JP2022528507A - Ｎｌｒｐ３インフラマソームの阻害 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの結合部位に関する。本発明はさらに、ＮＬＲＰ３活性化を阻害すること、およびＮＬＲＰ３阻害に応答する疾患、障害または病気を処置すること、における使用の方法および使用のための化合物に関する。本発明はさらに、ＮＬＲＰ３活性化を阻害することにより細胞またはミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）を低減する方法に関する。本発明はさらに、ＮＬＲＰ３インフラマソームの結合部位への化合物の結合の程度を決定するために化合物をスクリーニングする方法、およびそのようなスクリーニング方法により同定される化合物に関する。【選択図】図１６

Description

発明の分野
本発明は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの結合部位に関する。本発明はさらに、ＮＬＲＰ３活性化を阻害すること、およびＮＬＲＰ３阻害に応答する疾患、障害または病気を処置すること、における使用の方法および使用のための化合物に関する。本発明はさらに、ＮＬＲＰ３活性化を阻害することにより細胞またはミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）を低減する方法に関する。本発明はさらに、ＮＬＲＰ３インフラマソームの結合部位への化合物の結合の程度を決定するために化合物をスクリーニングする方法、およびそのようなスクリーニング方法により同定される化合物に関する。
発明の背景
インフラマソームは、炎症応答の活性化を担う。ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）ファミリーであるピリンドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）インフラマソームは、炎症過程の成分であり、その異常な活性は、クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）などの遺伝的障害、ならびに多発性硬化症、２型糖尿病、アルツハイマー病およびアテローム性硬化症などの複合疾患において病原性がある。
ＮＬＲＰ３は、多くの病原由来因子、環境因子および宿主由来因子を感知する細胞内シグナル伝達分子である。活性化の際に、ＮＬＲＰ３は、カスパーゼ活性化および動員ドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）に結合する。ＡＳＣはその後、重合して、ＡＳＣスペックとして知られる大きな凝集体を形成する。重合ＡＳＣは、順次、システインプロテアーゼカスパーゼ－１と相互作用して、インフラマソームと称される複合体を形成する。これがカスパーゼ－１の活性化をもたらし、それは炎症促進性サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の前駆形態（それぞれプロＩＬ－１βおよびプロＩＬ－１８と称される）を切断して、それによりこれらのサイトカインを活性化する。カスパーゼ－１はまた、パイロトーシスとして知られる型の炎症性細胞死を媒介する。ＡＳＣスペックはまた、カスパーゼ－８を動員し活性化でき、それはプロＩＬ－１βおよびプロＩＬ－１８をプロセシングしアポトーシス性細胞死を惹起できる。
カスパーゼ－１は、プロＩＬ－１βおよびプロＩＬ－１８を活性形態に切断し、それらは細胞から分泌される。活性カスパーゼ－１はまた、ガスダーミン－Ｄを切断して、パイロトーシスを惹起する。カスパーゼ－１はまた、パイロトーシス性細胞死経路の制御を通して、ＩＬ－３３および高移動度群ボックス１タンパク質（ＨＭＧＢ１）などのアラーミン分子の放出を媒介する。カスパーゼ－１はまた、細胞内ＩＬ－１Ｒ２を切断し、その分解をもたらし、ＩＬ－１αの放出を可能にする。ヒト細胞において、カスパーゼ－１はまた、ＩＬ－３７のプロセシングおよび分泌を制御し得る。細胞骨格および解糖経路の成分などの複数の他のカスパーゼ－１基質が、カスパーゼ－１依存性炎症に寄与し得る。
ＮＬＲＰ３依存性ＡＳＣスペックは、細胞外環境に放出され、そこでそれらは、カスパーゼ－１を活性化し、カスパーゼ－１基質のプロセシングを誘導し、炎症を伝播する可能性がある。
ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化に由来する活性サイトカインは、炎症の重要な駆動因子であり、他のサイトカイン経路と相互作用して、感染および傷害に対する免疫応答を具象化する。例えばＩＬ－１βシグナル伝達は、炎症促進性サイトカインＩＬ－６およびＴＮＦの分泌を誘導する。ＩＬ－１βおよびＩＬ－１８は、ＩＬ－２３と相乗作用して、メモリーＣＤ４ Ｔｈ１７細胞による、およびＴ細胞受容体エンゲージメントの非存在下でγδＴ細胞による、ＩＬ－１７生成を誘導する。ＩＬ－１８およびＩＬ－１２も相乗作用して、メモリーＴ細胞およびＮＫ細胞からのＩＦＮ－γ生成を誘導しＴｈ１応答を駆動する。
遺伝的ＣＡＰＳ病であるマックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、家族性寒冷自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）および新生児期発症多臓器系炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）は、ＮＬＲＰ３における機能獲得型変異により誘発され、これによりＮＬＲＰ３を炎症過程の不可欠成分として定義する。ＮＬＲＰ３はまた、特に２型糖尿病、アテローム性硬化症、肥満および痛風などの代謝障害を含む、複数の複合疾患の病原性に関連づけられている。
中枢神経系の疾患におけるＮＬＲＰ３の役割が、明らかになりつつあり、肺疾患も、ＮＬＲＰ３により影響を受けることが示されている。さらにＮＬＲＰ３は、肝臓疾患、腎臓疾患および加齢の進行において役割を有する。これらの関連性の多くは、Ｎｌｒｐ３－／－マウスを用いて定義されたが、これらの疾患におけるＮＬＲＰ３の特異的活性化への洞察もなされた。２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）では、膵臓の膵島アミロイドポリペプチドの沈着が、ＮＬＲＰ３およびＩＬ－１βシグナル伝達を活性化し、細胞死および炎症を起こす。
複数の低分子が、ＮＬＲＰ３インフラマソームを阻害することが示されている。グリブリドは、ＮＬＲＰ３の活性化に応答してマイクロモル濃度でＩＬ－１β生成を阻害するが、ＮＬＲＣ４またはＮＬＲＰ１を阻害しない。他の過去に特徴づけられた弱いＮＬＲＰ３阻害剤としては、パルテノリド、３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレンおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられるが、これらの薬剤は、限定された効能を有し、非特異的である。
ＮＬＲＰ３関連疾患の現行の処置は、ＩＬ－１を標的とする生物学的薬剤を含む。これらは、組換えＩＬ－１受容体アンタゴニストのアナキンラ、中和ＩＬ－１β抗体のカナキヌマブおよび可溶性デコイＩＬ－１受容体のリロナセプトである。これらのアプローチは、ＣＡＰＳの処置でうまくいくことが立証されており、これらの生物学的薬剤は、他のＩＬ－１β関連疾患への臨床試験で用いられている。
幾つかのジアリールスルホニルウレア含有化合物が、サイトカイン放出阻害薬（ＣＲＩＤ）として同定された（Ｐｅｒｒｅｇａｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ， ２９９： １８７－１９７， ２００１）。ＣＲＩＤは、ＩＬ－１βの翻訳後プロセシングを阻害するジアリールスルホニルウレア含有化合物の一分類である。ＩＬ－１βの翻訳後プロセシングは、カスパーゼ－１の活性化および細胞死を伴う。ＣＲＩＤは、カスパーゼ－１が不活性のままであり原形質膜の潜時（ｌａｔｅｎｃｙ）が維持されるように、活性化された単球を停止させる。
特定のスルホニルウレア含有化合物もまた、ＮＬＲＰ３の阻害剤として開示されている（例えば、Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ５９（５）、１６９１－１７１０， ２０１６；ならびにＷＯ２０１６／１３１０９８ Ａ１、ＷＯ２０１７／１２９８９７ Ａ１、ＷＯ２０１７／１４０７７８ Ａ１、ＷＯ２０１７／１８４６２３ Ａ１、ＷＯ２０１７／１８４６２４ Ａ１、ＷＯ２０１８／０１５４４５ Ａ１、ＷＯ２０１８/１３６８９０ Ａ１、ＷＯ２０１８／２１５８１８ Ａ１、ＷＯ２０１９／００８０２５ Ａ１、ＷＯ２０１９／００８０２９ Ａ１、ＷＯ２０１９／０３４６８６ Ａ１、ＷＯ２０１９／０３４６８８ Ａ１、ＷＯ２０１９／０３４６９０ Ａ１、ＷＯ２０１９／０３４６９２ Ａ１、ＷＯ２０１９／０３４６９３ Ａ１、ＷＯ２０１９／０３４６９６ Ａｌ、ＷＯ２０１９／０３４６９７ Ａ１、ＷＯ２０１９／０４３６１０ Ａ１、ＷＯ２０１９／０９２１７０ Ａ１、ＷＯ２０１９／０９２１７１ Ａ１、およびＷＯ２０１９／０９２１７２ Ａ１参照）。加えて、ＷＯ２０１７／１８４６０４ Ａ１およびＷＯ２０１９／０７９１１９ Ａ１は、ＮＬＲＰ３の阻害剤としての複数のスルホニルアミド含有化合物を開示する。特定のスルホキシイミン含有化合物もまた、ＮＬＲＰ３の阻害剤として開示されている（ＷＯ２０１８／２２５０１８ Ａ１、ＷＯ２０１９／０２３１４５ Ａ１、ＷＯ２０１９／０２３１４７ Ａ１、およびＷＯ２０１９／０６８７７２ Ａ１）。
しかし、ＮＬＲＰ３の阻害剤の厳密な作用機序は、未知である。
インフラマソームが形成するヒトＮＬＲＰタンパク質におけるＡＴＰ結合ドメインの生化学的および構造的態様が、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ， Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ（ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ． ２０１３． ６５（１０）：８５１－８６２）で議論されている。
要約すると、全てのＮＬＲＰは一般に、Ｎ－末端ピリンドメイン、Ｃ－末端ロイシンリッチリピート、および中央のヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）を特徴とする。ＮＢＤは、ＮＡＣＨＴドメインおよびＮＡＤ（ＮＡＣＨＴ関連ドメイン）領域で構成され、リンカー領域により連結された３つのらせん状サブドメインからなる。ＮＡＣＨＴは、神経アポトーシス阻害タンパク質（（ＮＡＩＰ）；主要組織適合性複合体クラスＩＩ転写活性化因子（ＣＩＩＴＡ）；真菌ポドスポラ・アンセリナからの不和合性タンパク質遺伝子座（ＨＥＴ－Ｅ）；および哺乳動物テロメラーゼ関連タンパク質）中に出現することから、そのように命名されている。
ＮＡＣＨＴドメインのＡＴＰ結合および加水分解特性は、様々な細胞活性（ＡＡＡ１）スーパーファミリーに関連するＡＴＰａｓｅのＳＴＡＮＤサブファミリー内のＮＬＲＰの分類の中枢である。このドメインは、Ｍｇ２１配位ループ（Ｍｇ２１ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｌｏｏｐ）およびＡＴＰａｓｅ特異性Ｐ－ループを含む、複数の異なる保存的モチーフからなる。このドメインの中枢は、ＮＬＲＰを他のＰ－ループＮＴＰａｓｅと識別する、Ｗａｌｋｅｒ ＡおよびＷａｌｋｅｒ Ｂモチーフの存在である。
Ｗａｌｋｅｒ ＡおよびＷａｌｋｅｒ Ｂモチーフは、高度に保存された三次元構造を有することが知られたタンパク質配列モチーフである。
Ｗａｌｋｅｒ Ａモチーフは、リン酸結合と関連づけられる。Ｗａｌｋｅｒ Ｂモチーフは、ほとんどのＰ－ループタンパク質中のモチーフであり、Ａモチーフのかなり下流に位置する。
ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤が、ＮＬＲＰ３活性化をどのように抑制するかを決定すること、およびＮＬＲＰ３結合部位を同定することが、必要とされている。
ＮＬＲＰ３結合部位に結合する化合物を同定および提供することもまた、必要とされている。
発明の概要
本発明の第一の態様は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの結合部位であって、
（ａ）ＮＬＲＰ３インフラマソームのＷａｌｋｅｒ Ａおよび／もしくはＷａｌｋｅｒ Ｂ部位にあるか、もしくはその近位にあり；かつ／または
（ｂ）Ａｒｇ１８３、Ｇｌｙ２２９、Ｉｌｅ２３０、Ｇｌｙ２３１、Ｌｙｓ２３２、Ｔｈｒ２３３、Ｉｌｅ２３４、Ｇｌｙ３０３、Ａｓｐ３０５、Ｇｌｕ３０６、Ｌｅｕ４１３およびＨｉｓ５２２から選択される１つもしくは複数の残基を含む、
結合部位、を提供する。
本発明の第一の態様の一実施形態において、結合部位は、ＮＬＲＰ３インフラマソームのＷａｌｋｅｒ Ａおよび／またはＷａｌｋｅｒ Ｂ部位にあるか、またはその近位にある。一実施形態において、結合部位は、ＮＬＲＰ３インフラマソームのＷａｌｋｅｒ Ａ部位にあるか、またはその近位にある。
本出願の目的では、用語「近位」は、１０Å未満、好ましくは５Å未満を意味する。
本発明の第一の態様の一実施形態において、結合部位は、Ａｒｇ１８３、Ｇｌｙ２２９、Ｉｌｅ２３０、Ｇｌｙ２３１、Ｌｙｓ２３２、Ｔｈｒ２３３、Ｉｌｅ２３４、Ｇｌｙ３０３、Ａｓｐ３０５、Ｇｌｕ３０６、Ｌｅｕ４１３およびＨｉｓ５２２から選択される２以上（または３以上、または４以上、または５以上、または６以上、または７以上、または８以上、または９以上、または１０以上、または１１以上、または１２全て）の残基を含む。
本発明の第一の態様の別の実施形態において、結合部位は、Ｇｌｎ１４９、Ｃｙｓ１５０、Ｇｌｕ１５２、Ａｓｐ１５３、Ａｒｇ１５４、Ａｓｎ１５５、Ａｌａ１５６、Ａｒｇ１５７、Ｌｅｕ１５８、Ｇｌｕ１６０、Ｓｅｒ１６１、Ｖａｌ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｓｐ３０２、Ｔｒｐ４１６およびＴｙｒ５６５から選択される１つまたは複数（または２以上、または３以上、または４以上、または５以上、または６以上、または７以上、または８以上、または９以上、または１０以上、または１１以上、または１２以上、または１３以上、または１４以上、または１５以上、または全１６）の残基をさらに含む。
本発明の第二の態様は、化合物を本発明の第一の態様の結合部位に結合させるステップを含む、ＮＬＲＰ３活性化を阻害する方法を提供する。本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様の結合部位に結合するように適合される、ＮＬＲＰ３活性化を阻害することにおける使用のための化合物を提供する。
本発明の目的では、化合物が、結合部位に「結合する」と言われる場合、これは、非限定的に、共有結合、非共有結合、可逆的結合、イオン結合、水素結合、およびファンデルワールス結合を含む、化合物と結合部位の間の任意の種類の相互作用を包含する。
本発明の第三の態様は、化合物の治療有効量を本発明の第一の態様の結合部位に結合させるステップを含む、ＮＬＲＰ３阻害に応答する疾患、障害または病気を処置する方法を提供する。本発明の第三の態様はさらに、本発明の第一の態様の結合部位に結合するように適合される、ＮＬＲＰ３阻害に応答する疾患、障害または病気を処置することにおける使用のための化合物を提供する。本発明の第三の態様はさらに、本発明の第一の態様の結合部位のアンタゴニストである、ＮＬＲＰ３阻害に応答する疾患、障害または病気を処置することにおける使用のための化合物を提供する。
本発明の第三の態様の一実施形態において、疾患、障害または病気は、
（ｉ）炎症；
（ｉｉ）自己免疫性疾患；
（ｉｉｉ）癌；
（ｉｖ）感染；
（ｖ）中枢神経系疾患；
（ｖｉ）代謝疾患；
（ｖｉｉ）心血管疾患；
（ｖｉｉｉ）呼吸器疾患；
（ｉｘ）肝臓疾患；
（ｘ）腎臓疾患；
（ｘｉ）眼科疾患；
（ｘｉｉ）皮膚疾患；
（ｘｉｉｉ）リンパ病；
（ｘｉｖ）精神障害；
（ｘｖ）移植片対宿主病；
（ｘｖｉ）疼痛；
（ｘｖｉｉ）糖尿病に関連する病気；
（ｘｖｉｉｉ）関節炎に関連する病気；
（ｘｉｘ）頭痛；
（ｘｘ）創傷または熱傷；および
（ｘｘｉ）個体がＮＬＲＰ３の生殖系または体細胞系非サイレント変異を有すると決定されている任意の疾患、
から選択される。
本発明の第三の態様の別の実施形態において、疾患、障害または病気は、
（ｉ）クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）；
（ｉｉ）マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）；
（ｉｉｉ）家族性寒冷自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）；
（ｉｖ）新生児期発症多臓器系炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）；
（ｖ）家族性地中海熱（ＦＭＦ）；
（ｖｉ）化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・ざ瘡症候群（ＰＡＰＡ）；
（ｖｉｉ）高免疫グロブリンＤおよび周期性発熱症候群（ＨＩＤＳ）；
（ｖｉｉｉ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）；
（ｉｘ）全身若年性特発性関節炎；
（ｘ）成人発症スチル病（ＡＯＳＤ）；
（ｘｉ）再発性多発性軟骨炎；
（ｘｉｉ）シュニッツラー症候群；
（ｘｉｉｉ）スウィート症候群；
（ｘｉｖ）ベーチェット病；
（ｘｖ）抗合成酵素症候群；
（ｘｖｉ）インターロイキン１受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＲＡ）；ならびに
（ｘｖｉｉ）Ａ２０ハプロ不全症（ＨＡ２０）
から選択される。
本発明の第四の態様は、化合物を本発明の第一の態様の結合部位に結合させるステップを含む、ＮＬＲＰ３活性化を阻害することにより細胞またはミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）を低減する方法を提供する。本発明の第四の態様はさらに、本発明の第一の態様の結合部位に結合するように適合される、ＮＬＲＰ３活性化を阻害することにより細胞またはミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）を低減することにおける使用のための化合物を提供する。
本発明の第二、第三および第四の態様の一実施形態において、化合物は、低分子（例えば、１０００Ｄａ未満）、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、抗体またはアプタマーである。
本発明の第二、第三および第四の態様の別の実施形態において、化合物は、結合部位に共有結合または非共有結合で（即ち、可逆的に）結合するように適合される。
本発明の第二、第三および第四の態様の別の実施形態において、化合物は、ＮＬＲＰ３の活性化の阻害を実行し、それによりＡＴＰがＮＬＲＰ３のＷａｌｋｅｒ Ａおよび／またはＷａｌｋｅｒ Ｂ部位からのＡＤＰに置き換わることを防止する。
本発明の第二、第三および第四の態様の別の実施形態において、化合物は、Ａｒｇ１８３、Ｇｌｙ２２９、Ｉｌｅ２３０、Ｇｌｙ２３１、Ｌｙｓ２３２、Ｔｈｒ２３３、Ｉｌｅ２３４、Ｇｌｙ３０３、Ａｓｐ３０５、Ｇｌｕ３０６、Ｌｅｕ４１３およびＨｉｓ５２２から選択される１つもしくは複数の残基に結合することにより、ＮＬＲＰ３の活性化の阻害を実行する。一実施形態において、化合物は、Ａｒｇ１８３、Ｇｌｙ２２９、Ｉｌｅ２３０、Ｇｌｙ２３１、Ｌｙｓ２３２、Ｔｈｒ２３３、Ｉｌｅ２３４、Ｇｌｙ３０３、Ａｓｐ３０５、Ｇｌｕ３０６、Ｌｅｕ４１３およびＨｉｓ５２２から選択される２以上（または３以上、または４以上、または５以上、または６以上、または７以上、または８以上、または９以上、または１０以上、または１１以上、または１２全て）の残基に結合することにより、ＮＬＲＰ３の活性化の阻害を実行する。別の実施形態において、化合物は、Ｇｌｎ１４９、Ｃｙｓ１５０、Ｇｌｕ１５２、Ａｓｐ１５３、Ａｒｇ１５４、Ａｓｎ１５５、Ａｌａ１５６、Ａｒｇ１５７、Ｌｅｕ１５８、Ｇｌｕ１６０、Ｓｅｒ１６１、Ｖａｌ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｓｐ３０２、Ｔｒｐ４１６およびＴｙｒ５６５から選択される１つまたは複数（または２以上、または３以上、または４以上、または５以上、または６以上、または７以上、または８以上、または９以上、または１０以上、または１１以上、または１２以上、または１３以上、または１４以上、または１５以上、または１６全て）の残基にさらに結合することにより、ＮＬＲＰ３の活性化の阻害を実行する。
本発明の第二、第三および第四の態様の別の実施形態において、化合物は、ホスホナート模倣物として作用するモチーフを含む。例えば化合物は、スルホキシド、スルホキシイミン、スルホニルアセトアミド、スルホンアミド、カルバマート、スルホニルカルバマート、ウレア、スルホニルウレア、またはスルホニルトリアゾールであってよい。
本発明の第五の態様は、化合物をスクリーニングする方法であって、（ｉ）化合物を本発明の第一の態様の結合部位に暴露するステップと、（ｉｉ）結合部位への化合物の結合の程度を決定するステップとを含む、方法を提供する。
本発明の第五の態様の一実施形態において、結合部位への化合物の結合の程度は、質量分析、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、Ｘ線結晶解析、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）または放射性リガンド結合により決定される。
本発明の第五の態様の別の実施形態において、スクリーニングの方法は、コンピュータを利用して実行される。それゆえ本発明の第五の態様はさらに、化合物をスクリーニングする方法であって、（ｉ）化合物を本発明の第五の態様の結合部位に暴露することをコンピュータでシミュレートするステップと、（ｉｉ）結合部位への化合物の結合の程度を決定するステップとを含む、方法を提供する。
本発明の第六の態様は、本発明の第五の態様のスクリーニング方法により同定される化合物、またはその医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを提供する。
本発明の第七の態様は、本発明の第一の態様の結合部位に結合するように適合された化合物、またはその医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを提供する。
本発明の化合物は、その遊離塩基形態およびその酸付加塩形態の両方で用いることができる。本発明の目的では、本発明の化合物の「塩」は、酸付加塩を包含する。酸付加塩は、好ましくは、非限定的にハロゲン化水素酸（例えば、フッ化水素酸、塩酸、臭化水素酸またはヨウ化水素酸）もしくは他の無機酸（例えば、硝酸、過塩素酸、硫酸またはリン酸）などの無機酸；または有機カルボン酸（例えば、プロピオン酸、酪酸、グリコール酸、乳酸、マンデル酸、クエン酸、酢酸、安息香酸、サリチル酸、コハク酸、リンゴ酸もしくはヒドロキシコハク酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、ムチン酸もしくはガラクタル酸、グルコン酸、パントテン酸、またはパモ酸）、有機スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸またはカンファースルホン酸）もしくはアミノ酸（例えば、オルニチン酸（ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、グルタミン酸またはアスパラギン酸）などの有機酸を含む、医薬的に許容できる、適切な酸との非毒性付加塩である。酸付加塩は、一酸、二酸、三酸、または多酸付加塩であってよい。好ましい塩は、ハロゲン化水素酸、硫酸、リン酸または有機酸付加塩である。好ましい塩は、塩酸付加塩である。
本発明の化合物が第四級アンモニウム基を含む場合、典型的には化合物は、塩形態で使用される。第四級アンモニウム基の対イオンは、任意の医薬的に許容できる非毒性の対イオンであってよい。適切な対イオンの例としては、酸付加塩に関連して先に議論されたプロトン酸の共役塩基が挙げられる。
本発明の化合物はまた、その遊離酸形態およびその塩形態の両方で使用できる。本発明の目的では、本発明の化合物の「塩」は、本発明の化合物のプロトン酸官能基性（カルボン酸基など）と適切なカチオンとの間に形成されたものを包含する。適切なカチオンとしては、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムおよびアンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。塩は、一塩、二塩、三塩、または多塩であってよい。好ましくは、塩は、一または二－リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩またはアンモニウム塩である。より好ましくは、塩は、一もしくは二ナトリウム塩、または一もしくは二カリウム塩である。
好ましくは任意の塩は、医薬的に許容できる非毒性塩である。しかし、医薬的に許容できる塩に加えて、他の塩が、本発明に包含され、なぜならそれらは、例えば医薬的に許容できる塩の精製もしくは調製において中間体として働く能力を有する、または遊離酸もしくは塩基の同定、特徴づけもしくは精製に有用であるためである。
本発明の化合物および／または塩は、無水であっても、または水和物（例えば、半水和物、一水和物、二水和物または三水和物）もしくは他の溶媒和物の形態であってもよい。そのような他の溶媒和物は、非限定的にアルコール溶媒、例えばメタノール、エタノールまたはイソプロパノールを含む、共通の有機溶媒で形成されてよい。
本発明の幾つかの実施形態において、治療的に不活性なプロドラッグが、提供される。プロドラッグは、ヒトなどの対象に投与されると、全体が、または一部が本発明の化合物に変換される化合物である。ほとんどの実施形態において、プロドラッグは、インビボで活性薬物分子に変換されて治療効果を発揮し得る、薬理学的に不活性な化学的誘導体である。本明細書に記載される化合物のいずれもが、プロドラッグとして投与されて、化合物の活性、生物学的利用度もしくは安定性を上昇させることができ、またはさもなければ化合物の特性を改変できる。プロドラッグの典型的な例としては、活性化合物の官能基部分にある生物学的に不安定な保護基を有する化合物が挙げられる。プロドラッグとしては、酸化、還元、アミノ化、脱アミノ化、水酸化、脱水酸化、加水分解、脱加水分解（ｄｅｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ）、アルキル化、脱アルキル化、アシル化、脱アシル化、リン酸化、および／または脱リン酸化されて、活性化合物を生成し得る化合物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明はまた、先に記載されたようなプロドラッグの塩および溶媒和物を包含する。
本発明の化合物、塩、溶媒和物およびプロドラッグは、少なくとも１種のキラル中心を含有してよい。それゆえ化合物、塩、溶媒和物およびプロドラッグは、少なくとも２種の異性体形態で存在してよい。本発明は、本発明の化合物、塩、溶媒和物およびプロドラッグのラセミ混合物、ならびに鏡像異性体について濃縮された異性体および実質的に鏡像異性体として純粋な異性体を包含する。本発明の目的では、化合物の「実質的に鏡像異性体として純粋な」異性体は、５重量％未満の、より典型的には２％重量未満の、最も典型的には０．５％重量未満の同化合物の他の異性体を含む。
本発明の化合物、塩、溶媒和物およびプロドラッグは、非限定的に１２Ｃ、１３Ｃ、１Ｈ、２Ｈ（Ｄ）、１４Ｎ、１５Ｎ、１６Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、１９Ｆおよび１２７Ｉを含む任意の安定した同位体、ならびに非限定的に１１Ｃ、１４Ｃ、３Ｈ（Ｔ）、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉを含む任意の放射性同位体を含有してよい。
本発明の化合物、塩、溶媒和物およびプロドラッグは、任意の多形または非晶質形態であってよい。
本発明の第八の態様は、本発明の第六または第七の態様の化合物、または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグと、医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
適切な医薬配合物の選択および調製のための従来の手順は、例えば“Ａｕｌｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ － Ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ”， Ｍ． Ｅ． Ａｕｌｔｏｎ ａｎｄ Ｋ． Ｍ． Ｇ． Ｔａｙｌｏｒ， Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ４ｔｈ Ｅｄ．， ２０１３に記載されている。
本発明の医薬組成物中で用いられ得るアジュバント、希釈剤または担体を含む医薬的に許容できる賦形剤は、医薬配合物の分野で従来から用いられるものであり、糖、糖アルコール、デンプン、イオン交換物質、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリセリン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセリロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン・ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂を含むが、これらに限定されない。
一実施形態において、本発明の第八の態様の医薬的組成物は追加で、１種または複数のさらなる活性剤を含む。
さらなる実施形態において、本発明の第八の態様の医薬的組成物は、部分品のキットの一部として提供されてよく、部分品のキットは、本発明の第八の態様の医薬的組成物と、１種または複数のさらなる医薬組成物とを含み、１種または複数のさらなる医薬組成物のそれぞれは、医薬的に許容できる賦形剤と、１種または複数のさらなる活性剤とを含む。
本発明の第九の態様は、薬品中での使用のための、かつ／または疾患、障害もしくは病気の処置もしくは予防における使用のための、本発明の第六または第七の態様の化合物、または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、あるいは本発明の第八の態様の医薬組成物を提供する。典型的には使用は、対象への化合物、塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬組成物の投与を含む。一実施形態において、使用は、１種または複数のさらなる活性剤の共投与を含む。
本明細書で用いられる用語「処置」は同等に、治癒的な治療、および改善もしくは緩和療法を指す。その用語は、有益な、または所望の生理学的結果を得ることを包含し、それは臨床的に確定されていても、または確定されていなくてもよい。有益な、または所望の臨床結果としては、検出可能であるか、または検出可能でないかに関わらず、症状の改善、症状の予防、疾患の程度の軽減、病気の安定化（即ち増悪しないこと）、病気／症状の進行／増悪の遅延または緩徐化、病気／症状の改善または緩和、および寛解（部分または全体のいずれかに関わらず）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で用いられる用語「緩和」およびその変形は、本発明の化合物、塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬組成物を投与しなかった場合に比較して、生理学的条件もしくは症状の程度および／もしくは望まない症状発現が低減すること、ならびに／または進行の時間経過が緩徐化もしくは延長すること、を意味する。疾患、障害または病気に関連して本明細書で用いられる用語「予防」は、防護的または予防的治療、および疾患、障害または病気を発症するリスクを低減する治療に関する。用語「予防」は、疾患、障害または病気の出現の回避と、疾患、障害または病気の開始の遅延の両方を包含する。制御された臨床試験による測定で、任意の統計学的に有意な（ｐ≦０．０５）出現回避、開始遅延またはリスク低減が、疾患、障害または病気の予防と見なされてよい。予防を施すことができる対象としては、遺伝的または生化学的マーカーによる同定で、疾患、障害または病気のリスクの高い対象が挙げられる。典型的には遺伝的または生化学的マーカーは、考慮されている疾患、障害または病気に適し、例えば、炎症の場合のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）などの炎症バイオマーカー；ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの場合の総コレステロール、トリグリセリド、インスリン抵抗性およびＣペプチド；ならびにより一般的にはＮＬＲＰ３阻害に応答性の疾患、障害または病気の場合のＩＬ－１βおよびＩＬ－１８を含む。
本発明の第十の態様は、疾患、障害または病気の処置または予防のための医薬の製造における、本発明の第六または第七の態様の化合物、または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグの使用を提供する。典型的には処置または予防は、対象への化合物、塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬の投与を含む。一実施形態において、処置または予防は、１種または複数のさらなる活性剤の共投与を含む。
本発明の第十一の態様は、疾患、障害または病気の処置または予防の方法であって、本発明の第六または第七の態様の化合物、または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、あるいは本発明の第八の態様の医薬組成物の有効量を投与して、それにより疾患、障害または病気を処置または予防するステップを含む、方法を提供する。一実施形態において、方法は、１種または複数のさらなる活性剤の有効量を共投与するステップをさらに含む。典型的には投与は、それを必要とする対象になされる。
本発明の第十二の態様は、ＮＬＲＰ３における生殖系または体細胞系非サイレント変異を有する個体における疾患、障害または病気の処置または予防における使用のための、本発明の第六または第七の態様の化合物、または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、あるいは本発明の第八の態様の医薬組成物を提供する。変異は、例えば機能獲得型、または結果としてＮＬＲＰ３活性を上昇させる他の変異であってよい。典型的には使用は、個体への化合物、塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬組成物の投与を含む。一実施形態において、使用は、１種または複数のさらなる活性剤の共投与を含む。使用はまた、化合物、塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬組成物が変異のための陽性診断に基づき個体に投与される、ＮＬＲＰ３における生殖系または体細胞系非サイレント変異を有する個体の診断も含んでよい。典型的には個体におけるＮＬＲＰ３の変異の同定は、任意の適切な遺伝的または生化学的手段によるものであってよい。
本発明の第十三の態様は、ＮＬＲＰ３における生殖系または体細胞系非サイレント変異を有する個体における疾患、障害または病気の処置または予防のための医薬の製造における、本発明の第六または第七の態様の化合物、または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグの使用を提供する。変異は、例えば機能獲得型、または結果としてＮＬＲＰ３活性を上昇させる他の変異であってよい。典型的には処置または予防は、個体への化合物、塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬の投与を含む。一実施形態において、処置または予防は、１種または複数のさらなる活性剤の共投与を含む。処置または予防はまた、化合物、塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬が変異のための陽性診断に基づき個体に投与される、ＮＬＲＰ３における生殖系または体細胞系非サイレント変異を有する個体の診断を含んでよい。典型的には個体におけるＮＬＲＰ３の変異の同定は、任意の適切な遺伝的または生化学的手段によるものであってよい。
本発明の第十四の態様は、疾患、障害または病気の処置または予防の方法であって、ＮＬＲＰ３における生殖系または体細胞系非サイレント変異を有する個体を診断するステップと、本発明の第六または第七の態様の化合物、または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、あるいは本発明の第八の態様の医薬組成物の有効量を、陽性と診断された個体に投与し、それにより疾患、障害または病気を処置または予防するステップとを含む、方法を提供する。一実施形態において、方法は、１種または複数のさらなる活性剤の有効量を共投与するステップをさらに含む。典型的には投与は、必要とする対象になされる。
一般的実施形態において、疾患、障害または病気は、免疫系、心血管系、内分泌系、消化器系、腎臓系、肝臓系、代謝系、呼吸器系、中枢神経系の疾患、障害もしくは病気であってよく、癌もしくは他の悪性疾患であってよく、かつ／または病原により誘発されても、もしくは病原に関連してもよい。
疾患、障害および病気の大まかな分類に従い定義されたこれらの一般的実施形態が、互いに排他的でないことは、察知されよう。これに関連して、任意の特別な疾患、障害または病気が、上記一般的実施形態の１つより多くに従い分類されてよい。非限定的例は、自己免疫疾患および内分泌系の疾患である、Ｉ型糖尿病である。
本発明の第九～第十四の態様の一実施形態において、疾患、障害または病気は、ＮＬＲＰ３阻害に応答性である。本明細書で用いられる用語「ＮＬＲＰ３阻害」は、ＮＬＲＰ３の活性レベルの完全なまたは部分的な低減を指し、例えば、活性ＮＬＲＰ３の阻害および／またはＮＬＲＰ３の活性化の阻害を包含する。
複数の異なる障害に関連して、またはそれの結果として生じた炎症応答におけるＮＬＲＰ３誘導性ＩＬ－１およびＩＬ－１８の役割についてのエビデンスがある（Ｍｅｎｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １６６： １－１５， ２０１１； Ｓｔｒｏｗｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，４８１：２７８－２８６， ２０１２）。
ＮＬＲＰ３への役割が示唆されている遺伝性疾患としては、鎌形赤血球症（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， １３０（Ｓｕｐｐｌ １）： ２２３４， ２０１７）、およびバロシン含有タンパク質疾患（Ｎａｌｂａｎｄｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， ４０（１）： ２１－４１， ２０１７）が挙げられる。
ＮＬＲＰ３は、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、高免疫グロブリンＤおよび周期性発熱症候群（ＨＩＤＳ）、化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・ざ瘡（ＰＡＰＡ）、スウィート症候群、慢性非細菌性骨髄炎（ＣＮＯ）、および尋常性ざ瘡を含む、複数の自己炎症性疾患に関連づけられている（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４０： ５９５－６５３， ２０１０）。特にＮＬＲＰ３変異は、ＣＡＰＳとして知られる一連の希少な自己炎症性疾患の原因であることが見出されている（Ｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ８：１５－２７， ２０１５； Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １４０： ８２１－８３２， ２０１０；およびＭｅｎｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １６６： １－１５， ２０１１）。ＣＡＰＳは、再発性の発熱および炎症を特徴とする遺伝性疾患であり、臨床連続体を形成する３つの自己炎症性障害で構成される。これらの疾患は、重症度が増す順に、家族性寒冷自己炎症症候群（ＦＣＡＳ）、マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、および慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ；新生児期発症多臓器系炎症性疾患ＮＯＭＩＤとも呼ばれる）であり、全てが、ＩＬ－１βの分泌増加を導く、ＮＬＲＰ３遺伝子の機能獲得型変異から生じることが示されている。
特に、多発性硬化症、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、乾癬、関節リウマチ（ＲＡ）、ベーチェット病、シュニッツラー症候群、マクロファージ活性化症候群、セリアック病（Ｍａｓｔｅｒｓ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（３）：２２３－２２８， ２０１３； Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ． ３：１－１０，２００４； Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３９： １１－１８，２０１３； Ｃｏｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ．２１（３）：２４８－５５ ２０１５；Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ３４（１）：８８－９３，２０１６；Ｐｏｎｔｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ， ４３（８）： ５８３－５８９， ２０１０;およびＧｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９４（２）： ２３１－２４３， ２０１８）、ループス腎炎（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，６５（１２）： ３１７６－３１８５， ２０１３）を含む全身性エリテマトーデス（Ｌｕ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８（３）：１１１９－２９，２０１７）、多発性硬化症（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， １２０（４）： ５１６０－５１６８， ２０１９）、および全身性硬化症（Ａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．６３（１１）： ３５６３－７４， ２０１１）を含む多数の自己免疫疾患が、ＮＬＲＰ３に関与することが示されている。
ＮＬＲＰ３はまた、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息（ステロイド耐性喘息および好酸球性喘息を含む）、気管支炎、石綿症、火山灰による炎症、および珪肺（Ｃａｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １０５（２６）： ９０３５－９０４０， ２００８； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＲＪ Ｏｐｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４： ００１３０－２０１７， ２０１８； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７０（２）： ４６２－４７５， ２０１９； Ｄａｍｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎ， ８： ２０００， ２０１８； Ｄｅ Ｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ， １８４： ４２－５４， ２０１４； Ｌｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２９３（４８）： １８４５４， ２０１８；およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ， １９６（３）： ２８３－９７， ２０１７）を含む複数の呼吸器および肺疾患においても役割を担うことが示されている。
ＮＬＲＰ３はまた、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、認知症、ハンチントン病、脳マラリア、肺炎球菌性髄膜炎による脳傷害（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， １５： ８４－９７， ２０１４、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｔｏｐｈａｇｙ， １－１３， ２０２０； Ｃｏｕｔｕｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍ， １３： ２０， ２０１６；およびＤｅｍｐｓｅｙ ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｉｎ． Ｂｅｈａｖ． Ｉｍｍｕｎ．６１：３０６－３１６， ２０１７）、頭蓋内動脈瘤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｓｔｒｏｋｅ ＆ Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓ， ２４（５）：９７２－９７９，２０１５）、脳内出血（ＩＣＨ）（Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｏｋｅ， ４９（１）： １８４－１９２， ２０１８）、脳虚血性再灌流傷害（Ｆａｕｚｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， ９：１０３４， ２０１８； Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒａｌ Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ， ２０１８： ８， ２０１８； Ｙｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ２９２： ４６－５５， ２０１７）、全身麻酔による神経炎症（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ， １２： ４２６， ２０１８）、敗血症関連脳症（ＳＡＥ）（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， ４２（１）： ３０６－３１８， ２０１９）、術後認知機能障害をはじめとする周術期神経認知障害（ＰＯＣＤ）（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ， １２： ４２６， ２０１８；およびＦｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ８２：１０６３１７， ２０２０）、早期脳損傷(クモ膜下出血 ＳＡＨ)（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ， １４６： ３２０－３２６， ２０１９）、および外傷性脳傷害（Ｉｓｍａｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，３５（１１）：１２９４－１３０３，２０１８およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １７１０：１６３－１７２， ２０１９）を含む複数の中枢神経系の病気において役割を有することが示唆されている。
ＮＬＲＰ３はまた、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、アテローム性硬化症、肥満、痛風、偽痛風、代謝症候群（Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １３：３５２－３５７， ２０１２； Ｄｕｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４６４：１３５７－１３６１， ２０１０； Ｓｔｒｏｗｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４８１：２７８－２８６， ２０１２）、および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）（Ｍｒｉｄｈａ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ． ６６（５）：１０３７－４６，２０１７）を含む様々な代謝疾患に関与することが示されている。
ＩＬ－１βを介したＮＬＲＰ３の役割もまた、アテローム性硬化症（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， ６（９）：ｅ００６３４７， ２０１７；およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ３５ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ４９５（１）： ３８２－３８７， ２０１８)、心筋梗塞（ｖａｎ Ｈｏｕｔ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ． Ｈｅａｒｔ Ｊ， ３８（１１）：８２８－３６，２０１７）、心血管疾患（Ｊａｎｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ３７（２５）： １９５９－１９６７， ２０１６)、心肥大および線維症（Ｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， １８６４（１）： １－１０， ２０１８）、心不全（Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ． ７１（８）：８７５－６６，２０１８）、大動脈瘤および解離（Ｗｕ ｅｔ ａｌ． Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． ３７（４）：６９４－７０６， ２０１７）、代謝機能障害による心臓傷害（Ｐａｖｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ， ８（５９）： ９９７４０－９９７５６， ２０１７；およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １８６３（６）： １５５６－１５６７， ２０１７）、心房細動（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １３８（２０）： ２２２７－２２４２， ２０１８）、高血圧（Ｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， １８６４（１）： １－１０， ２０１８）、ならびに他の心血管病（Ｒｉｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．， ｄｏｉ：１０．１０５６／ ＮＥＪＭｏａ１７０７９１４， ２０１７）において示唆されている。
ＮＬＲＰ３が関与することが示されている他の疾患、障害および病気としては、
－ 湿潤型および乾燥型の両方の加齢黄斑変性（Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １８：７９１－７９８， ２０１２、およびＴａｒａｌｌｏ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ， １４９（４）：８４７－５９， ２０１２）、糖尿病性網膜症（Ｌｏｕｋｏｖａａｒａ ｅｔ ａｌ． Ａｃｔａ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，９５（８）：８０３－８０８，２０１７）、および視神経損傷（Ｐｕｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ，６：２０９９８， ２０１６ Ｆｅｂ １９）などの眼科疾患；
－ 非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）（Ｈｅｎａｏ－Ｍｅｉｊａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４８２：１７９－１８５， ２０１２）、肝臓の虚血性再灌流傷害（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， １０３（２）： ３５３－３６２， ２０１９）、劇症肝炎（Ｐｏｕｒｃｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， １５４（５）： １４４９－１４６４， ｅ２０， ２０１８）、肝線維症（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｒａｓｉｔ Ｖｅｃｔｏｒｓ， １２（１）： ２９， ２０１９）、および急性肝不全を含む肝不全（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌ Ｒｅｓ， ４８（３）： Ｅ１９４－Ｅ２０２， ２０１８）などの肝臓疾患；
－ 腎石灰化症（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ， ９３（３）： ６５６－６６９， ２０１８）、慢性結晶腎症を含む腎線維症（Ｌｕｄｗｉｇ－ Ｐｏｒｔｕｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ， ９０（３）： ５２５－３９， ２０１６）、肥満関連の糸球体症（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， ａｒｔｉｃｌｅ ３１７２６４７， ２０１９）、急性腎傷害（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ Ｏｂｅｓｉｔｙ： Ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， １２：１２９７－１３０９， ２０１９）、および腎性高血圧（Ｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， １７３（４）： ７５２－６５， ２０１６； Ｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ， １１５（４）： ７７６－７８７， ２０１９； Ｄｉｎｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｇｉｎｇ， ９（６）： １５９５－ １６０６，２０１７)などの腎臓疾患;
－ 糖尿病性脳病（Ｚｈａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２３（３）： ５２２， ２０１８）、糖尿病性網膜症（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ， ８（７）： ６２９４１， ２０１７）、糖尿病性腎症（糖尿病性腎臓病とも呼ばれる）（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｎｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １８：１９２， ２０１８）、および糖尿病性低アディポネクチン血症（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ （ＢＢＡ）－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ， １８６３（６）： １５５６－１５６７， ２０１７）などの糖尿病に関連する病気;
－ 肺虚血再灌流傷害（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ５０３（４）： ３０３１－３０３７， ２０１８）、上皮間葉転換（ＥＭＴ）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３６２（２）： ４８９－４９７， ２０１８）、接触過敏症（水疱性類天疱瘡など（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｃｉ，８３（２）：１１６－２３，２０１６））、アトピー性皮膚炎（Ｎｉｅｂｕｈｒ ｅｔ ａｌ． Ａｌｌｅｒｇｙ，６９（８）：１０５８－６７， ２０１４）、化膿性汗腺炎（Ａｌｉｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ６０（４）：５３９－６１，２００９）、尋常性ざ瘡（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１３４（２）：３８１－８８，２０１４）、およびサルコイドーシス（Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ， １９１：Ａ５８１６，２０１５）などの肺および皮膚における炎症反応（Ｐｒｉｍｉａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９７（６）：２４２１－３３，２０１６）；
－ 関節内の炎症反応（Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．， ３：１－１０， ２００４）および骨関節炎（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， １０８（３６）： １４８６７－１４８７２， ２０１１）；
－ 関節炎の熱（Ｖｅｒｍａ， Ｌｉｎｋｏｐｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｓ， Ｎｏ．１２５０， ２０１１）などの関節炎に関連する病気;
－ 筋萎縮性側索硬化症（Ｇｕｇｌｉａｎｄｏｌｏ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，４１（１）：９３－１０３，２０１８）；
－ 嚢胞性線維症（Ｉａｎｎｉｔｔｉ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ， ７：１０７９１，２０１６）；
－ 卒中（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， １５：８４－９７， ２０１４；Ｙｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ２９２： ４６－５５， ２０１７）；
－ 偏頭痛などの頭痛（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， １６： ７８， ２０１９）;
－ 慢性腎臓疾患（Ｇｒａｎａｔａ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（３）：ｅ０１２２２７２，２０１５）；
－ シェーグレン症候群（Ｖａｋｒａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ， ９１： ２３－３３， ２０１８）；
－ 移植片対宿主病（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ７：１３０９７， ２０１７）；
－ 鎌形赤血球症（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， １３０（Ｓｕｐｐｌ １）： ２２３４， ２０１７）;ならびに
－ 潰瘍性大腸炎およびクローン病（Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．， ３：１－１０， ２００４、Ｎｅｕｄｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．２１４（６）：１７３７－５２， ２０１７、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ， ２０１８： ３０４８５３２， ２０１８；およびＬａｚａｒｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｄｉｇ． Ｄｉｓ． Ｓｃｉ，６２（９）：２３４８－５６，２０１７）、および敗血症（腸管上皮の破壊)（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ， ６３（１）： ８１－９１， ２０１８）を含む大腸炎および炎症性腸疾患、
が挙げられる。
ＮＬＲＰ３の遺伝的除去が、ＨＳＤ（高糖食）、ＨＦＤ（高脂肪食）およびＨＳＦＤ誘導性肥満（Ｐａｖｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ， ８（５９）： ９９７４０－９９７５６， ２０１７）を防御することが示されている。
ＮＬＲＰ３インフラマソームは、酸化ストレス、日焼け（Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ４７７（３）： ３２９－３３５， ２０１６）、およびＵＶＢ照射（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３２７：２９６－３００， ２０１０）に応答して活性化されることも見出されている。
ＮＬＲＰ３はまた、炎症性痛覚過敏（Ｄｏｌｕｎａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， ４０： ３６６－３８６， ２０１７）、創傷治癒（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ， ２７（１）： ８０－８６， ２０１８）、熱傷治癒（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ， ２７（１）： ７１－７９， ２０１８）、アロディニア、多発性硬化症関連の神経因性疼痛（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｌａｍｍｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ２６（１）： ７７－８６， ２０１８）、慢性骨盤痛（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｓｔａｔｅ， ７９（１２）： １４３９－１４４９， ２０１９）および癌による骨痛（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １４７： １０４３３９， ２０１９）を含む疼痛、ならびに早産に関連する羊膜内炎症／感染（Ｆａｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ， １００（５）： １２９０－１３０５， ２０１９；およびＧｏｍｅｚ－Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ， １００（５）： １３０６－１３１８， ２０１９）に関与することが示されている。
インフラマソーム、および具体的にはＮＬＲＰ３は、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）を含むスタフィロコッカス・アウレウス（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２２（９）： ２４３１－２４４１， ２０１８；およびＲｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ， ３（７）： ｅ９７４７０， ２０，２０１８）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（ＴＢ）（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ， １０： ３７０９，２０２０）、バシラス・セレウス（Ｍａｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ４： ３６２－３７４， ２０１９）、サルモネラ・タイフィムリウム（Ｄｉａｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ Ｒｅｐ， ７（１）： ６８６１， ２０１７）、およびＡ群連鎖球菌（ＬａＲｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １（２）： ｅａａｈ３５３９， ２０１６）などの細菌病原体；ＤＮＡウイルス（Ａｍｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｆｕｔｕｒｅ Ｖｉｒｏｌ， ８（４）： ３５７－３７０， ２０１３）、インフルエンザＡウイルス（Ｃｏａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ８： ７８２， ２０１７）、チングニア、ロスリバーウイルス、およびアルファウイルス（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２（１０）： １４３５－１４４５， ２０１７）などのウイルス；カンジダ・アルビカンス（Ｔｕｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， ｍＳｐｈｅｒｅ， １（３）， ｐｉｉ：ｅ０００７４－１６， ２０１６) などの真菌病原体；ならびにＴ．ゴンディ（Ｇｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９（８）： ２８５５－２８６４， ２０１７）、蠕虫ワーム（Ａｌｈａｌｌａｆ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２３（４）： １０８５－１０９８， ２０１８）、リーシュマニア（Ｎｏｖａｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ， １３（２）：ｅ１００６１９６， ２０１７）、およびプラスモジウム（Ｓｔｒａｎｇｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， １１５（２８）：７４０４－７４０９， ２０１８）などの他の病原体を含む様々な病原体によるモジュレーションのための標的としても提案されている。ＮＬＲＰ３は、ウイルス、細菌、真菌、および蠕虫病原体感染の効率的制御に必要とされることが示されている（Ｓｔｒｏｗｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４８１： ２７８－２８６， ２０１２）。ＮＬＲＰ３活性はまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によるなどのウイルス感染への感受性の上昇に関連づけられている（Ｐｏｎｔｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ ３５ Ａｑｕｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ Ｓｙｎｄｒ， ５４（３）： ２３６－２４０， ２０１０）。ＨＩＶおよびマイコバクテリウム・ツベルクローシス（ＴＢ）に重複感染した患者の間での早期死亡のリスク上昇も、ＮＬＲＰ３活性に関連づけられている（Ｒａｖｉｍｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｐｅｎ Ｆｏｒｕｍ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， ５（５）： ｏｆｙ０７５， ２０１８)。
ＮＬＲＰ３はまた、多くの癌の病原性に関連づけられている（Ｍｅｎｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６６：１－１５， ２０１１；およびＭａｓｔｅｒｓ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２３－２２８ ２０１３）。例えば、複数の過去の試験は、癌の浸潤、成長および転移におけるＩＬ－１βの役割を示唆しており、カナキヌマブでのＩＬ－１βの阻害が、無作為化二重盲検プラセボ対照試験において肺癌発症率および全癌死亡率を低下させることが示されている（Ｒｉｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ，Ｓ０１４０－６７３６（１７）３２２４７－Ｘ，２０１７）。ＮＬＲＰ３インフラマソームまたはＩＬ－１βの阻害はまた、インビトロで肺癌細胞の増殖および遊走を阻害することが示されており（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ，３５（４）：２０５３－６４，２０１６）、ＮＬＲＰ３は、発癌性および転移のＮＫ細胞を介した制御を抑制することが示されている（Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ７２（２２）： ５７２１－３２， ２０１２）。ＮＬＲＰ３インフラマソームの役割は、骨髄異形成症候群において（Ｂａｓｉｏｒｋａ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ，Ｄｅｃ ２２；１２８（２５）：２９６０－２９７５，２０１６）、および神経膠腫（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５（１）：４４２－４４９，２０１５）、結腸癌（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ， ２０７（５）： １０４５－５６， ２０１０）、黒色腫（Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ， ３１４（１）： ２４－３３， ２０１２）、乳癌（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ６： ３６１０７， ２０１６）、炎症誘導性腫瘍（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２０７（５）：１０４５－５６，２０１０、およびＨｕ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ，１０７（５０）：２１６３５－４０，２０１０）、多発性骨髄腫（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２１（３）：１４４－５１，２０１６）、および頭頸部の扁平上皮癌（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，３６（１）：１１６，２０１７；およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ７５： ２０４５－２０５８，２０１８）を含む様々な他の癌の発癌性においても示唆されている。ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化はまた、５－フルオロウラシルへの腫瘍細胞の化学療法抵抗性を介在することが示されており（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，３６（１）：８１，２０１７）、末梢神経におけるＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化は、化学療法誘導性神経因性疼痛に寄与する（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｐａｉｎ，１３：１－１１，２０１７）。
したがって、先に列挙された疾患、障害または病気のいずれかが、本発明の第九～第十四の態様により処置または予防されてよい。ＮＬＲＰ３阻害に応答する可能性があり、本発明の第九～第十四の態様により処置または予防される可能性がある疾患、障害または病気の詳細な例としては：
（ｉ）炎症性障害の結果として生じた炎症、例えば自己炎症性疾患、非炎症性障害の症状として生じた炎症、感染の結果として生じた炎症、または外傷、傷害もしくは自己免疫性に続発した炎症を含む炎症；
（ｉｉ）急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、抗合成酵素症候群、再生不良性貧血、自己免疫性副腎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性多内分泌腺不全、自己免疫性甲状腺炎、小児セリアック病を含むセリアック病、クローン病、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、川崎病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含むエリテマトーデス、原発性進行性多発性硬化症（ＰＰＭＳ）、続発性進行性多発性硬化症（ＳＰＭＳ）および再発性寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を含む多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、視神経炎、オルド甲状腺炎、天疱瘡、悪性貧血、多発性関節炎、原発性胆汁性胆管炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎またはスチル病、難治性痛風関節炎、ライター病、シェーグレン症候群、全身性硬化症、全身性結合組織障害、高安関節炎、側頭動脈炎、温式自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫、全身性脱毛、ベーチェット病、シャーガス病、自律神経障害、子宮内膜症、化膿性汗腺炎（ＨＳ）、間質性膀胱炎、神経筋緊張症、乾癬、サルコイドーシス、強皮症、潰瘍性大腸炎、シュニッツラー症候群、マクロファージ活性化症候群、ブラウ症候群、白斑、または外陰部痛などの自己免疫性疾患；
（ｉｉｉ）肺癌、膵臓癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、骨髄異形成症候群、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む白血病、副腎癌、肛門癌、基底細胞および扁平上皮癌、頭頸部の扁平上皮癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳および脊髄腫瘍、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、目の癌、胆嚢癌、消化管悪性腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛疾患、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭および下咽頭癌、肝臓癌、肺悪性腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、悪性中皮腫、黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌、多発性骨髄腫、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔および口咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、精巣癌、脳下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞種、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、胸腺癌、未分化甲状腺癌を含む甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰部癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍を含む癌；
（ｉｖ）ウイルス感染（例えば、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、アルファウイルス（チクングニアおよびロスリバーウイルスなど）、フラビウイルス（デングウイルスおよびジカウイルスなど）、ヘルペスウイルス（エプスタイン・バー・ウイルス、サイトメガロウイルス、膵島帯状疱疹ウイルス、およびＫＳＨＶなど）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス（改変ワクシニアウイルスアンカラ）およびミクソーマウイルスなど）、アデノウイルス（アデノウイルス５など）、またはパピローマウイルス由来）、細菌感染（例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡを含む）、ヘリコバクター・ピロリ、バシラス・アントラシス、バシラス・セレウス、ボルダテラ・ペルツシス、ブルクホルデリア・シュードマレイ、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、クロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・ボツリヌム、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、リステリア・モノサイトゲネス、ヘモフィリス・インフルエンザ、パステウレラ・ムルトシダ、シゲラ・ディセンテリエ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・レプラエ、マイコプラズマ・ニューモニエ、マイコプラズマ・ホミニス、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノレア、リケッチア・リケッチイ、レジオネラ・ニューモフィラ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノサ、プロピオニバクテリウム・アクネス、トレポネーマ・パリダム、クラミジア・トラコマティス、ビブリオ・コレラ、サルモネラ・タイフィムリウム、サルモネラ・タイフィ、ボレリア・ブルグドルフェリ、尿路病原性エシェリヒア・コリ（ＵＰＥＣ）またはエルシニア・ペスティス由来）、真菌感染（例えば、カンジダまたはアスペルギルス種由来）、原生動物感染（例えば、プラスモジウム、バベシア、ギアルジア、エンタモエバ、リーシュマニア症またはトリパノソーム由来）、蠕虫感染（例えば、住血吸虫、回虫、条虫または吸虫由来）、プリオン感染、および前述のいずれかとの重複感染（例えば、ＨＩＶおよびマイコバクテリウム・ツベルクローシスとの）を含む感染；
（ｖ）パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、運動ニューロン疾患、ハンチントン病、脳マラリア、肺炎球菌性髄膜炎による脳傷害、頭蓋内動脈瘤、脳内出血、敗血症関連脳症、周術期神経認知障害、術後認知機能障害、早期脳損傷、外傷性脳傷害、脳虚血再灌流傷害、卒中、全身麻酔による神経炎症、および筋萎縮性側索硬化症などの中枢神経系疾患；
（ｖｉ）２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、アテローム性硬化症、肥満、痛風および偽痛風などの代謝疾患；
（ｖｉｉ）高血圧、虚血、ＭＩ後虚血性再灌流傷害を含む再灌流傷害、虚血性脳卒中を含む卒中、一過性虚血発作、再発性心筋梗塞を含む心筋梗塞、うっ血性心不全および駆出率が保持される心不全を含む心不全、心肥大および線維症、塞栓症、腹部大動脈瘤をはじめとする動脈瘤、代謝誘導性心傷害、およびドレスラー症候群を含む心膜炎などの心血管疾患；
（ｖｉｉｉ）慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性喘息、好酸球性喘息およびステロイド耐性喘息などの喘息、石綿症、珪肺、火山灰による炎症、ナノ粒子誘導性炎症、嚢胞性線維症および特発性肺線維症を含む呼吸器疾患；
（ｉｘ）進行性線維症ステージＦ３およびＦ４を含む非アルコール性脂肪肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アルコール性脂肪肝臓疾患（ＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、肝臓の虚血性再灌流傷害、劇症肝炎、肝線維症、および急性肝不全を含む肝不全を含む肝臓疾患；
（ｘ）慢性腎臓疾患、シュウ酸塩腎症、腎臓結石、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、肥満関連の糸球体症、慢性結晶腎症を含む腎線維症、急性腎不全、急性腎傷害、および腎性高血圧を含む腎臓疾患；
（ｘｉ）目の上皮の疾患、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）（乾燥型および湿潤型）、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎、角膜感染、糖尿病性腎症、視神経損傷、ドライアイ、および緑内障を含む眼科疾患；
（ｘｉｉ）接触皮膚炎およびアトピー性皮膚炎などの皮膚炎、接触過敏症、乾癬、日焼け、皮膚病変、化膿性汗腺炎（ＨＳ）、他の嚢胞誘発性皮膚疾患、壊疽性膿皮症および集簇性ざ瘡を含む尋常性ざ瘡を含む皮膚疾患；
（ｘｉｉｉ）リンパ管炎およびキャッスルマン病などのリンパ病；
（ｘｉｖ）うつ病および精神的ストレスなどの精神障害；
（ｘｖ）移植片対宿主病；
（ｘｖｉ）骨盤痛、痛覚過敏、機械的アロディニアを含むアロディニア、多発性硬化症関連の神経因性疼痛を含む神経因性疼痛、および癌による骨痛などの疼痛；
（ｘｖｉｉ）糖尿病性脳病、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性血管内皮機能不全、および糖尿病性低アディポネクチン血症などの糖尿病に関連する病気;
（ｘｖｉｉｉ）関節炎の熱などの関節炎に関連する病気；
（ｘｉｘ）群発頭痛、特発性頭蓋内圧亢進、片頭痛、低圧性頭痛（例えば、硬膜穿刺後）、結膜充血および流涙を伴う短時間持続性片側神経痛様頭痛発作（ＳＵＮＣＴ）、および緊張型頭痛を含む頭痛；
（ｘｘ）皮膚創傷および皮膚熱傷を含む、創傷および熱傷；ならびに
（ｘｖｉｉ）個体がＮＬＲＰ３の生殖系または体細胞系非サイレント変異を有すると決定された、任意の疾患、
が挙げられる。
一実施形態において、疾患、障害または病気は、
（ｉ）癌、
（ｉｉ）感染；
（ｉｉｉ）中枢神経系疾患；
（ｉｖ）心血管疾患；
（ｖ）肝臓疾患；
（ｖｉ）眼科疾患；または
（ｖｉｉ）皮膚疾患、
から選択される。
より典型的には、疾患、障害または病気は、
（ｉ）癌、
（ｉｉ）感染；
（ｉｉｉ）中枢神経系疾患；または
（ｉｖ）心血管疾患；
から選択される。
一実施形態において、疾患、障害または病気は、
（ｉ）集簇性ざ瘡；
（ｉｉ）アトピー性皮膚炎；
（ｉｉｉ）アルツハイマー病；
（ｉｖ）筋萎縮性側索硬化症；
（ｖ）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）；
（ｖｉ）未分化甲状腺癌；
（ｖｉｉ）クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）；
（ｖｉｉｉ）接触皮膚炎
（ｉｘ）嚢胞性線維症；
（ｘ）うっ血性心不全；
（ｘｉ）慢性腎臓疾患；
（ｘｉｉ）クローン病；
（ｘｉｉｉ）家族性寒冷自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）；
（ｘｉｖ）ハンチントン病；
（ｘｖ）心不全；
（ｘｖｉ）駆出率が保持される心不全；
（ｘｖｉｉ）虚血性再灌流傷害；
（ｘｖｉｉｉ）若年性特発性関節炎；
（ｘｉｘ）心筋梗塞；
（ｘｘ）マクロファージ活性化症候群；
（ｘｘｉ）骨髄異形成症候群；
（ｘｘｉｉ）多発性骨髄腫；
（ｘｘｉｉｉ）運動ニューロン病；
（ｘｘｉｖ）多発性硬化症；
（ｘｘｖ）マックル・ウェルズ症候群；
（ｘｘｖｉ）非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；
（ｘｘｖｉｉ）新生児期発症多臓器系炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）；
（ｘｘｖｉｉｉ）パーキンソン病；
（ｘｘｉｘ）鎌形赤血球症；
（ｘｘｘ）全身若年性特発性関節炎；
（ｘｘｘｉ）全身性エリテマトーデス；
（ｘｘｘｉｉ）外傷性脳傷害；
（ｘｘｘｉｉｉ）一過性虚血発作；
（ｘｘｘｉｖ）潰瘍性大腸炎；または
（ｘｘｘｖ）バロシン含有タンパク質疾患
から選択される。
本発明の第九～第十四の態様の別の実施形態において、処置または予防は、ウイルス感染への感受性の低減を含む。例えば処置または予防は、ＨＩＶ感染への感受性の低減を含んでよい。
本発明のさらなる典型的実施形態において、疾患、障害または病気は、炎症である。本発明の第九～第十四の態様に従い処置または予防され得る炎症の例としては、
（ｉ）接触過敏症、水疱性類天疱瘡、日焼け、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、扁平苔癬、強皮症、天疱瘡、表皮水疱症、じんましん、紅斑、または脱毛などの皮膚病；
（ｉｉ）骨関節炎、全身若年性特発性関節炎、成人発症スチル病、再発性多発性軟骨炎、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、痛風、または血清陰性脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎またはライター病）などの関節病；
（ｉｉｉ）多発性菌炎または重症筋無力症などの筋肉病；
（ｉｖ）炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、大腸炎、胃潰瘍、セリアック病、直腸炎、膵臓炎、好酸球性胃腸炎、マストサイトーシス、抗リン脂質症候群、または腸から離れた作用を有し得る食物関連アレルギー（例えば、偏頭痛、鼻炎または湿疹）などの消化管病；
（ｖ）慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息（好酸球性、気管支、アレルギー性、内因性、外因性または塵埃喘息、特に慢性または常習的な喘息、例えば遅発型喘息および気道過敏症を含む）、気管支炎、鼻炎（急性鼻炎、アレルギー性鼻炎、アトピー性鼻炎、慢性鼻炎、乾酪性鼻炎、肥厚性鼻炎、化膿性鼻炎（ｒｈｉｎｉｔｉｓ ｐｕｍｌｅｎｔａ）、乾燥性鼻炎、薬物性鼻炎、膜性鼻炎、季節性鼻炎、例えば枯れ草熱、および血管運動性鼻炎を含む）、副鼻腔炎、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、サルコイドーシス、農夫肺、珪肺、石綿症、火山灰による炎症、成人呼吸窮迫症候群、過敏性肺炎、または特発性間質性肺炎などの呼吸器系病；
（ｖｉ）アテローム性硬化症、ベーチェット病、脈管炎、またはウェゲナー肉芽腫などの血管病；
（ｖｉｉ）全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、全身性硬化症、橋本甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、特発性血小板減少性紫斑病、またはグレーブス病などの自己免疫病；
（ｖｉｉｉ）ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、または春季カタルなどの眼病；
（ｉｘ）多発性硬化症または脳脊髄炎などの神経病；
（ｘ）後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）、急性もしくは慢性細菌感染、急性もしくは慢性寄生虫感染、急性もしくは慢性ウイルス感染、急性もしくは慢性真菌感染、髄膜炎、肝炎（Ａ、ＢもしくはＣ型、または他のウイルス性肝炎）、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、連鎖球菌筋炎、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（マイコバクテリウム・ツベルクローシスとＨＩＶの重複感染を含む）、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ、ニューモシスチス・カリニ肺炎、精巣炎／精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、インフルエンザＡ型、エプスタイン・バー・ウイルス感染、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎、または骨盤内炎症性疾患などの感染または感染関連病；
（ｘｉ）メサンギウム増殖性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、肥満関連の糸球体症、急性腎不全、急性腎傷害、尿毒症、腎炎症候群、慢性結晶腎症を含む腎線維症、または腎性高血圧などの腎臓病；
（ｘｉｉ）キャッスルマン病などのリンパ病；
（ｘｉｉｉ）高ＩｇＥ症候群、ライ腫性ハンセン病、家族性血球貪食性リンパ組織球症、または移植片対宿主病などの、免疫系の病気または免疫系に関与する病気；
（ｘｉｖ）慢性活動性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アルコール誘導性肝炎、非アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、原発性胆汁性肝硬変、劇症肝炎、肝線維症、または肝不全などの肝臓病；
（ｘｖ）先に列挙されたそれらの癌を含む、癌；
（ｘｖｉ）熱傷、創傷、外傷、出血または卒中；
（ｘｖｉｉ）放射線照射；
（ｘｖｉｉｉ）２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、アテローム性硬化症、肥満、痛風または偽痛風などの代謝疾患；および／あるいは
（ｘｉｘ）炎症性痛覚過敏、骨盤痛、アロディニア、神経因性疼痛、または癌による骨痛などの疼痛、
に関連して、あるいはその結果として生じる炎症応答が挙げられる。
本発明の第九～第十四の態様の一実施形態において、疾患、障害または病気は、クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）、マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、家族性寒冷自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、新生児期発症多臓器系炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、高免疫グロブリンＤおよび周期性発熱症候群（ＨＩＤＳ）、インターロイキン１受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＲＡ）、マアジード症候群、化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・ざ瘡症候群（ＰＡＰＡ）、成人発症スチル病（ＡＯＳＤ）、Ａ２０ハプロ不全症（ＨＡ２０）、小児期肉芽腫性関節炎（ＰＧＡ）、ＰＬＣＧ２関連抗体欠損・免疫異常症（ＰＬＡＩＤ）、ＰＬＣＧ２関連自己炎症性抗体欠損・免疫異常症（ＡＰＬＡＩＤ）、またはＢ細胞免疫欠損・周期性発熱・発達遅延を伴う鉄芽球性貧血（ＳＩＦＤ）などの自己炎症性疾患である。
ＮＬＲＰ３阻害に応答性である可能性があり、かつ本発明の第九～第十四の態様により処置または予防される可能性がある疾患、障害または病気の例を、先に列挙している。これらの疾患、障害または病気の幾つかは、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性、ならびにＮＬＲＰ３誘導性ＩＬ－１βおよび／またはＩＬ－１８により実質的に、または全体として媒介される。結果として、そのような疾患、障害または病気は、ＮＬＲＰ３阻害に特に応答性である可能性があり、かつ本発明の第九～第十四の態様に従う処置または予防に特に適する可能性がある。そのような疾患、障害または病気の例としては、クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）、マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、家族性寒冷自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）、新生児期発症多臓器系炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・ざ瘡症候群（ＰＡＰＡ）、高免疫グロブリンＤおよび周期性発熱症候群（ＨＩＤＳ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、全身若年性特発性関節炎、成人発症スチル病（ＡＯＳＤ）、再発性多発性軟骨炎、シュニッツラー症候群、スウィート症候群、ベーチェット病、抗合成酵素症候群、インターロイキン１受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＲＡ）、およびＡ２０ハプロ不全症（ＨＡ２０）が挙げられる。
さらに、先に言及された疾患、障害または病気の幾つかは、ＮＬＲＰ３における変異により生じ、特にＮＬＲＰ３活性上昇をもたらす。その結果、そのような疾患、障害または病気は、ＮＬＲＰ３阻害に特に応答性である可能性があり、かつ本発明の第九～第十四の態様に従う処置または予防に特に適する可能性がある。そのような疾患、障害または病気の例としては、クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）、マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、家族性寒冷自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）、および新生児期発症多臓器系炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）が挙げられる。
本発明の第十五の態様は、ＮＬＲＰ３活性化を阻害するための、本発明の第六または第七の態様の化合物または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、あるいは本発明の第八の態様の医薬組成物の使用を含む、ＮＬＲＰ３活性化を阻害する方法を提供する。
本発明の第十五の態様の一実施形態において、方法は、１種または複数のさらなる活性剤と組み合わせた、本発明の第六または第七の態様の化合物または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、あるいは本発明の第八の態様の医薬組成物の使用を含む。
本発明の第十五の態様の一実施形態において、方法は、例えばＮＬＲＰ３阻害の細胞に及ぼす影響を分析するために、エクスビボまたはインビトロで実施される。
本発明の第十五の態様の別の実施形態において、方法は、インビボで実施される。例えば方法は、本発明の第六または第七の態様の化合物または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、あるいは本発明の第八の態様の医薬組成物の有効量を投与して、それによりＮＬＲＰ３を阻害するステップを含んでよい。一実施形態において、方法は、１種または複数のさらなる活性剤の有効量を共投与するステップをさらに含む。典型的には投与は、それを必要とする対象になされる。
あるいは、本発明の第十五の態様の方法は、非ヒト動物対象においてＮＬＲＰ３を阻害する方法であって、化合物、塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬組成物を非ヒト動物対象に投与するステップ、および場合により続いて非ヒト動物対象を損傷または殺処分するステップ、を含む、方法であってよい。典型的にはそのような方法は、場合により損傷または殺処分された非ヒト動物対象由来の１種または複数の組織または流体試料を分析するステップをさらに含む。一実施形態において、方法は、１種または複数のさらなる活性剤の有効量を共投与するステップをさらに含む。
本発明の十六の態様は、ＮＬＲＰ３の阻害における使用のための、本発明の第六または第七の態様の化合物または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、あるいは本発明の第八の態様の医薬組成物を提供する。典型的には使用は、対象への化合物、塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬組成物の投与を含む。一実施形態において、化合物、塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬組成物は、１種または複数のさらなる活性剤と共投与される。
本発明の第十七の態様は、ＮＬＲＰ３の阻害のための医薬の製造における、本発明の第六または第七の態様の化合物または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグの使用を提供する。典型的には阻害は、対象への化合物、塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬の投与を含む。一実施形態において、化合物、塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬は、１種または複数のさらなる活性剤と共投与される。
１種または複数のさらなる活性剤の使用または共投与を含む、本発明の第九～第十七の態様のいずれかの実施形態において、１種または複数のさらなる活性剤は、例えば１、２または３種の異なるさらなる活性剤を含んでよい。
１種または複数のさらなる活性剤は、互いの前に、同時に、連続で、または次に、かつ／あるいは本発明の第六または第七の態様の化合物または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、または本発明の第八の態様の医薬組成物の前に、同時に、連続で、または次に、使用または投与されてよい。１種または複数のさらなる活性剤が、本発明の本発明の第六または第七の態様の化合物または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグと同時に投与される場合、１種または複数のさらなる活性剤を追加的に含む本発明の第八の態様の医薬組成物が、投与されてよい。
１種または複数のさらなる活性剤の使用または共投与を含む、本発明の第九～第十七の態様のいずれかの一実施形態において、１種または複数のさらなる活性剤は、
（ｉ）化学療法剤；
（ｉｉ）抗体；
（ｉｉｉ）アルキル化剤；
（ｉｖ）代謝抑制剤；
（ｖ）血管新生阻害剤；
（ｖｉ）植物アルカロイドおよび／もしくはテルペノイド；
（ｖｉｉ）トポイソメラーゼ阻害剤；
（ｖｉｉｉ）ｍＴＯＲ阻害剤；
（ｉｘ）スチルベノイド；
（ｘ）ＳＴＩＮＧアゴニスト；
（ｘｉ）癌ワクチン；
（ｘｉｉ）免疫調整剤；
（ｘｉｉｉ）抗生物質；
（ｘｉｖ）抗真菌剤；
（ｘｖ）駆虫薬；ならびに／または
（ｘｖｉ）他の活性剤、
から選択される。
活性剤の大まかな分類に従い定義されたこれらの一般的実施形態が互いに排他的でないことは、察知されよう。これに関連して、任意の特別な活性剤が、上記一般的実施形態の１つより多くに従い分類されてよい。非限定的例は、癌の処置のための免疫調整剤である、抗体のウレルマブである。
理解される通り、さらなる活性剤が小さな化学物質である場合、以下の具体的な小さな化学物質への任意の言及が、具体的な小さな化学物質の全ての塩、水和物、溶媒和物、多形およびプロドラッグ形態を包含することが、理解されなければならない。同様に、さらなる活性剤がモノクローナル抗体などの生物学的薬剤である場合、以下の具体的な生物学的薬剤への任意の言及が、全てのバイオシミラーを包含することが、理解されなければならない。
幾つかの実施形態において、１種または複数の化学療法剤は、アビラテロン酢酸エステル、アルトレタミン、アムサクリン、アンヒドロビンブラスチン、アウリスタチン、アザシチジン、５－アザシチジン、アザチオプリン、アドリアマイシンン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－バリル－Ｌ－バリル－Ｎ－メチル－Ｌ－バリル－Ｌ－プロリル－Ｌ－プロリン－ｔ－ブチルアミド、シスプラチン、カルボプラチン、カルボプラチン・シクロホスファミド、クロラムブシル、カケクチン、セマドチン、シクロホスファミド、カルムスチン、クラドリビン、クリプトフィシン、シタラビン、ドセタキセル、ドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）、ドキソルビシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ドラスタチン、エトポシド、リン酸エトポシド、エンザルタミド（ＭＤＶ３１００）、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、ゲムシタビン、ヒドロキシウレアおよびヒドロキシウレアタキサン（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａｔａｘａｎｅｓ）、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、イキサゾミブ、レナリドミド、レナリドミド・デキサメタゾン、ロイコボリン、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ラロタキセル（ＲＰＲ１０９８８１）、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、メルファラン、ミボブリン、３’，４’－ジデヒドロ－４’－デオキシ－８’－ノルビン－カロイコブラスチン、ニルタミド、オキサリプラチン、オナプリストン、プレドニムスチン、プロカルバジン、パクリタキセル、白金含有抗癌剤、２，３，４，５，６－ペンタフルオロ－Ｎ－（３－フルオロ－４－メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、プレドニムスチン、プロカルバジン、レブリミド、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、リン酸ストラムスチン、トレチノイン、タソネルミン、タキソール、トポテカン、タモキシフェン、テニポシド、タキサン、テガフル／ウラシル、サリドマイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、および／またはビンフルニンから選択される。
代わりまたは追加として、１種または複数の化学療法剤は、ＣＤ５９補体フラグメント、フィブロネクチンフラグメント、ｇｒｏ－ベータ（ＣＸＣＬ２）、ヘパリナーゼ、ヘパリン六糖フラグメント、ヒトコリン作動性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロンアルファおよびインターフェロンベータなどのＩ型インターフェロンリガンド、Ｉ型インターフェロンミメティック、インターフェロンガンマなどのＩＩ型インターフェロンリガンド、ＩＩ型インターフェロンミメティック、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ－１０）、クリングル５（プラスミノーゲンフラグメント）、メタロプロテイナーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）、２－メトキシエストラジオール、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、血小板第四因子（ＰＦ４）、プロラクチン１６ｋＤフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、様々なレチノイド、テトラヒドロコルチゾール－Ｓ、トリンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、トランスフォーミング成長因子－ベータ（ＴＧＦ－β）、バスキュロスタチン、バソスタチン（カルレチキュリンフラグメント）、サイトカイン（インターロイキン－１、インターロイキン－２、インターロイキン－５、インターロイキン－１０、インターロイキン－１２、およびインターロイキン－３３）、インターロイキン－１リガンドおよびミメティック（リロナセプト、アナキンラ、およびアナキンラ・デキサメタゾン）、インターロイキン－２リガンドおよびミメティック、インターロイキン－５リガンドおよびミメティック、インターロイキン－１０リガンドおよびミメティック、インターロイキン－１２リガンドおよびミメティック、ならびに／またはインターロイキン－３３リガンドおよびミメティックから選択されてよい。
幾つかの実施形態において、１種または複数の抗体は、１種または複数のモノクローナル抗体を含んでよい。幾つかの実施形態において、１種または複数の抗体は、抗ＴＮＦαおよび／または抗ＩＬ－６抗体、特に抗ＴＮＦαおよび／または抗ＩＬ－６モノクローナル抗体である。幾つかの実施形態において、１種または複数の抗体は、アバタセプト、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、アトリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ブレツキシマブ・ベドチン、ブロダルマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ・ペゴル、ダクリズマブ、デノスマブ、デュピルマブ、ドゥルバルマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エロツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、グセルクマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、イクセキズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ－ＣＤ３、ナタリズマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕａｂ）、ペムブロリズマブ、ラニビズマブ、レスリズマブ、リサンキズマブ、リツキシマブ、サリルマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、チルドラキズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、および／またはウステキヌマブから選択される。
幾つかの実施形態において、１種または複数のアルキル化剤は、例えば癌細胞を含む、細胞中に存在する条件下で、求核官能基をアルキル化できる薬剤を含んでよい。幾つかの実施形態において、１種または複数のアルキル化剤は、シスプラチン、カルボプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミドおよび／またはオキサリプラチンから選択される。幾つかの実施形態において、アルキル化剤は、生物学的に重要な分子中のアミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、および／またはリン酸基と共有結合を形成することにより、細胞機能を減じることにより機能してよい。幾つかの実施形態において、アルキル化剤は、細胞のＤＮＡを修飾することにより機能してよい。
幾つかの実施形態において、１種または複数の代謝抑制剤は、ＲＮＡまたはＤＮＡ合成に影響を及ぼす、またはそれを予防することができる薬剤を含んでよい。幾つかの実施形態において、１種または複数の代謝抑制剤は、アザチオプリンおよび／またはメルカプトプリンから選択される。
幾つかの実施形態において、１種または複数の血管新生阻害剤は、サリドマイド、レナリドミド、エンドスタチン、アンギオゲニン阻害剤、アンジオアレスチン、アンギオスタチン（プラスミノーゲンフラグメント）、基底膜コラーゲン由来血管新生阻害因子（ツムスタチン、カンスタチン、またはアレスタチン）、血管新生抑制アンチトロンビンＩＩＩ、および／または軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）から選択される。
幾つかの実施形態において、１種または複数の植物アルカロイドおよび／またはテルペノイドは、微細管機能を予防してよい。幾つかの実施形態において、１種または複数の植物アルカロイドおよび／またはテルペノイドは、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシンおよび／またはタキサンから選択される。幾つかの実施形態において、１種または複数のビンカアルカロイドは、マダガスカルニチニチソウ、ニチニチソウ（以前は、ニチニチカとして知られた）に由来してよく、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよび／またはビンデシンから選択されてよい。幾つかの実施形態において、１種または複数のタキサンは、タキソール、パクリタキセル、ドセタキセル、および／またはオルタタキセルから選択される。幾つかの実施形態において、１種または複数のポドフィロトキシンは、エトポシドおよび／またはテニポシドから選択される。
幾つかの実施形態において、１種または複数のトポイソメラーゼ阻害剤は、Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤および／またはＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤から選択され、ＤＮＡスーパーコイリングを妨害することによりＤＮＡの転写および／または複製を妨害してよい。幾つかの実施形態において、１種または複数のＩ型トポイソメラーゼ阻害剤は、エキサテカン、イリノテカン、ルルトテカン、トポテカン、ＢＮＰ１３５０、ＣＫＤ６０２、ＤＢ６７（ＡＲ６７）および／またはＳＴ１４８１から選択され得るカンプトテシンを含んでよい。幾つかの実施形態において、１種または複数のＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤は、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシドおよび／またはテニポシドから選択され得るエピポドフィロトキシンを含んでよい。
幾つかの実施形態において、１種または複数のｍＴＯＲ（ラパマイシンの機構的標的としても知られる、ラパマイシンの哺乳動物ターゲット）阻害剤は、ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムスおよび／またはデフォロリムスから選択される。
幾つかの実施形態において、１種または複数のスチルベノイドは、レスベラトロール、ピセアタンノール、ピノシルビン、プテロスチルベン、アルファ－ビニフェリン、アムペロプシンＡ、アムペロプシンＥ、ジプトインドネシンＣ、ジプトインドネシンＦ、イプシロン－ビニフェリン、フレクスオソールＡ、グネチンＨ、ヘムスレイアノールＤ、ホペアフェノール、トランス－ジプトインドネシンＢ、アストリンギン、ピセイドおよび／またはジプトインドネシンＡから選択される。
幾つかの実施形態において、１種または複数のＳＴＩＮＧ（膜貫通タンパク質（ＴＭＥＭ）１７３としても知られる、インターフェロン遺伝子の刺激物質）アゴニストは、以下の修飾特性：２’－Ｏ／３’－Ｏ結合、ホスホロチオアート結合、アデニンおよび／またはグアニン類似体、および／または２’－ＯＨ修飾（例えば、メチル基での２’－ＯＨ保護、または－Ｆもしくは－Ｎ３による２’－ＯＨの置き換え）の１つまたは複数を含み得る、ｃ－ジ－ＡＭＰ、ｃ－ジ－ＧＭＰ、およびｃＧＡＭＰなどの環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ならびに／または修飾環状ジヌクレオチドを含んでよい。幾つかの実施形態において、１種または複数のＳＴＩＮＧアゴニストは、ＢＭＳ－９８６３０１、ＭＫ－１４５４、ＡＤＵ－Ｓ１００、ｄｉＡＢＺＩ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、および／または２’３’－ｃＧＡＭＰから選択される。
幾つかの実施形態において、１種または複数の癌ワクチンは、ＨＰＶワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｏｎｃｏｐｈａｇｅおよび／またはＰｒｏｖｅｎｇｅから選択される。
幾つかの実施形態において、１種または複数の免疫調整剤は、免疫チェックポイント阻害剤を含んでよい。免疫チェックポイント阻害剤は、例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチン３（ＴＩＭ３またはＨＡＶＣＲ２）、ガレクチン９、ホスファチジルセリン、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ３）、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＬ１Ａ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ８０、ＣＤ２４４、ＣＤ４８、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＴＭＩＧＤ２、ＨＨＬＡ２、ＴＭＩＧＤ２、ブチロフィリン（ＢＴＮＬ２を含む）、シグレックファミリーメンバー、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、ＩＬＴ、白血球免疫グロブリン様受容体、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＤ２８、ＣＤ８６、ＳＩＲＰＡ、ＣＤ４７、ＶＥＧＦ、ニューロピリン、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＸＣＲ４、および／またはＣＸＣＬ１２を含む、免疫チェックポイント受容体、または受容体の組み合わせを標的にしてよい。
幾つかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ウレルマブ、ＰＦ－０５０８２５６６、ＭＥＤＩ６４６９、ＴＲＸ５１８、バルリルマブ、ＣＰ－８７０８９３、ペンブロリズマブ（ＰＤ１）、ニボルマブ（ＰＤ１）、アテゾリズマブ（以前は、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）（ＰＤ－Ｌ１）、ＭＥＤＩ４７３６（ＰＤ－Ｌ１）、アベルマブ（ＰＤ－Ｌ１）、ＰＤＲ００１（ＰＤ１）、ＢＭＳ－９８６０１６、ＭＧＡ２７１、リリルマブ、ＩＰＨ２２０１、エマクツズマブ、ＩＮＣＢ０２４３６０、ガルニセルチブ、ウロクプルマブ、ＢＫＴ１４０、バビツキシマブ、ＣＣ－９０００２、ベバシズマブ、および／またはＭＮＲＰ１６８５Ａから選択される。
幾つかの実施形態において、１種または複数の免疫調整剤は、補体経路モジュレータ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）を含んでよい。補体経路モジュレータは、補助活性化経路をモジュレートする。補体経路モジュレータは、Ｃ３および／もしくはＣ３ａおよび／もしくはＣ３ａＲ１受容体の活動を遮断するように作用してよく、またはＣ５および／もしくはＣ５ａおよび／もしくはＣ５ａＲ１受容体の活動を遮断するように作用してよい。幾つかの実施形態において、補体経路モジュレータは、Ｃ５補体経路モジュレータであり、エクリズマブ、ラブリズマブ（ＡＬＸＮ１２１０）、ＡＢＰ９５９、ＲＡ１０１４９５、テシドルマブ（ＬＦＧ３１６）、Ｚｉｍｕｒａ、クロバリマブ（ＲＯ７１１２６８９）、ポゼリマブ（ＲＥＧＮ３９１８）、ＧＮＲ－０４５、ＳＯＢＩ００５、および／またはコバーシンから選択されてもよい。幾つかの実施形態において、補体経路モジュレータは、Ｃ５ａ補体経路モジュレータであり、セムジシラン（ＡＬＮ－ＣＣ５）、ＩＦＸ－１、ＩＦＸ－２、ＩＦＸ－３、および／またはオレンダリズマブ（ＡＬＸＮ１００７）から選択されてよい。幾つかの実施形態において、補体経路モジュレータは、Ｃ５ａＲ１補体経路モジュレータであり、ＡＬＳ－２０５、Ｍ０Ｒ－２１０／ＴＪ２１０、ＤＦ２５９３Ａ、ＤＦ３０１６Ａ、ＤＦ２５９３Ａ、アバコパン（ＣＣＸ１６８）、および／またはＩＰＨ５４０１から選択されてよい。
幾つかの実施形態において、１種または複数の免疫調整剤は、抗ＴＮＦα剤を含んでよい。幾つかの実施形態において、抗ＴＮＦα剤は、抗体またはその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、可溶性ＴＮＦα受容体（例えば、可溶性ＴＮＦＲ１または可溶性ＴＮＦＲ２）、阻害性核酸、または低分子ＴＮＦαアンタゴニストであってよい。幾つかの実施形態において、阻害性核酸は、リボザイム、低分子ヘアピンＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンス核酸、またはアプタマーであってよい。幾つかの実施形態において、抗ＴＮＦα剤は、アダリムマブ、セルトリズマブ・ペゴル、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ＣＤＰ５７１、およびそれらのバイオシミラー（アダリムマブ－ａｄｂｍ、アダリムマブ－ａｄａｚ、アダリムマブ－ａｔｔｏ、エタネルセプト－ｓｚｚｓ、インフリキシマブ－ａｂｄａおよびインフリキシマブ－ｄｙｙｂなど）から選択される。
幾つかの実施形態において、１種または複数の免疫調整剤は、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、レボフロキサシンおよび／またはロキシスロマイシンを含んでよい。
幾つかの実施形態において、１種または複数の抗生物質は、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲルダナマイシン、ヘルビマイシン、リファキシミン、ロラカルベフ、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム、シラスタチン、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロティン（ｃｅｆａｌｏｔｉｎ）、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、セフタロリン・フォサミル、セフトビプロール、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、ダルババンシン、オリタバンシン、クリンダマイシン、リノコマイシン、ダプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、アズトレオナム、フラゾリドン、ニトロフラントイン、リネゾリド、ポシゾリド、ラデゾリド、トレゾリド、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、テモシリン、チカルシリン、カルブラナート、アンピシリン、スバクタム（ｓｕｂｂａｃｔａｍ）、タゾバクタム、チカルシリン、クラブラナート、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ，シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジキシン酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファジメトキシン、スルファメトキサゾール、スルファナミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム－スルファメトキサゾール、スルホンアミドクリソイジン、デメクロサイクリン、ミノサイクリン、オイテトラサイクリン（ｏｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、テトラサイクリン、クロファジミン、ダプソン、ダプレオマイシン（ｄａｐｒｅｏｍｙｃｉｎ）、シクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、ストレプトマイシン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン、ダルホプリスチン（ｄａｌｏｐｒｉｓｔｉｎ）、チアンフェニコール、チゲシサイクリン、チニダゾール、トリメトプリム、および／またはテキソバクチンから選択される。
幾つかの実施形態において、１種または複数の抗生物質は、１種または複数の細胞傷害性抗生物質を含んでよい。幾つかの実施形態において、１種または複数の細胞傷害性抗生物質は、アクチノマイシン、アントラセンジオン、アントラサイクリン、サリドマイド、ジクロロ酢酸、ニコチン酸、２－デオキシグルコース、および／またはクロファジミンから選択される。幾つかの実施形態において、１種または複数のアクチノマイシンは、アクチノマイシンＤ、バシトラシン、コリスチン（ポリミキシンＥ）および／またはポリミキシンＢから選択される。幾つかの実施形態において、１種または複数のアントラセンジオンは、ミトキサントロンおよび／またはピクサントロンから選択される。幾つかの実施形態において、１種または複数のアントラサイクリンは、ブレオマイシン、ドキソルビシ（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、プリカマイシンおよび／またはバルルビシンから選択される。
幾つかの実施形態において、１種または複数の抗真菌剤は、ビフォナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポジコナゾール（ｅｐｏｚｉｃｏｎａｚｏｌｅ）、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブスコナゾール（ｒａｖｕｓｃｏｎａｚｏｌｅ）、テルコナゾール、ボリコナゾール、アバファンギン、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギン、安息香酸、シクロピロックス、フルシトシン、５－フルオロシトシン、グリセオフルビン、ハロプロギン、トルナフラート（ｔｏｌｎａｆｌａｔｅ）、ウンデシレン酸、および／またはペルーバルサムから選択される。
幾つかの実施形態において、１種または複数の駆虫薬は、ベンゾイミダゾール（アルベンダゾール、メベンダゾール、チアベンダゾール、フェンベンダゾール、トリクラベンダゾール、およびフルベンダゾールを含む）、アバメクチン、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン、スラミン、パモ酸ピランテル、レバミゾール、サリチルアニリド（ニクロサミドおよびオキシクロザニドを含む）、および／またはニタゾキサニドから選択される。
幾つかの実施形態において、他の活性剤は、成長阻害剤、抗炎症剤（非ステロイド系抗炎症剤、低分子抗炎症剤（コルヒチンなど）、および例えばＴＮＦ、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１７またはＩＬ－３３を標的とする、抗炎症性生物学的製剤を含む）、ＪＡＫ阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＣＡＲ Ｔ治療薬、抗乾癬剤（アントラリンおよびその誘導体を含む）、ビタミンおよびビタミン誘導体（レチノイドおよびＶＤＲ受容体リガンドを含む）、ステロイド、コルチコステロイド、グルココルチコイド（デキサメタゾン、プレドニゾンおよびトリアムシノロン・アセトニドなど）、イオンチャネルブロッカー（カリウムチャネルブロッカーを含む）、免疫系調節剤（シクロスポリン、ＦＫ５０６、およびグルココルチコイドを含む）、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト（ロイプロリジン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｉｎｅ）、ゴセレリン、トリプトレリン、ヒストレリン、ビカルタミド、フルタミド、および／またはニルタミドなど）、ホルモン（エストロゲンを含む）、および／または尿酸降下薬（アロプリノールなど）から選択される。
他に断りがなければ、本発明の第九～第十七の態様のいずれかにおいて、対象は、任意のヒトまたは他の動物であってよい。典型的には対象は、哺乳動物、より典型的にはヒトまたは家畜の哺乳動物、例えばウシ、ブタ、子羊、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウスなどである。最も典型的には、対象は、ヒトである。
本発明で用いられる医薬のいずれもが、経口、非経口（静脈内、皮下、筋肉内、皮内、気管内、腹腔内、関節内、頭蓋内、および硬膜外を含む）、気道（エアロゾル）、直腸、膣、眼または局所投与（経皮、口腔、粘膜、舌下および局所眼投与を含む）により投与され得る。
典型的には、選択される投与様式は、処置または予防される障害、疾患または病気に最も適するものである。１種または複数のさらなる活性剤が投与される場合、投与様式は、本発明の化合物、塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬組成物の投与様式と同じであっても、または異なっていてもよい。
本発明の化合物、塩、溶媒和物またはプロドラッグの用量は、もちろん、処置または予防される疾患、障害または病気に応じて変動するであろう。一般に適切な用量は、０．０１～５００ｍｇ／レシピエント体重ｋｇ／日の範囲であろう。所望の用量は、１日おき、１日１回、１日２回、１日３回、または１日４回などの、適当な間隔をあけて供与されてよい。所望の用量が、例えば、投与剤形あたり１ｍｇ～５０ｇの有効成分を含有する、単位投与剤形中で投与されてよい。
疑念を避けるために、実行可能な限りにおいて、本発明の所与の態様の任意の実施形態は、本発明の同じ態様の任意の他の実施形態と組み合わせて起こってよい。加えて、実行可能な限りにおいて、本発明の任意の態様の任意の好ましい、典型的な、または任意選択による実施形態は、本発明の任意の他の態様の好ましい、典型的な、または任意選択による実施形態と見なされるべきであることが、理解されなければならない。
本発明の実施形態を、ここに添付の図面を参照して記載するが、それは例示に過ぎない。
メタノール中の光分解溶液中のＭＣＣ７８４０、ＭＣＣ９５０、ＩＺ１２０１およびＩＺ１４３８、ならびにそれらの光産物の構造； 過剰なＭＣＣ９５０またはＭＣＣ７８４０を含む、または含まない、光プローブＩＺ１２０１またはＩＺ１４３８で光標識されたｈＮＬＲＰ３を示すゲル内蛍光スキャニング； ｈＮＬＲＰ３に対応するゲルバンド中で同定されたタンパク質の順位分布（Ｒｎａｋ Ｏｒｄｅｒ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）； ＭＣＣ７８４０と競合させたＩＺ１４３８での組換えｈＮＬＲＰ３標識後のインタクトおよびＩＺ１４３８修飾ｈＮＬＲＰ３ペプチド１９５ＴＣＥＳＰＶＳＰＩＫ２０４のＭＳ１強度値； ｈＮＬＲＰ３のインタクトまたはＩＺ１４３８修飾ペプチドＴＣＥＳＰＶＳＰＩＫについてのＭＳ２スペクトル； 過剰発現するＨＥＫ細胞の上清（Ａ）およびカラム溶出画分（Ｂ）中のＮＬＲＰ３の存在の確認； ２種の異なる抗体（ＡおよびＢ）を用いた、過剰発現するＨＥＫ細胞の上清中のＮＬＲＰ３の存在および対照非トランスフェクトＨＥＫ細胞中の非存在の確認； 放射性リガンド結合アッセイの最適化； 放射性リガンド結合試験における組織直線性； 非トランスフェクトＨＥＫ分解物を用いた放射性リガンド結合試験のバックグランド評定； 結合飽和試験； 放射性リガンド結合のＡＴＰ競合； 予測されたリガンド結合部位を含むＮＬＲＰ３モデル； ＮＬＲＣ４およびＮＯＤ２構造の両方についてのＡＤＰのＸ線結晶構造解析法での構造と重ね合わせた、最も可能性の高いリガンド結合部位の予測によるＮＬＲＰ３モデル； Ｗａｌｋｅｒ ＡモチーフとＨｉｓ５２２残基の間に位置するスルホニルウレア基を含む、活性部位内にモデル化されたＭＣＣ９５０を含むＮＬＲＰ３モデル； 結合部位の付近にあると同定されたクリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）に関連する変異の選択を含むＮＬＲＰ３モデル。
実施例
実施例１：光親和性標識質量分析（ＰＡＬＭＳ）
概要
この試験の目的は、光親和性標識質量分析（ＰＡＬＭＳ）を適用して、ＭＣＣ７８４０とヒトＮＬＲＰ３（ｈＮＬＲＰ３）との相互作用を検証すること、およびｈＮＬＲＰ３のＭＣＣ７８４０結合部位に寄与するアミノ酸残基を同定することであった。
当業者に知られる通り、ＰＡＬＭＳは、光反応性基およびレポーター官能基を有する、生物活性リガンド（光親和性プローブ）の類似体を利用する。光親和性プローブは、親分子の構造－活性関連性に基づき設計および合成される。組み込まれた光反応性基およびレポーター官能基が、非誘導体化リガンドと比較して、受容体へのリガンドの結合親和性およびその機能性を有意に改変しないことを立証することが、重要である。ＰＡＬＭＳの間、光親和性プローブを、組換えタンパク質ターゲットとインキュベートし、ＵＶ光を照射する。複合体形成に続いて、光反応性基のＵＶ照射は、高反応生化学種（例えば、カルベン、ニトレン、またはラジカル）を生じ、それは高親和性プローブをその高分子結合パートナーに共有結合で架橋させる。光架橋されたタンパク質ターゲットを、蛍光タグまたはエピトープタグ（例えば、ＴＡＭＲＡ、ビオチン）でのクリックケミストリーによりタグ付けし、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびゲル内蛍光スキャニングまたはウエスタンブロッティングを用いてレポーター基により視覚化できる。プローブとタンパク質パートナーの間の共有結合形成は、次の、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いる結合ポケットにおけるプローブ修飾ペプチドおよびアミノ酸の同定を可能にする。光親和性標識事象の機能的選択性を、対照試料中の競合物質の添加を通してモニタリングし得る。
試験計画
第一のステップで、２種の光感受性プローブを用いる組換えｈＮＬＲＰ３の光標識の実験条件を、最適化した。第二のステップで、ｈＮＬＲＰ３の光標識を、２種の光感受性プローブの１種を用いて実行し、光標識されたペプチド（複数可）／アミノ酸（複数可）を、ラベルフリー定量ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により同定した。
Figure 2022528507000002
方法
ＭＣＣ７８４０の光活性化可能類似体を、ＭＣＣ７８４０のＳＡＲに基づき設計および合成した。親分子ＭＣＣ７８４０の生物学的ホールマークを保持する（細胞ＩＬ－１β放出アッセイで評価される）、２種の光プローブＩＺ１２０１およびＩＺ１４３８を、Ｓｆ２１細胞中で生成された精製組換えｈＮＬＲＰ３（６Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－ＴＥＶ－ＮＬＲＰ３［１２５－１０３６］）で光親和性標識実験を実施するために選択した。ｈＮＬＲＰ３の効率的な光標識を確実にするために、最適化条件を、さらなるＰＡＬ－ＭＳ実験：過剰な親薬物ＭＣＣ７８４０ ５０μＭを含む、または含まない２５μＭ ＩＺ１４３８での３０分間の処置、のために選択した。タンパク質消化の後、プローブ標識ペプチドを、ラベルフリー定量質量分析（ＭＳ）により分析した。マスシフト４３８．１７２７ｍ／ｚを有するペプチド付加体を、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウエアで分析し、続いてＣＩＤフラグメンテーションスペクトルを手作業で解釈した。
結果
■ プローブ中のミニマリスト二官能性光架橋剤は、ＴＨＰ－１細胞内でのＩＬ－１β放出アッセイで示された通り、細胞条件下で、親化合物に比較して標的エンゲージメントへの負の影響をほとんど有さなかった。
■ ＩＺ１２０１およびＩＺ１４３８は、生存細胞においてＭＣＣ７８４０と標的との相互作用を付与し得る、細胞透過性プローブである。
■ ３６５ｎｍでのＵＶ照射の際、ＩＺ１２０１およびＩＺ１４３８は、カルベン中間体を発生し、それは次にエチレン生成物中に再配置するか、または溶媒分子と反応して、メタノールまたはケトン生成物と高安定性のＣ－Ｏ共有結合を形成する。
■ ＩＺ１２０１およびＩＺ１４３８は、組換えｈＮＬＲＰ３に結合し、それらの結合は、親化合物ＭＣＣ７８４０およびＮＬＲＰ３特異性阻害剤ＭＣＣ９５０により阻害される。
■ ＭＳ１分析の間、１種の修飾ペプチド１９５ＴＣＥＳＰＶＳＰＩＫ２０４が、ＩＺ１４３８の分子量 －（マイナス） Ｎ２に対応する＋４３８，１７２７ｍ／ｚの特徴的マスシフトを有して同定された。
■ プローブ修飾ペプチドは、対照試料中では検出されず、ＭＣＣ７８４０の存在下（つまりＩＺ１４３８と競合する）ではあまり豊富でなかった。
■ ＭＳ２分析の間、修飾ペプチドが、ＣＩＤフラグメンテーションによりペプチドに付着されたプローブの切断から生じる＋２６５，０５８２ｍ／ｚの特徴的マスシフトを有して同定された。
■ プローブ修飾ペプチドおよびそのインタクト同等物のＭＳ２分析は、Ｅ１９７への２６５．０５８２m/zの付加体の部位を定位した。
結論（概要）
これらの結果は、ＩＺ１４３８が、ＭＣＣ７８４０と競合する様式でｈＮＬＲＰ３におけるＥ１９７を光標識することを実証する。
詳細
ＰＡＬＭＳは、光反応性基およびレポーター官能基を有する光親和性プローブ（生物活性リガンド（低分子、ペプチド）の類似体）を利用する。光親和性プローブを、親分子の構造－活性関連性に基づき設計および合成する。組み込まれた光反応性基およびレポーター官能基が、非誘導体化リガンドと比較して、受容体へのリガンドの結合親和性およびその機能性を有意に改変しないことを立証することが重要である。ＰＡＬＭＳの間、光親和性プローブを、組換えタンパク質ターゲットとインキュベートし、ＵＶ光を照射する。複合体形成に続いて、光反応性基のＵＶ照射は高反応生化学種（例えば、カルベン、ニトレン、またはラジカル）を生じ、それは高親和性プローブをその高分子結合パートナーに共有結合で架橋させる。光架橋されたタンパク質ターゲットを、蛍光タグまたはエピトープタグ（例えば、ＴＡＭＲＡ、ビオチン）でのクリックケミストリーによりタグ付けし、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびゲル内蛍光スキャニングまたはウエスタンブロッティングを用いてレポーター基により視覚化できる。プローブとタンパク質パートナーの間の共有結合形成は、次の、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いる結合ポケットにおけるプローブ修飾ペプチドおよびアミノ酸の同定を可能にする。光親和性標識事象の機能的選択性を、対照試料中の競合物質の添加を通してモニタリングし得る。
材料と方法
材料
Ｓｆ２１昆虫細胞株中で生成された組換えｈＮＬＲＰ３［６Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－ＴＥＶ－ＮＬＲＰ３（１２５－１０３６）、分子量１１６，９２９Ｄａ］を、使用まで１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＤＴ中、－８０℃で貯蔵した。２種の異なるバッチを、試験に使用した：バッチ１（０．４６ｍｇ／ｍＬ；４μＭ）およびバッチ２（０．２０ｍｇ／ｍＬ；２μＭ）。光プローブＩＺ１２０１およびＩＺ１４３８、ならびに親化合物ＭＣＣ９５０およびＭＣＣ７８４０は、Ｉｎｆｌａｚｏｍｅにより提供された（表Ａ）。
Figure 2022528507000003
組換えヒトＮＬＲＰ３の光親和性標識
組換えヒトＮＬＲＰ３（４μｇのバッチ１またはバッチ２、３．４ｐｍｏｌ、最終濃度０．６８μＭ）を別々に、９６ウェルプレートにおいて、指示濃度（ＤＭＳＯ原液から希釈され、ＤＭＳＯが最終溶液の１％を超えない）のそれぞれの光プローブ（ＩＺ１２０１またはＩＺ１４３８）、またはＤＭＳＯとリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートした（最終反応容量、５０μＬ）。室温で３０分間暗所においてインキュベートした後、混合物を、３６５ｎｍのＵＶ光で４℃にて２０分間、光照射した。競合的光親和性標識実験では、指示濃度の親化合物ＭＣＣ９５０またはＭＣＣ７８４０での１５分の前処置に続いて、光プローブ処置および光分解を行った。ＵＶ照射の後、１％ＳＤＳおよび１０ｍＭ ＤＴＴを添加し、５６℃で１時間インキュベートした後、タンパク質試料を、暗所において室温で４５分間３０ｍＭ ヨードアセトアミドで処置した。プローブ標識ｈＮＬＲＰ３を、製造業者の使用説明に従いＣｌｉｃｋ－ｉＴ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる銅のクリックケミストリーにより、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）アジド（１ｍＭ原液からの１００μＭ ＴＡＭＲＡアジド）でタグ付けした。－２０℃に予め冷蔵された無水アセトン（９容量）を添加し、濁った混合物を、徹底してボルテックス処理し、－２０℃で一晩インキュベートした。遠心分離（１５，０００×ｇ、４℃で１０分間）の後、上清を廃棄し、残ったペレットを、－２０℃アセトンで洗浄した。洗浄液の上清を、遠心分離により除去し、沈殿されたタンパク質ペレットを、室温で１０分間風乾した。
架橋タンパク質のゲルを基にした解析
過剰の親化合物ＭＣＣ９５０またはＭＣＣ７８４０を含む、または含まない、ＩＺ１２０１またはＩＺ１４３８で以前に光標識されたｈＮＬＲＰ３（４μｇ、３．４ｐｍｏｌ）の乾燥ペレットを、５０μＬ ＳＤＳローディング緩衝液（２．５％ｖ／ｖ ２－メルカプトエタノールを含有するＢｉｏ－ＲａｄのＸＴ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ）に再懸濁し、加熱した（６０℃で３０分間）。タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４～１５％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ、Ｂｉｏ Ｒａｄ）を用いて分解し、励起光源としての緑色ＬＥＤ光およびＢＰ６００／２０ｎｍ発光フィルターを含むＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標） ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）用いるゲル内蛍光スキャニングにより分析した。ゲル内蛍光スキャニングの後、ゲルを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色して、同量のタンパク質試料が確実に各レーンにロードされＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標） ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍで画像化されることを確実にした。ｈＮＬＲＰ３中の各光プローブの光取り込みを、ＩｍａｇｅＪ１．５２ｅを用いて対応するゲルバンドの蛍光強度を測定すること、およびこの値をＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色されたｈＮＬＲＰ３ゲルバンドの強度値に対し標準化してローディング差を制御すること、により定量的に評定した。
ＭＳ分析のための標識ｈＮＬＲＰ３の調製
５０μＬ リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の組換えｈＮＬＲＰ３（５５μｇのバッチ２、２．４７ｐｍｏｌ、最終濃度０．９４μＭ）を、１５分間５０μＭ ＭＣＣ７８４０またはビヒクルとプレインキュベートし、その後、２５μＭ ＩＺ１４３８により室温でさらに３０分間、処置した。試料を、４℃で２０分間光照射した後、ＳＤＳローディング緩衝液（４×原液、１７μＬ）で光架橋反応をクエンチした。タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４～１５％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて分解し、 ゲルを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色した。ｈＮＬＲＰ３に対応するタンパク質バンドを、ゲルから切り出し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーが除去されるまで、２５０μｌの５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３およびアセトニトリル（ＡＣＮ）（１：１）により３７℃で２時間洗浄した。その後、ゲル片を、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３中の１０ｍＭ ＤＴＴにより５６℃で３０分間処置し、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３およびＡＣＮ（１：１）で２回洗浄した。この後、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３中の５５ｍＭヨードアセトアミドにより室温で３５分間処置し、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３およびＡＣＮ（１：１）で２回洗浄し、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮機で乾燥させ、３μｇのＴｒｙｐｓｉｎ／Ｌｙｓ－Ｃ Ｍｉｘ、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ Ｇｒａｄｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ)を含有する６０μＬの５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液に再水和させた。上記混合物を、暗所で穏やかに撹拌しながら３７℃で消化のために一晩インキュベートした。消化の後、１０分間の短いスピンを与え、「Ｔｒｙｐｓｉｎ／Ｌｙｓ－ＣＭ画分」を、新しいＡｘｙｇｅｎ（商標） ＭａｘｙＣｌｅａｒ Ｓｎａｐｌｏｃｋ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｓ（ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に回収した。ゲル片を、頻繁にボルテックス処理しながら、１５分間に１００μＬの０．２％ギ酸およびＡＣＮ（１：１）で２回、そして５０μＬのエタノールおよびＡＣＮ（１：１）で１回再抽出した。上清を、「Ｔｒｙｐｓｉｎ／Ｌｙｓ－Ｃ画分」とひとまとめにし、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮機を用いて濃縮乾固した。ペプチド（最終濃度０．５５μｇ／μＬ）を、１００μＬの水中０．２％ギ酸および０．３％ＡＣＮで再構成し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析まで－２０℃で貯蔵した。
ペプチド混合物の質量分析
ペプチド混合物を、ナノエレクトロスプレーイオン源を具備したＱＥｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いるナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。試料を、水中の０．２％ギ酸および０．３％ＡＣＮで最終濃度０．０５μｇ／μｌに希釈した。試料（１μｇ、２０μＬ）を、水中０．２％ギ酸および０．３％ＡＣＮ中で２０μｌ／分でＣ１８プレカラム（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ、１００Å、５μｍ、１８０μｍ×２０ｍｍ）にロードした。脱塩ステップ（３分間）の後、プレカラムをオンラインで、９２％溶媒Ａ（水中の０．２％ギ酸）および８％溶媒Ｂ（水中の０．２％ギ酸および９０％ＡＣＮ）で平衡にされた分析ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１３０μｍ；１．７μｍ、７５μＭ×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）と切り替えた。ＸＣａｌｉｂｕｒソフトウエアで、ＭＳおよびクロマトグラフィーの機能を制御した。ペプチドを、流速２７０ｎＬ／分で１６５分間に溶媒Ｂの８－３５％勾配を利用して溶出した。質量分析計を、データ依存的取得モードで操作して、自動的にＭＳとＭＳ／ＭＳの取得を切り替えた。サーベイフルスキャンＭＳスペクトル（ｍ／ｚ３２５～１３００のもの）を、ｍ／ｚ２００での分解能６０，０００で取得した。ＡＧＣを、３×１０６、最大注入時間を４５ｍｓに設定した。最大強力イオンから上位２０のイオンを、２６％の標準化衝突エネルギーでの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）によるフラグメンテーションの標的とした（強度閾値３．３×１０４でＡＧＣ １×１０５および最大注入時間６０ｍｓ）。ダイナミックエクスクルージョンタイムウィンドウを、３０秒に設定して、同じペプチドの再選択を防止した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、分解能１５，０００でのプロファイルタイプで記録した。
ＭＳデータ処理
ローファイルを、ペプチドおよびタンパク質の同定および定量のために、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウエア（バージョン１．５．３．８）（１）で処理した。トリプシン消化のＭＳ／ＭＳのローファイルを、以下のパラメータを用いて、ヒトＮＬＲＰ３トランケート化配列（１２５－１０３６）を含む連結されたデータベースおよびスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ２１）データベースに対しＡｎｄｒｏｍｅｄａ検索エンジンを利用して検索した：システインのカルバミドメチル化を、固定された修飾として設定し、Ｎ－末端アセチル化およびメチオニン酸化を、可変的修飾として設定した。全てのペプチドは、５アミノ酸の最小ペプチド長および最大２つのミスクリベージを有する必要があった。トリプシン切断への厳密な特異性を必要とし、プロリンへのＮ－末端切断を可能にした。マストレランスを、それぞれＭＳおよびＭＳ／ＭＳで４．５ｐｐｍおよび２０ｐｐｍに設定した。検索を、過去に記載されたタンパク質配列の修飾された反転を有する連結されたターゲット・デコイ・データベースに対し実施した（２）。タンパク質およびペプチド同定のための偽発見率（ＦＤＲ）を、最大１％に設定した。同定を異なるランの間で検証および転送するために、ＭａｘＱｕａｎｔの「ｍａｔｃｈ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｕｎ’ｓ」のオプションを、０．７分のマッチタイムウィンドウおよび２０分のアライメントタイムウィンドウで可能にした。未知の修飾を、標準の検索でＭａｘＱｕａｎｔに実装された「依存的ペプチド」設定により、同定した。実装されたアルゴリズムはスペクトルマッチングを実施して、無バイアスの手法で修飾ペプチドを同定する。同定されなかったスペクトルが、同定されたスペクトルとマッチする場合、理論的プリカーサーマスおよび実測プリカーサーマスのマスシフト（ペプチドの修飾に対応する）、ならびにそのマッチした配列が、報告される。修飾ペプチドがＦＤＲ １％およびマストレランス ６．５ｍＤａの既に同定された非修飾ペプチドに由来する場合、それらは、同定されるのみである。修飾ペプチドを、ベースペプチドと依存的ペプチドの間のΔＭマスシフトと共にａｌｌＰｅｐｔｉｄｅｓ．ｔｘｔから抽出した。全てのアミノ酸を、修飾が可能な残基と見なした。プローブ修飾ペプチドの検索に用いられた修飾の質量は、ＩＺ１４３８では＋４３８．１７２５６ｍ／ｚであり、これは対応するプローブ －（マイナス） 分子窒素の質量である。この修飾を、全てのＭａｘＱｕａｎｔ検索において可変的修飾として設定した。定量の目的で、ＭａｘＱｕａｎｔにより計算されたラベルフリー定量（ＬＦＱ）強度を、用いた。ＬＦＱメトリックを、各タンパク質について、異なる定量試料の全ての対比較で測定された全てのペプチド比を考慮することにより、特異的標準化手順および特有の凝集法を利用してタンパク質強度を計算するＭａｘＬＦＱアルゴリズムにより、生データの強度から導く（３）。ＬＦＱ定量では、少なくとも２つの独特のペプチド比（最小ＬＦＱ比カウント＝２）から計算されたタンパク質比のみを、ＬＦＱタンパク質強度の計算で考慮した。ＭａｘＱｕａｎｔの処理データの解析を、手作業で実施した。手短に述べると、「依存的ペプチド」解析の場合、「ａｌｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ｔｘｔ」ファイルを、Ｅｘｃｅｌで開き、ＤＰ タンパク質の「ｓｐ｜ＮＲＬＰ３－ＥＶ６３４７｜」、ＤＰ質量差「４００＜Ｘ＜４６０」およびＤＰスコア「＞６０」でフィルタリングした。ＤＰマスシフトが＋４３８．１７２５６ｍ／ｚ（トレランス５ｐｐｍ）であり２つの条件「ＮＬＲＰ３＋ＩＺ１４３８」および「ＮＬＲＰ３＋ＩＺ１４３８＋ＭＣＣ７８４０」のみに存在し対照「ＮＬＲＰ３」には存在しない、選択されたペプチドを、陽性ヒットと見なした。陽性ヒットの検証を、手作業で実施した。ＭＳスペクトルを、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウエアで視覚化して、非修飾および修飾ペプチドの存在をチェックした。理想的には、非修飾ペプチドは、３つの条件全てで検出されるはずであり、＋４３８．１７２６５ｍ／ｚ光付加体で修飾されたペプチドは、条件「ＮＬＲＰ３＋ＩＺ１４３８」では検出され、条件「ＮＬＲＰ３＋ＩＺ１４３８＋ＭＣＣ７８４０」ではより少ない程度に検出され、対照「ＮＬＲＰ３」では検出されないはずである。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＭａｘＱｕａｎｔのビューワープログラムを用いて視覚化して、非修飾ペプチドのｙおよびｂイオンをアノテートした。該当する非修飾および修飾ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル（それぞれＤＰベーススキャンおよびＤＰ修飾スキャン）を、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウエアにより開き、両方のペプチドの配列を比較して、配列内の光付加体の位置を決定した。ｙおよび／またはｂイオンでの＋４３８．１７２６５ｍ／ｚ（トレランス５ｐｐｍ）のシフトが、予期される。
メタノール中の光分解生成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
メタノール中のジアジリンプローブＩＺ１２０１およびＩＺ１４３８の光分解を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて生成された光産物を分析することにより、別々に検査した。光プローブ（ＭｅＯＨ中の７０ｐｍｏｌ／μＬ）を、４℃で２０分間、暗所に保持するか、または３６５ｎｍで光照射し、その後、水中の０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および０．２％ＡＣＮで最終濃度５００ｆｍｏｌ／μＬに１４０倍希釈した。光プローブ溶液を、ナノエレクトロスプレーイオン源を具備したＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ Ｅｌｉｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） に連結されたＵｌｔｉｍａｔｅ ３５００ ＲＳＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いるナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。２０μｌの希釈された光プローブ溶液（１０ｐｍｏｌ）を、水中の０．０５％ＴＦＡおよび２％ＡＣＮ中で２０μｌ／分でＣ－１８プレカラム（Ａｃｃｌａｉｍ Ｐｅｐ Ｍａｐ Ｃ１８、１００Å、５μｍ、３００μｍ×５ｍｍ）にロードした。脱塩ステップ（３分）の後、プレカラムを、オンラインで、９７％溶媒Ａ（０．２％ギ酸）および３％溶媒Ｂ（水中の０．２％ギ酸および８０％ＡＣＮ）で平衡にされた分析ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１３０μｍ；１．７μｍ、７５μＭ×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）と切り替えた。プローブを、ナノＨＰＬＣシステム（Ｕ３０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて流速０．２５０ｎｌ／分で１３分間、溶媒Ｂの３－９９％勾配により溶出し、ナノエレクトロスプレーイオン源を介してＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ Ｅｌｉｔｅに直接、エレクトロスプレーした。ＸＣａｌｉｂｕｒソフトウエアにより、ＭＳおよびクロマトグラフィーの機能を制御した。質量分析計を、データ依存的取得モードで操作して、自動的にＭＳとＭＳ／ＭＳの取得を切り替えた。サーベイフルスキャンＭＳスペクトル（ｍ／ｚ１００～１６００のもの）を、分解能１２０，０００で取得した。ＡＧＣを１×１０６、最大注入時間を、２００ｍｓに設定した。最大強力イオンから上位７のイオンを、２８％の標準化衝突エネルギー（ＡＧＣ １×１０５）および最大注入時間１０ｍｓでの衝突誘起解離（ＣＩＤ）によるフラグメンテーションの標的とした。アイソレーションウィンドウ ２ｍ／ｚ。ダイナミックエクスクルージョンタイムウィンドウを、６０秒に設定して、同じペプチドの再選択を防止した。光分解の前および後に観察された異なる種の相対的存在量を、各種で測定されたＭＳイオン強度（またはピーク面積）から定量した。混合物中の各成分の組成率％を、ＭＳイオン強度値に基づき計算した。
結果
光反応性架橋および選別機能性の両方を含んだＭＣＣ７８４０の２種の光活性化可能類似体を、Ｉｎｆｌａｚｏｍｅにより消化および合成した：図１：メタノール中の光分解溶液中のＭＣＣ７８４０およびＭＣＣ９５０、ＩＺ１２０１およびＩＺ１４３８の構造、ならびにそれらの光産物の構造。ＬＣ－ＭＳモードで観察された分子イオンの（Ａ）構造、（Ｂ）質量、分子式、および光分解前のプローブに比較した分子マスシフト。光分解の前および後に観察された異なる種の相対的存在量を、各種で測定されたＭＳイオン強度から定量した。混合物中の各成分の組成率％を、ＭＳイオン強度値に基づき計算した。
脂肪族ジアジリン部分を、その小さなサイズ（タンパク質結合との干渉を最小限にするため）と、光分解での高反応性カルベン中間体を発生するのに必要とされる短い照射時間のため、光架橋基として選択した。本発明者らは、確立された生体直交型クリックケミストリーを利用して適切なレポータタグ（蛍光またはビオチンアジド基）にコンジュゲートされ得る、小さな脂肪族アルキンレポータ基を、プローブターゲット複合体のＬＣ－ＭＳ/ＭＳまたは動的細胞画像による次のエクスビボＰＤ／標的同定のために用いた。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１３（４）により過去に記載された、ミニマリスト末端アルキン含有ジアジリン光架橋剤を、ファーマコフォアに接近して組み込み、高反応性カルベンの形成の際に光反応性部分が結合パートナーと優先的に反応し溶媒と反応しない機会を最大にした。
ＰＡＬＭＳ実験を実行するために、親分子ＭＣＣ７８４０の生物学的ホールマークを保持しかつＭＣＣ７８４０と類似の作用様式および細胞内分子相互作用を有する、ＭＣＣ７８４０の光活性可能な類似体を選択する必要がある。この目的で、ＭＣＣ７８４０、ＭＣＣ９５０ならびに２種の光プローブＩＺ１２０１およびＩＺ１４３８の効能（ＩＣ５０値）および阻害効果を、ＴＨＰ－１細胞におけるＩＬ－１β放出アッセイで評定した。
インフラマソームは、カスパーゼ１を活性化するように機能し、カスパーゼ１はその後、炎症促進性サイトカインのインターロイキン－１β（ＩＬ－１β）およびＩＬ－１８をタンパク質分解で切断し活性化することを担う。インフラマソームはさらに、細胞死の炎症促進性形態であるパイロトーシスを誘発することにより炎症を促進する。ＴＨＰ－１細胞におけるＩＬ－１β放出アッセイを用いて、インフラマソーム介在性サイトカイン分泌を阻害する異なる分子の能力を評定した。
表Ｂに示される通り、ＭＣＣ９５０は、テストされた４種のうちもっとも強力な化合物であり、一方でＭＣＣ７８４０および光プローブＩＺ１４３８は、互いに同等の、かつＭＣＣ９５０の４分の１～６分の１のＩＣ５０値を有する。光プローブＩＺ１２０１は、活性がＩＺ１４３８のおよそ６分の１である。
これらの結果は、プローブ中のミニマリスト二官能性光架橋剤が、細胞条件下では親化合物に比較して標的エンゲージメントへの負の影響を極わずかしか有しないか、またはほとんど有しないことを示す。
Figure 2022528507000004
組換えヒトＮＬＲＰ３の光親和性標識およびゲル内蛍光分析
光プローブとｈＮＬＲＰ３の間の直接的相互作用を検証するために、本発明者らは、インビトロ光親和性標識実験を実施した。手短に述べると、バッチ１またはバッチ２からの組換えｈＮＬＲＰ３を、上昇濃度のＩＺ１２０１またはＩＺ１４３８で３０分間処置し、その後、ＵＶ照射して光架橋を開始した。次に、プローブ標識タンパク質を、プローブ上の脂肪族アルキン官能基を介する赤色蛍光ＴＡＭＲＡアジド色素とのクリック反応に供し、プローブ標識タンパク質（複数可）がＴＡＭＲＡレポータフルオロフォアで選択的にタグ付けされるようにした。タンパク質をその後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分解し、その後、ゲル内蛍光スキャニングを行って、蛍光タンパク質を視覚化した。
図２：過剰なＭＣＣ９５０またはＭＣＣ７８４０を含む、または含まない、ＩＺ１２０１またはＩＺ１４３８で光標識されたｈＮＬＲＰ３を示すゲル内蛍光スキャニング。
ｈＮＬＲＰ３を、ビヒクルまたは指示濃度のＩＺ１２０１もしくはＩＺ１４３８で１時間標識し、その後、標準の光親和性標識（ＰＡＬ）手順を行った。光分解に続いて、プローブ修飾タンパク質を、ＴＡＭＲＡ－アジドタグとクリック反応させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびゲル内蛍光スキャニングにより分析した。競合ＰＡＬ実験のために、バッチ１（Ｂ）またはバッチ２（Ｃ）からのｈＮＬＲＰ３を、ＭＣＣ７８４０もしくはＭＣＣ９５０（２５または５０μＭ）、またはビヒクルと１５分間プレインキュベートし、この後、先に記載された通り、ＵＶ照射、ＴＡＭＲＡ－アジドタグとのクリック反応、およびゲル内蛍光スキャニングを行った。ｈＮＬＲＰ３中の各光プローブの光取り込みを、対応するゲルバンド（黒い矢印）の蛍光強度を測定すること、およびこの値をＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色されたｈＮＬＲＰ３ゲルバンドの強度値に対して標準化することにより、定量的に評定した。
図２Ａに示された通り、類似の標識パターンが、両方のプローブおよび両方のｈＮＬＲＰ３バッチで観察された。本発明者らは、ｈＮＬＲＰ３への両方のプローブの用量依存的光取り込みを観察した（１１７ｋＤａ）。光取り込みの収率は、両方のプローブで類似していた。他のタンパク質バンド（約２８、約６０、約９０および約３００ｋＤａ）もまた、標識されるがｈＮＬＲＰ３よりかなり低い程度のようであった。１μＭのＩＺ１２０１またはＩＺ１４３８での処置は、上昇濃度の親化合物ＭＣＣ９５０およびＭＣＣ７８４０との競合実験を想定するのに充分なｈＮＬＲＰ３標識をインビトロで提供した。
ｈＮＬＲＰ３のＩＺ１２０１またはＩＺ１４３８標識の特異性を模索するために、ＭＣＣ９５０およびＭＣＣ７８４０での一組の競合標識実験を、実施した。手短に述べると、バッチ１またはバッチ２からのｈＮＬＲＰ３を、ＭＣＣ７８４０もしくはＭＣＣ９５０（２５または５０μＭ）、またはビヒクルと１５分間プレインキュベートし、その後、ＩＺ１２０１またはＩＺ１４３８（１μＭ）と１時間インキュベートし、この後、標準の光親和性標識手順を行った。プローブにより特異的に標識されるタンパク質は、競合物質として用いられた親化合物で前処置された試料中のゲル内蛍光シグナルの減少を呈するものである。図２Ｂに示された通り、ＭＣＣ９５０およびＭＣＣ７８４０の両方が、バッチ１およびバッチ２からｈＮＬＲＰ３へのＩＺ１２０１光取り込みを、弱く、かつどちらかと言うと一貫性なく阻害した。その一方で、両方の競合物質は、類似の能力により用量依存的様式でバッチ１からのｈＮＬＲＰ３のＩＺ１４３８標識を遮断した（２５μＭで約２３％阻害、および５０μＭで約３７％阻害）。しかし、ＭＣＣ９５０は、高用量であってもＩＺ１４３８によるバッチ２からのｈＮＬＲＰ３の標識を弱く防止し（５０μＭで１１％阻害）、一方でＭＣＣ７８４０は、良好な効能（５０μＭで約７０％阻害）でｈＮＬＲＰ３へのＩＺ１４３８光取り込みの用量依存的阻害を生じた（図２Ｃ）。
総括すると、これらのデータは、２種のプローブＩＺ１２０１およびＩＺ１４３８が組換えｈＮＬＲＰ３に結合すること、および親化合物ＭＣＣ７８４０およびＮＬＲＰ３特異性阻害物質ＭＣＣ９５０がそれらの結合を阻害することを示す。それゆえ本発明者らは、ＩＺ１２０１およびＩＺ１４３８がＭＣＣ７８４０および類似体とｈＮＬＲＰ３との相互作用を試験するための可変的光親和性プローブであると結論づける。ｈＮＬＲＰ３へのＭＣＣ７８４０の結合部位でのさらなる試験を、選択されたプローブとしてＩＺ１４３８および競合物質としてＭＣＣ７８４０を用いて、バッチ２からのｈＮＬＲＰ３で実施するであろう。
組換えｈＮＬＲＰ３でのＩＺ１４３８修飾ペプチドのマッピング
ＩＺ１４３８により光標識された厳密な残基を同定するために、ｈＮＬＲＰ３（バッチ２、０、９４μＭ）を単独で、またはＭＣＣ７８４０（５０μＭ）と組み合わせて、もしくは組み合わせずにＩＺ１４３８（２５μＭ）と共に光照射した。光分解の後、試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを利用して分解し、タンパク質を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色した。ｈＮＬＲＰ３に対応するタンパク質バンドを、ゲルから切り出し、ゲル内トリプシンタンパク質分解に供した。
図３：ｈＮＬＲＰ３に対応するゲルバンド中で同定されたタンパク質の順位分布。Ａ．ｈＮＬＲＰ３を含む１７２種のタンパク質を、それぞれ赤色（ｈＮＬＲＰ３）および青色（Ｓｆ２１タンパク質）の円で表す。タンパク質を、最大（右）存在量から最小（左）存在量の順序で並べる。Ｂ．６Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－ＴＥＶ－ＮＬＲＰ３（１２５－１０３６）の配列包括度の図解。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより同定されたペプチドを、赤色で示す。６Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－ＴＥＶタグの配列を、黄色で強調する。
全部で、ｈＮＬＲＰ３および１７１種のＳｆ２１タンパク質を含む、１７２種のタンパク質を同定した。強度に基づく１７２種のタンパク質の順位分布を、図４Ａに示す。当然のことながら、ｈＮＬＲＰ３は、ゲルバンドで定量された最も強力なタンパク質である。ｈＮＬＲＰ３の少なくとも９０％の配列包括度が、全ての試料で実現された（図３Ｂ）。
得られたペプチドを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＭＳデータを、任意のアミノ酸上の修飾としてＩＺ１４３８を有する組換えｈＮＬＲＰ３およびスポドプテラ・フルギペルダタンパク質配列を含む複合タンパク質データベースに対しＭａｘＱｕａｎｔにより検索した。光化学的コンジュゲーションの性質により、結合部位を、１種または複数のペプチド上の複数のアミノ酸残基への多重コンジュゲーション事象により表してよい。コンジュゲートされたペプチドに割り当てられた全てのペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）を、手作業で検証した。未知の修飾を有するペプチドを、標準の検索でＭａｘＱｕａｎｔに実装された「依存的ペプチド」設定を用いて、同定した。このペプチド付加体は、競合物質ＭＣＣ７８４０の存在下でプローブＩＺ１４３８と共に照射された試料中でも同定されたが、ピーク強度はプローブのみで光標識された試料に比較して２分の１であった。予期された通り、ＩＺ１４３８修飾１９５ＴＣＥＳＰＶＳＰＩＫ２０４ピークからの二重充填シグナル（ｄｏｕｂｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ｓｉｇｎａｌ）に対応する７７８．３７１１ｍ／ｚでのプリカーサーイオンは、対照試料（ＩＺ１４３８の非存在下でＵＶ照射されたｈＮＬＲＰ３）では検出されなかった（図４Ａ）。二重充填されたインタクトペプチド１９５ＴＣＥＳＰＶＳＰＩＫ２０４に対応する５５９．２８１７ｍ／ｚのベースピークは、対応するプローブ修飾ペプチドの約１０００倍の強度であり、ｈＮＬＲＰ３の結合部位におけるＩＺ１４３８の特異的な共有結合性光取り込みの収率が低かったことを示す（図４Ｂ）。
図４：ＭＣＣ７８４０と競合させたＩＺ１４３８での組換えｈＮＬＲＰ３標識後のインタクトおよびＩＺ１４３８修飾ｈＮＬＲＰ３ペプチド１９５ＴＣＥＳＰＶＳＰＩＫ２０４のＭＳ１強度値。ｈＮＬＲＰ３からのアミノ酸配列ＴＣＥＳＰＶＳＰＩＫを有する独特のトリプシン性ペプチドを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により検出し、このフラグメント中へのＩＺ１４３８組み込みに対応する＋４３８．１７２７ｍ／ｚのペプチド質量の増加があった。Ａ．異なる試料中のＩＺ１４３８修飾ＴＣＥＳＰＶＳＰＩＫに対応する７７８．３７１１ｍ／ｚ（ｚ＝２）でのプリカーサーイオンのＡＳ１強度値。Ｂ．ｈＮＬＲＰ３をＩＺ１４３８で標識した場合に検出されたインタクトおよびＩＺ１４３８修飾ＴＣＥＳＰＶＳＰＩＫにそれぞれ対応する５５９．２８１７ｍ／ｚ（ｚ＝２）および７７８．３７１１ｍ／ｚ（ｚ＝２）でのプリカーサーイオンのＭＳ１強度値。
ＭＳ１データの検査は、ＩＺ１４３８修飾１９５ＴＣＥＳＰＶＳＰＩＫ２０４フラグメントが非修飾同等物より遅く溶出したこと（それぞれ１７８分および４９分）を示し、ＩＺ１４３８の共有結合性付着の後、ペプチド付加体がより疎水性であり、それゆえより良好にＣ１８カラムにより良好に保持されたことを示唆する。プローブ修飾ペプチド（７７８．３７１１ｍ／ｚ、ｚ＝２）および非修飾形態（５５９．２８１７ｍ／ｚ、ｚ＝２）のＭＳ２スペクトルを、特異的なプローブ標識ｂまたはｙ型フラグメントイオンの存在、および光付加体（特異的アミノ酸残基への）の部位の定位について手作業で評価した。両方のペプチド形態は、プローブ修飾のＭＳ２スペクトルでの質量８５６．４７７２ｍ／ｚおよび非修飾ペプチドのそれの質量１１２１．５３０２ｍ／ｚで検出されたｙ８フラグメントイオンを除き、複数のｂおよびｙ型フラグメントイオンを共有した（図５Ａ）。このマスシフト＋２６５．０５８２ｍ／ｚは、ＣＩＤフラグメンテーションでペプチドに付着されたプローブの切断から生じる。
実際に、図５Ｂに示された通り、メタノール中のＩＺ１４３８のＣＩＤフラグメンテーションは、尿素結合の切断から生じた２つのフラグメントイオン：ヘキサヒドロ－ｓ－インダセン－４－アミン １０（１７４．１２８２ｍ／ｚ）、およびミニマリスト末端アルキン含有ジアジリン架橋剤で修飾された１Ｈ－ピラゾール－３－スルホニルイソシアナート １１（２９４．０６６１ｍ／ｚ）を生じた。ｙ８フラグメントイオンに付着された付加体の質量は、Ｎ２の損失後の光架橋剤を含有する１Ｈ－ピラゾール－３－スルホニルイソシアナートフラグメントの質量（２９４．０６６１ｍ／ｚ）に対応する。プローブ修飾ペプチドおよびそのインタクト同等物のＭＳ２分析は、Ｅ１９７への２６５．０５８２ｍ／ｚの付加体の部位を定位した。加えて、ＭＳ２スペクトルの注意深い精査も、プローブ修飾ペプチドのＭＳ２スペクトルのみに存在する質量１７４．１１２６ｍ／ｚのフラグメントイオンを示した（図５Ａ）。このフラグメントイオンはおそらく、ＣＩＤフラグメンテーションによる光付加体切断後に放出されたヘキサヒドロ－ｓ－インダセン－４－アミンに対応する。本発明者らの知見は、ＩＺ１４３８が、ｈＮＬＲＰ３中のグルタミン酸１９７を、ＭＣＣ７８４０阻害可能な様式で光標識することを実証した。
図５：ｈＮＬＲＰ３のインタクトまたはＩＺ１４３８修飾ペプチドＴＣＥＳＰＶＳＰＩＫについてのＭＳ２スペクトル：Ａ．プローブ修飾ペプチド７７８．３７１１ｍ／ｚおよびそのインタクト同等物５５９．２８１７ｍ／ｚのＭＳ２スペクトル。プローブ修飾ペプチドのｙ８フラグメントイオンは、ＣＩＤフラグメンテーションでＩＺ１４３８に由来する付加体１１に対応する特異的修飾（＋２６５．０５８２ｍ／ｚ）を含み、かつＥ１９７上に定位された（Ｅｍｏｄ）。加えて、ＩＺ１４３８から切断されたフラグメントイオン１７４．１１２６ｍ／ｚは、プローブ修飾ペプチドのＭＳ２スペクトルのみで検出された。Ｂ．特異的娘フラグメンテーション１７４．１２７４ｍ／ｚおよび２９４．０６４６ｍ／ｚ（拡大されたＭＳ２スペクトル）を示すＩＺ１４３８のＭＳ２スペクトル。
結論
本発明者らは、ミニマリスト末端アルキン含有ジアジリン光架橋剤を有する２種の新規な光親和性プローブＩＺ１２０１およびＩＺ１４３８を用いた組換えｈＮＬＲＰ３でのＰＡＬＭＳの実行に成功し、かつ両方の活性プローブが、ＮＬＲＰ３インフラマソームの強力で選択的な阻害剤ＭＣＣ７８４０およびＭＣＣ９５０により防護的様式でｈＮＬＲＰ３を光標識することを示した。これらの結果は、ＭＣＣ７８４０およびＭＣＣ９５０がインビトロでｈＮＬＲＰ３を結合することを示す。本発明者らは、ＭＣＣ７８４０をＩＺ１４３８と競合させるＰＡＬ－ＭＳを利用して、ｈＮＬＲＰ３におけるＭＣＣ７８４０の結合部位の一部として架橋アミノ酸Ｅ１９７を同定した。本発明者らの知識では、これは、質量分析によりアミノ酸分解での架橋位置を明瞭にするための、ｈＮＬＲＰ３への光親和性標識の最初の適用である。本発明者らの知見は、ＭＣＣ７８４０などの新しい阻害剤と相互作用するｈＮＬＲＰ３上の結合部位をマッピングするケミカルプロテオミクスの潜在能力を実証する。
装置
－ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐａｒａｄｉｇｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）
－ ＰｏｗｅｒＰａｃ ２００(Ｂｉｏ－Ｒａｄ)
－ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標） Ｔｕｒｂｏ（商標） Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ(Ｂｉｏ－Ｒａｄ)
－ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ １－１５ｐｋ（Ｓｉｇｍａ）
－ ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ(Ｂｉｏ－Ｒａｄ)
－ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
－ ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ）
－ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３５００ ＲＳＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉｏｎｅｘ）
－ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ Ｅｌｉｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
－ ＵＶＰ ＣＬ－１０００ ＵＶ架橋チャンバー（Ｈｙｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
参考資料
１．Ｃｏｘ Ｊ， Ｍａｎｎ Ｍ． ＭａｘＱｕａｎｔ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ， ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｐ．ｐ．ｂ．－ｒａｎｇｅ ｍａｓｓ ａｃｃｕｒａｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００８ Ｄｅｃ；２６（１２）：１３６７－７２． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｂｔ．１５１１．
２．Ｅｌｉａｓ ＪＥ， Ｇｙｇｉ ＳＰ． Ｔａｒｇｅｔ－ｄｅｃｏｙ ｓｅａｒｃｈ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ／Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２００７ Ｍａｒ；４（３）：２０７－１４．
３．Ｃｏｘ Ｊ， Ｈｅｉｎ ＭＹ， Ｌｕｂｅｒ ＣＡ， Ｐａｒｏｎ Ｉ， Ｎａｇａｒａｊ Ｎ， Ｍａｎｎ Ｍ． Ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｌａｙｅｄ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｘｉｍａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒａｔｉｏ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ， ｔｅｒｍｅｄ ＭａｘＬＦＱ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２０１４ Ｓｅｐ；１３（９）：２５１３－２６． ｄｏｉ： １０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ１１３．０３１５９１． Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｊｕｎ １７．
４．Ｌｉ Ｚ， Ｈａｏ Ｐ， Ｌｉ Ｌ， Ｔａｎ ＣＹ， Ｃｈｅｎｇ Ｘ， Ｃｈｅｎ ＧＹ， Ｓｚｅ ＳＫ， Ｓｈｅｎ ＨＭ， Ｙａｏ ＳＱ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔ ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｌｋｙｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｉａｚｉｒｉｎｅ ｐｈｏｔｏ－ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ－ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ． Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ． ２０１３ Ａｕｇ １２；５２（３３）：８５５１－６． ｄｏｉ： １０．１００２／ａｎｉｅ．２０１３００６８３．
実施例２：競合的放射性リガンドアッセイ形式でのＨＥＫ－ＮＬＲＰ３溶解物上清への化合物結合の評定
この目的は、［Ｈ３］－ＭＣＣ７８４０およびＮＬＲＰ３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞溶解物を利用して放射性リガンド結合アッセイを開発することであった。ＮＬＲＰ３は、細胞質タンパク質であるため、従来の濾過結合アッセイ法を用いて、細胞溶解物から遊離放射性リガンドおよび結合放射性リガンドを分離できなかった。ゲル濾過法を、文献の方法に基づき評価し（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０８， ２００２ １２７－１３３）、このアッセイを、ツール化合物を評価するために最適化した。
アッセイプロトコル
上清の調製
細胞ペレットを、氷上で解凍し、結合緩衝液で２倍希釈した。得られた溶液を、１．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に分取し、遠心分離した（１３．３ｇ×１０００、室温で５分）。上清を、取り出し、－２０℃で貯蔵した。タンパク質の決定を、製造業者の使用説明に従いＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡキットを用いて、これらの試料で実施した。
タンパク質単離＆ウエスタンブロッティング
細胞上清を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液で調製し、単一プローブ音波処理（ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｏｂｅ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を利用して音波処理した。ＢＣＡアッセイを利用して、タンパク質濃度を決定した。その後、等量のタンパク質を含有する多量のタンパク質溶解物を、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を用いて４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルで分離し、ｉＢＬＯＴ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｆｅｒシステムを用いてニトロセルロース膜に移した。
ブロットをその後、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中で１時間ブロックし、その後、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）中にて一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。ブロットをその後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、ＩＲＤｙｅコンジュゲート化ヤギ抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ二次抗体と室温で１．５時間インキュベートした。免疫反応性バンドを、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｌｉ－Ｃｏｒ赤外イメージングシステムを用いて視覚化した。
放射性リガンド結合アッセイ
１００μｌの最終アッセイ容量
細胞上清の容量は、細胞上清の各バッチのタンパク質濃度に依存した。
１０μｌ ２μＭ［３Ｈ］－ＭＣＣ７８４０（最終アッセイ濃度（ＦＡＣ）＝２００ｎＭ）
１０μｌ 化合物／非特異的結合（ＮＳＢ）（１０μＭ ＭＣＣ７８４０、ＦＡＣ １０μＭ）／ＤＭＳＯ対照（ＦＡＣ ＤＭＳＯ＝０．１％）
結合緩衝液の容量は、アッセイで用いられた上清の容量に依存した。試料を、ひとまとめにし、振とうしながら室温で４時間インキュベートした。
ＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ Ｇ－２５調製プレート（最終的なゲル濾過法）
ゲル濾過は、分子がカラムに充填されたゲル濾過媒体を通過する時に、サイズの差に応じて分子を分離する。ゲル濾過媒体は、定義された排除限界を有するＳｅｐｈａｄｅｘなどの球形粒子で作製される。試料および緩衝液がカラム全体を移動する際に、分子が、細孔の内部および外部に拡散する。より小さな分子は、さらに細孔内に移動し、そのためカラム内により長く保持される。より大きな分子は、細孔内に拡散できず、そのためより急速に溶出する。手短に述べると、ＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐプレートを、室温（ＲＴ）、８００ｇで１分間スピンダウンして、貯蔵緩衝液を除去した。それらを、３００μｌ／ウェル 結合緩衝液により８００ｇ、ＲＴ、１分間で５回洗浄した。
８０μｌの試料を、ウェルごとに添加し、４００ｇで１分間スピンダウンした。５０μｌのフロースルーを、Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ中の１４５μｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ－２０に添加した。プレートを、ＲＴでおよそ３０分間振とうした後、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＴｏｐＣｏｕｎｔで読み取った。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて解析した。
過剰発現するＨＥＫ細胞溶解物中のＮＬＲＰ３タンパク質の確認
ＮＬＲＰ３発現を、先に記載された通りウエスタンブロッティングを利用してＨＥＫ２９３細胞溶解物中で確認した。Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（＃１５１０１）からのＮＬＲＰ３ウサギ抗体を、１：１０００希釈で使用し、ＧＡＰＤＨ抗体を、１：５０００希釈で使用し、Ａｌｅｘａ－ｆｌｕｏｒヤギ抗ウサギ抗体８００を、１：１００００希釈で使用した。ウエスタンブロットを、Ｌｉｃｏｒ赤外イメージングシステムを用いて撮影した。図６：過剰発現するＨＥＫ細胞の上清（Ａ）およびカラム溶出画分（Ｂ）の中のＮＬＲＰ３の存在の確認。複数の溶解緩衝液（ＰＢＳ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を有するおよび有さないＲＩＰＡ）を、比較し、それらは同等の結果を示した。リポ多糖で刺激されたＴＨＰ－１細胞からの溶解物も、同じゲルで比較したが（Ａ）、これらの試料ではバンドは検出されなかった。これは、ＧＡＰＤＨで検出された強度の低いバンドに示される通り、かなり低量のタンパク質がこれらの試料から抽出およびロードされたことが原因である可能性がある。より高量のタンパク質ローディングは、正しいＮＬＲＰ３の正しいサイズに対応するバンドを示したが（Ｂ）、これは、リポ多糖刺激により増加しなかった。ＨＥＫ２９３－ＮＬＲＰ３上清試料を、溶出液中のＮＬＲＰ３の存在の確認のために、ローディング前のものと、ＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ Ｇ－２５調製プレートの溶出画分からのもの（Ｂ）とで比較した。
図７：２種の異なる抗体（ＡおよびＢ）を用いる、過剰発現するＨＥＫ細胞の上清中のＮＬＲＰ３の存在および対照非トランスフェクトＨＥＫ細胞中の非存在の確認。ＮＬＲＰ３発現の２０００倍を超える増加が、非トランスフェクト対照の独立した３回の実験に比較して、トランスフェクトＨＥＫ細胞で検出された（Ｃ）。
ＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）Ｇ－２５方法の最適化
遊離放射性標識からの結合放射性標識の分離を、一連の実験を通して最適化し、様々な遠心分離プロトコルおよび異なる緩衝調製物を調査した。真空により試料を運動させる試みは、カラムが長すぎるためこの手順が可能でないことを立証した。しかしスピンの速度を低減することにより、ＮＳＢを低減すること、およびおよそ３倍のアッセイウィンドウを得ることができた（図８：左側のグラフ：８００ｇ、２０秒；右側のグラフ：４００ｇ、１分）。
組織直線性
組織直線性実験を、放射性リガンド結合アッセイにおいて細胞上清のタンパク質濃度を変動させることにより実施した。非特異的結合を、１０μＭの非標識化合物ＭＣＣ７８４０を用いて定義した。特異的結合を、全結合から非特異的結合を差し引くことにより決定した。良好なアッセイウィンドウでの最低濃度を、ウェルあたりタンパク質７００μｇであると決定した。これは、次の全実験で用いられるタンパク質濃度であった（図９：放射性リガンド結合試験（２００ｎＭ ［３Ｈ］－ＭＣＣ７８４０、ＲＴで４時間）組織直線性（ｎ＝３））。
非トランスフェクトＨＥＫ細胞上清とＮＬＲＰ３トランスフェクトＨＥＫ細胞上清の比較
アッセイシグナルを、非トランスフェクト細胞上清とＮＬＲＰ３トランスフェクト細胞上清を用いて決定した。バックルランドシグナルの評定を、図５に示されたアッセイで、非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞上清およびＮＬＲＰ３過剰発現細胞上清において、全結合と非特異的結合を比較することにより実施した。２００ｎＭ ［３Ｈ］－ＭＣＣ７８４０の全結合は、非トランスフェクト対照上清に比較してＮＬＲＰ３細胞上清でおよそ３倍増加した（図１０：放射性リガンド結合試験（７００μｇタンパク質、２００ｎＭ ［３Ｈ］－ＭＣＣ７８４０、ＲＴで４時間））。
放射性リガンド飽和結合試験
［３Ｈ］－ＭＣＣ７８４０の飽和結合試験を、３種の独立した実験において濃度を２００倍範囲で変動させることにより実施して、Ｋｄを決定した。３種の別の実験からテストされた全ての濃度をまとめて、より正確なＫｄを得た（グラフ６ｅ）。［３Ｈ］－ＭＣＣ７８４０のＫｄは、３種の独立した実験からおよそ２３０ｎＭであると決定された（図１１）。
ＡＴＰおよびＡＤＰでの放射性リガンド競合結合試験
リガンド結合がＡＴＰおよびＡＤＰと競合的であるかどうかを示すために、実験を、ＡＴＰおよびＡＤＰの濃度を変動させること、ならびに２００ｎＭで［３Ｈ］－ＭＣＣ７８４０と競合させることにより実施した。幾つかの競合がＡＴＰで認められたが、より高濃度は、濃度応答曲線全体を定義するほどテストできなかった。推定ＩＣ５０ ７５ｍＭを、ＡＴＰ曲線フィットにおいて最小値を限定することにより得た（図１２：放射性リガンド結合試験（７００μｇタンパク質、２００ｎＭ ［３Ｈ］－ＭＣＣ７８４０、ＲＴで４時間）。
結論
この報告で提示されたデータは、ＮＬＲＰ３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞溶解物上清中のＮＬＲＰ３に結合する放射性リガンドの測定のための新規な９６ウェルプレートに基づくゲル濾過結合アッセイの開発成功を示す。このアッセイを利用して、ＮＬＲＰ３放射性リガンド［３Ｈ］－ＭＣＣ７８４０の結合特徴を決定した。
Figure 2022528507000005
結合緩衝液の組成：
５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（７．８８ｇ／ｌ）
１２０ｍＭ ＮａＣｌ２（２４ｍｌ ５Ｍ／ｌ）
５ｍＭ ＫＣｌ（０．３７２ｇ／ｌ）
１ｍＭ ＥＤＴＡ（０．２９２ｇ／ｌ）
ｐＨ７．４
実施例３：モデル化
デジタルコンストラクト（Ｄｉｇｉｔａｌ ｃｏｎｓｔｒｕcｔｓ）を作成して、ＮＬＲＰタンパク質をプローブする新規方法を提供し、それによりＮＬＲＰ３阻害剤の結合部位に機械論的洞察を与えた。
ヒトＮＬＲＰ３の複数のモデルを、手作業で構築されたアミノ酸配列アラインメントを利用して、マウスＮＬＲＣ４およびウサギＮＯＤ２タンパク質（それぞれｐｄｂコード４ｋｑｖおよび５ｉｒｎ）のＸ線結晶構造ＮＡＣＨＴドメインから構築した。これらを分析して、可能なリガンド結合部位を同定した（ＭｏｌＳｏｆｔ Ｌ．Ｃ．Ｃからのアルゴリズムを用いて）：予測されたリガンド結合部位を有するＮＬＲＰ３モデルの１つを示す、図１３を参照されたい。最大であり最も可能性の高い結合部位は、Ｐｏｃｋｅｔ １であり、一致して、最も可能性の高い低分子結合部位は、ＮＬＲＣ４およびＮＯＤ２の結晶構造からのＡＤＰと同等の場所にある；図１４を参照のこと、これは、ＮＬＲＣ４およびＮＯＤ２構造の両方についてのＡＤＰのＸ線結晶構造解析法での構造と重ね合わせた、最も可能性の高いリガンド結合部位の予測を含むＮＬＲＰ３モデルである。最も可能性の高い結合部位の予測は、ＡＤＰ分子のＸ線結晶構造解析法の構造の場所を包含する。ＡＴＰ結合部位は、同じ場所を有するであろう。
ＮＬＲＣ４およびＮＯＤ２のＸ線結晶構造は、リン酸基に結合し、隣接するヒスチジン残基（ＮＬＲＣ４構造のＨｉｓ４４３およびＮＯＤ２構造のＨｉｓ５８３）によりさらに安定化された、Ｗａｌｋｅｒ Ａモチーフを示す。ヒトＮＬＲＰ３中に同等のヒスチジン残基Ｈｉｓ５２２が存在し、Ｗａｌｋｅｒ Ａ結合モチーフと共に、それはＮＬＲＰ３中のＡＴＰ／ＡＤＰに対する同等のリン酸結合部位を定義する。低分子阻害剤ＭＣＣ９５０は、スルホニルウレア部分を含有し、それは、リン酸基を模倣し、タンパク質にモデル化されると、ポケット１により画定された空間のより多くを充填するようにその分子を配置する：Ｗａｌｋｅｒ ＡモチーフとＨｉｓ５２２残基の間に位置するスルホニルウレア基を含む活性部位内にモデル化されたＭＣＣ９５０を示す、図１５を参照されたい。
実施例４：変異原性データ
クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）に関連する変異の選択が、ＮＬＲＰ３の活性部位に接近していると同定された。以下の図１６および表Ｃを参照されたい。
Figure 2022528507000006
医師およびいくらかの研究者から得たＣＡＰＳ変異を記録したデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｎｆｅｖｅｒｓ．ｕｍａｉ－ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ．ｆｒ／ｗｈｅｂ／ｓｅａｒｃｈ．ｐｈｐ？ｎ＝４）において、残基数は、Ｕｎｉｐｒｏｔと同様のタンパク質データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９６Ｐ２０）におけるＮＬＲＰ３のタンパク質配列から－２アミノ酸である。本出願における計算モデルでは、Ｕｎｉｐｒｏｔの参照配列を、用いた。臨床変異アノテーションが本出願に含まれる、唯一の場所は、表Ｃである。
以下の表Ｄに詳述されたＮＬＲＰ３変異の１つまたは複数が、ＮＬＲＰ３阻害剤の結合を防止し、ＮＬＲＰ３タンパク質を不活性にし、ＮＬＲＰ３タンパク質を構造的に活性にし、かつ／または結合ポケットへの構造的洞察を提供することが、予期される。
Figure 2022528507000007
本発明が例示のみにより先に記載されたことは、理解されよう。実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲および主旨を逸脱することなく、様々な改良および実施形態を作製することができ、本発明は以下の特許請求の範囲のみにより定義される。

Claims (26)

  1. ＮＬＲＰ３インフラマソームの結合部位であって、
    （ａ）前記ＮＬＲＰ３インフラマソームのＷａｌｋｅｒ Ａおよび／もしくはＷａｌｋｅｒ Ｂ部位にあるかもしくはその近位にあり；かつ／または
    （ｂ）Ａｒｇ１８３、Ｇｌｙ２２９、Ｉｌｅ２３０、Ｇｌｙ２３１、Ｌｙｓ２３２、Ｔｈｒ２３３、Ｉｌｅ２３４、Ｇｌｙ３０３、Ａｓｐ３０５、Ｇｌｕ３０６、Ｌｅｕ４１３およびＨｉｓ５２２から選択される１つもしくは複数の残基を含む、
    結合部位。
  2. 請求項１に記載の結合部位に化合物を結合させるステップを含む、ＮＬＲＰ３活性化を阻害する方法。
  3. 請求項１に記載の結合部位に結合するように適合される、ＮＬＲＰ３活性化を阻害することにおける使用のための化合物。
  4. 請求項１に記載の結合部位に化合物の治療的有効量を結合させるステップを含む、ＮＬＲＰ３阻害に応答する疾患、障害または病気を処置する方法。
  5. 請求項１に記載の結合部位に結合するように適合される、ＮＬＲＰ３阻害に応答する疾患、障害または病気を処置することにおける使用のための化合物。
  6. 請求項１に記載の結合部位のアンタゴニストである、ＮＬＲＰ３阻害に応答する疾患、障害または病気を処置することにおける使用のための化合物。
  7. 前記疾患、障害または病気が、
    （ｉ）炎症；
    （ｉｉ）自己免疫性疾患；
    （ｉｉｉ）癌；
    （ｉｖ）感染；
    （ｖ）中枢神経系疾患；
    （ｖｉ）代謝疾患；
    （ｖｉｉ）心血管疾患；
    （ｖｉｉｉ）呼吸器疾患；
    （ｉｘ）肝臓疾患；
    （ｘ）腎臓疾患；
    （ｘｉ）眼科疾患；
    （ｘｉｉ）皮膚疾患；
    （ｘｉｉｉ）リンパ病；
    （ｘｉｖ）精神障害；
    （ｘｖ）移植片対宿主病；
    （ｘｖｉ）疼痛；
    （ｘｖｉｉ）糖尿病に関連する病気；
    （ｘｖｉｉｉ）関節炎に関連する病気；
    （ｘｉｘ）頭痛；
    （ｘｘ）創傷または熱傷；および
    （ｘｘｉ）個体がＮＬＲＰ３の生殖系のまたは体細胞系の非サイレント変異を有すると決定された任意の疾患、
    から選択される、請求項４に記載の方法、または請求項５もしくは６に記載の化合物。
  8. 前記疾患、障害または病気が、
    （ｉ）クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）；
    （ｉｉ）マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）；
    （ｉｉｉ）家族性寒冷自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）；
    （ｉｖ）新生児期発症多臓器系炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）；
    （ｖ）家族性地中海熱（ＦＭＦ）；
    （ｖｉ）化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・ざ瘡症候群（ＰＡＰＡ）；
    （ｖｉｉ）高免疫グロブリンＤおよび周期性発熱症候群（ＨＩＤＳ）；
    （ｖｉｉｉ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）；
    （ｉｘ）全身若年性特発性関節炎；
    （ｘ）成人発症スチル病（ＡＯＳＤ）；
    （ｘｉ）再発性多発性軟骨炎；
    （ｘｉｉ）シュニッツラー症候群；
    （ｘｉｉｉ）スウィート症候群；
    （ｘｉｖ）ベーチェット病；
    （ｘｖ）抗合成酵素症候群；
    （ｘｖｉ）インターロイキン１受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＲＡ）；ならびに
    （ｘｖｉｉ）Ａ２０ハプロ不全症（ＨＡ２０）
    から選択される、請求項４に記載の方法、または請求項５もしくは６に記載の化合物。
  9. 請求項１に記載の結合部位に化合物を結合させるステップを含む、ＮＬＲＰ３活性化を阻害することにより細胞内のまたはミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）を低減する方法。
  10. 請求項１に記載の結合部位に結合するように適合される、ＮＬＲＰ３活性化を阻害することにより細胞内のまたはミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）を低減することにおける使用のための化合物。
  11. 前記化合物が、低分子、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、抗体またはアプタマーである、請求項２～１０のいずれか１項に記載の方法または化合物。
  12. 前記化合物が、前記結合部位に共有結合または非共有結合で結合するように適合されている、請求項２～１１のいずれか１項に記載の方法または化合物。
  13. 前記化合物が、ＮＬＲＰ３の活性化を阻害しかつそれによりＡＴＰがＮＬＲＰ３のＷａｌｋｅｒ Ａおよび／またはＷａｌｋｅｒ Ｂ部位からのＡＤＰに置き換わることを防止する、請求項２～１２のいずれか１項に記載の方法または化合物。
  14. 前記化合物が、Ａｒｇ１８３、Ｇｌｙ２２９、Ｉｌｅ２３０、Ｇｌｙ２３１、Ｌｙｓ２３２、Ｔｈｒ２３３、Ｉｌｅ２３４、Ｇｌｙ３０３、Ａｓｐ３０５、Ｇｌｕ３０６、Ｌｅｕ４１３およびＨｉｓ５２２から選択される１つまたは複数の残基に結合することによりＮＬＲＰ３の活性化の阻害を実行する、請求項２～１３のいずれか１項に記載の方法または化合物。
  15. 前記化合物が、ホスホナート模倣物として作用するモチーフを含む、請求項２～１４のいずれかに記載の方法または化合物。
  16. 化合物をスクリーニングする方法であって、（ｉ）請求項１に記載の結合部位に前記化合物を暴露するステップと、（ｉｉ）前記結合部位への前記化合物の結合の程度を決定するステップを含む、方法。
  17. 前記結合部位への前記化合物の結合の前記程度が、質量分析、ＮＭＲ、Ｘ線結晶解析、ＳＰＲまたは放射性リガンド結合により決定される、請求項１６に記載の方法。
  18. 化合物をスクリーニングする方法であって、（ｉ）請求項１に記載の結合部位に前記化合物を暴露することをコンピュータでシミュレートするステップと、（ｉｉ）前記結合部位への前記化合物の結合の程度を決定するステップを含む、方法。
  19. 請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法により同定される化合物、またはその医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ。
  20. 請求項１に記載の結合部位に結合するように適合された化合物、またはその医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ。
  21. 請求項１９または２０に記載の化合物、または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグと、医薬的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物。
  22. 医薬における使用のための、請求項１９または２０に記載の化合物、または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、あるいは請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. ＮＬＲＰ３阻害に応答する疾患、障害または病気の処置または予防における使用のための、請求項２２に記載の化合物、医薬的に許容できる塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬組成物。
  24. 前記疾患、障害または病気が、
    （ｉ）炎症；
    （ｉｉ）自己免疫性疾患；
    （ｉｉｉ）癌；
    （ｉｖ）感染；
    （ｖ）中枢神経系疾患；
    （ｖｉ）代謝疾患；
    （ｖｉｉ）心血管疾患；
    （ｖｉｉｉ）呼吸器疾患；
    （ｉｘ）肝臓疾患；
    （ｘ）腎臓疾患；
    （ｘｉ）眼科疾患；
    （ｘｉｉ）皮膚疾患；
    （ｘｉｉｉ）リンパ病；
    （ｘｉｖ）精神障害；
    （ｘｖ）移植片対宿主病；
    （ｘｖｉ）疼痛；
    （ｘｖｉｉ）糖尿病に関連する病気；
    （ｘｖｉｉｉ）関節炎に関連する病気；
    （ｘｉｘ）頭痛；
    （ｘｘ）創傷または熱傷；および
    （ｘｘｉ）個体がＮＬＲＰ３の生殖系のまたは体細胞系の非サイレント変異を有すると決定された任意の疾患、
    から選択される、疾患、障害または病気の処置または予防における使用のための、請求項２２または２３に記載の化合物、医薬的に許容できる塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬組成物。
  25. 前記疾患、障害または病気が、
    （ｉ）クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）；
    （ｉｉ）マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）；
    （ｉｉｉ）家族性寒冷自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）；
    （ｉｖ）新生児期発症多臓器系炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）；
    （ｖ）家族性地中海熱（ＦＭＦ）；
    （ｖｉ）化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・ざ瘡症候群（ＰＡＰＡ）；
    （ｖｉｉ）高免疫グロブリンＤおよび周期性発熱症候群（ＨＩＤＳ）；
    （ｖｉｉｉ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）；
    （ｉｘ）全身若年性特発性関節炎；
    （ｘ）成人発症スチル病（ＡＯＳＤ）；
    （ｘｉ）再発性多発性軟骨炎；
    （ｘｉｉ）シュニッツラー症候群；
    （ｘｉｉｉ）スウィート症候群；
    （ｘｉｖ）ベーチェット病；
    （ｘｖ）抗合成酵素症候群；
    （ｘｖｉ）インターロイキン１受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＲＡ）；ならびに
    （ｘｖｉｉ）Ａ２０ハプロ不全症（ＨＡ２０）
    から選択される、疾患、障害または病気の処置または予防における使用のための、請求項２２または２３に記載の化合物、医薬的に許容できる塩、溶媒和物、プロドラッグまたは医薬組成物。
  26. ＮＬＲＰ３活性化を阻害するための、請求項１９もしくは２０に記載の化合物、または医薬的に許容できる塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、あるいは請求項２１に記載の医薬組成物の使用を含む、ＮＬＲＰ３活性化を阻害する方法。
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