）相互作用表面に１つ以上のアミノ酸置換を含む、単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

本発明者らは、Ｐタンパク質のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）内にあるＳＴＡＴ１相互作用表面を解明した。

したがって、本発明は、ＳＴＡＴ１相互作用表面がＰタンパク質のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）内にある、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

したがって、一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換がＰタンパク質のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）内にある、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

本明細書では、用語「Ｃ末端ドメイン」は、リッサウイルスＰタンパク質のＣ末端領域を含み、配列番号１で示されるアミノ酸配列の残基１８６～２９７に対応する領域を含む。

したがって、一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の残基１８６～２９７に対応する領域内にある、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

Ｐタンパク質の球状Ｃ末端ドメイン（Ｐ-ＣＴＤ）は、ＳＴＡＴ１及びＮ-ＲＮＡと結合するのに必要とされる部位を含有し、そのため複製及び免疫逃避におけるＰタンパク質の機能の中心である。

本発明者らは、Ｃ末端ドメインが、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面の一部を形成するいくつかの領域を含有することを実証した。

本明細書では、用語「領域Ａ」は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の残基２００～２１０に対応する領域である。本明細書では、用語「領域Ｂ」は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の残基２３４～２３９に対応する領域である。本明細書では、用語「領域Ｃ」は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の残基２７５～２７８に対応する領域である。

したがって、一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が、たとえば図１に示されているように、Ｐタンパク質のＣ末端ドメインのαヘリックス１、αヘリックス２及び／又はαヘリックス５内にあるか、隣接する、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

本発明者らは、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面における１つ以上のアミノ酸置換が、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１との相互作用に干渉し、及び／又はＰタンパク質のＩＦＮアンタゴニスト活性を調節することを実証した。

この研究において、本発明者らは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を用いて、Ｐ-ＣＴＤ上のＳＴＡＴ１結合界面を解明しており、Ｗホール変異のＰタンパク質－ＳＴＡＴ１相互作用への明らかな効果にも関わらず、ＷホールがＳＴＡＴ１と接触しないことを示し、結合表面を含むＰ-ＣＴＤ内のいくつかの異なる新規の部位が同定された。完全長組換えＳＴＡＴ１を用いて、界面の完全な範囲を解明することにより、本発明者らはさらに、Ｐ-ＣＴＤ結合部位がＳＴＡＴ１のＤＢＤ及びＣＣＤ上にあるが、ＳＴＡＴ１のＮ末端又はＣ末端ドメインのいずれかとの接触を含むようにも思われることを示し、ウイルスＳＴＡＴ１複合体が複雑な界面を含み得ることを示した。本発明者らはまた、より広い構造的効果によって作用するようであるＷホールの変異とは対照的に、変異が主として局在化された効果を生じる、Ｐ-ＣＴＤの接触残基のＳＴＡＴ１ターゲティングにおける特異的な機能を直接的に確認した。

したがって、一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１との相互作用に干渉する、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。上記で論じられているように、本明細書では、用語「Ｐタンパク質」は、Ｐ－遺伝子によりコードされるＰタンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。

本明細書では、用語「相互作用」、「結合すること」又は「特異的に相互作用すること」、「特異的に結合すること」は、結合ペア（たとえば、ＳＴＡＴ１とＰタンパク質）の間の相互作用を指す。一般的に、用語「相互作用」、「結合すること」又は「特異的に相互作用すること」、「特異的に結合すること」は、本明細書で記載のものを含む任意の標準アッセイにより測定される場合の相互作用のレベルが指定カットオフ値より高い、１つの化合物の別の化合物との特異的相互作用を指す。

重要なことには、本発明者らは、１つ以上のアミノ酸置換が、Ｐタンパク質のＩＦＮアンタゴニスト活性を調節できることを実証した。したがって、一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換がＰタンパク質のＩＦＮアンタゴニスト活性を調節する、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１との相互作用は、Ｐタンパク質－ＳＴＡＴ複合体の核排除を引き起こし、そのため、Ｐタンパク質はＩＦＮ依存性遺伝子の活性化を阻害することができる。したがって、一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換がＩＦＮ依存性遺伝子の活性化をアンタゴナイズするＰタンパク質の能力を阻害する、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

本明細書では、用語「アンタゴニスト活性」は、ＳＴＡＴ１と相互作用し、それにより、ＳＴＡＴ１の生物学的活性、たとえば、宿主細胞におけるインターフェロンＩ型（ＩＦＮα及びＩＦＮβ）及びＩＩ型（ＩＦＮγ）のシグナル伝達を阻止する所定のＰタンパク質の能力を指す。本明細書では、用語「調節する」は、ＳＴＡＴ１の生物学的活性（又はたとえば、ＩＦＮアンタゴニスト活性）といった特定の応答又は活性の量、質又は効果の変化を指す。応答又は活性の増加及び減少の両者が含まれる。

一つの態様において、ＩＦＮ依存性遺伝子の活性化をアンタゴナイズする置換型Ｐタンパク質又は置換型Ｐタンパク質をコードするリッサウイルスの能力は、野生型Ｐタンパク質又は野生型Ｐタンパク質をコードするリッサウイルスと比べて、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６２、６５、７０、７５、８０、８２、８５、９０、９５又は９６％、低下している。

一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２００～２７８に対応する領域内にある、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

本明細書では、用語「に対応する」及び「等価の保存位置」は、第２のＰタンパク質の等価位置におけるアミノ酸残基に対応する第１のＰタンパク質のアミノ酸残基を指す。たとえば、図２に示されているように、リッサウイルスＰタンパク質の配列は、リッサウイルスＰタンパク質の保存された及び高度に保存された残基を決定するためにアライメントすることができ、保存された及び高度に保存された残基の位置は、位置（たとえば、Ｐタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端からの残基番号）が異なり得る。１つの型のリッサウイルスにおける特定の残基の変異又は置換への本明細書を通しての言及は、別のリッサウイルスにおける対応するアミノ酸残基の変異又は置換を、その残基がＰタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端からの異なる残基番号にあるかどうかに関わらず、包含すると理解される。

以下の用語は、２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチドの間での配列関係を記載するために用いられる：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性」、及び（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」。

（ａ）本明細書では、「参照配列」は、配列比較の基礎として用いられる定義済みの配列である。参照配列は、特定化された配列のサブセット又は全体；たとえば、完全長ｃＤＮＡ又は遺伝子配列のセグメント又は完全なｃＤＮＡ又は遺伝子配列、ポリペプチド配列のセグメント又は完全長ポリペプチド配列であってもよい。

（ｂ）本明細書では、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の連続し且つ特定化されたセグメントに言及し、比較ウィンドウにおける上記ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が、その２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドの最適なアラインメントのために参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般的に、ヌクレオチドの場合、比較ウィンドウは、長さが少なくとも２０個の連続したヌクレオチド、任意で、３０、４０、５０、１００又はそれ以上である。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列におけるギャップの包含による参照配列との高い類似性を避けるために、通常、ギャップペナルティが導入され、一致の数から引き算されることを当業者は理解している。

比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野においてよく知られている。したがって、任意の２つの配列間のパーセント配列同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。そのような数学的アルゴリズムの非限定的例は、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズム；Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482のローカルアラインメントアルゴリズム；Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453のグローバルアラインメントアルゴリズム；Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448のローカルアラインメント方法のための検索；Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877において改変されているような、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズムである。

これらの数学的アルゴリズムのコンピュータ実装は、配列同一性を決定するための配列の比較に利用することができる。そのような実装には、以下が挙げられるが、それらに限定されるものではない：PC/GeneプログラムにおけるCLUSTAL W(2.1)（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能で、本明細書では図２で使用）；GCG Wis. Genetics Software Package、Version 10におけるALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及びTFAST（Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Calif., USAから入手可能）。これらのプログラムを用いるアラインメントは、デフォルトパラメータを用いて実施することができる。CLUSTALプログラムはHiggins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988)；Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153；Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90：Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65；及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331により十分、記載されている。ALIGNプログラムは、上記Myers and Miller(1988)のアルゴリズムに基づいている。アミノ酸配列を比較する時、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを、ALIGNプログラムと共に用いることができる。Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403のBLASTプログラムは、上記Karlin and Altschul(1990)のアルゴリズムに基づいている。本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同のヌクレオチド配列を得るために、BLASTヌクレオチド検索が、BLASTNプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施することができる。本発明のタンパク質又はポリペプチドと相同のアミノ酸配列を得るために、BLASTタンパク質検索が、BLASTXプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施することができる。比較を目的としてギャップドアラインメントを得るために、ギャップドBLAST（BLAST 2.0における）が、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に記載されているように利用することができる。あるいは、PSI-BLAST（BLAST 2.0における）が、分子間の遠位関係を検出する反復検索を実施するために用いることができる。Altschulら(1997)上記参照。BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLASTを利用する時、それぞれのプログラム（たとえば、ヌクレオチド配列についてのBLASTN、タンパク質についてのBLASTX）のデフォルトパラメータを用いることができる。www.ncbi.hlm.nih.govにおけるワールワイドウェブ上のNational Center for Biotechnology Informationウェブサイト参照。アラインメントはまた、目視検査により手作業で実施されてもよい。

他に提示のない限り、本明細書で示された配列同一性／類似性の値は、デフォルトペアワイズアラインメントパラメータ及びパーセンテージにおけるスコアリング法でのCLUSTAL Wマルチプル配列アラインメントアルゴリズムを用いるCLUSTAL W（version 1.83）を用いて得ることができ；又はその任意の等価のプログラム、たとえば、CLUSTAL（たとえば、CLUSTAL W(2.1)）、GAP Version 10、MatGAT Vector NTIなどを用いて得ることができる値を指す。本明細書では、用語「等価のプログラム」は、質問における任意の２つ以上の配列について、CLUSTAL Wにより作成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の一致及び同一のパーセント配列同一性を有するアライメントを作成する任意の配列比較プログラムを指す。

（ｃ）本明細書では、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の関連における「配列同一性」又は「同一性」は、特定化された比較ウィンドウにわたって最大一致のためにアラインメントされた時、同じである、２つの配列における残基に言及する。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して用いられる場合、同一ではない残基位置が、保存的アミノ酸置換により異なる場合が多いことは認識されており、その場合、アミノ酸残基が、類似した化学的性質（たとえば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基の代わりに置換され、その分子の機能的性質を変化させない。配列が保存的置換の点で異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存性を補正するために上方調整されてもよい。そのような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は当業者によく知られている。通常、これは、完全なというよりむしろ、部分的なミスマッチとして保存的置換をスコアリングし、それにより、パーセンテージ配列同一性を増加させることを含む。したがって、たとえば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換がゼロのスコアを与えられる場合、保存的置換は、ゼロと１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、たとえば、プログラムPC/GENE（Intelligenetics, Mountain View, Calif.）において実行されているように、計算される。

（ｄ）本明細書では、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアライメントされた配列を比較することにより決定された値を意味し、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の一部分は、その２つの配列の最適なアラインメントのために参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較した場合、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両者の配列に存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を出し、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を出すことにより計算される。

一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０３、２０４、２０６、２０７、２０９、２２８、２３４、２３５、２３６、２３９及び／又は２７７に対応するアミノ酸残基にある、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０３、２０４、２０６、２０７、２０９、２２８、２３４、２３５、２３６、２３９及び／又は２７７に対応するアミノ酸残基にあり、上記置換が２０３Ａ、２０６Ｇ、２０７Ａ、２０９Ａ、２０９Ｙ、２２８Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｋ、２３６Ａ、２３９Ａ及び／又は２７７Ａである、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

一つの側面において、本発明は、Ｐタンパク質がシグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）相互作用表面に少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。たとえば、一つの態様において、Ｐタンパク質は、ＳＴＡＴ１相互作用表面に少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。別の態様において、Ｐタンパク質は、ＳＴＡＴ１相互作用表面に少なくとも３つのアミノ酸置換を含む。別の態様において、Ｐタンパク質は、ＳＴＡＴ１相互作用表面に少なくとも４つのアミノ酸置換を含む。

別の側面において、本発明は、Ｐタンパク質が、ＳＴＡＴ１相互作用表面内ではない、少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

たとえば、追加のアミノ酸置換がＰタンパク質の他の部分に含まれてもよく、ただし、そのアミノ酸置換がそのＰタンパク質を含むウイルスの複製する能力を阻止しないことが構想される。

一つの側面において、本発明は、少なくとも２つのアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０６、２０９、２３５及び２３６に対応するアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基にある、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

一つの側面において、本発明は、２つのアミノ酸置換が、Ａ２０６Ｅ、Ｆ２０９Ａ、Ｄ２３５Ａ、Ｄ２３５Ｋ、Ｄ２３６Ａ又は等価の対応する位置からなる群から選択される、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

一つの側面において、本発明は、少なくとも２つのアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０９及び２３５に対応するアミノ酸残基、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０６及び２３５に対応するアミノ酸残基、並びに／又は配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２３５及び２３６に対応するアミノ酸残基にある、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

一つの側面において、本発明は、２つのアミノ酸置換が、Ｆ２０９ＡとＤ２３５Ａ、Ａ２０６ＥとＤ２３５Ｋ、Ｄ２３５ＡとＤ２３６Ａ、又は等価の対応する位置から選択される、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

ＮＭＲ滴定（図３）は、ＮｉＰ-ＣＴＤ Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖが、ＳＴＡＴ１と結合する能力を、より弱いとはいえ、保持することを示している；したがって、本発明者らは、これらの変異が、ＮｉＰ-ＣＴＤの構造への全体的な不安定化効果により界面の立体構造に間接的に影響するという説を提案する。

したがって、一つの側面において、本発明は、Ｐタンパク質がＰタンパク質のＷホールにアミノ酸置換を含まない、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

本明細書では、Ｗホールという用語は、Ｐ-ＣＴＤの疎水性間隙又はポケットを指す。Ｗホールは、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＬ２４４、Ｐ２４５、Ｃ２６１、Ｗ２６５及びＭ２８７と等価の残基、又は配列番号９で示されるアミノ酸配列の少なくともＣ２６２、Ｆ２６６及びＩ２８８と等価の残基に広く対応する。配列番号１で示されるアミノ酸配列の少なくともＴｒｐ２６５及びＭｅｔ２８７はＷホール内にある。

野生型ＮｉＰ-ＣＴＤと比較した、ＮｉＰ-ＣＴＤ Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ、Ａ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋ及びＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７ＶのＮＭＲによる二次構造の評価は極小の差を示したが（図４及び図１６）、ＮｉＰ-ＣＴＤ Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖの追加の生物物理学的特徴は、それが著しく且つ全体的に不安定化されていることを示した。組み合わされた変異Ｗ２６５Ｇ及びＭ２８７Ｖは、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ変異と比較してＮＭＲアッセイにおいてＳＴＡＴ１の結合の不完全な喪失を示し、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ変異が結合部位に直接的には影響せず、代わりに、弱められたが、完全に消失したとは限らない相互作用を生じる、立体構造的効果によりＳＴＡＴ１結合に影響することを示唆している。これと一致して、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ ＮｉＰタンパク質は、野生型タンパク質と比較して哺乳動物細胞においてＳＴＡＴ１シグナル伝達のアンタゴニズムにおいて欠陥があったが、見たところ、Ｆ２０９／Ｄ２３５Ａ又はＡ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋ ＮｉＰタンパク質よりは少ない程度であるようだった。

本明細書に記載されたデータは、新しく同定された相互作用部位内の置換（たとえば、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ及びＡ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋ）がワクチン弱毒化について新しい、最小限に破壊的な変異を提供することができることを示し、それは、「ＳＴＡＴ盲目性（STAT-blind）」ウイルスの安全性を向上させるために単独で、又はＷホール変異若しくはＰタンパク質若しくはウイルスゲノムにおける他の箇所での変異と組み合わせてのいずれかで、用いることができる。

したがって、一つの側面において、本発明は、Ｐタンパク質がＰタンパク質のＷホールに１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６５及び／又は２８７に対応するアミノ酸残基にある、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。一つの側面において、本発明は、アミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２６５Ｇ若しくは２８７Ｖ又は等価の保存位置である、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

一つの態様において、リッサウイルスタンパク質における置換は、参照タンパク質配列、たとえば野生型タンパク質配列と比べてである。

したがって、いくつかの態様において、リッサウイルスタンパク質は、参照タンパク質配列と比べて１つ以上の好ましいアミノ酸置換を天然で含んでもよく、したがって、それらの１つ以上の好ましいアミノ酸置換のうちの置換が必要とされない。たとえば、ＤＵＶＶ Ｐタンパク質は２６５Ｇを含む；そのため、たとえば２６５Ｇ及び２８７Ｖを有するＰタンパク質を発現するウイルスを作製するために、アミノ酸残基２６５において置換が必要とされない。

Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面とＰ-ＣＴＤにおけるＮ-ＲＮＡ結合部位の近さにも関わらず、本発明者らは、後者を大きく損なうことなく前者へ特異的に影響を及ぼす変異が導入され得ることを示した。たとえば、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ変異が、ＳＴＡＴ１相互作用及びアンタゴニズムへ効果を生じたが、Ｎタンパク質との相互作用の親和性にはほとんどあるいは全く効果を生じず、ＳＴＡＴ１結合及びウイルス複製に必要とされる重大な残基／表面は別々であることを実証している。それでもやはり、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面の領域Ａと推定Ｎ－結合部位の近さの実証は、これらのタンパク質との結合がＰタンパク質により緊密に協調されていることを示唆する。

。理論に拘束されるものではないが、本明細書に記載のアミノ酸置換は、ウイルス複製を損なうことなく弱毒化されたウイルスワクチンを産生する能力を可能にし、これらのワクチンの安全性プロファイルは、それらが対象（たとえば、非ヒト動物）集団に配備されるのを可能にする。

本発明者らは、ＳＴＡＴ１アンタゴニスト機能の消失にも関わらず、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ Ｐタンパク質の複製機能がＷＴのそれと等価であったことを実証した。

したがって、一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が複製を大幅に変化させることはない、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

したがって、一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換がポリメラーゼ補因子機能を無効にしない、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

たとえば、好ましい態様において、１つ以上のアミノ酸置換は、ウイルス転写を無効にせず、及び／又はウイルス複製を無効にせず、及び／又はＮタンパク質との結合を無効にしない。別の好ましい態様において、１つ以上のアミノ酸置換は、ウイルス転写を可能にし、及び／又はウイルス複製を可能にし、及び／又はＮタンパク質との結合を可能にする。

したがって、一つの側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換がＮタンパク質相互作用表面内にない、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

別の側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換がＮタンパク質相互作用表面内にある、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。別の側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換がＮタンパク質相互作用表面内にあり、上記アミノ酸置換が、Ｐタンパク質がＮタンパク質と相互作用／結合する能力を阻止しない、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供する。

本明細書では、用語「Ｎタンパク質相互作用表面」は、たとえば非共有結合性相互作用、たとえばアミノ酸における反対電荷の引力のようなイオン性相互作用、水素結合、又は疎水性相互作用により、Ｎタンパク質と相互作用／結合するＰタンパク質の領域を指す。Ｎタンパク質相互作用表面は、たとえば非共有結合性相互作用、たとえばアミノ酸における反対電荷の引力のようなイオン性相互作用、水素結合、又は疎水性相互作用による相互作用／結合に関与するアミノ酸残基を含む。Ｎタンパク質相互作用表面はまた、相互作用／結合に関与するアミノ酸残基と隣接したアミノ酸残基（たとえば、Ｐタンパク質のＮタンパク質結合面内にある残基）を含む。Ｎタンパク質相互作用表面を決定するための方法は、本明細書、たとえば実施例に記載されている。

一つの側面において、本発明は、本明細書に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質を提供し、リッサウイルスは、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス（ＬＢＶ）、モコラウイルス（ＭＯＫＶ）、ドゥーベンハーゲウイルス（ＤＵＶＶ）、ヨーロッパコウモリリッサウイルス１（ＥＢＬＶ－１）、ヨーロッパコウモリリッサウイルス２（ＥＢＬＶ－２）、オーストラリアコウモリリッサウイルス（ＡＢＬＶ）、アラバンウイルス（ＡＲＡＶ）、クージャンウイルス（ＫＨＵＶ）、イルクーツクウイルス（ＩＲＫＶ）、西コーカサスコウモリウイルス（ＷＣＢＶ）及びシモニコウモリウイルスからなる群から選択される。好ましくは、ウイルスは、狂犬病ウイルス、又はヒトにおいて狂犬病を引き起こすと報告されているウイルス、たとえば、モコラウイルス、ドゥーベンハーゲウイルス及びオーストラリアコウモリリッサウイルスである。

重要なことには、本発明者らは、本明細書で解明したＰタンパク質をコードする核酸を作製した。したがって、一つの側面において、本発明は、本明細書に記載のＰタンパク質をコードする単離された核酸又はその相補体／アンチゲノムを提供する。

伝統的なＲＮＡウイルスワクチンは、自然に弱毒化された分離株に由来し、それは、制御することが難しく、予測不可能な結果を与える。逆遺伝学テクノロジーは、ＲＮＡウイルスをＤＮＡとして操作することを可能にし、それは、計画的な設計によって変異させ、欠失させ又は再構築することができる。逆遺伝学は、ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡへの逆転写、及びベクター、たとえばプラスミドへのクローニングを含む。宿主細胞のトランスフェクション後、ベクターは、ＲＮＡへ転写されて、ウイルスタンパク質によってキャプシド形成され、そのウイルスタンパク質もプラスミドによって供給され得る。キャプシド形成されたＲＮＡは、リボヌクレオタンパク質複合体を形成する；リボヌクレオタンパク質複合体は、ウイルスｍＲＮＡの発現若しくはゲノム複製の鋳型を提供することができ、又は回収することができるビリオンへパッケージングされ得る。

狂犬病ウイルスＥＲＡ株に基づいた効率的な逆遺伝学システムは、参照により本明細書に組み入れられている、国際公開第2007/047459号に記載されている。この狂犬病逆遺伝学システムは、ワクチン開発のために確定した様式でウイルスを弱毒化すること、及び汎リッサウイルスワクチンの生成のために異種性タンパク質、たとえば別のリッサウイルス由来のタンパク質の発現のためのウイルスベクターを作製することを含むさまざまな目的に有用である。

ワクチン接種のための都合良い性質を有する組換えウイルスは、たとえば国際公開第2007/047459号に開示された逆遺伝学システムを用いて、設計することができる。

リッサウイルスは、２つの主要な構造コンポーネント、ヌクレオキャプシド又はリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）と、ＲＮＰコアを囲む二重膜の形をとるエンベロープで構成される。全てのリッサウイルスの感染性コンポーネントはＲＮＰコアであり、それは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）及びリン酸化タンパク質（Ｐ）と組み合わされた、ヌクレオプロテイン（Ｎ）によってキャプシド形成されたマイナス鎖ＲＮＡゲノムからなる。ＲＮＰを囲むエンベロープは膜貫通型糖タンパク質（Ｇ）を含有し、マトリックス（Ｍ）タンパク質の層はエンベロープの内面を裏打ちしている。したがって、ウイルスゲノムは、これらの５つのタンパク質：ＲＮＰにおける３つのタンパク質（Ｎ、Ｌ、及びＰ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）及び糖タンパク質（Ｇ）をコードする。

一つの側面において、本発明は、本明細書に記載のリッサウイルスゲノムであって、そのウイルスゲノムが少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含むタンパク質をコードする、リッサウイルスゲノムを提供する。一つの側面において、ウイルスゲノムは、Ｎ－、Ｌ－、Ｐ－、Ｍ－及び／又はＧ－タンパク質において少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含むタンパク質をコードする。

たとえば、Ｇタンパク質は、細胞侵入を媒介し、中和抗体の産生を誘発し、過去の弱毒化するための努力の焦点であった。特に、Ｇタンパク質の位置３３３におけるアルギニン残基は、その変異がウイルスを弱毒化することができるので、狂犬病ウイルスの病原性に寄与することが示されている（参照により本明細書に組み入れられる国際公開第2007/047459号参照）。したがって、ウイルスゲノムが、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含むタンパク質をコードする本発明の側面において、一つの態様において、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、Ｇタンパク質のアミノ酸残基３３３に対応するアミノ酸残基のアミノ酸置換である。

マイナス鎖ＲＮＡゲノム（たとえば、リッサウイルスのゲノム）を有するウイルスの関連において、「アンチゲノム」は、マイナス鎖ゲノムの相補体（プラス鎖）を指す。

本発明の遺伝子をコードするＰタンパク質は、完全長リッサウイルスゲノム内に含有され、その一部として発現してもよい。したがって、本発明の別の側面において、本明細書に記載のリン酸化タンパク質（Ｐタンパク質）をコードする組換えリッサウイルスゲノムが提供される。

別の側面において、本発明は、リッサウイルスゲノムの相補体が本明細書に記載のＰタンパク質をコードする、リッサウイルスゲノムを提供する。

一つの側面において、本発明は、本明細書に記載のリッサウイルスゲノムを含むリッサウイルスを提供する。一つの側面において、本発明は、本明細書に記載のリッサウイルスゲノムを含むリッサウイルスビリオンを提供する。

別の側面において、本発明は、リッサウイルスが弱毒化されている、本明細書に記載のリッサウイルスゲノムを含むリッサウイルスビリオンを提供する。

別の側面において、本発明は、リッサウイルスが複製することができる、本明細書に記載のリッサウイルスゲノムを含むリッサウイルスビリオンを提供する。

リッサウイルスの産生について、当業者に知られているように、細胞株、たとえば、ＢＨＫ２．１、Ｖｅｒｏ、及びＮｉｌ-２を用いることができる。好ましくは、Ｖｅｒｏ細胞又は他のインターフェロン欠損細胞株が用いられ、それらが、インターフェロンを産生せず、そのためＳＴＡＴ盲目性ウイルスの成長を阻害せず、したがって、リッサウイルスの高力価の調製物及び／又はリッサウイルスの大量の調製物の産生を可能にする。

一つの態様において、リッサウイルスは、Ｐタンパク質のシグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）相互作用表面に１つ以上のアミノ酸置換を含むＰタンパク質をコードする。

一つの態様において、リッサウイルスはＰタンパク質をコードし、相互作用表面が上記Ｐタンパク質のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）内にある。

一つの態様において、リッサウイルスはＰタンパク質をコードし、相互作用表面が配列番号１で示されるアミノ酸配列の残基１８６～２９７に対応する領域内にある。

一つの態様において、リッサウイルスはＰタンパク質をコードし、１つ以上のアミノ酸置換が、上記Ｐタンパク質のＣ末端ドメインのαヘリックス１、αヘリックス２及び／又はαヘリックス５内にあるか、隣接する。

一つの態様において、リッサウイルスはＰタンパク質をコードし、１つ以上のアミノ酸置換が上記Ｐタンパク質のＣ末端ドメインのαヘリックス１、αヘリックス２及び／又はαヘリックス５の間にある。

一つの態様において、リッサウイルスはＰタンパク質をコードし、１つ以上のアミノ酸置換が上記Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１との相互作用に干渉する。

一つの態様において、リッサウイルスはＰタンパク質をコードし、上記Ｐタンパク質が上記Ｐタンパク質のＷホールにアミノ酸置換を含まない。代替の態様において、リッサウイルスは、Ｐタンパク質のシグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）相互作用表面に１つ以上のアミノ酸置換を含むＰタンパク質をコードし、上記Ｐタンパク質が上記Ｐタンパク質のＷホールに１つ以上のアミノ酸置換を含む。

一つの態様において、リッサウイルスはＰタンパク質をコードし、１つ以上のアミノ酸置換がポリメラーゼ補因子機能を無効にしない。

一つの態様において、リッサウイルスが本明細書に記載のＰタンパク質をコードし、１つ以上のアミノ酸置換がＮタンパク質相互作用表面内にはない。代替の態様において、リッサウイルスが本明細書に記載のＰタンパク質をコードし、１つ以上のアミノ酸置換がＮタンパク質相互作用表面内にある。別の側面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換がＮタンパク質相互作用表面内にあり、且つ前記アミノ酸置換がＰタンパク質のＮタンパク質と相互作用／結合する能力を阻止しない、本明細書に記載のリッサウイルスを提供する。

一つの態様において、リッサウイルスはＰタンパク質をコードし、１つ以上のアミノ酸置換が上記Ｐタンパク質のＩＦＮアンタゴニスト活性を調節する。

一つの態様において、リッサウイルスは、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス（ＬＢＶ）、モコラウイルス（ＭＯＫＶ）、ドゥーベンハーゲウイルス（ＤＵＶＶ）、ヨーロッパコウモリリッサウイルス１（ＥＢＬＶ－１）、ヨーロッパコウモリリッサウイルス２（ＥＢＬＶ－２）、オーストラリアコウモリリッサウイルス（ＡＢＬＶ）、アラバンウイルス（ＡＲＡＶ）、クージャンウイルス（ＫＨＵＶ）、イルクーツクウイルス（ＩＲＫＶ）、西コーカサスコウモリウイルス（ＷＣＢＶ）及びシモニコウモリウイルスからなる群から選択される。好ましくは、ウイルスは、狂犬病ウイルス、又はヒトにおいて狂犬病を引き起こすと報告されているウイルス、たとえば、モコラウイルス、ドゥーベンハーゲウイルス及びオーストラリアコウモリリッサウイルスである。

本明細書では、生ウイルス、たとえばリッサウイルスビリオンの関連における用語「弱毒化した」は、ビリオン／ウイルスの細胞若しくは対象に感染する能力及び／又は疾患を生じるその能力が低下していることを指す。通常、弱毒化ウイルスは、免疫適格対象への投与後に免疫応答を誘発する少なくともいくらかの能力を保持する。場合によっては、弱毒化ウイルスは、感染の少しの徴候も症状も引き起こすことなく、防御免疫応答を誘発する能力がある。

本明細書に記載のリッサウイルス又はリッサウイルスビリオンは、免疫刺激組成物に用いることができる。

本明細書では、用語「免疫刺激すること」及び「免疫刺激」は、組成物、たとえば本明細書に記載のリッサウイルス又はリッサウイルスビリオンの対象への投与での免疫応答の発生を指す。免疫応答は予防的でも治療的でもよい。

一つの側面において、免疫刺激組成物は、それを対象への投与に適したものにするために、薬学的に許容される担体と共に製剤化される。

本明細書に記載されたアミノ酸置換は、多様なリッサウイルス（たとえば、異なるリッサウイルス遺伝子型）に用いることができる。

本明細書で示された免疫原性組成物は、ヒト及び非ヒト動物での使用が企図される。。理論に拘束されるものではないが、非ヒト動物を治療するための安全且つ効果的なワクチンの供給は、ヒト健康に影響を及ぼし、たとえば、イヌ集団からの狂犬病の根絶はヒト疾患を撲滅することが予想される。

重要なことには、本明細書で説明するように、投与は、飼い慣らされたペットだけでなく、リッサウイルスに感染し得る野生生物及び野良動物を保護及び治療するために餌を介して行われてもよい。好ましい側面において、投与は、イヌを保護及び治療するために、餌を介して行われる。

一つの側面において、本発明の免疫刺激組成物は、弱毒化生ウイルスワクチンである。弱毒化生ウイルスワクチンは、ウイルスにin vitro及びin vivoで複製できることを求める。したがって、重要なことには、ワクチンにおいて本発明のリッサウイルス粒子を利用することができるという観点から、リッサウイルスはin vivo及びin vitroで複製することができ、ワクチン産生を促進する。一つの側面において、リッサウイルス又はリッサウイルスビリオンがＩＦＮ依存性シグナル伝達の阻害を減少させた場合、免疫刺激は促進される。

一つの側面において、本発明は、本明細書に記載のリッサウイルス又はリッサウイルスビリオン、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。

本発明で企図される薬学的に許容される担体又は希釈剤には、用いられる投与量及び濃度においてレシピエントに無毒である任意の希釈剤、担体、賦形剤、及び安定剤が挙げられ、バッファー、たとえばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（たとえば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、たとえばメチル若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；及びm-クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、たとえば血漿アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、たとえばポリビニルピロリドン；アミノ酸、たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の糖質；キレート剤、たとえばＥＤＴＡ；糖、たとえばスクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール；塩形成対イオン、たとえばナトリウム；金属複合体（たとえば、ＺＮタンパク質複合体）；並びに／又は非イオン性界面活性剤、たとえば、TWEEN（登録商標）、PLURONICS（登録商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。

本明細書に記載の弱毒化生ウイルスワクチンは、アジュバントと共に製剤化する必要なしに、投与することができる。。理論に拘束されるものではないが、本明細書に記載の弱毒化生ウイルスワクチンは、感染し、細胞内で複製し、好ましくは、自然免疫応答及び適応免疫応答を高レベルに誘導することができる（たとえば、複製能ワクチンは液性応答だけでなく、細胞応答を強く活性化することができる）ため、好ましい形において、アジュバントと共に製剤化する必要性が低下し（たとえば、本弱毒化ウイルスワクチンはアジュバン潜在能力を有する）、複数回投与する必要性が低下し、及び／又は狂犬病免疫グロブリンと共に投与する（たとえば、ヒトの治療的ワクチン接種において）必要性が低下している。より強く且つより迅速な応答を発生する潜在能力のため、生ワクチンはまた、治療的ワクチン接種が、感染したヒト又は動物において成功し得る好機を広げる可能性がある。

あるいは、本発明の弱毒化生ウイルスワクチンは、任意に、アジュバントと共に製剤化される。アジュバントは、他の作用物質の効果を改変する薬理学的又は免疫学的作用物質である。ワクチン製剤におけるそれらの包含に関して、アジュバントは、ワクチンの抗原性コンポーネントに対するレシピエントの免疫応答を増強する。

本発明のワクチンにおける使用に適したアジュバントには、アルミニウム塩、水酸化物、パラフィンオイル、第三リン酸カルシウム（calcium phosphate hydroxide）、ベリリウム、細菌産物、モノホスホリルリピドＡ、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント、並びにそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

一つの側面において、本発明は、対象においてリッサウイルス感染を治療及び／又は防止するための薬剤の製造における本明細書に記載のリッサウイルスビリオンの使用を提供する。

一つの側面において、本発明は、治療有効量の、本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、対象においてリッサウイルス感染を治療及び／又は防止する方法を提供する。

本明細書では、薬学的組成物の「治療有効量」は、投与された時、対象において抗リッサウイルス免疫応答を生じる薬学的組成物の量を指す。一つの側面において、免疫応答は、もし対象がリッサウイルスに曝されたならば、対象をリッサウイルスによる感染から保護することができる。

本明細書では、用語「治療すること」及び「治療」は、リッサウイルス感染の徴候又は症状を軽快させることを含み、本明細書に記載されたリッサウイルスを含む組成物の投与後の任意の観察可能な有益な効果を指す。有益な効果は、たとえば、感染しやすい対象におけるリッサウイルス感染の臨床症状の発生の遅延、リッサウイルス感染の一部若しくは全部の臨床症状の重症度の低下、リッサウイルス感染のより遅い進行、対象の健康全般若しくは幸福の改善により、又はリッサウイルス感染に特異的である当技術分野においてよく知られた他のパラメータにより、証明することができる。

本明細書では、用語「保護すること」及び「保護」は、リッサウイルスの感染又はリッサウイルス感染関連死亡からの部分的保護を含み、曝露後処理を含む、ブースターワクチン接種又は他の適切な処理を必要とする保護も含む。

リッサウイルスにすでに曝され又は感染した対象の場合、「治療有効量」は、リッサウイルスを対象から排除するために、及び将来的な感染から保護するために対象の免疫応答を増強する量を指す。対象における抗リッサウイルス免疫応答の発生は、当技術分野において知られた技術を用いて；たとえば、抗体を測定することにより、又は後のチャレンジを乗り切る対象の能力を決定することにより、又はチャレンジ後のウイルス負荷を測定することにより、確認することができる。

本発明の、リッサウイルスビリオン又はリッサウイルスビリオンを含む薬学的組成物は、リッサウイルスからの感染のリスクがある対象に投与されてもよく、それにより、好ましくは少なくとも狂犬病ウイルス及び／又は同じ血清型のウイルス（たとえば、オーストラリアコウモリリッサウイルス）についての、防止的（又は予防的）ワクチンとして機能する可能性がある。ワクチン接種の結果として、対象は、リッサウイルスからの感染に対する免疫を生じる。したがって、本発明は、本発明によるリッサウイルスビリオン又はリッサウイルスビリオンを含む薬学的組成物の有効量を投与することを含む、対象をリッサウイルスの感染から保護する方法を提供する。本明細書に記載のリッサウイルスビリオン又はリッサウイルスビリオンを含む薬学的組成物の投与は、それ以降、もしヒト又は非ヒト対象がリッサウイルスに曝されたならば、ヒト又は非ヒト対象をリッサウイルスによる感染から保護する、抗リッサウイルス免疫応答を誘導する。

あるいは、本発明の、リッサウイルスビリオン又はリッサウイルスビリオンを含む薬学的組成物は、リッサウイルスに曝された、又は曝されたと疑われる対象に投与されてもよく、それにより、治療的ワクチンとして機能する可能性がある。ワクチンは、対象自身の免疫応答能力を増強すると同時にまた、対象をリッサウイルスによる再感染から保護する。したがって、本発明のこの側面において、本明細書に記載のリッサウイルスビリオン又はリッサウイルスビリオンを含む薬学的組成物の有効量を対象に投与することを含む、リッサウイルスに曝された又は曝されたと疑われる対象を治療する方法が提供される。

本明細書に記載の方法は、任意に、弱毒化生ウイルスワクチンの投与前に、疑われるリッサウイルス感染について対象をスクリーニングすることを含む。

本明細書に記載のリッサウイルスビリオン又はリッサウイルスビリオンを含む薬学的組成物が投与されてもよい対象は、ヒト、並びに任意の他の温血動物、特に家畜、たとえばイヌ及びネコ（野良イヌ及び野良ネコを含む）、並びに非限定的に、コウモリ、スカンク、キツネ、カワウソ、フェレット、ウマ、他の農業用動物、サル、オオカミ、野生のイヌ、コヨーテ、ディンゴ、アライグマ、及びオポッサムを含む野生生物である。

薬学的組成物は、便利には、単位剤形で提供され、通常の薬学的技術を用いて調製されてもよい。そのような技術は、活性成分及び薬学的担体又は賦形剤を会合させる工程を含む。

非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、バッファー、静菌剤及び製剤をレシピエントの血液又は組織の細胞と等張にする溶質を含有してもよい水性及び非水性無菌注射液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含んでもよい水性及び非水性無菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量又は複数回用量の容器、たとえば密封されたアンプル及びバイアルで提供されてもよく、使用直前に無菌液体担体、たとえば注射用水の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）又は等価の安定状態で保存されてもよい。即席の注射用溶液及び懸濁液は、当業者により一般的に用いられる無菌の粉末、顆粒、及び錠剤から調製されてもよい。

ある特定の態様において、単位用量製剤は、投与される成分の用量若しくは単位、又はその適切な分割量を含有するものである。上記で特に言及された成分に加えて、本明細書の製剤は、当業者により一般的に用いられる他の作用物質を含んでもよいことが理解されるべきである。

免疫原性組成物として用いられるものを含む、本明細書の組成物は、異なる経路、たとえば、頬側及び舌下を含む経口、直腸、非経口、エアロゾル、経鼻、筋肉内、皮下、皮内、経皮（たとえば、パッチに基づいた送達）、並びに局所を通して投与されてもよい。それらは異なる形で投与されてもよく、その形には、溶液、乳濁液及び懸濁液、ミクロスフェア、粒子、微小粒子、ナノ粒子並びにリポソームが挙げられるが、それらに限定されるものではない。いくつかの態様において、免疫原性組成物は経口で投与される。

一つの好ましい側面において、投与様式は経口投与である。

投与は、飼い慣らされたペットだけでなく、リッサウイルスにより感染し得る野生生物及び野良動物を保護及び治療するための餌を介して行われてもよい。

好ましい側面において、投与は、イヌを保護及び治療するための餌を介して行われる。

好ましくは、リッサウイルスは狂犬病ウイルスである。

投与の体積は、投与経路によって変わる。当業者は、異なる投与経路について適切な体積を決定することができる。

投与は、単一又は複数回用量によって達成することができる。本開示の関連における対象へ投与される用量は、時間をかけて有益な治療的応答を誘導する、たとえば、リッサウイルス感染又は狂犬病の発生を防止するのに十分であるべきである。必要とされる用量は、たとえば、対象の年齢、体重、及び一般的な健康状態によって変化する場合がある。

好ましくは、投与は、単一用量を用いて実施される。単一用量ワクチンの利点には、免疫刺激に加えて、費用対効果及び送達の容易さが挙げられる。

各投薬における薬学的組成物の量は、著しい副作用なしに免疫刺激応答を誘導する量として選択される。そのような量は、どの特定の組成が用いられるか、及びそれがどのようにして投与されるかによって変化する。初回量は約１μｇ～約１ｍｇであってもよく、いくつかの態様では、約１０μｇ～約８００μｇであり、さらに他の態様では、約２５μｇ～約５００μｇである。免疫原性組成物の初回投与後、対象は、適切に間隔を空けて、１回又は数回のブースター投与を受けてもよい。ブースター投与は、約１μｇ～約１ｍｇであってもよく、他の態様では、約１０μｇ～約７５０μｇ、さらに他の態様では、約５０μｇ～約５００μｇであってもよい。１～５年間、たとえば３年間の間隔での定期的なブースターが、防御免疫の望ましいレベルを維持するために望ましい場合がある。好ましい態様において、対象は、本明細書に記載の薬学的組成物の単一用量を受け、好ましい態様において、対象は、経口で送達される、本明細書に記載の薬学的組成物の単一用量を受ける。

この明細書の説明及び特許請求の範囲を通して、単語「含む（comprise）」及びその単語のバリエーション、たとえば「含むこと（comprising）」及び「含む（comprises）」は、他の添加物、コンポーネント、整数、又は工程を排除することを意図されない。

実施例１ 材料及び方法
発現ベクターの構築及び変異誘発
ＧＢ１融合ＳＴＡＴ１発現ベクターを、完全長ＳＴＡＴ１（４～７５０）及びＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤ（１３６～４９０）に対応する遺伝子をｐＧＥＶ２ベクターへ挿入することにより作製し、これは、ＧＢ１と発現タンパク質の間にトロンビン切断可能リンカー及びＣ末端Ｈｉｓ６タグを有するＧＢ１融合タンパク質を生成する。完全長ＳＴＡＴ１をまたｐＧＥＸ６Ｐ３へクローニングして、ＧＳＴ－ＳＴＡＴ１を産生した。

Ｃ末端システイン（Ｃｙｓ２９７）がセリンへ変異したＮｉＰ-ＣＴＤ遺伝子（残基１８６～２９７）を、ｐＥＴ２８ａベクターのＮｄｅＩ－ＥｃｏＲＩ部位へ、ＴＥＶ切断部位を含むＨｉｓ６タグ付きタンパク質としてクローニングした。ＧＦＰ融合ＮｉＰ-ＣＴＤ（ＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤ）は同様にクローニングされ、ＮｉＰ-ＣＴＤ配列と共に超安定な単量体ＧＦＰを含んだ。Ｎタンパク質のＮペプチド（ａａ３６３～４１４）をコードするＤＮＡを、ｐＧＥＸ－６Ｐ－３ベクターへＢａｍＨＩ－ＸｈｏＩ制限部位を用いて挿入し、Ｎ末端ＧＳＴタグ、続いてPreScissionプロテアーゼ切断部位を有した。

PrimeSTAR Max ＤＮＡポリメラーゼ（Takara）を用いて、製造会社の使用説明書に従い、変異をＮペプチド又はＮｉＰ-ＣＴＤ構築物へ導入した。変異誘発プライマーを設計し、化学的コンピテントＴｏｐ１０大腸菌細胞に形質転換する前に、ＰＣＲ混合物を、ＤｐｎＩを用いて３７℃で１．５時間、消化した。その変異を有するプラスミドを、単一コロニーから単離し、シーケンシングにより確認した。

Ｐタンパク質の哺乳動物細胞発現について、完全長Ｎｉ-及びＣＶＳ-Ｐタンパク質、ＣＶＳ ＰΔ３０並びに変異体Ｎｉ-Ｐを、他の実験室が説明するように、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１へクローニングした。

タンパク質発現及び精製
ＧＢ１－ＳＴＡＴ１構築物を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において、２ＹＴ自己誘導培地中、１６℃、２２５～２３０ｒｐｍで振盪させながら、発現させた。ＧＢ１－ＳＴＡＴ１バリアントを、以下のとおりに精製した。５００ｍＬ培養物からのペレットを５０ｍＬ抽出バッファー（５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）中に再懸濁し、ホモジナイズし、溶解させた（Avestin EmulsiFlex C3細胞粉砕機）。遠心分離（１３，０００ｇ、３０分間、４℃）後、上清を濾過し（０．２２μｍフィルター）、重力流カラムに充填された５ｍＬ Talon（登録商標）金属親和性樹脂（Clontech, TAKARA）へアプライした。４℃での９０分間の結合後、結合していないタンパク質を洗浄（１００ｍＬの抽出バッファー）により捨てた；ＧＢ１融合タンパク質を溶出した（５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４の８０ｍＬ）。ＭＷＣＯ １０ｋＤａ（ＧＢ１－ＳＴＡＴ１の短縮型）又は３０ｋＤａ（完全長ＧＢ１－ＳＴＡＴ１）を含む溶出画分を、Amicon Ultra-15を用いて１．５ｍＬへ濃縮し、５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８と予め平衡に達し、且つ１ｍＬ／分の流速で流すHiLoad（商標）16/60 Superdex（商標）200 prep gradeカラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりさらに精製した。溶出した１ｍＬ画分を収集し、プールし、再濃縮した。

遠心分離後、濾過された上清を、５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．４中で予め平衡に達した５ｍＬのグルタチオンSepharose 4 Fast Flow樹脂（GE Healthcare）に結合させることを除いて、ＧＳＴタグ付きＳＴＡＴ１を上記と同様に精製した。９０分後、結合していないタンパク質を除去し、ＧＳＴ－ＳＴＡＴ１を溶出した（５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ還元型グルタチオン、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．４の８０ｍＬ）；３Ｃプロテアーゼ（１００μｌの精製された９６μＭ ＧＳＴ融合３Ｃプロテアーゼ）を用いて４℃で一晩、切断した；上記のように、１．５ｍＬへ濃縮し、ＳＥＣでさらに精製した。

非標識のＮｉＰ-ＣＴＤ、ＮｉＰ-ＣＴＤの変異体及びＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤの変異体を、ＧＢ１－ＳＴＡＴ１構築物と同様に発現させた；一方、^１５Ｎ標識ＮｉＰ-ＣＴＤ及び変異体を、唯一の窒素源として^１５ＮＨ_４Ｃｌを用いる自己誘導培地中に発現させた。ＮｉＰ-ＣＴＤ変異体を^１３Ｃ及び^１５Ｎ同位元素で標識するために、細胞を、唯一の窒素源及び炭素源として１ｇ／Ｌの^１５ＮＨ_４Ｃｌ（Sigma-Aldrich）及び３ｇ／ＬのD-［^１３Ｃ］グルコース（Sigma-Aldrich）を追加したN-5052中で成長させた。細胞を、０．６～０．７のＯＤ_６００まで３７℃で成長させ、１６℃へ移し、０．４ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、２２５～２３０ｒｐｍで振盪させながら一晩、タンパク質を発現させた。^２Ｈ、^１５Ｎ－標識ＮｉＰ-ＣＴＤを発現させるために、細胞を、^２Ｈ_２Ｏ（Sigma-Aldrich）中１ｇ／Ｌの^１５ＮＨ_４Ｃｌ及び２ｇ／ＬのD-［^２Ｈ］-グルコース（Cambridge Isotope Laboratories）で調製されたN-5052培地において成長させた。５ｍｌの前培養物を、３７℃で６～７時間インキュベートされた単一コロニーから調製した。その後、細胞を、遠心分離し、洗浄し、^２Ｈ_２Ｏ中に調製され、且つ炭素源として^１Ｈ_６-グルコースを含むN-5052培地へ再懸濁して、一晩培養した。重水素化培地に適応した細胞をペレット化し、洗浄し、D-［^２Ｈ］-グルコースを追加したN-5052培地中に希釈した。１６℃に適応させた後、０．７～０．８のＯＤ_６００において０．４ｍＭ ＩＰＴＧを加えることにより誘導した後、一晩、タンパク質発現を実施した。全てのＮｉＰ-ＣＴＤタンパク質を、Talon（登録商標）金属親和性樹脂で精製し、ＴＥＶプロテアーゼでの切断後、ＳＥＣに供した。HiLoad（商標）16/60 Superdex（商標）75 prep gradeカラムをＮｉＰ-ＣＴＤに用いた；一方、HiLoad（商標）16/60 Superdex（商標）200 prep gradeカラムをＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤに用いた。ＮｉＰ-ＣＴＤの精製のさらなる詳細は記載されている。

ＮｉＰ-ＣＴＤの変異体を、野生型についての上記のように精製した。変異の、発現したタンパク質の溶解性への効果を評価するために、各変異体を発現する細菌培養物の類似した体積を溶解し、可溶性上清及び不溶性デブリへ分画し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。溶解度指数を、Image Lab 5.2.1（Biorad）を用いて、測定されたゲル上のバンド強度を用いて計算した。

ＲＡＢＶのＮペプチド（Ｎタンパク質、残基３６３～４１４、Ｓ３８９Ｅ）の^１５Ｎ－標識を、発現がｐＧＥＸ６Ｐ３ベクターを用いて調製されたＧＳＴ融合としてであることを除いて、ＮｉＰ-ＣＴＤと同様に行った。^１５Ｎ－標識Ｎペプチドを精製するために、抽出バッファーが５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５であることを除いて、細胞ペレットを、ＮｉＰ-ＣＴＤ精製について記載されているように処理した。細胞粉砕及び遠心分離後、透明な上清を重力流カラムへ充填された５ｍｌのグルタチオンセファロース高性能樹脂（GE Healthcare）と４℃で結合させた。２時間後、結合していない材料を、１００ｍＬ抽出バッファーで洗浄することにより除去した。カラム上での切断を、３Ｃプロテアーゼ（９６μＭの濃度を有する１００μＬの精製された自家製ＧＳＴ融合３Ｃプロテアーゼ）を用いて４℃で４時間にわたって実施した。切断されたペプチドを、２０ｍＬの抽出バッファーでの洗浄による重力流によってカラムから溶出した。Amicon Ultra-15（MWCO 3kDa）を用いる５ｍＬへの濃縮後、ペプチドを、バッファーＡ ０．１％トリフルオロ酢酸、バッファーＢ ０．１％トリフルオロ酢酸を含む１００％アセトニトリルを用いるAgilent Zorbax 300SB-C18カラムでの逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を用いて、さらに精製した。収集された画分をプールし、凍結乾燥し、さらなる使用のために－２０℃で保存した。得られた最終収量は、３～５ｍｇ／Ｌの細菌培養物であった。

円二色性（ＣＤ）分光光度法
ＣＤ分光光度法を、410 SF円二色性分光計（AVIV Biomedical, Lakewood, NJ）を用いて実施した。測定は、２５℃において、０．１ｃｍパス長を有する石英キュベット及び５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８中の０．１～０．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質を用いた。０．５ｎｍの増分及び１．０秒の平均時間を用いて、１９０～２６０ｎｍの波長範囲がスキャンされた。各タンパク質について、３個のスキャンが記録され、平均され、３個の平均バッファースキャンから引き算された。平均残基楕円率（ＭＲＥ）（度・ｃｍ^２・ｄｍｏｌ^－１）はＭＲＥ＝θ・ＭＲＷ／１０・ｌ・ｃ（式中、θが楕円率（ミリ度）であり、ｌがパス長（ｃｍ）であり、ｃがタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）である）を用いて計算され、ＭＲＷは、ＭＲＷ＝Ｍｒ／（Ｎ－１）（式中、Ｍｒがタンパク質のＭＷ（Ｄａ）であり、Ｎが残基の数である）として計算された平均残基重量である。ＳＴＡＴ１バリアント及びＮｉＰ-ＣＴＤ（野生型及び変異体）の二次構造解析を、DichroWebにおいてプログラムCDSSTRを用いて行った。

ＮｉＰ-ＣＴＤ（野生型及び変異体）の熱アンフォールディングを、試料温度を２０℃から９０℃へ１℃／分で上昇させることにより測定した。２２２ｎｍにおける標準化楕円率値を温度の関数としてプロットし、二状態転移（式１）へフィッティングし、フォールディングとアンフォールディングについての熱容量の変化なしと仮定し、転移前と転移後の変化を補正することにより、熱アンフォールディング転移及び中間点の融解温度（Ｔ_ｍ）を計算した：

式中、Ｙが所定の温度において観察された楕円率であり、Ｙ_Ｎ（Ｙ_Ｄ）及びβ_Ｎ（β_Ｄ）が傾き及び転移前と転移後の傾きの切片である；Ｔが温度（℃）であり、Ｔ_ｍが中間点の融解温度であり、ΔＨ_ＴｍがＴ_ｍにおけるエンタルピーである。

ＮｉＰ-ＣＴＤとＳＴＡＴ１相互作用の分析超遠心
沈降速度分析超遠心（ＳＶ－ＡＵＣ）実験を、An50 Tiローターを備えたBeckman Optima XL-I AUC（Beckman Coulter, IN）において行った。全てのタンパク質試料を、ＳＶ－ＡＵＣバッファー（５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ６．８）に対して透析し、そのバッファーを各実験についての参照として用いた。ＧＢ１－ＳＴＡＴ１タンパク質をさまざまなモル濃度で含有する試料をＥｐｏｎダブルセクター中心部の試料コンパートメントへ、バッファーを参照コンパートメントへロードした。試料を５０，０００ｒｐｍのローター速度、２０℃で遠心分離し、２８０ｎｍの波長で連続的にモニターした。蛍光検出ＳＶ－ＡＵＣ（ＦＤＳ－ＡＵＣ）実験を、蛍光検出システム（AVIV Biomedical、Lakewood, NJ）を備えたBeckman Optima XL-A AUCにおいて行った。ＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤの濃度を１０μＭで一定に維持し、一方、濃縮されたＧＢ１－ＳＴＡＴ１バリアントを、５μＭ～４０μＭの範囲でＳＶ－ＡＵＣバッファー中に希釈した。試料を５０，０００ｒｐｍのローター速度、２０℃で遠心分離し、連続的にモニターした。データを、０Ｓ～１５Ｓの範囲の１００個の沈降係数増加を用いてｐ＝０．９５の正則化パラメータでプログラムSEDFITにおいてフィッティングした。摩擦係数比をフィッティングし、蛍光検出実験について、メニスカス位置もフィッティングした。

ＮＭＲデータ取得
ＮＭＲ実験について、調製されたＮｉＰ-ＣＴＤ及びＳＴＡＴ１試料を、１０％Ｄ_２Ｏ／９０％Ｈ_２Ｏ中の最終試料を作製する前に、同じバッファー（５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８）において透析した。全てのＮＭＲデータを、三重共鳴クライオプローブを備えたBruker Avance IIIHD 700MHz分光計において２５℃で取得した。野生型ＮｉＰ ＣＴＤの^１Ｈ、^１３Ｃ、^１５Ｎ共鳴の完全に近い帰属が他の実験室で報告された（Biological Magnetic Resonance Bank、アクセッションコード27498）。ＮｉＰ-ＣＴＤ Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ及びＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ変異体のバックボーン（ＨＮ、^１５Ｎ、^１３Ｃα、^１３Ｃβ、^１３Ｃ’）共鳴を帰属させるために、均一に^１３Ｃ－^１５Ｎ標識されたタンパク質を用いる３Ｄ実験（ＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ、ＨＮＣＡＣＢ、ＨＮＣＯＣＡＣＢ）についてデータを収集した。２Ｄ ^１５Ｎ，^１Ｈ異核種単一量子コヒーレンス法（^１５Ｎ，^１Ｈ ＨＳＱＣ）スペクトルを、伝統的なアプローチを用いて収集し、一方、全ての３Ｄスペクトルを、１０％非一様サンプリング（ＮＵＳ）及びPoissonギャップサンプラーを用いて記録した。スペクトルを、ｑＭＤＤを用いる圧縮センシングアルゴリズムで再構成し、ＮＭＲＰｉｐｅを用いて処理し、ＮＭＲＦＡＭ－ＳＰＡＲＫＹで分析した。

^１５Ｎ－標識ＮｉＰ-ＣＴＤとＧＢ１－ＳＴＡＴ１の間の相互作用を、１：１の比におけるＮｉＰ-ＣＴＤとＧＢ１－ＳＴＡＴ１のスペクトルを取得することによりモニターした。転移交差飽和実験について、本発明者らは、９０％^２Ｈ_２Ｏ／１０％Ｈ_２Ｏにおいて、５００μＭの均一標識^２Ｈ－^１５Ｎ ＮｉＰ-ＣＴＤを５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８中の５０μＭ ＧＢ１－ＳＴＡＴ１又はＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤと混合することにより試料を調製した。ＳＴＡＴ１と混合する前に、^２Ｈ－^１５Ｎ ＮｉＰ-ＣＴＤを同じバッファー中に室温で８時間、その後、４℃で２日間、保ち、アミド交換が平衡に達するようにした。本発明者らの研究に用いられた２Ｄ ^１５Ｎ，^１Ｈ ＴＲＯＳＹ－ＨＳＱＣパルススキーム及びＷＵＲＳＴ ^１Ｈ－飽和パルス（１５ｍｓ、２８００Ｈｚバンド幅）は記載されているとおりであった。オン／オフ飽和についての交互列；^１Ｈにおける１２ｐｐｍ（２０４８個のデータ点）及び^１５Ｎにおける２７ｐｐｍ（５１２個のデータ点）のスペクトル幅での２５％非一様サンプリング及びPoissonギャップサンプラーを用いてデータを取得した。脂肪族プロトンＮｉＰ-ＣＴＤのＷＵＲＳＴ飽和は２ｓであり、飽和周波数は、オン共鳴について０．９ｐｐｍ及びオフ共鳴について－５０ｐｐｍに設定された。各転移交差飽和実験を６～１３時間、列あたり６４～１１２個のスキャン、及び１ｓのスキャン間のリサイクル時間で取得した。スペクトルを、ｑＭＤＤを用いる圧縮センシングアルゴリズムで再構成し、ＮＭＲＰｉｐｅを用いて処理した。

ＲＡＢＶ Ｎペプチドの野生型及び変異体ＮｉＰ-ＣＴＤとの結合をモニターするために、２Ｄ ^１５Ｎ，^１Ｈ ＨＳＱＣによりモニターされる滴定を、増加性濃度（２５、５０、１００、２００、４００、５００μＭ）の非標識ＮｉＰ-ＣＴＤバリアントと共に５０μＭの^１５Ｎ－標識Ｎペプチドを用いて行った。滴定中、ＮＭＲ試料の体積を、１０％の変動内に維持した。平均化学変化を以下から決定した：

解離定数（Ｋ_Ｄ）を、最も大きいシフトを示し、且つ滴定中速い交換状態のままであった十分に分離したピークを用いて測定した。データを、二状態交換を仮定する非線形曲線にフィッティングした（xcrvfit 4.0.12；Boyko及びSykes、University of Alberta、www.bionmr.ualberta.ca）。

野生型及び変異体ＮｉＰ-ＣＴＤの水素－重水素交換を、600MHz Bruker Avance III分光計において２５℃及びｐＨ６．８での２Ｄ ^１Ｈ－^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルの取得によりモニターした。５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８、１００％ Ｄ_２Ｏ中に予め平衡に達したillustra NAP-5カラムに２５０μＭ試料を通過させることにより交換を開始した。データを取得し、^１Ｈにおける１３ｐｐｍ（２０４８個のデータ点）及び^１５Ｎにおける２６ｐｐｍ（２５６個のデータ点）のスペクトル幅であった。２５％サンプリングでの取得にＮＵＳを用いた。各スペクトルについて、^１５Ｎデータ点あたり１６個のスキャンを取得し、２０分間の取得時間を生じた。１番目のスペクトルの取得は、最初の交換から８分後に生じた。交換率（ｋ_ａ）は、単一指数にフィッティングすることにより決定された：

式中、Ｉはピーク強度であり、ｋ_ａは交換率であり、ｔは時間である。野生型タンパク質と変異体タンパク質との間の交換の自由エネルギーの差（δΔＧ ｋＪ／ｍｏｌ）は、以下から決定された：

式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは温度（Ｋ）であり、ｋ_ａ１及びｋ_ａ２は同じプロトンについての交換率である。

哺乳動物細胞培養
ＨＥＫ-２９３-Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を追加したダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
Ｉ型ＩＦＮの誘導又はＩ型ＩＦＮシグナル伝達を測定するためのデュアルルシフェラーゼアッセイを、以前に記載されているように実施する。簡潔に説明すると、２４ウェルプレートで培養されたＨＥＫ-２９３-Ｔ細胞に、完全長野生型又は変異型Ｐタンパク質をコードするｐＥＧＦＰ－Ｃ１構築物、ｐＲＬ－ＴＫ（Promega）（ウミシイタケルシフェラーゼを構成的に発現する）、及びｐＩＳＲＥ－Ｌｕｃ（Stratagen）又はｐＧＬ３－ＩＦＮｂのいずれか（それぞれ、ＩＳＲＥプロモーター又はＩＦＮβプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼを発現する）を、Fugene（Promega）又はLipofectamine 2000（ThermoFisher）を用い、製造会社の使用説明書に従って、同時トランスフェクションする。

ＩＦＮシグナル伝達のアッセイについて、トランスフェクションから７時間後、デュアルルシフェラーゼアッセイによる分析前に１６時間、細胞を１０００Ｕ／ｍｌ ＩＦＮα（PBL Interferon Source）で処理する。相対的ルシフェラーゼ活性を、以前に記載したように、ホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化し、陽性対照試料（ＰΔ３０を発現し、かつＩＦＮで処理された細胞）の値に対して、正規化された値を計算することにより決定する（図５）。

ＩＦＮ誘導アッセイについて、同時トランスフェクションは、ＲＩＧ-Ｉ－フラグ（ＲＩＧ-Ｉシグナル伝達を活性化するため）及び／又はＲＩＧ-ＩのトランスフェクションもＰタンパク質プラスミドもない、試料についてトランスフェクションされた総ＤＮＡを等しくするためのｐＵＣ－１９を含む。ルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションから２４時間後、デュアルルシフェラーゼアッセイにより測定される。相対的ルシフェラーゼ活性は上記のように、ホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化し、Ｐタンパク質なしでｐＵＣ－１９及びＲＩＧ-Ｉ－フラグを発現する陽性対照試料についての値に対して、正規化された値を計算することにより決定される。

ミニゲノムアッセイを以前に記載されているように実施する。簡潔に説明すると、１２ウェルプレートに播種されたＨＥＫ-２９３-Ｔ細胞に、０．４μｇ ｐＲＶＤＩ－ｌｕｃ、０．６μｇ ｐＣ－ＲＮ、０．２μｇ ｐＣ－ＲＬ及び０．１μｇ野生型及び変異体Ｐタンパク質をコードするｐＥＧＦＰ－Ｃ１をトランスフェクションする。細胞を、４８時間後、溶解し、上記のように、ホタルルシフェラーゼ活性について分析する。

感染細胞におけるＩＦＮシグナル伝達の分析について、ＩＳＲＥの制御下でルシフェラーゼを発現する細胞（たとえば、ＳＴＩＮＧ－３７レポーター細胞）に野生型又は変異型組換えウイルス（たとえば、Ｔｈａ、ＣＥ－ＮｉＰウイルス）を感染させ、又は感染させない。インキュベーション後、細胞をＩＦＮα無し又は有りで処理し、ホタルルシフェラーゼキット（Promega）を用いて分析する。

ＳＴＡＴ１局在化の共焦点レーザー走査型顕微鏡法（ＣＬＳＭ）分析
Ｃｏｓ７細胞を、カバーガラス上に播種し、次の日、それに、野生型又は変異体Ｎｉ-Ｐを発現するｐＥＧＦＰ－Ｃ１プラスミドを、Lipofectamine（ThermoFisher）を用いて、製造会社の使用説明書に従ってトランスフェクションした。トランスフェクションから１６時間後、細胞を、１０分間の３．７％ホルムアルデヒドでの固定化及び５分間の９０％メタノールでの透過処理の前に３０分間、ＩＦＮα無し又は有りで処理する。細胞を、抗ＳＴＡＴ１抗体、続いてAlexa Fluor-568コンジュゲート型二次抗体で免疫染色する。カバーガラスを、スライドガラス上にMowiolマウンティング溶液を用いてマウントする。細胞をＣＬＳＭにより画像化する。

免疫沈降（ＩＰ）及びイムノブロッティングアッセイ
免疫共沈降（ｃｏ-ＩＰ）アッセイを、以前に記載されているように実施する。簡潔に説明すると、ＧＦＰ融合Ｐタンパク質を発現するようにＣＯＳ７細胞をトランスフェクションし、次いで、０．５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で一晩インキュベートする。その後、細胞を無血清ＤＭＥＭ中で（１時間）インキュベートし、１０００Ｕ／ｍｌ ＩＦＮαで処理する。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ－４０、ｐＨ７．５）中へ収集する。可溶化液を２７Ｇの針に１０回通過させ、氷上でインキュベートし（３０分間）、遠心分離（１２０００ｇ、１０分間、４℃）により清澄化する。

可溶化液の１０％（「インプット」試料）をＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファー中に可溶化し、残りを、製造会社の使用説明書に従ってＧＦＰ－Ｔｒａｐシステム（Chromotek）を用いるｃｏ-ＩＰに供し、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファーを用いて溶出する。インプット及びｃｏ-ＩＰ試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離させ、その後、抗ｐＹ－ＳＴＡＴ１抗体、抗ＳＴＡＴ１及び抗ＧＦＰ、続いて、ＨＲＰコンジュゲート型二次抗体を用いるウェスタンブロッティング及び分析、並びにWestern Lightening ECL試薬（Perkin Elmer）及びGel Doc（商標）XR+Gel Documentationシステムを用いる検出を行う。

逆遺伝学及びウイルス産生
組換えウイルスを、以前に記載されているように、狂犬病ウイルスのゲノムを有するプラスミドを用いて作製する。変異を、Wiltzer et al., (JID, 209: 11(1) 1744)に記載されているようにオーバーラップＰＣＲによりＣＥ－ＮｉＰ-ＷＴゲノムプラスミドに導入し、組換えウイルスをＢＨＫ／Ｔ７-９細胞においてレスキューする。ウイルスストックを、ＮＡ細胞において調製し、力価を、再び以前Wiltzerらに記載されているように、フォーカス形成アッセイにより決定して、フォーカス形成単位（ｆｆｕ）／ｍＬを計算した。

in vivo実験
病原性実験を、以前に記載されているように実施する；簡潔に説明すると、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに１０００ＦＦＵｓの組換えＲＡＢＶの筋肉内注射により感染させ、２１日間以上モニターする。晩期感染症状が出現した時（人道的エンドポイント）、マウスを屠殺する。

統計解析
スチューデントｔ検定（独立、両側）を用いてｐ値を計算するためにＰｒｉｓｍバージョン６ソフトウェア（Graphpad）を統計解析に用いる。生存曲線についてのｐ値を計算するために、ログランク（Mantel-Cox）検定を用いる。

実施例２ ＳＴＡＴ１の発現、精製及び解明
いくつかのＳＴＡＴ１の構造研究はタンパク質の短縮型を用いており、問題のある発現、精製及び溶解性を示唆している。Ｐタンパク質－ＳＴＡＴ１相互作用を評価するために、完全長ＳＴＡＴ１、並びにコイルドコイル及びＤＮＡ結合ドメインからなる短縮型（ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤ）を、ＧＳＴ融合体として発現させた。アフィニティクロマトグラフィーによる精製後、これらのタンパク質の収量はいずれも１Ｌの培養物から５ｍｇであった。ＧＳＴタグの除去及びＳＥＣによる精製後の収量は２ｍｇ未満であった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、ＳＥＣの空隙容量において溶出するＳＴＡＴ１タンパク質の５０％より多くの凝集物を示した。さらに、精製されたＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤは、室温でほぼすぐに又は４℃で８時間以内に沈降を開始し、タグを使用しない場合の安定性は低い。

収量及び溶解性を改善するために、溶解性増強タグとしてＧＢ１融合タグを試験した。Ｎ末端ＧＢ１タグ及びＣ末端Ｈｉｓ_６タグと共に発現する完全長ＳＴＡＴ１（ＧＢ１－ＳＴＡＴ１）は、発現した融合タンパク質の８０％より多くが、細胞溶解後の可溶性画分に存在することを示した。同様の結果が、融合体ＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤについて観察された。アフィニティクロマトグラフィー及びＳＥＣ後に得られたタンパク質の総量は、いずれも培養物の１Ｌあたり約３０ｍｇであった。切断型ＧＳＴ－ＳＴＡＴ１融合体とは対照的に、ＳＥＣはほとんど凝集を示さず（図６）、したがって、ＧＢ１タグが、ＳＴＡＴ１の発現、安定性及び溶解性を著しく増強し、ＧＳＴタグによる精製とその後のＧＳＴの除去と比較して１５倍を超える収量の改善を可能にしている。

ＳＴＡＴ１のＧＢ１タグ化と短縮型の潜在的な構造に対する影響を決定するために、ＣＤ分光光度法を用いて二次構造を推定した（図７）。どちらの構築物も、フォールディングされたタンパク質と一致したスペクトルを示した。ＧＢ１－ＳＴＡＴ１及びＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤについての実験的な二次構造の値は、計算された値とよくフィットし（図７ｃ）、正しいフォールディングを示唆している。ＳＶ－ＡＵＣ実験を行い、タンパク質の流体力学的性質及び予想されるタンパク質間の相互作用を形成する能力を解明した。沈降係数分布ｃ（ｓ）は、ＧＢ１－ＳＴＡＴ１（図８ａ及び図９）が、濃度３０、５０及び８０μＭで、主要種及び２つの少数種を形成し、主要なピークが、予想されるＧＢ１－ＳＴＡＴ１二量体に対応する約６．５Ｓの平均重み係数、及び１８６．８ｋＤａの推定分子量（二量体の１９１ｋＤａの理論量に一致）を有することを示した。より小さいピーク（約３．７Ｓ、約９．５Ｓ）は、少量の単量体及び多量体ＳＴＡＴ１に対応する可能性が高い。ＧＢ１－ＳＴＡＴ１の摩擦係数比は１．７で、伸長した形を示唆している。（１０及び２０μＭでの）ＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤの沈降係数（図８ｂ及び図１０）は、約４８．９ｋＤａの推定分子量に対応し、単量体ＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤ（５０ｋＤａ）の理論値に近く、Ｕ－ＳＴＡＴ１二量体化を安定化させるＮ末端ドメイン（ＮＤ）の非存在と一致する、約２．９Ｓの平均重み係数を有する主要種を同定した。ＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤの摩擦係数比は１．５で、これも非対称的な形を示している。

実施例３ Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面の解明
Ｐタンパク質のシグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）相互作用表面を解明するために、本発明者らは、Ｐタンパク質 ＣＴＤとＳＴＡＴ１の複合体を調べた。

簡潔に説明すると、本発明者らは、ＧＦＰでタグ付けされた、ＲＡＢＶのニシガハラ（Nishigahara）株のＰ-ＣＴＤ（ＮｉＰ-ＣＴＤ）を発現させ、精製した。ＦＤＳ－ＡＵＣ実験を、５、１０及び２０μＭの非蛍光ＧＢ１－ＳＴＡＴ１タンパク質で滴定する、１０μＭ ＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤに実施し（図８ｃ及び図１１）、ＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤ／ＧＢ１－ＳＴＡＴ１複合体に起因する約７．４Ｓの新しいピークが明らかにされた。ＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤを用いた滴定（図８ｄ及び図１２）は、ＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤピークの急激な減少及び３．７Ｓ前後の新しい種の出現を明らかにした。したがって、ＳＴＡＴ１タンパク質はＮｉＰ-ＣＴＤと相互作用している。１：１結合を仮定し、且つ遊離及び複合体化ＧＦＰ－ＮｉＰ-ＣＴＤのピーク呼出し量を考慮して、本発明者らは、ＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤの親和性がおよそ１０～２０μＭ（Ｋ_Ｄ）であると推定する。

上記データは、Ｎｉ-Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面がＰ-ＣＴＤ内にあり、且つＳＴＡＴ１－ＣＣＤ（コイルドコイルドメイン）－ＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）に関与することを示している。ＡＵＣ実験が、ＮｉＰ-ＣＴＤがＵ－ＳＴＡＴ１と弱く結合することを示したため、^１５Ｎ，^２Ｈ－標識ＮｉＰ-ＣＴＤ及び^１４Ｎ，^１Ｈ－標識ＧＢ１－ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤ又はＧＢ１－ＳＴＡＴ１を用いた転移交差飽和ＮＭＲ実験（図１３）を行った。ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤに関して、タンパク質配列では離れているがＣＴＤ構造では近位にあるＮｉＰ-ＣＴＤの２つの領域（配列番号１で示されるアミノ酸配列におけるＧｌｕ２００～Ｓｅｒ２１０（領域Ａ）及びＬｅｕ２３４～Ｌｙｓ２３９（領域Ｂ））のアミド共鳴は、大幅に減弱された（図１）。このデータは、領域Ａ及び領域ＢがＰタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面の一部を形成し、ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤと直接接触し、一方、遠位の領域Ｃは、Ｎ末端及び／又はＣ末端ドメインが関与する異なる相互作用を形成することを示している。

ＧＢ１－ＳＴＡＴ１を用いた実験は、これらの領域が減弱されていることを確認し、完全長ＳＴＡＴ１（図１Ａ）を用いてのみ明らかにすることが可能なＮｉＰ-ＣＴＤとＳＴＡＴ１の間の広範な界面を示す配列番号１で示されるアミノ酸配列の第３の領域Ｇｌｎ２７５～Ｖａｌ２７８（領域Ｃ）の共鳴の減弱を付加的に示した。このデータは、領域Ｃが、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面の一部を形成することを示している。

以前の実験は、Ｗホール残基Ｔｒｐ２６５及びＭｅｔ２８７の変異が、ＳＴＡＴ１の結合及びアンタゴニズム、並びにin vivoでのウイルス病原性を阻害することを示し、ＷホールがＰタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面の一部を形成する可能性があることを示唆した。特に、本発明者らの実験は、結合にＷホールが関与せず、Ｗホールが最も減弱された残基から遠いようであることを示している（図１）。重要なことには、Ｔｒｐ２６５のインドールＮＨは全く減弱されず（図１３）、この残基の側鎖が結合部位の一部ではないことを裏付けている。これらのデータは、ＷホールがＰタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面の一部を形成しないことを示している。

実施例４ Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換がＳＴＡＴ１アンタゴニズムを変化させる
ＮｉＰ-ＣＴＤの新しく提案されたＳＴＡＴ１結合部位を検証するために、アラニン点変異を、完全長ニシガハラ（Nishigahara）Ｐタンパク質（Ｎｉ-Ｐ）に導入し、哺乳動物細胞におけるＳＴＡＴ１のアンタゴニズムを、ＩＦＮ依存性ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを用いて評価した。ＮｉＰ-ＣＴＤの残基（図５）を、共鳴の減弱の程度及び表面露出（図１）に基づいて選択した。アッセイには、野生型Ｎｉ-Ｐ（ＮｉＰ-ｗｔ又はｗｔ）及びＣＶＳ Ｐタンパク質（ＣＶＳ-Ｐ又はＣＶＳ-ｗｔ）が含まれ、それらは、ＳＴＡＴ１アンタゴニズムに機能的で、ＣＶＳ-ＰはＣ末端の３０残基が欠失している（ＣＶＳＤ３０又はΔ３０）。ＣＶＳＤ３０は標準対照で、最後の２つのヘリックスがなく、その結果、ＣＴＤにおいてフォールディング化構造を欠き、そのため、ＳＴＡＴ１ターゲティング、複製、及びおそらく他のＣＴＤ関連機能が欠損しているタンパク質を生じる。

単一変異及び複合変異として、Ｗホール変異Ｗ２６５Ｇ及びＭ２８７Ｖを含有するＮｉ-Ｐが含まれ、複合変異はＣＶＳ-ＰによるＳＴＡＴ１アンタゴニズムを強く損なう。予想したように、野生型Ｎｉ-ＰはＩＦＮ依存性シグナル伝達を抑制し（ルシフェラーゼの誘導の低下により示される）、ＣＶＳＤ３０には大きな欠陥があった（図５Ａ）。Ｎｉ-Ｐ Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖも、明らかに欠陥を生じたが、これはＣＶＳΔ３０についての欠陥より程度が低いようであった。対応する残基で変異したＣＶＳ-Ｐについての以前のデータと一致して、Ｎｉ-Ｐ Ｗ２６５Ｇ及びＭ２８７Ｖは、部分的に欠陥を生じるようであった。

アミノ酸置換を含む新しい変異体のうち、Ａ２０６Ｅ（図５Ｂ）、Ｆ２０９Ａ（図５Ａ）、Ｄ２３５Ｋ（図５Ｂ）及びＤ２３５Ａ（図５Ａ及び図５Ｂ）のＳＴＡＴ１アンタゴニスト機能が低下し、多くの場合、Ｗ２６５Ｇ又はＭ２８７Ｖのそれと類似した又はそれより大きく、且つ試験された他の変異体のそれを超える程度で低下した（図５）。これらの残基の重要性をさらに試験するために、二重変異体Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ及びＡ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋ（図５Ａ及び図５Ｂ）を調製し、このように、領域Ａ及びＢのそれぞれに由来する１つの残基を組み合わせた（図１ａ）；２つの隣接する負に帯電した側鎖の変異の複合効果を試験するために、両方が領域Ｂ内にあるＤ２３５Ａ／Ｄ２３６Ａを組み合わせた変異体（図５Ａ）を作製した。データはＤ２３５Ａ／Ｄ２３６Ａ変異の組合せによるＳＴＡＴ１アンタゴニスト機能のさらなる部分的損失を示唆したが、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ及びＡ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋは、ＩＦＮ－アンタゴニスト機能の消失を生じ、それは、ＰΔ３０に匹敵した（図５Ａ及び図５Ｂ）。特に、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖの明らかな効果にも関わらず、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ及びＡ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋの変異は、より大きい欠陥を引き起こすことが観察され、後者の変異が、ＮｉＰ-ＣＴＤによるＳＴＡＴ１相互作用により強力に影響することを示唆した（図５Ａ）。

これらのデータは、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換がＳＴＡＴ１アンタゴニズムを変化させることを示している。特に、このデータは、Ｐタンパク質のＣ末端ドメインのαヘリックス１、αヘリックス２及び／若しくはαヘリックス５内の、又はこれらのαヘリックスに隣接した１つ以上のアミノ酸置換が、ＳＴＡＴ１アンタゴニズムを変化させる可能性があることを実証している。

これは、１つ以上のアミノ酸置換がＰタンパク質のＩＦＮアンタゴニスト活性を調節できることも実証している。

Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ変異のＩＦＮ／ＳＴＡＴ１依存性シグナル伝達のアンタゴニズムへの効果がＳＴＡＴ１との相互作用の変化によることを確認するために、相互作用をin vitroでＮＭＲにより評価した。^１５Ｎ－標識野生型ＮｉＰ-ＣＴＤの等モルのＧＢ１－ＳＴＡＴ１での、２Ｄ ^１Ｈ，^１５Ｎ ＨＳＱＣによりモニタリングされる滴定を調べ、野生型ＮｉＰ-ＣＴＤのＧＢ１－ＳＴＡＴ１の二量体（約２００ｋＤａの複合体を形成する）との結合について予想されるとおり、８８個の十分に分離したピークについての共鳴強度の平均５２％の損失を生じた（図１４ａ）。興味深いことに、ＩＦＮシグナル伝達アッセイにおけるＰタンパク質のアンタゴニスト機能への明らかな（不完全ではあるが）阻害効果（図５Ａ）にも関わらず、ＮｉＰ-ＣＴＤ Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖは、野生型と類似した広幅化パターンを生じ、８３個の十分に分離したピークについて強度の平均４１％損失であった（図１４ｂ）。対照的に、ＮｉＰ-ＣＴＤ Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５ＡのＧＢ１－ＳＴＡＴ１での滴定は、ほとんど広幅化を示さず、８５個の十分に分離したピークについて強度の平均７％損失であった（図１４Ｃ）。したがって、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ変異はＳＴＡＴ１との結合を低下させるが、消失させず、ＳＴＡＴ１シグナル伝達のアンタゴニズムへの不完全な効果と一致し、一方、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａは強く障害され、ＩＦＮアンタゴニスト機能の完全な損失と一致している。これらのデータは、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換がＰタンパク質のＳＴＡＴ１との相互作用に干渉できることを示している。

Ｐタンパク質／ＳＴＡＴ１相互作用の最初の同定は、ＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤが十分であることを示し、ＳＴＡＴ１チロシンリン酸化（Ｃ末端トランス活性化ドメイン、ＴＡＤにおける保存残基で生じる；図７）が必要とされないことを示している。しかし、転移交差飽和データ（図１）は、ＳＴＡＴ１ Ｃ末端ドメイン又はＮ末端ドメインのいずれかによる潜在的な寄与を示し、ウイルス－ＳＴＡＴ複合体が複雑な界面を含んでいる可能性があることを示している。重要なことには、例４のデータは、Ｐタンパク質／ＳＴＡＴ１相互作用に関与する残基がＳＴＡＴ１アンタゴニズムに関与することを示している。

実施例５ Ｗホールにおけるアミノ酸置換はＰタンパク質を全体的に著しく不安定化させる
Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ又はＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ変異を有するＰ-ＣＴＤの立体構造の完全性を評価するために、単一又は二重変異を有するＮｉＰ-ＣＴＤを発現させ、精製した（図６）。重要なことには、全ての単一変異体及びＮｉＰ-ＣＴＤ Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａは可溶性タンパク質として発現し（＞６０％）、ＮｉＰ-ＣＴＤ Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖは、主にペレット画分中で発現し（細胞溶解上清で１０％）、ｐＹ－ＳＴＡＴ１アンタゴニズムの欠陥は正しいフォールディングが喪失したことによる可能性があることを示唆した。

Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ及びＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ変異タンパク質の構造の完全性を評価するために、^１３Ｃ、^１５Ｎ標識ＮｉＰ-ＣＴＤ変異体を作製し、三重共鳴実験により^１５Ｎ、ＮＨ、^１３Ｃα、^１３Ｃβ及びＣ’共鳴を帰属した。^１３Ｃα及び^１３Ｃβはタンパク質の二次構造に感受性があり、正及び負の傾向は、それぞれ、α-ヘリックス及びβ-シートを示すので、ＳＳＰによる差を評価した。野生型ＮｉＰ-ＣＴＤで決定された二次構造は、ＣＶＳ Ｐ-ＣＴＤのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：１ｖｙｉ）と一致し、野生型と変異体タンパク質の間で大幅な差はなかった（図４ａ）。しかし、野生型ＮｉＰ-ＣＴＤに対するＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ（図４ｂ）及びＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ（図４ｃ）の^１Ｈ－^１５Ｎ平均化学シフトの変化を比較すると、予想したように、変異部位の近くでの変化が認められ、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖでは、フォールディングされた構造におけるこれらの部位から遠い領域での変化も認められ、全体的なフォールドへの影響を示唆した。

タンパク質の安定性を評価するために、野生型、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ及びＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ ＮｉＰ-ＣＴＤで水素－重水素交換実験を行った。野生型ＮｉＰ-ＣＴＤは、さまざまな交換速度を示し、Ｖａｌ２３８及びＬｅｕ２６８のアミドは最も遅い交換で、２４時間にわたってほとんど交換されなかったが、Ｃ末端ヘリックスのアミドは約３０分以内に完全に交換した。いくつかの他のアミドは、速度を計算することができる明らかな指数関数的減衰を示した（表１）。一般的に、ＮｉＰ-ＣＴＤ Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａは、野生型と比較して、全てのアミドでより速く交換する。変異体及び野生型の交換速度が容易に決定できるいくつかの十分に分離した共鳴について、野生型とＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ ＮｉＰ-ＣＴＤの間のアンフォールディングの自由エネルギーの差（δΔＧ）は、４．５～１１．３ｋＪ／ｍｏｌと推定された（表１）。

注目すべきことには、ＮｉＰ-ＣＴＤ Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖで、１番目のスペクトルによる完全な水素－重水素交換（約２０分）が認められ、この変異体の水素結合ネットワークの不安定化を示唆しされた。一般的に、ＮｉＰ-ＣＴＤ Ａ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋは、野生型と比較して全てのアミドで交換が遅く、Ａ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋ変異体は、これらの実験条件（ｐＨ６．８、２５℃）下でわずかにより安定な構造であることを示唆した。

ＣＤ分光光度法によりモニターする温度アンフォールディングも実施した（図１５及び図１７）。ＮｉＰ-ＣＴＤの２５℃における完全ＣＤスペクトルは、野生型及びＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａで類似のスペクトルを示し、二次構造が類似することが推定される（図１５）。Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖの推定された二次構造とＣＤスペクトルの形状は、野生型及びＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａと類似していたが、ＣＤシグナルの深度がはっきりと異なった。２２２ｎｍでモニターされるＮｉＰ-ＣＴＤのアンフォールディングは、野生型及びＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ変異体（図１５）、並びにＡ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋ変異体（図１７）が、それぞれ、５７．０、５１．０及び５３℃のＴ_ｍを有する二部位（two-site）アンフォールディングモデルにフィットすることを示している。

しかし、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ変異体は二状態モデルにあまりフィットせず、推定Ｔ_ｍは４６℃である（図１５）。まとめると、ＣＤスペクトル、温度アンフォールディング及び水素－重水素交換のデータは、ＮｉＰ-ＣＴＤ Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖの立体構造が、野生型並びにＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ及びＡ２０６Ｅ／Ｄ２３５Ｋ変異体と比較して全体的に著しく不安定化されていることを裏付けている。

これらのデータは、Ｗホールにおけるアミノ酸置換がＰタンパク質を全体的に著しく不安定化させることを実証している。これらのデータは、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換がＰタンパク質の著しい全体的な不安定化を生じないことも示している。

実施例６ Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換は複製のためのＮタンパク質結合を無効にしない
変異導入研究は、Ｐタンパク質のＮ-ＲＮＡ結合部位が、Ｐ-ＣＴＤのフォールドにより形成される正に帯電した側鎖（Ｌｙｓ２１１、Ｌｙｓ２１２及びＡｒｇ２６０）のクラスターであることを示唆している。この部位はＷホールの遠位にあるため、Ｗホール内の変異は、予想したように、実質的には複製に影響しない。しかし、Ｎ-ＲＮＡ結合部位は新しく同定された結合領域Ａの近位にあり（図１）、そのため、ＮｉＰ-ＣＴＤ Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ変異によって影響される可能性がある。これを評価するために、ＳＡＸＳモデルにおいてＰ-ＣＴＤ／Ｎ-ＲＮＡ相互作用を媒介すると提案された残基３６３～４１４を包含する、Ｎタンパク質の障害された領域に対応するペプチド（Ｎペプチド）を発現させた。Ｎタンパク質におけるＳｅｒ３８９のリン酸化はこの相互作用を増強すると報告されているため、リン酸化模倣変異（Ｓ３８９Ｅ）をそのペプチドに含めた。^１５Ｎ－標識ＮペプチドのＮｉＰ-ＣＴＤ野生型、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ及びＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖの２Ｄ ^１５Ｎ，^１Ｈ ＨＳＱＣでモニターされる滴定は、単一部位結合曲線（図３）にフィットするＮペプチドのＴｈｒ３７５～Ｇｌｙ３９７の残基について著しい化学シフトの差を示し（図３）、野生型ＮｉＰ-ＣＴＤについて８８±４μＭ及び最小限に撹乱された構造と一致するＮｉＰ-ＣＴＤ Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａについて１２２±１１μＭのＫ_Ｄを示した。しかし、ＮｉＰ-ＣＴＤ Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖの滴定は２分の１未満の親和性である２４９±２９μＭのＫ_Ｄを示し（図３）、以前に観察されているように、この変異体が明らかにＮタンパク質との著しい結合を保持し、ウイルス複製を可能にしているが、データは、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ変異がＰ-ＣＴＤの全体的構造に影響するという考えを裏付けているということを示している。

このデータは、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換が、複製に必要とされるＮタンパク質結合を無効にしないことを実証し、ＳＴＡＴ１結合とウイルス複製が空間的に別個であることを実証している。

Ｎペプチドとの観察された結合がその変異型タンパク質の複製機能の保持と相関することを確認するために、機能性Ｌ-タンパク質／Ｐタンパク質／Ｎ-ＲＮＡ相互作用がルシフェラーゼ活性により示されるミニゲノムアッセイを用いる。野生型と比較した、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ変異を含む変異の複製機能への効果を調べる。以前、組換えウイルスの分析により（たとえば、変異型ＮｉＰを有する組換えウイルスの分析及びＲＡＢＶ ＣＶＳ株Ｐタンパク質のミニゲノムアッセイにより）示されているように、Ｎタンパク質との結合は、効率的な複製を媒介するのに十分である。

重要なことには、このデータは、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換がＲＡＢＶ Ｎタンパク質相互作用を無効にしないことを実証している。Ｎタンパク質の役割を考えると、これらのデータは、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換がポリメラーゼ補因子機能を無効にしないことを示している。このデータは、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換が複製機能を無効にしないことも示している。

実施例７ ＲＡＢＶ弱毒における、Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換の役割
本発明者らは以前、ＳＴＡＴ相互作用を阻害するためにＲＡＢＶへＷホール変異を導入して、in vitroで親株から区別できない成長動態学を有するが、ＩＦＮ／ＳＴＡＴアンタゴニスト活性を欠く生存ウイルスを作製することが可能であることを実証した（Wiltzer et al. JID, 209: 11(1) 1744）。このウイルスは、ＩＦＮに対する感受性が高く、常に致死性の親株とは対照的に、マウスにおいて死亡を引き起こさずin vivoで極度に弱毒化されていた（データは示していない）。

したがって、感染におけるＳＴＡＴ１相互作用表面の役割を評価するために、ＣＥ－ＮｉＰ株（野生型はＣＥ－ＮｉＰ-ＷＴと、変異体株はＣＥ－ＮｉＰ－ＳＴＡＴ（－）と呼ぶ）に基づいた組換えＲＡＢＶ株及び／又は他の関連株を用いる。簡潔に説明すると、変異を、オーバーラップＰＣＲによりＣＥ－ＮｉＰ-ＷＴゲノムプラスミドに導入し、組換えウイルスをＢＨＫ／Ｔ７-９細胞でレスキューする。ＩＦＮ感受性株を調製するために一般的に用いられるＮＡ細胞でウイルスストックを調製し、フォーカス形成アッセイで力価を決定し、フォーカス形成単位（ｆｆｕ）／ｍＬを計算する。

一群あたり１２匹の６週齢の雌ｄｄＹマウス（Japan SLC Inc.）に、０．０３ｍＬの希釈液（対照）又は１０^４ｆｆｕのウイルスを含有する希釈液を脳内に（i.c.）接種する。マウスの症状を、２１日間観察する。脳のウイルス力価を測定するために、マウスを５ｄｐｉに安楽死させ、フォーカス形成アッセイによる分析のために脳をホモジナイズする。

たとえば、１２匹のｄｄＹマウスに１０^４ｆｆｕのＣＥ－ＮｉＰ-ＷＴ又はＣＥ－ＮｉＰ－ＳＴＡＴ（－）（たとえば、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ変異体）をi.c.接種し、体重減少及び重度の神経学的症状、並びに死亡／非応答性エンドポイントを２１日間モニターする。

実施例８ ＳＴＡＴ１相互作用及びＳＴＡＴ１核移行におけるＰタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面のアミノ酸置換の役割
単離されたタンパク質の相互作用への効果が細胞における相互作用と相関することを確認するために、ｃｏ-ＩＰ及び共焦点レーザー走査型顕微鏡法（ＣＬＳＭ）分析を用いた。Ｐタンパク質／ＳＴＡＴ１相互作用の最初の同定は、チロシンがトランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）内にあるため、チロシンリン酸化による活性化の非存在下で結合を媒介するのにＳＴＡＴ１－ＣＣＤ－ＤＢＤが十分であることを示した。しかし、いくつかの研究は、細胞からのｃｏ-ＩＰにより検出された効率的な相互作用がＩＦＮ活性化を必要とすることを示している。これと一致して、ＷＴ Ｐタンパク質が、ＩＦＮで０．５時間、処理された細胞から、ＳＴＡＴ１を共沈殿させたが、ＰΔ３０はＳＴＡＴ１を共沈殿させなかった（図１８Ａ）。ＮＭＲにおけるアンタゴニスト機能及び結合の欠損と一致して、Ｎｉ-Ｐ Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５ＡはＰΔ３０の表現型を複製し、検出可能な相互作用を示さなかった（図１８Ａ、ＩＰ：レーンＦＤ）。

ＧＦＰ融合ＷＴ及び変異体Ｐタンパク質を発現する細胞における免疫染色されたＳＴＡＴ１の局在化のＣＬＳＭ分析は、予想したように、ＳＴＡＴ１がＩＦＮ活性化（０．５時間）後、核へ迅速に蓄積し、これは、ＷＴ Ｎｉ-Ｐにより阻止されたことを示した（データは示していない）。ＳＴＡＴ１結合／アンタゴニズムの完全な喪失と一致して、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ Ｎｉ-Ｐは、ＳＴＡＴ１核移行を阻害しなかった。

これらのデータは、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ変異タンパク質がin vitroでＳＴＡＴ１を結合する重要な能力を保持するが、細胞におけるＩＦＮ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達のアンタゴニズムにおいて強い欠陥があることを示している（図５；図１８Ａ）。結合の保持と一致して、ＩＦＮ処理の少なくとも初期時点（０．５時間）で、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ Ｎｉ-Ｐは、ＩＦＮ依存性ＳＴＡＴ１核移行を抑制した（データは示していない）。ｃｏ-ＩＰアッセイも、細胞のｐＹ－ＳＴＡＴ１レベルが最大である０．５～１時間のＩＦＮ処理時点で、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ Ｎｉ-ＰがＳＴＡＴ１と相互作用したことを示した；しかし、複数のアッセイにおいて、ＷＴ Ｐタンパク質と比較して結合が明らかに低下していた。さらに、ＷＴ Ｐタンパク質は長時間（予想したように＞１６時間）にわたってＳＴＡＴ１を保持したが、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖでは結合は喪失した。Ｐタンパク質は、おそらく、核ホスファターゼによる脱リン酸化を阻止するアンタゴニスト複合体中に保持されるせいで、細胞においてｐＹ－ＳＴＡＴ１の蓄積を引き起こし、それは、通常、負の制御機構として０．５～１時間のＩＦＮ処理時点で生じる（図１８Ａ）。

したがって、Ｐタンパク質は、正常なリン酸化／脱リン酸化リサイクリングを阻止し、おそらく、それがアンタゴニズムの持続を可能にする。これらのデータは、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ Ｎｉ-Ｐが、最初の結合の親和性と、結果としての、欠陥アンタゴニズムの原因となるｐＹ－ＳＴＡＴ１の保持の両者に欠陥があることを示す。それでもやはり、それは、ＰΔ３０及びＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ変異タンパク質と比較して、残留ＳＴＡＴ１相互作用を明らかに生じ、アンタゴニスト機能の不完全な喪失を説明している（図１８）。ＮＭＲデータが、Ｗ２６５及びＭ２８７が新規な結合領域の残基と直接的には接触しないことを示しているため、その変異の効果は、おそらく、立体構造的効果を介して間接的である。対照的に、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ変異はＰΔ３０と同程度に強力で、重要なＳＴＡＴ１接触の特異的除去と一致している。

実施例９ Ｐ-ＣＴＤ相互作用がＳＴＡＴ１－ＤＮＡ結合を直接的に阻止する
領域Ａ及びＢに特異的に影響を及ぼす変異／置換が、Ｐタンパク質がＳＴＡＴ１転写をアンタゴナイズするのを阻止することは、ＣＣＤ－ＤＢＤとの特異的接触及びその結果のＳＴＡＴ１／ＤＮＡ相互作用の阻害が重要であると示唆した。

他の細胞因子の非存在下でのＷＴ及び変異型Ｐ-ＣＴＤのＳＴＡＴ１／ＤＮＡ結合への効果を確認するために、本発明者らは、ＧＡＳ配列を含有するＤＮＡ断片とのｐＹ－ＳＴＡＴの結合を評価した。ｐＹ－ＳＴＡＴ１は、電気泳動的移動度における強い濃度依存性シフトを誘導し、ＤＮＡの大部分がウェル内に停止するようになった（図１８Ｂ）；ＷＴ又は変異型Ｐ-ＣＴＤは単独ではＤＮＡ断片移動度の明らかなシフトを引き起こさなかった。ｐＹ－ＳＴＡＴ１の増加性量のＷＴ Ｐ-ＣＴＤとのプレインキュベーションは明らかに阻害性であるが、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ Ｐ-ＣＴＤは、試験されたいずれの濃度においてもほとんどあるいは全く影響を及ぼさず、ＤＢＤとの結合における領域Ａ／Ｂの重要性を裏付けている。Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖも阻害活性を欠き、ＳＴＡＴ１結合能力を、ＤＮＡ相互作用を阻止するのには不十分なレベルで低下させる立体構造的効果と一致した。

これらのデータは、Ｐタンパク質の最小ＳＴＡＴ１結合領域であるＰ-ＣＴＤが、ＤＮＡ相互作用を低下させるのに十分であることを実証している。これは、他のウイルス／細胞タンパク質を必要としない、孤立のＰ-ＣＴＤ／ＳＴＡＴ１複合体の形成が、ＳＴＡＴ１／ＤＮＡ相互作用をアンタゴナイズし、ＤＢＤの直接的遮断と一致する機構を裏付けている。

実施例１０ Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１相互作用表面におけるアミノ酸置換は他の必須Ｐタンパク質機能に干渉しない
変異導入研究は、Ｐタンパク質のＮ-ＲＮＡ結合部位が、Ｐ-ＣＴＤのフォールドにより形成された塩基性残基（Ｌｙｓ２１１、Ｌｙｓ２１２、及びＡｒｇ２６０）のクラスターであることを示唆している。Ｗホールから遠位の局在化と一致して、Ｗホール変異は、実質的には複製に影響を及ぼさなかった。しかし、Ｎ-ＲＮＡ結合部位は領域Ａの近位にあり、そのためＦ２０９Ａ変異によって影響される可能性がある。これを評価するために、ＳＡＸＳモデルにおいてＰ-ＣＴＤ／Ｎ-ＲＮＡ相互作用を媒介すると示唆された、Ｎタンパク質の障害された領域に対応するペプチド（Ｎペプチド）（残基３６３～４１４）を発現させた。^１５Ｎ－標識ＮペプチドのＷＴ及び変異体Ｐ-ＣＴＤでの２Ｄ ^１５Ｎ，^１Ｈ ＨＳＱＣでモニターされる滴定は、単一部位結合曲線（図３）にフィットするＮペプチドにおいて著しい化学シフトの差を示した（図３）。ＷＴ及びＦ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａは類似の親和性を示し、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖは２分の１未満の親和性を示した（図３Ｂ）。したがって、Ｗ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖ Ｐ-ＣＴＤは、明らかにＮタンパク質との際立った結合を保持し、正常なウイルス複製を可能にしているが、これらのデータは、この変異体の全体的な構造的効果を裏付けている。Ｎペプチド結合が複製機能と相関することを確認するために、機能性Ｌ-タンパク質／Ｐタンパク質／Ｎ-ＲＮＡ相互作用がルシフェラーゼ活性により示されるミニゲノムアッセイを用いた（図３Ｃ）。ＳＴＡＴ１アンタゴニスト機能の消失にも関わらず、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ Ｐタンパク質の複製機能はＷＴのそれと等価であった。

ＩＦＮシグナル伝達をアンタゴナイズすること以外に、Ｐタンパク質は、ＲＩＧ-Ｉ様受容体経路をアンタゴナイズすることにより感染細胞においてＩＦＮ誘導を阻害する。Ｐタンパク質における原因部位は知られていないが、Ｃ末端領域１５２～２９７が重要であることを示唆されている。Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａ変異がこの機能に影響を及ぼすかどうかを決定するために、本発明者らは、レポーターアッセイを用いてＲＩＧ-Ｉシグナル伝達を評価したが、Ｆ２０９Ａ／Ｄ２３５Ａの効果もＷ２６５Ｇ／Ｍ２８７Ｖの効果も見いだされなかった（後者はＣＶＳ-Ｐのデータ（図３Ｄ）と一致する）。したがって、その新しい変異は、Ｐタンパク質ＩＦＮアンタゴニズムのＳＴＡＴ１ターゲティングアームに特異的に影響を及ぼす。

Claims (29)

1. リン酸化タンパク質（Ｐタンパク質）のシグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）相互作用表面に１つ以上のアミノ酸置換を含む、単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
2. 前記相互作用表面が前記Ｐタンパク質のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）内にある、請求項１に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
3. 前記相互作用表面が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の残基１８６～２９７に対応する領域内にある、請求項２に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
4. 前記１つ以上のアミノ酸置換が、前記Ｐタンパク質のＣ末端ドメインのαヘリックス１、αヘリックス２及び／又はαヘリックス５内にあるか、隣接する、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
5. 前記１つ以上のアミノ酸置換が前記Ｐタンパク質のＳＴＡＴ１との相互作用に干渉する、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
6. 前記１つ以上のアミノ酸置換が前記Ｐタンパク質のＩＦＮアンタゴニスト活性を調節する、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
7. 前記Ｐタンパク質が前記Ｐタンパク質のＷホールにアミノ酸置換を含まない、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
8. 前記１つ以上のアミノ酸置換がポリメラーゼ補因子機能を無効にしない、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
9. 前記１つ以上のアミノ酸置換がＮタンパク質結合を無効にしない、請求項８に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
10. 前記１つ以上のアミノ酸置換がＮタンパク質相互作用表面内にない、請求項８に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
11. 前記１つ以上のアミノ酸置換が配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０３～２７７に対応する領域内にある、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
12. 前記１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０３、２０４、２０６、２０７、２０９、２３４、２３５、２３６、２３９及び／又は２７７に対応するアミノ酸残基にある、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
13. 前記１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０３、２０４、２０６、２０７、２０９、２３４、２３５、２３６、２３９及び／又は２７７に対応するアミノ酸残基にあり、前記置換が２０３Ａ、２０６Ｇ、２０７Ａ、２０９Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｋ、２３６Ａ、２３９Ａ及び／又は２７７Ａである、請求項１２に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
14. 前記Ｐタンパク質が少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
15. 前記少なくとも２つのアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０６、２０９及び２３５に対応するアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基にある、請求項１４に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
16. 前記２つのアミノ酸置換が、Ｆ２０９Ａ、Ｄ２３５Ａ、Ａ２０６Ｅ、Ｄ２３５Ｋ及びＤ２３６Ａ又は等価の保存位置からなる群から選択される、請求項１５に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
17. 前記Ｐタンパク質のＷホールに１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～６又は８～１６のいずれか一項に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
18. １つ以上のアミノ酸置換が配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６５及び／又は２８７に対応するアミノ酸残基にある、請求項１７に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
19. 前記アミノ酸置換が２６５Ｇ若しくは２８７Ｖ又は等価の保存位置である、請求項１８に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
20. リッサウイルスが、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、ドゥーベンハーゲウイルス、ヨーロッパコウモリリッサウイルス１及び２、イルクーツクウイルス、西コーカサスコウモリウイルス並びにオーストラリアコウモリリッサウイルスからなる群から選択される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の単離されたリッサウイルスＰタンパク質。
21. 請求項１～２０のいずれか一項に記載のＰタンパク質をコードする単離された核酸又はその相補体。
22. 請求項２１に記載の核酸を含む細胞又はベクター。
23. リッサウイルスゲノムの相補体が請求項１～２１のいずれか一項に記載のＰタンパク質をコードする、リッサウイルスゲノム。
24. 請求項２３に記載のリッサウイルスゲノムを含むリッサウイルスビリオン。
25. 前記リッサウイルスが弱毒化されている、請求項２４に記載のリッサウイルスゲノムを含むリッサウイルスビリオン。
26. 前記リッサウイルスが複製することができる、請求項２３に記載のリッサウイルスゲノムを含むリッサウイルスビリオン。
27. 請求項２４～２６のいずれか一項に記載のリッサウイルスビリオン及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
28. 対象においてリッサウイルス感染を治療及び／又は防止するための薬剤の製造における請求項２４～２６のいずれか一項に記載のリッサウイルスビリオンの使用。
29. 対象においてリッサウイルス感染を治療及び／又は防止する方法であって、前記方法が、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のビリオン又は請求項２７に記載の薬学的組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。

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