JP2022528203A - 腫瘍抑制因子融合物の組成物およびその製造方法 - Google Patents

腫瘍抑制因子融合物の組成物およびその製造方法 Download PDF

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Abstract

必要に応じたシグナルペプチド、血清アルブミン、必要に応じたリンカー、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）、および必要に応じた精製または検出可能なマーカーを任意の順序で含むか、あるいはこれらを本質的になるか、なおさらにはこれらからなる融合タンパク質を本明細書中に提供する。関連するポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、およびキットも開示する。融合タンパク質を被験体に送達させ、癌または腫瘍を処置し、そして／または融合タンパク質を産生する方法をさらに提供する。【選択図】図６Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年４月１２日出願の米国仮特許出願第６２／８３３，２５１号（その内容が、本開示に参考として援用される）の優先権を主張する。
本開示は、新規の腫瘍抑制因子の融合タンパク質およびこれらのタンパク質の製造方法に関する。
ホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）腫瘍抑制因子は、１９９７に同定された。ＰＴＥＮは、癌において非常に頻繁に過剰に活性化されるｐｉ３Ｋ／ＡＫＴキナーゼ経路の活性を下方制御するという重要な任務を担うタンパク質ホスファターゼである。そのようなものとして、ＰＴＥＮは、事実上全ての固形癌、リンパ腫、および白血病において、ならびに全癌症例の約２５％において、原発性癌、転移、癌幹細胞、および／または循環腫瘍細胞のレベルで不活化される。癌患者は、ＰＴＥＮタンパク質を完全に喪失しているか（「ＰＴＥＮヌル」）、細胞内に残存する任意の正常なＰＴＥＮとホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する変異発癌性ＰＴＥＮタンパク質を有し得る。ＰＴＥＮの欠損は、ＰＴＥＮ遺伝子のトランスフェクションもしくはウイルス感染またはタンパク質のリポソームカプセル化による細胞膜の迂回によって修復することができる。細胞内部に活性ＰＴＥＮが放出されると、細胞および異種移植された腫瘍に強く抗癌応答し（例えば、成長の阻害または死滅）、同時に、ｐｉ３Ｋ経路の薬力学的（ＰＤ）バイオマーカー（例えば、ＡＫＴ、ｐＰＲＡＳ４０、ｐＳ６Ｋ）が下方制御される。しかしながら、かかる患者および臨床試験が不足していることから明らかなように、どのアプローチも、いかなる治療的にも商業的にも適用されてこなかった。したがって、癌および他の疾患を処置するために可溶性形態のＰＴＥＮを大量に製造することが必要である。本開示は、このニーズを満たし、関連する利点も得られる。
血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）の連続したアミノ酸と融合したＰＴＥＮ（本明細書中でＰＴＥＮ腫瘍抑制因子とも呼ばれる、例えば、ＰＴＥＮ－Ｌおよび／またはヒトＰＴＥＮ）の連続したアミノ酸を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる組成物を開示する。ヒト血清アルブミンの連続したアミノ酸と融合したＰＴＥＮ腫瘍抑制因子の連続したアミノ酸を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる組成物も開示する。前述の組成物を製造する方法も開示する。
したがって、１つの態様では、本開示は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトＰＴＥＮ－ＬまたはＰＴＥＮ腫瘍抑制因子の連続したアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる融合タンパク質を提供する。１つの態様では、血清アルブミンのアミノ酸配列は、ＰＴＥＮのＮ末端に直接または間接的に抱合されている。別の態様では、血清アルブミンのアミノ酸配列は、ＰＴＥＮのＣ末端に直接または間接的に抱合されている。
１つの態様では、ＰＴＥＮは、ヒトＰＴＥＮ、サルＰＴＥＮ、ラットＰＴＥＮ、もしくはマウスＰＴＥＮ、または各々の断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物の群から選択される。１つの実施形態では、ＰＴＥＮは、ヒトＰＴＥＮ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物である。別の実施形態では、ＰＴＥＮは、マウスの（すなわち、マウス）ＰＴＥＮ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物である。さらにまたはあるいは、ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ（ＰＴＥＮ－Ｌ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物である。別の実施形態では、ＰＴＥＮ－Ｌは、配列番号３またはその等価物のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなるヒトＰＴＥＮ－Ｌである。さらにまたはあるいは、ＰＴＥＮ－Ｌは、配列番号１７１の操作されたポリヌクレオチド配列、配列番号１７１のヌクレオチド（ｎｔ）６４～ｎｔ１７２８、または配列番号１７１もしくは配列番号１７１のヌクレオチド（ｎｔ）６４～ｎｔ１７２８によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるヒトＰＴＥＮ－Ｌである。別の実施形態では、ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮ－Ｍイソ型、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物である。ＰＴＥＮ－Ｍは、配列番号６のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＥＮ－Ｍである。さらにまたはあるいは、ＰＴＥＮ－Ｍは、配列番号１９８の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号６と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるヒトＰＴＥＮ－Ｍである。さらに別の実施形態では、ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮ－Ｎイソ型、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であり、必要に応じて前述のＰＴＥＮ－Ｎは、配列番号７のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＥＮ－Ｎであり、そして／または必要に応じて前述のＰＴＥＮ－Ｎは、配列番号１９９の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号７と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるヒトＰＴＥＮ－Ｎである。さらなる実施形態では、ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮ－Ｏイソ型、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物である。ＰＴＥＮ－Ｏは、配列番号８のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＥＮ－Ｏである。さらにまたはあるいは、ＰＴＥＮ－Ｏは、配列番号２００の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号８と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるヒトＰＴＥＮ－Ｏである。さらなる実施形態では、ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮ－Ｓイソ型、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物である。ＰＴＥＮ－Ｓは、配列番号２またはその等価物のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＥＮ－Ｓである。さらにまたはあるいは、ＰＴＥＮ－Ｓは、配列番号１７２の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号２と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるヒトＰＴＥＮ－Ｓである。なおさらなる実施形態では、ＰＴＥＮは、最小ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物を含む。最小ＰＴＥＮ－Ｓは、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む。さらにまたはあるいは、最小ＰＴＥＮ－Ｓは、配列番号１９７から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１６２と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
１つの態様では、ＰＴＥＮは、配列番号１のアミノ酸１７４～５７６および以下のうちの１つまたはそれ超を含む：配列番号１のアミノ酸２２～２７；配列番号１のアミノ酸４４～５９；配列番号１のアミノ酸４３～７９；配列番号１のアミノ酸８０～１２０；配列番号１のアミノ酸１２１～１７３；および／または配列番号１のアミノ酸１５１～１７３。１つの実施形態では、ＰＴＥＮは、配列番号１のアミノ酸１２１～１７３を含む。さらなる実施形態では、ＰＴＥＮは、配列番号１のアミノ酸１２１～１７３およびＰＴＥＮ－Ｓを含む。さらなる実施形態では、ＰＴＥＮは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＰＴＥＮは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８、１９、１８、１２９ １３１、２５、または５０の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる態様では、ＰＴＥＮは、ＰＲ６１（配列番号１９）またはその等価物のアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
１つの態様では、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０、もしくはその断片の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはそれぞれ配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる融合タンパク質を提供する。１つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、もしくは１３６の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはそれぞれ配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、もしくは１３６と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
さらなる態様では、配列番号１４～１７、２０～２７、２９～３０、３４～３７、４９～５０、１０９～１３２、または各々の断片、類似体、バリアント、もしくは等価物、または各々の変異体のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態では、融合タンパク質は、以下：配列番号１のＳ６５、Ｓ８５、Ｓ８９、Ｓ９１、Ｓ９４、Ｓ１１１、Ｓ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｓ１３４、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８ならびに／または配列番号２のＳ１７０、Ｎ２９２、Ｓ３５５、Ｓ３６０、Ｓ３６６、およびＳ３７０のいずれか１つまたはそれ超に等価な選択された位置の、必要に応じたアスパラギン酸またはグルタミン酸への１またはそれを超える変異をさらに含む。さらにまたは必要に応じて、タンパク質はグリコシル化されている。例えば、タンパク質のセリン（Ｓ）残基および／またはトレオニン（Ｔ）残基のうちの１つまたはそれ超はＯ－グリコシル化されており、そして／またはタンパク質のアスパラギン（Ｎ）残基のうちの１つまたはそれ超はＮ－グリコシル化されている。１つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８、１９、１８、１２９，１３１、２５、もしくは５０、または各々のその断片、類似体、バリアント、もしくは等価物の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
必要に応じて、融合タンパク質は、以下：配列番号１のＳ６５、Ｓ８５、Ｓ８９、Ｓ９１、Ｓ９４、Ｓ１１１、Ｓ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｓ１３４、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８ならびに／または配列番号２のＳ１７０、Ｎ２９２、Ｓ３５５、Ｓ３６０、Ｓ３６６、およびＳ３７０のいずれか１つまたはそれ超に等価な選択された位置の１またはそれを超える変異またはこれらの変異したアミノ酸を保持するその等価物をさらに含む。１つの実施形態では、アミノ酸（複数可）は、アスパラギン酸またはグルタミン酸に変異している。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、以下：配列番号１のＳ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｓ１３４、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８のいずれか１つまたはそれ超に等価な選択された位置の１またはそれを超える変異またはこれらの変異したアミノ酸を保持するその等価物をさらに含む。さらなる実施形態では、融合タンパク質は、以下：配列番号１のＳ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８のいずれか１つまたはそれ超に等価な選択された位置の１またはそれを超える変異またはこれらの変異したアミノ酸を保持するその等価物をさらに含む。
さらに、血清アルブミンは、以下の群から選択される：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、サル血清アルブミン（ＳＳＡ）、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）、もしくはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、または各々の断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物。１つの実施形態では、血清アルブミンは、ＨＳＡ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物である。別の実施形態では、血清アルブミンは、ＭＳＡ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物である。１つの実施形態では、アルブミンは、配列番号１３のアミノ酸３５～３８５もしくは６３～５８５またはその等価物のアミノ酸配列を含む。必要に応じて、血清アルブミンは、配列番号１２のアミノ酸５８（配列番号１３のアミノ酸３４としても公知）に等価な位置の変異またはこれらの変異したアミノ酸を保持するその等価物を含む。さらに必要に応じて、変異は、システインからセリンへの変異である。さらにまたはあるいは、血清アルブミンは、配列番号１３のアミノ酸３４に等価な位置で分子に抱合したアミノ酸またはこれらの変異したアミノ酸を保持するその等価物を含む。分子は、以下の群から選択される：小分子、細胞傷害性分子、リンカー、ｐＨ感受性リンカー、および／またはチオールリンカー。さらなる実施形態では、血清アルブミンは、配列番号１２～１３、９０～９３、および１６３、またはそれぞれ配列番号１２、１３、９０～９３、もしくは１６３と同一または類似の活性を有する配列番号１２～１３、９０～９３、および１６３のうちのいずれか１つの断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物の群から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、血清アルブミンは、配列番号９２、または配列番号９２と同一または類似の活性を有する配列番号９２の断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、血清アルブミンは、配列番号９０、または配列番号９０と同一または類似の活性を有する配列番号９０の断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物のアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態では、血清アルブミンは、配列番号１３、または配列番号１３と同一または類似の活性を有するその断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物のアミノ酸配列を含む。かかる断片のうちの１つは、配列番号１６３のアミノ酸配列を含む。さらにまたはあるいは、血清アルブミンは、配列番号１７６～１７９の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１７６～１７９によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、融合タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含む。１つの実施形態では、シグナルペプチドは、分泌のために融合タンパク質のＮ末端に存在し、そして／または以下の群から選択される：ＨＳＡシグナルペプチド、ＳＳＡシグナルペプチド、ＲＳＡシグナルペプチド、ＭＳＡシグナルペプチド、マウスα２－マクログロブリンのシグナルペプチド、マウスフィブリノゲンシグナルペプチド、マウスα１－抗トリプシンシグナルペプチド、マウスＩｇＧκ鎖シグナルペプチド、ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド、ヒトＣＤ３３シグナルペプチド、または人工シグナルペプチド。さらなる実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号９３～１０５の群から選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号９３、９９、１００、１０３、または１０５の群から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号９３、９９、または１００の群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１８０～１９２の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはそれぞれ配列番号９３～１０５と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされる。
なおさらなる実施形態では、融合タンパク質は、以下のうちの１つまたはそれ超をさらに含む：アルブミンとＰＴＥＮとの間の第１のリンカー、シグナルペプチドのＣ末端の第２のリンカー、および融合タンパク質のＮ末端の第３のリンカー。１つの実施形態では、リンカーのうちの１つまたはそれ超は、癌周囲の細胞または組織に存在するプロテアーゼ、すなわち細胞内プロテアーゼによって必要に応じて切断可能である。さらなる実施形態では、リンカーのうちの１つまたはそれ超は、配列番号４８または１０６～１０８の群から選択されるアミノ酸配列を含む。
１つの態様では、ＨＳＡは、配列番号１２もしくは配列番号１３、もしくは配列番号９０～９２、もしくは配列番号１６３、または各々の等価物、断片、類似体、もしくはバリアントのアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる態様では、ＰＴＥＮまたはＰＴＥＮ－Ｌは、配列番号１、２、３、６、７、８、８８、もしくは８９、もしくは配列番号１３４もしくは配列番号１６２、または各々の等価物、断片、類似体、もしくはバリアントのアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。別の態様では、融合タンパク質は、配列番号２８、１４～１７、１８、１９、２０～２７、２９～３０、５０、１１７～１３２、または配列番号２８、１４～１７、１８、１９、２０～２７、５０、１１７～１３２の各々の断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらにまたはあるいは、融合タンパク質は、配列番号６８、５４～５７、５８、５９、６０～６７、６９～７０、１３６、１４５～１６０、もしくはその断片の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはそれぞれ配列番号６８、５４～５７、５８、もしくは５９、６０～６７、６９～７０、１３６、１４５～１６０によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
１つの態様では、上記のポリペプチドまたは融合タンパク質のうちの任意の１つまたはそれ超は、検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む。
配列番号１８、１９、または各々のその等価物もしくは断片、類似体もしくはバリアントのアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる融合タンパク質をさらに提供する。１つの実施形態では、配列番号２４、または各々のその等価物もしくは断片、類似体もしくはバリアントのアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる融合タンパク質も提供する。別の態様では、配列番号２５、またはその等価物もしくは断片、類似体もしくはバリアントのアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる融合タンパク質を提供する。配列番号１２６、１２８、もしくは１６４～１７１または各々のその等価物もさらに提供する。配列番号２６～２８、３８、５０、１２６～１３２、もしくは１６４～１７１、または各々の断片、類似体、もしくはバリアントのアミノ酸配列のうちのいずれかを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる融合タンパク質をなおさらに提供する。１つの態様では、融合タンパク質は、検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む。
さらなる態様では、融合タンパク質は、アミノ酸配列番号２もしくは３またはその等価物のＰＴＥＮポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。ＰＴＥＮポリペプチドを、本明細書中に記載の血清アルブミン成分と組み合わせることができる。１つの態様では、血清アルブミンは、配列番号１６４もしくは９２またはその等価物のアミノ酸を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる１つの態様では、ＰＴＥＮおよび／または血清アルブミン成分は、本明細書中に記載のシグナルペプチド成分（かかる成分には、配列番号９３、９９、もしくは１００、またはその等価物が含まれる）を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。なおさらなる態様では、ＰＴＥＮおよび／または血清アルブミン成分（必要に応じてシグナルペプチドを含む）は、配列番号４８、１０６～１０８、１６４、もしくは１６５、またはその等価物のアミノ酸のリンカーペプチドを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。１つの態様（ａｐｅｃｔ）では、融合タンパク質は、ＰＲ６１（配列番号６１）を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。これらの成分のみまたは相互の組み合わせをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。ポリペプチド、融合タンパク質、および／またはポリヌクレオチドは、検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含み得る。
本開示の融合タンパク質をコードする単離されたおよび／または操作されたポリヌクレオチド、ならびに前述のポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞系をさらに提供する。１つの態様では、単離されたおよび／または操作されたポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞は、検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む。１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一であり、かつそれぞれ配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、もしくは１３６の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、または１３６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一であり、かつそれぞれ配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、または１３６と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。ある特定の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、１またはそれを超える、表１にまとめられているか、本明細書中に列挙されている任意のポリヌクレオチドから選択される操作されたポリヌクレオチド、または各々に対して少なくとも９０％同一であり、かつまたは同一のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
１つの態様では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。１つの態様では、細胞は、開示のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞は、融合タンパク質の組換え産生に有用である。１つの態様では、ポリヌクレオチドは、配列最適化されている（例えば、配列番号４１～４７、５４～７８、８６、１３５～１６１、１６６～１６７、１７１～１７２、１７６～２００、および２０４～２０６）。宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現させ、前述のポリヌクレオチドの発現を好む条件下で前述の細胞を成長させることによって産生される組換えポリペプチドの産生方法をさらに提供する。さらなる態様では、組換え融合タンパク質は、細胞または培養培地から単離される。細胞は、原核細胞または真核細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）など）、および翻訳後修飾が異なる各細胞によって産生された融合物であり得る。これらの方法によって産生されたタンパク質、ポリペプチド、よび融合物も提供する。
１つの態様では、融合タンパク質（例えば、アルブミン－ＰＴＥＮ融合タンパク質）を、ポリヌクレオチド（例えば、アルブミン－ＰＴＥＮポリヌクレオチド）をコードする前述の融合タンパク質の発現に適切な条件下で前述の融合タンパク質（例えば、アルブミン－ＰＴＥＮ融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養する工程を含み、細胞培養物または培養培地から細胞によって産生された融合タンパク質を単離する工程を必要に応じてさらに含む過程によって産生する。細胞は、原核細胞または真核細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など）であり得る。これらの方法によって産生されたタンパク質、ポリペプチド、よび融合物も提供する。本明細書中に開示の融合タンパク質を産生する方法をさらに提供する。前述の方法は、融合タンパク質の発現に適切な条件下で融合タンパク質を発現することができる宿主細胞を培養する工程、および必要に応じて細胞または細胞培養培地から融合タンパク質を精製または単離する工程を含む。この方法は、同一の宿主細胞を介して同一の条件下で産生された野生型ＰＴＥＮ－Ｌタンパク質と比較して、収率および／または安定性が高い。
融合タンパク質（複数可）、ポリヌクレオチド（複数可）、ベクター（複数可）、および／または宿主細胞（複数可）のうちの１つまたはそれ超、ならびに担体（例えば、薬学的に許容され得る担体）を含む組成物も提供する。１つの実施形態では、ベクターは、宿主細胞および／または被験体において融合タンパク質を発現するウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ、ＨＳＶ、またはアデノウイルスベクター（ＡｄＶ））である。１つの態様では、融合タンパク質（例えば、本明細書中に開示のアルブミン－ＰＴＥＮ融合タンパク質）、ならびに少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体および必要に応じた安定剤または防腐剤を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる医薬組成物を本明細書中に提供する。組成物は、さらなる治療剤（例えば、本明細書中に開示の化学療法剤および／または併用療法剤）を必要に応じて含む。
したがって、有効量の本明細書中に開示の融合タンパク質、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および／または前述のポリヌクレオチドを含むベクターのうちの１つまたはそれ超を、細胞と接触させることによる、癌細胞の成長を阻害する方法をさらに提供する。接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏであり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する場合、前述の方法は、癌に対する単独または他の治療薬との組み合わせた融合ポリペプチドの有効性を試験するのに有用である。動物内においてｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する場合、前述の方法は、単独または他の治療薬との組み合わせの有効性を試験するための都合の良い動物モデルを提供する。１つの態様では、癌は、固形腫瘍および／または非固形（例えば、血液）癌を指す。さらにまたはあるいは、癌はＰＴＥＮ発現を欠く。例えば、癌のＰＴＥＮ染色のＨスコアは約２０またはそれ未満である。Ｈスコアの計算方法は、当業者が利用可能である（例えば、本明細書中に開示されている）。別の態様では、癌は、対照と比較してｐｉ３Ｋ経路薬力学バイオマーカー（例えば、ＡＫＴ、ｐＰＲＡＳ４０、ｐＳ６Ｋ、ｐＧＳＫ３、ｐＦＯＸＯ、またはその任意の組み合わせ）が増加する。かかる対照は、いかなる癌や腫瘍も存在しない被験体由来の生物試料、また別の癌の生物試料であり得る。さらなる実施形態では、前述の方法は、有効量の本明細書中に開示の併用治療薬と細胞を接触させる工程を含む。
被験体における癌を処置する方法であって、有効量の融合タンパク質／ポリペプチド、融合タンパク質／ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはポリヌクレオチドを含むベクターのうちの１つまたはそれ超を被験体に投与し、それにより、癌を処置する工程を含む、方法も提供する。１つの態様では、癌は、固形腫瘍および／または非固形（例えば、血液）癌を指す。さらにまたはあるいは、癌はＰＴＥＮ発現を欠く。例えば、癌のＰＴＥＮ染色のＨスコアは約２０またはそれ未満である。Ｈスコアの計算方法は、当業者が利用可能である（例えば、本明細書中に開示されている）。別の態様では、癌は、対照と比較してｐｉ３Ｋ経路薬力学バイオマーカー（例えば、ＡＫＴ、ｐＰＲＡＳ４０、ｐＳ６Ｋ、ｐＧＳＫ３、ｐＦＯＸＯ、またはその任意の組み合わせ）が増加する。かかる対照は、いかなる癌や腫瘍も存在しない被験体由来の生物試料、また別の癌の生物試料であり得る。さらなる実施形態では、前述の方法は、有効量の本明細書中に開示の併用治療薬を被験体に投与する工程を含む。
有効量の融合タンパク質／ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはベクターのうちの１つまたはそれ超を投与し、それにより前述のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または組成物を被験体に送達させることによる、融合タンパク質／ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または前述を含む組成物を被験体に送達させる方法をさらに提供する。必要に応じて、融合タンパク質は、被験体の癌の細胞外基質（ＥＣＭ）に送達される。
融合タンパク質／ポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞のうちの１つまたはそれ超、ならびに必要に応じた併用療法薬および／または使用説明書を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなるキットをさらに提供する。
図１は、６ｘＨｉｓタグの位置がＰＴＥＮ－Ｌの発現および溶解性に予想外の影響を及ぼすが、製造可能性はいかなる場合でも容認できないことを示す代表的なゲルの結果を提供する。細胞質またはペリプラズムのＮ’またはＣ’末端を６ｘＨｉｓでタグ化したＰＴＥＮ－Ｌバリアントタンパク質（６３ＫＤａ；矢印）を、示すように、Ｔ５プロモーターの調節下でＢＬ２１大腸菌中で発現させた。細胞を、標準的な手順によって誘導するか誘導しないままにし、次いで、１×ＴＢＳ ｐＨ７．４で溶解した。全画分（ＴＯＴ）および可溶性画分（ＳＯＬ）を調製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動し；ゲルをクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ）で染色した。
図２は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍがヒトＰＴＥＮ－Ｌを分泌できない代わりに、タンパク質が細胞質内の細胞内封入体内に捕捉されたままであることを示す。
図３は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍがｍａｎＢのような外因性酵素を分泌することができるが、ヒトＰＴＥＮ－Ｌは分泌できないことを示す。
図４は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓがＰＴＥＮ－Ｌまたはヒト血清アルブミン－ＰＴＥＮ－Ｍ融合物を作製することができないことを示す。
図５Ａ～５Ｂは、Ｎ末端チオレドキシン－ＰＴＥＮ－Ｍ融合タンパク質に関して得た結果を提供する。（図５Ａ）Ｓｆ９昆虫／バキュロウイルス系は、Ｎ末端チオレドキシン－ＰＴＥＮ－Ｍ融合物（ＷＢ、レーン１、上のボックスで囲んだ８２ＫＤａのバンド；矢印）および短縮ＰＴＥＮ－Ｍ（ＷＢ、レーン１、下のボックスで囲んだ６５ＫＤａのバンド）を分泌することができ、一方、外因性タンパク質の大部分は細胞内に残存する（ＷＢ、レーン３～４）。タンパク質上のＣ末端６ｘＨｉｓタグを標的にするＷＢを示す。しかしながら、６５ＫＤａバンドのＬＣ／ＭＳタンパク質配列決定によって判断した場合、６５ＫＤａバンドは６Ａｒｇを含む最小細胞透過ドメイン（ＭＣＰＤ；配列番号３９）を欠き（図５Ｂ）、この系は、要するに、ＰＴＥＮの工業生産における価値があったとしてもほとんどないことを実証している。
図６Ａ～６Ｄは、融合タンパク質および産物プラスミドの代表的な図を示す。（図６Ａ）本明細書中に開示の重要な哺乳動物ＰＴＥＮ－アルブミン融合物の図。ＰＲ４０２の方向はＮ’－ＰＴＥＮ－Ｌ－ヒト血清アルブミン－Ｃ’であるのに対して、ＰＲ６１は逆方向である：Ｎ’－ヒト血清アルブミン－ＰＴＥＮ－Ｓ－Ｃ’。ＰＲ４０２（例えば、ＰＲ３）およびＰＲ６１（例えば、ＰＲ６５）の両方の逆バージョンは、ＣＨＯ－３Ｅ７細胞によって有意義な量まで分泌することはできない。ＰＲ４０７は、２つのドメインの間にインフレームで付加されたカテプシンＢ－切断可能リンカーを有するＰＲ４０２であり、癌周辺領域でこの癌関連プロテアーゼのみによって切断することができる。ＳＰ：タンパク質分泌の際に切断されるヒト血清アルブミンのシグナルペプチド（配列番号９３）。さらなる詳細については、実施例および表１を参照のこと。（図６Ｂ）ＰＲ４０２様融合物およびＰＲ６１様融合物、ならびに重要な市販の抗ＰＴＥＮモノクローナル抗体および抗アルブミンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合部位および特徴の略図。これらのｍＡｂのうちのいくつかは、販売者によってＨＲＰ－抱合体として市販されている（星印で示す）。クエスチョンマークは、結合部位が未知または推定であることを意味する。ｍＡｂの種選択性を、各ボックスの下に以下のように示す：Ｍ：マウス；Ｒ：ラット；Ｓ：サル；Ｈ：ヒト。（図６Ｃ）本研究において種々のＰＲ（表１を参照のこと）を発現するために使用したｐＴＴ５哺乳動物発現ベクターの図。ベクター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ポリアデニル化シグナル、複製起点など）の顕著な特徴を示す。さらなる詳細を、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ＆Ｌｏｉｇｎｏｎ、（２００９）；および米国特許第８６３７３１５号で見出すことができる。最適化されたＰＲｃＤＮＡを、ベクターポリリンカー中の固有のＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてクローン化した。全ての場合において、断片／ベクターの同一性を、制限分析およびＤＮＡ配列を用いて確認した。（図６Ｄ）アルブミン－ＰＴＥＮ融合物を発現する組換え腫瘍崩壊性ＨＳＶ－１ベクターの構築（上のパネル）およびＨＳＶゲノム上のゲノム座標（下のパネル）。上のパネルでは、ＨＳＶ－１ゲノムを実線で示し、それに対して、目的の遺伝子をボックスで囲んでいる。図は正確な縮尺率ではない。下のパネルでは、各プライマーは、例えば、ＩＣＰ４７上流隣接領域順方向プライマー４７ｕｐＦ（配列番号２１２）がＨＳＶ－１ゲノムのチミジン１４３，６７５～シトシン１４３，６９９に結合し、それに対して、残りのプライマー配列がクローニングに使用されるようにマッピングされている。符号は、ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＣ＿００１８０６．２を参照している。
図７は、ＣＨＯ－３Ｅ７細胞上清中に分泌された種々の変異体の発現および安定性を示す。Ｆ－１ ｐａｎ－ＰＴＥＮ抗体（Ａｂ）（その結合部位については図６Ｂを参照のこと）が上清中の３００ＫＤａタンパク質にも非特異的に結合することに留意のこと（レーン１３）。
図８Ａ～８Ｂは、分泌されたＰＲ１～４（図８Ａ）およびＰＲ５～８（図８Ｂ）の発現および安定性に関する、３つの異なる条件下で成長させたＨＥＫ２９３細胞とＣＨＯ－３Ｅ７細胞との比較を示す。
図９は、チオレドキシンのＣ末端でのＰＴＥＮ－Ｌの融合物が、他の哺乳動物細胞においてＴｒｘ１分泌を媒介することが知られている非標準的（リーダーレス）経路を介して、ＣＨＯ－３Ｅ７によって得られた（ＰＲ４３０）融合物を全く分泌しないことを示す。星印は、同一条件下でのＰＲ４０２およびＰＲ６１の首尾の良い分泌を示す。
図１０は、ＰＲ４０１、ＰＲ４０３、およびＰＲ４０４の全てがフューリン様プロテアーゼによって切断され、それに対して、推定フューリン様配列を依然として含むＰＲ４０２の大部分が保護されることを示す。
図１１Ａ～１１Ｄは、ＰＴＥＮ－Ｌの最小細胞透過ドメイン（６ｘＡｒｇ）がフューリン様媒介切断の標的であることを示す。（図１１Ａ）ＰＲ３およびＰＲ５の分解傾向を、非特異的プロテアーゼ阻害剤様クエン酸第二鉄（Ｆ；Ｌｏｎｚａ ＢＥ０２－０４３Ｅ；１０倍最終濃度に希釈して１ｄｐｔで使用）やＳｉｇｍａ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩ；＃Ｐ１８６０；８００倍希釈にて１ｄｐｔおよび１，６００倍希釈にて３ｄｐｔで使用）での培養物の処理によって逆転させることができない；対照的に、ＰＲ６は、プロテアーゼ阻害と無関係に安定である。Ｕ：未処理；Ｍ：偽；Ｄレーン：前の調製物由来の陽性対照抽出物（レーン６Ｄは、いくらかの「ゲルスマイリング」を示し、再現性がなかった）。（図１１Ｂ）ＰＲ３切断は細胞透過性フューリンペプチド阻害剤に感受性を示したが、培養を継続するにつれて効果が低下する（Ｆ；Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃３４４９３０；０．５％ＤＭＳＯ中最終濃度５０μＭ）。Ｄ：ＤＭＳＯ（０．５％）；Ｕ：未処理。細胞生存率は、全ての場合において２ｄｐｔで９３．７％超であった；６ｄｐｔでの生存率は以下であった：レーン（４～６）；（１０～１２）；および（１６～１８）について、それぞれ、（７３、７９、８８）；（８３、９１、９０）；および（８４、８３、８７）。（図１１Ｃ）フューリン様プロテアーゼは、コンセンサス配列内のＰＲ１を切断する。（図１１Ｄ）ＰＲ３と異なり、ＰＲ３４はＰＴＥＮ－Ｍの最小細胞透過ドメインを欠くため、フューリン様プロテアーゼによる切断から保護される。
図１２Ａ～１２Ｄは、種々の融合タンパク質の分泌に対する評価を提供する。（図１２Ａ）ＰＲ４０２上のシグナルペプチド（ＳＰ）配列の最適化。成熟ＰＴＥＮ－Ｌ ＨＳＡ融合物は、ヒト血清アルブミンシグナルペプチド（ＰＲ４０２；対照）、またはマウスα２－マクログロブリンのシグナルペプチド（ＰＲ４１９）、マウスフィブリノゲン（ＰＲ４２０）、マウスα１－抗トリプシン（ＰＲ４２１）、マウスＩｇＧκ鎖（ＰＲ４２２）、ヒトＩｇＧ重鎖（ＰＲ４２４）、ヒトＣＤ３３（ＰＲ４２５）、およびＧｕｌｅｒ－Ｇａｎｅ ｅｔ ａｌ，（２０１６）ＰＭＩＤ：２７１９５７６５由来の２つの人工ＳＰ（ＰＲ４２６およびＰＲ４２７）の調節下で発現および分泌された。ＰＲ４２８（ＰＲ４０２のマウス等価物）の発現および分泌も示す。（図１２Ｂ）ＰＲ４０２ ＰＴＥＮ－Ｌ ＨＳＡ融合物のバリアント（ＰＲ４１５）と異なり、ＰＴＥＮ－Ｍ ＨＳＡ融合物（ＰＲ４１６）は、ＣＨＯ－３Ｅ７細胞によって分泌することができない。ＰＲ４１５およびＰＲ４１６は、いわゆるＨＳＡのスカベンジャーＣｙｓ３４のＣｙｓ３４Ｓｅｒ点変異を含む。この変異はＰＲ４１５に影響を及ぼさず、対照ＰＲ４０２融合物と同様に発現および分泌される。（図１２Ｃ）ＰＲ４０２の上流に酸性血球凝集素（ＨＡ）タグを付加すると、逆にＣＨＯ－３Ｅ７上清中の分泌が増加するようである（ＰＲ４０９）。ＨＳＡのドメインＩ（ａａ１～１９８）は、ＰＴＥＮ－Ｌ－ＨＳＡ融合物（ＰＲ４１４）の安定化および分泌には不十分であり、それに対して、少なくともドメインＩおよびＩＩ（ａａ１～３８５；ＰＲ４１３）、最も好ましくは全ＨＳＡ（ａａ１～５８５）は、この目的のために必要である。（図１２Ｄ）成熟ＨＳＡの最初の３４および６２ａａを欠くＰＲ４１７およびＰＲ４１８の両方が対照ＰＲ４０２と類似のレベルまで発現されるので、ＨＳＡの最初の６２ａａは、ＣＨＯ細胞上清中のＰＲ４０２分泌には不必要である。
図１３は、逆変異ＰＲ６１およびそのマウス（ＰＲ６８）およびラット（ＰＲ６６）のホモログと異なり、ＰＲ６５がＰＲ４０２に類似のドメイン構造を有するにもかかわらず（ＰＴＥＮ－Ｓ－ＨＳＡおよびＰＴＥＮ－Ｌ－ＨＳＡ）、驚いたことにＰＲ６５はＣＨＯ細胞上清中に検出可能にはほとんど分泌されないことを示す。著しいことに、ＲＳＡのドメインＩＩＩ（ＰＲ６７）は、ＰＴＥＮ－Ｌ安定化とは対照的に、ＰＴＥＮ－Ｓ安定化には見かけ上不要である（図１２Ｃ）。ＣＨＯ－３Ｅ７細胞上清中のＰＲ６１様タンパク質の収量を評価するために、種々の量のＢＳＡ（精製組換えウシ血清アルブミン）をゲル中に含めた。
図１４は、ＰＲ４０２のＰＴＥＮ－Ｌとアルブミンドメインとの間にＭＭＰ２／９切断可能リンカーをインフレームで付加すると、ＰＲ４０２と同様にフューリンによる切断可能から保護された融合タンパク質（ＰＲ４０５）が得られることを示す。対照的に、等価な位置にフューリン切断可能リンカーを含むＰＲ４０１は完全に分解される。
図１５は、ＰＲ４０２、ＰＲ４０５、ＰＲ４０６、ＰＲ４０７、およびＰＲ４０８のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化に関する結果を提供し、ＰＴＥＮ－Ｌ様の約７０ＫＤａの断片（星印）が放出される、組換えＭＭＰ２（ＰＲ４０５のみ）およびＣＡＴＳＢ（ＰＲ４０７、ＰＲ４０８のみ）による配列およびｐＨに特異的な融合物の切断を実証している。
図１６Ａ～１６Ｂは、ＰＲ４０２産生の評価を提供する。（図１６Ａ）イミダゾールアフィニティクロマトグラフィによるＰＲ４０２の製造および精製スカウティング（クーマシー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ）で染色した４～１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル）。開始時（ＳＮ；レーン１）、通過画分（ＦＴ；レーン２）、洗浄（３～４）、および精製し、脱塩したタンパク質（レーン５）を示す。レーン６は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ前に還元しなかった精製ＰＲ４０２に対応する。（図１６Ｂ）１３０ＫＤａにセミピュアＰＲ４０２を示すＦ－１ ｐａｎ－ＰＴＥＮ抗体を使用した（図１６Ａ）由来の表示のレーンのＷＢ。
図１７Ａ～１７Ｃは、ＰＲ４０５産生の評価を提供する。Ｃｉｂａｃｒｏｎ ＢｌｕｅアルブミンアフィニティクロマトグラフィによるＰＲ４０５（星印で示す）の製造および精製スカウティング（図１７Ａ）、その後のアルブミン分解物（十字で示す）を除去するためのヘパリンアフィニティクロマトグラフィ（図１７Ｂ）、それによって得られた実質的に純粋なＰＲ４０５（図１７Ｃ）。ＳＴ：カラムの出発物質；ＦＴ：カラムの通過画分；ｂＤ：透析前にプールした試料；ＤＰ：ＰＲ４０５が透析中に可溶性を維持していることを示す、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中に溶解した透析沈殿物；Ｗ：カラム洗浄物；Ｐ：陽性対照６ｘＨｉｓタグ化タンパク質。図１７ＡおよびＢにＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示し、図１７Ａ～ＣにＷＢ（抗６ｘＨｉｓ）を示す。
図１８は、疎水性相互作用クロマトグラフィでのＰＲ４０２の経時バッチの精製スカウティングを示す。ＰＲ４０２は、高濃度の塩の存在下でカラムに結合し、塩濃度の低下によってカラムから溶出することができる。Ｐ：陽性対照６ｘＨｉｓタグ化タンパク質。
図１９Ａ～１９Ｃは、ＩＭＡＣ精製済みの（図１６Ａ～１６Ｂ）ゲルから切り出した単量体タンパク質のＬＣ／ＭＳによって判定した場合に、翻訳後修飾（図１９Ａ）ＰＲ４０２に関する分析によって配列が正確に予測されたことを示す。有効範囲は９９．６％であった。（図１９Ｂ）ＩＭＡＣ精製済みのゲルから切り出した単量体ＰＲ４０２融合物およびＦ１３７融合物（ドメイン構造：それぞれ、ＬＵＤ－ＰＴＥＮ－Ｓ－ＨＳＡおよびＬＵＤ－ｐ５３－ＨＳＡ）のＬＣ／ＭＳによって判定した場合、ＬＵＤは、重度にＯ－グリコシル化されたムチン様構造である。ＰＲ４０２のＬＣ／ＭＳと対照的に、ＨＳＡシグナルペプチド（配列番号９３）は、Ｆ１３７のＬＣ／ＭＳスペクトルで検出することができ、Ｆ１３７融合物が適切に切断されていないことが示唆され；これはおそらく、Ｆ１３７ Ｏ－グリカンコーティングが非常に不均一であるからと考えられることに留意のこと。下のパネルは、ＰＲ４０２（上のライン）およびＦ１３７（下のライン）の実験によって決定されたＯ－グリカンのアラインメントの図を示し、これは、Ｏ－グリカン標的残基が高度に一致していることを示す。ボックスで囲んだアミノ酸は、Ｏ－グリカンコーティングされた残基を表す。太字の残基は、マウスで見いだされたヒト配列の変異に対応し（Ｓ８５ＣおよびＳ１２９Ｇ）；これは、げっ歯類では見いだされないＳ８５およびＳ１２９のＯ－糖アンテナがヒトにおけるさらなる機能を果たし得ることを示し；Ｓ１１６Ｇは、サルで見いだされた唯一のＰＴＥＮ－Ｌ変異であり、また、この変異により、高度にグリコシル化されたＳ１２８～１３０クラスター内でサルとヒトとの間のＯ－糖プロフィールがわずかに異なり得る。（図１９Ｃ）ＬＣ／ＭＳによって判定した場合のＰＲ４０２のＰＴＥＮ－Ｓ部のＮ－グリカンおよびＯ－グリカン連結残基。Ｔｎ：Ｔｎ抗原（ＧａｌＮＡｃ）；Ｔｆ：Ｔ抗原（ＧａｌＮＡｃ－３Ｇ）；ｓＴ：シアリル－Ｔ抗原（ＧａｌＮＡｃ－３ＳＧ）；２ｓＴ：ジシアリル－Ｔ抗原（ＧａｌＮＡｃ－６Ｓ－３ＳＧ）。
図２０Ａ～２０Ｈは、本明細書中に開示のＰＴＥＮ－アルブミン融合物が機能的な細胞透過性腫瘍抑制因子であることを示す。（図２０Ａ）（上のパネル）ＰＴＥＮヌル（ＫＴＯＳＡ）またはＰＴＥＮ－Ｓ－ヌル（ＲＥＭ１３４）癌細胞のいずれかに４時間接触させたＰＲ５ ＣＨＯ－３Ｅ７細胞上清中に含まれる外因性ＰＴＥＮ－Ｍ（約７０ＫＤａ；星印）は、細胞に侵入し、ｐＳ６Ｋのリン酸化を下方制御する。ｐａｎ－ＰＴＥＮ ｍＡｂ １３８Ｇ６、ｐＳ６Ｋのリン酸化型特異的抗体（Ｔ３８９）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号９２０２）、またはローディグ対照としてのβ－アクチン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号１３Ｅ５）を使用した総ＫＴＯＳＡおよびＲＥＭ１３４細胞抽出物のＷＢを示す。（下のパネル）上記で使用した同一のＰＲ５ ＣＨＯ－３Ｅ７細胞上清を抗ＰＴＥＮ抗体および抗ＨＳＡ抗体でブロッティングして、ＰＴＥＮ－Ｍ含有断片（星印）またはＨＳＡ含有断片（十字）を可視化した。同一であった両方のブロットのポンソー染色に基づいて（ここではＨＳＡポンソーＳ染色のみ示す）、ＰＲ５ ＣＨＯ－３Ｅ７上清がアルブミン分解物を実質的に含み、ＰＴＥＮ－Ｍはほとんど存在しないと結論づけることができる。Ｆ－１ブロットで認められた３００ＫＤａバンドは、ＰＲ５凝集体または宿主細胞タンパク質であり得る（図７、説明文など）。Ｍｃｋ：偽。（図２０Ｂ）ＰＲ４０２は、ＰＴＥＮヌルＰＣ３前立腺癌細胞に侵入する。ＰＣ３細胞に、表示最終濃度のＩＭＡＣ精製ＰＲ４０２（図１６など）を４時間または２４時間投与した。レーン２～４および８～１０では、セミピュアＰＲ４０２ストック溶液を、新鮮な培養培地で希釈し、次いで、ＰＣ３細胞に添加したのに対して、レーン６および１２では、ストック溶液を等体積の粗製の偽トランスフェクトしたＣＨＯ－３Ｅ７上清で希釈して、後者の要因がＰＲ４０２細胞進入に影響を及し得るかどうかを調査した。細胞抽出物を、いくつかの非特異的バンド（図７で報告した３００ＫＤａバンドを含む）を認識し、それにもかかわらず、内部対照としての機能を果たすＦ－１ 抗ＰＴＥＮｍＡｂでブロッティングした。ＰＲ４０２の進入は、１０ｎＭ ＰＲ４０２（レーン３）で既に目視可能であるが、１００ｎＭで特に４時間後に顕著になる（レーン４、６、１０、および１２の１３０ＫＤａ）。（図２０Ｃ）カスパーゼ３／７－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイによって測定した場合、セミピュアＰＲ４０２の２つの個別のバッチは、たった１時間の処置後にＰＣ３前立腺癌細胞に対して類似のレベルのアポトーシスを開始させる。（図２０Ｄ）カスパーゼ３／７－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイによって測定した場合、ＰＲ４０２は、ＰＴＥＮヌルＳＫ－ＭＥＬ－２８ヒト黒色腫細胞の用量反応性細胞死を開始させる。（図２０Ｅ）カスパーゼ３／７－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイによって測定した場合の、ＰＲ４０２によるマウス４Ｔ１トリプルネガティブ乳癌細胞およびマウスＩＤ－８卵巣癌細胞の細胞死の用量反応性の開始。ＧＬ２６１マウス膠芽細胞腫細胞は、ＰＲ４０２または１μΜのスタウロスポリン（このアッセイのための陽性対照としての機能を果たす）のいずれかによるアポトーシスに抵抗性を示す（データ示さず；全てのＰＲ４０２反応性細胞（例えば、４Ｔ１など）もスタウロスポリン開始細胞死に反応した）。（図２０Ｆ）ＰＲ６１はＰＴＥＮヌルＰＣ３前立腺癌細胞に進入してその死滅を開始させる。９６ウェルプレートで成長させた５００個のＰＣ３細胞を、無血清成長培地で完全に洗浄した。洗浄した培地をデカントし、ＰＲ６１（レーン２）または空のｐＴＴ５ベクター（レーン４）のいずれかでトランスフェクトされているＣＨＯ－３Ｅ７細胞由来の培養上清と置換した。ＰＣ３細胞を、これらのＣＨＯ－３Ｅ７馴化培地を用いて３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、細胞を無血清成長培地で２回洗浄し、最後にＣＡＳＰ３／７ ＴｉｔｅｒＧｌｏ溶解緩衝液で溶解した。ライセートの半分を抗６ｘＨｉｓでブロッティングし（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ；上のパネル）、それに対して、ライセートの他方の半分をルシフェラーゼ測定のために処理した（下のパネル）。結果は、ＣＨＯ－３Ｅ７細胞上清中に含まれるＰＲ６１（レーン３、投入タンパク質についての６１／Ｉ染色）がＰＣ３細胞に進入してこれらを死滅させることができることを実証している。（図２０Ｇ）ＦｃＲｎ結合ドメイン（ＨＳＡ ｄＩＩＩ）は、癌細胞内のＰＲ６１様タンパク質の進入には不要である。ＰＲ６７およびＰＲ６８をＣＨＯ－３Ｅ７細胞内に発現させ、ＩＭＡＣで均質度約７０％まで精製し、２０ｍＭクエン酸（ｐＨ）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ６．３）緩衝液中で透析した（上のパネル）。タンパク質を無血清成長培地で１：２に希釈し、細胞上に１時間直接適用した。細胞ライセートを、抗６ｘＨｉｓ ｍＡｂ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）でブロッティングした（下のパネル）。Ｒ：還元試料；ＮＲ：非還元試料；Ｍｃ：無血清成長培地で処置した細胞；Ｂ：５０％クエン酸緩衝液および５０％培地で処置した細胞；１３７：細胞進入の陽性対照として精製Ｆ１３７（ＬＵＤ－ｐ５３－ＨＳＡ）を使用した。Ｐ：ｍＡｂ陽性対照としての機能を果たすｐｏｌｙ－ｔａｇタンパク質（ＧｅｎＳｒｉｐｔ）。（図２０Ｈ）カスパーゼ３／７－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイによって測定した場合、Ｆ１３７は、ＰＣ３細胞死の開始に関してＰＲ４０２と効力が等しい（共に１μΜで使用）。
図２１Ａ～２１Ｅは、ＰＲ４０２およびＰＲ６１のためのＰＫ法開発スカウティングを示す。３Ａ４．１／Ａ２Ｂ１ ｍＡｂ組み合わせを使用してラット血漿（図２１Ａ）、サル血漿（図２１Ｂ）、ホモジナイズされたラット器官抽出物（図２１Ｃ）のいずれかにスパイクされた漸増量（０～１００ｎｇ）のＩＭＡＣ精製ＰＲ４０２のＩＰ－ＷＢ。それぞれ、ＰＲ４０２（１３０ＫＤａ）を星印で示し、それに対して、夾雑物を十字で示し、アルブミンをクエスチョンマークで示す。左から２番目のレーン（Ａ、Ｂ）またはＰＲ４０２レーン（Ｃ）は、Ａ２Ｂ１による出発物質のＷＢであり、投入物中の３Ａ４．１抗体によって認識されないＰＲ４０２分解産物の存在を示す。乳房抽出物で６ｍｇ／ｍｌであったことを除いた全てのＩＰ中に約１６ｍｇ／ｍｌの総基質タンパク質を含んでいた。（図２１Ｄ）漸増体積のＰＲ６１を発現する粗ＣＨＯ－３Ｅ７細胞上清（ＰＲ６１の評価最終量が０～２００ｎｇになる）を、ラット血漿（レーン１～５）またはＰＢＳ（レーン６～１０）にスパイクし、次いで、１３８Ｇ６／Ｆ－１０ ｍＡｂ組み合わせを使用してＩＰ－ＷＢのために処理した。Ｒ６１（１２０ＫＤａ）を星印で示し、それに対して、５０ＫＤａおよび７０ＫＤａの夾雑物を十字で示す。両方の夾雑物は、１３８Ｇ６ ｍＡｂによって特異的に免疫沈降される（レーン５と１０を比較のこと）。レーン１１は、Ｆ－１０による出発物質のＷＢに対応し、投入物中の１３８Ｇ６抗体によって認識されないＰＲ６１分解産物の存在を示す。（図２１Ｅ）評価量５０ｎｇのＰＲ６１（偶数レーン；星印）を発現する粗ＣＨＯ－３Ｅ７細胞上清または等体積の偽トランスフェクトしたＣＨＯ－３Ｅ７細胞由来の上清（奇数レーン）を、ＰＢＳまたはステージＩＶ肺癌患者由来の血漿（ＰｒｏＭｅｄＤｘ，Ｎｏｒｔｏｎ，ＭＡ）にスパイクした。チューブを３７℃でｔ＝０またはｔ＝８時間インキュベートし、次いで、（図２１Ｄ）にあるようにＳＰ２１８／Ｆ－１０ Ａｂ組み合わせを用いたＩＰ－ＷＢに供した。１３８Ｇ６と同様に、ＳＰ２１８ ｍＡｂは、５０ＫＤａおよび７０ＫＤａのタンパク質も特異的に免疫沈降される（レーン２および６対４および８；十字）。両方の夾雑物は、偽調製物およびＰＲ６１調製物に存在せず（レーン９～１０）、これは癌患者の血清中に既存していたことを示す。また、実験は、ＣＨＯ－３Ｅ７上清のような粗供給源（細胞デブリおよびこれから放出されたプロテアーゼに富む）中に含まれるＰＲ６１であっても、ＰＢＳ（物理化学安定性）または癌血清（細胞デブリから放出されたプロテアーゼに対する抵抗性）のいずれかにおいて長時間（８時間）インキュベートした場合に非常に安定であることを実証している（ＰＲ６１バンドの強度をレーン２および６と４および８で比較した場合）。
発明の詳細な説明
２０１３年に、ＰＴＥＮ－Ｌ（ＰＴＥＮ－ＬｏｎｇまたはＰＴＥＮαとしても公知の、選択的転写開始を介してＰＴＥＮ ｍＲＮＡから発現された翻訳イソ型）が同定された（Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＭＩＤ：２３７４４７８１）。全長ヒトプレ－ＰＴＥＮ－Ｌタンパク質（ｃＤＮＡ配列番号１７７に対応する配列番号１）は、標準的なＰＴＥＮタンパク質（４０３ａａ、配列番号１７８に対応する配列番号２；本明細書中で「ＰＴＥＮ－Ｓ」と称される）のＮ末端に１７３個のさらなるアミノ酸（ａａ）のＰＴＥＮ－Ｌ固有ドメイン（「ＬＵＤ」）を有する。
ＰＴＥＮタンパク質は、哺乳動物で非常に保存されている。例えば、ＰＴＥＮ－Ｓは、アミノ酸レベルでマウスとラットの間で同一であり（配列番号８８；対応するマウスＰＴＥＮ－Ｓ ｃＤＮＡは配列番号１６６である）、ヒトＰＴＥＮ－Ｓ（配列番号２）に対してたった１つのＳｅｒ＞Ｔｈｒ（すなわち、セリンからトレオニンへの）変換しかなく（アミノ酸レベルでの同一率９９．９％）、それに対して、マウスマウスＰＴＥＮ－Ｌ（タンパク質配列番号８９；ｃＤＮＡ配列番号１６７）は、ヒトＰＴＥＮ－Ｌ（配列番号３）に対してたった１０しか変異していない（アミノ酸レベルでの同一率９８．２％）。
成熟ヒトＰＴＥＮ－Ｌ（配列番号３のアミノ酸（ａａ）２２～５７６）は、プレタンパク質（配列番号１）からの２１－アミノ酸シグナルペプチドリーダー配列（配列番号４）の切断の際に血中に分泌される。成熟ヒトＬＵＤ（配列番号５のａａ２２～１７）は、アルギニンが豊富な最小細胞透過ドメイン（「ＭＣＰＤ」；タンパク質配列番号３９、ｃＤＮＡ配列番号１６９；それに対して、ＭＣＰＤは、配列番号１のａａ４７～５２に対応する）を含み、これは、３０を超える癌細胞株においてＰＴＥＮ－Ｌの効率的な細胞進入を媒介するが、その侵入は「正常」細胞では遥かに少ない（例えば、ＭＣＦ１０Ａ；Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，２０１３：ＰＭＩＤ：２３７４４７８１）。ＭＣＰＤは透過に必要であるが、膜結合ドメイン（ＭＢＤ；配列番号４０、ＬＵＤのＣ末端部分で配列番号１のａａ１５１～１７３に対応する（Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＭＩＤ：２３７４４７８１；Ｍａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＰＭＩＤ：２６５２７７３７）などの他の決定要因と相乗作用し得る。ＬＵＤ自体は、細胞進入に必要かつ十分であり、その後に透過されてＰＴＥＮ－Ｓおよびｐ５３のようなカーゴタンパク質の抗癌作用を発揮する（Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＭＩＤ：２３７４４７８１）。
３つの天然に存在するＰＴＥＮ－Ｌイソ型または欠損変異体が公知である（ＰＴＥＮ－Ｍ（本明細書中でＰＴＥＮβとも呼ばれる；配列番号６）、ＰＴＥＮ－Ｎ（配列番号７）、およびＰＴＥＮ－Ｏ（配列番号８）（Ｔｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＰＭＩＤ：２７２４９８１９））。指定がない限り、国際条約に従って、種々のＰＴＥＮイソ型のアミノ酸位置番号は、以後、最長のＰＴＥＮ－Ｌプレタンパク質（配列番号１；Ｐｕｌｉｄｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＭＩＤ：２４９８５３４４）に基づく。そのようなものとして、全てのバリアントは、ＰＴＥＮ－Ｓを連続形態で依然として含むＰＴＥＮ－Ｌの漸進的なＮ末端欠損変異体であると見なされ（Ｍａｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ，２０１７：ＰＭＩＤ：２８２８９７６０）、それ故、拡大解釈すれば、ＰＴＥＮ－Ｓの上流にインフレームで融合した欠損特異的（Ｍ、Ｎ、およびＯ）固有ドメインを有すると説明することができ、すなわち、本明細書中で、それぞれ、ＭＵＤ（配列番号９）、ＮＵＤ（配列番号１０）、およびＯＵＤ（配列番号１１）と定義される（Ｔｚａｎｉ ｅｔ ａｌ，２０１６：ＰＭＩＤ：２７２４９８１９）。
ホスファターゼ触媒ドメインが共通のＰＴＥＮ－Ｓ配列内に存在するので、全てのＰＴＥＮ－Ｌイソ型は、その名の通りタンパク質および脂質のホスファターゼである。ＰＴＥＮ－Ｌはヒト血清中に直接分泌され得る同等物のうちの唯一のものであるが、ＰＴＥＮ－ＬおよびＰＴＥＮ－Ｍは、細胞透過および核膜透過、ホスファターゼ活性、ならびに抗癌作用に関して識別不能なようである（Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，２０１３：ＰＭＩＤ：２３７４４７８１；Ｔｚａｎｉ ｅｔ ａｌ，２０１６：ＰＭＩＤ：２７２４９８１９；Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１７：ＰＭＩＤ：２８３３２４９４）。ＰＴＥＮの固有のヒト血清分泌および適合性、自発的な癌細胞透過性、多価の作用機序（ｐｉ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、ＥＲＫ、ＶＥＧＦの阻害）、いくつかの前臨床モデルにおける細胞および異種移植片の全生存を延長させる強い抗癌単剤療法の作用により、ＰＴＥＮ遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスが生存可能かつ癌耐性を示すだけでなく、同腹子より良好に血糖を調節し、有意に長期間生存もするという事実がある。
ＰＴＥＮ－Ｌは、全ての腫瘍学および血液学における適応症にわたる抗ウイルス治療および抗癌治療のための最有力の候補薬物である（Ｗｕ ｅｔ ａｌ，２０１７：ＰＭＩＤ：２８７８３５００；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，２０１８：ＰＭＩＤ：２９８５８６０４）。しかしながら、新規の抗癌治療薬としての重要性が推定されるにもかかわらず、ＰＴＥＮ－Ｌは、製造が非常に困難であることが証明されており、あらゆる公開された場合を考慮すると、このタンパク質は収率が低く、物理化学的に不安定であるという欠点が報告されている（Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，２０１３：ＰＭＩＤ：２３７４４７８１；Ｍａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，２０１６：ＰＭＩＤ：２６５２７７３７；Ｗｕ ｅｔ ａｌ，２０１７ ＰＭＩＤ：２８７８３５００）。
ＰＴＥＮ－Ｌと対照的に、組換えＰＴＥＮ－Ｓまたはｐ５３タンパク質は自律的に細胞に透過する能力を持たず、細胞内でのＰＴＥＮ－Ｓの発現には、ＰＴＥＮ－Ｓ ｃＤＮＡを使用した細胞トランスフェクションもしくはウイルス形質導入、またはリポソームもしくはカチオン性脂質のような膜様化学構造中の腫瘍抑制因子タンパク質のカプセル化（Ａｌｔｉｎｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ，２０１６；ＰＭＩＤ：２７７４８７７５）、またはハイブリッドタンパク質－ＤＮＡハイブリッドナノ構造（Ｒｙｕ ｅｔ ａｌ，２０２０；ＰＭＩＤ：３２０５７０５２）が必要である。しかしながら、癌細胞内で発現された時点で、ＰＴＥＮ－Ｓは、実質的に全ての公知の癌適応症にわたって癌細胞を死滅させることができる。ＰＴＥＮ－Ｓのトランスフェクションは医学的に適用できず、そのタンパク質カプセル化は製造の観点から困難であり；同様に、腫瘍抑制因子の遺伝子治療は、中国のみでアデノウイルス５３型に対してのみ承認されている（Ｇｅｎｄｉｃｉｎｅ；Ｇｏｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ，２０１９；ＰＭＩＤ：３１０６９１６９）。結果として、製造可能なＰＴＥＮ－Ｓ融合タンパク質が当該分野で公知のいかなる他の送達テクノロジーよりも医学的、治療的、および商業的に遥かに価値が高いということになる。
しかしながら、治療上有用なタンパク質（ＰＴＥＮタンパク質など）は、常に「開発可能」であるわけではない。一例として、タンパク質は、経済的または産業的に不適切な量で発現され得るか（例えば、一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上清中の５μｇ／ｍｌ未満の分泌タンパク質）、生物学的に不安定であり得るか（例えば、分解もしくは凝集または細菌発現の場合の翻訳後修飾の欠如に起因する）、不適切な薬物動態学的プロフィールを有し得る（例えば、ヒト血清中での不安定性、または非常に短い血清半減期、または特定の緩衝液もしくは賦形剤の必要性）。以下のアプローチは、かかるタンパク質の開発可能性を増大させ、そして／または医学的な妥当性を改善する可能性があることが知られている：（ａ）前述のタンパク質の、天然に半減期が長いタンパク質もしくはタンパク質ドメイン（Ｆｃ（抗体テール）ドメイン、トランスフェリン、およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）タンパク質など）への遺伝子融合；または不活性ポリペプチドへの融合（ＸＴＥＮ（組換えＰＥＧまたは「ｒＰＥＧ」としても公知）など）、もしくはホモアミノ酸ポリマーへの融合（ＨＡＰ；ＨＡＰ化）、もしくはプロリン－アラニン－セリンポリマーへの融合（ＰＡＳ；ＰＡＳ化）、もしくはエラスチン様ペプチドへの融合（ＥＬＰ；ＥＬＰ化）；（ｂ）標的タンパク質の流体力学半径を増大させるための前述のタンパク質の反復化学部分（例えば、ＰＥＧ（ＰＥＧ化））またはヒアルロン酸への化学的抱合；（ｃ）タンパク質のポリシアル化または負電荷の高度にシアル化されたペプチドへのその融合；（ｄ）前述のタンパク質の、通常は半減期が長いタンパク質（ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ヒトＩｇＧ、またはトランスフェリンなど）への非共有結合；（ｅ）前述のタンパク質の、ＨＳＡ、Ｆｃ、またはトランスフェリンへの化学的抱合（Ｓｔｒｏｈｌ，２０１５，ＰＭＩＤ：２６１７７６２９で概説）。
本開示の実施形態は、以後により完全に記載されるであろう。しかしながら、本開示の態様は、異なる形態で具体化されてよく、本明細書中に記載の実施形態に制限されると解釈すべきでない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が綿密かつ完全であり、当業者に本発明の範囲が完全に伝えられるように提供されている。本明細書中の説明において使用された用語法は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、制限することを意図しない。
別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての用語（技術用語および科学用語が含まれる）は、本発明に属する当業者が一般的に理解している意味を有する。本明細書中で明確に定義されない限り、一般的に使用される辞書に定義されている用語などの用語が本出願および関連分野の文脈においてその意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、理想化されたり過度に形式ばった意味で解釈されるべきではないとさらに理解されるであろう。以下に明確に定義されていないが、かかる用語は、その一般的な意味に従って解釈されるべきである。
本明細書中の説明において使用された用語法は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。
本テクノロジーの実施には、別段の指示がない限り、当業者の範囲内の組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来技術を使用するであろう。
文脈上別段の指示がない限り、本明細書中に記載の本発明の種々の特徴を任意の組み合わせで使用することができることが特に意図される。さらに、本開示は、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の任意の特徴または特徴の組み合わせを排除または省略することができることも意図する。例証するために、複合体が成分Ａ、Ｂ、およびＣを含むと明細書に記載されている場合、Ａ、Ｂ、もしくはＣのうちのいずれか、またはその組み合わせを省略し、単独もしくは任意の組み合わせを放棄することができることが具体的に意図される。
明確に別段の指示がない限り、全ての具体的に記載された実施形態、特徴、および用語は、列挙した実施形態、特徴、または用語、およびその生物学的等価物の両方を含むことが意図される。
範囲を含む全ての数字表示（例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量）は近似値であり、必要に応じて１．０または０．１の変化量で（＋）または（－）に変動し、あるいは＋／－１５％、あるいは１０％、あるいは５％、あるいは２％で変動し、かかる範囲が含まれる。常に明記しているわけではないが、全ての数字表示には用語「約」が先行していると理解すべきである。常に明記しているわけではないが、本明細書中に記載の試薬は単なる例示であり、かかる試薬の等価物が当該分野で公知であることも理解すべきである。
本開示を通して、種々の刊行物、特許、および公開された特許明細書は、確認のための引用またはアラビア数字によって参照され得る。アラビア数字によって識別される刊行物の完全な引用は、特許請求の範囲の直前に見出される。これらの刊行物、特許、および公開された特許明細書の開示は、本発明が属する先行技術をより完全に記載するために、その全体が本開示に参考として援用される。
定義
本テクノロジーの実施には、別段の指示がない限り、当業者の範囲内の有機化学、薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来技術を使用するであろう。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照のこと。
本発明の説明および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な指示がない限り、複数形も含まれることが意図される。
本明細書中で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、組成物および方法が列挙した構成要素を含むが、他の構成要素を排除しないことを意味することを意図する。本明細書中で使用される場合、「～から本質的になる」という伝統的な句（および文法上の異型）は、列挙された材料または工程ならびに列挙した実施形態の基本的な特徴および新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されるものとする。したがって、本明細書中で使用される用語「～から本質的になる」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と等価であると解釈されるべきではない。「～からなる」は、他の成分の微量の構成要素および本明細書中に開示の組成物の投与のための実質的な方法の工程を超えるものを排除することを意味するものとする。これらの移行句の各々によって定義された態様は、本開示の範囲内にある。
量または濃度などの測定可能な値に関して言及する場合に本明細書中で使用される用語「約」は、指定した量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「減少した（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）、「高い」、「低い」、またはその任意の文法上の異型は、基準となる組成物、ポリペプチド、タンパク質などの約９０％、８０％、５０％、２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに０．１％の変動を指す。
タンパク質／ポリペプチド「の発現を欠く」という句は、（ｉ）タンパク質／ポリペプチドがコードされないか存在せず、そして／または（２）タンパク質／ポリペプチドが対照（例えば、非癌細胞または非癌組織）と比較して低レベルで存在することを指す。
本明細書中に開示の任意の成分、範囲、投与形態などの選択を説明するために使用する場合の用語「許容され得る」、「有効な」、または「十分な」は、前述の成分、範囲、投与形態などが開示の目的に適切であることを意図する。
また、本明細書中で使用される場合、「および／または」は、列挙した関連事項のうちの１つまたはそれ超のありとあらゆる可能な組み合わせを、さらに、選択肢と解釈する場合には組み合わせを欠くこと（「または」）を指し、これらを包含する。
用語「融合タンパク質」は、少なくとも２つの異なる供給源に由来するアミノ酸配列を共に含むポリペプチドを指す。融合タンパク質は、融合ポリペプチド、キメラタンパク質、またはキメラポリペプチドも指し得る。融合タンパク質は、異なる供給源由来の２つまたそれを超えるコード領域が、核酸分子が融合タンパク質をコードするようにインフレームで連結した核酸分子によってコードされ得る。１つの実施形態では、融合タンパク質は、ＰＴＥＮ－ＬまたはＰＴＥＮならびにヒト血清アルブミンおよび必要に応じたアフィニティタグを含む第２の部分を含む。別の態様では、融合タンパク質は、ヒト血清アルブミンならびにＰＴＥＮ－ＬまたはＰＴＥＮおよびアフィニティタグを含む第２の部分を含む。他の実施形態では、融合構築物または融合タンパク質、アルブミン、およびＰＴＥＮまたはＰＴＥＮ－Ｌの一部分を、各々、前述の融合構築物または融合タンパク質の「部分」、「領域」、または、「部」と呼ぶ場合がある。
ＰＴＥＮという用語は、ホスファターゼ・テンシン・ホモログの略語である。本明細書中で使用される場合、この用語は、ＰＴＥＮもしくはＰＴＥＮ－Ｌ、またはＰＴＥＮもしくはＰＴＥＮ－Ｌの断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物（但し、ＰＴＥＮまたはＰＴＥＮ－Ｌの酵素活性が保持され、必要に応じて、妥当な量で発現することができることを条件とする）を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなるポリペプチドまたはタンパク質の属を意図する。かかる活性を、当該分野で公知であるか、本明細書中に記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（マラカイトグリーンホスファターゼアッセイなど）またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（哺乳動物細胞における細胞透過を測定するアッセイなど）またはＰＴＥＮタンパク質の腫瘍抑制因子機能を測定する別の細胞ベースのアッセイ（癌細胞死の開始を測定するアッセイなど）で測定することができる。ＰＴＥＮの非限定的な例には、ＰＴＥＮ－Ｌ、ＰＴＥＮ－Ｍ、ＰＴＥＮ－Ｎ、ＰＴＥＮ－Ｏ、ＰＴＥＮ－Ｓ、および最小ＰＴＥＮ断片（本明細書中で最小ＰＴＥＮ－Ｓとも呼ばれる）が含まれる。ある特定の実施形態では、ＰＴＥＮおよびＰＴＥＮ－Ｌという用語は、特に「または断片」が続く場合に互換的に使用される。
ある特定の実施形態では、アミノ酸配列またはポリペプチドまたはタンパク質に関して言及する場合、ヒト「ＰＴＥＮ－Ｌ」または「ＰＴＥＮ－Ｌ部分」または「ＰＴＥＮ－Ｌ領域」または「ＰＴＥＮ－Ｌ部」という用語は、配列番号１（ヒトプレ－ＰＴＥＮ－Ｌ）、または配列番号３（成熟ヒトＰＴＥＮ－Ｌ）、ならびに各々のそのありとあらゆる断片、最小断片、類似体、変異体、イソ型、等価物、およびバリアントを有するポリペプチドを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
本明細書中で使用される場合、タンパク質またはポリペプチドの断片は、Ｎ末端、Ｃ末端、または両方の末端を短縮したタンパク質またはポリペプチドを提供する。
タンパク質またはポリペプチド（本明細書中で基準と呼ばれる）の等価物は、基準に対して少なくとも５０％（または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）同一であり、基準の機能および製造可能性を保持する。
本明細書中で使用される場合、用語「機能」、「活性」、および「酵素活性」は、互換的に使用される。例えば、（ａ）ＰＴＥＮ、（ｂ）ＰＴＥＮの断片、類似体、バリアント、変異体、または等価物、または（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）を含む融合タンパク質の活性は、細胞および／または核膜の透過、ホスファターゼとしての作用、ならびに抗癌治療結果が得られることを指し得る。かかる活性を、当該分野で公知であるか、本明細書中に記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（マラカイトグリーンホスファターゼアッセイなど）またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（哺乳動物細胞における細胞透過を測定するアッセイなど）、またはＰＴＥＮタンパク質の腫瘍抑制因子機能を測定する別の細胞ベースのアッセイ（癌細胞死の開始を測定するアッセイなど）で測定することができる。
ポリヌクレオチド（本明細書中で基準と呼ばれる）の等価物は、基準に対して少なくとも５０％（または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）同一であり、基準によってコードされるポリペプチドと同一のポリペプチドをコードするか、基準によってコードされるポリペプチドの等価物をコードする。
試験配列の位置もしくは連続したセグメントを、基準配列のアミノ酸／ヌクレオチド残基または連続したセグメントに割り当てる（または対応させる）ために、試験配列と基準配列との間で配列アラインメントを行う。相互にアラインメントされた位置またはセグメントは、等価物と判断される。
用語「ＰＴＥＮ等価物」は、ポリペプチドであって、当該分野で公知であるか、本明細書中に記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（マラカイトグリーンホスファターゼアッセイなど）またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（哺乳動物細胞における細胞透過を測定するアッセイなど）またはＰＴＥＮタンパク質の腫瘍抑制因子機能を測定する別の細胞ベースのアッセイ（癌細胞死の開始を測定するアッセイなど）において、妥当な量で発現することができ、ＰＴＥＮタンパク質活性を依然として保持するか改善するポリペプチドを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
用語「最小ＰＴＥＮ断片」は、１またはそれを超える改変されたアミノ酸を有するが、配列番号１６２と少なくとも９０％の配列類似性または同一性を保持するポリペプチドを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、当該分野で公知であるか（例えば、配列番号１６２の最小ＰＴＥＮ断片が癌細胞において触媒活性を保持していること（Ｏｄｒｉｏｚｏｌａ ｅｔ ａｌ，２００７；ＰＭＩＤ：１７５６５９９９））、本明細書中に記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（マラカイトグリーンホスファターゼアッセイなど）またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（哺乳動物細胞における細胞透過を測定するアッセイなど）またはＰＴＥＮタンパク質の腫瘍抑制因子機能を測定する別の細胞ベースのアッセイ（癌細胞死の開始を測定するアッセイなど）において、前述の断片は妥当な量で発現することができ、かつ前述の断片はＰＴＥＮタンパク質活性を依然として保持する。
用語「類似体」は、１またはそれを超える改変されたアミノ酸および別のアミノ酸に置換された１またはそれを超えるアミノ酸を有する等価物を指す。かかる改変には、分子（例えば、小分子、細胞傷害性分子、リンカー、ｐＨ感受性リンカー、および／またはチオールリンカー）との抱合、シアル化、ポリシアル化、Ｏ－グリコシル化、Ｎ－グリコシル化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化もしくはプレニル化、グリピアチオン、リポイル化、ホスホパンテテイン化、エタノールアミンホスホグリセロール付着、ジフタミド形成、ヒプシン形成、アシル化、アセチル化、ホルミル化、アルキル化、メチル化、アミド化、シトルリン化、脱アミド、エリミニル化、ＩＳＧ化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化、ＮＥＤＤ化、プピル化、ビオチン化、カルバミル化、酸化、ペグ化、グリケーション、カルバミル化、カルボニル化、自発的イソペプチド結合形成、ブチリル化、γ－カルボキシル化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ヌクレオチド付加、リン酸エステル（Ｏ－結合）またはホスホルアミダート（Ｎ－結合）形成、リン酸化、アデニリル化、ウリジリル化、プロピオニル化、ピログルタマート形成、Ｓ－グルタチオン化、Ｓ－ニトロシル化、Ｓ－スルフェニル化、Ｓ－スルフィニル化、Ｓ－スルホニル化、スクシニル化、および／または硫酸化が含まれ得るが、これらに限定されない。
用語「ＰＴＥＮ類似体」は、１またはそれを超える改変または置換されたアミノ酸を有するが、ＰＴＥＮタンパク質（例えば、配列番号１または配列番号３（ヒトＰＴＥＮ－Ｍ（配列番号６）、ヒトＰＴＥＮ－Ｎ（配列番号７）、ヒトＰＴＥＮ－Ｏ（配列番号８）、ヒトＰＴＥＮ－Ｓ（配列番号２）、マウスＰＴＥＮ－Ｓ（配列番号８８）、マウスマウスＰＴＥＮ－Ｌ（配列番号８９）が含まれるが、これらに限定されない））と少なくとも９０％の配列類似性または同一性を保持するポリペプチドを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、当該分野で公知であるか、本明細書中に記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（マラカイトグリーンホスファターゼアッセイなど）またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（哺乳動物細胞における細胞透過を測定するアッセイなど）または別の細胞ベースのアッセイ（癌細胞死の開始を測定するアッセイなど）において、前述の類似体は妥当な量で発現することができ、かつ前述の類似体はＰＴＥＮタンパク質活性を依然として保持するか改善する。
本明細書中で使用される場合、ポリペプチド／タンパク質バリアントという用語は、ポリペプチド／タンパク質の等価物および１またはそれを超えるさらなるアミノ酸を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
用語「ＰＴＥＮバリアント」は、典型的にはＰＴＥＮタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端、またはその両方のいずれかに４０未満または好ましくは１５未満のさらなるアミノ酸を有する１またはそれを超えるさらなるアミノ酸を有するポリペプチドを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、当該分野で公知であるか、本明細書中に記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（マラカイトグリーンホスファターゼアッセイなど）またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（哺乳動物細胞における細胞透過を測定するアッセイなど）または別の細胞ベースのアッセイ（癌細胞死の開始を測定するアッセイなど）において、前述のバリアントは妥当な量で発現することができ、かつ前述のバリアントはＰＴＥＮ活性を依然として保持するか改善する。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、１９日間という長い平均半減期を有する多機能性タンパク質である。ＨＳＡは濃度が５０ｍｇ／ｍＬ（０．６ｍＭ）の濃度のヒト血漿中で最も豊富なタンパク質であり、血漿においていくつかの機能（血漿ｐＨの維持、代謝産物および脂肪酸の輸送、ならびに血圧維持の役割が含まれる）を有する。ＨＳＡは、腎臓によるタンパク質の糸球体濾過サイズの上限にあり、陰イオン性が高いので、腎臓での濾過がさらに遅い。ＩｇＧとは結合部位および結合機序が異なるが、ＨＳＡは、ＩｇＧのようにｐＨ依存性の様式でＦｃＲｎと呼ばれる特異的受容体または新生児受容体にも結合し、ＩｇＧと同様に再利用され、それにより、半減期が延長される。また、ＨＳＡは、腫瘍および炎症性組織に蓄積する傾向があり、このことは、アルブミンに融合または結合させると、タンパク質またはペプチドがこれらの部位を標的するのに役立つ可能性があり得ることを示唆している。サル血清アルブミン（ＳＳＡ；配列番号９０）、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ；配列番号９１）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ 配列番号９２）は、類似の機能を果たし、ＨＳＡ（配列番号１２～１３）と比較してかなり保存されている。全ての血清アルブミン（ＳＡ）は、高度に保存されたシグナルペプチド（配列番号９３～９６）の切断後に細胞から分泌される。ヒトＦｃＲｎに対する変異ＨＳＡの親和性を、いくつかの天然に存在するＨＳＡ変異（例えば、Ｃａｓｅｂｒｏｏｋ Ｄ４９４Ｑ）または操作されたＨＳＡ変異（例えば、Ｄ１０８Ａ）は減少させ、それに対して、他の操作された変異（例えば、Ｋ５７３Ｐ）は、増大させる。全てのＳＡは、ｄＩ（ａａ１～１９７）、ｄＩＩ（ａａ１９８～３８１）、およびｄＩＩＩ（ａａ３８２～５８５）（アミノ酸位置番号は配列番号１３を参照のこと）と呼ばれる３つの主要ドメインからなり、ｄＩＩＩのＣ末端部分（哺乳動物間で非常に異なる領域）を介してその同族ＦｃＲｎに結合する。そのようなものとして、ＦｃＲｎによるＳＡリサイクル機能には顕著な種特異性が存在し、それにより、例えば生きているマウスに注射されたＨＳＡは、マウスＦｃＲｎによって内因性ＭＳＡリガンドよりも見逃される。種特異的ＦｃＲｎ－ＳＡ結合特性は、培養されたヒトまたはマウスの癌細胞で喪失されているようである－これらの細胞は、いかなる明らかな制限もなくＭＳＡ、ＲＳＡ、またはＨＳＡを迅速に取り込む（Ｓｗｉｅｒｃｚ ｅｔ ａｌ，２０１７；ＰＭＩＤ：２７９７４６８１）。そのようなものとして、ＳＡの選択は、特に外因性の治療用アルブミン融合物の組織生体内分布に関したアルブミン融合物の治療薬開発に大きな影響がある（Ｓａｎｄ ｅｔ ａｌ，２０１５；ＰＭＩＤ：２５６７４０８３に概説）。
用語「血清アルブミンタンパク質」、または「血清アルブミン－ＳＡ」は、「アルブミン部分」または「アルブミン領域」または「アルブミン部」と互換的に使用され、「ヒト血清アルブミン－ＨＳＡ」、または「サル血清アルブミン－ＳＳＡ」、または「ラット血清アルブミン－ＲＳＡ」または「マウス血清アルブミン－ＭＳＡ」を指し得る。１つの実施形態では、この用語は、配列番号１２（ＨＳＡプレタンパク質）、または配列番号１３（成熟ＨＳＡ）、または配列番号９０（成熟ＳＳＡ）、または配列番号９１（成熟ＲＳＡ）、または配列番号９２（成熟ＭＳＡ）、ならびにそのありとあらゆる断片、最小断片、類似体、およびバリアントを有するポリペプチドを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
用語「アルブミン等価物」は、ポリペプチドであって、当該分野で公知であるか、本明細書中に記載のように、妥当な量で発現することができ、ある特定のアルブミンの性質（アルブミン断片のＦｃＲｎ受容体への結合が含まれる）を依然として保持するか改善するポリペプチドを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
用語「最小アルブミン断片」は、１またはそれを超える改変されたアミノ酸を有するが、配列番号１６３と少なくとも９０％の配列類似性または同一性を保持するポリペプチドを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、当該分野で公知であるか、本明細書中に記載のように、前述の断片は妥当な量で発現することができ、かつ断片はある特定のアルブミンの性質（アルブミン断片のＦｃＲｎ受容体への結合が含まれる）を依然として保持するか改善する。
用語「アルブミン類似体」は、１またはそれを超える改変または置換されたアミノ酸を有するが、血清アルブミン（例えば、配列番号１２～１３、９０～９２、および１６３）と少なくとも９０％の配列類似性または同一性を保持するポリペプチドを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、当該分野で公知であるか、本明細書中に記載のように、前述の類似体は妥当な量で発現することができ、かつ前述の類似体はある特定のアルブミンの性質（アルブミン断片のＦｃＲｎ受容体への結合が含まれる）を依然として保持するか改善する。
用語「アルブミンバリアント」は、１またはそれを超えるさらなるアミノ酸を有するが、配列番号１２～１３、９０～９２、および１６３と少なくとも９０％の配列類似性または同一性を保持するポリペプチドを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、当該分野で公知であるか、本明細書中に記載のように、前述の類似体は妥当な量で発現することができ、かつ前述の類似体はある特定のアルブミンの性質（アルブミン断片のＦｃＲｎ受容体への結合が含まれる）を依然として保持するか改善する。
シグナルペプチドは、小胞体を標的にし、分泌経路に沿って小胞体、リソソーム、または任意の他のオルガネラの内腔に保持される分泌型／細胞外型／ペリプラズム型などのいずれかになるか、Ｉ型１回膜貫通タンパク質になるように運命づけられるタンパク質中で見出される。シグナル配列は、通常、プレタンパク質および／またはプロタンパク質中に存在し、成熟タンパク質中で除去される。ある特定の実施形態では、本明細書中で使用されるシグナルペプチドは、融合タンパク質が宿主細胞から分泌されるように指示する。１つの実施形態では、シグナルペプチドは、分泌のために融合タンパク質のＮ末端に存在し、そして／または以下の群から選択される：ＨＳＡシグナルペプチド、ＳＳＡシグナルペプチド、ＲＳＡシグナルペプチド、ＭＳＡシグナルペプチド、マウスα２－マクログロブリンのシグナルペプチド、マウスフィブリノゲンシグナルペプチド、マウスα１－抗トリプシンシグナルペプチド、マウスＩｇＧκ鎖シグナルペプチド、ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド、ヒトＣＤ３３シグナルペプチド、または人工シグナルペプチド。さらなる実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号９３～１０５の群から選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１８０～１９２の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはそれぞれ配列番号９３～１０５と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされる。
用語「アフィニティタグ」は、融合タンパク質内に含まれ得るポリペプチドであって、アフィニティタグに結合することができる（すなわち、アフィニティタグに親和性を有する）リガンドを使用した融合タンパク質の検出および／または細胞環境からの融合タンパク質の精製を可能にするポリペプチドを指す。リガンドは、抗体、樹脂、または相補性ポリペプチドであり得るが、これらに限定されない。アフィニティタグは、小ペプチド（一般に、およそ４から１６アミノ酸長のペプチド）含み得るか、より大きなポリペプチドを含み得る。一般的に使用されているアフィニティタグには、とりわけ、ポリアルギニン、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ポリヒスチジン、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｎ利用物質タンパク質Ａ（ＮｕｓＡ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、およびグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が含まれる（例えば、ＧＳＴ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｈａｎｄｂｏｏｋ－Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈを参照のこと）。１つの実施形態では、アフィニティタグは、ポリヒスチジンタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ）である。融合タンパク質にアフィニティタグを含めることにより、アフィニティタグに強固かつ特異的に結合することができるアフィニティ媒体を使用したアフィニティ精製によって、融合タンパク質を細胞環境から精製することが可能である。アフィニティ媒体は、例えば、アガロースまたは金属ビーズなどの固定相（マトリックス）に共有結合した金属充填樹脂またはリガンドを含み得る。例えば、ポリヒスチジンタグ化融合タンパク質（Ｈｉｓタグ化融合タンパク質とも呼ばれる）を、Ｎｉ２＋またはＣｏ２＋負荷樹脂を使用した固定金属イオンクロマトグラフィによって回収することができ、抗ＦＬＡＧアフィニティゲルを使用してＦＬＡＧタグ化融合タンパク質が捕捉される場合があり、アガロースなどの固体支持体に架橋したグルタチオンを使用してＧＳＴタグ化融合タンパク質が捕捉される場合がある。
本明細書中で使用される用語「精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、「精製（ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ）」、または「分離（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ）」は、複合混合物（細胞ライセートまたはポリペプチドの混合物など）から１またはそれを超えるポリペプチドを単離する過程を指す。精製、分離、または単離は、完全である必要はなく、すなわち、複合混合物のいくつかの成分が精製過程後の１またはそれを超えるポリペプチドと共存しても良い。しかしながら、精製生成物は、精製前の複合混合物と比較して１またはそれを超えるポリペプチドが富化されていなければならず、複合混合物内に最初に存在していた他の成分のうちのかなりの部分が精製過程によって除去されていなければならない。
本明細書中で使用される用語「細胞」は、必要に応じて被験体または市販されている供給源から得た原核細胞または真核細胞のいずれかを指し得る。
「真核細胞」は、モネラ界を除く全ての生物界を含む。真核細胞は、膜に結合した核によって容易に区別することができる。動物、植物、真菌、および原生生物は、真核生物であるか、細胞内膜および細胞骨格によって細胞が複雑な構造に組織化された生物である。最も特徴的な膜結合構造は、核である。具体的な列挙がない限り、用語「宿主」には、真核生物宿主（例えば、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物の細胞が含まれる）が含まれる。真核生物の細胞または宿主の非限定的な例には、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、トリ、爬虫類、およびヒト（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、および２９３Ｔ細胞）が含まれる。
「原核細胞」は、通常、核または任意の他の膜結合オルガネラを欠き、２つのドメイン（細菌および古細菌）に分類される。染色体ＤＮＡに加えて、これらの細胞は、エピソームと呼ばれる円形ループ中にも遺伝情報を含むことができる。細菌細胞は非常に小さく、ほぼ動物のミトコンドリアのサイズである（直径約１～２μｍ、長さ１０μｍ）。原核細胞は、以下の３つの主な形状を特徴とする：桿状、球状、およびらせん状。真核生物のような精巧な複製過程を経る代わりに、細菌細胞は、二分裂によって分裂する。例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細菌、大腸菌細菌、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌が含まれるが、これらに限定されない。
用語「～をコードする」は、核酸配列に適用される場合、ポリペプチド「をコードする」と言われるポリヌクレオチドを指し、このポリヌクレオチドは、未変性の状態であるか、当業者に周知の方法によって操作されたときに、ポリペプチドおよび／またはその断片のｍＲＮＡが産生されるように転写および／または翻訳され得る。アンチセンス鎖はこのような核酸の相補物であり、コード配列はアンチセンス鎖から推定することができる。
用語「等価物」または「生物学的等価物」は、特定の分子、生物学的物質、または細胞物質を指す場合に互換的に使用され、依然として所望の構造または機能性を維持し（例えば、類似の機能活性を有し）ながら最小の相同性を有するものを意図する。明示されていない場合、基準のポリペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドの等価物または生物学的等価物について言及するときは、等価物または生物学的等価物が、基準のポリペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドに対する列挙した構造的な関連および等価なまたは実質的に等価な生物学的活性を有すると理解すべきである。例えば、等価なポリペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドの非限定的な例には、基準ポリヌクレオチドの長さにわたってポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはタンパク質の配列と少なくとも６０％、あるいは少なくとも６５％、あるいは少なくとも７０％、あるいは少なくとも７５％、あるいは８０％、あるいは少なくとも８５％、あるいは少なくとも９０％、あるいは少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドが含まれる。あるいは、等価なポリペプチドは、高ストリンジェンシー条件下でかかる基準ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成し、実質的に等価であるか、等価な生物学的活性を有するポリヌクレオチドまたはその相補物によってコードされるポリペプチドである。高ストリンジェンシー条件は、本明細書中に記載されており、本明細書中で参考として援用される。あるいは、ポリペプチドの等価物は、基準ポリヌクレオチド（例えば、野生型ポリヌクレオチド）の長さにわたって少なくとも７０％、あるいは少なくとも７５％、あるいは８０％、あるいは少なくとも８５％、あるいは少なくとも９０％、あるいは少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９７％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはその等価物によってコードされるポリペプチドである。かかる等価なポリペプチドは、基準ポリヌクレオチドと同一の生物学的活性を有する。
等価なポリペプチドの非限定的な例には、基準ポリヌクレオチドと少なくとも６０％、あるいは少なくとも６５％、あるいは少なくとも７０％、あるいは少なくとも７５％、あるいは８０％、あるいは少なくとも８５％、あるいは少なくとも９０％、あるいは少なくとも９５％、あるいは少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドが含まれる。また、等価物は、高ストリンジェンシー条件下で基準ポリヌクレオチドにハイブリッド形成するポリヌクレオチドまたはその相補物を意図する。かかる等価なポリペプチドは、基準ポリヌクレオチドと同一の生物学的活性を有する。
別の配列とある特定の百分率（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、アラインメントしたときにその塩基（またはアミノ酸）の百分率が、２つの配列を比較した場合に基準ポリヌクレオチドの長さにわたって同一であることを意味する。アラインメントおよび相同率または配列同一性を、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ ７．７．１に記載のもの）を使用して決定することができる。ある特定の実施形態では、デフォルトパラメーターをアラインメントのために使用する。非限定的なアラインメントプログラムの例は、ＢＬＡＳＴ（デフォルトパラメーターを使用）である。特に、例示的なプログラムには、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰが含まれ、以下のデフォルトパラメーターを使用する：遺伝暗号＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；分類方法＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細を、以下のインターネットアドレスで見出すことができる：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。配列同一性および同一率を、ｃｌｕｓｔａｌＷに組み込むことによって決定することができる（以下のウェブアドレスで利用可能：ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／、最終アクセス日：２０１７年１月１３日）。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチドの間または２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。相同性を、比較のためにアラインメントされ得る各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列内の位置が同一の塩基またはアミノ酸で占められる場合、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列が共有する適合した位置または相同な位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同性の」配列は、本開示の配列のうちの１つと４０％未満の同一性、あるいは２５％未満の同一性を有する。
本明細書中で使用される場合、用語「少なくとも９０％同一の」は、２つの比較される配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）の同一性が約９０％～約１００％であることを指す。また、これには、少なくとも少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、約９１％～約１００％、約９２％～約１００％、約９３％～約１００％、約９４％～約１００％、約９５％～約１００％、約９６％～約１００％、約９７％～約１００％、約９８％～約１００％、または約９９％～約１００％の同一性が含まれる。
また、「相同性」または「同一性」または「類似性」は、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する２つの核酸分子を指すことができる。
本明細書中で使用される場合、用語「保持する」、「類似の」、および「同一の」は、互換的に使用されるが、ポリヌクレオチド、タンパク質、および／またはペプチドの機能、活性、または機能活性を説明しており、基準のタンパク質、ポリヌクレオチド、および／またはペプチドの活性の少なくとも約２０％（少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または約１００％が含まれるが、これらに限定されない）の機能活性について言及している。
「ハイブリッド形成」は、１またはそれを超えるポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間で水素結合を介して安定された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合、または任意の他の配列特異的様式によって生じ得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つまたはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリッド形成鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリッド形成反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断などのより大規模な過程中の工程を構成し得る。
ストリンジェントなハイブリッド形成条件の例には、以下が含まれる：インキュベーション温度約２５℃～約３７℃；ハイブリッド形成の緩衝液濃度約６×ＳＳＣ～約１０×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度約０％～約２５％；および約４×ＳＳＣ～約８×ＳＳＣの洗浄溶液。中程度のハイブリッド形成条件の例には、以下が含まれる：インキュベーション温度約４０℃～約５０℃；緩衝液濃度約９×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度約３０％～約５０％；および約５×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの洗浄溶液。高ストリンジェンシー条件の例には、以下が含まれる：インキュベーション温度約５５℃～約６８℃；緩衝液濃度約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度約５５％～約７５％；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液。一般に、ハイブリッド形成のインキュベーション時間は、５分間～２４時間（１回、２回、またはそれを超える回数の洗浄工程を伴う）であり、洗浄インキュベーション時間は、約１、２、または１５分間である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である。他の緩衝系を使用したＳＳＣの等価物を使用することができると理解される。１つの態様では、等価なポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で基準ポリヌクレオチドまたはその相補物にハイブリッド形成するものである。別の態様では、等価なポリペプチドは、ストリンジェントな条件下で基準ポリヌクレオチドまたはその相補物にハイブリッド形成するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。
本明細書中で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程および／または転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。
本明細書中で使用される用語「単離された」またはその文法上の異型は、実質的に他の物質を含まない分子または生物学的物質または細胞物質を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「機能的な」は、特定の具体的な効果を達成することを意図するために任意の分子、生物学的物質、または細胞物質を修飾するために使用され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）の重合形態を指すために互換的に使用される。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、もしくは多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基およびピリミジン塩基、または他の天然の、化学的もしくは生物学的に改変された、非天然の、もしくは誘導されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、および／または小型のヘアピンＲＮＡを含み、そして／またはコードする。１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡであるか、これをコードする。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ（操作されたｄｓＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡから合成されたｄｓｃＤＮＡなど）である。
本明細書中で使用される場合、用語「操作された」、「合成の」、「組換えの」、および「天然に存在しない」は、互換的であり、ヒトによる意図的な操作（例えば、その天然に存在する形態からの改変および／または配列最適化）を示す。
用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は、最も広義では、アミノ酸、アミノ酸アナログ、またはペプチド模倣物の２つまたはそれを超えるサブユニットの化合物を指すために互換的に使用される。サブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。別の態様では、サブユニットは、他の結合（例えば、エステル、エーテルなど）によって連結され得る。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチドの配列が含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書中で使用される用語「アミノ酸」は、天然および／もしくは非天然のアミノ酸または合成アミノ酸（グリシンならびにＤ体およびＬ体の両方の光学異性体、アミノ酸アナログ、ならびにペプチド模倣物が含まれる）のいずれかを指す。
本明細書中で使用される場合、連続したアミノ酸配列は、少なくとも２つのアミノ酸を有する配列を指す。しかしながら、第１の部分および第２の部分の連続したアミノ酸配列は、第１の部分と第２の部分が直接抱合したアミノ酸配列に制限されないことが留意される。第１の部分が第３の部分（連結など）を介して第２の部分に連結することによって１つの連続したアミノ酸配列を形成することも可能である。
本明細書中で使用される場合、用語「抱合する（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」、「抱合した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」、「抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）」、および「抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）」は、分子間、特に、２つのアミノ酸配列および／または２つのポリペプチドの間の結合の形成を指す。抱合は、直接的（すなわち、結合）または間接的（すなわち、さらなる分子を介する）であり得る。抱合は、共有結合性または非共有結合性であり得る。
本明細書中で使用される場合、連続したアミノ酸配列は、相互の直接的または間接的（例えば、リンカーを介して）抱合された２またはそれを超えるポリペプチドを含み得る。
１つの実施形態では、第２のタンパク質／ポリペプチドのＮ末端（すなわち、Ｎ’）またはＣ末端（すなわち、Ｃ’）の第１のタンパク質／ポリペプチドは、第１のタンパク質／ポリペプチドが第２のタンパク質／ポリペプチドの一部であり、第２のタンパク質／ポリペプチドのＮ’またはＣ’末端に存在することを示す。別の実施形態では、これは、第１のタンパク質／ポリペプチドが第２のタンパク質／ポリペプチドの一部ではなく、第２のタンパク質／ポリペプチドのＮ’またはＣ’末端に直接または間接的に抱合されることを示す。
本明細書中で使用される場合、大文字に続く数字は、配列内のアミノ酸を指すために使用され、ここで、大文字は、標準的な一文字表記のアミノ酸コードによるアミノ酸を示し、数字は、配列のＮ末端から数えたアミノ酸の位置を提供している。例えば、配列番号１のＳ６５は、配列番号１のＮ末端から数えて６５番目のアミノ酸（セリンである）を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「組換え発現系」は、組換えによって形成されたある特定の遺伝子材料の発現のための遺伝子構築物（または複数）を指す。
「遺伝子送達ビヒクル」は、宿主細胞に挿入されるポリヌクレオチドを運搬し得る任意の分子と定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、ミセル、生体適合性ポリマー（天然ポリマーおよび合成ポリマーが含まれる）；リポタンパク質；ポリペプチド；ポリサッカリド；リポ多糖；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；および細菌、またはウイルス（狂犬病ウイルス、フラビウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルス、バクテリオファージなど）、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、ならびに種々の真核生物宿主および原核生物宿主での発現が記載されており、かつ遺伝子治療および簡潔なタンパク質発現のために使用され得る当該分野で典型的に使用される他の組換えビヒクルである。
本明細書中に開示のポリヌクレオチドを、遺伝子送達ビヒクルを使用して、細胞または組織に送達させることができる。本明細書中で使用される「遺伝子送達」、「遺伝子移入」、「ｍＲＮＡベースの送達」、および「形質導入」などは、使用した導入方法と無関係の外因性ポリヌクレオチド（時折、「導入遺伝子」と呼ばれる）の宿主細胞への導入について言及する用語である。かかる方法には、種々の周知の技術（ベクター媒介遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または種々の他のタンパク質ベースまたは脂質ベースの遺伝子送達複合体（例えば、プロタミン複合体、脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子、および無機ナノ粒子、またはその組み合わせが含まれる）による）および「裸の」ポリヌクレオチドの送達を容易にする技術（エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入のために使用される種々の他の技術など）など）が含まれる。導入されたたポリヌクレオチドは、未改変であり得るか、１またはそれを超える改変を含むことができる；例えば、改変されたｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャッピング；１００～２５０個のアデノシン残基のテールを付加するための酵素的ポリアデニル化；およびシチジンの５－メチルシチジンとの置換および／またはウリジンのプソイドウリジンとの置換のうちの１つまたは両方を含み得る。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で安定にまたは一過性に維持され得る。安定な維持には、典型的には、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞に適合した複製起点を含むか、宿主細胞のレプリコン（染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）など）または核もしくはミトコンドリアの染色体に組み込まれる必要がある。当該分野で公知であり、かつ本明細書中に記載のように、いくつかのベクターは、遺伝子の哺乳動物細胞への移入を媒介することができることが公知である。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＲＮＡの小型で２２～２５ヌクレオチドの非コード領域である。これらの配列は、３’ＵＴＲの標的後の翻訳抑制または伝令ＲＮＡ転写物の分解のいずれかによって遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡ配列は、全ての種にわたって高度に保存されており、ｍｉＲＮＡが細胞の分化、増殖、および細胞周期の調節で果たす重要な役割が実証される。現在、ｍｉＲＮＡは悪性疾患において頻繁に制御解除され、ｍｉＲＮＡが上方制御または下方制御され得ることが認識されている。例えば、低発現ｍｉＲＮＡ（肺癌におけるｌｅｔ－７および白血病におけるｍｉｒｓ－１５／１６など）は、腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡであり、それぞれＲａｓおよびＢＣＬ２を抑制する。対照的に、種々のｍｉＲＮＡは、ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子ｍＲＮＡの３’を標的にし、それにより、機能的ＰＴＥＮ発現の喪失を促進する（ｏｎｃｏ－ｍｉＲ）。これらのｏｎｃｏ－ｍｉＲの非限定的な例には、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１３０ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ－１、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２１４、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０１ａ、ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｍｉｒ－１２７３ｇ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１０３、ｍｉＲ－１０６ｂ、ｍｉＲ－１０６ｂ－９３、ｍｉＲ－１０７、ｍｉＲ－１０ｂ、ｍｉＲ－１２９７、ｍｉＲ－１３０、ｍｉｒ－１３０ｂ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６ｂ、ｍｉＲ－１５３、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－１８１ａ、ｍｉＲ－１８１ｃ、ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１９、ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－２００、ｍｉＲ－２００ａ、ｍｉＲ－２０５、ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２１８、ｍｉＲ－２２、ｍｉＲ－２２１、ｍｉＲ－２２２、ｍｉＲ－２２４、ｍｉＲ－２３ａ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２５、ｍｉｒ－２９ｃ、ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－３３５、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３７４ａ、ｍｉＲ－４１０－３ｐ、ｍｉＲ－４２９９、ｍｉＲ－４５４、ｍｉＲ－４９４、ｍｉＲ－５４３、ｍｉＲ－５４８、ｍｉＲ－６１６－３ｐ、ｍｉＲ－７、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－９２ｂ、ｍｉＲ－９３、ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｍｉＲ－９４０、およびｍｉＲ－ｌｅｔ ７ｂが含まれる。腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡまたはｏｎｃｏ－ｍｉＲアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏ－ｍｉＲ）を、ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子レベルが増加するように前述の送達方法を使用して被験体に効果的に送達させることができる。さらに、患者の血中を循環する上記リストの選択されたｏｎｃｏ－ｍｉＲ（すなわち、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１３０ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ－１、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２１４、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０１ａ、ｍｉＲ－４８６－５ｐ）のレベルは、被験体における機能的なＰＴＥＮ腫瘍抑制因子の存在の予後因子である。非限定的な例として、Ｌｉ ｅｔ ａｌ ２０１８；ＰＭＩＤ：２９３１６８９１で見出されたｍｉＲ－４８６－５ｐは、対照患者と比較して子宮頸癌患者の血清中および組織内で有意に過剰発現され、それに対して、ｍｉＲ－４８６－５ｐは腫瘍抑制遺伝子ＰＴＥＮの３’非翻訳領域を直接標的にしてその発現を阻害し、このｍｉＲ－４８６－５ｐの過剰発現がＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を活性化する。別の例では、異種移植されたマウス腫瘍およびヒト癌患者の両方において、ｍｉＲ－２１の血清／血漿レベルは逆相関し、種々の癌（胃癌、結腸直腸癌、トリプルネガティブ乳癌などが含まれる）内のＰＴＥＮタンパク質レベルの完全な予後因子である（Ｆｅｎｇ＆Ｔｓａｏ，２０１６；ＰＭＩＤ：２７６９９００４に概説）。それ故、被験体におけるｏｎｃｏ－ｍｉＲの血液レベル（ｍｉＲ－２１の血漿レベルなど）は、被験体の血中を循環するタンパク質、ＤＮＡ、または癌細胞を分析するアッセイとして一般的に定義されている液体生検としての機能を果たすことができる。
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡから分離しており、染色体ＤＮＡから独立して複製することができる染色体外ＤＮＡ分子である。多くの場合、プラスミドは、環状かつ二本鎖である。プラスミドは、微生物集団内の遺伝子水平伝播機序を提供し、典型的には、所与の環境状態下で選択的な利点が得られる。プラスミドは、競合的微小環境における天然に存在する抗生物質に対する耐性を提供するか、あるいは、産生されたタンパク質が類似の環境下で毒素として作用し得る遺伝子を保有し得る。
遺伝子操作で使用される「プラスミド」は、「プラスミドベクター」と呼ばれる。かかる用途のための多くのプラスミドが市販されている。複製されるべき遺伝子は、細胞に特定の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子および多重クローニング部位（ＭＣＳ、すなわちポリリンカー）（いくつかの一般的に使用されている制限部位を含む短い領域であり、この制限部位にＤＮＡ断片を容易に挿入することが可能である）を含むプラスミドのコピーに挿入される。プラスミドの別の主な用途は、大量のタンパク質を作製することである。この場合、研究者は、目的の遺伝子を保有するプラスミドを含む細菌を成長させる。細菌が抗生物質耐性を付与するためのタンパク質を産生した時点で、挿入された遺伝子から大量のタンパク質が産生されるように細菌を誘導することもできる。
「酵母人工染色体」または「ＹＡＣ」は、巨大なＤＮＡ断片（１００ｋｂ超かつ３０００ｋｂまで）をクローン化するために使用されるベクターを指す。これは、人工的に構築された染色体であり、酵母細胞における複製および維持に必要なテロメア、セントロメア、および複製起点の配列を含む。初期の環状プラスミドを使用して構築する場合、プラスミドを制限酵素を使用して線状化し、次いで、ＤＮＡリガーゼにより、付着末端を使用して線状分子内に目的の配列または遺伝子を付加することができる。酵母発現ベクター（ＹＡＣ、ＹＩｐ（酵母組み込みプラスミド）、およびＹＥｐ（酵母エピソームプラスミド）など）は、酵母自体が真核細胞であるので翻訳後修飾される真核生物タンパク質産物を得ることができるので非常に有利であるが、しかしながら、ＹＡＣは、ＢＡＣより不安定であり、キメラが産生されることが見出されている。
「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで宿主細胞に送達すべきポリヌクレオチドを含む組換えによって産生されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。
ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターなどが含まれる。
新規のウイルスベクターを開発するための研究は、病原性遺伝子を治療ＤＮＡに置換することに特に注目して着実に進められている。実際に、非病原性で複製欠損のヒトに負担をかけないウイルスベクターが、７０％を超える進行中の遺伝子治療臨床試験で世界的に使用されている。ウイルスベクター（アデノウイルス、セネカバレーウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、レオウイルス、コクサッキーウイルス、パルボウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、および麻疹ウイルスなど）の特に好まれる用途の１つは、腫瘍崩壊ウイルス（ＯＶ）の形態での使用である。２０１６年の１年間のみで、ＯＶを使用して行われた臨床試験数は４０を超えていた。ＯＶは、悪性癌細胞内で特異的に複製されてこれらの細胞を有効に溶解し、頑強な抗腫瘍免疫応答も誘導することによって悪性癌細胞を破壊する。ＯＶは、種々の方法（腫瘍細胞上のウイルス特異的受容体など）によって腫瘍細胞内で選択的に複製される。ＯＶを使用して、抗血管形成遺伝子、自殺遺伝子、免疫賦活遺伝子、および小核酸をコードするＤＮＡを送達させることができる。免疫賦活遺伝子の運搬は別として、ＯＶは、細胞デブリおよびウイルス抗原を放出することによって免疫応答を誘導することができる（Ｇｏｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ，２０１９；ＰＭＩＤ：３１０６９１６９）。
感染性タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベースのベクターは、タンパク質を製造するために使用することができ、タバコ葉内でグリフィスシンを発現することが報告されている（Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６（１５）：６０９９－６１０４）。また、アルファウイルスベクター（セムリキ森林ウイルスベースのベクターおよびシンドビス・ウイルスベースのベクターなど）は、遺伝子治療および免疫療法で用いるために開発されている。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ＆Ｄｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４－４３９およびＹｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３－８２７を参照のこと。遺伝子移入がレトロウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノムまたはその一部、および治療遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子移入におけるベクターの現代の使用方法に関するさらなる詳細は、例えば、Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｕｔｌｏｏｋ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １７で見出され得る。
本明細書中で使用される場合、「レトロウイルス媒介遺伝子移入」または「レトロウイルス形質導入」は、同一の意味を有し、ウイルスが細胞に進入し、そのゲノムを宿主細胞ゲノムに組み込むことによって遺伝子または核酸配列が宿主細胞に安定に移入される過程を指す。その通常の感染機序またはウイルスが異なる宿主細胞表面受容体またはリガンドに結合して細胞に侵入するように改変された感染機序を介して、ウイルスは宿主細胞に侵入することができる。本明細書中で使用される場合、レトロウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス様の進入機序によって外因性核酸を細胞に導入することができるウイルス粒子を指す。
レトロウイルスは、遺伝情報をＲＮＡの形態で保有しているが、しかしながら、ウイルスが細胞に感染した時点で、ＲＮＡはＤＮＡ形態に逆転写され、感染細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたＤＮＡ形態は、プロウイルスと呼ばれる。
アデノウイルス（ＡｄＶ）は、比較的十分に特徴づけられた同種のウイルス群であり、５０を超える血清型が含まれる。最も一般的に使用されているＡｄ血清型である血清型５の血清有病率は、北米でおよそ５０％であり、アフリカのいくつかの地域ではほぼ１００％に到達している一方で、米国におけるＡｄ３およびＡｄ３５の血清有病率は、それぞれ、ほぼ１００％および３％～２２％である。ＡｄＶは、宿主細胞ゲノムに組み込まれる必要はない。組換えＡｄ由来のベクター、特に、野生型ウイルスの組換えおよび産生の可能性が抑えられたベクターも構築されている。
ウイルスゲノムまたはその断片、および目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（本明細書中で導入遺伝子とも呼ばれる）を含むＤＮＡウイルスベクター（アデノウイルス（ＡｄＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）など）は、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）、およびＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｇｅｎｅ（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ）などの供給元から市販されている。野生型ＡＡＶは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる感染性および特異性が高い。Ｗｏｌｄ ａｎｄ Ｔｏｔｈ（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１３（６）：４２１－４３３、Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６４６６－６４７０、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８－３９９６を参照のこと。
プロモーターおよびポリヌクレオチドを作動可能に連結することができるクローニング部位の両方を有するベクターは、当該分野で周知である。かかるベクターは、ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで転写することができ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などの供給元から市販されている。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を最適にするために、余剰の潜在的な不適切な代替的翻訳開始コドンまたは転写または翻訳レベルのいずれかで発現を干渉するか低下させ得る他の配列を排除するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去するか、付加するか、変化させることが必要な場合がある。あるいは、発現を増強するために、コンセンサスリボソーム結合部位を、開始コドンの５’側に近隣して挿入することができる。
また、遺伝子送達ビヒクルには、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセル、および標的化されたウイルスタンパク質－ＤＮＡ複合体が含まれる。標的抗体またはその断片も含むリポソームを、本明細書中に開示の方法で使用することができる。細胞または細胞集団へのポリヌクレオチドの送達に加えて、細胞または細胞集団への本明細書中に記載のタンパク質の直接導入を、非限定的なタンパク質トランスフェクション技術によって行うことができ、あるいは、本明細書中に開示のタンパク質の発現を増強し、そして／または活性を促進することができる培養条件は、他の非限定的な技術である。
本明細書中で使用される場合、用語「ウイルスキャプシド」または「キャプシド」は、ウイルス粒子のタンパク質性のシェルまたは外被を指す。キャプシドは、ウイルスゲノムをキャプシド形成し、保護し、輸送し、宿主細胞に放出する機能を果たす。キャプシドは、一般に、タンパク質のオリゴマー構造サブユニット（「キャプシドタンパク質」）から構成される。本明細書中で使用される場合、用語「キャプシド形成された」は、ウイルスキャプシドに封入されたことを意味する。
本明細書中で使用される場合、ウイルスまたはプラスミドに関する用語「ヘルパー」は、ウイルス粒子または組換えウイルス粒子（本明細書中に開示の改変されたＡＡＶなど）の複製およびパッケージングに必要なさらなる成分を提供するために使用されるウイルスまたはプラスミドを指す。ヘルパーウイルスによってコードされる成分には、ビリオンアセンブリ、キャプシド形成、ゲノム複製、および／またはパッケージングに必要な任意の遺伝子が含まれ得る。例えば、ヘルパーウイルスは、ウイルスゲノムの複製に必要な酵素をコードし得る。ＡＡＶ構築物と共に使用するのに適切なヘルパーウイルスおよびプラスミドの非限定的な例には、ｐＨＥＬＰ（プラスミド）、アデノウイルス（ウイルス）、またはヘルペスウイルス（ウイルス）が含まれる。
本明細書中で使用される場合、用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの標準的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、一本鎖ＤＮＡパルボウイルスであり、ヘルパーウイルスとの重感染によって一定の機能を果たす細胞内のみで成長する。ＡＡＶの一般的な情報および概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８およびＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で見出すことができる。種々の血清型が遺伝子レベルですら構造および機能の両方において極めて密接に関連していることが周知であるので、これらの概説に記載の原理と同一の原理を概説の公開日後に特徴づけられたさらなるＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．；およびＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照のこと）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製タンパク質を見かけ上示し；これらは全て３つの関連するキャプシドタンパク質（ＡＡＶ２で発現されるものなど）を保有する。ゲノムの長さに沿った血清型の間の広範な交差ハイブリッド形成および「逆位末端配列」（ＩＴＲ）に相当する末端における類似する自己アニーリングセグメントの存在がヘテロ二重鎖分析によって明らかにされたことで、近縁度がさらに示唆される。また、感染パターンの類似性は、各血清型の複製機能が類似の調節管理下にあることを示唆している。
本明細書中で使用される「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する１またはそれを超える目的のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含むベクターを指す。ｒｅｐ遺伝子産物およびｃａｐ遺伝子産物をコードし発現するベクターでトランスフェクトされている宿主細胞中に存在するときに、かかるＡＡＶベクターは複製し、感染性ウイルス粒子中にパッケージングするとができる。
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質および被包化されたポリヌクレオチドＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド（哺乳動物細胞に送達されるべき導入遺伝子など））を含む場合、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または単純に「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ＡＡＶベクター粒子の産生には必然的にＡＡＶベクターの産生が含まれ、そのようなものとして、ベクターは、ＡＡＶベクター粒子の範囲内に含まれる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損性パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、長さが約４．７ｋｂであり、２つの１４５ヌクレオチドの逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており；ＡＡＶ－２の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）に提供されており；ＡＡＶ－３の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており；ＡＡＶ－４の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿００１８２９に提供されており；ＡＡＶ－５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており；ＡＡＶ－６の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００ １８６２に提供されており；ＡＡＶ－７ゲノムおよびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供されており；ＡＡＶ－９ゲノムはＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており；ＡＡＶ－１０ゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており；ＡＡＶ－１１ゲノムはＶｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、米国特許第９，４３４，９２８号（本明細書中で参考として援用される）に提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組み込みを指示するシス作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（その関連マップの位置に関してｐ５、ｐｌ９、およびｐ４０と命名されている）は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部読み取り枠の発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐｉ９）により、（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）単一のＡＡＶイントロンのディファレンシャルスプライシングと併せて、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）が産生される。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製を担う複数の酵素的性質を有する。ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現され、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。オルタナティブスプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するキャプシドタンパク質の産生を担う。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムマップの９５位に存在する。ＡＡＶの生活環およびゲノミクスは、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。
ＡＡＶは、例えば遺伝子治療において外来ＤＮＡを細胞に送達させるためのベクターとして魅力的な固有の特徴を有する。培養細胞のＡＡＶ感染は細胞を変性させず、ヒトおよび他の動物の自然感染は無症候かつ無症状である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染し、ｉｎ ｖｉｖｏで多くの異なる組織を標的にすることが可能である。さらに、ＡＡＶは、分裂が遅いか非分裂の細胞に形質導入し、転写活性核エピソーム（染色体外エレメント）として本質的にこれらの細胞の生存期間にわたって存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中にクローン化されたＤＮＡとして挿入され、組換えゲノムの構築を可能にする。さらに、ＡＡＶ複製およびゲノムキャプシド形成を指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるので、ゲノム内部のおよそ４．３ｋｂ（複製および構造キャプシドタンパク質（ｒｅｐ－ｃａｐ）をコードする）のいくつかまたは全ては、外来ＤＮＡと置換され得る。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の特筆すべき特徴は、極めて安定かつ頑強なウイルスであることである。ＡＡＶは、アデノウイルスを不活化させるために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存もあまり問題にならない。ＡＡＶはさらに凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重感染に耐性を示さない。
複数の研究によって筋肉内での長期間（１．５年超）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現が実証されている。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）；Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）；およびＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照のこと。Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）も参照のこと。さらに、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）およびＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載のように、筋肉は高度に血管化されているので、組換えＡＡＶが形質導入されると筋肉内注射後に体循環中に導入遺伝子産物が認められる。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が正確な抗体のグリコシル化、折りたたみ、および分泌に必要な細胞因子を保有し、筋肉が分泌型タンパク質治療薬を安定に発現することができることを示すことを実証している。ｒＡＡＶゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスを誘導することができる任意のＡＡＶ血清型に由来してよく、この血清型には、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、およびＡＡＶ ｒｈ７４が含まれるが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２号に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶバリアント（例えば、キャプシドが変異したｒＡＡＶ）も意図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照のこと。種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が当該分野で公知である。
単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）は、免疫系および循環している抗ウイルス薬を回避し、複数の遺伝子を送達させ、多種多様の細胞に感染し、健康に悪影響を及ぼすリスクが低く、腫瘍細胞中で特異的に増殖することができるので、癌および他の疾患に対する予防用および治療用ワクチンとしての途方も無い可能性を有すると考えられている。ＨＳＶは、１２０～２４０ｋｂの線状ｄｓＤＮＡを保有し、爬虫類、鳥類、魚類、両生類、および哺乳動物に感染する巨大なエンベロープウイルスである。以下の８つのヒトヘルペスウイルスが公知である：単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、およびヒトヘルペスウイルス６型および７型（α、β、およびγの亜科に分類される）。ＨＳＶベクターは、一般に、ウイルスゲノムと、組換えを受けるためのウイルスゲノム上の標的座に相同な配列に隣接する治療遺伝子を保有するプラスミドとの同時トランスフェクションによる、真核細胞における相同組換えによって構築される。複製不全ベクターは、複製に不可欠ないくつかの最初期遺伝子（ＩＣＰ４およびＩＣＰ２７が含まれる）の変異または欠失のいずれかによって作出され、したがって、一過性に補足された特別設計の細胞株内でのみ成長することができる。例えば、Ｖｅｒｏ－７ｂ細胞株は、欠損ウイルス遺伝子によってコードされるタンパク質をトランスで提供することができる。これらのタンパク質は、神経細胞中で生涯にわたって維持および発現されることが公知の安全かつ非炎症性の進歩したベクタープラットフォームであり、したがって、神経因性、炎症性、および癌に関連する疼痛の処置のために使用される。ヘルパー依存性のＨＳＶベクター、すなわちアンプリコンベクターは、１またはそれを超える非必須遺伝子を欠失しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複製する能力を保持しているが、ｉｎ ｖｉｖｏでは状況依存的にその能力を欠く。これらのウイルスは野生型ＨＳＶと同一であり、プラスミドはパッケージングシグナルおよび目的の遺伝子を含む。アンプリコンは、１００ｋｂまでのサイズの非常に巨大な治療配列を収容する能力を有するが、産生および安定性に問題がある。複製不全ベクターおよびアンプリコンは、神経系、筋肉、心臓、および肝臓で遺伝子を発現させるために使用されている。
ＰＴＥＮ－Ｌを保有する腫瘍崩壊性ＨＳＶ－１は、脳癌を処置するために首尾よく使用されており（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ，２０１８；ＰＭＩＤ：３０４７９３３４）、それに対して、ＦＤＡ承認Ｔ－Ｖｅｃ ＨＳＶ薬が含まれるさらなる例は、Ｇｏｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ，２０１９（ＰＭＩＤ：３１０６９１６９）に概説されている。
１つの実施形態では、ＨＳＶウイルスゲノムまたはその断片および融合タンパク質コードするポリヌクレオチドを含むＨＳＶベクターを提供する。さらなる実施形態では、ＨＳＶベクターを、ＨＳＶ－１菌株１７（１５２，２２２ｂｐ；ＮＣＢＩ リファレンス配列：ＮＣ＿００１８０６．２；Ｎａｔｉｏｎａｌ（ＵＫ）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｖｉｒｕｓｅｓ，カタログ番号０１０４１５１ｖ）から生成する。公知のＨＳＶベクター（ＨＳＶ－１菌株１７など）からかかるＨＳＶベクターを作出する方法は、実施例に見出すことができる。なおさらなる実施形態では、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４７およびＩＣＰ３４．５病原性ＨＳＶ遺伝子の一方または両方を欠く。１つの実施形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子のうちの１つまたはそれ超を、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに置換する。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、融合タンパク質の発現を指示する制御配列をさらに含む。必要に応じて、制御配列は、ＣＭＶプロモーターおよび／またはＣＭＶ５プロモーターを含む。さらにまたはあるいは、ポリヌクレオチドは、本明細書中に開示のアルブミン－ＰＴＥＮ融合物ｃＤＮＡ（配列番号５４～７０、７４～７７、または１３５～１６０のうちの１つまたはそれ超など）を含む。１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６８のｃＤＮＡまたはその等価物を含み、配列番号２８のＰＲ４０２タンパク質を発現する。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５９のｃＤＮＡまたはその等価物を含み、配列番号１９のＰＲ６１タンパク質を発現する。さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６５のｃＤＮＡまたはその等価物を含み、配列番号２５のＰＲ３３タンパク質を発現する。１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１３６のｃＤＮＡまたはその等価物を含み、配列番号５０のＰＲ３４タンパク質を発現する。１つの実施形態では、ＨＳＶベクターは、図６Ｄに図示したＨＳＶ－１／１７／Δ４７／Δ３４．５－ＰＲｎであり、これは、ＩＣＰ４７を欠き、ＩＣＰ３４．５遺伝子（複数可）が、ＣＭＶプロモーターの制御下で融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに置換されている。ＨＳＶの産生および／または融合タンパク質の発現のために本明細書中に開示のＨＳＶを感染させた宿主細胞をさらに提供する。１つの実施形態では、宿主細胞は、許容性細胞（ウイルスがその防御を回避して複製することが可能な細胞）である。さらにまたはあるいは、宿主細胞は、ＨＳＶ進入を媒介する受容体（ネクチン－１、ヘルペスウイルス進入メディエーター（ＨＶＥＭ）、または３－Ｏ－硫酸化ヘパラン硫酸が含まれるが、これらに限定されない）を含む。さらなる実施形態では、宿主細胞は、４Ｔ１細胞、ＭＤＡＭＢ４６８細胞、またはＰＣ３細胞の群から選択される。１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４～３０、３４～３７、４９～５０、および１０９～１３２から選択されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする。別の実施形態では、組換え腫瘍崩壊性ＨＳＶを、ＣＲＩＳＰＲ方法論またはＴＡＬＥＮ方法論を使用して構築する。１つの実施形態では、ウイルスはＨＳＶ－１である。別の実施形態では、ＨＳＶウイルスはＨＳＶ－２である。別の実施形態では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、必要に応じて（配列番号１７１または配列番号１８０～１９２のｎｔ（１～６３））から選択されるＮ末端シグナルペプチドをコードするポリペプチドを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチドを欠くが、必要に応じてそれぞれアルブミンまたはＰＴＥＮのいずれかのＮ末端にイニシエーターメチオニン残基（必要に応じてＡＴＧコドンによってコードされる）を含む。別の実施形態では、必要に応じて、融合タンパク質は、シグナルペプチドを欠くが、アルブミン（例えば、必要に応じてポリヌクレオチドをコードするアルブミンの最初の３つのヌクレオチドがＡＴＧと置換された成熟アルブミン、さらに必要に応じてアルブミンコードポリペプチドは、配列番号１７６～１７９から選択される）またはＰＴＥＮ（例えば、必要に応じてＰＴＥＮコードポリヌクレオチドの最初の３つのヌクレオチドがＡＴＧと置換された成熟ＰＴＥＮ－Ｌ、さらに必要に応じて、ＰＴＥＮコードポリヌクレオチドは、配列番号１６７または配列番号１７１のヌクレオチド（ｎｔ）６４～ｎｔ１７２８から選択される配列を含む）の最初の残基が置換されたイニシエーターメチオニン（必要に応じてＡＴＧコドンによってコードされる）を含む。別の実施形態では、組換え腫瘍崩壊性ＨＳＶウイルスは、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０から選択される１つのアルブミン－ＰＴＥＮ融合物のｃＤＮＡを保有する／含む。別の実施形態では、ウイルスは、配列番号５４～７０、７４～７７、または１３５～１６０から選択される２またはそれを超えるアルブミン－ＰＴＥＮ融合物のｃＤＮＡを保有する／含む。別の実施形態では、本明細書中に開示の組換え腫瘍崩壊性ＨＳＶウイルスまたは別の他のベクターは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４～７０、７４～７７、または１３５～１６０から選択される。さらにまたはあるいは、本明細書中に開示の組換え腫瘍崩壊性ＨＳＶウイルスまたは任意の他のベクターは、アルブミンのアミノ酸配列およびｐ５３タンパク質のアミノ酸配列を含むさらなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書中で使用される場合、アルブミンおよびｐ５３タンパク質のアミノ酸配列を含む融合タンパク質は、本明細書中でアルブミン－ｐ５３タンパク質と呼ばれる。さらなる実施形態では、アルブミン－ｐ５３タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７８または１６１から選択される。ある特定の実施形態では、本明細書中に記載の組換えウイルスベクターおよび／または任意のベクターは、異種タンパク質またはポリペプチドの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
１つの実施形態では、異種タンパク質は、ウイルスベクターに対して異種である。さらなる実施形態では、異種タンパク質は、融合タンパク質に対して異種である（例えば、ヒトＰＴＥＮおよび／またはアルブミンである場合、ヒトに対して異種である）。なおさらなる実施形態では、異種タンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。１つの実施形態では、異種タンパク質は、ＰＴＥＮ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。１つの実施形態では、異種タンパク質は、シグナルペプチドおよび／または検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む。１つの実施形態では、異種タンパク質は、アルブミンのアミノ酸配列を欠く。さらなる実施形態では、異種タンパク質は、ＰＴＥＮ－Ｌ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。なおさらなる実施形態では、異種タンパク質は、配列番号３１～３３、または各々の断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、異種タンパク質は、配列番号７１～７３、１７１～７２、１６６～１６７、１９８～２００、２０４～２０６から選択される配列、その断片を含むポリヌクレオチド、または配列番号７１～７３、１７１～７２、１６６～１６７、１９８～２００、２０４～２０６と少なくとも９０％同一であり、かつそれぞれ配列番号７１～７３、１７１～７２、１６６～１６７、１９８～２００、２０４～２０６によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドによってコードされる。別の実施形態では、異種タンパク質を、癌の処置で使用することができる（抗体またはその断片など）。さらなる実施形態では、異種タンパク質は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその等価物であり、以下が含まれるが、これらに限定されない：ＶＥＧＦＲを認識して結合するｍＡｂまたはその等価物（アバスチン（商標）など）、またはＨＥＲ２を認識して結合するｍＡｂまたはその等価物（ハーセプチン（商標）など）、またはＥＧＦＲを認識して結合するｍＡｂまたはその等価物（アービタックス（商標）など）または免疫チェックポイントを制御するｍＡｂまたはその等価物（「チェックポイント抗体」としても広く知られている）（ＣＴＬＡ４を認識して結合するもの（例えば、ヤーボイ（商標）（イピリムマブ））、またはＰＤ－１を認識して結合するもの（例えば、キイトルーダ（商標）（ペムブロリズマブ）およびオプジーボ（商標）（ニボルマブ））、またはＰＤ－Ｌ１を認識して結合するもの（例えば、テセントリク（商標）（アテゾリズマブ）など）。別の実施形態では、異種タンパク質は、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）またはその等価物、インターロイキン（ＩＬ－２またはＩＬ－１５など）、またはインターフェロン（ＩＦＮβまたはＩＦＮγなど）；または天然の生物活性ペプチド（サイモシンＡまたはアディポネクチンなど）、または合成ペプチド（ヘキサレリンなど）の群から選択される。
水力学的送達は、げっ歯類における膜不透過性物質を細胞内送達するための最も簡潔かつ最も有効な方法として登場した。このシステムは、内皮および実質細胞の原形質膜の透過性を強化して細胞内に物質を送達させるために血管内に大量の溶液を迅速に注射することによって得られる物理的な力を使用する。手順はマウスにおける遺伝子送達のために最初に確立され、その適用はタンパク質、オリゴヌクレオチド、ゲノムＤＮＡ、およびＲＮＡの各配列、ならびに小分子の送達にまで広まっている。遺伝子の治療機能を研究するために水力学的遺伝子送達を使用することの利点は明白である。発現のための制御配列を有するプラスミドまたはＤＮＡ断片中の候補遺伝子を、標的疾患を罹患している動物（マウスまたはラット）に水力学的に注射することができる。次いで、疾患の進行または抑制に対する遺伝子産物（タンパク質またはＲＮＡ）の治療効果を、経時的に評価する。従来の薬物研究と同様に、反復遺伝子移入、異なる量のＤＮＡ、および異なるレジメン（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）を使用して、治療結果を最大にすることができる。治療の評価を精製タンパク質に依存する従来の生物工学的アプローチと比較して、水力学ベースのプロトコールは、肝臓を治療タンパク質の製造所にし、タンパク質の産生および特徴づけのための工程および費用が排除される。さらに、治療評価が動物内で直接行われるので、製剤の開発および生物学的利用能に関する問題に取り組む必要がない。疾患を処置するための水力学遺伝子送達の例には、動物の生存期間を延長するための脳腫瘍へのエンドスタチン遺伝子の動脈内送達；ジエチルニトロソアミン（ｄｉｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ）によって誘導されたラット肝細胞癌において高レベルで遺伝子発現される肝動脈を介したプラスミドＤＮＡの大量の水力学的注射；マウス転移モデルにおける裸のプラスミドＤＮＡを用いた静脈内インターフェロン遺伝子送達の治療効果など（Ｂｏｎａｍａｓｓａ ｅｔ ａｌ，２０１１；ＰＭＩＤ：２１１９１６３４に概説）が含まれる。
本明細書中で使用される場合、用語「動物」は、生きている多細胞脊椎動物を指し、このカテゴリーには、例えば、哺乳動物および鳥類が含まれる。用語「哺乳動物」には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方が含まれる。
用語「被験体」、「宿主」、「個体」、および「患者」は、ヒトおよび獣医学的被験体（例えば、ヒト、動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、およびウシ）を指すために本明細書中で互換的に使用される。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
「有効量」または「有効な量」は、哺乳動物または他の被験体の処置のために投与したときに、疾患のかかる処置に十分な単剤の量、または２またはそれを超える薬剤の組み合わせた量を指す。「有効量」は、薬剤（複数可）、疾患およびその重症度、ならびに処置を受ける被験体の年齢、体重などに応じて変動するであろう。
本明細書中で使用される場合、生物試料、または試料を、被験体、細胞株、または培養された細胞もしくは組織から得ることができる。例示的な試料には、細胞試料、組織試料、腫瘍生検、血液などの液体試料および生体起源の他の液体試料（眼液（眼房水および硝子体液）、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液または尿道球腺液、膣液、汗、涙、嚢胞液、胸膜液および腹腔液、心膜液、腹水、リンパ、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、経血、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物／流出物、滑液、粘膜分泌物、便水溶液、膵液、鼻腔洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液（ｂｌａｓｔｏｃｙｌ ｃａｖｉｔｙ ｆｌｕｉｄ）、または臍帯血が含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの例では、試料は、腫瘍／癌生検である。
「固形腫瘍」は、通常は嚢胞や液体領域を含まない異常な組織塊である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。異なるタイプの固形腫瘍は、固形腫瘍を形成する細胞のタイプから名付けられる。固形腫瘍の例には、肉腫、癌腫、およびリンパ腫が含まれる。固形腫瘍は、局在性または転移性であり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「細胞外基質」（ＥＣＭ）は、細胞外高分子（コラーゲン、酵素、および糖タンパク質など）の三次元網目構造であり、周囲の細胞を構造的および生化学的に支持している。ＥＣＭは、腫瘍微小環境の必須成分である。癌の発生および進行はＥＣＭの沈着および架橋の増加に関連し、一方、ＥＣＭから誘発される化学的シグナルおよび物理的シグナルは、癌細胞の増殖および浸潤に必要である。１つの実施形態では、癌のＥＣＭは、癌周囲の細胞または組織を含む。
ｐｉ３Ｋ経路は、細胞外シグナルに応答して代謝、増殖、細胞生存、成長、および血管形成を促進する細胞内シグナル伝達経路である。これは、ある範囲の下流物質のセリンおよび／またはトレオニンのリン酸化によって媒介される。関与する重要なタンパク質は、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびＡｋｔ／プロテインキナーゼＢである。ＰＴＥＮは、ＰＩＰ３をＰＩＰ２に変換することができる主な下方制御タンパク質である。これらの制御タンパク質に加えて、経路自体もフィードバック機序を有する：Ａｋｔによって活性化される転写因子ＮＦ－κＢは、ペルオキシソーム増殖活性化受容体δ（ＰＰＡＲβ／δ）アゴニストおよび腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を制御し、次に正のフィードバックとしてＰＴＥＮ発現を抑制する；負のフィードバックループは、ｍＴＯＲＣ１およびＳ６Ｋ１の活性化によって機能する。Ｓ６Ｋ１は、ＩＲＳ－１の複数のセリン残基をリン酸化してＲＴＫへの結合が阻止され、それによりＰＩ３Ｋ活性化を抑制することができる。
本明細書中で使用される場合、用語「検出可能なマーカー」は、検出可能なシグナルを直接または間接的に産生することができる少なくとも１つのマーカーを指す。このマーカーの包括的ではないリストには、例えば、比色、蛍光、発光によって検出可能なシグナルを産生する酵素（セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼなど）、発色団（蛍光、発光染料など）、電子顕微鏡法またはその電気的性質（導電率、電流滴定、ボルタンメトリー、インピーダンスなど）によって検出される電子密度を有する基、検出可能な基であって、例えば、その分子が、物理的および／または化学的性質の検出可能な改変を誘導するのに十分なサイズの分子である、検出可能な基が含まれ、かかる検出を、光学的方法（回折、表面プラズモン共鳴、表面変化、接触角の変化など）または物理的方法（原子間力分光法、トンネル効果、または放射性分子（３２Ｐ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、もしくは１２５Ｉなど）など）によって行ってよい。
本明細書中で使用される場合、用語「精製マーカー」は、精製または同定に有用な少なくとも１つのマーカーを指す。このマーカーの包括的ではないリストには、Ｈｉｓ、ｌａｃＺ、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＢＣＣＰ、ｃ－ｍｙｃ、ＣａＭ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｃｈｅｒｒｙ、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、Ｖ５、Ｓｎａｐ、ＨＡ、キチン結合タンパク質、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、またはＳ－タンパク質が含まれる。適切な直接または間接的な蛍光マーカーは、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｃｈｅｒｒｙ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＮＰ、ＡＭＣＡ、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｔａｍｒａ、テキサスレッド、ローダミン、アレクサフルオル、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、または任意の他の蛍光色素もしくはハプテンを含む。
本明細書中で使用される場合、エピトープタグは、抗体によって認識される抗原として作用するタンパク質または炭水化物などの生物学的構造または配列である。ある特定の実施形態では、エピトープタグは、精製マーカーおよび／またはアフィニティタグと互換的に使用される。
本明細書中で使用される場合、「光学的イメージング」は、関心領域由来のシグナルのうちの少なくともいくつかが可視光線範囲の電磁放射線の形態であるシグナルのイメージングを指す。光学的イメージングの非限定的な例には、蛍光および発光シグナルの検出が含まれる。かかるシグナルを、光学デバイス（カメラなど）によって捕捉することができる。
本明細書中で使用される場合、「非光学的イメージング」は、関心領域由来のシグナルのうちの少なくともいくつかが可視領域外の電磁放射線の形態であるシグナルのイメージングを指し、粒子、および他のエネルギー伝播が含まれ得る。非光学的イメージングの非限定的な例には、ガンマ線（例えば、ＳＰＥＣＴ）、Ｘ線、ＲＦシグナル（例えば、ＭＲＩ）、電子または陽電子などの粒子（例えば、ＰＥＴ）、および他のエネルギー伝播形態（例えば、超音波）の検出が含まれる。
本明細書中で使用される場合、「免疫表現型検査」は、試料中の種々の集団の存在および比率を同定することを目的とした細胞の不均一集団の分析を指す。これらの細胞によって発現された特異的抗原（マーカーと称される）を検出することによって細胞を同定するために抗体を使用する。１つの態様では、細胞試料を、フローサイトメトリーなどの技術を使用した免疫表現型検査によって特徴付ける。別の態様では、細胞試料中に存在する種々の細胞型（Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびそのサブセットなど）は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）または免疫細胞化学（ＩＨＣ）などの任意の適切な方法論を使用して特徴付けられ得る。１つの態様では、細胞試料中に存在する細胞集団または細胞型を、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、Ｐｄ－１、ＣＤ６９（ｌａｇ３／ＩＣＯＳ／ＣＴＬＡ４）、Ｋｉ－６７、ＣＤ４９ｂ／ＣＤ３３５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ－６Ｇ、Ｌｙ－６Ｃ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２４、Ｆ４／８０、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ２０６、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１０３、ＸＣＲ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｓｉｇｌｅｃ－Ｈ（１５）、ＣＤ１１５、ＰＤ－Ｌ１から選択される１またはそれを超える細胞表面マーカーの有無に基づいて同定する。
句「ファーストライン」または「セカンドライン」または「サードライン」は、患者が受ける処置の順序を指す。ファーストライン治療レジメンは最初に受ける処置であり、それに対して、セカンドライン治療またはサードライン治療は、それぞれ、ファーストライン治療後またはセカンドライン治療後に受ける。国立癌研究所は、ファーストライン治療を、「疾患または病態のための第１の処置」と定義している。癌患者では、一次処置は、手術、化学療法、放射線療法、またはこれらの治療の組み合わせであり得る。ファーストライン治療は、当業者によって「一次治療および一次処置」とも呼ばれている。典型的には、ファーストライン治療に対して正の臨床応答または亜臨床応答を示さなかったか、ファーストライン治療を中止した場合に、患者は、その後に化学療法レジメンを受ける。
明確な言及がなく、別の意図がない限り、本開示がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体に関するとき、その等価物または生物学的等価物は本開示の範囲内にあると推測すべきである。本明細書中で使用される場合、用語「その生物学的等価物」は、基準のタンパク質、抗体、ポリペプチド、または核酸に言及するときに「その等価物」と同義であることが意図され、所望の構造または機能性を依然として維持している一方で最小の配列同一性を有するものを意図する。本明細書中に具体的な列挙がない限り、本明細書中に言及した任意のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質にはその等価物も含まれることが意図される。例えば、等価物は、基準配列の長さにわたって少なくとも約７０％の相同性または同一性、または少なくとも８０％の相同性または同一性、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは９８％の相同性または同一性を意図し、基準のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と実質的に等価な生物学的活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドに言及するとき、その等価物は、ストリンジェントな条件下で基準ポリヌクレオチドまたはその相補物にハイブリッド形成するポリヌクレオチドである。
「組成物」は、活性なポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体と、別の化合物または組成物（不活性な（例えば、検出可能な標識）または活性な（例えば、遺伝子送達ビヒクル））との組み合わせを意味することが意図される。
「医薬組成物」は、組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏでの診断または治療での使用に適切にする、活性なポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体の、不活性または活性な担体（固体支持体など）との組み合わせが含まれることが意図される。
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容され得る担体」は、標準的な薬学的担体（リン酸緩衝生理食塩水、水、および乳剤（水中油乳剤または油中水乳剤など）、および種々のタイプの湿潤剤など）のうちのいずれかを包含する。また、組成物は、安定剤および防腐剤を含むことができる。担体、安定剤、およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ（１９７５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ）を参照のこと。
診断または処置の「被験体」は、細胞または動物（哺乳動物など）またはヒトである。被験体は、特定の種に制限されず、診断または処置するための非ヒト動物被験体が含まれ、感染症被験体または動物モデル（例えば、サル、ネズミ科（ラット、マウス、チンチラなど）、イヌ科（イヌなど）、ウサギ科（ウサギなど）、家畜、競技用動物、および愛玩動物）である。ヒト被験体もこの用語に含まれる。
用語「組織」は、生きているか死んでいる生物の組織または生きているか死んでいる生物に由来するか模倣するように設計された任意の組織を指すために本明細書中で使用される。組織は、健康であり、罹患しており、そして／または遺伝子変異を有していてよい。生物組織には、任意の単一の組織（例えば、相互に関連し得る細胞の集合物）または生物の器官もしくは身体の一部もしくは領域を構成する組織の群が含まれ得る。組織は均一な細胞物質を含み得るか、複合構造（身体の領域で見出される複合構造（例えば肺組織、骨格組織、および／または筋組織を含むことができる胸郭が含まれる）など）であり得る。例示的な組織には、肝臓、肺、甲状腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆管系、十二指腸、腹大動脈、腸骨静脈、心臓、および腸（その任意の組み合わせが含まれる）に由来する組織が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、被験体における疾患の「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、（１）罹患しやすいか、疾患の症状を依然として示していない被験体において症状または疾患が生じるのを予防すること；（２）疾患を抑制するか、その発症を停止させること；または（３）疾患または疾患の症状を回復させるか後退させることを指す。当該分野で理解されるように、「処置」は、有利であるか望ましい結果（臨床結果が含まれる）を得るためのアプローチである。このテクノロジーのために、有利であるか望ましい結果には、以下のうちの１つまたはそれ超が含まれ得るが、これらに限定されない：１またはそれを超える症状の緩和もしくは回復、容態（疾患が含まれる）の範囲の縮小、容態（疾患が含まれる）の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、容態（疾患が含まれる）の遅滞もしくは遅延、容態（疾患が含まれる）の進行、緩和、または一時的軽減、状態および寛解（部分的または全体を問わず）（検出可能または検出不可能を問わず）。１つの態様では、用語「処置」は予防は除外される。
本明細書中で使用される場合、用語「有効性」または「効能」は、本明細書中に開示の融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または方法のうちの１つまたはそれ超の接触、投与、および／または送達などの所与の介入によって有利なおよび／または所望の結果を達成する能力を指す。１つの実施形態では、所与の介入は、被験体のｉｎ ｖｉｖｏ処置である。別の実施形態では、所与の介入は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施され／行われ、例えば、被験体から単離した癌細胞もしくは組織、または癌細胞株に適用される。所望の有効性（治療効果とも呼ばれる）の非限定的な例には、被験体においける疾患（例えば、癌）の処置の成功、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの癌細胞の成長の抑制、および／またはバイオマーカーの変化が含まれる。種々の方法を、かかる有効性の評価のために使用することができる（実施例に開示の方法が含まれる）。ある特定の実施形態では、所望の有効性には、癌細胞／組織内のＰＴＥＮ遺伝子コピー、ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ、および／またはＰＴＥＮタンパク質の増加も含まれ得る。さらにまたはあるいは、所望の有効性は、癌周辺領域内の（１）ＰＴＥＮタンパク質、（２）ＰＴＥＮタンパク質の断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物、および／または（３）本明細書中に記載の（１）または（２）を含む融合タンパク質の増加を指す。（３）の融合タンパク質は、細胞（例えば、癌細胞）に透過可能なアミノ酸配列（血清アルブミンおよび／またはＰＴＥＮの最小細胞透過ドメイン（ＭＣＰＤ）など）をさらに含み得る。句「癌細胞成長の抑制」またはその任意の文法上の異型は、本明細書中で使用される場合、以下のうちの１または複数を指す：癌細胞複製の抑制、停止、転移、遅滞、および／または遅延、総癌細胞数の減少、癌細胞の細胞死（アポトーシスおよび壊死など）の促進、癌細胞バイオマーカー（ｏｎｃｏ－ｍｉＲ、すなわちｐｉ３Ｋ経路薬力学バイオマーカーなど）の発現の減少、ならびに／または癌細胞内で欠くか低レベルで発現される分子（ＰＴＥＮなど）の存在もしくは発現の増加。
発明を実施するための形態
本開示は、血清アルブミン（ＳＡ）（ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、サル血清アルブミン（ＳＳＡ）、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、またはその欠損変異体、バリアント、もしくはアナログが含まれるが、これらに限定されない）およびヒトＰＴＥＮ－ＬもしくはＰＴＥＮ腫瘍抑制因子またはその欠損変異体、バリアント、もしくはアナログの連続したアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる融合タンパク質を提供する。１つの実施形態では、血清アルブミンのアミノ酸配列は、ＰＴＥＮのＮ末端に直接または間接的に抱合している。別の実施形態では、血清アルブミンのアミノ酸配列は、ＰＴＥＮのＣ末端に直接または間接的に抱合している。
１つの態様では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、サル血清アルブミン（ＳＳＡ）、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）、もしくはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、または各々の断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物の群から選択される。別の実施形態では、血清アルブミンは、配列番号１３のアミノ酸１～１９７に等価なアルブミンドメインＩを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる実施形態では、血清アルブミンは、配列番号１３のアミノ酸１～３９５と等価なアルブミンのドメインＩおよびＩＩを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。なおさらなる実施形態では、アルブミンは、配列番号１３のアミノ酸３８２～５８５と等価なアルブミンドメインＩＩＩを欠く。ある特定の実施形態では、アルブミンは、配列番号１３のアミノ酸１９８～３８１と等価なアルブミンドメインＩＩを欠く。１つの実施形態では、アルブミンは、配列番号１３のアミノ酸１９８～５８５と等価なアルブミンドメインＩＩおよびＩＩＩを欠く。別の実施形態では、アルブミンは、成熟ＨＳＡの最初の３４個もしくは６２個のアミノ酸またはその等価物を欠く。必要に応じて、アルブミンは、配列番号１３のアミノ酸３５～３８５もしくは６３～５８５またはその等価物のアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。１つの実施形態では、血清アルブミンは、シグナルペプチドを含むプレタンパク質またはシグナルペプチドを欠く成熟血清アルブミンである。さらなる実施形態では、血清アルブミンは、配列番号１２のアミノ酸５８もしくは配列番号１３のアミノ酸３４に等価な位置に必要に応じたシステインからセリンへの変異、または配列番号１３のアミノ酸３４に変異を保持する各々の等価物を含む。さらにまたはあるいは、血清アルブミンは、配列番号１３のアミノ酸３４に等価な位置で分子と抱合したアミノ酸を含み、前述の分子は、小分子、細胞傷害性分子、リンカー、ｐＨ感受性リンカー、および／またはチオールリンカーである。
１つの実施形態では、血清アルブミンは、配列番号１２～１３、９０～９３、および１６３、またはそれぞれ配列番号１２、１３、９０～９３、もしくは１６３と同一もしくは類似の活性を有する配列番号１２～１３、９０～９３、および１６３のうちのいずれか１つの断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらにまたはあるいは、血清アルブミンは、配列番号１７６～１７９から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１７６～１７９によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
別の実施形態では、融合タンパク質のＳＡ部分は、配列番号１２～１３（ＨＳＡ）もしくは配列番号９０（ＳＳＡ）、もしくは配列番号９１（ＲＳＡ）もしくは配列番号９２（ＭＳＡ）、またはその欠損変異体（最小ヒト血清アルブミン（配列番号１６３）など）、または各々のその等価物、もしくは断片、もしくは最小断片、もしくは類似体、もしくはバリアントのアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
さらなる態様では、ＰＴＥＮは、哺乳動物（例えば、ヒトＰＴＥＮ、サルＰＴＥＮ、ラットＰＴＥＮ、またはマウスＰＴＥＮ）の群から選択される。１つの実施形態では、ＰＴＥＮは、単一のペプチドを欠くその成熟形態（例えば、配列番号３）であるか、プレタンパク質（例えば、配列番号１）である。
１つの実施形態では、ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ（ＰＴＥＮ－Ｌ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる実施形態では、ＰＴＥＮ－Ｌは、配列番号３のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＥＮ－Ｌであり、さらにまたはあるいは、ＰＴＥＮ－Ｌは、配列番号１７１の操作されたポリヌクレオチド配列または配列番号１７１のヌクレオチド（ｎｔ）６４～ｎｔ１７２８、または配列番号１７１もしくは配列番号１７１のヌクレオチド（ｎｔ）６４～ｎｔ１７２８によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるヒトＰＴＥＮ－Ｌである。１つの実施形態では、ＰＴＥＮは、列番号１７１、配列番号１７１のヌクレオチド（ｎｔ）６４～ｎｔ１７２８、または配列番号１６７から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはそれぞれ配列番号１７１、配列番号１７１のｎｔ６４～ｎｔ１７２８、または配列番号１６７によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＰＴＥＮは、配列番号１もしくは３もしくは８９、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
１つの実施形態では、ＰＴＥＮは、配列番号６もしくは２０１、または配列番号６もしくは２０１の断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物のアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらにまたはあるいは、ＰＴＥＮは、配列番号１９８もしくは２０４の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはそれぞれ配列番号１９８もしくは２０４によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮ－Ｍイソ型、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物である。ある特定の実施形態では、ＰＴＥＮ－Ｍは、配列番号６のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＥＮ－Ｍである。さらにまたはあるいは、ＰＴＥＮ－Ｍは、配列番号１９８の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号６と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるヒトＰＴＥＮ－Ｍである。
別の実施形態では、ＰＴＥＮは、配列番号７もしくは２０２、または配列番号７もしくは２０２の断片、類似体、バリアント、変異体、もしくはバリアントのアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらにまたはあるいは、ＰＴＥＮは、配列番号１９９もしくは２０５の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはそれぞれ配列番号１９９もしくは２０５によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。ある特定の実施形態では、ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮ－Ｎイソ型、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物である。さらなる実施形態では、ＰＴＥＮ－Ｎは、配列番号７のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＥＮ－Ｎである。さらにまたはあるいは、ＰＴＥＮ－Ｎは、配列番号１９９の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号７と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるヒトＰＴＥＮ－Ｎである。
さらに別の実施形態では、ＰＴＥＮは、配列番号８もしくは２０３、または配列番号８もしくは２０３の断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物のアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらにまたはあるいは、ＰＴＥＮは、配列番号２００もしくは２０６の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片、または配列番号２００もしくは２０６によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。ある特定の実施形態では、ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮ－Ｏイソ型、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物である。さらなる実施形態では、ＰＴＥＮ－Ｏは、配列番号８のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＥＮ－Ｏである。さらにまたはあるいは、ＰＴＥＮ－Ｏは、配列番号２００の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号８と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるヒトＰＴＥＮ－Ｏである。
１つの実施形態では、ＰＴＥＮは、配列番号２もしくは８８、または配列番号２もしくは８８の断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらにまたはあるいは、ＰＴＥＮは、配列番号１７２もしくは１６６の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはそれぞれ配列番号１７２もしくは１６６によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる実施形態では、ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物である。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＰＴＥＮ－Ｓとアルブミンとの間の切断可能なリンカーを欠く。
別の実施形態では、ＰＴＥＮは、最小ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる実施形態では、最小ＰＴＥＮ－Ｓは、配列番号１６２のアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらにまたはあるいは、最小ＰＴＥＮ－Ｓは、配列番号１９７から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１６２と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
別の実施形態では、ＰＴＥＮは、以下のうちの任意の１つまたはそれ超を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる：成熟ヒトＰＴＥＮ－Ｌ固有ドメイン（ＬＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物（必要に応じてＬＵＤは、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、さらに必要に応じてＬＵＤは、配列番号（ＳＥＤ ＩＤ ＮＯ：）１９３の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号５と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、必要に応じてＬＵＤはグリコシル化されている）；ヒトＰＴＥＮ－Ｍ固有ドメイン（ＭＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物（必要に応じてＭＵＤは、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、そして／またはさらに必要に応じてＭＵＤは、配列番号１９４の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号９と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、必要に応じてＭＵＤはグリコシル化されている）；ヒトＰＴＥＮ－Ｎ固有ドメイン（ＮＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物（必要に応じてＮＵＤは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、そして／またはさらに必要に応じてＮＵＤは、配列番号１９５の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１０と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、必要に応じてＮＵＤはグリコシル化されている）；ヒトＰＴＥＮ－Ｏ固有ドメイン（ＯＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物（必要に応じてＯＵＤは、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、そして／またはさらに必要に応じてＯＵＤは、配列番号１９６の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１１と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、必要に応じてＯＵＤはグリコシル化されている）；６×Ａｒｇのアミノ酸配列（配列番号３９）を含む最小細胞透過ドメイン（ＭＣＰＤ）（必要に応じて融合タンパク質は、ＰＴＥＮとアルブミンとの間に断可能なリンカーを含む）；膜結合ドメイン（ＭＢＤ）（必要に応じてＭＢＤは、配列番号４０のアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる）；および最小ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物（必要に応じて最小ＰＴＥＮ－Ｓは、配列番号１６２のアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、そして／またはさらに必要に応じて最小ＰＴＥＮ－Ｓは、配列番号１９７の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１６２と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる）。ある特定の実施形態では、ＬＵＤ、ＭＵＤ、ＮＵＤ、および／またはＯＵＤのセリン（Ｓ）残基および／またはトレオニン（Ｔ）残基のうちの１つまたはそれ超は、Ｏ－グリコシル化されている。さらにまたはあるいは、ＬＵＤ、ＭＵＤ、ＮＵＤ、および／またはＯＵＤのアスパラギン（Ｎ）残基のうちの１つまたはそれ超は、Ｎ－グリコシル化されている。１つの実施形態では、グリコシル化された残基（複数可）は、以下に等価な位置の１つまたはそれ超に存在する：配列番号１のＳ６５、Ｓ８５、Ｓ８９、Ｓ９１、Ｓ９４、Ｓ１１１、Ｓ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｓ１３４、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８ならびに／または配列番号２のＳ１７０、Ｎ２９２、Ｓ３５５、Ｓ３６０、Ｓ３６６、およびＳ３７０。ある特定の実施形態では、グリコシル化された残基（複数可）は、以下のうちの任意の１つまたはそれ超に等価な位置の１つまたはそれ超に存在する：配列番号１のＳ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｓ１３４、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８、またはこれらの変異したアミノ酸を保持するその等価物。さらなる実施形態では、グリコシル化された残基（複数可）は、以下のうちの任意の１つまたはそれ超に等価な位置の１つまたはそれ超に存在する：配列番号１のＳ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８、またはこれらの変異したアミノ酸を保持するその等価物。
さらなる実施形態では、融合タンパク質は、以下：配列番号１のＳ６５、Ｓ８５、Ｓ８９、Ｓ９１、Ｓ９４、Ｓ１１１、Ｓ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｓ１３４、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８ならびに／または配列番号２のＳ１７０、Ｎ２９２、Ｓ３５５、Ｓ３６０、Ｓ３６６、およびＳ３７０のいずれか１つまたはそれ超に等価な選択された位置の１またはそれを超える変異をさらに含む。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、以下：配列番号１のＳ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｓ１３４、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８のいずれか１つまたはそれ超に等価な選択された位置の１またはそれを超える変異またはこれらの変異したアミノ酸を保持するその等価物をさらに含む。さらなる実施形態では、融合タンパク質は、以下：配列番号１のＳ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８のいずれか１つまたはそれ超に等価な選択された位置の１またはそれを超える変異またはこれらの変異したアミノ酸を保持するその等価物をさらに含む。なおさらなる実施形態では、アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸に変異している。
別の実施形態では、ＰＴＥＮは、配列番号１のアミノ酸１７４～５７６および以下のうちの１つまたはそれ超を含む：配列番号１のアミノ酸２２～２７、４４～５９、４３～７９、８０～１２０、１２１～１７３、および／または１５１～１７３。１つの実施形態では、ＰＴＥＮは、配列番号１のアミノ酸１２１～１７３またはその等価物を含む。さらなる実施形態では、ＰＴＥＮは、配列番号１のアミノ酸１２１～１７３およびＰＴＥＮ－Ｓまたはその等価物を含む。さらなる実施形態では、ＰＴＥＮは、配列番号２５のアミノ酸配列またはその等価物を含む。別の実施形態では、ＰＴＥＮは、配列番号５０のアミノ酸配列またはその等価物を含む。
１つの実施形態では、融合タンパク質のＰＴＥＮ部分は、配列番号１、２、３、６、７、８、８８、８９、１３４、もしくは１６２、または各々の等価物、もしくは断片、もしくは最小断片、もしくは類似体、もしくはバリアントのアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
１つの実施形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含む。さらなる実施形態では、シグナルペプチドは、分泌のための融合タンパク質のＮ末端である。なおさらなる実施形態では、シグナルペプチドは、ＨＳＡシグナルペプチド、ＳＳＡシグナルペプチド、ＲＳＡシグナルペプチド、ＭＳＡシグナルペプチド、マウスα２－マクログロブリンのシグナルペプチド、マウスフィブリノゲンシグナルペプチド、マウスα１－抗トリプシンシグナルペプチド、マウスＩｇＧκ鎖シグナルペプチド、ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド、ヒトＣＤ３３シグナルペプチド、または人工シグナルペプチドの群から選択される。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号９３～１０５の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。１つの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１８０～１９２の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはそれぞれ配列番号９３～１０５と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされる。
１つの実施形態では、融合タンパク質は、リンカーをさらに含む。さらなる実施形態では、融合タンパク質は、以下：アルブミンとＰＴＥＮとの間の第１のリンカー、シグナルペプチドのＣ末端の第２のリンカー、および融合タンパク質のＮ末端の第３のリンカーのうちの１つまたはそれ超を含み、必要に応じてリンカーのうちの１つまたはそれ超は切断可能である。１つの実施形態では、リンカーは、癌周囲の細胞または組織に存在するプロテアーゼによって切断可能である。プロテアーゼの非限定的な例には、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、またはカテプシンＢが含まれる。さらなる実施形態では、リンカーは、配列番号１６４～１６５および１０６～１０８の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。別の実施形態では、リンカーおよび／または融合タンパク質は、細胞内プロテアーゼ（例えば、フューリンもしくはフューリン様プロテアーゼ、またはカテプシンＢプロテアーゼ）によって切断可能である。ある特定の実施形態では、リンカーは、配列番号４８または１０６～１０８の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、そして／またはＰＴＥＮは、小細胞透過ドメイン（ＭＣＰＤ）を含む。
１つの実施形態では、プロテアーゼは、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、ＢＡＣＥ、レニン）、アスパラギン酸カテプシン（例えば、カテプシンＤ、カテプシンＥ）、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４）、システインカテプシン（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ）、システインプロテイナーゼ（例えば、クルジパイン、レグマイン、オツバイン－２）、ＫＬＫ（例えば、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４）、メタロプロテイナーゼ（例えば、メプリン、ネプリライシン、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ－１）、ＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２３、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７）、セリンプロテアーゼ（例えば、活性化プロテインＣ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、チマーゼ）、凝固因子プロテアーゼ（例えば、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ）、エラスターゼ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球エラスターゼ、ラクトフェリン、マラプシン、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＡ、ｔＰＡ、トロンビン、トリプターゼ、ｕＰＡ、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）（例えば、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、またはＴＭＰＲＳＳ４）の群から選択される。
１つの実施形態では、融合タンパク質は、精製または検出可能なマーカー（例えば、６ｘＨｉｓタグ、血球凝集素（ＨＡ）タグ、フラッグタグ、または任意の他のエピトープタグ）のうちの１つまたはそれ超をさらに含む。さらなる実施形態では、１またはそれを超えるマーカーは、融合タンパク質のＣ末端に存在し、そして／または１またはそれを超えるマーカーは、アルブミンとＰＴＥＮとの間に存在する。
配列番号１８、１９、２４、２５、もしくは１６４～１７１、または各々のその等価物、もしくは断片、もしくは最小断片、もしくは類似体、もしくはバリアントのアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる融合タンパク質をさらに提供する。配列番号２８、１１７～１３２、またはその断片、類似体、もしくはバリアント、もしくは各々の等価物のアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる融合タンパク質をさらに提供する。配列番号１４～３７、４９～５０、もしくは１０９～１３２、または配列番号１４～３７、４９～５０、もしくは１０９～１３２の各々の断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる融合タンパク質も提供する。さらにまたはあるいは、融合タンパク質は、配列番号５４～７７もしくは１３５～１６０から選択される操作されたポリヌクレオチド配列またはその断片、またはそれぞれ配列番号５４～７７もしくは１３５～１６０と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
別の実施形態では、Ｎ’－アルブミン－ＰＴＥＮ－Ｃ’融合タンパク質（例えば、ＰＲ１（配列番号１４；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号５４）、ＰＲ２（配列番号１５；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号５５）、ＰＲ３（配列番号１６；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号５６）、ＰＲ５（配列番号１７；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号５７）、ＰＲ６３（配列番号２１；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号６１）、ＰＲ６４（配列番号２２；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号６２）、ＰＲ３１（配列番号２３；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号６３）、ＰＲ３２（配列番号２４；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号６４）、ＰＲ３３（配列番号２５；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号６５）、ＰＲ３４（配列番号５０；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号１３６））を提供する。別の実施形態では、Ｎ’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－Ｃ’融合タンパク質（例えば、ＰＲ４（配列番号２６；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号６６）、ＰＲ４０１（配列番号２７；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号６７）、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号６８）、ＰＲ４０３（配列番号２９；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号６９）、ＰＲ４０４（配列番号３０；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号７０））を提供する。さらなる実施形態では、Ｎ’末端最小ＰＴＥＮドメインおよびＣ’末端アルブミンを含む融合タンパク質を作出する。なおさらなる実施形態では、最小ＰＴＥＮドメインは、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む。さらにまたはあるいは、アルブミンはＨＳＡであり、融合タンパク質は、ＨＳＡシグナルペプチドおよび６ｘＨｉｓタグをさらに含む。別の実施形態では、Ｎ’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－Ｃ’融合タンパク質（例えば、ＰＲ４１９（配列番号１０９；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１３７）、ＰＲ４２０（配列番号１１０；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１３８）、ＰＲ４２１（配列番号１１１；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１３９）、ＰＲ４２２（配列番号１１２；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４０）、ＰＲ４２４（配列番号１１３；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４１）、ＰＲ４２５（配列番号１１４；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４２）、ＰＲ４２６（配列番号１１５；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４３）、ＰＲ４２７（配列番号１１６；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４４）、ＰＲ４２８（配列番号１１７；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４５）、ＰＲ４０９（配列番号１１８；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４６）、ＰＲ４１５（配列番号１１９；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４７）、ＰＲ４１６（配列番号１２０；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４８）、ＰＲ４１３（配列番号１２１；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４９）、ＰＲ４１４（配列番号１２２；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１５０）、ＰＲ４１７（配列番号１２３；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１５１）、およびＰＲ４１８（配列番号１２４；ｃＤＮＡ，５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１５２））を提供する。別の実施形態では、Ｎ’－アルブミン－ＰＴＥＮ－Ｃ’融合タンパク質（例えば、ＰＲ６（配列番号１８；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号５８）、ＰＲ６１（配列番号１９；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号５９）、ＰＲ６２（配列番号２０；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号６０）、ＰＲ６６（配列番号１２６；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号１５４）、ＰＲ６７（配列番号１２７；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号１５５）、およびＰＲ６８（配列番号１２８；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号１５６））を提供する。別の実施形態では、Ｎ’－ＰＴＥＮ－Ｓ－アルブミン－Ｃ’融合タンパク質（例えば、ＰＲ６５（配列番号１２５；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｓ－アルブミン－３’、配列番号１５３））を提供する。別の実施形態では、Ｎ’－ＰＴＥＮ－Ｓ－アルブミン－ＰＴＥＮ－Ｓ－Ｃ’融合タンパク質（例えば、ＰＲ９１１（配列番号３７；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｓ－アルブミン－ＰＴＥＮ－Ｓ－３’、配列番号７７））を提供する。別の実施形態では、Ｎ’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－Ｃ’融合タンパク質（例えば、ＰＲ４０５（配列番号１２９；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１５７）、ＰＲ４０６（配列番号１３０；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１５８）、ＰＲ４０７（配列番号１３１；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１５９）、およびＰＲ４０８（配列番号１３２；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１６０））を提供する。さらなる実施形態では、Ｎ’末端アルブミンおよびＣ’末端最小ＰＴＥＮドメインを含む融合タンパク質を提供する。なおさらなる実施形態では、最小ＰＴＥＮドメインは、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む。さらにまたはあるいは、アルブミンはＨＳＡであり、融合タンパク質は、ＨＳＡシグナルペプチドおよび６ｘＨｉｓタグをさらに含む。
別の実施形態では、Ｎ’－アルブミン－ＬＵＤ－ｐ５３－Ｃ’融合タンパク質（例えば、Ｆ１３１（配列番号３８；ｃＤＮＡ配列番号７８））を提供する。別の実施形態では、Ｎ’－ＬＵＤ－ｐ５３－アルブミン－Ｃ’融合物（例えば、Ｆ１３７（配列番号１３３；ｃＤＮＡ配列番号１６１））を提供する。
ある特定の実施形態では、アルブミンを、Ｆｃまたはチオレドキシンに置換する。１つの実施形態では、Ｎ’－ＰＴＥＮ－Ｌ－Ｆｃ－Ｃ’融合タンパク質（例えば、ＰＲ７（配列番号３４；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－Ｆｃ－３’、配列番号７４）、ＰＲ７００（配列番号３５；ｃＤＮＡ，５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－Ｆｃ－３’、配列番号７５））を提供する。別の実施形態では、Ｎ’－Ｆｃ－ＰＴＥＮ－Ｌ－Ｃ’融合タンパク質（例えば、ＰＲ８（配列番号３６；ｃＤＮＡ、５’－Ｆｃ－ＰＴＥＮ－Ｌ－３’、配列番号７６））を提供する。別の実施形態では、Ｎ’－チオレドキシン－ＰＴＥＮ－Ｌ－Ｃ’融合タンパク質：ＰＲ４３０（配列番号４９；ｃＤＮＡ、５’－チオレドキシン－ＰＴＥＮ－Ｌ－３’、配列番号１３５）を提供する。
さらに別の実施形態では、配列番号１４～３０、３４～３７、４９～５０、および１０９～１３２から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態では、タンパク質は、例えば、（配列番号１７１のｎｔ（１～６３）または配列番号１８０～１９２）から選択される配列によってコードされるＮ末端シグナルペプチドをさらに含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチドを欠くが、必要に応じてそれぞれアルブミンまたはＰＴＥＮのいずれかのＮ末端に配置されたイニシエーターメチオニン残基（必要に応じてＡＴＧによってコードされる）を含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチドを欠くが、アルブミン（例えば、成熟アルブミン）またはＰＴＥＮ（例えば、成熟ＰＴＥＮ－Ｌ）の最初の残基が置換されたイニシエーターメチオニン（必要に応じてＡＴＧによってコードされる）を含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４～７０、７４～７７、または１３５～１６０のうちの１つまたはそれ超を含む。
１つの態様では、タンパク質、融合タンパク質、その断片、類似体、またはバリアントは、検出可能な標識または精製標識をさらに含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなり、その例は、当該分野で公知であり、かつ本明細書中に簡潔に記載されている。
ポリヌクレオチド
本開示の融合タンパク質をコードする単離されたおよび／または操作されたポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチド（例えば、前述のポリヌクレオチドのうちの１つまたはそれ超）を含むベクターおよび宿主細胞系をさらに提供する。１つの実施形態では、単離されたおよび／もしくは操作されたポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞は、検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む。
１つの態様では、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞内での遺伝子発現の効率を高めるために配列最適化されており（例えば、配列番号４１～４７；５４～７８、８６、１３５～１６１、１６６～１６７、１７１～１７２、１７６～２００、および２０４～２０６）、最適化には、コドン使用頻度バイアス、ＧＣ含量、ＣｐＧジヌクレオチド含量、ｍＲＮＡ二次構造、隠れスプライシング部位、未熟ポリＡ部位、内部χ部位およびリボゾーム結合部位、ネガティブＣｐＧ島、ＲＮＡ不安定性モチーフ（ＡＲＥ）、反復配列（ダイレクトリピート、リバースリピート、およびダイアドリピート）、クローニングを干渉し得る制限部位、強力コザック配列、ならびに強力終結コドンの導入が含まれるが、これらに限定されない。かかるコドン最適化を実施するための種々のアルゴリズムおよびツールが利用可能である（ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）など）。
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一であり、かつそれぞれ配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、もしくは１３６の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、または１３６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一であり、かつそれぞれ配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、または１３６と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
さらにまたはあるいは、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１７６～１７９の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１７６～１７９によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
ある特定の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１６６～１７２、１９３～２００、または２０４～２０６の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１６６～１７２、１９３～２００、もしくは２０４～２０６によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
ある特定の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１８０～１９２の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１８０～１９２によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
ある特定の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、１またはそれを超える、表１にまとめられているか、本明細書中に列挙されている任意のポリヌクレオチドから選択される操作されたポリヌクレオチド、または同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
１つの態様では、ポリヌクレオチドは、細胞透過性ドメイン（例えば、配列番号１６８～１７０）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。別の態様では、ポリヌクレオチドは、分泌ペプチドの切断後に培養上清にプレタンパク質を分泌させる分泌ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む（例えば、配列番号９３～１０５）。さらなる態様では、ポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、または宿主細胞系でのポリヌクレオチドの発現のための他の制御ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。１つの実施形態では、制御配列は、ベクター（ウイルスまたは非ウイルス）での使用に適している。１つの実施形態では、制御配列は、腫瘍特異的である（例えば、肝細胞癌に特異的なＡＦＰプロモーター、膵臓癌に特異的なＣＣＫＡＲプロモーター、上皮癌に特異的なＣＥＡプロモーター、乳癌および膵臓癌に特異的なｃ－ｅｒｂＢ２プロモーター、前立腺癌に特異的なＣＯＸ－２プロモーター、ＣＸＣＲ４プロモーター、Ｅ２Ｆ－１プロモーター、ＨＥ２プロモーター、ＬＰプロモーター、ＭＵＣ１プロモーター、ＰＳＡプロモーター、黒色腫に特異的なサバイビンプロモーター、ＴＲＰ１プロモーター、黒色腫に特異的なＴｙｒプロモーター、肝細胞癌に特異的なＡＦＰ／ｈＡＦＰプロモーター、肝細胞癌に特異的なＳＶ４０／ＡＦＰプロモーター、上皮癌に特異的なＣＥＡ／ＣＥＡプロモーター、前立腺癌に特異的なＰＳＡ／ＰＳＡプロモーター、または黒色腫に特異的なＳＶ４０／Ｔｙｒプロモーター）。かかるポリヌクレオチドの非限定的な例には、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、またはそのハイブリッドが含まれる。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ治療での使用に適したｍＲＮＡである。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、低分子ヘアピン型ＲＮＡまたは小ヘアピン型ＲＮＡをさらに含むか、コードする。かかるＲＮＡの二次構造は、ＲＮＡ折りたたみをガイドし、リボザイム内で相互作用を決定づけ、ｍＲＮＡを分解から保護し、ＲＮＡ結合タンパク質のための認識モチーフとしての機能を果たすことができ、遺伝子発現を制御することもできる。さらにまたはあるいは、低分子ヘアピン型ＲＮＡは、例えば癌処置での使用に適した低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にプロセシングされ得る。例えば、Ｍａｈｍｏｏｄｉ Ｃｈａｌｂａｔａｎｉ Ｇ ｅｔ ａｌ，２０１９：ＰＭＩＤ：３１１１８６２６を参照のこと。
本開示の態様は、上記の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸のうちの１つまたはそれ超を含むベクターに関する。１つの実施形態では、ベクターは、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる実施形態では、ベクターは、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一であり、かつそれぞれ配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。別の実施形態では、ベクターは、配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、もしくは１３６の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる実施形態では、ベクターは、配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、または１３６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一であり、かつそれぞれ配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、または１３６と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。なおさらなる実施形態では、ベクターは、本明細書中に記載の異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。１つの実施形態では、ベクターは、配列番号７４～７７および１６１から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号７４～７７および１６１のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一であり、かつそれぞれ配列番号７４～７７および１６１によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
１つの実施形態では、ベクターは、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる実施形態では、ベクターは、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一であり、かつそれぞれ配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。１つの実施形態では、ベクターは、配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、もしくは１３６の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。さらなる実施形態では、ベクターは、配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、または１３６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一であり、かつそれぞれ配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、または１３６と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
さらにまたはあるいは、ベクターは、配列番号１７６～１７９の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１７６～１７９によってコードされと同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号１６６～１７２、１９３～２００、もしくは２０４～２０６の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１６６～１７２、１９３～２００、もしくは２０４～２０６によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号１８０～１９２の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１８０～１９２によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
ある特定の実施形態では、ベクターは、１またはそれを超える、表１にまとめられているか、本明細書中に列挙されている任意のポリヌクレオチドから選択される操作されたポリヌクレオチド、または同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
ある特定の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）の群から選択されるプラスミドまたはウイルスベクターである。１つの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。さらなる実施形態では、ベクターは、狂犬病ウイルス、フラビウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルスベクター（ＨＳＶ）、アルファウイルスベクター、セネカバレーウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、コクサッキーウイルス、パルボウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、または感染性タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の群から選択される。別の実施形態では、ベクターは非ウイルスベクターである。さらなる実施形態では、ベクターは、以下の群から選択される：リポソーム、カチオン性脂質、ミセル、生体適合性ポリマー（天然ポリマーおよび合成ポリマーが含まれる）；ナノ粒子；リポタンパク質；ポリペプチド；ポリサッカリド；リポ多糖；金属粒子；細菌、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、酵母人工染色体、または真菌ベクター。なおさらなる実施形態では、プラスミドは、ｐＳＩＰ６０９ Ｌ ｐｌａｎｔａｒｕｍ発現ベクター、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクター、または哺乳動物発現ベクターの群から選択される。本明細書中で使用されたかかるベクターの非限定的な例には、ｐＳＩＰ６０９ Ｌ ｐｌａｎｔａｒｕｍ発現ベクター（Ｓａｋ－Ｕｂｏｌ ｅｔ ａｌ，２０１６；ＰＭＩＤ：２７１７６６０８）（配列番号１７４として開示）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクター（配列番号１７５）、および哺乳動物発現ベクター（ｐＴＴ５、配列番号１７３；図６Ｃ）が含まれる。さらなる実施形態では、本明細書中に開示のポリヌクレオチドをさらに含む発現ベクターを提供する。なおさらなる実施形態では、ベクターは、配列番号１７３中の各制限酵素制限部位ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間のヌクレオチド残基が本明細書中に開示のポリヌクレオチド（配列番号（ＳＥＤＱ ＩＤ ＮＯ）：６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、もしくは１３６から選択される配列を有するポリヌクレオチドなど）またはこれらの変異したアミノ酸を保持するその等価物に置換された配列番号１７３のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、プラスミドは、配列番号１７３～１７５の群から選択される配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号２１０、２１１、またはその断片の配列を含む。１つの実施形態では、プラスミドは、配列番号２１１またはその断片の配列を有し、本明細書中に開示の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含むｐＡｄ（ｄｐｓ）ΔＣＵ－ＩＲＥＳ－Ｅ１Ａである。別の実施形態では、プラスミドは、配列番号２１０またはその断片の配列を有し、本明細書中に開示の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含むｐＡｄＥａｓｙ－１である。さらなる実施形態では、本明細書中に開示のプラスミドのうちの１つまたはそれ超を使用して産生されたｒＡｄＶベクターを提供する。
遺伝子移入がＤＮＡウイルスベクター（アデノウイルス（ＡｄＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）など）によって媒介される態様では、ベクターは、ウイルスゲノムまたはその断片、および目的のタンパク質（本明細書中に開示のアルブミン－ＰＴＥＮタンパク質融合物など）をコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質は、配列番号１４～３０、３４～３７、４９～５０、および１０９～１３２から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、（配列番号１７１のｎｔ（１～６３）または配列番号１８０～１９２）から選択される配列をコードするＮ末端シグナルペプチドを含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチドを欠くが、必要に応じてそれぞれアルブミンまたはＰＴＥＮのいずれかのＮ末端に配置されたイニシエーターメチオニン残基（必要に応じてＡＴＧによってコードされる）を含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチドを欠くが、アルブミン（例えば、必要に応じてアルブミンコードポリヌクレオチドの最初の３つのヌクレオチドがＡＴＧと置換された成熟アルブミン、さらに必要に応じてアルブミンコードポリヌクレオチドは、配列番号１７６～１７９から選択される）またはＰＴＥＮ（例えば、ＰＴＥＮコードポリヌクレオチドの最初の３つのヌクレオチドがＡＴＧと置換された成熟ＰＴＥＮ－Ｌ、さらに必要に応じてＰＴＥＮコードポリヌクレオチドは、配列番号１６７または配列番号１７１のヌクレオチド（ｎｔ）６４～ｎｔ１７２８から選択される）の最初の残基が置換されたイニシエーターメチオニン（必要に応じてＡＴＧによってコードされる）を含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４～７０、７４～７７、または１３５～１６０のうちの１つまたはそれ超を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書中に開示の組換えウイルスベクター（腫瘍崩壊性ＨＳＶウイルス、ＡｄＶ、または１つを超えるポリペプチドをコードするＡｄＶ（例えば、二重Ａｄベクター）など）または任意の他のベクターは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４～７０、７４～７７、または１３５～１６０から選択される。さらにまたはあるいは、ベクターは、アルブミンのアミノ酸配列およびｐ５３タンパク質のアミノ酸配列を含むさらなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書中で使用される場合、アルブミンおよびｐ５３タンパク質のアミノ酸配列を含む融合タンパク質は、本明細書中でアルブミン－ｐ５３タンパク質と呼ばれる。さらなる実施形態では、アルブミン－ｐ５３タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７８または１６１から選択される。ある特定の実施形態では、本明細書中に記載の組換えウイルスベクターおよび／または任意のベクターは、異種タンパク質またはポリペプチドの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。１つの実施形態では、異種タンパク質は、ベクターに対して異種である。さらなる実施形態では、異種タンパク質は、融合タンパク質に対して異種である（例えば、ヒトＰＴＥＮおよび／またはアルブミンである場合、ヒトに対して異種である）。なおさらなる実施形態では、異種タンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。１つの実施形態では、異種タンパク質は、ＰＴＥＮ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。１つの実施形態では、異種タンパク質は、シグナルペプチドおよび／または検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む。１つの実施形態では、異種タンパク質は、アルブミンのアミノ酸配列を欠く。さらなる実施形態では、異種タンパク質は、ＰＴＥＮ－Ｌ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。なおさらなる実施形態では、異種タンパク質は、配列番号３１～３３、または各々の断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、異種タンパク質は、配列番号７１～７３、１７１～７２、１６６～１６７、１９８～２００、２０４～２０６から選択される配列、その断片を含むポリヌクレオチド、または配列番号７１～７３、１７１～７２、１６６～１６７、１９８～２００、２０４～２０６と少なくとも９０％同一であり、かつそれぞれ配列番号７１～７３、１７１～７２、１６６～１６７、１９８～２００、２０４～２０６によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドによってコードされる。１つの実施形態では、異種タンパク質を、癌の処置で使用することができる（抗体またはその断片など）。さらなる実施形態では、異種タンパク質は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその等価物であり、以下が含まれるが、これらに限定されない：ＶＥＧＦＲを認識して結合するｍＡｂまたはその等価物（アバスチン（商標）など）、またはＨＥＲ２を認識して結合するｍＡｂまたはその等価物（ハーセプチン（商標）など）、またはＥＧＦＲを認識して結合するｍＡｂまたはその等価物（アービタックス（商標）など）または免疫チェックポイントを制御するｍＡｂまたはその等価物（「チェックポイント抗体」としても広く知られている）（ＣＴＬＡ４を認識して結合するもの（例えば、ヤーボイ（商標）（イピリムマブ））、またはＰＤ－１を認識して結合するもの（例えば、キイトルーダ（商標）（ペムブロリズマブ）およびオプジーボ（商標）（ニボルマブ））、またはＰＤ－Ｌ１を認識して結合するもの（例えば、テセントリク（商標）（アテゾリズマブ）など）。別の実施形態では、異種タンパク質は、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）またはその等価物、インターロイキン（ＩＬ－２またはＩＬ－１５など）、またはインターフェロン（ＩＦＮβまたはＩＦＮγなど）；または天然の生物活性ペプチド（サイモシンＡまたはアディポネクチンなど）、または合成ペプチド（ヘキサレリンなど）の群から選択される。１つの実施形態では、組換え腫瘍崩壊性ＨＳＶウイルスは、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０のポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｄｉｅｓ）および配列番号７１～７３、１７１～１７２、１６６～１６７、１９８～２００、２０４～２０６のポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｄｉｅｓ）から選択されるＰＴＥＮをコードするポリヌクレオチドから選択されるアルブミン－ＰＴＥＮ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する／含む。さらなる実施形態では、組換え腫瘍崩壊性ＨＳＶウイルスは、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０のポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｄｉｅｓ）および配列番号１７１～１７２、または１６６～１６７のポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｄｉｅｓ）から選択されるＰＴＥＮをコードするポリヌクレオチドから選択されるアルブミン－ＰＴＥＮ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する／含む。なおさらなる実施形態では、腫瘍崩壊性ＨＳＶベクターは、本明細書中に記載の異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド（第２の導入遺伝子）をさらに含む。１つの実施形態では、腫瘍崩壊性ＨＳＶベクターは、配列番号７４～７７および１６１から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号７４～７７および１６１のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一であり、かつそれぞれ配列番号７４～７７および１６１によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ある特定の実施形態では、腫瘍崩壊性ＨＳＶベクターは、１またはそれを超える、表１にまとめられているか、本明細書中に列挙されている任意のポリヌクレオチドから選択される操作されたポリヌクレオチド、または同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
１つの実施形態では、組換えアデノウイルスベクター（ｒＡｄＶ）は、非複製性かつ非伝播性のＡｄＶである（（ΔＥ１Ａ；ΔＥ１Ｂ；ΔＥ３）－ＡｄＶ、ここで、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、およびＥ３の各ＡｄＶタンパク質は全て欠失しており、その結果、ウイルスベクターが感染細胞内で複製することができず、他の非感染細胞に伝播することもできず、それにより、被験体への適用に効率的で非常に安全でもある）。さらなる実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、配列番号５８、５９、６８、５４～５７、６０～６７、６９～７０、７４～７７、１３５～１３６、または１３７～１６０の群から選択されるアルブミン－ＰＴＥＮ融合物ｃＤＮＡのポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、当該分野で公知のように（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ，２０１５：ＰＭＩＤ：２５５８８７４２）、組換えアデノウイルスベクターは、２つの導入遺伝子を含み、ここで、一方の導入遺伝子は、配列番号５８、５９、６８、５４～５７、６０～６７、６９～７０、７４～７７、１３５～１３６、１３７～１６０の群から選択されるアルブミン－ＰＴＥＮ融合物ｃＤＮＡのポリヌクレオチドを含み、第２の導入遺伝子は、配列番号７８または１６１の群から選択されるアルブミン－ｐ５３融合物ｃＤＮＡのポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡｄＶベクターを、ＡｄＥａｓｙプラスミド系（配列番号２１０など）を使用した細菌内での相同組換えによって構築する。ある特定の実施形態では、アルブミン－ＰＴＥＮ融合物ｃＤＮＡを保有するプラスミドを、ＰａｃＩで消化し、ＨＥＫ２９３細胞に形質転換する。ある特定の実施形態では、ｒＡｄＶを、ＢＭＡｄ－Ｅ１（アデノウイルスＥ１遺伝子を発現するＡ５４９細胞）においてプラーク精製する（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，２０１４；ＰＭＩＤ：２５１５９０３３に記載）。ある特定の実施形態では、ｒＡｄＶを、ＳＦ－ＢＭＡｄ－Ｒ細胞（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，２０１４；ＰＭＩＤ：２５１５９０３３）を使用して増幅させ、塩化セシウム勾配によって精製する。１つの実施形態では、感染性粒子の力価を、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０％）アッセイを使用して測定する。さらにまたはあるいは、配列番号５８、５９、６８、５４～５７、６０～６７、６９～７０、７４～７７、１３５～１３６、１３７～１６０の群から選択されるｃＤＮＡが対応するＰＴＥＮ－アルブミン融合物（それぞれ配列番号１８、１９、２８、１４～１７、２０～２７、２９～３０、３４～３７、４９～５０、および１０９～１３２）の発現を駆動する能力を、細胞ライセートおよび細胞培養培地において、抗ＰＴＥＮ抗体または抗アルブミン抗体を使用したウェスタンブロット（例えば、図６Ｂを参照のこと）によって調査する。ある特定の実施形態では、培養された癌細胞または必要とする被験体（異種移植したマウスまたはヒトの癌患者など）に対するｒＡｄＶの有効性をアッセイする。１つの実施形態では、組換えアデノウイルスベクター（ｒＡｄＶ）は、複製性（腫瘍崩壊性）であるが非伝播性のｒＡｄＶである（例えば、（ΔＥ１Α；ΔＰＳ）－ＡｄＶ、ここで、ウイルスの伝播を促進するＥ１Αタンパク質およびＡｄＶプロテアーゼＰＳが欠失されており、その結果、ウイルスベクターが感染細胞内で複製することができるが、他の非感染細胞に伝播することができず、それにより、被験体への適用に非常に効率的かつ安全である）。さらなる実施形態では、ｒＡｄＶは、配列番号５８、５９、６８、５４～５７、６０～６７、６９～７０、７４～７７、１３５～１３６、１３７～１６０の群から選択されるアルブミン－ＰＴＥＮ融合物ｃＤＮＡを含む。なおさらなる実施形態では、ｒＡｄＶベクターを、ｐＡｄ（ｄｐｓ）ΔＣＵ－ＩＲＥＳ－Ｅ１Ａを使用した細菌内での相同組換えによって構築する（Ｂｏｕｒｂｅａｕ ｅｔ ａｌ，２００７；ＰＭＩＤ：１７４０９４４９）（例えば、配列番号２１１を参照のこと）。１つの実施形態では、アルブミン－ＰＴＥＮ融合物ｃＤＮＡを保有するプラスミドをＰａｃＩで消化し、ＨＥＫ２９３Ａ－ＣｙｍＲ－ＰＳ細胞（ｃｕｍａｔｅリプレッサーの調節下でアデノウイルスプロテアーゼを安定に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞株（Ｈａｑ ｅｔ ａｌ，２０１９；ＰＭＩＤ：３１５０６１９３および論文中の参考文献）；ｃｕｍＲがＡＶベクターに挿入された外来遺伝子の合成を防止し、それにより、産生中の細胞へのダメージが軽減されてｒＡｄＶ収量をより高くすることができることに留意のこと；ｃｕｍＲを、細胞培地中にクーママイシンを添加することによって抑制解除することができる）に形質転換する。さらなる実施形態では、次いで、ｒＡｄＶを、ＢＭＡｄ－Ｅ１（アデノウイルスＥ１遺伝子を発現するＡ５４９細胞）においてプラーク精製する（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，２０１４；ＰＭＩＤ：２５１５９０３３に記載）。なおさらなる実施形態では、ｒＡｄＶを、ＳＦ－ＢＭＡｄ－ＰＳ細胞（アデノウイルスＥ１遺伝子を発現するＡ５４９ 細胞株；Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，２０１３；要約番号１３５；ＤＯＩ：１０．１０１６／Ｓ１５２５－００１６（１６）３４４７０－７）を使用して増幅させ、塩化セシウム勾配によって精製する。さらにまたはあるいは、感染性粒子の力価を、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０％）アッセイを使用して測定する。さらなる実施形態では、配列番号５８、５９、６８、５４～５７、６０～６７、６９～７０、７４～７７、１３５～１３６、１３７～１６０の群から選択される導入遺伝子ｃＤＮＡが対応するＰＴＥＮ－アルブミン融合物（それぞれ配列番号１８、１９、２８、１４～１７、２０～２７、２９～３０、３４～３７、４９～５０、および１０９～１３２）の発現を駆動する能力を、細胞ライセートおよび細胞培養培地において、抗ＰＴＥＮ抗体または抗アルブミン抗体を使用したウェスタンブロット（例えば、図６Ｂを参照のこと）によって調査する。なおさらなる実施形態では、培養された癌細胞または必要とする被験体（異種移植したマウスまたはヒトの癌患者など）に対するｒＡｄＶの有効性をアッセイする。１つの実施形態では、ｒＡｄＶは、ＡｄＶ５（血清型５）である。別の実施形態では、ｒＡｄＶはＡｄＶ３である。他の実施形態では、ｒＡｄＶは、ＡｄＶ５／３などの混合血清型であり、ここで、各血清型は、被験体における種感染性にしたがって、ＡｄＶの５０種の血清型から選択される。なおさらなる実施形態では、ＡｄＶベクターは、本明細書中に記載の異種タンパク質（第２の導入遺伝子）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。１つの実施形態では、ＡｄＶベクターは、配列番号７４～７７および１６１から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号７４～７７および１６１のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一であり、かつそれぞれ配列番号７４～７７および１６１によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＡｄＶベクターは、１またはそれを超える、表１にまとめられているか、本明細書中に列挙されている任意のポリヌクレオチドから選択される操作されたポリヌクレオチド、または同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。
この開示の他の態様は、本明細書中に開示のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む単離された細胞に関する。単離された細胞の非限定的な例は、原核細胞（細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ））など）、または真核細胞である。別の態様では、単離された細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、単離された真核細胞は、動物細胞、哺乳動物細胞、ウシ細胞、ネコ細胞、サル、イヌ細胞、マウス細胞、ウマ細胞、またはヒト細胞から選択される。１つの態様では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞は、融合タンパク質の組換え産生に有用である。宿主細胞内でポリヌクレオチドを発現させ、ポリヌクレオチド発現の好む条件下で細胞を成長させることによって産生された組換えポリペプチドをさらに提供する。さらなる態様では、組換え融合タンパク質は、細胞または培養培地から単離される。
さらなる態様では、ポリペプチド、タンパク質、類似体、バリアント、断片、ベクター、または宿主細胞を、精製マーカーで検出可能に標識するか、標識する。
１つの態様では、アルブミン－ＰＴＥＮ融合タンパク質を、アルブミン－ＰＴＥＮポリヌクレオチドの発現に適切な条件下でアルブミン－ＰＴＥＮ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養する工程を含み、細胞培養物または培養培地から細胞によって産生された融合タンパク質を単離する工程を必要に応じてさらに含む過程によって産生する。細胞は、原核細胞または真核細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など）であり得る。
さらなる好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、宿主細胞によってプロセシングされ、周囲の培養培地に分泌される。発現のために使用される宿主の分泌経路で生じる新生融合タンパク質のプロセシングには、シグナルペプチドの切断；ジスルフィド結合の形成；適切な折りたたみ；炭水化物の付加およびプロセシング（例えば、Ｎ－およびＯ－結合型グリコシル化）；特異的タンパク質分解的切断；および多量体タンパク質へのアセンブリが含まれ得るが、これらに限定されない。本発明の融合タンパク質は、プロセシング済みの形態であることが好ましい。最も好ましい実施形態では、「プロセシング済み形態の融合タンパク質」または「プロセシング済み形態のプレタンパク質」または「成熟タンパク質」は、本明細書中で「成熟融合タンパク質」とも呼ばれる、Ｎ末端シグナルペプチドの切断を受けた融合タンパク質産物に関する。シグナルペプチドの例は、配列番号９３～１０５として開示されている。
組成物
融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、および担体（例えば、薬学的に許容され得る担体）のうちの１つまたはそれ超を含む組成物も提供する。１つの態様では、本明細書中に開示の融合タンパク質（例えば、アルブミン－ＰＴＥＮ融合タンパク質）、および少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる医薬組成物を本明細書中に提供する。組成物は、さらなる治療剤（例えば、化学療法剤）を必要に応じて含む。したがって、細胞を有効量の本明細書中に開示の融合タンパク質に接触させることによる、癌細胞の成長を抑制する方法をさらに提供する。接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏであり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する場合、前述の方法は、癌に対する単独または他の治療薬との組み合わせた融合ポリペプチドの有効性を試験するのに有用である。動物においてｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する場合、方法は、効能を試験するための従来の動物モデルを提供する。
ある特定の実施形態では、組成物は、併用治療薬をさらに含む。１つの実施形態では、併用治療薬は、１）天然の生物活性ペプチド（サイモシンＡ；アディポネクチン）；２）ＰＴＥＮによって増強されるか、インタクトなＰＴＥＮを介して機能するか、応答（抵抗性）の喪失がＰＴＥＮの喪失によって相関する／駆動される以下などのＦＤＡおよび／またはＥＭＡ承認抗癌薬の群から選択される：（ａ）細胞傷害薬：シスプラチン、ドキソルビシン、ビノレルビン、メルファラン；タキソール；ブロモクリプチン／アルテヌサート、カンプトセシン；（ｂ）免疫調節薬：サリドマイド；ラパマイシン、フィンゴリモド／ＦＴＹ２０；（ｃ）ＶＥＧＦ阻害剤：スーテント（商標）、アバスチン（商標）；（ｄ）チロシンキナーゼ阻害剤：タルセバ（商標）；イコチニブ、イマチニブ、ダサチニブ；（ｅ）ＨＥＲ２ ｍＡｂ：ハーセプチン（商標）、（ｆ）抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ（例えば、アービタックス（商標））、（ｇ）ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１（「チェックポイント」）ｍＡｂ：例えば、ヤーボイ（商標）、オプジーボ（商標）など；（ｆ）ＰＡＲＰ阻害剤：Ｇｌｙｎｐａｒｚａ（商標）；（ｈ）新規抗癌薬クラス：ＢＥＴ阻害剤；（ｉ）抗マラリア薬：アルテスナート；（ｊ）抗疼痛薬：トラマドール、リドカイン；（ｋ）抗精神病薬：バルプロ酸；（ｌ）抗代謝症候群薬（現在、制癌剤（ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒｏｎｅｓ）としても利用されている）：シンバスタチン、アトルバスタチン、メトホルミン、リスベラトロール、カトプトリル、ロサルタン、ピオグリタゾン（ｍ）抗炎症薬：セレコキシブ、アスピリン、ニメスリド、モンテルカスト、ジクロフェナック；（ｎ）抗条虫症薬（ニクロサミド）；（ｏ）抗生物質：ドキシサイクリン（ｄｏｃｙｃｙｃｌｉｎ）、アルボリキシン；（ｐ）成長ホルモン放出因子：ヘキサレリン；および（ｑ）Ａ型ボツリヌス毒素（Ｂｏｔｕｌｉｍｕｍ ｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅ Ａ）。
１つの実施形態では、併用治療薬は、精製されたタンパク質薬である。非限定的な例には、治療ｍＡｂ、治療タンパク質（顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）またはその等価物など）、インターロイキン（ＩＬ－２またはＩＬ－１５など）、インターフェロン（（ＩＦＮβまたはＩＦＮγ）など））、天然の生物活性ペプチド（サイモシンＡまたはアディポネクチンなど）、または合成ペプチド（ヘキサレリンまたはアディポネクチンなど）が含まれる。さらなる実施形態では、治療ｍＡｂは、以下の群から選択される：ＶＥＧＦＲを認識して結合するｍＡｂまたはその等価物（アバスチン（商標）など）、ＨＥＲ２を認識して結合するｍＡｂまたはその等価物（ハーセプチン（商標）など）、ＥＧＦＲを認識して結合するｍＡｂまたはその等価物（アービタックス（商標）など）、免疫チェックポイントを制御するｍＡｂまたはその等価物（ＣＴＬＡ４を認識して結合するもの（例えば、ヤーボイ（商標）（イピリムマブ））、またはＰＤ－１を認識して結合するもの（例えば、キイトルーダ（商標）（ペムブロリズマブ）およびオプジーボ（商標）（ニボルマブ））、またはＰＤ－Ｌ１を認識して結合するもの（例えば、テセントリク（商標）（アテゾリズマブ）］など）。
ある特定の実施形態では、併用治療薬は、小分子薬、例えば、ＰＡＲＰ阻害剤；ＢＥＴ阻害剤、化学療法薬、抗マラリア薬、抗疼痛薬；抗精神病薬、抗代謝症候群薬（例えば、メトホルミン）；抗炎症薬、抗条虫症薬、抗生物質（抗菌薬など）；またはＡ型ボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｍｕｍ ｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅ Ａ）である。
簡潔に述べれば、特許請求の範囲に記載の組成物のうちのいずれか１つが含まれるが、これらに限定されない本発明の医薬組成物は、本明細書中に記載の融合タンパク質、またはポリヌクレオチド（例えば、融合タンパク質をコードする最適化ポリヌクレオチド配列）、ベクター、宿主細胞、および担体を、１またはそれを超える薬学的または生理学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含み得る。かかる組成物は、緩衝液（中性緩衝生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水など）；炭水化物（フルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなど）；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（グリシンなど）；抗酸化剤；キレート剤（ＥＤＴＡまたはグルタチオンなど）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；安定剤、および防腐剤を含み得る。本開示の組成物は、経口、静脈内、局所、経腸、腫瘍内、および／または非経口への投与のために製剤化され得る。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
使用方法
本開示の態様は、有効量の融合タンパク質、ポリヌクレオチド（例えば、融合タンパク質および／または導入遺伝子をコードするもの）、ベクター、上記開示の組み合わせと腫瘍を接触することによる癌細胞（または癌抗原もしくは腫瘍抗原を発現する腫瘍）の成長を阻害する方法に関する。接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏであり得る。接触がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏである場合、前述の方法を使用して、患者の腫瘍または癌に対する個別化治療を試験するか、併用療法をアッセイすることができる。接触がｉｎ ｖｉｖｏである場合、前述の方法は、癌を罹患しているヒトなどの必要としている被験体における腫瘍または癌細胞の成長を抑制するのに有用であり、患者は、有効量の融合タンパク質、ポリヌクレオチド（例えば、融合タンパク質をコードするもの）、またはベクターを投与される。ある特定の実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。有効量を、単独または本明細書中に記載の他の治療薬と組み合わせて投与する。ある特定の実施形態では、標的にされる癌／腫瘍は、固形腫瘍または血液および／または骨髄の癌（例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ））である。別の態様では、前述の方法は、有効量の細胞縮小治療薬を被験体に投与する工程をさらに含むか、またはこれらから本質的になるか、またはなおさらにはこれらからなる。治療薬は、ファーストライン、セカンドライン、サードラインなどであり得、有効量の融合タンパク質、ポリヌクレオチド、またはベクターを細胞または腫瘍に送達させる方法によって投与されるであろう。
タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、または組成物のうちの１つまたはそれ超の投与を、１回量で行うか、一連の処置を通して連続的または間欠的に行うことができる。最も有効な投与手段および投薬量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療のために使用した組成物、治療の目的、および治療を受ける被験体に応じて変動するであろう。担当医によって選択された用量およびパターンを用いて１回または複数回投与することができる。適切な製剤および薬剤の投与方法は、当該分野で公知である。さらなる態様では、本発明の融合タンパク質および組成物を、以下が含まれるが、これらに限定されない他の処置のうちの１つまたはそれ超と組み合わせて投与することができる：１）天然の生物活性ペプチド（サイモシンＡ；アディポネクチン）；２）ＰＴＥＮによって増強されるか、インタクトなＰＴＥＮを介して機能するか、応答（抵抗性）の喪失がＰＴＥＮの喪失によって相関する／駆動される以下などのＦＤＡおよび／またはＥＭＡ承認抗癌薬：（ａ）細胞傷害薬：シスプラチン、ドキソルビシン、ビノレルビン、メルファラン；タキソール；ブロモクリプチン／アルテヌサート、カンプトセシン；（ｂ）免疫調節薬：サリドマイド；ラパマイシン、フィンゴリモド／ＦＴＹ２０；（ｃ）ＶＥＧＦ阻害剤：スーテント（商標）、アバスチン（商標）；（ｄ）チロシンキナーゼ阻害剤：タルセバ（商標）；イコチニブ、イマチニブ、ダサチニブ；（ｅ）ＨＥＲ２ ｍＡｂ：ハーセプチン（商標）、（ｆ）抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ（例えば、アービタックス（商標））、（ｇ）ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１（「チェックポイント」）ｍＡｂ：例えば、ヤーボイ（商標）、オプジーボ（商標）など；（ｆ）ＰＡＲＰ阻害剤：Ｇｌｙｎｐａｒｚａ（商標）；（ｈ）新規抗癌薬クラス：ＢＥＴ阻害剤；（ｉ）抗マラリア薬：アルテスナート；（ｊ）抗疼痛薬：トラマドール、リドカイン；（ｋ）抗精神病薬：バルプロ酸；（ｌ）抗代謝症候群薬（現在、制癌剤（ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒｏｎｅｓ）としても利用されている）：シンバスタチン、アトルバスタチン、メトホルミン、リスベラトロール、カトプトリル、ロサルタン、ピオグリタゾン（ｍ）抗炎症薬：セレコキシブ、アスピリン、ニメスリド、モンテルカスト、ジクロフェナック；（ｎ）抗条虫症薬（ニクロサミド）；（ｏ）抗生物質：ドキシサイクリン（ｄｏｃｙｃｙｃｌｉｎ）、アルボリキシン；（ｐ）成長ホルモン放出因子：ヘキサレリン；および（ｑ）Ａ型ボツリヌス毒素（Ｂｏｔｕｌｉｍｕｍ ｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅ Ａ）。一連の研究において、チェックポイントｍＡｂで処置された動物モデルおよびヒト患者の両方が、ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子が腫瘍細胞内で機能的に不活化されたときに、これらの薬剤に対する抵抗性を生じることを示された。機能的ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子は腫瘍を比較的「ホットな」位置に維持し（すなわち、腫瘍が免疫系に明白であり、免疫系によって攻撃される）、それに対して、ＰＴＥＮの喪失は腫瘍を「コールド」にし、免疫系は不活性または反応不顕性であることが広く受け入れられている（Ｃｈｅｎ＆Ｅｎｇ，２０１９；ＰＭＩＤ：３０９２８４３８に概説）。実際に、Ｃｈｅｎ＆Ｅｎｇ，２０１９；ＰＭＩＤ：３０９２８４３８は、ＰＴＥＮがチェックポイントｍＡｂと相乗作用すると予測されると述べている。一貫して、ＰＴＥＮ－ＬがＨＳＶ１ウイルスベクターを介して膠芽細胞腫（ＧＢＭ）（コールド脳腫瘍）を有するマウスに送達される場合、ＰＤ－Ｌ１レベルは著しく低下し、マウスは極めて長期間生存する（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ，２０１８；ＰＭＩＤ：３０４７９３３４）。Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ，２０１８；ＰＭＩＤ：３０４７９３３４およびＣｈｅｎ＆Ｅｎｇ，２０１９；ＰＭＩＤ：３０９２８４３８を考慮して、本明細書中に開示のＰＴＥＮ－アルブミン融合物が腫瘍抑制因子機能に関してＰＴＥＮ－Ｌと等価であるので、ＰＴＥＮ－アルブミン融合物が被験体における腫瘍または癌を処置するためにチェックポイント抗体と相乗作用し、前述の融合物が、腫瘍／癌内のＰＤ－Ｌ１レベルを低下させ、そして／または被験体において腫瘍／癌の処置に通常は必要とされるチェックポイントｍＡｂのレベルを低下させることが予想される。
ある特定の実施形態では、本明細書中に記載の組換えウイルスベクターまたは任意の他のベクターを、精製タンパク質薬などの別の治療薬とさらに組み合わせる。非限定的な例には、治療ｍＡｂ（例えば、アバスチン（商標）、ハーセプチン（商標）、ヤーボイ（商標）、キイトルーダ（商標）、オプジーボ（商標）、テセントリク（商標）など）、または治療タンパク質（ＧＭ－ＣＳＦ、インターロイキン、インターフェロン、サイモシンＡ、ヘキサレリン、またはアディポネクチンなど）が含まれる。ある特定の実施形態では、併用治療薬は、小分子薬、例えば、ＰＡＲＰ阻害剤；ＢＥＴ阻害剤、化学療法薬、抗マラリア薬、抗疼痛薬；抗精神病薬、抗代謝症候群薬（例えば、メトホルミン）；抗炎症薬、抗条虫症薬、抗生物質（抗菌薬など）；またはＡ型ボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｍｕｍ ｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅ Ａ）である。１つの実施形態では、併用処置薬は、本明細書中に開示の融合タンパク質および／またはベクターならびに併用治療薬を、必要とする被験体に同時に、連続的に、および／または個別に投与する工程を含む。１つの実施形態では、融合タンパク質、ベクター、および併用治療薬を、同一の投与経路を介して被験体に投与する。別の実施形態では、異なる投与経路を使用する。ある特定の実施形態では、２つの投与のうちのいずれかには、約０．５時間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約１２時間、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約１週間、約２週間、または約１ヶ月間の間隔がある。
ある特定の実施形態では、本明細書中に記載の任意の併用療法は、癌などの疾患の処置において相乗効果が得られる。
有効量の本明細書中に記載の融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物のうちの１つまたはそれ超を必要とする被験体に投与する工程を含む、癌を処置する方法も提供する。１つの実施形態では、前述の方法は、有効量の本明細書中に記載の融合タンパク質およびポリヌクレオチドまたはベクターを投与する工程を含む。さらなる実施形態では、前述の方法は、有効量の併用処置薬を投与する工程をさらに含み、それにより、処置する癌に相乗効果が得られる。
本明細書中に記載の融合タンパク質、ポリヌクレオチド（例えば、融合タンパク質をコードするもの）、ベクター、または医薬組成物を必要とする被験体に送達させる方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、またはベクターを、被験体の癌の細胞外基質（ＥＣＭ）に送達させる。
１つの実施形態では、被験体は、ＰＴＥＮの低発現または発現の欠如に関連する癌または疾患を有する疑いがあり、そして／または前述の癌または疾患と診断されている。
さらにまたはあるいは、被験体は、対照と比較してＰＴＥＮ腫瘍抑制因子ｍＲＮＡの３’を標的にするｍｉＲＮＡの発現レベルが高い。１つの実施形態では、対照は、いかなる癌や腫瘍も存在しない被験体由来の生物試料である。別の実施形態では、対照は、健康な被験体由来の生物試料である。さらに別の実施形態では、対照は、任意の他の癌または腫瘍である。ｍｉＲＮＡの非限定的な例は、ｍｉＲ－２１、任意の他のｏｎｃｏ－ｍｉＲ（複数可）、またはその任意の組み合わせである。１つの実施形態では、ｍｉＲＮＡの発現レベルを、被験体の液体生物試料（液体生検など）中で検出する。かかる試料には、血液、血清、または血漿が含まれるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、本明細書中に開示の融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、および／または方法の有効性を、ｍｉＲＮＡの発現を検出することによってモニタリングおよび／または査定する。所望の有効性の非限定的な例には、被験体における癌処置の成功、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの癌細胞の成長もしくは転移の阻害、ｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質レベルでの癌内のＰＴＥＮの増加、ならびに／または癌周辺領域内のＰＴＥＮタンパク質もしくはＰＴＥＮポリペプチド断片の増加が含まれる。１つの実施形態では、必要に応じて配列番号２０６～２０８のヌクレオチド配列を有するプライマーのうちの１つまたはそれ超を使用した、ｍｉＲ－２１、任意の他のｏｎｃｏ－ｍｉＲ（複数可）、またはその任意の組み合わせの発現の減少は、所望の有効性を示す。
１つの実施形態では、癌は、固形腫瘍（例えば、癌腫または肉腫）または非固形癌（例えば、血液の癌）である。さらにまたはあるいは、癌または腫瘍は、原発性または転移性の癌または腫瘍である。さらなる実施形態では、癌は、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵巣癌、腎細胞癌、ユーイング肉腫、黒色腫、中皮腫、肺癌、非小細胞肺癌、ステージＩＶ肺癌、脳癌、膠芽細胞腫、リンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫（ＭＭ）から選択される。別の実施形態では、癌は、血液および／または骨髄に影響を及ぼす。
１つの実施形態では、癌は、ＰＴＥＮタンパク質の発現を欠く（または、その発現レベルが低い）。さらなる実施形態では、癌は、ＰＴＥＮの修正組織病理学スコア（Ｈスコア）が約２０またはそれ未満である。Ｈスコアは、免疫組織化学および関連分野においてある特定のタンパク質の発現を定量する際に当業者によって使用されている。１つの実施形態では、ＰＴＥＮ発現のＨスコアを、規定の強度（０＝染色なし、１＋＝中程度／低下、２＋＝完全）に染色された細胞の百分率の、内部陽性対照に対する積として計算され、積はＨスコアとして０～２００の範囲であり、ここで、ＩＨＣ試料の染色強度は、少なくとも２人の独立した病理学者によって盲検的に評価される（Ｓａｎｇａｌｅ ｅｔ ａｌ，２０１１；ＰＭＩＤ：２０９３０６１４）。さらなる実施形態では、内部陽性対照は、２＋に設定した内皮または腫瘍間質である。別の実施形態では、ＰＴＥＮ ＩＨＣは、ＳＰ２１８ ｍＡｂまたは１３８Ｇ６ ｍＡｂを使用する（図６Ｂを参照のこと）。別の実施形態では、ＰＴＥＮ ＩＨＣ法は、独立した第三者（開発業務受託機関が含まれる）によって検証されており、前述の第三者は、公認機関によって認定されているか、臨床検査室改善修正法案（ＣＬＩＡ）または米国臨床病理医協会（ＣＡＰ）の認定を受けていることが好ましい。別の実施形態では、ＰＴＥＮ ＩＨＣ染色強度は、コンピュータを使用して評価されている（Ｒｕｌｌｅ ｅｔ ａｌ，２０１８；ＰＭＩＤ：３０２４０８５１）。別の態様では、免疫系の制御におけるＰＴＥＮタンパク質（ＰＴＥＮ－Ｌが含まれる）が果たす役割が極めて重要であることと一致して（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ，ＰＭＩＤ：３０４７９３３４）、患者腫瘍組織ＩＨＣ内の多重定量的組織イメージング解析および免疫細胞のバイオマーカー関連表現型検査（「免疫表現型検査」）を容易にするために、ＰＴＥＮ ＩＨＣをフローサイトメトリー（「ｈｉｓｔｏ－ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」）と組み合わせる。なおさらなる実施形態では、癌または腫瘍は機能不全性／不活性ＰＴＥＮを含み、当該分野で公知であるか、本明細書中に記載のように、その機能を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏアッセイ（マラカイトグリーンホスファターゼアッセイなど）、またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（哺乳動物細胞における細胞透過を測定するアッセイなど）または腫瘍抑制因子機能（細胞死の活性化が含まれる）を測定する別の細胞ベースのアッセイで測定することができる。
１つの実施形態では、癌または腫瘍は、対照と比較してｐｉ３Ｋ経路の薬力学バイオマーカーが増加する。さらなる実施形態では、対照は、いかなる癌や腫瘍も存在しない被験体由来の生物試料である。また、対照は、別の癌または腫瘍由来の生物試料である。バイオマーカー（複数可）は、以下の群から選択される：ＡＫＴセリン／トレオニンキナーゼ（ＡＫＴ）、４０ｋＤａのリン酸化プロリンリッチＡｋｔ基質（ｐＰＲＡＳ４０）、ｐＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）、ｐＦＯＸＯ（転写因子のフォークヘッドファミリー）、またはリン酸化リボゾームタンパク質Ｓ６キナーゼＢ１（ｐＳ６Ｋ）。
本明細書中に開示の方法のうちのいずれかは、方法または方法に列挙された任意の工程（複数可）の実施前、同時、および／または実施後に有効性をモニタリングする工程をさらに含む。１つの実施形態では、有効性を、被験体における疾患（例えば、癌）の処置、癌細胞成長の阻害、および／またはバイオマーカーの変化として評価および／または定量する。
本明細書中で使用されるバイオマーカーの変化は、癌細胞マーカー（ｏｎｃｏ－ｍｉＲおよび／またはｐｉ３Ｋ経路の薬力学バイオマーカーなど）の発現の変化、および／または対照（ＰＴＥＮなど）と比較して癌細胞内で欠くか、癌細胞内で低レベルで発現される分子（例えば、ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｅｏｔｉｄｅ）またはポリペプチド）の発現の変化を指し得る。１つの実施形態では、所望の有効性は、本明細書中に開示の方法の実施後に認められる。
別の実施形態では、有効性の結果およびＰＤバイオマーカーの両方を、被験体の癌または腫瘍内で同時に決定することができる。非限定的な例では、ヒト腫瘍異種移植片を保有するげっ歯類を使用する。好ましくはルシフェラーゼなどの生物発光遺伝子を発現するように操作されたヒト腫瘍細胞をげっ歯類（マウスまたはラットなど）に移植し、活性化可能な蛍光の光学的造影剤をげっ歯類に注射することによって可視化することが可能である。適切な腫瘍細胞には、４Ｔ１－Ｌｕｃマウス乳癌細胞株が含まれるが、これらに限定されず、一方で、薬剤は、以下から選択され得る：ＭＭＰＳｅｎｓｅ６４５ ＦＡＳＴ（カタログ番号ＮＥＶ１１１１２）、Ｃａｔ Ｂ６８０ ＦＡＳＴ（カタログ番号ＮＥＶ１０１２６）、および類似の薬剤（ＦＡＳＴプラットフォーム、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。１つの実施形態では、光学的造影剤は、正常組織と対照的に癌周辺領域で遥かに高濃度で存在するプロテアーゼ（ＭＭＰ２／９、カテプシンＢ、および他の癌関連プロテアーゼなど）に感受性を示し、かつこれらによって活性化可能であり、それにより、所望の波長（例えば、６４５ｎｍ、６８０ｎｍ、７５０ｎｍ）で被験体におけるプロテアーゼ作用を定量的および多チャンネルで測定し、定量された蛍光を癌の進行および病理学的応答と相関させることが可能であり、ここで、後者を、被験体の同一の腫瘍小結節内のルシフェラーゼ活性によって同時に独立して定量する。
別の実施形態では、癌を有し、かつ抗癌薬の処置を受けている被験体を、同一の抗癌剤の適切に標識されたバージョン（近赤外蛍光剤媒介標識および／または癌プロテアーゼ活性可能プローブが含まれる）でさらに処置し、次いで、２またはそれを超える波長での非侵襲性光学的イメージングを用いてライブイメージングし、それにより、被験体の腫瘍および他の部分内の薬物の分布ならびにプロテアーゼ作用を時間の関数として同時に可視化および定量することができる。ある特定の実施形態では、被験体は、動物、例えばげっ歯類、好ましくはラット、さらにより好ましくはマウスであり得る。ある特定の実施形態では、被験体は、癌を有していても有していなくてもよい。ある特定の実施形態では、被験体は、腫瘍同種移植片を保有するラットまたはマウスであってよく、ここで、移植された腫瘍は、同一の種（同系腫瘍）またはヒトなどの他の種（同種異系腫瘍）に由来する。ある特定の実施形態では、腫瘍は、樹立細胞株（ＣＤＸ移植片）または新たに誘導した患者生検組織（ＰＤＸ移植片）に由来し得る。ある特定の実施形態では、腫瘍を、イメージング後に被験体から切り出し、ＩＨＣ、フローサイトメトリー、免疫表現型検査、および他の技術のために処理し、それにより、被験体における薬物生体内分布／イメージングを、治療に対する（前）臨床応答、ならびに形態学的、解剖学的、細胞下、および分子の特質（薬力学的バイオマーカーまたはイメージングバイオマーカーなど）と関連付け得る。
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、疾患の転帰の予後因子である（すなわち、被験体への処置と無関係に疾患の一般的な経過および転帰を提供する）。当該分野で公知であるか、本明細書中に記載のように、かかる予後バイオマーカーは、典型的には、ＩＨＣ抗原コホートから選択され、サイトケラチン、ビメンチン、細胞接着分子、癌遺伝子、および腫瘍抑制因子などであり得る。他の実施形態では、これらのバイオマーカーは、特定の薬物（特許請求の範囲に記載のアルブミン－ＰＴＥＮ融合物など）に応答した疾患の転帰の予測因子である。非限定的な例として、理論に拘束されないが、ＰＴＥＮタンパク質レベルが腫瘍転帰と相関し、それに対して、ｏｎｃｏ－ｍｉＲ（ｍｉＲ－２１など）もＰＴＥＮレベルおよび被験体の全生存の両方と逆相関するので、ｏｎｃｏ－ｍｉＲは、以下から選択されるアルブミン－ＰＴＥＮ組成物を投与した被験体における処置転帰（予測バイオマーカー）を予測する：当該分野で公知であるか、本明細書中に記載のように、被験体に使用するための精製されたアルブミン－ＰＴＥＮタンパク質調製物、アルブミン－ＰＴＥＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療調製物、アルブミン－ＰＴＥＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むｍＲＮＡ治療薬、その組み合わせ、および／もしくは各々のその組み合わせ、または他の処置薬との各々のその組み合わせ。１つの実施形態では、ｏｎｃｏ－ｍｉＲ予測バイオマーカーの測定を、被験体の血液（液体生検）で行う。別の実施形態では、組織抽出物、好ましくは癌組織抽出物中のｏｎｃｏ－ｍｉＲ予測バイオマーカーを決定する。別の実施形態では、ｏｎｃｏ－ｍｉＲ予測バイオマーカーの精度は、７０％または７５％または８０％またはそれを超える。別の実施形態では、ｏｎｃｏ－ｍｉＲレベルを、癌患者および非癌ボランティアの静脈血の血清部分から抽出した総ＲＮＡを用い、配列番号２０７のＲＴプライマーおよび配列番号２０８～２０９のＰＣＲプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲによって測定する。
産生方法およびその組成物
本明細書中に記載の融合タンパク質／ポリペプチドを産生する方法も提供する。前述の方法は、融合タンパク質の発現に適切な条件下で融合タンパク質を発現することができる宿主細胞を培養する工程を含む。
１つの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。さらなる実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。さらにまたはあるいは、宿主細胞は細胞株である。なおさらなる実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＨＥＫ２９３細胞の群から選択される。１つの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、ＥｘＰＡＳｙ受入番号ＣＶＣＬ＿ＪＹ７４を有するＣＨＯ－３Ｅ７細胞である。別の実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞は、ＥｘＰＡＳｙ受入番号ＣＶＣＬ＿ＨＦ２０を有するＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ１－６Ｅである。適切な宿主細胞の培養条件および／または融合タンパク質の発現を、例えば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｅｎ／Ｇｕｉｄｅｓ．ａｓｐｘで見出すことができる。１つの実施形態では、宿主細胞は、天然フューリンノックアウト（ＫＯ）細胞または細胞株である。さらなる実施形態では、宿主細胞は、結腸直腸癌細胞である。なおさらなる実施形態では、宿主細胞は、ＬｏＶｏ細胞である。例えば、Ｓｕｓａｎ－Ｒｅｓｉｇａ ｅｔ ａｌ．２０１１，ＰＭＩＤ：２１５５０９８５を参照のこと。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、融合タンパク質を切断することができるプロテアーゼの発現を欠く（または低レベルで発現する）。１つの実施形態では、プロテアーゼは、細胞内プロテアーゼまたは癌周囲の細胞もしくは組織に存在するプロテアーゼである。さらなる実施形態では、プロテアーゼは、フューリン、ＭＭＰ２／９、またはカテプシンＢの群から選択される。
１つの実施形態では、プロテアーゼは、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、ＢＡＣＥ、レニン）、アスパラギン酸カテプシン（例えば、カテプシンＤ、カテプシンＥ）、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４）、システインカテプシン（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ）、システインプロテイナーゼ（例えば、クルジパイン、レグマイン、オツバイン－２）、ＫＬＫ（例えば、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４）、メタロプロテイナーゼ（例えば、メプリン、ネプリライシン、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ－１）、ＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２３、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７）、セリンプロテアーゼ（例えば、活性化プロテインＣ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、チマーゼ）、凝固因子プロテアーゼ（例えば、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ）、エラスターゼ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球エラスターゼ、ラクトフェリン、マラプシン、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＡ、ｔＰＡ、トロンビン、トリプターゼ、ｕＰＡ、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）（例えば、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、またはＴＭＰＲＳＳ４）の群から選択される。
さらに、方法は、必要に応じて細胞または細胞培養培地から融合タンパク質を精製または単離する工程をさらに含む。１つの実施形態では、精製および／または単離工程は、宿主細胞を溶解して発現された融合タンパク質を放出させる工程を含む。別の実施形態では、精製および／または単離工程は、宿主細胞を溶解する工程を含まないが、その代わりに、融合タンパク質が宿主細胞外に分泌される。１つの実施形態では、培養後または培養中に、宿主細胞の上清および／または細胞培養培地は、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍ、約１μｇ／ｍｌ超、約２μｇ／ｍｌ超、約３μｇ／ｍｌ超、約４μｇ／ｍｌ超、約５μｇ／ｍｌ超、約１０μｇ／ｍｌ超、約１５μｇ／ｍｌ超、約２０μｇ／ｍｌ超、約２５μｇ／ｍｌ超、約３０μｇ／ｍｌ超、約４０μｇ／ｍｌ超、約５０μｇ／ｍｌ超、約１００μｇ／ｍｌ超、約１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約２５μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約２０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌ、約１～約１０μｇ／ｍｌ、約１～約５μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ～約２５μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ～約２０μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約２５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約２０μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ～約２５μｇ／ｍｌ、約１５～約２０μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ～約２５μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、または約５０μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの分泌された融合タンパク質を含む。融合タンパク質の検出および定量を、融合タンパク質を特異的に認識して結合する抗体を使用して行うことができる（実施例を参照のこと）。当該分野で公知であるか、本明細書中に記載のように、融合タンパク質を、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（マラカイトグリーンホスファターゼアッセイなど）、またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（哺乳動物細胞における細胞透過を測定するアッセイなど）または腫瘍抑制因子機能（細胞死の活性化が含まれる）を測定する別の細胞ベースのアッセイでのＰＴＥＮおよび／または融合タンパク質の機能の測定によって検出することもできる。また、種々のテクノロジーを、この精製／単離工程で使用しても良い（例えば、アルブミンアフィニティクロマトグラフィおよび／またはヘパリンアフィニティクロマトグラフィ）。
本明細書中に開示の融合タンパク質は、天然に半減期が長いタンパク質またはタンパク質ドメイン（血清アルブミンなど）を含む。かかる融合タンパク質は、例えば、負電荷アミノ酸へのポリシアル化によって、野生型タンパク質と比較して安定性が高く、そして／または低凝集にさらに改変され得る。さらに、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（複数可）およびベクター（複数可）を、宿主細胞内でより良好に発現されるように最適化した。理論に拘束されることを望まないが、これらの性質により、高収量で融合タンパク質を産生する生産的かつ効率的な方法が得られる。
本明細書中に開示のポリヌクレオチドのうちの１つまたはそれ超および／またはベクターのうちの１つまたはそれ超を含む宿主細胞も提供する。１つの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。さらなる実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。さらにまたはあるいは、宿主細胞は細胞株である。なおさらなる実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＨＥＫ２９３細胞の群から選択される。１つの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、ＥｘＰＡＳｙ受入番号ＣＶＣＬ＿ＪＹ７４を有するＣＨＯ－３Ｅ７細胞である。別の実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞は、ＥｘＰＡＳｙ受入番号ＣＶＣＬ＿ＨＦ２０を有するＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ１－６Ｅである。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、融合タンパク質を切断することができるプロテアーゼの発現を欠く。１つの実施形態では、プロテアーゼは、細胞内プロテアーゼまたは癌周囲の細胞もしくは組織に存在するプロテアーゼである。さらなる実施形態では、プロテアーゼは、フューリン、ＭＭＰ２／９、またはカテプシンＢの群から選択される。１つの実施形態では、宿主細胞は、天然フューリンノックアウト（ＫＯ）細胞または細胞株である。さらなる実施形態では、宿主細胞は、結腸直腸癌細胞である。なおさらなる実施形態では、宿主細胞は、ＬｏＶｏ細胞である。例えば、Ｓｕｓａｎ－Ｒｅｓｉｇａ ｅｔ ａｌ．２０１１，ＰＭＩＤ：２１５５０９８５を参照のこと。
１つの実施形態では、フューリンタンパク質（例えば、ＰＲ３３およびＰＲ３４）を、野生型ＣＨＯ細胞を使用して産生／製造する。別の実施形態では、フューリンタンパク質（例えば、ＰＲ４０２、ＰＲ６１、ＰＲ６、ＰＲ４０５、ＰＲ４０７ ＰＲ３３、および／またはＰＲ３４）を、フューリンＫＯ宿主細胞（ＬｏＶｏなど）を使用して産生／製造する。
製造方法
低収量、低凝集、および／または高安定性の融合タンパク質を製造する方法も提供する。１つの実施形態では、かかる方法により、以下のうちの１つまたはそれ超が可能である：タンパク質の大量産生（例えば、少なくとも約５μｇ／ｍｌの融合タンパク質を含む融合タンパク質を分泌する宿主細胞の培養で使用される培地）、高収量（例えば、野生型ＰＴＥＮに現在利用可能な産生方法と比較した場合）、連続処理（例えば、宿主細胞の成長を妨害することなく、そして／または発現された融合タンパク質を放出するために宿主細胞を回収および溶解することなく、必要に応じてフィルタを介した分泌融合タンパク質を含む宿主細胞の培養培地の回収）、または低凝集および／または高安定性（例えば、野生型ＰＴＥＮと比較した場合）での融合タンパク質の産生。
複数の方法またはキットを使用して、産生されたタンパク質の収量、凝集性、または安定性を評価してよい（実施例に公開した方法またはキットならびに収量を定量するためのＢＣＡタンパク質アッセイキット；タンパク質凝集を評価するための超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、動的光散乱、または濁度測定；および安定性の査定のための示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）、パルスチェイス法、ブリーチチェイス法、シクロヘキシミドチェイス法、円二色性（ＣＤ）分光法、または蛍光ベースの活性アッセイなど）。例えば、ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｂｃａ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ａｓｓａｙ－ｋｉｔ－ａｂ１０２５３６．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｅｎｚｏｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ－ｃｅｎｔｅｒ／ｔｅｃｈｎｏｔｅｓ／２０１７／ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ／ｗｈａｔ－ａｒｅ－ｔｈｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ－ｍｅｔｈｏｄｓ－ｏｆ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ？／、ｄｅｎ Ｅｎｇｅｌｓｍａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ（２０１０），ＰＭＩＤ：２０９７２６１１、ｉｎｆｏ．ｇｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｂｌｏｇ／ｍｅｔｈｏｄｓ－ｏｆ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｓｔａｂｉｌｉｔｙ、およびｗｗｗ．ｎｅｗｓ－ｍｅｄｉｃａｌ．ｎｅｔ／ｗｈｉｔｅｐａｐｅｒ／２０１６１０２７／Ａ－Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ－Ｇｕｉｄｅ－ｔｏ－Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ－Ａｓｓａｙ－Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ．ａｓｐｘを参照のこと。
前述の方法は、融合タンパク質の発現に適切な条件下で融合タンパク質を発現することができる宿主細胞を培養する工程を含む。宿主細胞は、本明細書中に記載の任意の宿主細胞であり得る。
さらに、方法は、必要に応じて細胞または細胞培養培地から融合タンパク質を精製または単離する工程をさらに含む。１つの実施形態では、精製および／または単離工程は、宿主細胞を溶解して発現された融合タンパク質を放出させる工程を含む。別の実施形態では、精製および／または単離工程は、宿主細胞を溶解する工程を含まないが、その代わりに、融合タンパク質が宿主細胞外に分泌される。１つの実施形態では、培養後または培養中に、宿主細胞の上清および／または細胞培養培地は、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍ、約１μｇ／ｍｌ超、約２μｇ／ｍｌ超、約３μｇ／ｍｌ超、約４μｇ／ｍｌ超、約５μｇ／ｍｌ超、約１０μｇ／ｍｌ超、約１５μｇ／ｍｌ超、約２０μｇ／ｍｌ超、約２５μｇ／ｍｌ超、約３０μｇ／ｍｌ超、約４０μｇ／ｍｌ超、約５０μｇ／ｍｌ超、約１００μｇ／ｍｌ超、約１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約２５μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約２０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌ、約１～約１０μｇ／ｍｌ、約１～約５μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ～約２５μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ～約２０μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約２５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約２０μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ～約２５μｇ／ｍｌ、約１５～約２０μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ～約２５μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、または約５０μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの分泌された融合タンパク質を含む。
キット
融合ポリペプチド／タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞、ならびに必要に応じた製造および／または使用のための説明書のうちの１つまたはそれ超であるキットをさらに提供する。
実験
当該分野で標準的な手順を使用して、出願人は、Ｎ’末端またはＣ末端をヘキサヒスチジン（６ｘＨｉｓ）タグでインフレームでタグ化したヒトＰＴＥＮ－Ｌ ｃＤＮＡを含むペリプラズムおよび細胞質発現ベクターを生成することによって細菌内でＰＴＥＮ－Ｌ（配列番号３）を最初に発現させた。最良の配向は、細胞質を標的にしたＮ’末端Ｈｉｓ変異体であった（図１）。誘導条件を最適化しても可溶性タンパク質の絶対収量を著しく増加させることはできず、全期間で非常に低いままであった；さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏホスファターゼアッセイにおけるマラカイトグリーンでのタンパク質の比活性（Ｓｐｉｎｅｌｌｉ＆Ｌｅｓｌｉｅ，２０１５：ＰＭＩＤ：２５４６１８０９）は低く、再現性がほとんどなかった（データ示さず）。したがって、大腸菌は、ＰＴＥＮ－Ｌ腫瘍抑制因子を発現させるための適切な系ではない。
ヒトＰＴＥＮ－Ｌ ｃＤＮＡを、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ発現のために配列最適化し、ｐＰＫ４発現ベクターおよびｐＫ１０発現ベクター中の３つの特異的なＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ分泌リーダーシグナル（ＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＴｏｒＡ）の下流にクローン化し、ここで、得られたｃＤＮＡおよびタンパク質を、それぞれ配列番号４１（ＣｓｐＡ－ＰＴＥＮ－Ｌ ｃＤＮＡ）、配列番号４２（ＣｓｐＢ－ＴＥＶ－ＰＴＥＮ－Ｌ ｃＤＮＡ）、配列番号４３（ＴｏｒＡ－ＰＴＥＮ－Ｌ ｃＤＮＡ）、配列番号７９（ＣｓｐＡ－ＰＴＥＮ－Ｌ）、配列番号８０（ＣｓｐＢ－ＴＥＶ－ＰＴＥＮ－Ｌ）、および配列番号８１（ＴｏｒＡ－ＰＴＥＮ－Ｌ）として列挙する。他の分泌系と同様に、分泌の際にリーダー配列は除去され、標的タンパク質がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの上清中に放出される。（当該分野で公知のように、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含めると、必要であれば野生型タンパク質を放出するのに役立ち得る）。しかしながら、ＰＴＥＮ－Ｌはこの宿主で発現されるにもかかわらず、培養７２時間後にこれらの細菌の細胞内不溶性画分に捕捉されたままであり（図２、点）、分泌できない。それ故、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは大腸菌と大差なく、これらは共にタンパク質の工業生産には不適切である。
プロバイオティクス細菌のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属は、細菌上清中に異種外因性タンパク質を分泌することができることが公知である。ヒトＰＴＥＮ－Ｌ ｃＤＮＡを、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍにおける発現のために配列最適化し、ｐＳＩＰ６０９ Ｌ ｐｌａｎｔａｒｕｍ発現ベクター（Ｓａｋ－Ｕｂｏｌ ｅｔ ａｌ，２０１６；ＰＭＩＤ：２７１７６６０８）中の６つの特異的なＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍリーダー分泌シグナルの下流にクローン化した；試験した６つのシグナルのうちの２つのみ（すなわち、２９５８および０２９７リーダー）の発現結果をここに示す；ここで、対応するｃＤＮＡおよびタンパク質を、それぞれ配列番号４４（Ｌｐ２９５８－ＰＴＥＮ－Ｌ ｃＤＮＡ）、配列番号４５（Ｌｐ０２９７－ＰＴＥＮ－Ｌ ｃＤＮＡ）、配列番号８２（Ｌｐ２９５８－ＰＴＥＮ－Ｌ）、および配列番号８３（Ｌｐ０２９７－ＰＴＥＮ－Ｌ）として列挙する（図３）。外因性ｍａｎＢタンパク質が実際にＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ上清中に分泌することができ（左）、一方で、ＰＴＥＮ－Ｌは、この宿主において全く発現されず、細胞ライセートにおいてさえ発現されない（レーン３～６）。陽性対照として、哺乳動物神経膠腫ＳＨＳＹＳＹ抽出物をｐａｎ－ＰＴＥＮ ｍＡｂ（Ｆ－１）と共にボトリングすると、抽出物中にＰＴＥＮ－Ｓ（５５ＫＤａ）およびＰＴＥＮ－Ｌ（７０ＫＤａ）の両方の存在が明らかとなった（レーン２）。奇数レーン中に認められる種々の高ＭＷバンドは、非特異的ｍＡｂ反応性Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍタンパク質であり、非形質転換細胞（レーン１）およびｐＳＩＰ６０９形質転換細胞（レーン３および５）の両方で認められ得る。それ故、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍは、ＰＴＥＮ－Ｌの工業生産には不適切である。
ヒトアルブミン－ＰＴＥＮ－Ｍ融合物（配列番号４６）または単なるヒトＰＴＥＮ－Ｌ ｃＤＮＡ（配列番号４７）の分泌を駆動するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ特異的シグナルペプチドを含む酵母配列最適化ｃＤＮＡを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクター（ＡＴＵＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ）にクローン化し、酵母中に発現させた（対応するタンパク質配列を、それぞれ配列番号８４（ＨＳＡ－ＰＴＥＮ－Ｍ）および配列番号８５（ＰＴＥＮ－Ｌ）を列挙している）。Ｇｉｓｔ ｍｕｔＳＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を、ベクターを用いて形質転換し、次いで、プロモーターを、０．５％メタノールを用いて２４時間または４８時間誘導した。培養上清および細胞ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードし（図４、上）、ＬＵＤ特異的ＰＴＥＮ－Ｌ ｍＡｂ（クローン３Ａ４．１，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてその後にウェスタンブロッティングを行った。しかしながら、ＰＴＥＮ－Ｌは、分泌されることも（「細胞外」）、絶対的に作製されることも（細胞ライセートの「細胞内」画分）なく、それに対して、抗体は細菌で発現されたＰＴＥＮ－Ｌを容易に検出する（大腸菌封入体から単離し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に溶解する；図４、下）。それ故、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、ＰＴＥＮ－Ｌの工業生産には不適切である。
次いで、出願人は、昆虫Ｓｆ９細胞が融合のためのｃＤＮＡを保有するバキュロウイルスの感染によって媒介されたＰＴＥＮ－Ｍ融合タンパク質を発現することができるかどうかを査定した。したがって、昆虫Ｓｆ９細胞ｇｐ６４分泌性シグナルペプチド、ヒトチオレドキシン（Ｔｒｘ）（発現困難なタンパク質を溶解することが当該分野で公知）、ＴＥＶプロテアーゼをコードする最適化されたｃＤＮＡ配列、ヒトＰＴＥＮ－Ｍ腫瘍抑制因子のｃＤＮＡ、およびＣ末端６ｘＨｉｓタグを合成し、ｐＦａｓｔＢａｃ１バキュロウイルス発現ベクターに５’から３にインフレームで挿入した（融合物の最適化されたｃＤＮＡを配列番号８６として開示し、一方で、得られたタンパク質配列を配列番号８７として開示する）。当該分野で公知の標準的な手順によって行ったＳｆ９細胞のウイルス感染後、ｃＤＮＡをプレタンパク質（ｇｐ６４－Ｔｒｘ－ＴＥＶ－ＰＴＥＮ－Ｍ）融合物に最初に発現させ、リーダーペプチドを切断し、最終的に、Ｔｒｘ－ＰＴＥＮ－Ｍ融合タンパク質が培養上清に分泌される。しかしながら、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって判断した場合に、陰性対照（空の）ウイルス上清と比較して融合物をコードするウイルスを感染させた細胞の上清中には明らかな富化は認められなかった（図５、上のパネル、レーン１対５）。しかしながら、抗６ｘＨｉｓ抗体を使用したこれらの抽出物のウェスタンブロッティングの際に（図５、中央のパネル）、分泌融合物の予想ＭＷに移動したタンパク質（およそ８０ＫＤａ；緑色バンド）を、細胞上清中に検出することができただけでなく、ウイルス感染細胞の全ておよび可溶性画分の両方でも検出できたが（緑色バンド；図５、中央のパネル、レーン１～３）、空のウイルス感染細胞の対応する画分には検出できなかった（図５、中央のパネルのレーン４～６）。さらに、抗Ｈｉｓ抗体は、およそ予想されるＰＴＥＮ－Ｌレベルに移動した６５～７０ＫＤａのタンパク質バンドを特異的に検出する（図５，中央のパネル、レーン１～３で検出されたが、４～８では検出されない）。その後に多量で感染を繰り返し、レーン１由来のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、６５ＫＤａバンドをゲルから切り出し、ＬＣ／ＭＳによって配列決定した。６５ＫＤａバンドが、正確なアミノ酸配列（配列番号１の５２～５７６）またはヒトＰＴＥＮ－Ｌを有するＰＴＥＮ－Ｌバリアントに対応することが判明した（図５、下のパネル、下線を引いた残基）。しかしながら、このバリアントは、Ｈｉｓ５２の上流の全てのＮ’配列（Ｔｒｘ配列を含む）、より困難には、６個のアルギニンから構成される最小細胞透過ドメインストレッチ（ＭＣＰＤ；配列番号３９）（６０～８０％のＰＴＥＮ－ＬおよびＰＴＥＮ－Ｍの細胞侵入を媒介することが知られている）を欠く（Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，２０１３：ＰＭＩＤ：２３７４４７８１；Ｔｚａｎｉ ｅｔ ａｌ，２０１６：ＰＭＩＤ：２７２４９８１９；Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１７：ＰＭＩＤ：２８３３２４９４）。分解物が特異的に富化することがほとんどなく（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；レーン１対４）、主なＰＴＥＮ－Ｌ（６５～７０ＫＤａ）バンドが細胞透過ドメインを持たないので、この系は、結局のところ野生型細胞透過性ＰＴＥＮ－Ｌ腫瘍抑制因子の工業生産には容認できないと見なされる。
出願人は、以下の通り、一連の哺乳動物アルブミン－ＰＴＥＮ融合物を両方の方向で構築した（詳細については、表１を参照のこと）：
Ｎ’－（ＳＰ）（Ｌ１）（アルブミン）（Ｌ２）（ＰＴＥＮ）（Ｌ３）－Ｃ’
Ｎ’－（ＳＰ）（Ｌ１）（ＰＴＥＮ）（Ｌ２）（アルブミン）（Ｌ３）－Ｃ’
ここで、ＳＰは、配列番号４、９３～１０５の群から選択されるシグナルペプチドである。
Ｌ１、Ｌ２、またはＬ３は、融合特異的リンカー配列である。
Figure 2022528203000002
Figure 2022528203000003
Figure 2022528203000004
Figure 2022528203000005
Figure 2022528203000006
Figure 2022528203000007
Figure 2022528203000008
Figure 2022528203000009
Figure 2022528203000010
Figure 2022528203000011
いくつかの実施形態では、示すように（図６Ａおよび表１）、リンカー配列は、６ｘＨｉｓ、Ｆｌａｇ血球凝集素（ＨＡ）、および他の類似のタグの群から選択されるエピトープタグが省略されていてもよく、含んでもよく、さらにはこれらからなってもよい。
いくつかの実施形態では、上記融合ＰＴＥＮタンパク質は、エピトープタグを含む。他の実施形態では、上記融合ＰＴＥＮタンパク質は、エピトープタグを含まない。
アルブミンは、配列番号１２、１３、もしくは配列番号９０～９２、もしくは配列番号１６３の群から選択されるＨＳＡ、ＳＳＡ、ＲＳＡ、もしくはＭＳＡ、または各々のその等価物、欠損変異体、点変異体、アナログ、もしくはバリアントである。
ＰＴＥＮは、配列番号２～３；もしくは配列番号６～８もしくは配列番号８８～８９、もしくは配列番号１６２の群から選択されるＰＴＥＮタンパク質、または各々のその等価物、欠損変異体、点変異体、アナログ、もしくはバリアントである。
１つの実施形態では、以下のＰＴＥＮ－Ｌバリアントを作出した：ＰＲ４１０（配列番号３１；ｃＤＮＡ配列番号７１）、ＰＲ４１１（配列番号３２；ｃＤＮＡ配列番号７２）、ＰＲ４１２（配列番号３３；ｃＤＮＡ配列番号７３）。
別の実施形態では、以下のＮ’－ＰＴＥＮ－Ｌ－Ｆｃ－Ｃ’融合物を作出した：ＰＲ７（配列番号３４；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－Ｆｃ－３’，配列番号７４）、ＰＲ７００（配列番号３５；ｃＤＮＡ，５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－Ｆｃ－３’，配列番号７５）。
別の実施形態では、以下のＮ’－Ｆｃ－ＰＴＥＮ－Ｌ－Ｃ’融合物を作出した：ＰＲ８（配列番号３６；ｃＤＮＡ、５’－Ｆｃ－ＰＴＥＮ－Ｌ－３’，配列番号７６）。
別の実施形態では、以下のＮ’－チオレドキシン－ＰＴＥＮ－Ｌ－Ｃ’融合物を作出した：ＰＲ４３０（配列番号４９；ｃＤＮＡ、５’－チオレドキシン－ＰＴＥＮ－Ｌ－３’，配列番号１３５）。
別の実施形態では、以下のＮ’－アルブミン－ＰＴＥＮ－Ｃ’融合物を作出した：ＰＲ１（配列番号１４；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号５４）、ＰＲ２（配列番号１５；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号５５）、ＰＲ３（配列番号１６；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号５６）、ＰＲ５（配列番号１７；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号５７）、ＰＲ６３（配列番号２１；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号６１）、ＰＲ６４（配列番号２２；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号６２）、ＰＲ３１（配列番号２３；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号６３）、ＰＲ３２（配列番号２４；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号６４）、ＰＲ３３（配列番号２５；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号６５）、ＰＲ３４（配列番号５０；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号１３６）。
別の実施形態では、以下のＮ’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－Ｃ’融合物を作出した：ＰＲ４（配列番号２６；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号６６）、ＰＲ４０１（配列番号２７；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号６７）、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号６８）、ＰＲ４０３（配列番号２９；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号６９）、ＰＲ４０４（配列番号３０；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号７０）。さらなる実施形態では、Ｎ’末端最小ＰＴＥＮドメインおよびＣ’アルブミンを含む融合タンパク質を作出する。なおさらなる実施形態では、最小ＰＴＥＮドメインは、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む。さらにまたはあるいは、アルブミンはＨＳＡであり、融合タンパク質は、ＨＳＡシグナルペプチドおよび６ｘＨｉｓタグをさらに含む。
別の実施形態では、以下のＮ’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－Ｃ’融合物を作出した：ＰＲ４１９（配列番号１０９；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１３７）、ＰＲ４２０（配列番号１１０；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１３８）、ＰＲ４２１（配列番号１１１；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１３９）、ＰＲ４２２（配列番号１１２；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４０）、ＰＲ４２４（配列番号１１３；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４１）、ＰＲ４２５（配列番号１１４；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４２）、ＰＲ４２６（配列番号１１５；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４３）、ＰＲ４２７（配列番号１１６；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４４）、ＰＲ４２８（配列番号１１７；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４５）、ＰＲ４０９（配列番号１１８；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４６）、ＰＲ４１５（配列番号１１９；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４７）、ＰＲ４１６（配列番号１２０；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４８）、ＰＲ４１３（配列番号１２１；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１４９）、ＰＲ４１４（配列番号１２２；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１５０）、ＰＲ４１７（配列番号１２３；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１５１）、およびＰＲ４１８（配列番号１２４；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１５２）。
別の実施形態では、以下のＮ’－アルブミン－ＰＴＥＮ－Ｃ’融合物を作出した：ＰＲ６（配列番号１８；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号５８）、ＰＲ６１（配列番号１９；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号５９）、ＰＲ６２（配列番号２０；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号６０）、ＰＲ６６（配列番号１２６；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号１５４）、ＰＲ６７（配列番号１２７；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号１５５）、およびＰＲ６８（配列番号１２８；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＰＴＥＮ－３’、配列番号１５６）。さらなる実施形態では、Ｎ’末端アルブミンおよびＣ’末端最小ＰＴＥＮドメインを含む融合タンパク質を作出する。なおさらなる実施形態では、最小ＰＴＥＮドメインは、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む。さらにまたはあるいは、アルブミンはＨＳＡであり、融合タンパク質は、ＨＳＡシグナルペプチドおよび６ｘＨｉｓタグをさらに含む。
別の実施形態では、以下のＮ’－ＰＴＥＮ－Ｓ－アルブミン－Ｃ’融合物を作出した：ＰＲ６５（配列番号１２５；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｓ－アルブミン－３’、配列番号１５３）。
別の実施形態では、以下のＮ’－ＰＴＥＮ－Ｓ－アルブミン－ＰＴＥＮ－Ｓ－Ｃ’融合物を作出した：ＰＲ９１１（配列番号３７；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｓ－アルブミン－ＰＴＥＮ－Ｓ－３’、配列番号７７）。
別の実施形態では、以下のＮ’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－Ｃ’融合物を作出した：ＰＲ４０５（配列番号１２９；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１５７）、ＰＲ４０６（配列番号１３０；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１５８）、ＰＲ４０７（配列番号１３１；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１５９）、およびＰＲ４０８（配列番号１３２；ｃＤＮＡ、５’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－３’、配列番号１６０）。
別の実施形態では、以下のＮ’－アルブミン－ＬＵＤ－ｐ５３－Ｃ’融合物を作出した：Ｆ１３１（配列番号３８；ｃＤＮＡ、５’－アルブミン－ＬＵＤ－ｐ５３－３’、配列番号７８）。
別の実施形態では、以下のＮ’－ＬＵＤ－ｐ５３－アルブミン－Ｃ’融合物を作出した：Ｆ１３７（配列番号１３３；ｃＤＮＡ、５’－ＬＵＤ－ｐ５３－アルブミン－３’、配列番号１６１）。
哺乳動物ＰＴＥＮ－アルブミン融合物の全てのｃＤＮＡを配列最適化し（例えば、配列番号５４～７８；１３５～１６１；１７２～１７９；図６および表１を参照のこと）、化学合成し、配列決定して同一性を確認し、ｐＴＴ５（配列番号１７３；図６Ｃ；Ｄｕｒｏｃｈｅｒ＆Ｌｏｉｇｎｏｎ，２００９：ｐａｔｅｎｔｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｐａｔｅｎｔ／ＵＳ８６３７３１５）のＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に固有のＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてサブクローン化した。これら全ての操作は、ＧｅｎｓＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙによって実施された。
１つの例では、ＨＳＶ－１菌株１７（１５２，２２２ｂｐ；ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＣ＿００１８０６．２；Ｎａｔｉｏｎａｌ（ＵＫ）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｖｉｒｕｓｅｓ，カタログ番号０１０４１５１ｖ）を使用して、ＩＣＰ４７およびＩＣＰ３４．５病原性ＨＳＶ遺伝子の両方を欠き、かつ本明細書中に開示のアルブミン－ＰＴＥＮ融合物ｃＤＮＡを保有する組換え腫瘍崩壊性ＨＳＶ－１を作出する（例えば、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０、図６Ｄも参照のこと）。最初に、ＭＨＣＩ－ＣＤ８（＋）阻害剤をコードする病原性ＩＣＰ４７遺伝子を、２つの連続した相同組換え事象によって除去する。そのために、ＨＳＶ－１ゲノムの上流（ｕｐ）および下流（ｄｎ）の隣接領域を、プライマー対４７ｕｐＦ（配列番号２１２）および４７ｕｐＲ（配列番号２１３）ならびに４７ｄｎＦ（配列番号２１４）および４７ｄｎＲ（配列番号２１５）を使用してＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物をその後にそれぞれＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ－ＳａｌＩで消化する。次いで、相補リンカー（例えば、配列番号２１６～２１７）を使用して、２つの隣接領域を共に大型のｐＢＳＳＫベクター断片のＥｃｏＲＩ部位とＳａｌＩ部位との間に繋ぎ合わせ、プラスミドｐΔ４７を作出する。次いで、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の２３９ａａ ＯＲＦおよびＣＭＶ５プロモーターを含むｐｃＤＮＡ３．１－ｅＧＦＰ（Ｎｏｖａ Ｌｉｆｅｔｅｃｈ，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ，カタログ番号ＰＶＴ１０７５４）の小型のＥｃｏＲＩ－ＸｈｏＩ断片を、ｐΔ４７のＥｃｏＲＶ部位に平滑末端を用いてライゲーションして、ｐΔ４７－ｅＧＦＰを作出する。次いで、ＨＳＶ－１／１７＋菌株ウイルスＤＮＡおよびｐΔ４７－ｅＧＦＰを、第１のＨＳＶ組換えが可能になるようにＢＨＫ細胞に同時トランスフェクトし、それにより、ＩＣＰ４７がｅＧＦＰに置換されてＨＳＶ－１／１７／４７－ｅＧＦＰウイルスが生成される（図６Ｄ）。後者を４回プラーク精製し、ここで、４～６個の単一プラークを選別し、蛍光顕微鏡下で毎回ｅＧＦＰ発現について確認する。次いで、ＨＳＶ－１／１７／Δ４７－ｅＧＦＰを、上記の２回目のように組換えるが、ここでは代わりにｐΔ４７プラスミドを使用し、それにより第２ラウンドの子孫ウイルスからｅＧＦＰを排除し、ＩＣＰ４７を喪失させる（ＨＳＶ－１／１７／Δ４７ウイルス；図６Ｄ）。第２の病原性遺伝子ＩＣＰ３４．５（ＨＳＶ神経病原性の主な決定因子である）を欠失させるために、ＨＳＶ－１ゲノムの対応する上流（ｕｐ）および下流（ｄｎ）の隣接領域を、プライマー対３４５ｕｐＦ（配列番号２１８）および３４５ｕｐＲ（配列番号２１９）ならびに３４５ｄｎＦ（配列番号２２０）および３４５ｄｎＲ（配列番号２２１）をそれぞれ使用してＰＣＲ増幅し、次いで、ＰＣＲ産物をプライマー対３４５ｕｐＦおよび３４５ｄｎＲ（配列番号２１８、２２１）を使用した重複ＰＣＲを用いて連結し、その後に大型の平滑末端変換ＢａｍＨＩ－ＸｈｏＩ ｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクター断片に挿入して、プラスミドｐΔ３４．５を作出する。次いで、ｐｃＤＮＡ３．１－ｅＧＦＰの小型のＥｃｏＲＩ－ＸｈｏＩ断片をｐΔ３４．５に挿入して、ｐΔ３４．５－ｅＧＦＰを作出する。同様に、アルブミン－ＰＴＥＮ融合物の小型のＳｐｅＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ｐＴＴ５のＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にクローン化されたｐＴＴ５ ＣＭＶ５プロモーター領域および各アルブミン－ＰＴＥＮ ｃＤＮＡを含む）（図６Ｃを参照のこと））をｐΔ３４．５に挿入してｐΔ３４．５－ＰＲｎを作出し、ここで、ｎは、本明細書中に開示の配列番号１４～３０、３４～３７、４９～５０、および１０９～１３２から選択されるＰＲタンパク質に対応する（それにより、例えば、ｐΔ３４．５－ＰＲ４０２は、配列番号６８のｃＤＮＡを含み、配列番号２８のＰＲ４０２タンパク質を発現し、ｐΔ３４．５－ＰＲ６１は、配列番号５９のｃＤＮＡを含み、配列番号１９のＰＲ６１タンパク質を発現する）。次いで、前の工程由来のＨＳＶ－１／１７／Δ４７ウイルスを、２つの連続する組換えラウンドに供する。最初に、ＨＳＶ－１／１７／Δ４７ウイルスＤＮＡをｐΔ３４．５－ｅＧＦＰで組換えてＩＣＰ３４．５遺伝子座にｅＧＦＰをノックインし、それにより、ＨＳＶ－１／１７／Δ４７／Δ３４．５－ｅＧＦＰウイルスを作出する（図６Ｄ）。プラーク精製後（４回、ここで、４～６個の単一プラークを選別し、蛍光顕微鏡下で毎回ｅＧＦＰ発現について確認する）、上記のように、ＨＳＶ－１／１７／Δ４７／Δ３４．５－ｅＧＦＰウイルスをｐΔ３４．５－ＰＲｎで組換えて、最終組換え腫瘍崩壊ウイルスＨＳＶ－１／１７／Δ４７／Δ３４．５－ＰＲｎを作出する（図６Ｄ）。当該分野で公知であり、そして／または本明細書中に記載のように、後者のウイルスを、４Ｔ１、ＭＤＡＭＢ４６８、ＰＣ３、および他の細胞への感染後に導入遺伝子発現について査定し、ＷＢまたは活性ベースのアッセイを使用してコードされたタンパク質を同定する。１つの実施形態では、組換えＨＳＶ－１Δ４７／Δ３４．５アルブミン－ＰＴＥＮウイルスのアルブミン－ＰＴＥＮ導入遺伝子は、配列番号１４～３０、３４～３７、４９～５０、および１０９～１３２から選択されるポリヌクレオチドである。別の実施形態では、組換え腫瘍崩壊性ＨＳＶを、ＣＲＩＳＰＲ方法論またはＴＡＬＥＮ方法論を使用して構築する。１つの実施形態では、ウイルスはＨＳＶ－１である。別の実施形態では、ＨＳＶウイルスは、上記示すように正確に操作することができるＨＳＶ－２である（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，２０１４；ＰＭＩＤ：２４６７１１５４）。別の実施形態では、組換え腫瘍崩壊性ＨＳＶウイルスによって発現されるべきＰＴＥＮアルブミン融合物ｃＤＮＡは、（配列番号１７１のｎｔ（１～６３）または配列番号１８０～１９２）の群から選択されるＮ末端シグナルペプチドｃＤＮＡを有する。別の実施形態では、発現されるべきＰＴＥＮアルブミン融合物は、シグナルペプチドを持たないが、イニシエーターメチオニン残基のＡＴＧコドンが、それぞれ必要に応じて、成熟アルブミンｃＤＮＡ（配列番号１７６～１７９から選択される）または成熟ＰＴＥＮ－Ｌ ｃＤＮＡ（配列番号１６７または配列番号１７１のヌクレオチド（ｎｔ）６４～ｎｔ１７２８から選択される）のいずれかの上流に配置されている。別の実施形態では、発現されるべきＰＴＥＮアルブミン融合物は、シグナルペプチドを持たないが、イニシエーターメチオニンのＡＴＧコドンと、必要に応じて、成熟アルブミンｃＤＮＡ（配列番号１７６～１７９から選択される）または成熟ＰＴＥＮ－Ｌ ｃＤＮＡ（配列番号１６７または配列番号１７１のヌクレオチド（ｎｔ）６４～ｎｔ１７２８から選択される）の第１の残基が置換されている。別の実施形態では、組換え腫瘍崩壊性ＨＳＶウイルスは、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０から選択される１つのアルブミン－ＰＴＥＮ融合物のｃＤＮＡを保有する／含む。別の実施形態では、ウイルスは、配列番号５４～７０、７４～７７、７８、１３５～１６０、１６１の群から選択される２またはそれを超えるアルブミン融合物ｃＤＮＡを保有する／含む。さらなる実施形態では、組換え腫瘍崩壊性ＨＳＶウイルスは、配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０の群から選択される１つのアルブミン－ＰＴＥＮ融合物ｃＤＮＡおよび配列番号７１～７３、１７１～１７２、１６６～１６７、１９８～２００、２０４～２０６の群から選択される１つのＰＴＥＮ ｃＤＮＡを保有する／含む。他の実施形態では、組換えウイルスは、１つのアルブミン－ＰＴＥＮ融合物ｃＤＮＡおよび異種タンパク質（チェックポイント抗体が含まれるモノクローナル抗体など）のｃＤＮＡを保有する／含む。
実施例１．産業的に妥当なＰＴＥＮ－ＬおよびＰＴＥＮ－Ｓヒト血清アルブミン融合物の生成。
材料と方法
ｐＴＴ５ベースのアルブミンＰＴＥＮ融合物発現ベクターを、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３－６Ｅ、または工業グレードのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ－３Ｅ７）細胞（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ＆Ｌｏｉｇｎｏｎ，２００９：ｐａｔｅｎｔｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｐａｔｅｎｔ／ＵＳ８６３７３１５）に一過性にトランスフェクトした。両方の細胞株は、馴化培地中に融合タンパク質を分泌する。細胞を、血清およびタンパク質を含まないＦ１７合成培地を含む懸濁液（総体積３ｍｌ）中、３２℃で６日間までのトランスフェクション後日数（ｄｐｔ）にて成長させた。上清を試料採取し、細胞生存率を、Ａｃｃｕｍａｘを用いて２４時間毎または表示の通りに査定する。ＣＨＯ－３Ｅ７生存率は、これらの条件下での全ての一過性トランスフェクションについて体系的に７５％を超え、それに対して、ＨＥＫ２９３は変動し、発現されるベクターの影響を受けたが、５ｄｐｔで常に６５％を超えていた。細胞および細胞デブリを含まない順化培地も、８～１２％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードした。ゲルに結合したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、最初にポンソーで染色し、次いで、以下の一次抗体のうちの１つを用いてブロッティングした（図６Ｂ）：
抗ＰＴＥＮ抗体：
ａ．クローンＦ－１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号ｓｃ－３９３１８６）。製造者によれば、マウスｍＡｂ Ｆ－１は、ヒトＰＴＥＮ－Ｓ（配列番号２）のａａ（３～２９）に結合する。この領域は全ての哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｓで同一であるので、Ｆ－１は、全ての哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌタンパク質およびＰＴＥＮ－Ｓタンパク質と相互作用することができるｐａｎ－ＰＴＥＮ ｍＡｂである。
ｂ．クローンＡ２Ｂ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号ｓｃ－７９７４）；製造者によれば、Ａ２Ｂ１はヒトＰＴＥＮ－Ｓのａａ（３８８～４００）に惹起され、ヒト、マウス、およびラットのＰＴＥＮ－Ｓの検出に推奨されている。しかしながら、サルおよびヒトのＰＴＥＮ－Ｓは同一であり、一方で、げっ歯類ＰＴＥＮ－ＳはＴ３９８Ｓ変異（しかし、この変異は非常に保存的な置換である）を有することに留意のこと。したがって、Ａ２Ｂ１マウスｍＡｂは、おそらく、ｐａｎ－ＰＴＥＮ Ａｂであり、ヒトおよびサルの両方と相互作用することができ、マウスおよびラットのＰＴＥＮ－ＬおよびＰＴＥＮ－Ｓの両方と相互作用ことができる可能性が非常に高い。
ｃ．クローン１３８Ｇ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；カタログ番号９５５６）。製造者は、このウサギｍＡｂの正確な標的エピトープを開示していない。しかしながら、Ｍｉｎｇｏ ｅｔ ａｌ，２０１９（ＰＭＩＤ：３０９９３２０８）は、１３８Ｇ６がヒトＰＴＥＮ－Ｓのａａ（３８８～３９４）に結合することを実証していた。この領域は、哺乳動物ＰＴＥＮの間で保存されている。それ故、１３８Ｇ６はｐａｎ－ＰＴＥＮ ｍＡｂである。
ｄ．クローンＳＰ２１８（ＡｂＣａｍ；カタログ番号ａｂ２２８４６６Ｐ）。製造者は、このウサギｍＡｂの標的エピトープを開示していない。しかしながら、Ｍｉｎｇｏ ｅｔ ａｌ，２０１９（ＰＭＩＤ：３０９９３２０８）は、ＳＰ２１８がヒトＰＴＥＮ－Ｓのａａ（３９４～４０２）に結合することを実証していた。この領域は、げっ歯類ＰＴＥＮ－ＳのＴ３９８Ｓ変異に及ぶ。それ故、ＳＰ２１８は、ヒトおよびサルのｐａｎ－ＰＴＥＮ ｍＡｂであり、マウスおよびラットのＰＴＥＮ－ＬおよびＰＴＥＮ－Ｓとも相互作用する可能性が非常に高い。
ｅ．クローン１７．Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号ＭＡ５－１２２７８）。製造者は、このマウスｍＡｂの標的エピトープを開示していない。しかしながら、Ｍｉｎｇｏ ｅｔ ａｌ、２０１９（ＰＭＩＤ：３０９９３２０８）は、１７．ＡがヒトＰＴＥＮ－Ｓのａａ（３９２～４０２）に結合することを実証していた。この領域は、げっ歯類ＰＴＥＮ－ＳのＴ３９８Ｓ変異に及ぶ。しかしながら、製造者によれば、１７．ＡはマウスおよびヒトのＰＴＥＮ－Ｓの両方と反応し、１７．Ａがヒトおよびサルのｐａｎ－ＰＴＥＮ ｍＡｂであることが示唆され、マウスおよびラットのＰＴＥＮ－ＬおよびＰＴＥＮ－Ｓとも相互作用する可能性が非常に高い。
ｆ．クローン３Ａ４．１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号ＭＡＢＳ１６８０）。これは、ＧＳＴに融合したヒトＬＵＤ（配列番号５）に対して惹起するマウスｍＡｂであり、細菌内で発現される。製造者は、標的エピトープを開示していない。しかしながら、製造者は、３Ａ４．１がヒトＰＴＥＮ－Ｌに結合すると主張している；これは、３Ａ４．１がサルＰＴＥＮ－Ｌにも結合することを意味する（ＬＵＤ内にたった１つの変異しかない、Ｇ１１６）。３Ａ４．１がげっ歯類ＰＴＥＮ－Ｌに結合するかどうかは知られていないが、３Ａ４．１はいかなるＰＴＥＮ－Ｓにも結合しないであろう。
抗アルブミン抗体
ｇ．クローンＡＬ－０１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号ＭＡ１－１９１７４）。製造者はこのｍＡｂの標的エピトープを開示していないが、ＨＳＡに特異的であることを主張している。出願人は、ＡＬ－０１がＰＲ４１３（ＨＳＡのａａ（１～３８５）；配列番号１２１を含む；ｃＤＮＡ配列番号１４９））と相互作用することができるが、ＰＲ４１４（ＨＳＡのａａ（１～１９７）を含む；配列番号１２２；ｃＤＮＡ配列番号１５０）に結合できないことを見出した。これは、ＡＬ－０１の結合部位がＨＳＡの（ａａ（３６２～３７５））またはドメインＩＩ（ＨＳＡ（配列番号１３）とＭＳＡ（配列番号９２）との間で非常に多様な領域）内にあることを示唆している。それ故、ＡＬ－０１は、ｄＩＩに結合するＨＳＡ特異的なｍＡｂである。
ｈ．クローンＦ－１０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号ｓｃ－２７１６０５）。製造者によれば、Ｆ－１０は、ａａ（３９～１６４）（ＨＳＡのドメインＩである）に結合する。製造者は、ＭＳＡおよびＲＳＡも検出するためにＦ－１０を使用することを推奨している。しかしながら、ＨＳＡ（配列番号１３）をＳＳＡ（配列番号９０）とアラインメントすると、ＳＳＡとＨＳＡのａａ（３９～１６４）の間の残基の不一致はたった３つしかないことが示される。したがって、Ｆ－１０は、全ての哺乳動物アルブミンのドメインＩに結合するｐａｎ－アルブミンｍＡｂである可能性が非常に高い。
抗６ｘＨｉｓ抗体。以下の２つのかかるクローンを使用した：Ｃａｎａｄｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ；ｉｎ－ｈｏｕｓｅ ｃｌｏｎｅ）のクローンおよびＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ；カタログ番号Ａ００１８６）のクローン（非常に類似した結果が得られた）。
ｍＡｂの作業希釈倍率は、表示のように、適用（ＷＢ、ＩＰ）に応じて１：１００～１：１０００であった。いくつかの実施形態では、二次Ａｂは、ＨＲＰ抱合されていた（図６Ｂ）。適切な二次抗体を、１：１０００の希釈倍率で使用した。
結果
ＰＴＥＮ－Ｌの培養上清中の分泌は微量であり、濃縮後でしか検出することができないという以前の報告（Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，２０１３：ＰＭＩＤ：２３７４４７８１）と一致して、Ｃ末端を６ｘＨｉｓでタグ化したヒトＰＴＥＮ－Ｌ（ＰＲ４１０（配列番号３１；ｃＤＮＡ配列番号７１）またはＰＲ４１１（配列番号３２；ｃＤＮＡ配列番号７２））は、工業グレードのＣＨＯ－３Ｅ７細胞で本質的に発現されなかった／（できなかった）。実際に、アルブミンまたは免疫グロブリンのリーダーが分泌を駆動したかどうかと無関係に、タンパク質はわずかしかなく、存在したとしても、無濃縮の培養培地のＷＢによって検出可能な程度である（図７；ＰＴＥＮブロット；レーン９～１０中のおよそ７５ＫＤａにＰＴＥＮ－Ｌが認められるが、過剰発現ＷＢの１３には認められない）。ＰＴＥＮ－Ｍ、Ｎ、およびＯの翻訳イニシエーター残基の変異は、報告（Ｔｚａｎｉ ｅｔ ｅｌ，２０１６：ＰＭＩＤ：２７２４９８１９）によれば、リボソーム結合をＰＴＥＮ－Ｌのロイシンイニシエーターの上流に移動させる場合があり、それにより、ＰＴＥＮ－Ｌ発現（ＰＲ４１２、配列番号３３；ｃＤＮＡ配列番号７３）が増加する可能性があるが、前述の変異は役立たなかった（図７、ＰＴＥＮ ＷＢのレーン１１）。これらの条件下で、ＣＨＯ－３Ｅ７培養上清中のＰＲ４１０、ＰＲ４１１、およびＰＲ４１２の濃度は、十分に１ｎｇ／ｍｌ未満であると推定された。対照的に、細胞は大量の他のＰＴＥＮ融合物（ＰＲ６１（配列番号１９；ｃＤＮＡ配列番号５９）およびＰＲ３２（配列番号２４；ｃＤＮＡ配列番号６４）など）を分泌し（以下を参照のこと）、それにより、この細胞がこの目的に適していることが実証された。したがって、野生型（非融合）ヒトＰＴＥＮ－Ｌを、ＣＨＯ細胞によって工業的に有意義に製造することはできない。
免疫グロブリンＦｃテール配列の付加は、生物製剤を安定化させるのに有用な方法である。しかしながら、Ｆｃをその「天然の」Ｃ末端に含めると、ＰＴＥＮ－Ｌ融合タンパク質（ＰＲ７；配列番号３４；ｃＤＮＡ配列番号７４）が得られ、これは、実際には検出の再現性があるが（図８Ｂ、過剰発現ＷＢ、レーン１０～１２対１７～１８；８０ＫＤａおよび図７；レーン８対１３）、製造可能では全く無い（図８Ｂ、ポンソー、レーン１０～１２；レーン９～１１に認められた７２ＫＤａバンドおよび７７ＫＤａバンドが、偽処置ＨＥＫ２９３上清中でも存在するので、実際には非特異的であることに留意のこと；レーン１７）。同様に、Ｎ２９７Ｑ変異を保有するＡＤＣＣ欠損ＰＲ７バリアント（ＰＲ７００；配列番号３５；ｃＤＮＡ配列番号７５）は、ＰＲ７よりも良好に発現されない（図７、レーン８、１２、および１３）。さらに、ＰＲ７（配列番号３４；ｃＤＮＡ配列番号７４）は、野生型様ＰＴＥＮ－Ｌ（ＰＲ４１０～１２；配列番号３１～３３）を超える発現の改善は認められず（図７、レーン８～１３）、ＰＴＥＮ－Ｌの３’へのＦｃテールの付加が無益であることが示唆される。同様に、逆方向でＦｃを導入すると（ＰＲ８；配列番号３６；ｃＤＮＡ配列番号７６）、ほとんど検出不可能なレベルに発現がさらにより低下する（図８Ｂ；レーン９～１８）。また、細胞が大量のＰＲ６（配列番号１８；ｃＤＮＡ配列番号５８）を分泌し（図８Ｂ、ポンソー染色、レーン８）、それにより、細胞が目的に適合していることが実証された。したがって、いずれの方向へのＦｃの付加もＰＴＥＮ－Ｌを全く安定させず、腫瘍抑制因子を工業的に妥当に製造することはできない。
Ｒｕｂａｒｔｅｌｌｉ＆Ｓｉｔｉａ Ｒ，１９９１（ＰＭＩＤ：１８８９６０８）が、非標準的経路（すなわち、いかなるシグナルペプチドリーダーも使用しない）を介してＩＬ－１およびチオレドキシン（Ｔｒｘ－１）が正常細胞によって分泌され得ることを示しているので；Ｔｒｘ－１は、ＰＴＥＮ－Ｓと相互作用することが公知であり（Ｍｅｕｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ，２００４；ＰＭＩＤ：１５３１３２１５）；ＰＴＥＮ－Ｌコード配列の上流のＴｒｘ－１融合物は昆虫細胞中のタンパク質を部分的に安定化させる場合があり（図５）、出願人はＰＲ４３０融合物（配列番号４９；ｃＤＮＡ配列番号１３５）を構築した。しかしながら、ＰＲ６１（配列番号１９；ｃＤＮＡ配列番号５９）およびＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）（以下を参照のこと）と異なり、ＰＲ４３０（配列番号４９；ｃＤＮＡ配列番号１３５）はＣＨＯ上清中でも分泌できなかった（図９）。これらの条件下で、ＰＲ６１は、ＰＲ４０２よりも遥かに高いレベルで発現された（図７も参照のこと）。
次いで、出願人は、それぞれ、プレタンパク質ＨＳＡ（配列番号１２）をＰＴＥＮ－Ｍの上流に連結してＰＲ１（配列番号１４；ｃＤＮＡ配列番号５４）、ＰＲ２（配列番号１５；ｃＤＮＡ配列番号５５）、ＰＲ３（配列番号１６；ｃＤＮＡ配列番号５６）、およびＰＲ５（配列番号１７；ｃＤＮＡ配列番号５７）を作出するか、ＰＴＥＮ－Ｓの上流に連結してＰＲ６；（配列番号１８；ｃＤＮＡ配列番号５８）を作出することによって一連のアルブミンＰＴＥＮ融合物を構築した。また、出願人は、ＰＴＥＮ－Ｌがプロセシングされた分泌型のＨＳＡ（配列番号１３）に先行する逆変異体ＰＲ４（配列番号２６；ｃＤＮＡ配列番号６６）を構築した。ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯ－３Ｅ７細胞中にＰＲ１～４が最初に発現され、抗Ｈｉｓ抗体を使用したＷＢによって培養上清中のタンパク質をアッセイした（図８Ａ）。工業グレードのＣＨＯ－３Ｅ７細胞は、発現がＨＥＫ２９３とＣＨＯ－３Ｅ７との間で本質的に同一であったＰＲ４（配列番号２６；ｃＤＮＡ配列番号６６）を除く研究したほとんど全ての場合において、ＨＥＫ２９３細胞より多くの総外因性ＰＲタンパク質を分泌した（図８Ａ；レーンＡ～Ｃ対Ｄ）。全てのＮ末端ＨＳＡ融合物（ＰＲ１～３）は、１２０～１３０ＫＤａの予想される分子量に移動したが（図７、Ｈｉｓブロット、長期曝露）、６０～７０ＫＤａの１つまたは２つの主なバンドへのさらなる大きな分解を受けた（図８Ａ、ポンソー）；これらの６０～７０ＫＤａ分解物のうちの１つは、Ｃ末端Ｈｉｓエピトープタグ抗体によって選別されたので、ＨＳＡである（図８Ａ、Ｈｉｓブロット）。また、ＰＲ５は、ＰＲ１～３に類似して、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯ－３Ｅ７細胞の両方において大きな分解を受ける（図８Ｂ）。対照的に、出願人が非常に驚いたことには、ＰＴＥＮ－Ｌから始まり、Ｃ’が成熟ＨＳＡで終結するＰＲ４（配列番号２６；ｃＤＮＡ配列番号６６）は、ＰＲ１～３およびＰＲ５より安定しているが、依然としてかなりの程度まで分解される（図８Ａ）。なおさらに逆説的には、ドメイン構造がＰＲ１～３およびＰＲ５に類似しているＰＲ６（配列番号１８；ｃＤＮＡ配列番号５８）は、分解があったとしてもわずかであり、非常に大量に発現された（図８Ｂ、ポンソー；レーン５～８対１７～１８；ＰＲ６はＨＡタグ化されているため、図８Ｂレーン８において、抗Ｈｉｓ ｍＡｂ ＷＢと交差反応しないことに留意のこと）。
これらの結果は、ＰＲ４（配列番号２６；ｃＤＮＡ配列番号６６）、特にＰＲ６（配列番号１８；ｃＤＮＡ配列番号５８）が工業的に妥当なレベルで製造可能であり得ることを示唆していた。それ故、出願人は、ＰＲ４およびＰＲ６の両方のバリアントを作出した。第一に、ＰＲ６（配列番号１８；ｃＤＮＡ配列番号５８）のＣ末端に見出される酸性ＨＡエピトープタグを６ｘＨｉｓタグに置換して、ＰＲ６１タンパク質融合物（配列番号１９；ｃＤＮＡ配列番号５９）を作出した。さらに、ＰＲ４の部分的タンパク質分解活性がＰＲ４タンパク質上にＭＭＰ２／９およびフューリン感受性リンカー（配列番号４８）が存在することに起因し得ると仮定した。この考えに沿って、培養中の細胞死の際に放出されたプロテアーゼは、ＰＲ４のそのリンカー配列番号４８を攻撃するであろう；かかるタンパク質分解活性は、当該分野で周知の問題である。したがって、ＨＡタグおよび配列番号４８をＰＲ４から除去し、他方では６ｘＨｉｓタグを末端に配置して、ＰＲ４０２を作出した（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）。
ＰＲ６１およびＰＲ４０２に対応する配列最適化ｃＤＮＡ（それぞれ、配列番号５９および６８）をｐＴＴ５（ｃＤＮＡ配列番号１７３；図６Ｃ）にクローン化し、組換えベクターをＣＨＯ－３Ｅ７細胞に一過性にトランスフェクトした。結果は、ＰＲ４０２が依然としていくらか分解され（図７；抗ＰＴＥＮおよびＨＳＡブロット；レーン７）、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）のかなりの部分がこの時点で培養上清中に推定分子量約１３０ＫＤａで分泌され得、これは明らかに中程度であるが、全体として工業的に（ｉｎｓｕｓｔｒｉａｌｌｙ）妥当な全長ＰＲ４０２レベルである（図７；特に、ポンソー染色；レーン７対１３）ことを実証していた。同様に、ＰＲ６を用いた出願人による結果から予想されるように、ＰＲ６１（配列番号１９；ｃＤＮＡ配列番号５９）は優れた絶対発現レベルに寄与し、この時点で抗６ｘＨｉｓでも検出可能となった（図７；ＷＢ、特にポンソー染色；レーン１対１３）。どちらの場合も、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）およびＰＲ６１（配列番号１９；ｃＤＮＡ配列番号５９）の両方の絶対レベルは、全ての非融合ＰＴＥＮ－Ｌバリアントおよび両方のＰＴＥＮ－Ｌ／Ｆｃ融合物が寄与する絶対レベルよりはるかに高く（図７；特にポンソー染色；レーン１、７対８～１３）、ＰＲ６１は再度ＰＲ４０２よりも遥かに高いレベルで発現された（図９も参照のこと）。
図８Ａから導かれる別の結論は、ＰＲ６のＮ’にＰＴＥＮ－Ｍ－固有ドメイン（ＭＵＤ；配列番号９）を含めると極めて安定なＰＲ６タンパク質がむしろ不安定なＰＲ３（配列番号１６；ｃＤＮＡ配列番号５６）融合物に崩壊することである。かかるプロフィールは、ＭＵＤを標的にしたＬＵＤ（配列番号５）の伸長による細胞内または細胞デブリ由来のタンパク質分解活性と一致する。そうだとしたら、ＰＲ６またはＰＲ６１にＬＵＤ配列を漸増的に付加すると、後者はプロテアーゼに感受性を示すようになるはずである。実際に、配列番号５１リンカー（ＬＵＤのａａ（４３～７９）に対応し、より広い細胞透過ドメイン（ＷＣＰＤ）と定義される）の、ＰＲ６１のＨＳＡ部分とＰＴＥＮ－Ｓ部分の間へのインフレームでの組み込みは、得られた融合物ＰＲ３１（配列番号２３；ｃＤＮＡ配列番号６３）を分解に感受性を示させるのに十分であった（図７；特に、ポンソー染色；レーン１、３、および１３）。ＰＴＥＮ－Ｌ（配列番号１）のＬｅｕ４３がＡｒｇリッチＭＣＰＤのすぐ上流のＰＴＥＮ－Ｎ（配列番号７）のイニシエーターアミノ酸でもあるので、ＰＲ３１と同様に、ＨＳＡ－ＰＴＥＮ－Ｎ融合物もタンパク質分解活性の影響を受けやすいと予測することができる。同様に、ＣＰＤ＊配列（配列番号５３、ＷＣＰＤの短鎖バージョンであり、ＬＵＤのａａ（４４～５９）に相当する）の付加は、得られた融合物ＰＲ６３（配列番号２１；ｃＤＮＡ配列番号６１）も分解に感受性を示させるのに十分である（図７；特に、ポンソー染色；レーン１～２対１３）。したがって、ＰＲ６またはＰＲ６１のＨＳＡ部分とＰＴＥＮ－Ｓ部分との間のＷＣＰＤ（配列番号５１）リンカー全体またはその欠損変異体（ＣＰＤ＊（配列番号５３）など）または最も可能性が高い最小の６Ａｒｇ部分のみ（別名ＭＣＰＤ；配列番号３９）の融合により、得られた融合物がＡｒｇリッチ配列を標的にするＭＣＰＤ標的プロテアーゼ（フューリンなど）に感受性を示すようになる（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ，２０１６；ＰＭＩＤ：２１５４１０４２）。それ故、ＷＣＰＤ含有融合物（ＰＲ３１（配列番号２３；ｃＤＮＡ配列番号６３）およびＰＲ６３（配列番号２１；ｃＤＮＡ配列番号６１）など）は、本質的に製造不可能である。対照的に、２つのＰＲ６１部分の間にインフレームで融合されるべきリンカーが配列番号５２の連続したアミノ酸を含む場合、得られた融合物（ＰＲ３２（配列番号２４；ｃＤＮＡ配列番号６４）およびＰＲ３３（配列番号２５；ｃＤＮＡ配列番号６５）など）は、切断から保護され、それ故、十分に製造可能である（図７；特に、ポンソー染色；レーン１対４～５および１３）。
また、ＡｒｇリッチＣＰＤ＊配列（配列番号５３；ｃＤＮＡ配列番号１７０）がフューリン様プロテアーゼ感受性を付与することを、ＣＰＤ＊を含むＰＲ４０２バリアント（すなわち、ＰＲ４０１（配列番号２７；ｃＤＮＡ配列番号６７）、ＰＲ４０３（配列番号２９；ｃＤＮＡ配列番号６９）、およびＰＲ４０４（配列番号３０；ｃＤＮＡ配列番号７０））を操作することによって確認した。実際に、主にフューリン様分解から保護されるＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）と対照的に、ＰＲ４０１、ＰＲ４０３、およびＰＲ４０４は、ＣＨＯ－３Ｅ７上清中で完全に分解された（図１０）。
ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）のフューリン様分解に対する予想外の耐性のために、出願人は、このプロテアーゼの阻害がＰＲ３変異体（配列番号１６；ｃＤＮＡ配列番号５６）も製造可能にする場合があるのかと考えた。そのために、非特異的および特異的なプロテアーゼ阻害剤の両方を試験した。図１１Ａは、クエン酸第二鉄またはプロテアーゼ阻害剤タブレットのような非特異的プロテアーゼ阻害剤がＰＲ３（配列番号１６；ｃＤＮＡ配列番号５６）およびＰＲ５（配列番号１７；ｃＤＮＡ配列番号５７）に最初に僅かな保護効果を示し（ＷＢ抗ＰＴＥＮ；３～４ｄｐｔ）、次いで、培養を継続するにつれて、不運なことに次第に喪失される（ポンソー染色；４～５ｄｐｔ）ことを示す。対照的に、ＰＲ６（配列番号１８；ｃＤＮＡ配列番号５８）は、両方のプロテアーゼ阻害剤処理に感受性を示さず、それ故、その発現は経時的に増加する（図１１Ａ、ＷＢ抗ＰＴＥＮ；非飽和画像および図１１Ａ；レーン１～１８）。細胞透過性フューリン触媒中心ペプチド阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃３４４９３０）での培養物の処理により、実際に、２ｄｐｔおよび６ｄｐｔの両方で細胞によって産生された全長ＰＲ３（配列番号１６；ｃＤＮＡ配列番号５６）の量が増加し（図１１Ｂ；レーン１～６対１３～１８）、それにも関わらず、細胞生存率の低下は認められなかった（図１１Ｂ、説明文）。対照的に、出願人の結果によって再度予測されるように、ＰＲ６（配列番号１８；ｃＤＮＡ配列番号５８）の発現は、フューリン阻害剤に対して感受性を示さず、経時的に増加した（図１１Ｂ；レーン７～１８）。アルブミン－ＰＴＥＮ－Ｌ融合物の切断を媒介するフューリンと一致して、大量に作製した全長ＰＲ１タンパク質（配列番号１４；ｃＤＮＡ配列番号５４）をゲルから切り出し、その後にＬＣ／ＭＳによって配列決定した場合、フューリンコンセンサス配列中の２つのアルギニン残基の間の切断部位をマッピングすることができた（図１１Ｃ）。最後に、ＰＲ３から推定フューリン切断部位を（すなわち、ＭＣＰＤの）遺伝子欠失すると、切断から保護される変異体（ＰＲ３４；配列番号５０；ｃＤＮＡ配列番号１３６）が得られた（図１１Ｄ）。これらの結果は、フューリンまたはフューリン様プロテアーゼがＬＵＤ（配列番号５）のおそらく６－Ａｒｇ最小細胞透過ドメイン（配列番号３９）を用いて切断することを実証している。
細胞株提供者Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙは、ノックアウトＨＡＰ１安定性細胞株を販売しており、それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集を使用してフューリンのコードエクソン中の２ｂｐを欠損させ、これらの細胞内のタンパク質を喪失させている（カタログＩＤ：ＨＺＧＨＣ００１３０２ｃ００１）。これは哺乳動物フューリンノックアウト細胞株の生成が絶対的な意味で可能であることを示す。そのようなものとして、出願人の開示に基づいて、当業者がＣＨＯ－３Ｅ７またはＨＥＫ２９３のフューリンノックアウト誘導体を生成することは容易であり、得られたフューリンノックアウト細胞株においてＰＴＥＮ－Ｌ融合物（ＰＲ３（配列番号１６；ｃＤＮＡ配列番号５６）、ＰＲ６３（配列番号２１；ｃＤＮＡ配列番号６１）、ＰＲ３１（配列番号２３；ｃＤＮＡ配列番号６３）、ＰＲ６２（配列番号２０；ｃＤＮＡ配列番号６０）；（図７、ポンソー染色を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない）の分泌が増加することが実証されるであろう。
ＰＲ４０２の発現レベルに及ぼす種々のシグナルペプチドの影響を査定するために、ＰＲ４０２のＨＳＡシグナルペプチド（配列番号９３）を、ヒト血漿中に大量に分泌されることが公知のタンパク質のシグナルペプチドに置換した（表１；配列番号９７～１０５）。そのようなものとして、ＰＲ４１９（配列番号１０９；ｃＤＮＡ配列番号１３７）、ＰＲ４２０（配列番号１１０；ｃＤＮＡ配列番号１３８）、ＰＲ４２１（配列番号１１１；ｃＤＮＡ配列番号１３９）、ＰＲ４２２（配列番号１１２；ｃＤＮＡ配列番号１４０）、ＰＲ４２４（配列番号１１３；ｃＤＮＡ配列番号１４１）、ＰＲ４２５（配列番号１１４；ｃＤＮＡ配列番号１４２）、ＰＲ４２６（配列番号１１５；ｃＤＮＡ配列番号１４３）、およびＰＲ４２７（配列番号１１６；ｃＤＮＡ配列番号１４４）を作出した。マウスＰＴＥＮ－Ｌを含むＰＲ４０２のマウス等価物（ＭＳＡシグナルペプチドによって駆動されるＭＳＡ）も構築した（ＰＲ４２８；配列番号１１７；ｃＤＮＡ配列番号１４５）。対応する発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞中で一過性にトランスフェクトし、培養上清中の外来タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出した（図１２Ａ）。全てのシグナルペプチドは、検出可能量の成熟ＰＲ４０２を指示することが見出された。しかしながら、ネイティブＨＳＡ（配列番号９３）、マウスα１－抗トリプシン（配列番号９９）、マウスＩｇＧκ鎖（配列番号１００）および、おそらく、ＭＳＡシグナルペプチド（配列番号９６）は、ゲルの目視によって評価した場合、総分泌タンパク質に関して、他の全てよりも最良なようであった（図１２Ａ）。（以下で考察するように、ＨＳＡシグナルペプチドは、ＰＲ４０２融合物（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）の正確な発現および切断も駆動し、これは、ＬＣ／ＭＳによって判断したところ、後者が予測される切断されたＰＲ４０２配列と９９．５％同一であるからである（図１９Ａ）。それ故、ネイティブＨＳＡシグナルペプチドは、本明細書中に開示の全てのＰＴＥＮタンパク質に好ましいリーダー配列である）。
出願人は、可溶性ＰＴＥＮ－Ｍが細菌中により大量に発現されることを以前に見出している（未発表の結果）。これは、哺乳動物細胞においてＰＴＥＮ－ＭがＰＴＥＮ－Ｌより大量に発現され得ることを示したＴｚａｎｉ ｅｔ ａｌ，２０１６：ＰＭＩＤ：２７２４９８１９の結果と一致する。しかしながら、ＰＴＥＮ－ＭがＨＳＡシグナルペプチドの下流に融合された場合は、正反対の結果となった。図１２Ｂは、予想外に、ＰＴＥＮ－Ｍ－ＨＳＡ融合物ＰＲ４１６（配列番号１２０；ｃＤＮＡ配列番号１４８）は、Ｎ末端のたった６個のアミノ酸しか欠かない場合でさえも、全く分泌できないのに対して、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）およびＰＲ４１５（配列番号１１９；ｃＤＮＡ配列番号１４７）は、同等な量で作製されることを示す。（ＰＲ４１５（配列番号１１９；ｃＤＮＡ配列番号１４７）およびＰＲ４１６（配列番号１２０；ｃＤＮＡ配列番号１４８）の両方は変異したスカベンジャーＨＳＡ Ｃｙｓ３４Ｓｅｒを保有することに留意のこと；しかしながら、図１２Ｂによれば、これはＰＲ４１５発現に大きな影響を及ぼさない）。したがって、ＨＳＡシグナルペプチド（配列番号９３）は、ＰＲ４０２を効果的に分泌させるためにＰＴＥＮ－Ｌの野生型Ｎ末端（野生型６ａａ配列ＳＥＳＰＶＴからなる；配列番号３を参照のこと）を必要とし、ＨＳＡシグナルペプチドは、この６ａａストレッチを欠くＰＴＥＮ－Ｍ末端（ＰＲ４１６バックグラウンド）に由来する分泌を媒介しない。しかしながら、逆に再度、ＰＴＥＮ－Ｌの始まりであるＳｅｒの上流に酸性エピトープタグ（ＨＡタグ）を含めると、ネイティブＨＳＡシグナルペプチドとさらに有効に相乗効果を示し、得られるバリアントＰＲ４０９（配列番号１１８；ｃＤＮＡ配列番号１４６）が有効に（それどころか、いくらか増加して）分泌される（図１２Ｃ；レーン１～２）。ＰＲ４０９（配列番号１１８；ｃＤＮＡ配列番号１４６）とＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）との間の発現の相違は依然として劇的ではないことから、ＰＴＥＮ－ＬのＮ末端の固有の６ａａストレッチをさらに操作したときにＰＲ４０２バックグラウンドにおける発現を増加させる見込みと、この操作によってＰＴＥＮ－Ｌのような天然に存在するタンパク質に免疫原性決定基が導入される可能性とのバランスをとる必要があることが示唆される。
別の実施形態では、ＰＴＥＮ－ＬのＣ’に配置することができ、得られた（ＰＲ４０２様）融合物の効率的な分泌を依然として媒介する最小アルブミンドメインを決定した。ＨＳＡのＦｃＲｎ結合ドメインｄＩＩＩのＨＳＡ Ｃ’を欠失させると、得られた融合物ＰＲ４１３（配列番号１２１；ｃＤＮＡ配列番号１４９）の全分泌が対照ＰＲ４０２レベルの約３０～４０％まで低下し（図１２Ｃ、レーン３対１および５）、それに対して、ドメインＩＩおよびＩＩＩをさらに欠失させると検出不可能な融合物（ＰＲ４１４；配列番号１２２；ｃＤＮＡ配列番号１５０）が得られた（図１２Ｃ、レーン４対１、３、および５）。対照的に、得られた融合物（ＰＲ４１７；配列番号１２３；ｃＤＮＡ配列番号１５１）（ＨＳＡの最初の３４ａａを欠く）およびＰＲ４１８（配列番号１２４；ｃＤＮＡ配列番号１５２）（ＨＳＡの最初の６２ａａを欠く）はＰＲ４０２と比較して識別不能なようであったので（図１２Ｄ）、ＨＳＡのＮ’からそのａａ６３までをさらに欠失させても効果はなかった。したがって、ＨＳＡ（配列番号１６３）のａａ（６３～３８５）またはより好ましくはａａ（６３～５８５）は、Ｎ’－ＰＴＥＮ－Ｌ－アルブミン－Ｃ’（ＰＲ４０２様）方向でＰＴＥＮ－Ｌを安定化させるのに十分な最小アルブミンドメインである。
追跡実験では、ＰＲ６１のＰＴＥＮ－Ｓおよびアルブミンドメインの相対配向を反転すると、融合タンパク質（ＰＲ６５、配列番号１２５；ｃＤＮＡ配列番号１５３）が得られ、この融合タンパク質は、ＷＢの過剰曝露によって微量しか検出することがでなかったので（図１３）、ＣＨＯ－３Ｅ７細胞によって本質的に分泌できず、それに対して２つのＰＴＥＮ－Ｓ部分とグリシンリンカーとの間にＭＵＤ（配列番号９）が挟まれた対照融合物（ＰＲ９１１、配列番号３７；ｃＤＮＡ配列番号７７）は全く発現されなかった（結果を示さず）。対照的に、ＰＲ６１（配列番号１９；ｃＤＮＡ配列番号５９）は、類似するＰＲ６１融合物と同様に、ＣＨＯ上清中で非常に高レベルで再度分泌され、それにより、ＨＳＡを、ＲＳＡ（ＰＲ６６；配列番号１２６；ｃＤＮＡ配列番号１５４）または野生型ＭＳＡ（ＰＲ６８；配列番号１２８；ｃＤＮＡ配列番号１５６）（図１３）のいずれかに置換している。意外にも、ＰＲ６７（配列番号１２７；ｃＤＮＡ配列番号１５５）（おそらくラットＦｃＲｎ（Ｓａｎｄ ｅｔ ａｌ，２０１５：ＰＭＩＤ：２５６７４０８３）に結合しないＲＳＡドメインＩＩＩ欠損変異体）は、ＰＲ４０２レベルの約３０％まででしかないＰＲ４１３（配列番号１２１；ｃＤＮＡ配列番号１４９）と対照的に（図１２Ｃ）、ＰＲ６１に匹敵するレベルで発現された（図１３）。したがって、アルブミンｄＩＩＩ、すなわち、一般に最小アルブミンドメイン（配列番号１６３）は、ＰＴＥＮ－Ｓ様融合物（例えば、ＰＲ６１；配列番号１９；ｃＤＮＡ配列番号５９）よりもむしろＰＴＥＮ－Ｌ様融合物（例えば、ＰＲ４０２；配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）の安定化に重要である。それにもかからず、ＨＳＡに融合するとＰＴＥＮ－Ｌ（例えば、ＰＲ４０２；配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）およびＰＴＥＮ－Ｓ（例えば、ＰＲ６１；配列番号１９；ｃＤＮＡ配列番号５９）の発現および分泌がより増大する分子機序が知られていないことに留意すべきである。ＰＴＥＮ－Ｌ／ＰＴＥＮ－ＳのＨＳＡとの潜在的な分子内相互作用がＰＲ４０２またはＰＲ６１の配向のいずれかで可能である一方で、α－フェトプロテイン（関連した構造のアルブミン様オンコプロテイン）が同一の条件下でＰＴＥＮ－Ｓと相互作用することができた（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ，２０１５；ＰＭＩＤ：２６０７８９４０）にもかかわらず、供局在化、免疫共沈、および分子ドッキング実験においてＨＳＡはＰＴＥＮ－Ｓに結合することができないことが以前に示されていた。
要約すれば、野生型ＰＴＥＮ－Ｌ腫瘍抑制因子を、主要な公知の工業発現系（大腸菌、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、酵母、ＣＨＯ／２９３細胞）のうちのいずれにおいても有意義に発現することができなかった。さらに、ＰＴＥＮ－Ｌをチオレドキシンに融合しても、いずれも相当量は分泌されない。同様に、ＰＴＥＮ－ＬのＦｃ抗体部分へのいずれの方向の融合も無益である。同様に、（例えば、ＰＲ３中の）ＨＳＡのＣ’でのＰＴＥＮ－Ｌの融合も得られた融合タンパク質が大きく分解され、いかなる製造目的にも合わない。対照的に、非常に驚いたことに、成熟ＨＳＡが続くＰＴＥＮ－ＬからなるＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）は、工業的に許容され得るレベルのタンパク質が得られ、このタンパク質はさらに最適化することによって改善することができ（例えば、シグナルペプチド選択レベルでの、主にフューリンプロテアーゼの下方制御による分解の防止または細胞培養物の灌流による）、それに対して、予想外に、ＰＲ４１６（配列番号１２０；ｃＤＮＡ配列番号１４８）（成熟ＨＳＡがつづく野生型ＰＴＥＮ－ＭからなるＰＲ４０２バリアント）は全く発現されなかった。さらに、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）およびそのバリアント（ＰＲ４、ＰＲ４０１）と全く対照的に、ＰＴＥＮ－Ｓにアルブミンが続く相同構築物ＰＲ６５（配列番号１２５；ｃＤＮＡ配列番号１５３）は、ＣＨＯ－３Ｅ７細胞によって本質的に分泌されず、これは、ＰＲ３（配列番号１６；ｃＤＮＡ配列番号５６）およびＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）を用いた出願人の結果に基づいて予想される結果と正反対である。対照的に、ＰＲ６１（配列番号１９；ｃＤＮＡ配列番号５９）およびＰＲ６（配列番号１８；ｃＤＮＡ配列番号５８）（共に、ＰＲ６５の逆バージョン）は、全く逆でありかつ非常に劇的に、非常に大量に分泌され、実質的に分解に耐性を示す。したがって、大規模の変異誘発後、出願人は、アルブミンがＰＴＥＮ－ＬおよびＰＴＥＮ－Ｓの両方に予想外に溶解するが、これはその都度逆方向に配置した場合に限る（図６Ａ）ことを実証した。ＰＴＥＮ－Ｌ／ＰＴＥＮ－Ｓ－ＨＳＡ融合物のこの顕著な矛盾の分子基盤の理解を助けるためには、さらなる生物物理研究および結晶学的研究が必要であろう。にもかかわらず、出願人の結果は、いかなる当業者にも予想できなかったはずである。
実施例２．切断可能なＰＴＥＮ－ＬおよびＰＴＥＮ－Ｓヒト血清アルブミン融合物の生成。
Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ、２０１３（ＰＭＩＤ：２３７４４７８１）は、皮下ヒト癌異種移植片を保有するマウスを外因性ＰＴＥＮ－Ｌで処置すると、ＰＴＥＮ－Ｌは癌の腫瘍細胞中だけでなく、正常マウス組織（肺および脳など）の細胞中にも見出された（ｐｉ３Ｋ経路の薬力学的バイオマーカーリン酸化の低下によって評価した場合）ことを報告していた。これは、ＰＴＥＮ－Ｌがｉｎ ｖｉｖｏで癌細胞と正常細胞を区別することができないことを示唆している。しかしながら、腫瘍抑制因子の癌細胞選択性は、癌組織で完全に異常な細胞外基質（ＥＣＭ）の状態に影響される可能性が高い。これは、癌細胞がその異常な成長を促進するために細胞外間隙中に種々の細胞内プロテアーゼを分泌するからである。例えば、フューリン、マトリックスメタロプロテアーゼスーパーファミリーのいくつかのメンバー（ゼラチナーゼ ＭＭＰ２／９など）、さらにリソソーム内プロテアーゼのカテプシンファミリーのいくつかのメンバー（カテプシンＢ（ＣＡＴＳＢ）など）は、正常組織と対照的に癌組織で高度に富化される（Ｂｒａｕｎ＆Ｓａｕｔｅｒ，２０１９：ＰＭＩＤ：３１４０６５７４；Ｊａｂｌｏｎｓｋａ－Ｔｒｙｐｕｃ ｅｔ ａｌ，２０１６：ＰＭＩＤ：２７０２８４７４；Ｖｉｄａｋ ｅｔ ａｌ，２０１９：ＰＭＩＤ：３０８９７８５８）；いくつかの場合、プロテアーゼ富化は、実際は癌進行中の癌細胞内のＰＴＥＮ自体の喪失に由来し得る（例えば、Ｌｉ Ｙ ｅｔ ａｌ，２０１８：ＰＭＩＤ：２９７０４４２７）。
出願人は、コンセンサスＭＭＰ２／９切断部位（配列番号１６５）を保有する３つのＰＲ（すなわち、ＰＲ２（配列番号１５；ｃＤＮＡ配列番号５５）、ＰＲ４（配列番号２６；ｃＤＮＡ配列番号６６）、およびＰＲ５（配列番号１７；ｃＤＮＡ配列番号５７））を最初に構築した。しかしながら、ＰＲ２（配列番号１５；ｃＤＮＡ配列番号５５）は、製造可能でないことが示されたため、そのＭＭＰ２／９消化に対するその感受性に取り組むことができなかった；それに対して、ＰＲ４（配列番号２６；ｃＤＮＡ配列番号６６）およびＰＲ５（配列番号１７；ｃＤＮＡ配列番号５７）はフューリン感受性リンカー（ＭＣＰＤ（配列番号３９）または配列番号１６４など）も含み、これは、上記で示すように、完全に分解させるのに十分でもある。それ故、製造可能性について配列番号１６５のＭＭＰ２／９切断性を査定するために、出願人はＰＲ４０５（配列番号１２９；ｃＤＮＡ配列番号１５７）を構築した。ＰＲ４０５は、ＰＲ４０５がＰＴＥＮ－ＬとＨＳＡとの間にインフレームで融合された配列番号１６５リンカーも含むことを除いて、全ての他の態様においてＰＲ４０２と同一である。図１４は、ＰＲ４０５（配列番号１２９；ｃＤＮＡ配列番号１５７）が製造可能であり、ＰＲ４０２のようにフューリン媒介分解に感受性を示さないようであることを実証している。全く対照的に、ＰＲ４０１（フューリンコンセンサス部位を有するリンカー配列を含むことを除いてＰＲ４０５と同一である（それぞれ、配列番号１６４対配列番号１６５））は、完全に分解される。したがって、ＰＲ４０２の２つの部分の間に挿入されたリンカーのタイプおよび配列は、得られた融合物の分解性およびそれによる製造可能性に劇的な影響を及ぼし、それに対して、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）およびＰＲ４０５（配列番号１２９；ｃＤＮＡ配列番号１５７）は、製造性が等価であり、共に製造可能である。
同様かつ別の実施形態では、出願人は、カテプシンＢ感受性リンカー（配列番号１０６～１０８）をＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）のＰＴＥＮ－ＬドメインとＨＳＡドメインとの間にインフレームで挿入して、それぞれＰＲ４０６（配列番号１３０；ｃＤＮＡ配列番号１５８）、ＰＲ４０７（配列番号１３１；ｃＤＮＡ配列番号１５９）、およびＰＲ４０８（配列番号１３２；ｃＤＮＡ配列番号１６０）を生成した。ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）およびＰＲ４０５（配列番号１２９；ｃＤＮＡ配列番号１５７）と同様に、ＰＲ４０６（配列番号１３０；ｃＤＮＡ配列番号１５８）、ＰＲ４０７（配列番号１３１；ｃＤＮＡ配列番号１５９）、およびＰＲ４０８（配列番号１３２；ｃＤＮＡ配列番号１６０）は全て、有意な分解が認められなかったので、製造可能であることが見出された（結果を示さず、図１５）。引き続いて、これら５つのタンパク質を、精製組換えＭＭＰ２およびＣＡＴＳＢを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイに供した。
材料と方法
ｐＴＴ５ベースのＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）、ＰＲ４０５（配列番号１２９；ｃＤＮＡ配列番号１５７）、ＰＲ４０６（配列番号１３０；ｃＤＮＡ配列番号１５８）、ＰＲ４０７（配列番号１３１；ｃＤＮＡ配列番号１５９）、およびＰＲ４０８（配列番号１３２；ｃＤＮＡ配列番号１６０）発現ベクターを、実施例１に記載のようにＣＨＯ－３Ｅ７細胞に一過性にトランスフェクトした。次いで、トランスフェクション５日後に得た９０μｌの粗培養上清を、１０μｌの１０ｘＭＭＰ２消化緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、１Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＣａＣｌ２）または１０ｘＣＡＴＳＢ（ｐＨ５．０）緩衝液（２００ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＤＴＴ（消化前に新たに添加））または１０ｘＣＡＴＳＢ（ｐＨ７．０）緩衝液（２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ ＤＴＴ（消化前に新たに添加））のいずれかと混合した。各々の１×緩衝液の最終ｐＨを、ｐＨ試験紙を用いて確認した。次いで、２０ｎＭ（最終）の組換え活性ＭＭＰ２プロテアーゼ（Ｅｎｚｏカタログ番号ＢＭＬ－ＳＥ２３７－００１０；１．２ｍｇ／ｍｌまたは３０μＭで提供）または０．３μｇ／ｍｌ（最終）活性ＣＡＴＳＢ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ＃７５８０－５；０．５ｍｇ／ｍｌで提供）を、各反応物に添加した。直後（ｔ＝０）または４時間後または２１時間後に、２４μｌの各消化反応物を、ＤＴＴを有する８μｌ試料緩衝液を含む個別のチューブに入れた。次いで、試料を７０℃で１０分間加熱し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードした。前に記載のように、ゲルを、Ｆ－１（抗ＰＴＥＮ）抗体およびＨＲＰ抱合二次抗体を用いてブロッティングした。
結果
図１５は、粗ＣＨＯ－３Ｅ７上清中のＰＲ４０６（配列番号１３０；ｃＤＮＡ配列番号１５８）、ＰＲ４０７（配列番号１３１；ｃＤＮＡ配列番号１５９）、およびＰＲ４０８（配列番号１３２；ｃＤＮＡ配列番号１６０）の発現がＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）の発現に類似していたことを示す。ＰＲ４０２は、組換えＭＭＰ２またはＣＡＴＳＢによってあまり切断されなかった。しかしながら、ＭＭＰ２はＰＲ４０５上のそのコンセンサス部位（配列番号１６５）のみを切断した；この切断によってＰＴＥＮ－Ｌ様断片（約７０ＫＤａ）が放出されたことが抗ＰＴＥＮ抗体を用いて同定された（図１５、星印）。ＰＲ４０５（配列番号１２９；ｃＤＮＡ配列番号１５７）はＣＡＴＳＢによって切断されず、配列番号１６５がＭＭＰ２に特異的であることを実証していた。対照的に、ＣＡＴＳＢは、ＰＲ４０７（配列番号１３１；ｃＤＮＡ配列番号１５９）およびＰＲ４０８（配列番号１３２；ｃＤＮＡ配列番号１６０）を切断して類似の量のＰＴＥＮ－Ｌ様断片を放出したが（全体の約２０％）、ＰＲ４０６（配列番号１３０；ｃＤＮＡ配列番号１５８）を切断しなかった。したがって、ＣＡＴＳＢは、好ましくは配列番号１０８のリンカーを含むか、より好ましくは配列番号１０７の最小リンカーを含むＰＴＥＮ－Ｌ－ＨＳＡ融合物に高度に特異的であり、ここで、前述のＣＡＴＳＢリンカーは、ＰＴＥＮ－ＬのＣ’とＨＳＡのＮ’との間にインフレームで挿入されている。顕著には、ＣＡＴＳＢはＰＲ４０７およびＰＲ４０８を低ｐＨ（癌組織周囲で生じることが公知の酸性ｐＨなど）でのみ切断する（図１５）。このことは、必要とする被験体に静脈内投与された循環ＰＴＥＮ－Ｌ－（ＣＡＴＳＢリンカー）－アルブミン融合物が癌部位で見出される酸性ｐＨで細胞外ＣＡＴＳＢによって切断され、それにより活性ＰＴＥＮ－Ｌを放出し、活性ＰＴＥＮ－Ｌがその最小細胞透過ドメイン（配列番号３９）を介して癌細胞を透過して癌細胞を死滅させると考えられるので、本発明の特に妥当な実施形態である。別の実施形態では、必要とする被験体に静脈内投与された循環ＰＴＥＮ－Ｌ－（ＭＭＰ２リンカー）－アルブミン融合物が、癌部位で大量に見出される細胞外ＭＭＰ２によって切断され、それにより活性ＰＴＥＮ－Ｌを放出し、活性ＰＴＥＮ－Ｌがその最小細胞透過ドメイン（配列番号３９）を介して癌細胞を透過して癌細胞を死滅させるであろう。
ＰＴＥＮ－Ｌ－（ＭＭＰ２／９切断性リンカー）－アルブミン融合物またはＰＴＥＮ－Ｌ－（ＣＡＴＳＢ切断性リンカー）－アルブミン融合物を、被験体（例えば、ヒト腫瘍異種移植片を保有するげっ歯類）に静脈内投与する。このげっ歯類動物モデルでは、ヒト腫瘍細胞株を、生物発光遺伝子（ルシフェラーゼなど）を発現するように操作する。１つの適切な操作された腫瘍細胞株は、ＰＴＥＮ－アルブミン融合物４Ｔ１－Ｌｕｃ応答性マウス乳癌細胞株である。それぞれ活性化可能な蛍光造影剤（ＭＭＰＳｅｎｓｅ６４５ ＦＡＳＴ（ＭＭＰ２／９）が含まれるが、これに限定されない）およびＣａｔ Ｂ６８０ ＦＡＳＴ（ＣＡＴＳＢ）プロテアーゼ感受性造影剤（ＦＡＳＴプラットフォーム、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を腫瘍細胞に同時投与した。腫瘍周囲領域での融合物に対するプロテアーゼ作用に起因する活性ＰＴＥＮ－Ｌの放出を同時に検出し、定量し、そして／または全く同一の癌部位で同時に作用するプロテアーゼ感受性プローブが寄与するイメージングと相関させる。一方、造影剤の蛍光強度は、活性ＰＴＥＮ－Ｌの放出、生体内分布、および腫瘍細胞への透過後に、アルブミン－ＰＴＥＮ融合物での被験体の処置の結果として、全く同一の癌部位内で同時のルシフェラーゼシグナル伝達の喪失とさらに相関し、それにより、全体として被験体における癌の腫瘍イメージングバイオマーカーとの融合物に対する被験体の（前）臨床的有効性と相関する。さらに別の実験では、インタクトなアルブミン－ＰＴＥＮ－Ｌ融合物またはアルブミン－ＰＴＥＮ－Ｓ融合物は、アルブミン－ＦｃＲｎ受容体系（ＰＴＥＮ－Ｌの場合にＬＵＤ媒介透過と協力的または相乗的に作用する）によって媒介された細胞透過によって癌細胞に取り込まれる。また、内在化されたアルブミン－ＰＴＥＮ融合タンパク質は、エンドソームまたはリソソームのＣＡＴＳＢによる切断後に細胞内で消化され、それにより、癌細胞内部に活性ＰＴＥＮタンパク質を放出し、癌細胞を死滅させる。
別の実験では、インタクトなアルブミン－ＰＴＥＮ－Ｌ融合物またはアルブミン－ＰＴＥＮ－Ｓ融合物を、ＭＭＰＳｅｎｓｅ６４５ ＦＡＳＴ（ＭＭＰ２／９）およびＣａｔ Ｂ６８０ ＦＡＳＴ（ＣＡＴＳＢ）プロテアーゼ感受性造影剤と同時投与する。内在化アルブミン－ＰＴＥＮ融合タンパク質は、アルブミン－ＦｃＲｎ受容体系によって媒介される細胞透過によって癌細胞に取り込まれ、一方で、内在化アルブミン－ＰＴＥＮ融合タンパク質は、エンドソームまたはリソソームのＣＡＴＳＢによる切断後に細胞内で消化され、それにより、癌細胞内部に活性ＰＴＥＮタンパク質を放出し、癌細胞を死滅させる。したがって、融合物の生体内分布、活性ＰＴＥＮの腫瘍細胞内への透過、融合薬物に対する被験体の（前）臨床的有効性応答は、被験体における腫瘍の癌周囲領域特異的イメージングバイオマーカーと直接かつ測定可能に相関される。以下から選択される癌関連プロテアーゼの適切な切断部位を含むリンカーを含むアルブミン－ＰＴＥＮ融合タンパク質も試験する：ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、ＢＡＣＥ、レニン、アスパラギン酸カテプシン（例えば、カテプシンＤ、カテプシンＥ）、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４）、システインカテプシン（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ）、システインプロテイナーゼ（例えば、クルジパイン、レグマイン、オツバイン－２、ＫＬＫ（例えば、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４）、メタロプロテイナーゼ（例えば、メプリン、ネプリライシン、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ－１）、ＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２３、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７）、セリンプロテアーゼ（例えば、活性化プロテインＣ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、チマーゼ）、凝固因子プロテアーゼ（例えば、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ）、エラスターゼ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球エラスターゼ、ラクトフェリン、マラプシン、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＡ、ｔＰＡ、トロンビン、トリプターゼ、ｕＰＡ、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）（例えば、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４）。１つの実験では、ＰＴＥＮ－アルブミン融合物の細胞内消化は、プロテアーゼ様フューリンによって媒介される。
実施例３．ＰＴＥＮヒト血清アルブミン融合物の製造および製造スカウティング。
動物起源ではなく、タンパク質を含まず、規定組成の培地中で成長させた１ＬＴのＣＨＯ－３Ｅ７細胞を、ｐＴＴ５－ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）で一過性にトランスフェクトし、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ＆Ｌｏｉｇｎｏｎ，２００９（ｐａｔｅｎｔｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｐａｔｅｎｔ／ＵＳ８６３７３１５）に正確に記載のように、懸濁培養液中にて３２℃で成長させた。細胞および培地を、トランスフェクション４日後に回収した。Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）によってアッセイした場合の回収時の生存率は７５．５％であった。上清を２ｍｌニッケル－セファロースカラムに直接ロードした。カラムの通過画分（９５０ｍｌ）を回収し、カラムを１２ｍｌの（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ７．０））緩衝液で最初に洗浄し、次いで、１２ｍｌの（３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ７．０））緩衝液で洗浄した。（３００ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）を用いた０．５ｍｌの画分中にＰＲ４０２が溶離された。タンパク質（Ｎａｎｏｖｕｅによって判断した場合）を含む最良の画分（番号４～１５）をプールし、ＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））中で脱塩し、濾過滅菌し、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって定量し、等分し、－８０℃で凍結した。図１６に示すように、ＰＲ４０２の一部（１３０ＫＤａ）が通過画分中に残留し（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、レーン１～２）、それに対して、いくらかの夾雑物および分解産物も最終的な半精製調製物中に存在した（レーン５および６；試料を、それぞれ還元および非還元のＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動した）。したがって、６ｘＨｉｓでタグ化したＰＴＥＮアルブミン融合物を、ＩＭＡＣを用いて純度約５０％まで精製することができる。
別の実施形態では、ｐＴＴ５－ＰＲ４０５（配列番号１２９；ｃＤＮＡ配列番号１５７）を、懸濁培地中で５日間成長させた４０ｍｌのＨＥＫ２９３細胞中に一過性にトランスフェクトした。次いで、上清を４体積（１６０ｍｌ）の緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム；１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ５．８））で希釈し、次いで、１ｍｌのＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅセファロース（ＧＥ ＨｉＴｒａｐ（商標）ＢｌｕｅＨＰ）カラムにロードした。カラムを８ｍｌ緩衝液Ａで洗浄し、結合したタンパク質を、以下の２工程で溶離した：最初に、８ｍｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム；２ｍＭ ＤＴＴ、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ５．８））を添加し、それにより、各４ｍｌの７つの画分を回収すること；次いで、８ｍｌの緩衝液Ｃ（２０ｍＭリン酸ナトリウム；２ｍＭ ＤＴＴ、２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ５．８））を添加し、それにより、各約５ｍｌの６つの画分を回収すること。各画分のアリコートをＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードし、ゲルを、抗６ｘＨｉｓ抗体を用いてブロッティングした。
図１７Ａに認められるように、ＰＲ４０５は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅに定量的に結合した（レーン１および２）。次いで、ＰＲ４０５を、１Ｍ ＮａＣｌ超から２Ｍ ＮａＣｌまででカラムから溶離することができる（レーン３～１３）。Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ染料がアルブミンに対する親和性が高いという事実から予想されるように、６０～６５ＫＤａのアルブミン分解物（成熟ＨＳＡのサイズに類似し、ＰＲ４０５融合物の２つの主なドメインへの分解と一致する）もカラムに結合し、溶離することができる（図１７Ａ、クロス）。しかしながら、アルブミン分解物を、以下のようにヘパリン－アフィニティクロマトグラフィによってその後に除去することができる。
Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅカラム溶離物の画分６～１３をプールし、緩衝液Ｄ（２０ｍＭリン酸ナトリウム；０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ６．１））中で一晩透析した。次いで、透析された溶液を、緩衝液Ｄ中で平衡化した１ｍｌのヘパリン－セファロース６Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）にロードした。カラムを、８カラム体積（ＣＶ）の緩衝液Ｄで洗浄し、次いで、以下の２工程のＮａＣｌで溶離した；最初に、５ＣＶの緩衝液Ｅ（２０ｍＭ リン酸ナトリウム；１．０Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ６．１））を適用し、次いで、５ＣＶの緩衝液Ｆ（２０ｍＭリン酸ナトリウム；２．０Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ６．１））を適用すること。各画分のアリコートをＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードし、ゲルを、抗６ｘＨｉｓ抗体を用いてブロッティングした。図１７Ｂに示すように、アルブミン分解物の大部分がヘパリンから排除され（レーン３～５）、ヘここで、約１Ｍ ＮａＣｌでヘパリンからＰＲ４０５を実質的に富化された形態で溶離することができる（図１７Ｂ、レーン６～１１および図１７Ｃ）。
両方のカラムからＰＲ４０５を溶離するために高塩濃度が必要であることを考慮して、洗浄緩衝液のＮａＣｌ濃度が０．７５ＭになるまでＮａＣｌを添加すると（またはホフマイスターシリーズに従ったＮａＣｌより強い塩の使用）、宿主細胞タンパク質のより効率的な除去が容易になり（図１７Ａ、レーン３～１４）、精製すべきＰＴＥＮタンパク質融合物がより富化されることが予想される。
別の実施形態では、ある程度時間を経た（－２０℃で維持した８ヶ月間のバッチ）ＰＲ４０２のＩＭＡＣ精製試料（上記を参照のこと）を、（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）、２．２Ｍ ＮａＣｌ）緩衝液に透析し、次いで、同一の緩衝液で予め平衡化した５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ（商標）フェニル（Ｌｏｗ Ｓｕｂ ＦＦ）疎水性相互作用クロマトグラフィ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）に吸着させた。カラムを、結合緩衝液で２回洗浄し、結合したタンパク質を５ＣＶの（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８））で溶離した。出発物質、通過画分、洗浄液、および溶離物のアリコートをＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードした；ゲルを、抗Ｈｉｓを用いてブロッティングした。図１８に示すように、ＰＲ４０２はカラムに定量的に結合することができ、カラムからＰＲ４０２を、イオン強度の低下によって溶離することができる。
１つの実施形態では、精製すべきアルブミンＰＴＥＮ融合タンパク質を、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅアフィニティクロマトグラフィによって捕捉し、高塩濃度で溶離し、透析し、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィに結合させる。
別の実施形態では、ＰＴＥＮ融合タンパク質を、製造者が公開した説明書にしたがってＡｌｂｕｐｕｒｅアフィニティクロマトグラフィ（ＰｒｏＭｅｔｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ，ＵＫ）によって捕捉し、ここで、Ａｌｂｕｐｕｒｅアフィニティクロマトグラフィは、特許請求の範囲に記載のＰＴＥＮ融合タンパク質のようなアルブミン融合物が高度に富化されるように精製するように開発されている。
別の実施形態では、ＰＴＥＮ融合タンパク質を、以下からなる一連のカラムを使用することによって直交性に精製する：アルブミン分解物がカラム通過画分中で除去されるような、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質の捕捉、高塩濃度（およそ０．７５Ｍ ＮａＣｌ）での融合タンパク質の溶離；Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅアフィニティクロマトグラフィへの溶離物の直接的な吸着、約２Ｍ ＮａＣｌでのＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅからの融合物の溶離；その後のフェニルセファロース疎水性相互作用 クロマトグラフィへの溶離物の直接吸着（この吸着から、ＰＴＥＮ融合タンパク質を低／生理学的塩濃度で溶離し、薬学的に許容され得る緩衝液に移すことができる）。
ＰＲ４０２の経時調製物が凝集体を含んでいたとしても、図１６の新たに製造したＰＲ４０２のバッチは、還元および非還元のゲル電気泳動の両方で１２０～１３０ＫＤａの単量体として移動し、それにより、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上に認められる高ＭＷバントは、これらのバンドが抗ＰＴＥＮＷＢによって可視化されないので、凝集体ではなく夾雑物のようである（図１６）。これは、アルブミン－ＰＴＥＮ融合物のネイティブ状態が単量体であることを示唆している。
当該分野の標準的な手順にしたがって、１３０ＫＤａの主なバンドを図１６のゲルから切り出し、溶解し、トリプシンまたはキモトリプシンで消化し、ＬＣ／ＭＳによって配列決定した（図１９）。結果は、予想配列（配列番号２８）と完全に（９９．６％）適合していた。非常に重要なことに、Ｎ末端ペプチド（ＳＥＳＰ…ＰＰＴＲ）（図１９Ａを参照のこと）が同定され（成熟ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）の所望のＮ末端配列が確認される）、それにより、ＨＳＡシグナルペプチド（配列番号９３）がＥＲおよびＴＧＮによる融合タンパク質の正確な翻訳、その後のＣＨＯ細胞の上清中の成熟ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）の切断および分泌を媒介することができることが示唆される。
ＬＣ／ＭＳによってアッセイした場合にＰＲ４０２のいくつかのメチオニン残基が酸化されていることが見出され、還元形態と非還元形態との間に１０ＫＤａの移動度の相違があることに寄与し得る（図１６、レーン５～６）。さらに、７つのＡｓｎ残基は、脱アミド化されていることが見出され、これはＰＲ４０２を精製するために使用された弱アルカリ性の緩衝液（ＴＮＥ（ｐＨ７．４））中のこの残基の予想される挙動と一致する（図１６）。
ＰＴＥＮ－Ｌを工業的に妥当な形態で細菌中に系統的に製造することができず、さらに、物理化学的観点および薬物動態学的／腎クリアランス観点の両方から、高等な種で見出されるＮ－結合およびＯ－結合グリコシル化が（細菌内で発現された）タンパク質を安定化し得ることが知られているので、出願人は、ＬＵＤ（配列番号５）を重視してＰＲ４０２の糖修飾も決定した。以前にバイオインフォマティクスによって予測されていたように（Ｍａｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ，２０１３：ＰＭＩＤ：２４０５６７２７）、ＰＲ４０２のＬＵＤは、重度にＯ－グリコシル化されていることが見出された。しかしながら、実際のＯ－糖保有残基は、Ｍａｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．によって予想されたものと実質的に異なっていた。具体的には、ＰＲ４０２ ＬＵＤ（配列番号５）は、以下の９つのＬＵＤ残基上にいくつかのムチン様Ｏ－結合グリカン（Ｔｎ、Ｔｆ、シアリル－Ｔ、およびジシアリルＴ構造など）を含むことが見出された（これらのグリカン修飾の概説については、Ｋｕｄｅｌｋａ ｅｔ ａｌ，２０１５；ＰＭＩＤ：２５７２７１４６を参照のこと）（配列番号１の後に番号を付けている）：Ｓ６５、Ｓ８５、Ｓ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６４、およびＳ１６８（図１９Ｂ）。
これらのＯ－グリカンが実際にＬＵＤを代表するのかを確認するために、本出願人は、ＰＴＥＮ－Ｓの代わりにｐ５３ 腫瘍抑制因子を発現するＦ１３７（配列番号１３３；ｃＤＮＡ配列番号１６１）を構築し、ここで、Ｆ１３７のｐ５３ドメインは、ＰＲ４０２バックボーン内の同一の位置および方法に正確に配置されている。Ｆ１３７を、図１６に示すようにＩＭＡＣによって精製した（結果を示さず）。単量体Ｆ１３７融合タンパク質を、上記のようにゲルから切り出し、ＬＣ／ＭＳを用いて配列決定した。Ｆ１３７ ＬＵＤが、Ｓ１３５を除いて、ＬＵＤの同一の残基に類似のＯ－グリカン修飾を有することが見出された（図１９Ｂ）。さらに、Ｆ１３７ ＬＵＤは、４つのさらなるＯ－糖部位を有しており（図１９Ｂ）、これはＰＲ４０２ ＬＵＤには存在しない。したがって、ヒトＬＵＤは、いくつかの残基が天然にＯ－グリコシル化されているようである（主にＳ６５、Ｓ８５、Ｓ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６４、およびＳ１６８が含まれるが、これらに限定されない）。対照的に、昆虫細胞中でＰＴＥＮ－Ｌ融合物が発現すると（図５）、Ｏ－グリカンプロフィールが完全に異常かつ有意に低くなる（図１９Ｂ）。そのようなものとして、昆虫ＰＴＥＮ－Ｌ融合物が製造可能であったとしても、被験体に注射した際に免疫原性を有意に生じるであろう。
別の態様では、ＰＲ４０２ ＬＵＤ上に高度に硫酸化されたＯ－グリカンアンテナが存在すると局所的にいくらかの負電荷が導入されることが予測され、実際に野生型ＬＵＤの有効ｐＩ（１１．５５と予想される）をＰＴＥＮ－ＳのｐＩ（５．９４である）に大きく低下させるであろう。かかる実施形態では、Ｓ６５、Ｓ８５、Ｓ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６４、およびＳ１６８がアスパラギン酸またはグルタミン酸に同時に変異すると、単独のｐＩ９．２９を有する変異したヒトＬＵＤ（配列番号１３４）が得られると考えられ、ＰＴＥＮ－Ｓ（配列番号２）に融合した場合には、計算値がｐＩ６．３３の「シアル化様」ＰＴＥＮ－Ｌが得られるであろう。
別の実施形態では、Ｓ６５、Ｓ８５、Ｓ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６４、およびＳ１６８のアスパラギン酸またはグルタミン酸への変異を、結果として得られる細菌が発現したタンパク質をヒトに近づけて実質的に物理化学的により安定になるように細菌発現ベクターにおいて操作することができる。
他の実施形態では、Ｏ－グリカンを保有するＬＵＤ残基のうちの１つ、２つ、またはそれを超えるか、全てを、アスパラギン酸またはグルタミン酸に変異させ、それにより、得られたヒトタンパク質のｐＩが低下してその薬物動態学的性質が改善される場合があり、ここで、前述の変異すべき残基は、配列番号１のＳ６５、Ｓ８５、Ｓ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６４、およびＳ１６８から選択される。
別の態様では、出願人は、ＰＲ４０２のＰＴＥＮ－Ｓ部分の潜在的なグリコシル化部位を決定した。図１９Ｃに示すように、ＬＵＤと同様に、ＰＲ４０２バックグラウンドにおいてＣＨＯ－３Ｅ７細胞中に発現されたＰＴＥＮ－Ｓも、ＬＵＤよりはるかに小さな程度であるが、Ｏ－グリコシル化される。ＰＴＥＮ－Ｓテール（ａａ３５０～４０３；ＰＴＥＮ－Ｓナンバリング；配列番号２）は、ほとんどのＯ－結合部位を保有し、これはテールの制御活性と一致している。さらに、Ｎ２９２（ＰＴＥＮ－Ｓナンバリング）は、４つの類似するＮ－グリカンで修飾されており；かかるＮ結合構造は、ＣＨＯ細胞中に発現されたタンパク質で時折認められる。しかしながら、ＰＴＥＮ－Ｓに関する論文が膨大に存在するにもかかわらず、ＰＴＥＮ－ＳのＮ２９２がタンパク質安定性または癌に関与または関連する可能性についての報告はなく、この残基が必要に応じてＯ－グリカンの不均一性を軽減するように変異される可能性があり、それにより、ＰＲ４０２様融合物またはＰＲ６１様融合物の分析プロセスの開発を容易にする可能性があることを示唆している。
実施例４．ＰＴＥＮアルブミン融合タンパク質は機能的な細胞透過性腫瘍抑制因子である。
次いで、本出願人は、本明細書中に開示のＰＴＥＮアルブミン融合物が腫瘍抑制因子機能を有するのかどうかを判定した。
１つの実施形態では、ＰＲ５（配列番号１７；ｃＤＮＡ配列番号５７）または偽トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞のいずれか由来の工業基準と比較して非常に不十分な（すなわち、精製度が非常に低く、希薄で、デブリを含有する）上清（図８Ｂを参照のこと）を、ＫＴＯＳＡ（ＰＴＥＮヌル癌細胞株（図２０Ａ、上のパネルの左側））またはＰＴＥＮ－Ｌを明らかに依然として発現するＲＥＭ１３４（ＰＴＥＮ－Ｓ－ヌル癌細胞株）の表面上に４時間直接配置した。次いで、細胞を、洗浄し、溶解し、細胞抽出物を表示の抗体を用いてブロッティングした（図２０Ａ）。ＰＲ５上清中に含まれる７０ＫＤａのＰＴＥＮ－Ｍ様タンパク質（図８Ｂを参照のこと）が両方の細胞株に侵入したことが見出された（図２０Ａ；上のパネル、中央）。このＰＲ５が生成したＰＴＥＮ－Ｍは、内因性ＲＥＭ１３４ ＰＴＥＮ－Ｌタンパク質の直下の予想されるＭＷ（約７０ＫＤａ）に移動しているので、全長であると考えられる。ＲＥＭ１３４細胞抽出物は、およそ６５ＫＤａの２つのさらなるバンドを含んでおり、ＫＴＯＳＡライセート中に等価なバンドが存在しないので、これらのバンドは、外因性ＰＴＥＮ－Ｍの分解産物の可能性が高い。ＰＲ５が放出した細胞透過成分ＰＴＥＮ－Ｍが、ＲＥＭ１３４細胞におけるｐＳ６Ｋリン酸化の検出可能な下方制御を媒介したことが重要である（ｐＳ６Ｋは、外因性に適用したＰＴＥＮ－Ｌタンパク質薬の公知の薬力学的（ＰＤ）標的である；Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，２０１３：ＰＭＩＤ：２３７４４７８１）。ＰＴＥＮ－ＭのこのＰＤ効果は、この実験で使用したＰＲ５上清が本質的にＨＳＡのみを含み、ＰＴＥＮ－Ｍをほとんど含まなかったことを考慮した場合に、より顕著となる（図２０Ａ、下のパネル）。したがって、微量の細胞透過性ＰＴＥＮが癌細胞において有意な薬力学的効果を発揮し得る。
１つの実施形態では、被験体において標的癌細胞の薬力学を好ましく制御する外因性の細胞透過性ＰＴＥＮ（ＰＴＥＮ－ＬおよびＰＴＥＮ－Ｍなど）を放出するＰＴＥＮ－アルブミン融合物は、ＰＲ４０５（配列番号１２９；ｃＤＮＡ配列番号１５７）であり、ここで、前述の融合物は被験体の血中を循環し、ＭＭＰ２／９のようなプロテアーゼの作用によって細胞透過性ＰＴＥＮに分解され、ここで、かかるプロテアーゼは、被験体の癌周辺組織に豊富に存在するが、被験体の正常組織中では遥かに少ない。
別の実施形態では、被験体において標的癌細胞の薬力学を好ましく制御する外因性の細胞透過性ＰＴＥＮ（ＰＴＥＮ－ＬおよびＰＴＥＮ－Ｍなど）を放出するＰＴＥＮ－アルブミン融合物は、ＰＲ４０７（配列番号１３１；ｃＤＮＡ配列番号１５９）またはＰＲ４０８（配列番号１３２；ｃＤＮＡ配列番号１６０）であり、ここで、前述の融合物は被験体の血中を循環し、カテプシンＢのようなプロテアーゼの作用によって細胞透過性ＰＴＥＮに分解され、ここで、かかるプロテアーゼは、被験体の酸性癌周辺組織に豊富に存在するが、被験体の弱アルカリ性の生理学的に正常な組織中では遥かに少ない。
別の実施形態では、被験体に投与したＰＴＥＮ－アルブミン融合物がＰＴＥＮ－ＬおよびＰＴＥＮ－Ｍなどの融合物から外因性の細胞透過性ＰＴＥＮを放出し、それにより被験体における標的癌細胞薬力学を好ましく制御する対象プロテアーゼは、以下から選択されるプロテアーゼである：ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、ＢＡＣＥ、レニン）、アスパラギン酸カテプシン（例えば、カテプシンＤ、カテプシンＥ）、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４）、システインカテプシン（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ）、システインプロテイナーゼ（例えば、クルジパイン、レグマイン、オツバイン－２）、ＫＬＫ（例えば、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４）、メタロプロテイナーゼ（例えば、メプリン、ネプリライシン、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ－１）、ＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２３、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７）、セリンプロテアーゼ（例えば、活性化プロテインＣ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、チマーゼ）、凝固因子プロテアーゼ（例えば、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ）、エラスターゼ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球エラスターゼ、ラクトフェリン、マラプシン、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＡ、ｔＰＡ、トロンビン、トリプターゼ、ｕＰＡ、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）（例えば、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、およびＴＭＰＲＳＳ４）。
別の実験では、インタクトなアルブミン－ＰＴＥＮ－Ｌ融合物またはアルブミン－ＰＴＥＮ－Ｓ融合物を、ＭＭＰＳｅｎｓｅ６４５ ＦＡＳＴ（ＭＭＰ２／９）およびＣａｔ Ｂ６８０ ＦＡＳＴ（ＣＡＴＳＢ）プロテアーゼ感受性造影剤と同時投与する。内在化されたアルブミン－ＰＴＥＮ融合タンパク質は、アルブミン－ＦｃＲｎ受容体系（すなわち、ＰＴＥＮ－Ｌの細胞透過ドメイン）によって媒介される細胞透過を介して癌細胞によって取り込まれ、一方で、内在化されたアルブミン－ＰＴＥＮ融合タンパク質は、エンドソームまたはリソソームのＣＡＴＳＢによる切断後に細胞内で消化され、それにより、癌細胞内部に活性ＰＴＥＮタンパク質を放出し、癌細胞を死滅させる。融合物の生体内分布、活性ＰＴＥＮの腫瘍細胞内への透過、融合薬物に対する被験体の（前）臨床的有効性応答を、被験体における腫瘍の癌周囲領域特異的イメージングバイオマーカーと直接または測定可能に相関させる。別の実験では、アルブミンＰＴＥＮ融合物によって誘発された認められたＰＤ効果が測定可能かつ明白な腫瘍抑制因子の効果（癌細胞死など）とも相関するかどうかを査定するために、本出願人は、ＰＴＥＮヌルのＰＣ３ヒト前立腺癌細胞株における細胞ベースのアッセイを設定した。腫瘍抑制因子が癌細胞を死滅させる１つの方法は、不活性な細胞質のプロ－カスパーゼ３酵素を切断してより小型のアポトーシスを実行するＣＡＳＰ３酵素を放出することによってアポトーシスを開始させ、次いで、アポトーシスによって細胞が細胞自体を破壊するように指示することである。この性質は、種々の市販の細胞ベースのアッセイキットで利用されており、それにより、ルシフェラーゼでタグ化されたアポトーシス性のＣＡＳＰ３酵素またはＣＡＳＰ７酵素の活性化を、照度計によって細胞ライセート中で定量的に測定することができる。
出願人の結果から予想されるように、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）が４時間または２４時間の細胞の処置後にＰＣ３細胞に実際に侵入することが最初に確認された（図２０Ｂ、レーン１対４および７対１０）。その後に、カスパーゼ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ，カタログ番号Ｇ８０９０）を、以下のように、ＰＲ４０２媒介性癌細胞死が測定されるように最適化した：１０％ＦＢＳを補足したＦ１２Ｋ培地中で成長している６００個のＰＣ－３細胞を、９６ウェルプレート中の同一の培地にプレーとし、一晩培養した。翌日に、培地を除去し、０．１ｍｌの（Ｆ１２Ｋ＋０．５％ＦＢＳ；すなわち、無血清）培地に置換した。次いで、ＰＲ４０２を適切な濃度でおよび所望の時間（典型的には、１～４時間）で細胞に添加した。インキュベーションの終了時に、薬物溶液を除去し、細胞を０．２ｍｌの無血清培地で２回洗浄し、次いで、室温で静置した。次いで、製造者の説明書にしたがって調製した０．１ｍｌのカスパーゼ３／７ Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加した。ウェルを穏やかに振盪し、室温で３０分間さらにインキュベートして、細胞を溶解させた。各試料ライセートの発光シグナルを、プレートリーダーを使用して三連で測定した。全測定値からブランク値を差し引いた。
このプロトコールを使用して、本出願人は、驚いたことに、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）融合物の２つの個別のバッチ（両方を実施例３に従って製造）をＰＣ３細胞と接触させた場合に、これらのバッチは類似のレベルでＣＡＳＰ３／７を頑強に活性化させたことが見出された（図２０Ｃ）。実際に、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）は、アポトーシスを開始させるために必要とされる細胞単層との接触時間がたった１時間であるようであり、それにより、より長い時間にわたってインキュベートしても細胞死のさらなる増強は大きくはならなかった（すなわち、４時間まで）（図２０Ｃ）。そのＰＣ３細胞死滅能と一致して、外因性ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）は、他のＰＴＥＮヌル細胞（ＳＫ－ＭＥＬ－２８（黒色腫；図２０Ｄ）、ＭＳＴＯ－２１１（中皮腫）、およびＡ２７８０（卵巣癌）など）の細胞死も開始させることが見出された（結果を示さず）。
ｐａｎ－ＰＴＥＮ抗体（１３８Ｇ６およびＳＰ２１８など）を用いたＰＴＥＮの免疫組織化学的反応（Ｈスコアと呼ばれ、Ｈ＜２０）の完全な非存在によってアッセイした場合に、全癌患者の約３０～５０％が、適応症と無関係に、ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子が全く存在しない（Ｐｕｌｉｄｏ ｅｔ ａｌ，２０１９；ＰＭＩＤ：３１５０１２６５）。その一部について、一見したところ正常なＨスコアを有する患者は、機能不全（ｄｙｓｆｕｎｔｉｏｎａｌ）または不活化またはさらには癌促進性のＰＴＥＮバリアントを依然として含み得る。後者の表現型は、典型的には、ＰＴＥＮタンパク質上の点変異によって生成され、共に抗体ベースの方法による検出が非常に困難であり、ＰＴＥＮヌル表現型よりも処置がより困難である可能性もある（Ｌｅｓｌｉｅ＆Ｌｏｎｇｙ，２０１６：ＰＭＩＤ：２６８２７７９３）。しかしながら、図２０Ｅに示すように、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）は、見かけ上正常な内因性ＰＴＥＮを有する癌細胞株（４Ｔ１マウストリプルネガティブ乳癌（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，２０１３；ＰＭＩＤ：２３９５１１７２）およびＩＤ－８マウス卵巣癌など）の細胞死も開始させる。したがって、本明細書中に提供されたＰＴＥＮアルブミン融合物は、被験体の内因性ＰＴＥＮタンパク質の潜在的状態と無関係に癌細胞を死滅させることができる。
別の態様では、出願人は、驚いたことに、ＰＲ６１を含有するＣＨＯ－３Ｅ７上清をＰＣ３細胞単層と２時間接触させた場合に、比較的大量のＰＲ６１（配列番号１９；ｃＤＮＡ配列番号５９）を細胞に侵入させることができ、それに対して、対照の空ベクター（すなわち、ｐＴＴ５；配列番号１７３）をトランスフェクトしたＣＨＯ－３Ｅ７上清は抗６ｘＨｉｓ免疫反応性を示さなかった（図２０Ｆ、上のパネル、レーン２対４）。その上、ＰＲ６１（配列番号１９；ｃＤＮＡ配列番号５９）は、ＣＡＳＰ３／７の活性化によって測定した場合に、細胞死を開始させることができた（図２０Ｆ、下のパネル）。ＰＴＥＮ－Ｓに細胞透過能があることは知られていなかったので、後者は、アルブミンによって媒介されているに違いない。どのアルブミンドメインがＰＲ６１様融合物の細胞侵入を担うのかを試験するために、ＰＲ６７（配列番号１２７；ｃＤＮＡ配列番号１５５）およびＰＲ６８（配列番号１２８；ｃＤＮＡ配列番号１５６）をＩＭＡＣによって半精製し、次いで、ＰＣ３細胞に接触させた。図２０Ｇに示すように、非常に驚いたことに、両方の融合物が１時間のインキュベーション以内にＰＣ３細胞に侵入した。したがって、ＰＲ６１様およびＰＲ６７様のＨＳＡ－ＰＴＥＮ－Ｓ融合物は、癌細胞に侵入して癌細胞を死滅させることができる。さらに、最小ヒト血清アルブミンドメイン（配列番号１６３）は、ＰＲ６１様融合物（ＰＲ６７（配列番号１２７；ｃＤＮＡ配列番号１５５）およびＰＲ６８（配列番号１２８；ｃＤＮＡ配列番号１５６）が含まれるが、これらに限定されない）の機能的（抗癌）特性を媒介するのに十分である。
アルブミンｄＩＩＩは、ＰＴＥＮ－Ｓ融合物（ＰＲ６７など；図１３および２０Ｇ）の安定化および細胞侵入の両方に関して見かけ上冗長である。対照的に、ｄＩＩＩは、ＰＲ４０２を最大限安定化するのに必要であり、それに対して、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）は、ｄＩＩを除去した場合にもさらにより安定化される（図１２Ｃ、ＰＲ４１３、ＰＲ４１４）。したがって、アルブミンは、類似するが、異なる方法でＰＴＥＮ－ＳおよびＰＴＥＮ－Ｌと相互作用し、この相互作用は、当業者が実験前には予測することができなかった。
さらに別の態様では、アルブミン－ＰＴＥＮ－Ｌ融合物の、野生型の非融合ＰＴＥＮ－Ｌと比較した相対的な細胞傷害能を決定することができないので（（後者を可溶性形態および純粋な形態で合成することができないため（図１～５および７を参照のこと））、本出願人は、その代わりに、ＣＡＳＰ３／７アッセイにおいて、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）をＦ１３７（配列番号１３３；ｃＤＮＡ配列番号１６１）と比較した。両方の融合物がパートナーとしてのアルブミンを同一の相対的位置に含むので、かかる比較の方が納得がいく。図２０Ｆに示すように、同量のＩＭＡＣ精製ＰＲ４０２は、類似のレベルのＰＣ３細胞死を開始させるようである。図１９の構造の結果を考慮して、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）とＦ１３７（配列番号１３３；ｃＤＮＡ配列番号１６１）は生物学的機能が等価であるようである。まとめると、図２０は、本明細書中に開示のアルブミン－ＰＴＥＮ－Ｌ融合物が癌細胞の内部に機能的なＰＴＥＮ腫瘍抑制因子を迅速に送達させ、それにより、薬力学的（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｍａｎｉｃ）マーカーが好ましく制御されるだけでなく、アポトーシスによる癌細胞死も得られ、後者は、機能的腫瘍抑制因子の最も重要な性質であることを実証している。したがって、本発明は、インタクトな腫瘍抑制因子機能を有する製造可能な細胞性アルブミン－ＰＴＥＮ融合物を提供することによって、ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子タンパク質が癌細胞膜に形質導入できないという問題を解決した。
他の実験では、外因性ＰＴＥＮ－Ｌが腫瘍小結節内のＣＡＳＰ３／７活性化を誘導し、それにより、ヒト癌異種移植片を保有する動物における腫瘍小結節の体積を減少させることができるので（Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，２０１３：ＰＭＩＤ：２３７４４７８１）、本出願人が本明細書中に開示のアルブミン－ＰＴＥＮ融合物が癌細胞死を媒介するようにＣＡＳＰ３／７を活性化すると判断していたことを考慮して、ＰＣ３ヒト前立腺、４Ｔ１－Ｌｕｃマウス、またはＭＤＡＭＢ４６８ヒトトリプルネガティブ乳癌の異種移植片を有するマウスに１日１回の静脈内単剤療法薬として投与した場合に、５週間の標準的なクールにわたる用量応答性の方法において、アルブミン－ＰＴＥＮ融合物がマウスにおける腫瘍小結節の体積も減少させることを示すための実験を行う。
いくつかの実験では、被験体における薬力学的（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｍａｎｉｃ）マーカーの好ましい制御に関連する癌細胞死を導く製造可能な細胞透過性アルブミン－ＰＴＥＮ融合物は、ＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）、ＰＲ４０５（配列番号１２９；ｃＤＮＡ配列番号１５７）、ＰＲ４０７（配列番号１３１；ｃＤＮＡ配列番号１５９）、ＰＲ４０８（配列番号１３２；ｃＤＮＡ配列番号１６０）、または各々のその欠失物、点変異体、アナログ、もしくはバリアントから選択される。
他の実施形態では、被験体における薬力学的（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｍａｎｉｃ）マーカーの好ましい制御に関連する癌細胞死を導く製造可能な細胞透過性アルブミン－ＰＴＥＮ融合物は、ＰＲ６（配列番号１８；ｃＤＮＡ配列番号５８）、ＰＲ６１（配列番号１９；ｃＤＮＡ配列番号５９）、ＰＲ３２（配列番号２４；ｃＤＮＡ配列番号６４）、ＰＲ３３（配列番号２５；ｃＤＮＡ配列番号６５）、ＰＲ３４（配列番号５０；ｃＤＮＡ配列番号１３６）、ＰＲ６６（配列番号１２６；ｃＤＮＡ配列番号１５４）、ＰＲ６７（配列番号１２７；ｃＤＮＡ配列番号１５５）、ＰＲ６８（配列番号１２８；ｃＤＮＡ配列番号１５６）、または各々のその欠失物、点変異体、アナログ、もしくはバリアントから選択される。
他の実施形態では、被験体に注射した場合に被験体の血中を循環する製造可能なアルブミン－ＰＴＥＮ融合物は、インタクトな形態の癌細胞を透過し、それにより、被験体における薬力学的（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｍａｎｉｃ）マーカーの好ましい制御に関連する癌細胞死を導く。
他の実施形態では、被験体に注射した場合に被験体の血中を循環する製造可能なアルブミン－ＰＴＥＮ融合物は、癌関連プロテアーゼによる融合物の切断後に細胞透過性ＰＴＥＮタンパク質に分解され、ここで、そのようにして放出された細胞透過することができるＰＴＥＮタンパク質は癌細胞に侵入し、被験体における薬力学的（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｍａｎｉｃ）マーカーの好ましい制御に関連する癌細胞死を導く。
他の実験では、被験体に注射した場合に被験体の血中を循環する製造可能なアルブミン－ＰＴＥＮ融合物は、癌関連プロテアーゼによる融合物の切断後に細胞透過性ＰＴＥＮタンパク質に分解される。そのようにして放出された細胞透過することができるＰＴＥＮタンパク質は癌細胞に侵入し、被験体における腫瘍イメージングマーカーの定量的測定に関連する癌細胞死を導く。アルブミン－ＰＴＥＮ融合物に対する被験体の前（臨床）有効性は、同一かつ同時の細胞イメージングバイオマーカーレベルと直接相関する。
実施例６．げっ歯類、サル、およびヒトの血漿中のＰＴＥＮ－アルブミン融合物薬のＰＫレベルを測定するための分析方法の開発スカウティング。
ＰＴＥＮ－Ｌおよびアルブミンが全ての哺乳動物に存在するので、ラットおよびカニクイザルは、ＰＴＥＮアルブミン融合物のＩＮＤ用ＧＬＰ毒性試験に妥当な種である。しかしながら、哺乳動物血漿中の循環アルブミン量が飽和し、かつ高度に保存されていることを考慮して、抗体ベースの薬物動態学的（「ＰＫ」）生物学的分析法（サンドイッチＥＬＩＳＡなど）を、アルブミンよりもむしろＰＴＥＮの捕捉に基づいて設計しなければならない。したがって、被験体の総血漿ＰＴＥＮ－Ｌレベルが比較的低いとすれば、ＰＲ４０２様タンパク質薬のＰＫを、分析物の捕捉および検出のためにそれぞれ抗ＬＵＤ Ａｂ（例えば、３Ａ４．１）および４つの利用可能なＣ末端ｐａｎ－ＰＴＥＮ Ａｂのうちの１つ（図６Ｂ）を使用して測定することができる。かかるＥＬＩＳＡは、ラット、サル、およびヒトの血漿中のインタクトなＰＴＥＮ－Ｌ腫瘍抑制因子の総循環量を、被験体へのＰＲ４０２様タンパク質の注射後に測定する。拡大解釈すれば、３Ａ４．１／Ｆ－１０（ラット、サル、ヒトのＰＫに有効）または３Ａ４．１／ＡＬ－０１（ヒトＰＫのみに有効）のサンドイッチＥＬＩＳＡは、対応する種の癌部位での融合物からの成熟ＰＴＥＮ－Ｌ放出前のＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）、ＰＲ４０５（配列番号１２９；ｃＤＮＡ配列番号１５７）、ＰＲ４０６（配列番号１３０；ｃＤＮＡ配列番号１５８）、ＰＲ４０７（配列番号１３１；ｃＤＮＡ配列番号１５９）、およびＰＲ４０８（配列番号１３２；ｃＤＮＡ配列番号１６０）中のインタクトなプロドラッグの総ＰＫレベルを測定する（Ａｂ特異性については図６Ｂを参照のこと）。両方のデザインにおいて、ＰＴＥＮ ＰＫの測定値に注目していると考えられ、それにより、アルブミンは、むしろ活性な細胞透過性ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子の放出のためだけに提供された受動的役割を果たすと見なされる。上記の３つ全てのＰＫアッセイには同一の抗ＬＵＤ捕捉Ａｂを必要とするので、本出願人は、市販の３Ａ４．１ＡｂがＰＲ４０２様薬物の生物学的ＰＫ分析法の開発に適合するかどうかを最初に判定した。
そのために、５０μｌの新たに再構築したＩｇＧ捕捉ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＢｉｏＲａｄカタログ番号１６１－４０１３）を、（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄し、１０μｌの３Ａ４．１Ａｂ（Ｓｉｇｍａ）と穏やかに振盪しながら室温（ＲＴ）で１０分間混合した。個別にプールした全性別のＫ３－ＥＤＴＡ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット血漿（ＢｉｏＩＶＴ、カタログ番号ＲＡＴ００ＰＬＫ３ＰＮＮ）を（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）で７倍に希釈して最終濃度１６．８ｍｇ／ｍｌにし、次いで、緩衝液または漸増量のセミピュアＰＲ４０２（実施例３にしたがって製造）のいずれかをスパイクした。次いで、スパイクした血漿溶液を、抗体－ビーズ溶液と混合して最終反応体積２ｍｌとし（３Ａ４．１ ｍＡｂの最終希釈倍率は、１：２００であった）、穏やかに振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした。３Ａ４．１－ＰＲ４０２免疫沈降複合体を含むビーズをスピンし、上清（すなわち、通過画分）中の非結合物質を個別のチューブに回収した。ビーズを（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）でさらに３回洗浄し、最後にＤＴＴの存在下にて７０℃で１０分間加熱することによって４×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中に溶出させた。３Ａ４．１免疫沈降物を含む上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードし、ゲルを、ＨＲＰに抱合したＡ２Ｂ１ 抗ＰＴＥＮＡｂを用いてブロッティングした。
図２１Ａは、全ての通過画分（奇数レーン）が４５～７０ＫＤａの領域に高濃度のタンパク質の曖昧で尾を引くバンド（クエスチョンマーク）を含むことを示し、これは、ラットアルブミン（ＲＳＡ）に相当する可能性が非常に高い。非スパイク対照（レーン２）は、３Ａ４．１ｍＡｂが３００ＫＤａの１つのかすかなバンドを認識し（偶数レーン、クロス）、一方、溶離物は非常にクリーンであることを示し、これは、このｍＡｂがＰＲ４０２に非常に特異的であり、ラット血漿マトリックスによる干渉がほとんどないことを示唆している。５ｎｇ未満の、おそらくたった１ｎｇのスパイクＰＲ４０２でさえも、これらの条件下で３Ａ４．１によって免疫沈降することができ（図２１Ａ、レーン６および４；星印）、これは、３Ａ４．１ｍＡｂが粗ラット血漿マトリックス中でも非常に感度が高いことを示唆している。
プールした全性別のＫ３－ＥＤＴＡカニクイザル血漿（ＢｉｏＩＶＴ、カタログ番号ＮＨＰ０１ＰＬＫ３ＰＮＮ；図２１Ｂ）を使用して、上記実験を繰り返した。ＩＰから３００ＫＤａの夾雑物はここには存在しないことを考慮すると、このマトリックスにおける抗体特異性は非常に高いようであり、それに対して、４５ＫＤａ領域への曖昧な移動は、通過画分中の過剰負荷されたサルアルブミン（ＳＳＡ）の人工物でもあり得る。対照的に、５ｎｇのＰＲ４０２スパイクをもはや検出できないので、サル血漿における分析物の感度は低い。それにもかかわらず、結果をまとめると、抗ＬＵＤ ３Ａ４．１がラットおよびカニクイザルの血漿中のＰＲ４０２様薬物を検出するためのＥＬＩＳＡ生物学的分析法の開発における捕捉Ａｂとして適切であることが示唆される。
ラットおよびカニクイザルの血漿中で３Ａ４．１ ｍＡｂが高い精度で認められたことを考慮して、本出願人は、ラット器官抽出物も上記ＰＫ ＥＬＩＳＡに適しているかもしれないとの疑問を持った。そのために、高齢の雌ラットを屠殺し、その器官を回収し、テフロン（登録商標）によって（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ｖ／ｖ ＮＰ－４０、０．２５％ｗ／ｖデオキシコール酸、０．１％ｗ／ｖ ＳＤＳ＋ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤）中でホモジナイズした。次いで、１５ｍｇ／ｍｌの清澄化器官ホモジネート（乳房を除く：６ｍｇ／ｍｌ）に、緩衝液または５０ｎｇのＰＲ４０２をスパイクし、上記のように処置した。図２１Ｃは、３Ａ４．１ ｍＡｂのＩＰは依然として非常にクリーンであり、それぞれ１００ＫＤａ超のさらなる強い、おそらく特異的なバンドおよび非常に複雑なバンドパターンに寄与する胸腺および脳を除いて、ほとんどの器官にわたっておよそ５０～６０ＫＤａにたった１つの非特異的バンドが認められることを示す。それ故、ＰＲ４０２様薬物を検出するための３Ａ４．１ベースのＥＬＩＳＡ生物学的分析法は、脳および胸腺を除くほとんどのラット器官マトリックス中のＰＲ４０２生体内分布を決定するための代替法として有用であり得る。
次いで、本出願人は、Ｃ’末端ＰＴＥＮ ｍＡｂ（ＩＰ）／Ｆ－１０（ＷＢ）Ａｂ組み合わせが被験体の血漿中のインタクトなＰＲ６１（配列番号１９；ｃＤＮＡ配列番号５９）の総循環レベルの測定に適切であるかどうかを判定した。図６Ｂに示し、Ｐｕｌｉｄｏ ｅｔ ａｌ，２０１９（ＰＭＩＤ：３１５０１２６５）によって実験において詳細に判定されたように、１３８Ｇ６、ＳＰ２１８、および１７Ａ．１の各Ａｂは、ＰＴＥＮ－Ｓの最後のアミノ酸に結合する。それ故、拡大解釈すれば、これらのＡｂは、ＰＲ６１－ラインタンパク質にも結合するはずである。実際に、粗ＣＨＯ－３Ｅ７上清に含まれた種々の量のＰＲ６１をＰＢＳまたはラット血漿中にスパイクし、次いで、１３８Ｇ６／Ｆ－１０抗体組み合わせを使用したＩＰ－ＷＢに供した場合、１３８Ｇ６によるＰＲ６１の用量応答性の捕捉を実証することができた（図２１Ｄ、レーン１～１０；１２０ＫＤａ；星印）。しかしながら、１３８Ｇ６は、ラット血漿由来の７０ＫＤａおよび５０ＫＤａのタンパク質も非常に特異的に捕捉し、それに対して、前述の２つのタンパク質のいずれもＰＲ６１をスパイクしたＰＢＳから免疫沈降することができず（レーン５、クロス対レーン１０および６）、それにより、７０ＫＤａおよび５０ＫＤａの活性が実際にラットタンパク質であり、ＣＨＯ－３Ｅ７宿主細胞の夾雑物ではないことが実証された。驚いたことに、ステージＩＶ肺癌患者（被験体番号２６７８２４６；ＰｒｏＭｅｄＤｘ，Ｎｏｒｔｏｎ，ＭＡ）由来の全血清（ＰＢＳで２０倍に希釈）を使用し、ＩＰにおける捕捉抗体としてＳＰ２１８または１７Ａ．１のいずれかを使用して実験を繰り返した場合、両方の抗体によるＰＲ６１の特異的捕捉も実証することができ、さらに、ＳＰ２１８および１７Ａ．１の両方は５０ＫＤａおよび７０ＫＤａのタンパク質の両方を共沈させた（図２１Ｅ、レーン１対３および５対７、１７Ａ．１についてのデータは示さず）。したがって、ラット血漿および癌患者の血清中に存在する２つのＰＴＥＮ様タンパク質は、全ての利用可能なＣ末端ｍＡｂと交差反応し、ＰＲ６１様タンパク質のためのかかるＥＬＩＳＡベースのＰＫ法の精度を強く制限するインタクトなＰＴＥＮ－Ｓを測定することができる。
被験体に外因的に投与された組換えヒトタンパク質のＰＫレベルの測定が、宿主に存在する同一のタンパク質による干渉のために困難であることは当該分野で公知である。かかる問題を、抗体ベースの分析物捕捉をプロテアーゼ消化、液体クロマトグラフィ分離、および得られた消化免疫複合体の質量分析と組み合わせることによって解決することができる。ＭＳＩＡ（質量分析免疫アッセイ）と呼ばれるこの技術は、ＰＲ６１様薬物のＰＫ測定に適切であり得る。ＨＳＡ、ＳＳＡ、およびＲＳＡの各配列（配列番号１３、９１、および９０）の検査することにより、Ｐ１’位のＡｓｐとの結合を特異的に切断するＡｓｐ－ＮエンドペプチダーゼがこのＭＳＩＡの開発に適切であり得ることが示される。したがって、アルブミン上の最後のＡｓｐ残基（Ｄ５６２、Ｄ５６２、およびＤ５６５である）を切断すると、ＨＳＡ、ＲＳＡ、およびＭＳＡによる２３ａａ長、２２ａａ長、および２１ａａ長のペプチドが放出されるであろう。アルブミンおよびＰＴＥＮ－Ｓタンパク質の下流において、最初のＡｓｐ－Ｎ切断はＤ１９にあると予想される。それ故、ＰＲ６１様タンパク質についてのＡｓｐ ＮベースのＭＳＩＡは、それぞれ４２ａａ、４１ａａ、および４０ａａの固有のシグネチャーペプチドを放出するであろう（勿論２ドメイン間のリンカーの存在を除外し、存在する場合、シグネチャーペプチド長は、リンカーまたはそのＡｓｐ分解物のサイズ分が増加するであろう）。これらのシグネチャーペプチドがアルブミン－ＰＴＥＮジャンクションに及ぶので、前述のシグネチャーペプチドは固有のものであるため、正確なＰＫ法を開発することが可能である。
別の態様では、図２１Ｅの実験は、ＣＨＯ－３Ｅ７上清（細胞デブリおよび細胞デブリから放出されるプロテアーゼが豊富である）のような粗供給源中に含まれるＰＲ６１（配列番号１９；ｃＤＮＡ配列番号５９）であってもＰＢＳ中（物理化学安定性）または癌血清中（細胞デブリから放出されたプロテアーゼに対する耐性）のいずれかでの長期間（８時間）のインキュベーションにおいて非常に安定であることも実証している（図２１Ｅ、レーン２対６および４対８）。これにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性プロテアーゼとの一晩のインキュベーション中のＰＲ４０２（配列番号２８；ｃＤＮＡ配列番号６８）、および他のかかる融合物（ＰＲ４０５（配列番号１２９；ｃＤＮＡ配列番号１５７）、ＰＲ４０６（配列番号１３０；ｃＤＮＡ配列番号１５８）、ＰＲ４０７（配列番号１３１；ｃＤＮＡ配列番号１５９）、およびＰＲ４０８（配列番号１３２；ｃＤＮＡ配列番号１６０）が含まれるが、これらに限定されない）の安定性が優れていることが予想される（図１５）。以下にさらに考察されるように、この安定性は、アルブミン－ＰＴＥＮ融合物の開発に特に適している。
要約すれば、主な発現系、ベクター、および宿主細胞の詳細な解析後に、ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子機能を保持しながら発現し、そして／または大量の製造することができるいくつかの「許容される」新規のアルブミン－ＰＴＥＮ融合物、ポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ）が開示される。したがって、本開示のｃＤＮＡおよびタンパク質は、必要とする被験体の遺伝子およびタンパク質治療に適切である。
本発明の実施形態
実施形態１．ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮまたはＰＴＥＮ－Ｌ）腫瘍抑制因子の連続したアミノ酸配列を含む融合タンパク質であって、前述のＨＳＡが、ＰＴＥＮまたはＰＴＥＮ－Ｌの上流または下流にある、融合タンパク質。
実施形態２．ＨＳＡが、配列番号１２、１３、９０、９１、９２、もしくは１６３、または各々の等価物のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の融合タンパク質。
実施形態３．ＰＴＥＮ－Ｌが、配列番号１、２、３、６、７、８、８８、８９、もしくは１６２、または各々の等価物のアミノ酸配列を含む、実施形態１または２に記載の融合タンパク質。
実施形態４．配列番号２８、１９、１８、１２９、１３１、２５、もしくは５０、または各々の断片、類似体、バリアント、もしくは等価物の群から選択されるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
実施形態５．配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、もしくは１３６の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはそれぞれ配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、または１３６と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
実施形態６．配列番号１４～３０、３４～３７、４９～５０、１０９～１３２、または各々の断片、類似体、バリアント、もしくは等価物、または以下：配列番号１のＳ６５、Ｓ８５、Ｓ８９、Ｓ９１、Ｓ９４、Ｓ１１１、Ｓ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｓ１３４、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８ならびに／または配列番号２のＳ１７０、Ｎ２９２、Ｓ３５５、Ｓ３６０、Ｓ３６６、およびＳ３７０のいずれか１つまたはそれ超に等価な選択された位置の、必要に応じたアスパラギン酸またはグルタミン酸への１またはそれを超える変異を各々がさらに含む変異体のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含み、必要に応じて前記タンパク質がグリコシル化されており、さらに必要に応じて前述のタンパク質が、配列番号２のＮ２９２に等価な位置以外の位置の１つまたはそれ超でＯ－グリコシル化されており、さらに必要に応じて前記配列番号２のＮ２９２に等価なアミノ酸残基がＮ－グリコシル化されている、融合タンパク質。
実施形態７．配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、もしくはその断片、またはそれぞれ配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
実施形態８．血清アルブミンおよびホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）の連続したアミノ酸配列を含む融合タンパク質であって、必要に応じて前述のＰＴＥＮが、ヒトＰＴＥＮ、サルＰＴＥＮ、ラットＰＴＥＮ、ｏｒ マウスＰＴＥＮの群から選択される、融合タンパク質。
実施形態９．前述の血清アルブミンのアミノ酸配列が、前述のＰＴＥＮのＮ末端に直接または間接的に抱合している、実施形態８に記載の融合タンパク質。
実施形態１０．前述の血清アルブミンのアミノ酸配列が、前述のＰＴＥＮのＣ末端に直接または間接的に抱合している、実施形態８に記載の融合タンパク質。
実施形態１１．前述の血清アルブミンが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、サル血清アルブミン（ＳＳＡ）、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）、もしくはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、または各々の断片、類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物の群から選択され、必要に応じて前述の血清アルブミンが配列番号１３のアミノ酸１～１９７に等価なアルブミンドメインＩを含み、必要に応じて前述の血清アルブミンが配列番号１３のアミノ酸１～３９５に等価なアルブミンのドメインＩおよびＩＩを含み、必要に応じて前述のアルブミンが配列番号１３のアミノ酸３８２～５８５に等価なアルブミンドメインＩＩＩを欠き、必要に応じて前述のアルブミンが配列番号１３のアミノ酸１９８～３８１に等価なアルブミンドメインＩＩを欠き、必要に応じて前述のアルブミンが配列番号１３のアミノ酸１９８～５８５に等価なアルブミンドメインＩＩおよびＩＩＩを欠き、必要に応じて前述のアルブミンが成熟ＨＳＡの最初の３４個もしくは６２個アミノ酸またはその等価物を欠き、さらに必要に応じて前述のアルブミンが配列番号１３のアミノ酸３５～３８５もしくは６３～５８５またはその等価物のアミノ酸配列を含む、実施形態８～１０のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態１２．前述の血清アルブミンが、シグナルペプチドを含むプレタンパク質またはシグナルペプチドを欠く成熟血清アルブミンであり、必要に応じて前述の血清アルブミンが、配列番号１２のアミノ酸５８もしくは配列番号１３のアミノ酸３４に等価な位置に必要に応じたシステインからセリンへの変異、または配列番号１３のアミノ酸３４に変異を保持する各々の等価物を含み、必要に応じて前述の血清アルブミンが、配列番号１３のアミノ酸３４に等価な位置で分子と抱合したアミノ酸を含み、前述の分子が、小分子、細胞傷害性分子、リンカー、ｐＨ感受性リンカー、および／またはチオールリンカーである、実施形態８～１１のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態１３．前述の血清アルブミンが、配列番号１２～１３、９０～９３、および１６３、またはそれぞれ配列番号１２、１３、９０～９３、もしくは１６３と同一もしくは類似の活性を有する配列番号１２～１３、９０～９３、および１６３のうちのいずれか１つの類似体、バリアント、変異体、イソ型、もしくは等価物の群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態８～１２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態１４．前述の血清アルブミンが、配列番号１７６～１７９の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１７６～１７９によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、実施形態８～１３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態１５．シグナルペプチドをさらに含む、実施形態８～１４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態１６．前述のシグナルペプチドが、分泌のための融合タンパク質のＮ末端である、実施形態１５に記載の融合タンパク質。
実施形態１７．前述のシグナルペプチドが、ＨＳＡシグナルペプチド、ＳＳＡシグナルペプチド、ＲＳＡシグナルペプチド、ＭＳＡシグナルペプチド、マウスα２－マクログロブリンのシグナルペプチド、マウスフィブリノゲンシグナルペプチド、マウスα１－抗トリプシンシグナルペプチド、マウスＩｇＧκ鎖シグナルペプチド、ヒトＩｇＧ重鎖シグナルペプチド、ヒトＣＤ３３シグナルペプチド、または人工シグナルペプチドから選択され、必要に応じて前述のシグナルペプチドが、配列番号９３～１０５の群から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、前述のシグナルペプチドがＨＳＡシグナルペプチドである、実施形態１５または１６に記載の融合タンパク質。
実施形態１８．前述のシグナルペプチドが、配列番号１８０～１９２の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはそれぞれ配列番号９３～１０５と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされる、実施形態１５～１７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態１９．前述のＰＴＥＮが、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ（ＰＴＥＮ－Ｌ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であり、必要に応じて前述のＰＴＥＮ－Ｌが、配列番号３のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＥＮ－Ｌであり、そして／または必要に応じて前述のＰＴＥＮ－Ｌが、配列番号１７１の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１７１のヌクレオチド（ｎｔ）６４～ｎｔ１７２８、または配列番号１７１もしくは配列番号１７１のヌクレオチド（ｎｔ）６４～ｎｔ１７２８によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるヒトＰＴＥＮ－Ｌである、実施形態８～１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態２０．前述のＰＴＥＮが、ＰＴＥＮ－Ｍイソ型、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であり、必要に応じて前述のＰＴＥＮ－Ｍが、配列番号６のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＥＮ－Ｍであり、そして／または必要に応じて前述のＰＴＥＮ－Ｍが、配列番号１９８の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号６と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるヒトＰＴＥＮ－Ｍである、実施形態８～１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態２１．前述のＰＴＥＮが、ＰＴＥＮ－Ｎイソ型、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であり、必要に応じて前述のＰＴＥＮ－Ｎが、配列番号７のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＥＮ－Ｎであり、そして／または必要に応じて前述のＰＴＥＮ－Ｎが、配列番号１９９の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号７と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるヒトＰＴＥＮ－Ｎである、実施形態８～１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態２２．前述のＰＴＥＮが、ＰＴＥＮ－Ｏイソ型、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であり、必要に応じて前述のＰＴＥＮ－Ｏが、配列番号８のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＥＮ－Ｏであり、そして／または必要に応じて前述のＰＴＥＮ－Ｏが、配列番号２００の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号８と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるヒトＰＴＥＮ－Ｏである、実施形態８～１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態２３．前記ＰＴＥＮが、以下のうちのいずれか１つまたはそれ超を含む、実施形態８～１８実のいずれか１つに記載の融合タンパク質：
（ｉ）成熟ヒトＰＴＥＮ－Ｌ固有ドメイン（ＬＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であって、必要に応じて前記ＬＵＤが配列番号５のアミノ酸配列を含み、さらに必要に応じて前記ＬＵＤが、配列番号（ＳＥＤ ＩＤ ＮＯ：）１９３の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号５と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、必要に応じて前記ＬＵＤがグリコシル化されており、さらに必要に応じて前記ＬＵＤのセリン（Ｓ）残基および／またはトレオニン（Ｔ）残基のうちの１つまたはそれ超がＯ－グリコシル化されている、成熟ヒトＰＴＥＮ－Ｌ固有ドメイン（ＬＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物；；
（ｉｉ）ヒトＰＴＥＮ－Ｍ固有ドメイン（ＭＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であって、必要に応じて前記ＭＵＤが配列番号９のアミノ酸配列を含み、そして／またはさらに必要に応じて前記ＭＵＤが、配列番号１９４の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号９と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、必要に応じて前記ＭＵＤがＯ－グリコシル化されている、ヒトＰＴＥＮ－Ｍ固有ドメイン（ＭＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物；；
（ｉｉｉ）ヒトＰＴＥＮ－Ｎ固有ドメイン（ＮＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であって、必要に応じて前記ＮＵＤが配列番号１０のアミノ酸配列を含み、そして／またはさらに必要に応じて前記ＮＵＤが、配列番号１９５の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１０と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、必要に応じて前記ＮＵＤがグリコシル化されており、さらに必要に応じて前記ＮＵＤのセリン（Ｓ）残基および／またはトレオニン（Ｔ）残基のうちの１つまたはそれ超がＯ－グリコシル化されている、ヒトＰＴＥＮ－Ｎ固有ドメイン（ＮＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物；；
（ｉｖ）ヒトＰＴＥＮ－Ｏ固有ドメイン（ＯＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であって、必要に応じて前記ＯＵＤが配列番号１１のアミノ酸配列を含み、そして／またはさらに必要に応じて前記ＯＵＤが、配列番号１９６の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１１と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、必要に応じて前記ＯＵＤがグリコシル化されており、さらに必要に応じて前記ＯＵＤのセリン（Ｓ）残基および／またはトレオニン（Ｔ）残基のうちの１つまたはそれ超がＯ－グリコシル化されている、ヒトＰＴＥＮ－Ｏ固有ドメイン（ＯＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物；；
（ｖ）６×Ａｒｇ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含む最小細胞透過ドメイン（ＭＣＰＤ）であって、必要に応じて前記融合タンパク質が、前記ＰＴＥＮと前記アルブミンとの間に切断可能なリンカーを含む、最小細胞透過ドメイン；
（ｖｉ）膜結合ドメイン（ＭＢＤ）であって、必要に応じて前記ＭＢＤが配列番号４０のアミノ酸配列を含む、膜結合ドメイン；
（ｖｉｉ）最小ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であって、必要に応じて前記最小ＰＴＥＮ－Ｓが配列番号１６２のアミノ酸配列を含み、そして／またはさらに必要に応じて前記最小ＰＴＥＮ－Ｓが、配列番号１９７の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１６２と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、最小ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物；および
（ｖｉｉｉ）ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であって、必要に応じて前記ＰＴＥＮ－Ｓが配列番号２のアミノ酸配列を含み、そして／またはさらに必要に応じて前記ＰＴＥＮ－Ｓが、配列番号１７２の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号２と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物。
実施形態２４．前述のＰＴＥＮが、最小ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物を含み、必要に応じて前述の最小ＰＴＥＮ－Ｓが、配列番号１６２のアミノ酸配列を含み、そして／またはさらに必要に応じて前述の最小ＰＴＥＮ－Ｓが、配列番号１９７から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１６２と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、実施形態８～２３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態２５．前述のＰＴＥＮが、ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物を含む、実施形態８～２４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態２６．前述のＰＴＥＮが、ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であり、必要に応じて前述の融合タンパク質が、前述のＰＴＥＮ－Ｓと前述のアルブミンとの間の切断可能なリンカーを欠く、実施形態８～２５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態２７．前述のＰＴＥＮが、単一のペプチドを欠くその成熟形態であるか、プレタンパク質である、実施形態８～２６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態２８．前述のＰＴＥＮが、配列番号１もしくは３もしくは８９、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物の群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態８～１９、２３～２５、および２７実のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態２９．前述のＰＴＥＮが、配列番号１７１、配列番号１７１のヌクレオチド（ｎｔ）６４～ｎｔ１７２８、もしくは配列番号１６７の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはそれぞれ配列番号１７１、配列番号１７１のｎｔ６４～ｎｔ１７２８、または配列番号１６７によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、実施形態８～１９、２３～２５、２７、および２８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態３０．前述のＰＴＥＮが、配列番号６もしくは２０１、または配列番号６もしくは２０１の断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物のアミノ酸配列を含む、実施形態８～１８、２０、２３～２５、および２７実のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態３１．前述のＰＴＥＮが、配列番号１９８もしくは２０４の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはそれぞれ配列番号１９８もしくは２０４によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、実施形態８～１８、２０、２３～２５、２７および３０のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態３２．前述のＰＴＥＮが、配列番号７もしくは２０２、または配列番号７もしくは２０２の断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物のアミノ酸配列を含む、実施形態８～１８、２１、２３～２５、および２７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態３３．前述のＰＴＥＮが、配列番号１９９もしくは２０５の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはそれぞれ配列番号１９９もしくは２０５によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、実施形態８～１８、２１、２３～２５、２７、および３２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
実施形態３４．前述のＰＴＥＮが、配列番号８もしくは２０３、または配列番号８もしくは２０３の断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物のアミノ酸配列を含む、実施形態８～１８、２２～２５、および２７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態３５．前述のＰＴＥＮが、配列番号２００もしくは２０６の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片、または配列番号２００もしくは２０６によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、実施形態８～１８、２２～２５、２７、および３４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態３６．前述のＰＴＥＮが、配列番号２もしくは８８、または配列番号２もしくは８８の断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物の群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態８～１８および２３～２７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態３７．前述のＰＴＥＮが、配列番号１７２もしくは１６６の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはそれぞれ配列番号１７２もしくは１６６によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、実施形態８～１８、２３～２７、および３６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態３８．以下：配列番号１のＳ６５、Ｓ８５、Ｓ８９、Ｓ９１、Ｓ９４、Ｓ１１１、Ｓ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｓ１３４、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８ならびに／または配列番号２のＳ１７０、Ｎ２９２、Ｓ３５５、Ｓ３６０、Ｓ３６６、およびＳ３７０のいずれか１つまたはそれ超に等価な選択された位置の、必要に応じたアスパラギン酸またはグルタミン酸への１またはそれを超える変異をさらに含む、実施形態８～２５および２７～３７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態３９．前述のＰＴＥＮが、配列番号１のアミノ酸１７４～５７６および以下のうちの１つまたはそれ超を含む、実施形態８～２５および２７～３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸２２～２７；
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸４４～５９；
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸４３～７９；
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸８０～１２０；
（ｖ）配列番号１のアミノ酸１２１～１７３；および／または
（ｖｉ）配列番号１のアミノ酸１５１～１７３。
実施形態４０．以下：前記アルブミンと前記ＰＴＥＮとの間の第１のリンカー、前記シグナルペプチドのＣ末端の第２のリンカー、および前記融合タンパク質のＮ末端の第３のリンカーのうちの１つまたはそれ超をさらに含み、必要に応じて前記リンカーのうちの１つまたはそれ超が、切断可能である、実施形態８～３９実のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態４１．前述のリンカーが、癌周囲の細胞または組織に存在するプロテアーゼによって切断可能であり、必要に応じて前述のプロテアーゼが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、またはカテプシンＢの群から選択され、さらに必要に応じて前述のリンカーが、配列番号４８、１６４～１６５、および１０６～１０８の群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態４０に記載の融合タンパク質。
実施形態４２．前述のリンカーおよび／または融合タンパク質が、細胞内プロテアーゼによって切断可能であり、必要に応じて前述のプロテアーゼが、フューリンもしくはフューリン様プロテアーゼ、またはカテプシンＢプロテアーゼであり、さらに必要に応じて前述のリンカーが、配列番号４８または１０６～１０８の群から選択されるアミノ酸配列を含み、そして／または前述のＰＴＥＮが、最小細胞透過ドメイン（ＭＣＰＤ）である、実施形態４０に記載の融合タンパク質。
実施形態４３．精製または検出可能なマーカーをさらに含む、実施形態１～４２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態４４．前述のマーカーが、６ｘＨｉｓタグ、血球凝集素（ＨＡ）タグ、フラッグタグ、または任意の他のエピトープタグの群から選択されるマーカー（複数可）のうちの１つまたはそれ超である、実施形態４３に記載の融合タンパク質。
実施形態４５．１またはそれを超えるマーカーが、融合タンパク質のＣ末端に存在し、そして／または１またはそれを超えるマーカーが、前述のアルブミンと前述のＰＴＥＮとの間に存在する、実施形態４３または４４に記載の融合タンパク質。
実施形態４６．配列番号１４～３０、３４～３７、４９～５０、１０９～１３２、または配列番号１４～３０、３４～３７、４９～５０、１０９～１３２の各々の断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物、または以下：配列番号１のＳ６５、Ｓ８５、Ｓ８９、Ｓ９１、Ｓ９４、Ｓ１１１、Ｓ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｓ１３４、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８ならびに／または配列番号２のＳ１７０、Ｎ２９２、Ｓ３５５、Ｓ３６０、Ｓ３６６、およびＳ３７０のいずれか１つまたはそれ超に等価な選択された位置の、必要に応じたアスパラギン酸またはグルタミン酸への１またはそれを超える変異を各々がさらに含む変異体の群から選択されるアミノ酸配列からなり、必要に応じて前記タンパク質がグリコシル化されており、さらに必要に応じて前記タンパク質のセリン（Ｓ）残基および／またはトレオニン（Ｔ）残基のうちの１つまたはそれ超がＯ－グリコシル化されており、なおさらに必要に応じて前記タンパク質のアスパラギン（Ｎ）残基の１つまたはそれ超がＮ－グリコシル化されている、融合タンパク質。
実施形態４７．配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはそれぞれ配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
実施形態４８．配列番号１４～３０、３４～３７、４９～５０、１０９～１３２、または配列番号１４～３０、３４～３７、４９～５０、１０９～１３２の各々の断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物、または以下：配列番号１のＳ６５、Ｓ８５、Ｓ８９、Ｓ９１、Ｓ９４、Ｓ１１１、Ｓ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｓ１３４、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８ならびに／または配列番号２のＳ１７０、Ｎ２９２、Ｓ３５５、Ｓ３６０、Ｓ３６６、およびＳ３７０のいずれか１つまたはそれ超に等価な選択された位置の、必要に応じたアスパラギン酸またはグルタミン酸への１またはそれを超える変異を各々がさらに含む変異体の群から選択されるアミノ酸配列からなり、必要に応じて前記タンパク質がグリコシル化されており、さらに必要に応じて前記タンパク質のセリン（Ｓ）残基および／またはトレオニン（Ｔ）残基のうちの１つまたはそれ超がＯ－グリコシル化されており、なおさらに必要に応じて前記タンパク質のアスパラギン（Ｎ）残基の１つまたはそれ超がＮ－グリコシル化されている、融合タンパク質。
実施形態４９．配列番号５４～７０、７４～７７，１３５～１６０の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、もしくはその断片、またはそれぞれ配列番号５４～７０、７４～７７，１３５～１６０と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
実施形態５０．前述の融合タンパク質が、前述の融合タンパク質を発現することができる宿主細胞を、前述の融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程を含む過程によって産生されている、実施形態１～４９のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態５１．前述の融合タンパク質を、細胞または細胞培養培地から必要に応じて精製または単離する工程をさらに含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
実施形態５２．前述の宿主細胞が、原核細胞または真核細胞であり、必要に応じて前述の宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＨＥＫ２９３細胞の群から選択され、必要に応じて前述のＣＨＯ細胞が、ＥｘＰＡＳｙ受入番号ＣＶＣＬ＿ＪＹ７４を有するＣＨＯ－３Ｅ７細胞であり、必要に応じて前述のＨＥＫ２９３細胞が、ＥｘＰＡＳｙ受入番号ＣＶＣＬ＿ＨＦ２０を有するＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ１－６Ｅであり、さらに必要に応じて前述の宿主細胞が、プロテアーゼの発現を欠き、必要に応じて前述のプロテアーゼが、癌周囲の細胞または組織に存在する細胞内プロテアーゼまたはプロテアーゼであり、必要に応じて前述のプロテアーゼが、フューリン、ＭＭＰ２／９、またはカテプシンＢの群から選択され、必要に応じて前述の宿主細胞が、天然ヒューリン（ｆｕｉｎ）ノックアウト（ＫＯ）細胞であり、さらに必要に応じて前述の宿主細胞がＬｏＶｏ細胞である、実施形態５０または５１に記載の融合物。
実施形態５３．必要に応じて前述のポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、伝令ＲＮＡ、またはそのハイブリッドの群から選択される、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
実施形態５４．宿主細胞内でのポリヌクレオチドの発現のための制御配列をさらに含み、必要に応じて前述の制御配列が腫瘍特異的である、実施形態５３に記載のポリヌクレオチド。
実施形態５５．前述の制御配列が、プロモーターエレメントおよび／またはエンハンサーエレメントを含む、実施形態５４に記載のポリヌクレオチド。
実施形態５６．実施形態５３～５５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
実施形態５７．必要に応じて前記ベクターがＡｄＶベクターまたはＨＳＶベクターであり、さらに必要に応じて前記ベクターがウイルスベクターであり、必要に応じて前記ベクターが、狂犬病ウイルス、フラビウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、セネカバレーウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、コクサッキーウイルス、パルボウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、または感染性タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の群から選択され、さらに必要に応じて前記ベクターが、抗癌治療および／または遺伝子治療に適切である、実施形態５６に記載のベクター。
実施形態５８．前述のベクターが非ウイルスベクターであり、必要に応じて前述のベクターが、リポソーム、カチオン性脂質、ミセル、生体適合性ポリマー（天然ポリマーおよび合成ポリマーが含まれる）；ナノ粒子；リポタンパク質；ポリペプチド；ポリサッカリド；リポ多糖；金属粒子；細菌、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、酵母人工染色体、または真菌ベクターの群から選択され、必要に応じて前述のプラスミドが、ｐＳＩＰ６０９Ｌ ｐｌａｎｔａｒｕｍ発現ベクター、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクター、または哺乳動物発現ベクターの群から選択され、さらに必要に応じて前述のプラスミドが、配列番号１７３～１７５の群から選択される配列を含み、さらに必要に応じて前述のベクターが、抗癌治療および／または遺伝子治療に適切である、実施形態５６に記載のベクター。
実施形態５９．実施形態５３～５５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、および／または実施形態５６～５８のいずれか１つに記載のベクターを含む、宿主細胞。
実施形態６０．前述の宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＨＥＫ２９３細胞の群から選択され、必要に応じて前述のＣＨＯ細胞が、ＥｘＰＡＳｙ受入番号ＣＶＣＬ＿ＪＹ７４を有するＣＨＯ－３Ｅ７細胞であり、必要に応じて前述のＨＥＫ２９３細胞が、ＥｘＰＡＳｙ受入番号ＣＶＣＬ＿ＨＦ２０を有するＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ１－６であり、さらに必要に応じて前述の宿主細胞が、プロテアーゼの発現を欠き、必要に応じて前述のプロテアーゼが、癌周囲の細胞または組織に存在する細胞内プロテアーゼまたはプロテアーゼであり、必要に応じて前述のプロテアーゼが、フューリン、ＭＭＰ２／９、またはカテプシンＢの群から選択され、必要に応じて前述の宿主細胞が、天然のヒューリン（ｆｕｉｎ）ノックアウト（ＫＯ）細胞であり、さらに必要に応じて前述の宿主細胞がＬｏＶｏ細胞である、実施形態５９に記載の宿主細胞。
実施形態６１．実施形態１～５２のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態５３～５５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、および／または実施形態５９～６０のいずれか１つに記載のベクター；ならびに少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体以下のうちの１つまたはそれ超を含み、必要に応じて前述の薬学的に許容され得る担体が、安定剤および／または防腐剤を含む、医薬組成物。
実施形態６２．前述のＨＳＡ－ＰＴＥＮ－Ｌ融合タンパク質が、配列番号１９または配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態６１に記載の医薬組成物。
実施形態６３．配列番号１９または配列番号２８のアミノ酸配列および少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体を含むＨＳＡ－ＰＴＥＮ－Ｌ融合タンパク質を含む、医薬組成物
実施形態６４．配列番号１９または配列番号２８のアミノ酸配列、および少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体からなるＨＳＡ－ＰＴＥＮ－Ｌ融合タンパク質を含む、医薬組成物。
実施形態６５．前述のＨＳＡ－ＰＴＥＮ－Ｌ融合タンパク質が、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞中で産生され、必要に応じて前述のＣＨＯ細胞が、ＥｘＰＡＳｙ受入番号ＣＶＣＬ＿ＪＹ７４を有するＣＨＯ－３Ｅ７細胞であり、必要に応じて前述のＨＥＫ２９３細胞が、ＥｘＰＡＳｙ受入番号ＣＶＣＬ＿ＨＦ２０を有するＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ１－６であり、さらに必要に応じて前述のｃｅｌｌが、プロテアーゼの発現を欠き、必要に応じて前述のプロテアーゼが、癌周囲の細胞または組織に存在する細胞内プロテアーゼまたはプロテアーゼであり、必要に応じて前述のプロテアーゼが、フューリン、ＭＭＰ２／９、またはカテプシンＢの群から選択され、必要に応じて前述の宿主細胞が、天然のヒューリン（ｆｕｉｎ）ノックアウト（ＫＯ）細胞であり、さらに必要に応じて前述の宿主細胞がＬｏＶｏ細胞である、実施形態６１～６４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態６６．さらなる治療剤をさらに含む、実施形態６１～６５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態６７．以下のうちの１つまたはそれ超を含むキット：実施形態１～５２のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態５３～５５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、実施形態５６～５８のいずれか１つに記載のベクター、または実施形態６１～６６のいずれか１つに記載の医薬組成物、および必要に応じた使用のための説明書。
実施形態６８．癌または腫瘍を処置する方法であって、有効量の以下：実施形態１～５２のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態５３～５５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、実施形態５６～５８のいずれか１つに記載のベクター、または実施形態６１～６６のいずれか１つに記載の医薬組成物のうちの１つまたはそれ超を必要とする被験体に投与する工程を含み、それにより、前述の癌または腫瘍が処置される、方法。
実施形態６９．前述の被験体が、ＰＴＥＮの低発現または発現の欠如に関連する癌または腫瘍または疾患を有する疑いがあり、そして／または前述の癌または腫瘍または疾患と診断されており、そして／または前述の被験体が、対照と比較して前述のＰＴＥＮ腫瘍抑制因子ｍＲＮＡの３’を標的にするｍｉＲＮＡの発現レベルが高く、必要に応じて前述の対照が、いかなる癌や腫瘍も存在しない被験体由来の生物試料であり、必要に応じて前述の対照が、任意の他の癌または腫瘍であり、必要に応じて前述のｍｉＲＮＡがｏｎｃｏ－ｍｉＲであり、必要に応じて前述のｏｎｃｏ－ｍｉＲが、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１３０ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ－１、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２１４、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０１ａ、ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｍｉｒ－１２７３ｇ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１０３、ｍｉＲ－１０６ｂ、ｍｉＲ－１０６ｂ－９３、ｍｉＲ－１０７、ｍｉＲ－１０ｂ、ｍｉＲ－１２９７、ｍｉＲ－１３０、ｍｉｒ－１３０ｂ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６ｂ、ｍｉＲ－１５３、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－１８１ａ、ｍｉＲ－１８１ｃ、ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１９、ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－２００、ｍｉＲ－２００ａ、ｍｉＲ－２０５、ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２１８、ｍｉＲ－２２、ｍｉＲ－２２１、ｍｉＲ－２２２、ｍｉＲ－２２４、ｍｉＲ－２３ａ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２５、ｍｉｒ－２９ｃ、ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－３３５、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３７４ａ、ｍｉＲ－４１０－３ｐ、ｍｉＲ－４２９９、ｍｉＲ－４５４、ｍｉＲ－４９４、ｍｉＲ－５４３、ｍｉＲ－５４８、ｍｉＲ－６１６－３ｐ、ｍｉＲ－７、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－９２ｂ、ｍｉＲ－９３、ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｍｉＲ－９４０、またはｍｉＲ－ｌｅｔ ７ｂのうちの１つまたはそれ超であり、必要に応じて前述のｍｉＲＮＡのレベルが、被験体の液体生物試料中で検出され、さらに必要に応じて前述の液体生物試料が、血液、血清、または血漿の群から選択される、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７０．前述の癌または腫瘍が、原発性または転移性の癌または腫瘍；固形腫瘍；胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵巣癌、腎細胞癌、ユーイング肉腫、黒色腫、中皮腫、肺癌、非小細胞肺癌、ステージＩＶ肺癌、脳癌、膠芽細胞腫、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫（ＭＭ）；固形腫瘍、もしくは血液および／もしくは骨髄に影響を及ぼす癌；または通常、ＰＴＥＮタンパク質の発現を欠く（または、その発現レベルが低い）組織内の癌もしくは腫瘍、必要に応じてＨスコアが約２０またはそれ未満の前述の癌または腫瘍であり、ここで、前述のＨスコアが、規定の強度（０＝染色なし、１＋＝中程度／低下、２＋＝完全）に染色された細胞の百分率の、内部陽性対照（内皮または腫瘍間質であり得る、２＋に設定）に対する積として計算され、積は０～２００の範囲であり、必要に応じて前述のＩＨＣ試料の染色強度が、少なくとも２人の独立した病理学者によって盲検的に評価されるか、コンピュータを使用して評価される、実施形態６８または６９に記載の方法。
実施形態７１．前述の癌または腫瘍が、不活性ＰＴＥＮを含み、必要に応じて前述の癌または腫瘍が、ＰＴＥＮタンパク質の発現を欠く、実施形態６８～７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７２．前述の癌または腫瘍が、対照と比較してｐｉ３Ｋ経路の薬力学バイオマーカーが増加している、実施形態６８～７１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７３．前述の対照が、いかなる癌や腫瘍も存在しない被験体由来の生物試料であり、そして／または前述の対照が、任意の他の癌または腫瘍である、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７４．前述のバイオマーカーが、ＡＫＴ、ｐＰＲＡＳ４０、ｐＳ６Ｋ、ｐＧＳＫ３、またはｐＦＯＸＯの群から選択される１またはそれを超えるバイオマーカー（複数可）である、実施形態７２～７３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７５．前述のベクターが、異種タンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、必要に応じて前述の異種タンパク質が、ＰＴＥＮ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物を含み、必要に応じて前述の異種タンパク質が、配列番号３１～３３、１～２、８８～８９、６～８、２０１～２０３から選択されるアミノ酸配列を含み、必要に応じて前述の異種タンパク質またはポリペプチドが、アルブミンのアミノ酸配列およびｐ５３タンパク質のアミノ酸配列を含み、必要に応じて異種タンパク質をコードする前述のポリヌクレオチドが、配列番号７８または１６１から選択され、必要に応じて前述の異種タンパク質が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその等価物であり、さらに必要に応じて前述の異種タンパク質が、ＶＥＧＦＲを認識して結合するｍＡｂまたはその等価物（アバスチン（商標）など）、ＨＥＲ２を認識して結合するｍＡｂまたはその等価物（ハーセプチン（商標）など）、ＥＧＦＲを認識して結合するｍＡｂまたはその等価物（アービタックス（商標）など）、免疫チェックポイントを制御するｍＡｂまたはその等価物（ＣＴＬＡ４を認識して結合するもの（例えば、ヤーボイ（商標）（イピリムマブ））、またはＰＤ－１を認識して結合するもの（例えば、キイトルーダ（商標）（ペムブロリズマブ）およびオプジーボ（商標）（ニボルマブ））、またはＰＤ－Ｌ１を認識して結合するもの（例えば、テセントリク（商標）（アテゾリズマブ））など）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）もしくはその等価物、インターロイキン（ＩＬ－２またはＩＬ－１５など）、インターフェロン（ＩＦＮβまたはＩＦＮγなど）、天然の生物活性ペプチド（サイモシンＡまたはアディポネクチンなど）、または合成ペプチド（ヘキサレリンなど）から選択される、実施形態６８～７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７６．癌細胞の成長を阻害する方法であって、細胞を、有効量の以下：実施形態１～５２のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態５３～５５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、実施形態５６～５８のいずれか１つに記載のベクター、または実施形態６１～６６のいずれか１つに記載の医薬組成物のうちの１つまたはそれ超と接触させる工程を含む、方法。
実施形態７７．前述の接触を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行う、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８．融合タンパク質を被験体に送達させる方法であって、有効量の以下：実施形態１～５２のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態５３～５５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、実施形態５６～５８のいずれか１つに記載のベクター、または実施形態６１～６６のいずれか１つに記載の医薬組成物のうちの１つまたはそれ超を被験体に送達させる工程を含み、それにより、前述の融合タンパク質が前述の被験体に送達され、必要に応じて前述の融合タンパク質が前述の被験体の腫瘍または癌の細胞外基質（ＥＣＭ）に送達される、方法。
実施形態７９．実施形態１～５２のいずれか１つに記載の融合タンパク質を産生する方法であって、
（ｉ）前述の融合タンパク質を発現することができる宿主細胞を、前述の融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程であって、必要に応じて前述の宿主細胞が、前述の融合タンパク質を切断することができるプロテアーゼの発現を欠く（または低レベルで発現する）、培養する工程；および
（ｉｉ）前述の融合タンパク質を、細胞または細胞培養培地から必要に応じて精製または単離する工程であって、必要に応じてアルブミンアフィニティクロマトグラフィおよび／またはヘパリンアフィニティクロマトグラフィを含む、精製または単離する工程
を含み、
ｉ．それにより、産生された野生型ＰＴＥＮ－Ｌタンパク質と比較して高収率、低凝集、および／または高安定性が達成され、必要に応じて前記培養後または培養中に、宿主細胞の上清が約５μｇ／ｍｌを超える分泌融合タンパク質を含む、方法。
実施形態８０．高収率、高安定性、および／または低凝集を有する融合タンパク質を製造する方法であって、
（ｉ）前述の融合タンパク質を発現することができる宿主細胞を、前述の融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程であって、必要に応じて前述の宿主細胞が、前述の融合タンパク質を切断することができるプロテアーゼの発現を欠く（または低レベルで発現する）、培養する工程；および
（ｉｉ）前述の融合タンパク質を、細胞または細胞培養培地から必要に応じて精製または単離する工程であって、必要に応じてアルブミンアフィニティクロマトグラフィおよび／またはヘパリンアフィニティクロマトグラフィを含む、精製または単離する工程
を含む、方法。
実施形態８１．前述の宿主細胞が、実施形態５３～５５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、および／または実施形態５６～５８のいずれか１つに記載のベクターを含む、実施形態７９または８０に記載の方法。
実施形態８２．宿主細胞を溶解して発現された融合タンパク質を放出させる工程をさらに含み、あるいは、前述の融合タンパク質が、宿主細胞外に分泌される、実施形態７９～８１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８３．前述の宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＨＥＫ２９３細胞の群から選択され、必要に応じて前述のＣＨＯ細胞が、ＥｘＰＡＳｙ受入番号ＣＶＣＬ＿ＪＹ７４を有するＣＨＯ－３Ｅ７細胞であり、必要に応じて前述のＨＥＫ２９３細胞が、ＥｘＰＡＳｙ受入番号ＣＶＣＬ＿ＨＦ２０を有するＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ１－６Ｅであり、さらに必要に応じて前述の宿主細胞が、プロテアーゼの発現を欠き、必要に応じて前述のプロテアーゼが、癌周囲の細胞または組織に存在する細胞内プロテアーゼまたはプロテアーゼであり、必要に応じて前述のプロテアーゼが、フューリン、ＭＭＰ２／９、またはカテプシンＢの群から選択され、必要に応じて前述の宿主細胞が、天然のヒューリン（ｆｕｉｎ）ノックアウト（ＫＯ）細胞であり、さらに必要に応じて前述の宿主細胞がＬｏＶｏ細胞である、実施形態７９～８２のいずれか１つに記載の方法。
均等物
本開示が上記の実施形態と併せて記載されているが、前述の説明および実施例が例示を目的とし、本発明の範囲を制限しないと理解すべきである。本開示の範囲内の他の態様、利点、および修正形態が、本開示に属する当業者に明らかであろう。
本明細書中に例示的に記載された開示は、本明細書中に具体的に開示されていない任意の構成要素（または複数）、限度（または複数）の非存在下で適切に実施され得る。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、広義かつ無制限に解釈されるものとする。さらに、本明細書中で使用した用語および表現は、制限のためではなく説明のために使用されており、かかる用語および表現の使用が、表示および記載の特徴の任意の等価物またはその一部を排除することを意図しないが、特許請求の範囲に記載の開示の範囲内で種々の修正が可能であることが認識される。
したがって、本開示を好ましい実施形態および必要に応じた特徴によって具体的に開示しているが、本明細書中に具体化された本開示の修正、改善、および変形を当業者が用いることができ、かかる修正、改善、および変形が本開示の範囲内になると見なされると理解すべきである。本明細書中に提供した材料、方法、および実施例は、好ましい実施形態の代表であり、例であり、本開示の範囲を制限することを意図しない。
本開示を、本明細書中に広義かつ包括的に記載している。包括的開示の範囲内にあるより狭義の種および包括未満の群の各々も、本開示の一部を形成する。これには、切り取った資料を本明細書中で具体的に引用するかどうかと無関係に、但し書きまたは属から任意の主題を除いた消極的限定を含む本発明の包括的説明を含む。
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群で記載されている場合、当業者は、本開示がマーカッシュ群のメンバーの任意の個別のメンバーまたはメンバーの下位集団に関しても記載されると認識するであろう。
本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、各々が個別に参照として援用される場合と同程度に、その全体が参照として明確に援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。
配列
SEQ ID NO:1
Human PTEN-L or pre-PTEN-L
LERGGEAAAAAAAAAAAPGRGSESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
SEQ ID NO:2
Human PTEN-S
MTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
SEQ ID NO:3
Mature human PTEN-L or PTEN-L
SESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
SEQ ID NO:4
Human PTEN-L signal peptide
LERGGEAAAAAAAAAAAPGRG
SEQ ID NO:5
Mature human PTEN-L Unique Domain (LUD)
SESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD
SEQ ID NO:6
Human PTEN-M
ISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
SEQ ID NO:7
Human PTEN-N
LPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
SEQ ID NO:8
Human PTEN-O
LAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
SEQ ID NO:9
Human PTEN-M Unique Domain (MUD)
ISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD
SEQ ID NO:10
Human PTEN-N Unique Domain (NUD)
LPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD
SEQ ID NO:11
Human PTEN-O Unique Domain (OUD)
LAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD
SEQ ID NO:12
Human Serum Albumin (HSA); (full length pre-protein)
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO:13
Mature Human Serum Albumin (HSA) (secreted form)
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO:14
PR1: SP(HSA)-HSA-Fu-PTEN-M-6xHis
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLTNRRKKRALDAAYISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVHHHHHH
SEQ ID NO:15
PR2: SP(HSA)-HSA-MMP2/9-PTEN-M-6xHis
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGPAALKAAISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVHHHHHH
SEQ ID NO:16
PR3: SP(HSA)-HSA-PTEN-M-6xHis
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SEQ ID NO:17
PR5: SP(HSA)-HSA-MMP2/9-Fu-PTEN-M-6xHis
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SEQ ID NO:18
PR6: SP(HSA)-HSA-PTEN-S-HAtag
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SEQ ID NO:19
PR61: SP(HSA)-HSA-PTEN-S-6xHis
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SEQ ID NO:20
PR62: SP(HSA)-HSA-Fu-PTEN-S-6xHis
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SEQ ID NO:21
PR63: SP(HSA)-HSA-[L(44-59)-L(151-173)]-PTEN-S-6xHis
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SEQ ID NO:22
PR64: SP(HSA)-HSA-Fu-[L(44-59)-L(151-173)]-PTEN-S-6xHis
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLTNRRKKRALDAAYPPTRRRRRRHIQGPGPKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVHHHHHH
SEQ ID NO:23
PR31: SP(HSA)-HSA-L(43-79)-PTEN-S-6xHis
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SEQ ID NO:24
PR32: SP(HSA)-HSA-L(80-120)-PTEN-S-6xHis
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SEQ ID NO:25
PR33: SP(HSA)-HSA-L(121-173)-PTEN-S-6xHis
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SEQ ID NO:26
PR4: SP(HSA)-PTEN-L-6xHis-MMP2/9-Fu-HSA-Flag
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SEQ ID NO:27
PR401: SP(HSA)-PTEN-L-Fu-HSA-6xHis
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SEQ ID NO:28
PR402: SP(HSA)-PTEN-L-HSA-6xHis
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRSESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH
SEQ ID NO:29
PR403: SP(HSA)-[L(22-27)-L(44-59)-L(151-173)]-PTEN-S-HSA-6xHis
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRSESPVTPPTRRRRRRHIQGPGPKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH
SEQ ID NO:30
PR404: SP(HSA)-[L(22-27)-L(44-59)-L(151-173)]-PTEN-S-Fu-HSA-6xHis
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRSESPVTPPTRRRRRRHIQGPGPKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVTNRRKKRALDAAYDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH
SEQ ID NO:31
PR410: SP(HSA)-PTEN-L-6xHis
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRSESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVHHHHHH
SEQ ID NO:32
PR411: SP(IgGκ)-PTEN-L-6xHis
MEFGLSWVFLVAILKGVQCSESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVHHHHHH
SEQ ID NO:33
PR412: SP(HSA)-PTEN-L(3xPro)-6xHis
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRSESPVTPSRAGNAGELVSPLLPPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPPAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVHHHHHH
SEQ ID NO:34
PR7: SP(IgGκ)-PTEN-L-6xHis-Fc
MEFGLSWVFLVAILKGVQCSESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVHHHHHHPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:35
PR700: SP(IgGκ)-PTEN-L-6xHis-Fc(N297Q)
MEFGLSWVFLVAILKGVQCSESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVHHHHHHEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:36
PR8: SP(IgGκ)-Fc-(GGGGS)-PTEN-M-6xHis
MEFGLSWVFLVAILKGVQCPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVHHHHHH
SEQ ID NO:37
PR911: SP(HSA)-HAtag-PTEN-S-(GGGG)-PTEN-L(8-173)-PTEN-S-6xHis
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRYPYDVPDYACMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVGGGGSRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVHHHHHH
SEQ ID NO:38
F131: SP(HSA)-HSA-MUD-(GGGGS)-p53-6xHis
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDGGGGSMEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSDHHHHHH
SEQ ID NO:39
Minimal Cell Penetration Domain (MCPD)
RRRRRR
SEQ ID NO:40
Membrane Binding Domain (MBD)
KKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD
SEQ ID NO:41
CspA-PTEN-L cDNA
ATGAAACGCATGAAATCGCTGGCTGCGGCGCTCACCGTCGCTGGGGCCATGCTGGCCGCACCTGTGGCAACGGCATCCGAGTCTCCTGTGACCATCTCTCGCGCTGGCAACGCTGGCGAGCTTGTCTCTCCGCTGCTGCTTCCTCCTACCCGTCGTCGTCGTCGTCGCCACATCCAGGGTCCAGGCCCAGTGCTGAACCTGCCATCCGCAGCTGCTGCACCACCAGTTGCACGTGCACCAGAAGCTGCCGGCGGTGGCTCCCGCTCCGAGGACTACTCCTCCTCCCCACACTCCGCAGCTGCTGCAGCTCGCCCACTGGCAGCAGAAGAGAAGCAGGCACAGTCCCTGCAGCCATCCTCCTCCCGCCGCTCCTCCCACTACCCAGCTGCTGTTCAGTCCCAGGCAGCTGCTGAACGCGGTGCTTCCGCAACCGCAAAGTCCCGTGCAATCTCCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCATCCCTGTCCTCCTTCTTCTTCTCCCACCGCCTGCCAGACATGACCGCTATCATCAAGGAAATCGTTTCCCGCAACAAGCGCCGCTACCAGGAAGATGGCTTCGATCTGGACCTGACCTACATCTACCCAAACATCATCGCAATGGGTTTCCCAGCTGAACGCCTGGAGGGCGTGTACCGCAACAACATCGATGACGTGGTCCGCTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTACAAGATCTACAACCTGTGCGCTGAACGCCACTACGATACCGCCAAGTTCAACTGCCGCGTCGCACAGTACCCATTCGAGGACCACAACCCACCACAGCTGGAACTGATCAAGCCATTCTGCGAGGATCTGGACCAGTGGCTGTCCGAAGATGACAACCACGTTGCAGCTATCCACTGCAAGGCTGGCAAGGGCCGCACCGGTGTGATGATCTGCGCCTACCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCTCAGGAAGCCCTGGATTTCTACGGTGAGGTTCGCACCCGCGACAAGAAGGGCGTGACCATCCCATCCCAGCGCCGCTACGTGTACTACTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGATTACCGCCCAGTCGCTCTGCTGTTCCACAAGATGATGTTCGAAACCATCCCAATGTTCTCCGGTGGCACCTGCAACCCACAGTTCGTTGTGTGCCAGCTGAAGGTCAAGATCTACTCCTCCAACTCCGGTCCAACCCGTCGCGAGGATAAGTTCATGTACTTCGAGTTCCCACAGCCACTGCCAGTGTGCGGCGACATCAAGGTCGAATTCTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTCCACTTCTGGGTCAACACCTTCTTCATCCCAGGTCCAGAAGAAACCTCTGAAAAGGTTGAGAACGGCTCCCTGTGCGATCAGGAGATCGACTCCATCTGCTCCATCGAACGCGCAGATAACGACAAGGAGTACCTGGTTCTGACCCTGACCAAGAACGATCTGGACAAGGCCAACAAGGACAAGGCAAACCGCTACTTCTCCCCAAACTTCAAGGTCAAGCTGTACTTCACCAAGACCGTTGAAGAGCCATCCAACCCAGAAGCTTCCTCCTCCACCTCTGTGACCCCAGATGTTTCCGACAACGAGCCAGATCACTACCGCTACTCCGATACCACCGACTCCGACCCTGAGAACGAGCCATTCGACGAGGACCAGCACACCCAGATTACCAAAGTCTAA
SEQ ID NO:42
CspB-TEV-PTEN-L cDNA
ATGTTTAACAACCGTATCCGCACTGCAGCTCTCGCTGGTGCAATCGCAATCTCCACCGCAGCTTCCGGCGTAGCTATCCCAGCATTCGCTGCAGAGACCAACCCAACCTCCGAGTCCCCTGTGACCATCTCCCGCGCCGGCAACGCTGGTGAACTCGTGTCCCCGCTCCTCCTCCCTCCGACCCGCCGTCGTCGCCGTCGCCACATCCAGGGTCCAGGCCCAGTGCTGAACCTGCCATCCGCAGCTGCTGCACCACCAGTTGCACGTGCACCAGAAGCTGCCGGCGGTGGCTCCCGCTCCGAGGACTACTCCTCCTCCCCACACTCCGCAGCTGCTGCAGCTCGCCCACTGGCAGCAGAAGAGAAGCAGGCACAGTCCCTGCAGCCATCCTCCTCCCGCCGCTCCTCCCACTACCCAGCTGCTGTTCAGTCCCAGGCAGCTGCTGAACGCGGTGCTTCCGCAACCGCAAAGTCCCGTGCAATCTCCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCATCCCTGTCCTCCTTCTTCTTCTCCCACCGCCTGCCAGACATGACCGCTATCATCAAGGAAATCGTTTCCCGCAACAAGCGCCGCTACCAGGAAGATGGCTTCGATCTGGACCTGACCTACATCTACCCAAACATCATCGCAATGGGTTTCCCAGCTGAACGCCTGGAGGGCGTGTACCGCAACAACATCGATGACGTGGTCCGCTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTACAAGATCTACAACCTGTGCGCTGAACGCCACTACGATACCGCCAAGTTCAACTGCCGCGTCGCACAGTACCCATTCGAGGACCACAACCCACCACAGCTGGAACTGATCAAGCCATTCTGCGAGGATCTGGACCAGTGGCTGTCCGAAGATGACAACCACGTTGCAGCTATCCACTGCAAGGCTGGCAAGGGCCGCACCGGTGTGATGATCTGCGCCTACCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCTCAGGAAGCCCTGGATTTCTACGGTGAGGTTCGCACCCGCGACAAGAAGGGCGTGACCATCCCATCCCAGCGCCGCTACGTGTACTACTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGATTACCGCCCAGTCGCTCTGCTGTTCCACAAGATGATGTTCGAAACCATCCCAATGTTCTCCGGTGGCACCTGCAACCCACAGTTCGTTGTGTGCCAGCTGAAGGTCAAGATCTACTCCTCCAACTCCGGTCCAACCCGTCGCGAGGATAAGTTCATGTACTTCGAGTTCCCACAGCCACTGCCAGTGTGCGGCGACATCAAGGTCGAATTCTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTCCACTTCTGGGTCAACACCTTCTTCATCCCAGGTCCAGAAGAAACCTCTGAAAAGGTTGAGAACGGCTCCCTGTGCGATCAGGAGATCGACTCCATCTGCTCCATCGAACGCGCAGATAACGACAAGGAGTACCTGGTTCTGACCCTGACCAAGAACGATCTGGACAAGGCCAACAAGGACAAGGCAAACCGCTACTTCTCCCCAAACTTCAAGGTCAAGCTGTACTTCACCAAGACCGTTGAAGAGCCATCCAACCCAGAAGCTTCCTCCTCCACCTCTGTGACCCCAGATGTTTCCGACAACGAGCCAGATCACTACCGCTACTCCGATACCACCGACTCCGACCCAGAGAACGAGCCATTCGATGAAGACCAGCACACCCAGATTACCAAAGTTTAG
SEQ ID NO:43
TorA-PTEN-L cDNA
ATGAACAATAACGATCTCTTTCAGGCATCACGTCGGCGTTTTCTGGCACAACTCGGCGGCTTAACCGTCGCCGGGATGCTGGGGCCGTCATTGTTAACGCCGCGACGTGCGACTGCGTCCGAGTCTCCTGTGACCATCTCTCGCGCTGGCAACGCTGGCGAGCTGGTCTCTCCTCTGCTGCTTCCTCCTACCCGTCGTCGTCGTCGTCGCCACATCCAGGGTCCAGGCCCAGTGCTGAACCTGCCATCCGCAGCTGCTGCACCACCAGTTGCACGCGCACCAGAAGCTGCCGGCGGTGGCTCCCGCTCCGAGGACTACTCCTCCTCCCCACACTCCGCAGCTGCTGCAGCTCGCCCACTGGCAGCAGAAGAGAAGCAGGCACAGTCCCTGCAGCCATCCTCCTCCCGCCGCTCCTCCCACTACCCAGCTGCTGTTCAGTCCCAGGCAGCTGCTGAACGCGGTGCTTCCGCAACCGCAAAGTCCCGTGCAATCTCCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCATCCCTGTCCTCCTTCTTCTTCTCCCACCGCCTGCCAGACATGACCGCTATCATCAAGGAAATCGTTTCCCGCAACAAGCGCCGCTACCAGGAAGATGGCTTCGATCTGGACCTGACCTACATCTACCCAAACATCATCGCAATGGGTTTCCCAGCTGAACGCCTGGAGGGCGTGTACCGCAACAACATCGATGACGTGGTCCGCTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTACAAGATCTACAACCTGTGCGCTGAACGCCACTACGATACCGCCAAGTTCAACTGCCGCGTCGCACAGTACCCATTCGAGGACCACAACCCACCACAGCTGGAACTGATCAAGCCATTCTGCGAGGATCTGGACCAGTGGCTGTCCGAAGATGACAACCACGTTGCAGCTATCCACTGCAAGGCTGGCAAGGGCCGCACCGGTGTGATGATCTGCGCCTACCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCTCAGGAAGCCCTGGATTTCTACGGTGAGGTTCGCACCCGCGACAAGAAGGGCGTGACCATCCCATCCCAGCGCCGCTACGTGTACTACTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGATTACCGCCCAGTCGCTCTGCTGTTCCACAAGATGATGTTCGAAACCATCCCAATGTTCTCCGGTGGCACCTGCAACCCACAGTTCGTTGTGTGCCAGCTGAAGGTCAAGATCTACTCCTCCAACTCCGGTCCAACCCGTCGCGAGGATAAGTTCATGTACTTCGAGTTCCCACAGCCACTGCCAGTGTGCGGCGACATCAAGGTCGAATTCTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTCCACTTCTGGGTCAACACCTTCTTCATCCCAGGTCCAGAAGAAACCTCTGAAAAGGTTGAGAACGGCTCCCTGTGCGATCAGGAGATCGACTCCATCTGCTCCATCGAACGCGCAGATAACGACAAGGAGTACCTGGTTCTGACCCTGACCAAGAACGATCTGGACAAGGCCAACAAGGACAAGGCAAACCGCTACTTCTCCCCAAACTTCAAGGTCAAGCTGTACTTCACCAAGACCGTTGAAGAGCCATCCAACCCAGAAGCTTCCTCCTCCACCTCTGTGACCCCAGATGTTTCCGACAACGAGCCAGATCACTACCGCTACTCCGATACCACCGACTCCGACCCTGAGAACGAGCCATTCGATGAAGACCAGCACACCCAGATTACCAAAGTTTAG
SEQ ID NO:44
Lp2958-PTEN-L cDNA
ATGAAATTATCGAAGCGTGGTTTATTCTGGCTGTTAGGTTTAGTCTCATTTGCGATCTTGTTGTTGTTCTCTCAGCCCTTGGGTGCTCAAGCTTCAGAGTCTCCAGTGACGATTTCGCGGGCGGGTAACGCCGGTGAATTGGTTAGCCCGCTATTGCTGCCACCGACCCGCCGACGGCGTCGGCGTCATATTCAGGGCCCAGGTCCGGTTTTGAACTTGCCTTCAGCGGCAGCTGCGCCTCCCGTCGCTCGGGCACCTGAAGCCGCTGGGGGCGGCTCGCGCTCAGAGGATTATAGTAGTAGTCCCCACAGTGCCGCCGCTGCGGCCCGCCCCCTAGCCGCCGAGGAAAAACAAGCACAGTCATTACAGCCTTCTAGTTCACGCCGTAGTTCTCATTACCCGGCAGCTGTCCAAAGCCAAGCGGCGGCCGAGCGTGGGGCAAGCGCCACTGCCAAGAGCCGTGCAATTTCGATTTTACAAAAGAAACCACGTCATCAACAGTTACTGCCGTCATTATCTAGCTTTTTCTTTAGTCATCGGCTACCAGATATGACAGCTATTATTAAAGAAATTGTTAGTCGAAATAAGCGGCGCTATCAAGAAGATGGTTTCGATTTAGATTTAACATACATTTATCCAAATATCATTGCGATGGGATTTCCCGCTGAGCGGTTGGAAGGCGTCTATCGAAACAATATCGACGATGTTGTCCGGTTTTTAGATTCGAAGCATAAGAATCACTACAAGATTTACAACCTGTGTGCAGAACGGCATTATGACACTGCGAAGTTTAATTGTCGAGTTGCACAATATCCGTTTGAAGATCATAACCCCCCACAATTAGAGTTAATCAAACCATTTTGTGAAGATTTAGATCAGTGGTTAAGTGAAGATGATAATCACGTGGCGGCTATTCATTGTAAGGCTGGGAAGGGTCGTACAGGCGTGATGATTTGCGCTTACTTATTACACCGTGGAAAGTTTCTAAAAGCGCAAGAAGCATTAGATTTCTATGGTGAAGTTCGTACCCGAGATAAAAAGGGCGTCACGATCCCGAGTCAACGCCGCTATGTTTACTACTATTCGTACTTACTAAAGAATCACCTAGATTATCGCCCAGTCGCTTTGTTGTTCCATAAGATGATGTTTGAAACGATTCCAATGTTTTCTGGTGGCACGTGTAACCCGCAATTTGTAGTGTGTCAACTAAAAGTGAAGATATATAGTTCAAATAGTGGGCCCACTCGACGGGAAGATAAGTTCATGTATTTCGAGTTTCCACAGCCATTGCCAGTTTGCGGAGACATCAAAGTCGAATTTTTCCACAAGCAAAATAAGATGCTGAAAAAAGATAAAATGTTTCACTTTTGGGTAAACACTTTCTTTATTCCAGGACCAGAAGAAACCTCTGAAAAAGTCGAAAATGGTTCGTTATGCGATCAAGAAATTGATTCGATTTGTAGTATTGAACGTGCGGACAATGACAAAGAATATCTGGTATTGACTTTGACGAAAAATGACTTGGACAAAGCCAATAAAGATAAGGCAAATCGGTACTTTTCACCGAACTTCAAGGTCAAATTATATTTTACGAAAACTGTGGAAGAACCATCAAATCCAGAGGCAAGCTCAAGCACCAGTGTTACACCTGACGTCAGTGACAACGAACCTGATCATTATCGGTATAGCGACACCACGGATTCAGATCCTGAAAATGAACCGTTTGACGAAGATCAACATACTCAGATCACGAAAGTTTGA
SEQ ID NO:45
Lp0297-PTEN-L cDNA
ATGAAAGAAGTGCGTTTCTGGGGTTTACTATTAGGGTTGTTTGTCTGTTTGGGTGCTGTTATCCCTCTGGTATCTAAAGCCTCAGAGTCTCCAGTGACGATTTCGCGGGCGGGTAACGCCGGTGAATTGGTTAGCCCGCTATTGCTGCCACCGACCCGCCGACGGCGTCGGCGTCATATTCAGGGCCCAGGTCCGGTTTTGAACTTGCCTTCAGCGGCAGCTGCGCCTCCCGTCGCTCGGGCACCTGAAGCCGCTGGGGGCGGCTCGCGCTCAGAGGATTATAGTAGTAGTCCCCACAGTGCCGCCGCTGCGGCCCGCCCCCTAGCCGCCGAGGAAAAACAAGCACAGTCATTACAGCCTTCTAGTTCACGCCGTAGTTCTCATTACCCGGCAGCTGTCCAAAGCCAAGCGGCGGCCGAGCGTGGGGCAAGCGCCACTGCCAAGAGCCGTGCAATTTCGATTTTACAAAAGAAACCACGTCATCAACAGTTACTGCCGTCATTATCTAGCTTTTTCTTTAGTCATCGGCTACCAGATATGACAGCTATTATTAAAGAAATTGTTAGTCGAAATAAGCGGCGCTATCAAGAAGATGGTTTCGATTTAGATTTAACATACATTTATCCAAATATCATTGCGATGGGATTTCCCGCTGAGCGGTTGGAAGGCGTCTATCGAAACAATATCGACGATGTTGTCCGGTTTTTAGATTCGAAGCATAAGAATCACTACAAGATTTACAACCTGTGTGCAGAACGGCATTATGACACTGCGAAGTTTAATTGTCGAGTTGCACAATATCCGTTTGAAGATCATAACCCCCCACAATTAGAGTTAATCAAACCATTTTGTGAAGATTTAGATCAGTGGTTAAGTGAAGATGATAATCACGTGGCGGCTATTCATTGTAAGGCTGGGAAGGGTCGTACAGGCGTGATGATTTGCGCTTACTTATTACACCGTGGAAAGTTTCTAAAAGCGCAAGAAGCATTAGATTTCTATGGTGAAGTTCGTACCCGAGATAAAAAGGGCGTCACGATCCCGAGTCAACGCCGCTATGTTTACTACTATTCGTACTTACTAAAGAATCACCTAGATTATCGCCCAGTCGCTTTGTTGTTCCATAAGATGATGTTTGAAACGATTCCAATGTTTTCTGGTGGCACGTGTAACCCGCAATTTGTAGTGTGTCAACTAAAAGTGAAGATATATAGTTCAAATAGTGGGCCCACTCGACGGGAAGATAAGTTCATGTATTTCGAGTTTCCACAGCCATTGCCAGTTTGCGGAGACATCAAAGTCGAATTTTTCCACAAGCAAAATAAGATGCTGAAAAAAGATAAAATGTTTCACTTTTGGGTAAACACTTTCTTTATTCCAGGACCAGAAGAAACCTCTGAAAAAGTCGAAAATGGTTCGTTATGCGATCAAGAAATTGATTCGATTTGTAGTATTGAACGTGCGGACAATGACAAAGAATATCTGGTATTGACTTTGACGAAAAATGACTTGGACAAAGCCAATAAAGATAAGGCAAATCGGTACTTTTCACCGAACTTCAAGGTCAAATTATATTTTACGAAAACTGTGGAAGAACCATCAAATCCAGAGGCAAGCTCAAGCACCAGTGTTACACCTGACGTCAGTGACAACGAACCTGATCATTATCGGTATAGCGACACCACGGATTCAGATCCTGAAAATGAACCGTTTGACGAAGATCAACATACTCAGATCACGAAAGTTTGA
SEQ ID NO:46
SP(αMF)-HSA-PTEN-M cDNA
ATGAGATTCCCATCTATTTTCACCGCTGTCTTGTTCGCTGCCTCCTCTGCATTGGCTGCCCCTGTTAACACTACCACTGAAGACGAGACTGCTCAAATTCCAGCTGAAGCAGTTATCGGTTACTCTGACCTTGAGGGTGATTTCGACGTCGCTGTTTTGCCTTTCTCTAACTCCACTAACAACGGTTTGTTGTTCATTAACACCACTATCGCTTCCATTGCTGCTAAGGAAGAGGGTGTCTCTCTCGAGAAAAGAGATGCTCATAAATCAGAGGTTGCACATAGGTTTAAAGATTTGGGTGAGGAAAATTTCAAGGCTCTAGTTTTGATTGCATTTGCACAATACCTACAGCAATGTCCATTTGAAGATCACGTAAAATTGGTCAATGAAGTCACAGAGTTTGCAAAGACATGCGTCGCCGACGAGAGTGCAGAGAATTGTGACAAATCCTTGCATACCCTTTTTGGTGATAAGCTATGTACAGTTGCTACATTGCGTGAGACATATGGTGAGATGGCTGATTGTTGTGCAAAGCAAGAGCCCGAAAGGAACGAATGTTTCTTGCAACATAAAGATGATAATCCAAATCTGCCTAGATTGGTCAGACCTGAAGTGGACGTCATGTGTACCGCTTTCCACGATAACGAAGAGACTTTCTTGAAAAAGTACTTGTATGAAATCGCTAGACGTCATCCTTACTTCTATGCACCAGAATTGCTTTTCTTCGCTAAGCGATACAAAGCTGCTTTCACTGAGTGTTGTCAGGCCGCAGACAAAGCAGCTTGTCTGTTACCTAAGCTCGACGAATTGCGTGACGAGGGTAAGGCAAGCTCCGCTAAACAAAGACTGAAGTGCGCTAGCTTGCAGAAGTTTGGAGAAAGAGCTTTTAAGGCCTGGGCTGTGGCACGACTGTCACAACGTTTTCCTAAGGCTGAGTTCGCTGAGGTTTCAAAACTAGTTACAGATTTGACAAAAGTGCACACAGAATGCTGTCATGGTGATTTACTGGAATGTGCAGACGATCGCGCTGATCTGGCAAAGTACATTTGCGAAAACCAGGATTCAATCTCTTCCAAATTAAAGGAATGCTGTGAAAAACCTTTGTTGGAAAAAAGTCATTGTATCGCTGAAGTGGAAAATGACGAAATGCCTGCCGATCTGCCTTCCTTAGCTGCCGACTTCGTAGAATCGAAAGACGTATGTAAAAATTACGCCGAAGCTAAAGACGTGTTTCTAGGTATGTTTTTGTACGAGTATGCTAGAAGGCACCCTGATTACTCAGTAGTCCTTTTGCTGAGACTTGCTAAAACGTATGAAACGACGCTGGAAAAATGTTGTGCTGCTGCCGATCCACATGAGTGTTACGCAAAAGTTTTTGATGAATTCAAACCTCTGGTTGAGGAACCTCAAAACTTGATTAAGCAAAATTGCGAGCTTTTTGAACAACTTGGTGAATATAAATTCCAGAATGCATTGTTGGTAAGATATACCAAAAAAGTTCCACAGGTGTCCACTCCAACATTGGTTGAAGTTTCCCGTAACTTGGGTAAGGTGGGTTCGAAGTGCTGCAAGCATCCTGAAGCTAAGAGAATGCCTTGCGCTGAGGACTATCTATCCGTCGTTCTTAACCAATTATGTGTTTTGCACGAAAAGACTCCCGTGAGTGACAGAGTTACTAAATGTTGTACTGAATCATTAGTTAACAGACGTCCATGTTTCTCTGCGCTCGAAGTTGACGAGACATACGTACCCAAGGAATTCAACGCCGAGACTTTTACTTTTCATGCTGACATTTGCACACTGTCGGAAAAGGAACGTCAGATCAAAAAGCAAACAGCTTTGGTCGAACTTGTGAAGCATAAGCCAAAAGCAACTAAAGAGCAATTGAAAGCTGTTATGGACGATTTTGCTGCATTTGTGGAGAAGTGTTGCAAGGCTGATGACAAAGAGACATGTTTCGCTGAAGAGGGTAAAAAACTAGTGGCCGCTTCTCAAGCAGCTCTGGGTTTGGGCCCAGCAGCATTAAAGGCTGCCACTAATCGTAGGAAAAAGAGAGCCTTGGATGCAGCTTATATCTCCAGAGCCGGAAATGCCGGTGAATTAGTTTCCCCACTGTTGTTGCCGCCCACTCGTAGACGTAGGCGTAGACATATCCAGGGACCAGGACCAGTGCTGAATTTACCTTCAGCTGCTGCTGCTCCGCCGGTAGCTAGGGCCCCAGAAGCGGCAGGAGGTGGTTCTAGGTCCGAGGATTACTCTAGCTCTCCACATTCGGCTGCTGCCGCCGCAAGACCTTTAGCAGCAGAAGAGAAGCAAGCACAATCTTTGCAACCTTCCTCCTCTAGAAGATCAAGCCATTATCCTGCTGCTGTCCAGAGTCAGGCAGCTGCTGAGAGGGGTGCCTCTGCTACTGCCAAATCTAGAGCTATATCTATCTTGCAGAAAAAGCCTAGACACCAACAACTCCTTCCATCCCTGTCGAGTTTCTTCTTCTCTCACAGGCTCCCAGATATGACTGCCATTATCAAGGAGATCGTCAGTCGTAACAAGAGAAGATACCAAGAGGACGGCTTCGACCTGGATCTTACATATATTTACCCAAACATCATAGCTATGGGGTTCCCCGCAGAAAGATTGGAAGGTGTCTATAGAAATAATATTGACGACGTTGTTAGATTTCTAGATAGCAAACATAAAAATCACTACAAGATATACAACCTCTGTGCTGAAAGACACTACGACACTGCTAAGTTCAATTGTAGAGTAGCACAGTACCCCTTCGAGGATCATAATCCTCCACAACTTGAGTTGATCAAACCTTTTTGTGAGGACTTGGACCAATGGCTGTCAGAGGACGATAATCACGTCGCAGCTATTCATTGTAAGGCTGGAAAAGGTCGAACAGGAGTCATGATTTGTGCTTATCTACTGCACAGAGGTAAGTTTCTAAAAGCTCAAGAGGCTTTGGATTTTTATGGTGAAGTTAGGACTAGAGACAAAAAGGGTGTTACCATCCCCAGCCAGAGAAGGTACGTATATTATTACAGTTATCTGTTGAAAAACCACTTAGACTACCGTCCCGTTGCACTGTTATTCCACAAGATGATGTTTGAAACGATCCCAATGTTCTCTGGTGGAACTTGTAACCCTCAATTCGTTGTTTGCCAGTTAAAGGTTAAAATTTATAGCTCCAATTCAGGACCCACAAGACGGGAAGATAAATTTATGTACTTTGAATTTCCACAACCATTGCCAGTCTGTGGTGATATTAAGGTAGAGTTTTTCCATAAGCAAAACAAAATGTTGAAAAAAGACAAAATGTTCCACTTCTGGGTGAATACCTTCTTCATTCCTGGACCAGAGGAAACGTCCGAAAAAGTTGAAAACGGCTCATTGTGTGATCAAGAGATTGACTCCATCTGTTCAATCGAGCGTGCAGACAATGATAAAGAGTACTTGGTGCTTACATTGACCAAAAATGATCTGGATAAGGCTAACAAAGACAAAGCCAATAGATATTTCTCACCAAATTTTAAAGTTAAGTTGTATTTCACCAAGACTGTTGAGGAGCCTTCCAATCCAGAAGCATCCAGCAGTACTTCAGTTACTCCAGACGTATCTGACAATGAGCCTGACCATTATCGTTACTCTGATACTACTGACTCCGATCCTGAAAACGAACCATTTGATGAGGACCAGCACACCCAAATTACAAAAGTTCATCACCATCATCATCACTAG
SEQ ID NO:47
SP(αMF)-PTEN-L cDNA
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAATTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAATGTCTGAGTCGCCAGTGACTATCTCCAGAGCCGGAAATGCCGGTGAATTAGTTTCCCCACTGTTGTTGCCGCCCACTCGTAGACGTAGGCGTAGACATATCCAGGGACCAGGACCAGTGCTGAATTTACCTTCAGCTGCTGCTGCTCCGCCGGTAGCTAGGGCCCCAGAAGCGGCAGGAGGTGGTTCTAGGTCCGAGGATTACTCTAGCTCTCCACATTCGGCTGCTGCCGCCGCAAGACCTTTAGCAGCAGAAGAGAAGCAAGCACAATCTTTGCAACCTTCCTCCTCTAGAAGATCAAGCCATTATCCTGCTGCTGTCCAGAGTCAGGCAGCTGCTGAGAGGGGTGCCTCTGCTACTGCCAAATCTAGAGCTATATCTATCTTGCAGAAAAAGCCTAGACACCAACAACTCCTTCCATCCCTGTCGAGTTTCTTCTTCTCTCACAGGCTCCCAGATATGACTGCCATTATCAAGGAGATCGTCAGTCGTAACAAGAGAAGATACCAAGAGGACGGCTTCGACCTGGATCTTACATATATTTACCCAAACATCATAGCTATGGGGTTCCCCGCAGAAAGATTGGAAGGTGTCTATAGAAATAATATTGACGACGTTGTTAGATTTCTAGATAGCAAACATAAAAATCACTACAAGATATACAACCTCTGTGCTGAAAGACACTACGACACTGCTAAGTTCAATTGTAGAGTAGCACAGTACCCCTTCGAGGATCATAATCCTCCACAACTTGAGTTGATCAAACCTTTTTGTGAGGACTTGGACCAATGGCTGTCAGAGGACGATAATCACGTCGCAGCTATTCATTGTAAGGCTGGAAAAGGTCGAACAGGAGTCATGATTTGTGCTTATCTACTGCACAGAGGTAAGTTTCTAAAAGCTCAAGAGGCTTTGGATTTTTATGGTGAAGTTAGGACTAGAGACAAAAAGGGTGTTACCATCCCCAGCCAGAGAAGGTACGTATATTATTACAGTTATCTGTTGAAAAACCACTTAGACTACCGTCCCGTTGCACTGTTATTCCACAAGATGATGTTTGAAACGATCCCAATGTTCTCTGGTGGAACTTGTAACCCTCAATTCGTTGTTTGCCAGTTAAAGGTTAAAATTTATAGCTCCAATTCAGGACCCACAAGACGGGAAGATAAATTTATGTACTTTGAATTTCCACAACCATTGCCAGTCTGTGGTGATATTAAGGTAGAGTTTTTCCATAAGCAAAACAAAATGTTGAAAAAAGACAAAATGTTCCACTTCTGGGTGAATACCTTCTTCATTCCTGGACCAGAGGAAACGTCCGAAAAAGTTGAAAACGGCTCATTGTGTGATCAAGAGATTGACTCCATCTGTTCAATCGAGCGTGCAGACAATGATAAAGAGTACTTGGTGCTTACATTGACCAAAAATGATCTGGATAAGGCTAACAAAGACAAAGCCAATAGATATTTCTCACCAAATTTTAAAGTTAAGTTGTATTTCACCAAGACTGTTGAGGAGCCTTCCAATCCAGAAGCATCCAGCAGTACTTCAGTTACTCCAGACGTATCTGACAATGAGCCTGACCATTATCGTTACTCTGATACTACTGACTCCGATCCTGAAAACGAACCATTTGATGAGGACCAGCACACCCAAATTACAAAAGTTTAG
SEQ ID NO:48
MMP2/9 & Furin-sensitive linker sequence
GPAALKAATNRRKKRALDAAY
SEQ ID NO:49
PR430: Trx-6xHis-UBI-TEV-PTEN-L
MVKQIESKTAFQEALDAAGDKLVVVDFSATWCGPCKMIKPFFHSLSEKYSNVIFLEVDVDDCQDVASECEVKCMPTFQFFKKGQKVGEFSGANKEKLEATINELVHHHHHHQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGENLYFQGSESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
SEQ ID NO:50
PR34: SP(HSA)-HSA-PTEN-M(ΔR6)-6xHis
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLISRAGNAGELVSPLLLPPTHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVHHHHHH
SEQ ID NO:51
Wider Cell Penetration Domain (WCPD)
LPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAA
SEQ ID NO:52
GGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD
SEQ ID NO:53
Cell Penetration Domain* (CPD*)
PPTRRRRRRHIQGPGP
SEQ ID NO:54
PR1 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGAAATGGGTCACCTTTATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCAGCAGCGCCTACAGCAGAGGCGTGTTCAGAAGAGATGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACAGATTCAAGGACCTGGGCGAAGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTCGCTCAGTACCTGCAGCAGTGCCCCTTTGAGGACCACGTGAAGCTGGTCAACGAAGTGACCGAGTTCGCCAAGACCTGCGTGGCCGATGAGAGCGCCGAGAACTGTGATAAGAGCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGTACAGTGGCCACACTGAGAGAAACCTACGGCGAGATGGCCGACTGCTGCGCCAAGCAAGAGCCCGAGAGAAACGAGTGCTTCCTGCAGCACAAGGACGACAACCCCAACCTGCCTAGACTCGTGCGGCCTGAAGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTCCACGACAACGAGGAAACCTTCCTGAAGAAGTACCTGTACGAGATCGCCAGACGGCACCCCTACTTTTACGCCCCTGAGCTGCTGTTCTTCGCCAAGCGGTATAAGGCCGCCTTCACCGAGTGTTGTCAGGCCGCTGATAAGGCTGCCTGCCTGCTGCCTAAGCTGGACGAGCTTAGAGATGAGGGCAAAGCCAGCTCCGCCAAGCAGAGACTGAAGTGTGCCAGCCTGCAGAAGTTCGGCGAGAGAGCCTTTAAGGCCTGGGCCGTTGCTAGACTGAGCCAGAGATTTCCCAAGGCCGAGTTTGCCGAGGTGTCCAAGCTCGTGACCGACCTGACAAAGGTGCACACCGAATGCTGCCACGGCGACCTGCTGGAATGCGCCGATGATAGAGCCGACCTGGCCAAGTACATCTGCGAGAACCAGGACAGCATCAGCAGCAAGCTGAAAGAGTGCTGCGAGAAGCCACTGCTGGAAAAGAGCCACTGTATCGCCGAGGTGGAAAACGACGAGATGCCCGCCGATCTGCCTTCTCTGGCCGCCGATTTTGTGGAAAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTACGCCGAGGCCAAGGATGTGTTCCTGGGCATGTTTCTGTATGAGTACGCCCGCAGACACCCCGACTACTCTGTTGTGCTGCTGCTGAGACTGGCCAAAACCTACGAGACAACCCTGGAAAAGTGCTGTGCCGCCGCTGATCCTCACGAGTGTTACGCCAAGGTGTTCGACGAGTTCAAGCCTCTGGTGGAAGAACCCCAGAACCTGATCAAGCAGAACTGCGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTACAAGTTCCAGAACGCCCTGCTCGTGCGGTACACCAAGAAGGTGCCCCAGGTTTCCACACCTACACTGGTTGAGGTGTCCCGGAACCTGGGCAAAGTGGGCAGCAAGTGTTGCAAGCACCCTGAGGCCAAGAGAATGCCCTGCGCCGAGGATTACCTGAGCGTGGTGCTGAATCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAAACCCCTGTGTCCGACAGAGTGACCAAGTGCTGTACCGAGAGCCTGGTCAACAGACGGCCTTGCTTTAGCGCCCTCGAGGTGGACGAGACATACGTGCCCAAAGAGTTCAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGACATCTGTACCCTGAGCGAGAAAGAGCGGCAGATCAAGAAACAGACTGCCCTGGTGGAACTGGTCAAGCACAAGCCCAAGGCCACCAAAGAACAGCTGAAGGCCGTGATGGACGACTTCGCCGCCTTCGTGGAAAAATGCTGCAAGGCCGACGACAAAGAGACATGCTTCGCCGAAGAGGGCAAGAAACTGGTGGCCGCTTCTCAGGCTGCTCTCGGACTTACAAACCGGCGGAAAAAGAGAGCCCTGGACGCCGCCTATATCAGCAGAGCTGGAAATGCCGGCGAGCTGGTGTCTCCTTTGCTGCTGCCTCCTACCAGACGGCGGAGAAGGCGGCATATACAAGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCATCTGCTGCTGCAGCTCCTCCTGTGGCTAGAGCACCTGAAGCTGCTGGCGGAGGCTCTAGAAGCGAGGACTACTCTAGCAGCCCTCATTCTGCTGCCGCTGCCGCTAGACCTCTGGCTGCCGAAGAAAAACAGGCCCAGAGTCTGCAGCCTAGCAGCTCCAGAAGAAGCAGCCATTATCCTGCCGCCGTGCAGTCACAGGCTGCAGCTGAAAGGGGAGCCTCTGCCACAGCCAAGAGCAGAGCCATCAGCATCCTGCAGAAAAAGCCCCGGCACCAGCAACTGCTGCCAAGCCTGAGCAGCTTCTTCTTCTCTCACCGGCTGCCTGACATGACCGCCATCATCAAAGAAATCGTGTCTCGGAACAAGCGGCGCTACCAAGAGGACGGCTTCGACCTGGATCTGACCTACATCTACCCCAACATCATTGCCATGGGCTTCCCCGCCGAAAGACTGGAAGGGGTGTACCGGAACAACATCGACGATGTCGTGCGGTTCCTGGACTCTAAGCACAAGAACCACTACAAGATCTACAACCTGTGCGCCGAGCGGCACTACGACACCGCCAAGTTCAATTGCAGAGTGGCCCAGTATCCTTTCGAGGATCACAACCCTCCACAGCTCGAACTGATTAAGCCCTTCTGCGAGGACCTGGACCAGTGGCTGAGCGAGGACGATAATCACGTGGCCGCCATCCACTGCAAAGCCGGCAAGGGAAGAACCGGCGTGATGATCTGTGCTTACCTGCTGCACCGGGGCAAGTTTCTGAAGGCCCAAGAGGCTCTGGACTTCTACGGCGAAGTGCGGACCAGAGACAAGAAAGGCGTGACAATCCCCAGCCAGCGGAGATACGTGTACTACTACAGCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGACCCGTCGCTCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACTATCCCCATGTTCTCCGGCGGCACCTGTAATCCCCAGTTCGTCGTGTGTCAGCTCAAAGTGAAGATCTACTCCAGCAACAGCGGCCCCACCAGACGCGAGGATAAGTTCATGTACTTCGAGTTCCCACAGCCACTGCCTGTGTGCGGCGATATCAAGGTGGAATTTTTCCATAAGCAGAACAAGATGCTGAAAAAGGACAAGATGTTCCACTTCTGGGTCAACACCTTCTTCATCCCCGGACCTGAAGAGACAAGCGAGAAGGTCGAGAACGGCTCCCTGTGCGACCAAGAGATCGACAGCATCTGCTCCATCGAGCGGGCCGACAATGACAAAGAATACCTGGTGCTCACCCTGACCAAGAACGATCTGGACAAGGCCAACAAGGATAAGGCCAACCGGTACTTCAGCCCCAACTTCAAAGTCAAGCTGTACTTCACCAAGACCGTCGAGGAACCCAGCAATCCAGAGGCCAGCTCTAGCACCTCTGTGACCCCTGACGTGTCCGATAACGAGCCCGACCACTACAGATACAGCGACACCACCGACAGCGACCCCGAGAACGAGCCTTTTGATGAGGACCAGCACACCCAGATCACCAAGGTGCACCACCACCATCACCACTGATAAGCTT
SEQ ID NO:55
PR2 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGAAATGGGTCACCTTTATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCAGCAGCGCCTACAGCAGAGGCGTGTTCAGAAGAGATGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACAGATTCAAGGACCTGGGCGAAGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTCGCTCAGTACCTGCAGCAGTGCCCCTTTGAGGACCACGTGAAGCTGGTCAACGAAGTGACCGAGTTCGCCAAGACCTGCGTGGCCGATGAGAGCGCCGAGAACTGTGATAAGAGCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGTACAGTGGCCACACTGAGAGAAACCTACGGCGAGATGGCCGACTGCTGCGCCAAGCAAGAGCCCGAGAGAAACGAGTGCTTCCTGCAGCACAAGGACGACAACCCCAACCTGCCTAGACTCGTGCGGCCTGAAGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTCCACGACAACGAGGAAACCTTCCTGAAGAAGTACCTGTACGAGATCGCCAGACGGCACCCCTACTTTTACGCCCCTGAGCTGCTGTTCTTCGCCAAGCGGTATAAGGCCGCCTTCACCGAGTGTTGTCAGGCCGCTGATAAGGCTGCCTGCCTGCTGCCTAAGCTGGACGAGCTTAGAGATGAGGGCAAAGCCAGCTCCGCCAAGCAGAGACTGAAGTGTGCCAGCCTGCAGAAGTTCGGCGAGAGAGCCTTTAAGGCCTGGGCCGTTGCTAGACTGAGCCAGAGATTTCCCAAGGCCGAGTTTGCCGAGGTGTCCAAGCTCGTGACCGACCTGACAAAGGTGCACACCGAATGCTGCCACGGCGACCTGCTGGAATGCGCCGATGATAGAGCCGACCTGGCCAAGTACATCTGCGAGAACCAGGACAGCATCAGCAGCAAGCTGAAAGAGTGCTGCGAGAAGCCACTGCTGGAAAAGAGCCACTGTATCGCCGAGGTGGAAAACGACGAGATGCCCGCCGATCTGCCTTCTCTGGCCGCCGATTTTGTGGAAAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTACGCCGAGGCCAAGGATGTGTTCCTGGGCATGTTTCTGTATGAGTACGCCCGCAGACACCCCGACTACTCTGTTGTGCTGCTGCTGAGACTGGCCAAAACCTACGAGACAACCCTGGAAAAGTGCTGTGCCGCCGCTGATCCTCACGAGTGTTACGCCAAGGTGTTCGACGAGTTCAAGCCTCTGGTGGAAGAACCCCAGAACCTGATCAAGCAGAACTGCGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTACAAGTTCCAGAACGCCCTGCTCGTGCGGTACACCAAGAAGGTGCCCCAGGTTTCCACACCTACACTGGTTGAGGTGTCCCGGAACCTGGGCAAAGTGGGCAGCAAGTGTTGCAAGCACCCTGAGGCCAAGAGAATGCCCTGCGCCGAGGATTACCTGAGCGTGGTGCTGAATCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAAACCCCTGTGTCCGACAGAGTGACCAAGTGCTGTACCGAGAGCCTGGTCAACAGACGGCCTTGCTTTAGCGCCCTCGAGGTGGACGAGACATACGTGCCCAAAGAGTTCAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGACATCTGTACCCTGAGCGAGAAAGAGCGGCAGATCAAGAAACAGACTGCCCTGGTGGAACTGGTCAAGCACAAGCCCAAGGCCACCAAAGAACAGCTGAAGGCCGTGATGGACGACTTCGCCGCCTTCGTGGAAAAATGCTGCAAGGCCGACGACAAAGAGACATGCTTCGCCGAAGAGGGCAAGAAACTGGTGGCCGCTTCTCAGGCTGCTCTCGGACTTGGACCTGCTGCTCTGAAAGCCGCCATCAGCAGAGCTGGAAATGCCGGCGAGCTGGTGTCTCCTTTGCTGCTGCCTCCTACCAGACGGCGGAGAAGGCGGCATATACAAGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCATCTGCTGCTGCAGCTCCTCCTGTGGCTAGAGCACCTGAAGCTGCTGGCGGAGGCTCTAGAAGCGAGGACTACTCTAGCAGCCCTCATTCTGCTGCCGCTGCCGCTAGACCTCTGGCTGCCGAAGAAAAACAGGCCCAGAGTCTGCAGCCTAGCAGCTCCAGAAGAAGCAGCCATTATCCTGCCGCCGTGCAGTCACAGGCTGCAGCTGAAAGGGGAGCCTCTGCCACAGCCAAGAGCAGAGCCATCAGCATCCTGCAGAAAAAGCCCCGGCACCAGCAACTGCTGCCAAGCCTGAGCAGCTTCTTCTTCTCTCACCGGCTGCCTGACATGACCGCCATCATCAAAGAAATCGTGTCTCGGAACAAGCGGCGCTACCAAGAGGACGGCTTCGACCTGGATCTGACCTACATCTACCCCAACATCATTGCCATGGGCTTCCCCGCCGAAAGACTGGAAGGGGTGTACCGGAACAACATCGACGATGTCGTGCGGTTCCTGGACTCTAAGCACAAGAACCACTACAAGATCTACAACCTGTGCGCCGAGCGGCACTACGACACCGCCAAGTTCAATTGCAGAGTGGCCCAGTATCCTTTCGAGGATCACAACCCTCCACAGCTCGAACTGATTAAGCCCTTCTGCGAGGACCTGGACCAGTGGCTGAGCGAGGACGATAATCACGTGGCCGCCATCCACTGCAAAGCCGGCAAGGGAAGAACCGGCGTGATGATCTGTGCTTACCTGCTGCACCGGGGCAAGTTTCTGAAGGCCCAAGAGGCTCTGGACTTCTACGGCGAAGTGCGGACCAGAGACAAGAAAGGCGTGACAATCCCCAGCCAGCGGAGATACGTGTACTACTACAGCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGACCCGTCGCTCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACTATCCCCATGTTCTCCGGCGGCACCTGTAATCCCCAGTTCGTCGTGTGTCAGCTCAAAGTGAAGATCTACTCCAGCAACAGCGGCCCCACCAGACGCGAGGATAAGTTCATGTACTTCGAGTTCCCACAGCCACTGCCTGTGTGCGGCGATATCAAGGTGGAATTTTTCCATAAGCAGAACAAGATGCTGAAAAAGGACAAGATGTTCCACTTCTGGGTCAACACCTTCTTCATCCCCGGACCTGAAGAGACAAGCGAGAAGGTCGAGAACGGCTCCCTGTGCGACCAAGAGATCGACAGCATCTGCTCCATCGAGCGGGCCGACAATGACAAAGAATACCTGGTGCTCACCCTGACCAAGAACGATCTGGACAAGGCCAACAAGGATAAGGCCAACCGGTACTTCAGCCCCAACTTCAAAGTCAAGCTGTACTTCACCAAGACCGTCGAGGAACCCAGCAATCCAGAGGCCAGCTCTAGCACCTCTGTGACCCCTGACGTGTCCGATAACGAGCCCGACCACTACAGATACAGCGACACCACCGACAGCGACCCCGAGAACGAGCCTTTTGATGAGGACCAGCACACCCAGATCACCAAGGTGCACCACCACCATCACCACTGATAAGCTT
SEQ ID NO:56
PR3 cDNA
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SEQ ID NO:57
PR5 cDNA
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SEQ ID NO:58
PR6 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGAAATGGGTCACCTTTATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCAGCAGCGCCTACAGCAGAGGCGTGTTCAGAAGAGATGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACAGATTCAAGGACCTGGGCGAAGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTCGCTCAGTACCTGCAGCAGTGCCCCTTTGAGGACCACGTGAAGCTGGTCAACGAAGTGACCGAGTTCGCCAAGACCTGCGTGGCCGATGAGAGCGCCGAGAACTGTGATAAGAGCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGTACAGTGGCCACACTGAGAGAAACCTACGGCGAGATGGCCGACTGCTGCGCCAAGCAAGAGCCCGAGAGAAACGAGTGCTTCCTGCAGCACAAGGACGACAACCCCAACCTGCCTAGACTCGTGCGGCCTGAAGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTCCACGACAACGAGGAAACCTTCCTGAAGAAGTACCTGTACGAGATCGCCAGACGGCACCCCTACTTTTACGCCCCTGAGCTGCTGTTCTTCGCCAAGCGGTATAAGGCCGCCTTCACCGAGTGTTGTCAGGCCGCTGATAAGGCTGCCTGCCTGCTGCCTAAGCTGGACGAGCTTAGAGATGAGGGCAAAGCCAGCTCCGCCAAGCAGAGACTGAAGTGTGCCAGCCTGCAGAAGTTCGGCGAGAGAGCCTTTAAGGCCTGGGCCGTTGCTAGACTGAGCCAGAGATTTCCCAAGGCCGAGTTTGCCGAGGTGTCCAAGCTCGTGACCGACCTGACAAAGGTGCACACCGAATGCTGCCACGGCGACCTGCTGGAATGCGCCGATGATAGAGCCGACCTGGCCAAGTACATCTGCGAGAACCAGGACAGCATCAGCAGCAAGCTGAAAGAGTGCTGCGAGAAGCCACTGCTGGAAAAGAGCCACTGTATCGCCGAGGTGGAAAACGACGAGATGCCCGCCGATCTGCCTTCTCTGGCCGCCGATTTTGTGGAAAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTACGCCGAGGCCAAGGATGTGTTCCTGGGCATGTTTCTGTATGAGTACGCCCGCAGACACCCCGACTACTCTGTTGTGCTGCTGCTGAGACTGGCCAAAACCTACGAGACAACCCTGGAAAAGTGCTGTGCCGCCGCTGATCCTCACGAGTGTTACGCCAAGGTGTTCGACGAGTTCAAGCCTCTGGTGGAAGAACCCCAGAACCTGATCAAGCAGAACTGCGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTACAAGTTCCAGAACGCCCTGCTCGTGCGGTACACCAAGAAGGTGCCCCAGGTTTCCACACCTACACTGGTTGAGGTGTCCCGGAACCTGGGCAAAGTGGGCAGCAAGTGTTGCAAGCACCCTGAGGCCAAGAGAATGCCCTGCGCCGAGGATTACCTGAGCGTGGTGCTGAATCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAAACCCCTGTGTCCGACAGAGTGACCAAGTGCTGTACCGAGAGCCTGGTCAACAGACGGCCTTGCTTTAGCGCCCTCGAGGTGGACGAGACATACGTGCCCAAAGAGTTCAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGACATCTGTACCCTGAGCGAGAAAGAGCGGCAGATCAAGAAACAGACTGCCCTGGTGGAACTGGTCAAGCACAAGCCCAAGGCCACCAAAGAACAGCTGAAGGCCGTGATGGACGACTTCGCCGCCTTCGTGGAAAAATGCTGCAAGGCCGACGACAAAGAGACATGCTTCGCCGAAGAGGGCAAGAAACTGGTGGCCGCTTCTCAGGCTGCTCTCGGACTTATGACCGCCATCATCAAAGAAATCGTGTCTCGGAACAAGCGGCGCTACCAAGAGGACGGCTTCGACCTGGATCTGACCTACATCTACCCCAACATCATTGCCATGGGCTTCCCCGCCGAAAGACTGGAAGGGGTGTACCGGAACAACATCGACGATGTCGTGCGGTTCCTGGACTCTAAGCACAAGAACCACTACAAGATCTACAACCTGTGCGCCGAGCGGCACTACGACACCGCCAAGTTCAATTGCAGAGTGGCCCAGTATCCTTTCGAGGATCACAACCCTCCACAGCTCGAACTGATTAAGCCCTTCTGCGAGGACCTGGACCAGTGGCTGAGCGAGGACGATAATCACGTGGCCGCCATCCACTGCAAAGCCGGCAAGGGAAGAACCGGCGTGATGATCTGTGCTTACCTGCTGCACCGGGGCAAGTTTCTGAAGGCCCAAGAGGCTCTGGACTTCTACGGCGAAGTGCGGACCAGAGACAAGAAAGGCGTGACAATCCCCAGCCAGCGGAGATACGTGTACTACTACAGCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGACCCGTCGCTCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACTATCCCCATGTTCTCCGGCGGCACCTGTAATCCCCAGTTCGTCGTGTGTCAGCTCAAAGTGAAGATCTACTCCAGCAACAGCGGCCCCACCAGACGCGAGGATAAGTTCATGTACTTCGAGTTCCCACAGCCACTGCCTGTGTGCGGCGATATCAAGGTGGAATTTTTCCATAAGCAGAACAAGATGCTGAAAAAGGACAAGATGTTCCACTTCTGGGTCAACACCTTCTTCATCCCCGGACCTGAAGAGACAAGCGAGAAGGTCGAGAACGGCTCCCTGTGCGACCAAGAGATCGACAGCATCTGCTCCATCGAGCGGGCCGACAATGACAAAGAATACCTGGTGCTCACCCTGACCAAGAACGATCTGGACAAGGCCAACAAGGATAAGGCCAACCGGTACTTCAGCCCCAACTTCAAAGTCAAGCTGTACTTCACCAAGACCGTCGAGGAACCCAGCAATCCAGAGGCCAGCTCTAGCACCTCTGTGACCCCTGACGTGTCCGATAACGAGCCCGACCACTACAGATACAGCGACACCACCGACAGCGACCCCGAGAACGAGCCTTTTGATGAGGACCAGCACACCCAGATCACCAAGGTGTACCCGTATGACGTGCCGGATTATGCGTGCTGATAAGCTTAAGCTT
SEQ ID NO:59
PR61 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGAAGTGGGTCACCTTTATTAGTCTGCTGTTTCTGTTTTCTTCCGCTTACTCACGAGGGGTCTTTAGGAGAGATGCTCACAAATCAGAGGTGGCCCACCGGTTTAAGGACCTGGGCGAGGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTTGCCCAGTATCTGCAGCAGTGCCCCTTCGAGGATCACGTGAAGCTGGTGAATGAGGTGACCGAGTTTGCCAAGACATGCGTGGCCGACGAGTCTGCCGAGAACTGTGATAAGAGCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGCACCGTGGCCACACTGCGGGAGACATACGGCGAGATGGCCGATTGCTGTGCCAAGCAGGAGCCCGAGAGAAATGAGTGCTTTCTGCAGCACAAGGACGATAACCCAAATCTGCCAAGGCTGGTGCGCCCTGAGGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTTCACGATAACGAGGAGACATTCCTGAAGAAGTATCTGTACGAGATCGCCCGGAGACACCCATATTTCTACGCCCCCGAGCTGCTGTTCTTTGCCAAGAGATATAAGGCCGCCTTTACCGAGTGCTGTCAGGCAGCAGACAAGGCAGCATGCCTGCTGCCTAAGCTGGACGAGCTGAGGGATGAGGGCAAGGCCAGCTCCGCCAAGCAGCGCCTGAAGTGTGCCAGCCTGCAGAAGTTTGGCGAGAGGGCCTTCAAGGCCTGGGCAGTGGCAAGGCTGTCTCAGAGATTTCCAAAGGCCGAGTTCGCCGAGGTGAGCAAGCTGGTGACCGATCTGACAAAGGTGCACACCGAGTGCTGTCACGGCGACCTGCTGGAGTGCGCAGACGATAGAGCCGATCTGGCCAAGTACATCTGTGAGAACCAGGACAGCATCTCTAGCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGAGAAGCCCCTGCTGGAGAAGTCCCACTGCATCGCCGAGGTGGAGAATGACGAGATGCCAGCAGATCTGCCTTCTCTGGCAGCAGACTTCGTGGAGAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTATGCCGAGGCCAAGGACGTGTTCCTGGGCATGTTCCTGTATGAGTACGCCAGGCGCCACCCAGACTATTCCGTGGTGCTGCTGCTGCGGCTGGCCAAGACCTACGAGACAACCCTGGAGAAGTGCTGTGCAGCAGCCGATCCCCACGAGTGCTACGCAAAGGTGTTTGACGAGTTCAAGCCTCTGGTGGAGGAGCCACAGAACCTGATCAAGCAGAATTGTGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTATAAGTTTCAGAATGCCCTGCTGGTGAGATACACCAAGAAGGTGCCCCAGGTGTCCACCCCTACACTGGTGGAGGTGTCTAGGAACCTGGGCAAGGTCGGCAGCAAGTGCTGTAAGCACCCAGAGGCAAAGAGGATGCCATGCGCAGAGGACTATCTGTCCGTGGTGCTGAATCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAGACCCCAGTGTCTGATAGGGTGACCAAGTGCTGTACAGAGTCCCTGGTGAATAGACGGCCCTGCTTCTCTGCCCTGGAGGTGGACGAGACATACGTGCCTAAGGAGTTTAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGATATCTGTACCCTGAGCGAGAAGGAGCGCCAGATCAAGAAGCAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCCACCAAGGAGCAGCTGAAGGCCGTGATGGACGATTTTGCCGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGTAAGGCCGACGATAAGGAGACATGCTTCGCAGAGGAGGGCAAGAAGCTGGTGGCAGCATCCCAGGCCGCCCTGGGCCTGATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCCGCAATAAGAGGCGCTATCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCAAACATCATCGCCATGGGATTTCCAGCAGAGAGGCTGGAGGGCGTGTACAGGAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGCGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTAGAGTGGCCCAGTACCCATTTGAGGACCACAATCCACCCCAGCTGGAGCTGATCAAGCCCTTTTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGAGCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGAAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACAGGGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGCGGACCAGAGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCTAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACCGCCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATAGCTCCAATTCTGGCCCCACCAGGCGCGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCCCAGCCTCTGCCAGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCCGGCCCTGAGGAGACAAGCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCCCTGTGCGACCAGGAGATCGATTCTATCTGTAGCATCGAGAGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATCGCTATTTTTCTCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTAGCAATCCAGAGGCCTCTAGCTCCACCAGCGTGACACCCGACGTGTCCGATAACGAGCCTGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCTGAGAACGAGCCATTTGACGAAGACCAGCATACTCAGATTACTAAAGTCCACCATCATCACCACCACTAATAAGCTTGGATCC
SEQ ID NO:60
PR62 cDNA
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SEQ ID NO:61
PR63 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGAAGTGGGTCACCTTTATTAGTCTGCTGTTTCTGTTTTCTTCCGCTTACTCACGAGGGGTCTTTAGGAGAGATGCTCACAAATCAGAGGTGGCCCACCGGTTTAAGGACCTGGGCGAGGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTTGCCCAGTATCTGCAGCAGTGCCCCTTCGAGGATCACGTGAAGCTGGTGAATGAGGTGACCGAGTTTGCCAAGACATGCGTGGCCGACGAGTCTGCCGAGAACTGTGATAAGAGCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGCACCGTGGCCACACTGCGGGAGACATACGGCGAGATGGCCGATTGCTGTGCCAAGCAGGAGCCCGAGAGAAATGAGTGCTTTCTGCAGCACAAGGACGATAACCCAAATCTGCCAAGGCTGGTGCGCCCTGAGGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTTCACGATAACGAGGAGACATTCCTGAAGAAGTATCTGTACGAGATCGCCCGGAGACACCCATATTTCTACGCCCCCGAGCTGCTGTTCTTTGCCAAGAGATATAAGGCCGCCTTTACCGAGTGCTGTCAGGCAGCAGACAAGGCAGCATGCCTGCTGCCTAAGCTGGACGAGCTGAGGGATGAGGGCAAGGCCAGCTCCGCCAAGCAGCGCCTGAAGTGTGCCAGCCTGCAGAAGTTTGGCGAGAGGGCCTTCAAGGCCTGGGCAGTGGCAAGGCTGTCTCAGAGATTTCCAAAGGCCGAGTTCGCCGAGGTGAGCAAGCTGGTGACCGATCTGACAAAGGTGCACACCGAGTGCTGTCACGGCGACCTGCTGGAGTGCGCAGACGATAGAGCCGATCTGGCCAAGTACATCTGTGAGAACCAGGACAGCATCTCTAGCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGAGAAGCCCCTGCTGGAGAAGTCCCACTGCATCGCCGAGGTGGAGAATGACGAGATGCCAGCAGATCTGCCTTCTCTGGCAGCAGACTTCGTGGAGAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTATGCCGAGGCCAAGGACGTGTTCCTGGGCATGTTCCTGTATGAGTACGCCAGGCGCCACCCAGACTATTCCGTGGTGCTGCTGCTGCGGCTGGCCAAGACCTACGAGACAACCCTGGAGAAGTGCTGTGCAGCAGCCGATCCCCACGAGTGCTACGCAAAGGTGTTTGACGAGTTCAAGCCTCTGGTGGAGGAGCCACAGAACCTGATCAAGCAGAATTGTGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTATAAGTTTCAGAATGCCCTGCTGGTGAGATACACCAAGAAGGTGCCCCAGGTGTCCACCCCTACACTGGTGGAGGTGTCTAGGAACCTGGGCAAGGTCGGCAGCAAGTGCTGTAAGCACCCAGAGGCAAAGAGGATGCCATGCGCAGAGGACTATCTGTCCGTGGTGCTGAATCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAGACCCCAGTGTCTGATAGGGTGACCAAGTGCTGTACAGAGTCCCTGGTGAATAGACGGCCCTGCTTCTCTGCCCTGGAGGTGGACGAGACATACGTGCCTAAGGAGTTTAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGATATCTGTACCCTGAGCGAGAAGGAGCGCCAGATCAAGAAGCAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCCACCAAGGAGCAGCTGAAGGCCGTGATGGACGATTTTGCCGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGTAAGGCCGACGATAAGGAGACATGCTTCGCAGAGGAGGGCAAGAAGCTGGTGGCAGCATCCCAGGCCGCCCTGGGCCTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCTGGACCAAAGAAGCCTAGACACCAGCAGCTGCTGCCATCCCTGTCCTCTTTCTTTTTCTCTCACAGGCTGCCTGACATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCCGCAATAAGAGGCGCTATCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCAAACATCATCGCCATGGGATTTCCAGCAGAGAGGCTGGAGGGCGTGTACAGGAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGCGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTAGAGTGGCCCAGTACCCATTTGAGGACCACAATCCACCCCAGCTGGAGCTGATCAAGCCCTTTTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGAGCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGAAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACAGGGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGCGGACCAGAGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCTAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACCGCCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATAGCTCCAATTCTGGCCCCACCAGGCGCGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCCCAGCCTCTGCCAGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCCGGCCCTGAGGAGACAAGCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCCCTGTGCGACCAGGAGATCGATTCTATCTGTAGCATCGAGAGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATCGCTATTTTTCTCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTAGCAATCCAGAGGCCTCTAGCTCCACCAGCGTGACACCCGACGTGTCCGATAACGAGCCTGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCTGAGAACGAGCCATTTGACGAAGACCAGCATACTCAGATTACTAAAGTCCACCATCATCACCACCACTAATAAGCTTGGATCC
SEQ ID NO:62
PR64 cDNA
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SEQ ID NO:63
PR31 cDNA
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SEQ ID NO:64
PR32 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGAAATGGGTCACCTTTATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCAGCAGCGCCTACAGCAGAGGCGTGTTCAGAAGAGATGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACAGATTCAAGGACCTGGGCGAAGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTCGCTCAGTACCTGCAGCAGTGCCCCTTTGAGGACCACGTGAAGCTGGTCAACGAAGTGACCGAGTTCGCCAAGACCTGCGTGGCCGATGAGAGCGCCGAGAACTGTGATAAGAGCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGTACAGTGGCCACACTGAGAGAAACCTACGGCGAGATGGCCGACTGCTGCGCCAAGCAAGAGCCCGAGAGAAACGAGTGCTTCCTGCAGCACAAGGACGACAACCCCAACCTGCCTAGACTCGTGCGGCCTGAAGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTCCACGACAACGAGGAAACCTTCCTGAAGAAGTACCTGTACGAGATCGCCAGACGGCACCCCTACTTTTACGCCCCTGAGCTGCTGTTCTTCGCCAAGCGGTATAAGGCCGCCTTCACCGAGTGTTGTCAGGCCGCTGATAAGGCTGCCTGCCTGCTGCCTAAGCTGGACGAGCTTAGAGATGAGGGCAAAGCCAGCTCCGCCAAGCAGAGACTGAAGTGTGCCAGCCTGCAGAAGTTCGGCGAGAGAGCCTTTAAGGCCTGGGCCGTTGCTAGACTGAGCCAGAGATTTCCCAAGGCCGAGTTTGCCGAGGTGTCCAAGCTCGTGACCGACCTGACAAAGGTGCACACCGAATGCTGCCACGGCGACCTGCTGGAATGCGCCGATGATAGAGCCGACCTGGCCAAGTACATCTGCGAGAACCAGGACAGCATCAGCAGCAAGCTGAAAGAGTGCTGCGAGAAGCCACTGCTGGAAAAGAGCCACTGTATCGCCGAGGTGGAAAACGACGAGATGCCCGCCGATCTGCCTTCTCTGGCCGCCGATTTTGTGGAAAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTACGCCGAGGCCAAGGATGTGTTCCTGGGCATGTTTCTGTATGAGTACGCCCGCAGACACCCCGACTACTCTGTTGTGCTGCTGCTGAGACTGGCCAAAACCTACGAGACAACCCTGGAAAAGTGCTGTGCCGCCGCTGATCCTCACGAGTGTTACGCCAAGGTGTTCGACGAGTTCAAGCCTCTGGTGGAAGAACCCCAGAACCTGATCAAGCAGAACTGCGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTACAAGTTCCAGAACGCCCTGCTCGTGCGGTACACCAAGAAGGTGCCCCAGGTTTCCACACCTACACTGGTTGAGGTGTCCCGGAACCTGGGCAAAGTGGGCAGCAAGTGTTGCAAGCACCCTGAGGCCAAGAGAATGCCCTGCGCCGAGGATTACCTGAGCGTGGTGCTGAATCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAAACCCCTGTGTCCGACAGAGTGACCAAGTGCTGTACCGAGAGCCTGGTCAACAGACGGCCTTGCTTTAGCGCCCTCGAGGTGGACGAGACATACGTGCCCAAAGAGTTCAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGACATCTGTACCCTGAGCGAGAAAGAGCGGCAGATCAAGAAACAGACTGCCCTGGTGGAACTGGTCAAGCACAAGCCCAAGGCCACCAAAGAACAGCTGAAGGCCGTGATGGACGACTTCGCCGCCTTCGTGGAAAAATGCTGCAAGGCCGACGACAAAGAGACATGCTTCGCCGAAGAGGGCAAGAAACTGGTGGCCGCTTCTCAGGCTGCTCTCGGACTTGGCGGAGGCTCTAGAAGCGAGGACTACTCTAGCAGCCCTCATTCTGCTGCCGCTGCCGCTAGACCTCTGGCTGCCGAAGAAAAACAGGCCCAGAGTCTGCAGCCTAGCAGCTCCAGAAGAAGCATGACCGCCATCATCAAAGAAATCGTGTCTCGGAACAAGCGGCGCTACCAAGAGGACGGCTTCGACCTGGATCTGACCTACATCTACCCCAACATCATTGCCATGGGCTTCCCCGCCGAAAGACTGGAAGGGGTGTACCGGAACAACATCGACGATGTCGTGCGGTTCCTGGACTCTAAGCACAAGAACCACTACAAGATCTACAACCTGTGCGCCGAGCGGCACTACGACACCGCCAAGTTCAATTGCAGAGTGGCCCAGTATCCTTTCGAGGATCACAACCCTCCACAGCTCGAACTGATTAAGCCCTTCTGCGAGGACCTGGACCAGTGGCTGAGCGAGGACGATAATCACGTGGCCGCCATCCACTGCAAAGCCGGCAAGGGAAGAACCGGCGTGATGATCTGTGCTTACCTGCTGCACCGGGGCAAGTTTCTGAAGGCCCAAGAGGCTCTGGACTTCTACGGCGAAGTGCGGACCAGAGACAAGAAAGGCGTGACAATCCCCAGCCAGCGGAGATACGTGTACTACTACAGCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGACCCGTCGCTCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACTATCCCCATGTTCTCCGGCGGCACCTGTAATCCCCAGTTCGTCGTGTGTCAGCTCAAAGTGAAGATCTACTCCAGCAACAGCGGCCCCACCAGACGCGAGGATAAGTTCATGTACTTCGAGTTCCCACAGCCACTGCCTGTGTGCGGCGATATCAAGGTGGAATTTTTCCATAAGCAGAACAAGATGCTGAAAAAGGACAAGATGTTCCACTTCTGGGTCAACACCTTCTTCATCCCCGGACCTGAAGAGACAAGCGAGAAGGTCGAGAACGGCTCCCTGTGCGACCAAGAGATCGACAGCATCTGCTCCATCGAGCGGGCCGACAATGACAAAGAATACCTGGTGCTCACCCTGACCAAGAACGATCTGGACAAGGCCAACAAGGATAAGGCCAACCGGTACTTCAGCCCCAACTTCAAAGTCAAGCTGTACTTCACCAAGACCGTCGAGGAACCCAGCAATCCAGAGGCCAGCTCTAGCACCTCTGTGACCCCTGACGTGTCCGATAACGAGCCCGACCACTACAGATACAGCGACACCACCGACAGCGACCCCGAGAACGAGCCTTTTGATGAGGACCAGCACACCCAGATCACCAAGGTGCACCACCACCATCACCACTGATAAGCTTGGATCC
SEQ ID NO:65
PR33 cDNA
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SEQ ID NO:66
PR4 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGAAGTGGGTGACCTTTATTAGCCTGCTGTTCCTGTTTAGTTCCGCATACTCAAGAGGGGTGTTTAGAAGAAGCGAGAGCCCTGTGACCATCTCCAGGGCCGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCTCCTCTGCTGCTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCCAGATCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCACACAGCGCCGCCGCCGCCGCCCGGCCCCTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGACATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAATAAGCGGCGGTACCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCCAACATCATCGCCATGGGATTTCCTGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTCGCGTGGCCCAGTACCCCTTTGAGGACCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGCAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGGCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCTGGCCCAACCCGGAGAGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCCAATCCAGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCTGACGTGTCCGATAACGAGCCAGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCAGAGAACGAGCCCTTTGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTGCATCACCACCACCACCACGGACCTGCCGCCCTGAAGGCAGCAACCAATAGGCGCAAGAAGAGGGCCCTGGACGCAGCATATGATGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACCGCTTTAAGGACCTGGGCGAGGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTTGCCCAGTACCTGCAGCAGTGCCCATTCGAGGATCACGTGAAGCTGGTGAATGAGGTGACCGAGTTTGCCAAGACATGCGTGGCCGACGAGAGCGCCGAGAACTGTGATAAGTCCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGCACCGTGGCCACACTGCGGGAGACATATGGCGAGATGGCCGATTGCTGTGCCAAACAGGAGCCTGAGAGAAATGAGTGCTTTCTGCAGCACAAGGACGATAACCCAAATCTGCCTAGGCTGGTGCGGCCCGAGGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTTCACGATAACGAGGAGACATTCCTGAAGAAGTATCTGTACGAGATCGCCCGGAGACACCCCTATTTCTACGCCCCTGAGCTGCTGTTTTTCGCCAAGAGATACAAGGCCGCCTTTACCGAGTGCTGTCAGGCAGCAGACAAGGCAGCATGCCTGCTGCCAAAGCTGGACGAGCTGAGGGATGAGGGCAAGGCCAGCTCCGCCAAGCAGAGACTGAAGTGTGCCAGCCTGCAGAAGTTTGGAGAGAGGGCCTTCAAGGCCTGGGCAGTGGCAAGGCTGAGCCAGCGGTTCCCAAAGGCAGAGTTCGCAGAGGTGTCCAAGCTGGTGACCGATCTGACAAAGGTGCACACCGAGTGCTGTCACGGCGACCTGCTGGAGTGCGCAGACGATAGGGCAGATCTGGCCAAGTACATCTGTGAGAACCAGGACTCTATCTCTAGCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGAGAAGCCCCTGCTGGAGAAGAGCCACTGCATCGCCGAGGTGGAGAATGACGAGATGCCTGCCGATCTGCCATCTCTGGCCGCCGACTTCGTGGAGAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTATGCCGAGGCCAAGGACGTGTTTCTGGGCATGTTCCTGTATGAGTACGCCAGGCGCCACCCCGATTATTCCGTGGTGCTGCTGCTGCGGCTGGCCAAGACCTACGAGACAACCCTGGAGAAGTGCTGTGCCGCCGCCGACCCCCACGAGTGCTACGCAAAGGTGTTTGACGAGTTCAAGCCACTGGTGGAGGAGCCCCAGAACCTGATCAAGCAGAATTGTGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTATAAGTTTCAGAATGCCCTGCTGGTGAGATACACAAAGAAGGTGCCTCAGGTGTCCACCCCAACACTGGTGGAGGTGTCTAGGAACCTGGGCAAGGTCGGCAGCAAGTGCTGTAAGCACCCAGAGGCAAAGAGGATGCCTTGCGCCGAGGACTATCTGTCTGTGGTGCTGAACCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAGACCCCCGTGAGCGATCGGGTGACCAAGTGCTGTACAGAGTCTCTGGTGAATAGACGGCCCTGCTTCAGCGCCCTGGAGGTGGACGAGACATACGTGCCAAAGGAGTTTAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGACATCTGTACCCTGTCCGAGAAGGAGAGACAGATCAAGAAGCAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTGAAGCACAAGCCTAAGGCCACCAAGGAGCAGCTGAAGGCCGTGATGGACGATTTTGCCGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGTAAGGCCGACGATAAGGAGACATGCTTCGCCGAGGAGGGCAAGAAGCTGGTCGCCGCTTCACAGGCTGCTCTGGGGCTGGACTACAAGGACGATGATGACAAATGATAAGCTT
SEQ ID NO:67
PR401 cDNA
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SEQ ID NO:68
PR402 cDNA
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SEQ ID NO:69
PR403
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SEQ ID NO:70
PR404
GAATTCCCGCCGCCACCATGAAGTGGGTGACCTTTATTAGCCTGCTGTTCCTGTTTAGTTCCGCATACTCAAGAGGGGTGTTTAGAAGAAGCGAGAGCCCTGTGACCCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGACATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAATAAGCGGCGGTACCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCCAACATCATCGCCATGGGATTTCCTGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTCGCGTGGCCCAGTACCCCTTTGAGGACCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGCAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGGCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCTGGCCCAACCCGGAGAGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCCAATCCAGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCTGACGTGTCCGATAACGAGCCAGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCAGAGAACGAGCCCTTTGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTGACCAATAGGCGCAAGAAGAGGGCCCTGGACGCAGCATATGATGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACCGCTTTAAGGACCTGGGCGAGGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTTGCCCAGTACCTGCAGCAGTGCCCATTCGAGGATCACGTGAAGCTGGTGAATGAGGTGACCGAGTTTGCCAAGACATGCGTGGCCGACGAGAGCGCCGAGAACTGTGATAAGTCCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGCACCGTGGCCACACTGCGGGAGACATATGGCGAGATGGCCGATTGCTGTGCCAAACAGGAGCCTGAGAGAAATGAGTGCTTTCTGCAGCACAAGGACGATAACCCAAATCTGCCTAGGCTGGTGCGGCCCGAGGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTTCACGATAACGAGGAGACATTCCTGAAGAAGTATCTGTACGAGATCGCCCGGAGACACCCCTATTTCTACGCCCCTGAGCTGCTGTTTTTCGCCAAGAGATACAAGGCCGCCTTTACCGAGTGCTGTCAGGCAGCAGACAAGGCAGCATGCCTGCTGCCAAAGCTGGACGAGCTGAGGGATGAGGGCAAGGCCAGCTCCGCCAAGCAGAGACTGAAGTGTGCCAGCCTGCAGAAGTTTGGAGAGAGGGCCTTCAAGGCCTGGGCAGTGGCAAGGCTGAGCCAGCGGTTCCCAAAGGCAGAGTTCGCAGAGGTGTCCAAGCTGGTGACCGATCTGACAAAGGTGCACACCGAGTGCTGTCACGGCGACCTGCTGGAGTGCGCAGACGATAGGGCAGATCTGGCCAAGTACATCTGTGAGAACCAGGACTCTATCTCTAGCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGAGAAGCCCCTGCTGGAGAAGAGCCACTGCATCGCCGAGGTGGAGAATGACGAGATGCCTGCCGATCTGCCATCTCTGGCCGCCGACTTCGTGGAGAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTATGCCGAGGCCAAGGACGTGTTTCTGGGCATGTTCCTGTATGAGTACGCCAGGCGCCACCCCGATTATTCCGTGGTGCTGCTGCTGCGGCTGGCCAAGACCTACGAGACAACCCTGGAGAAGTGCTGTGCCGCCGCCGACCCCCACGAGTGCTACGCAAAGGTGTTTGACGAGTTCAAGCCACTGGTGGAGGAGCCCCAGAACCTGATCAAGCAGAATTGTGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTATAAGTTTCAGAATGCCCTGCTGGTGAGATACACAAAGAAGGTGCCTCAGGTGTCCACCCCAACACTGGTGGAGGTGTCTAGGAACCTGGGCAAGGTCGGCAGCAAGTGCTGTAAGCACCCAGAGGCAAAGAGGATGCCTTGCGCCGAGGACTATCTGTCTGTGGTGCTGAACCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAGACCCCCGTGAGCGATCGGGTGACCAAGTGCTGTACAGAGTCTCTGGTGAATAGACGGCCCTGCTTCAGCGCCCTGGAGGTGGACGAGACATACGTGCCAAAGGAGTTTAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGACATCTGTACCCTGTCCGAGAAGGAGAGACAGATCAAGAAGCAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTGAAGCACAAGCCTAAGGCCACCAAGGAGCAGCTGAAGGCCGTGATGGACGATTTTGCCGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGTAAGGCCGACGATAAGGAGACATGCTTCGCCGAGGAGGGCAAGAAGCTGGTCGCCGCTTCACAGGCTGCTCTGGGGCTGCATCACCACCACCACCACTGATAAGCTTGGATCC
SEQ ID NO:71
PR410 cDNA
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SEQ ID NO:72
PR411 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGTCATGGGTGTTCCTGGTCGCAATCCTGAAAGGCGTGCAGTGTTCCGAGAGCCCTGTGACCATCTCCAGGGCCGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCTCCTCTGCTGCTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCCAGATCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCACACAGCGCCGCCGCCGCCGCCCGGCCCCTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGACATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAATAAGCGGCGGTACCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCCAACATCATCGCCATGGGATTTCCTGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTCGCGTGGCCCAGTACCCCTTTGAGGACCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGCAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGGCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCTGGCCCAACCCGGAGAGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCCAATCCAGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCTGACGTGTCCGATAACGAGCCAGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCAGAGAACGAGCCCTTTGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTGCATCACCACCACCACCACTGATAAGCTTGGATCC
SEQ ID NO:73
PR412 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGAAGTGGGTGACCTTTATTAGCCTGCTGTTCCTGTTTAGTTCCGCATACTCAAGAGGGGTGTTTAGAAGAAGCGAGAGCCCTGTGACCCCATCCAGGGCCGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCTCCTCTGCTGCCACCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCCAGATCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCACACAGCGCCGCCGCCGCCGCCCGGCCCCCAGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGACATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAATAAGCGGCGGTACCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCCAACATCATCGCCATGGGATTTCCTGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTCGCGTGGCCCAGTACCCCTTTGAGGACCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGCAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGGCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCTGGCCCAACCCGGAGAGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCCAATCCAGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCTGACGTGTCCGATAACGAGCCAGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCAGAGAACGAGCCCTTTGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTGCATCACCACCACCACCACTGATAAGCTTGGATCC
SEQ ID NO:74
PR7 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGTCCTGGGTCTTTCTGGTCGCAATCCTGAAGGGCGTGCAGTGTTCCGAATCCCCCGTCACAATCTCAAGGGCAGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCCCCACTGCTGCTGCCACCTACCCGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCAAGGGCACCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCAGCCGCTCCGAGGACTATAGCTCCTCTCCCCACTCCGCCGCAGCAGCAGCAAGGCCTCTGGCAGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGAGCCAGGCAGCAGCAGAGAGGGGAGCATCCGCCACCGCCAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCAAGGCACCAGCAGCTGCTGCCTTCCCTGTCTAGCTTCTTTTTCTCTCACAGGCTGCCCGATATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGTCCCGCAATAAGCGGAGATATCAGGAGGACGGCTTTGACCTGGATCTGACATATATCTACCCTAACATCATCGCCATGGGATTCCCAGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTTCTGGATAGCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGCGGCACTATGACACCGCCAAGTTTAACTGTAGAGTGGCCCAGTACCCCTTCGAGGATCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGAAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACAGGGGCAAGTTTCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTCTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCTTCTCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACAGCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACCGCCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACCATCCCAATGTTTTCTGGCGGCACATGCAACCCCCAGTTCGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATAGCGGCCCCACCCGGAGAGAGGACAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGATATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGACAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACAAGCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCCCTGTGCGACCAGGAGATCGATTCCATCTGTTCTATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCTAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTTACCAAGACAGTGGAGGAGCCCTCCAATCCTGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCAGACGTGTCCGATAACGAGCCCGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCTGAGAATGAGCCATTCGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTGCACCACCACCACCACCACCCTTGCCCAGCACCAGAGCTGCTGGGAGGCCCTAGCGTGTTTCTGTTCCCCCCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCAGCAGAACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTATAACTCTACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCTGCCCCAATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCAAAGGGACAGCCAAGGGAGCCACAGGTGTATACACTGCCACCCTCCCGCGATGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTTTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCAGAGAACAATTATAAGACCACACCTCCAGTGCTGGACAGCGATGGCTCCTTTTTCCTGTACTCTAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCTTGCAGCGTGATGCACGAGGCACTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCACTGTCCCTGTCCCCCGGATAAGGATCC
SEQ ID NO:75
PR700 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGTCCTGGGTCTTTCTGGTCGCAATCCTGAAGGGCGTGCAGTGTTCCGAATCCCCCGTCACAATCTCAAGGGCAGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCCCCACTGCTGCTGCCACCTACCCGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCAAGGGCACCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCAGCCGCTCCGAGGACTATAGCTCCTCTCCCCACTCCGCCGCAGCAGCAGCAAGGCCTCTGGCAGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGAGCCAGGCAGCAGCAGAGAGGGGAGCATCCGCCACCGCCAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCAAGGCACCAGCAGCTGCTGCCTTCCCTGTCTAGCTTCTTTTTCTCTCACAGGCTGCCCGATATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGTCCCGCAATAAGCGGAGATATCAGGAGGACGGCTTTGACCTGGATCTGACATATATCTACCCTAACATCATCGCCATGGGATTCCCAGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTTCTGGATAGCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGCGGCACTATGACACCGCCAAGTTTAACTGTAGAGTGGCCCAGTACCCCTTCGAGGATCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGAAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACAGGGGCAAGTTTCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTCTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCTTCTCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACAGCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACCGCCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACCATCCCAATGTTTTCTGGCGGCACATGCAACCCCCAGTTCGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATAGCGGCCCCACCCGGAGAGAGGACAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGATATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGACAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACAAGCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCCCTGTGCGACCAGGAGATCGATTCCATCTGTTCTATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCTAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTTACCAAGACAGTGGAGGAGCCCTCCAATCCTGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCAGACGTGTCCGATAACGAGCCCGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCTGAGAATGAGCCATTCGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTGCACCACCACCACCACCACGAGCCAAAGAGCTCCGATAAGACCCACACATGCCCACCTTGCCCAGCACCAGAGCTGCTGGGAGGCCCTAGCGTGTTTCTGTTCCCCCCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCAGCAGAACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTATCAGTCTACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCTGCCCCAATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCAAAGGGACAGCCAAGGGAGCCACAGGTGTATACACTGCCACCCTCCCGCGATGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTTTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCAGAGAACAATTATAAGACCACACCTCCAGTGCTGGACAGCGATGGCTCCTTTTTCCTGTACTCTAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCTTGCAGCGTGATGCACGAGGCACTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCACTGTCCCTGTCCCCCGGATAATAAGCTTGGATCC
SEQ ID NO:76
PR8 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGTCCTGGGTCTTCCTGGTCGCAATCCTGAAAGGCGTGCAGTGTCCCTGTCCCGCACCTGAGCTGCTGGGCGGACCTAGCGTGTTTCTGTTCCCCCCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCTGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCCAGGGAGGAGCAGTATAACTCTACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGCCCGCCCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCAAAGGGACAGCCAAGGGAGCCTCAGGTGTATACACTGCCACCCAGCCGCGATGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTTTACCCAAGCGACATCGCAGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAACAATTATAAGACCACACCTCCAGTGCTGGACAGCGATGGCTCCTTCTTTCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGATAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACACAGAAGTCTCTGAGCCTGTCCCCAGGAGGAGGAGGAGGCTCTATCAGCAGGGCAGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGAGCCCACTGCTGCTGCCACCTACCCGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCCGTGCTGAACCTGCCATCCGCCGCAGCAGCACCACCAGTGGCCAGGGCCCCTGAGGCCGCCGGCGGCGGCTCCCGCTCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCCCACAGCGCCGCAGCAGCAGCAAGGCCTCTGGCAGCAGAGGAGAAGCAGGCACAGTCCCTGCAGCCTAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCAGCAGCAGTGCAGTCTCAGGCAGCAGCAGAGAGGGGAGCAAGCGCCACCGCCAAGTCCAGAGCCATCTCTATCCTGCAGAAGAAGCCTAGACACCAGCAGCTGCTGCCATCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACAGGCTGCCCGATATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCCGCAATAAGCGGAGATATCAGGAGGACGGCTTTGACCTGGATCTGACATATATCTACCCAAACATCATCGCCATGGGATTCCCAGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTTCTGGATTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGCGGCACTATGACACCGCCAAGTTTAACTGTAGAGTGGCCCAGTACCCCTTCGAGGATCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGAGCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGAAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACAGGGGCAAGTTTCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTCTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCTTCCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCTTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACCGCCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACCATCCCAATGTTTAGCGGCGGCACATGCAACCCCCAGTTCGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCCGGCCCCACCCGGAGAGAGGACAAGTTTATGTACTTTGAGTTCCCTCAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGATATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGACAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCTGGCCCAGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATTCTATCTGTAGCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATATTTTTCTCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCATCCAATCCCGAGGCCAGCTCCTCTACCTCCGTGACACCCGACGTGTCTGATAACGAGCCTGACCACTATAGGTACAGCGATACCACAGACTCCGATCCTGAGAACGAGCCATTTGACGAAGACCAGCATACTCAGATTACTAAAGTCCACCATCACCACCACCATTGAGGATCC
SEQ ID NO:77
PR911 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGAAGTGGGTCACCTTTATTTCCCTGCTGTTCCTGTTTAGCTCCGCTTACTCAAGAGGCGTGTTCCGACGGTATCCTTATGATGTCCCCGACTACGCCTGCATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCCGGAACAAGCGGAGATATCAGGAGGATGGCTTTGACCTGGATCTGACATACATCTATCCAAATATCATCGCCATGGGATTCCCAGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGATTTCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTACAAGATCTATAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTACGACACCGCCAAGTTTAACTGTCGCGTGGCCCAGTATCCTTTCGAGGATCACAATCCCCCTCAGCTGGAGCTGATCAAGCCATTCTGTGAGGACCTGGATCAGTGGCTGAGCGAGGACGATAACCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGAAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTACCTGCTGCACAGGGGCAAGTTTCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTCTATGGCGAGGTGCGGACCAGAGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGAGGCGCTACGTGTACTATTACTCCTATCTGCTGAAGAATCACCTGGATTACAGGCCCGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCCATGTTTTCTGGCGGCACATGCAACCCTCAGTTCGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTACAGCTCCAATAGCGGCCCCACCCGGAGAGAGGACAAGTTCATGTATTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGATATCAAGGTGGAGTTCTTTCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGACAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTCTTTATCCCAGGCCCCGAGGAGACAAGCGAGAAGGTGGAGAACGGCTCCCTGTGCGACCAGGAGATCGATTCCATCTGTTCTATCGAGAGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATCGCTACTTTTCTCCAAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCAAGCAATCCCGAGGCCTCTAGCTCCACCTCTGTGACACCAGACGTGAGCGATAACGAGCCCGACCACTACAGGTATTCCGATACCACAGACTCTGATCCCGAGAACGAGCCTTTCGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAAGTGGGAGGAGGAGGCAGCCGCGCAGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCCCCACTGCTGCTGCCACCAACCAGGCGCCGGAGAAGGCGCCACATCCAGGGACCTGGACCAGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCTCCAGTGGCAAGGGCACCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCTAGAAGCGAGGACTACTCTAGCTCCCCACACTCCGCCGCAGCAGCAGCCAGGCCCCTGGCAGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCTCTAGCTCCCGGAGATCTAGCCACTATCCTGCCGCCGTGCAGTCTCAGGCAGCAGCAGAGAGGGGAGCAAGCGCCACCGCCAAGTCTAGAGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCTCGCCACCAGCAGCTGCTGCCATCTCTGTCCTCTTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCTGATATGACTGCTATCATCAAGGAAATCGTGAGCAGAAACAAGAGGCGCTACCAGGAAGACGGATTCGACCTGGATCTGACCTATATCTATCCTAACATTATTGCTATGGGCTTTCCAGCAGAGAGGCTGGAGGGCGTGTATCGCAATAACATCGACGATGTGGTGCGGTTTCTGGATAGCAAACATAAAAATCATTATAAAATCTATAATCTGTGCGCTGAAAGACATTATGATACTGCTAAGTTTAACTGCCGCGTGGCCCAGTATCCCTTCGAGGACCATAACCCTCCACAGCTGGAACTGATCAAGCCTTTCTGCGAAGACCTGGACCAGTGGCTGTCTGAAGATGACAATCATGTCGCCGCCATTCATTGTAAGGCAGGCAAGGGCAGAACCGGCGTGATGATTTGCGCCTACCTGCTGCACCGCGGCAAGTTTCTGAAAGCTCAAGAGGCCCTGGACTTCTATGGTGAGGTGAGGACCCGCGACAAAAAGGGCGTGACAATCCCTTCCCAGCGGAGATACGTGTATTACTATTCTTATCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGACCAGTGGCCCTGCTGTTCCATAAAATGATGTTTGAGACAATCCCTATGTTTTCCGGCGGCACATGCAATCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTAAAGATCTACAGCTCCAACTCTGGACCAACCAGGAGGGAGGATAAGTTCATGTACTTCGAGTTCCCACAGCCTCTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCATAAACAAAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAAATGTTCCATTTTTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCCGGCCCTGAGGAGACATCCGAAAAAGTGGAGAACGGCTCTCTGTGCGATCAGGAAATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGAGAGCTGATAATGACAAAGAATACCTGGTGCTGACCCTGACGAAAAACGACCTGGACAAAGCTAACAAGGATAAGGCCAATAGATACTTTAGCCCCAATTTCAAGGTGAAGCTGTATTTCACCAAAACCGTGGAGGAGCCTTCCAACCCAGAGGCCTCTTCCTCCACCTCCGTGACACCCGACGTGTCTGATAATGAGCCTGACCACTACAGATATAGCGATACCACAGACTCCGATCCTGAGAATGAGCCATTTGACGAGGACCAGCATACCCAGATTACTAAAGTGCATCATCACCACCACCATTGATAAGCTTGGATCC
SEQ ID NO:78
F131 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGAAATGGGTCACCTTTATCAGTCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGTGCTTATTCTAGGGGCGTGTTTAGGCGGGATGCTCACAAGTCCGAGGTGGCCCACCGCTTTAAGGATCTGGGCGAGGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTTGCCCAGTACCTGCAGCAGTGCCCCTTCGAGGACCACGTGAAGCTGGTGAACGAGGTGACCGAGTTTGCCAAGACATGCGTGGCCGACGAGAGCGCCGAGAATTGTGATAAGTCCCTGCACACCCTGTTCGGCGATAAGCTGTGCACCGTGGCCACACTGCGCGAGACATATGGCGAGATGGCCGACTGCTGTGCCAAGCAGGAGCCAGAGCGGAACGAGTGCTTTCTGCAGCACAAGGACGATAACCCAAATCTGCCCAGACTGGTGAGGCCCGAGGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTTCACGATAATGAGGAGACATTCCTGAAGAAGTACCTGTATGAGATCGCCCGGAGACACCCTTACTTCTATGCCCCAGAGCTGCTGTTCTTTGCCAAGAGATACAAGGCCGCCTTTACCGAGTGCTGTCAGGCAGCAGATAAGGCAGCATGCCTGCTGCCAAAGCTGGACGAGCTGAGAGATGAGGGCAAGGCCAGCTCCGCCAAGCAGAGGCTGAAGTGTGCCTCCCTGCAGAAATTTGGCGAGCGCGCCTTCAAGGCCTGGGCAGTGGCAAGGCTGTCCCAGCGGTTTCCAAAGGCCGAGTTCGCCGAGGTGTCTAAGCTGGTGACCGACCTGACAAAGGTGCACACCGAGTGCTGTCACGGCGACCTGCTGGAGTGCGCAGACGATAGGGCAGATCTGGCCAAGTACATCTGTGAGAACCAGGACTCCATCTCTAGCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGAGAAGCCCCTGCTGGAGAAGTCTCACTGCATCGCCGAGGTGGAGAACGACGAGATGCCAGCAGATCTGCCTAGCCTGGCAGCAGACTTCGTGGAGTCCAAGGACGTGTGCAAGAATTACGCCGAGGCCAAGGACGTGTTCCTGGGCATGTTCCTGTACGAGTATGCCAGGCGCCACCCTGACTACAGCGTGGTGCTGCTGCTGCGCCTGGCCAAGACCTATGAGACCACACTGGAGAAGTGCTGTGCCGCCGCCGATCCACACGAGTGCTATGCCAAGGTGTTTGACGAGTTCAAGCCCCTGGTGGAGGAGCCTCAGAACCTGATCAAGCAGAATTGTGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTACAAGTTTCAGAACGCCCTGCTGGTGCGGTATACAAAGAAGGTGCCACAGGTGTCTACCCCCACACTGGTGGAGGTGAGCAGAAATCTGGGCAAGGTCGGCTCCAAGTGCTGTAAGCACCCTGAGGCCAAGAGGATGCCATGCGCCGAGGATTACCTGTCTGTGGTGCTGAATCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAGACCCCCGTGAGCGACAGAGTGACCAAGTGCTGTACAGAGTCCCTGGTGAACCGGAGACCTTGCTTCTCTGCCCTGGAGGTGGATGAGACATATGTGCCAAAGGAGTTTAATGCCGAGACCTTTACATTCCACGCCGACATCTGTACCCTGAGCGAGAAGGAGAGGCAGATCAAGAAGCAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTGAAGCACAAGCCTAAGGCCACCAAGGAGCAGCTGAAGGCCGTGATGGACGATTTTGCCGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGTAAGGCCGACGATAAGGAGACATGCTTCGCAGAGGAGGGCAAGAAGCTGGTGGCAGCATCTCAGGCCGCCCTGGGACTGATCAGCAGAGCAGGAAACGCAGGAGAGCTGGTGTCCCCACTGCTGCTGCCACCTACCAGGCGCCGGAGAAGGCGCCACATCCAGGGACCAGGACCCGTGCTGAATCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCAAGAGCACCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCTAGGAGCGAGGACTACTCCTCTAGCCCTCACAGCGCCGCAGCAGCAGCAAGGCCACTGGCAGCAGAGGAGAAGCAGGCACAGTCCCTGCAGCCATCCTCTAGCCGGAGATCCTCTCACTATCCTGCCGCCGTGCAGAGCCAGGCAGCAGCAGAGAGGGGAGCATCCGCCACCGCCAAGTCCCGGGCCATCTCTATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGAGCTCCTTCTTTTTCAGCCACAGGCTGCCAGATGGAGGAGGAGGCTCCATGGAGGAGCCACAGTCTGACCCCAGCGTGGAGCCTCCACTGTCTCAGGAGACATTCAGCGACCTGTGGAAGCTGCTGCCCGAGAACAATGTGCTGAGCCCTCTGCCATCCCAGGCCATGGACGATCTGATGCTGAGCCCTGACGATATCGAGCAGTGGTTTACCGAGGACCCCGGACCTGATGAGGCACCTAGAATGCCAGAGGCAGCACCACCTGTGGCACCAGCACCAGCCGCCCCTACACCAGCCGCCCCCGCCCCTGCCCCATCCTGGCCCCTGTCTAGCTCCGTGCCTTCCCAGAAGACCTACCAGGGCTCTTATGGCTTTAGGCTGGGCTTCCTGCACTCCGGCACAGCCAAGTCTGTGACCTGCACATACAGCCCAGCCCTGAACAAGATGTTCTGCCAGCTGGCCAAGACCTGTCCCGTGCAGCTGTGGGTGGATTCTACCCCACCACCTGGAACACGGGTGAGAGCAATGGCAATCTATAAGCAGAGCCAGCACATGACAGAGGTGGTGAGGCGCTGCCCACACCACGAGCGGTGTTCCGACTCTGATGGACTGGCACCACCACAGCACCTGATCAGGGTGGAGGGCAACCTGCGGGTGGAGTACCTGGACGATAGAAATACCTTCAGGCACAGCGTGGTGGTGCCCTATGAGCCTCCAGAAGTGGGCTCCGACTGCACCACAATCCACTACAACTATATGTGCAATTCTAGCTGTATGGGCGGCATGAACCGGAGACCTATCCTGACCATCATCACACTGGAGGATTCCTCTGGCAACCTGCTGGGCAGAAATTCCTTTGAGGTGAGGGTGTGCGCATGTCCTGGAAGGGACAGGAGGACCGAGGAGGAGAATCTGCGGAAGAAGGGAGAGCCACACCACGAGCTGCCACCTGGCAGCACCAAGCGCGCCCTGCCCAACAATACAAGCTCCTCTCCCCAGCCCAAGAAGAAGCCTCTGGATGGCGAGTACTTCACACTGCAGATCAGGGGCCGCGAGCGGTTTGAGATGTTCCGGGAGCTGAATGAGGCCCTGGAGCTGAAGGACGCACAGGCAGGCAAGGAGCCTGGAGGCTCTAGAGCCCACAGCTCCCACCTGAAGAGCAAGAAGGGCCAGAGCACCTCCAGGCACAAGAAACTGATGTTCAAAACTGAGGGACCCGATTCCGACCACCACCACCACCACCACTAAAAGCTTGGATCC
SEQ ID NO:79
CspA-PTEN-L
MKRMKSLAAALTVAGAMLAAPVATASESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
SEQ ID NO:80
CspB-TEV-PTEN-L
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETNPTSESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
SEQ ID NO:81
TorA-PTEN-L
MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATASESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
SEQ ID NO:82
Lp2958-PTEN-L
MKLSKRGLFWLLGLVSFAILLLFSQPLGAQASESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
SEQ ID NO:83
Lp0297-PTEN-L
MKEVRFWGLLLGLFVCLGAVIPLVSKASESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
SEQ ID NO:84
SP(αMF)-HSA-PTEN-M
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGPAALKAATNRRKKRALDAAYISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVHHHHHH
SEQ ID NO:85
SP(αMF)-PTEN-L
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDELEGDFDVAVLPFSASIAAKEEGVSLEKRMSESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
SEQ ID NO:86
Gp64-Trx-TEV-PTEN-M-6xHis (cDNA)
GAATTCGCCGCCACCATGGTTTCGGCAATCGTCCTCTACGTTCTCCTGGCTGCTGCGGCTCATTCGGCTTTCGCCTCGGACAAAATCATCCACCTCACTGACGACTCCTTCGACACTGACGTCCTGAAGGCTGACGGTGCTATCCTGGTGGACTTCTGGGCCCACTGGTGCGGTCCATGCAAGATGATCGCTCCAATCCTGGACGAGATCGCCGACGAATACCAGGGCAAGCTGACTGTCGCTAAGCTGAACATCGACCACAACCCAGGTACCGCCCCAAAGTACGGTATCCGTGGTATCCCCACTCTGCTGCTGTTCAAGAACGGAGAAGTGGCCGCTACCAAGGTCGGTGCTCTGTCAAAGGGACAGCTGAAGGAGTTCCTGGACGCTAACCTGGCTGAGAACCTGTACTTCCAGGGTATCAGCAGAGCTGGCAACGCCGGTGAACTGGTCTCCCCACTGCTGCTGCCACCTACCCGTAGACGCAGGCGTAGACACATCCAGGGACCAGGTCCTGTCCTGAACCTGCCTTCAGCTGCTGCCGCTCCTCCAGTCGCCAGAGCTCCAGAGGCTGCCGGAGGCGGTTCTCGTTCCGAGGACTACTCCTCTAGCCCTCACTCCGCTGCCGCTGCTGCTAGACCACTGGCCGCTGAAGAGAAGCAGGCCCAGAGCCTGCAGCCATCCAGCTCAAGGCGTAGCTCTCACTACCCTGCTGCCGTCCAGTCACAGGCTGCTGCCGAAAGAGGCGCTTCCGCCACCGCTAAGTCCAGAGCTATCTCCATCCTGCAGAAGAAGCCACGTCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCCAGCTTCTTCTTCTCACACCGTCTGCCAGACATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTCAGCAGAAACAAGCGTAGATACCAGGAGGACGGTTTCGACCTGGACCTGACTTACATCTACCCAAACATCATCGCTATGGGTTTCCCCGCTGAAAGGCTGGAGGGTGTCTACCGTAACAACATCGACGACGTCGTGAGATTCCTGGACAGCAAGCACAAGAACCACTACAAGATCTACAACCTGTGCGCTGAGAGACACTACGACACCGCTAAGTTCAACTGCCGTGTGGCTCAGTACCCATTCGAGGACCACAACCCCCCTCAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAAGACCTGGACCAGTGGCTGTCCGAGGACGACAACCACGTGGCTGCCATCCACTGCAAGGCTGGCAAGGGTAGGACCGGTGTGATGATCTGCGCTTACCTGCTGCACCGCGGAAAGTTCCTGAAGGCTCAGGAGGCCCTGGACTTCTACGGCGAAGTGAGAACCCGTGACAAGAAGGGTGTGACCATCCCTTCCCAGCGTAGATACGTGTACTACTACAGCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGACCCGTGGCCCTGCTGTTCCACAAGATGATGTTCGAGACTATCCCCATGTTCTCCGGAGGTACCTGCAACCCACAGTTCGTGGTCTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTACTCCTCTAACTCCGGACCTACTAGACGTGAAGACAAGTTCATGTACTTCGAGTTCCCCCAGCCACTGCCTGTGTGCGGTGACATCAAGGTGGAGTTCTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGACAAGATGTTCCACTTCTGGGTCAACACCTTCTTCATCCCTGGTCCAGAAGAAACTTCCGAAAAGGTCGAGAACGGTAGCCTGTGCGACCAGGAGATCGACTCCATCTGCTCCATCGAACGTGCCGACAACGACAAGGAGTACCTGGTGCTGACTCTGACCAAGAACGACCTGGACAAGGCTAACAAGGACAAGGCCAACAGATACTTCTCCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACTAAGACCGTCGAAGAGCCATCCAACCCAGAAGCCAGCAGCTCCACCTCCGTCACTCCTGACGTCTCAGACAACGAACCAGACCACTACAGATACAGCGACACCACTGACTCCGACCCCGAGAACGAGCCATTCGACGAGGACCAACATACTCAGATTACCAAAGTTCATCATCATCATCACCATTAATGAAAGCTT
SEQ ID NO:87
Gp64-Trx-TEV-PTEN-M-6xHis
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFASDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAHWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDHNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAENLYFQGISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVHHHHHH
SEQ ID NO:88
Mouse PTEN-S
MTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHSQITKV
SEQ ID NO:89
Mature mouse PTEN-L
SESPVTIARAGNAGELLSPLLLPPTRRRRRRHVQGPGPVLSLPSAAAAPPLARAPEAAGGGSRCEDYPSSPHSAASAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQGQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHSQITKV
SEQ ID NO:90
Mature Simian Serum Albumin (SSA)
DTHKSEVAHRFKDLGEEHFKGLVLVAFSQYLQQCPFEEHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPPLVRPEVDVMCTAFHDNEATFLKKYLYEVARRHPYFYAPELLFFAARYKAAFAECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGDRAFKAWAVARLSQKFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYMCENQDSISSKLKECCDKPLLEKSHCLAEVENDEMPADLPSLAADYVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVMLLLRLAKAYEATLEKCCAAADPHECYAKVFDEFQPLVEEPQNLVKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGAKCCKLPEAKRMPCAEDYLSVVLNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALELDEAYVPKAFNAETFTFHADMCTLSEKEKQVKKQTALVELVKHKPKATKEQLKGVMDNFAAFVEKCCKADDKEACFAEEGPKFVAASQAALA
SEQ ID NO:91
Mature Rat Serum Albumin (RSA)
EAHKSEIAHRFKDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCPYEEHIKLVQEVTDFAKTCVADENAENCDKSIHTLFGDKLCAIPKLRDNYGELADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPPFQRPEAEAMCTSFQENPTSFLGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEKYNEVLTQCCTESDKAACLTPKLDAVKEKALVAAVRQRMKCSSMQRFGERAFKAWAVARMSQRFPNAEFAEITKLATDVTKINKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQACCDKPVLQKSQCLAEIEHDNIPADLPSIAADFVEDKEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEGDPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCELYEKLGEYGFQNAVLVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEAQRLPCVEDYLSAILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATEDQLKTVMGDFAQFVDKCCKAADKDNCFATEGPNLVARSKEALA
SEQ ID NO:92
Mature Mouse Serum Albumin (MSA)
EAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALA
SEQ ID NO:93
Signal Peptide of Human Serum Albumin
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR
SEQ ID NO:94
Signal Peptide of Simian Serum Albumin
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR
SEQ ID NO:95
Signal Peptide of Rat Serum Albumin
MKWVTFLLLLFISGSAFSRGVFRR
SEQ ID NO:96
Signal Peptide of Mouse Serum Albumin
MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGVFRR
SEQ ID NO:97
Signal Peptide of murine α2-macroglobulin
MRRNQLPTPAFLLLFLLLPRDA
SEQ ID NO:98
Signal Peptide of murine fibrinogen
MLSLRVTCLILSVASTVWT
SEQ ID NO:99
Signal Peptide of murine α1-antitrypsin
MTPSISWGLLLLAGLCCLVPSFLA
SEQ ID NO:100
Signal Peptide of murine IgGκ chain
METDTLLLWVLLLWVPGSTG
SEQ ID NO:101
Signal Peptide of human IgGκ heavy chain
MEFGLSWVFLVAILKGVQC
SEQ ID NO:102
Signal Peptide of human IgGκ chain
MVLQTQVFISLLLWISGAYG
SEQ ID NO:103
Human Siglec 3 (CD33) Signal Peptide
MPLLLLLPLLWAGALA
SEQ ID NO:104
Artificial Signal Peptide (Secrecon)
MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA
SEQ ID NO:105
Artificial Signal Peptide (Boosted Secrecon)
MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWAAA
SEQ ID NO:106
Cathepsin B-sensitive linker sequence
GGAGS
SEQ ID NO:107
Cathepsin B-sensitive linker sequence
GFVG
SEQ ID NO:108
Cathepsin B-sensitive linker sequence
FGFVG
SEQ ID NO:109
PR419: SP(SEQ ID NO:97)-PTEN-L-HSA-6xHis
MRRNQLPTPAFLLLFLLLPRDASESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH
SEQ ID NO:110
PR420: SP(SEQ ID NO:98)-PTEN-L-HSA-6xHis
MLSLRVTCLILSVASTVWTSESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH
SEQ ID NO:111
PR421: SP(SEQ ID NO:99)-PTEN-L-HSA-6xHis
MTPSISWGLLLLAGLCCLVPSFLASESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH
SEQ ID NO:112
PR422: SP(SEQ ID NO:100)-PTEN-L-HSA-6xHis
METDTLLLWVLLLWVPGSTGSESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH
SEQ ID NO:113
PR424: SP(SEQ ID NO:102)-PTEN-L-HSA-6xHis
MVLQTQVFISLLLWISGAYGSESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH
SEQ ID NO:114
PR425: SP(SEQ ID NO:103)-PTEN-L-HSA-6xHis
MPLLLLLPLLWAGALASESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH
SEQ ID NO:115
PR426: SP(SEQ ID NO:104)-PTEN-L-HSA-6xHis
MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWASESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPSAAAAPPVARAPEAAGGGSRSEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQSQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKVDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH
SEQ ID NO:116
PR427: SP(SEQ ID NO:105)-PTEN-L-HSA-6xHis
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SEQ ID NO:117
PR428: SP(MSA)-muPTEN-L-MSA-6xHis
MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGVFRRSESPVTIARAGNAGELLSPLLLPPTRRRRRRHVQGPGPVLSLPSAAAAPPLARAPEAAGGGSRCEDYPSSPHSAASAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQGQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHSQITKVEAHKSEIAHRFKDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCPYEEHIKLVQEVTDFAKTCVADENAENCDKSIHTLFGDKLCAIPKLRDNYGELADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPPFQRPEAEAMCTSFQENPTSFLGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEKYNEVLTQCCTESDKAACLTPKLDAVKEKALVAAVRQRMKCSSMQRFGERAFKAWAVARMSQRFPNAEFAEITKLATDVTKINKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQACCDKPVLQKSQCLAEIEHDNIPADLPSIAADFVEDKEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEGDPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCELYEKLGEYGFQNAVLVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEAQRLPCVEDYLSAILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATEDQLKTVMGDFAQFVDKCCKAADKDNCFATEGPNLVARSKEALAHHHHHH
SEQ ID NO:118
PR409: SP(HSA)-HAtag-PTEN-L-HSA-6xHis
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SEQ ID NO:119
PR415: SP(HSA)-PTEN-L-HSA(C34S)
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SEQ ID NO:120
PR416: SP(HSA)-PTEN-M-HSA(C34S)
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SEQ ID NO:121
PR413: SP(HSA)-PTEN-L-HSA(1-385)-6xHis
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SEQ ID NO:122
PR414: SP(HSA)-PTEN-L-HSA(1-197)-6xHis
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SEQ ID NO:123
PR417: SP(HSA)-PTEN-L-HSA(35-585)-6xHis
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SEQ ID NO:124
PR418: SP(HSA)-PTEN-L-HSA(63-585)-6xHis
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SEQ ID NO:125
PR65: SP(HSA)-PTEN-S(2-403)-HSA-6xHis
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SEQ ID NO:126
PR66: SP(MSA)-RSA-mouse PTEN-S(2-403)-6xHis
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SEQ ID NO:127
PR67: SP(MSA)-RSA(1-381)-mouse PTEN-S(2-403)-6xHis
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SEQ ID NO:128
PR68: SP(MSA)-MSA-mouse PTEN-S(2-403)-6xHis
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SEQ ID NO:129
PR405: SP(HSA)-PTEN-L-MMP2/9-HSA-6xHis
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SEQ ID NO:130
PR406: SP(HSA)-PTEN-L-cathepsin B-HSA-6xHis
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SEQ ID NO:131
PR407: SP(HSA)-PTEN-L-cathepsin B*-HSA-6xHis
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SEQ ID NO:132
PR408: SP(HSA)-PTEN-L-cathepsinB**-HSA-6xHis
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SEQ ID NO:133
F137: SP(HSA)-LUD-p53-HSA-6xHis
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SEQ ID NO:134
SESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPVLNLPDAAAAPPVARAPEAAGGGSRDEDYSSSPHSAAAAARPLAAEEKQAQSLQPDSDRRSSHYPAAVQDQAAAERGASADAKSRAISILQKKPRHQQLLPDLSDFFFDHRLPD
SEQ ID NO:135
PR430 cDNA
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SEQ ID NO:136
PR34 cDNA
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SEQ ID NO:137
PR419 cDNA
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SEQ ID NO:138
PR420 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGCTGTCTCTGAGGGTGACCTGCCTGATCCTGAGCGTGGCCTCCACCGTGTGGACAAGCGAGAGCCCTGTGACCATCTCCAGGGCCGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCTCCTCTGCTGCTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCCAGATCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCACACAGCGCCGCCGCCGCCGCCCGGCCCCTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGACATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAATAAGCGGCGGTACCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCCAACATCATCGCCATGGGATTTCCTGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTCGCGTGGCCCAGTACCCCTTTGAGGACCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGCAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGGCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCTGGCCCAACCCGGAGAGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCCAATCCAGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCTGACGTGTCCGATAACGAGCCAGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCAGAGAACGAGCCCTTTGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTGGATGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACCGCTTTAAGGACCTGGGCGAGGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTTGCCCAGTACCTGCAGCAGTGCCCATTCGAGGATCACGTGAAGCTGGTGAATGAGGTGACCGAGTTTGCCAAGACATGCGTGGCCGACGAGAGCGCCGAGAACTGTGATAAGTCCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGCACCGTGGCCACACTGCGGGAGACATATGGCGAGATGGCCGATTGCTGTGCCAAACAGGAGCCTGAGAGAAATGAGTGCTTTCTGCAGCACAAGGACGATAACCCAAATCTGCCTAGGCTGGTGCGGCCCGAGGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTTCACGATAACGAGGAGACATTCCTGAAGAAGTATCTGTACGAGATCGCCCGGAGACACCCCTATTTCTACGCCCCTGAGCTGCTGTTTTTCGCCAAGAGATACAAGGCCGCCTTTACCGAGTGCTGTCAGGCAGCAGACAAGGCAGCATGCCTGCTGCCAAAGCTGGACGAGCTGAGGGATGAGGGCAAGGCCAGCTCCGCCAAGCAGAGACTGAAGTGTGCCAGCCTGCAGAAGTTTGGAGAGAGGGCCTTCAAGGCCTGGGCAGTGGCAAGGCTGAGCCAGCGGTTCCCAAAGGCAGAGTTCGCAGAGGTGTCCAAGCTGGTGACCGATCTGACAAAGGTGCACACCGAGTGCTGTCACGGCGACCTGCTGGAGTGCGCAGACGATAGGGCAGATCTGGCCAAGTACATCTGTGAGAACCAGGACTCTATCTCTAGCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGAGAAGCCCCTGCTGGAGAAGAGCCACTGCATCGCCGAGGTGGAGAATGACGAGATGCCTGCCGATCTGCCATCTCTGGCCGCCGACTTCGTGGAGAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTATGCCGAGGCCAAGGACGTGTTTCTGGGCATGTTCCTGTATGAGTACGCCAGGCGCCACCCCGATTATTCCGTGGTGCTGCTGCTGCGGCTGGCCAAGACCTACGAGACAACCCTGGAGAAGTGCTGTGCCGCCGCCGACCCCCACGAGTGCTACGCAAAGGTGTTTGACGAGTTCAAGCCACTGGTGGAGGAGCCCCAGAACCTGATCAAGCAGAATTGTGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTATAAGTTTCAGAATGCCCTGCTGGTGAGATACACAAAGAAGGTGCCTCAGGTGTCCACCCCAACACTGGTGGAGGTGTCTAGGAACCTGGGCAAGGTCGGCAGCAAGTGCTGTAAGCACCCAGAGGCAAAGAGGATGCCTTGCGCCGAGGACTATCTGTCTGTGGTGCTGAACCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAGACCCCCGTGAGCGATCGGGTGACCAAGTGCTGTACAGAGTCTCTGGTGAATAGACGGCCCTGCTTCAGCGCCCTGGAGGTGGACGAGACATACGTGCCAAAGGAGTTTAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGACATCTGTACCCTGTCCGAGAAGGAGAGACAGATCAAGAAGCAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTGAAGCACAAGCCTAAGGCCACCAAGGAGCAGCTGAAGGCCGTGATGGACGATTTTGCCGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGTAAGGCCGACGATAAGGAGACATGCTTCGCCGAGGAGGGCAAGAAGCTGGTCGCCGCTTCACAGGCTGCTCTGGGGCTGCATCACCACCACCACCACTGATAAGCTTGGATCC
SEQ ID NO:139
PR421 cDNA
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SEQ ID NO:140
PR422 cDNA
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SEQ ID NO:141
PR424 cDNA
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SEQ ID NO:142
PR425 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGCCCCTGCTGCTGCTGCTGCCTCTGCTGTGGGCCGGCGCTCTGGCCAGCGAGAGCCCTGTGACCATCTCCAGGGCCGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCTCCTCTGCTGCTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCCAGATCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCACACAGCGCCGCCGCCGCCGCCCGGCCCCTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGACATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAATAAGCGGCGGTACCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCCAACATCATCGCCATGGGATTTCCTGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTCGCGTGGCCCAGTACCCCTTTGAGGACCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGCAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGGCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCTGGCCCAACCCGGAGAGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCCAATCCAGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCTGACGTGTCCGATAACGAGCCAGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCAGAGAACGAGCCCTTTGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTGGATGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACCGCTTTAAGGACCTGGGCGAGGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTTGCCCAGTACCTGCAGCAGTGCCCATTCGAGGATCACGTGAAGCTGGTGAATGAGGTGACCGAGTTTGCCAAGACATGCGTGGCCGACGAGAGCGCCGAGAACTGTGATAAGTCCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGCACCGTGGCCACACTGCGGGAGACATATGGCGAGATGGCCGATTGCTGTGCCAAACAGGAGCCTGAGAGAAATGAGTGCTTTCTGCAGCACAAGGACGATAACCCAAATCTGCCTAGGCTGGTGCGGCCCGAGGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTTCACGATAACGAGGAGACATTCCTGAAGAAGTATCTGTACGAGATCGCCCGGAGACACCCCTATTTCTACGCCCCTGAGCTGCTGTTTTTCGCCAAGAGATACAAGGCCGCCTTTACCGAGTGCTGTCAGGCAGCAGACAAGGCAGCATGCCTGCTGCCAAAGCTGGACGAGCTGAGGGATGAGGGCAAGGCCAGCTCCGCCAAGCAGAGACTGAAGTGTGCCAGCCTGCAGAAGTTTGGAGAGAGGGCCTTCAAGGCCTGGGCAGTGGCAAGGCTGAGCCAGCGGTTCCCAAAGGCAGAGTTCGCAGAGGTGTCCAAGCTGGTGACCGATCTGACAAAGGTGCACACCGAGTGCTGTCACGGCGACCTGCTGGAGTGCGCAGACGATAGGGCAGATCTGGCCAAGTACATCTGTGAGAACCAGGACTCTATCTCTAGCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGAGAAGCCCCTGCTGGAGAAGAGCCACTGCATCGCCGAGGTGGAGAATGACGAGATGCCTGCCGATCTGCCATCTCTGGCCGCCGACTTCGTGGAGAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTATGCCGAGGCCAAGGACGTGTTTCTGGGCATGTTCCTGTATGAGTACGCCAGGCGCCACCCCGATTATTCCGTGGTGCTGCTGCTGCGGCTGGCCAAGACCTACGAGACAACCCTGGAGAAGTGCTGTGCCGCCGCCGACCCCCACGAGTGCTACGCAAAGGTGTTTGACGAGTTCAAGCCACTGGTGGAGGAGCCCCAGAACCTGATCAAGCAGAATTGTGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTATAAGTTTCAGAATGCCCTGCTGGTGAGATACACAAAGAAGGTGCCTCAGGTGTCCACCCCAACACTGGTGGAGGTGTCTAGGAACCTGGGCAAGGTCGGCAGCAAGTGCTGTAAGCACCCAGAGGCAAAGAGGATGCCTTGCGCCGAGGACTATCTGTCTGTGGTGCTGAACCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAGACCCCCGTGAGCGATCGGGTGACCAAGTGCTGTACAGAGTCTCTGGTGAATAGACGGCCCTGCTTCAGCGCCCTGGAGGTGGACGAGACATACGTGCCAAAGGAGTTTAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGACATCTGTACCCTGTCCGAGAAGGAGAGACAGATCAAGAAGCAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTGAAGCACAAGCCTAAGGCCACCAAGGAGCAGCTGAAGGCCGTGATGGACGATTTTGCCGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGTAAGGCCGACGATAAGGAGACATGCTTCGCCGAGGAGGGCAAGAAGCTGGTCGCCGCTTCACAGGCTGCTCTGGGGCTGCATCACCACCACCACCACTGATAAGCTTGGATCC
SEQ ID NO:143
PR426 cDNA
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SEQ ID NO:144
PR427 cDNA
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SEQ ID NO:145
PR428 cDNA
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SEQ ID NO:146
PR409 cDNA
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SEQ ID NO:147
PR415 cDNA
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SEQ ID NO:148
PR416 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGAAGTGGGTGACCTTTATTAGCCTGCTGTTCCTGTTTAGTTCCGCATACTCAAGAGGGGTGTTTAGAAGAATCTCCAGGGCCGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCTCCTCTGCTGCTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCCAGATCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCACACAGCGCCGCCGCCGCCGCCCGGCCCCTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGACATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAATAAGCGGCGGTACCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCCAACATCATCGCCATGGGATTTCCTGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTCGCGTGGCCCAGTACCCCTTTGAGGACCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGCAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGGCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCTGGCCCAACCCGGAGAGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCCAATCCAGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCTGACGTGTCCGATAACGAGCCAGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCAGAGAACGAGCCCTTTGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTGGATGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACCGCTTTAAGGACCTGGGCGAGGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTTGCCCAGTACCTGCAGCAGAGCCCATTCGAGGATCACGTGAAGCTGGTGAATGAGGTGACCGAGTTTGCCAAGACATGCGTGGCCGACGAGAGCGCCGAGAACTGTGATAAGTCCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGCACCGTGGCCACACTGCGGGAGACATATGGCGAGATGGCCGATTGCTGTGCCAAACAGGAGCCTGAGAGAAATGAGTGCTTTCTGCAGCACAAGGACGATAACCCAAATCTGCCTAGGCTGGTGCGGCCCGAGGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTTCACGATAACGAGGAGACATTCCTGAAGAAGTATCTGTACGAGATCGCCCGGAGACACCCCTATTTCTACGCCCCTGAGCTGCTGTTTTTCGCCAAGAGATACAAGGCCGCCTTTACCGAGTGCTGTCAGGCAGCAGACAAGGCAGCATGCCTGCTGCCAAAGCTGGACGAGCTGAGGGATGAGGGCAAGGCCAGCTCCGCCAAGCAGAGACTGAAGTGTGCCAGCCTGCAGAAGTTTGGAGAGAGGGCCTTCAAGGCCTGGGCAGTGGCAAGGCTGAGCCAGCGGTTCCCAAAGGCAGAGTTCGCAGAGGTGTCCAAGCTGGTGACCGATCTGACAAAGGTGCACACCGAGTGCTGTCACGGCGACCTGCTGGAGTGCGCAGACGATAGGGCAGATCTGGCCAAGTACATCTGTGAGAACCAGGACTCTATCTCTAGCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGAGAAGCCCCTGCTGGAGAAGAGCCACTGCATCGCCGAGGTGGAGAATGACGAGATGCCTGCCGATCTGCCATCTCTGGCCGCCGACTTCGTGGAGAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTATGCCGAGGCCAAGGACGTGTTTCTGGGCATGTTCCTGTATGAGTACGCCAGGCGCCACCCCGATTATTCCGTGGTGCTGCTGCTGCGGCTGGCCAAGACCTACGAGACAACCCTGGAGAAGTGCTGTGCCGCCGCCGACCCCCACGAGTGCTACGCAAAGGTGTTTGACGAGTTCAAGCCACTGGTGGAGGAGCCCCAGAACCTGATCAAGCAGAATTGTGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTATAAGTTTCAGAATGCCCTGCTGGTGAGATACACAAAGAAGGTGCCTCAGGTGTCCACCCCAACACTGGTGGAGGTGTCTAGGAACCTGGGCAAGGTCGGCAGCAAGTGCTGTAAGCACCCAGAGGCAAAGAGGATGCCTTGCGCCGAGGACTATCTGTCTGTGGTGCTGAACCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAGACCCCCGTGAGCGATCGGGTGACCAAGTGCTGTACAGAGTCTCTGGTGAATAGACGGCCCTGCTTCAGCGCCCTGGAGGTGGACGAGACATACGTGCCAAAGGAGTTTAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGACATCTGTACCCTGTCCGAGAAGGAGAGACAGATCAAGAAGCAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTGAAGCACAAGCCTAAGGCCACCAAGGAGCAGCTGAAGGCCGTGATGGACGATTTTGCCGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGTAAGGCCGACGATAAGGAGACATGCTTCGCCGAGGAGGGCAAGAAGCTGGTCGCCGCTTCACAGGCTGCTCTGGGGCTGTGATAAGCTTGGATCC
SEQ ID NO:149
PR413 cDNA
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SEQ ID NO:150
PR414 cDNA
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SEQ ID NO:151
PR417 cDNA
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SEQ ID NO:152
PR418 cDNA
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SEQ ID NO:153
PR65 cDNA
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SEQ ID NO:154
PR66 cDNA
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SEQ ID NO:155
PR67 cDNA
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SEQ ID NO:156
PR68 cDNA
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SEQ ID NO:157
PR405 cDNA
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SEQ ID NO:158
PR406 cDNA
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SEQ ID NO:159
PR407 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGAAGTGGGTGACCTTTATTAGCCTGCTGTTCCTGTTTAGTTCCGCATACTCAAGAGGGGTGTTTAGAAGAAGCGAGAGCCCTGTGACCATCTCCAGGGCCGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCTCCTCTGCTGCTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCCAGATCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCACACAGCGCCGCCGCCGCCGCCCGGCCCCTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGACATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAATAAGCGGCGGTACCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCCAACATCATCGCCATGGGATTTCCTGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTCGCGTGGCCCAGTACCCCTTTGAGGACCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGCAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGGCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCTGGCCCAACCCGGAGAGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCCAATCCAGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCTGACGTGTCCGATAACGAGCCAGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCAGAGAACGAGCCCTTTGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTGGGCTTCGTGGGCGATGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACCGCTTTAAGGACCTGGGCGAGGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTTGCCCAGTACCTGCAGCAGTGCCCATTCGAGGATCACGTGAAGCTGGTGAATGAGGTGACCGAGTTTGCCAAGACATGCGTGGCCGACGAGAGCGCCGAGAACTGTGATAAGTCCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGCACCGTGGCCACACTGCGGGAGACATATGGCGAGATGGCCGATTGCTGTGCCAAACAGGAGCCTGAGAGAAATGAGTGCTTTCTGCAGCACAAGGACGATAACCCAAATCTGCCTAGGCTGGTGCGGCCCGAGGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTTCACGATAACGAGGAGACATTCCTGAAGAAGTATCTGTACGAGATCGCCCGGAGACACCCCTATTTCTACGCCCCTGAGCTGCTGTTTTTCGCCAAGAGATACAAGGCCGCCTTTACCGAGTGCTGTCAGGCAGCAGACAAGGCAGCATGCCTGCTGCCAAAGCTGGACGAGCTGAGGGATGAGGGCAAGGCCAGCTCCGCCAAGCAGAGACTGAAGTGTGCCAGCCTGCAGAAGTTTGGAGAGAGGGCCTTCAAGGCCTGGGCAGTGGCAAGGCTGAGCCAGCGGTTCCCAAAGGCAGAGTTCGCAGAGGTGTCCAAGCTGGTGACCGATCTGACAAAGGTGCACACCGAGTGCTGTCACGGCGACCTGCTGGAGTGCGCAGACGATAGGGCAGATCTGGCCAAGTACATCTGTGAGAACCAGGACTCTATCTCTAGCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGAGAAGCCCCTGCTGGAGAAGAGCCACTGCATCGCCGAGGTGGAGAATGACGAGATGCCTGCCGATCTGCCATCTCTGGCCGCCGACTTCGTGGAGAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTATGCCGAGGCCAAGGACGTGTTTCTGGGCATGTTCCTGTATGAGTACGCCAGGCGCCACCCCGATTATTCCGTGGTGCTGCTGCTGCGGCTGGCCAAGACCTACGAGACAACCCTGGAGAAGTGCTGTGCCGCCGCCGACCCCCACGAGTGCTACGCAAAGGTGTTTGACGAGTTCAAGCCACTGGTGGAGGAGCCCCAGAACCTGATCAAGCAGAATTGTGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTATAAGTTTCAGAATGCCCTGCTGGTGAGATACACAAAGAAGGTGCCTCAGGTGTCCACCCCAACACTGGTGGAGGTGTCTAGGAACCTGGGCAAGGTCGGCAGCAAGTGCTGTAAGCACCCAGAGGCAAAGAGGATGCCTTGCGCCGAGGACTATCTGTCTGTGGTGCTGAACCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAGACCCCCGTGAGCGATCGGGTGACCAAGTGCTGTACAGAGTCTCTGGTGAATAGACGGCCCTGCTTCAGCGCCCTGGAGGTGGACGAGACATACGTGCCAAAGGAGTTTAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGACATCTGTACCCTGTCCGAGAAGGAGAGACAGATCAAGAAGCAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTGAAGCACAAGCCTAAGGCCACCAAGGAGCAGCTGAAGGCCGTGATGGACGATTTTGCCGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGTAAGGCCGACGATAAGGAGACATGCTTCGCCGAGGAGGGCAAGAAGCTGGTCGCCGCTTCACAGGCTGCTCTGGGGCTGCATCACCACCACCACCACTGATAAGCTTGGATCC
SEQ ID NO:160
PR408 cDNA
GAATTCCCGCCGCCACCATGAAGTGGGTGACCTTTATTAGCCTGCTGTTCCTGTTTAGTTCCGCATACTCAAGAGGGGTGTTTAGAAGAAGCGAGAGCCCTGTGACCATCTCCAGGGCCGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCTCCTCTGCTGCTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCCAGATCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCACACAGCGCCGCCGCCGCCGCCCGGCCCCTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGACATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAATAAGCGGCGGTACCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCCAACATCATCGCCATGGGATTTCCTGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTCGCGTGGCCCAGTACCCCTTTGAGGACCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGCAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGGCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCTGGCCCAACCCGGAGAGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCCAATCCAGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCTGACGTGTCCGATAACGAGCCAGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCAGAGAACGAGCCCTTTGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTGTTCGGCTTCGTGGGCGATGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACCGCTTTAAGGACCTGGGCGAGGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTTGCCCAGTACCTGCAGCAGTGCCCATTCGAGGATCACGTGAAGCTGGTGAATGAGGTGACCGAGTTTGCCAAGACATGCGTGGCCGACGAGAGCGCCGAGAACTGTGATAAGTCCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGCACCGTGGCCACACTGCGGGAGACATATGGCGAGATGGCCGATTGCTGTGCCAAACAGGAGCCTGAGAGAAATGAGTGCTTTCTGCAGCACAAGGACGATAACCCAAATCTGCCTAGGCTGGTGCGGCCCGAGGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTTCACGATAACGAGGAGACATTCCTGAAGAAGTATCTGTACGAGATCGCCCGGAGACACCCCTATTTCTACGCCCCTGAGCTGCTGTTTTTCGCCAAGAGATACAAGGCCGCCTTTACCGAGTGCTGTCAGGCAGCAGACAAGGCAGCATGCCTGCTGCCAAAGCTGGACGAGCTGAGGGATGAGGGCAAGGCCAGCTCCGCCAAGCAGAGACTGAAGTGTGCCAGCCTGCAGAAGTTTGGAGAGAGGGCCTTCAAGGCCTGGGCAGTGGCAAGGCTGAGCCAGCGGTTCCCAAAGGCAGAGTTCGCAGAGGTGTCCAAGCTGGTGACCGATCTGACAAAGGTGCACACCGAGTGCTGTCACGGCGACCTGCTGGAGTGCGCAGACGATAGGGCAGATCTGGCCAAGTACATCTGTGAGAACCAGGACTCTATCTCTAGCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGAGAAGCCCCTGCTGGAGAAGAGCCACTGCATCGCCGAGGTGGAGAATGACGAGATGCCTGCCGATCTGCCATCTCTGGCCGCCGACTTCGTGGAGAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTATGCCGAGGCCAAGGACGTGTTTCTGGGCATGTTCCTGTATGAGTACGCCAGGCGCCACCCCGATTATTCCGTGGTGCTGCTGCTGCGGCTGGCCAAGACCTACGAGACAACCCTGGAGAAGTGCTGTGCCGCCGCCGACCCCCACGAGTGCTACGCAAAGGTGTTTGACGAGTTCAAGCCACTGGTGGAGGAGCCCCAGAACCTGATCAAGCAGAATTGTGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTATAAGTTTCAGAATGCCCTGCTGGTGAGATACACAAAGAAGGTGCCTCAGGTGTCCACCCCAACACTGGTGGAGGTGTCTAGGAACCTGGGCAAGGTCGGCAGCAAGTGCTGTAAGCACCCAGAGGCAAAGAGGATGCCTTGCGCCGAGGACTATCTGTCTGTGGTGCTGAACCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAGACCCCCGTGAGCGATCGGGTGACCAAGTGCTGTACAGAGTCTCTGGTGAATAGACGGCCCTGCTTCAGCGCCCTGGAGGTGGACGAGACATACGTGCCAAAGGAGTTTAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGACATCTGTACCCTGTCCGAGAAGGAGAGACAGATCAAGAAGCAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTGAAGCACAAGCCTAAGGCCACCAAGGAGCAGCTGAAGGCCGTGATGGACGATTTTGCCGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGTAAGGCCGACGATAAGGAGACATGCTTCGCCGAGGAGGGCAAGAAGCTGGTCGCCGCTTCACAGGCTGCTCTGGGGCTGCATCACCACCACCACCACTGATAAGCTTGGATCC
SEQ ID NO:161
F137 cDNA
GAATTCGCCACCATGAAGTGGGTCACCTTTATTTCTCTGCTGTTTCTGTTCTCCAGTGCCTATTCCCGTGGGGTCTTTCGTCGTTCCGAGTCACCTGTGACCATCAGCAGGGCTGGAAACGCTGGAGAGCTGGTGTCTCCACTGCTGCTGCCACCTACAAGGAGGAGAAGGAGGAGGCACATCCAGGGACCAGGACCAGTGCTGAATCTGCCATCCGCCGCTGCCGCTCCACCCGTGGCTAGGGCTCCAGAGGCTGCTGGAGGAGGCTCTAGATCCGAGGATTACTCCAGCTCTCCTCACTCCGCTGCTGCTGCTGCCAGACCACTGGCTGCTGAGGAGAAGCAGGCTCAGAGCCTGCAGCCCTCCAGCTCTAGACGCTCCAGCCATTATCCTGCTGCTGTGCAGAGCCAGGCTGCTGCTGAGAGGGGAGCTTCTGCCACCGCTAAGAGCAGGGCCATCTCTATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTTCCTTCTTTTTCTCCCATAGGCTGCCTGACATGGAGGAGCCCCAGTCTGATCCTTCCGTGGAGCCTCCACTGTCTCAGGAGACATTCTCCGACCTGTGGAAGCTGCTGCCCGAGAACAATGTGCTGTCCCCTCTGCCAAGCCAGGCTATGGACGATCTGATGCTGAGCCCTGACGATATCGAGCAGTGGTTTACCGAGGACCCCGGCCCTGATGAGGCTCCAAGGATGCCAGAGGCTGCTCCACCTGTGGCCCCAGCTCCCGCCGCTCCTACACCAGCTGCTCCAGCTCCTGCTCCATCTTGGCCTCTGAGCTCTTCCGTGCCAAGCCAGAAGACCTACCAGGGCTCTTATGGCTTTAGACTGGGCTTCCTGCACAGCGGCACAGCCAAGTCTGTGACCTGCACATACTCCCCAGCTCTGAACAAGATGTTCTGCCAGCTGGCCAAGACCTGTCCCGTGCAGCTGTGGGTGGATTCTACCCCACCACCTGGAACAAGGGTGCGGGCTATGGCTATCTATAAGCAGTCCCAGCACATGACAGAGGTGGTGAGGCGGTGCCCCCACCATGAGAGGTGTAGCGACTCTGATGGCCTGGCTCCACCACAGCATCTGATCCGCGTGGAGGGCAACCTGAGGGTGGAGTACCTGGACGATCGCAATACCTTCAGGCACTCCGTGGTGGTGCCCTATGAGCCTCCAGAAGTGGGCAGCGACTGTACCACAATCCATTACAACTATATGTGCAATAGCTCTTGTATGGGCGGCATGAACAGACGCCCTATCCTGACCATCATCACACTGGAGGATTCCAGCGGCAACCTGCTGGGCAGGAACTCCTTTGAGGTGAGAGTGTGCGCTTGTCCTGGACGCGACAGGAGAACCGAGGAGGAGAATCTGAGGAAGAAGGGAGAGCCACACCATGAGCTGCCACCTGGCAGCACCAAGAGGGCTCTGCCTAACAATACATCTTCCAGCCCCCAGCCCAAGAAGAAGCCACTGGATGGCGAGTACTTCACACTGCAGATCAGAGGCCGCGAGAGGTTTGAGATGTTCAGGGAGCTGAACGAGGCTCTGGAGCTGAAGGACGCCCAGGCTGGCAAGGAGCCAGGAGGCTCCCGGGCTCACTCTTCCCATCTGAAGAGCAAGAAGGGCCAGTCCACCAGCAGACACAAGAAGCTGATGTTTAAGACAGAGGGCCCCGATTCCGACGATGCTCACAAGAGCGAGGTGGCCCATCGCTTTAAGGACCTGGGCGAGGAGAATTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTTGCTCAGTACCTGCAGCAGTGCCCCTTCGAGGACCACGTGAAGCTGGTGAACGAGGTGACCGAGTTTGCTAAGACATGCGTGGCTGACGAGTCCGCCGAGAATTGTGATAAGAGCCTGCATACCCTGTTCGGCGATAAGCTGTGTACCGTGGCCACACTGCGCGAGACATATGGCGAGATGGCTGACTGCTGTGCCAAGCAGGAGCCAGAGAGGAACGAGTGCTTTCTGCAGCATAAGGACGATAACCCTAATCTGCCAAGGCTGGTGAGGCCCGAGGTGGACGTGATGTGTACCGCTTTTCACGATAATGAGGAGACATTCCTGAAGAAGTACCTGTATGAGATCGCCAGACGCCATCCTTACTTCTATGCTCCAGAGCTGCTGTTTTTCGCCAAGCGGTACAAGGCCGCTTTTACCGAGTGCTGTCAGGCCGCTGATAAGGCCGCTTGCCTGCTGCCTAAGCTGGACGAGCTGCGGGATGAGGGCAAGGCTAGCTCTGCCAAGCAGAGACTGAAGTGTGCTAGCCTGCAGAAGTTTGGCGAGAGGGCCTTCAAGGCTTGGGCTGTGGCTAGGCTGTCTCAGAGATTTCCAAAGGCTGAGTTCGCCGAGGTGTCCAAGCTGGTGACCGACCTGACAAAGGTGCACACCGAGTGCTGTCATGGCGACCTGCTGGAGTGCGCCGACGATAGGGCTGATCTGGCCAAGTACATCTGTGAGAACCAGGACAGCATCTCCAGCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGAGAAGCCTCTGCTGGAGAAGTCTCACTGCATCGCTGAGGTGGAGAACGACGAGATGCCAGCCGATCTGCCCTCTCTGGCCGCTGACTTCGTGGAGTCCAAGGATGTGTGTAAGAATTACGCTGAGGCCAAGGATGTGTTTCTGGGCATGTTCCTGTACGAGTATGCTAGGCGGCACCCTGACTACTCTGTGGTGCTGCTGCTGCGCCTGGCCAAGACCTATGAGACAACACTGGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCCGATCCACATGAGTGCTATGCTAAGGTGTTTGACGAGTTCAAGCCCCTGGTGGAGGAGCCTCAGAACCTGATCAAGCAGAATTGTGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTACAAGTTTCAGAACGCCCTGCTGGTGAGGTATACCAAGAAGGTGCCACAGGTGAGCACCCCCACACTGGTGGAGGTGTCTCGGAATCTGGGCAAGGTCGGCTCCAAGTGCTGTAAGCACCCCGAGGCTAAGAGAATGCCTTGCGCCGAGGATTACCTGAGCGTGGTGCTGAACCAGCTGTGTGTGCTGCATGAGAAGACCCCCGTGTCTGACCGGGTGACCAAGTGCTGTACAGAGTCTCTGGTGAACAGACGCCCCTGCTTCTCCGCTCTGGAGGTGGATGAGACATATGTGCCTAAGGAGTTTAATGCTGAGACATTCACCTTCCACGCCGACATCTGTACCCTGTCTGAGAAGGAGAGACAGATCAAGAAGCAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTGAAGCATAAGCCTAAGGCTACCAAGGAGCAGCTGAAGGCCGTGATGGACGATTTTGCTGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGTAAGGCTGACGATAAGGAGACATGCTTTGCCGAGGAGGGAAAGAAACTGGTCGCCGCATCTCAGGCCGCTCTGGGACTGCATCATCATCATCATCACTGATAGGGATCC
SEQ ID NO:162
Minimal Mouse/Rat/Human PTEN-S
IVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKT
SEQ ID NO:163
Minimal Human Serum Albumin DKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ
SEQ ID NO:164
Furin-sensitive linker sequence
TNRRKKRALDAAY
SEQ ID NO:165
MMP2/9-Sensitive Linker Sequence
GPAALKAA
SEQ ID NO:166
Mouse PTEN-S cDNA
ATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAACAAGAGGAGATACCAGGAGGACGGCTTCGACCTGGATCTGACATACATCTACCCTAACATCATCGCTATGGGATTTCCAGCTGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGGAACAACATCGACGATGTGGTGCGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTACAAGATCTACAACCTGTGCGCTGAGAGGCACTACGACACCGCCAAGTTCAACTGTAGAGTGGCTCAGTACCCTTTTGAGGATCACAACCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCATTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGAGCGAGGACGATAACCACGTGGCTGCCATCCACTGCAAGGCCGGAAAGGGCCGGACAGGAGTGATGATCTGTGCTTACCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCTCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGAGAGGTGAGGACCAGAGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCTTCCCAGCGGCGCTACGTGTACTACTACTCTTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACCGCCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCAATGTTCTCTGGAGGCACATGCAACCCCCAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTACAGCTCCAACAGCGGACCAACCAGGAGAGAGGACAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCTCTGCCCGTGTGCGGCGATATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGACAAGATGTTTCACTTCTGGGTCAACACCTTTTTCATCCCCGGACCTGAGGAGACAAGCGAGAAGGTGGAGAACGGCTCCCTGTGCGACCAGGAGATCGATTCTATCTGTAGCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAACGACCTGGATAAGGCTAACAAGGATAAGGCCAACCGCTACTTTTCCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCTAACCCAGAGGCCTCTAGCTCCACCTCTGTGACACCAGACGTGAGCGATAACGAGCCCGACCACTACAGGTACAGCGATACCACAGACTCCGATCCCGAGAACGAGCCTTTTGACGAGGATCAGCACAGCCAGATCACCAAGGTG
SEQ ID NO:167
Mature Mouse PTEN-L cDNA
TCAGAGTCACCAGTCACCATCGCTAGGGCTGGAAACGCTGGAGAGCTGCTGTCCCCTCTGCTGCTGCCCCCTACAAGGAGACGGCGCAGGAGACACGTGCAGGGACCTGGACCAGTGCTGTCCCTGCCATCTGCCGCTGCTGCTCCACCACTGGCTAGGGCTCCTGAGGCCGCTGGCGGAGGCTCTCGCTGCGAGGACTACCCAAGCTCCCCACACAGCGCCGCTTCCGCCGCTCGGCCACTGGCTGCTGAGGAGAAGCAGGCTCAGAGCCTGCAGCCTTCTAGCTCCCGGCGCTCTAGCCACTACCCAGCTGCTGTGCAGGGACAGGCTGCTGCTGAGAGGGGAGCTTCCGCCACCGCTAAGTCCAGAGCCATCTCTATCCTGCAGAAGAAGCCAAGGCACCAGCAGCTGCTGCCTTCCCTGTCCTCTTTCTTTTTCTCTCACAGGCTGCCTGATATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAACAAGAGGAGATACCAGGAGGACGGCTTCGACCTGGATCTGACATACATCTACCCTAACATCATCGCTATGGGATTTCCAGCTGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGGAACAACATCGACGATGTGGTGCGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTACAAGATCTACAACCTGTGCGCTGAGAGGCACTACGACACCGCCAAGTTCAACTGTAGAGTGGCTCAGTACCCTTTTGAGGATCACAACCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCATTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGAGCGAGGACGATAACCACGTGGCTGCCATCCACTGCAAGGCCGGAAAGGGCCGGACAGGAGTGATGATCTGTGCTTACCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCTCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGAGAGGTGAGGACCAGAGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCTTCCCAGCGGCGCTACGTGTACTACTACTCTTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACCGCCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCAATGTTCTCTGGAGGCACATGCAACCCCCAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTACAGCTCCAACAGCGGACCAACCAGGAGAGAGGACAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCTCTGCCCGTGTGCGGCGATATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGACAAGATGTTTCACTTCTGGGTCAACACCTTTTTCATCCCCGGACCTGAGGAGACAAGCGAGAAGGTGGAGAACGGCTCCCTGTGCGACCAGGAGATCGATTCTATCTGTAGCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAACGACCTGGATAAGGCTAACAAGGATAAGGCCAACCGCTACTTTTCCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCTAACCCAGAGGCCTCTAGCTCCACCTCTGTGACACCAGACGTGAGCGATAACGAGCCCGACCACTACAGGTACAGCGATACCACAGACTCCGATCCCGAGAACGAGCCTTTTGACGAGGATCAGCACAGCCAGATCACCAAGGTG
SEQ ID NO:168
Wider Cell Penetration Domain (WCPD) cDNA
CTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCA
SEQ ID NO:169
Minimal Cell Penetration Domain cDNA
CGGAGAAGGCGCCGGAGA
SEQ ID NO:170
Cell Penetration Domain* (CPD*) cDNA
CCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCT
SEQ ID NO:171
Human PTEN-L or pre-PTEN-L cDNA
CTGGAGCGGGGGGGAGAAGCGGCGGCGGCGGCGGCCGCGGCGGCTGCAGCTCCAGGGAGGGGGAGCGAGAGCCCTGTGACCATCTCCAGGGCCGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCTCCTCTGCTGCTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCCAGATCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCACACAGCGCCGCCGCCGCCGCCCGGCCCCTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGACATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAATAAGCGGCGGTACCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCCAACATCATCGCCATGGGATTTCCTGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTCGCGTGGCCCAGTACCCCTTTGAGGACCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGCAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGGCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCTGGCCCAACCCGGAGAGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCCAATCCAGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCTGACGTGTCCGATAACGAGCCAGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCAGAGAACGAGCCCTTTGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTG
SEQ ID NO:172
Human PTEN-S cDNA
ATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAATAAGCGGCGGTACCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCCAACATCATCGCCATGGGATTTCCTGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTCGCGTGGCCCAGTACCCCTTTGAGGACCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGCAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGGCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCTGGCCCAACCCGGAGAGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCCAATCCAGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCTGACGTGTCCGATAACGAGCCAGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCAGAGAACGAGCCCTTTGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTG
SEQ ID NO:173
pTT5 mammalian expression vector cDNA (empty vector)
GTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGTTTAAACGGATCTCTAGCGAATTCCCTCTAGAGGGCCCGTTTCTGCTAGCAAGCTTGCTAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGGACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGATGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGC
SEQ ID NO:174
L. plantarum expression pSIP609 vector cDNA (including the Lp2958-PTEN-L insert)
AGATCTGCGGCCGCACCGGTTTAATTTGAAAATTGATATTAGCGTTTAACAGTTAAATTAATACGTTAATAATTTTTTTGTCTTTAAATAGGGATTTGAAGCATATTGGTGTTATAGCGTACTTAGCTGGCCAGCATATAAGTATTCTATAAAATACTATTACAAGGAGGAAATTTACATGAAATTATCGAAGCGTGGTTTATTCTGGCTGTTAGGTTTAGTCTCATTTGCGATCTTGTTGTTGTTCTCTCAGCCCTTGGGTGCTCAAGCTTCAGAGTCTCCAGTGACGATTTCGCGGGCGGGTAACGCCGGTGAATTGGTTAGCCCGCTATTGCTGCCACCGACCCGCCGACGGCGTCGGCGTCATATTCAGGGCCCAGGTCCGGTTTTGAACTTGCCTTCAGCGGCAGCTGCGCCTCCCGTCGCTCGGGCACCTGAAGCCGCTGGGGGCGGCTCGCGCTCAGAGGATTATAGTAGTAGTCCCCACAGTGCCGCCGCTGCGGCCCGCCCCCTAGCCGCCGAGGAAAAACAAGCACAGTCATTACAGCCTTCTAGTTCACGCCGTAGTTCTCATTACCCGGCAGCTGTCCAAAGCCAAGCGGCGGCCGAGCGTGGGGCAAGCGCCACTGCCAAGAGCCGTGCAATTTCGATTTTACAAAAGAAACCACGTCATCAACAGTTACTGCCGTCATTATCTAGCTTTTTCTTTAGTCATCGGCTACCAGATATGACAGCTATTATTAAAGAAATTGTTAGTCGAAATAAGCGGCGCTATCAAGAAGATGGTTTCGATTTAGATTTAACATACATTTATCCAAATATCATTGCGATGGGATTTCCCGCTGAGCGGTTGGAAGGCGTCTATCGAAACAATATCGACGATGTTGTCCGGTTTTTAGATTCGAAGCATAAGAATCACTACAAGATTTACAACCTGTGTGCAGAACGGCATTATGACACTGCGAAGTTTAATTGTCGAGTTGCACAATATCCGTTTGAAGATCATAACCCCCCACAATTAGAGTTAATCAAACCATTTTGTGAAGATTTAGATCAGTGGTTAAGTGAAGATGATAATCACGTGGCGGCTATTCATTGTAAGGCTGGGAAGGGTCGTACAGGCGTGATGATTTGCGCTTACTTATTACACCGTGGAAAGTTTCTAAAAGCGCAAGAAGCATTAGATTTCTATGGTGAAGTTCGTACCCGAGATAAAAAGGGCGTCACGATCCCGAGTCAACGCCGCTATGTTTACTACTATTCGTACTTACTAAAGAATCACCTAGATTATCGCCCAGTCGCTTTGTTGTTCCATAAGATGATGTTTGAAACGATTCCAATGTTTTCTGGTGGCACGTGTAACCCGCAATTTGTAGTGTGTCAACTAAAAGTGAAGATATATAGTTCAAATAGTGGGCCCACTCGACGGGAAGATAAGTTCATGTATTTCGAGTTTCCACAGCCATTGCCAGTTTGCGGAGACATCAAAGTCGAATTTTTCCACAAGCAAAATAAGATGCTGAAAAAAGATAAAATGTTTCACTTTTGGGTAAACACTTTCTTTATTCCAGGACCAGAAGAAACCTCTGAAAAAGTCGAAAATGGTTCGTTATGCGATCAAGAAATTGATTCGATTTGTAGTATTGAACGTGCGGACAATGACAAAGAATATCTGGTATTGACTTTGACGAAAAATGACTTGGACAAAGCCAATAAAGATAAGGCAAATCGGTACTTTTCACCGAACTTCAAGGTCAAATTATATTTTACGAAAACTGTGGAAGAACCATCAAATCCAGAGGCAAGCTCAAGCACCAGTGTTACACCTGACGTCAGTGACAACGAACCTGATCATTATCGGTATAGCGACACCACGGATTCAGATCCTGAAAATGAACCGTTTGACGAAGATCAACATACTCAGATCACGAAAGTTTGATCTAGACTCGAGGAATTCGGTACCCCGGGTTCGAAGGCGCCAAGCTTCAAATTACAGCACGTGTTGCTTTGATTGATAGCCAAAAAGCAGCAGTTGATAAAGCAATTACTGATATTGCTGAAAAATTGTAATTTATAAATAAAAATCACCTTTTAGAGGTGGTTTTTTTATTTATAAATTATTCGTTTGATTTCGCTTTCGATAGAACAATCAAAGCGAGAATAAGGAAGATAAATCCCATAAGGGCGGGAGCAGAATGTCCGAGACTAATTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATCGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGAAGGATTATTCGGCTGGTTGAGACGTTAAAATGATAAAGGTTGTATTAATCTTATATTACGGTTATAATGTACTCAACTTAATAAATGAACGCAAAAAAAAGAACCCTCAACTTAGCAGAGTTAGGATTCACGACTTATCAGCACAACCTGATAAGATTTTCGATAGCAAGTACTACCAATACAAGCTATCTAACTTGGTACTATTATAACATGTAGGCTAAGTTTTTCAACCATTGATACTTAAAGTAAACGGTTGTTATCGGGAATCTTAACAGAAACCTGATAGCAACCGTTTTTTTGTTATTCAATGGTTAGCAACCATCAAAGCAACTAAAGGCTGGAAACCTGTTCTTAGCTAGTAAAACCTCCCGTGAGTGTCGTTCGTGACCCCGCTTGCAGTTAACAACATAGGTATGCTAAACCTTGTCGAGATCAACGCGACTAAAGACGTGGCTGGAAGACTAGGAAATGATACGGACAGGCTAACTATTAACGCAGATTATTCGGGTTGCTGCTAAAACCAACTCTAATAATAGTTAGTGCAAGGGCTGGTTGAGCTTAAATTGTCTGATAAAGAGTTCTCTCTTTATACTGCAAAAGAAGCGCAGTTATTCACGATTAGGATAACTGTTTGAGAGAGCCTAAGGGCTTGACCCTTGATGGTTTAAGCACCGCTATGCGTGCGGGATCCCCTTAGAAGCAAACTTAAGAGTGTGTTGATAGTGCATTATCTTAAAATTTTGTATAATAGGAATTGAAGTTAAATTAGATGCTAAAAATAGGAATTGAAGTTAAATTAGATGCTAAAAATTTGTAATTAAGAAGGAGGGATTCGTCATGTTGGTATTCCAAATGCGTAATGTAGATAAAACATCTACTGTTTTGAAACAGACTAAAAACAGTGATTACGCAGATAAATAAATACGTTAGATTAATTCCTACCAGTGACTAATCTTATGACTTTTTAAACAGATAACTAAAATTACAAACAAATCGTTTAACTTCAGGAGAGATTACATGGTTGTAATTGGGGAGCACCGCCACACACAAGTCACAGTCGACTTGCAGGCAATTAAGACAAATATTAGTAATGAAATGGCGCAAAAGGATGAGTTGACCGAGTTATGGGCAGTCGTTAAAGCGAATGGTTATGGACATGGAATTATCCAAGTTGCTCAGGCCGCCAAAGAAGCCGGGGCGACCGGCTTTTGTGTTGCAATCCTGGATGAGGCCTTAGCGTTGCGGGCCGCTGGCTTTGCGGAACCCATCCTAGTACTTGGAATTACGGAACCGGAATACGCCCCACTGGTAGCTGAAAAGGATATTTCACTAGCTGTTGGAACGCAAGATTGGCTGACTACGGCCGCAGCAATTTTAGCGGCTAATCAAGTGACGACACCACTTCACGTTCATCTTGCATTAGATACGGGTATGGGACGAATCGGGTTTCAGACGCCCGAAGAATTGGCAACGGCGGTTACGACTTTGCGTCAACCGCAGTCACCATTTGACTTTGAAGGGATTTTTACGCATTTTGCAACGGCTGACCAGGCAGATGATACGTATTTTACTCATCAATTAAATAATTGGAAACACTTGATTGCAGTGGTGGATGAGCTACCACGCTATGTCCACGTGTCCAATTCGGCCACCAGTCTCTGGCATCAAGCTTGCAATGGCAACATGGTGCGCTTTGGGGTTGCACTCTATGGTCTAAATCCTTCTGGTCGCGAACTCAGCGCACCATACCCCTTGCAACCCGCGTTGTCGCTAACGGCACGCTTGACGTTTGTTAAACGCTTGGCTCGGGGCAAATCGGTCAGCTATGGTGCCACGTATACGGCCGCACAGGATGAATGGATTGGCACGGTGCCGATTGGGTATGCGGACGGCTATGAACGCCGATTACAAGGCTTCCATGTACTTGTTGATGGTGAGTTTTGCGAAATCGTCGGACGGGTCTGCATGGACCAGCTGATGGTTCGTCTGCCACATGAAGTACCGGTTGGAGCTAAGGTAACTTTGGTTGGCACGGACGGTGCTCGTACCATTTCGTTGCAAGATATTGCTGACTATTGTGGGACAATTCATTATGAGATTGCTTGTGGGTTAGCACCACGAGTGCCGAGAGTTTATATAGATTAATTCTATGAGTCGCTTTTTTAAATTTGGAAAGTTACACGTTACTAAAGGGAATGGAGACCGGGGCCCTTCAATAGAGTTCTTAACGTTAATCCGAAAAAAACTAACGTTAATATTAAAAAATAAGATCCGCTTGTGAATTATGTATAATTTGATTAGACTAAAGAATAGGAGAAAGTATGATGATATTTAAAAAACTTTCTCGTTAAGATAGGTTGTTGGTGAGCATGTTATATACGGATGTATCGGTTTCCTTAATGCAAAATTTTGTTGCTATCTTATTAATTTTTCTATTATATAGATATATTCAAAGAAAGATAACATTTAAACGGATCATATTAGATATTTTAATAGCGATTATTTTTTCAATATTATATCTGTTTATTTCAGATGCGTCATTACTTGTAATGGTATTAATGCGATTAGGGTGGCATTTTCATCAACAAAAAGAAAATAAGATAAAAACGACTGATACAGCTAATTTAATTCTAATTATCGTGATCCAGTTATTGTTAGTTGCGGTTGGGACTATTATTAGTCAGTTTACCATATCGATTATCAAAAGTGATTTCAGCCAAAATATATTGAACAATAGTGCAACAGATATAACTTTATTAGGTATTTTCTTTGCTGTTTTATTTGACGGCTTGTTCTTTATATTATTGAAGAATAAGCGGACTGAATTACAACATTTAAATCAAGAAATCATTGAATTTTCGTTAGAAAAACAATATTTTATATTTATATTTATTTTATTTATAGTAATAGAAATTATTTTAGCAGTTGGGAATCTTCAAGGAGTAACAGCCACGATATTATTAACCATTATCATTATTTTTTGTGTCCTTATCGGGATGACTTTTTGGCAAGTGATGCTTTTTTTGAAGGCTTATTCGATTCGCCAAGAAGCCAATGACCAATTGGTCCGGAATCAACAACTTCAAGATTATCTAGTCAATATCGAACAGCAGTACACCGAATTACGGCGATTTAAGCATGATTATCAAAACATCTTATTATCGTTGGAGAGTTTTGCCGAAAAGGGCGATCAGCAACAGTTTAAGGCGTATTACCAAGAATTATTAGCACAACGGCCAATTCAAAGTGAAATCCAAGGGGCAGTCATTGCACAACTCGACTACTTGAAAAATGATCCTATTCGAGGATTAGTCATTCAAAAGTTTTTGGCAGCCAAACAGGCTGGTGTTACTTTAAAATTCGAAATGACCGAACCAATCGAATTAGCAACCGCTAATCTATTAACGGTTATTCGGATTATCGGTATTTTATTAGACAATGCGATTGAACAAGCCGTTCAAGAAACCGATCAATTGGTGAGTTGTGCTTTCTTACAATCTGATGGTTTAATCGAAATTACGATTGAAAATACGGCCAGTCAAGTTAAGAATCTCCAAGCATTTTCAGAGTTAGGCTATTCAACGAAAGGCGCTGGTCGGGGGACTGGTTTAGCTAATGTGCAGGATTTGATTGCCAAACAAACCAATTTATTCTTAGAAACACAGATTGAAAATAGAAAGTTACGACAGACATTGATGATTACGGAGGAAACTTAATTTGTATCCCGTTTATTTATTAGAGGATGATTTACAGCAACAAGCGATTTATCAGCAAATTATCGCGAATACGATTATGATTAACGAATTTGCAATGACTTTAACATGCGCTGCCAGTGATACTGAGACATTGTTGGCGGCAATTAAGGATCAGCAACGAGGTTTATTCTTTTTGGATATGGAAATTGAGGATAACCGCCAAGCCGGTTTAGAAGTGGCAACTAAGATTCGGCAGATGATGCCGTTTGCGCAAATTGTCTTCATTACAACCCACGAGGAACTGACATTATTAACGTTAGAACGAAAAATAGCGCCTTTAGATTACATTCTCAAGGACCAAACAATGGCTGAAATCAAAAGGCAATTGATTGATGATCTATTGTTAGCTGAGAAGCAAAACGAGGCGGCAGCGTATCACCGAGAAAATTTATTTAGTTATAAAATAGGTCCTCGCTTTTTCTCATTACCATTAAAGGAAGTTGTTTATTTATATACTGAAAAAGAAAATCCGGGTCATATTAATTTGTTAGCCGTTACCAGAAAGGTTACTTTTCCAGGAAATTTAAATGCGCTGGAAGCCCAATATCCAATGCTCTTTCGGTGTGATAAAAGTTACTTAGTTAACCTATCTAATATTGCCAATTATGACAGTAAAACACGGAGTTTAAAATTTGTAGATGGCAGTGAGGCAAAAGTCTCGTTCCGGAAATCACGGGAACTAGTGGCCAAATTAAAACAAATGATGTAGCGCCTGCAGGCACGCCAAATGATCCCAGTAAAAAGCCACCCGCATGGCGGGTGGCTTTTTATTAGCCCTAGAAGGGCTTCCCACACGCATTTCAGCGCCTTAGTGCCTTAGTTTGTGAATCATAGGTGGTATAGTCCCGAAATACCCGTCTAAGGAATTGTCAGATAGGCCTAATGACTGGCTTTTATAATATGAGATAATGCCGACTGTACTTTTTACAGTCGGTTTTCTAATGTCACTAACCTGCCCCGTTAGTTGAAGAAGGTTTTTATATTACAGCTCC
SEQ ID NO:175
P. pastoris expression vector cDNA (including the SP(αMF)-PTEN-L insert)
AACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAACCTTTTTGCCATCCGACATCCACAGGTCCATTCTCACACATAAGTGCCAAACGCAACAGGAGGGGATACACTAGCAGCAGACCGTTGCAAACGCAGGACCTCCACTCCTCTTCTCCTCAACACCCACTTTTGCCATCGAAAAACCAGCCCAGTTATTGGGCTTGATTGGAGCTCGCTCATTCCAATTCCTTCTATTAGGCTACTAACACCATGACTTTATTAGCCTGTCTATCCTGGCCCCCCTGGCGAGGTTCATGTTTGTTTATTTCCGAATGCAACAAGCTCCGCATTACACCCGAACATCACTCCAGATGAGGGCTTTCTGAGTGTGGGGTCAAATAGTTTCATGTTCCCCAAATGGCCCAAAACTGACAGTTTAAACGCTGTCTTGGAACCTAATATGACAAAAGCGTGATCTCATCCAAGATGAACTAAGTTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTTCCAAAAGTCGGCATACCGTTTGTCTTGTTTGGTATTGATTGACGAATGCTCAAAAATAATCTCATTAATGCTTAGCGCAGTCTCTCTATCGCTTCTGAACCCCGGTGCACCTGTGCCGAAACGCAAATGGGGAAACACCCGCTTTTTGGATGATTATGCATTGTCTCCACATTGTATGCTTCCAAGATTCTGGTGGGAATACTGCTGATAGCCTAACGTTCATGATCAAAATTTAACTGTTCTAACCCCTACTTGACAGCAATATATAAACAGAAGGAAGCTGCCCTGTCTTAAACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCTTACTTTCATAATTGCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTAACGACAACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTGAAAGAATTCAAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAATTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAATGTCTGAGTCGCCAGTGACTATCTCCAGAGCCGGAAATGCCGGTGAATTAGTTTCCCCACTGTTGTTGCCGCCCACTCGTAGACGTAGGCGTAGACATATCCAGGGACCAGGACCAGTGCTGAATTTACCTTCAGCTGCTGCTGCTCCGCCGGTAGCTAGGGCCCCAGAAGCGGCAGGAGGTGGTTCTAGGTCCGAGGATTACTCTAGCTCTCCACATTCGGCTGCTGCCGCCGCAAGACCTTTAGCAGCAGAAGAGAAGCAAGCACAATCTTTGCAACCTTCCTCCTCTAGAAGATCAAGCCATTATCCTGCTGCTGTCCAGAGTCAGGCAGCTGCTGAGAGGGGTGCCTCTGCTACTGCCAAATCTAGAGCTATATCTATCTTGCAGAAAAAGCCTAGACACCAACAACTCCTTCCATCCCTGTCGAGTTTCTTCTTCTCTCACAGGCTCCCAGATATGACTGCCATTATCAAGGAGATCGTCAGTCGTAACAAGAGAAGATACCAAGAGGACGGCTTCGACCTGGATCTTACATATATTTACCCAAACATCATAGCTATGGGGTTCCCCGCAGAAAGATTGGAAGGTGTCTATAGAAATAATATTGACGACGTTGTTAGATTTCTAGATAGCAAACATAAAAATCACTACAAGATATACAACCTCTGTGCTGAAAGACACTACGACACTGCTAAGTTCAATTGTAGAGTAGCACAGTACCCCTTCGAGGATCATAATCCTCCACAACTTGAGTTGATCAAACCTTTTTGTGAGGACTTGGACCAATGGCTGTCAGAGGACGATAATCACGTCGCAGCTATTCATTGTAAGGCTGGAAAAGGTCGAACAGGAGTCATGATTTGTGCTTATCTACTGCACAGAGGTAAGTTTCTAAAAGCTCAAGAGGCTTTGGATTTTTATGGTGAAGTTAGGACTAGAGACAAAAAGGGTGTTACCATCCCCAGCCAGAGAAGGTACGTATATTATTACAGTTATCTGTTGAAAAACCACTTAGACTACCGTCCCGTTGCACTGTTATTCCACAAGATGATGTTTGAAACGATCCCAATGTTCTCTGGTGGAACTTGTAACCCTCAATTCGTTGTTTGCCAGTTAAAGGTTAAAATTTATAGCTCCAATTCAGGACCCACAAGACGGGAAGATAAATTTATGTACTTTGAATTTCCACAACCATTGCCAGTCTGTGGTGATATTAAGGTAGAGTTTTTCCATAAGCAAAACAAAATGTTGAAAAAAGACAAAATGTTCCACTTCTGGGTGAATACCTTCTTCATTCCTGGACCAGAGGAAACGTCCGAAAAAGTTGAAAACGGCTCATTGTGTGATCAAGAGATTGACTCCATCTGTTCAATCGAGCGTGCAGACAATGATAAAGAGTACTTGGTGCTTACATTGACCAAAAATGATCTGGATAAGGCTAACAAAGACAAAGCCAATAGATATTTCTCACCAAATTTTAAAGTTAAGTTGTATTTCACCAAGACTGTTGAGGAGCCTTCCAATCCAGAAGCATCCAGCAGTACTTCAGTTACTCCAGACGTATCTGACAATGAGCCTGACCATTATCGTTACTCTGATACTACTGACTCCGATCCTGAAAACGAACCATTTGATGAGGACCAGCACACCCAAATTACAAAAGTTTAGGGTTAAGGGGCGGCCGCTCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCAGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAAACCTTCGTTTGTGCGGATCCTTCAGTAATGTCTTGTTTCTTTTGTTGCAGTGGTGAGCCATTTTGACTTCGTGAAAGTTTCTTTAGAATAGTTGTTTCCAGAGGCCAAACATTCCACCCGTAGTAAAGTGCAAGCGTAGGAAGACCAAGACTGGCATAAATCAGGTATAAGTGTCGAGCACTGGCAGGTGATCTTCTGAAAGTTTCTACTAGCAGATAAGATCCAGTAGTCATGCATATGGCAACAATGTACCGTGTGGATCTAAGAACGCGTCCTACTAACCTTCGCATTCGTTGGTCCAGTTTGTTGTTATCGATCAACGTGACAAGGTTGTCGATTCCGCGTAAGCATGCATACCCAAGGACGCCTGTTGCAATTCCAAGTGAGCCAGTTCCAACAATCTTTGTAATATTAGAGCACTTCATTGTGTTGCGCTTGAAAGTAAAATGCGAACAAATTAAGAGATAATCTCGAAACCGCGACTTCAAACGCCAATATGATGTGCGGCACACAATAAGCGTTCATATCCGCTGGGTGACTTTCTCGCTTTAAAAAATTATCCGAAAAAATTTTCTAGAGTGTTGTTACTTTATACTTCCGGCTCGTATAATACGACAAGGTGTAAGGAGGACTAAACCATGGCTAAACTCACCTCTGCTGTTCCAGTCCTGACTGCTCGTGATGTTGCTGGTGCTGTTGAGTTCTGGACTGATAGACTCGGTTTCTCCCGTGACTTCGTAGAGGACGACTTTGCCGGTGTTGTACGTGACGACGTTACCCTGTTCATCTCCGCAGTTCAGGACCAGGTTGTGCCAGACAACACTCTGGCATGGGTATGGGTTCGTGGTCTGGACGAACTGTACGCTGAGTGGTCTGAGGTCGTGTCTACCAACTTCCGTGATGCATCTGGTCCAGCTATGACCGAGATCGGTGAACAGCCCTGGGGTCGTGAGTTTGCACTGCGTGATCCAGCTGGTAACTGCGTGCATTTCGTCGCAGAAGAACAGGACTAACAATTGACACCTTACGATTATTTAGAGAGTATTTATTAGTTTTATTGTATGTATACGGATGTTTTATTATCTATTTATGCCCTTATATTCTGTAACTATCCAAAAGTCCTATCTTATCAAGCCAGCAATCTATGTCCGCGAACGTCAACTAAAAATAAGCTTTTTATGCTGTTCTCTCTTTTTTTCCCTTCGGTATAATTATACCTTGCATCCACAGATTCTCCTGCCAAATTTTGCATAATCCTTTACAACATGGCTATATGGGAGCACTTAGCGCCCTCCAAAACCCATATTGCCTACGCATGTATAGGTGTTTTTTCCACAATATTTTCTCTGTGCTCTCTTTTTATTAAAGAGAAGCTCTATATCGGAGAAGCTTCTGTGGCCGTTATATTCGGCCTTATCGTGGGACCACATTGCCTGAATTGGTTTGCCCCGGAAGATTGGGGAAACTTGGATCTGATTACCTTAGCTGCAGGTACCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGGTACCCAGATCCAATTCCCGCTTTGACTGCCTGAAATCTCCATCGCCTACAATGATGACATTTGGATTTGGTTGACTCATGTTGGTATTGTGAAATAGACGCAGATCGGGAACACTGAAAAATACACAGTTATTATTCATTTAAAT
SEQ ID NO:176
cDNA of Mature Human Serum Albumin (HSA)
GATGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACCGCTTTAAGGACCTGGGCGAGGAGAACTTCAAGGCCCTGGTGCTGATCGCCTTTGCCCAGTACCTGCAGCAGTGCCCATTCGAGGATCACGTGAAGCTGGTGAATGAGGTGACCGAGTTTGCCAAGACATGCGTGGCCGACGAGAGCGCCGAGAACTGTGATAAGTCCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGCACCGTGGCCACACTGCGGGAGACATATGGCGAGATGGCCGATTGCTGTGCCAAACAGGAGCCTGAGAGAAATGAGTGCTTTCTGCAGCACAAGGACGATAACCCAAATCTGCCTAGGCTGGTGCGGCCCGAGGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTTCACGATAACGAGGAGACATTCCTGAAGAAGTATCTGTACGAGATCGCCCGGAGACACCCCTATTTCTACGCCCCTGAGCTGCTGTTTTTCGCCAAGAGATACAAGGCCGCCTTTACCGAGTGCTGTCAGGCAGCAGACAAGGCAGCATGCCTGCTGCCAAAGCTGGACGAGCTGAGGGATGAGGGCAAGGCCAGCTCCGCCAAGCAGAGACTGAAGTGTGCCAGCCTGCAGAAGTTTGGAGAGAGGGCCTTCAAGGCCTGGGCAGTGGCAAGGCTGAGCCAGCGGTTCCCAAAGGCAGAGTTCGCAGAGGTGTCCAAGCTGGTGACCGATCTGACAAAGGTGCACACCGAGTGCTGTCACGGCGACCTGCTGGAGTGCGCAGACGATAGGGCAGATCTGGCCAAGTACATCTGTGAGAACCAGGACTCTATCTCTAGCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGAGAAGCCCCTGCTGGAGAAGAGCCACTGCATCGCCGAGGTGGAGAATGACGAGATGCCTGCCGATCTGCCATCTCTGGCCGCCGACTTCGTGGAGAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTATGCCGAGGCCAAGGACGTGTTTCTGGGCATGTTCCTGTATGAGTACGCCAGGCGCCACCCCGATTATTCCGTGGTGCTGCTGCTGCGGCTGGCCAAGACCTACGAGACAACCCTGGAGAAGTGCTGTGCCGCCGCCGACCCCCACGAGTGCTACGCAAAGGTGTTTGACGAGTTCAAGCCACTGGTGGAGGAGCCCCAGAACCTGATCAAGCAGAATTGTGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTATAAGTTTCAGAATGCCCTGCTGGTGAGATACACAAAGAAGGTGCCTCAGGTGTCCACCCCAACACTGGTGGAGGTGTCTAGGAACCTGGGCAAGGTCGGCAGCAAGTGCTGTAAGCACCCAGAGGCAAAGAGGATGCCTTGCGCCGAGGACTATCTGTCTGTGGTGCTGAACCAGCTGTGCGTGCTGCACGAGAAGACCCCCGTGAGCGATCGGGTGACCAAGTGCTGTACAGAGTCTCTGGTGAATAGACGGCCCTGCTTCAGCGCCCTGGAGGTGGACGAGACATACGTGCCAAAGGAGTTTAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGACATCTGTACCCTGTCCGAGAAGGAGAGACAGATCAAGAAGCAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTGAAGCACAAGCCTAAGGCCACCAAGGAGCAGCTGAAGGCCGTGATGGACGATTTTGCCGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGTAAGGCCGACGATAAGGAGACATGCTTCGCCGAGGAGGGCAAGAAGCTGGTCGCCGCTTCACAGGCTGCTCTGGGGCTG
SEQ ID NO:177
cDNA of Mature Simian Serum Albumin (SSA)
GATACCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACCGCTTTAAGGACCTGGGCGAGGAGCACTTCAAGGGCCTGGTGCTGGTGGCCTTTTCCCAGTATCTGCAGCAGTGCCCTTTCGAGGAGCACGTGAAGCTGGTGAATGAGGTGACCGAGTTTGCCAAGACATGCGTGGCCGACGAGAGCGCCGAGAACTGTGATAAGTCCCTGCACACCCTGTTCGGCGACAAGCTGTGCACCGTGGCCACACTGCGGGAGACATACGGCGAGATGGCCGATTGCTGTGCCAAGCAGGAGCCAGAGAGAAATGAGTGCTTTCTGCAGCACAAGGACGATAACCCAAATCTGCCACCTCTGGTGCGGCCCGAGGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTTCACGATAACGAGGCCACATTCCTGAAGAAGTATCTGTACGAGGTGGCCAGGCGCCACCCCTATTTCTACGCCCCTGAGCTGCTGTTTTTCGCCGCCAGATATAAGGCAGCCTTTGCCGAGTGCTGTCAGGCAGCAGACAAGGCAGCATGCCTGCTGCCAAAGCTGGACGAGCTGAGGGATGAGGGCAAGGCCAGCTCCGCCAAGCAGAGACTGAAGTGTGCCTCCCTGCAGAAGTTTGGCGACAGGGCCTTCAAGGCCTGGGCAGTGGCAAGGCTGAGCCAGAAGTTTCCCAAGGCCGAGTTCGCCGAGGTGTCCAAGCTGGTGACCGATCTGACAAAGGTGCACACCGAGTGCTGTCACGGCGACCTGCTGGAGTGCGCAGACGATAGGGCAGATCTGGCCAAGTACATGTGCGAGAACCAGGACTCTATCTCTAGCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGATAAGCCCCTGCTGGAGAAGAGCCACTGCCTGGCCGAGGTGGAGAATGACGAGATGCCTGCCGATCTGCCATCTCTGGCCGCCGACTATGTGGAGAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTACGCCGAGGCCAAGGACGTGTTTCTGGGCATGTTCCTGTATGAGTACGCCCGGAGACACCCCGATTATAGCGTGATGCTGCTGCTGAGACTGGCCAAGGCCTACGAGGCCACCCTGGAGAAGTGCTGTGCAGCAGCCGATCCTCACGAGTGCTACGCAAAGGTGTTTGACGAGTTCCAGCCACTGGTGGAGGAGCCCCAGAACCTGGTGAAGCAGAATTGTGAGCTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTATAAGTTTCAGAATGCCCTGCTGGTGAGGTACACCAAGAAGGTGCCTCAGGTGTCCACCCCAACACTGGTGGAGGTGTCTCGCAACCTGGGCAAGGTCGGCGCCAAGTGCTGTAAGCTGCCCGAGGCCAAGAGGATGCCTTGCGCCGAGGACTATCTGTCTGTGGTGCTGAATCGCCTGTGCGTGCTGCACGAGAAGACACCCGTGAGCGAGAAGGTGACCAAGTGCTGTACAGAGTCTCTGGTGAATAGGCGCCCCTGCTTCAGCGCCCTGGAGCTGGACGAGGCCTACGTGCCTAAGGCCTTTAACGCCGAGACATTCACCTTCCACGCCGATATGTGCACCCTGAGCGAGAAGGAGAAGCAGGTGAAGAAGCAGACAGCCCTGGTGGAGCTGGTGAAGCACAAGCCTAAGGCCACCAAGGAGCAGCTGAAGGGCGTGATGGATAACTTTGCCGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGTAAGGCCGACGATAAGGAGGCCTGCTTCGCCGAGGAGGGACCCAAGTTTGTCGCCGCATCACAGGCAGCACTGGCA
SEQ ID NO:178
cDNA of Mature Rat Serum Albumin (RSA)
GAGGCTCACAAGTCCGAGATCGCCCACAGGTTCAAGGACCTGGGAGAGCAGCACTTCAAGGGCCTGGTGCTGATCGCCTTTTCTCAGTACCTGCAGAAGTGCCCCTACGAGGAGCACATCAAGCTGGTGCAGGAGGTGACCGATTTCGCTAAGACATGCGTGGCTGACGAGAACGCCGAGAACTGTGATAAGAGCATCCACACACTGTTTGGAGACAAGCTGTGCGCCATCCCCAAGCTGAGGGACAACTACGGCGAGCTGGCTGATTGCTGTGCCAAGCAGGAGCCTGAGAGAAACGAGTGCTTCCTGCAGCACAAGGACGATAACCCCAACCTGCCACCTTTTCAGCGGCCTGAGGCTGAGGCTATGTGCACCTCTTTTCAGGAGAACCCTACAAGCTTCCTGGGACACTACCTGCACGAGGTGGCTCGGCGCCACCCTTACTTCTACGCTCCAGAGCTGCTGTACTACGCTGAGAAGTACAACGAGGTGCTGACCCAGTGCTGTACAGAGAGCGACAAGGCTGCCTGCCTGACCCCCAAGCTGGATGCTGTGAAGGAGAAGGCCCTGGTGGCTGCCGTGCGGCAGCGCATGAAGTGTTCTAGCATGCAGAGGTTTGGAGAGAGAGCCTTCAAGGCTTGGGCTGTGGCTAGGATGTCCCAGAGGTTCCCTAACGCTGAGTTCGCCGAGATCACCAAGCTGGCCACCGACGTGACAAAGATCAACAAGGAGTGCTGTCACGGCGATCTGCTGGAGTGCGCTGACGATAGAGCTGAGCTGGCCAAGTACATGTGCGAGAACCAGGCCACAATCTCCTCTAAGCTGCAGGCTTGCTGTGACAAGCCAGTGCTGCAGAAGAGCCAGTGCCTGGCCGAGATCGAGCACGACAACATCCCAGCTGATCTGCCCTCCATCGCTGCCGACTTCGTGGAGGATAAGGAGGTGTGCAAGAACTACGCTGAGGCCAAGGACGTGTTCCTGGGCACCTTCCTGTACGAGTACAGCAGGAGACACCCCGACTATAGCGTGTCCCTGCTGCTGAGGCTGGCTAAGAAGTACGAGGCCACCCTGGAGAAGTGCTGTGCTGAGGGCGACCCCCCAGCTTGCTACGGAACAGTGCTGGCTGAGTTCCAGCCACTGGTGGAGGAGCCTAAGAACCTGGTGAAGACCAACTGTGAGCTGTACGAGAAGCTGGGAGAGTACGGCTTTCAGAACGCCGTGCTGGTGAGATACACACAGAAGGCTCCACAGGTGTCCACCCCCACACTGGTGGAGGCTGCCAGGAACCTGGGAAGAGTGGGCACCAAGTGCTGTACACTGCCTGAGGCTCAGCGGCTGCCATGCGTGGAGGATTACCTGTCTGCTATCCTGAACCGCCTGTGCGTGCTGCACGAGAAGACCCCCGTGAGCGAGAAGGTGACAAAGTGCTGTTCTGGAAGCCTGGTGGAGCGGCGCCCATGCTTCTCCGCCCTGACCGTGGACGAGACATACGTGCCCAAGGAGTTTAAGGCTGAGACATTCACCTTCCACTCTGACATCTGTACCCTGCCAGATAAGGAGAAGCAGATCAAGAAGCAGACAGCTCTGGCCGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCCACCGAGGACCAGCTGAAGACAGTGATGGGCGACTTTGCTCAGTTCGTGGATAAGTGCTGTAAGGCTGCCGACAAGGATAACTGTTTCGCCACCGAAGGTCCAAATCTCGTCGCCCGCTCCAAAGAAGCACTGGCT
SEQ ID NO:179
cDNA of Mature Mouse Serum Albumin (MSA)
GAGGCTCACAAAAGCGAGATTGCCCATAGATACAACGACCTGGGGGAACAGCATTTCAAGGGACTGGTCCTGATTGCATTTTCACAGTACCTGCAGAAGTGCAGCTATGACGAGCACGCCAAGCTGGTGCAGGAGGTGACCGATTTCGCCAAGACATGCGTGGCAGACGAGTCCGCCGCAAACTGTGATAAGTCTCTGCACACCCTGTTTGGCGACAAGCTGTGCGCCATCCCCAACCTGCGGGAGAATTATGGCGAGCTGGCCGATTGCTGTACAAAGCAGGAGCCTGAGCGCAACGAGTGCTTCCTGCAGCACAAGGACGATAATCCAAGCCTGCCACCTTTTGAGCGGCCCGAGGCAGAGGCAATGTGCACCTCCTTCAAGGAGAACCCAACCACCTTCATGGGCCACTACCTGCACGAGGTGGCCAGGAGACACCCCTACTTCTATGCCCCTGAGCTGCTGTACTATGCCGAGCAGTATAATGAGATCCTGACCCAGTGCTGTGCCGAGGCCGACAAGGAGAGCTGCCTGACACCTAAGCTGGATGGCGTGAAGGAGAAGGCCCTGGTGAGCTCCGTGCGGCAGCGCATGAAGTGTTCTAGCATGCAGAAGTTCGGCGAGAGGGCCTTTAAGGCATGGGCAGTGGCAAGGCTGTCCCAGACCTTCCCAAACGCCGACTTTGCCGAGATCACAAAGCTGGCCACCGATCTGACAAAAGTGAATAAGGAGTGCTGTCACGGCGACCTGCTGGAGTGCGCAGACGATAGGGCAGAGCTGGCCAAGTATATGTGCGAGAACCAGGCCACCATCTCCTCTAAGCTGCAGACATGCTGTGATAAGCCCCTGCTGAAGAAGGCCCACTGCCTGTCTGAGGTGGAGCACGACACCATGCCTGCAGATCTGCCAGCAATCGCAGCAGACTTCGTGGAGGATCAGGAGGTGTGCAAGAACTACGCCGAGGCCAAGGACGTGTTCCTGGGCACCTTTCTGTACGAGTATTCCCGGCGCCACCCTGATTACAGCGTGTCCCTGCTGCTGAGGCTGGCCAAGAAGTATGAGGCCACCCTGGAGAAGTGCTGTGCAGAGGCAAATCCACCAGCATGCTACGGAACAGTGCTGGCAGAGTTCCAGCCACTGGTGGAGGAGCCCAAGAACCTGGTGAAGACCAATTGTGACCTGTACGAGAAGCTGGGCGAGTATGGCTTTCAGAACGCCATCCTGGTGAGATATACACAGAAGGCCCCTCAGGTGTCCACCCCAACACTGGTGGAGGCCGCCAGGAATCTGGGCAGAGTGGGCACCAAGTGCTGTACACTGCCCGAGGACCAGAGGCTGCCTTGCGTGGAGGATTACCTGTCTGCCATCCTGAATAGGGTGTGCCTGCTGCACGAGAAGACCCCTGTGAGCGAGCACGTGACAAAGTGCTGTTCTGGCAGCCTGGTGGAGAGGAGGCCCTGCTTCTCCGCCCTGACCGTGGACGAGACATACGTGCCAAAGGAGTTTAAGGCCGAGACTTTCACGTTTCACTCTGATATCTGTACCCTGCCAGAGAAGGAGAAGCAGATCAAGAAGCAGACAGCCCTGGCCGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCCACCGCCGAGCAGCTGAAGACAGTGATGGACGATTTCGCCCAGTTTCTGGACACCTGCTGTAAGGCCGCCGATAAGGACACCTGTTTCTCCACTGAGGGGCCTAATCTGGTCACACGCTGTAAAGACGCACTGGCA
SEQ ID NO:180
cDNA of Signal Peptide of Human Serum Albumin
ATGAAGTGGGTGACCTTTATTAGCCTGCTGTTCCTGTTTAGTTCCGCATACTCAAGAGGGGTGTTTAGAAGA
SEQ ID NO:181
cDNA of Signal Peptide of Simian Serum Albumin
ATGAAGTGGGTGACCTTTATTAGCCTGCTGTTCCTGTTTAGTTCCGCATACTCAAGAGGGGTGTTTAGAAGA
SEQ ID NO:182
cDNA of Signal Peptide of Rat Serum Albumin
ATGAAATGGGTCACCTTCCTCCTCCTGCTGTTCATCTCTGGTTCCGCCTTTAGCCGGGGGGTCTTCCGACGG
SEQ ID NO:183
cDNA of Signal Peptide of Mouse Serum Albumin
ATGAAATGGGTCACCTTCCTCCTCCTGCTGTTCGTGTCTGGTTCCGCCTTTAGCCGGGGGGTCTTCCGACGG
SEQ ID NO:184
cDNA of Signal Peptide of murine α2-macroglobulin
ATGAGGAGAAACCAGCTGCCCACCCCTGCCTTCCTGCTGCTGTTTCTGCTGCTGCCAAGGGACGCT
SEQ ID NO:185
cDNA of Signal Peptide of murine fibrinogen
ATGCTGTCTCTGAGGGTGACCTGCCTGATCCTGAGCGTGGCCTCCACCGTGTGGACA
SEQ ID NO:186
cDNA of Signal Peptide of murine α1-antitrypsin
ATGACCCCAAGCATCTCCTGGGGACTGCTGCTGCTGGCTGGACTGTGCTGTCTGGTGCCTTCTTTCCTGGCT
SEQ ID NO:187
cDNA of Signal Peptide of murine IgGκ chain
ATGGAGACCGACACACTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGA
SEQ ID NO:188
cDNA of Signal Peptide of human IgG heavy chain
ATGGAGTTTGGGCTGTCATGGGTGTTCCTGGTCGCAATCCTGAAAGGCGTGCAGTGT
SEQ ID NO:189
cDNA of Signal Peptide of human IgGκ chain
ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCAGCCTGCTGCTGTGGATCTCCGGCGCCTACGGA
SEQ ID NO:190
cDNA of Human Siglec 3 (CD33) Signal Peptide
ATGCCCCTGCTGCTGCTGCTGCCTCTGCTGTGGGCCGGCGCTCTGGCC
SEQ ID NO:191
cDNA of Artificial Signal Peptide (Secrecon)
ATGTGGTGGAGGCTGTGGTGGCTCCTCCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCC
SEQ ID NO:192
cDNA of Artificial Signal Peptide (Boosted Secrecon) ATGTGGTGGAGGCTGTGGTGGCTCCTCCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCCGCTGCC
SEQ ID NO:193
Mature human PTEN-L Unique Domain (LUD) cDNA
AGCGAGAGCCCTGTGACCATCTCCAGGGCCGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCTCCTCTGCTGCTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCCAGATCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCACACAGCGCCGCCGCCGCCGCCCGGCCCCTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGAC
SEQ ID NO:194
Human PTEN-M Unique Domain (MUD) cDNA
ATCTCCAGGGCCGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCTCCTCTGCTGCTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCCAGATCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCACACAGCGCCGCCGCCGCCGCCCGGCCCCTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGAC
SEQ ID NO:195
Human PTEN-N Unique Domain (NUD) cDNA
CTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCCAGATCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCACACAGCGCCGCCGCCGCCGCCCGGCCCCTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGAC
SEQ ID NO:196
Human PTEN-O Unique Domain (OUD) cDNA
CTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGAC
SEQ ID NO:197
Minimal Mouse/Rat/Human PTEN-S cDNA
ATCGTGAGCCGCAATAAGAGGCGCTATCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCAAACATCATCGCCATGGGATTTCCAGCAGAGAGGCTGGAGGGCGTGTACAGGAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGCGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTAGAGTGGCCCAGTACCCATTTGAGGACCACAATCCACCCCAGCTGGAGCTGATCAAGCCCTTTTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGAGCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGAAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACAGGGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGCGGACCAGAGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCTAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACCGCCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATAGCTCCAATTCTGGCCCCACCAGGCGCGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCCCAGCCTCTGCCAGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCCGGCCCTGAGGAGACAAGCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCCCTGTGCGACCAGGAGATCGATTCTATCTGTAGCATCGAGAGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATCGCTATTTTTCTCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACA
SEQ ID NO:198
Human PTEN-M cDNA
ATCTCCAGGGCCGGAAATGCAGGAGAGCTGGTGTCTCCTCTGCTGCTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCCAGATCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCACACAGCGCCGCCGCCGCCGCCCGGCCCCTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGAC ATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAATAAGCGGCGGTACCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCCAACATCATCGCCATGGGATTTCCTGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTCGCGTGGCCCAGTACCCCTTTGAGGACCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGCAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGGCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCTGGCCCAACCCGGAGAGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCCAATCCAGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCTGACGTGTCCGATAACGAGCCAGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCAGAGAACGAGCCCTTTGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTG
SEQ ID NO:199
Human PTEN-N cDNA
CTGCCACCTACACGGAGAAGGCGCCGGAGACACATCCAGGGACCAGGACCTGTGCTGAACCTGCCAAGCGCCGCCGCCGCCCCACCCGTGGCCAGAGCCCCAGAGGCAGCAGGAGGAGGCTCCAGATCTGAGGACTATAGCTCCTCTCCACACAGCGCCGCCGCCGCCGCCCGGCCCCTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGACATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAATAAGCGGCGGTACCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCCAACATCATCGCCATGGGATTTCCTGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTCGCGTGGCCCAGTACCCCTTTGAGGACCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGCAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGGCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCTGGCCCAACCCGGAGAGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCCAATCCAGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCTGACGTGTCCGATAACGAGCCAGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCAGAGAACGAGCCCTTTGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTG
SEQ ID NO:200
Human PTEN-O cDNA
CTGGCCGCCGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAGCCCAGCTCCTCTAGGCGCAGCTCCCACTACCCTGCAGCAGTGCAGTCCCAGGCTGCCGCCGAGAGGGGAGCCTCTGCCACCGCAAAGTCTCGCGCCATCAGCATCCTGCAGAAGAAGCCACGCCACCAGCAGCTGCTGCCCTCTCTGTCTAGCTTCTTTTTCAGCCACCGGCTGCCCGACATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAATAAGCGGCGGTACCAGGAGGATGGCTTCGACCTGGATCTGACATATATCTACCCCAACATCATCGCCATGGGATTTCCTGCAGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGAAACAATATCGACGATGTGGTGAGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTATAAGATCTACAATCTGTGCGCCGAGAGGCACTATGATACCGCCAAGTTCAACTGTCGCGTGGCCCAGTACCCCTTTGAGGACCACAATCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCTTTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGTCCGAGGACGATAATCACGTGGCAGCAATCCACTGCAAGGCAGGCAAGGGCAGGACAGGCGTGATGATCTGTGCCTATCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCCCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGCGAGGTGAGGACCCGCGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCAAGCCAGCGGCGGTACGTGTACTATTACTCCTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACAGGCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCTATGTTCTCCGGCGGCACATGCAACCCACAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTATTCCTCTAATTCTGGCCCAACCCGGAGAGAGGATAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCACTGCCCGTGTGCGGCGACATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGATAAGATGTTTCACTTCTGGGTGAATACCTTTTTCATCCCAGGCCCCGAGGAGACATCCGAGAAGGTGGAGAATGGCTCTCTGTGCGACCAGGAGATCGATAGCATCTGTTCCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAATGACCTGGATAAGGCCAACAAGGACAAGGCCAATAGATACTTCAGCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCCAATCCAGAGGCCAGCTCCTCTACCAGCGTGACACCTGACGTGTCCGATAACGAGCCAGACCACTATCGGTACTCCGATACCACAGACTCTGATCCAGAGAACGAGCCCTTTGACGAGGATCAGCACACCCAGATCACAAAGGTG
SEQ ID NO:201
Mouse PTEN-M
IARAGNAGELLSPLLLPPTRRRRRRHVQGPGPVLSLPSAAAAPPLARAPEAAGGGSRCEDYPSSPHSAASAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQGQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHSQITKV
SEQ ID NO:202
Mouse PTEN-N
LPPTRRRRRRHVQGPGPVLSLPSAAAAPPLARAPEAAGGGSRCEDYPSSPHSAASAARPLAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQGQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHSQITKV
SEQ ID NO:203
Mouse PTEN-O
LAAEEKQAQSLQPSSSRRSSHYPAAVQGQAAAERGASATAKSRAISILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHSQITKV
SEQ ID NO:204
Mouse PTEN-M cDNA
ATCGCTAGGGCTGGAAACGCTGGAGAGCTGCTGTCCCCTCTGCTGCTGCCCCCTACAAGGAGACGGCGCAGGAGACACGTGCAGGGACCTGGACCAGTGCTGTCCCTGCCATCTGCCGCTGCTGCTCCACCACTGGCTAGGGCTCCTGAGGCCGCTGGCGGAGGCTCTCGCTGCGAGGACTACCCAAGCTCCCCACACAGCGCCGCTTCCGCCGCTCGGCCACTGGCTGCTGAGGAGAAGCAGGCTCAGAGCCTGCAGCCTTCTAGCTCCCGGCGCTCTAGCCACTACCCAGCTGCTGTGCAGGGACAGGCTGCTGCTGAGAGGGGAGCTTCCGCCACCGCTAAGTCCAGAGCCATCTCTATCCTGCAGAAGAAGCCAAGGCACCAGCAGCTGCTGCCTTCCCTGTCCTCTTTCTTTTTCTCTCACAGGCTGCCTGATATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAACAAGAGGAGATACCAGGAGGACGGCTTCGACCTGGATCTGACATACATCTACCCTAACATCATCGCTATGGGATTTCCAGCTGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGGAACAACATCGACGATGTGGTGCGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTACAAGATCTACAACCTGTGCGCTGAGAGGCACTACGACACCGCCAAGTTCAACTGTAGAGTGGCTCAGTACCCTTTTGAGGATCACAACCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCATTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGAGCGAGGACGATAACCACGTGGCTGCCATCCACTGCAAGGCCGGAAAGGGCCGGACAGGAGTGATGATCTGTGCTTACCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCTCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGAGAGGTGAGGACCAGAGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCTTCCCAGCGGCGCTACGTGTACTACTACTCTTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACCGCCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCAATGTTCTCTGGAGGCACATGCAACCCCCAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTACAGCTCCAACAGCGGACCAACCAGGAGAGAGGACAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCTCTGCCCGTGTGCGGCGATATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGACAAGATGTTTCACTTCTGGGTCAACACCTTTTTCATCCCCGGACCTGAGGAGACAAGCGAGAAGGTGGAGAACGGCTCCCTGTGCGACCAGGAGATCGATTCTATCTGTAGCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAACGACCTGGATAAGGCTAACAAGGATAAGGCCAACCGCTACTTTTCCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCTAACCCAGAGGCCTCTAGCTCCACCTCTGTGACACCAGACGTGAGCGATAACGAGCCCGACCACTACAGGTACAGCGATACCACAGACTCCGATCCCGAGAACGAGCCTTTTGACGAGGATCAGCACAGCCAGATCACCAAGGTG
SEQ ID NO:205
Mouse PTEN-N cDNA
CTGCCCCCTACAAGGAGACGGCGCAGGAGACACGTGCAGGGACCTGGACCAGTGCTGTCCCTGCCATCTGCCGCTGCTGCTCCACCACTGGCTAGGGCTCCTGAGGCCGCTGGCGGAGGCTCTCGCTGCGAGGACTACCCAAGCTCCCCACACAGCGCCGCTTCCGCCGCTCGGCCACTGGCTGCTGAGGAGAAGCAGGCTCAGAGCCTGCAGCCTTCTAGCTCCCGGCGCTCTAGCCACTACCCAGCTGCTGTGCAGGGACAGGCTGCTGCTGAGAGGGGAGCTTCCGCCACCGCTAAGTCCAGAGCCATCTCTATCCTGCAGAAGAAGCCAAGGCACCAGCAGCTGCTGCCTTCCCTGTCCTCTTTCTTTTTCTCTCACAGGCTGCCTGATATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAACAAGAGGAGATACCAGGAGGACGGCTTCGACCTGGATCTGACATACATCTACCCTAACATCATCGCTATGGGATTTCCAGCTGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGGAACAACATCGACGATGTGGTGCGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTACAAGATCTACAACCTGTGCGCTGAGAGGCACTACGACACCGCCAAGTTCAACTGTAGAGTGGCTCAGTACCCTTTTGAGGATCACAACCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCATTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGAGCGAGGACGATAACCACGTGGCTGCCATCCACTGCAAGGCCGGAAAGGGCCGGACAGGAGTGATGATCTGTGCTTACCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCTCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGAGAGGTGAGGACCAGAGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCTTCCCAGCGGCGCTACGTGTACTACTACTCTTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACCGCCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCAATGTTCTCTGGAGGCACATGCAACCCCCAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTACAGCTCCAACAGCGGACCAACCAGGAGAGAGGACAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCTCTGCCCGTGTGCGGCGATATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGACAAGATGTTTCACTTCTGGGTCAACACCTTTTTCATCCCCGGACCTGAGGAGACAAGCGAGAAGGTGGAGAACGGCTCCCTGTGCGACCAGGAGATCGATTCTATCTGTAGCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAACGACCTGGATAAGGCTAACAAGGATAAGGCCAACCGCTACTTTTCCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCTAACCCAGAGGCCTCTAGCTCCACCTCTGTGACACCAGACGTGAGCGATAACGAGCCCGACCACTACAGGTACAGCGATACCACAGACTCCGATCCCGAGAACGAGCCTTTTGACGAGGATCAGCACAGCCAGATCACCAAGGTG
SEQ ID NO:206
Mouse PTEN-O cDNA
CTGGCTGCTGAGGAGAAGCAGGCTCAGAGCCTGCAGCCTTCTAGCTCCCGGCGCTCTAGCCACTACCCAGCTGCTGTGCAGGGACAGGCTGCTGCTGAGAGGGGAGCTTCCGCCACCGCTAAGTCCAGAGCCATCTCTATCCTGCAGAAGAAGCCAAGGCACCAGCAGCTGCTGCCTTCCCTGTCCTCTTTCTTTTTCTCTCACAGGCTGCCTGATATGACCGCCATCATCAAGGAGATCGTGAGCAGAAACAAGAGGAGATACCAGGAGGACGGCTTCGACCTGGATCTGACATACATCTACCCTAACATCATCGCTATGGGATTTCCAGCTGAGCGGCTGGAGGGCGTGTACAGGAACAACATCGACGATGTGGTGCGGTTCCTGGACTCCAAGCACAAGAACCACTACAAGATCTACAACCTGTGCGCTGAGAGGCACTACGACACCGCCAAGTTCAACTGTAGAGTGGCTCAGTACCCTTTTGAGGATCACAACCCTCCACAGCTGGAGCTGATCAAGCCATTCTGCGAGGACCTGGATCAGTGGCTGAGCGAGGACGATAACCACGTGGCTGCCATCCACTGCAAGGCCGGAAAGGGCCGGACAGGAGTGATGATCTGTGCTTACCTGCTGCACCGCGGCAAGTTCCTGAAGGCTCAGGAGGCCCTGGACTTTTACGGAGAGGTGAGGACCAGAGATAAGAAGGGCGTGACAATCCCTTCCCAGCGGCGCTACGTGTACTACTACTCTTACCTGCTGAAGAACCACCTGGACTACCGCCCAGTGGCCCTGCTGTTTCACAAGATGATGTTCGAGACAATCCCAATGTTCTCTGGAGGCACATGCAACCCCCAGTTTGTGGTGTGCCAGCTGAAGGTGAAGATCTACAGCTCCAACAGCGGACCAACCAGGAGAGAGGACAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCACAGCCTCTGCCCGTGTGCGGCGATATCAAGGTGGAGTTTTTCCACAAGCAGAACAAGATGCTGAAGAAGGACAAGATGTTTCACTTCTGGGTCAACACCTTTTTCATCCCCGGACCTGAGGAGACAAGCGAGAAGGTGGAGAACGGCTCCCTGTGCGACCAGGAGATCGATTCTATCTGTAGCATCGAGCGGGCCGACAACGATAAGGAGTACCTGGTGCTGACCCTGACAAAGAACGACCTGGATAAGGCTAACAAGGATAAGGCCAACCGCTACTTTTCCCCCAACTTCAAGGTGAAGCTGTACTTCACCAAGACAGTGGAGGAGCCTTCTAACCCAGAGGCCTCTAGCTCCACCTCTGTGACACCAGACGTGAGCGATAACGAGCCCGACCACTACAGGTACAGCGATACCACAGACTCCGATCCCGAGAACGAGCCTTTTGACGAGGATCAGCACAGCCAGATCACCAAGGTG
SEQ ID NO:207
miR21 primer for Reverse Transcription (5'>3')
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAAC
SEQ ID NO:208
miR21 forward primer (5'>3')
GCGGCGGTAGCTTATCAGACTG
SEQ ID NO:209
miR21 reverse primer (5'>3')
ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG
SEQ ID NO:210
pAdEasy-1 complete sequence
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SEQ ID NO:211
pAd(dps)ΔCU-IRES-E1A
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SEQ ID NO:212
47upF
AAAAGAATTCGATTGGGTTCGATTGGCAATGTTGTCTC
SEQ ID NO:213
47upR
AAAAACTAGTGATGTCCCGGGTACGACCATCACCCGAG
SEQ ID NO:214
47dnF
AAAAAAGCTTCACGACATGCTCCCCCCCGACGAGC
SEQ ID NO:215
47dnR
AAAACAGCTGACGCGGAACTAGCGCGGACCGGTCG
SEQ ID NO:216
complementary linker 1
CTAGTGAATTCTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCA
SEQ ID NO:217
complementary linker 2
AGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGAATTCA
SEQ ID NO:218
345upF
CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG
SEQ ID NO:219
345upR
GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGCTCCTGACCGCGGG
SEQ ID NO:220
345dnF
GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCA
SEQ ID NO:221
345dnR
TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA

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Claims (16)

  1. 血清アルブミン（ＳＡ）およびホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）腫瘍抑制因子の連続したアミノ酸配列を含む融合タンパク質であって、必要に応じて前記血清アルブミンがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）であり、必要に応じて前記ＰＴＥＮが、ヒトＰＴＥＮ、サルＰＴＥＮ、ラットＰＴＥＮ、またはウスＰＴＥＮの群から選択される、融合タンパク質。
  2. ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮまたはＰＴＥＮ－Ｌ）腫瘍抑制因子の連続したアミノ酸配列を含む融合タンパク質であって、前記ＨＳＡが、ＰＴＥＮまたはＰＴＥＮ－Ｌの上流または下流にある、融合タンパク質。
  3. 前記血清アルブミンが、配列番号１６３または１３のアミノ酸および配列番号２または３のアミノ酸のＰＴＥＮを含む、請求項２に記載の融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）。
  4. 前記融合タンパク質が、配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、もしくは１３６の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはそれぞれ配列番号６８、５９、５８、１５７、１５９、６５、もしくは１３６と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  5. 配列番号２８、１９、１８、１２９、１３１、２５、もしくは５０、または各々の断片、類似体、バリアント、もしくは等価物の群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  6. 配列番号１４～１７、２０～２７、２９～３０、３４～３７、４９～５０、１０９～１３２、または各々の断片、類似体、バリアント、もしくは等価物、または各々の変異体のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを有し、以下：配列番号１のＳ６５、Ｓ８５、Ｓ８９、Ｓ９１、Ｓ９４、Ｓ１１１、Ｓ１１５、Ｓ１１７、Ｓ１２９、Ｓ１３４、Ｔ１４０、Ｓ１６１、Ｓ１６３、Ｓ１６４、およびＳ１６８ならびに／または配列番号２のＳ１７０、Ｎ２９２、Ｓ３５５、Ｓ３６０、Ｓ３６６、およびＳ３７０のいずれか１つまたはそれ超に等価な選択された位置の、必要に応じたアスパラギン酸またはグルタミン酸への１またはそれを超える変異を必要に応じてさらに含み、必要に応じて前記タンパク質がグリコシル化されており、さらに必要に応じて前記タンパク質のセリン（Ｓ）残基および／またはトレオニン（Ｔ）残基のうちの１つまたはそれ超がＯ－グリコシル化されており、なおさらに必要に応じて前記タンパク質のアスパラギン（Ｎ）残基の１つまたはそれ超がＮ－グリコシル化されている、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  7. 配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０、もしくはその断片の群から選択される操作されたポリヌクレオチド配列、またはそれぞれ配列番号５４～７０、７４～７７、１３５～１６０と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  8. 前記血清アルブミンのアミノ酸配列が、前記ＰＴＥＮのＮ末端またはＣ末端に直接または間接的に抱合されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  9. 前記ＰＴＥＮが、以下のうちのいずれか１つまたはそれ超を含む、請求項１、２、および８のいずれか１項に記載の融合タンパク質：
    （ｉ）成熟ヒトＰＴＥＮ－Ｌ固有ドメイン（ＬＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であって、必要に応じて前記ＬＵＤが配列番号５のアミノ酸配列を含み、さらに必要に応じて前記ＬＵＤが、配列番号（ＳＥＤ ＩＤ ＮＯ：）１９３の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号５と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、必要に応じて前記ＬＵＤがグリコシル化されており、さらに必要に応じて前記ＬＵＤのセリン（Ｓ）残基および／またはトレオニン（Ｔ）残基のうちの１つまたはそれ超がＯ－グリコシル化されている、成熟ヒトＰＴＥＮ－Ｌ固有ドメイン（ＬＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物；
    （ｉｉ）ヒトＰＴＥＮ－Ｍ固有ドメイン（ＭＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であって、必要に応じて前記ＭＵＤが配列番号９のアミノ酸配列を含み、そして／またはさらに必要に応じて前記ＭＵＤが、配列番号１９４の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号９と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、必要に応じて前記ＭＵＤがグリコシル化されており、さらに必要に応じて前記ＭＵＤのセリン（Ｓ）残基および／またはトレオニン（Ｔ）残基のうちの１つまたはそれ超がＯ－グリコシル化されている、ヒトＰＴＥＮ－Ｍ固有ドメイン（ＭＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物；
    （ｉｉｉ）ヒトＰＴＥＮ－Ｎ固有ドメイン（ＮＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であって、必要に応じて前記ＮＵＤが配列番号１０のアミノ酸配列を含み、そして／またはさらに必要に応じて前記ＮＵＤが、配列番号１９５の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１０と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、必要に応じて前記ＮＵＤがグリコシル化されており、さらに必要に応じて前記ＮＵＤのセリン（Ｓ）残基および／またはトレオニン（Ｔ）残基のうちの１つまたはそれ超がＯ－グリコシル化されている、ヒトＰＴＥＮ－Ｎ固有ドメイン（ＮＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物；；
    （ｉｖ）ヒトＰＴＥＮ－Ｏ固有ドメイン（ＯＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であって、必要に応じて前記ＯＵＤが配列番号１１のアミノ酸配列を含み、そして／またはさらに必要に応じて前記ＯＵＤが、配列番号１９６の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１１と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、必要に応じて前記ＯＵＤがグリコシル化されており、さらに必要に応じて前記ＯＵＤのセリン（Ｓ）残基および／またはトレオニン（Ｔ）残基のうちの１つまたはそれ超がＯ－グリコシル化されている、ヒトＰＴＥＮ－Ｏ固有ドメイン（ＯＵＤ）、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物；
    （ｖ）６×Ａｒｇ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含む最小細胞透過ドメイン（ＭＣＰＤ）であって、必要に応じて前記融合タンパク質が、前記ＰＴＥＮと前記アルブミンとの間に切断可能なリンカーを含む、最小細胞透過ドメイン；
    （ｖｉ）膜結合ドメイン（ＭＢＤ）であって、必要に応じて前記ＭＢＤが配列番号４０のアミノ酸配列を含む、膜結合ドメイン；
    （ｖｉｉ）最小ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であって、必要に応じて前記最小ＰＴＥＮ－Ｓが配列番号１６２のアミノ酸配列を含み、そして／またはさらに必要に応じて前記最小ＰＴＥＮ－Ｓが、配列番号１９７の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１６２と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、最小ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物；および
    （ｖｉｉｉ）ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物であって、必要に応じて前記ＰＴＥＮ－Ｓが配列番号２のアミノ酸配列を含み、そして／またはさらに必要に応じて前記ＰＴＥＮ－Ｓが、配列番号１７２の操作されたポリヌクレオチド配列、または配列番号２と同一のアミノ酸配列をコードする少なくとも９０％同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、ＰＴＥＮ－Ｓ、またはその断片、類似体、バリアント、変異体、もしくは等価物。
  10. 以下：シグナルペプチド（必要に応じて前記シグナルペプチドがヒト血清アルブミンシグナルペプチドを含む）、前記アルブミンと前記ＰＴＥＮとの間の第１のリンカー、前記シグナルペプチドのＣ末端の第２のリンカー、および前記融合タンパク質のＮ末端の第３のリンカーのうちの１つまたはそれ超をさらに含み、必要に応じて前記リンカーのうちの１つまたはそれ超が、切断可能な、検出可能なマーカーまたは精製マーカーである、請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  11. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含むポリヌクレオチドを含むベクターであって、必要に応じて前記ベクターがＡｄＶベクターまたはＨＳＶベクターであり、さらに必要に応じて前記ベクターがウイルスベクターであり、必要に応じて前記ベクターが、狂犬病ウイルス、フラビウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、セネカバレーウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、コクサッキーウイルス、パルボウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、または感染性タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の群から選択され、さらに必要に応じて前記ベクターが、抗癌治療および／または遺伝子治療に適切である、ベクター。
  12. 癌または腫瘍細胞の成長または転移を阻害する方法であって、前記細胞を、有効量の以下：請求項１～１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項１１に記載のベクターのうちの１つまたはそれ超と接触させる工程を含み、前記細胞を、有効量の併用治療薬と接触させる工程を必要に応じてさらに含む、方法。
  13. 前記癌または腫瘍細胞はＰＴＥＮの発現が低いか発現を欠き、そして／または前記被験体は、対照と比較してＰＴＥＮ腫瘍抑制因子ｍＲＮＡの３’を標的にするｍｉＲＮＡの発現レベルが高く、必要に応じて前記対照は、いかなる癌や腫瘍も存在しない被験体から単離した生物試料であり、必要に応じて前記対照は、任意の他の癌または腫瘍であり、必要に応じて前記ｍｉＲＮＡはｏｎｃｏ－ｍｉＲであり、必要に応じて前記ｏｎｃｏ－ｍｉＲは、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１３０ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ－１、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２１４、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０１ａ、ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｍｉｒ－１２７３ｇ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１０３、ｍｉＲ－１０６ｂ、ｍｉＲ－１０６ｂ－９３、ｍｉＲ－１０７、ｍｉＲ－１０ｂ、ｍｉＲ－１２９７、ｍｉＲ－１３０、ｍｉｒ－１３０ｂ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６ｂ、ｍｉＲ－１５３、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－１８１ａ、ｍｉＲ－１８１ｃ、ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１９、ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－２００、ｍｉＲ－２００ａ、ｍｉＲ－２０５、ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２１８、ｍｉＲ－２２、ｍｉＲ－２２１、ｍｉＲ－２２２、ｍｉＲ－２２４、ｍｉＲ－２３ａ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２５、ｍｉｒ－２９ｃ、ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－３３５、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３７４ａ、ｍｉＲ－４１０－３ｐ、ｍｉＲ－４２９９、ｍｉＲ－４５４、ｍｉＲ－４９４、ｍｉＲ－５４３、ｍｉＲ－５４８、ｍｉＲ－６１６－３ｐ、ｍｉＲ－７、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－９２ｂ、ｍｉＲ－９３、ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｍｉＲ－９４０、またはｍｉＲ－ｌｅｔ ７ｂのうちの１つまたはそれ超であり、必要に応じて前記ｍｉＲＮＡのレベルは、前記癌細胞または腫瘍細胞を有する被験体の液体生物試料中で検出され、さらに必要に応じて前記液体生物試料は、血液、血清、または血漿の群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記癌または腫瘍細胞が、原発性または転移性の癌または腫瘍細胞；固形腫瘍細胞；胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、トリプルネガティブ乳癌細胞、卵巣癌細胞、腎細胞癌細胞、ユーイング肉腫細胞、黒色腫細胞、中皮腫細胞、肺癌細胞、非小細胞肺癌細胞、ステージＩＶ肺癌細胞、脳癌細胞、膠芽細胞腫細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞；固形腫瘍細胞または血液および／もしくは骨髄の癌細胞；またはＰＴＥＮタンパク質を正常に発現しない（すなわち、発現レベルが低い）組織内の癌もしくは腫瘍の細胞から選択され、必要に応じて前記癌または腫瘍のＨスコアが約２０またはそれ未満であり、ここで、前記Ｈスコアは、規定の強度（０＝染色なし、１＋＝中程度／低下、２＋＝完全）に染色された細胞の百分率の、内部陽性対照（必要に応じて前記内部陽性対照は、２＋に設定した強度を有する内皮または腫瘍間質を含む）に対する積として計算され、積は０～２００の範囲であり、必要に応じてＩＨＣ試料の前記染色強度が、少なくとも２人の独立した病理学者によって盲検的に評価されるか、コンピュータを使用して評価される、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を産生する方法であって、
    （ｉ）融合タンパク質を発現することができる宿主細胞を、前記融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程であって、必要に応じて前記宿主細胞が、前記融合タンパク質を切断することができるプロテアーゼの発現を欠く（または低レベルで発現する）、培養する工程；および
    （ｉｉ）前記融合タンパク質を前記細胞または細胞培養培地から必要に応じて精製または単離する工程であって、必要に応じてアルブミンアフィニティクロマトグラフィおよび／またはヘパリンアフィニティクロマトグラフィを含む、精製または単離する工程
    を含み、
    それにより、産生された野生型ＰＴＥＮ－Ｌタンパク質と比較して高収率、低凝集、および／または高安定性のうちの１つまたはそれ超が達成され、必要に応じて前記培養後または培養中に、宿主細胞の上清が約５μｇ／ｍｌを超える分泌融合タンパク質を含む、方法。
  16. 高収率、高安定性、および／または低凝集のうちの１つまたはそれ超を有する融合タンパク質を製造する方法であって、
    （ｉ）請求項１～１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を発現することができる宿主細胞を、前記融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程であって、必要に応じて前記宿主細胞が、前記融合タンパク質を切断することができるプロテアーゼの発現を欠く（または低レベルで発現する）、培養する工程；および
    （ｉｉ）前記融合タンパク質を前記細胞または細胞培養培地から必要に応じて精製または単離する工程であって、必要に応じてアルブミンアフィニティクロマトグラフィおよび／またはヘパリンアフィニティクロマトグラフィを含む、精製または単離する工程
    を含む、方法。
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