JP2022521663A - 抗－ｔｍ４ｓｆ４抗体及びこの用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＴＭ４ＳＦ４（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４）に特異的に結合する新規の抗体又はこの抗原結合断片に関し、これら抗体又はこの抗原結合断片は、癌細胞の増殖阻害活性を示して癌を効果的に予防又は治療することができ、癌幹細胞の自己再生能力を減少させるので、既存の抗癌治療の予後がよくない癌の治療にも有用に用いられ得る。

Description

本発明は、ＴＭ４ＳＦ４（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ
Ｍｅｍｂｅｒ ４）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、及びこれを含む癌の予防又は治療用組成物に関する。

ＴＭ４ＳＦ４（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４）は、テトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ）タンパク質の一種であり、この分類の他のタンパク質であるＴＭ４ＳＦ１及びＴＭ４ＳＦ５は多数の腫瘍で発現が上向き調節され、上皮間葉転移及び細胞移動に関与することが報告され、癌細胞関連の研究が多数進められている。ＴＭ４ＳＦ４は、癌細胞で細胞の死滅と分化、そして細胞の浸透能力に関与すると一部で報告されたことがある。しかし、癌幹細胞の特性に関して知られているところがなく、何等の研究も進められたことがない。最近、本研究陣は、ヒト肺癌細胞でＴＭ４ＳＦ４タンパク質が癌幹細胞の生長、自己複製（Ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）能力及び転移／浸潤を促進させると報告し、ＴＭ４ＳＦ４が癌の発生に重要な信号伝達システムであるＩＧＦ１Ｒβ／ＡＫＴ／ＮＦκＢ又はＪＡＫ２（ｏｒ ＦＡＫ）／ＳＴＡＴ３活性化を促進させ、それにより促進されるサイトカイン分泌により癌幹細胞の特性を強化させて腫瘍をさら悪性化させることを提示した（Ｃｈｏｉ ＳＩ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１４；５（２０）：９８２３－９８３７、Ｃｈｏｉ ＳＩ ｅｔ
ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７；８（６０）：１０１２８４－１０１２９７）。

抗体は、ターゲット抗原に対する高い結合特異性と人体内安定性により治療剤として活用されている。特に、抗癌機能の抗体は、抗体工学技術の発展に基づいて、ヒト化抗体、単鎖抗体、二重抗体、薬物融合抗体などに改善され、癌治療の効能を大きく向上させて活用されている。しかし、癌特性の多様性と新たな抗原発現による治療抵抗性の誘導などにより、既存に癌細胞ターゲティングのために活用されている抗原の種類に限界性が指摘されており、新規の癌特異抗原を探索してこれに対する抗体を導出する研究が持続している。

特に、既存の癌治療法に活用されている標的薬物や放射線治療に抵抗性を示して再発する癌の場合、癌幹細胞の特性が重要に作用することが報告されているので、癌幹細胞のターゲティングに活用することができる抗原の発掘及び特異抗体の確保の重要さが浮上している。

このような技術的背景下で、本発明者達は、癌幹細胞をターゲットにする新規抗体を開発するために鋭意努力した結果、ＴＭ４ＳＦ４に高い親和力で結合する新規の抗ＴＭ４ＳＦ４抗体を開発し、このような新規抗体が癌幹細胞を含む腫瘍細胞の増殖を顕著に阻害させるのみならず、抗癌効果に優れていることを確認することにより本発明を完成した。

よって、本発明の一目的は、ＴＭ４ＳＦ４（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４）に特異的に結合する抗体又はこの抗原結合断片を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記抗体又はこの抗原結合断片を暗号化する核酸分子、前記核酸
分子を含む発現ベクター、前記発現ベクターを含む宿主細胞、前記宿主細胞を培養する段階を含む、抗体又はこの抗原結合断片の生産方法を提供することにある。

本発明のまた他の目的は、前記抗体又はこの抗原結合断片を含むＴＭ４ＳＦ４検出用組成物、これを含む検出用キット、及びこれらを用いてＴＭ４ＳＦ４抗原を検出する方法を提供することにある。

本発明のまた他の目的は、前記抗体又はこの抗原結合断片を含む癌の予防又は治療用薬学的組成物；癌幹細胞成長抑制用組成物；及び放射線抗癌治療補助用組成物を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明の一側面は、ＴＭ４ＳＦ４（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４）に特異的に結合する抗体又はこの抗原結合断片を提供する。
本発明の他の一側面は、前記抗体又はこの抗原結合断片を暗号化する核酸分子を提供する。
本発明のまた他の一側面は、前記核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
本発明のまた他の一側面は、前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明のまた他の一側面は、前記宿主細胞を培養する段階を含む、抗体又はこの抗原結合断片を生産する方法を提供する。
本発明のまた他の一側面は、前記抗体又はこの抗原結合断片を含むＴＭ４ＳＦ４検出用組成物及びキットを提供する。

本発明のまた他の一側面は、前記抗体又はこの抗原結合断片を、ＴＭ４ＳＦ４抗原を含むものと予想される検出対象試料と接触させる段階を含む、ＴＭ４ＳＦ４抗原を検出する方法を提供する。

本発明のまた他の一側面は、（ａ）前記抗体又はこの抗原結合断片の治療的有効量；及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む、癌の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
本発明のまた他の一側面は、癌幹細胞成長抑制用組成物を提供する。
本発明のまた他の一側面は、抗体又はこの抗原結合断片を含む放射線抗癌治療補助用組成物を提供する。

本発明のＴＭ４ＳＦ４に特異的に結合する抗体又はこの抗原結合断片は、新規の配列を有し、優れた癌細胞増殖阻害活性を示して癌などの疾患を効果的に予防又は治療することができる。

また、癌幹細胞の自己再生能力、浸潤能力及び移動能力を減少させることによって癌幹細胞の成長を抑制することができ、これにより既存の抗癌治療方法に耐性がある癌を効果的に治療することができる。

また、既存の抗癌剤又は放射線治療と併行処理することにより、抗癌活性をより高めることができ、抗癌剤の使用量を画期的に減らすことができるので、抗癌剤の使用による副作用を軽減させることができ、従来の放射線治療に抵抗性が存在して治療が容易でなかった個体に対する放射線抗癌治療の効果を顕著に向上させることができる技術であって、既存の抗癌治療の予後がよくない癌の治療に有用である。
したがって、本発明の新規の抗体又はこの抗原結合断片は、ＴＭ４ＳＦ４を標的とする新たな抗体医薬品の開発に有用に用いられ得る。

本発明の抗体又はこの抗原結合断片が特異的に結合するＴＭ４ＳＦ４タンパク質内のエピトープ領域を示した図である：エピトープ領域は、ＴＭ４ＳＦ４タンパク質中、細胞膜外部に露出された部位のうち１２６番目から１４０番目の１５ｍｅｒペプチド；Ｇはグリコシル化部位；Ｃはジスルフィド結合を形成するシステイン。 新規の抗体５種（ＥＣＬ－２Ｂ７、ＥＣＬ－４Ｃ１、ＥＣＬ－８Ｅ２、ＥＣＬ－８Ｅ５及びＥＣＬ－１２Ａ８）をハイブリドーマ細胞培養液から精製して精製純度を確認した結果を示す図である。各抗体の重鎖（ＩｇＧ－ＨＣ）及び軽鎖（ＩｇＧ－ＬＣ）がそれぞれ５５ｋＤａ、２６ｋＤａの位置で確認されることから新規の抗体がＩｇＧタイプの抗体であることを確認することができ、還元できなかったＩｇＧは、１７０ｋＤａの上側に位置するバンド（ＩｇＧ）と確認され、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）はタンパク質量を比べるための対照群である。 本発明の新規の抗体による抗原反応性をＴＭ４ＳＦ４_{（１２６－１４０）}－ＢＳＡ抗原に対するＥＬＩＳＡを実施して示した図である。抗原は、５００～４ｎｇ／ｗｅｌｌ水準にコーティングし、抗体はＸ軸に表示した範囲（２００～０．８ｎｇ／ｗｅｌｌ）の範囲に処理された。５個の抗体のいずれもペプチド抗原に対する高い反応性を示した（Ａ－Ｅ）。特に、１００ｎｇ／ｗｅｌｌのペプチドコーティング抗原を用いたＥＬＩＳＡで比べた結果をみるとき、２Ｂ７、４Ｃｌ、１２Ａ８抗体が高い抗原親和力を示すことを確認することができる（Ｆ）。 本発明の新規の抗体による抗原反応性を、分子間相互作用分析（Ｂｉｏｃｏｒｅ）を用いて製造した抗体がＴＭ４ＳＦ４タンパク質に特異的に結合するか否かで確認した結果を示した図である。ＥＣＬ－２Ｂ７、ＥＣＬ－４Ｃ１、及びＥＣＬ－１２Ａ８抗体を用いており、それぞれの濃度に対する特異結合値の変化が有意に動くことを観察し、結合する値が高く測定されたことを確認した。グラフが増加する結合区間が時間の経過により増加していることを観察することができ、４８０秒に結合を抑制させたとき結合能力が減少されていることを示し、これは分子間相互作用分析で示される結合能力が高い抗体の典型的な形態である。 本発明の新規の抗体による抗原反応性を免疫沈降物の分析で製造した抗体がＴＭ４ＳＦ４タンパク質に特異結合するか否かで確認した結果を示した図である。Ａは、Ｆｌａｇ発現又はＦｌａｇ－ＴＭ４ＳＦ４発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させて得た細胞破砕液（試料１及び２）を新規の抗体又は対照群抗体であるマウス抗－ＧＡＰＤＨ抗体を用いて免疫沈降し、免疫沈降物をウェスタンブロッティングして抗－Ｆｌａｇ抗体で検出した結果であり、Ｂは、前記免疫沈降実験に同一量の抗体が添加されたかを確認するために免疫沈降物に対する抗－マウス抗体ＨＲＰで投与抗体量を検証した結果である。 本発明の新規の抗体がターゲット抗原特異結合をするか検証するために免疫蛍光染色分析を実施した結果を示した図であり、新規の抗体がＨＥＫ２９３Ｔ細胞面に発現されたＥＧＦＰ－ＴＭ４ＳＦ４に結合していることを確認した結果である。 本発明の新規の抗体がターゲット抗原特異結合をするか検証するために免疫蛍光染色分析を実施した結果を示した図であり、新規の抗体がＡ５４９細胞の表面に存在するＴＭ４ＳＦ４に特異的に結合していることを確認した結果である。特に、ｓｉＲＮＡでＴＭ４ＳＦ４抗原の発現を抑制するとき抗体反応が消滅することを確認して新規の抗体がＴＭ４ＳＦ４抗原に特異的に結合することを再び検証した。 本発明の新規の抗体による癌幹細胞の自己再生能力の阻害効果を確認した図である。新規の抗体は、ＥＣＬ－２Ｂ７及びＥＣＬ－４Ｃ１を用いており、対照群（ｃｏｎ）としてシグマ社製の抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体を用いた。左側は癌幹細胞のスフィア形成能を光学顕微鏡で観察したものであり、右側は形成されたスフィアの直径長さを示したグラフである。 本発明の新規の抗体による癌細胞の移動能力及び浸潤能力の抑制効果を確認した図である。新規の抗体は、ＥＣＬ－２Ｂ７及びＥＣＬ－４Ｃ１を用いており、対照群（ｃｏｎ）としてシグマ社製の抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体を用いた。左側は移動した細胞及び浸湿細胞を染色して観察したものであり、右側は対照群に対する相対的な移動能及び浸潤能をグラフで示したものである。移動能力（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）実験は３回の反復実験を総４回にわたって進め、浸潤能力（ｉｎｖａｔｉｏｎ）実験は３回の反復実験を３回にわたって進めた。 本発明の新規の抗体による癌細胞の放射線敏感度の向上効果を確認した図である。Ａ５４９細胞（Ａ）とＨｕｈ７細胞（Ｂ）に抗体（ＥＣＬ－２Ｂ７、ＥＣＬ－４Ｃ１、及びＥＣＬ－１２Ａ８）を処理した後、６Ｇｙの放射線を照射して細胞の集落形成が減少することを確認した。 新規の抗体の作用機転をウエスタンブロットで確認した図である。抗体は、ＥＣＬ－２Ｂ７、ＥＣＬ－４Ｃ１、ＥＣＬ－８Ｅ２、ＥＣＬ－１２Ａ８が用いられており、癌細胞は、Ａ５４９細胞を用いた。それぞれの抗体を処理したとき、癌幹細胞のタンパク質タグであるＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＣＤ４４が減少したことを観察し、癌幹細胞の自己再生に関与するβ－ｃａｔｅｎｉｎとＯｃｔ４の減少を確認した。また、標識因子と自己再生能力の調節因子に関与する信号伝達経路として知られているＩＧＦ１βとＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ信号伝達経路がそれぞれの抗体を処理したとき減少され、本発明の新規の抗体はＩＦＧ１ＲβとＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ信号伝達経路を抑制することにより癌幹細胞を調節していることを確認した。 本発明の新規の抗体による抗癌効果を検証するために肺癌ゼノグラフトアッセイ（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ａｓｓａｙ）動物実験を実施した結果を示した図である。癌組織の大きさが３０ｍｍ^３以上（Ａ、Ｂ）又は２００ｍｍ^３以上（Ｃ、Ｄ）となったとき、抗体を癌組織に直接注入した。抗体は、２つの実験いずれも同一に１回に個体当り～１３ｕｇ水準で総６回にわたって注入し（Ｂ、Ｄの矢印日付）、癌組織は２～３日間隔で大きさを測定した。 本発明の新規の抗体の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）配列分析のためにＲＴ－ＰＣＲとクローニングを実施した結果を示した図である：ＥＣＬ－２Ｂ７抗体のＩｇＧ１亜型重鎖遺伝子及びカッパ（ｋａｐｐａ）軽鎖遺伝子（Ａ）、ＥＣＬ－４Ｃ１抗体のＩｇＧ２ａ亜型重鎖遺伝子及びカッパ（ｋａｐｐａ）軽鎖遺伝子（Ｂ）を、制限酵素配列が含まれているプライマーを活用してＲＴ－ＰＣＲに増幅し、これをベクターにクローニングした。ベクターにクローニングされた配列は、再び制限酵素切断で確認した後、抗体遺伝子部位に対する塩基配列分析を実施した。各抗体の重鎖遺伝子はＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断し、軽鎖遺伝子はＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで切断してアガロースゲルで確認した。黒色矢印：切断後のベクター（Ｖ）、赤色矢印：切断された挿入遺伝子（Ｃ、Ｄ）。 新規の抗体ＥＣＬ－２Ｂ７の重鎖可変領域の塩基配列及びタンパク質配列を分析した結果を示した図である。抗体構造による抗原認識決定部位をカバット（ｋａｂａｔ）ナンバリングを介して整理し、配列にＣＤＲ１、２、３で表示した。 新規の抗体ＥＣＬ－２Ｂ７の軽鎖可変領域の塩基配列及びタンパク質配列を分析した結果を示した図である。抗体構造による抗原認識決定部位をカバットナンバリングを介して整理し、配列にＣＤＲ１、２、３で表示した。 新規の抗体ＥＣＬ－４Ｃ１の重鎖可変領域の塩基配列及びタンパク質配列を分析した結果を示した図である。抗体構造による抗原認識決定部位をカバットナンバリングを介して整理し、配列にＣＤＲ１、２、３で表示した。 新規の抗体ＥＣＬ－４Ｃ１の軽鎖可変領域の塩基配列及びタンパク質配列を分析した結果を示した図である。抗体構造による抗原認識決定部位をカバットナンバリングを介して整理し、配列にＣＤＲ１、２、３で表示した。 本発明の新規の抗体による癌細胞死滅の効果を、群集形成能力を介して観察した結果を示した図である。肺癌細胞株（Ｈ１２９９）、肝癌細胞株（Ｈｕｈ７）、乳癌細胞株（ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ２３１）及び膵臓癌細胞株（ＭＩＡ Ｐａｃａ－２）を用いており、それぞれの細胞にＥＣＬ－２Ｂ７抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体（実験群）及びマウスＩｇＧ（対照群）をそれぞれ５ｕｇずつ処理した後、細胞の群集形成能力を確認した。使用した全ての細胞株で群集形成の程度が減少していることを観察することができ、これは、肺癌細胞だけでなく、肝癌細胞、乳癌細胞及び膵臓癌細胞でも本発明の抗体が作用できることを示す。

以下、本発明を詳しく説明する。
一側面において、本発明は、
ＴＭ４ＳＦ４（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４）に特異的に結合する抗体又はこの抗原結合断片を提供する。

本発明における用語「抗体」は、免疫学的に特定の抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識する受容体の役割を担うタンパク質分子を意味し、その例として、単一クローン抗体、多クローン抗体、全長抗体（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ）及び抗体断片をいずれも含んでよい。また、前記用語は、二価又は二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ又はテトラボディを含んでよい。

本発明における用語「単一クローン抗体」は、実質的に同一の抗体集団で収得した単一分子組成の抗体分子を称し、このような単一クローン抗体は、特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示す。本発明における用語「全長抗体」は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖の不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。ＩｇＧは、亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）であって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。

本発明における用語「断片」、「抗体断片」及び「抗原結合断片」は、抗体の抗原結合機能を保有する本発明の抗体の任意の断片を称するものであって、互換的に用いられる。例示的な抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）の断片、単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価単一鎖抗体、単一鎖ファージ抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ポリペプチドへの特定の抗原に結合するのに十分な免疫グロブリンの１つ以上の断片を含有するポリペプチドなどを含むが、これに限定されない。

前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の１番目の不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造であって、１個の抗原結合部位を有する。抗体分子の抗原結合断片又は抗体断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ
ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）_２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域のみを有している最小の抗体片を意味する。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般的にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結さるか又はＣ－末端でそのまま連結されているので、二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなすことができる。これに制限されるものではないが、このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素
を用いて得られ［例えば、全体抗体をパパインで制限切断すれば、Ｆａｂを得ることができ、ペプシンで切断すれば、Ｆ（ａｂ’）_２断片を得ることができる］、又は遺伝子組み換え技術を介して製作することができる。

本発明における用語「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、免疫グロブリン、抗体又はこの抗原結合断片が特異的に認識して結合することができる抗原上の特定部位を意味する。前記エピトープは、連続アミノ酸から、又はタンパク質の３次折り畳みにより併置された不連続アミノ酸から形成されてよい。

本発明の一具現形態において、本発明は、膜タンパク質であるＴＭ４ＳＦ４が細胞外に露出された部位に存在するエピトープ領域でＴＭ４ＳＦ４タンパク質に結合する抗体又はこの抗原結合断片を提供する。

前記エピトープ領域は、例えば、基準ＴＭ４ＳＦ４抗原（配列番号１）でＮ－末端から４番目から３３番目のＧＧＣＡＲＣＬＧＧＴＬＩＰＬＡＦＦＧＦＬＡＮＩＬＬＦＦＰＧＧ（配列番号２３）、５３番目から６７番目のＬＧＳＧＶＬＭＩＦＰＡＬＶＦＬ（配列番号２４）、７１番目から８０番目のＮＮＤＣＣＧＣＣＧＮ（配列番号２５）、９２番目から１１２番目のＳＴＩＦＡＶＶＧＦＬＧＡＧＹＳＦＩＩＳＡＩ（配列番号２６）、配列番号１１６番目から１２２番目のＫＧＰＫＣＬＭ（配列番号２７）、１２７番目から１３３番目のＷＧＹＰＦＨＤ（配列番号２８）、１４６番目から１９８番目のＣＲＥＰＬＮＶＶＰＷＮＬＴＬＦＳＩＬＬＶＶＧＧＩＱ ＭＶＬＣＡＩＱＶＶＮＧＬＬＧＴＬＣＧＤＣＱＣＣＧＣＣＧＧ（配列番号２９）であってよく、より具体的に、基準ＴＭ４ＳＦ４抗原（配列番号１）でＮ－末端から１２６番目から１４０番目のＴＷＧＹＰＦＨＤＧＤＹＬＮＤＥ（配列番号２）であってよい。

また、前記配列番号２で記載されたエピトープ領域は、本発明の抗体又はこの抗原結合断片が結合するＴＭ４ＳＦ４の抗原配列が一部変異（置換、付加又は削除）を含むか、又は結合する抗原がＴＭ４ＳＦ４の断片、前駆体又は亜型の形態で存在することにより、その結合位置又は配列が多少変わったとしても、通常の技術者は、基準ＴＭ４ＳＦ４の抗原のエピトープ配列情報に基づいて本発明の抗原又はこの抗原結合断片が結合する位置及び配列を明確に特定することができる。

本発明の具体的な一実施形態では、２０２個のアミノ酸からなる膜タンパク質であるＴＭ４ＳＦ４抗原構造から細胞外に露出され、抗体誘導能が高いものと予想され、グリコシル化又はジスルフィド結合がない部位を抗体生成のためのエピトープ領域として選別した（図１）。

本発明の他の具現形態として、前記抗体は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖の可変領域；及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖の可変領域を含む抗体；又は（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖の可変領域；及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖の可変領域を含む抗体であってよい。

本発明における用語「重鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びこの断片をいずれも含んでよい。また、本発明におけ
る用語「軽鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びこの断片をいずれも含んでよい。

本発明において、前記抗体は、マウスから生産されたマウス抗体、及びこれから抗体の親和度、免疫性などを改善させるために親抗体のアミノ酸配列に一部を置換、付加及び／又は欠失させた変異体をいずれも含んでよい。前記変異体はこれに制限されないが、その例として、キメラ抗体、ヒト化抗体、親和度最適化抗体などを含んでよい。前記変異体は、親抗体と同一のＣＤＲを含むか、あるいは同一のエピトープを標的とする条件で親抗体ＣＤＲアミノ酸配列の一部が変異（置換、付加又は欠失）された抗体を包括的に称する。このような変異体は、同一のエピトープに対する結合能が維持される範囲内で抗体の親和度及び免疫性などを改善させるために、当業者により適宜調節されてよい。

すなわち、本発明の抗体又はこの抗原結合断片は、ＴＭ４ＳＦ４を特異的に認識することができる範囲内で、本明細書に記載された抗ＴＭ４ＳＦ４抗体の配列だけでなく、その生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他の生物学的特性を一層改善させるために、抗体のアミノ酸配列に更なる変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形状及び種類に対する分析により、アルギニン、リシンとヒスチジンはいずれも正電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシンとセリンは類似の大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは類似の形状を有するということが分かる。よって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは生物学的に機能均等物といえる。

本発明における用語「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域及びヒト抗体の不変領域を組み換えさせた抗体であって、マウス抗体に比べて免疫反応が大きく改善された抗体である。

本発明における用語「ヒト化抗体」は、ヒトでない種から由来した抗体のタンパク質配列を、ヒトから自然的に生産された抗体変異体と類似するように変形させた抗体を意味する。その例として、前記ヒト化抗体は、マウス由来のＣＤＲをヒト抗体由来のＦＲと組み換えさせてヒト化可変領域を製造し、これを好ましいヒト抗体の不変領域と組み換えさせてヒト化抗体を製造することができる。但し、単にＣＤＲグラフティングのみを行う場合、ヒト化抗体の親和度が下がるため、ＣＤＲの３次元構造に影響を与えるものと考えられる幾つかの重要なＦＲアミノ酸残基をマウス抗体のものに親和させることにより、本来のマウス抗体の親和度と同じ水準に上げることができる。

本発明における「親和度最適化抗体」とは、特定抗体のＣＤＲ配列の一部が置換、付加、欠失された変異体であって、前記特定抗体と同一の抗原エピトープに結合しながらも、抗原に対する結合親和度が向上された抗体をいう。具体的に、本発明の親和度最適化抗体とは、本発明の（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖の可変領域；及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖の可変領域を含む抗体；又は（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖の可変領域；及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤ
Ｒ－Ｌ３を含む軽鎖の可変領域を含む抗体と同一のエピトープに結合する変異体抗体をいう。通常の技術者は、特定された軽鎖及び重鎖ＣＤＲ配列に基づき、公知の技術を用いて前記親和度最適化抗体を製造することができる。

本発明の他の具現形態として、前記抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域；及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域を含む抗体であってよい。例えば、前記抗体は、配列番号１７のヌクレオチド配列により暗号化される重鎖の可変領域；及び配列番号１８のヌクレオチド配列により暗号化される軽鎖の可変領域を含む抗体であってよいが、これに限定されるものではない。

また、前記抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域；及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域を含む抗体であってよい。例えば、前記抗体は、配列番号２１のヌクレオチド配列により暗号化される重鎖の可変領域；及び配列番号２２のヌクレオチド配列により暗号化される軽鎖の可変領域を含む抗体であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明の具体的な一実施形態では、ヒトのＴＭ４ＳＦ４タンパク質を抗原としてマウスからハイブリドーマ細胞群を確保しており、これらからＴＭ４ＳＦ４タンパク質を抗原として用いたＥＬＩＳＡ分析方法を介してスクリーニングを行うことにより、ＴＭ４ＳＦ４に特異的に結合する抗ＴＭ４ＳＦ４抗体を選別した。

他の側面において、本発明は、前記抗体又はこの抗原結合断片を暗号化する核酸分子、前記核酸分子を含む発現ベクター、前記発現ベクターが導入された宿主細胞、前記宿主細胞を用いて抗体又はこの抗原結合断片を生産する方法を提供する。

本明細書における用語「核酸分子」は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、前記核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖の可変領域を暗号化する核酸分子の配列は変形されてよく、前記変形はヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。

本発明の核酸分子は、前記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものとして解釈される。本発明において実質的な同一性とは、前記本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列とを最大限対応されるようにアラインし、当業界で通常用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最小８０％の相同性、具体的に最小９０％の相同性、より具体的には最小９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。

本明細書における用語「ベクター」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であって、プラスミドベクター；コズミドベクター；そしてバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ－連関ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含み、具体的にプラスミドベクターであってよいが、これに制限されない。

本発明のベクターにおいて重鎖の可変領域をコーディングする核酸分子及び軽鎖の可変領域をコーディングする核酸分子は、プロモーターと作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）されたものであってよい。

本発明における用語「作動可能に連結された」とは、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の
機能的な結合を意味し、これにより前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。
本発明の組み換えベクターシステムは、当業界に公知の多様な方法を介して構築され得る。

本発明のベクターは、典型的にクローニングのためのベクター又は発現のためのベクターとして構築されてよい。また、本発明のベクターは、原核細胞又は真核細胞を宿主として構築されてよい。

例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進めさせることができる力強いプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読開始のためのリボゾーム結合サイト及び転写／解読終結配列を含むことが一般的である。宿主細胞として、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５αなど）が用いられる場合、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９８４）１５８：１０１８－１０２４）、そしてファージλの左向プロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ ａｎｄ Ｈａｇｅｎ，Ｄ，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，（１９８０）１４：３
９９－４４５）が調節部位として用いられ得る。宿主細胞としてバチルス菌が用いられる場合、バチルスチューリンゲンシスの毒素タンパク質遺伝子のプロモーター（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９８）６４：３９３２－３９３８；Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ（１９９６）２５０：７３４－７４１）、又はバチルス菌で発現可能な如何なるプロモーターでも調節部位に用いられ得る。

一方、本発明の組み換えベクターは、当業界でたびたび用いられるプラスミド（例：ｐＣＬ、ｐＳＣ１０１、［００７３］ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ及びｐＵＣ１９など）、ファージ（例：λｇｔ４・λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１及びＭ１３など）又はウイルス（例：ＳＶ４０など）を操作して作製されてよい。

一方、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来されたプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）、又は哺乳動物ウイルスから由来されたプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーターエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられてよく、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。具体的に、本発明の組み換えベクターは、ＣＭＶプロモーターを含む。

本発明の組み換えベクターは、それから発現される抗体の精製を容易にするため他の配列と融合されてよい。融合される配列には、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などがある。また、本発明のベクターにより発現されるタンパク質が抗体
なので、精製のための更なる配列がなくとも、発現された抗体は、タンパク質Ａカラムなどを介して容易に精製することができる。

一方、本発明の組み換えベクターは、選択標識として当業界で通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含むことができる。

本発明の抗体を発現するベクターは、軽鎖と重鎖が１つのベクターで同時に発現されるベクターシステム、又は軽鎖と重鎖をそれぞれ別途のベクターで発現させるシステムのいずれも可能である。後者の場合、２つのベクターは、例えば、同時形質転換(ｃｏ－ｔｒ
ａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）又は標的形質転換（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を介して宿主細胞に導入され得る。同時形質転換は、軽鎖及び重鎖をコーディングするそれぞれのベクターＤＮＡを同時に宿主細胞に導入した後、軽鎖と重鎖を全て発現する細胞を選別する方法である。標的形質転換は、軽鎖（又は重鎖）を含むベクターに形質転換された細胞を選別し、選別された細胞を、重鎖（又は軽鎖）を含むベクターに再び形質転換して軽鎖及び重鎖の全てを発現する細胞を最終的に選別する方法である。

本発明のベクターを安定的かつ連続的にクローニング及び発現させることができる宿主細胞であれば、当業界に公知の如何なる宿主細胞も用いることができ、例えば、エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を含んでよいが、これに制限されるものではない。

前記ベクターの好適な真核宿主細胞は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）のような真菌、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセスセルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）のような酵母、その他の下等真核細胞、昆虫－由来細胞のような高等真核生物の細胞、そして植物又は哺乳動物から由来した細胞を用いることができる。

具体的に、宿主細胞は、ＣＯＳ７細胞（ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、ベビーハムスターの腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髓腫細胞株、ＨｕＴ ７８細胞又は２９３細胞であってよいが、これに制限されない。

本発明において、宿主細胞への「形質転換」及び／又は「形質感染」は、核酸を有機体、細胞、組織又は器官に導入する何等の方法も含まれ、当分野で公知のとおり、宿主細胞に従って好適な標準技術を選択して行うことができる。前記のような方法には、エレクトロポレーション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈澱、シリコンカーバイド繊維を用いた撹拌、アグロバクテリア媒介形質転換、ＰＥＧ、デキストランスルファート、リポフェクタミン及び乾燥／抑制媒介形質転換方法などが含まれるが、これに制限されない。

本発明において、前記宿主細胞を用いた抗体又はその抗原結合断片を生産する方法は、具体的に（ａ）本発明の組み換えベクターに形質転換された宿主細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記宿主細胞で抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体又はこの抗原結合断片を発現させる段階を含むことができる。

前記抗体の製造で形質転換された宿主細胞の培養は、当業界に知られている適当な培地と培養条件によりなされ得る。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に従って容易に調整して用いることができる。細胞の培養は、細胞の成長方式により懸濁培養と付着培養、培養方法により回分式、流加式及び連続培養式の方法に区分される。培養に用いられる培地は、特定の菌株の要求条件を適切に満たさなければならない。

動物細胞培養において、前記培地は、多様な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。使用可能な炭素源の例には、ブドウ糖、蔗糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉及びセルロースのような炭水化物、大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油のような脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸のような脂肪酸、グリセロール及びエタノールのようなアルコール、そして酢酸のような有機酸があり、これらの炭素源は単独で又は組み合せて用いられてよい。

本発明で使用可能な窒素源は、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液（ＣＳＬ）及び大豆粕のような有機窒素源、並びにヨウ素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源を含んでよく、これらの窒素源は単独で又は組み合せて用いられてよい。前記培地には、リン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応されるナトリウム含有塩が含まれてよい。また、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄のような金属塩を含んでよい。その他、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体などが含まれてよい。

培養中に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方式で添加することにより、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。さらに、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素又は酸素－含有気体（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は、普通２０℃から４５℃、好ましくは２５℃から４０℃である。

前記生産方法は、（ｃ）前記宿主細胞で発現された抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体又はこの抗原結合断片を回収する段階を追加で含んでよい。前記形質転換された宿主細胞を培養して収得した抗体は、精製していない状態で用いられてよく、又は追加で多様な通常の方法、例えば、透析、塩沈澱及びクロマトグラフィーなどを用いて高純度に精製して用いられてよい。そのうち、クロマトグラフィーを用いる方法が最も多く用いられ、カラムの種類と順序は、抗体の特性、培養方法などにより、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどから選択することができる。

また他の側面において、本発明は、前記抗体又はこの抗原結合断片を含むＴＭ４ＳＦ４検出用組成物、これを含む検出用キット、及びこれらを用いたＴＭ４ＳＦ４抗原を検出する方法を提供する。

前記ＴＭ４ＳＦ４検出用組成物及びこれを含むキットは、ＴＭ４ＳＦ４に特異的に結合する抗体又はこの抗原結合断片を検出対象試料に接触させて抗原－抗体複合体を形成することにより、効果的にＴＭ４ＳＦ４を検出することができる。

本明細書において用いられる用語「抗原－抗体複合体」とは、試料中のＴＭ４ＳＦ４を発現する腫瘍又は癌細胞を確認するためのＴＭ４ＳＦ４とこれを認知する抗体の結合物を意味する。

ＴＭ４ＳＦ４検出用組成物及びこれを含むキットを用いたＴＭ４ＳＦ４抗原の定量方法は、抗原－抗体複合体の形成を確認して行われてよく、前記抗原－抗体複合体の形成の確認は、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫細胞化学法（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、放射免疫分析法（ＲＩＡ）、免疫沈澱分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、免疫拡散分析法（Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）又はタンパク質チップ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｉｐ）などによりなされてよいが、これに制限されはしない。前記酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）には、固体支持体に付着された抗原を認知する標識された抗体を用いる直接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着された抗原を認知する抗体の複合体で捕獲抗体を認知する標識された二次抗体を用いる間接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着された抗体と抗原の複合体で抗原を認知する標識されたまた他の抗体を用いる直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着された抗体と抗原の複合体で抗原を認知するまた他の抗体と反応させた後、この抗体を認知する標識された２次抗体を用いる間接的サンドイッチＥＬＩＳＡなど、多様なＥＬＩＳＡ方法を含む。

抗原－抗体複合体の形成を定性的又は定量的に測定可能とさせるラベルには、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、ミクロ粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、レドックス分子及び放射線アイソトープなどがあり、必ずこれに制限されるものではない。

前記酵素には、β－グルクロニダーゼ、β－Ｄ－グルコシダーゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼとＧＤＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ、グルコースオキシダーゼとルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸デカルボキシラーゼ、β－ラクタマーゼなどがあり、これに制限されない。
また他の側面において、本発明は、前記抗体又はこの抗原結合断片を含む、癌の予防又は治療用組成物を提供する。
前記抗体及びこの抗原結合断片は、先に説明したとおりである。

本発明の抗体又はこの抗原結合断片は、ＴＭ４ＳＦ４に高い親和度で結合して癌細胞の成長を抑制することができるため、抗体単独で又は通常の薬学的に許容される担体と共に、癌のような過増殖性疾患の治療、予防及び診断に用いられ得る。

本発明の組成物に適用される疾患である癌は、具体的に、肺癌、胃癌、大腸癌、直膓癌、三重乳癌、膠母細胞腫、膵臓癌、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮内膜癌、唾液腺癌又は甲状腺癌であり、より具体的には、肺癌、乳癌、肝癌、腎臓癌、胃癌、膵臟癌、脳癌であり得るが、これに制限されない。本発明における癌は、特にＴＭ４ＳＦ４の過発現、増幅、突然変異又は活性化による癌であり得るが、これに制限されない。すなわち、本発明の抗体又はこの結合断片を含む組成物は、ＴＭ４ＳＦ４の異常発現又は突然変異と関わりなく全ての癌腫に対して増殖抑制効果を有するので、本発明の医薬用途がＴＭ４ＳＦ４の発現様態又は突然変異の有無により制限されない。
前記組成物は、薬学的組成物、医薬外品組成物、健康食品用組成物の形態であってよい
。

本発明の癌の予防又は治療用組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでよい。前記「薬学的に許容可能な」の意味は、有効成分の活性を抑制せずとも、適用（処方）対象が適応可能である以上の毒性を有しないということであり、前記「担体」は、細胞又は組織内への化合物の付加を容易にする化合物として定義される。

本発明の前記薬学的組成物は、単独で又はある便利な担体などと共に混合して投与されてよく、そのような投与剤形は単回投与又は反復投与の剤形であってよい。前記薬学組成物は、固形製剤又は液状製剤であってよい。固形製剤には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤などがあるが、これに限定されるものではない。固形製剤には、担体、着香剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、滑剤、充填剤などが含まれてよいが、これに制限されるものではない。液状製剤としては、水、プロピレングリコール溶液のような溶液剤、懸濁液剤、乳剤などがあるが、これに限定されるものではなく、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤などを添加して製造することができる。例えば、散剤は、本発明の有効成分である多重不飽和脂肪酸のトリ－ヒドロキシ誘導体と乳糖、澱粉、微晶質セルロースなどの、薬剤学的に許容可能な適当な担体を単に混合することにより製造されてよい。顆粒剤は、本発明の前記多重不飽和脂肪酸のトリ－ヒドロキシ誘導体、薬学的に許容可能な適当な担体、及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの薬学的に許容可能な適当な結合剤を混合した後、水、エタノール、イソプロパノールなどの溶媒を用いた湿式顆粒法、又は圧縮力を用いた乾式顆粒法を用いて製造されてよい。また、錠剤は、前記顆粒剤をマグネシウムステアレートなどの薬学的に許容可能な適当な滑剤と混合した後、打錠機を用いて打錠することにより製造されてよい。

前記薬学的組成物は、治療すべき疾患及び個体の状態により、経口剤、注射剤（例えば、筋肉注射、腹腔注射、静脈注射、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、皮下注射、インプラント）、吸入剤、鼻腔投与剤、膣剤、直腸投与剤、舌下剤、経皮剤、外用剤などで投与されてよいが、これに制限されるものではない。投与経路により通常用いられ非毒性である、薬学的に許容可能な担体、添加剤、ビヒクルを含む適当な投与ユニットの剤形に製剤化されてよい。

前記薬学組成物は、毎日約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約１０ｇ／ｋｇが投与されてよく、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１ｇ／ｋｇの１日投与容量で投与されてよい。しかし、前記投与量は、前記混合物の精製の程度、患者の状態（年齢、性別、体重など）、治療している状態の深刻性などにより多様であり得る。必要に応じて、便利性のために１日の総投与量を１日間数回に分けて投与されてよい。
また、本発明は、前記抗体又はこの抗原結合断片を含む、癌幹細胞成長抑制用組成物を提供する。

本発明における「癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＣＳＣ）」とは、多様な癌細胞に分化することができる能力を有した未分化細胞を意味する。癌幹細胞は、悪性腫瘍組織内に１～２％程度に存在し、正常の幹細胞の特性である自己複製能力と多分化能を有しているが、自己調節機能に異常があって細胞分裂活性化で細胞数が増加するようになり、自ら悪性腫瘍細胞に分化する。このような癌幹細胞の特徴により、抗癌治療を介して一般の癌細胞は除去されるが癌幹細胞は生き残り、生き残った一部の癌幹細胞により癌の再発及び転移がなされるものと知られている。

具体的に、本発明の癌幹細胞は、癌幹細胞のマーカー中の１つであるＡＬＤＨ１（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １）タンパク質が過剰発現されるか、タンパク質活性が陽性である癌細胞であってよい。

本発明では、前記抗体又はこの抗原結合断片が癌幹細胞を選択的に抑制し、特に、抗癌治療抵抗性が高い癌幹細胞が含まれている癌細胞群を死滅させることにより、優れた抗癌効果を得ることができることを確認した。本発明の抗体又はこの抗原結合断片は、癌幹細胞の自己再生能力、浸潤能力及び移住能力を減少させることにより、癌幹細胞の成長を抑制することができる。前記抗体又はこの抗原結合断片は、これに制限されるものではないが、癌幹細胞の特性を有する癌を予防又は治療するのに用いることができる。

癌幹細胞の特性を有する癌は、既存の抗癌治療に対して抵抗性を示してその予後が良くないので、既存の抗癌治療とは異なる治療が適用されなければならない。例えば、同一の癌腫の患者であるとしても、その癌腫が癌幹細胞の比率が高い場合に該当するならば、この患者は抗癌剤投与又は放射線治療のような既に知られている抗癌治療では癌治療の効果を得ることができなくなる。したがって、同一種類の癌であるとしても、癌病変部位の細胞で癌幹細胞の比率が高い場合には、既存の抗癌治療と異なる新たな治療法を適用するのが非常に重要である。

本発明における「癌幹細胞特性を有する癌」とは、癌をなす細胞群で癌幹細胞の比率が高い癌を意味する。一般的な癌細胞中の癌幹細胞の比率が約１％以上５％未満程度であることを考慮するとき、例えば、癌をなす細胞群で癌幹細胞の比率が５％以上、１０％以上、３０％以上、５０％以上、７０％以上である場合を「癌幹細胞特性を有する癌」と定義することができ、前述したとおり、既存の抗癌治療に対して抵抗性を示して抗癌治療の予後が良くないことを特徴とすることができる。

具体的に、本発明における前記「癌幹細胞特性を有する癌」は、ＡＬＤＨ１を過剰発現する癌であってよい。前記ＡＬＤＨ１を過剰発現する癌は、ＡＬＤＨ１を発現するかその活性が陽性である癌幹細胞の比率が一般的な癌より相対的に高い癌であってよい。

具体的に、前記「ＡＬＤＨ１を過剰発現する癌」は、肺癌、乳癌、肝癌、腎臓癌、胃癌、膵臟癌、脳癌からなる群から選択される何れか１つ以上のものであってよいが、これに制限されない。

前記癌の予防又は治療は、癌幹細胞の再生能、成長能、浸潤能又は移動能を減少させることを介し、癌治療の途中又は癌治療後の癌化学耐性、癌再発、又は癌転移を予防又は治療するものであってよい。
また他の側面において、本発明は、前記抗体又はこの抗原結合断片を有効成分として含む放射線抗癌治療補助用組成物を提供する。

本発明の前記組成物は、前記抗体又はこの抗原結合断片を癌関連細胞の放射線敏感性の向上のための有効成分として含む。抗体及びこの抗原結合断片に対する内容は、前述したとおりである。

本発明の前記癌関連細胞は、癌をなしている細胞であって、正常の細胞に比べて形状が不均一であり、無限定に増殖し、周辺細胞との結束力が弱い特徴を有するものであり得る。具体的に、前記癌関連細胞は、癌細胞又は癌幹細胞であってよく、具体的に癌幹細胞であってよい。

前記癌幹細胞は、多様な癌細胞に分化することができる能力を有した未分化細胞であってよく、具体的に、ＡＬＤＨ１を発現するか活性が陽性である癌細胞であってよい。本発明における前記癌幹細胞は、放射線の照射によっても細胞増殖が抑制されず、自己再生能力が低下せず、移動及び浸潤能力が抑制されない特徴を有するものであり得る。

また、前記癌関連細胞は、放射線に対する敏感性が低いもの、すなわち放射線治療に対する抵抗性が高いものであってよく、実質的に放射線に対する敏感性がないので、放射線の照射による抗癌治療が不可能なものであってよい。

前記抗癌は、放射線の照射、外科的手術及び化学療法などを介して癌関連細胞の増殖の抑制、転移及び浸潤の抑制、細胞の死滅を誘導することであってよい。本発明における前記抗癌は、放射線の照射と共に併用して前記抗体又はこの抗原結合断片を投与することであってよい。このように、抗体又は抗原結合断片を放射線の照射と共に併用して投与する場合、前記抗体又は抗原結合断片により癌関連細胞の放射線敏感性が向上され、放射線の照射による抗癌治療効果を最大化させることができ、ひいては、癌の再発及び転移を防ぐことができる。

以下、本発明を実施例及び実験例により詳しく説明する。
但し、下記実施例及び実験例は本発明を具体的に例示するものであり、本発明の内容が下記実施例及び実験例によって限定されはしない。

［実施例１］
ＴＭ４ＳＦ４－抗原に対するヒト単一クローン抗体の生成
＜１－１＞ ヒトＴＭ４ＳＦ４膜タンパク質抗原特異抗体の製造のためのエピトープ配列の選別
ＴＭ４ＳＦ４抗原が媒介する癌幹細胞特性関連の信号伝達体系を抑制することができるＴＭ４ＳＦ４特異反応抗体を製造するため、２０２個のアミノ酸からなる膜タンパク質であるＴＭ４ＳＦ４抗原構造から細胞外に露出され、抗体誘導能が高いものと予想される部位を選別しようとした。

先ず、タンパク質配列分析によって、膜タンパク質であるＴＭ４ＳＦ４は、細胞外に露出される２個のループ構造（アミノ酸配列３１－４５及び１１５－１５８）を含んでいることを確認した。そのうち、１２４番、１５６番目のアミノ酸であるアスパラギンがグリコシル化部位であり、１２０番、１４６番目のアミノ酸であるシステインの間にジスルフィド結合が形成されることを確認した（図１）。次に、抗原性予測プログラムを活用し、ＴＭ４ＳＦ４タンパク質配列を分析した。全体配列に対するＫｏｌａｓｋａｒ ａｎｄ Ｔｏｎｇａｏｎｋａｒ法を用いた抗原性分析の結果、４－３３、５３－６７、７１－８０、９２－１１２、１２７－１３３、１４６－１９８番目の配列が抗原性の高い部位として予測された（表１）。

このような結果を総合し、本発明では細胞外の露出部位でありながら抗原性が高く、グリコシル化又はジスルフィド結合がない部位（すなわち、１２６－１４０番目のアミノ酸配列からなる「ＴＷＧＹＰＦＨＤＧＤＹＬＮＤＥ」）を抗体生成のための抗原エピトープとして選定した（図１ａ）。

＜１－２＞ 抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体生成Ｂ細胞ハイブリドーマクローンの選別
選定した抗原配列のペプチドのアミノ末端にシステインを付加した配列のペプチド「ＣＴＷＧＹＰＦＨＤＧＤＹＬＮ ＤＥ」を合成し、Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣを用いてＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）にコンジュゲーションした。準備された抗原は、マウス４匹に一般的な免疫化過程により３回注射し、免疫化の効果で血液中に抗原特異反応抗体が増加したか否かをＥＬＩＳＡで確認した。最終免疫化後に抗体の生成が確認されたマウスの脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）を採取し、マウスのミエローマ（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞と融合して抗体生成Ｂ細胞ハイブリドーマ細胞を確保した。融合細胞株の培養にＨＡＴ選別培地を用いて成功的に融合されたＢ細胞ハイブリドーマを多数確保し、ハイブリドーマ細胞選別の一般的なプロトコールにより培養しながら、細胞培養液中で抗原特異抗体をＥＬＩＳＡ法で検査した。ＥＬＩＳＡには、免疫化に用いていた抗原ペプチドコンジュゲートＢＳＡと、対照群としてＢＳＡとをコーティング抗原（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）として用いた。

その結果、ＢＳＡに対する反応に比べ、ＴＭ４ＳＦ４ペプチドコンジュゲートＢＳＡに対する反応が遥かに高い５個の抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体生成Ｂ細胞ハイブリドーマクローンＥＣＬ－２Ｂ７、ＥＣＬ－４Ｃ１、ＥＣＬ－８Ｅ２、ＥＣＬ－８Ｅ５、ＥＣＬ－１２Ａ８を選別した（表２）。

３次にわたった限界希釈培養法（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）による細胞クローン選別を行って抗体生成細胞を確定し、これらが生成する抗体グロブリンのサブタイプがＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂなどであり、カッパ型の軽鎖からなることをアイソタイピングキットで検証した（表３）。

＜１－３＞ 新規抗体の精製
新規抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｖｉｖｏ効能の検証のために、ＥＣＬ－２Ｂ７などのＢ細胞ハイブリドーマクローンを大量培養し、培養液から抗体を精製した。

具体的に、新規抗体を精製するため、各Ｂ細胞ハイブリドーマを１０％のウシ血清が含まれたＤＭＥＭ培地で３～４日間培養し、十分に抗体が生成した後に分泌されるように準備し、細胞培養液を収去して抗体の精製に用いた。収去した細胞培養液に亜硫酸アンモニウムを５０％の濃度で処理し、１０，０００ｘｇで３０分間遠心分離して抗体を沈澱させた後、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に溶かした。抗体のアイソタイプがそれぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂであることを確認したので、これらに対する親和度が高いＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ－アガロースを用いて製品使用のプロトコールにより精製した。精製した抗体はブラッ
ドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法及びＥＬＩＳＡ法で定量し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで純度を確認した。

その結果、抗体は、親和度クロマトグラフィー法で９９％程度に純度高く精製され、細胞培養液２００ｍＬで各抗体当りおおよそ１ｍｇ水準で確保された。各抗体の重鎖（ＩｇＧ－ＨＣ）及び軽鎖（ＩｇＧ－ＬＣ）が５５ｋＤａ、２６ｋＤａの位置で確認され、ＩｇＧタイプの抗体であることを確認し、還元されていないＩｇＧは、１７０ｋＤａ上側に位置するバンド（ＩｇＧ）と確認された。

［実施例２］
新規の抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体の抗原特異反応性の確認
＜２－１＞ 酵素結合免疫吸着検査法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）による新規抗体の抗原特異反応の検証

新規抗体の抗原特異反応性を確認するため、ＴＭ４ＳＦ４タンパク質の細胞外大ループドメイン（ＥｘｔｒａＣｅｌｌｕｌａｒ Ｌａｒｇｅ ｌｏｏｐ ｄｏｍａｉｎ：ＥＣＬ）中、一部ペプチド配列である１２６－１４０番目のアミノ酸を結合させたウシ血清アルブミン（ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）抗原（ＴＭ４ＳＦ４－ｐｅｐｔｉｄｅ－ＢＳＡ）を用いた。新規抗体の抗原親和度も、免疫源（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）を用いたＥＬＩＳＡで測定して抗原結合能に優れた抗体を選別した。

具体的に、ＴＭ４ＳＦ４－ｐｅｐｔｉｄｅ－ＢＳＡ抗原に対する抗体反応性を確認するため、抗原をＰＢＳに希釈して９６－ｗｅｌｌ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に分株し、接着を誘導して抗原がコーティングされたｐｌａｔｅを準備した。抗原は、５００ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度から始めて１／５ずつ順次希釈し、希釈された１００μｌの抗原をｐｌａｔｅの個別ｗｅｌｌに添加し、４℃で１６時間以上抗原がｐｌａｔｅ ｗｅｌｌの表面にコーティングされるように誘導した。抗原のコーティング後、ｗｅｌｌ当り３００μｌの洗浄溶液ＴＢＳＴ（０．１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ－２０を含むＴＢＳ）で２回洗浄してコーティングされていない残存抗原を除去し、ブロッキング溶液で脱脂乳溶液（５％（ｗ／ｖ）ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ／ＴＢＳＴ）を３００μｌずつ添加して常温で２時間反応させ、抗原のコーティング後に残った部位をブロッキングした。新規の抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体は、ブロッキング溶液に２００ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度から始めて１／３ずつ順次希釈して準備し、希釈された抗体をブロッキングが完了したｐｌａｔｅにｗｅｌｌ当り１００μｌずつ添加した後、３７℃で５０ｒｐｍの速度で２時間撹拌しながら抗原／抗体の結合を誘導した。反応後、溶液を除去し、３００μｌ／ｗｅｌｌの洗浄溶液で５回洗浄し、抗原に結合していない抗体を除去し、抗原に結合された抗体は、ブロッキングバッファーに１：２５００の比率で希釈された二次抗体であるマウス抗－ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を処理して検出した。二次抗体もやはり３７℃で５０ｒｐｍの速度で９０分間撹拌して反応させ、次いで、洗浄溶液で６回洗浄して抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体に結合されていない二次抗体を除去した後、ＨＲＰの基質としてＴＭＢ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて発色反応し、４５０ｎｍで吸光度を測定して抗原－抗体反応を定量化した。

その結果、前記実施例１で製造した本発明の抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体の５種、ＥＣＬ－２Ｂ７、ＥＣＬ－４Ｃ１、ＥＣＬ－８Ｅ２、ＥＣＬ－８Ｅ５、ＥＣＬ－１２Ａ８は、いずれもペプチド抗原に対して優れた抗原結合能を有することが確認され、これらのうち、ＥＣＬ－２Ｂ７、ＥＣＬ－４Ｃ１、ＥＣＬ－１２Ａ８抗体は特に、より一層高い抗原親和力を示すものと確認された（図３）。

＜２－２＞ 表面プラズモン共鳴法（ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎ
ｃｅ、ＳＰＲ）による新規抗体の分子間相互作用の検証
新規抗体の抗原特異反応性を確認するため、実施例２－１で用いたＴＭ４ＳＦ４－ｐｅｐｔｉｄｅ－ＢＳＡ（Ｂｉｏｔｉｎ－ＧＳＡＧＧＳＴＷＧＹＰＦＨＤＧＤＹＬＮＤＥ）を抗原として用い、ＥＣＬ－２Ｂ７、ＥＣＬ－４Ｃ１及びＥＣＬ－１２Ａ８抗体を処理して測定した。

具体的に、各抗体のＴＭ４ＳＦ４－ｐｅｐｔｉｄｅ－ＢＳＡ抗原に対する抗体反応性を確認するため、１Ｍ Ｎａｃｌと５０ｍＭ ＮａＯＨ試薬を用いてセンサーチップ（ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ）に存在する表面タンパク質を除去した。Ｂｉｏｔｉｎ－ｐｅｐｔｉｄｅ（ｌｉｇａｎｄ）の最適化された固定（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）条件を見出すため、リガンドの濃度を１０ｐＭ～１００ｎＭで固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を試みた。固定後、抗体ＥＣＬ－２Ｂ７、ＥＣＬ－４Ｃ１及びＥＣＬ－１２Ａ８を３２ｎＭの濃度で流して抗原との結合を確認し、再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を繰り返してべースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）の安定化を試みた。１時間以上が経た後、安定化されたべースラインに基づいてＥＣＬ－２Ｂ７、ＥＣＬ－４Ｃ１及びＥＣＬ－１２Ａ８のアナライト（ａｎａｌｙｔｅ）を分析した。

その結果、グラフが増加する結合区間が、時間の経過につれて増加していることを観察し、４８０秒に結合を抑制させたときに結合能力が減少していることを確認した。
これを介し、ＥＣＬ－２Ｂ７、ＥＣＬ－４Ｃ１及びＥＣＬ－１２Ａ８抗体がペプチド抗原に対して結合能力が大きい抗体であることが分かる。

＜２－３＞ 免疫沈降後、ウェスタンブロッティング（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ／ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）による新規抗体の抗原特異反応の検証

ＴＭ４ＳＦ４ペプチド抗原に対して高い反応性を見せた新規抗体が細胞ターゲティングに活用されるためには、細胞で発現されるＴＭ４ＳＦ４抗原の３次構造に対する反応性が高くなければならない。これを検証するために、細胞発現ＴＭ４ＳＦ４タンパク質抗原に対する新規抗体の特異反応を検証した。Ｆｌａｇ－エピトープが標識されたＴＭ４ＳＦ４タンパク質発現ベクター（ｐＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４）を製造し、これをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させた。これらの細胞破砕液に対して新規の抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体で免疫沈降法を実施し、ウェスタンブロッティング後、ＦＬＡＧ－標識を検出して新規抗体で免疫沈降された抗原がＴＭ４ＳＦ４であることを確認した。

具体的に、ＴＭ４ＳＦ４タンパク質の全体遺伝子配列を、ヒト肺癌細胞であるＡ５４９細胞のｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いてＰＣＲ反応で準備し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素配列を用いてｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ^ＴＭ－７．１ベクター（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）にクローニングし、細胞内でＴＭ４ＳＦ４タンパク質がＮ－末端に３個のＦＬＡＧタグ（３ｘ－ＦＬＡＧ ｔａｇ）と共に発現されるベクター（３ｘＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４ ｖｅｃｔｏｒ：ｐＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４）を構築した。ｐＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４の細胞内発現は、ヒト胎児腎細胞（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｔ）に遺伝子伝達感染（ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して誘導した。先ず、１００ｍｍの細胞培養ｐｌａｔｅに６×１０^５／ｗｅｌｌ個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地に１６時間培養し、３ｘＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４タンパク質を発現させるための細胞を準備した。準備された細胞の培養液を除去し、３６μｇの３ｘＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４ベクターｐＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４と同一量のポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を１ｍＬのＤＭＥＭ（５％ＦＢＳ）培養液に混合し、室温で１５分間反応させた後、９ｍＬの培養液が入っている細胞に処理して遺伝子伝達感染させた。１５時間後、細胞培養液を除去し、再び１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液に４８時間培養して３ｘＦ
ＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４タンパク質の発現を誘導し、免疫沈降法とウェスタンブロッティングで新規抗体に対する特異反応性を検証した。遺伝子伝達感染した細胞を、ＲＩＰＡバッファー（１％ ＮＰ４０、０．５％ Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ ＳＤＳ、ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、ｐｒｅｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ／ＰＢＳ）に溶かし、２１振幅で５秒間音波破砕した後、４℃で１３，０００ｒｐｍで遠心分離して細胞タンパク質溶液を得た。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法でタンパク質定量を実施し、５００μｇのタンパク質を５μｇの新規抗体又は対照群抗体であるマウス抗－ＧＡＰＤＨ抗体と４℃で１６時間混合し、抗体とタンパク質の抗原／抗体の結合を誘導し、３０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズを追加して再び４時間反応させることにより抗体をビーズに結合させた。非特異タンパク質を除去するため、ビーズをＲＩＰＡバッファーで６回洗浄した後、還元剤が含まれたＳＤＳサンプルバッファーを添加して９５℃で沸騰し、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルでタンパク質を展開した。展開されたタンパク質はＰＶＤＦ膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移動させ、タンパク質移動の完了した膜は、５％（ｗ／ｖ）脱脂乳を含んだＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）ブロッキング溶液で室温で１時間ブロッキ
ング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）し、ブロッキング溶液に希釈した抗－ＦＬＡＧ抗体（Ｃｅｌｌ
ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を室温で２時間処理した後、ＴＢＳＴで５分間８回撹拌し洗浄して非特異抗体を除去した。３ｘＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４タンパク質に結合された抗－ＦＬＡＧ抗体は、二次抗体（ウサギ抗－ＩｇＧ－ＨＲＰ）を処理した後、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）方法で検出した。

その結果、予測された３ｘＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４タンパク質の分子量は２４．８ｋＤａであるが、３ｘＦＬＡＧ又は３ｘＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４タンパク質を発現した細胞破砕液に対する抗－ＦＬＡＧ抗体反応を確認した結果（図５のＡのライン１及び２のｉｎｐｕｔ試料）、２６～３０ｋＤａの位置で特異反応が確認され、３４ｋＤａ及び９５ｋＤａ以上の分子量位置でも特異反応が確認された。ＴＭ４ＳＦ４タンパク質は、システイン残基を用いて周辺のタンパク質と共有結合を形成するテトラスパニンの特性を有することは既に確認されている事実である。高い分子量のタンパク質でＦｌａｇ標識が対照群と異なって確認される理由は、ＴＭ４ＳＦ４タンパク質がシステイン残基により結合体を形成したためであると判断される。免疫沈降のために用いられた新規抗体は、対照群ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ^ＴＭ－７．１ベクター（ｐＦＬＡＧ）が遺伝子伝達された細胞破砕液（試料１）ではＦＬＡＧタンパク質タグを免疫沈降させることができなかった一方、３ｘＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４ベクター（ｐＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４）が遺伝子伝達された細胞破砕液（試料２）では、２６ｋＤａ以上の位置で３ｘＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４を特異的に免疫沈降検出できることを確認し、これによって細胞に発現されるＴＭ４ＳＦ４に対する新規抗体の特異反応を検証した（図５のＡ）。また、２６ｋＤａの３ｘＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４が確認された試料では、９５ｋＤａ以上の分子量のタンパク質もともに免疫沈降検出されたことを確認し、これらがＴＭ４ＳＦ４タンパク質の多重結合体であることを立証した。２６ｋＤａのＦＬＡＧ－ＴＭ４ＳＦ４下側に確認されるタンパク質バンドの場合、免疫沈降の際に陰性対照群の免疫沈降抗体として用いたマウス抗－ＧＡＰＤＨ抗体（ｍｓＩｇＧ）を処理した試料でもともに検出されることからみて、抗－ＦＬＡＧ抗体の非特異結合と判断される（図５のＡ、ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ Ａｎｔｉｇｅｎ）。免疫沈降の際に用いた抗体はいずれもマウス由来の抗体であって、ＰＶＤＦ膜にマウス抗－ＩｇＧ－ＨＲＰを処理して検出することにより、免疫沈降の際に同一量の抗体が用いられたことを確認した（図５のＢ）。

＜２－４＞ 免疫蛍光細胞染色（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）による新規抗体の細胞面抗原特異反応の検証
新規抗体が細胞面発現ＴＭ４ＳＦ４を特異的に認識することができるのか確認するため
、細胞面発現ＴＭ４ＳＦ４に対する結合能を免疫蛍光法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）で検証した。

具体的に、ＴＭ４ＳＦ４の細胞内発現位置を確認するため、ＴＭ４ＳＦ４のＮ－末端に緑色の蛍光タンパク質であるＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を標識化してＴＭ４ＳＦ４が細胞内発現時に緑色の蛍光を帯びるように遺伝子導入ベクターを準備した。ＴＭ４ＳＦ４タンパク質の全体遺伝子配列をヒト肺癌細胞であるＡ５４９細胞のｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いてＰＣＲして準備し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素配列を用いてｐＥＧＦＰ－Ｃ２ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）にクローニングし、細胞内でＴＭ４ＳＦ４タンパク質がＮ－末端にＥＧＦＰタグ（ＥＧＦＰ ｔａｇ）と共に発現されるベクターを構築した（ＥＧＦＰ－ＴＭ４ＳＦ４ ｖｅｃｔｏｒ）。ＥＧＦＰ－ＴＭ４ＳＦ４の細胞内発現は、ヒト胎児腎細胞（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｔ）に遺伝子伝達感染（ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して誘導した。先ず、カバースライドを入れた細胞培養６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０^５／ｗｅｌｌ個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地に１６時間培養し、ＥＧＦＰ－ＴＭ４ＳＦ４タンパク質を発現させるための細胞を準備した。準備された細胞の培養液を除去し、６μｇのＥＧＦＰ－ＴＭ４ＳＦ４ベクターと同一量のポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を４００μｌのＤＭＥＭ（５％ ＦＢＳ）培養液に混合して室温で１５分間反応させた後、１．６ｍＬの培養液が入っている細胞に処理して遺伝子伝達感染させた。１５時間後、細胞培養液を除去し、再び１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液に４８時間培養してＥＧＦＰ－ＴＭ４ＳＦ４タンパク質の発現を誘導し、新規抗体と細胞発現ＴＭ４ＳＦ４との反応を免疫蛍光法で確認した。免疫蛍光法の過程は、次のとおりである。ＥＧＦＰ－ＴＭ４ＳＦ４タンパク質発現の誘導後、ｐｌａｔｅの培養液を全て除去し、２％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を含んでいる培養液を室温で２分間前処理し、次いで、ＰＢＳに混合された２％のパラホルムアルデヒド固定液を室温で１５分間撹拌処理して細胞を固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）させた。細胞固定の過程後、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ洗浄溶液で５分間３回洗浄して残存固定液を除去し、抗体の非特異結合を予防するため細胞をブロッキング溶液（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ）で３０分間ブロッキングした。ブロッキング溶液に５０μｇ／ｍＬの濃度で新規抗体を希釈して室温で１時間処理して抗体－抗原結合を誘導し、次いで、洗浄溶液で５分間３回洗浄して抗原に結合していない残存の抗体を除去した。抗原と結合された抗体は、ブロッキング溶液に１：１０００の比率で希釈されたマウス抗－ＩｇＧ－Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＲＤＭ）二次抗体を１時間処理し、洗浄溶液を再び５分間３回処理した後、ＤＡＰＩ溶液で５分間細胞核を染色して共焦点レーザー顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で確認した。ＥＧＦＰの緑色蛍光を測定してＥＧＦＰ－ＴＭ４ＳＦ４発現を確認し、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅの赤色蛍光を測定して抗体反応位置を確認した。

また、ＴＭ４ＳＦ４が過剰発現される肺癌細胞であるＡ５４９にｓｉＲＮＡを処理してＴＭ４ＳＦ４の発現を抑制した場合、新規抗体の反応が減少するのか確認した。ＴＭ４ＳＦ４特異ｓｉＲＮＡ［ｓｅｎｓｅ，５’－ｇｃｃ ｕｃｕ ｃａａ ｕｇｕ ｇｇｕ ｕｃｃ ｃｕｇ ｇａａ ｕ－３’（配列番号３０）；ａｎｔｉｓｅｎｓｅ，５’－ａｕｕ
ｃｃａ ｇｇｇ ａａｃ ｃａｃ ａｕｕ ｇａｇ ａｇｇ ｃ－３’（配列番号３１）］又は対照群Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉＴＭＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｅｄｉｕｍ ＧＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＡ５４９細胞内に転移させ、４８時間後に収去して１×１０^５個の細胞をカバーグラスが準備されたディッシュに２４時間培養した。培養された細胞の培養液を除去した後、前述したとおり、パラホルムアルデヒド溶液で細胞を固定して新規抗体を反応させた。抗原と結合された抗体は、ブロ
ッキング溶液に１：１０００の比率に希釈されたマウス抗－ＩｇＧ－ＦＩＴＣ二次抗体を１時間処理し、洗浄溶液を再び５分間３回処理した後、ＤＡＰＩ溶液で５分間細胞核を染色して蛍光顕微鏡で確認した。

その結果、図６のＡでみられるとおり、発現された緑色のＥＧＦＰ信号を介してＥＧＦＰ－ＴＭ４ＳＦ４タンパク質がＨＥＫ２９３細胞で発現されるときに細胞の表面に位置していることを確認し、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅの赤色蛍光信号で検出される新規抗体－抗原反応を細胞面を含んだ細胞内部で確認することができた。併せて、赤色と緑色の２つの信号を重ねてみると（ｍｅｒｇｅ）、２つの信号が同一位置に存在して黄色を帯びる部位が細胞膜に位置することを確認することができた。

これにより、新規抗体の５種のいずれも細胞面位置のＴＭ４ＳＦ４タンパク質と結合することを検証し、そのうち、ＥＣＬ－２Ｂ７、ＥＣＬ－４Ｃ１、ＥＣＬ－１２Ａ８の反応性がさらに高いことを確認した。Ａ５４９細胞は、ＴＭ４ＳＦ４発現が高い細胞であって、新規抗体（ＥＣＬ－２Ｂ７、ＥＣＬ－４Ｃ１、ＥＣＬ－１２Ａ８）の細胞面反応が高いことを確認することができた（図６のＢ）。しかし、ｓｉ－ＴＭ４ＳＦ４を処理してＴＭ４ＳＦ４の発現を抑制した場合に抗体反応を確認することができず、このため、新規抗体の抗原特異反応をもう一度確認した。

［実施例３］
抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体による癌幹細胞の成長抑制効果の確認
ＴＭ４ＳＦ４抗原反応特異性が確認された新規抗体の癌幹細胞特性抑制の効果を確認するため、Ｓｐｈｅｒｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｓｓａｙ、そして、Ｉｎｖａｓｉｏｎ及びＭｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙを実施した。
＜３－１＞ 癌幹細胞の分離及び培養

具体的に、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞は、３７℃の加湿された５％のＣＯ_２条件で培養した。細胞は、１０％の胎児ウシ血清とストレプトマイシン（１００ｇ／ｍｌ）が補充されたＲＰＭＩで培養した。これらのうち、Ａ５４９－ＡＬＤＨ１^＋癌幹細胞を分離し、その後、実験に用いた。

＜３－２＞ 新規抗体による癌幹細胞の自己再生（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）能力抑制効果の確認
Ａ５４９－ＡＬＤＨ１^＋癌幹細胞をＤＭＥＭ－Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ：２０ｎｇ／ｍＬ）、ｂａｓｉｃ
ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（２０ｎｇ／ｍＬ）及び２％のＢ２７ ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１：５０）を含む癌幹細胞許容培地に培養した。細胞培養器としては、ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（コーニング社製）を用いた。培養器ウェル当り１～２個の細胞を添加し、２４時間安定化させた後、細胞培養液に新規抗体又はシグマ社製の抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体を３μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ処理した。処理後、３７℃の加湿された５％のＣＯ_２細胞培養器で培養を行い、１０日後、癌幹細胞を対象に顕微鏡を用いて球状形成の個数及び大きさを確認した。

その結果、図７に示されているとおり、本発明の新規抗体を処理した場合、公知の抗体を処理した場合に比べて球状形成の個数及び大きさが顕著に減少することを確認した。

前記のような結果から、癌幹細胞の細胞膜に存在するＴＭ４ＳＦ４の抑制を介して癌幹細胞の球状形成能力を効果的に抑制することができ、これから癌幹細胞の自己再生能力が阻害されたことが分かる。

＜３－３＞ 新規抗体による癌細胞の浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）及び移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）能力抑制効果の確認
Ａ５４９細胞（５ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を、０．２ｍｌの無血清ＲＰＭＩ培地に懸濁した。浸潤分析のためには、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）１０ｍｇ／ｍｌにプレコーティングされた８μｍのポアサイズのトランスウェルチャンバ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒ）の上部ウェル（Ｕｐｐｅｒ ｗｅｌｌ）に細胞を分株した。準備した上部ウェルは、０．８ｍｌの血清含有ＲＰＭＩ培地で満たされた下部ウェルチャンバの上にかけておいて培養し、３７℃で４８時間培養後、上部フィルターの外側に移動した浸湿細胞を染色して分析した。移動分析時には、浸潤実験時に用いたインサート（Ｉｎｓｅｒｔ）にマトリゲルがコーティングされていないチャンバを用いた。抗体は、上部ウェルに３μｇ／ｍＬの濃度で細胞分株と同時に添加した。

その結果、図８に示されているとおり、本発明の新規抗体を処理した場合、公知の抗体を処理した場合に比べて、移動及び浸潤が起こった癌幹細胞の数が顕著に減少したことを確認した。
これにより、本発明の新規抗体が癌細胞の浸潤能及び移動能を効果的に抑制できることが分かる。

［実施例４］
抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体による癌細胞の放射線に対する抵抗力抑制効果の確認
Ａ５４９細胞及びＨｕｈ７細胞を、それぞれ３５ｍｍのディッシュに１×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで塗布した。２４時間後、細胞培養液に新規抗体（ＥＣＬ－２Ｂ７、ＥＣＬ－４Ｃ１、ＥＣＬ－１２Ａ８）又はシグマ社製の抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体を３μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ処理した。処理後、７日間、３７℃の加湿された５％のＣＯ_２細胞培養器で培養した。培養液を除去したプレートに０．５％のクリスタルバイオレット試薬で１０分間染色した後、数回ＰＢＳで洗浄して顕微鏡で確認した。放射線照射の敏感性を確認するためには、Ａ５４９細胞に６０Ｃｏ γ－ｒａｙ源を用いて総放射線量６Ｇｙ（線量率（ｄｏｓｅ ｒａｔｅ）：ｘ／時間）を照射してプレートに塗布した後、２４時間後に抗体を処理した。

その結果、図９に示されているとおり、公知の抗体を処理した際に生き残った細胞の群集より、本発明の新規抗体を処理した際に生き残った細胞の群集が顕著に少なく形成されることを確認した。また、肺癌細胞だけでなく肝癌細胞でも類似の効果が現れることを確認した。

これにより、本発明の新規抗体を放射線治療効果を増加させる方法として活用することができ、肺癌細胞だけでなく肝癌細胞においても放射線治療効果を増加させる方法として活用できることが分かる。

［実施例５］
抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体の癌細胞死滅誘導に関する細胞内信号伝達過程の確認
本発明の新規抗体の癌細胞死滅誘導に関与する細胞内信号伝達過程を検証するため、ＴＭ４ＳＦ４関連の信号伝達過程を確認し、抗体によりこれらが影響を受けるのかを調べた。

具体的に、先行研究の結果から確認したとおり、ＴＭ４ＳＦ４の発現により増加する信号伝達過程の結果物であるＩＧＦ１、ＩＬ１ｂｅｔａ、Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎの発現が新規抗体の処理により抑制されるのかについて、タンパク質の発現をウエスタンブロット分析で確認した。ウエスタンブロット実験のために各細胞を集めてタンパク質溶解（ｌｙ
ｓｉｓ）溶液を５０μｌずつ入れ、４℃で３０分間反応した後、１３０００ＲＰＭの４℃の遠心分離機でペレットと上澄み液を分離した。前記上澄み液をタンパク質定量キット（ｓｉｇｍａ）を用いてそれぞれのタンパク質を４０μｇずつＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングした。その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングされたタンパク質をニトロセルロースメンブレンに移動させた後、ＢＳＡバッファーで３０分常温で反応させて他の抗体が結合できないようにしてから、一次抗体ＴＭ４ＳＦ４、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ３（Ａｂｃａｍ）、β－ｃａｔｅｎｉｎ、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ４（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とＣＤ４４、β－ａｃｔｉｎ（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を１：１０００に希釈したＰＢＳバッファーに４時間反応した後、再び二次抗体抗－Ｒａｂｂｉｔ又は抗－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇｓ－ＨＲＰ（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を１：１００００に希釈したＰＢＳバッファーに１時間反応させた。その後、ＰＢＳで５回ニトロセルロースメンブレンを洗浄してからＥＣＬ検出溶液で反応した後、フィルムに感光させた。

その結果、図１０に示されているとおり、抗体の処理後、癌幹細胞のタンパク質タグであるＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＣＤ４４が抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体を処理したとき減少し、癌幹細胞の自己再生に関与するβ－ｃａｔｅｎｉｎとＯｃｔ４の発現も減少していることを観察した。また、癌の悪性化に関与する信号伝達機転のうち、ＩＧＦ１Ｒβ信号伝達機転が関与していることを観察した。これは、ＩＧＦ１Ｒβ信号を介して癌幹細胞の悪性化を調節していることが分かった。これにより、本発明の新規抗体による腫瘍抑制の効果及び放射線敏感性向上の効果は、癌幹細胞の死滅、自己再生能力の抑制、浸潤及び移動能の抑制による効果であることが分かる。

［実施例６］
新規抗体の癌細胞死滅効能の確認のためのマウスのゼノグラフトアッセイ（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ａｓｓａｙ）
新規抗体の癌細胞死滅の効能を生体条件で確認するため、マウスに肺癌細胞ゼノグラフト（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）を形成させて新規抗体を注入し、癌細胞成長の抑制／又は死滅の可否を検証した。

具体的に、肺癌ゼノグラフトを形成させるため用いたマウスはＢａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅであって、６週齢に右側後足部位の皮下に１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅのＡ５４９細胞を注入した。注入後、癌組織の大きさが１００ｍｍ^３の大きさに成長したとき、ＴＭ４ＳＦ４抗体を癌組織に直接注射して癌組織の大きさを２～３日の間隔で測定した。注射した抗体はマウス当り総８０μｇであって、各注射当り１３．３３３μｇ／ｍｏｕｓｅで６回に分けて２～３日の間隔で注射した。全体の実験は、癌細胞の注射後、４９日目まで進められた。癌組織の大きさは、癌組織の直径を用いて短軸^２×（長軸／２）の計算法で計算した。

癌組織の大きさにより抗体の投与時期を異ならせた２回の実験を実施した。１回目の実験は、癌細胞を注入してから４週後、癌組織の大きさが３０ｍｍ^３以上となったときに抗体を投与し始めた。

その結果、抗体を投与したグループの癌組織は成長が抑制され、これ以上癌組織の大きさが増加しなかった（図１１のＡ、Ｂ）。２回目の実験では、癌細胞を注入してから５週後、癌組織の大きさが２００ｍｍ^３以上となったときに抗体を投与し始めた。このときもまた、抗体投入群で癌細胞の成長が抑制されることを観察した。しかし、癌細胞の大きさが維持され、抗体注射を終了した後に癌の大きさが多少増加したことを確認したので、抗癌剤として抗体を用いるときに効果を最大化できる腫瘍の大きさと抗体量の相関関係があるものと判断される（図１１のＣ、Ｄ）。３回目の実験は、癌組織に直接注射する方式ではなく血管に抗－ＴＭ４ＳＦ４抗体を注射して癌組織の大きさの変化を観察した。その結
果、前記で実験した実験と類似の結果を得ることができた（図１１のＥ、Ｆ）。

［実施例７］
新規の単一クローン抗体ＥＣＬ－２Ｂ７とＥＣＬ－４Ｃ１の抗体遺伝子のクローニング及び塩基配列の分析
新規抗体の抗原に対する相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定することで抗体特異性の究明を図った。新規抗体のＣＤＲ部位に該当するタンパク質配列を決定する抗体遺伝子をクローニングし、ＣＤＲ部位の塩基配列を決定した。

具体的に、旺盛に育つハイブリドーマＥＣＬ－２Ｂ７又はＥＣＬ－４Ｃ１細胞クローン５×１０^６個を遠心分離して収穫した後、ＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ（ＴａＫａＲａ、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）で供給者のプロトコールにより全体のＲＮＡを抽出した。得られた全体ＲＮＡは、ＯＤ２６０値を測定してＲＮＡの量を定量した。全体ＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ）を入れて逆転写重合酵素連鎖反応混合液を作ってｃＤＮＡを合成した。

抗体遺伝子をクローニングするためには、既知の重合酵素連鎖反応プライマーを変形した後に用いた（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ ２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
２３３：１６７）。合成されたｃＤＮＡで重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）クローニングするためには、ＩｇＧ１亜型抗体であるＥＣＬ－２Ｂ７及びＩｇＧ２ａ亜型抗体であるＥＣＬ－４Ｃ１の各々の不変領域に該当する重合酵素連鎖反応プライマーである塩基配列５’－ＧＧＡ ＧＴＣ ＧＡＣ ＡＴＡ ＧＡＣ ＡＧＡ ＴＧＧ ＧＧＧ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ ＧＧＣ－３’（ＩｇＧ１亜型不変領域）又は５’－ＧＧＡ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＴＴ ＧＡＣ ＣＡＧ ＧＣＡ ＴＣＣ ＴＡＧ ＡＧＴ ＣＡ－３’（ＩｇＧ２ａ亜型不変領域）であるオリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌｅと、重鎖抗体可変領域のＮ末端に該当するプライマーである塩基配列５’ＭＨ１ ５’－ｃｔｔ ｃｃｇ ｇａａ ｔｔｃ ＳＡＲ ＧＴＮ ＭＡＧ ＣＴＧ ＳＡＧ ＳＡＧ ＴＣ－３’と５’ＭＨ２－５’－ｃｔｔ ｃｃｇ ｇａａ ｔｔｃ ＳＡＲ ＧＴＮ ＭＡＧ ＣＴＧ ＳＡＧ ＳＡＧ ＴＣＷ ＧＧ－３’であるオリゴヌクレオチドとを入れて連鎖重合反応混合液を作製した。軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）クローニングのためには、カッパ鎖（ｋａｐｐａ
ｃｈａｉｎ）不変領域に該当するプライマーである５’－ｇｇｔ ｇｔｃ ｇａｃ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＧＴ ＴＧＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＡＴＣ－３’オリゴヌクレオチドと、カッパ鎖可変領域のＮ末端に該当するプライマーである５’ＭＫ ５’－ｃｇｇ ａａｇ
ｃｔｔ ＧＡＹ ＡＴＴ ＧＴＧ ＭＴＳ ＡＣＭ ＣＡＲ ＷＣＴ ＭＣＡ－３’とをそれぞれ用いた。重合酵素連鎖反応産物の効率的なクローニングのために、軽鎖の場合は、３’－プライマーの末端にＳａｌＩ制限酵素のサイトを付与し、５’－プライマーの場合、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素のサイトを付与した。重鎖の場合には、５’－プライマーにはＥｃｏＲＩ、３’－プライマーにはＳａｌＩ制限酵素のサイトを付与した。重鎖及び軽鎖反応液をそれぞれ交ぜた後、先ず９５℃で１分、４０℃で１分、７２℃で１分で３０回反応させた。増幅し出したＥＣＬ－２Ｂ７とＥＣＬ－４Ｃ１遺伝子をクローニングするため、先ず、重合酵素連鎖反応産物を、重鎖はＥｃｏＲＩとＳａｌＩで処理し、軽鎖はＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで処理した後、１．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲルに展開させてＦａｖｏｒＰｒｅｐ ＧＥＬ^ＴＭＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｆａｖｏｒｇｅｎ社製、台湾）で約４００ｂｐと３９０ｂｐに該当するＤＮＡを分離した。重鎖遺伝子をクローニングするベクターとして用いるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで処理し、軽鎖遺伝子のクローニングベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで処理した後、ＦａｖｏｒＰｒｅｐ ＧＥＬ^ＴＭＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで分離した（図１２のＣ、Ｄ）。この２つのＤＮＡをＴ４ ＤＮＡ連結酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製、米国）で連結し、大腸菌ＤＨ５αにＣａＣｌ_２方法で形質転換した。重鎖の場合、約４００
ｂｐサイズのＤＮＡ挿入物を有したクローン、軽鎖の場合、約３９０ｂｐのサイズを有した大腸菌クローンを選抜した。

抗体遺伝子のＤＮＡ塩基配列分析のため、前記多くのクローンを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが含有された３ｍｌのＬＢ培地で一晩中培養した後、ＤＮＡ－Ｓｐｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ、韓国）を用いてプラスミドＤＮＡを分離し、それぞれのＤＮＡ挿入物の塩基配列をＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｂｉｏｎｉｃｓ、韓国）を介して確認した。

その結果、単一クローン抗体ＥＣＬ－２Ｂ７とＥＣＬ－４Ｃ１の遺伝子増幅の結果、重鎖不変領域に該当するＤＮＡ切片として推定される長さである約４００ｂｐ、軽鎖不変領域に該当するＤＮＡ切片として推定される長さである約３９０ｂｐに該当する位置で増幅されたＤＮＡを得ることができた（図１２のＡ、Ｂ）。これらをクローニングした後、ＤＮＡ挿入物（図１２のＣ、Ｄ）の塩基配列を分析した結果を確保し、重鎖及び軽鎖ＤＮＡの塩基配列をアミノ酸に翻訳した後、抗体構造による抗原認識決定部位をｋａｂａｔナンバリングによって整理し、配列にＣＤＲ１、２、３で表示した。抗体配列の比較分析の結果、ＥＣＬ－２Ｂ７とＥＣＬ－４Ｃ１抗体の重鎖はサブグループＩＩＩＣに属し、軽鎖はサブグループＶに属した（図１３、図１４）。

［実施例８］
群集形成能力の比較による他の癌腫への拡張性の検証
新規抗体の多様な癌細胞悪性化抑制の程度を確認するため、細胞の群集能力の比較実験を進めた。
具体的に、Ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｓｓａｙのために肺癌細胞であるＨ１２９９と肝癌細胞であるＨｕｈ７細胞、乳癌細胞であるＭＣＦ７とＭＤＡ－ＭＢ ２３１細胞、及び膵臓癌細胞であるＭＩＡ－Ｐａｃａ－２細胞を３５ｍｍのディッシュに１×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで塗布した。２４時間後、細胞培養液に新規抗体（ＥＣＬ－２Ｂ７）を５μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ処理した。処理後、７日間、３７℃の加湿された５％のＣＯ_２細胞培養器で培養した。培養液を除去したプレートに０．５％のクリスタルバイオレット試薬で１０分間染色後、数回ＰＢＳで洗浄し、顕微鏡で確認した。

その結果、肺癌細胞だけでなく、肝癌細胞と乳癌細胞においても、本発明の新規抗体を処理したときに群集形成の程度がいずれも減少していることを確認した（図１５）。
これを介し、新規抗体のＴＭ４ＳＦ４抗原特異結合を用いて多様な癌を対象とした抗癌治療技術を提案できることが分かる。

Claims (18)

1. ＴＭ４ＳＦ４（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４）に特異的に結合する抗体又はこの抗原結合断片であって、
   前記抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むエピトープ領域に結合するものである、抗体又はこの抗原結合断片。
2. 前記抗体は、
   （ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖の可変領域；及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖の可変領域を含む抗体；又は、
   （ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖の可変領域；及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖の可変領域を含む抗体である、請求項１に記載の抗体又はこの抗原結合断片。
3. 前記抗体は、
   配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域；及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域を含むものである、請求項２に記載の抗体又はこの抗原結合断片。
4. 前記抗体は、
   配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域；及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域を含むものである、請求項２に記載の抗体又はこの抗原結合断片。
5. 前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）_２又はＦｖであるものである、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体又はこの抗原結合断片。
6. 請求項１から４の何れか一項に記載の抗体又はこの抗原結合断片を暗号化する核酸分子。
7. 請求項６に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
8. 請求項７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
9. 請求項８に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、抗体又はこの抗原結合断片を生産する方法。
10. 請求項１から４の何れか一項に記載の抗体又はこの抗原結合断片を含む、ＴＭ４ＳＦ４検出用組成物。
11. 請求項１０に記載のＴＭ４ＳＦ４検出用組成物を含む、ＴＭ４ＳＦ４検出用キット。
12. 請求項１から４の何れか一項に記載の抗体又はこの抗原結合断片を、ＴＭ４ＳＦ４抗原を含むものと予想される検出対象試料と接触させる段階を含む、ＴＭ４ＳＦ４抗原を検出する方法。
13. （ａ）請求項１から４の何れか一項に記載の抗体又はこの抗原結合断片の治療的有効量
    ；及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む、癌の予防又は治療用薬学的組成物。
14. 前記癌の予防又は治療は、癌治療途中又は癌治療後の癌化学耐性、癌再発、又は癌転移を予防又は治療するものである、請求項１３に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
15. 前記癌は、肺癌、胃癌、卵巣庵、子宮頸部癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、結腸癌、食道癌、皮膚癌、甲状腺癌、腎臓癌、肝癌、頭頚部癌、膀胱癌、前立腺癌、血液癌、多発性骨髓腫、急性骨髓性白血病、悪性リンパ腫、胸腺腫瘍、骨肉腫、繊維性腫瘍及び脳癌からなる群から選択される何れか１つ以上のものである、請求項１３に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
16. 請求項１から４の何れか一項に記載の抗体又はこの抗原結合断片を含む、癌幹細胞成長抑制用組成物。
17. 請求項１から４の何れか一項に記載の抗体又はこの抗原結合断片を含む放射線抗癌治療補助用組成物。
18. 前記抗体又はこの抗原結合断片は、癌幹細胞を含む癌細胞の放射線に対する敏感度を増進させるものである、請求項１７に記載の放射線抗癌治療補助用組成物。

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