JP2022526448A - 核酸合成方法及び有機分子の多段階合成のための装置 - Google Patents

核酸合成方法及び有機分子の多段階合成のための装置 Download PDF

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Abstract

核酸合成のための方法及び装置。この方法は、脱保護ステップを実施するための少なくとも１つの脱保護ユニットと、カップリングステップを実施するための少なくとも１つのカップリングユニットと、酸化又はチオレーションステップを実施するための少なくとも１つの酸化／チオレーションユニットと、キャッピングステップを実施するための少なくとも１つのキャッピングユニットと、洗浄ステップを実施するための少なくとも１つの洗浄ユニットとを備える装置を使用する。複数の核酸合成反応容器を、所望の核酸配列の合成スキームに従ってユニットに移動させ、少なくとも２つの反応容器が一列に並べられ、いくつかのユニットにおいて作用される。【選択図】図１

Description

本出願は、２０１９年４月１０日に出願された米国仮出願６２／８３１，８５３の利益を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本実施形態は、分子を合成するためのシステム及び方法に関する。より具体的には、本実施形態は、ポリペプチド及びオリゴヌクレオチド等の生物学的ポリマーを合成するための装置及び方法に関する。しかしながら、本実施形態は、他の同様の用途にも適用可能であることを理解されたい。
オリゴヌクレオチドは、糖及び核酸塩基を含むヌクレオシドの配列からなる高分子である。各ヌクレオシドは、ヌクレオシド間結合（internucleosidic linkage）によって隣接するヌクレオシドから間が空けられており、これがヌクレオシド間の結合に効果的に働く。糖は、デオキシリボース、リボース、又は２’－０－置換リボース等のペントースであってもよい。多くの異なる塩基及び置換された塩基を使用することができ、最も一般的な４つはアデニン、シトシン、グアニン、及びチミン（それぞれＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔと略される）である。ヌクレオシド間結合は、最も一般的にはリン酸であり、非架橋酸素原子において種々の置換基で置換されていてもよく、最も一般的には、硫黄又はアルキル、エステル、もしくはアミド基によって置換されていてもよい。
オリゴヌクレオチドは、研究、診断及び治療に従事するバイオテクノロジー分野の研究室で使用される最も重要で一般的な試薬の１つである。オリゴヌクレオチドに対する高い需要は、生物学的試料から得られるＤＮＡ又はＲＮＡ中の相補的ヌクレオチド配列に対するそれらの特異性に由来する。オリゴヌクレオチドを合成するために、ホスホロアミダイト法（phosphoramidite method）、ホスホトリエステル法（phosphotriester method）、及びＨ－ホスホネート法（H－phosphonate method）を含む異なる方法が使用され、これらの各々は生化学の分野で一般に知られている。
担体（fixed bed）を経由する制御された流体を用いた複雑な有機分子の固相ベースの多段階合成は、核酸合成の１つの普及する方法論である。この一般的な技術は、ペプチド、オリゴヌクレオチド及び類似の長鎖生物学的ポリマーの合成に多く適用されている。オリゴヌクレオチド生産のための化学及び合成技術の包括的な議論は、E. Paredes, V. Aduha、KL. Ackley、及びH. Cramer、“Manufacturing of Oligonucleotides”、Comprehensive Medical Chemistry、3rd Edition、２０１７年、Elsevier Inc.に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
多種多様なオリゴヌクレオチドの商業規模での生産は、これらの物質が研究室から出て、主流の治療用途に移行するにつれて、ますます重要になってきている。市販のオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも６ヌクレオチドの長さであり、時には１２～５０ヌクレオチドの長さであり、１５～３０ヌクレオチドが最も一般的な長さである。
オリゴヌクレオチド分子を製造するための１つのシステムにおいて、固体支持体を反応容器内に設けることができ、多数のジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護ヌクレオシドを固体支持体に固定することができる。脱トリチルメカニズム（detritylation mechanism）を介して作用する脱保護剤を加えてヌクレオシドからＤＭＴを除去してヒドロキシルを「脱保護する（deprotect）」。その結果、配列の末端のヌクレオシドは、次のアミダイトを受け取る準備ができている１つのヒドロキシ基をもっている。アセトニトリル（ＡＣＮ）等の溶媒に溶解したヌクレオシドホスホロアミダイト（nucleoside phosphoramidete）（以下、「アミダイト（amidite）」と称する。）が容器に導入される。活性剤が、アミダイトと共に容器内に導入されてもよい。アミダイト中のリンはヒドロキシル中の酸素と結合し、これにより、支持体に結合したヌクレオチドを提供する。支持体に結合したヌクレオチドが形成された後、過剰なアミダイトがＡＣＮで容器から洗い流されてもよい。次いで、酸化剤を添加して、三価リンを五価に変換してもよい。酸化剤がフラッシュされた後、キャッピング剤を添加して、保護されていないヒドロキシルが後の段階で導入されたアミダイトと反応するのをブロックすることができる。ＡＣＮを再び導入して、キャッピング剤を洗い流してもよい。これらのステップを何回も繰り返して、支持体に結合したヌクレオシドから伸長するオリゴヌクレオチド鎖をつくることができる。
従来の合成装置では、様々なライン、ポンプ、バルブが常に液体で満たされ、液体がカラムと呼ばれる容器に導入されるフロースルー設計を使用する。カラムは、典型的に、新しく導入された液体が以前に導入された液体を置換するフロースルー装置である。多くの場合、大規模な製造施設では、合成装置のアレイをバッチプロセスで使用することにより、高いスループットを達成する。これらの合成装置は、典型的には、モノマーを加えるサイクルの個々のステップを連続して行うように構成され、いくつかの異なるオリゴヌクレオチドに対して並行して行うことができる。従って、複数のオリゴヌクレオチドに対する一連の反応は、各オリゴヌクレオチドについて脱トリチルが行われ、次いで各オリゴヌクレオチドについてカップリングが行われ、次いで各オリゴヌクレオチドのキャッピングが行われ、次いで各オリゴヌクレオチドが酸化されるように行われる。そして、このサイクルを、全長のオリゴヌクレオチドが得られるまで繰り返す。
生体高分子（例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチド、その他）を大規模に製造するために、広く受け入れられている固相合成アプローチを使用することができる。この方法では、出発モノマーを不安定なリンカーを介して不溶性マトリックスに結合させる。このマトリックスに、必要な反応物及び追加の反応性モノマーを添加して、不溶性ビーズ上にオリゴマー化合物を伸長させる。具体的には、オリゴヌクレオチドの製造のための固相合成サイクルは、一般に、４つの反復ステップで行うことができる。最初に、第１のヌクレオシド又は補助残基を担持する固体支持体を固体支持体ハウジング上に配置する。次いで、支持体を脱保護剤溶液で処理して、マスキング基、一般的にはヒドロキシル基上のＤＭＴ保護基を除去する。新たにマスクされなくなったヒドロキシル基は、その後の工程において、オリゴマー配列中の次の所望の残基と自由に反応する。この場合、次の残基は、反応を促進するために用いられる活性剤と混合されたホスホロアミダイトモノマーとして添加される。新たに生成したホスホトリエステルは、合成の残りの部分に対して十分に安定ではないので、一般に酸化、チオレーション、又は他の方法で安定化される。次のサイクルを再開する前に、未反応種をキャッピング試薬の使用によって不活性化される。これにより、未反応のヒドロキシル基が再マスクされ、その後のカップリングサイクルにおけるさらなる伸長が防止される。４つのステップ（マスキング解除、カップリング、リンケージ安定化、及びキャッピング）を繰り返すことにより、様々な長さのオリゴヌクレオチドを生成することができる。固相オリゴマー合成の複雑なプロセスは、固相合成装置を使用することにより単純化できる。
１つの大きなカラムを用いた大規模な核酸合成では、流路方向の支持層の長さ（以下、「カラム長」と称する。）が長いこと、又は、直径が広いことが必要である。しかし、フローの分配（flow distribution）と高い作動背圧のためにカラム径とカラム長さの双方は制限される。このような状況では均一な物質移動は困難である。したがって、実施可能なカラムサイズ、したがって、製造サイズには元より制限がある。従って、典型的な市販のオリゴヌクレオチドの長さは、１５～４０Ｍｅｒに制限される。
オリゴヌクレオチドの需要は絶えず拡大しており、従って、可能な限り多くのオリゴヌクレオチドを安価に、短時間で、高品質で、高収率で製造する能力を有することが望まれている。本開示は、バッチプロセスの制限を克服するオリゴヌクレオチド及びポリペプチドの製造のための改良された連続プロセス及び改良された装置を記載する。
基本的な理解を提供するため、本開示の種々の詳細を以下に要約する。本要約は、開示の広範な概要ではなく、開示の特定の要素を特定することも、その範囲を説明することも意図していない。むしろ、本要約の主な目的は、以下に提示されるより詳細な説明に先立って、開示のいくつかの概念を簡略化した形で提示することである。
第１の実施形態によれば、核酸合成方法が提供される。当該方法は、脱保護ステップを実施する少なくとも１つの脱保護ユニットと、カップリングステップを実施する少なくとも１つのカップリングユニットと、酸化又はチオレーションステップを実施する少なくとも１つの酸化／チオレーションユニットと、洗浄ステップを実施する少なくとも１つの洗浄ユニットとを備える装置を用いる。核酸合成のための複数の反応容器又は「ポット」が、所望の核酸配列の合成スキームに従って上記ユニットに移動され、少なくとも２つの反応容器が、一列に並べられ、いくつかのユニットで同時に作用される。
別の実施形態によれば、核酸合成方法が提供される。この方法は、鎖長が増加する有機分子の多段階合成のための装置を使用する。当該装置は、脱保護のステップを実施するための少なくとも１つの脱保護ステーション；カップリングステップを実施するための少なくとも１つのカップリングステーション；酸化又はチオレーションステップを実施するための少なくとも１つの酸化／チオレーションステーション；キャッピングステップを実施するための少なくとも１つのキャッピングステーション、及び洗浄ステップを実施するための少なくとも１つの洗浄ステーションを備える。それぞれのステーションは、適切な流体リザーバを含む。選択された核酸配列を構築するための合成スキームに従って、複数の核酸合成容器は、コンベヤ装置を介して、前記ステーションに対して並列で移動され、少なくとも１つのステーションが他のステーションと比較して最長の時間（Ｒ）を必要とする反応を行う。容器の少なくとも大部分は、設定された時間（Ｔ）に従って、上記ステーション間で一斉に（必ずしもすべてのステーションに同時にではなく）移動され、前記容器は、Ｔの倍数の時間、Ｒ未満の反応時間を有するステーションに留まる。
本開示のデバイス実施形態によれば、有機化合物の多段階合成のための装置が提供される。当該装置は、（ａ）複数の反応容器；（ｂ）複数の流体リザーバ；（ｃ）当該流体リザーバに関連付けられたバルブエレメント；（ｄ）前記流体リザーバから前記容器への供給ストリームを提供するための流体供給装置；（ｅ）複数の前記容器からの流出物の化学組成を監視することができる複数の装置；及び（ｆ）プログラムされたパターンに従って、前記容器を１つの流体リザーバとの流体エンゲージメントから次の流体リザーバへ順次搬送するのに適した前記プログラムされたパターンを有するコンベヤ、を組み合わせて備える。
さらに別の実施形態によれば、有機化合物の多段階合成のための装置が提供される。当該装置は、（ａ）複数の反応容器を収容するコンベヤであって軸上又は軸の周りを移動可能なコンベヤ、（ｂ）前記コンベヤを段階的に移動させるデバイスであって、複数の流体リザーバのうちの１つにそれぞれの前記容器をドッキングさせるそれぞれの増分ステップ；（ｃ）それぞれのドッキングステーションにおいて前記流体リザーバからそれぞれの容器に液体を供給する流体供給装置；（ｄ）それぞれの前記ドッキングステーションのそれぞれの前記容器からの液体流出物を複数の指定容器のうちの１つに排出する排水システム；（ｅ）前記コンベヤ、前記流体供給装置、及び前記排水システムを制御するプログラム可能なコンピュータ；を備える。
追加の実施形態によれば、生体分子を構築するプロセスを順次実施する反応装置が開示される。当該装置は、複数の別々の反応容器を備え、それぞれの容器が、前記分子を結合可能な支持体を収容する。前記プロセスのステップを実施するための流体を収容することができる複数の流体リザーバも同様に提供される。コンベヤは、個々に、それぞれの容器をそれぞれの前記流体リザーバと流体コンタクトモードにする。前記コンベヤは、少なくとも第１の流体リザーバ及び第２の流体リザーバとの連続的な流体コンタクトモードで容器を配置する。前記容器は、前記流体リザーバのそれぞれの内容物であって、前記分子を順次処理する内容物と順次接触することができる。前記装置の少なくとも１つの動作モードは、少なくとも２つの前記容器が単一の流体リザーバから流体を同時に受け取ることを可能にする。
別の実施形態によれば、核酸合成装置が提供される。この装置は、脱トリチルステップを実施するための少なくとも１つの脱トリチルステーション；カップリングステップを実施するための少なくとも１つのカップリングステーション；酸化又はチオレーションステップを実施するための少なくとも１つの酸化／チオレーションステーション；キャッピングステップを実施するための少なくとも１つのキャッピングステーション、及び洗浄ステップを実施するための少なくとも１つの洗浄ステーション、を備える。それぞれのステーションは適切な流体リザーバを含み、前記ステーションは並列で運用される。この装置は、少なくとも１００Ｍｅｒの選択された核酸配列を構築するための合成スキームに従って、コンベヤ装置を介して複数の核酸合成容器を前記ステーションに移動させることを可能にする。
別の実施形態によれば、ペプチド製造プロセスが提供される。このプロセスは、連続するアミノ酸をカルボキシル基活性化状態にし、カルボキシル末端を介して活性化されたサイトに連続的に連結する多段階合成のためのデバイスを用いる。当該デバイスは、少なくとも１つの脱トリチル化ステーション；適切なアミノ酸のアリコートを供給する少なくともいくつかのステーション；洗浄ステップを実施するための少なくとも１つのステーション；中和ステップを実施するための少なくとも１つのステーション；カップリングステップを実施するための少なくとも１つのステーション、を備える。それぞれのステーションは、適切な流体リザーバを含む。このプロセスは、選択されたアミノ酸配列を構築するための合成スキームに従って、コンベヤ装置を介して複数のペプチド合成容器を前記ステーションに同時に移動させる。このプロセスは、少なくとも２つのペプチド合成容器を、一列に並べ、いくつかの前記ステーションで同時に作用されるように配置する。
以下は、本明細書に開示された例示的な実施形態を図示する目的で提示された図面の簡単な説明であり、図面を限定する目的で提示されたものではない。
図１は、本開示に係るシステムの概略図である。 図２Ａは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図２Ｂは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図２Ｃは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図２Ｄは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図２Ｅは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図２Ｆは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図２Ｇは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図２Ｈは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図２Ｉは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図２Ｊは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図２Ｋは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図２Ｌは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図２Ｍは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図２Ｎは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図２Ｏは、本開示の連続的な側面の概略図を提供する。 図３は、図２のプロセスに続く適切な簡略化された第２の連続的なステップの概略図を提供する。 図４は、図３のプロセスに続く適切な簡略化された第３の連続的なステップの概略図を提供する。 図５は、図４のプロセスに続く適切な簡略化された第４の連続的なステップの概略図を提供する。 図６は、図５のプロセスに続く適切な簡略化された第５の連続的なステップの概略図を提供する。 図７は、並行して実施される第１～第５の連続的なステップの各々の概略図を提供する。 図８は、複数のステージの統合を示す概略図である。 図９は、反応容器又はポットの概略図である。 図１０は、シリアルプロトコル（series protocol）を用いた場合の反応時間の変動にどのように対処するのかを示す概略図である。 図１１は、パラレルプロトコル（parallel protocol）を使用して、反応時間の分散にどのように対処するのかを示す概略図である。
本明細書に開示される構成要素、プロセス及び装置のより完全な理解は、添付の図面を参照することによって得ることができる。これらの図は、本開示を説明する便宜及び容易さに基づく単なる概略的な表現であり、したがって、装置又はその構成要素の相対的なサイズ及び寸法を示すこと及び／又は例示的な実施形態の範囲を定義又は制限することを意図していない。
以下の説明では、明確にするために特定の用語を使用しているが、これらの用語は、図面の例示のために選択された実施形態であって、開示の範囲を定義又は限定することを意図していない。以下の図面及び以下の説明において、同様の符号指定は、同様の機能の構成要素を指すことを理解されたい。
単数形の「a」、「an」、及び「the」は、文脈上明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で使用される場合、「約」、「一般的に」、及び「実質的に」という用語は、そのような用語によって修飾される要素又は数の目的に有意に影響しない構造的又は数値的修飾を包含することを意図する。
本明細書で使用される場合、特定の合成ステップは、場合によっては特定の化学反応として、広範に記載される。例えば、脱保護という用語は、マスキング基を除去するステップを説明するために使用され、脱トリチル化（detritylation）は、酸性溶液によるＤＭＴ（４，４’－ジメトキシ性）基の特異的除去を説明するために使用される。しかしながら、これらの用語は、オリゴヌクレオチド合成のステップを記述するために互換的に使用することができる。
本明細書で使用される場合、エンドポイントによる数値範囲の記載は、その範囲内に包含されるすべての数を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．６、４、５等を含む。）。同様に、項目（item）に関して複数の範囲が記載されている場合、範囲は、それらの様々な組み合わせを反映する（例えば、１～５又は２～３は、同様に、１～３及び２～５の範囲も含む。）ことが意図される。
明細書及び特許請求の範囲において使用されるように、用語「備える（comprising）」は、「～から成る（consisting of）」、「本質的に～から成る（consisting essentially of）」という実施形態を含み得る。本明細書において使用される用語「備える（comprise(s)）」、「含む（include(s)）」、「有する（having）」、「有する（has）」、「できる（can）」、「含む（contain(s)）」、及びその変形は、指定された成分／ステップの存在を必要とし、かつ他の成分／ステップの存在を可能にする、開放端の移行句、用語、又は語であることを意図している。しかしながら、そのような記載は、組成又は方法を、列挙された成分／ステップの「～から成る」及び「本質的に～から成る」としても記載するものと解釈され、それは、そこから生じるかもしれない任意の不純物と共に、指定された成分／ステップのみの存在を可能にし、他の成分／ステップを除外する。
図１に、本開示の合成装置２の基本構成要素を示す。当該構成は、洗浄（例えば、ＡＣＮ）、脱トリチル化（例えば、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）／トルエン）、カップリング（例えば、ＡＣＮ、アミダイト、活性剤）、チオレーション（例えば、ピリジン／ＡＣＮ）、キャッピング（例えば、ピリジン／ＡＣＮ／Ｎ－メチルイミダゾール（ＮＭＩ）、及び合成後洗浄（例えばＴＢＡ／ＡＣＮ）のような必要な合成ステップを実施するための液体を含む、反応物／試薬供給容器４を含む。反応物（reactant）という用語は、オリゴマーを伸長させるために使用される液体を特定するために使用される。試薬（reagent）という用語は、合成プロセスの調製及び／又は活性化のために使用される液体を特定するために使用される。ラベルされていない複数の供給容器は、合成装置が、意図された合成によって必要とされる任意の適切な追加の供給材料を収容することができることを実証するために示される。同様に、例示された材料は、すべての合成プロセスに必要であるとは限らない。
合成装置２は、さらに、供給容器４と流体を流通可能なポンプ６（又は流体インジェクタ）を含む。ポンプ６は、反応ポット１０へ供給するため、選択された試薬／反応物をバルブ８に供給する。バルブは、ブロックバルブとすることができる。導入される試薬／反応物の量を監視するために、流量計１２を設けることができる。流量計及びバルブは、ＰＬＣ１４のような制御装置と協働して作動し、以下により詳細に説明する反応ステーションでそれぞれの反応ポットに正確な量を提供するように、流体供給制御を提供することができる。
ＵＶ分光計のような少なくとも１つの分析装置１６は、分子合成プロセスにおけるステップを監視するために装置に付随させることができる。ポンプ６、流量計１２、ブロックバルブ８、及び分析装置１６の動作及び監視は、プログラマブルロジックコントローラ（ＰＬＣ）１４によって行うことができる。当業者が認識するように、配管１８は合成装置全体に設けられているが、図面においては、視認性向上のため、本発明の概念の特徴がその存在によってよりよく伝えられる箇所にのみ示されている。例えば、配管を設けて、反応残渣を反応ポット１０から収集容器２０に搬送することができる。これにより、試薬／反応物のリサイクルを改善し、収集した材料をプロセスで再利用することもできる。合成装置２は、多数の個々の反応ポット１０を含み、これらの反応ポットは、移動ベルトのようなコンベヤ機構２２に関連している。１１個の反応ポットの上部がコンベヤ機構上に配列されている。コンベヤ機構は、円形（circular）、線形（linear）、又はジグザグ形状（zig-zag）であると考えられる。
合成装置の構成要素、特に試薬／反応体と直接接触する構成要素は、ステンレス鋼、ポリエーテルエーテルケトン（polyetheretherketone）、及び／又はポリテトラフルオロエチレン（polytetrafluoroethylene）等の適切な材料から形成することができると考えられる。合成装置は、ＦＤＡの規制、例えばＣＦＲ ２１ Ｐａｒｔ １１７のｃＧＭＰに従って製造することが推奨される。合成装置は、アルゴンのような不活性ガス又は窒素のような低反応性ガスでパージ（purge）され得る制御された環境で収容及び／又は操作されることがさらに考えられる。
それぞれの反応ステーション（例えば、図１参照）は、少なくとも１つの供給容器、少なくとも１つのポンプ、少なくとも１つの流量計、及び少なくとも１つの制御バルブを備えることができる。もちろん、特定のステーションに適切な試薬／反応物を供給するために適切な配管が存在する。反応の必要性及び試薬のタイプに応じて、それぞれのステーションは、関連する試薬／反応液を約１０～１０００ｍｌ／分の体積で分散させる能力を有することが想定される。
それぞれの供給容器は、関連するポンプ、配管、流量計、バルブ、分析装置、及び収集容器と組み合わせて、反応ステーション又は処理ステーションとみなすことができる。ステーションに関連する装置のいずれかを加熱又は冷却してもよく、及び／又は、ポンプ、バルブ、配管及び／又は容器を処理するための加圧ガス源（source of pressurized gas）を含んでもよい。ステーションはそれぞれ、分離ユニット、濾過ユニット、膜抽出ユニット、及び／又はクロマトグラフィーユニットの１つ以上をさらに備えることができる。
ここで、ＰＬＣに関しては、有線又は無線のフィードバック線を介してＰＬＣ１４と合成装置とが通信し、ＰＬＣがリアルタイムで反応ポットの位置を維持するようにする。位置センサを設けて、反応ポットの位置を監視することができる。当該ＰＬＣは、反応プロトコルを通して反応ポット１０の移動を制御し、プログラムされた合成プロセスに従って個々のポットとステーションとを、これらの間で流体を流通できるように接続する。
ＰＬＣにて合成制御も可能である。ＰＬＣからの指示は、反応ポットに試薬／反応物を導入するタイミング、容量、流量及びシーケンスを制御し、これによりオリゴマー合成のシーケンスを決定することができる。これらの指示、例えば、種々のバルブを開閉するための指示、コンベヤ／反応ポットを移動させるための指示、種々のポンプを作動させるための指示、流量計又は分析装置を監視するための指示等は、特定の構造の長鎖分子の構築に関連するマスター命令に結び付けることができる。
ＰＬＣは、装置が、第１の長鎖分子の複数の反応ポットの「バッチ」を調製し、次いで異なる長鎖分子の複数の反応ポットのバッチを調製するように再プログラムすることができるようにプログラム可能であり得る。
反応ポット１０内の反応生成物又は反応ポット１０から収集された残留物の一方又は両方を分析するために、複数（又はすべて）のステーションに、ＵＶ分光計等の分析装置（又は複数）を設けることができる。加えて、又はＵＶ分光計の代替として、システムは、品質管理のため、液体クロマトグラフィー質量分析器（ＬＣＭＳ）、光モニタ、温度モニタ、赤外線モニタ、ＮＭＲ分光器、及び／又はラマン分光計を備えてもよい。システムは、合成エラー又は反応が不完全な分子等の不満足な結果を示す反応ポットを、コンベヤ機構から除去するか、又は他の方法で取り除かれて、さらなる処理ステップから除外することを可能にすることが好ましい。これにより、失敗した反応ステップの影響を単一の反応ポットに止めることができ、稼動している製造全体を汚染することを防ぐことができる。
図２Ａ～Ｏに、本装置に関連する合成プロセスの連続的な性質を示す。具体的には、図２Ａにおいて、第１の反応ポット１を第１のステーションに導入する（合成前洗浄）。反応ポット２は、次にコンベヤ機構に取り上げられるように配置される。
図示された一連のステップは、当然ながら例示的なものである。さらに、それぞれのステップは、必ずしも図示された正確な順序で実行される必要はない。例えば、それぞれのステップの終わりにおけるアミノ洗浄は必要ではない。同様に、例示されたステップは、列挙された化学物質を用いて実施する必要はない。むしろ、類似／同一の機能を実行することができる代替の流体が当技術分野で知られている。
反応ポット１（及びそれに続くポット）は、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬのような支持体を含むことができる。フリット又はフィルタ布を反応ポット内に設けて支持体をホスト（host）することができる。支持体は、反応ポットのサイズが比較的小さいことを考慮すると、圧力損失は比較的小さいため、従来の（例えば、８０μｍ未満、又は４０μｍ未満、又は１μｍ未満、又は０．３μｍ未満）よりも小さいサイズを有する粒子を含むことができる。液相合成も考えられることに留意されたい。
反応ポット１は、まず、合成前洗浄のためのステーションと関連付けられて、ＡＣＮを受け取る。廃液収集容器は、リサイクルのため、過剰なＡＣＮを回収するために、合成前ステーションで反応ポットに連結される。それぞれのステーションは、供給容器から液体を導入するための独自のポンプを有することができる。また、それぞれのステーションは、当該ステーションで生じる反応／処理のキネティクス（kinetics）に適合するように流体導入の速度を制御するために、それ自身の流量計を含むことができる。さらに、それぞれのステーションは、関連する反応／処理を完了するのに十分な量の流体を反応ポットへ確実に供給するために、それ自身の制御バルブ（又は一連の制御バルブ）を含むことができる。さらに、複数の制御バルブがステーションに設けられてもよく、これにより、複数の反応ポットを同時に処理することができる。
図２Ｂでは、反応ポット２がコンベヤ機構に入って合成前洗浄のための第１のステーションに配置されている間に、反応ポット１が第２のステーションに移行して脱トリチルが行われる。反応ポット１及び反応ポット２のそれぞれは、少なくともほぼ同じ時間、それぞれの合成ステーションに配置することができる。第２のステーションは、第１（又は後続）のステーションとは異なる流量及び／又は容積で動作してもよい。これは装置の他のステーションについても同様である。
第２のステーションは、ＵＶ分光計１６又は他の分析デバイスを含むことができ、これにより反応ポット１及び／又はその残渣の状態の評価することができる。第２のステーションには、余分な試薬を回収してリサイクルできるように、別の廃液回収（リサイクル）容器が用意されている。これは装置の他のステーションについても同様である。
図２Ｃでは、コンベヤ機構は、異なる濃度のＤＣＡ／トルエンが供給される第２の脱トリチルステージのために、反応ポット１を第３のステーションに移動させる。少なくとも実質的に同時に、反応ポット２は、第１の脱トリチル処理のためにコンベヤ機構によって第２のステーションに移動され、反応ポット３は、合成前洗浄のために装置の第１のステーションに入る。第３のステーションにおける反応ポット１及び／又はその残留物の含有量を評価するために、ＵＶ分光計が提供されている。
それぞれのステーションで同じポンプ、配管、及びバルブ装置が同じ試薬で使用されているので、合成ステップの間で液体残留物を排出したり、洗浄したりする必要がない。この利点は、第１の分子を形成する合成配列から第２の分子を形成するように構成された合成配列への移行にも及ぶ。これにより、処理速度が向上し、廃液が削減される。
図２Ｄでは、反応ポット１は、カップリングのための第４ステーションに到達し、一方、反応ポット４は、コンベヤ機構によってピックアップされ、合成前洗浄のために第１のステーションに搬送される。それぞれの反応ポット１～４は、それぞれのステーションにおいて、少なくとも実質的に同時に作用される。カップリングステーションは、反応ポット１よりも前にあった可能性のある３つの反応ポット（説明のために３つの反応ポットを示したに過ぎない）とともに示されている。双方向フロー（counter-current flow）を使用することにより、比較的高価なホスホロアミダイトの導入に関連して、並外れた効率を提供する。さらに、ホスホロアミダイトの廃液を、従来のバッチ処理よりも少なくすることができる。
カップリングステーションの反応ポットは、アレイ内の他の反応ポットと同時に移動できるが、複数の活性期間（active period）の間（すなわち、反応ポットがステーションから流体を受け取る時間）、当該カップリングステーションと流体を流通可能な状態のままである。液体の双方向フローは、複数の反応ポットを同時に処理することを可能にする。図２Ｄにおいて、４つの反応ポットは、同時に、アミダイト反応供給チミン（amidite reaction feed thymine）、ＡＣＮ、及び活性剤（エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）等）を受け取る。アミダイトの供給は、１つの反応ポットに必要な濃度以上の濃度にすることができる。アミダイトは、３：１の化学量論的必要量よりも大きい量で第１の反応ポットに導入することができる。例えば、ホスホロアミダイトは、支持体の体積に基づく反応容量（reaction capacity）の約０～５．０当量又は約１．５～３．０当量の量で添加することができる。過剰のアミダイトは一列に連結した反応ポットに移動する。このようにして、１つの連続的に連結された反応ポットからの未反応のアミダイトは、次の反応ポットに流れ、分子構築のためにピックアップされ、バッチ処理と比較して、ホスホロアミダイトの損失の有意に減少することができる。
ある種の合成プロセスでは、カップリングプロセスにおいて、断続的な洗浄及び／又はパルス洗浄（pulsed washing）が提供されることが望ましい場合がある。さらに、パルス洗浄は、他の方法では下流の反応ポットに容易に流れない可能性のある未反応のアミダイトを剥がすために使用できる。洗浄は、ＡＣＮ等の液体又はＮ２等のガス又はこれらの組み合わせによって行うことができる。
導入したアミダイトは、伸長分子に追加される。反応ポットを連続的に連結し、次に双方向フローのチェーンを順次上に移動させることにより、このプロセスは、カップリングステーションの最後の位置で化学量論的に最高濃度のアミダイトに反応ポットをさらすことにより、適切な分子構築を保証する。要するに、１つの反応ポットからの「残留」アミダイトは、後続の反応ポットを「前処理」するために使用され、廃液を低減する。また、アミダイト供給ステーションに関連して使用される双方向フロー方法は、合成装置の他のステーションのいずれか又は全てでの使用に等しく適していることに留意されたい。
図２Ｅ～図２Ｇは、反応ポットがコンベヤ機構上で下流に移動されると、反応ポット５、６、７が、新たに、反応ポットの連続進行に参加し、反応ポット２、３、４は、双方向フローの配置において、チミンカップリングステーションの反応ポット１に参加する。
図２Ｈ及び図２Ｉは、それぞれ、反応ポット１及び反応ポット２が、どのようにしてカップリング洗浄ステーションへと連続的に移動するかを示す。カップリング洗浄ステーションは、双方向フロー構成とすることもできる。２つの反応ポットが一列に並び、カップリング流体を受けている例が示されている。もちろん、２つ以上の反応ポットを一列に連結することができる。明らかなように、これらの反応ポットの後に新しい反応ポット（反応ポット８、９）が順番に続いている。
図２Ｊ及び２Ｋでは、反応ポット１及び反応ポット２は、順次、チオレーションステーション（ピリジン／ＡＣＮ）に移動している。明らかなように、これらの反応ポットの後には、新しい反応ポット（反応ポット１０、１１）が順番に続いている。
図２Ｌ及び図２Ｍは、それぞれ、反応ポット１及び反応ポット２が、キャッピングステーション（ピリジン／ＡＣＮ／ＮＭＩ／ＡＣ２０）に、再び双方向フロー構成を用いて、順次移動されることを示す。明らかなように、これら反応ポットの後には、新しい反応ポット（反応ポット１３、１４）が順番に続いている。
図２Ｎ及び図２０は、それぞれ、反応ポット１及び反応ポット２が、合成後アミン洗浄ステーションに順次移動されることを示す。合成プロセスにおいて、これらの反応ポットの後には、新しい反応ポット（反応ポット１５、１６）が順番に続いている。合成後アミン洗浄の完了後、例示的な第１の合成ステージは完了したと見なすことができ、第１のオリゴヌクレオチド単位ｄＴを有する進行中の分子（in-process molecule）を含む多数の反応ポットをもたらす。
図３は、第１の合成ステージの反応ポットが受け取られ、さらに処理される第２の合成ステージを示す。ステージ１で使用されるのと同じステーションをステージ２で使用することができることが好ましい。実際には、ステーションは、ステージ１、ステージ２、ステージ３等を同時に実行することが想定されている。第２の合成ステージには、合成前洗浄及び第１の脱トリチルステップ等の特定のステップは実施されなくてもよい。わかりやすくするために、ステージ１からのステーション３、５、６、７、８はステージ２で再利用され、シトシンを提供するためのステーション９がステージ２のプロトコルに加えられることに留意されたい。
さらに、どんなアミダイトでも第２の合成ステージで処理することができ、シトシンの合成が示されている。これは、シトシン供給ステーション９の追加によって達成することができる。また、完全なステーション（供給容器、ポンプ、流量計、バルブブロック、分析装置及び残渣回収装置）がシトシン導入のために提供されることも企図される。分子中に含まれるアミダイトごとにさらにステーションを追加することができる。特に、合成装置は、任意の数のオリゴヌクレオチドを形成するように構成することができるので、一般的に使用されるアミダイト又はすべてのアミダイトのためのステーションを備える可能性が高い。
図４、図５及び図６は、より長いポリマーを構築するために使用されるさらなる合成ステージを示しており、先行するステージの反応ポットは、アミダイトを添加するために順次導入される。ステーション１０は、新しいアミダイトｄＧを供給するために設けられる。しかし、ポンプ（４）は、ステージ４におけるｄＴの２回目の導入のために再び使用される。ステーション９は、ステージ５でのｄＣの２回目の導入のために使用される。図５は、合成プロセスにおける新しいステップを示し、プロトコルのステップ１の繰り返しも構成している。図６は、シーケンスプロトコルのステージ２の繰り返しを示す。
アミダイトステーションのこの再利用は、所望の構造及び長さの分子を構築するために必要に応じて繰り返すことができる。この文脈において、２～３００Ｍｅｒ、又は少なくとも１００Ｍｅｒ、又は２００Ｍｅｒより大きい、又は３００Ｍｅｒより大きい分子が生成され得ることが想定される（ポリペプチドを考慮する場合、塩基対が適切な基準である）。複数の反応ポット中で所望の分子を合成した後、その内容物をより大きな貯蔵容器中で組み合わせることができる。組み合わされた内容物は、従来のオリゴヌクレオチド製造／精製技術に従って処理されてもよい。
本システムは、所望の長さの分子を達成するために、１００を超える反応ポットを処理する１５を超えるコンベヤアレイを含むことができる。一般に、それぞれのコンベヤアレイは、複数の（例えば７以上）反応ポットを受け取ることが想定される。
本開示の反応器は、一列に多数の（例えば２０超の）反応を有することができ、複数の列（例えば２０超）を提供することができることが想定される。この文脈において、４００以上の反応ポットを同時に作用させることができ、大部分のポットは、分子構築において異なるステージにある。一般に、例示的な反応器は、５～２５の反応ステーションを有し、５～１０の列を含むことができる。
図７に、本合成装置の効率を示す。例えば、合成配列のそれぞれのステップに対して単一の供給容器及び供給装置（ステーション）を提供することが可能である。別個のポンプ、流量計、バルブ、及び配管を設けることによって、単一のリザーバは、ステージ１～５（又はそれ以上）のいずれかにおいて反応ポットに対して供給を行うことができる。同様に、単一のアミダイトリザーバは、合成配列中の異なるステップにアミダイトを供給することができる（例えば、チミンをステージ１及びステージ４に）。
さらに、試薬／反応物は、分子合成の異なるステップで異なる濃度で供給され得ることが企図される。例えば、ステージ１よりもステージ５でより多くの活性剤を導入することが望ましい場合がある。同様に、合成プロセスの後のステージにおいて、より低い濃度のカップリング洗浄を加えることが望ましい場合がある。同様に、導入されるアミダイトの量は、単一の反応ステーションで一列に連結された反応ポットの数に応じて変化させることができる。
ポンプ、流量計、バルブを合成プロセスのステップ間で洗浄する必要がないため、それぞれの反応ステーションを１種類の反応物／試薬のみで使用することでさらにメリットが得られます。同様に、反応ステージ間に装置を空にする必要もない。この文脈において、単一のステーション（例えば、チオレーション）を使用して、ポリマー合成の異なるステージで複数の反応ポットを処理することができる。
また、合成装置は、切断、脱保護、分離、濾過、膜抽出及び／又はクロマトグラフィーのユニットの１つを、１つ又は複数のステーションに含むことが考えられる。
図８は、カップリングステーションを除いて、それぞれのステーションに対して単一のポンプを使用することができ、使用するアミダイトごとにポンプを供給することができることを示している。さらに、いくつかのステーションは、複数の供給ストリーム（feed stream）を同時に供給する能力を有するマルチブロックバルブを含むことができる。カップリングステーションを例にとると、マルチブロックバルブは、ステーション４からのｄＴの供給ストリームを、ステージ１及びステージ４で一列に連結された反応ポットに、また、ステーション９からのｄＣの供給ストリームを、ステージ２及びステージ５で一列に連結された反応ポットに同時に供給することができる。他のステーションは、合成プロセスの異なるステージへ異なる濃度の供給ストリームを供給するために、マルチブロックバルブを含むことができる。例えば、ステージ１よりもステージ５のキャッピングステーションに、高い濃度のＮＭＩを供給することが望ましい場合がある。説明明確のため、「ステージ・・・」は、反応ポットを受け取るのに適した「Ｕ」型の入口／出口の管を含むコンベヤプレート機構（下記の図９の１２０を参照）の概略図を含むことに留意されたい。このコンベヤプレート機構により、反応ポットを適切なアレイ及び間隔に配置して、所望の生物学的ポリマーを最も効率的に構築することができる。それぞれのステージのアレイは、反応ポットが第１のプレートアレイから取り外されて次のプレートアレイに取り付けられる別個のプレートであり得るか、またはアレイは機械的に統合され得る。
図９は、例示的な反応ポット１００を示す。ポット１００は、反応ベッド１１３を含む容器１１２を含むことができる。ポットの上面１１４は、液体供給ストリームを反応ポットの上部に導入する入口１１６と、反応ベッド１１３を通過した後にポットの下部領域から液体を除去する出口１１８とを含むことができる。ガスが、除去を補助するために入口１１６（又は別の通路）から導入されてもよい。反応ポット１００は、それぞれのステーションに配置され、密封可能な嵌合接合部を含む実質的にプレート１２０と嵌合するように構成することができる。プレート１２０は垂直に移動して反応ポット１１０と係合／離脱することができ、反応ポット１１０はステーションからステーションへ水平に移動する。しかしながら、反応ポット搬送機構は、異なるサイズ及び形状のポットを受け取ることができることが想定される。反応ポットは、実施される合成の必要性に応じて、使い切り（例えば、使い捨て容器及び／又はバッグ）又は再使用可能である。
例示的な反応ポットのサイズは、内径が約１～１００ｍｍ、又は内径が約１０～５０ｍｍ、高さが１５０ｍｍまでであり得る。反応ポット内の支持体の有効寸法は指定可能である。例えば、溶媒によって膨潤した状態の支持体は、高さが約０～約１５０ｍｍ、又は約５～３０ｍｍ、又は約１０ｍｍ～４０ｍｍで、直径が０ｍｍ超過～約１００ｍｍ又は約１０ｍｍ～５０ｍｍであり得る。しかしながら、容器の形状は円筒状である必要はないことに留意されたい。
比較的小さな体積（例えば、１５ｃｍ３未満）の複数の反応ポットでシステムを運用することにより、それぞれの反応ポットで起こる反応の物質移動が改善される。改善された物質移動には、反応ポットあたりの圧力降下が約５バール未満である等の利点がある。にもかかわらず、システム全体を考慮すると、多くの反応ポットを使用することにより、バッチプロセスにおいて現在実用的であるよりも大きな反応体積（例えば直径２，０００ｍｍ、高さ２００ｍｍ＝３，１４０ｃｍ３）を有する合成装置が提供されるのに対し、直径４０ｍｍ、高さ１５０ｍｍの２００個の反応ポットは、９，４２０ｃｍ３の体積を提供する。
反応ポットは、温度制御装置、混合装置、圧力調整装置及び／又はｐＨ調整装置を備えてもよい。実施される処理／反応のための環境を最適にするため、ステーション間で反応ポットの条件（例えば温度）を変更することが望ましい場合がある。反応ポットはまた、温度、圧力、ｐＨ、導電率及び時間のうちの少なくとも１つを監視するためのプローブを含むことができる。
反応ポットに、識別のために個々にマーク（例えばバーコード）を付すこともできる。このようにして、それぞれの反応ポットの合成された分子の様相をデータベースに記憶することができる。この情報は、例えば、製造ステージ、予想される又は実際の分子構造、製造日、純度等を含むことができる。
特定の実施形態では、反応ポットは、設定された時間（Ｔ）に従って、ステーション間で一斉に（必ずしもすべてのステーションで同時にではなく）移動される。しかし、合成プロセスのそれぞれのステップは、同じ時間で完了しない場合がある。さらに、少なくとも１つのステップが最長の反応時間（Ｒ）を有してもよい。従って、反応ポットは位置を移動することができるが、Ｔの倍数（倍数は整数であり得る）の時間、Ｒ未満の反応時間のステーションに留まる。この文脈において、いくつかのステーションにおいて、反応ポットは、当該ステーションが非アクティブである間、ステーションに保持され得る。
スタートアップモードにおいて、容器は、それぞれのステーションに少なくとも１つの容器が関連付けられるまで、Ｔの分数である反応時間（reaction time which is a fraction of T）の期間の後に移動され得る。当該スタートアップの後、少なくとも１つの反応容器をそれぞれのステーションに配置することができ、通常の移動速度Ｔが開始される。形成される分子に応じて、それぞれの反応ポットは、数秒～１０分毎、あるいは１／２分～５分毎に移動することが想定される。
図１０に、本発明の合成装置が設定された時間間隔に従ってシリアルに動作する概念を示す。さらに、それぞれのステップは、期待される反応時間に等しいポット位置を有するように構成される。例えば、脱トリチルステップは、３分間の反応時間及び対応する３つのポット位置を有し、１つの供給物から同時に供給液（例えばＤＣＡ／トルエン）を受け取ることができる。この構成では、それぞれのポットはアセンブリ全体で前に進むポットを追従することができる。
図１１に、本発明の合成装置が設定された時間間隔に従ってパラレルに動作する概念を示す。さらに、ステーションにおけるポットの数は、関連する反応時間に対応する。例えば、２つのポットは、第１の脱トリチル化ステーションに留まり、ＤＣＡ／トルエンは、２つのポットのうちの第１のポットから第２のポットに順次供給される。この構成では、ポットは、直前のポットに追従せず、より長い反応ステップの位置に移動する。図１０及び図１１のプロトコルのいずれにおいても、この構成の意図は、反応を完了するのに十分な時間の間、それぞれのポットをステーションに配置することである。その文脈において、シリアル及び／又はパラレルの戦略は、ステーションにおいて、共に又は代替的に使用することができることが想定される。
所望の高分子の構築の終了において、この手順は、合成装置アレイから所望の高分子を含有する反応ポットを取り外すことを企図する。同様に、この手順は、最終反応ポットへの供給を完了したステーションが、その指定された試薬／反応物の導入を停止できることを企図している。この文脈において、それぞれのステーションは、（潜在的には、洗浄用流体の集中リザーバからの）洗浄用流体（cleaning fluid）の供給を含み得ることが想定される。このようにして、サイクルを終了するポットは、最後に高分子を構築した反応ポットに続いて、アレイ内のそれぞれのステーションを終了するために使用される洗浄用流体を受け取ることができる。例示的な洗浄用流体はＡＣＮである。
また、個々のステーションからの過剰の試薬／反応物を、リサイクルのため、列に沿った異なるステーションに、又は異なる列のステーションにさえ供給することができると考えられる。これは、高分子の構築のどの時点でも可能であり、サイクルの最後で採用すると、終了された反応ステーションがアクティブな反応ステーションのアレイにさらに供給することができる。例えば、ＡＣＮをステーション１からステーション１の供給容器にリサイクルするのではなく、ステーション５（又は他の適切なもの）にリサイクルして原材料を保存することができ、特にプロセスの終了時において、運用効率を改善することができる。
特定の試薬及び反応物が図示されているが、開示はこれらの実施例又は配列に限定されない。むしろ、当業者は、合成配列における無数のバリエーションが実現可能であることを認識するであろう。
当該合成装置は、ポリペプチドを合成する反応溶液を分配するように構成することもできる。固体支持体上のペプチド合成プロセスは、一般に、カルボキシル末端からペプチドを構築することを含む。ペプチドは、そのカルボキシル末端のアミノ酸を介して固体支持体に結合され、アミノ末端のα－アミノ基上に保護基をさらに含む。次いで、保護基をペプチドから切断して脱保護ペプチドを形成する。次に、保護されたα－アミノ基を含む単量体アミノ酸を、脱保護されたペプチドのα－アミノ基と当該単量体アミノ酸のα－カルボキシル基との間のペプチド結合を形成する条件下で、脱保護されたペプチドと接触させる。単量体アミノ酸は、活性化された形態で提供されてもよいし、活性化試薬が、アミノ酸及び伸長ペプチドに添加されてもよい。試薬を除去するため、ステップとステップとの間に洗浄を行うことができる。所望の長さのペプチドが合成されるまで、次のアミノ酸の脱保護と、追加のアミノ酸のカップリングとのサイクルを繰り返すことができる。アミノ酸の任意の反応性を有する側鎖は、一般的には、カップリング及びα－アミノ基の脱保護プロセスに耐えることができる化学基によって保護される。しかし、これらの側鎖の保護基は、合成の最後において除去され得る。ステーションのアレイ、及びアレイが相互に協働するスケジュールは、本明細書の教示及びペプチド合成のための公知の反応スキーム、例えば、Goodman他（著）、Synthesis of Peptides and Petidomimetics、Vol.E22a、Georg Thieme Verlag、Stuttgart、２００２年、に記載されているものに従って相関させることができる。
以下の実施例は、例示として提示されており、限定ではない。
オリゴヌクレオチドは、複数の反応ポットに流体を供給すること及び当該反応ポットからの廃液を排出することを含む物理的なステップに従って、本明細書に記載の装置を使用して製造される。コンピュータは、適切な反応物を指定された反応ポットに指定された順序で供給するようにプログラムされる。
オリゴヌクレオチド合成は、脱保護、縮合（condensation）、酸化及びキャッピングを含む。脱保護は、糖部分の５’－ＯＨから酸に不安定なＤＭＴr基を除去することである。縮合は、過剰の活性化モノマーを伸長鎖（growing chain）にカップリングさせる。酸化とは、３’－５’ヌクレオチド間の亜リン酸トリエステル結合（3'-5' internucleotide phosphite triester linkage）のより安定なホスホトリエステル結合（phosphotriester linkage）への酸化である。次いで、ポリマーを処理して保護基を除去し、それによってホスホジエステル結合（phophodiester linkage）を生成する。キャッピングステップは、酢酸エステルとして縮合しなかった５’－ヒドロキシル基をキャッピングすることである。一般的なプロトコルは、１．支持体の洗浄；２．保護基を除去するための脱ブロッキング剤を含む液体の分配；排水；３．保護されたヌクレオチド及びカップリング活性剤を含む液体の分配；排水；４．キャッピング剤を含む液体の分配；液体の排出；支持体の洗浄；酸化剤を含む液体の排出、である。ヌクレオチド配列が完成するまでステップが繰り返される。
ポリペプチド合成は、１．における、新生ポリペプチド鎖へのアミノ酸の付加を含み得る。伸長ペプチド鎖の末端のα－アミノ基を利用可能にするために、保護基（Ｆｍｏｃ又はＢｏｃ）を取り除くことによる脱保護；２．アミノ酸残基を活性エステルに活性化し、次いで伸長ペプチド鎖の末端で脱保護されたα－アミノ基とアミド結合を形成することによるカップリング；及び３．未反応のα－アミノ基をＤＮＡ／ＲＮＡ合成と同じ試薬でキャップする。Ｆｍｏｃを用いる合成では、塩基に不安定な保護基（Ｆｍｏｃ）はそれぞれのサイクルで除去される。合成の最後において、側鎖保護基は弱酸（weak acid）によって除去され、ペプチドを支持体に固定している結合も切断される。Ｂｏｃを用いる化学では、Ｂｏｃ保護基は酸に不安定であり、弱酸（mild acid）で除去することができる。最後の脱保護及び切断ステップには強酸（strong acid）を用いる。
Ｆｍｏｃを用いる化学を使用するペプチド合成のためのプロトコルは、以下のステップを含むことができる：１．脱保護（少なくとも１回）－ピペリジン，２回－７分；２．ドレイン；３．洗浄（少なくとも１回）－Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），６回；４．カップリング－１８秒の活性化＋３５分のカップリング；５．ドレイン；６．キャッピング［オプション］－１分；７．ドレイン；８．洗浄（少なくとも１回）－ＮＭＰ又はＤＭＦ，３回。アミノ酸配列が完成するまでステップ１～８が繰り返される。Ｂｏｃの化学を用いたペプチド合成のためのプロトコルは、以下のステップを含むことができる：１．洗浄（少なくとも１回）－クロロメタン（ＤＣＭ）、１回；２．脱保護（少なくとも１回）－トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２回－６分；３．ドレイン；４．洗浄（少なくとも１回）－クロロメタン（ＤＣＭ）、１回；５．洗浄（少なくとも１回）－ＮＭＰ又はＤＭＦ、６回；６．カップリング－１８秒の活性化＋３５分のカップリング；７．ドレイン；８．キャッピング［オプション］－１分；９．ドレイン；１０．洗浄（少なくとも１回）－ＮＭＰ又はＤＭＦ、３回。アミノ酸配列が完成するまでステップ１～１０が繰り返される。
例示的な実施形態を、好ましい実施形態を参照して説明した。明らかに、前述の詳細な説明により、他の者に、修正や変更を思いつかせることができる。例示的な実施形態は、添付の特許請求の範囲又はその等価物の範囲内に限り、そのようなすべての修正及び変更を含むものと解釈されることが意図される。
特許庁及び本出願及び結果として生じる特許の読者が本出願に添付されたクレームを解釈するのを助けるために、出願人は、「～のための手段」又は「～のためのステップ」という用語が特定のクレームにおいて明示的に使用されていない限り、添付されたクレーム又はクレーム要素のいずれも３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１２条（ｆ）を援用する意図を持たない。

Claims (63)

  1. 脱保護ステップを実施するための少なくとも１つの脱保護ユニットと、カップリングステップを実施するための少なくとも１つのカップリングユニットと、酸化又はチオレーションステップを実施するための少なくとも１つの酸化／チオレーションユニットと、洗浄ステップを実施するための少なくとも１つの洗浄ユニットとを含む装置を使用する核酸合成方法であって、核酸合成のための複数の反応容器が、所望の核酸配列の合成スキーム（synthesis scheme）に従って前記ユニットに移動され、少なくとも２つの反応容器が、一列に（in series）並べられ、前記ユニットの少なくともいくつかに同時に作用される、核酸合成方法。
  2. 前記反応容器内において、支持体は、ガラス固相（glass solid phase）、ポリマー固相（polymer solid phase）、及び混合懸濁液のうちの１つである、請求項１に記載の核酸合成方法。
  3. それぞれの反応容器が再使用可能又は使い切りである、請求項１又は２に記載の核酸合成方法。
  4. それぞれのユニットが１種類の核酸又は処理用の化学物質に対してのみ使用される、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸合成方法。
  5. 少なくともいくつかの前記ユニットが核酸の合成において２回以上使用される、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸合成方法。
  6. アミダイトが、反応容器への１回の添加において、３：１を超える化学量論的条件で添加される、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸合成方法。
  7. 全ての反応容器が同時に移動する、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸合成方法。
  8. 選択されたユニットにおいて、前記反応容器は移動するが、同じユニットと流体を流通可能なままである、請求項１に記載の核酸合成方法。
  9. 前記カップリングユニットに使用される材料はホスホロアミダイト（phosphoramidite）であり、前記ホスホロアミダイトが０～５．０当量（equivalents）、好ましくは１．５～３．０当量の量で添加される、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸合成方法。
  10. 前記カップリングユニットに使用される材料は活性剤（activator）であり、前記活性剤は、前記合成配列（synthesis sequence）の異なるポイントで異なる濃度で添加される、請求項１に記載の核酸合成方法。
  11. 前記反応ユニット及び前記洗浄ユニットで使用される材料は、合成配列の異なるポイントで異なる濃度で添加される、請求項１に記載の核酸合成方法。
  12. ユニットで反応容器から回収された材料が、前記合成スキームにおける後の反応容器の反応又は処理のために、前記ユニットにおいて再使用される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸合成方法。
  13. 前記反応容器内の反応生成物が、いくつか又は全ての反応ステーションで評価され、不満足な結果を示す反応容器は合成プロセス（synthesis procedure）から除去される、請求項１に記載の核酸合成方法。
  14. 液相合成（liquid phase synthesis）を含む、請求項１に記載の核酸合成方法。
  15. アミダイトの添加量が、一列に連結された反応容器の数に応じて変化する、請求項６に記載の核酸合成方法。
  16. 鎖長が増加する有機分子の多段階合成のための装置を備えるデバイスを使用する核酸合成方法であって、
    前記装置は、
    脱保護ステップを実施するための少なくとも１つの脱保護ステーション；
    カップリングステップを実施するための少なくとも１つのカップリングステーション；
    酸化又はチオレーションステップを実施するための少なくとも１つの酸化／チオレーションステーション；及び
    洗浄ステップを実施するための少なくとも１つの洗浄ステーション；
    適切な流体リザーバを含むそれぞれのステーション；
    を備え、
    選択された核酸配列を構築するための合成スキームに従って、複数の核酸合成容器がコンベヤ装置を介して前記ステーションに移動され；
    少なくとも１つのステーションが、他のステーションと比較して最長の時間（Ｒ）を必要とする反応を行い；
    前記ステーションが並列で（in parallel）運用され；
    前記容器の少なくとも大部分は、設定された時間（Ｔ）に従って前記ステーション間で一斉に移動され、当該容器は、Ｔの倍数の時間、Ｒ未満の反応時間のステーションに留まる、
    核酸合成方法。
  17. 前記倍数は整数である、請求項１６に記載の核酸合成方法。
  18. 前記容器が、それぞれのステーションに少なくとも１つの容器が関連付けられるまで、Ｔの分数である反応時間の期間の後に移動されるスタートアップモードを含む、請求項１６に記載の核酸合成方法。
  19. 前記スタートアップモードの後に、複数の容器は１つ以上のステーションで一列に連結され、当該容器は、Ｔに等しい時間又はＴに近づく時間で移動する、請求項１６に記載の核酸合成方法。
  20. スタートアップモードにおいて、少なくともいくつかの空の反応容器が、選択されたユニットに配置される、請求項１６に記載の核酸合成方法。
  21. 連続するアミノ酸をカルボキシル基活性化状態（carboxyl activated state）にし、カルボキシル末端を介して活性化されたサイト（active sites）に連続的に連結する多段階合成のための装置を備えるデバイスを用いてペプチド製造プロセスであって、
    前記装置は、
    少なくとも１つの脱保護ステーション；
    適切なアミノ酸のアリコートを供給する少なくともいくつかのステーション；
    洗浄ステップを実施するための少なくとも１つのステーション；
    中和ステップを実施するための少なくとも１つのステーション；
    カップリングステップを実施するための少なくとも１つのステーション；
    適切な流体リザーバを含むそれぞれのステーション；
    を備え、
    複数のペプチド合成容器が、選択されたアミノ酸配列を構築するための合成スキームに従ってコンベヤ装置を介して前記ステーションに移動され、少なくとも２つのペプチド合成容器が、一列に並べられ、いくつかの前記ステーションで同時に作用される。
  22. 有機分子の多段階合成のための装置であって、（ａ）複数の反応容器；（ｂ）複数の流体リザーバ；（ｃ）前記流体リザーバに関連付けられたバルブエレメント（valve elements）；（ｄ）前記流体リザーバから前記容器への供給ストリーム（feed stream）を提供するための流体供給装置；（ｅ）複数の前記容器からの流出物の化学組成を監視することができる複数のデバイス；及び（ｆ）プログラムされたパターンに従って、前記容器を１つの流体リザーバとの流体エンゲージメント（fluid engagement）から次の流体リザーバに順次搬送するのに適した前記プログラムされたパターンを有するコンベヤ、を組み合わせて備える装置。
  23. 有機分子の多段階合成のための装置であって、（ａ）複数の反応容器を収容するコンベヤであって、軸上又は軸の周りを移動可能なコンベヤ；（ｂ）コンベヤを段階的に移動させるデバイスであって、複数の流体リザーバのうちの１つにそれぞれの前記容器をドッキングさせるそれぞれの増分ステップ（incremental step）；（ｃ）それぞれのドッキングステーションにおいて前記流体リザーバからそれぞれの容器に液体を供給する流体供給装置；（ｄ）それぞれのドッキングステーションにおけるそれぞれの容器からの液体流出物を複数の指定容器のうちの１つに排出する排水システム；（ｅ）前記コンベヤ、前記流体供給装置、及び前記排水システムを制御するプログラム可能なコンピュータ；を備える装置。
  24. 分子を構築するプロセスを順次実施するための反応装置であって、複数の別々の反応容器であって、それぞれの容器が前記分子を結合可能な支持体を収容する反応容器と、前記プロセスのステップを実施するための流体を収容することができる複数の流体リザーバと、それぞれの容器をそれぞれの前記流体リザーバとの流体コンタクトモード（fluid-contact mode）にするためのコンベヤと、を備え、前記コンベヤは、少なくとも第１の流体リザーバ及び第２の流体リザーバとの連続的な流体コンタクトモードで容器を配置することができ、前記容器は、前記流体リザーバのそれぞれの内容物であって、前記分子を順次処理する内容物と順次接触可能であり、前記装置は、少なくとも２つの前記容器が単一の流体リザーバから流体を同時に受け取る少なくとも１つのモードをさらに備える、反応装置。
  25. それぞれの流体リザーバは、反応及び／又は処理ステーションを含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の装置。
  26. 前記装置が、複数の前記ステーションにおける、切断（cleavage）、脱保護、分離（separation）、濾過、膜抽出（membrane extraction）、キャッピング、クロマトグラフィー、及び／又は他の従来のオリゴ処理のユニットのうちの１つをさらに含む、請求項２５に記載の装置。
  27. 少なくとも１つのステーションは、少なくとも３つの容器に同時に接続される、請求項２５又は２６に記載の装置。
  28. 前記流体リザーバが、双方向フロー（counter-current flow）機構又は並行フロー（co-current flow）機構として、前記反応容器と接続される、請求項２７に記載の装置。
  29. 前記少なくとも３つの容器が一列に連結される、請求項２７に記載の装置。
  30. それぞれの容器は、温度制御され、又は混合装置を含み、又は圧力調節可能及び／又はｐＨ調節可能である、請求項２５又は２６に記載の装置。
  31. 前記長鎖有機化合物又は分子が、オリゴヌクレオチドの場合には少なくとも１００Ｍｅｒ、又はポリペプチドの場合には少なくとも１００塩基対、好ましくは少なくとも２００塩基対を含む、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の装置。
  32. 前記流体リザーバの少なくともいくつかが核酸を含む、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の装置。
  33. 少なくとも１００の反応容器を備える、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の装置。
  34. 前記流体供給装置は、ポンプ及び／又は流体インジェクタを備える、請求項２２又は２３に記載の装置。
  35. 前記流出物は遠隔リサイクル装置に移送される、請求項２３に記載の装置。
  36. 前記容器は支持体を含む、請求項２２～３５のいずれか一項に記載の装置。
  37. 前記支持体は固体である、請求項３６に記載の装置。
  38. 前記固体支持体が、８０μｍ又は４０μｍ又は１μｍ又は０．３μｍ未満のサイズを有する粒子を含む、請求項３７に記載の装置。
  39. それぞれの容器から除去された流体を個別にリサイクルするための機構をさらに含み、リサイクルされる流体は、それが出発した流体リザーバに戻され、及び／又は別の流体リザーバに供給される、請求項２２～３８のいずれか一項に記載の装置。
  40. 前記除去された流体を処理するための装置をさらに含む、請求項３９に記載の装置。
  41. 前記装置は、第１の長鎖有機化合物が第１の合成において製造され、第２の長鎖有機化合物が第２の合成において製造されるように、プログラム可能である、請求項２２～４０のいずれか一項に記載の装置。
  42. 前記化学組成を監視することができる前記デバイスは、ＬＣＭＳ、光モニタ、温度モニタ、ｐＨモニタ、赤外線モニタ、ＮＭＲ分光器、及び／又はラマン分光計から選択され、前記デバイスからのデータがＰＬＣに提供され、当該データに応答して前記装置の動作パラメータが前記ＰＬＣによって修正される、請求項２２に記載の装置。
  43. 少なくとも２つの異なるデバイスが、異なる流体リザーバの位置に提供される、請求項４２に記載の装置。
  44. 監視装置が所定の範囲外の排出物を識別する場合、関連する前記容器をプログラムされたパターンから除去することができる、請求項４２に記載の装置。
  45. 前記コンベヤが円形（circular）又は線形（linear）である、請求項２２～４４のいずれか一項に記載の装置。
  46. 前記容器が上部開口ポット（open top pot）を含み、前記上部開口（open top）が少なくとも実質的に平坦なプレートでシールされている、請求項２２～４５のいずれか一項に記載の装置。
  47. 前記プレートが、少なくとも１つの入口及び少なくとも１つの出口を備える、請求項４６に記載の装置。
  48. それぞれの容器は、温度、圧力、ｐＨ、導電率（conductivity）、及び時間のうちの少なくとも１つをモニタリングするためのプローブを備える、請求項２２～４７のいずれか一項に記載の装置。
  49. 前記流体リザーバの少なくともいくつかがアミノ酸を含む、請求項２２又は２３に記載の装置。
  50. 前記流体リザーバ、又はこれに関連するポンプ、配管、及び／又はバルブが加熱及び／又は冷却される、請求項２５又は２６に記載の装置。
  51. 前記反応容器は、流体リザーバ間の温度を調節可能である、請求項２２～５０のいずれか一項に記載の装置。
  52. ポンプ、バルブ、配管及び／又は少なくとも１つ容器を処理するための加圧ガス源を含む、請求項２２～５０のいずれか一項に記載の装置。
  53. 少なくともＸ個の流体リザーバ及び少なくともＹ個の容器を含み、Ｙ＞Ｘである、請求項２２～５０のいずれか一項に記載の装置。
  54. スタートアップの後、少なくとも１つの反応容器Ｙがそれぞれの流体リザーバＸに配置される、請求項５３に記載の装置。
  55. Ｙが少なくとも３Ｘである、請求項５３に記載の装置。
  56. 少なくとも３つの容器Ｙが、それぞれの流体リザーバＸに配置される、請求項５５に記載の装置。
  57. 脱保護ステップを実施するための少なくとも１つの脱トリチル化ステーション；カップリングステップを実施するための少なくとも１つのカップリングステーション；酸化又はチオレーションステップを実施するための少なくとも１つの酸化／チオレーションステーション；キャッピングステップを実施するための少なくとも１つのキャッピングステーション、及び洗浄ステップを実施するための少なくとも１つの洗浄ステーション；を備え、それぞれのステーションは流体リザーバを備え；複数の核酸合成容器は、少なくとも１００Ｍｅｒの選択された核酸配列を構築するための合成スキームに従って、コンベヤ装置を介して前記ステーションに移動され；前記ステーションが並列で運用されている、核酸合成装置。
  58. 前記カップリングステーションが、少なくとも２つの前記容器に同時にアミダイトを供給する、請求項５７に記載の装置。
  59. それぞれのステーションが、試薬及び／又は溶媒を少なくとも２つの容器に同時に供給する、請求項５７に記載の装置。
  60. 前記少なくとも２つの前記容器のうちの第１の容器が、当該容器のうちの第２の容器への流れ（flow-through）を提供する、請求項５８又は５９に記載の装置。
  61. 前記第１の容器の分子が、前記第２の容器の分子よりも多くのＭｅｒユニット（Mer units）を含む、請求項６０に記載の装置。
  62. 図及び対応する本文に示される要素から構成される長鎖有機化合物の製造装置であって、個別に示されるが他の点では一緒に有用な要素の組合せを含む装置。
  63. 請求項２２～６２のいずれか一項に記載の装置を用いる核酸合成方法。
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