JPH0219395A - 生体高分子の分割合成のための多孔質ウエハー - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 見肌夏里見 本発明は生体高分子の化学合成に関する。特に例えばポ
リヌクレオチド、ポリペプチド、ポリサッカライドなど
の多数の生体高分子を同時に合成するためのデバイスに
関する。

いかなる望みの配列をもった生体高分子を化学的に合成
する方法の発展は近年、生物学や医学の領域で大きな進
歩をもたらした。例えば合成したＤＮＡ断片の構造と相
互作用についての物理的、生化学的研究はＤＮＡ代謝を
含む遺伝的過程の分子機構や遺伝子の発現に関して重要
な新知見に導いた。合成ポリヌクレオチドはＤＮＡ配列
決定のプライマーとしてまた遺伝子のクローニングにお
けるハイブリダイゼーション・プローブやリンカ−やア
ダプターとしてそれらを使うことを通して遺伝子の構成
の研究に鍵となる役割をもった。合成ポリヌクレオチド
のもう一つの用法は病気の診断におけるＤＮＡプローブ
法においてである。結局１合成ポリヌクレオチドは遺伝
病を治す遺伝子置換治療や病気や死に対して抵抗するそ
の他の遺伝子工学的方法に使うことができよう。合成ポ
リヌクレオチドは通常は部位を指向した試験管内（ｉｎ
　ｖｉｔｒｏ）での変異発現、遺伝子的に制御される要
素の構造と機能の相関についての研究、および蛋白の機
能に及ぼす特定のアミノ酸の置換の影響などに使われる
。蛋白工学といわれる最後の用途は酵素や他の蛋白の働
らきの機構を理解させるばかりでなく、機能的によりす
ぐれた蛋白や薬剤を設計させ、医薬、農業、工業におい
て重要な進歩に導びくだろう。同様に合成した配列のき
まったポリペプチドを利用できることは、蛋白化学、免
疫学、薬剤学、バイオテクノロジーの分野で等しく驚異
的な進歩をするだろう。

多くの遺伝子工学プロジェクトにおいては多くの配列の
判った異なるポリヌクレオチド、時には何百の異なる配
列を１つの実験に使うことが必要である。同様にある蛋
白化学の実験では何百の異なるペプチド配列が要求され
る。ヒトの染色体のヌクレオチド配列を決めるためには
（間もなくそのプロジェクトが多くの研究室が参加して
始まろうとしている）、５千万のオーダーの異なるポリ
ヌクレオチドのプライマーが必要とされる。個々の実験
室で行うことのできたその他の有益なプロジェクトと共
に、この最後に述べた努力は合成のポリヌクレオチド研
究者にとって現行のコストで経済的に実用的でなかろう
（ヌクレオチド残基当り＄５〜＄２０）。

決まった配列の化学的に合成されたポリヌクレオチドが
利用できるようになったのは１９５０年代のミッチェル
ソンとトッドの先駆者的業績の結果であった（Ｍｉｃｈ
ｅｌｓｏｎ、　Ａ、Ｍ　＆　Ｔｏｄｄ、Ｓｉｒ＾。

Ｒ０ｒヌクレオチド」第３２部、ｒ３’　：　５’−イ
ンターヌクレオチド結合を含むジチミジン・ジヌクレオ
チドの合成」、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　１９５５年、
２６３２〜２６３８頁）、そしてそれによっ七５’−３
’インターヌクレオチドホスホジエステル結合の特殊な
化学的合成のための方法が開発された。この方法はさら
に次の２０年間でコラーナとその協力者によって発展さ
れ転移ＲＮＡの遺伝子の全合成で頂点に達している（に
ｈｏｒａｎａ、　Ｈ，Ｇ、、ｒ遺伝子の全合成」、５ｃ
ｉｅｎｃｅ　、第２０３巻、６１４−６２５頁、１９７
９年）。

最近、ホスフェイトジエステル法はホスフェイト（Ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ）　　トリエステル法（Ｌｅｔｓｉｎｇ
ｅｒ。

Ｒ，Ｌ、ａｎｄ　０ｇ１ｌｖｉｅ、に、に、、ｒオリゴ
チミジレ−１〜誘導体の段階的大量合成のための簡便法
」、Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、第８９巻、４８０１−４８０３頁
、１９６７年；Ｎａｒｏｎｇ、　Ｓ、Ａ、、　Ｂｒｏｕ
ｓｓｅａｕ、　Ｒ，、Ｈｓｉｕｎｇ、　Ｈ，Ｍ。

ａｎｄ　Ｍｉｃｈｎｉｅｉｉｉｃｚ、Ｊ、Ｊ、Ｊ改良ト
リエステル法によるデオキシオリゴヌクレオチドの化学
合成」、肚肋」ジ１阻り、第６５巻６１０−６２０頁、
１９８０年）やホスファイト（Ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ）　
トリエステル法（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｒ，Ｌ、、Ｆｉ
ｎｎａｎ、Ｊ、Ｌ、、１ｌｅａｖｅｎｅｒ。

Ｇ、Ａ、ａｎｄ　Ｌｕｎ５ｆｏｒｄ、　Ｗ、Ｂ、、「イ
ンターヌクレオチド結合を生成するフォスファイトカッ
プリング法」、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　、第９
７巻、３２７８−３２７９頁、１９７５年；　Ｂｅａｕ
ｃａｇｅ、　Ｓ、Ｌ、ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　
Ｍ、Ｈ，。

「デオキシヌクレオチド　フォスフォラミダイトーデオ
キシボリヌクレオチド合成のための新しい種類の鍵とな
る中間体」、Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２２巻、　１
８５９−１８６２頁、１９８１年）に置きかえられてお
り、これらの方法はより早い合成が得られ副反応も少な
い利点がある。これらの方法はともに、元々考えられた
ように溶液中で行われるが最近はポリヌクレオチドの固
相合成に適用されている（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、　Ｍ、
Ｄ、ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、Ｈ，、ｒポリ
マー担体上でのデオキシオリゴヌクレオチドの合成Ｊ、
　ＪＪ＠、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、第１０３巻、３１８５
−３１９１頁、１９８１頁；５ｐｒｏａｔ、　Ｂ、Ｓ、
ａｎｄ　Ｂａｎｎｗａｒｔｈ、Ｗ、。

「ホスホトリエステル化学とフローシステムを使ったコ
ントロールされた多孔ガラス上でのオリゴデオキシヌク
レオチドの改良合成法Ｊ、　Ｔｅｔ。

し戸」よ、第２４巻、５７７１−５７７４頁、１９８３
年）。固相合成法は成長する鎖が不溶性の支持体に共有
結合でついており、モノマーを添加したたび毎にポリヌ
クレオチド産物を精製する必要が除かれているために合
成の速度が著しく早い利点がある。

さらに固和合或はプロセスを自動化できそのために個々
の塩基の添加（多段階の反応サイクルを経て）は常温で
１０分間ぐらいで実施できる。

この条件下での高い縮合効率（大兄９９％以上）は１０
０以上の鎖長のポリデオキシヌクレオチドの自動合成を
可能にしている。

ポリペプチドの固相合成に使われる化学的方法はしばし
ば、メリフィールドの療法にもとづいており、それは酵
素活性をもった１２４残基のリボヌクレアーゼＡの合成
にうまく利用された（Ｇｕｔｔｅ、　Ｂ、ａｎｄ　Ｍｅ
ｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、、　ｒリボヌクレアーゼ
Ａの合成Ｊ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、第２４６巻
、１９２２−１９４１頁、１９７１年）。この方法は標
準的ポリスチレン−ジビニルベンゼンの支持体を使い、
ｔ−ブチロキシ・カルボニル（Ｂｏａ）アミノ基保護と
対称形の無水中間体とＤＤＣ活性化縮合が用いられる。

この方法は自動ペプチド合成において以下にのべるハー
クトンの同時合成法で使われている。

ペプチド合成するためにいくつかの改変法が考えられて
いる。特に利点にあるもの（Ａｕｆｆｒｅｔ。

Ａ、Ｄ、ａｎｄ　Ｍｅａｄｔ、Ｌ、Ｇ、＋ｒペプチド合
成における別の戦略」、　　　と　　における合成ペプ
チド、Ａｌｊ、ｔａｌｏ、に、、Ｐａｒｔａｎｅｎ、Ｐ
、ａｎｄ　Ｖａｈｅｒｉ、＾、編、エルセヴイア科学出
版社、アムステルダム、１９８５年）は固く圧縮したポ
リアミド・キーゼルグール支持体くこれが連続フロー合
成には最もすぐれていることがわかった）、フルオレニ
ルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）によるアミノ基保護
、及びペンタフルオロフェニルエステル（ＰＦＰＥ）中
間体との１−ヒドロキシベンザトリアゾール活性化縮合
を利用している。活性エステル中間体の高い安定性が比
較的不安定な無水中間体よりも便利にペプチド合成に使
わせている。

化学的反応の記載を含むポリヌクレオチド合成における
最近の進歩はＪｏｈｎ　Ｓｍ１ｔｈによる総説論文にま
とめられている（「オリゴデオキシリボヌクレオチドの
自動固相合成」、アメリカン・バイオテクノロジー・ラ
ボラトリ−１１５〜２４頁、１９８３年１２月号やＭａ
ｒｖｉｎ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓの「遺伝子合成機：ＤＮ
Ａの化学とその利用」、５ｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、
２８１−８５頁、１９８５年）。特に将来を約束する最
近の進歩は安価な保護ヌクレオチドからホスホラミダイ
ト中間体をその場で生成する経済的な方法の開発である
（Ｂａｒｏｎｅ、　Ａ、Ｄ、、Ｔａｎｇ、Ｊ、−Ｙ　ａ
ｎｄＣａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、Ｈ，、ｒビス−ジアル
キルアミノホスフィンのその場での活性化−ポリマー支
持体上でのデオキシオリゴヌクレオチド合成の新法」Ｎ
ｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、第１２巻、４０５１−
４０６１頁、　１９８４年；Ｎｉｅｌｓｅｍ、　Ｊ、、
　Ｔａａｇａａｒｄ、　Ｍ、、　Ｍａｒｉｇｇ、Ｊ、Ｅ
、。

ｖａＩＩＩＢｏｏｍ、　Ｊ、Ｈ，ａｎｄ　Ｄａｈｌ、　
Ｏ，、ｒデオキシリボヌクレオシド・ホスホラミダイ１
〜の固相調製のための２−シアノエチル、Ｎ、Ｎ、Ｎ’
　、Ｎ’−テ（−ライソプロピルホスホロジアミダイト
の応用とポリマーでの利用−オリゴデオキシリボヌクレ
オチドの支持合成Ｊ　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
＋第１４巻、７３９１−７４０３頁、１９８６年）。

もう一つの利点のある最近の進歩はエキソサイクリック
・アミノ基を保護するためのアミジン基の利用である（
例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、Ｈ，＋ＭｃＢｒｉ
ｄｅ、　Ｌ、Ｊ、、　Ｂｒａｃｃｏ、　Ｌ、Ｐ、ａｎｄ
　Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆｆ。

Ｊ、Ｗ、、　ｒヌクレオチド化学の研究１５．アミジン
保護ヌクレオシドを用いるオリゴデオキシヌクレオチド
の合成」ヌクレオシドとヌクレオチド、第４巻、９５−
１０５頁、１９８５年）。アミジンで保護した基は合成
サイクルの脱トリチル化段階に起こる酸触媒による脱プ
リン化反応（ｄｅｐｕｒｊ、ｎａｔｉｏｎ）に対してデ
オキシアデノシン残基を安定にし、それによってより長
いポリヌクレオチドの合成を可能にする。

最後に改良されたホスホラミダイト法を含めたシリカ支
持体上でのＲＮＡポリマーの合成法が最近報告されてい
る（に１ｅｒｚｅｋ、　Ｒ，、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ。

阿、Ｈ，、Ｌｏｎｇｆｅｌｌｏｔｉ、　Ｃ，Ｅ、、　５
ｗ１ｎｔｏｎ、　Ｄ、、Ｔｕｒｎｅｒ。

Ｄ、Ｈ，ａｎｄ　Ｆｒｅｉｅｒ、　Ｓ、Ｍ、、ｒポリマ
ーで支持されたＲＮＡ合成とその二重鎖安定のために直
近−隣接モデルをテストするためへの適用」肛刈鼓畦１
第２５巻、７８４０−７８４６頁、１９８６年）。

上記の方法は一度に適当な価格で１つまたは数個のポリ
ヌクレオチド配列の合成ができるが。

この分野の技術的発展のためには合成のコストを減らし
、多数のポリヌクレオチド配列を一気に合成するための
ニーズが大きい。この目的のための進歩は最近ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドの多数同時合成をさせる方
法と装置の形で実現している。

フランク等（「多数のオリゴヌクレオチドの同時化学合
成のための新しい一般的アプローチ二分割された固相支
持体」、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
。

第１１巻、１１号、４３６５−７７頁、１９８３年）は
最近、ポリヌクレオチド合成の固相支持体としてセルロ
ース濾紙を使った。保護されたヌクレオシドが３′−〇
−サクシネート結合によって濾紙の水酸基に共有結合さ
れ、それから先に隙間のあるビーズ状の固相支持体で用
いられたホスフェート・トリエステル法で伸長された。

この論文では著者は２つのオクタマーの合成を報告して
おり、濾紙を４つの伸長する鎖にＡ、Ｇ、Ｃ，Ｔの残基
を添加するための別々の反応カラムに装着し、そのディ
スクを反応サイクルの間に選択しながら多数の異なるポ
リヌクレオチド配列を同時に合成できたと提唱した。著
者らはこの方法で合成された２つのオクタマー（大抵の
サイクルの間開−の反応カラム中に存在している）はそ
れなりの収率で得られることを示し、ＤＮＡ配列の解析
でできたものに期待されたヌクレオシド配列から成り、
互いには混り合っていないことが証明された。

多くの配列の同時合成に対して濾紙法を使うべきことは
後にマツチェス等によって支持された（［微量スケール
での１００以上のポリヌクレオチドの同時で迅速な化学
合成」、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ。

第３巻、４号、８０１−０５頁、１９８４年）。これら
の著書らは１００以上のポリヌクレオチド配列を２週間
以内に同時に合成するためにフランク等によって報告さ
れたものと同じホスフェートトリエステル法を用いた。

マツチェス等の方法にはいくつかの制限が存在している
。濾紙ディスクにのせられる容量が低く、また物質を移
動させる能力も好ましくない（従って成長している鎖に
試薬が最適に近づくのを妨げることになる）ために、各
ステップにおける結合効率は標準的な固相合成法で得ら
れるものと比べて低く、ごく少量の限られた鎖長（大兄
２０個まで）の求めたポリヌクレオチドしか得られない
。この産物はより短鎖の欠陥のある配列が混じっており
、使用前に時間をかけて精製する必要がある。しかしな
がら、この方法は低コストで数多い配列を生みだす可能
性をもっている。この方法は明らかに多くの研究室で試
みられているが、この方法で使用しうる生産物を得るこ
とのできた研究室はごく限られている。

ごく最近の報告（Ｂａｎｎｔｚａｒｔｈ、Ｗ、ａｎｄ　
Ｌａ１ｚａ、Ｐ、。

「固相上でのいろいろなりＮＡ断片の同時化学合成シス
テム」、明り１、第５巻、４１３−４１９頁、１９８６
年）はいくつかの異なるポリヌクレオチドを同時に合成
できる機械的装置について述べている。この装置は一連
のはめこみできる回転金属板と放射対称の位置に１ケの
反応室と多くの細い「バイパス」孔から成っている。は
め込み式の金属板は回転すると与えられたヌクレオシド
残基を支持体に結合したＤＮＡ鎖に添加できるように全
ての反応室に垂直の流路を作ることができる。

かくしてこの金属板を適当に回転させ、反応サイクルを
１回行うことによって（この系によって試薬と溶媒が連
続的に流れることになる）。

異なるＤＮＡ配列がはめこんだ金属板の各々において合
成される。

この装置が分割されたが紙性に勝る主な点は反応室の中
に調節された多孔質のガラス製支持体をおくことによっ
てより高いカップリング効率を得たことである。３６残
基長までのＤＮＡ鎖がホスホラミダイト化学を利用して
作られた。この設計のもう一つの利点は自動化しうろこ
とである。主な欠点は同時合成の数が比較的低いことで
ある（最大１２ＤＮＡ断片は同時に作られた）。

異なるポリペプチドの同時合成に利用されるもう一つの
アプローチではハークトンが標準的なペプチド固相合成
に使われる固相支持樹脂を入れたポリプロピレン網を使
った（ｌｌｏｕｇｈｔｅｎ、［多数のペプチドの迅速固
相合成の一膜性方法二個々のアミノ酸のレベルの抗原−
抗体反応の特異性」、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、第８２巻、５１３］、−５
１３５頁、１９８５年８月）。これらの樹脂を含んだ多
数の袋を一つの撹拌した反応室におき、与えられるアミ
ノ酸が加えられるペプチド配列全てが同時にカップリン
グ反応にかけられる。

この方法を使って著者らは２４８の異なる１３−マー（
１３−ｍｅｒ）のペプチドを合成しているが標準的な単
一ペプチド固相法で得られるものと匹敵する収率が得ら
れた。この仕事で１３−マーのペプチドの各々が現に一
つのアミノ酸が置換したことを例外に対照とした配列と
同一の配列から成っている。かくして、各々のアミノ酸
の添加では樹脂を入れた袋は同一の撹拌された反応室に
おかれているが、一方、特定のアミノ酸が配列の中のそ
の場所に加えられるべきペプチドを含む樹脂だけが全体
かられけられて反応した。ハ−クトンの療法で合成され
た「異なる」ペプチド配列夫々は単一のアミノ酸が対照
とした配列とちがっている同一の配列から成っているに
も拘らず、多くの樹脂を含んだ袋を入れた撹拌反応槽を
複数使うことによって、この方法は多数の完全に独立し
たペプチド配列を同時に合成するのに使うことができる
と提案している。１２０種の完全に異なる１５残基のペ
プチドの同時合成に使うことの記載を含めてハークトン
の「ティーバッグ」方式は最近の論文にも記載されてい
る（ｌｌｏｕｇｈｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ｒ複数ペプ
チドの同時合成：多数の生物学的、免疫学的、方法論的
研究のための分泌性ペプチドの調製Ｊ　Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｉ　ｕｅｓ、第４巻、第６号、５２５−２８．１９８
６年）。

ハークトンの「ティバッグ」方式は多数のポリヌクレオ
チド配列の同時合成について２つの困難がある。密封で
きるポリプロピレン網の袋はポリスクレオチド合成に現
在使われているホスフェイト・トリエステル法やホスフ
ァイト・トリエステル法に使うには十分不活性ではない
。

テフロンのような不活性素材で作られる支持体を入れる
多孔質の袋はもし密封することが不可能でないにしても
合成の間に袋からの固相の支持体の損失を防ぐことをむ
づかしくしている。

もっと深刻な問題はポリヌクレオチド合成のための固相
法では支持床の上のカラムに十分な空間が残されていて
、溶媒や試薬が下から送られるとき支持体は上方への流
れによって持ち上げられ殆んど定量的に化学反応するに
必要なビーズの中での必要な物質輸送を行わせねばなら
ないことである。形の決まっていない「ティーバッグ」
の物理的特性はカラムを通しての溶媒や試薬の通過の間
、支持体の必要な上昇を保つことができない。

従って、現在の装置や方法に欠点があるために、異なる
配列の生体高分子を多数同時にしかも迅速、高収量で低
コストに得るための装置や方法に対しての必要性が存在
する。

見匪立１葱 生体高分子の化学合成のための改良された装置を提供す
ることが本発明の目的である。

本発明のもう一つの目的は多数の生体高分子を同時に合
成するための改良された装置を提供することである。

本発明のさらにもう一つの目的は多数の規定された配列
をもった生体高分子を非常に安価に同時生産することを
提供することである。

本発明のもう一つの目的は異なる生体高分子のどれをも
同時に固相合成するのに適用できる装置を提供すること
である。

なおもう一つの本発明の目的は多数の規定された配列の
生体高分子を同時に高収率で生産することを提供するこ
とである。

本発明のさらにもう一つの目的は生体高分子を同時に生
産するために分割された装置の改良を提供することであ
る。

本発明の別の目的は少ない合成時間で多数の生体高分子
を同時に生産する改良された装置を提供することである
。

本発明のなおもう一つの目的は今後は「ウェハー」と呼
ぶところの多くの分割基盤が各反応サイクル毎にお互い
に分離されやすいような多数の生体高分子を同時に生産
するための改良された装置を提供することである。

さらにつけ加える本発明の目的は生体高分子の化学合成
のために改良された固相支持体の切゛片「ウェハー」を
提供することである。

かくして、上記の目的と共に、本発明の一目的に従って
、溶媒輸送系とカラムを通して溶媒と試薬の流れを提供
する溶媒輸送系につないだ少くとも１本のカラムとその
カラムの中に位置してポリマーの合成を行う少くとも１
個のウェハーからなる複数の規定された配列をもった生
体高分子の合成のための分割されたウェハー合成装置を
提供している。好ましい実施例では合成装置は４つの試
薬を受けるために少くとも４本のカラムをもち、その各
々に複数のウェハーがあり、その各々のウェハーは規定
された配列のポリマーの合成に用いられる。その装置は
使用者の必要に応じて自動でも半自動でもマニュアル式
にでもしうる。

別の実施例では、その装置は複数のウェハーを積み重ね
てカラムの形とし、そのカラムを通して液が流れるよう
につながれた溶媒輸送系と連結している。

もう一つの別の本発明の目的によれば、例えばポリヌク
レオチド、ポリペプチド、ポリサッカライドのような生
体高分子を合成するのに、固相の支持物質と、その保持
リングの内壁で作られる室にその支持物質を保持するた
めの保持リング及びその支持物質に保持リングを通して
液を流し、支持体が保持リングの外へ行かないようにす
るためのもの（例えば膜とかガラス質）から成るウェハ
ーが提供されている。望ましくは保持リングは支持物質
を受けとめ保持し、その両端が開放されているような内
側で取りかこまれた反応室をもっている形がよい。多孔
質の液送り手段は本質的に不活性の多孔性物質であり、
好ましくは保持リングの両端にあり、そして内室を閉じ
るよう内室全体にわたっているのがよい。さらに、ウェ
ハーは支持体を保持体におさめておける不活性の゛保定
手段をもっているのがよい。

固相の支持体は、シリカ、コントロールされた孔質ガラ
ス（ＣＰＧ）、ポリスチレン・ジビニル・ベンゼン、ポ
リアミド樹脂、ポリアミド−ケイソウ土圧縮（Ｋｉｅｓ
ａｌｇｕｈｒ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）樹脂、多孔質網状
樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、モノビーズ（ＭＯＮ
ＯＢＩＥＡＤＳ）樹脂（ファルマグア社で作られた樹脂
）のような多孔質のプラスチック樹脂などから成る群か
ら選ばれる。多孔質の支持物質は例えばポリヌクレオチ
ド合成の場合にはヌクレオシドのような基を共有結合で
結合した誘導体材料を含んでいる。

多孔質の膜あるいはガラス質としては好ましくはテフロ
ンやその他の不活性のフルオロカーボンよりなる可撓性
膜あるいはガラス、ステンレス・スチール或いはチタン
よりなる硬い多孔質体がある。その膜あるいはガラス質
の孔はウェハーを通して液が流れるに十分に大きく、ウ
ェハーでは多孔質の支持体を保持できるほど十分小さい
。

望ましい実施例の一例では、ウェハーは固相支持体と支
持体を受けとめ、保持するためのリングの内壁で作られ
た内側の反応室を含む内側のハウジングリングでそのリ
ングは両端が開いているものと、そのハウジングリング
の開いた両端をおおっている不活性の多孔質膜あるいは
ガラス質でその膜は内側のリングよりも大きな直径をも
っており、そして内側のリングより少し大きい内径をも
った外側のリングで、その外側のリングが内側のリング
をとりがこみ内側と外側のリングの間の膜の縁をとめて
いるようなリング等を備えている。特に望ましくは、外
側をとめている方法はハウジングリングの両端の外面あ
たりに位置する保持リングを含んでいる。

もう一つの選んだ実施例では、ウェハーは固相支持物質
、不活性の円筒形のハウジングリング、両端の開口部、
及びハウジングリングの開口端近くの切れこみに入れら
れた円形の不活性ガラス多孔質から成っている。

本発明のウェハーの設計は多数の生体高分子を同時に生
産できるよう作られている。支持体の大きさはカップリ
ングの効率を高め、硬質のウェハーは夫々の反応サイク
ルを行った後容易に分類される。この配置は多くの異な
る配列を同時に合成させることができる。いろいろ異な
る容量（誘導体化の程度）をもった支持体を使うことに
よって、また、夫々のウェハーの高さをかえることによ
って、合成の規模は１セグメント当り０．１マイクロモ
ル以下から１０マイクロモルまで変えられる。さらに、
異なる高さのセグメント（分割ウェハー）を各カラムに
積み重ねることができ、それで広範囲の規模の産物を同
時に合成できる。このやり方の柔軟性と効率性はかなり
低価格で多数の生体高分子の合成を行えるはずである。

例えば、ポリヌクレオチド合成の現在のコストは理想的
な条件下で（自分のところで合成サービスがあるような
）残基当り１０〜１５ドルである。分割したウェハー装
置ではコストは著しく低くおそらく残基当り０．５０〜
２ドル程度であろう。現在コストが合成生体高分子を使
う際の律速因子となっているので、分割ウェハー装置の
開発は科学研究での生体高分子の使用における飛躍であ
り生物医学の将来的発展を加速するにちがいない。

次に示す図のための簡単な記載につづく選択した実施例
の詳細な記載をみることでさらに目的、特徴及びその利
点などが明らかとなろう。

好ましい態様の詳細な記 本発明はまず、図面を参照して記述されよう。

以下の明細書においているいろな点で、本発明はポリヌ
クレオチドの合成について論議されている。すでに示し
たように、この発明は固相支持体上で合成されつるいか
なる生体高分子の生産に等しく適用でき、有用である。

さらに、以下の論議や図面は専ら特定のウェハーの設計
について記述し説明している。この明細書は説明の目的
のためのみのものと理解され、従って他のウェハー設計
は可能であり本発明の展開の中に含まれる。

第１図は組立て前の本発明のウェハー１０を示し、従っ
て分解された系統図である。ウェハーは上と下の保持リ
ング１２と１４を含む外側の固定手段をもっている。相
対している保持リングの１２と１４の間に位置に内側の
ハウジングリング１６があり、それは膜１８と２０と共
にハウジングリング１６の一端にあってそれを覆ってい
て、ハウジングリング１６と保持リング１２と１４の間
をとめている。

ハウジングリング１６は保持リング１２と１４の内径よ
り若干少ない外径をもっている。多孔膜１８と２０は保
持リングの外径より大きい外径をもっている。

内側のハウジングリングと保持リングの両方についてこ
こで使っているようなリングとはそのリングのデザイン
には円形、角形、正方形またはその他の幾何学的なちが
いのあるものを含んでいる。重要なデザインとしての項
目はリングが以下で述べるように反応に要する要素を保
持するための孔のあいた内空間をもっていることである
。

ウェハー１０は第２図、第３図では組立てられた状態で
示されている。ウェハーを組立てるためには多孔性の膜
２０が底部の保持リング１４の上に置かれ、その膜の縁
がその全外周のまわりをおおうように広げられている。

ハウジングリング１６は底部の膜２０の上におかれ、底
部の保持リング１４の中におしこめられる。リング１２
，１４．１６の直径は膜により、リングの間の液の流れ
を密封するように選ばれる。ハウジングリングの中に固
相支持体をおいた後、上部の膜１８、保持リング１２、
及びハウジングリング１６をリング１６の上に膜１８を
置き、リング１２を押し込むようにして同じように密封
する。液体の密封を作るとともに、その設計は化学反応
の間、膜をしつかりその場にとめておくことができる。

この結果はハウジングリング１６の上に、膜の縁を重ね
て保持リング１２と１４及びハウジングリング１６の間
に膜を固定することで達せられる。

第２図と第３図で説明されるように、組立てられたウェ
ハー１０では膜１８と２０は内側のハウジングリング１
６の端金体に広げられ、膜の縁は外側の保持リング１２
及び１４と内側のハウジングリング１６の間に固定され
る。

組立てられたウェハーは反応要素２２を含んでいる。反
応要素は固相支持体へ有機性のスペーサーの腕によって
残基、例えばヌクレオシドを共有結合で結合することに
よって誘導体化した固相支持体である。残基、すなわち
それから重合の成長がはじまる最初の塩基は支持物質の
表面から分けられる。反応要素の２２は膜１８と保持リ
ング１２でウェハーを密封する前に内側のハウジングリ
ング１６の中におかれる。かくしてハウジングリング１
６と膜１８．２０はともに、反応要素２２のための反応
室を形成する。

すでに述べたように、上記の明細は１つの特定のウェハ
ーの設計について述べている。数多くのウェハーのデザ
インが可能であり、それらは本発明の範囲の中にある。

例えば、ウェハーは硬質で化学的に不活性の室であり、
それによって生体高分子の合成に使われる薬品を妨害し
ないしあるいはそれと反応することはない。外側の保持
リングと内側のハウジングリングはいろいろな不活性材
料、例えばテフロンやＫＥＶＬＡＲやＫＡＬＲＥＺのよ
うなその他のフルオロカーボンで作ることができる。

ウェハーの大きさは広い範囲でかえられる。

ミリグラム単位の量のポリヌクレオチドの合成には内側
の保持リングの内径は望ましくは２〜１０ｍｍの範囲に
あり、その高さは２〜１０ｍｍからである。生産物ｇ単
位の量には内径は２０〜１００＋ａｍが望ましく高さは
約２０〜１００ｍｍからである。さらに積み重ねたウェ
ハーのカラムの高さは多数の異なるポリヌクレオチド鎖
の同時合成をさせるために増やすことができる。この技
術に通じた者は、もちろんウェハーの大きさが特定の合
成の特殊性によって上記のディメンションより小さかっ
たり大きかったりできることを認識するだろう。さらに
この技術の精通する者はカラムのディメンションは合成
される生体高分子や使われる固相支持体によって変わる
ことも認識するだろう。ペプチドの生産では、ウェハー
のディメンションは一般にこれらの範囲の上限の方の傾
向にあるだろう。

ウェハーを通して試薬を流すための多孔材料も化学的に
不活性の素材で作られる。例えば考えられる不活性素材
はテフロンやＫ［ＥＶＬＡＲのようなフルオロカーボン
材、多孔性のガラスやチタン、ステンレススチールのフ
リットが含まれる。

ポアサイズは変えることができるが試薬や洗液がウェハ
ーを通して十分に流れるように、しかし−力支持体や生
長しつつある生体高分子鎖がウェハーの中に保持される
ように選択される。

５０〜１００ミクロンのポアサイズがＣＰＧ支持体を使
うために推められるがそれは典型的には直径が１２０〜
１８０ミクロンのものである。多孔質は必要な流れと封
入性をもっている限りいろいろなデザインが考えられる
。ここに説明記載されているように、多孔質は柔軟性の
ある膜、硬くて孔をあけた構造のものなどの形で用いら
れる。

生体高分子の鎖が作られる固相支持体はいろいろな既知
の支持体から選択することができる。

考えられるポリヌクレオチド合成のための支持体にはポ
リスチレン・ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、ポリアミド
−けいそう土、シリカ、調節された孔隙をもったガラス
（ＣＰＧ）、モノビーズ（ＭＯＮＯＢＥＡＤＳ＝ファル
マシア社で生産している樹脂）のようなプラスチック樹
脂などが含まれる。ＣＰＧ、シリカ、モノビーズ（ＭＯ
ＮＯＢＥＡＤＳ）は特に、それらが強固であるので、す
なわち膨潤したり収縮したりしないので固相支持体には
好んで用いられる。ポリペプチド合成のために考えられ
る支持体にはポリスチレン、ビニルベンゼン樹脂、ポリ
アミド樹脂、ポリアミド−けんそう主樹脂、ベンズヒド
リルアミン樹脂、多孔質網状樹脂などがある。

大きなポアサイズ、例えば２００〜２０００人をもった
支持体は試薬が伸長しつつある鎖に近づきやすく、また
反応物の洗い去りの効率もよい。

またこれらの支持体は比較的長い鎖、例えば５０〜２０
０残基のものをポリマー間の立体障害なくくみ上げるこ
とができる。

ウェハーに供給される支持体２２の量は変えることがで
きる。加えられる支持体の量を決めるのに考慮すべき要
因にはＤＮＡ、　ＲＮＡ、ポリペプチド、ポリサッカラ
イドあるいはその他の必要とされる生体高分子、流速、
固相支持体の誘導体化した程度、例えば支持体ｇ当すモ
ノマーの残基のマイクロモル、などがある。好ましい結
果はウェハーが２／３から３７４はど満たされる。従っ
て混合が可能でありまたいかなる膨潤も可能である。例
えば３０００〜４０００人のシリカのような非常に大き
なポアサイズの硬い固相支持体を使うことは支持体の中
への物質移動を最大にし、ウェハーは誘導体化された支
持体で完全に充たされる。

第４図にみられるように、−たび組みたてられるとウェ
ハーはカラム２４の中におかれそれを通して、試薬や洗
液が反応サイクルを完成するために通される。カラム２
４は多くのウェハー１０を受は入れるように設計される
。第４図及び５図に説明されるように、例えばアルゴン
の圧を利用している輸送系２６は試薬や洗液をカラム２
４とウェハー１０を通して流している。望ましくは与え
られたウェハーの中の多孔質の支持体の混合と分配をお
こすことによって反応を容易にするためにカラムの下か
ら上へ流れを作る。典型的には、輸送系は４つの塩基で
あるシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、
アデニン（Ａ）に対応する少くとも４つのカラムに並列
につながれている。もし、修飾された塩基や塩基の混合
物を合成に利用する場合にはもっと他のカラムが用意さ
れる。作るろうとしている生体高分子の配列の数に応じ
て各カラムにどんな数のウェハーでも置くことができる
。例えば、１本のカラムに１ケのウェハーをつけること
もできる。しかしながら、これはどうしてもコメ１−が
かかり、非効果的であり、以前に指摘したように、現在
利用できる設計のもののいくつかのもつ問題である。典
型的にはウェハーの数はカラム当り１５〜２５の程度で
ある。しかし、もちろんカラムを通して十分な液の流れ
を得るためにウェハーの数は選ばれねばならない。この
点においてウェハーの外径はウェハーそれ自体を通って
液を流し、カラムの側面を沿って流れないようにカラム
の内面にぴったり合致するように選ばれるべきである。

もしさらに流速が要るならば、別の溶媒輸送系が利用さ
れる。また、ウェハーの数はもちろん、カラムの高さに
応じて変わるだろう。

カラム２４はいかなる不活性の素材ででも作ることがで
きる。例えば、ガラスやステンレススチールが２つの望
ましい素材である。典型的にはカラムにはプ・ランジャ
ー２８があり、それはカラムの中のウェハーの数と高さ
が変わるのに対応できるようにしている。

もう一つの別の実施例では、ウェハーは分割したウェハ
ーカラムとなるように分けることができる。それによっ
て別々になった支持カラムに必要なことを軽減している
。この実施例では輸送システム２６が分割されたウェハ
ーカラムに直接結合されよう。

合成においては先に示したように、一連のカラムをウェ
ハーをつけてセットする。各カラムは残基の附加のため
に試薬が供給される。例えば、ＤＮＡの合成では、１つ
のカラムはシトシン（Ｃ）の、もう１つはチミン（Ｔ）
、もう１つはグアニン（Ｇ）、そしてもう一つはアデニ
ン（Ａ）の添加のためにある。同様にＲＮＡ合成のため
には、チミンはウラシル（Ｕ）を加えるために必要な試
薬に置きかえられる。しかし、先に示したように、使用
されるカラムの数は本発明にとって必須でない。単一の
カラムで十分だろうが、これでは生体高分子の合成を完
結するに要する時間が増える。試薬を各合成毎に切り換
えねばならなず、４カラムの場合より少ない試料しか一
つのカラムでは合成されない、かくして複数のカラムを
使うことは実施される反応の数を増し、その方法の効率
を増す。二量体や二量体などを添加する方法もある。こ
の合成には別のカラムが加えられる。例えば二量体では
、２０のカラムが使われる。すなわち加えられる二量体
各々に１つのカラムが、また加えられる単一のヌクレオ
シド塩基の各々に１つのカラムが使われる。

ＤＮＡ法に戻って、ウェハーは加えられる最初の塩基に
よりＴ、Ｇ、ＣまたはＡのカラムのうちの１つに位置す
るよう選ばれる。その塩基をポリヌクレオチド鎖に添加
するための試薬や薬品を適当に通した後（反応サイクル
を構成する）ウェハーをそのカラムから取りのぞき、次
の合成ステップのため分類し、適当なカラムに挿入しそ
して合成ステップを繰り返す。この方法は求めたポリヌ
クレオチド配列が合成されるまでくり返される。かくし
て塩基の付加に対して異なるカラムを使って、夫々のカ
ラムでその個有の合成パターンを経過させる。この方法
によって多くの異なるポリヌクレオチドを同時に合成す
ることができる。

本発明は固相合成によるいかなる生体高分子の生産に用
いられる。時に好ましい合成にはこの方法が本発明にお
いて行われるものとしての流過方式を使う場合には固相
法によるポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリサッカ
ライドの合成がある。本発明を使ってのペプチド合成の
ための特に望ましい固相合成ルートは先にのべたポリア
ミド−けいそう土の支持体を利用したＦｍｏｃペンタフ
ルオロフェニルエステル法である。

この方法は複数の規定された配列をもった生体高分子の
同時合成に手動でも、半自動では、全自動ででも適用で
きる。例えば、半自動装置はマイクロコンピュータで制
御されて使われる。

プログラム編集によってオペレータに固相支持体に全て
の試薬を輸送することを制御させる。

コンピュータもまた各ステップでオペレータにウェハー
の分類とそれを正しいカラムに置くための指示を出すこ
とができる。半自動システムではオペレータはこれらの
最後の機能を実施する。もちろん、この技術に精通した
者は全自動システムを選ぶことを認識している。この系
においてはウェハーの分類と次のカラムにそれをもって
いくことを機械によって行われる。

分割されたウェハー装置は、固相法で流過方式で達せら
れる生体高分子の合成のために特別デザインされている
。生体高分子の合成における固相化学の利点は生体高分
子を作るのに段階的に付加していくことが生成物をその
縮合段階ごとに精製する必要がないので大いに簡単にさ
れていることである。反応生成物と試薬は簡単に洗い流
される。この固相合成法は生体高分子の合成に用いてい
る数多くの化学者のために開発されてきた。分割された
ウェハーはこれら全ての方法で使うことができる。

ポリヌクレオチドの合成では、固相合成の各ステップで
の反応の効率は大兄９５から９９％以上の間にあり加え
られたヌクレオシド当り約５〜３０分のサイクル時間で
あった。この方法は求めている産物の量がたいていの用
途には十分なミリグラムの範囲にあるときには望ましい
方法である。さらに、固相合或は配列中のある場所で残
基が混在しているポリヌクレオチドの混合試料の合成に
は特に望ましい。

固相合成のホスホラミダイト法（ダイアグラムを下に示
した）は本発明の用途として好ましい。

（以下余白） この進め方の活性化された中間体は５’　−ＤＭＴ　−
２′−デオキシヌクレオシド、３′−ホスホラミダイト
である。この方法は最初のヌクレオシドの３′−ハイド
ロキシ基を長いアルキル鎖のスペーサーアームを介して
固体の支持体に共有結合で結合することで始まる。

酸に不安定なジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）はうす
いジクロロ酢酸で処理することによって支持体に結合し
たヌクレオシドの５’−ＯＨから分離される。ヌクレオ
シドホスホラミダイト（支持体に結合したヌクレオシド
の５’−ＯＨの１０〜２０倍モル過剰量で）は無水条件
下でテトラゾールを用いてその窒素原子を水素化するこ
とによって活性化され、ステップ２に示すように縮合が
おきる。各連続したカップリングの完了時に、テトラヒ
ドロフランと水にとかしたヨウ素溶液によって反応性の
高いホスファイトはより安定なホスフェイトに変えられ
る（ステップ４）。もし望むなら、「先をそろえて切っ
た」配列や「ノンセンス」　（ごちゃまぜにした）配列
のできるのを防ぐために先のカップリングで活性化され
たホスホラミダイトと反応しなかった５′−ヒドロキシ
ル基をアセチル化するため（無水酢酸ジメチルアミノピ
リジン／ルチジン、ステップ５で）「キャッピング」反
応を次に行う。

各合成サイクルのおわりにはＡ、Ｃ，Ｇのエキソ環状ア
ミノ基が保護されたアミドのままであり、インターヌク
レオチド燐酸基はメチルエステル化され、伸長している
鎖の３’−ＯＨ末端は支持体にサクシネート結合したま
まである。次の残基を添加する前に、脱トリチル化段階
は繰り返される。鮮やかなオレンジ色のＤＭＴｒカチオ
ンが結合の効率を計算するため分光光学的に定量される
。分割されたウェハー法を用いれば、約９５〜９９％の
範囲のカップリング効率が得られる。

合成のまわりに、ホスフェイトメチル化された保護基は
トリエチルアミン存在下でトリフエノールから作られる
チオフェノキサイドイオンで分解（ｃｌｓａｖｅ）され
る（ステップ６）。このステツブはもし合成において２
−シアノエチルホスホラミダイトが用いられるならば必
要ない。それからアルカリに不安定なアシル基（Ａ、Ｇ
、Ｃのエキソ環状アミノ基を保護している）と固相支持
体との共有結合をアンモニア水溶液で処理することで分
解する（ステップ７．８）。もし開Ｔｒ基が残っている
ときは濃酢酸で分解される（ステップ９）。

前に論議したように、ポリヌクレオチド合成にはもう一
つの方法（ホスホトリエステル法）が一般に使われてい
る。ホスホトリエステル法は本発明での使用に適用され
うるが、サイクル時間がより長く、ウェハーの分類の間
維持することがむずかしい無水の条件を要求するので適
しない。

その場でホスホラミダイトを生成し、アミジン保護基と
りボポリマー合成を含む固相ポリヌクレオチド合成にお
ける最近の進歩は本発明の中で使うことができる。さら
に、この技術に通じる者にとって、縮合、保護基をつけ
たりはずしたすする反応やあるいは固相支持体の改良を
含む生体高分子合成化学における将来的な発展に本発明
を適用できることは明白だろう。

生体高分子の分割ウェハー合成における上記の合成法の
使用は市販されている系で自動化できる。例えば、４本
のカラムをもった自動装置のＣｒｕａｃｈｅｍ　ＰＳ２
００型合成機はＩＢＮ　ＰＣ−互換性マイクロコンピュ
ータによってコントロールできる。プログラム編集者は
オペレータに代って固相支持体へ全ての試薬を送入する
ことをコントロールできる。このことは分割されたウェ
ハー法において使われる反応サイクルを発展させるのに
必要とされる。さらに、コンピュータはカラムの中ヘウ
エハーを挿入する順序の道筋を保つことによって分類工
程を容易にすることができる。コンピュータプログラム
は合成の間適当なカラムに個々のウェハーを置かせるよ
う利用される。かくして、どのウェハー（番号をつけて
おく）を反応サイクルの後に与えられたカラムに置かれ
るかをプリントアウトが示し、それによってウェハーは
容易に分類され、分けられたウェハーを適当な合成反応
を続けるためにカラムに入れさせる。コンピュータプロ
グラムを使うことは合成の失敗を減らし、信頼性を高め
る。さらに加えて、コンピュータで制御され合成機とつ
ながっている自動分類装置の開発は分割ウェハー装置を
使って生体分子の完全自動合成をもたらすことも可能で
ある。

器庭桝 本発明の次の実施例を用いてさらに説明される。

去−ｍ この例は、化学的に不活性の多孔質ウェハーの中での分
割されたポリヌクレオチド合成に用いられる標準的方法
である。この方法の特別な応用例の詳細は以下の例で与
えられる。

Ａ、相互作用合成のセットアツププログラムの実行 合成すべきＤＮＡ配列をＩＢＭ互換コンピュータでワー
ドプロセシングプログラムを用いて入力する（５′→３
′方向に）。配列のファイルはノン・ドキュメン１〜フ
ァイルに保存され、フォーマットに名をつけられる。配
列を入力すれば、ウェハー・ＤＮＡセットアツププログ
ラム（ベーシックで書かれている）がディスクドライブ
の配列ファイルで動かされる。ウェハー・ＤＮＡプログ
ラムは配列ファイルを調べ次のインフォメーションのハ
ードコピーを示す。すなわち、（ｉ）入力された全配列
をうたれた番号と夫々に示された名前と共にリス１〜ア
ツプする。（ｉｔ）あらゆるタイプの誘導体化されたＣ
ＰＧ支持体につけられた番号をふられたウェハーのリス
ト（各配列の３′末端塩基を規定している）、　（ｉｉ
ｉ）各反応サイクル後にウェハーの分類を行わせるため
のスキームを示す。

Ｂ、試薬の調製、　Ｃｒｕａｃｈｅｍ　、ＰＳ２００型
ＤＮＡ合成機のウェハー組み立てとセットアツプ Ｃｒｕａｃｈｅｍ　ＤＮＡ合成機に用意されたソフトウ
ェアを用い、″ウェハーＣＥ２０”と呼ばれる方法が作
り出された。その方法は次のとおりである。

方法　：ウエハーＣＥ２０ 容器１ニアセトニトリル 容器２　：　ＤＭＡＰ／ＴＩＩＦ 容器３：無水酢酸／ＴＨＦ／ルチジン 容器４：ヨウ素／ＴＨＦ／ルチジン／水容器５ニアセト
ニトリル 容器６　：　ＤＣＡ／ＤＣＥ 方法：ウェハーＧＥ２０ 第１サイクル ステップ１ニアセトニトリル洗滌　固定時間２：１５分
間 ステップ２：デブロックＯＣＡ／ＤＣＥ、塩基可変Ａ　
　　　時間＝１？３０分間 Ｇ　　　　時間＝１：３０分間 Ｃ時間＝２：３０分間 Ｔ　　　　時間＝２：３０分間 プリン（Ａ／Ｇ）　　　時間＝２：３０分間ピリミジン
（Ｔ／Ｃ）　　時間＝２：３０分間Ｎ　（Ａ／Ｃ／Ｇ／
Ｔ）　　　時間＝２：３０分間ステップ３ニアセトニト
リル洗滌　固定、時間−＝１：３０分間 通常のサイクル ステップ１：反応、固定　　時間＝４ｅＯＯ分間ステッ
プ２ニアセトニトリル洗滌、固定時間＝１：３０分間 ステップ３：無水酢酸／　Ｔ　ＨＦ　／ルチジン洗滌、
固定　時間＝Ｏ：１２分間 ステップ４　：　ＤＭＡＰ／ＴＨＦ　　洗滌、固定時間
＝Ｏ：１２分間 ステップ５：無水酢酸／ＴＩＩＦ／ルチジン洗滌、固定
　時間＝Ｏ：１２分間 ステップ６　：　ＤＭＡＰ／ＴＩＩＦ　　洗滌、固定時
間＝Ｏ：１２分間 ステップ７：無水酢酸／ＴＨＦ／ルチジン洗滌、固定　
時間＝０：１２分間 ステップ８　：　ＤＭＡＰ／ＴＨＦ　　洗滌、固定時間
＝Ｏ：１２分間 ステップ９：無水酢酸／ＴＩＩＦ／ルチジン洗滌、固定
　時間＝Ｏ：１２分間 ステップ１０ニアセトニトリル洗滌、固定時間＝Ｏ：１
２分間 ステップ１１：蓋をする７作用させる　固定時間＝１：
３０分間 ステップ１２ニアセトニトリル洗滌、固定時間＝１：３
０分間 ステップ１３：ヨウ素／ＴＨＦ／ルチジン／水洗滌、固
定　時間＝２ｅＯＯ分間 ステップ１４ニアセトニトリル洗滌、固定時間＝１：３
０分間 ステップ１５：蓋をする７作用させる　固定時間＝６０
：００分間 ステップ１６：デブロックＯＣＡ／ＤＣＥ　　塩基可変
Ａ　　　　　時間＝１：３０分間 Ｇ　　　　　時間＝１：３０分間 Ｃ時間＝２：３０分間 Ｔ　　　　　時間＝２：３０分間 プリン（Ａ／Ｇ）　　　時間＝ｌ：３０分間ピリミジン
（Ｔ／Ｃ）　　時間＝２：３０分間Ｎ　（Ａ／Ｃ／Ｇ／
Ｔ）　　　時間＝２：３０分間ステップ１７：アセトニ
トリル洗滌、固定時間＝１：３０分間 最終サイクル ステップ１：反応、固定、時間＝４ＣＯＯ分間ステップ
２ニアセトニトリル洗滌、固定時間＝１：３０分間 ステップ３：ヨウ素パＨＦ／ルチジン／水洗滌、固定　
時間＝２：ＯＯ分間 ステップ４ニアセトニトリル洗滌、固定時間＝４：００
分間 合成が始まる前にウェハーを組立てる必要がある。各ウ
ェハーについてウェハーの底の部分をまず組立て、それ
によって誘導化された孔径の調節されたガラス（ＣＰＧ
）の支持体を頂部から加えられるようにする。約１８Ｂ
の適当なＣＰＧをウェハーＤＮＡセットアツププログラ
ムからの出力によって指示されたように加える。最後に
ウェハーを反応槽の上に多孔性のテフロン布をかぶせ、
これを外側のテフロンの保持リングでしっかりとおさえ
ることによって閉鎖する。ウェハーをウェハーＤＮＡセ
ットアツププログラムからの出力のステップ２で指示さ
れたように適当なカラムにつめる。

合成機を操作準備するためには、貯液槽を個々の試薬で
満たし、その溶媒ラインをＣｒｕａｃｈｅｍ合成機で供
給される操作プログラムを用いて溶媒で洗う。調製され
る最後の試薬はホスホラミダイトと昇華性のテトラゾー
ルである。第１表は分割ウェハー法でのポリヌクレオチ
ド合成に使われる試薬を示している。

通常のサイクル：ウェハーＣＥ２０法 １０ウェハーのカラム当りの溶媒／試薬１、　アセトニ
トリル−１２，５ｍＱ（ＩＱの貯液槽を使う） ２、　６．５％ジメチルアミノピリジンのＴＨＦ溶液（
讐／ν）　　１．２ｍＱ ３、　無水酢酸／ＴＨＦ／ルチジン−１，６＋ｎＱ４、
　ヨウ素〔０，１モル、水／ルチジン／　Ｔ　ＨＦ（１
：１０：４）溶液）−４ｍＱ ５．３％ジクロロ酢酸／ジクロロエタン（ν／ｖ）４ｍ
Ｑ 溶媒の流速：２ｍＱＩ分 平均サイクル時間：１８分間 合成スケール：ウェハー当り０．５〜１マイクロモル 支持体：ヌクレオシド化ＣＰＧ、典型例でウェハー当り
１５〜２０ｍｇ、 モノマー溶液：　０．ＩＭ　ＣＩＥホスホラミダイト６
．６７ａ＋Ｑアセトニトリル１０．５ｇＴ−ホスホラミ
ダイト ６．０Ｏｎ＋Ｑアセトニトリル１０．５ｇＧ−ホスホラ
ミダイト ５．８０ｍＱアセトニ１〜リル１０．５ｇＡ−ホスホラ
ミダイト ６、ＯＯ＋ｎＱアセトニトリル１０．５ｇＣ−ホスホラ
ミダイト 触媒−０，５Ｍテトラゾール（２０ｍｆｆアセトニアセ
トニトリル１０トラゾール） ０．５ｍ１２のモノマーと０．５ｍＱの触媒とをまぜカ
ラムに注入する。

Ｃ，ポリヌクレオチドの合成 ＰＳ２００型ＣｒｕａｃｈｅｍＤＮＡ合成機と保有して
いる操作ソフトウェア、ウェハー・ＣＥ２０方式、及び
第５図に示されている分割ウェハー合成デバイスを使っ
てポリヌクレオチドの分割合成を先にのべた２−シアノ
エチルホスホラミダイト化学を用いて実施する。ウェハ
ーを入れたカラムを合成機に結合してから脱トリチル化
と洗滌だけから成る第一サイクルをその方法（「第一サ
イクルｊステップ１から３まで）に示されているように
して行う。それに続くサイクルの夫々の開始はホスホラ
ミダイトの注入でおこり、直ちにステップ１（「通常サ
イクル」の）が進行する。ステップ１５（「通常サイク
ル」の）は栓をするステップ１１のくり返しでなく、む
しろ、ウェハーが分類される「休止」期間でありウェハ
ー・ＤＮＡセットアツププログラムからのプリントアウ
トによって指示されている。通常のサイクルではウェハ
ーが分類され、カラムが合成機に再び連結されるとすぐ
に合成サイクルが再びはじまり、脱トリチル化と洗滌が
行われる。最終サイクルは栓をするのと脱トリチル化が
省略される以外は正常サイクルと同一である。もし必要
ならば、全てのウェハーの中で合成が完了した後ウェハ
ーをカラムの中へ再び戻してくみ立て、残存している５
　’−ＤＭＴ保護基を除くため脱トリチル化される。

合成が終了後にウェハーの中味をスクリューキャップの
ついたバイアルにあけ、ＤＮＡを支持体からはずし、さ
らにＣｒｕａｃｈｅｍ　ＰＳ２００型の操作マニュアル
に用意された手順書に従って従来技術によって脱保護基
し精製される。

以上の方法は何回を行われており、１日に３から７９の
異なったＤＮＡ配列で１５から２５残基の長さをもった
ＤＮＡを同時に合成できている。（０，５〜１．０マイ
クロモルの規模で）。各ステップのカップリング効率は
典型的には９５％程度でＤＮＡ配列はＭａｘａｍ−Ｇｉ
ｌｂｅｒｔ配列決定法で確められた。

１−庭一■−１ ３種のテスト的なポリヌクレオチドの同時合成例 この生体高分子合成のための分割ウェハー合成装置の有
用性を評価するために以下に詳細を示すように第１〜５
図に説明された装置で実施例１でのべられた一般法を用
いて、３つのペンタデカマーの同時合成を行った。テス
トに使用したＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は次のとお
りであるニー １、　５’−ＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣＣＡＧ−３’２
、　５’−ＧＣ：ＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡ−３’３
、　５’−ＧＡＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧ−３’合成
の詳細は 試薬の給源：　Ｃｒｕａｃｈｅｍ 合成のスケールとウェハーの大きさ：各つェハー（外径
１０ｍｍＸ高さ４ｍｍ）は１８ｍｇのヌクレオシドＣＰ
Ｇ　（約０．６マイクロモル）を含み、次の大きさの要
素から組立てられた（第１〜３図をみよ）：多孔性テフ
ロン布、１２ｍｍ径；内側のハウジング・リング、内径
４ｍｍＸ高さ４ｍｍ；外側の保持リング、外径１．０ｍ
ｍＸ高さ２ｍｍ；内容積０．０５０ｍＱ。

反応のサイクルと試薬／溶媒の使用量：標準のｒＣＥホ
スホラミダイト」プロトコールと反応サイクルはＣｒｕ
ａｃｈｅｎＰＳ２００型合成機の操作マニュアル和合成
機ているようにしてこの実験で用いた。反応サイクルの
「静止」段階（縮合ステップ１と栓をするステップ１１
）は「ウェハーＣＥ２０Ｊ法での例Ｉに示されたと同じ
時間（夫々４．０と１．５分間）で行った。ステップ１
は０．１＋＋Ｑの０．１Ｍ　ＣＥホスホラミダイ］−と
０．１ｍｍの０．５Ｍテトラゾール（いずれも無水のア
セトニトリル中）をシリンジ中で混合し、各カラムにそ
の混合液を注入することによって開始された。反応サイ
クルの残りの「流す」ステップでは「ウェハーＣＥ２０
Ｊ法の「通常サイクル」について実施例Ｉで規定した時
間の半分で行った（２ｍＱ／分）。カラムは分類ステッ
プ１５の直前にアルゴンを短時間吹きかけた。

平均サイクル時間は１１分間であった。サイクル当り、
ウェハー当り消費される試薬の量と塩基の添加１回当り
の大よそのコスト（ヌクレオチド・ＣＰＧ、試薬、溶媒
のカタログ価格にもとづいて）は次のとおりであった。

３．７ｍｍのアセトニトリル ０．４ｍｍの６．５％ジメチルアミノピリジン、ＴＨＦ
溶液 ０．５＋ｎＱの無水酢酸／ＴＨＦ／ルチジン１．２ｍｍ
のヨウ素（０，１Ｍ、水／ルチジン／ＴＩ（Ｆ（１：１
０：４）中〕 １　、２＋ｎ１２の６．３％ジクロロ酢酸／ジクロロエ
タン０．０６ｍＱの０．５Ｍテトラゾール、アセ１−二
トリル溶液として ０．０６ｎ＋Ｑの０．１Ｍ　２−シアノエチルフォスフ
ォラミダイト、アセトニトリル溶液 として 塩基添加当りコスト：もしＣｒｕａｃｈｅｍＰＳ２００
型合成機で標準モード（従来法）で操作して合成を行っ
た場合の５．４２ドル／塩基と比べて１．９８ドル。

合成後は脱保護基、ＤＮＡＭ製、分析である：最後の脱
トリチレーションのステップはカラム上で行われた（「
通常サイクル」のステップ１６にあるようにして）。ウ
ェハーの中味を１　、５ｍＱエッペンドルフ・チューブ
にあけた後、１ｍｍの新しい濃アンモニアを加え、チュ
ーブの蓋をして混合する。室温で２０分後、（その間に
ＣＰＧからのポリヌクレオチドの分離が起こる）液体を
さらに１ｍｍの濃アンモニアを使ってスクリューキャッ
プ付ガラスバイヤル（内径１５ｍｍＸ長さ４５ｍｍ）に
移して、テフロンのついたキャップで密栓し、５５℃で
６〜１５時間インキュベートした（Ｃ，Ａ、　Ｇのエキ
ソ環状アミノ基を脱保護するため）。５ａｖａｎｔＳｐ
ｅｅｄｖａｃ濃縮機を使って（ｌｈｒは水ジェツトで次
いで一晩高真空で）アンモニアを除いた。乾燥したＤＮ
Ａは少量の水にとかしそれから電気泳動（２０％ポリア
クリルアミド、７Ｍ尿素）で精製し、「Ｕｖシャドウ」
ゲルで可視化された。粗製の反応産物の２０Ａ２．。単
位から得られたパターンが第６図に示されている。

各ゲルの上の方のバンドは求めている完全な長さの生成
物で、うすい下の方のバンドは「まちがった」配列のも
ので底部の濃いバンドはブロムフェノールブルーのマー
カー色素を示しているにれらのゲルは自動化されたアプ
ライド・バイオシステムの３８０Ａ型合成°機（従来の
フオスフォラミグイト法を使っている）で作られた同じ
ようなりＮＡ産物で得られたものと同じと比較され、ま
たその間カップリング効率は９８〜９９％と測定された
（標準のトリチルの遊離を分析して）。かくして、分割
ウェハー合成装置によって３つのペンタデカマーを合成
した際の平均カップリング効率は約９８〜９９％と考え
られた。

注釈：これらのＤＮＡ生成物は従来技術によって５′−
燐酸化でき（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで）ハイブ
リダイゼーション・プローグとして使うことができる。

この生成物が高収量で、高純度で安価であることはポリ
ヌクレオチドの同時合成に本発明が有用であることを示
している。

さらに重要な知見は各反応サイクルの後で行われる手動
の分類工程が合成にマイナスの効果を与えないことであ
る。

失−流一叢一旦 ６２個の生体ポリマーの同時合成 多数の生体高分子の同時合成に対して本発明の利用性を
評価するために６２の異なるＤＮＡのノナデカマーを詳
細を以下に述べるようにして第１〜５図に説明された装
置と実施例■で概観した一般的方法によって合成した。

テストしたＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は次のとおり
である。

１　、５’−ＧＡＡＡＧＧＴＴＡＧＡＴＴＣＣＴＣＡＣ
−３’２　、５’−ＡＡＧＡＡＡＧＧＴＣＡＡＡＴＴＣ
ＣＴＣ−３’３　、５’−ＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡＡＧ
ＧＴＴＡＡＡ−３’４　、５’　−ＧＣＴＴＧＧＴＧＧ
ＣＡＧＡＡＡＧＧＴＴ−３’５　、５’−ＧＡＡＴＧＧ
ＴＴＴＣＴＡＡＣＴＧＣＴＴ−３’６　、５’−ＴＴＴ
ＴＣＡＡＡＧＣＧＡＡＴＧＧＴＴＴ−３’７　、５’　
−ＧＧＴＴＴＡＡＴＧＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴ−３’８　
、５’　−ＧＧＣＧＴＴＴＴＣＡＴＣＡＧＣＧＧＴＴ−
３’９　、５’　−ＣＣＡＣＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＴ
ＴＣＡ−３’１０、５’−ＧＡＣＧＧＣＧＣＧＴＣＡＣ
ＣＣＧＧＣＣ−３’１１、５’−ＧＴＴＧＡＣＧＧＣＴ
ＣＧＣＣＡＣＣＣＧ−３’１２、５’−ＴＣＴＴＣＣＡ
ＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＧ−３’１３．５’−ＡＧＴＴ
ＣＴＴＣＣＣＧＴＡＣＣＴＣＴＴ−３’１４、５’−Ｃ
ＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＡＣＴＣＣＡＧ−３’１５、５
’−ＧＡＴＴＴＣＡＧＣＡＴＣＧＣＣＡＧＡＣ−３’１
６．５’−ＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＧＧＴＧＴ−
３’１７．５’−ＴＧＣＡＣＡＣＧＣＴＣＧＧＴＴＴＴ
ＣＧ−３’１８．５’−ＴＡＴＧＣＡＣＡＣＣＣＣＣＧ
ＧＴＴＴＴ−３’１９．５’−ＡＡＧＡＧＧＴＡＴＣＣ
ＡＣＡＣＧＣＣＣ−３’２０．５’−ＧＧＴＧＡＴＡＡ
ＧＣＧＧＴＡＴＧＣＡＣ−３’２１．５’−ＣＡＡＣＧ
ＴＣＣＣＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡ−３’２２．５’−ＡＴ
ＡＡＡＣＧＴＣＴＣＧＴＴＧＣＡＧＴ−３’２３．５’
−ＡＣＧＡＴＡＡＡＣＣＴＣＣＣＧＴＴＧＣ−３’２４
．５’−ＴＴＴＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＡＴＣＧＧＴ−３
’２５．５’−ＡＴＣＴＴＴＴＧＣＣＧＧＴＴＡＧＧＡ
Ｔ−３’２６．５’−ＣＧＣＡＣＣＧＧＡＣＴＧＴＴＴ
ＴＧＣＡ−３’２７．５’−ＴＣＧＴＴＡＣＧＣＴＣＣ
ＧＧＡＡＴＧＴ−３’２８．５’−ＣＴＴＣＧＴＴＡＣ
ＣＣＡＣＣＧＧＡＡＴ−３’２９．５’−ＴＡＣＧＡＣ
ＧＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＴＴ−３’３０．５’−ＡＣＧ
ＣＣＴＧＧＣＣＧＡＴＡＣＧＡＣＧ−３’３１．５’−
ＧＣＡＡＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＡ−３’３２．
５’−ＧＧＣＧＣＡＡＴＡＧＡＣＧＣＣＴＧＧＣ−３’
３３．５’−ＴＣＣＴＣＴＧＧＣＴＣＡＡＴＡＡＡＣＧ
−３’３４．５’−ＣＡＡＴＣＴＧＣＧＣＧＴＡＧＴＣ
ＣＧＣ−３’３５．５’−ＡＴＡＡＴＧＣＧＣＣＧＴＴ
ＣＡＡＴＣＴ−３’３６、５’−ＣＣＡＴＡＡＴＧＣＣ
ＣＡＧＴＴＣＡＡＴ−３’３７、５’−ＧＡＡＡＧＡＴ
ＧＣＴＣＣＡＴＡＡＴＧＣ−３’３８、５’−ＧＡＡＡ
ＧＡＴＧＣＴＣＣＡＴＡＡＴＧＣ−３’３９、５’−Ｇ
ＣＧＡＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＡＡＴ−３’４０、５
’−ＣＧＣＴＡＣＧＧＣＣＴＴＧＣＴＣＧＣＴ−３’４
１、５’−ＡＴＣＧＣＴＴＴＣＴＣＧＣＴＡＣＧＧＣ−
３’４２、５’−ＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＣＧＣＧＣＴＡ
ＣＧ−３’４３、５’−ＡＡＡＴＣＡＧＡＣＧＡＡＡＧ
ＴＴＧＡＴ−３’４４、５’−ＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡ
ＡＴＣＡＧＡＣＣ−３’４５、５’−ＣＡＣＴＣＡＴＧ
ＣＧＡＴＡＡＡＴＣＡＧ−３’４６、５’−ＧＡＧＣＡ
ＣＧＧＧＣＧＣＧＴＴＣＣＡＴ−３’４７、５’−ＴＴ
ＣＧＣＣＴＧＡＴＣＡＣＧＧＧＴＧＣ−３’４８、５’
−ＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＣ−３’４９
、５’−ＣＧＴＣＣＧＴＣＣＣＧＣＧＴＴＴＣＡＡ−３
’５０、５’−ＧＡＣＧＧＣＧＴＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧ
Ｔ−３’５１、５’−ＡＣＡＧ’ＡＣＧＧＣＣＴＣＣＧ
ＴＣＣＡＧ−３’５２、５’−ＧＡＴＡＣＡＧＡＣＣＧ
ＣＧＴＣＣＧＴＣ−３’５３、５’−ＴＴＡＡＴＧＧＣ
ＴＴＣＡＣＧＴＴＣＡＧ−３’合成の詳細は次のとおり
である。

試薬の給源：　Ｃｒｕａｃｈｅｍ。

合成スケールとウェハーの大きさ：実施例Ｈにあるよう
に１８ｍｇの誘導体化されたＣＰＧ　（約０．６マイク
ロモル）を外径１０ｍｍＸ高さ４ｍｍの大きさの各ウェ
ハーに設置した。

反応のサイクル：　「ウェハーＣＥ２０４法（実施例Ｉ
に揚げた反応サイクル）を用いて合成を行った。０．５
ｍ１２の０．５Ｍテトラゾールと０．５ｔＱの０．１Ｍ
２−シアノエチルホスホラミダイトの混合液をウェハー
のカラムの上からステップ１をスタートさせるために注
入した。平均の反応サイクル時間は１８分間であった。

分類のための（ステップ１５）必要時間は１２分間であ
った。

反応サイクル当りの試薬と溶媒の使用量：ウエハー当り
塩基付加１回当り必要な試薬と溶媒の量及び塩基付加１
個当り合成コストは次のとおりである： ０．８０＋ｎＱのアセトニトリル ０．０８ｍｇの６．５％ジメチルアミノピリジン（ＴＨ
Ｆ溶液として） ０．１０ｍｇの無水酢酸／ＴＨＦ／ルチジン０．２６ｍ
ｇのヨウ素〔水／ルチジン／ＴＨＦ（１：１０：４）中
０、１Ｍ） ０．２６ｍｇの６．３％ジクロロ酢酸／ジクロロエタン
０．０３＋ｎＱの０．５Ｍテトラゾール（アセトニトリ
ル液として） ０．０３ｍ１ｌｌの０．１Ｍ　２−シアノエチルホスホ
ラミダイト（アセトニトリル溶液として） 塩基付加当りのコスト：　０．６５ドル。この値はＣｒ
ｕａｃｈｅｍ　ＰＳ２００型合成機あるいは完全自動化
されたアプライドバイオシステム３８０Ａ型で標準モー
ド（従来技術）で操作してこれら同じポリヌクレオチド
の合成を行った合成コストの大兄１／８にすぎない。

６２のポリヌクレオチドの合成に要した時間二合成は１
日、はぼ１２時間で完了した。これは３カラムの完全自
動化されたアプライドバイオシステム３８０Ａ型合成機
でカラム当り１日２つの合成で行ってこの数のポリヌク
レオチドを作るのに大兄１０日かかるのと比べられる。

合成機の脱保護、ＤＮＡ精製、分析：実施例■と同じ方
法で実施した。第７及び８図に示された「Ｕｖ吸収」ゲ
ルはこの実験で作られた粗製の反応産物２０Ａ２．　。

単位を用いて得られたものを表わしている。

精製ＤＮＡ産物のＵＶ吸収ゲル分析と定量の結果によれ
ば、平均のカップリング効率はこの複数の同時合成の間
９２〜９８％とみなされた。

注釈：精製されたポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチ
ド・指向性の変異原性に対する従来技術で使用される。

この研究の間にＤＮＡ生成物は５′−燐酸化され（Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼによって）、ＤＮＡの鋳型に
くみこまれ、そしてＤＮＡポリメラーゼで伸長された。

かくして高品質のＤＮＡ産物が従来の技術での方法に比
べて高収率で非常に安価で時間的にずっと短かく生産さ
れた。

かくして、本発明のウェハーは複数の配列を規定した生
体高分子の合成法を提供している。

支持体の構造は高いカップリング効率をもたらし、また
硬質のウェハーは各反応サイクルのあと毎に分類ならび
かえを可能にしている。非常に利点となるのは、本発明
によって合成コストが減少し多数の生体高分子の合成に
要する時間を減らしたことである。この分割ウェハー法
で作り出される経済的１時間短縮の利点は市販の商品に
対する要望をまし、医学における将来の発展をかき立て
るであろう。

それ放水発明はこの中に内在しているものと同時にここ
に述べられた目的を実行しその目的と利点を得るために
よく適している。この発明においてここに選んでのせた
実施例はこの明細のために示したものであるが、その部
分の構成と配置などの詳細において多の変化をつけられ
ることはこの技術分野に通じるものにとって容易に推測
でき、そしてそれらはこの発明の概念と特許請求範囲の
展望の中に含まれる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のウェハーの内容について配置分解図で
ある。第２図は本発明のウェハーの組立てた状態のもの
の断面図である。第３図は本発明のウェハーの組立てた
状態での透視図である。第４図（Ａ）本発明によった分
割されたウェハー合成装置のカラムに集めた全体図、第
４図（Ｂ）はカラム２４を取付ける前のウェハー合成装
置、第４図（Ｃ）はカラム２４の正面図である。 第５図は、本発明による分割されたウェハー合成装置の
全体図である。第６．７．８図は本発明によって作られ
たＤＮＡ分子のＵＶ吸収を眼でみえるようにして説明し
ている図面である。 図の中にある全ての数字は別の図における同一部分が同
じになるよう一致している。 特許出願人　ベイラー　カレッジ　オブ　メディシンＦ
／（３ Ｆ／（３，３ 図面の浄書（′内γｉに変更なし） ５，７ノ ′：′ｌ′１″・ 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第１５９７３１号 ２、発明の名称 生体高分子の分割合成のための多孔質ウェハー３、補正
をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　アメリカ合衆国、　７７０３０　　テキサス。 ヒユーストン、ベイラー　プラザ １番地 名　称　ベイラー　カレッジ　オブ メディシン 代表者　サムエル　ニス、クロッカー ４、代理人 東京都千代田区麹町４丁目５番地（〒１０２）５、補正
指令の日付 昭和６３年９月２７日 ６、補正の対象 （１）　　明細書の「図面の簡単な説明」の欄（２）　
　図　　面（第６〜８図） ７、補正の内容 （１）　　明細書第６９頁第９行の「説明している図面
である。」の記載を「説明している写真である。」と補
正する。 （２）　　図面第６〜８図の浄書（内容に変更なし。）
を提出する。 ８、添付書類の目録

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、固相の支持体と、その内壁によって作られる部屋に
   支持体を保持するための保持リングと、その保持リング
   を通して支持体に液の流れを作りかつ支持体が保持リン
   グから外へ出ないようにするための多孔質体よりなる生
   体高分子の合成のための化学的に不活性なウェハー。 ２、保持リングが支持体を受け入れ保持するための内側
   に密封される反応室をもちその保持リングが両端で開口
   している特許請求の範囲第１項記載のウェハー。 ３、多孔質体により液を流す手段が保持リングの両端に
   あり、その部室を封じるために開口端全体にいきわたっ
   ている分離手段を含む特許請求の範囲第２項記載のウェ
   ハー。 ４、保持リングへ液を流すための多孔質体を留めるおさ
   え具を含む特許請求の範囲第１項記載のウェハー。 ５、おさえ具が化学的に不活性である特許請求の範囲第
   ４項記載のウェハー。 ６、保持リングが化学的に不活性である特許請求の範囲
   第１項記載のウェハー。 ７、固相の支持体がシリカ、コントロールされた孔をも
   ったガラス、ポリスチレン・ジビニルベンゼン、ポリア
   ミド・けいそう土、ベンジル基の結合したポリスチレン
   樹脂、スペーサーを結合したスチレン樹脂、ポリアミド
   樹脂およびマクロ網状樹脂からなる群から選ばれる特許
   請求の範囲第１項記載のウェハー。 ８、固相の支持体がコントロールされた孔をもったガラ
   スである特許請求の範囲第７項記載のウェハー。 ９、固相の支持体が共有結合で結合した基をもつ誘導体
   化された素材を含む特許請求の範囲第１項記載のウェハ
   ー。 １０、液を流すための多孔質体がフルオロカーボン素材
   、微孔をもった（ｆｒｉｔｔｅｄｏｒｓｃｉｎｔｅｒｅ
   ｄ）ガラス、チタン、ステンレススチールのフリッツ（
   ｆｒｉｔｓ）を含む特許請求の範囲第１項記載のウェハ
   ー。 １１、前記液を流すための多孔質体の孔隙がウェハーを
   通して液を流せるに十分大きく、ウェハーの中に固相の
   支持体を保持できるに十分小さい特許請求の範囲第１項
   記載のウェハー。 １２、固相の支持体と、その支持体を受けとめ保持する
   ために両端が開口しており内面の壁で作られる反応槽を
   もつ内側のハウジングリングと、その内側の保持リング
   の両開口端に位置して開口端全面を覆ってその内側リン
   グより大きな直径をもっている不活性の多孔質膜と、そ
   の内側リングより少し大きな内径をもち、その内側のリ
   ングと外面のリングの間でその膜の縁をとめている２つ
   の外側リングとを含む生体高分子を合成するための化学
   的に不活性のウェハー。 １３、前記液を流すための多孔質体がその保持リングに
   圧しつけてとめている特許請求の範囲第３項記載のウェ
   ハー。 １４、溶媒を輸送するシステム、少くとも１本のカラム
   を通して溶媒と試薬を流すため、その溶媒輸送システム
   につながれた少くとも１本のカラム及び重合体の合成を
   行うカラム内に設置された特許請求の範囲第１項記載の
   ウェハーで少くとも１つのウェハーを含む複数の配列が
   決められている生体高分子の合成のための分割されたウ
   ェハー合成装置。 １５、４つの試薬を受けるための少くとも４つのカラム
   とその個々のカラムに複数のウェハーをもち、そのウェ
   ハーの各々が配列の決められた生体高分子の合成のため
   に用いられる特許請求の範囲第１４項記載の合成装置。 １６、溶媒輸送システムと特許請求の範囲第１項記載の
   ウェハーで積み重ねた複数のウェハーを含みそのウェハ
   ーの各々が生体高分子合成材を含み、カラムを作るため
   に次の隣りのウェハーと連結し、その溶媒輸送システム
   がそのカラムを通して液を流せるようにつなげられてい
   る複数の配列の決められた生体高分子の合成をするため
   の分割されたウェハー合成装置。